(A)

A blokkoló vagy kompetitív ELISA-próbát a következő eljárásnak megfelelően végzik el: A 3-17-A3 monoklonális ellenanyagot alkalmazó kompetitív ELISA képes a kéknyelvbetegség-vírus (BTV) valamennyi ismert szerotípusa elleni ellenanyag azonosítására. A próba elve a BTV antigén és a csoportspecifikus monoklonális ellenanyag (3-17-A3) közötti reakció megszakítása a vizsgálandó szérum hozzáadásával. A vizsgálandó szérumban lévő BTV-ellenanyagok blokkolják a monoklonális ellenanyag (Mab) reaktivitását, és ez a várt színreakció csökkenését eredményezi az enzimmel jelölt anti-egér ellenanyag és a kromogén/szubsztrát hozzáadása után. A szérumok vizsgálhatók egyetlen, 1:5 hígítás mellett (színreakció – 1. függelék) vagy titrálhatók (szérumtitrálás – 2. függelék), így megadható a hígítás végpontja. Az 50 %-nál magasabb inhibíciós értékek pozitívnak tekinthetők. Anyagok és reagensek: 1. Megfelelő ELISA mikrotitráló lemezek. 2. Antigén: sejtkivonat-koncentrátumként megadva, a lent leírtak szerint elkészítve, és – 20 °C-on vagy – 70 °C-on tárolva. 3. Blokkoló puffer: foszfát-pufferes sóoldat (PBS), amely 0,3 % BTV-negatív felnőtt szarvasmarha-szérumot, 0,1 tf% Tween-20 (polioxietilén-szorbiton-monolaureát szirup formájában adva) tartalmaz PBS-ben. 4. Monoklonális ellenanyag: 3-17-A3 (hibridóma szövettenyészet felülúszója formájában adva), amely a VP7 csoportspecifikus polipeptid ellen irányul, – 20 °C-on tárolva vagy fagyasztva szárítva, használat előtt a blokkoló pufferrel 1:100 arányban hígítva. 5. Konjugátum: nyúl anti-egér globulin (abszorbeálva és eluálva) tormaperoxidázzal konjugálva és 4 °C-on, fénytől elzárva tartva. 6. Kromogén és szubsztrát: ortofenilén-diamin (OPD-kromogén) 0,4 mg/ml végső koncentrációban steril desztillált vízben. Hidrogén-peroxidot (30 v% - szubsztrát) adnak közvetlenül hozzá 0,05 tf%-ban a felhasználás előtt (5 μl H2O2/10 ml OPD). (Az OPD óvatosan kezelendő – gumikesztyű viselése ajánlott – feltételezhetően mutagén). 7. 1 mólos kénsav: 26,6 ml sav, 473,4 ml desztillált vízhez adva. (Figyelem! Mindig a savat kell a vízhez önteni, sosem a vizet a savhoz.) 8. Körkörös rázógép. 9. ELISA-lemezleolvasó (a próba eredménye vizuálisan értékelhető). A próba formátuma Cc: konjugátumkontroll (nincs benne szérum/nincs benne monoklonális ellenanyag); C++: erősen pozitív szérumkontroll; C+: gyengén pozitív szérumkontroll; C-: negatív szérumkontroll; Cm: monoklonális ellenanyagkontroll (nincs benne szérum).



1. FÜGGELÉK Pontszerű hígítási (1:5) formátum (40 szérum lemezenként) Kontrollok Vizsgálandó szérumok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2. FÜGGELÉK Szérum-titrálási formátum (10 szérum lemezenként) Kontrollok Vizsgálandó szérumok 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Vizsgálati eljárás: Konjugátum-kontroll (Cc) : Az 1A és 1B vájat BTV antigénből és konjugátumból álló vak kontroll. Ez az ELISA-leolvasó vakvizsgálatára használható. Mab-kontroll (Cm) : Az 1. és 2. oszlop G és H sora monoklonális ellenanyagkontrollként szolgál és BTV antigént, monoklonális ellenanyagot és konjugátumot tartalmaz. E vájatok a maximális színreakciót jelenítik meg. Az ebből a kontrollból leolvasott optikai sűrűség átlaga adja meg a 0 %-os inhibíciós értéket. Pozitív kontroll (C++, C+) : Az 1. és 2. oszlop C-D-E-F sora. E vájatok BTV antigént, BTV erősen, illetve gyengén pozitív antiszérumot, Mab-ot és konjugátumot tartalmaznak. Negatív kontroll (C-) : A 2A és 2B vájat negatív kontroll, amely BTV antigént, BTV negatív antiszérumot, Mab-ot és konjugátumot tartalmaz. Vizsgálandó szérumok : Az átfogó szerológiai felmérések és gyors szűrővizsgálatok esetén a szérumok egyetlen, 1:5-ös hígítás mellett is megvizsgálhatók (1. függelék). Alternatív módon megvizsgálható egy 10 szérumból álló, 1:5-ös hígítástól 1:640-es hígításig terjedő hígítási sor (2. függelék). Ezzel hozzávetőleges információ nyerhető a vizsgált szérumok ellenanyagtiteréről is. Eljárás: 1. Hígítson fel PBS-ben BTV antigént az előtitrálási koncentrációra, röviden ultrahangozza az összecsapódott vírus diszpergálása céljából (ha nem áll rendelkezésre ultrahangképző berendezés, pipettázza erősen az oldatot), és tegyen abból 50 μl-t az ELISA-lemez minden vájatába. Finoman ütögesse meg a lemez oldalát, hogy szétoszlassa az antigént. 2. Inkubálja a körkörös rázógépen 60 percig, 37 °C-on. Mossa át a lemezeket háromszor olyan módon, hogy a vájatokat felönti nem steril PBS-szel, majd azt leönti róluk, és itatóspapírra fektetve szárítsa fel. 3. Kontroll-vájatok: Adjon 100 μl blokkoló puffert a Cc vájatokhoz. Adjon 50 μl pozitív és negatív kontrollszérumot 1:5 hígítás mellett (10 μl szérum + 40 μl blokkoló puffer) a megfelelő C-, C+ és C++ vájatokba. Adjon 50 μl blokkoló puffert a Mab kontrollvájatokhoz. Pontszerű titrálási módszer: Adjon 1:5 arányú hígítást valamennyi vizsgálandó szérumhoz blokkoló pufferral úgy, hogy a 3–12 oszlop vájatait megkétszerezi (10 μl szérum + 40 μl blokkoló puffer), vagy Szérumtitrálási módszer: készítsen kétszeres hígítási sort valamennyi vizsgálandó szérumból (1:5–1:640) blokkoló pufferban a 3–12 egyszeres oszlop nyolc vájatában. 4. Közvetlenül a vizsgálandó szérumok hozzáadása után hígítsa a Mab-ot blokkoló pufferben 1:100 arányban és a lemez valamennyi vájatába tegyen abból 50 μl-t, kivéve a vak kontrollt. 5. Inkubálja a körkörös rázógépen 60 percig, 37 °C-on. Mossa át háromszor PBS-szel és itassa szárazra. 6. Hígítson nyúl anti-egér koncentrátumot 1:5000 arányban blokkoló pufferban és a lemez valamennyi vájatába tegyen abból 50 μl-t. 7. Inkubálja a rázógépen 60 percig, 37 °C-on. Mossa át háromszor PBS-szel és itassa szárazra. 8. Olvassza fel az O-fenilén-diamin dihidrokloridot (OPD) és közvetlenül felhasználás előtt adjon 5 μl 30 %-os hidrogén-peroxidot minden 10 ml OPD-hez. A lemez minden vájatába tegyen abból 50 μl-t. Hagyja körülbelül 10 percig, hogy kialakuljon a színreakció, majd 1 mólos kénsavval (50 μl vájatonként) állítsa le. Színreakciónak kell kialakulnia a Mab kontrollvájatokban és azokban a vájatokban, amelyek olyan szérumot tartalmaznak, amelyekben nincs BTV ellenanyag. 9. Vizsgálja meg a lemezeket vizuálisan vagy spektrofotometriás leolvasóval, és az eredményeket jegyezze fel. Az eredmények analízise: A szoftvercsomag felhasználásával nyomtassa ki az optikai sűrűség (OD) értékeket és a százalékos inhibíciót (PI) a vizsgálandó és a kontrollszérumokra vonatkozóan az antigénkontroll-vájatokban regisztrált átlagértékek alapján. Az OD és PI értékek formájában kifejezett adatok felhasználásával meghatározható, hogy a vizsgálat a megengedett határértékek között ment-e végbe. A Mab-kontrollokra (antigén plusz Mab, nincs vizsgálandó szérum) vonatkozó felső kontroll-határértékek (UCL) és alsó kontroll-határértékek (LCL) 0,4 és 1,4 közötti OD érték között vannak. Ki kell zárni azokat a lemezeket, amelyek nem felelnek meg a fenti kritériumoknak. Ha nem áll rendelkezésre számítógépes szoftvercsomag, az ELISA-nyomtatóval nyomtassa ki az OD értékeket. Számítsa ki azt az antigénkontroll-vájatokra vonatkozó átlag OD-értéket, amely megfelel a 100 %-os értéknek. Határozza meg az 50 %-os OD-értéket és manuális úton számítsa ki valamennyi minta pozitivitását és negativitását. Százalékos inhibíciós (PI) érték = 100 - (az egyes vizsgálati kontrollok OD-ja/a Cm átlag OD-ja) × 100. A kétszeres negatív kontrollszérum-vájatoknak és a kétszeres vakvájatoknak + 25 % és – 25 %, illetve + 95 % és + 105 % közötti PI értékeket kell mutatniuk. Amennyiben az érték nem e határértékek közé esik, az még nem zárja ki a vizsgálatból a lemezt, hanem háttérszín kialakulását sejteti. Az erősen és gyengén pozitív kontrollszérumoknak + 81 % és + 100 %, illetve + 51 % és + 80 % közötti PI értékeket kell mutatniuk. A vizsgálandó szérumok diagnosztikai küszöbértéke 50 % (PI 50 % vagy OD 50 %). Az 50 %-nál kisebb PI-értékeket mutató mintákat negatívként regisztrálják. A kétszeres vájatokra vonatkozó küszöb feletti és alatti PI értékeket mutató minták kétségesnek tekintendők; ezek a minták színreakciós vizsgálattal és/vagy titrálással újra megvizsgálhatók. A pozitív minták is titrálhatók annak érdekében, hogy meghatározzák a pozitivitás fokát. Vizuális leolvasás: A pozitív és negatív mintákat könnyű szabad szemmel megkülönböztetni; a gyengén pozitív vagy erősen negatív minták szabad szemmel való értékelése már nehezebb lehet. A BTV ELISA-antigén előkészítése: 1. Mosson át háromszor 40–60 Roux-palacknyi összefolyó BHK-21 sejtekből álló sejttenyészetet szérummentes Eagle-féle tápközeggel, majd fertőzze meg 1-es szerotípusú kéknyelvbetegség-vírussal, szérummentes Eagle-féle tápközegben. 2. Inkubálja 37 °C-on és vizsgálja meg naponta, hogy jelentkezik-e citopatogén hatás (CPE). 3. Amikor valamennyi Roux-palackban a sejtréteg 90–100 %-ában teljes CPE mutatkozik, az üvegre tapadt sejtek lerázásával gyűjtse be a vírust. 4. Centrifugálja 2 000 –3 000 -es percenkénti fordulatszámmal, a sejtek pelletizálása céljából. 5. Öntse el a felülúszót, szuszpendálja újra a sejteket körülbelül 30 ml PBS-ben, amely 1 %-ban „Sarkosylt” és 2 ml fenil-metil-szulfonil-fluoridot tartalmaz (lízis-puffer). A sejtek ettől gélt alkothatnak, ez a jelenség további lízis-puffer hozzáadásával csökkenthető. (Megjegyzés: a fenil-metil-szulfonil-fluorid egészségre káros – kezelje különleges elővigyázatossággal!) 6. Roncsolja a sejteket 60 másodpercen át ultrahangos szonda felhasználásával, 30 mikronos amplitúdón. 7. Centrifugáljon 10 000 -es percenkénti fordulatszámon, 10 percig. 8. Tartsa a felülúszót + 4 °C-on és szuszpendálja újra a megmaradt sejtpelletet 10–20 ml lízis-pufferben. 9. Ultrahangozza és tisztítsa meg a szuszpenziót, tartsa meg a felülúszót valamennyi lépésben, összesen három alkalommal. 10. Elegyítse a felülúszókat és centrifugálja 24 000 -es percenkénti (100,000 g) fordulatszámmal 120 percig + 4 °C-on 5 ml 40 %-os szacharózoldatra (v% PBS-ben) rétegezve, 30 ml-es Beckmann-centrifugacső és SW 28-as rotor felhasználásával. 11. Öntse el a felülúszót, alaposan csepegtesse le a csöveket és szuszpendálja újra a pelletet PBS-ben ultrahangozással. Tárolja az antigént előre kimért egyenlő adagokban, – 20 °C-on. A BTV ELISA-antigén titrálása: A kéknyelv betegség ELISA antigénjét indirekt ELISA segítségével titrálják. Az antigén kétszeres hígítását egy állandó hígítású (1:100) monoklonális ellenanyaggal (3-17-A3) szemben titrálják. Az eljárás a következő: 1. Titráljon egy 1:20 hígítású BTV antigént PBS-ben a mikrotitráló lemez hosszában egy kétszeres hígítású sorozatban (50 μl vájatonként), többcsatornás pipetta felhasználásával. 2. Inkubálja egy órán át 37 °C-on körkörös rázógépen. 3. Mossa át a lemezeket háromszor PBS-szel. 4. Tegyen 50 μl (1:100 hígítású) 3-17-A3 monoklonális ellenanyagot a mikrotitráló lemez minden vájatába. 5. Inkubálja egy órán át 37 °C-on körkörös rázógépen. 6. Mossa át a lemezeket háromszor PBS-szel. 7. Tegyen 50 μl, tormaperoxidázhoz konjugált, az előre titrált optimális koncentrációra hígított nyúl anti-egér globulint a mikrotitráló lemez minden vájatába. 8. Inkubálja egy órán át 37 °C-on körkörös rázógépen. 9. Adjon hozzá szubsztrátot és kromogént az előbb leírtak szerint. Állítsa le a reakciót 10 perc múlva 1 mólos kénsav hozzáadásával (50 μl vájatonként). A kompetitív vizsgálatban a monoklonális ellenanyagnak túlsúlyban kell lenni, ezért olyan antigén-hígítást kell választani, amely a titrációs görbére esik (nem a platótartományra), és 10 perc elteltével körülbelül 0,8 OD értéket ad.