1998L0057 — HU — 30.07.2006 — 001.001

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű, az intézmények semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért

Módosította:









▼B

A TANÁCS 98/57/EK IRÁNYELVE

(1998. július 20.)

a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. elleni védekezésről







AZ EURÓPAI UNIÓ TANÁCSA, tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre és különösen annak 43. cikkére, tekintettel a Bizottság javaslatára ( 1 ), tekintettel az Európai Parlament véleményére ( 2 ), tekintettel a Gazdasági és Szociális Bizottság véleményére ( 3 ), mivel a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. nevű károsító szervezet korábban Pseudomonas solanacearum (Smith)-ként volt ismert; mivel a jövőben valószínűleg Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. lesz a károsító szervezet általánosan elfogadott neve; mivel a Tanácsnak figyelembe kell vennie a tudományos fejlődést ebben az irányelvében; mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés fontos helyet foglal el a Közösség mezőgazdaságában; mivel a burgonya- és a paradicsomtermés hozamát a károsító szervezetek folyamatosan veszélyeztetik; mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés károsító szervezetek elleni védelme révén nemcsak szinten lehet tartani a termőképességet, hanem a mezőgazdasági termelékenységet is növelni lehet; mivel a károsító szervezeteknek az egyes tagállamokba való behurcolását megakadályozó növényvédelmi intézkedéseknek csak korlátozott hatása lenne, ha e szervezetek ellen nem védekeznének egyidejűleg és módszeresen az egész Közösségben és nem akadályoznák meg ezek elterjedését; mivel a burgonyát és a paradicsomot károsító szervezetek egyike a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., a burgonya barnarothadásának, valamint a burgonya és a paradicsom baktériumos hervadásának kórokozója; mivel a Közösség bizonyos térségeiben már előfordultak a kórokozó által kiváltott megbetegedések, és léteznek még elszigetelt fertőzési források; mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés a Közösség egész területén állandó veszélynek van kitéve, ha nem kerül sor e kultúrák vonatkozásában hatékony intézkedésekre a károsító szervezet lokalizálására és földrajzi elterjedésének meghatározására, előfordulásának és elterjedésének megelőzésére, valamint – előfordulása esetén – továbbterjedésének megakadályozására és az ellene való védekezésre a felszámolás szándékával; mivel ennek érdekében bizonyos intézkedéseket kell foganatosítani a Közösségen belül; mivel a tagállamoknak lehetővé kell tenni, hogy amennyiben nem akadályozzák a burgonya és a paradicsom Közösségen belüli szabad mozgását, szükség esetén további, vagy még szigorúbb intézkedéseket hozzanak, ha a növények vagy növényi termékek károsító szervezeteinek a Közösségbe történő behurcolása és a Közösségen belüli elterjedése elleni védekezési intézkedésekről szóló, 1976. december 21-i 77/93/EGK tanácsi irányelv ( 4 ) másképp nem rendeli; mivel a tagállamok kötelesek értesíteni a többi tagállamot és a Bizottságot minden ilyen jellegű intézkedésről; mivel az intézkedéseknek figyelembe kell venniük, hogy módszeres hatósági vizsgálatokra van szükség a kórokozó lokalizálására; mivel a vizsgálatok keretében ellenőrzést és – tekintettel arra, hogy bizonyos környezeti feltételek mellett a megbetegedés látens marad és nem észlelhető sem a fejlődő burgonyanövényeken, sem pedig a betárolt burgonyagumókon – bizonyos esetekben mintavételt és laboratóriumi vizsgálatokat is kell végezni; mivel a legfontosabb tényező nem a kórokozónak a fejlődőkultúrában való elszaporodása, hanem a kórokozó felszíni vizek és a burgonyafélékhez tartozó egyes vad növényfajok útján is terjedhet, és ezért a burgonya- és a paradicsomkultúrák kórokozóval fertőzött vízzel történő öntözése ezeknek a kultúráknak a megfertőzését eredményezheti; mivel a kórokozó képes áttelelni árvakelésű burgonya és paradicsom növényekben, és ezek az egyik tenyészidőről a másikra átvitt fertőzés forrásai lehetnek; mivel a kórokozó terjed fertőzött burgonyával vagy olyan ültető, betakarító, illetve anyagkezelő eszközökkel, szállító- és tárolóedényekkel történő érintkezése útján is, amelyek fertőzött burgonyával való korábbi érintkezésük során a károsítóval szennyeződtek; mivel a kórokozó elterjedése csökkenthető, illetve megakadályozható ezen eszközök fertőtlenítésével; mivel a vetőburgonya minden ilyen szennyeződése a kórokozó elterjedésének súlyos kockázatával jár; mivel a vetőburgonya látens fertőzöttsége úgyszintén a kórokozó elterjedésének súlyos kockázatával jár, és ez megelőzhető olyan hivatalosan elismert program keretében termesztett vetőburgonya felhasználásával, amelynek során laboratóriumi vizsgálat alapján megállapították a vetőburgonya fertőzésmentességét; mivel a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. európai körülmények közötti biológiájára és járványtanára vonatkozó jelenlegi tudományos ismeretek hiányosak, és néhány tenyészidőn belül várhatóan szükségessé válik a javasolt intézkedések felülvizsgálata; mivel a laboratóriumi vizsgálatok eljárásait várhatóan szintén javítani kell a jövőbeni kutatási eredmények tükrében, különös tekintettel a vizsgálati módszerek érzékenységére és specificitására, a lehető legoptimálisabb vizsgálati módszerek kiválasztása és egységesítése érdekében; mivel az általános intézkedések részletes meghatározására, valamint a kórokozónak a területükre történő behurcolásának megakadályozására a tagállamok által tett további, illetve még szigorúbb intézkedésekhez célszerű, hogy a tagállamok szorosan együttműködjenek a Bizottsággal a Növény-egészségügyi Állandó Bizottság (a továbbiakban: „a bizottság”) keretén belül, ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:







1. cikk

Ez az irányelv a tagállamok a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., korábbi nevén Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (a továbbiakban: „károsító”) ellen meghozandó intézkedéseire alkalmazandó, a károsító szervezetnek az I. melléklet 1. szakaszában felsorolt gazdanövények (a továbbiakban: „felsorolt növényanyag”) vonatkozásában történő:

a) lokalizálására és földrajzi elterjedésének meghatározására;

b) előfordulásának és elterjedésének megakadályozására; és

c) előfordulása esetén, továbbterjedésének megakadályozására és az ellene való védekezésre, a felszámolás szándékával.

2. cikk

(1) A tagállamok módszeres hatósági vizsgálatok keretében évente megvizsgálják a károsító szervezet előfordulását a területükről származó felsorolt növényanyagban. A felsorolt növényanyag termesztését fenyegető egyéb lehetséges szennyező források meghatározására a tagállamok kockázati elemzést végeznek, és – hacsak a felmérés tanúsága szerint nincs tényleges veszélye a károsító szervezet elterjedésének – a felsorolt növényanyag termőterületein célirányos hatósági vizsgálatok keretében megvizsgálják a károsító szervezet előfordulását a felsorolt növényanyagon kívüli növényekben, beleértve a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényeket is, valamint a felsorolt növényanyag öntözésére vagy permetezéséhez használt felszíni vizekben, továbbá a felsorolt növényanyaggal foglalkozó ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott és a felsorolt növényanyag öntözésére vagy permetezéséhez használt folyékony hulladékban. A célirányos vizsgálatok körét a felmért kockázat alapján kell meghatározni. A hatósági vizsgálatok keretében a tagállamok vizsgálhatják a károsító szervezet előfordulását más anyagokban, így például termőközegben, talajban vagy ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemekből származó szilárd hulladékokban is.

(2) Az (1) bekezdésben foglalt hatósági vizsgálatokat az alábbiak szerint kell elvégezni:

a) a felsorolt növényanyag vonatkozásában az I. melléklet II. szakasza 1. pontjának megfelelően; és

b) a felsorolt növényanyagon kívüli gazdanövények, illetve a vizek vonatkozásában, beleértve a folyékony hulladékot is, megfelelő módszerek alkalmazásával, és szükség szerint mintavétellel, melyet hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálatnak vetnek alá;

c) szükség szerint egyéb anyagok vonatkozásában a megfelelő módszerek alkalmazásával.

A 77/93/EGK irányelv szerinti illetékes hivatalos szervek megalapozott tudományos és statisztikai elvek, valamint a károsító szervezet biológiája alapján meghatározzák a hatósági ellenőrzések keretében folytatott vizsgálatok, valamint a mintavételek számának, eredetének, rétegezésének és időzítésének további részleteit, figyelembe véve a felsorolt növényanyagnak, illetve adott esetben a károsító szervezet egyéb gazdanövényeinek az érintett tagállamon belüli sajátos termesztési rendszereit.

(3) Az (1) bekezdésben foglalt hatósági vizsgálatok részleteiről és eredményeiről a tagállamok évente értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot az I. melléklet II. szakasza 2. pontjának megfelelően. Az értesítéseket minden év június 1-jéig kell megküldeni, kivéve a vetőgumóként felhasznált burgonyáról szóló értesítést, amelyet szeptember 1-jéig küldenek meg a tagállamok. A kultúrnövények vizsgálati eredményeiről szóló részletes értesítés mindig az előző évre vonatkozik. A részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik.

(4) A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak megfelelően a tagállamok megállapítják:

— a (2) bekezdés első albekezdésének b) pontjában meghatározott vizsgálatra és laboratóriumi vizsgálatokra vonatkozó eljárást.

(5) A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak megfelelően a tagállamok megállapíthatják:

— a (2) bekezdés első albekezdésének c) pontjában meghatározott vizsgálatra vonatkozó eljárást,

— a (2) bekezdés második albekezdésében meghatározott részletes előírásokra vonatkozó szabályokat az előírások betartásának összehasonlíthatósága érdekében.

3. cikk

A tagállamok gondoskodnak arról, hogy az illetékes hivatalos szerveik értesüljenek a károsító szervezet területükön vélt vagy bizonyított jelenlétéről.

4. cikk

(1) A károsító szervezet előfordulásának gyanúja esetén, a gyanú igazolása vagy eloszlatása céljából az érintett tagállam illetékes hivatalos szervei gondoskodnak a hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálatok, a felsorolt növényanyagra vonatkozóan a II. mellékletben meghatározott módszernek a III. melléklet 1. pontjában foglalt feltételek szerint, vagy – minden egyéb esetben – bármely más hivatalosan elfogadott módszer alkalmazásával történő végrehajtásáról. Amennyiben a gyanú beigazolódik, a III. melléklet 2. pontjában foglalt követelmények az irányadók.

(2) Amíg a károsító szervezet előfordulásának (1) bekezdés szerinti gyanúja be nem igazolódik vagy eloszlatásra nem kerül, minden olyan gyanús esetben, ahol

i. a károsító szervezet által okozott megbetegedés tüneteit észlelték, és a II. melléklet I. szakaszának 1. pontjában és a II. szakaszban meghatározott gyors szűrővizsgálat vagy -vizsgálatok eredménye pozitív volt; vagy

ii. a II. melléklet I. szakaszának 2. pontjában és a III. szakaszban meghatározott szűrővizsgálat vagy -vizsgálatok eredménye pozitív volt,

a tagállamok illetékes hivatalos szervei saját növénytermesztésük vonatkozásában

a) megtiltják valamennyi olyan kultúrnövényből, tételből vagy szállítmányból származó növény és gumó mozgását, amelyekből a mintákat vették, kivéve, ha mozgásuk hatósági ellenőrzés mellett történik, és ha megállapították, hogy nem áll fenn a károsító szervezet elterjedésének tényleges veszélye;

b) lépéseket tesznek a károsító szervezet vélt előfordulása eredetének megállapítására;

c) a károsító szervezet elterjedésének megakadályozására további megfelelő óvintézkedéseket hoznak a becsült kockázat mértéke alapján, különös tekintettel a felsorolt növényanyag termesztésére és az a) pont hatálya alá nem tartozó azon vetőburgonya-tételek mozgására, ahonnan az a) pontban említett mintákat vették.

(3) A károsító szervezet előfordulásának olyan gyanúja esetén, amikor fennáll a felsorolt növényanyag vagy a felszíni vizek szennyeződésének az egyik tagállamból vagy tagállamba történő átvitelének veszélye, az a tagállam, amelyben az előfordulás gyanúját jelentették, a megállapított kockázat alapján haladéktalanul közli az érintett tagállammal vagy tagállamokkal a vélt előfordulással kapcsolatos részletes adatokat, és az említett tagállamok kötelesek megfelelően együttműködni a veszély elhárítására. Az értesített tagállam vagy tagállamok elrendelik a (2) bekezdés c) pontja szerinti óvintézkedéseket, és megteszik az (1) és (2) bekezdés szerint szükséges további intézkedéseket.

(4) A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak megfelelően a tagállamok megállapíthatják:

— a (2) bekezdés c) pontjában foglalt intézkedéseket.

5. cikk

(1) Amennyiben a felsorolt növényanyagra a II. mellékletben meghatározott hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálat vagy – minden egyéb esetben – bármely más hivatalosan elfogadott módszer megerősíti a károsító szervezet jelenlétét az ezen irányelvben foglaltak szerint vett mintában, a tagállam illetékes hivatalos szervei megfelelő tudományos elvek, a károsító szervezet biológiája, valamint gazdanövényeinek az adott országon belüli sajátságos termesztési, értékesítési és feldolgozó rendszerei alapján:

a) a felsorolt növényanyag vonatkozásában i. vizsgálatot rendelnek el a szennyeződés mértékének és elsődleges forrásának vagy forrásainak meghatározására a IV. mellékletben foglalt rendelkezéseknek megfelelően, és a 4. cikk (1) bekezdése szerint további vizsgálatot folytatnak, legalább az egymással klonális rokonságban álló vetőburgonya-állományokra kiterjedően; és ii. fertőzöttnek minősítik azt a felsorolt növényanyagot, szállítmányt, illetve tételt, amelyből a minta származik, továbbá mindazokat a gépeket, járműveket, edényeket, raktárakat vagy annak részeit, valamint minden egyéb anyagot, beleértve a csomagolóanyagokat is, amelyek érintkezésbe kerültek azzal a felsorolt növényanyaggal, amelyből a minta származik; indokolt esetben fertőzöttnek minősítik továbbá azt a táblát, védett termesztőegységet vagy egyéb termőhelyet, ahonnan a mintavétel alapjául szolgáló növényanyagot betakarították; a tenyészidőszak során vett minták esetében pedig fertőzöttnek minősítik a védett kultúráknak azt a tábláját, termőhelyét, illetve adott esetben a védett termesztőegységét, ahonnan a minták származnak; és iii. az V. melléklet 1. pontjában foglalt rendelkezéseknek megfelelően meghatározzák a minősített szennyeződéssel betakarítás előtt vagy után termesztési, öntözési vagy permetezési kapcsolatok során való érintkezés, vagy klonális kapcsolat útján keletkezett valószínű szennyeződés mértékét; és iv. övezetet jelölnek ki a ii. alpont szerint minősített szennyeződés, a iii. alpont szerint meghatározott mértékű valószínű szennyeződés és a károsító szervezet lehetséges elterjedése alapján, az V. melléklet 2. pontja i. alpontjának megfelelően;

b) az a) pontban nem említett olyan termesztett gazdanövények vonatkozásában, ahol a felsorolt növényanyag termesztése veszélyben forog, i. vizsgálatot rendelnek el az a) pont i. alpontjának megfelelően; és ii. fertőzöttnek minősítik a károsító szervezetnek azokat a gazdanövényeit, amelyekből a minta származik; és iii. megállapítják a valószínű fertőzés mértékét és övezetet jelölnek ki az a) pont iii. és iv. alpontjának megfelelően a felsorolt növényanyag termesztésének vonatkozásában;

c) a felszíni vizek (beleértve a felsorolt növényanyaggal foglalkozó feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott folyékony hulladékot is) és a burgonyafélékhez tartozó olyan vad gazdanövények vonatkozásában, ahol a felsorolt növényanyag termesztését a felszíni vízzel történő öntözés, permetezés, illetve a felszíni víz kiáradása veszélyezteti, i. a fertőzés mértékének megállapítására hatósági ellen- őrzésre is kiterjedő vizsgálatot folytatnak a felszíni vízből és szükség esetén a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényekből megfelelő időpontokban vett mintákon; és ii. az i. alpontnak megfelelően végzett vizsgálat alapján a mintavétel alapjául szolgáló felszíni vizet indokolt mértékben fertőzöttnek minősítik; és iii. meghatározzák a valószínű fertőzöttséget és övezetet jelölnek ki a ii. alpont szerint minősített fertőzés és a károsító szervezet valószínű elterjedése alapján, figyelembe véve az V. melléklet 1. pontjában és 2. pontjának ii. alpontjában foglalt rendelkezéseket.

(2) Az V. melléklet 3. pontjában foglalt rendelkezéseknek megfelelően a tagállamok haladéktalanul értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot az (1) bekezdés a) pontjának ii. alpontja és az (1) bekezdés c) pontjának ii. alpontja szerint minősített fertőzésről, valamint az (1) bekezdés a) pontjának iv. alpontja és – megfelelő esetben – az (1) bekezdés c) pontjának iii. alpontja szerinti övezet kijelölésének részleteiről. Az e bekezdésben meghatározott részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik.

A tagállamok ugyanakkor megküldik a Bizottságnak az V. melléklet 4. pontjában meghatározott további értesítést. Az ezen albekezdésben előírt részletes értesítést a tagállamok haladéktalanul megküldik a bizottság tagjainak.

(3) A (2) bekezdés szerinti értesítés és az abban foglalt elemek eredményeként az értesítésben megjelölt többi tagállam az (1) bekezdés a) pontjának i. alpontja és – megfelelő esetben – az (1) bekezdés c) pontjának i. alpontja értelmében vizsgálatot indít, és szükség esetén további intézkedéseket tesz az (1) és a (2) bekezdésben foglaltak szerint.

6. cikk

(1) A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerint fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyagot tilos elültetni, és – az adott tagállam illetékes hivatalos szerveinek ellenőrzése és jóváhagyása mellett – a VI. melléklet 1. pontjában foglalt valamely rendelkezésnek kell alávetni, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet elterjedésének azonosítható veszélye.

(2) A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja, és c) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyagot, beleértve az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg fertőzöttnek minősülő helyen termesztett veszélyeztetett növényanyagot is, tilos elültetni, és az adott tagállam illetékes hivatalos szerveinek ellenőrzése mellett a VI. melléklet 2. pontjában foglaltaknak megfelelően kell felhasználni vagy eltávolítani, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet elterjedésének azonosítható veszélye.

(3) A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek, vagy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja és c) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg szennyezettnek minősülő gépeket, járműveket, edényeket, raktárakat vagy annak részeit, valamint minden egyéb anyagot, beleértve a csomagolóanyagokat is, meg kell semmisíteni, vagy megfelelő módszerrel fertőtleníteni kell a VI. melléklet 3. pontjában foglaltak szerint. A fertőtlenítést követően ezeket az anyagokat a továbbiakban nem kell fertőzöttnek tekinteni.

(4) Az (1), (2) és (3) bekezdésben foglalt intézkedések sérelme nélkül a tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdés a) pontja iv. alpontjának és c) pontja iii. alpontjának megfelelően kijelölt övezetben a VI. melléklet 4.1. és 4.2. pontjában foglaltak szerint további intézkedéseket kell tenni. A tagállamok évente részletesen értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot ezekről az intézkedésekről. A részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik.

7. cikk

(1) A tagállamok elrendelik, hogy a vetőburgonyának meg kell felelnie a 77/93/EGK irányelv követelményeinek, és közvetlenül olyan hivatalosan elismert program keretében termesztett burgonyaanyagból kell származnia, amelyet hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött vizsgálat során a II. mellékletben foglalt megfelelő módszerrel a károsító szervezettől mentesnek találtak.

A fent említett vizsgálatot a tagállamok az alábbiak szerint végzik el:

a) amennyiben saját vetőburgonya-termesztésük során a károsító szervezet előfordulását állapították meg i. a korábbi szaporítások vizsgálatával, beleértve a kiinduló vegetatívszaporulat-szelekciót és a vetőburgonya teljes vegetatívszaporulat-alapjának módszeres vizsgálatát; vagy ii. amennyiben megállapításra került, hogy nincs klonális kapcsolat, a vetőburgonya teljes vegetatívszaporulat-alapjának vagy korábbi szaporításainak vizsgálatával, beleértve a kiinduló vegetatívszaporulat-szelekciót is; és

b) egyéb esetekben vagy a kiinduló vegetatívszaporulat-szelekció minden egyes növényének, vagy a vetőburgonya-alapból, vagy a korábbi szaporításokból vett reprezentatív minták vizsgálatával.

(2) A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak megfelelően a tagállamok megállapíthatják:

— az (1) bekezdés második albekezdése a) pontjának alkalmazására vonatkozó részletes szabályokat,

— az (1) bekezdés második albekezdésének b) pontjában foglalt reprezentatív mintákra vonatkozó szabályokat.

8. cikk

A tagállamok megtiltják a károsító szervezet tartását és kezelését.

9. cikk

A 77/93/EGK irányelv rendelkezéseinek sérelme nélkül, a 95/44/EK ( 5 ) irányelv szerinti vizsgálati, tudományos vagy fajtaszelekciós munka céljából a tagállamok eltéréseket engedélyezhetnek az irányelv 6. és 8. cikkében meghatározott intézkedésektől.

10. cikk

Saját növénytermesztésük vonatkozásában a tagállamok további vagy szigorúbb intézkedéseket vezethetnek be a károsító szervezet elleni védekezés, vagy elterjedésének megakadályozása érdekében, feltéve hogy ezek az intézkedések összhangban állnak a 77/93/EGK irányelv rendelkezéseivel.

A tagállamok részletesen értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot ezekről az intézkedésekről. A részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik.

11. cikk

Ezen irányelv mellékleteit a Tanács a tudományos vagy műszaki ismeretek fejlődése tükrében a 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében foglalt eljárásnak megfelelően módosíthatja. A II. mellékletben meghatározott módszerek és a VI. melléklet 4.1. és 4.2. pontjában foglalt intézkedések vonatkozásában a Bizottság jelentést készít a módszerek és az intézkedések felülvizsgálatáról a szerzett tapasztalatok alapján, és a jelentést 2002. január 1-jéig benyújtja a bizottságnak.

12. cikk

(1) A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek 1999. augusztus 21-éig megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.

Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.

(2) A tagállamok haladéktanul közlik a Bizottsággal nemzeti joguknak azokat a főbb rendelkezéseit, amelyeket az irányelv által szabályozott területen fogadtak el. A Bizottság tájékoztatja erről a többi tagállamot.

13. cikk

Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetésének napján lép hatályba.

14. cikk

Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.









I. MELLÉKLET

I. SZAKASZ

A Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1. cikkben említett gazdanövényeinek felsorolása







Solanum tuberosum L. növényei (gumóit is beleértve), a magok kivételével Burgonya Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. növényei, termésük és magvaik kivételével Paradicsom

II. SZAKASZ

Vizsgálatok

1. A 2. cikk (2) bekezdésének a) pontjában meghatározott hatósági vizsgálatoknak a károsító szervezet biológiáján és az adott tagállam sajátos termesztési rendszerein kell alapulniuk, továbbá ki kell terjedniük a következőkre: i. burgonya esetében; — a fejlődő növény megfelelő időpontokban végzett szemrevételezéses vizsgálatára, illetve mintavételre vető- vagy egyéb burgonyákból, a tenyészidőszak vagy a raktározás során. A mintákat hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött szemlének kell alávetni, a gumók felvágásával, és — vetőburgonyáknál és indokolt esetben egyéb burgonyáknál is, hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálatra a II. mellékletben meghatározott módszer segítségével; ii. paradicsom esetében; — legalább a szakmai felhasználás céljából átültetésre kerülő fejlődő növények megfelelő időpontokban végzett szemrevételezéses vizsgálatára.

2. A 2. cikk (3) bekezdésében meghatározott hatósági vizsgálatokról szóló értesítésnek magában kell foglalnia a következőket: i. burgonya vizsgálata esetén: — a vető- és egyéb burgonyákkal beültetett összterület becsült nagysága hektárban, — a minták osztályozása a vetőburgonya kategóriái, áruburgonya és adott esetben régiók szerint, — a vizsgálati céllal vett minták száma és a mintavételek időpontja, — a szabadföldi helyszíni szemlék száma, — a gumók szemrevételezéses vizsgálatainak száma (és a minta nagysága); ii. legalább a szakmai felhasználás céljából átültetésre kerülő fejlődő paradicsomnövények megfelelő időpontokban végzett szemrevételezéses vizsgálata esetén: — a növények becsült összmennyisége, — a szemrevételezéses vizsgálatok száma; iii. a burgonyán és a paradicsomon kívüli egyéb gazdanövények – beleértve a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényeket is – vizsgálata esetén: — fajok, — a minták száma és a mintavételek időpontja, — megfelelő esetben a mintavétel során vizsgált terület vagy folyóvíz, — elemzési módszer; iv. vizek és az ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott folyékony hulladék vizsgálata esetén: — a minták száma és a mintavétel időpontja, — terület, folyóvíz vagy az építmény fekvése, ahonnan a mintát vették, — elemzési módszer.

▼M1









II. MELLÉKLET

VIZSGÁLATI PROGRAM A RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOSZTIZÁLÁSÁRA, KIMUTATÁSÁRA ÉS AZONOSÍTÁSÁRA

A VIZSGÁLATI PROGRAM ALKALMAZÁSI KÖRE

A bemutatott program az alábbi esetekben használt eljárások leírását tartalmazza:

i. a barna rothadás diagnosztizálása burgonyagumókban, és a baktériumos hervadás diagnosztizálása burgonya-, paradicsom- és néhány egyéb gazdanövényben;

ii. a Ralstonia solanacearum kimutatása burgonyagumó-mintákban, burgonya-, paradicsom- és egyéb gazdanövényekben, vízben és talajban;

iii. a Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) azonosítása.

TARTALOMJEGYZÉK







Általános alapelvek I. SZAKASZ: A vizsgálati program alkalmazása 1. Kimutatási program a barna rothadás és a baktériumos hervadás (R. solanacearum) diagnosztizálására burgonyagumókban, valamint a barna rothadás vagy a baktériumos hervadás tüneteit mutató burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövényekben 2. Az R. solanacearum tünetmentes burgonyagumó-mintákban történő kimutatásának és azonosításának programja 3. Az R. solanacearum tünetmentes burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövény-mintákban történő kimutatásának és azonosításának programja II. SZAKASZ: Részletes módszerek az R. solanacearum kimutatására burgonyagumókban, valamint a barna rothadás vagy a baktériumos hervadás tüneteit mutató burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövényekben 1. Tünetek 2. Gyors szűrővizsgálatok 3. Izolálási eljárás 4. Az R. solanacearum azonosítási vizsgálatai III. SZAKASZ: 1. Részletes módszerek az R. solanacearum kimutatására és azonosítására tünetmentes burgonyagumó-mintákban 1.1. Mintaelőkészítés 1.2. Vizsgálat 2. Részletes módszerek az R. solanacearum kimutatására és azonosítására tünetmentes burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövény-mintákban 2.1. Mintaelőkészítés 2.2. Vizsgálat IV. SZAKASZ: 1. Az R. solanacearum kimutatásának és azonosításának programja, vízben 2. Az R. solanacearum vízben történő kimutatásának és azonosításának módszerei 2.1. Mintaelőkészítés 2.2. Vizsgálat V. SZAKASZ: 1. Az R. solanacearum kimutatásának és azonosításának programja, talajban 2. Az R. solanacearum talajban történő kimutatásának és azonosításának módszerei 2.1. Mintaelőkészítés 2.2. Vizsgálat VI. SZAKASZ: Optimalizált protokollok az R. solanacearum kimutatására és azonosítására A. Diagnosztikai és kimutatási vizsgálatok 1. Áramlásvizsgálat a szárban 2. Poli-β-hidroxibutirát szemcsék kimutatása 3. Szerológiai agglutinációs vizsgálat 4. Szelektív izolálás 4.1. Szelektív lemeztenyésztés 4.2. Dúsítási eljárás 5. Immunofluorescence test (IF) 6. Polimeráz láncreakció teszt (PCR) 6.1. DNS-tisztítási módszerek a. A Pastrik-féle módszer (2000) b. Egyéb módszerek 6.2. PCR 6.3. A PCR termék elemzése 7. Fluorescent in-situ hybridization test (FISH) teszt 8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) tesztek a. Közvetett ELISA b. DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA 9. Biológiai vizsgálat B. Azonosítási vizsgálatok 1. Táplálkozási és enzimes azonosítási vizsgálat 2. IF-teszt 3. ELISA-teszt 4. PCR-teszt 5. FISH-teszt 6. Zsírsav-meghatározás (FAP) 7. A törzs jellemzésének módszerei 7.1. Biovariáns-meghatározás 7.2. Genom-ujjlenyomat készítés 7.3. PCR-módszerek C. Megerősítő vizsgálat 1. függelék A protokollok optimalizálásába és validálásába bevont laboratóriumok 2. függelék Az R. solanacearum izolálására és tenyésztésére szolgáló táptalajok 3. függelék A. Kereskedelmi forgalomban kapható standardizált kontrollanyag B. A kontrollok készítése 4. függelék Pufferek a vizsgálati eljárásokhoz 5. függelék A fertőzöttségi szint meghatározása az IF- és a FISH-próbában 6. függelék Validált PCR-protokollok és reagensek 7. függelék Validált reagensek a FISH-próbához 8. függelék A paradicsom és tojásgyümölcs termesztési feltételei Irodalomjegyzék

ÁLTALÁNOS ALAPELVEK

A különböző módszerek optimalizált protokolljai, a validált reagensek, valamint a vizsgálati- és a kontrollanyagok elkészítésének részletei megtalálhatók a függelékekben. A protokollok optimalizálásába és validálásába bevont laboratóriumok felsorolása az 1. függelékben található.

Mivel a protokollok egy zárlati károsító kimutatásával járnak, és életképes R. solanacearum tenyészetek kontrollanyagként történő felhasználását fogják magukban foglalni, szükséges lesz, hogy az eljárások elvégzésére megfelelő növény-egészségügyi zárlati feltételek mellett – beleértve a hulladék ártalmatlanítására szolgáló megfelelő berendezéseket –, valamint a hivatalos növény-egészségügyi zárlatért felelős hatóságok által kiállított megfelelő engedély feltételei szerint kerüljön sor.

A vizsgálati paramétereknek biztosítaniuk kell az R. solanacearum szintjének következetes és reprodukálható kimutatását a kiválasztott módszerek megadott küszöbértékein.

A pozitív kontrollok precíz elkészítése elengedhetetlenül szükséges.

A szükséges küszöbértékek szerinti vizsgálat ugyancsak magában foglalja az eszközök helyes beállítását, karbantartását és kalibrációját, a reagensek gondos kezelését és megőrzését, valamint minden olyan intézkedést, amely a minták közötti fertőződés megakadályozását szolgálja, pl. a pozitív kontrollok elválasztása a vizsgálati mintáktól. Az adminisztratív és egyéb hibák elkerülése érdekében minőségellenőrzési előírásokat kell alkalmazni, különösen a címkézés és a dokumentáció vonatkozásában.

A károsító előfordulásának a 98/57/EK irányelv 4. cikke (2) bekezdésében említett gyanúja feltételezi az alábbi folyamatábrában meghatározott mintán elvégzett diagnosztikai vagy szűrővizsgálatok pozitív eredményét. A pozitív első szűrővizsgálatot (IF-teszt, PCR/FISH, szelektív izolálás) meg kell erősíteni egy második szűrővizsgálattal, amely eltérő biológiai elven alapul.

Ha az első szűrővizsgálat pozitív, akkor az R. solanacearum-mal való fertőzöttség gyanúja fennáll, és egy második szűrővizsgálatot kell elvégezni. Ha a második szűrővizsgálat pozitív, akkor a gyanú megerősítésre került (gyanított előfordulás), és az eljárás szerinti vizsgálatokat kell lefolytatni. Ha a második szűrővizsgálat negatív, akkor úgy tekintik, hogy a minta nem fertőzött az R. solanacearum-mal.

A 98/57/EK irányelv 5. cikke (1) bekezdésében említett megerősített előfordulás feltételezi az R. solanacearum tiszta tenyészetének izolálását és azonosítását, beleértve a patogenitás megerősítését.

I. SZAKASZ

A VIZSGÁLATI PROGRAM ALKALMAZÁSA

1. Kimutatási program a barna rothadás és a baktériumos hervadás (R. solanacearum) diagnosztizálására burgonyagumókban, valamint a barna rothadás vagy a baktériumos hervadás tüneteit mutató burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövényekben.

A vizsgálati eljárás a barna rothadás vagy a vaszkuláris hervadás jellegzetes vagy gyanított tüneteit mutató burgonyagumók és -növények vizsgálatára szolgál. Tartalmaz egy gyors szűrővizsgálatot, a kórokozó izolálását fertőzött edénynyaláb szövetből (szelektív) táptalajon, és – pozitív eredmény esetén – a tenyészet azonosítását Ralstonia solanacearum-ként.

2. A Ralstonia solanacearum tünetmentes burgonyagumó-mintákban történő kimutatásának és azonosításának programja

Az alapelv:

A vizsgálati eljárás a lappangó fertőzések burgonyagumókban történő kimutatására szolgál. Legalább két – eltérő biológiai elven alapuló – szűrővizsgálat pozitív eredményét3 ki kell egészíteni a kórokozó izolálásával; ezt jellegzetes telepek izolálása esetén a tiszta tenyészet R. solanacearum-ként történő azonosítása követi. Mindössze egy szűrővizsgálat pozitív eredménye nem elegendő a minta gyanúsnak tekintéséhez.

A szűrővizsgálatoknak és az izolálási vizsgálatoknak lehetővé kell tenniük 103–104 sejt/ml újraszuszpendált pellet kimutatását, amely pozitív kontrollként kerül alkalmazásra minden egyes vizsgálati sorozatnál.

3. A Ralstonia solanacearum tünetmentes burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövény-mintákban történő kimutatásának és azonosításának programja

II. SZAKASZ

RÉSZLETES MÓDSZEREK A RALSTONIA SOLANACEARUM KIMUTATÁSÁRA BURGONYAGUMÓKBAN, VALAMINT A BARNA ROTHADÁS VAGY A BAKTÉRIUMOS HERVADÁS TÜNETEIT MUTATÓ BURGONYA-, PARADICSOM- VAGY EGYÉB GAZDANÖVÉNYEKBEN

1. Tünetek (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Tünetek burgonyában

A burgonyanövény. A fertőzés korai szakaszában a szántóföldön magas hőmérsékleten nappal a növénycsúcs tájékán a levelek hervadása jelentkezik, amit éjszakai regenerálódás követ. A hervadás korai szakaszában a levelek zöldek maradnak, de később elsárgulnak, és barna elhalás alakul ki. Epinasztia is jelentkezik. Egy hajtás vagy az egész növény hervadása gyorsan visszafordíthatatlanná válik, és a növény összeesését és elpusztulását eredményezi. Az elhervadt növények keresztirányban elvágott szárában lévő edénynyaláb-szövet rendszerint barna színű, és a metszéslapból összenyomással tejszerű baktériumnyálka szivárog ki vagy préselhető ki. Amikor az elvágott szárat függőlegesen vízbe helyezzük, nyálkafonalak áramlanak ki az edénynyaláb-kötegekből.

A burgonyagumó. A burgonyagumókat keresztirányban kell elvágni a köldökrész közelében vagy hosszirányban a köldökrész fölött. A fertőzés korai szakaszában az edénynyaláb-gyűrű üvegszerű sárgától világosbarnáig terjedő elszíneződése figyelhető meg, és az edénynyaláb gyűrűből spontán módon halvány krémszínű baktériumnyálka szivárog ki néhány perc elteltével. Később az edénynyaláb elszíneződése kifejezettebben barnává válik, és az elhalás kiterjedhet a parenchima-szövetre is. Az előrehaladott szakaszokban a fertőzés kifelé terjed a köldökrésztől és a szemektől, amelyekből baktériumnyálka szivároghat ki talajrészecskék odatapadását eredményezve. Vörösesbarna, kissé bemélyedő elváltozások jelenhetnek meg a héjon az edénynyaláb-szövetek belső összeomlása következtében. A betegség előrehaladott szakaszában általános a gombás vagy baktériumos lágyrothadás másodlagos kialakulása.

1.2. Tünetek paradicsomban

A paradicsomnövény. Az első látható tünet a legfiatalabb levelek hervadt megjelenése. A kórokozó számára kedvező környezeti feltételek mellett (talajhőmérséklet kb. 25 °C, telített páratartalom) a növény egyik oldalának vagy a teljes növénynek az epinasztiája vagy hervadása következik be néhány napon belül, amely a teljes növény összeeséséhez vezet. Kevésbé kedvező körülmények között (21 °C alatti talajhőmérséklet) a hervadás kisebb mértékű, de nagy számú mellékgyökér fejlődhet ki a száron. A szár tövétől induló átázott sávok figyelhetők meg, ami a vaszkuláris rendszerben bekövetkezett elhalást jelzi. Amikor a szárat keresztirányban elvágjuk, az elszíneződött barna edénynyaláb-szövetek fehér vagy sárgás baktériumnyálkát bocsátanak ki.

1.3. Tünetek egyéb gazdanövényekben

Solanum dulcamara és S. nigrum növények. Természetes feltételek mellett a hervadási tünetek ritkán figyelhetők meg ezeken a gazda-gyomnövényeken, hacsak a talajhőmérséklet nem emelkedik 25 °C fölé vagy az oltóanyag szintje nem szélsőségesen magas (pl. beteg paradicsom- vagy burgonyanövények közelében növő S. nigrum esetében). Amikor hervadás következik be, a tünetek a paradicsomnál leírtakkal megegyeznek. A vízben lévő szárral és gyökérzettel növő, nem hervadó S. dulcamara növények edénynyaláb-szövetei világosbarna elszíneződést mutathatnak a szár tövének vagy a víz alatti szárrészek keresztmetszetében. Baktériumnyálka szivároghat az elvágott edénynyaláb-szövetekből, vagy nyálkafonalakat képezhet, ha az elvágott szárat függőlegesen vízbe helyezzük, még a hervadási tünetek hiányában is.

2. Gyors szűrővizsgálatok

A gyors szűrővizsgálatok megkönnyíthetik a vélelmezett diagnózis felállítását, de nem nélkülözhetetlenek. Az alábbi validált vizsgálatok közül egyet vagy többet használjunk:

2.1. Áramlásvizsgálat a szárban

(Lásd a VI.A.1. szakaszt)

2.2. Poli-β-hidroxibutirát (PHB) szemcsék kimutatása

Az R. solanacearum sejtjeiben lévő jellegzetes PHB szemcsék a fertőzött szövetből vett baktériumnyálka tárgylemezre hővel rögzített kenetének níluskék „A” vagy szudánfekete festésével tehetők láthatóvá (Lásd a VI.A.2. szakaszt).

2.3. Szerológiai agglutinációs vizsgálat

(Lásd a VI.A.3. szakaszt)

2.4. Egyéb vizsgálatok

A további megfelelő gyors szűrővizsgálatok közé tartozik az IF-teszt (lásd: a VI.A.5. szakaszt), a FISH-teszt (lásd a VI.A.7. szakaszt), az ELISA-teszt (lásd: a VI.A.8. szakaszt) és a PCR-teszt (lásd a VI.A.6. szakaszt).

3. Izolálási eljárás

a) Távolítsuk el a nyálkát vagy az elszíneződött szövetet tartalmazó részeket a burgonyagumó edénynyaláb gyűrűjéből, illetve a burgonya-, a paradicsom- vagy egyéb hervadó gazdanövények szárában lévő edénynyaláb-kötegekből. Szuszpendáljuk kis mennyiségű steril desztillált vízben vagy 50 mM foszfátpufferben (4. függelék), és hagyjuk 5–10 percig állni.

b) Készítsünk a szuszpenzióból tízes léptékű hígítássorozatot.

c) Vigyük át a szuszpenzió 50–100 µl-jét és a hígításokat egy általános táptalajra (NA, YPGA vagy SPA; lásd a 2. függeléket) és/vagy a Kelman-féle tetrazóliumos táptalajra (2. függelék) és/vagy egy validált szelektív táptalajra (pl. SMSA; lásd a 2. függeléket). Szélesztés bottal vagy kaccsal a megfelelő hígításos lemeztenyésztési technika használatával. Ha hasznosnak ítéljük, készítsünk külön lemezeket a 2. biovariánsba tartozó R. solanacearum higított sejtszuszpenziójával pozitív kontrollnak.

d) Inkubáljuk a lemezeket 2–6 napig 28 °C hőmérsékleten. — Az általános táptalajon az R. solanacearum virulens izolátumai gyöngyházfényű, krémfehér, lapos, szabálytalan alakú és folyadékszerű telepeket hoznak létre, középpontjukban gyakran jellegzetes spirálokkal. Az R. solanacearum avirulens formái kicsi, kerek, nem folyékony, vajszerű telepeket képeznek, melyek teljes egészükben krémfehérek. — A Kelman-féle tetrazóliumos táptalajon és az SMSA táptalajon a spirálok vérvörös színűek. A Ralstonia solanacearum avirulens formái kicsi, kerek, nem folyékony, vajszerű telepeket képeznek, melyek teljes egészükben mélyvörösek.

4. Az R. solanacearum Azonosítási vizsgálatai

Az R. solanacearum vélelmezett izolátumai azonosságának megerősítésére szolgáló vizsgálatok a VI.B. szakaszban kerülnek bemutatásra.

III. SZAKASZ

1. Részletes módszerek a Ralstonia solanacearum kimutatására és azonosítására tünetmentes burgonyagumó-mintákban

1.1. Mintaelőkészítés

Megjegyzés:

— A standard mintaméret 200 burgonyagumó vizsgálatonként. Intenzívebb mintavétel esetén több vizsgálatot kell elvégezni ekkora mintákon. Ha ennél több burgonyagumót tartalmaz a minta, az gátláshoz vagy nehezen értelmezhető eredményekhez vezet. Az eljárás azonban könnyen alkalmazható 200-nál kevesebb burgonyagumóból álló mintákra is, amennyiben kevesebb burgonyagumó áll rendelkezésre.

— Az alábbiakban leírt valamennyi kimutatási módszer validálása 200 burgonyagumóból álló minták vizsgálatán alapszik.

— Az alábbiakban leírt burgonyakivonat felhasználható a burgonya gyűrűs rothadás baktérium, a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus kimutatására is.

A mintaelőkészítést megelőző, szabadon választható előkezelés:

a) Inkubáljuk a mintákat 25–30 °C-on két hétig a vizsgálat előtt az R. solanacearum populációk szaporodásának elősegítése érdekében.

b) Mossuk le a burgonyagumókat. Megfelelő fertőtlenítőszereket (a PCR-teszt alkalmazása esetén klórvegyületeket a kórokozó DNS-ek eltávolítása céljából) és mosószereket használjunk az egyes minták között. Levegőn szárítsuk meg a burgonyagumókat. Ez a lemosási eljárás különösen akkor hasznos (de nem kötelező), ha a minták földesek, és ha PCR-próbát vagy közvetlen izolálási eljárást kell alkalmazni.

1.1.1. Távolítsuk el tiszta, fertőtlenített szikével vagy gyümölcskéssel a burgonyagumó köldökrészén a héjat úgy, hogy az edénynyaláb-szövetek láthatóvá váljanak. Óvatosan vágjunk ki egy kis darabot az edénynyaláb-szövetből a köldökrészen, és tartsuk a nem edénynyaláb-szövet mennyiségét minimális szinten. (Lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Megjegyzés: Tegyük félre a feltételezett tüneteket mutató (rothadó) burgonyagumókat, és vizsgáljuk azokat külön. Ha a köldökrészből vett darab eltávolítása során a barna rothadás alapvető feltételezett tünetei észlelésére kerül sor, akkor el kell végezni az adott burgonyagumó szemrevételezéses vizsgálatát, majd a köldökrész közelében elvágjuk a gumót. A feltételezett tüneteket mutató, elvágott gumókat szobahőmérsékleten kell tartani legalább 2 napig a parásodás lehetővé tétele érdekében, majd hűtőszekrényben tárolni (4–10 °C között) megfelelő növény-egészségügyi zárlati feltételek mellett. Minden burgonyagumót, beleértve a gyanús tüneteket mutatókat is, a III. melléklet szerint kell tárolni.

1.1.2. A köldökrészből vett darabokat még nem használt, becsukható és/vagy lezárható egyszer használatos tartályokban gyűjtsük össze (amennyiben a tartályok ismét felhasználásra kerülnek, akkor azokat alaposan ki kell tisztítani, és klórvegyületekkel fertőtleníteni kell). A köldökrészből vett darabokat lehetőleg azonnal fel kell dolgozni. Ha ez nem lehetséges, akkor azokat a tartályban kell tárolni, puffer hozzáadása nélkül, hűtött állapotban legfeljebb 72 órán át vagy szobahőmérsékleten legfeljebb 24 órán át vagy dolgozzuk fel a köldökrészből vett darabokat a következő eljárások egyikével: a) Töltsünk a darabokra megfelelő mennyiségű (mintegy 40 ml) kivonópuffert (4. függelék), és rázzuk rotációs rázógépen (50–100 fordulat/perc) 4 órán át 24 °C alatt, vagy 16–24 órán át hűtött állapotban. b) Homogenizáljuk a darabokat megfelelő mennyiségű (mintegy 40 ml) kivonópufferrel (4. függelék) aprítógépben (pl. Waring vagy Ultra Thurax), vagy lezárt, egyszer használatos macerációs tasakban (pl. Stomacher vagy Bioreba, erős guage polietilén, 150 mm × 250 mm; sugárzással sterilizált) gumikalapáccsal vagy megfelelő zúzóberendezéssel (pl. Homex) történő összezúzás útján. Megjegyzés: A minták keresztbe fertőződésének nagy a veszélye az aprítógépben történő homogenizálás esetén. Tegyünk óvintézkedéseket az aeroszol képződés és a kilöttyenés elkerülése érdekében a kivonási eljárás során. Biztosítsuk, hogy frissen sterilizált aprítókések és edények kerüljenek felhasználásra minden mintánál. A PCR-teszt elvégzésekor, kerüljük el a DNS-ek áthozatalát a tartályokon vagy a zúzóberendezésen. A PCR alkalmazásánál az egyszer használatos tasakokban történő összezúzás és egyszer használatos kémcsövek használata ajánlott.

1.1.3. Fejtsük le a felülúszó folyadékot. Ha nagyon zavaros, derítsük lassú centrifugálással (legfeljebb 180 g-vel, 10 percig, 4–10 °C közötti hőmérsékleten) vagy vákuumszűréssel (40–100 µm) a szűrőt további (10 ml) kivonópufferrel átmosva.

1.1.4. Koncentráljuk a baktérium frakciót 7 000 g-vel 15 percig (vagy 10 000 g-vel 10 percig) tartó centrifugálással 4–10 °C közötti hőmérsékleten, és távolítsuk el a felülúszó folyadékot a pellet felkavarása nélkül.

1.1.5. Szuszpendáljuk újra a pelletet 1,5 ml pellet-pufferben (4. függelék). Használjunk 500 µl-t az R. solanacearum vizsgálatához, 500 µl-t a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus-hoz és 500 µl-t referencia célokra. Adjunk steril glicerint, melynek végkoncentrációja 10–25 % (v/v), a referencia aliquot 500 µl-éhez és a fennmaradó vizsgálati aliquothoz, Vortex-szel keverjük össze, és tároljuk 16 és –4 °C között (hetekig) vagy 68 és 86 °C között (hónapokig). A vizsgálat során a vizsgálati aliquotokat 4–10 °C-on tartsuk. A többszöri lefagyasztás és felengedés nem ajánlott. Ha szükséges a kivonat szállítása, akkor biztosítsuk, hogy a szállítás hűtőtáskában történjen 24–48 órán belül.

1.1.6. Rendkívül fontos, hogy az összes R. solanacearum pozitív kontrollt és mintát külön kezeljük a fertőzés elkerülése érdekében. Ez vonatkozik az IF-lemezekre és minden vizsgálatra.

1.2. Vizsgálat

Lásd a folyamatábrát, valamint a vizsgálatok és az optimalizált protokollok leírását a vonatkozó függelékekben:

Szelektív izolálás (lásd a VI.A.4. szakaszt)

IF-teszt (lásd a VI.A.5. szakaszt)

PCR-teszt (lásd a VI.A.6. szakaszt)

FISH-teszt (lásd a VI.A.7. szakaszt)

ELISA-teszt (lásd a VI.A.8. szakaszt)

Biológiai vizsgálat (lásd a VI.A.9. szakaszt)

2. Részletes módszerek az R. solanacearum kimutatására és azonosítására tünetmentes burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövény-mintákban

2.1. Mintaelőkészítés

Megjegyzés: A látens R. solanacearum populációk kimutatásához összetett minták vizsgálata ajánlott. Az eljárás könnyen alkalmazható a legfeljebb 200 szárdarabból álló összetett mintákra. Amennyiben vizsgálatokat végzünk, azoknak a vizsgálat alatt álló növénypopuláció statisztikailag reprezentatív mintáján kell alapulniuk.

2.1.1. Gyűjtsünk 1–2 cm-es szárdarabokat egy zárt és steril tartályban a következő mintavételi eljárásoknak megfelelően: Paradicsompalánták a palántaneveldében: Tiszta, fertőtlenített késsel távolítsunk el mindegyik szár tövéből – közvetlenül a földfelszín felett – egy 1 cm-es darabot. Szántóföldi vagy üvegházi paradicsomnövények: Tiszta, fertőtlenített késsel távolítsuk el mindegyik növény legalsó oldalhajtását úgy, hogy levágjuk azt közvetlenül a főszárba való becsatlakozási pont felett. Távolítsuk el a legalsó 1 cm-es darabot mindegyik oldalhajtásról. Egyéb gazdanövények: Tiszta, fertőtlenített késsel vagy metszőollóval távolítsunk el egy 1 cm-es darabot mindegyik szár tövéből közvetlenül a földfelszín felett. Az S. dulcamara vagy más vízben növő gazdanövény esetében távolítsunk el 1–2 cm-es szakaszokat a víz alatti szárakból vagy vízi gyökerekkel rendelkező indákból. Egy adott helyszínen végzett mintavétel esetén ajánlott a mintavételi helyenként minden egyes lehetséges gazda gyomnövény legalább 10 egyedéből álló statisztikailag reprezentatív minta vizsgálata. A kórokozó kimutatása késő tavasszal, nyáron és ősszel lesz a legmegbízhatóbb, bár a természetes fertőzések egész évben kimutathatók az évelő Solanum dulcamara-ban, amely vízfolyásokban nő. Az ismert gazdanövények közé tartoznak az árvakelésű burgonyanövények, a Solanum dulcamara, az S. nigrum, a Datura stramonium és a Solanaceae család más tagjai. További gazdanövények a Pelargonium fajok és a Portulaca oleracea. A következő európai gyomfajok potenciális befogadói lehetnek az R. solanacearum 2. biovariánsba/3. rasszba tartozó populációinak a gyökérben és/vagy a gyökérzónában speciális környezeti feltételek mellett: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra és Urtica dioica. Megjegyzés: A belső tünetekre (edénynyalábok elszíneződése, baktériumnyálka) irányuló szemrevételezéses vizsgálatot ebben a szakaszban lehet elvégezni. Tegyük félre a tüneteket mutató szárdarabokat, és vizsgáljuk azokat külön (lásd a II. szakaszt).

2.1.2. Fertőtlenítsük rövid ideig a szádarabokat 70 %-os etil-alkohollal, és itatóspapíron azonnal itassuk szárazra azokat. Majd dolgozzuk fel a szárdarabokat az alábbi eljárások egyikével: a) Töltsünk a darabokra megfelelő mennyiségű (mintegy 40 ml) kivonópuffert (4. függelék), és rázzuk rotációs rázógépen (50–100 rpm) 4 órán át 24 °C alatt, vagy hűtötten 16–24 órán át, vagy b) Azonnal dolgozzuk fel a darabokat erős macerációs tasakban (pl. Stomacher vagy Bioreba) történő összezúzás útján megfelelő mennyiségű kivonópuffer hozzáadásával (4. függelék) gumikalapács vagy megfelelő zúzóberendezés (pl. Homex) felhasználásával. Ha ez nem lehetséges, tároljuk a szárdarabokat hűtve legfeljebb 72 órán át, vagy legfeljebb 24 órán át szobahőmérsékleten.

2.1.3. Fejtsük le a felülúszó folyadékot 15 perces ülepítés után.

2.1.4. A kivonat további derítése vagy a baktérium frakció koncentrálása általában nem szükséges, de szűréssel és/vagy centrifugálással elérhető III.1.1.3–1.1.5. szakaszban leírtak szerint.

2.1.5. Osszuk a híg vagy koncentrált mintakivonatot két egyenlő részre. Az egyik felét tartsuk 4–10 °C között a vizsgálat során, a másik felét pedig tároljuk 10–25 % (v/v) steril glicerinben 16 és 24 °C között (hetekig) vagy 68 és 86 °C között (hónapokig), arra az esetre, ha további vizsgálatokat kell végezni.

2.2. Vizsgálat

Lásd a folyamatábrát, valamint a vizsgálatok és az optimalizált protokollok leírását a vonatkozó függelékekben:

Szelektív izoláció (lásd a VI.A.4. szakaszt)

IF-teszt (lásd a VI.A.5. szakaszt)

PCR-teszt (lásd a VI.A.6. szakaszt)

FISH-teszt (lásd a VI.A.7. szakaszt)

ELISA-teszt (lásd a VI.A.8. szakaszt)

Biológiai vizsgálat (lásd a VI.A.9. szakaszt)

IV. SZAKASZ

1. Az R. solanacearum vízben történő kimutatásának és azonosításának programja

2. Az R. solanacearum vízben történő kimutatásának és azonosításának módszerei

Az alapelv

Az ebben a szakaszban leírt validált kimutatási módszer a kórokozó felszíni vizekből vett mintákban történő kimutatására alkalmazható, és ugyancsak alkalmazni lehet a burgonya-feldolgozásból vagy a szennyvízhálózatból származó szennyvízből vett minták vizsgálatára. Azt azonban fontos megjegyezni, hogy a kimutatás várt érzékenysége az anyagtól függően változni fog. Az izolálási vizsgálat érzékenységét befolyásolják a kompetitív szaprofita baktériumok populációi, amelyek általában sokkal népesebbek a burgonya-feldolgozásból és a szennyvízhálózatból származó szennyvízben, mint a felszíni vizekben. Mivel az alábbi módszerrel szemben literenként mintegy 103 sejt kimutatása az elvárás a felszíni vizek esetében, a kimutatás érzékenysége valószínűleg jelentősen alacsonyabb lesz a burgonya-feldolgozásból vagy a szennyvízhálózatból származó szennyvíz esetében. Ezért a szennyvizek vizsgálatát ajánlott valamilyen tisztítási eljárás (pl. ülepítés vagy szűrés) után végezni, melynek során csökken a szaprofita baktérium populációk száma. A vizsgálati módszer érzékenységének korlátait figyelembe kell venni a kapott negatív eredmények megbízhatóságának megállapításánál. Mivel ezt a módszert sikerrel használják a felméréseknél a kórokozó jelenlétének vagy hiányának felszíni vizekben történő kimutatására, a korlátaival tisztában kell lennünk, amikor a burgonya-feldolgozásból vagy szennyvízhálózatból származó szennyvizeken végzett hasonló felméréseknél alkalmazzuk.

2.1. Mintaelőkészítés

Megjegyzés:

— Az R. solanacearum felszíni vizekben történő kimutatása késő tavasszal, nyáron és ősszel a legmegbízhatóbb, amikor a vízhőmérséklet meghaladja a 15 °C-ot.

— A fent említett időszak különböző időpontjaiban a kijelölt mintavételi helyeken végzett ismételt mintavétel növeli a kimutatás megbízhatóságát a klimatikus ingadozás hatásainak csökkentése révén.

— Vegyük figyelembe a heves esőzések és a vízfolyás földrajzi adottságainak hatását a nagyarányú hígulási hatás kiküszöbölése érdekében, melynek következtében rejtve maradhat a kórokozó jelenléte.

— A gazdanövények közelében vegyünk mintát a felszíni vizekből, ha azok előfordulnak.

2.1.1. A kiválasztott mintavételi helyeken egyszer használatos, steril kémcsövekbe vagy üvegekbe gyűjtsük a vízmintákat, ha lehetséges, 30 cm-nél mélyebbről és a parttól számított 2 méteren belülről. A feldolgozóipari és a szennyvízhálózati szennyvizek esetében a szennyvízkibocsátás helyén gyűjtsük a mintákat. Az ajánlott mintaméret 500 ml mintavételi helyenként. Ha a kisebb mintákat részesítjük előnyben, akkor ajánlatos mintavételi helyenként legalább 3 alkalommal mintát venni, és az egyes minták 2 legalább 30 ml-es megismételt részmintából álljanak. Az intenzív felméréseknél legalább 3 mintavételi helyet jelöljünk ki 3 kilométerenként a vízfolyás mentén, és gondoskodjunk arról, hogy a vízfolyásba ömlő mellékfolyókban is történjen mintavételezés.

2.1.2. A mintákat hűvösben és sötétben (4–10 °C) szállítsuk, és 24 órán belül vizsgáljuk meg

2.1.3. Ha szükséges, a baktériumfrakciót koncentrálhatjuk az alábbi módszerek egyikével: a) Centrifugáljunk 30–50 ml részmintát 10 000 g-vel 10 percig (vagy 7 000 g-vel 15 percig) lehetőleg 4–10 °C között, távolítsuk el a felülúszó folyadékot, szuszpendáljuk újra a pelletet 1 ml pellet-pufferben (4. függelék). b) Membránszűrés (minimális pórusméret 0,45 µm), majd a szűrő kimosása 5–10 ml pelletpufferben, és a mosástermékek megtartása. Ez a módszer alkalmazható kevés szaprofitát tartalmazó nagy mennyiségű víznél. A koncentrálás rendszerint nem ajánlott a burgonya-feldolgozásból vagy a szennyvízhálózatból származó szennyvízminták esetében, mivel a kompetitív szaprofita baktériumok megnövekedett populációi meg fogják gátolni a R. solanacearum kimutatását.

2.2. Vizsgálat

Lásd a folyamatábrát, valamint a vizsgálatok leírását a vonatkozó függelékekben.

V. SZAKASZ

1. Az R. solanacearum talajban történő kimutatásának és azonosításának programja

2. Az R. solanacearum talajban történő kimutatásának és azonosításának módszerei

Az alapelvek

Az ebben a szakaszban leírt validált kimutatási módszer a kórokozó talajmintákban történő kimutatásánál alkalmazható, de ugyancsak alkalmazni lehet a szilárd burgonya-feldolgozási hulladék vagy a szennyvíziszap vizsgálatára. Meg kell azonban jegyezni, hogy ezek a módszerek nem kellően érzékenyek ahhoz, hogy garantálják az alacsony egyedszámú és/vagy szabálytalan eloszlású R. solanacearum populációk kimutatását, amelyek előfordulhatnak ezen anyagok természetes úton fertőződött mintáiban.

A vizsgálati módszer érzékenységének korlátait figyelembe kell venni a kapott negatív eredmények megbízhatóságának megállapításánál, és akkor is, amikor a kórokozó jelenlétének vagy hiányának talajban vagy szennyvíziszapban történő kimutatására használják. A kórokozó jelenlétének a szántóföld talajában történő kimutatására a legmegbízhatóbb vizsgálati módszer az, hogy elültetünk egy fogékony gazdanövényt, és figyeljük rajta a fertőzés megjelenését, de még ezzel a módszerrel sem lehet kimutatni a kismértékű fertőzéseket.

2.1. Mintaelőkészítés

2.1.1. A szántóföld talajából történő mintavételnek a fonalférgek kimutatása céljából történő mintavételnél alkalmazott standard elvek szerint kell történnie. Gyűjtsünk mintánként 0,5–1 kg talajt 60 helyről 0,3 hektáronként 10–20 cm mélyről (vagy egy 7x7 méteres négyzethálóban). Ha feltételezzük a kórokozó előfordulását, akkor növeljük a gyűjtőhelyek számát 120-ra 0,3 hektáronként. Tartsuk a mintákat 12–15 °C-on a vizsgálat előtt. A burgonya-feldolgozásból és a szennyvízhálózatból származó szennyvíziszapokból történő mintavétel esetén összesen 1 kg-nyi mintát vegyünk a vizsgálandó szennyvíziszap teljes mennyiségét reprezentáló helyeken. Minden mintát jól keverjünk össze a vizsgálat megkezdése előtt.

2.1.2. Oszlassuk szét a 10–25 g talajt vagy szennyvíziszapot tartalmazó részmintákat rotációs rázógépen (250 fordulat/perc) 60–150 ml kivonópufferben (4. függelék) 2 órán át. Ha szükséges, 0,02 % steril Tween-20 és 10–20 g steril kavics hozzáadásával elősegíthetjük a szétoszlatást.

2.1.3. Tartsuk a szuszpenziót 4 °C-on a vizsgálat során.

2.2. Vizsgálat

Lásd a folyamatábrát, valamint a vizsgálatok leírását a vonatkozó függelékekben.

VI. SZAKASZ

OPTIMALIZÁLT PROTOKOLLOK AZ R. SOLANACEARUM KIMUTATÁSÁRA ÉS AZONOSÍTÁSÁRA

A. DIAGNOSZTIKAI ÉS KIMUTATÁSI VIZSGÁLATOK

1. Áramlásvizsgálat a szárban

A R. solanacearum hervadó burgonya-, paradicsom- vagy egyéb gazdanövények szárában való jelenlétét a következő egyszerű valószínűsítő vizsgálattal határozhatjuk meg: vágjuk el a szárat közvetlenül a talajszint felett. Állítsuk a metszéslapot egy tiszta vízzel teli kémcsőbe. Néhány perc múlva megfigyelhető a baktériumnyálka-fonalak jellegzetes spontán kiáramlása az átvágott edénynyaláb kötegekből.

2. Poli-β-hidroxibutirát szemcsék kimutatása

1. Készítsünk kenetet a fertőzött szövetből vagy a YPGA vagy SPA táptalajon (2. függelék) nyert 48 órás tenyészetből származó baktériumnyálkából egy tárgylemezen.

2. Készítsünk pozitív kontrollkeneteket az R. solanacearum valamely 2. biovariánsba tartozó törzséből, és – ha ezt hasznosnak véljük – egy negatív kontrollkenetet egy közismert PHB-negatív törzsből.

3. Hagyjuk levegőn megszáradni, majd a tárgylemezek alsó felületét gyorsan vigyük át láng felett, hogy a kenet rögzüljön.

4. Festékkészítés níluskékkel vagy szudánfeketével, és mikroszkópos megfigyelés az alábbiakban leírtak szerint:

A níluskék vizsgálat:

a) Öntsünk minden tárgylemezre níluskék „A” 1 %-os vizes oldatot, és 10 percig inkubáljuk 55 °C-on.

b) Öntsük le a festékoldatot. Mossuk le gyengén folyó csapvízzel. Távolítsuk el a felesleges vizet itatóspapírral.

c) Öntsük le kenetet ecetsav 8 %-os vizes oldatával, és inkubáljuk egy percig szobahőmérsékleten.

d) Gyorsan öblítsük le gyengén folyó csapvízzel. Távolítsuk el a felesleges vizet itatóspapírral.

e) Nedvesítsük meg újra egy csepp vízzel, és tegyünk rá fedőlemezt.

f) Vizsgáljuk meg a megfestett kenetet epifluoreszcens mikroszkóppal 450 nm hullámhosszon, olajimmerzió mellett, 600–1 000-szeres nagyításnál, olaj- vagy vízimmerziós tárgylencsével.

g) Figyeljük meg a PHB-szemcsék élénk narancsszínű fluoreszkálását. Tanulmányozzuk átbocsátott normál fénynél is, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a szemcsék intracellulárisak, és a sejtmorfológia az R. solanacearum-ra jellemző.

A szudánfekete vizsgálat:

a) Öntsünk minden tárgylemezre 0,3 %-os szudánfekete „B” 70 %-os etil-alkoholos oldatát, és inkubáljuk 10 percig szobahőmérsékleten.

b) Öntsük le a festékoldatot, és öblítsük le kissé csapvízzel, majd a felesleges vizet itatóspapírral távolítsuk el.

c) Merítsük a tárgylemezeket rövid időre xilolba, és itassuk szárazra itatóspapírral. Vigyázat: a xilol veszélyes anyag, tegyük meg a szükséges óvintézkedéseket, és dolgozzunk vegyifülkében!

d) Öntsünk a tárgylemezekre 0,5 %-os (m/v) vizes szafranin oldatot, és hagyjuk 10 másodpercig szobahőmérsékleten. Vigyázat: a szafranin veszélyes anyag, tegyük meg a szükséges óvintézkedéseket, és dolgozzunk vegyifülkében!

e) Öblítsük le gyengén folyó csapvízzel, itassuk szárazra szűrőpapíron, és tegyünk rá fedőlemezt.

f) Tanulmányozzuk a megfestett keneteket átbocsátott fénnyel működő fénymikroszkóppal, olajimmerzió mellett, 1 000-szeres nagyításnál, olajimmerziós tárgylencsével.

g) Figyeljük meg, hogy a PHB-szemcsék az R. solanacearum sejtekben kékesfeketére színeződnek, a sejtfal pedig rózsaszínűre festődik.

3. Szerológiai agglutinációs vizsgálat

Az R. solanacearum sejtek agglutinációját baktériumnyálkában vagy tüneteket mutató szövetek kivonataiban legjobban validált ellenanyagok (lásd a 3. függeléket) felhasználásával figyelhetjük meg, melyek megfelelő színes markerrel vannak megjelölve, mint például vörös Staphylococcus aureus sejtekkel vagy színes latex szemcsékkel. A kereskedelmi forgalomban kapható készlet (lásd a 3. függeléket) használata esetén, kövessük a gyártó útmutatásait. Egyébként végezzük el a következő eljárást:

a) Keverjük össze a megjelölt ellenanyag szuszpenziójának cseppjeit a baktériumnyálkával (mindegyik hozzávetőlegesen 5 µl) több mintahelyes vizsgálati lemezek ablakaiban.

b) Készítsünk pozitív és negatív kontrollokat az R. solanacearum 2. biovariánsába tartozó törzs és egy heterológ törzs szuszpenzióinak a felhasználásával.

c) Figyeljük meg az agglutinációt a pozitív mintákban 15 másodpercig tartó enyhe keverés után.

4. Szelektív izolálás

4.1. Szelektív lemeztenyésztés

Megjegyzés: Mielőtt először használjuk ezt a módszert, végezzünk előzetes vizsgálatokat, hogy biztosítsuk a korábbi vizsgálatokban negatívnak bizonyult minták kivonataihoz adott 103–104/ml R. solanacearum telepalkotó egység kimutatásának reprodukálhatóságát.

Használjunk megfelelően validált szelektív táptalajt, mint például a SMSA-t (Elphinstone et al. által módosított, 1996; lásd a 2. függeléket).

Ügyelni kell az R. solanacearum megkülönböztetésére a táptalajon telepeket létrehozni képes egyéb baktériumoktól. Továbbá az R. solanacearum telepei mutathatnak atipikus morfológiát, ha a táptalaj lemezek túlzsúfoltak, vagy antagonisztikus baktériumok is jelen vannak. Amennyiben a verseny vagy az antagonizmus hatásai gyaníthatók, a mintát újra kell vizsgálni egy másik vizsgálati eljárással.

A legmagasabb kimutatási érzékenység ezzel a módszerrel akkor várható, ha frissen készített mintakivonatokat használunk. A módszer azonban alkalmazható olyan mintáknál is, amelyeket glicerinben tároltak 68és86 °C között.

Pozitív kontroll céljára készítsünk tízes léptékű hígításokat egy virulens, 2. biovariánsba tartozó R. solanacearum törzs (pl. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 cfu/ml szuszpenziójából. A fertőzés bármely lehetőségének kiküszöbölése érdekében, a pozitív kontrollokat a vizsgálandó mintáktól teljesen elkülönítve készítsük el.

A szelektív táptalaj minden egyes újonnan készített tétele esetében meg kell vizsgálni, hogy az megfelel-e a kórokozó szaporodásához, mielőtt a rutin minták vizsgálatánál felhasználásra kerülne.

A kontrollanyagot a mintával/mintákkal azonos módon vizsgáljuk.

4.1.1. Használjunk megfelelő hígításos lemeztenyésztési technikát annak biztosítása érdekében, hogy a háttérben lévő szaprofita telepalkotó populációk kihígítódjanak. Lemezenként szélesszünk 50–100 µl-t a mintakivonatból és az egyes hígításokból.

4.1.2. Inkubáljuk a lemezeket 28 °C-on. Olvassuk le a lemezeket 48 óra elteltével, majd azt követően naponta 6 napon át. A jellemző R. solanacearum telepek SMSA-táptalajon tejfehérek, laposak, szabálytalanok és elfolyósodottak, és 3 napos inkubáció után a közepükön a rózsaszíntől a vérvörösig terjedő elszíneződés alakul ki, melynek belsejében csíkok és spirálok mutatkoznak. (Lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Megjegyzés: Néha kifejlődnek ezen a táptalajon az R. solanacearum atipikus telepei. Ezek kicsik, kerekek, színük teljesen vörös és nincsenek elfolyósodva, vagy csak részben elfolyósodottak, és ezért nehéz megkülönböztetni azokat a szaprofita telepalkotó baktériumoktól.

4.1.3. Tisztítsuk a vélelmezett R. solanacearum telepeket szélesztés vagy hígításos lemeztenyésztés után általános táptalajon, hogy izolált telepeket kapjunk (lásd a 2. függeléket).

4.1.4. Tároljuk a tenyészeteket rövid távon steril vízben (pH 6-8, klórmentes) szobahőmérsékleten és sötétben, vagy hosszú távon megfelelő mélyhűtéstől védő közegben 68 és 86 °C között vagy liofilizálva.

4.1.5. Azonosítsuk a vélelmezett tenyészeteket (lásd a VI.B. szakaszt), és végezzük el a patogenitás vizsgálatot (lásd a VI.C. szakaszt).

A szelektív lemeztenyésztési vizsgálat negatív, ha baktériumtelepek nem figyelhetők meg 6 nap után, vagy ha az R. solanacearum-ra jellemző vélelmezett telepek nem kerülnek izolálásra, feltéve, hogy a más baktériumok általi verseny vagy antagonizmus okozta gátlás gyanúja nem merül fel, és hogy, jellemző R. solanacearum telepek kerülnek izolálásra a pozitív kontrollokban. A szelektív lemeztenyésztési vizsgálat pozitív, ha vélelmezett R. solanacearum telepek kerülnek izolálásra.

4.2. Dúsítási eljárás

Használjunk validált dúsítási táptalajt, mint például módosított Wilbrink-táplevest (lásd a 2. függeléket).

Az eljárás az R. solanacearum populációk szelektív növesztésére használható a mintakivonatokban, valamint a kimutatás érzékenységének növelésére. Az eljárás a PCR-reakció gátlóit is hatékonyan hígítja (1:100). Meg kell jegyezni azonban, hogy az R. solanacearum dúsítása sikertelen lehet a szaprofita szervezetek által okozott verseny vagy antagonizmus következtében, melyek dúsulása gyakran párhuzamosan bekövetkezik. Emiatt az R. solanacearum izolálása a dúsított tápleves tenyészetekből nehézkes lehet. Továbbá, mivel a szerológiailag rokon szaprofiták populációi növekedhetnek, a specifikus monoklonális ellenanyagok használata ajánlott a poliklonális ellenanyagokkal szemben, amennyiben ELISA-teszt alkalmazására kerül sor.

4.2.1. Dúsítási PCR céljára vigyünk át 100 µl mintakivonatot 10 ml dúsítási táplevesbe (2. függelék), melyből korábban aliquot részeket mértünk DNS-mentes kémcsövekbe vagy lombikokba. Dúsítási ELISA céljára nagyobb arányban tartalmazhat mintakivonatot a tápleves (pl. 100 µl mintakivonat 1,0 ml dúsítási táplevesben).

4.2.2. Inkubáljuk 72 órán át 27 és 30 °C között rázótenyészetben vagy statikus tenyészetben, a kupakokat lazán illesztve a levegőzés biztosítása érdekében.

4.2.3. Jól keverjük össze mielőtt az ELISA- vagy a PCR-vizsgálatoknál felhasználjuk.

4.2.4. A dúsított táplevest ugyanúgy kezeljük, mint a mintá(ka)t a fenti vizsgálatokban. Megjegyzés: Ha az R. solanacearum dúsulásának a gátlása várható – bizonyos kompetitív szaprofita baktériumok népes populációinak következtében – akkor a mintakivonatok bármilyen centrifugálás vagy egyéb koncentrálás előtti dúsítása jobb eredményeket adhat.

5. IF-teszt

Az alapelv

Az IF-teszt elsőszámú szűrővizsgálatként történő használata ajánlott, mivel bizonyított erőteljessége a szükséges küszöbértékek elérésében.

Amennyiben az IF-tesztet használjuk elsőszámú szűrővizsgálatként, és az IF eredménye pozitív, második szűrővizsgálatként el kell végezni az izolálási, a PCR- vagy a FISH-vizsgálatot. Amennyiben az IF-tesztet második szűrővizsgálatként használjuk, és az IF eredménye pozitív, további vizsgálatra van szükség a folyamatábrának megfelelően az elemzés befejezéséhez.

Megjegyzés: Az R. solanacearum validált forrásból származó ellenanyagait használjuk (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Ajánlott a titert minden egyes új ellenanyag tételre meghatározni. A titer úgy van definiálva, hogy az a legmagasabb hígítás, melyen optimális reakció megy végbe az R. solanacearum homológ törzsének 105–106 sejt/ml-es szuszpenziója vizsgálatánál a megfelelő fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugátumnak a gyártó ajánlásai szerint történő felhasználása esetén. A validált poliklonális antiszérumok mindegyike legalább 1:2 000-es IF-titerű volt. A vizsgálat során az ellenanyagokat a titerhez közeli vagy az azzal megegyező munkahígítás(ok)ban kell használni.

A vizsgálatot frissen készített mintakivonatokon kell elvégezni. Szükség esetén sikeresen elvégezhető 68 és 86 °C között glicerin alatt tárolt kivonatokon. A glicerin 1 ml pellet-puffer hozzáadásával (4. függelék) eltávolítható a mintáról, újracentrifugálás 15 percen át 7 000 g-vel, és újraszuszpendálás azonos térfogatú pellet-pufferben. Ez gyakran nem szükséges, különösen, ha a mintalemezeken a mintákat láng segítségével rögzítjük.

Készítsünk külön pozitív kontroll-lemezeket a homológ törzsből vagy az R. solanacearum bármely más referenciatörzséből, burgonyakivonatban – a 3. B. függelékben leírtak szerint – és szabadon választhatóan pufferben szuszpendálva.

Természetes úton fertőződött (liofilizálással vagy 16 és 24 °C közötti fagyasztással fenntartott) szövetet kell használni – amennyiben lehetséges – hasonló kontrollként ugyanazon a lemezen.

Negatív kontrollként olyan mintakivonat aliquot térfogatait lehet használni, melynek vizsgálata az R. solanacearum-ra nézve negatív eredményt hozott.

Az ehhez a vizsgálathoz rendelkezésre álló standardizált pozitív és negatív kontrollanyagok felsorolása a 3. függelékben található.

Használjunk több mintahelyes tárgylemezeket lehetőleg 10, legalább 6 mm átmérőjű ablakkal.

A kontrollanyagot a mintával/mintákkal azonos módon vizsgáljuk.

5.1. A tesztlemezeket a következő eljárások egyikével készítsük el:

i. Viszonylag kevés keményítő-üledéket tartalmazó pelletek esetén: Pipettázzunk egy kimért állandó térfogatot (15 µl megfelelő a 6 mm-es ablakátmérőhöz – nagyobb ablakokhoz használjunk arányosan nagyobb térfogatot) az újraszuszpendált burgonyapellet 1/100 hígításából az első ablakra. Ezután pipettázzunk hasonló térfogatot a hígítatlan pelletből (1/1) a sor fennmaradó ablakaira. A második sor használható ismétlésként vagy egy második mintaként, amint azt az 1. ábra mutatja.

ii. Egyéb pelletek esetén: Készítsünk tízes hígítási sorozatot (1/10, 1/100) az újraszuszpendált pelletből pelletpufferben. Pipettázzunk egy kimért állandó térfogatot (15 µl megfelelő a 6 mm-es ablakátmérőhöz – nagyobb ablakokhoz használjunk arányosan nagyobb térfogatot) az újraszuszpendált pelletből és mindegyik hígításból az ablakok egy sorára. A második sor használható ismétlésként vagy egy második mintaként, amint azt a 2. ábra mutatja.

5.2. Szárítsuk a cseppeket szobahőmérsékleten vagy 40–45 °C-os hőmérsékletig történő melegítéssel. Rögzítsük a baktériumsejteket a lemezhez hevítéssel (15 percig 60 °C-on), lánggal vagy 95 %-os etil-alkohollal, vagy az ellenanyagok szállítójának specifikus útmutatása szerint. Szükség esetén a rögzített lemezeket ezután egy kiszárított dobozban fagyasztva lehet tárolni a szükséges kis ideig (legfeljebb 3 hónapig) a további vizsgálatok elvégzését megelőzően.

5.3. IF-eljárás i. Az 5.1. i. pontban leírt tesztlemez-készítési eljárás szerint: Készítsünk egy sorozatot a kétszeres hígításokból. Az első mintahely tartalmazza a titer 1/2-ét (T/2), a többi a titer 1/4-ét (T/4), a titer 1/2-ét (T/2), a titert (T) és a titer kétszeresét (2T). ii. Az 5.1. ii. pontban leírt tesztlemez-készítési eljárás szerint: Készítsük el az ellenanyag munkahígítását (WD) IF-pufferben. A munkahígítás befolyásolja a specifikusságot.



1. ábra A tesztlemez elkészítése az 5.1. i. és az 5.3. i. pont szerint Az újraszuszpendált pellet hígításai 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Az újraszuszpendált pellet hígításai (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Az antiszérum/ellenanyag kétszeres hígításai 1. minta 1 2 3 4 5 Az 1. minta ismétlése vagy 2. minta 6 7 8 9 10



2. ábra A tesztlemez elkészítése az 5.1. ii. és az 5.3. ii. pont szerint Az antiszérum/ellenanyag munkahígítása 1/1 1/10 1/100 üres üres  Az újra-szuszpendált pellet tízes hígítása 1. minta 1 2 3 4 5 Az 1. minta ismétlése vagy 2. minta 6 7 8 9 10 5.3.1. Rendezzük el a tesztlemezeket nedves itatóspapíron. Borítsuk a tesztablakokat teljesen az ellenanyag hígításával (hígításaival). Az ablakokra felvitt ellenanyag térfogatának legalább akkorának kell lennie, mint az alkalmazott kivonat térfogata. A következő eljárást abban az esetben kell elvégezni, ha az ellenanyagok szállítója nem szolgáltatott specifikus útmutatásokat: 5.3.2. Lefedve inkubáljuk a tesztlemezeket nedves papíron 30 percig szobahőmérsékleten (18–25 °C). 5.3.3. Rázzuk le a cseppeket a tesztlemezekről, és gondosan öblítsük le azokat IF-pufferrel. Alámerítve mossuk 5 percig IF-puffer-Tween-ben (4. függelék), és ezt követően IF-pufferben. Kerüljük el az aeroszolok vagy cseppek átvitelét, ami keresztbefertőződéshez vezethet. Gondosan távolítsuk el a felesleges nedvességet gyengéd felitatással. 5.3.4. Rendezzük el a tesztlemezeket nedves itatóspapíron. Borítsuk a tesztablakokat a FITC konjugátumnak a titer meghatározásához használt hígításával. Az ablakokra felvitt konjugátum térfogatának meg kell egyeznie az alkalmazott ellenanyag térfogatával. 5.3.5. Lefedve inkubáljuk a tesztlemezeket nedves papíron 30 percig szobahőmérsékleten (18–25 °C). 5.3.6. Rázzuk le a konjugátumcseppeket a tesztlemezről. Öblítsük és mossuk el a korábbiak szerint (5.3.3.). Gondosan távolítsuk el a felesleges vizet. 5.3.7. Pipettázzunk 5–10 µl 0,1 M foszfátpufferes glicerint (3. függelék) vagy valamilyen kereskedelmi forgalomban kapható „montírozót” minden egyes ablakra, és helyezzünk fel fedőlemezt.

5.4. Az IF-teszt leolvasása: 5.4.1. Tanulmányozzuk a tesztlemezeket epifluoreszcens mikroszkóppal az FITC gerjesztésére alkalmas szűrőkkel, víz- vagy olajimmerzió mellett, 500–1 000-szeres nagyításban. Alaposan vegyük szemügyre az ablakokat két egymásra merőleges átmérőjük és a kerületük mentén. Azon minták esetében, amelyekben egyáltalán nem vagy csak kis számban mutatkoznak sejtek, legalább 40 mikroszkóp látómezőt vizsgáljunk meg. Először a pozitív kontroll-lemezt ellenőrizzük. A sejteknek fényesen kell fluoreszkálniuk, és teljes mértékű festődést kell mutatniuk a meghatározott ellenanyag titeren vagy a munkahígításon. Az IF-próbát (VI.A.5. szakasz) meg kell ismételni, ha a festődés rendellenes. 5.4.2. Figyeljük meg az R. solanacearum jellegzetes morfológiájával rendelkező, fényesen fluoreszkáló sejteket a tesztlemezek tesztablakaiban (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A fluoreszcencia intenzitásának meg kell egyeznie a pozitív kontroll-törzs által ugyanazon ellenanyag-hígításnál adottal. A nem teljesen festődött vagy gyengén fluoreszkáló sejteket figyelmen kívül kell hagyni. Ha bármilyen fertőzés gyanúja felmerül, a vizsgálatot meg kell ismételni. Ilyen eset lehet, amikor egy tételben minden tesztlemez pozitív sejteket mutat a puffer fertőződésének következtében, vagy amikor pozitív sejtekre bukkanunk (a tesztablakokon kívül) a tesztlemez bevonatán. 5.4.3. Sok olyan probléma létezik, amely az immunfluoreszcenciás vizsgálat specifikusságából adódik. Az atipikus morfológiájú fluoreszkáló sejtek háttérpopulációi és a keresztbe reagáló szaprofita baktériumok, melyek mérete és morfológiája hasonló az R. solanacearum-éhoz, valószínűleg előfordulnak a burgonyagumó köldökrészéből vett darabokból és a szár darabjaiból készített pelletben. 5.4.4. Csak a jellemző méretű és morfológiájú, az ellenanyagok titerén vagy munkahígításán fluoreszkáló sejteket vegyük figyelembe, ahogy az 5.3. pontnál. 5.4.5. Az IF eredményének kiértékelése: i. Ha találunk jellegzetes morfológiájú, fényesen fluoreszkáló sejteket, akkor határozzuk meg a mikroszkóp látómezejébe eső jellemző sejtek számának középértékét, és számítsuk ki az újraszuszpendált pellet 1 ml-ében lévő jellemző sejtek számát (5. függelék). Az IF-teszt eredménye pozitív azon minták esetében, amelyek 1 ml újraszuszpendált pelletben legalább 5x103 jellemző sejtet tartalmaznak. Az ilyen minta potenciálisan fertőzöttnek minősül, és további vizsgálatok elvégzése szükséges. ii. Az IF-teszt eredménye negatív azon minták esetében, amelyek 1 ml újraszuszpendált pelletben kevesebb, mint 5x103 sejtet tartalmaznak, és az ilyen minta negatívnak minősül. További vizsgálatok elvégzése nem szükséges.

6. PCR-teszt

Az alapelvek

Amennyiben a PCR-tesztet elsőszámú szűrővizsgálatként használjuk, és pozitívnak bizonyul, akkor el kell végezni az izolálási vizsgálatot vagy az IF-et második, kötelező szűrővizsgálatként. Amennyiben PCR-t második szűrővizsgálatként használunk, és pozitívnak bizonyul, további vizsgálatra van szükség a folyamatábrának megfelelően a diagnosztizálás befejezéséhez.

E módszer elsőszámú szűrővizsgálatként történő teljes körű felhasználása csak akkor ajánlott, ha a szükséges specifikus szakmai ismeretek elsajátításra kerültek.

Megjegyzés: Az e módszerrel végzett előzetes vizsgálatnak lehetővé kell lennie a korábbi vizsgálatok szerint negatív mintakivonatokhoz adott 103–104/ml R. solanacearum sejt reprodukálható kimutatását. Optimalizálási kísérletekre lehet szükség a maximális érzékenység és specifikusság eléréséhez minden laboratóriumban.

Használjunk validált PCR-reagenseket és protokollokat (lásd a 6. függeléket). Lehetőleg belső ellenőrzésű módszert válasszunk.

Tegyük meg a megfelelő óvintézkedéseket annak érdekében, hogy elkerüljük a minta megfertőződését a cél DNS-sel. A PCR-próbát gyakorlott technikusoknak kell végezniük erre szolgáló molekuláris biológiai laboratóriumokban, hogy minimalizáljuk a cél DNS-sel való fertőződés veszélyét.

A negatív kontrollokat (DNS kivonási és PCR eljárásokra) mindig úgy kell kezelni, mint végső mintákat az eljárás során, hogy nyilvánvaló legyen, vajon történt-e DNS-átvitel.

A következő negatív kontrollokat kell alkalmazni a PCR-próbánál:

— Mintakivonat, amelyet előzőleg megvizsgáltak és az R. solanacearum-ra negatívnak bizonyult,

— Puffer kontrollok, amelyeket a baktérium és a DNS-mintából történő kivonására használnak,

— PCR-reakcióelegy.

A következő pozitív kontrollokat kell alkalmazni:

— Aliquot térfogatok az újraszuszpendált pelletből, melyhez R. solanacearum került hozzáadásra (elkészítését lásd a 3.B. függelékben).

— Egy virulens izolátumból származó 106/ml R. solanacearum sejt szuszpenziója vízben (pl. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; lásd a 3.B. függeléket).

— Ha lehetséges, használjunk a pozitív kontroll mintákból származó DNS-t is a PCR elvégzése során.

A lehetséges fertőzések elkerülése érdekében a pozitív kontrollokat a vizsgálandó mintáktól különálló környezetben készítsük el.

A mintakivonatok amennyire csak lehetséges legyenek mentesek a talajtól. Ezért ajánlatos lehet megmosott burgonyából készíteni a kivonatokat a PCR-protokollok alkalmazásakor.

Az ehhez a vizsgálathoz használható standardizált pozitív és negatív kontrollok felsorolása a 3. függelékben található.

6.1. DNS-tisztítási módszerek

Használjuk a fentiekben leírt pozitív és negatív kontrollmintákat (lásd a 3. függeléket).

Vizsgáljuk a kontrollanyagot a mintával/mintákkal azonos módon.

Különféle módszerek állnak rendelkezésre a cél DNS megtisztítására a komplex minta szubsztrátumoktól, melyek eltávolítják a PCR és más enzimatikus reakciók inhibitorait, és koncentrálják a cél DNS-t a mintakivonatban. A következő módszert optimalizálták a 6. függelékben bemutatott validált PCR módszereknél történő felhasználásra.

a) A Pastrik-féle módszer (2000)

1) Pipettázzunk 220 µl lízis-puffert (100 mM NaCl, 10 mM tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe.

2) Adjunk hozzá 100 µl mintakivonatot, és helyezzük egy hevítő blokkba vagy vízfürdőbe 95 °C-ra 10 percig.

3) Tegyük a csövet jégre 5 percre.

4) Adjunk hozzá 80 µl lizozim törzsoldatot (50 mg/ml lizozim 10 mM-os tris-HCl-ben, pH 8,0), és inkubáljuk 37 °C-on 30 percig.

5) Adjunk hozzá 220 µl Easy DNA® A oldatot (Invitrogen), vortex-szel jól keverjük össze, és inkubáljuk 65 °C-on 30 percig.

6) Adjunk hozzá 100 µl Easy DNA® B oldatot (Invitrogen), erőteljesen vortex-szeljük, amíg a csapadék már szabadon mozog a csőben, és a minta egyenletesen viszkózus lesz.

7) Adjunk hozzá 500 µl kloroformot, és vortex-szeljük, amíg a viszkozitás csökken, és az elegy homogénné válik.

8) Centrifugáljuk 15 000 g-vel 20 percig 4 °C-on, hogy a fázisok elkülönüljenek, és kialakuljon az interfázis.

9) Vigyük át a felső fázist egy új Eppendorf-csőbe.

10) Adjunk hozzá 1 ml 100 %-os etil-alkoholt (20 °C) rövid ideig Vortex-szeljük, és inkubáljuk jégen 10 percig.

11) Centrifugáljuk 15 000 g-vel 20 percig 4 °C-on, és távolítsuk el az etil-alkoholt a pelletből.

12) Adjunk hozzá 500 µl 80 %-os etil-alkoholt (20 °C), és keverjük össze a cső felfordításával.

13) Centrifugáljuk 15 000 g-vel 10 percig 4 °C-on, őrizzük meg a pelletet, és távolítsuk el az etil-alkoholt.

14) Hagyjuk a pelletet megszáradni a levegőn vagy egy gyors DNS vákuumszárítóban.

15) Szuszpendáljuk újra a pelletet 100 µl steril UPW-ben, és hagyjuk szobahőmérsékleten legalább 20 percig.

16) Tároljuk 20 °C-on amíg a PCR-hez szükség lesz rá.

17) Centrifugálással húzzuk le a fehér csapadékot, és vegyünk 5 µl-t a DNS-t tartalmazó felülúszó folyadékból a PCR-hez.

b) Egyéb módszerek

Egyéb DNS kivonási módszerek, pl. a Qiagen DNeasy Plant Kit, is alkalmazhatók, feltéve, hogy bizonyítottan ugyanennyire hatékonyan végzik a DNS-tisztítást 103–104/ml kórokozó sejtet tartalmazó kontroll mintákból.

6.2. PCR

6.2.1. Készítsünk teszt- és kontrollmintákat a PCR-hez a validált protokolloknak megfelelően (VI.A.6. szakasz). Készítsünk egy tízes léptékű hígítást a minta DNS-kivonatból (1:10 UPW-ben).

6.2.2. Készítsük el a megfelelő PCR reakcióelegyet fertőzésmentes környezetben a közzétett protokollok szerint (6. függelék). Amennyiben lehetséges, ajánlatos a multiplex PCR protokoll használata, amely magában foglal egy belső PCR ellenőrzést is.

6.2.3. Adjunk 2–5 µl DNS-kivonatot 25 µl PCR reakcióelegyhez steril PCR csövekben a PCR protokolloknak megfelelően (lásd a 6. függeléket).

6.2.4. Vonjunk be egy negatív kontroll-mintát, amely csak PCR reakcióelegyet tartalmaz, és adjunk hozzá UPW-t, mely ugyanabból a forrásból származzon, mint amit a PCR reakcióelegyben a minta helyén használtunk.

6.2.5. Helyezzük a csöveket ugyanabba a thermal cycler-be, melyet az előzetes vizsgálat során használtunk, és futtassuk le a megfelelően optimalizált PCR-programot (6. függelék).

6.3. A PCR termék elemzése

6.3.1. Elemezzük a PCR-fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel. Futtassunk legalább 12 µl felerősített DNS reakcióelegyet mindegyik mintából, 3 µl töltőpufferrel keverve (6. függelék) 2,0 %-os (m/v) agarózgélben tris-acetát-EDTA (TAE) pufferben (6. függelék) 5–8 V/cm-en. Használjunk megfelelő DNS markert, pl. 100 bp ladder-t.

6.3.2. Tárjuk fel a DNS láncokat etidium-bromid festéssel (0,5 mg / L) 30–60 percig, kellő óvintézkedések mellett dolgozzunk ezzel a mutagénnel.

6.3.3. Tanulmányozzuk a megfestett gélt rövidhullámú UV átvilágítás (λ = 302 nm) mellett a várható méretű felerősített PCR-termékekre nézve (6. függelék), és dokumentáljuk.

6.3.4. Minden új leletnél/esetnél igazoljuk a PCR-fragmentum hitelességét restrikciós enzim analízissel, melyet a maradék felerősített DNS-ből származó mintán végezzünk el optimális hőmérsékleten és ideig inkubálva a megfelelő enzimmel és pufferrel (lásd a 6. függeléket). Elemezzük a feltárt fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel, mint korábban, és tanulmányozzuk a jellegzetes restrikciós fragmentum mintázatot UV átvilágítás mellett etidium-bromid festés után, és hasonlítsuk össze a feltáratlan és a feltárt pozitív kontrollal.

A PCR-teszt eredményeinek kiértékelése:

A PCR-teszt negatív, ha az R. solanacearum-specifikus várható méretű PCR-fragmentum nem mutatható ki a kérdéses mintában, viszont kimutatható valamennyi pozitív kontroll mintában (a belső ellenőrzésű primerekkel végzett multiplex PCR esetében: egy második várható méretű PCR-terméket kell felerősíteni a kérdéses mintával együtt).

A PCR-teszt pozitív, ha az R. solanacearum-specifikus várható méretű PCR-fragmentum és (amennyiben szükséges) a restrikciós mintázat kimutatható, feltéve, hogy az nem erősödött fel valamelyik negatív kontroll mintától. A pozitív eredmény megbízható megerősítése elérhető a vizsgálat megismétlésével a PCR-primerek második sorozatán (6. függelék).

Megjegyzés: A PCR gátlása gyanítható, ha a várható fragmentumot nyerjük a vízben lévő R. solanacearum-ot tartalmazó pozitív kontroll mintából, viszont negatív eredményeket kapunk a burgonyakivonatban lévő R. solanacearum-ot tartalmazó pozitív kontrollokból. A belső PCR ellenőrzésű multiplex PCR-protokollokban jelzik a reakció gátlását, ha a két fragmentum egyike sem kerül kinyerésre.

Gyanítható a fertőzés, ha a várható fragmentumot nyerjük egy vagy több negatív kontrollból.

7. FISH-teszt

Az alapelv

Amennyiben a FISH-tesztet használjuk első szűrővizsgálatként, és pozitívnak bizonyul, akkor el kell végezni az izolálási eljárást vagy az IF-tesztet kötelező második szűrővizsgálatként. Amennyiben a FISH-tesztet második szűrővizsgálatként használjuk, és pozitívnak bizonyul, akkor további vizsgálat szükséges a folyamatábrának megfelelően a diagnosztizálás befejezéséhez.

Megjegyzés: Használjunk validált R. solanacearum-specifikus oligo-szondákat (lásd a 7. függeléket). Az ezzel a módszerrel végzett előzetes vizsgálatnak lehetővé kell tennie a korábban negatívnak vizsgált mintakivonathoz adott legalább 103–104/ml R. solanacearum sejt reprodukálható kimutatását.

A következő eljárást lehetőleg frissen készült mintakivonaton kell elvégezni, de sikeresen elvégezhető glicerin alatt 16 és 24 vagy 68 és 86 °C között tárolt mintakivonaton.

Negatív kontrollként használjuk a korábban R. solanacearum-ra negatívnak vizsgált mintakivonat aliquot térfogatait.

Pozitív kontrollnak készítsünk szuszpenziót, amely 105–106/ml 3–5 napos tenyészetből származó, 2. biovariánsba tartozó R. solanacearum sejtet (pl. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 törzs, lásd a 3. függeléket) tartalmaz 0,01M foszfát-pufferben (PB). Készítsünk külön pozitív kontroll lemezeket a homológ törzsből vagy az R. solanacearum bármely más referenciatörzséből, burgonyakivonatban szuszpendálva, a 3.B. függelékben meghatározottak szerint.

A FITC-vel címkézett eubakteriális oligoszonda használata biztosítja a hibridizáció folyamatának ellenőrzését, mivel megfesti a mintában jelen levő összes eubaktériumot.

Az ehhez a vizsgálathoz rendelkezésre álló standardizált pozitív és negatív kontrollanyagok felsorolása a 3.A. függelékben található.

Vizsgáljuk a kontrollanyagot a mintával/mintákkal azonos módon.

7.1. A burgonyakivonat fixálása

A következő protokoll Wullings et al. (1998) alapján készült:

7.1.1. Készítsünk fixáló oldatot (lásd a 7. függeléket).

7.1.2. Pipettázzunk 100 µl-t mindegyik mintakivonatból egy Eppendorf-csőbe, és centrifugáljuk 7 percig 7 000 g-vel.

7.1.3. Távolítsuk el a felülúszó folyadékot, és oldjuk fel a pelletet 200 µl fixálóban, melyet kevesebb, mint 24 órával korábban készítettünk. Vortex-szeljük, és inkubáljuk 1 órán át hűtőszekrényben.

7.1.4. Centrifugáljuk 7 percig 7 000 g-vel, távolítsuk el a felülúszó folyadékot, és szuszpendáljuk újra a pelletet 75 µl 0,01M PB-ben (lásd a 7. függeléket).

7.1.5. Cseppentsünk 16 µl-t a fixált szuszpenzióból egy tiszta multiteszt lemezre, ahogy a 7.1. ábra mutatja. Két különböző mintát használjunk lemezenként hígítatlanul, és használjunk 10 µl-t egy 1:100 hígításhoz (0,01 M PB-ben). A maradék mintaoldatot (49 µl) tárolhatjuk 20 °C-on 1 térfogatnyi 96 %-os etil-alkohol hozzáadása után. Abban az esetben, ha a FISH-próbát meg kell ismételni, távolítsuk el az etil-alkoholt centrifugálással, és adjunk a mintaoldathoz azonos térfogatnyi 0,01 M PB-t (keverjük össze vortex-szeléssel).



7.1. ábra A FISH-lemez elrendezése 1. minta vak vak vak 2. minta 1. ablak 2. ablak 3. ablak 4. ablak 5. ablak 1. minta vak vak vak 2. minta 6. ablak 7. ablak 8. ablak 9. ablak 10. ablak 1. fedőlemez 2. fedőlemez

7.1.6. Levegőn szárítsuk meg a lemezeket (vagy lemezszárítón, 37 °C-on), és rögzítsük azokat lángon való áthúzással. Ezen a ponton az eljárást félbeszakíthatjuk, és a hibridizációval másnap folytathatjuk. A lemezeket pormentesen és száraz szobahőmérsékleten kell tárolni.

7.2. Hibridizáció

7.2.1. Dehidratáljuk a sejteket egy fokozatos – 50, 80 és 96 %-os – etil-alkohol sorozatban, mindegyikben 1 percig. Levegőn hagyjuk megszáradni a lemezeket egy lemeztartóban.

7.2.2. Készítsünk egy nedves inkubációs kamrát úgy, hogy egy légmentesen záródó doboz aljára 1x hibmix-be (lásd a 7. függeléket) áztatott itatós- vagy szűrőpapírt terítünk. Végezzük el a doboz előinkubálását a hibridizációs kemencében 45 °C-on legalább 10 percig.

7.2.3. Tegyünk 10 μl hibridizációs oldatot (7. függelék) mindegyik lemez 8 ablakába (1., 2., 4., 5., 6., 7., 9. és 10. ablak; lásd a 7.1. ábrát), a két középső ablakot (3. és 8) üresen hagyva.

7.2.4. Tegyünk fedőlemezt (24 x 24 mm) az első és az utolsó négy ablakra a levegő beszorítása nélkül. Helyezzük a lemezeket az előmelegített nedves kamrába, majd hibridizáljuk azokat 5 órán át a kemencében 45 °C-on sötétben.

7.2.5. Készítsünk el 3 főzőpoharat, melyek 1 l Milli Q (molekuláris fokozatú) vizet, 1 l 1x hibmix-et (334 ml 3x hibmix és 666 ml Milli Q víz) és 1 l 1/8x hibmix-et (42 ml 3x hibmix és 958 ml Milli Q víz) tartalmaznak. Végezzük el az előinkubációjukat vízfürdőben 45 °C-on.

7.2.6. Vegyük le a fedőlemezeket a lemezekről, és helyezzük a lemezeket lemeztartóba.

7.2.7. Mossuk ki a felesleges szondát a főzőpohárban 1x hibmix-szel 45 °C-on történő, 15 percig tartó inkubálással.

7.2.8. Vigyük át a lemeztartót 1/8 hibmix mosóoldatba, és inkubáljuk további 15 percig.

7.2.9. Mártsuk a lemezeket rövid időre Milli Q vízbe, és tegyük őket szűrőpapírra. Távolítsuk el a felesleges nedvességet a felszínük szűrőpapírral történő óvatos letakarásával. Pipettázzunk 5–10 μl „montírozó” oldatot (pl. Vectashield-et, Vecta Laboratories, CA, USA vagy azzal egyenértékűt) mindegyik ablakra, és takarjuk le egy nagyméretű fedőlemezzel (24 x 60 mm) az egész lemezt.

7.3. A FISH-teszt leolvasása

7.3.1. Azonnal nézzük meg a lemezeket epifluoreszcens mikroszkóppal 630 nm hullámhosszon vagy 1 000-szeres nagyításon olajimmerzió mellett. Fluoreszcein-izotiocianáthoz (FITC) használható szűrővel a mintában lévő eubakteriális sejtek (beleértve a legtöbb gram-negatív sejtet) fluoreszkáló zöldre festődnek. Tetrametilrodamin-5-izotiocianáthoz használható szűrővel az R. solanacearum Cy3-mal festett sejtjei fluoreszkáló vörösnek tűnnek. Hasonlítsuk össze a sejtmorfológiát a pozitív kontrollokéval. A sejteknek élénken kell fluoreszkálniuk, és teljesen meg kell festődniük. A FISH-próbát (VI.A.7. szakasz) meg kell ismételni, ha a festődés rendellenes. Alaposan vegyük szemügyre az ablakokat két egymásra merőleges átmérőjük és a kerületük mentén. Azon minták esetében, amelyekben egyáltalán nem vagy csak kis számban mutatkoznak sejtek, legalább 40 mikroszkóp látómezőt vizsgáljunk meg.

7.3.2. Tanulmányozzuk az R. solanacearum élénken fluoreszkáló, jellegzetes morfológiájú sejtjeit a tesztlemezek tesztablakaiban (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A fluoreszkálás intenzitásának meg kell egyeznie, vagy erősebbnek kell lennie a pozitív kontroll törzsénél. A tökéletlen festődésű vagy gyengén fluoreszkáló sejteket nem szabad figyelembe venni.

7.3.3. Ha bármilyen fertőzés gyanúja felmerül, a vizsgálatot meg kell ismételni. Ilyen eset lehet, amikor egy tételben minden tesztlemez pozitív sejteket mutat a puffer fertőződésének következtében, vagy amikor pozitív sejtekre bukkanunk (a tesztablakokon kívül) a tesztlemez bevonatán.

7.3.4. Sok olyan probléma létezik, amely a FISH-teszt specifikusságából adódik. Az atipikus morfológiájú fluoreszkáló sejtek háttérpopulációi és a keresztbe reagáló szaprofita baktériumok, melyek mérete és morfológiája hasonló az R. solanacearum-éhoz, előfordulhatnak – bár sokkal ritkábban, mint az IF-tesztnél – a burgonyagumó köldökrészéből vett darabokból és a szár darabjaiból készített pelletben.

7.3.5. Csak a jellemző méretű és morfológiájú, fluoreszkáló sejteket vegyük figyelembe.

7.3.6. A FISH-teszt eredményének kiértékelése: i) A FISH-teszt eredménye akkor érvényes, ha az R. solanacearum-ra jellemző méretű és morfológiájú, élénk zölden fluoreszkáló sejtek figyelhetők meg FITC-szűrő használatával és élénkvörösen fluoreszkáló sejtek a rodamin-szűrő használatával az összes pozitív kontrollnál, viszont a negatív kontrollok egyikénél sem. Ha találunk élénken fluoreszkáló, jellegzetes morfológiájú sejteket, becsüljük meg a jellemző sejtek átlagos számát mikroszkóp látómezőnként, és számoljuk ki a jellemző sejtek számát az újraszuszpendált pellet 1 ml-ére (4. függelék). Azok a minták, amelyek legalább 5x103 jellemző sejtet tartalmaznak az újraszuszpendált pellet 1 ml-ében potenciálisan fertőzöttnek tekinthetők. További vizsgálat szükséges. Azok a minták, amelyek kevesebb, mint 5x103 jellemző sejtet tartalmaznak az újraszuszpendált pellet 1 ml-ében negatívnak tekinthetők. ii) A FISH-teszt negatív, ha az R. solanacearum-ra jellemző méretű és morfológiájú, élénkvörösen fluoreszkáló sejtek nem figyelhetők meg rodamin-szűrő használatával, feltéve, hogy jellemző, élénkvörösen fluoreszkáló sejtek figyelhetők meg a pozitív kontroll készítményekben rodamin-szűrő használatával.

8. ELISA-TESZT

Az alapelv

Az ELISA csak szabadon választható vizsgálatként alkalmazható az IF-, a PCR- vagy a FISH-vizsgálaton felül a viszonylag alacsony érzékenysége miatt. Amennyiben DASI ELISA-t használunk a dúsítás és a monoklonális ellenanyagok használata kötelező (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A minta dúsítása az ELISA alkalmazása előtt hasznos lehet a vizsgálat érzékenységének növelése szempontjából, de sikertelennek bizonyulhat a mintában található más szervezetek által okozott verseny következtében.

Megjegyzés: Az R. solanacearum validált forrásból származó ellenanyagait használjuk (lásd a honlapot: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Ajánlott a titert minden egyes új ellenanyag-tételre meghatározni. A titer úgy van definiálva, hogy az a legmagasabb hígítás, melyen optimális reakció megy végbe az R. solanacearum homológ törzsének 105–106 sejt/ml-es szuszpenziója vizsgálatánál a megfelelő másodlagos ellenanyag konjugátumoknak a gyártó ajánlásai szerint történő felhasználása esetén. A vizsgálat során az ellenanyagokat a kereskedelmi készítmények titeréhez közeli vagy azzal megegyező munkahígításban kell használni.

Határozzuk meg az ellenanyagok titerét az R. solanacearum homológ törzsének 105–106 sejt/ml-es szuszpenzióján.

Negatív kontrollként használjunk egy mintakivonatot, melynek vizsgálata korábban az R. solanacearum-ra nézve negatív eredményt hozott, és egy keresztbe nem reagáló baktérium szuszpenzióját foszfátpufferes sóoldatban (PBS).

Pozitív kontrollként használjuk az aliquot térfogatait egy mintakivonatnak, melynek vizsgálata korábban negatív eredményt hozott, összekeverve 103-104/ml 2. biovariánsba tartozó R. solanacearum sejttel (pl. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 törzs, lásd a 2.A. és 2.B. függeléket). Az eredmények összehasonlíthatósága érdekében mindegyik lemezen használjuk a 105–106/ml R. solanacearum sejtet PBS-ben tartalmazó standard szuszpenziót. Gondoskodjunk arról, hogy a pozitív kontrollok jól el vannak különítve a mikrotiter-lemezen a vizsgált mintá(k)tól.

Az ehhez a vizsgálathoz rendelkezésre álló standardizált pozitív és negatív kontrollanyagok felsorolása a 3.A. függelékben található.

A kontrollanyagot a mintával/mintákkal azonos módon vizsgáljuk.

Két ELISA-protokollt validáltak.

a) Közvetett ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

1) Használjuk a mintakivonat 100–200 µl-es aliquot térfogatait. (A vízfürdőben vagy hevítő blokkban 100 °C-on 4 percig történő hevítés csökkentheti a nem specifikus eredményeket bizonyos esetekben.)

2) Adjunk hozzá egyenlő térfogatban kétszeres erősségű bevonópuffert (4. függelék) és Vortex-szeljük.

3) Vigyünk a mikrotitráló-lemez (pl. Nunc-Polysorp vagy azzal egyenértékű) legalább 2 vájulatának mindegyikébe 100 µl aliquot térfogatot, és inkubáljuk 1 órán át 37 °C-on vagy egy éjszakán át 4 °C-on.

4) Távolítsuk el a kivonatokat a vájulatokból. Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (4. függelék) úgy, hogy az utolsó mosóoldatot legalább 5 percig a vájulatokban hagyjuk.

5) Készítsük el az R. solanacearum elleni ellenanyagok megfelelő hígítását blokkoló pufferben (4. függelék). A validált kereskedelmi ellenanyagok esetében használjuk az ajánlott hígításokat (rendszerint kétszer olyan tömények, mint a titer).

6) Vigyünk 100 µl-t mindegyik vájulatba, és inkubáljuk 1 órán át 37 °C-on.

7) Távolítsuk el az ellenanyag oldatot a vájulatokból, és a vájulatokat mossuk ki az előbbiekben leírtak szerint (4. pont).

8) Készítsük el a másodlagos ellenanyag – alkalikus foszfatáz konjugátum megfelelő hígítását blokkoló pufferben. Tegyünk 100 µl-t mindegyik vájulatba, és inkubáljuk 1 órán át 37 °C-on.

9) Távolítsuk el az ellenanyag konjugátumot a vájulatokból, és mossuk ki a vájulatokat az előbbiekben leírtak szerint (4. pont).

10) Vigyünk 100 µl alkalikus foszfatáz szubsztrát oldatot (4. függelék) mindegyik vájulatba. Inkubáljuk sötétben szobahőmérsékleten, és olvassuk le az abszorbanciát 405 nm-nél rendszeres 90 percen belüli – időközönként.

b) DASI ELISA

1) Készítsünk megfelelő hígítást az R. solanacearum elleni poliklonális immunglobulinokból pH 9,6-os bevonó pufferben (4. függelék). Vigyünk 200 µl-t mindegyik vájulatba. Inkubáljuk 37 °C-on 4–5 órán át vagy 4 °C-on 16 órán át.

2) Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (4. függelék). Vigyünk 190 µl mintakivonatot legalább 2 vájulatba. Ugyancsak vigyünk pozitív és negatív kontrollokat 2–2 vájulatba lemezenként. Inkubáljuk 16 órán át 4 °C-on.

3) Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (4. függelék).

4) Készítsünk megfelelő hígítást R. solanacearum-specifikus monoklonális ellenanyagokból PBS-ben (4. függelék), amely 0,5 % szarvasmarha szérum albumint (BSA) is tartalmaz, és vigyünk 190 µl-t mindegyik vájulatba. Inkubáljuk 37 °C-on 2 órán át.

5) Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (4. függelék).

6) Készítsünk megfelelő hígítást alkalikus foszfatázzal konjugált anti-egér immunglobulinokból PBS-ben. Vigyünk 190 µl-t mindegyik vájulatba. Inkubáljuk 37 °C-on 2 órán át.

7) Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (4. függelék).

8) Készítsünk alkalikus foszfatáz szubsztrát oldatot, amely 1 mg/ml p-nitrofenil-foszfátot tartalmaz szubsztrát-pufferben (4. függelék). Vigyünk 200 µl-t mindegyik vájulatba. Inkubáljuk sötétben szobahőmérsékleten, és olvassuk le az abszorbanciát 405 nm-nél rendszeres 90 percen belüli – időközönként.

Az ELISA-teszt eredményeinek kiértékelése:

Az ELISA-teszt negatív, ha az ismételt minta vájulatokból leolvasott átlagos optikai sűrűség (OD) kisebb, mint a negatív mintakivonat kontroll vájulatban leolvasott átlagos optikai sűrűség kétszerese, feltéve, hogy az OD-értékek az összes pozitív kontroll esetében 1,0 fölött vannak (a szubsztráttal való 90 perces inkubáció után), és meghaladják a negatív mintakivonatnál kapott OD kétszeresét.

Az ELISA-teszt pozitív, ha az ismételt minta vájulatokból leolvasott átlagos optikai sűrűség (OD) nagyobb, mint a negatív mintakivonat vájulatban leolvasott átlagos optikai sűrűség kétszerese, feltéve, hogy az OD-értékek az összes negatív kontroll vájulat esetében meghaladják a pozitív kontroll vájulatokban kapott OD kétszeresét.

A negatív ELISA leolvasások a pozitív kontroll vájulatokban azt jelzik, hogy a vizsgálatot nem megfelelően végezték el, vagy azt, hogy gátolva volt. A pozitív ELISA leolvasások a negatív kontroll vájulatokban azt jelzik, hogy keresztbe fertőződés vagy nem specifikus ellenanyagkötődés történt.

9. Biológiai vizsgálat

Megjegyzés: Az ezzel a módszerrel végzett előzetes vizsgálatnak lehetővé kell tennie a korábbi vizsgálatokban negatívnak bizonyult mintakivonatokhoz (elkészítését lásd a 3. fügelékben) adott 103–104/ml R. solanacearum telepalkotó egység reprodukálható kimutatását.

A kimutatás érzékenysége várhatóan akkor lesz a legmagasabb, ha frissen készített mintakivonatot használunk, és optimális szaporodási feltételeket biztosítunk. A módszert azonban sikeresen lehet alkalmazni olyan kivonatokon, amelyeket glicerin alatt 68 és 86 °C között tároltunk.

A következő protokoll Janse (1988) alapján készült:

9.1. Használjunk minden mintához 10 tesztnövényt egy fogékony paradicsomfajtából (pl. a „Moneymaker”-ből vagy azzal azonos fogékonyságú, a vizsgálati laboratórium által meghatározott fajtát) három valódi leveles állapotukban. A tenyésztéssel kapcsolatos részleteket lásd a 8. függelékben. Használhatunk tojásgyümölcsöt is (pl. a „Black Beauty” fajtát vagy azzal azonos fogékonyságú fajtákat), csak 2–3 leveles növény