Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jelleg ű, az intézmények semmiféle felel ősséget nem vállalnak a tartalmáért  
►B A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE  
(2008. május 30.)  
a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, engedélyezésér ől és korlátozásáról (REACH) szóló 
1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati 
módszerek megállapításáról  
(EGT-vonatkozású szöveg)  
(HL L 142., 2008.5.31., 1. o.)  
Módosította:  
Hivatalos Lap  
Szám  Oldal  Dátum  
►M1 A Bizottság 761/2009/EK rendelete (2009. július 23.)  L 220  1  2009.8.24.  
►M2 A Bizottság 1152/2010/EU rendelete (2010. december 8.)  L 324  13  2010.12.9.  
►M3 A Bizottság 640/2012/EU rendelete (2012. július 6.)  L 193  1  2012.7.20.  
►M4 A Bizottság 260/2014/EU rendelete (2014. január 24.)  L 81  1  2014.3.19.  
►M5 A Bizottság 900/2014/EU rendelete (2014. július 15.)  L 247  1  2014.8.21.  2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1
A BIZOTTSÁG 440/2008/EK RENDELETE  
(2008. május 30.)  
a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, engedélyezésér ől és 
korlátozásáról (REACH) szóló 1907/2006/EK európai parlamenti és a tanácsi rendelet értelmében alkalmazandó vizsgálati módszerek 
megállapításáról
 
(EGT-vonatkozású szöveg)  
AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,  
tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerz ődésre,  
tekintettel a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, engedélyezé ­
séről és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség 
létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/ ­
EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/ ­
21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezésér ől szóló, 2006. 
december 18-i 1907/2006/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre (
 1 ) 
és különösen annak 13. cikke (3) bekezdésére,  
mivel:  
(1) Az 1907/2006/EK rendelet értelmében közösségi szinten vizs ­
gálati módszereket kell elfogadni olyan vizsgálatokat illet ően, 
amelyek szükségesek az egyes anyagok lényegi tulajdonságaira vonatkozó információk megszerzéséhez.
 
(2) A veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézé ­
sére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítésér ől szóló 67/548/EGK tanácsi irányelv (
 2 ) V. melléklete 
megállapította az anyagok és készítmények fizikai és kémiai tulaj ­
donságainak, toxicitásának, valamint ökotoxicitásának meghatá ­
rozására szolgáló módszereket. A 2006/121/EK európai parla ­
menti és tanácsi irányelv 2008. január 1-jei hatállyal törölte a 
67/548/EGK rendelet V. mellékletét.  
(3) A 67/548/EGK rendelet V. mellékletében szerepl ő vizsgálati 
módszereket bele kell foglalni ebbe a rendeletbe.  
(4) E rendelet nem zárja ki más vizsgálati módszerek használatát, 
feltéve hogy alkalmazásuk összhangban van az 1907/2006/EK rendelet 13. cikkének (3) bekezdésével.  ▼
B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) HL L 396., 2006.12.30., 1. o., helyesbítve: HL L 136., 2007.5.29., 3. o. 
( 2 ) HL 196., 1967.8.16., 1. o. A legutóbb a 2006/121/EK európai parlamenti és 
tanácsi irányelvvel (HL L 396., 2006.12.30., 850. o., helyesbítve: HL L 136., 
2007.5.29., 281. o.) módosított irányelv –  frissítésre kerül a megfelel ő hivat­
kozásokkal, amint közzéteszik a m űszaki fejlődéshez történ ő 30. hozzáigazí ­
tásról szóló dokumentumot .
 (5) A vizsgálati eljárások során az állatok helyettesítésére, illetve a 
felhasználásuk csökkentésére és finomítására vonatkozó elveket teljes mértékben figyelembe kell venni a vizsgálati módszerek kidolgozásakor, különösen akkor, ha az állatkísérletek kiváltására, számának csökkentésére vagy finomítására alkalmas, hitelesített módszerek rendelkezésre állnak.
 
(6) E rendelet rendelkezései összhangban vannak az 1907/2006/EK 
rendelet 133. cikkével létrehozott bizottság véleményével,  
ELFOGADTA EZT A RENDELETET:  
1. cikk  
Az 1907/2006/EK rendelet céljából alkalmazandó vizsgálati módsze ­
reket e rendelet melléklete állapítja meg.  
2. cikk  
A Bizottság szükség esetén felülvizsgálja az e rendeletben foglalt vizs ­
gálati módszereket a gerinces állatokon végzett kísérletek helyettesítése, számának csökkentése és finomítása érdekében.
 
3. cikk  
A 67/548/EGK irányelv V. mellékletére történ ő hivatkozásokat az e 
rendeletre való hivatkozásként kell értelmezni.  
4. cikk  
Ez a rendelet az  Európai Unió Hivatalos Lapjában  történő kihirdetését 
követő napon lép hatályba.  
Rendelkezéseit 2008. június 1-jét ől kell alkalmazni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
MELLÉKLET  
A. RÉSZ: A FIZIKAI-KÉMIAI TULAJDONSÁGOK MEGHATÁROZÁ ­
SÁNAK MÓDSZEREI  
TARTALOMJEGYZÉK 
A.1. OLVADÁSPONT/FAGYÁSPONT 
A.2. FORRÁSPONT 
A.3. RELATÍV S ŰRŰSÉG 
A.4. G ŐZNYOMÁS 
A.5. FELÜLETI FESZÜLTSÉG 
A.6. OLDHATÓSÁG VÍZBEN 
A.8. MEGOSZLÁSI HÁNYADOS A.9. LOBBANÁSPONT 
A.10. T ŰZVESZÉLYESSÉG (SZILÁRD ANYAGOK) 
A.11. T ŰZVESZÉLYESSÉG (GÁZOK) 
A.12. T ŰZVESZÉLYESSÉG (ÉRINTKEZÉS VÍZZEL) 
A.13. SZILÁRD ANYAGOK ÉS FOLYADÉKOK ÖNGYULLADÁSI 
KÉPESSÉGE 
A.14. ROBBANÁSI TULAJDONSÁGOK 
A.15. ÖNGYULLADÁSI H ŐMÉRSÉKLET (FOLYADÉKOK ÉS 
GÁZOK) 
A.16. SZILÁRD ANYAGOK RELATÍV ÖNGYULLADÁSI H ŐMÉR­
SÉKLETE 
A.17. OXIDÁLÓ TULAJDONSÁGOK (SZILÁRD ANYAGOK) A.18. A POLIMEREK SZÁMÁTLAG SZERINTI MOLEKULATÖ ­
MEGE ÉS MOLEKULATÖMEG-ELOSZLÁSA 
A.19. POLIMEREK KIS MOLEKULATÖMEG-TARTALMA 
A.20. POLIMEREK OLDÓDÁS/EXTRAKCIÓ VISELKEDÉSE 
VÍZBEN 
A.21. OXIDÁLÓ TULAJDONSÁGOK (FOLYADÉKOK) 
A.22. ROSTOK HOSSZAL SÚLYOZOTT ÁTLAGOS GEOMETRIAI 
ÁTMÉRŐJE
 
▼M4 
A.23. MEGOSZLÁSI HÁNYADOS (1-OKTANOL/VÍZ): LASSÚ 
KEVERÉSES MÓDSZER  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. OLVADÁSPONT/FAGYÁSPONT  
1. MÓDSZER  
A leírt módszerek többsége az 1. OECD vizsgálati irányelven alapul. 
Az alapelveket a (2) és (3) szakirodalom ismerteti.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az anyagok olvadáspontjának meghatározásához a leírt módszereket 
és eszközöket kell alkalmazni az anyagok tisztasági fokára vonatkozó 
mindenfajta korlátozás nélkül.  
A módszer kiválasztása a vizsgálni kívánt anyag természetét ől függ. 
Ennek következtében a korlátozó tényez ő attól függ, hogy könnyen, 
nehezen vagy egyáltalán nem porítható az anyag.  
Néhány anyag esetében a fagyáspont vagy dermedési pont meghatá ­
rozása a megfelel őbb, és az ezek meghatározására vonatkozó szab ­
ványok is szerepelnek ebben a módszerben.  
Ahol az anyag különleges tulajdonságai miatt a fenti paraméterek 
közül egyik sem mérhet ő nehézség nélkül, a dermedéspont lehet 
megfelelő. 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az olvadáspont az a h őmérséklet, amelynél légköri nyomáson 
létrejön a fázisátmenet a szilárd halmazállapotból folyékony halmaz ­
állapotba, és ez a h őmérséklet ideális esetben megegyezik a fagyás ­
ponttal.  
Mivel sok anyag fázisátmenete bizonyos h őmérséklet-tartományban 
jön létre, ezért ezt gyakran olvadási tartományként írják le.  
Mértékegységek átszámítása (K-r ől o C-ra)  
t = T – 273,15  
t: Celsius-skála szerinti h őmérséklet, Celsius-fok (  o C) 
T: termodinamikai h őmérséklet, Kelvin (K)  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel kapott eredményekkel.  
Néhány kalibrációs anyagot a (4) szakirodalom sorol fel.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Meghatározza a szilárd halmazállapotból folyékony halmazállapotba 
vagy folyékony halmazállapotból szilárd halmazállapotba történ ő 
fázisátmenet h őmérsékletét (h őmérséklettartományát). A gyakor ­
latban a vizsgált anyag mintájának légköri nyomáson végrehajtott 
melegítése/h űtése során az olvadás/fagyás kezdetének és az olvadás/ ­
fagyás befejezésének h őmérsékletét határozzák meg. A leírás öt 
módszert ismertet, nevezetesen a kapilláris módszert, a f űtőasztalos 
módszereket, a fagyáspont-meghatározásokat, a termikus analízis 
módszerét és a dermedéspont meghatározását (ahogyan ezt az ásványolajokhoz kifejlesztették).
 
Bizonyos esetekben megfelel ő lehet a fagyáspont mérése az olvadás ­
pont mérése helyett.  
1.4.1.  Kapilláris módszer  
1.4.1.1.  Olvadáspontmér ő készülékek folyadékfürd ővel 
Kis mennyiség ű, finomra őrölt anyagot helyeznek el egy kapilláris 
csőben, és szorosan tömörítik. Ezután felmelegítik a csövet egy 
hőmérővel együtt, és a h őmérséklet-emelkedést 1 K/perc körüli 
értéknél kisebbre állítják be a tényleges olvasztás során. Meghatá ­
rozzák az olvadás kezd ő és végső hőmérsékletét.  
1.4.1.2.  Olvadáspontmér ő készülékek fémblokkos eszközzel  
Megegyezik az 1.4.1.1. pontban ismertetett eljárással, azzal a kivé ­
tellel, hogy melegített fémblokkban helyezik el a kapilláris csövet 
és a hőmérőt, és ezek a blokkban kialakított nyílásokon keresztül 
figyelhetők. 
1.4.1.3.  Fotocellás meghatározás  
A kapilláris cs őben elhelyezett mintát automatikusan melegítik egy 
fémhengerben. Fénysugarat irányítanak az anyagon keresztül a 
hengerben kialakított nyílás segítségével egy pontosan kalibrált foto ­
cellához. A legtöbb anyag optikai tulajdonságai opálosról átlátszóra változnak a hevítés során. A fotocellát elér ő fény intenzitása 
megnövekszik, és stop jelet küld a digitális jelz őkészüléknek, 
amely a f űtőkamrában elhelyezett platina ellenállás-h őmérő hőmér­
sékletét jelzi. Ez a módszer nem alkalmas néhány, er ősen színezett 
anyaghoz.
 
1.4.2.  Fűtőasztalok  
1.4.2.1.  Kofler-féle f űtőasztal  
A Kofler-féle f űtőasztal két, különböz ő hővezető képesség ű, elektro­
mosan melegített fémb ől áll, ahol a f űtőasztalt úgy tervezték, hogy a 
hosszúsága mentén a h őmérséklet-gradiens majdnem lineáris legyen. 
A fűtőasztal hőmérséklete 283-tól 573 K-ig változhat. A f űtőasztalt 
egy, a fűtőasztalhoz tervezett skálával és mutatót tartalmazó külön ­
leges hőmérsékletjelz ő készülékkel látták el. Az olvadáspont 
meghatározására az anyagot vékony rétegben közvetlenül a f űtőasztal 
felületére helyezik. Néhány másodpercen belül éles elválasztó vonal alakul ki a folyékony és szilárd fázis között. Ekkor a mutatót a vonal 
hátralévő részéhez állítva leolvassák az elválasztó vonalnál kapott 
hőmérsékletet.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Olvadásvizsgáló mikroszkóp  
Többféle, mikroszkóppal végrehajtott f űtőasztal-vizsgálat alkalmas a 
kis mennyiség ű anyag olvadáspontjának meghatározására. A f űtőasz­
talok többségében a h őmérsékletet érzékeny termoelemmel mérik, de 
esetenként higanyh őmérőt használnak. Egy jellegzetes mikroszkópos, 
fűtőasztalos olvadáspontvizsgáló-készülék olyan, fémlemezt tartal ­
mazó hevít őkamrával rendelkezik, amelyre a mintát egy tárgy ­
lemezen helyezik el. A fémlemez közepén lév ő nyílás lehet ővé teszi, 
hogy bejusson a fény a mikroszkóp megvilágító tükrér ől. Használat 
közben üveglappal fedik le a kamrát annak érdekében, hogy a vizs ­
gált területr ől kizárják a leveg őt. 
A minta hevítését reosztát szabályozza. Optikailag anizotróp anya ­
gokon történ ő nagyon pontos mérések végrehajtásához polarizált 
fény használható.  
1.4.2.3.  Meniszkusz-módszer  
Ezt a módszert kifejezetten poliamidokhoz használják.  
Vizuálisan meghatározzák azt a h őmérsékletet, amelynél egy 
fűtőasztal és egy, a poliamid próbadarab által tartott üvegfedél 
közé zárt szilikonolaj meniszkusza elmozdul.  
1.4.3.  Fagyáspont meghatározásának módszere  
A mintát speciális kémcs őbe helyezik a fagyáspont meghatározására 
szolgáló készülékbe. A mintát óvatosan és folyamatosan keverik a 
hűtés során, és megfelel ő időközönként megmérik a h őmérsékletét. 
Amikor a h őmérséklet néhány leolvasás során állandó marad, ezt a 
hőmérsékletet jegyzik fel (a h őmérő hibájának figyelembevételével) 
fagyáspontként.  
A túlhűtést a szilárd és a folyékony fázisok közötti egyensúly fenn ­
tartásával kell elkerülni.  
1.4.4.  Termikus analízis  
1.4.4.1.  Differenciál-termoanalízis (DTA)  
Ez a módszer az anyag és egy referenciaanyag közötti h őmérsék­
let-különbséget a h őmérséklet függvényében regisztrálja, miközben 
az anyagot és a referenciaanyagot ugyanazzal az irányított h őmér­
sékletprogrammal vizsgálják. Amikor a minta entalpiaváltozással járó fázisátalakuláson megy keresztül, ezt a változást a h őáramlási 
görbe alapvonalától való endoterm (olvadás) vagy exoterm (fagyás) 
eltérés jelzi.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Differenciál scanning kalorimetria (DSC)  
Ez a módszer egy anyagba és a referenciaanyagba történ ő ener­
giabevitelek közötti különbséget a h őmérséklet függvényében 
regisztrálja, miközben az anyagot és a referenciaanyagot ugyan ­
olyan irányított h őmérsékletprogrammal vizsgálják. Ez az energia 
az anyag és a referenciaanyag közötti nulla h őmérséklet- 
különbség létrehozásához szükséges energia. Amikor a minta entalpiaváltozással járó fázisátalakuláson megy keresztül, ezt a 
változást a h őáramlási görbe alapvonalától való endoterm (olva ­
dás) vagy exoterm (fagyás) eltérés jelzi.
 
1.4.5.  Dermedéspont  
Ezt a módszert ásványolajoknál történ ő használatra fejlesztették 
ki, és minden alacsony olvadáspontú, olajtartalmú anyaghoz hasz ­
nálható.  
Előzetes melegítés után a mintát meghatározott ütemben h űtik, és 
3 K hőfokintervallumonként megvizsgálják a folyási jellemz őit. 
Dermedéspontként azt a legalacsonyabb h őmérsékletet jegyzik fel, 
amelynél még megfigyelhet ő az anyag mozgása.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A következ ő táblázat sorolja fel az olvadáspont/olvadási tartomány 
meghatározásához használt különböz ő módszerek alkalmazhatóságát 
és pontosságát:  
TÁBLÁZAT: A MÓDSZEREK ALKALMAZHATÓSÁGA  
A. Kapilláris módszerek  
Mérési módszer Azok az 
anyagok, 
amelyek 
poríthatók Azok az anyagok, 
amelyek nem 
poríthatók könnyen Hőmérséklet- 
tartomány Becsült 
pontosság (  1 ) Meglévő szabvány  
Olvadáspontmér ő 
készülékek folya ­
dékfürdővel Igen Csak 
néhányhoz 273-tól 
573 K-ig ± 0,3K J1S K 0064 
Olvadáspontmér ő 
készülékek fémb ­
lokkal Igen Csak 
néhányhoz 293-tól > 
573 K-ig ± 0,5K ISO 1218 (E) 
Fotocellás 
meghatározás Igen Többféle 
Készülékkel, 
eszközzel 253-tól 
573 K-ig ± 0,5K  
( 1 ) A készülék típusától és az anyag tisztaságának fokától függ.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Fűtőasztalok és fagyasztási módszerek  
Mérési módszer Azok az 
anyagok, 
amelyek 
poríthatók Azok az anyagok, 
amelyek nem 
poríthatók könnyen Hőmérséklet- 
tartomány Becsült 
pontosság (  1 ) Meglévő szabvány  
Kofler-féle 
fűtőasztal rúd Igen Nem 283-tól > 
573 K-ig ± 1,0 K ANSI/ASTMD 
3451-76 
Olvadást vizsgáló 
mikroszkóp Igen Csak 
néhányhoz 273-tól > 
573 K-ig ± 0,5K DIN 53736 
Meniszkusz- 
módszer Nem Különösen 
poliamidokhoz 293-tól > 
573 K-ig ± 0,5K ISO 1218(E) 
Fagyáspont 
meghatározási 
módszer Igen Igen 223-tól 
573 K-ig ± 0,5 K pl. BS 4695  
( 1 ) A készülék típusától és az anyag tisztaságának fokától függ.  
C. Termoanalízis  
Mérési módszer Azok az 
anyagok, 
amelyek 
poríthatók Azok az anyagok, 
amelyek nem 
poríthatók könnyen Hőmérséklet- 
tartomány Becsült 
pontosság (  1 ) Meglévő szabvány  
Differenciál- 
termoanalízis Igen Igen 173-tól 
1 273 K-ig 600 K-ig 
± 0,5 K, 
1 273 K-ig 
± 2,0 K ASTM E 537- 76 
Differenciál scan ­
ning kalorimetria Igen Igen 173-tól 
1 273 K-ig 600 K-ig 
± 0,5 K, 
1 273 K-ig 
± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) A készülék típusától és az anyag tisztaságának fokától függ.  
D. Dermedéspont  
Mérési módszer Azok az 
anyagok, 
amelyek 
poríthatok Azok az anyagok, 
amelyek nem 
poríthatók könnyen Hőmérséklet- 
tartomány Becsült 
pontosság (  1 ) Meglévő szabvány  
Dermedéspont Ásványola ­
jokhoz és 
olajtartalmú 
anyagokhoz Ásványola ­
jokhoz és olaj ­
tartalmú anya ­
gokhoz 223-tól 
323K-ig ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) A készülék típusától és az anyag tisztaságának fokától függ.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
A nemzetközi és nemzeti szabványok csaknem minden vizsgálati 
módszert leírnak (lásd az 1. függeléket).  
1.6.1.  Módszerek kapilláris cs ővel 
Lassú hőmérséklet-növelés esetén a finom porrá őrölt anyagok rend ­
szerint az 1. ábrán látható olvadási szakaszokat mutatják.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
1. ábra
  
Az olvadáspont meghatározása során az olvadás kezdeti és végh ő­
mérsékletét jegyzik fel.  
1.6.1.1.  Olvadáspontmér ő folyadékfürd ő készülék  
A 2. ábra egy szabványosított, üvegb ől készített olvadáspontmér ő 
készüléktípust (JIS K 0064) mutat; minden méret milliméterben van megadva.
 
2. ábra
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Fürdőfolyadék:  
Megfelelő folyadékot kell választani. A folyadék kiválasztása a 
meghatározni kívánt olvadásponttól függ, például 473 K-nél nem 
magasabb olvadáspontokhoz folyékony paraffin, 573 K-nél nem magasabb olvadáspontokhoz szilikonolaj alkalmas.
 
523 K feletti olvadáspontokhoz három tömegrész kénsavból és két 
tömegrész káliumszulfátból álló keverék használható. Ennek haszná ­
lata esetén megfelel ő óvintézkedéseket kell tenni.  
Hőmérő: 
Csak azok a h őmérők használhatók, amelyek megfelelnek az alábbi, 
vagy ezzel egyenérték ű szabványok követelményeinek:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Eljárás:  
A száraz anyagot dörzscsészében finom porrá őrlik, és behelyezik 
az egyik végén leforrasztott kapilláris cs őbe úgy, hogy a töltési 
szint körülbelül 3 mm legyen szoros összetömörítés után. Az egységes tömörített minta eléréséhez a kapilláris csövet függ őlege­
sen, üvegcsövön keresztül óraüvegre kell ejteni körülbelül 700 mm 
magasságból.
 
A megtöltött kapilláris csövet úgy kell a fürd őbe helyezni, hogy a 
hőmérő higanygömbjének középs ő része azon a helyen érintkezzen a 
kapilláris cs ővel, ahol az anyag található. A kapilláris csövet álta ­
lában az olvadási h őmérsékletnél 10 K-nel alacsonyabb h őmérséklet 
mellett helyezik a készülékbe.  
A folyadékfürd őt úgy melegítik, hogy a h őmérséklet-növekedés 
mértéke körülbelül 3 K/perc legyen. A folyadékot keverni kell. 
Körülbelül 10 K-nel a várt olvadáspont el őtt a hőmérsékletnöveke ­
dési ütemet maximum 1 K/perc értékre kell módosítani.  
Számítás:  
Az olvadáspont számítása a következ őképpen történik:  
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E ) n 
Ahol:  
T = korrigált olvadáspont K-ben  
T D = a D h őmérő által mutatott h őmérsékletérték K-ben  
T E = az E h őmérő által mutatott h őmérsékletérték K-ben  
N = a D h őmérőn a folyadékfürd őből kiemelked ő részen a 
higanyoszlop fokbeosztásainak száma  
1.6.1.2.  Olvadáspontmér ő készülékek fémblokkal  
Készülék:  
A következ őkből áll:  
— hengeres fémblokk, amelynek a bels ő része üreges és kamrát 
alkot (lásd a 3. ábrát),  
— fémdugó, két vagy több furattal, amelynek segítségével csövek 
vezethetők a fémblokkba,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— egy, a fémblokkhoz létrehozott f űtőrendszer, amelyet például a 
fémblokkhoz csatolt, zárt elektromos ellenállás biztosít,  
— reosztát az energiabevitel szabályozásához, elektromos f űtés 
használatakor,  
— a kamra oldalfalain négy, h őálló üvegb ől készült ablak, 
egymással szemben, derékszögben elhelyezve. Az egyik ablak elé nézőkét szereltek fel a kapilláris cs ő megfigyeléséhez. A 
többi három ablakot lámpák segítségével a burkolat belsejének 
megvilágítására használják,
 
— egyik végén zárt, h őálló üvegb ől készült kapilláris cs ő (lásd az 
1.6.1.1. pontot).  
Lásd az 1.6.1.1. pontban említett szabványokat. Hasonló pontosságú 
termoelektromos mér őkészülékek is alkalmazhatók.  
3. ábra
  
1.6.1.3.  Fotocellás meghatározás  
Készülék és eljárás:  
A készülék egy automatikus h űtőrendszerrel ellátott fémkamrából áll. 
Három kapilláris csövet töltenek meg az 1.6.1.1. pontnak megfele ­
lően, és helyeznek a kemencébe.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Különböz ő lineáris h őmérséklet-növelési lehet őségek állnak rendel ­
kezésre a készülék kalibrálásához, az alkalmas h őmérséklet-növe ­
kedés beállítása elektromosan történik egy el őre kiválasztott kons ­
tans és lineáris értékre. Regisztráló készülékek mutatják a kemence tényleges h őmérsékletét és a kapilláris csövekben lév ő anyag 
hőmérsékletét.
 
1.6.2.  Fűtőasztalok  
1.6.2.1.  Kofler-féle f űtőasztal  
Lásd a függeléket.  
1.6.2.2.  Olvadásvizsgáló mikroszkóp  
Lásd a függeléket.  
1.6.2.3.  Meniszkusz-módszer (poliamidok)  
Lásd a függeléket.  
Az olvadásponton a hevítés sebességének 1 K/perc értéknél 
kisebbnek kell lennie.  
1.6.3.  A fagyáspont meghatározásának módszerei  
Lásd a függeléket.  
1.6.4.  Termikus analízis  
1.6.4.1.  Differenciál-termoanalízis  
Lásd a függeléket.  
1.6.4.2.  Differenciál scanning kalorimetria  
Lásd a függeléket.  
1.6.5.  Dermedéspont meghatározása  
Lásd a függeléket.  
2. ADATOK  
Néhány esetben a h őmérő helyesbítése szükséges.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az alkalmazott módszert,  
— az anyag pontos leírását (azonosság és szennyez ődések), és 
amennyiben volt ilyen, el őzetes tisztítási fokának pontos ismer ­
tetését,  
— a pontosság becslését.  
Legalább két, a becsült pontossági tartományban lév ő mért érték 
(lásd a táblázatokat) középértékét adják meg olvadáspontként.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Amennyiben az olvadás kezdetén és végs ő szakaszában mért h őmér­
séklet közötti különbség a módszer pontossági határai között van, az 
olvadás végs ő szakaszában mért h őmérsékletet kell olvadáspontnak 
tekinteni; egyébként meg kell adni mind a két h őmérsékletet.  
Amennyiben az anyag elbomlik vagy szublimál az olvadáspont 
elérése el őtt, meg kell adni azt a h őmérsékletet, amelynél ez a 
hatás megfigyelhet ő. 
A vizsgálati jelentésben közölni kell minden, az eredmények értel ­
mezése szempontjából lényeges információt és megjegyzést, külö ­
nösen azokat, amelyek az anyag szennyez ődéseivel és fizikai álla ­
potával kapcsolatosak.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 102. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II., 803–834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3  rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, part I, chapter VII.  
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Függelék  
További technikai információt például a következ ő szabványok nyújthatnak.  
1. Kapilláris módszerek  
1.1. Olvadáspontmér ő készülékek folyadékfürd ővel 
ASTM E 324-69 Standard test method for relatíve initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products
 
1.2. Olvadáspontmér ő készülékek fémblokkal 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunsts ­
toffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  
2. F űtőasztal  
2.1. Kofler-féle f űtőasztal 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Olvadáspont-vizsgáló mikroszkóp 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunsts ­
toffen  
2.3. Meniszkusz-módszer (poliamidok) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion materials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion”. Méthode du 
ménisque
 
3. Módszerek a fagyáspont meghatározására  
BS 4633 Method for the determination of 
crystallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling 
Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Termikus analízis  
4.1. Differenciál termoanalízis 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Differenciál scanning kalorimetria 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal 
analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Dermedéspont meghatározása  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits 
du pétrole: Point de trouble et point 
d'écoulement limite – Monsterneming 
en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. FORRÁSPONT  
1. MÓDSZER  
A leírt módszerek többsége az OECD vizsgálati irányelveken (1) 
alapul. Az alapelveket a (2) és (3) szakirodalom ismerteti.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az itt leírt módszerek és eszközök folyadékokhoz és alacsony olva ­
dáspontú anyagokhoz alkalmazhatók, feltéve hogy azok a forráspont alatt nem mennek keresztül kémiai reakción (például autooxidáció, 
átrendeződés, bomlás stb.). A módszerek tiszta és szennyezett folyé ­
kony anyagokhoz alkalmazhatók.
 
A hangsúly a fotocellás meghatározást és a termikus analízist hasz ­
náló módszereken van, mivel ezek a módszerek lehet ővé teszik az 
olvadás-, valamint a forráspontok meghatározását. Ezenkívül a mérések automatikusan hajthatók végre.
 
A „dinamikus módszernek” megvan az az el őnye, hogy a g őznyomás 
meghatározásához is alkalmazható, és nincs szükség a forráspontnak a normál nyomásra (105,325 kPa) történ ő átszámítására, mivel a 
normál nyomás a mérés során manosztát segítségével beállítható.
 
Megjegyzések:  
A szennyez ődéseknek a forráspont meghatározására gyakorolt hatása 
nagymértékben függ a szennyezés természetét ől. Amennyiben olyan 
illékony szennyezések vannak a mintában, amelyek befolyásolhatják 
az eredményt, az anyag még tisztítható lehet.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A normál forráspont az a h őmérséklet, amelynél valamely folyadék 
gőznyomása 101,325 kPa.  
Amennyiben a forráspontot nem normál légköri nyomáson mérik, a 
gőznyomásnak a h őmérséklett ől való függése a Clausius–Clapeyron 
egyenlet segítségével írható le:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ konstans  
ahol:  
p = az anyag g őznyomása Pascalban  
H v = az anyag párolgási h ője mol  –1 mértékegységben  
R = általános moláris gázállandó = 8,314 J mol  –1 K –1 
T = termodinamikus h őmérséklet K-ben  
A forráspontot a mérés során észlelhet ő környezeti nyomás figye ­
lembevételével adják meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Átszámítások  
Nyomás (mértékegysége: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(a „bar” még mindig megengedhet ő, de nem ajánlott)  
133 Pa = 1 Hgmm = 1 Torr 
(a „Hgmm” és „Torr” mértékegységek nem megenge ­
dettek)  
1 atm = normál atmoszféra = 101 325 Pa 
(az „atm” mértékegység nem megengedett)  
Hőmérséklet (mértékegység: K)  
t = T – 273,15  
t: Celsius h őmérséklet, Celsius-fok (  o C) 
T: termodinamikus h őmérséklet, Kelvin (K)  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel kapott eredményekkel.  
Néhány kalibrációs anyag a függelékben felsorolt módszerek leírá ­
sában található.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A forráspont (forrásponttartomány) meghatározására szolgáló öt 
módszer a forráspont mérésén, míg két további módszer termikus analízisen alapul.
 
1.4.1.  Meghatározás ebulliométer segítségével  
Az ebulliométereket eredetileg a forráspont-növekedés alapján 
történő molekulasúlymeghatározáshoz fejlesztették ki, de pontos 
forráspontmérésekhez is alkalmasak. Az ASTM D 1120-72-es szab ­
vány egy nagyon egyszer ű készüléket ismertet (lásd a függeléket). A 
folyadékot ebben a készülékben egyensúlyi körülmények között, légköri nyomáson forrásig hevítik.
 
1.4.2.  Dinamikus módszer  
E módszerrel a g őz újrakondenzálódási h őmérsékletét mérik forrás ­
kor, megfelel ő hőmérővel a refluxban. A módszerben a nyomás 
változtatható.  
1.4.3.  Desztillációs módszer forráspont meghatározására  
Ez a módszer a folyadék desztillálását, a g őz kondenzációs h őmér­
sékletének mérését és a desztillátum mennyiségének meghatározását 
foglalja magában.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Siwoloboff-módszer  
A mintát folyadékfürd őbe merített mintacs őben melegítik. A minta ­
csőbe bemerítenek egy, az alsó részében leveg őbuborékot tartalmazó, 
az alján összeolvasztott hajszálcsövet.  
1.4.5.  Fotocellás meghatározás  
A Siwoloboff-alapelvet követve automatikus fotoelektromos mérést 
hajtanak végre felszálló buborékok segítségével.  
1.4.6.  Differenciál-termoanalízis  
Ez a módszer az anyag és egy referenciaanyag közötti h őmérséklet- 
különbséget a h őmérséklet függvényében regisztrálja, miközben az 
anyagot és a referenciaanyagot ugyanazzal az irányított h őmérséklet ­
programmal vizsgálják. Amikor a minta entalpiaváltozással járó fázi ­
sátalakuláson megy át, ezt a változást a regisztrált h őmérsékleti görbe 
alapvonalától való endoterm eltérés (forrás) jelzi.  
1.4.7.  Differenciál scanning kalorimetria  
Ez a módszer az anyagba és a referenciaanyagba történ ő energiabe ­
vitelek közötti különbséget regisztrálja a h őmérséklet függvényében, 
miközben az anyagot és a referenciaanyagot ugyanazzal az irányított hőmérsékletprogrammal vizsgálják. Ez az energia az anyag és a 
referenciaanyag közötti nulla h őmérséklet-különbség létrehozásához 
szükséges energia. Amikor a minta entalpiaváltozással járó fázisát ­
alakuláson megy át, ezt a változást a h őáramlási görbe alapvonalától 
való endoterm eltérés (forrás) jelzi.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Az 1. táblázat sorolja fel a forráspont/forrástartomány meghatározá ­
sához használt különböz ő módszerek alkalmazhatóságát és pontos ­
ságát.  
1. táblázat  
A módszerek összehasonlítása  
Mérési módszer Becsült pontosság Meglév ő szabvány  
Ebulliométer ± 1,4 K (373 K-ig) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (600 K-ig) (  1 ) ( 2 ) ASTMD 1120-72 (  1 ) 
Dinamikus módszer ± 0,5 K (600 K-ig) (  2 ) 
Desztillációs folyamat (forrási 
tartomány) ± 0,5 K (600 K-ig) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Siwoloboff szerint ± 2 K (600 K-ig) (  2 ) 
Fotocellás meghatározás ± 0,3 K (373 K-ig) (  2 ) 
Differenciál-termokalorimetria ± 0,5 K (600 K-ig) 
± 2,0 K (1 273 K-ig) ASTM E 537-76 
Differenciál scanning kalorimetria ± 0,5 K (600 K-ig) 
± 2,0 K (1 273 K-ig) ASTM E 537-76  
( 1 ) Ez a pontosság csak az olyan egyszer ű készülékhez érvényes, mint amelyet például az ASTM D1120-70 ír le; a 
pontosság növelhet ő korszerű ebulliométerrel. 
( 2 ) Csak tiszta anyagokra érvényes. Más körülmények közötti használatát indokolni kell.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
A nemzetközi és nemzeti szabványok (lásd a függeléket) csaknem 
minden vizsgálati módszert tartalmaznak.  
1.6.1.  Ebulliométer  
Lásd a függeléket.  
1.6.2.  Dinamikus módszer  
Lásd a g őznyomás meghatározására szolgáló A.4-es vizsgálati 
módszert.  
Az észlelt forráspontot 101,325 kPa alkalmazott nyomás mellett 
adják meg.  
1.6.3.  Desztillációs folyamat (forrási tartomány)  
Lásd a függeléket.  
1.6.4.  Siwoloboff-módszer  
A mintát egy olvadáspontmér ő készülékben, egy körülbelül 5 mm 
átmérőjű mintacsőben melegítik (1. ábra).  
Az 1. ábra a szabványosított olvadás- és forráspontmér ő készülékek 
egyik típusát (JIS K 0064) mutatja be (üvegb ől készült, minden 
méret milliméterben van megadva).  
1. ábra
  
A mintacs őbe egy, az alsó vége fölött körülbelül 1 cm-rel leforrasz ­
tott kapilláris csövet helyeznek be (forrási kapilláris). A vizsgált anyagot addig töltik be, hogy a kapilláris leforrasztott szakasza a folyadék felszíne alatt legyen. A forrási kapillárist tartalmazó minta ­
csövet a h őmérőhöz rögzítik egy gumiszalaggal, vagy oldalról egy 
tartóval rögzítik (lásd a 2. ábrát):
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
2. ábra  
Müködési alapelv Siwoloboff szerint  3. ábra  
Módosított alapelv
  
A folyadékfürd őt a forráspontnak megfelel ően választják ki. 
573 K h őmérsékletig szilikonolaj használható. Paraffinolaj csak 
legfeljebb 473 K-ig használható. A fürd őben lévő folyadék mele ­
gítését el őször 3 K/perc h őmérséklet-növekedésre kell beállítani. A 
folyadékfürd őt keverni kell. A várt forráspont alatt körülbelül 10 
K-nel csökkenteni kell a melegítést úgy, hogy a h őmérséklet-növe ­
kedés üteme 1 K/perc értéknél kisebb legyen. A forráspont megközelítésekor gyors ütemben buborékok kezdenek megjelenni 
a forraló kapillárisból.
 
A forráspont az a h őmérséklet, amelynél, további h űtéskor, megáll 
a buboréklánc, és hirtelen növekedni kezd a folyadékszint a kapil ­
lárisban. Az ennek megfelel ő, a hőmérőn látható érték az anyag 
forráspontja.  
A módosított alapelv esetében (3. ábra) a forráspontot egy olvadás ­
pont mérésére szolgáló kapillárisban határozzák meg. Ezt a kapillá ­
rist megnyújtották hegyes csúcsúra körülbelül 2 cm hosszúságban (a), és ezzel kis mennyiség ű mintát szívnak fel. A hegyes kapilláris 
cső nyitott végét összeolvasztással lezárják úgy, hogy a végén legyen 
egy kis légbuborék. Az olvadáspont meghatározására szolgáló 
készülék melegítésekor (b) kitágul a légbuborék. A forráspont annak a h őmérsékletnek felel meg, amelynél az anyagból álló dugó 
eléri a folyadékfürd ő felületének szintjét (c).
 
1.6.5.  Fotocellás meghatározás  
A mintát egy f űtött fémblokkba helyezett kapilláris cs őben melegítik.  
A blokkban lév ő alkalmas nyílásokon keresztül egy fénysugarat 
irányítanak az anyagon át egy pontosan kalibrált fotocellára.  
A minta h őmérséklet-növekedése során egyenként légbuborékok 
jelennek meg a forrásban lév ő anyagot tartalmazó kapillárisból. A 
forráspont elérésekor nagymértékben megnövekszik a buborékok száma. Ez változást hoz létre a fényer őben, amelyet egy fotocella 
regisztrál, és stopjelet ad a blokkban elhelyezett platina ellenállás- 
hőmérő hőmérsékletét jelz ő készüléknek.
 
A módszer különösen hasznos, mivel lehet ővé teszi a szobah őmér­
séklet alatti meghatározásokat egészen 253,15 K-ig (–20  o C) anélkül, 
hogy bármilyen változtatást kellene végrehajtani a készülékben. A 
készüléket egyszer űen el kell helyezni egy h űtőfürdőben. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Termikus analízis  
1.6.6.1.  Differenciál-termoanalízis  
Lásd a függeléket.  
1.6.6.2.  Differenciál scanning kalorimetria  
Lásd a függeléket.  
2. ADATOK  
A normál nyomástól való kis eltéréseknél (max. ± 5 kPa) a forrás ­
pontokat T  n -re normalizálják az alábbi, Sidney Young-féle számér ­
tékegyenlet segítségével:  
T n = T + (f  T x Δ p) 
ahol:  
Δ p = (101,325 – p) [figyeljen az el őjelre]  
P = mért nyomás kPa mértékegységben  
f T = forráspontváltozás üteme a nyomás függvényében, K/kPa 
mértékegységben  
T = mért forráspont K-ben  
T n = normál nyomásra korrigált forráspont K-ben  
Számos anyagra a h őmérséklet-korrekciós tényez őket, az f  T -t, és a 
közelítő meghatározásokra szolgáló egyenleteket a fent említett 
nemzetközi és nemzeti szabványok tartalmazzák.  
Például a DIN 53171-es módszer a festékekben lév ő oldószerekhez a 
következő közelítő korrekciókat említi meg:  
2. táblázat  
Hőmerseklet-korrekcios tényez ők, F  T 
Hőmérséklet, T (K) Korrekciós tényez ő, f T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az alkalmazott módszert,  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyezések), és ameny ­
nyiben van ilyen, az el őzetes tisztítási fok pontos ismertetését,  
— a pontosság becslését.  
Legalább két, a becsült pontossági tartományban lév ő mért érték 
(lásd az 1. táblázatot) középértékét adják meg olvadáspontként.  
Meg kell adni a mért forráspontokat és azok középértékét, továbbá 
kPa-ban azt (azokat) a nyomást (nyomásokat), amelyeknél a méré ­
seket végrehajtották. A nyomásnak lehet őleg a normál légköri 
nyomáshoz kell közel lennie.  
Meg kell adni az eredmények értelmezéséhez lényeges valamennyi 
információt és megjegyzést, különösen azokat, amelyek az anyag 
szennyeződéseivel és fizikai állapotával kapcsolatosak.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, a 103. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, volume I, part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Függelék  
További technikai információt például a következ ő szabványok nyújthatnak:  
1. Ebulliométer  
1.1. Olvadáspontmér ő készülékek folyadékfürd ővel 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Desztillációs folyamat (forrási tartomány)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Differenciál-termoanalízis és differenciál scanning kalorimetria  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoa ­
nalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. RELATÍV S ŰRŰSÉG  
1. MÓDSZER  
A leírt módszerek az OECD vizsgálati irányelveken (1) alapulnak. 
Az alapelveket a (2) szakirodalom ismerteti.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az itt leírt, a relatív s űrűség meghatározására szolgáló módszerek 
szilárd és folyékony anyagokhoz alkalmazhatók, a tisztasági fokukra 
vonatkozó korlátozás nélkül. Az 1. táblázat sorolja fel a különböz ő 
alkalmazandó módszereket.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A szilárd anyagok vagy folyadékok D  20 4 relatív sűrűsége a vizsgált 
anyag 20  o C hőmérsékleten meghatározott térfogatának tömege és a 
4 o C hőmérsékleten meghatározott ugyanolyan térfogatú víz tömege 
közötti arány.  
A relatív s űrűség dimenzió nélküli szám.  
Valamely anyag ρ sűrűsége az m tömegének és v térfogatának a 
hányadosa. A ρ sűrűség Sí-mértékegységben kg/m  3 -ben van 
megadva.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK (1) (3)  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel nyert eredményekkel.  
1.4. A MÓDSZEREK ALAPELVE  
Négy különböz ő osztályba sorolt módszer használatos.  
1.4.1.  Felhajtóer őn alapuló módszer  
1.4.1.1.  Hidrométer (folyékony anyagokhoz)  
Megfelelően pontos és gyors s űrűségmeghatározások érhet ők el úszó 
hidrométerekkel, amelyek lehet ővé teszik valamely folyadék s űrű­
ségének meghatározását a merülési mélysége alapján, egy skála leolvasásával.
 
1.4.1.2.  Hidrosztatikus mérleg (folyékony és szilárd anyagokhoz)  
A levegőben és egy alkalmas folyadékban (például vízben) mért 
vizsgálati minta tömege közötti különbség használható a minta s űrű­
ségének meghatározására.  
Szilárd anyagok esetében a mért s űrűség csak az adott, méréshez 
használt minta s űrűségét reprezentálja. Folyadékok s űrűségének 
meghatározásához megmérik egy ismert v térfogatú test tömegét 
levegőben, majd a folyadékban.  
1.4.1.3.  Merül őtest-módszer (folyékony anyagokhoz) (4)  
E módszerben valamely folyadék s űrűségét a vizsgált folyadékba 
ismert térfogatú test bemerítése el őtt és után a folyadék tömegéb ől 
határozzák meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Piknométeres módszerek  
Szilárd anyagokhoz vagy folyadékokhoz különböz ő alakú és ismert 
térfogatú piknométerek használhatók. A s űrűséget a megtöltött és 
üres piknométer tömege közötti különbségb ől és annak ismert térfo ­
gatából számítják ki.  
1.4.3.  Leveg ő-összehasonlítású piknométer (szilárd anyagokhoz)  
A szilárd test s űrűsége, alakjától függetlenül, szobah őmérsékleten, 
gáz-összehasonlítású piknométerrel mérhet ő meg. Ehhez az anyag 
térfogatát leveg őben vagy inert gázban egy állítható, kalibrált térfo ­
gatú hengerben mérik meg. A s űrűség számításához a térfogatmérés 
befejezését követ ően tömegmérést végeznek.  
1.4.4.  Oszcillációs s űrűségmérő (5) (6) (7)  
Valamely folyadék s űrűsége megmérhet ő oszcillációs s űrűségmérő­
vel. Egy U-cs ő alakban gyártott mechanikus oszcillátort rezegtetnek 
az oszcillátor tömegét ől függő oszcillátor rezonanciafrekvenciáján, 
amely ennek tömegét ől függ. A minta bevitele megváltoztatja az 
oszcillátor rezonanciafrekvenciáját. A készüléket két, ismert s űrűségű 
folyékony anyag segítségével kell kalibrálni. Ezeket az anyagokat 
lehetőleg úgy kell kiválasztani, hogy a s űrűségük lefedje a mérni 
kívánt tartományt.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A relatív s űrűség meghatározására használt különböz ő módszerek 
alkalmazhatóságát a táblázat sorolja fel.  
1.6. A MÓDSZEREK LEÍRÁSA  
A függelék ismerteti azokat a példaként megadott szabványokat, 
amelyeket a további technikai részletek megismeréséhez tanulmá ­
nyozni kell.  
A vizsgálatokat 20  o C hőmérsékleten kell végrehajtani, és legalább 
két mérést kell elvégezni.  
2. ADATOK  
Lásd a szabványokat.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, az alábbi informá ­
ciókat kell tartalmaznia:  
— az alkalmazott módszert,  
— az anyag pontos leírását (azonosság és szennyez ődések) és 
előzetes tisztítási foka, amennyiben van ilyen.  
A D 20 
4 relatív sűrűséget az 1.2. pontban meghatározott módon kell 
megadni a mért anyag fizikai állapotával együtt.  
Meg kell adni az eredmények értelmezése szempontjából lényeges 
minden információt és megjegyzést, különösen azokat, amelyek az 
anyag szennyez ődéseivel és fizikai állapotával kapcsolatosak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Táblázat  
A módszerek alkalmazhatósága  
Mérési módszer Sűrűséget A leginkább lehet ­
séges dinamikus 
viszkozitás Meglévő szabványok 
Szilárd anyag Folyadék  
1.4.1.1. Hidrométer igen 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2 Hidrosztatikus mérleg a) szilárd anyagok igen ISO 1183 (A) b) folyadékok igen 5 Pa s ISO 901 és 758 
1.4.1.3. Mer űlőtest-módszer igen 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2. Piknométer ISO 3507 
a) szilárd anyagok igen ISO 1183(B) 
NF T 20-053 
b) folyadékok igen 500 Pa s ISO 758 1.4.3. leveg ő összehasonlítós 
piknométer igen DIN 55990 Teil 3. 
DIN 53243 
1.4.4. Oszcillációs s űrűségmérő igen 5 Pa s
 
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 109. vizsgálati irányelv, a Tanács C(81) 
30. határozata, végleges.  
(2) R. Weissberger ed, Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3  rd ed, chapter IV, Interscience 
Publ., New York, 1959, vol. I, part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.
 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 
427–430.  
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19., 297–302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brau ­
ereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Függelék  
További technikai információt például a következ ő szabványok nyújtanak:  
1. Felhajtóer őn alapuló módszer  
1.1. Hidrométer 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters
 
1.2. Hidrosztatikus mérleg  
Szilárd anyagokhoz  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids other than powders and cellular products 
– Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Folyékony anyagokhoz  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 és ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum 
products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3. Merül őtest-módszer 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of 
density; immersed body method  
2. Piknométeres módszerek  
2.1. Folyékony anyagokhoz 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than 100 x 
l0 –6 m 2 s –1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a 
kinematic viscosity of less than 100 x 10
 –6 m 2 s –1 at 20  o C, applicable in particular 
also to hydrocarbons and aqueous solutions 
as well as to liquids with higher vapour pres ­
sure, approximately 1 bar at 90  o C) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high a 
vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids 
which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compo ­
unds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer 
method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pycnometric method
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Szilárd anyagokhoz 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pycnometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Leveg ő-összehasonlítású piknométer  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. GŐZNYOMÁS  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer megfelel az OECD TG 104 (2004) jel ű módszernek.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az A.4. (1) módszer jelen átdolgozott változata tartalmaz egy újabb 
módszert: „Effúziós módszer: izoterm termogravimetria”, amit 
nagyon kis g őznyomású (10  –10 Pa-ig) anyagokra dolgoztak ki. Az 
eljárásokra vonatkozó igények, különösen a kis g őznyomású 
anyagok g őznyomásának mérése iránti igények alapján a módszer 
más eljárásai is átértékelésre kerültek további alkalmazási tartomá ­
nyokat illet ően. 
Termodinamikailag egyensúlyban lév ő tiszta anyagok g őznyomása 
csak a hőmérséklet függvénye. Az alapelvek ismertetése megtalál ­
ható az irodalomban (2)(3).  
Nincs egyetlen mérési eljárás a g őznyomás mérésére a 10  –10 Pa 
alattitól a 10  5 Pa-ig terjed ő tartomány egészére. Ez a módszer 
nyolc különböz ő gőznyomásmérési módszert foglal magában, 
melyek különböz ő gőznyomás-tartományokra alkalmazhatóak. Az 
1. táblázat a különböz ő módszereket hasonlítja össze az alkalma ­
zásuk és a mérési tartományok szerint. A módszereket csak olyan 
anyagok esetén lehet alkalmazni, amelyek nem bomlanak a mérés körülményei között. Azokban az esetekben, amikor kísérleti módszerek eljárástechnikai okok miatt nem alkalmazhatók, a 
gőznyomás becsléssel is megállapítható, és a függelék tartalmaz 
egy ajánlott becslési módszert.
 
1.2. DEFINÍCIÓK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Egy anyag g őznyomása definíció szerint a szilárd vagy folyékony 
anyag felett kialakult, telített g őz nyomása.  
A nyomás SI mértékegységét, a pascalt (Pa) kell használni. 
Korábban alkalmazott más mértékegységek, és átváltási tényez őik: 
1 torr = 1 Hgmm = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmoszféra = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Az SI szerinti h őmérséklet-mértékegység a kelvin (K). A Celsius fok 
átváltása kelvin fokra a következ ő egyenlet alapján történik:  
T = t + 273,15  
ahol T a kelvinben mért, más néven termodinamikai h őmérséklet, t 
pedig a h őmérséklet Celsius fokban.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
1. táblázat  
Mérési módszer Anyag becsült ismétel ­
hetőség becsült reprodu ­
kálhatóság ajánlott tartomány 
szilárd folyékony  
Dinamikus 
módszer kis olvadás ­
pont Igen 25 %-ig 
1–5 % 25 %-ig 
1–5 % 10 3 Pa–2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa–10  5 Pa 
Statikus eljárás Igen Igen 5–10 % 5–10 % 10 Pa–10  5 Pa 
10 –2 Pa–10  5 Pa (  1 ) 
Izoteniszkópos 
módszer Igen Igen 5–10 % 5–10 % 10  2 Pa–10  5 Pa 
Effúziós módszer: 
gőznyomás-egyen ­
súly Igen Igen 5–20 % 50 %-ig 10  –3 –1 Pa 
Effúziós módszer: 
Knudsen-cella Igen Igen 10–30 % — 10  –10 –1 P 
Effúziós módszer: 
izoterm termogra ­
vimetria Igen Igen 5–30 % 50 %-ig 10  –10 –1 Pa 
Gáztelítéses eljárás Igen Igen 10–30 % 50 %-ig 10  –10 –10  3 Pa 
Rotoros eljárás Igen Igen 10–20 % — 10  –4 –0,5 Pa  
( 1 ) Kapacitív manometer használatakor.  
1.3. A MÉRÉS ELVE  
A gőznyomás meghatározása általában különböz ő hőmérsékleteken 
történik. Véges h őmérséklettartományban a tiszta anyag g őznyomá­
sának logaritmusa lineáris függvénye a termodinamikai h őmérséklet 
reciprokának, az egyszer űsített Clapeyron-Clausius egyenlet szerint:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ állandó  
ahol:  
p = g őznyomás, pascal (Pa)  
ΔHv = párolgási entalpia, J mól  –1 
R = egyetemes gázállandó, 8,314 J mól  –1 K –1 
T = h őmérséklet, kelvin fok (K)  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. REFERENCIAANYAGOK  
Referenciaanyagokat nem szükséges használni. Ezek els ődlegesen a 
módszer alkalmasságának rendszeres ellen őrzésére szolgálnak, illetve 
lehetővé teszik a különböz ő módszerekkel kapott eredmények össze ­
hasonlítását.  
1.5. AZ ELJÁRÁS LEÍRÁSA  
1.5.1.  Dinamikus eljárás (Cottrell-módszer)  
1.5.1.1.  Elv  
Az anyag g őznyomását a forráspontnak különböz ő meghatározott 
nyomásokon (kb. 10  3 és 10  5 Pa közötti tartományban) történ ő mérésével 
határozzuk meg. Ez az eljárás ajánlott a forráspont meghatározására is. 
Erre a célra egészen 600 K-ig használható. A folyadékok forráspontja 
3–4 cm-rel a folyadék felszíne alatt közelít őleg 0,1  o C-kal nagyobb, mint 
a felszínén, a folyadékoszlop hidrosztatikai nyomása miatt. A Cottrell- módszernél (4) a h őmérő a folyadék felszíne fölötti g őztérben van, és a 
forrásban lév ő folyadék a forrás szivattyúzó hatásának köszönhet ően 
folyamatosan elborítja a h őmérő érzékelőjét. Ekkor egy vékony folya ­
dékréteg fedi be a h őmérő érzékelőgömbjét, amely egyensúlyt tart a 
gőzzel a környezeti nyomáson. A h őmérő így a valódi forráspontot 
mutatja, a túlhevítés, vagy a hidrosztatikai nyomásból ered ő hiba nélkül. 
Az eredeti Cottrell-szivattyú az 1. ábrán látható. Az A jel ű lombik tartal ­
mazza a forrásban lév ő folyadékot. Egy platinaszál (B) van a lombik 
fenekébe forrasztva, biztosítva az egyenletes forrást. A C jel ű csonk egy 
kondenzátorral van összekötve, a D jel ű köpeny pedig megakadályozza, 
hogy a hideg kondenzátum elérje a h őmérőt (E). Amikor a folyadék forr 
a lombikban, a tölcsér által felfogott buborékok és folyadék a szivattyú két ágán (F) keresztül ráfolyik a h őmérő gömbjére.  
1. ábra
 2 ábra
  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrell-szivattyú (4)  
A: Hőelem  
B: Vákuumpuffer  
C: Nyomásmér ő 
D: Vákuum  
E: Mérőpont 
F: Fűtőelem, körülbelül 150 W-os  
1.5.1.2.  Készülék  
A Cottrell-elv alapján m űködő, nagyon pontos készülék látható a 2. 
ábrán. Ez egy lombikból áll, amelynek az alsó részén történik a 
forralás, a középs ő részén van egy h űtő, és a fels ő részén van egy 
kivezetés és egy zárófedél. A Cottrell-szivattyú a forrástérben van elhelyezve, amit egy elektromos f űtőbetét hevít. A h őmérsékletet a 
zárófedélen keresztül bevezetett tokozott h őelem, vagy pedig ellen ­
állás-hőmérő méri. A kivezetés a nyomásszabályozó rendszerbe van 
bekötve. Az utóbbi egy vákuumszivattyúból, egy puffertérb ől, egy 
nitrogénadagolással m űködő nyomásszabályozóból, és egy nyomás ­
mérőből áll.
 
1.5.1.3.  Eljárás  
Az anyagot a forrástérbe helyezzük. Nem porszer ű szilárd anyagok 
problémát jelenthetnek, de ezek néha kiküszöbölhet őek a hűtőköpeny 
fűtésével. A készüléket a fedéllel lezárjuk, és az anyagot gáztala ­
nítjuk. Habzó anyag nem mérhet ő ezzel a módszerrel.  
Ezután beállítjuk a legkisebb kívánt nyomást és bekapcsoljuk a 
fűtést. Ugyanekkor a h őmérsékletérzékel őt rákötjük egy regisztráló ­
műszerre.  
Az egyensúlyt akkor értük el, amikor állandó nyomás mellett a 
regisztrálóm űszer állandó forrási h őmérsékletet mutat. Külön 
figyelmet kell fordítani arra, hogy elkerüljük a megfutást a forralás alatt. Fontos továbbá, hogy teljes kondenzáció történjen a h űtőben. 
Amikor kis olvadáspontú szilárd anyag g őznyomását határozzuk 
meg, figyelmet kell fordítani a h űtő esetleges eltöm ődésének elkerü ­
lésére is.
 
Az egyensúlyi pont regisztrálása után állítsuk be a következ ő kívánt 
nyomást. A folyamatot egészen a 10  5 Pa eléréséig folytatjuk 
(összesen kb. 5–10 mérési pont). Ellen őrzésként ismételjük meg az 
eljárást visszafelé, úgy, hogy a nyomásértékek csökkennek.  
1.5.2.  Statikus eljárás  
1.5.2.1.  Elv  
A statikus eljárásban (5), a g őznyomást egy adott h őmérsékleten 
termodinamikai egyensúlyban határozzuk meg. Ez az eljárás olyan anyagokhoz, többkomponens ű folyadékokhoz és szilárd anyagokhoz 
használható, melyek g őznyomástartománya 10
 –1 –10  5 Pa tarto­
mányban van, valamint, megfelel ő gondossággal, használható az 
1–10 Pa tartományban is.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Készülék  
A készülék egy állandó h őmérséklet ű (pontosság: ± 0,2 K) fürd őből, 
egy vákuumvezetékhez kapcsolt mintatartályból, egy nyomásmér ő­
ből, és egy nyomásszabályozó rendszerb ől áll. A mintatartály (3a. 
ábra) egy szelepen és egy nyomáskülönbség-mér őn (U-csöves mano ­
méter alkalmas folyadékkal) keresztül kapcsolódik a vákuumvezeték ­
hez, ez utóbbi a nulla nyomáskülönbség jelzésére szolgál. A nyomás ­
tartománytól és a mérend ő anyag kémiai viselkedését ől függően 
higany, szilikonok és ftalátok használhatók az U-csöves manométer ­
ben. Környezetvédelmi szempontok miatt azonban a higany haszná ­
lata lehet őség szerint kerülend ő. A mérend ő anyag nem oldódhat 
észlelhető mértékben az U-csöves manométerben lév ő folyadékban, 
és nem léphet vele reakcióba. Az U-csöves manométer helyett hasz ­
nálható nyomásmér ő (3b. ábra). Az U-csöves manométerben higany 
a légköri nyomástól a 10  2 Pa-ig terjed ő tartományban használható, 
míg a szilikonfolyadékok és ftalátok 10  2 Pa alatt is használhatók, 
egészen 10 Pa nyomásig. Léteznek más nyomásmér ők is, amelyeket 
lehet 10  2 Pa alatt használni, és a f űthető membrános kapacitív 
nyomásmér ők használhatók még 10  –1 Pa alatt is. A h őmérséklet 
mérése a mintát tartalmazó edény küls ő falán vagy magában az 
edényben történik.  
1.5.2.3.  Eljárás  
A 3a. ábrán látható készülék használata esetén a mérés megkezdése 
előtt az U-csöves manométert megtöltjük a kiválasztott folyadékkal, 
amelyet a mérések megkezdése el őtt melegítéssel gáztalanítani kell. 
Helyezzük be a mérend ő anyagot a készülékbe és gáztalanítsuk csök ­
kentett hőmérsékleten. Többkomponens ű minta esetében olyan kis 
hőmérsékletet kell alkalmazni, amelyen a mérend ő anyag összetétele 
még nem változik meg. Az egyensúly beállását keveréssel gyorsít ­
hatjuk. A minta folyékony nitrogénnel vagy szárazjéggel h űthető, de 
vigyázni kell, hogy elkerüljük a leveg őben lévő pára, vagy a szivaty ­
tyúfolyadék lecsapódását A mintatartó edény fölött lév ő szelepet 
kinyitva néhány perces szivattyúzással eltávolítjuk a leveg őt. Ha 
szükséges, a gáztalanítási m űveltet néhányszor megismételjük.  
3a. ábra
  3b. ábra
  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Amikor a szelep zárva van és hevítjük az anyagot, a g őznyomás n ő. 
Ez megváltoztatja a folyadék egyensúlyát az U-cs őben. Ellensúlyo ­
zandó ezt a hatást, nitrogént vagy leveg őt engedünk a rendszerbe 
addig, amíg a nyomáskülönbség-mér ő ismét nullát nem mutat. A 
kiegyenlítéshez szükséges nyomás értéke leolvasható a manométer ­
ről, vagy egy nagyobb pontosságú m űszerről. Ez a nyomás felel meg 
az anyag g őznyomásának az adott h őmérsékleten. Ha a 3b. ábrán 
látható készüléket használjuk, akkor a g őznyomás közvetlenül 
leolvasható.  
A gőznyomás meghatározása megfelel ő kis hőmérsékletintervallu ­
monként történik (összesen kb. 5–10 mérési pont) egészen a kívánt 
legnagyobb h őmérsékletig.  
A kis h őmérsékletértékeket eredményez ő méréseket ellen őrzés 
céljából meg kell ismételni. Ha a megismételt mérés eredménye 
nem esik egybe a növekv ő hőmérsékletre kapott görbével, az a 
következő két eset valamelyikére vezethet ő vissza:  
i. a minta még mindig tartalmaz leveg őt (pl. nagy viszkozitású 
anyagok esetében) vagy kis forráspontú anyagokat, melyek felsza ­
badulnak a melegítés alatt;  
ii. az anyagnál kémiai reakció lép fel a vizsgált h őmérséklettarto ­
mányban (pl. bomlás, polimerizáció).  
1.5.3.  Izoteniszkópos eljárás  
1.5.3.1.  Elv  
Az izoteniszkóp (6) a statikus eljárás elvén alapul. A módszernél az 
anyagot egy állandó h őmérsékleten tartott gömbbe helyezzük, és 
csatlakoztatunk egy manométert és egy vákuumszivattyút. Az 
anyagnál illékonyabb szennyez ődések csökkentett nyomás mellett 
gáztalanítással eltávolíthatók. A minta g őznyomását adott h őmérsék­
leteken ismert nyomású semleges gázzal egyensúlyba hozzuk. Az izoteniszkópot egyes folyékony szénhidrogének mérésére fejlesz ­
tették ki, de alkalmas szilárd anyagok vizsgálatára is. A módszer 
általában nem alkalmazható többkomponens ű rendszerek esetében. 
Nem illékony szennyez ődéseket tartalmazó minták esetében az ered ­
ményekben csak kisebb hibák jelentkeznek. Az ajánlott tartomány 
10
 2 –10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Készülék  
A mérőkészülékre a 4. ábrán látható példa. Teljes leírás az ASTM D 
2879–86 szabványban (6) található.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Eljárás  
Folyadékok esetén magát az anyagot használjuk tölt őfolyadékként az 
U-csöves manométerben. Az izoteniszkópba elegend ő folyadékot 
töltünk ahhoz, hogy a gömb és a manométer rövidebb szára feltöl ­
tődjön. Az izoteniszkópot csatlakoztatjuk egy vákuumrendszerhez, 
kiszivattyúzzuk a leveg őt majd megtöltjük nitrogénnel. A kiszivaty ­
tyúzást és a rendszer átöblítését kétszer megismételjük, hogy eltávo ­
lítsuk a maradék oxigént. A megtöltött izoteniszkópot vízszintes helyzetbe állítjuk, hogy a minta vékony rétegben szétterüljön a 
mintatartó gömbben és a manométerben. A rendszer nyomását 133 
Pa-ra csökkentjük, és a mintát óvatosan melegítjük, amíg éppen forrni nem kezd (az oldott gázok eltávolítása). Ezután az izotenisz ­
kópot úgy helyezzük el, hogy a minta visszatérjen a gömbbe és 
feltöltse a manométer rövid szárát. A nyomást 133 Pa-on kell tartani. 
A mintatartó gömb elnyújtott csúcsát kis lánggal hevítjük úgy, hogy a mintából felszabaduló g őz elegend ően kiterjedjen ahhoz, hogy 
kiszorítsa a minta egy részét a mintatartó gömb fels ő részéből és a 
manométer szárából a manométerbe, el őállítva így egy g őzzel töltött, 
nitrogénmentes teret. Ezután az izoteniszkópot állandó h őmérséklet ű 
fürdőbe merítjük, és a nitrogén nyomását beállítjuk úgy, hogy 
egyenlő legyen a mintáéval. Egyensúlyban a nitrogén nyomása 
megegyezik az anyag g őznyomásával.
 
4. ábra
  
Szilárd anyag esetén a h őmérséklet- és nyomástartománytól függ ően 
a manométer tölt őfolyadékaként szilikonfolyadékok, vagy ftalátok 
használhatók. A gáztalanított manométerfolyadékot az izoteniszkóp hosszú szárán kialakított öblösebb részbe töltjük be. Ezután a vizs ­
gálandó szilárd anyagot behelyezzük a mintatartó gömbbe, és mele ­
gítéssel gáztalanítjuk. Ezt követ ően az izoteniszkópot megdöntjük, 
hogy a manométerfolyadék befolyjon az U-cs őbe.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Effúziós eljárás: g őznyomás-egyensúly  (7) 
1.5.4.1.  Elv  
A vizsgálati anyagból vett mintát légüres búra alatt egy kis kemen ­
cében hevítjük. A kemence fedelén ismert átmér őjű kis lyukak 
vannak. Az anyag g őze kilép az egyik lyukon és egy nagyon érzé ­
keny mérleg serpeny őjébe jut, ami szintén a légüres búra alatt van. 
Néhány konstrukcióban a mérleg serpeny ője egy hűtődobozban van, 
ami hővezetéssel kivonja a h őt a kültérbe, és a serpeny őt hősugárzás 
révén hűti, hogy a g őz kondenzálódjon rajta. A kilép ő gőz nyoma­
téka erőként hat a mérlegre. A g őznyomást kétféleképpen kaphatjuk 
meg: közvetlenül a mérleg serpeny őjére ható er őből, vagy pedig a 
párolgási sebességb ől, a Hertz-Knudsen egyenlet segítségével (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
ahol:  
G = párolgási sebesség (kg s  –1 m –2 ) 
M = moláris tömeg (g mol  –1 ) 
T = h őmérséklet (K)  
R = egyetemes gázállandó (J mol  –1 K –1 ) 
p = g őznyomás (Pa)  
Az ajánlott tartomány 10  –3 –1 Pa.  
1.5.4.2.  Készülék  
A készülék m űködési elve az 5. ábrán látható.  
5. ábra
  
A: Alaplemez F: H űtődoboz és h űtőrúd 
B: Mozgó tekercses berendezés G: Párologtató kemence 
C: Búra H: Dewar-edény folyékony nitrogénnel D: Mérleg serpeny ővel I: Minta h őmérsékletének mérése 
E: Vákuummér ő műszer J: Mérend ő anyag
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Effúziós eljárás: Knudsen-cella  
1.5.5.1.  Elv  
Az eljárás a vizsgált anyag Knudsen-cellából (8) mikronyíláson ultra ­
vákuumban egységnyi id ő alatt gőz formában kilép ő tömegének 
becslésén alapul. A kilép ő gőz tömegét meghatározhatjuk a cella 
tömegvesztéséb ől, vagy úgy, hogy a g őzt kis hőmérsékleten konden ­
záltatjuk, és az elpárolgott anyag mennyiségét kromatográfiásan meghatározzuk. A g őznyomást a Hertz-Knudsen összefüggésb ől 
számolhatjuk ki (lásd 1.5.4.1.), a készülék paramétereit ől függő 
korrekciós tényez őkkel (9). Az ajánlott tartomány 10
 –10 –1 Pa (10) ­
(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Készülék  
A készülék m űködési elve a 6.ábrán látható.  
6. ábra
  
1: Vákuumcsatlakozás 7: Menetes fedél 
2: Platina ellenállás-h őmérő számára, vagy 
hőmérsékletmérésre és -szabályozásra 
szolgáló furatok 8: Szárnyas anyák 
3: Vákuumtartály fedele 9: Csavarok 
4: O-gy űrű 10: Effúziós cella saválló acélból 
5: Alumínium vákuumtartály 11: F űtőbetét 
6: Eszköz az effúziós cellák be- és kihelye ­
zéséhez  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Effúziós eljárás: izoterm termogravimetria  
1.5.6.1.  Elv  
A módszer a vizsgált anyag nagyobb h őmérsékleten és környezeti 
nyomáson fellép ő megnövelt párolgási sebességeinek termogravimet ­
riás módszerrel történ ő meghatározásán alapul (10)(15)(16)(17)(18) ­
(19)(20). A párolgási sebességeket (v  T ) úgy kapjuk, hogy a kiválasz ­
tott anyagot lassan áramló inert gáznak tesszük ki, és megfigyeljük az adott T izoterm h őmérsékleten (kelvin) megfelel ő időegységek 
alatt bekövetkez ő tömegveszteséget. A g őznyomást (p
 T ) a v  T érté­
kekből számítjuk ki, a g őznyomás logaritmusa és a párolgási 
sebesség logaritmusa közötti lineáris összefüggés segítségével. Ha 
szükséges, a (log p  T )-(1/T) görbét regressziós analízissel extrapolál ­
hatjuk 20 °C-ra és 25 °C-ra. Az eljárás alkalmas nagyon kicsi, 10  –10 
Pa (10  –12 mbar) gőznyomású anyagok méréséhez is, de csak nagyon 
nagy tisztaságú (majdnem 100 %-os) anyagok esetén, elkerülend ő a 
mért tömegvesztés hibás értelmezését.  
1.5.6.2.  Készülék  
Az kísérleti készülék m űködési elve a 7. ábrán látható.  
7. ábra
  
A mintatartó tányér szabályozott h őmérséklet ű kamrában függ egy 
mikromérlegen, és száraz nitrogén gáz áramlik át rajta, amely elszál ­
lítja a mérend ő anyagból elpárolgó molekulákat. A kamrából kilép ő 
gázáramot egy abszorpciós egység tisztítja.  
1.5.6.3.  Eljárás  
A mérend ő anyagot homogén rétegben szétterítjük egy érdesített 
felületű üvegtányéron. Szilárd anyagok esetén a tányért egyenletesen 
benedvesítjük az anyag megfelel ő oldószerben képzett oldatával, és 
inert gázzal megszárítjuk. A méréshez a tányért, rajta a mintával, 
felfüggesztjük a termogravimetriás analizátorban, és folyamatosan 
mérjük a tömegvesztését az id ő függvényében.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Az adott h őmérséklethez tartozó párolgási sebességet (v  T ) a minta ­
tartó tányér Δm tömegvesztéséb ől számítjuk a következ ő képlettel:  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
Ahol az F a mérend ő anyag felszíne, szokásosan a mintatányér 
felszíne, a t pedig a Δm tömegvesztéshez tartozó id őtartam.  
A gőznyomás (p  T ) a v  T párolgási sebesség függvényeként számol ­
ható:  
Log p  T = C + D log v  T , 
ahol a C és D állandók, melyek az adott kísérleti elrendezésre jellem ­
zőek és a használt mér őkamra átmér őjétől és a gáz áramlási sebes ­
ségétől függenek. Ezeket az állandókat egyszer kell meghatározni, 
ismert gőznyomású vegyületek mérésével és a kapott (log p  T )-(log v) 
függvények regresszióelemzésével (11)(21)(22).  
A gőznyomás (p  T )és a hőmérséklet T (kelvin) közötti összefüggést a 
következő egyenlet adja meg:  
Log p  T = A + B 1/T  
ahol A és B a (log p  T )-(1/T) függvény regresszióelemzésével kapott 
állandók. Az egyenlet segítségével a g őznyomás extrapolációval 
átszámolható bármely más h őmérsékletre.  
1.5.7.  Gáztelítéses eljárás  (23)  
1.5.7.1.  Elv  
Semleges gáz ismert sebességgel, szobah őmérsékleten áramlik a 
mintaanyag felett vagy azon keresztül, elég lassan ahhoz, hogy megtörténjen a telít ődés. A gázfázis telítettségének elérése kritikus 
fontosságú. A gáz által szállított anyagot felfogjuk, általában abszor ­
benssel, és ezt a felfogott anyagmennyiséget határozzuk meg. A g őz 
felfogása és az azt követ ő analízis alternatívájaként a szállított anyag 
mennyiségi meghatározására folyamatos analitikai technikák is hasz ­
nálhatók, mint például gázkromatográfia. A g őznyomás annak a 
feltételezésnek az alapján számítható ki, hogy érvényes az ideális ­
gáz-törvény, és hogy a gázkeverék össznyomása megegyezik az azt alkotó gázok parciális nyomásának összegével. A mintaanyag parci ­
ális nyomása, azaz a g őznyomás az ismert össz-gáztérfogatból és a 
gáz által szállított anyag tömegéb ől számítható ki.
 
A gáztelítéses eljárás szilárd, vagy folyékony anyagok mérésére 
használható. Egészen 10  –10 Pa gőznyomásig alkalmazható (10)(11) ­
(12)(13)(14). Az eljárás 10  3 Pa gőznyomás alatt a legmegbízhatóbb. 
Általában 10  3 Pa felett a g őznyomás értéke túlbecsült, valószín űleg 
aeroszol-képz ődés miatt. Mivel a g őznyomás-mérés szobah őmérsék­
leten történik, nincs szükség nagy h őmérsékletr ől történő extrapolá ­
lásra – amely gyakran komoly hibákat okoz – és így az elkerülhet ő. 
1.5.7.2.  Készülék  
Az eljárás állandó h őmérséklet ű készülék használatát igényli. A 8. 
ábrán lév ő rajzon látható készülékben három-három mintatartó van 
folyékony, illetve szilárd mintákhoz, ami lehet ővé teszi egy szilárd 
vagy folyékony minta hármas elemzését. A h őmérsékletszabályozás 
pontossága ± 0,5 °C, vagy jobb.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
8. ábra
  
Inert vivőgázként általában nitrogént használunk, de esetenként más 
gáz lehet szükséges (24). A viv őgáznak száraznak kell lennie. A 
gázáram 6 részáramra van osztva, amelyeket t űszelep szabályoz 
(kb. 0,79 mm-es szelepnyílás), és 3,8 mm bels ő átmérőjű rézcsö­
veken keresztül jut be az edénybe. A h őmérséklet kiegyenlít ődése 
után a gáz átáramlik a mintán és az abszorbensen, majd kilép a 
készülékb ől. 
Szilárd mintákat 5 mm-es bels ő átmérőjű üvegcsőbe, üveggyapot- 
dugók közé töltünk (9. ábra). A 10. ábrán egy folyadékminta-tartó 
és abszorpciós rendszer látható. Folyadékok g őznyomás-mérésének 
legjobban reprodukálható módszere az, hogy a folyadékot üveg ­
gyöngyre vagy inert abszorbens anyagra (pl. szilika) visszük fel, és 
a mintatartót ezekkel a gyöngyökkel töltjük meg. Más megoldásként 
a vivőgáz durva üvegszemcséken áramlik keresztül, és átbuborékol a 
vizsgált anyag folyadékoszlopán.  
9. ábra
  10. ábra
  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Az abszorbensrendszer egy elüls ő és egy hátsó abszorbensszakaszból 
áll. Nagyon kis g őznyomáson az abszorbens csak csekély mennyi ­
séget tart vissza és a minta és az abszorbens között lév ő üveggya ­
poton és üvegcsövön lejátszódó abszorpció komoly probléma lehet.  
Egy másik hatékony módja az elpárolgott anyag felfogásának a 
szárazjéggel h űtött folyadékcsapda. Nem okoz ellennyomást a telít ő 
oszlopon, és a felfogott anyag teljes mennyisége is könnyen vissza ­
nyerhető. 
1.5.7.3.  Eljárás  
A kilépő vivőgáz áramlási sebességét szobah őmérsékleten hatá ­
rozzuk meg. Az áramlási sebességet gyakran kell ellen őrizni a 
kísérlet folyamán, biztosítandó, hogy pontos érték álljon rendelke ­
zésre a viv őgáz össztérfogatára vonatkozóan. Célszer ű folyamatos 
ellenőrzést végezni tömegáram-mér ővel. A gázfázis telítése meglehe ­
tősen hosszú tartózkodási id őt igényel, így a gázáramlási sebességek 
meglehetősen kicsik lesznek (25).  
A kísérlet végén mind az elüls ő, mind a hátsó abszorbensszakaszt 
külön-külön elemezzük. A vegyületet mindegyik szakaszban oldó ­
szer hozzáadással deszorbeáljuk. A kapott oldatokat kvantitatív elem ­
zésnek vetjük alá az egyes szakaszokból deszorbeált mennyiségek 
meghatározására. A vizsgált anyag jellege szabja meg az analitikai 
módszer kiválasztását (illetve az abszorbens és a deszorpcióhoz hasz ­
nált oldószer kiválasztását is). A deszorpció hatékonyságát úgy hatá ­
rozzuk meg, hogy ismert mennyiség ű mintát juttatunk az abszor ­
bensre, majd deszorbeáljuk és meghatározzuk a visszanyert anyag ­
mennyiséget. Fontos ellen őrizni a deszorpció hatékonyságát a kísér ­
letben használt, vagy ahhoz közeli mintakoncentrációkkal.  
Három különböz ő gázáramlási sebességet kell használni, biztosí ­
tandó, hogy a viv őgáz telítődjön a minta g őzével. Ha a számított 
gőznyomás-értékek azt mutatják, hogy függetlenek az áramlási 
sebességt ől, akkor a gázt telítettnek tételezzük fel.  
A gőznyomás a következ ő egyenletb ől számítható ki:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
ahol:  
p = gőznyomás (Pa)  
W = elpárolgott minta tömege (g)  
V = a telített gáz térfogata (m  3 ) 
R = egyetemes gázállandó, 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = hőmérséklet (K)  
M = a vizsgált anyag moláris tömege (g mol  –1 ) 
A mért térfogatot korrigálni kell az áramlásmér ő és a telít ő közötti 
nyomás- és h őmérsékletkülönbségekkel.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Rotoros eljárás  
1.5.8.1.  Elv  
Ez az eljárás rotoros viszkozitásmér őt használ, amelyben a mér őelem 
egy mágneses térben lebeg ő, kis acélgolyó, amelyet forgó mágneses 
mező forgat (26)(27)(28). A forgási sebességét felvev őtekercsek 
mérik. Amikor a golyó elért egy adott fordulatszámot (rendszerint 
kb. 400 fordulat/sec), kikapcsoljuk a forgatómágneseket és a gázban fellépő súrlódás következtében a golyó lassulni kezd. A forgási 
sebesség csökkenését az id ő függvényében mérjük. A g őznyomást 
az acélgolyó nyomásfügg ő lassulásából számíthatjuk. Az ajánlott 
tartomány 10
 –4 –0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Készülék  
A kísérleti készülék sematikus ábrája a 11. ábrán látható. A mér őfej 
egy 0,1 °C pontossággal szabályozott állandó h őmérséklet ű szek­
rényben van. A mintatartó egy külön szekrényben van, és ennek is 
0,1 °C-on belül szabályozzuk a h őmérsékletét. A készülék minden 
más részén a h őmérsékletnek ennél nagyobbnak kell lennie, hogy 
elkerüljük a kondenzációt. Az egész készülék egy nagy vákuumot 
biztosító rendszerrel van összekapcsolva.  
11. ábra
  
2. ADATOK ÉS DOKUMENTÁCIÓ  
2.1. ADATOK  
A fenti ELJÁRÁSOK bármelyikével kapott g őznyomást legalább két 
hőmérsékleten kell meghatározni. Három, vagy ennél több pont aján ­
lott 0–50 °C tartományban, hogy ellen őrizzük a g őznyomás-görbe 
linearitását. Az effúziós módszer (Knudsen-cella és izoterm termog ­
ravimetria) és a gáztelítéses módszer esetén a 0–50 °C mérési h őmér­
séklettartomány helyett 120–150 °C tartomány ajánlott.  
2.2. MÉRÉSI JEGYZ ŐKÖNYV  
A mérési jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell a következ ő informáci ­
ókat:  
— alkalmazott módszer,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— a minta pontos leírása (megnevezés és szennyez ők), és adott 
esetben az el őzetes tisztítási m űveletek,  
— legalább két g őznyomás- és h őmérsékletérték (de három vagy 
több ajánlott) a 0–50 °C (vagy 120–150 °C) tartományban,  
— legalább egy mérésnek 25 °C-on vagy az alatt kell történnie, ha a 
választott módszerrel ez technikailag lehetséges,  
— minden eredeti adat,  
— a (log p)–(1/T) görbe,  
— a gőznyomás becslése 20 vagy 25 °C-ra.  
Ha átalakulás lép fel (halmazállapot-változás, bomlás), a következ ő 
információkat fel kell tüntetni jegyz őkönyvben:  
— a változás jellege,  
— az a h őmérséklet, ahol a változás bekövetkezett légköri 
nyomáson,  
— gőznyomás 10 és 20c°C-kal az átalakulási h őmérséklet alatt és 
10 és 20 °C-kal e h őmérséklet felett (kivéve, ha az átalakulás 
szilárd állapotból gáz állapotba történik).  
Minden, az eredmények értelmezése szempontjából fontos informá ­
ciót és észrevételt fel kell tüntetni a jegyz őkönyvben, különösen a 
minta szennyez ődéseire és az anyag fizikai állapotára vonatkozókat.  
3. IRODALOM  
(1) Official Journal of the European Communities L 383 A, 26–47 
(1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static 
method.  
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 
34, 593.  
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521–532.  
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth 
Edition (2000)  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination 
of small vapour pressures determination of the vapour pressures of 
some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147.
 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393–400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relati ­
onship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982) 161–168.  
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric 
Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27–31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermog ­
ravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512–20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C.
 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Regis ­
ter, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Függelék  
Becslési eljárás  
BEVEZETÉS  
A gőznyomásra becsült értéket használhatunk a következ ő esetekben:  
— annak eldöntésére, hogy melyik kísérleti módszer a megfelel ő, 
— becsült érték vagy határérték megadására, amikor a kísérleti módszer tech ­
nikai okok miatt nem kivitelezhet ő. 
BECSLÉSI MÓDSZER  
Folyadékok és szilárd anyagok g őznyomása megbecsülhet ő a módosított Watson- 
korrelációval (a). Az egyetlen szükséges kísérleti adat a normál forráspont. Az 
eljárás a 10  –5 Pa–10  5 Pa tartományban alkalmazható.  
Részletes információk találhatók a „Handbook of Chemical Property Estimation 
Methods” cím ű kézikönyvben (b). Lásd még: OECD Environmental Monograph 
No. 67 (c).  
SZÁMÍTÁSI ELJÁRÁS  
A gőznyomás a következ ők szerint számolható:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
ahol:  
T = a kérdéses h őmérséklet  
T b = a normál forráspont  
P vp = gőznyomás a T h őmérsékleten  
ΔH vb = párolgási entalpia  
ΔZ b = kompresszibilitási tényez ő (becsült: 0,97)  
m = tapasztalati tényez ő, a vizsgált h őmérsékleten fennálló fizikai álla ­
pottól függ  
Továbbá,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
ahol K  F egy tapasztalati tényez ő az anyag polaritásának figyelembevétele céljá ­
ból. Néhány vegyülettípus K  F tényezője megtalálható az irodalomban (b).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Elég gyakran olyan adatok állnak rendelkezésre, ahol a forráspont kisebb 
nyomásra van megadva. Ebben az esetben a g őznyomást a következ ők szerint 
számítjuk:  
lnP vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
ahol T  1 a kisebb P  1 nyomáson mért forráspont.  
DOKUMENTÁCIÓ  
A becslési módszer használata esetén a jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell a 
számítás átfogó dokumentációját.  
IRODALOM  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. FELÜLETI FESZÜLTSÉG  
1. MÓDSZER  
Az itt leírt módszerek az OECD vizsgálati irányelvén alapulnak. Az 
alapelveket a (2) szakirodalom ismerteti.  
1.1. BEVEZETÉS  
A leírt módszerek vizes oldatok felületi feszültségének méréséhez 
alkalmazhatók.  
E vizsgálat végrehajtásához hasznos el őzetes információkat szerezni 
az anyag vízben való oldhatóságáról, szerkezetér ől, hidralizáló tulaj ­
donságairól és a micellák képz ődése szempontjából kritikus koncent ­
rációjáról.  
A következ ő módszerek a legtöbb vegyi anyaghoz alkalmazhatók, 
tisztasági fokuktól függetlenül mindenfajta korlátozás nélkül.  
A gyűrűs felületifeszültség-mér ő módszerrel végrehajtott felületife ­
szültség-mérés körülbelül 200 mPa s-nél kisebb, dinamikus viszko ­
zitású vizes oldatokra korlátozódik.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az egységnyi területre vonatkoztatott szabad felületi entalpiát felületi 
feszültségnek nevezzük.  
A felületi feszültséget a következ őképpen adják meg:  
N/m (SI-mértékegység); vagy  
mN/m (SI-almértékegység);  
1 N/m = 10  3 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyn/cm az elavult CGS-rendszerben.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel nyert eredményekkel.  
Az 1. és 3. szakirodalom a felületi feszültségek széles tartományát 
felölelő referenciaanyagokat ismertet.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A módszerek annak a maximális er őnek a mérésén alapulnak, 
amelyet függ őlegesen kell kifejteni egy mér őcsészébe elhelyezett 
vizsgálandó folyadék felületével érintkez ő mérőkengyelre vagy 
gyűrűre, annak e felülett ől történő elválasztása érdekében, vagy 
egy lemezre, amelynek egyik széle érintkezik a felülettel, a kialakult film kiemelése érdekében.
 
Azokat az anyagokat, amelyek legalább 1 mg/l koncentrációban 
oldhatók vízben, vizes oldatban vizsgálják egyetlen koncentráció mellett.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
E módszerek nagyobb pontosságra képesek, mint amelyre a környe ­
zeti értékeléshez valószín űleg szükség van.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Elkészítik az anyag oldatát desztillált vízben. Az oldat koncentráci ­
ójának az anyag telített vizes oldatához tartozó koncentrációérték 90 %-ának kell lennie; ha ez a koncentráció meghaladja az 1 g/l 
értéket, 1 g/l koncentrációt használnak a vizsgálathoz. Nem kell 
megvizsgálni azokat az anyagokat, amelyek oldhatósága a vízben 1 mg/l-nél kisebb.
 
1.6.1.  Lemezes módszer  
Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid 
films).  
1.6.2.  Kengyeles módszer  
Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid 
films).  
1.6.3.  Gy űrűs módszer  
Lásd az ISO 304 és NF T 73-060 szabványokat (Surface active 
agents – determination of surface tension by drawing up liquid films).
 
1.6.4.  Az OECD által harmonizált gy űrűs módszer  
1.6.4.1.  Készülék  
E méréshez megfelel őek a kereskedelemben kapható felületifeszült ­
ség-mérők. Ezek a következ ő részekből állnak:  
— mobil mintaasztal,  
— erőmérő rendszer,  
— mérőtest (gyűrű), 
— mérőtartály.  
1.6.4.1.1. M o b i l m i n t a a s z t a l  
A mobil mintaasztalt a vizsgálandó folyadékot tartalmazó, szabályo ­
zott hőmérséklet ű mérőtartály tartójaként használják. Az er őmérő 
rendszerrel együtt egy talpazatra kell felszerelni.  
1.6.4.1.2. E r ő m é r ő r e n d s z e r  
Az erőmérő rendszer (lásd az ábrát) a mintaasztal fölött helyezkedik 
el. Az er őmérés hibájának nem szabad ± 10  –6 N-nál nagyobbnak 
lennie, a tömegmérés ± 0,1 mg hibahatárának megfelel ően. A keres ­
kedelemben kapható felületifeszültség-mér ő mérőskálája legtöbbször 
mN/m-ben lett kalibrálva azért, hogy a felületi feszültség közvetlenül 
mN/m-ben legyen leolvasható, 0,1 mN/m pontossággal.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M é r ő t e s t ( g y ű r ű ) 
A gyűrű rendszerint körülbelül 0,4 mm vastagságú és 60 mm átlagos 
átmérőjű, platinairídium huzalból készül. A huzalgy űrűt vízszintesen 
függesztik le egy fémt űről és egy huzalszerel ő kengyelr ől az erőmérő 
rendszerhez történ ő csatlakozás létrehozása érdekében (lásd az ábrát).  
Ábra  
Mérőtest 
(Minden méret mm-ben van megadva)
  
1.6.4.1.4. M é r ő t a r t á l y  
A vizsgált oldatot tartalmazó mér őtartálynak szabályozott h őmérsék­
letű üvegtartálynak kell lennie. Úgy kell tervezni, hogy a mérés 
során a vizsgálandó oldat folyadékfázisának és a felszín feletti gázfá ­
zisnak a h őmérséklete állandó maradjon, és a minta ne párolog ­
hasson el. 45 mm-nél nem kisebb bels ő átmérőjű hengeres üvegtar ­
tályok elfogadhatók.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  A készülék el őkészítése  
1.6.4.2.1. T i s z t í t á s  
Az üvegtartályokat gondosan meg kell tisztítani. Amennyiben szük ­
séges, azokat forró króm-kénsavval és ezt követ ően tömény (83–98 
tömegszázalékos H  3 PO 4 ) foszforsavval kell mosni, alaposan le kell 
öblíteni csapvízben, és végül kétszer desztillált vízben kell mosni 
mindaddig, amíg semleges nem lesz, majd meg kell szárítani, és ki 
kell öblíteni a vizsgált folyadék egy részével.  
A gyűrűt először minden vízben oldható anyag eltávolítása érde ­
kében alaposan le kell öblíteni vízben, rövid id őre be kell meríteni 
króm-kénsavba, le kell mosni kétszer desztillált vízzel, amíg 
semleges nem lesz, és végül rövid ideig melegíteni kell metanol láng fölött.
 
Megjegyzés:  
Az olyan anyagokkal történ ő szennyezést, amelyek a króm- 
kénsavban vagy a foszforsavban nem oldódnak fel vagy nem 
bomlanak el – ilyenek például a szilikonok – alkalmas szerves oldó ­
szer segítségével kell eltávolítani.  
1.6.4.2.2. A k é s z ü l é k k a l i b r á l á s a  
A készülék hitelesítése a nullapont ellen őrzéséből és ennek beállítá ­
sából áll úgy, hogy a m űszer jelzése mindig megbízható legyen 
mN/m-ben.  
Összeszerelés:  
A készüléket vízszintbe kell állítani, például a felületifeszültség-mér ő 
alaptestére elhelyezett vízszintez ő segítségével, az alaplapon elhelye ­
zett vízszintez ő csavarok állításával.  
A nullapont beállítása:  
A gyűrűnek a készülékre történ ő felszerelése után és a folyadékba 
bemerítés el őtt a felületifeszültség-mér ő által jelzett értéket nullára 
kell állítani, és ellen őrizni kell, hogy a gy űrű párhuzamos-e a folya ­
dékfelülettel. Ehhez a folyadékfelszín tükörként használható.  
Kalibráció:  
A tényleges vizsgálati kalibrálás a következ ő két eljárás valamelyi ­
kének a segítségével hajtható végre:  
a) Egy tömeg segítségével: ehhez az eljáráshoz 0,1 és 1,0 gramm 
közötti, ismert tömeg ű súlyokat helyeznek a gy űrűre. Ezt a Φ a 
kalibrálási tényez őt, amellyel minden, a m űszer által megadott 
értéket meg kell szorozni, a következ ő egyenletnek (1) megfele ­
lően kell meghatározni:  
Φ a ¼ σ r 
σ a 
ahol:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = a súly tömege (g)  
g = gravitációs gyorsulás (981 cm s  –2 tengerszinten)  
b = a gy űrű átlagos kerülete (cm)  
σ a = a felületifeszültség-mér ő által mutatott érték a gy űrűn a 
súly elhelyezése után (mN/m).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Víz segítségével: az eljárásnál tiszta vizet használnak, amelynek a 
felületi feszültsége, például 23  o C hőmérsékleten 72,3 mN/m. Az 
eljárás gyorsabb a súllyal történ ő kalibrációnál, de mindig fennáll 
az a veszély, hogy a víz felületi feszültségét meghamisítják a felületaktív anyagokkal történ ő szennyez ődési nyomok.
 
A Φ b kalibrálási tényez őt, amellyel a m űszer által mutatott 
minden értéket meg kell szorozni, a következ ő egyenletnek (2) 
megfelelően kell meghatározni:  
Φ b ¼ σ o 
σ g 
ahol:  
σ o = a szakirodalomban a víz felületi feszültségére megadott 
érték (mN/m)  
σ g = a víz felületi feszültségének mért értéke (mN/m), mind ­
kettő ugyanazon a h őmérsékleten.  
1.6.4.3.  Minták el őkészítése  
A vizsgált anyagokból vizes oldatot kell készíteni a szükséges 
koncentrációk használatával, és ezeknek nem szabad tartalmazniuk 
nem oldott anyagot.  
Az oldatot állandó h őmérsékleten (± 0,5  o C) kell tartani. Mivel a 
mérőtartályban lév ő oldat felületi feszültsége változik id ővel, több 
mérést kell végrehajtani különböz ő időpontokban, és fel kell rajzolni 
egy görbét, amely a felületi feszültséget mutatja az id ő függvényé ­
ben. Amennyiben további változás nem jön létre, beáll az egyensúlyi 
állapot.  
A mérést zavarják más anyagok por és gáznem ű szennyez ődései. 
Ezért a munkát véd őburkolat alatt kell végrehajtani.  
1.6.5.  Vizsgálati körülmények  
A mérést körülbelül 20  o C hőmérsékleten kell végrehajtani, és a 
hőmérsékletet ± 0,5  o C-on belül kell szabályozni.  
1.6.6.  A vizsgálat végrehajtása  
A mérend ő oldatokat be kell vinni a gondosan megtisztított mér őtar­
tályba, ügyelve a habosodás elkerülésére, és ezután a mér őtartályt rá 
kell helyezni a vizsgálókészülék asztalára. Az asztallapot a mér őtar­
tállyal együtt meg kell emelni, amíg a gy űrű bele nem merül az 
oldatba. Ezután az asztallapot fokozatosan és egyenletesen süllyesz ­
teni kell (körülbelül 0,5 cm/perc sebességgel) a gy űrűnek a felülett ől 
történő elválasztása érdekében, egészen a maximális er ő eléréséig. A 
gyűrűhöz tapadt folyadékrétegnek nem szabad leválnia a gy űrűről. A 
mérések elvégzése után a gy űrűt újra az oldatba kell meríteni, és a 
mérést meg kell ismételni, amíg a kapott felületi feszültség értéke állandó nem lesz. Az oldatnak a mér őtartályba helyezéséig eltelt id őt 
fel kell jegyezni minden egyes meghatározáshoz. Az értékek leolva ­
sását annál a maximális er őnél kell végrehajtani, amely ahhoz szük ­
séges, hogy elválassza a gy űrűt a folyadékfelülett ől.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. ADATOK  
A felületi feszültség kiszámításához a készüléken mN/m-ben leolva ­
sott értéket el őször meg kell szorozni (az alkalmazott kalibrálási 
eljárástól függ ően) Φ a vagy Φ b kalibrálási tényez ővel. Az így kapott 
érték csak közelít őleg érvényes, és ezért helyesbíteni kell.  
Harkins és Jordan (4) kísérletileg helyesbítési tényez őket határoztak 
meg a gy űrű méreteit ől, a folyadék s űrűségétől és ennek felületi 
feszültségét ől függő gyűrűs módszer által mért felületifeszültség-érté ­
kekhez.  
Mivel munkaigényes feladat a Harkins- és Jordan-táblázatokból 
minden egyes méréshez a helyesbítési tényez ő meghatározása, 
vizes oldatok felületi feszültségének kiszámításához használható az egyszerűsített eljárás, nevezetesen a helyesbített felületifeszültség- 
értékek közvetlen kiolvasása a táblázatból (interpolálni kell a táblá ­
zatban közölt értékek közé es ő értékekhez).
 
Táblázat:  
A mért felületi feszültség helyesbítése  
Csak vizes oldatokhoz, ρ = 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (gy űrű átlagos sugara) 
r = 0,185 mm (gy űrű huzalának sugara)  
Kisérleti érték (mN/m) Helyesbített érték (mN/m) 
Kalibráció vízre (lásd az 1.6.4.2.2. 
pont a) alpontja alatt) Kalibráció vízre (lásd az 1.6.4.2.2. 
pont b) alpontja alatt)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 
24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 
32 28,1 30,1 
34 29,9 32,1 
36 31,8 34,1 
38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 
42 37,6 40,3 
44 39,5 42,3 
46 41,4 44,4 
48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 
56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Kisérleti érték (mN/m) Helyesbített érték (mN/m) 
Kalibráció vízre (lásd az 1.6.4.2.2. 
pont a) alpontja alatt) Kalibráció vízre (lásd az 1.6.4.2.2. 
pont b) alpontja alatt)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 
66 61,2 65,5 
68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 —
 
Ezt a táblázatot a Harkins–Jordan-helyesbítés alapján állították össze. 
Hasonlít a DIN-szabványban (DIN 53914) lév ő, vízre és vizes olda ­
tokra (sűrűség, ρ = 1 g/cm  3 ) vonatkozó táblázathoz, és az R = 
9,55 mm (gy űrű átlagos sugara) és r = 0,185 mm (gy űrű huzalának 
sugara) méretekkel rendelkez ő, kereskedelmi forgalomban kapható 
gyűrűre érvényes. A táblázat tömeggel vagy vízzel végrehajtott 
kalibrálás után mért felületi feszültség értékek helyesbített értékeit adja meg.
 
Más lehet őségként, az el őző kalibrálás nélkül, a felületi feszültség a 
következő képletnek megfelel ően számítható ki:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
ahol:  
F = a film elszakadásakor a dinamométeren mért er ő 
R = a gy űrű sugara  
f = a helyesbítési tényez ő (1) 
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az alkalmazott módszert,  
— a vizsgálathoz használt víz vagy oldat típusát,  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a mérési eredményeket: felületi feszültség (leolvasott érték), 
megadva mind az egyes leolvasott értékeket, mind az adott számbeli középértéket, valamint a helyesbített középértéket (a 
berendezés tényez őjének és a helyesbítési táblázat figyelembe ­
vételével),
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— az oldat koncentrációját,  
— a vizsgálati h őmérsékletet,  
— a felhasznált oldat életkorát; különösen az oldat elkészítése és 
mérése közötti id őt, 
— az oldatnak a mér őtartályba helyezése után a felületi feszültség 
időfüggésének leírását,  
— az eredmények értelmezéséhez szükséges minden információt és 
megjegyzést közölni kell, különösen azokat, amelyek az anyag 
szennyeződéseivel és fizikai állapotával kapcsolatosak.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Figyelembe véve, hogy a desztillált víz felületi feszültsége 
72,75 mN/m 20  o C hőmérsékleten, azokat az anyagokat, amelyek 
60 mN/m-nél kisebb felületi feszültséget mutatnak e módszer felté ­
telei mellett, felületaktív anyagoknak kell tekinteni.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 115. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter XIV.
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. OLDHATÓSÁG VÍZBEN  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 105. vizsgálati iránymuta ­
tásában (1995) leírt módszerrel. A vizsgálati módszer az eredeti, 1981-ben elfogadott 105. vizsgálati iránymutatás átdolgozott változata. A jelenlegi és 
az 1981. évi változat között tartalmi különbség nincs. A módosítások els ő­
sorban formai jelleg űek. Az átdolgozás alapjául az „Oldhatóság vízben” 
elnevezés ű európai uniós vizsgálati módszer szolgált (
 1 ). 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
2. Egy anyag vízoldékonyságát jelent ősen befolyásolhatja a szennyez ődések 
jelenléte. Ez a vizsgálati módszer a lényegében tiszta, vízben stabil, nem 
illékony anyagok vízoldékonyságának megállapítására szolgál. A vízoldé ­
konyság megállapítása el őtt érdemes el őzetes információkat szerezni a vizs ­
gált anyagról, például annak szerkezeti képletér ől, gőznyomásáról, disszoci ­
ációs állandójáról és a pH függvényében kifejezett hidrolízisér ől. 
3. Ez a vizsgálati módszer két, a 10  –2 g/l alatti, illetve feletti oldhatóságra 
kiterjedő módszer – az oszlopelúciós és a lombikmódszer – leírását foglalja 
magában. Tartalmazza emellett egy egyszer ű előzetes vizsgálat leírását is. Ez 
utóbbi lehet ővé teszi a végleges vizsgálathoz használandó minta megfelel ő 
mennyiségének hozzávet őleges meghatározását, valamint a telítettség eléré ­
séhez szükséges id ő megállapítását.  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
4. Valamely anyag vízoldékonysága az anyag adott h őmérsékleten vízben 
fennálló telítettségi tömegkoncentrációját jelenti.  
5. A vízoldékonyságot oldott anyag tömege/oldattérfogat egységekben fejezik 
ki. Az SI-mértékegység a kg/m  3 , azonban a g/l is használható.  
REFERENCIAANYAGOK  
6. Az anyagok vizsgálata során nem szükséges referenciaanyagokat alkalmazni.  
A MÓDSZEREK LEÍRÁSA  
Vizsgálati körülmények  
7. A vizsgálatot lehet őleg 20 ± 0,5 °C h őmérsékleten kell végrehajtani. A 
kiválasztott h őmérsékletet állandó értéken kell tartani a berendezés minden 
lényeges részében.  
Előzetes vizsgálat  
8. Körülbelül 0,1 g, csiszolt üvegdugójú, 10 ml-es mér őhengerben lév ő 
mintához (ha a vizsgált anyag szilárd, porítani kell) adjunk hozzá fokoza ­
tosan egyre nagyobb térfogatú, szobah őmérséklet ű vizet. Minden egyes 
vízmennyiség hozzáadása után a keveréket 10 percig rázzuk, és szemrevé ­
telezéssel ellen őrizzük, hogy vannak-e a mintának fel nem oldott részei. 
Amennyiben 10 ml víz hozzáadása után a minta vagy annak egyes részei 
nem oldódtak fel, a kísérletet 100 ml-es mér őhengerben kell folytatni. A  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
lenti 1. táblázatban látható az oldhatóság közelít őleges értéke azon vízmeny ­
nyiség alatt, amelyben a minta teljesen feloldódik. Alacsony oldhatóság 
esetében a vizsgált anyag feloldása hosszú id őt vehet igénybe, és ez esetben 
legalább 24 órát kell várni. Ha a vizsgált anyag 24 óra elteltével sem oldódott fel, hosszabb ideig (akár 96 óráig) kell várni, vagy további hígí ­
tással próbálkozva meg kell állapítani, hogy az oszlopelúciós vagy a lombik ­
módszer alkalmazandó-e.
 
1. táblázat  
ml víz 0,1 g oldott anyaghoz 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
közelítőleges oldhatóság (g/l) > 1 000 1 000–2 ­
00 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1  
Oszlopelúciós módszer  
Elv 
9. Ez a módszer a vizsgált anyag vízzel, mikrooszlopból végrehajtott elúcióján 
alapul; az oszlop a vizsgált anyag feleslegével el őzetesen bevont inert 
hordozóanyaggal van megtöltve (2). A vízoldékonyságot az eluátum tömeg ­
koncentrációja határozza meg, amikor az koncentrációplatót ér el az id ő 
függvényében.  
Készülék  
10. A készülék egy állandó h őmérsékleten tartott mikrooszlopból áll (1. ábra). A 
mikrooszlop vagy egy újrakeringtet ő szivattyúhoz (2. ábra), vagy egy 
kiegyenlít ő tartályhoz (3. ábra) csatlakozik. A mikrooszlop inert hordozó ­
anyagot tartalmaz, amelyet egy, a részecskék kisz űrésére is szolgáló, kismé ­
retű üveggyapotdugó rögzít. Hordozóanyagként üveggyöngy, kovaföld vagy 
egyéb inert anyagok alkalmazhatók.  
11. Az 1. ábrán egy, az újrakeringtet ő szivattyúhoz való csatlakoztatásra 
alkalmas mikrooszlop látható. A mikrooszlop öt (a kísérlet elején kiöntött) tartálytérfogat és öt (a kísérlet során elemzési célból eltávolított) minta tárolására alkalmas tölt őtérrel rendelkezik. Más megoldásként kisebb méret 
is alkalmazható, ha a kísérlet során víz tölthet ő a rendszerbe a szennyez ő­
désekkel eltávolított öt kezdeti tartálytérfogat pótlására. Az oszlop inert anyagból készült csövön keresztül csatlakozik a körülbelül 25 ml/h áramlási sebesség elérésére képes újrakeringtet ő szivattyúhoz. Az újrakeringtet ő 
szivattyú például perisztaltikus szivattyú vagy membránszivattyú lehet. 
Gondoskodni kell arról, hogy a cs ő anyaga ne okozzon semmilyen szeny ­
nyeződést és/vagy adszorpciót.
 
12. A 3. ábrán egy kiegyenlít ő tartályt alkalmazó megoldás vázlatos elrendezése 
látható. Ebben az elrendezésben a mikrooszlop egyirányú üvegcsappal van ellátva. A kiegyenlít ő tartállyal való összeköttetést egy csiszolt üvegb ől 
készült csatlakozó és inert anyagból készült cs ővezeték biztosítja. A 
kiegyenlít ő tartályból való áramlás sebessége körülbelül 25 ml/óra kell, 
hogy legyen.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
1. ábra
  
A méretek mm-ben értend ők. 
A. Csiszolt üveg csatlakozó csatlakoztatási helye  
B. Felső tér 
C. Bels ő rész (5)  
D. Küls ő rész (19)  
E. Üveggyapot dugó  
F. Üvegcsap  
2. ábra
  
A. Atmoszférikus egyensúlyba hozatal  
B. Áramlásmér ő 
C. Mikrooszlop  
D. Szabályozott h őmérséklet ű keringtet ő szivattyú  
E. Újrakeringtet ő szivattyú  
F. Kétállású szelep mintavételhez  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
3. ábra
  
A. Kiegyenlít ő tartály (például 2,5 literes lombik)  
B. Oszlop  
C. Frakciógy űjtő 
D. Termosztát  
E. Tefloncs ő 
F. Csiszolt üveg csatlakozó  
G. Vízvezeték (a termosztát és az oszlop között, bels ő átmérője körülbelül 
8 mm)  
13. Töltsünk körülbelül 600 mg hordozóanyagot egy 50 ml-es gömblombikba. 
Oldjunk fel kell ő mennyiség ű vizsgált anyagot analitikai tisztaságú illékony 
oldószerben, és ebb ől az oldatból megfelel ő mennyiséget adjunk hozzá a 
hordozóanyaghoz. Az oldószert teljesen párologtassuk el, például forgó párologtatóval, mivel egyébként az elúciós lépés során a felületen jelentkez ő 
megoszlás miatt nem érhet ő el a hordozóanyag vízzel történ ő telítése. A 
megtöltött hordozóanyagot két órán át áztassuk körülbelül 5 ml vízben, és 
ezután a szuszpenziót töltsük a mikrooszlopba. Más megoldásként száraz megtöltött hordozóanyag önthet ő a vízzel teli mikrooszlopba, és körülbelül 
két óra alatt hozható egyensúlyba.
 
14. A hordozóanyag megtöltése problémákat, és következésképpen hibás ered ­
ményeket okozhat, például ha a vizsgált anyag olajos fázisként leülepszik. Ezeket a problémákat ki kell vizsgálni, és a részleteket jegyz őkönyvbe kell 
venni.
 
Eljárás újrakeringtet ő szivattyú használata esetén  
15. Indítsuk el az áramlást az oszlopon keresztül. Az ajánlott áramlási sebesség 
körülbelül 25 ml/óra, ami az itt leírt oszlop esetében 10 tartálytérfogat/óra sebességnek felel meg. Legalább az els ő öt tartálytérfogatot öntsük ki, hogy 
eltávolítsuk a vízben oldható szennyez ődéseket. Ezt követ ően a szivattyút az 
egyensúlyi állapot létrejöttéig hagyjuk m űködni öt olyan, egymást követ ő, 
véletlenszer űen választott minta felhasználásával, amelyek koncentrációja 
nem tér el egymástól ± 30 %-nál nagyobb mértékben. E minták levétele között legalább tíz tartálytérfogat áthaladásának megfelel ő időnek kell eltel ­
nie. Az alkalmazott analitikai módszert ől függően ajánlatos lehet az egyen ­
súlyi állapot létrejöttét koncentráció/id ő görbével ábrázolni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Eljárás kiegyenlít ő tartály használata esetén  
16. Az egymást követ ő eluátumfrakciókat össze kell gy űjteni, és elemezni kell a 
kiválasztott módszerrel. Az oldhatóság meghatározására abból a középs ő 
eluátumtartományból származó frakciókat használjuk, ahol a koncentrációk 
legalább öt egymást követ ő frakcióban ± 30 %-on belül állandóak.  
17. Az ajánlott eluáló anyag a kétszer desztillált víz. 10 megohm/cm feletti 
ellenállású és 0,01 % alatti összes szerves széntartalmú deionizált víz is használható.
 
18. Mindkét eljárás esetében egy második méréssorozatot is végre kell hajtani az 
első méréssorozat áramlási sebességének felét alkalmazva. Amennyiben a 
két méréssorozat eredményei megegyeznek egymással, a vizsgálat kielégít ő. 
Ha a kisebb áramlási sebesség mellett nagyobb a mért oldhatóság, az áram ­
lási sebesség felezését folytatni kell, amíg két egymást követ ő méréssorozat 
azonos oldhatóságot nem ad.  
19. Mindkét eljárás során a Tyndall-jelenség el őfordulásának vizsgálatával ellen ­ 
őrizni kell, hogy a frakciókban nincs-e jelen kolloidanyag. Részecskék jelen ­
léte esetén a vizsgálat érvénytelennek tekintend ő, és az oszlop sz űrési hatá­
sának javítását követ ően megismétlend ő. 
20. Meg kell mérni minden egyes minta pH-ját, lehet őleg különleges indikátor ­
papírral.  
Lombikmódszer  
Elv 
21. A vizsgált anyagot (a szilárd anyagokat porítani kell) oldjuk fel a vizsgálati 
hőmérsékletnél némileg magasabb h őmérséklet ű vízben. A telítés elérésekor 
hűtsük le a keveréket, és tartsuk a vizsgálati h őmérsékleten. Más megoldás ­
ként – ha megfelel ő mintavételezéssel meggy őződtünk a telítettségi egyen ­
súly létrejöttér ől – a mérés közvetlenül a vizsgálati h őmérsékleten is végre ­
hajtható. Ezt követ ően alkalmas analitikai módszerrel határozzuk meg a 
vizsgált anyag tömegkoncentrációját a vizes oldatban, amely nem tartal ­
mazhat fel nem oldott részecskét (3).  
Készülék  
22. A következ ő felszerelések szükségesek:  
— szokásos laboratóriumi üvegeszközök és m űszerek,  
— oldatok szabályozott, állandó h őmérséklet melletti keverésére alkalmas 
készülék,  
— centrifuga (lehet őleg szabályozott h őmérséklet ű), ha emulziókhoz szük ­
séges, és  
— analitikai felszerelés.  
Eljárás  
23. Az el őzetes vizsgálat alapján becsléssel határozzuk meg a vizsgált anyag 
kívánt vízmennyiség telítéséhez szükséges mennyiségét. E mennyiségnek körülbelül ötszörösét mérjük be a három, becsiszolt üvegdugóval felszerelt 
üvegedénybe (például centrifuga-kémcs őbe, lombikba). Az analitikai 
módszer és az oldhatósági tartomány függvényében kiválasztott vízmeny ­
nyiséget töltsük be az egyes edényekbe. Az edényeket szorosan dugózzuk le, majd 30 °C h őmérsékleten rázzuk össze. Állandó h őmérsékleten való 
működésre képes rázó- vagy kever őkészüléket, például szabályozott h őmér­
sékletű vízfürdőben elhelyezett mágneses kever őberendezést kell használni. 
Egy nap eltelte után az egyik edényt vizsgálati h őmérsékleten 24 óráig 
hagyjuk egyensúlyi állapotba állni, és id őnkénti rázzuk fel. Az edény 
tartalmát ezután vizsgálati h őmérsékleten centrifugáljuk, és alkalmas anali ­
tikai módszerrel határozzuk meg a vizsgált anyag koncentrációját a tiszta,
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
átlátszó vizes fázisban. A másik két lombikot hasonlóan kezeljük a kezdeti, 
30 °C hőmérsékleten két, illetve három napon át végrehajtott egyensúlyba 
hozatal után. Amennyiben legalább az utolsó két edény vizsgálata során mért koncentrációk legfeljebb 15 %-kal térnek el egymástól, a vizsgálat kielégítő. Ha az 1., 2. és 3. edényb ől kapott eredmények növekv ő tenden­
ciájúak, a teljes vizsgálatot meg kell ismételni hosszabb egyensúlyba hoza ­
tali idő alkalmazásával.
 
24. A vizsgálat 30 °C-on végrehajtott el őzetes inkubáció nélkül is végrehajtható. 
A telítési egyensúly beállítása sebességének becsléséhez vegyünk mintákat 
mindaddig, amíg a keverési id ő már nincs hatással a mért koncentrációra.  
25. Meg kell mérni minden egyes minta pH-ját, lehet őleg különleges indikátor ­
papírral.  
Analitikai meghatározások  
26. Előnyben részesítend ő az anyagspecifikus módszer, mivel a kis mennyi ­
ségekben jelen lév ő oldható szennyez ődések jelent ős hibákat okozhatnak a 
mért oldhatóságban. Ilyen módszer például a gáz- vagy folyadékkromatog ­
ráfia, a titrálás, a fotometria, a voltametria.  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
Oszlopelúciós módszer  
27. Minden egyes méréssorozatból ki kell számítani a telítési plató legalább öt 
egymást követ ő mintájának középértékét, valamint a szórást. A különböz ő 
áramlási sebességgel végrehajtott két vizsgálatban kapott középértékek 
legfeljebb 30 %-kal térhetnek el egymástól.  
Lombikmódszer  
28. A három lombiknál kapott egyes eredményeket, amelyek legfeljebb 15 %- 
kal térhetnek el egymástól, átlagoljuk.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
Oszlopelúciós módszer  
29. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
— az előzetes vizsgálat eredményei,  
— kémiai azonosság és szennyez ődések (adott esetben az el őzetes tisztítási 
művelet),  
— minden egyes minta koncentrációja, áramlási sebessége és pH-ja,  
— minden egyes méréssorozat telítettségi platója legalább öt mintájának 
középértékei és szórása,  
— legalább két egymást követ ő méréssorozat átlaga,  
— a víz h őmérséklete a telítési folyamat során,  
— az elemzési módszer,  
— a hordozóanyag jellege  
— a hordozóanyag betöltése,  
— a felhasznált oldószer,  
— az anyag vizsgálat során észlelt bármilyen kémiai instabilitásának bizo ­
nyítéka,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden információ, 
különösen a vizsgált anyag szennyez ődéseivel és halmazállapotával 
kapcsolatban.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Lombikmódszer  
30. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
— az előzetes vizsgálat eredményei,  
— kémiai azonosság és szennyez ődések (adott esetben az el őzetes tisztítási 
művelet),  
— az egyes analitikai meghatározások és azok átlagai, ha egynél több 
értéket határoztunk meg az egyes lombikokhoz,  
— minden minta pH-ja,  
— az egymással egyez ő, különböz ő lombikokból kapott értékek átlaga,  
— a vizsgálati h őmérséklet,  
— az analitikai módszer,  
— az anyag vizsgálat során észlelt bármilyen kémiai instabilitásának bizo ­
nyítéka,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden információ, 
különösen a vizsgált anyag szennyez ődéseivel és halmazállapotával 
kapcsolatban.  
SZAKIRODALOM  
(1) A Bizottság 1992. július 31-i 92/69/EGK irányelve a veszélyes anyagok 
osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítésér ől szóló 67/548/EGK tanácsi irány ­
elvnek a m űszaki fejl ődéshez történ ő tizenhetedik hozzáigazításáról, HL 
L 383., 1992.12.29., 113. o.
 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method  
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. MEGOSZLÁSI HÁNYADOS  
1. MÓDSZER  
Az itt leírt „lombikrázásos” módszer az OECD vizsgálati 
irányelven (1) alapul.  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat végrehajtásához hasznos el őzetes információkat szerezni 
az anyag szerkezeti képletér ől, disszociációs állandójáról, vízben 
oldhatóságáról, hidrolízisér ől, n-oktanol oldhatóságáról és felületi 
feszültségér ől. 
Ionizálható anyagokon a méréseket csak nem ionos formájukban 
(szabad sav vagy szabad bázis) szabad végrehajtani, amelyet legalább egy pH-egységgel a pK alatti (szabad sav) vagy feletti (szabad bázis) pH-jú, megfelel ő puffer használatával hoznak létre.
 
Ez a vizsgálati módszer két különálló eljárást foglal magában: a 
lombikrázásos módszert és a nagynyomású folyadékkromatográfiát („high performance liquid chromatography”, HPLC). Az el őbbi 
akkor alkalmazható, amikor a P-érték (a meghatározásokat lásd 
lejjebb) a –2 és + 4 közötti tartományba, és az utóbbi a 0 és 6 közötti tartományba esik. A kísérleti eljárások közül bármelyik végrehajtása el őtt először a megoszlási hányados el őzetesen becsült 
értékét kell megállapítani.
 
A lombikrázásos módszer csak vízben és n-oktanolban oldható, 
lényegében tiszta anyagokhoz alkalmazható. Nem alkalmazható felü ­
letaktív anyagok esetében (amelyekhez biztosítani kell az egyedi n- 
oktanol- és vízoldékonyságon alapuló becsült vagy számított értéket).  
A HLPC-módszer nem alkalmazható er ős savak és lúgok, komplex 
fémvegyületek, felületaktív anyagok és olyan anyagok esetében, amelyek az eluáló anyagokkal reakcióba lépnek. Ezen anyagok 
esetében egyedi n-oktanol- és vízoldékonyságon alapuló, becsült 
vagy számított értéket kell biztosítani.
 
A HPLC-módszer kevésbé érzékeny a vizsgálandó vegyületben lév ő 
szennyeződések jelenlétére, mint a lombikrázásos módszer. Ennek 
ellenére bizonyos esetekben a szennyez ődések megnehezíthetik az 
eredmények értelmezését, mivel bizonytalanná válik a csúcs kijelö ­
lése. Olyan keverékek esetében, amelyek határozatlan sávot eredmé ­
nyeznek, meg kell adni a log P fels ő és alsó határát.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁS ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A megoszlási hányados (P) két, egymással nem elegyed ő oldószerb ől 
álló, kétfázisú rendszerben feloldott anyag egyensúlyi koncentráció ­
inak (c  i ) aránya. N-oktanol és víz esetében:  
p ow ¼ c nÄoktanol  
c víz 
A megoszlási hányados (P) két koncentráció hányadosa, és rendsze ­
rint 10-es alapú logaritmus (log P) alakjában adják meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
A lombikrázásos módszer  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel nyert eredményekkel.  
A HPLC-módszer  
Valamely vegyület mért HPLC-adata és annak P-értéke korrelációba 
állításához létre kell hozni a kromatográfiai adatok függvényében a 
log P kalibrációs görbéjét legalább 6 referenciapontot használva. A felhasználó feladata a megfelel ő referenciaanyagok kiválasztása. 
Amikor csak lehetséges, legalább egy referenciavegyületnek a vizs ­
gált anyag P
 ow -je fölötti, és egy másiknak a vizsgált anyag P  ow -je 
alatti P  ow -vel kell rendelkeznie. Négynél kisebb log P-értékek 
esetében a kalibráció a lombikrázásos módszerrel kapott adatokon 
alapulhat. Négynél nagyobb log P-értékekhez a kalibráció szakiro ­
dalmi értékeken alapulhat, amennyiben ezek összhangban vannak a számított értékekkel. Nagyobb pontosság elérésére el őnyben kell 
részesíteni az olyan referenciavegyületeket, amelyek szerkezetileg 
kapcsolatban vannak a vizsgált anyaggal.
 
Sok vegyi anyagcsoport esetében a log P  ow -értékek terjedelmes jegy ­
zékei állnak rendelkezésre (2) (3). Amennyiben a szerkezetileg 
egymással összefüggésben lév ő vegyületek megoszlási hányadosairól 
nem állnak rendelkezésre adatok, más referenciavegyületekkel végre ­
hajtott általánosabb kalibrálás használható.  
A javasolt referenciaanyagok és azok P  ow -értékeinek jegyzékét a 2. 
függelék tartalmazza.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
1.4.1.  A lombikrázásos módszer  
A megoszlási hányados meghatározásához egyensúlyt kell teremteni 
a rendszer valamennyi, egymással kölcsönhatásban lév ő komponense 
között, és meg kell határozni a két fázisban feloldott anyagok koncentrációit. Az ezzel a témakörrel foglalkozó szakirodalom vizs ­
gálata azt jelzi, hogy többféle különböz ő módszer használható ennek 
a problémának a megoldására, azaz a két fázis alapos keverésére, amelyet a szétválasztásuk követ a vizsgált anyag egyensúlyi koncent ­
rációjának meghatározására.
 
1.4.2.  A HPLC-módszer  
A HPLC-t olyan, a kereskedelemben kapható szilárd fázissal megtöl ­
tött analitikai oszlopokon hajtják végre, amely kémiailag kovasavhoz kötött hosszú szénhidrogénláncokat (például C
 8 , C 18 ) tartalmaz. Az 
oszlopba befecskendezett vegyi anyagok különböz ő sebességekkel 
mozognak az oszlop mentén a mozgó fázis és az álló szénhidrogén ­
fázis közötti, különböz ő mértékű megoszlásuk miatt. A vegyi 
anyagok keverékei a víztaszító képességük sorrendjében eluálódnak, úgy, hogy el őször a vízben oldható vegyi anyagok eluálódnak, és 
utoljára az olajban oldható vegyi anyagok, a szénhidrogén-víz 
megoszlási hányadosukkal arányosan. Ez lehet ővé teszi az ilyen (for ­
dított fázisú) oszlopon a retenciós id ő és az n-oktanol/víz megoszlási 
hányados közötti összefüggés meghatározását. A megoszlási 
hányados a következ ő kifejezés által megadott „k” kapacitási faktor  
segítségével határozható meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
amelyben t  r = a vizsgált anyag retenciós ideje, és t  0 = az az átlagos 
idő, amelyre egy oldószer-molekulának szüksége van ahhoz, hogy 
keresztülhaladjon az oszlopon (holtid ő). 
Kvantitatív analitikai módszerek nem szükségesek, és csak az elúciós 
időket kell meghatározni.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
1.5.1.  Ismételhet őség 
A lombikrázásos módszer  
A megoszlási hányados pontosságának biztosítása érdekében két 
meghatározást kell végrehajtani három különböz ő vizsgálati körül ­
mény között, amelyek során változtatható az el őírt anyagmennyiség, 
valamint az oldószertérfogatok aránya. A megoszlási hányados 10-es 
alapú logaritmusban kifejezett értékeinek ± 0,3 logegység-tartomá ­
nyon belül kell lennie.  
A HPLC-módszer  
A mérés megbízhatóságának növelésére két meghatározást kell 
végrehajtani. Az egyes mérésekb ől meghatározott log P értékeknek 
± 0,1 logegység-tartományon belül kell lenniük.  
1.5.2.  Érzékenység  
A lombikrázásos módszer  
A módszer mérési tartományát az analitikai eljárás detektálási határa 
határozza meg. Ennek lehet ővé kell tennie a –2 és + 4 (esetenként, 
amikor teljesülnek ennek a feltételei, ez a tartomány egészen 5-ös log 
P ow -re is kib ővíthető) közötti tartományban lév ő log P  ow értékek 
kiértékelését, amennyiben az oldatban lév ő anyag koncentrációja 
egyik fázisban sem több 0,01 mol/liternél.  
A HPLC-módszer  
A HPLC-módszer 0 és 6 közötti log P  ow tartományban teszi lehet ővé 
a megoszlási hányadosok becslését.  
Általában valamely vegyület megoszlási hányadosa a lombikrázásos 
értéktől számított ± 1 logegységen belül becsülhet ő meg. A jelleg ­
zetes korrelációk megtalálhatók a szakirodalomban (4) (5) (6) (7) (8). Nagyobb pontosság rendszerint akkor érhet ő el, amikor a korrelációs 
görbék egymással szerkezetileg kapcsolatban lév ő referenciavegyüle ­
teken alapulnak (9).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Alkalmazhatóság  
A lombikrázásos módszer  
A Nernst-féle megoszlási törvény csak állandó h őmérsékleten, 
nyomáson és pH mellett érvényes híg oldatokra. Szigorúan két tiszta oldószer között diszpergálódott tiszta anyagra érvényes. Amennyiben 
egyidejűleg több különböz ő oldott anyag van jelen egy vagy több 
fázisban, ez hatással lesz az eredményekre.
 
Az oldott molekulák disszociációja vagy asszociációja eltéréseket 
eredményez a Nernst-féle megoszlási törvényt ől. Az ilyen eltéréseket 
az a tény jelzi, hogy a megoszlási hányados függ ővé válik az oldat 
koncentrációjától.  
Mivel többszörös egyensúlyról van szó, ezt a módszert nem szabad 
alkalmazni ionizálható vegyületekre helyesbítés alkalmazása nélkül. Ilyen vegyületek esetében meg kell fontolni pufferoldatok használatát víz helyett; a puffer pH-jának legalább 1 pH-egységgel el kell térnie 
az anyag pKa-értékét ől, és figyelembe kell venni ennek a pH-nak az 
összefüggését a környezettel.
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  A megoszlási hányados el őzetes becslése  
A megoszlási hányados becslését lehet őleg számítási módszer (lásd 
az 1. függeléket) segítségével, vagy adott esetben a tiszta oldósze ­
rekben lév ő vizsgált anyag oldhatóságainak arányából (10) kell 
végrehajtani.  
1.6.2.  A lombikrázásos módszer  
1.6.2.1.  Előkészület  
n-oktanol: a megoszlási hányados meghatározását nagy tisztaságú, 
analitikai min őségű reagenssel kell végrehajtani.  
Víz: üveg- vagy kvarckészülékben lév ő desztillált vagy kétszer desz ­
tillált vizet kell használni. Ionizálható vegyületekhez víz helyett pufferoldatokat kell használni, amennyiben indokolt.
 
Megjegyzés:  
Nem szabad közvetlenül valamilyen ioncserél őből vett vizet hasz ­
nálni.  
1.6.2.1.1. A z o l d ó s z e r e k e l ő z e t e s t e l í t é s e  
Valamely megoszlási hányados meghatározása el őtt kölcsönösen 
telítik az oldószerrendszer fázisait a kísérleti h őmérsékleten végrehaj ­
tott rázással. Ennek végrehajtásához célszer ű 24 órán át egy mecha ­
nikus rázókészülékben nagy tisztaságú, analitikai min őségű n-okta­
nolt vagy vizet tartalmazó két olyan, nagy tárolópalackot rázni, amelyek közül mindkett ő elegendő mennyiséget tartalmaz a másik 
oldószerb ől, és ezután ezeket addig kell alkalmazni, amíg a fázisok 
szétválnak, és bekövetkezik a telítettségi állapot.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. E l ő k é s z ü l e t a v i z s g á l a t h o z  
A kétfázisú rendszer teljes mennyiségének majdnem meg kell 
töltenie a vizsgálati tartályt. Ez segíteni fog az elillanás miatti anyag ­
veszteség megakadályozásában. Az alkalmazandó térfogatarányt és anyagmennyiségeket a következ ők határozzák meg:
 
— a megoszlási hányados el őzetes értékelése (lásd fent),  
— az analitikai eljáráshoz szükséges vizsgált anyag minimális 
mennyisége, és  
— a mindkét fázisban 0,01 mol/literes maximáliskoncentráció-korlá ­
tozás.  
Három vizsgálatot kell végezni. Az els őben az n-oktanol és víz 
számított térfogatarányát használják; a másodikban ezt az arányt 
kettővel elosztják; és a harmadikban ezt az arányt kett ővel megszo ­
rozzák (például, 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. V i z s g á l t a n y a g  
Törzsoldatot készítenek vízzel el őre telített n-oktanolban. Ennek a 
törzsoldatnak a koncentrációját pontosan meg kell határozni, miel őtt 
a megoszlási hányados meghatározásához használnánk. Ezt az 
oldatot olyan körülmények között kell tárolni, amely biztosítja annak stabilitását.
 
1.6.2.2.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálati h őmérsékletet állandó értéken (± 1  o C) kell tartani, és 
ennek a 20 és 25  o C közötti tartományban kell lennie.  
1.6.2.3.  Mérési eljárás  
1.6.2.3.1. A m e g o s z l á s i e g y e n s ú l y l é t r e h o z á s a  
Minden vizsgálati körülményhez el ő kell készíteni a pontosan 
megmért két oldószermennyiséget, valamint a szükséges törzsoldat ­
mennyiséget tartalmazó vizsgálati tartályt.  
Az n-oktanol-fázisokat térfogat alapján kell mérni. A vizsgálati tartá ­
lyokat vagy alkalmas rázókészülékbe kell helyezni, vagy kézzel kell keverni. Centrifugakémcs ő használatakor javasolt módszer a kémcs ő 
gyors forgatása 180 fokban a f őtengelye mentén úgy, hogy minden 
oldott leveg ő távozzék a két fázisból. A tapasztalat azt mutatja, hogy 
50 ilyen forgatás rendszerint elegend ő a megoszlási egyensúly létre ­
hozásához. Azért, hogy bizonyosan létrejöjjön az egyensúly, öt perc 
alatt 100 forgatás ajánlott.
 
1.6.2.3.2. F á z i s e l k ü l ö n í t é s  
Adott esetben a fázisok elkülönítéséhez a keveréket centrifugálni 
kell. Ezt a m űveletet szobah őmérsékleten, laboratóriumi centrifu ­
gában kell elvégezni, vagy ha nem szabályozott h őmérséklet ű cent­
rifugát használnak, a centrifugakémcsöveket az elemzés el őtt 
legalább egy óra hosszat egyensúlyban kell tartani a vizsgálati 
hőmérsékleten.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Elemzés  
A megoszlási hányados meghatározásához meg kell határozni a vizs ­
gált anyag koncentrációját mindkét fázisban. Ez úgy tehet ő meg, 
hogy ki kell venni minden egyes vizsgálati körülményhez tartozó 
minden egyes kémcs őből mindkét fázis aliquot részét, és elemezni 
kell azokat a kiválasztott eljárással. Ezután ki kell számítani a mindkét fázisban jelen lév ő teljes anyagmennyiséget, és ezt össze 
kell hasonlítani az eredetileg bevitt anyagmennyiséggel.
 
A vizes fázisból olyan eljárással kell mintát venni, amely minimá ­
lissá teszi az n-oktanol maradéka bevitelének veszélyét: a vizes fázisból a mintavételhez egy eltávolítható t űvel ellátott üvegfecs ­
kendő használható. A fecskend őt kiinduláskor részben meg kell 
tölteni leveg ővel. A leveg őt óvatosan ki kell tolni, miközben a t űt 
behelyezik az n-oktanol-rétegen keresztül. Ezután megfelel ő mennyi­
ségű vizes fázist kell beszívni a fecskend őbe. A fecskend őt gyorsan 
el kell távolítani az oldatból, és le kell venni a t űt. A fecskend ő 
tartalma ezután vizes mintaként használható. A két elkülönített 
fázisban a koncentrációt lehet őleg valamilyen, anyagra jellemz ő 
módszerrel kell meghatározni. A következ ő felsorolás példákat ad 
azokra az analitikai módszerekre, amelyek megfelel őnek bizonyul ­
hatnak:
 
— fotometrikus módszerek,  
— gázkromatográfia,  
— nagy nyomású folyadékkromatográfia.  
1.6.3.  A HPLC-módszer  
1.6.3.1.  Előkészület  
Készülék  
Impulzusmentes szivattyúval és alkalmas detektáló készülékkel 
felszerelt folyadékkromatográf szükséges. Injektáló hurkokkal rendel ­
kező injektor használata ajánlatos. Álló fázisban poláros csoportok 
jelenléte nagymértékben károsíthatja a HPLC-oszlop megfelel ő 
működését. Ezért az álló fázisnak minimális százalékban szabad 
csak tartalmaznia poláros csoportokat (11). A kereskedelemben 
kapható mikroszemcsés, reverz fázisú töltetek vagy el őretöltött 
oszlopok is használhatók. Az injektáló rendszer és az analitikai oszlop közé véd őoszlop helyezhet ő el.
 
Mobil fázis  
Eluáló oldószer elkészítésére HPLC-min őségű metanolt és HPLC- 
minőségű vizet használnak, amelyet gáztalanítanak használat el őtt. 
Izokratikus eluálást kell alkalmazni. Minimum 25 % víztartalmú 
metanol/víz arányt kell használni. Általában 3:1 (térfogat/térfogat) metanol-víz keverék megfelel ő log P = 6 vegyületek 1 órán belüli 
eluálásához 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Ha a vegyület log 
P-je nagy, szükségessé válik az elúciós id ő lerövidítése (referencia ­
vegyületeknél is) a mobil fázis polaritásának vagy az oszlop hosszú ­
ságának csökkentésével.
 
A n-oktanolban nagyon kis mértékben oldható anyagok hajlamosak 
arra, hogy rendkívül alacsony log P  ow -értékeket adjanak a HPLC- 
módszerrel; az ilyen vegyületek csúcsai esetenként az oldószer ­
fronttal együtt jelentkeznek. Ez valószín űleg annak tulajdonítható, 
hogy túl lassú a megoszlási folyamat ahhoz, hogy létrejöhessen az egyensúly az alatt az id ő alatt, amíg általában egy HPLC-elválasztás 
tart. Az áramlási sebesség csökkentése vagy a metanol/víz arány 
csökkentése hatásos lehet abban, hogy reális értéket kapjanak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
A vizsgált, és a referenciavegyületeknek elegend ő koncentrációkban 
oldhatóaknak kell lenniük a mobil fázisban ahhoz, hogy kimutat ­
hatók legyenek. Csak kivételes esetekben használhatók adalék ­
anyagok a metanol/víz keverékhez, mivel az adalékanyagok megvál ­
toztatják az oszlop tulajdonságait. Adalékanyagokkal rendelkez ő 
kromatogramokhoz kötelez ő az ugyanolyan típusú, külön oszlop 
használata. Amennyiben nem megfelel ő a metanol-víz, más szerves 
oldószer-víz keverékek használhatók, például etanol-víz vagy aceto- nitril-víz.
 
Az eluáló folyadék pH-ja dönt ő fontosságú ionizálható vegyületek 
esetében. Ennek belül kell lennie az oszlop üzemi pH-tartományán, ami rendszerint 2 és 8 között van. Ajánlatos a pufferolás. El kell 
kerülni a só kicsapódását és az oszlop min őségromlását, amely bizo ­
nyos szerves fázis/puffer keverékek esetében megvalósulhat. Nem ajánlatos kovasav alapú, álló fázisú HPLC-berendezéssel pH 8 felett méréseket végrehajtani, mivel a lúgos mobil fázis használata gyors 
romlást okozhat az oszlop teljesít őképességében.
 
Oldott anyagok  
A referenciavegyületeknek a lehet ő legtisztább vegyületeknek kell 
lenniük. A vizsgálatra vagy kalibrálásra szánt vegyületeket, ameny ­
nyiben lehetséges, feloldják a mobil fázisban.  
Vizsgálati körülmények  
A mérések során a h őmérsékletnek nem szabad ± 2 K-nél nagyobb 
értékkel változnia.  
1.6.3.2.  Mérés  
A t 0 holtidő számítása  
A t  0 holtidő valamely homológ sor (például n-alkil-metil-ketonok) 
vagy kromatográffal nem késleltetett szerves vegyületek (például tiokarbamid vagy formamid) segítségével határozható meg. A t
 0 holt­
időnek homológ sor segítségével végrehajtott számításához valamely 
homológ sornak legalább hét tagját fecskendezik be, és meghatá ­
rozzák a megfelel ő holtidőt. Felrajzolják a t  r (n c + 1)  alapretenciós 
időt a t  r(n c ) függvényében, és meghatározzák a következ ő regressziós 
egyenletet:  
t r(nc + 1) = a + b t  r(nc) 
„a” metszéspontját és „b” meredekségét (n = szénatomok száma). A 
t 0 holtidőt ekkor a következ ő összefüggés adja meg:  
t o = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibrációs görbe  
A következ ő lépés a log P függvényében a log k-értékek korreláci ­
ójának megállapítása megfelel ő referenciaanyagok esetében. A 
gyakorlatban egyidej űleg fecskendeznek be 5–10 tagból álló standard 
referenciavegyületet, amelyek log P-értéke a várt tartomány körül 
van, és lehet őleg a detektáló rendszerhez kapcsolt regisztráló integ ­
rátoron meghatározzák a retenciós id őket. Kiszámítják a kapacitásté ­
nyezők megfelel ő – k – logaritmusait, és felrajzolják a lombikrázásos 
módszerrel meghatározott log P függvényében. A kalibrálást rend ­
szeres időközönként, naponta legalább egyszer elvégzik azért, hogy 
felismerjék az esetleges változásokat az oszlop viselkedésében.  
A vizsgált anyag kapacitási tényez őjének meghatározása  
A vizsgált anyagot a mobil fázis lehet ő legkisebb mennyiségében 
fecskendezik be. Meghatározzák (kétszer) a retenciós id őt, amely 
lehetővé teszi a k kapacitástényez ő kiszámítását. A referenciavegyü ­
letek korrelációs görbéjéb ől interpolálható a vizsgált anyag megosz ­
lási hányadosa. Nagyon kicsi és nagyon nagy megoszlási hánya ­
dosok esetében extrapoláció szükséges. Ilyen esetekben gondosan kell figyelembe venni a regressziós egyenes konfidenciahatárait.
 
2. ADATOK  
Lombikrázásos módszer  
A P meghatározott értékeinek megbízhatósága a párhuzamos 
meghatározások középértékeinek az általános középértékkel való 
összehasonlításával vizsgálható.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosság és szennyez ődések),  
— amikor a módszerek nem alkalmazhatók (például felületaktív 
anyag), az egyes n-oktanol- és vízoldékonyságon alapuló valami ­
lyen számított értéket vagy becslést kell megadni,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges valamennyi 
információt és megjegyzést, különösen azokat, amelyek az anyag 
szennyeződéseivel és fizikai állapotával kapcsolatosak.  
Lombikrázásos módszer esetében:  
— adott esetben az el őzetes becslés eredményeit,  
— azt a h őmérsékletet, amelyen a meghatározást mérték,  
— a koncentrációk meghatározásához használt analitikai eljárások 
adatait,  
— adott esetben a centrifugálás idejét és sebességét,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— mindkét fázisban a mért koncentrációkat, minden egyes meghatá ­
rozáshoz (ez azt jelenti, hogy összesen 12 koncentrációnak kell 
szerepelnie a jelentésben),  
— a vizsgált anyag súlyát, az egyes vizsgálati tartályokban alkalma ­
zott minden egyes fázis térfogatát és egyensúlyba hozás után az 
egyes fázisokban jelen lév ő vizsgált anyag teljes, számított 
mennyiségét,  
— a megoszlási hányados (P) számított értékeit, és minden vizs ­
gálati körülmény esetében meg kell adni a középértéket, vagyis 
minden meghatározáshoz meg kell adni a középértéket. Ameny ­
nyiben létezik javaslat a megoszlási hányados koncentrációfügg ő­
ségére, ezt is szerepeltetni kell a jelentésben,  
— meg kell adni az egyes P értékeknek a középérték körüli standard 
deviációját,  
— az összes meghatározásból megállapított átlagos P értéket 10-es 
alapú logaritmusaként is ki kell kifejezni,  
— a számított elméleti P  ow -t, amikor ilyen értéket meghatároznak, 
vagy amikor a mért érték > 10  4 , 
— a kísérlet során felhasznált víz és vizes fázis pH-ját,  
— víz helyett puffer használata esetén a pufferek használatának 
indoklását, a pufferek összetételét, koncentrációját és pH-ját, és 
a vizes fázis pH-ját a kísérlet el őtt és után.  
A HPLC-módszer esetében:  
— adott esetben az el őzetes becslés eredményét,  
— a vizsgált és referenciaanyagokat és azok tisztaságát,  
— azt a h őmérséklet-tartományt, amelyben a meghatározások 
történtek,  
— azt a pH-t, amelyben a meghatározások történtek,  
— az analitikai és véd őoszlop, a mobil fázis és a detektálásra szol ­
gáló eszközök adatait,  
— a kalibrálás során használt referenciaanyagok regressziós adatait 
és a szakirodalomban közölt log P-értékeit,  
— az illesztett regressziós egyenes részleteit (log k a log P függ ­
vényében),  
— a vizsgált vegyület átlagos retenciós adatait és interpolált log P 
értékét,  
— a berendezés és a m űködési állapot leírását,  
— az elúciós profilokat,  
— az oszlopba bevitt vizsgált és referenciaanyagok mennyiségét,  
— a holtid őt, és mérésének módját.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 107. vizsgálati irányelv, a Tanács 
határozata, C(81) 30 végleges.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – A Pomona College Medical Chemistry Project 1982, 
Pomona College, Claremont, Kalifornia, 91711. címr ől szerez­
hető be.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12,219. (1981).  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, 
vol. 7, 675.  
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umpraxis (edited by E. Müller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band 1/1, 223–339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking 
method.  
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, 
vol. 12, 1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, 
vol. 71, 525.  
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ, Qual., 1981, 
vol. 10, 382.  
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
1. Függelék  
Számítási/becslési módszerek  
BEVEZETÉS  
A Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) cím ű mű ismerteti a 
számítási módszerek, adatok és példák általános bevezetését.  
A P  ow számított értékei használhatók:  
— annak eldöntésére, hogy a kísérleti módszerek közül melyik megfelel ő (lombik­
rázási tartomány: log P  ow : –2-től 4-ig, HPLC-tartomány: log P  ow : 0-tól 6-ig),  
— a megfelel ő vizsgálati körülmények kiválasztásához (például referencia ­
anyagok HPLC-eljárásokhoz, n-oktanol/víz térfogatarány lombikrázásos módszerhez),
 
— a lehetséges kísérleti hibák bels ő laboratóriumi ellen őrzéséhez,  
— P  ow becslés biztosítására, ahol a kísérleti módszerek technikai okok miatt nem 
alkalmazhatók.  
BECSLÉSI MÓDSZER  
A megoszlási hányados el őzetes becslése  
A megoszlási hányados értéke a tiszta oldószerekben a vizsgálati anyag oldha ­
tóságának segítségével becsülhet ő meg. Ehhez:  
P telítési ¼ telítésic  n Ä oktanol  
telítésic  viz 
SZÁMÍTÁSI MÓDSZEREK  
A számítási módszerek alapelve  
Minden számítási módszer a molekulának olyan elemekre való formális lebom ­
lásán alapul, amelyekhez ismertek megbízható log P  ow értékek. Ekkor a teljes 
molekula log P  ow értékét a megfelel ő fragmentum összege plusz az intermoleku ­
láris kölcsönhatásokhoz tartozó korrekciós kifejezések összege adja.  
A fragmentumkonstansok és korrekciós kifejezések jegyzékei rendelkezésre 
állnak (b) (c) (d) (e). Néhányat közülük rendszeresen frissítenek (b).  
Minőségi követelmények  
Általában a számítási módszer megbízhatósága csökken a vizsgált vegyület 
növekvő bonyolultságával. Kis molekulasúlyú és egy- vagy kétfunkciós csoportú, 
egyszerű molekulák esetében a különböz ő fragmentálási módszerek eredményei 
és a mért érték között 0,1–0,3 log P  ow eltérés várható. Összetettebb molekulák 
esetében a hibahatár nagyobb lehet. Ez a fragmentumkonstansok megbízhatósá ­
gától és rendelkezésre állásától, valamint az intramolekuláris kölcsönhatások (pél ­
dául hidrogénkötések) felismerhet őségétől és a korrekciós kifejezések pontos 
használatától függ (kisebb a probléma a CLOGP-3-as szoftverrel) (b). Ionizálható 
vegyületek esetében fontos a töltés vagy az ionizáció mértékének megfelel ő 
figyelembevétele.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Számítási eljárások  
Hansch-féle π-módszer  
A Fujita és munkatársai (f) által bevezetett eredeti π hidrofób helyettesít ő kons­
tanst a következ őképpen definiálták:  
π X = log P  ow (PhX) -log P  ow (PhH)  
ahol P  ow (PhX) egy aromás származék megoszlási hányadosa és P  ow (PhH) a 
kiindulási vegyület megoszlási hányadosa.  
(például π Cl = log P  ow (C 6 H 5 C1) -log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71)  
A definíció alapján a π-módszer általában aromás szubsztitúcióra alkalmazható. 
Nagy számú szubstituens π-értékeit (b) (c) (d) már táblázatba foglalták. Ezeket 
aromás molekulák vagy szubstruktúrák log P  ow értékének kiszámításához hasz ­
nálják.  
A Rekker-féle módszer  
Rekker szerint (g) a log P  ow érték kiszámítása a következ őképpen történik:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðinterakciós kifejezés Þ 
ahol f  j a különböz ő molekuláris fragmentumkonstansok és a  i ezeknek a vizsgált 
molekulában való el őfordulási gyakorisága. A korrekciós kifejezések egyetlen C  m 
konstans (egy úgynevezett „magic constant”) egész számú többszöröseként fejez ­
hetők ki. Az f  j és C  m fragmentumkonstansokat egy 1 054 kísérleti P  ow értéket 
(825 vegyület) tartalmazó jegyzékb ől határozták meg többszörös regresszió ­
analízis (c) (h) segítségével. A interakciós kifejezések meghatározását az (e) (h) (i) szakirodalomban leírt szabályoknak megfelel ően hajtották végre.
 
A Hansch–Leo-féle módszer  
Hansch és Leo (c) szerint a log P  ow érték a következ ő összefüggésb ől 
számítható ki:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
ahol f  i a különböz ő molekularész állandói, F  j a korrekciós kifejezések és a  i , b j a 
megfelelő előfordulási gyakoriság. Kísérleti P  ow értékekből atomos és csoportf ­
ragmentálási értékek jegyzékét és F  j korrekciós kifejezések (úgynevezett „ténye ­
zők”) jegyzékét határozták meg a fokozatos megközelítés módszerével. A korrek ­
ciós kifejezéseket több különböz ő osztályba sorolták be (a) (c). Viszonylag 
bonyolult és id őigényes minden szabály és korrekciós kifejezés figyelembevétele. 
Szoftvercsomagokat fejlesztettek ki (b).  
Összetett módszer  
Összetett molekulák log P  ow értékének számítása lényegesen javítható, ha a 
molekula nagyobb szerkezeti elemekre bontható, amelyekhez rendelkezésre 
állnak megbízható log P  ow értékek táblázatokból (b) (c), vagy saját mérések ­
ből. Az ilyen részek (például heterociklusok, antrakinon, azobenzol) ezután 
kombinálhatók a Hansch-féle π-értékekkel, vagy a Rekker-vagy Leo-féle részál ­
landókkal.  
Megjegyzések  
i. A számítási módszerek csak akkor alkalmazhatók részben vagy teljesen ioni ­
zált vegyületekhez, amikor lehet őség van a szükséges korrekciós tényez ő 
figyelembevételére.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii. Amennyiben intramolekuláris hidrogénkötések feltételezhet ők, hozzá kell 
adni a megfelel ő korrekciós tagot (körülbelül + 0,6 és + 1,0 közötti log 
P ow egységek) (a). Az ilyen kötések jelenlétét a molekula sztereomodelljei 
vagy spektroszkópikus adatai jelezhetik.  
iii. Amennyiben több tautomeralak lehetséges, a legvalószín űbb alakot kell hasz ­
nálni számítási alapként.  
iv. A részkonstansok jegyzékeinek módosítását körültekint ően kell végrehajtani.  
Vizsgálati jelentés  
A számítási/becslési módszerek használatakor a vizsgálati jelentésnek, ameny ­
nyiben lehetséges, a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
— az anyag leírását (keverék, szennyez ődések stb.),  
— minden lehetséges intramolekuláris hidrogénkötés, disszociáció, töltés és 
minden egyéb szokatlan hatás (például tautoméria) jelzését,  
— a számítási módszer leírását,  
— az adatbázis azonosítását vagy a készlet ismertetését,  
— a részek kiválasztásának sajátosságait,  
— a számítás átfogó dokumentálását.  
SZAKIRODALOM  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, Kalifornia 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3)  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971. vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. – Chim. Ther. 1979, 
vol. 14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington, D.C., 1984, 
Symposium Series 255, 225.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
2. Függelék  
HPLC-Módszerhez Javasolt Referenciaanyagok  
Szena Referenciaanyag log P  ow pKa 
1 2-butanon 0,3 
2 4-Acetilpiridin 0,5 
3 Anilin 0,9 
4 Acetanilid 1,0 
5 Benzilalkohol 1,1 6 p-Metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 
7 Fenoxiecetsav 1,4 pKa = 3,12 
8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 
9 2,4-Dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitril 1,6 11 Fenilacetonitril 1,6 
12 4-Metilbenzil-alkohol 1,6 
13 Acetofenon 1,7 
14 2-Nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-Nitrobenzoesav 1,8 pKa = 3,47 16 4-Klóranilin 1,8 pKa = 4,15 
17 Nitrobenzol 1,9 
18 Fahéj alkohol 1,9 
19 Benzoesav 1,9 pKa = 4,19 
20 p-Krezol 1,9 pKa = 10,17 21 Fahéjsav 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 Anizol 2,1 
23 Metilbenzoát 2,1 
24 Benzol 2,1 
25 3-Metilbenzoesav 2,4 pKa = 4,27 26 4-Klórfenol 2,4 pKa = 9,1 
27 Triklóretilén 2,4 
28 Atrazin 2,6 
29 Etilbenzoát 2,6 
30 2,6-Diklórbenzonitril 2,6 31 3-Klórbenzoesav 2,7 pKa = 3,82 
32 Toluol 2,7 
33 1-Naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Diklóranilin 2,8 
35 Klórbenzol 2,8 
36 Allil-feniléter 2,9 
37 Brómbenzol 3,0
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Szena Referenciaanyag log P  ow pKa 
38 Etilbenzol 3,2 
39 Benzofenon 3,2 
40 4-Fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 Timol 3,3 
42 1,4-Diklórbenzol 3,4 
43 Difenilamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalin 3,6 45 Fenilbenzoát 3,6 46 Izopropilbenzol 3,7 47 2,4,6-Triklórfenol 3,7 pKa = 6 48 Bifenil 4,0 49 Benzil-benzoát 4,0 50 2,4-Dinitro-6-szekunder butilfenol 4,1 51 1,2,4-Triklórbenzol 4,2 52 Dedekánsav 4,2 
53 Difeniléter 4,2 
54 n-Butilbenzol 4,5 55 Fenantrin 4,5 56 Fluorantén 4,7 57 Dibenzil 4,8 58 2,6-Difenilpiridin 4,9 59 Trifenil-amin 5,7 60 DDT 6,2 
Egyéb, alacsony log P
 ow értékű referenciaanyagok 
1 Nikotinsav - 0,07  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. LOBBANÁSPONT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat végrehajtásához hasznos el őzetes információkat szerezni 
az anyag lobbanékonyságáról. A vizsgálati eljárás olyan folyékony 
anyagokhoz alkalmazható, amelyek g őzeit meggyújthatják gyújtófor ­
rások. A leírásban felsorolt vizsgálati módszerek csak az egyes módszereknél megadott lobbanáspont-tartományoknál megbízhatóak.
 
A használni kívánt módszer kiválasztásakor vizsgálni kell az anyag 
és a mintatartó közötti kémiai reakciók lehet őségét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A lobbanáspont az a 101,325 kPa nyomásra korrigált legalacso ­
nyabb hőmérséklet, amelyen a vizsgálati módszerben meghatározott 
feltételek mellett valamely folyadék olyan mennyiségben fejleszt 
gőzt, hogy a vizsgálati tartályban meggyújtható g őz/levegő keverék 
jön létre.  
Mértékegységek:  o C 
t = T – 273,15  
(t o C-ban és T K-ben)  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagot használni. 
Ezeknek els ősorban arra kell szolgálniuk, hogy id őnként ellen őrizzék 
a módszer megfelel őségét, és lehet ővé tegyék az összehasonlítást 
más módszerekkel nyert eredményekkel.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az anyagot vizsgálati tartályban helyezik el, és felmelegítik vagy 
lehűtik az egyes vizsgálati módszerekben leírt eljárásnak megfelel ő 
vizsgálati h őmérsékletre. Gyújtási kísérleteket végeznek azért, hogy 
meggyőződjenek arról, fellobban-e vagy sem a minta a vizsgálati 
hőmérsékleten.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
1.5.1.  Ismételhet őség 
Az ismételhet őség a lobbanáspont-tartománynak és az alkalmazott 
vizsgálati módszernek megfelel ően változik; maximum 2  o C. 
1.5.2.  Érzékenység  
Az érzékenység az alkalmazott vizsgálati módszert ől függ.  
1.5.3.  Alkalmazhatóság  
Néhány vizsgálati módszer alkalmazhatósága bizonyos lobbanáspont- 
tartományokra korlátozódik, és az anyaggal kapcsolatos adatoktól 
(például magas viszkozitás) függ.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
A vizsgált anyagból vett mintát valamilyen vizsgáló készülékben 
helyezik el az 1.6.3.1. és/vagy 1.6.3.2. pontnak megfelel ően. 
Energiadús vagy toxikus anyagokhoz biztonsági okok miatt ajánlatos 
kis, körülbelül 2 cm  3 mintaméretet használó módszert alkalmazni.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
A készüléket, amennyiben ez biztonsági szempontból megfelel, 
huzatmentes helyre kell helyezni.  
1.6.3.  A vizsgálat végrehajtása  
1.6.3.1.  Egyensúlyi módszer  
Lásd az ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679-es szabványt.  
1.6.3.2.  Nem egyensúlyi módszer  
Ábel-féle készülék:  
Lásd a BS 2000 170. részét, az NF M07-011, NF T66-009 szab ­
ványt.  
Ábel–Pensky-féle készülék:  
Lásd az EN 57, DIN 51755 1. részét (5-t ől 65  o C-ig terjed ő hőmér­
sékletekhez), a DIN 51755 2. részét (5  o C alatti h őmérsékletekhez), 
az NF M07-036 szabványt.  
Tag-féle készülék:  
Lásd az ASTM D 56 szabványt.  
Pensky-Martens-féle készülék:  
Lásd az ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, 
NF M07-019 szabványt.  
Megjegyzések:  
Amennyiben az 1.6.3.2. pontban szerepl ő, nem egyensúlyi 
módszerrel meghatározott lobbanáspontról megállapítják, hogy az 
értéke 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C vagy 55 ± 2  o C, ezt az eredményt 
meg kell er ősíteni az ugyanezt a készüléket használó valamilyen 
egyensúlyi módszerrel.  
Bejelentéshez csak azok a módszerek használhatók, amelyek 
megadják a lobbanáspont h őmérsékletét.  
Oldószereket tartalmazó, viszkózus folyadékok (festékek, ragasztó ­
anyagok és ehhez hasonlóak) lobbanáspontjának meghatározásához 
csak viszkózus folyadékok lobbanáspontjának meghatározására alkalmas készülékek és vizsgálati módszerek használhatók.
 
Lásd az ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 1. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. ADATOK  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— meg kell adni az alkalmazott módszert, valamint minden eset ­
leges eltérést,  
— az eredményeket és az eredmények értelmezése szempontjából 
lényeges minden további megjegyzést.  
4. SZAKIRODALOM  
Nincs.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  TŰZVESZÉLYESSÉG (SZILÁRD ANYAGOK)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat végrehajtásához hasznos el őzetes információkat szerezni 
az anyag lehetséges robbanási tulajdonságairól.  
Ezt a vizsgálatot csak porszer ű, szemcsés vagy pasztaszer ű anya­
gokhoz szabad alkalmazni.  
Ahhoz, hogy ne vizsgáljanak minden meggyújtható anyagot, hanem 
csak azokat, amelyek hevesen égnek, vagy égési tulajdonságai vala ­
milyen ok miatt különösen veszélyesek, csak azok az anyagok tekint ­
hetők tűzveszélyesnek, amelyek égési sebessége meghalad egy bizo ­
nyos határértéket.  
A tűz eloltásakor jelentkez ő nehézségek miatt különösen veszélyes 
lehet, ha a fémporban izzás terjed. A fémporokat t űzveszélyesnek 
kell tekinteni, ha az anyagban az izzás terjedése egy el őírt időtar­
tamon belül van.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Égési idő, másodpercben kifejezve.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs megadva.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az anyagot megszakítás nélküli, körülbelül 250 mm hosszú csíkba vagy 
porsávba rendezik, és el őzetes vizsgálatot hajtanak végre annak 
meghatározására, hogy gázlánggal meggyújtva lánggal terjed-e vagy parázslik-e. Amennyiben az el őírt időtartamon belül a porcsík 
200 mm-es szakasza mentén bekövetkezik a terjedés, teljes vizsgálati 
programot hajtanak végre az égési sebesség meghatározása érdekében.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincs megadva.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előzetes screening vizsgálat  
Az anyagot körülbelül 250 mm hosszú, 20 mm széles és 10 mm 
magas, megszakítás nélküli csíkba vagy porsávba rendezik egy nem 
éghető, nem porózus és alacsony h ővezető-képesség ű alaplemezen. 
Egy (legalább 5 mm átmér őjű) gázégőből forró lángot bocsátanak a 
porcsík egyik végére mindaddig, amíg a por meg nem gyullad, vagy maximum 2 percig (fémek vagy fémötvözetek porai esetében 5 
percig). Figyelni kell, hogy az égés tovaterjed-e a csík 200 mm-es 
szakasza mentén a 4 perces vizsgálati id őtartamon belül (vagy 
fémporok esetében 40 perc alatt). Amennyiben az anyag nem gyullad 
meg, és lángolva vagy parázzsal nem továbbítja az égést a porcsík 
200 mm-es szakasza mentén a 4 perces (vagy 40 perces) vizsgálati időtartamon belül, akkor az anyagot nem szabad t űzveszélyesnek 
tekinteni, és további vizsgálat nem szükséges. Amennyiben az 
anyag kevesebb mint 4 perc alatt vagy fémporok esetében kevesebb 
mint 40 perc alatt továbbítja az égést a porcsík 200 mm-es szakasza mentén, az alábbiakban (az 1.6.2. pontban és azt követ ően) leírt 
eljárást végre kell hajtani.
 
1.6.2.  Égési sebesség vizsgálata  
1.6.2.1.  Előkészület  
Egy 250 mm hosszú, háromszög keresztmetszet ű, 10 mm bels ő 
magasságú és 20 mm szélesség ű formába lazán betöltik a porszer ű 
vagy szemcsés anyagokat. A forma mindkét oldalán, hosszirányban, két fémlemezt helyeznek el oldalsó határoló felületként, amelyek 
2 mm-rel túlnyúlnak a háromszög keresztmetszet ű alakzat fels ő 
szélén (lásd az ábrát). A formát ezután háromszor leejtik 2 cm magasságból valamilyen szilárd felületre. Amennyiben szükséges, a formát újból feltöltik vizsgálati anyaggal. Az oldalhatárolókat ezután 
eltávolítják, és a felesleges anyagot lekaparják. Valamilyen nem 
éghető, nem porózus és alacsony h ővezető-képesség ű alaplemezt 
helyeznek a forma tetejére, a készüléket megfordítják és a formát eltávolítják.
 
A pasztaszer ű anyagokat nem éghet ő, nem porózus és kis h ővezető- 
képességű alaplemezen terítik el 250 mm hosszúságú és körülbelül 
1 cm  2 keresztmetszet ű kötél alakjában.  
1.6.2.2.  Vizsgálati körülmények  
Nedvszívó anyag esetében a vizsgálatot az anyagnak a tartályból 
történt eltávolítása után a lehet ő leggyorsabban kell végrehajtani.  
1.6.2.3.  A vizsgálat végrehajtása  
A halmot az elszívószekrény huzatába kell elhelyezni.  
A levegősebességnek elegend őnek kell lennie ahhoz, hogy megaka ­
dályozza az égéstermékeknek a laboratóriumba szökését, és ezt nem 
szabad változtatni a vizsgálat során. Huzaterny őt kell felszerelni a 
készülék köré.  
Gázégőből (legalább 5 mm átmér őjű) kibocsátott forró lángot hasz ­
nálnak az anyaghalom egyik végén történ ő meggyújtására. Amikor a 
halom már 80 mm távolságig égett, megmérik az égési sebességet a 
következő 100 mm mentén.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
A vizsgálatot hatszor hajtják végre, minden alkalommal tiszta, hideg 
lemezt használva, kivéve ha korábban pozitív eredményt kaptak.  
2. ADATOK  
Az értékeléshez az el őzetes szűrővizsgálat (1.6.1.) során nyert égési 
idő és a legfeljebb hat vizsgálatban (1.6.2.3.) nyert legrövidebb égési 
idő kell.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a vizsgált anyag leírását, ennek fizikai állapotát, beleértve a 
nedvességtartalmat,  
— az előzetes screening-vizsgálat és az égési sebesség vizsgálata 
során nyert eredményeket, amennyiben végeztek ilyen vizsgála ­
tokat,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A porszer ű, szemcsés vagy pasztaszer ű anyagokat t űzveszélyesnek 
kell tekinteni, amennyiben az 1.6.2. pontban leírt vizsgálati eljá ­
rásnak megfelel ően végrehajtott bármely vizsgálat során az égési 
idő kevesebb mint 45 másodperc. Fémek vagy fémötvözetek porait 
tűzveszélyesnek kell tekinteni, amennyiben meggyújthatók, és a láng 
vagy a reakciózóna 10 perc vagy ennél rövidebb id ő alatt halad 
keresztül a teljes mintán.  
4. FELHASZNÁLT IRODALOM  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Függelék  
Ábra  
Forma és tartozékok a halom elkészítéséhez  
(Minden métet mm-ben van megadva)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  TŰZVESZÉLYESSÉG (GÁZOK)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
A módszer lehet ővé teszi annak meghatározását, hogy leveg ővel 
kevert, szobah őmérséklet ű (körülbelül 20  o C-os) és légköri nyomású 
gázok tűzveszélyesek-e, és ha igen, milyen koncentrációtartomány ­
ban. A vizsgálati gáz leveg ővel alkotott, egyre növekv ő gázkoncent ­
rációjú keverékeit elektromos szikra hatásának teszik ki, és figyelik, 
hogy előfordul-e gyulladás.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A tűzveszélyességi tartomány az alsó és fels ő robbanási határ közötti 
koncentrációtartomány. Az alsó és fels ő robbanási határ a leveg ővel 
kevert, kismértékben t űzveszélyes gáznak azon koncentrációhatárai, 
amelyeknél nem jön létre lángterjedés.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs megadva.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Lépésenként növelik a gázkoncentrációt a leveg őben, és a keveréket 
minden egyes szakaszban elektromos szikra hatásának teszik ki.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincs megadva.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Készülék  
A vizsgálati tartály egy függ őleges, 50 mm minimális bels ő átmérőjű 
és 300 mm minimális magasságú üveghenger. A gyújtóelektródák 
3–5 mm távolságra vannak egymástól, és a henger aljától 60 mm- 
re helyezkednek el. A hengert nyomásmentesít ő nyílással szerelték 
fel. A készüléket véd őburkolattal kell ellátni mindenféle robbanásve ­
szély korlátozására.  
Gyújtóforrásként 0,5 szekundum id őtartamú, álló, indukciós szikrát 
használnak, amelyet 10– 15 kV kimeneti feszültség ű (bemeneti telje ­
sítmény maximum 300 W), nagyfeszültség ű transzformátor hoz létre. 
A (2) szakirodalom az alkalmas készülék egy példáját írja le.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálatot szobah őmérsékleten (körülbelül 20  o C) kell 
végrehajtani.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  A vizsgálat végrehajtása  
Adagoló szivattyúk segítségével ismert koncentrációjú, leveg őbe 
kevert gázt visznek be az üveghengerbe. Szikrát vezetnek a keve ­
réken keresztül, és megfigyelik, hogy elválik-e a láng a gyújtófor ­
rástól és terjed-e önállóan. A gázkoncentrációt 1 térfogatszázalékos 
lépésekben változtatják, amíg be nem következik a gyulladás a fenti ­
eknek megfelel ően. 
Amennyiben a gáz kémiai szerkezete azt jelzi, hogy az valószín űleg 
nem tűzveszélyes, és kiszámítható a leveg ővel alkotott sztöchiomet ­
rikus keveréke, akkor csak a sztöchiometriai összetételnél 10 %-kal kisebb érték űtől a 10 %-kal nagyobb összetételig terjed ő tarto­
mányban lév ő keverékeket kell megvizsgálni 1 %-os lépésekben.
 
2. ADATOK  
E tulajdonság meghatározásához a lángterjedés el őfordulása az 
egyetlen lényeges információ.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a vizsgálathoz használt készülék leírását, a méreteivel együtt,  
— azt a h őmérsékletet, amelyen a vizsgálatot végrehajtották,  
— a vizsgált koncentrációkat és a kapott eredményeket,  
— a vizsgálat eredményét: nem t űzveszélyes gáz vagy 
tűzveszélyes gáz,  
— amennyiben arra a következtetésre jutottak, hogy a gáz nem 
tűzveszélyes, meg kell adni azt a koncentrációtartományt, 
amely felett 1 %-os lépésekben vizsgálták meg,  
— az eredmények értelmezéséhez szükséges minden információt és 
megjegyzést közölni kell.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Crosse-Wortmann, T. 
Redeker und H. Schacke. „Entwicklung einer Standard-Appa ­
ratur zur Messung von Explosionsgrenzen”. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126-127.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  TŰZVESZÉLYESSÉG (ÉRINTKEZÉS VÍZZEL)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálati módszer annak meghatározására használható, hogy vala ­
mely anyag vízzel vagy nedves leveg ővel létrejött reakciója olyan 
gáz vagy gázok fejl ődéséhez vezet-e, amelyek t űzveszélyesek.  
A vizsgálati módszer mind szilárd, mind folyékony anyagokhoz 
alkalmazható. E módszer nem alkalmazható olyan anyagoknál, amelyeknél öngyulladás lép fel, amikor leveg ővel érintkeznek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Tűzveszélyesek: azok az anyagok, amelyek vízzel vagy nedves leve ­
gővel érintkezve veszélyes mennyiségben, minimum 1 liter/kg/óra 
ütemben fejlesztenek t űzveszélyes gázokat.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az anyagot az alábbi lépések sorrendjének megfelel ően vizsgálják; 
amennyiben valamely lépésnél gyulladás következik be, további vizsgálat nem szükséges. Amennyiben ismert, hogy az anyag 
nem lép er őteljes reakcióba vízzel, tovább kell haladni a 4. 
lépéshez (1.3.4.).
 
1.3.1.  1. lépés  
A vizsgált anyagot elhelyezik egy 20  o C-os hőmérséklet ű desztillált 
vizet tartalmazó tálba, és figyelik, hogy a fejl ődő gáz meggyullad-e.  
1.3.2.  2. lépés  
A vizsgált anyagot egy 20  o C-os hőmérséklet ű desztillált vizet tartal ­
mazó edény felületén lebeg ő szűrőpapírra helyezik, és figyelik, hogy 
a fejlődő gáz meggyullad-e. A sz űrőpapír arra szolgál, hogy egy 
helyen tartsa az anyagot a gyulladás lehet őségének növelésére.  
1.3.3.  3. lépés  
A vizsgált anyagot egy körülbelül 2 cm magas és 3 cm átmér őjű 
halomba helyezik. Néhány csepp vizet adnak hozzá a halomhoz, és figyelik, hogy a fejl ődő gáz meggyullad-e.
 
1.3.4.  4. lépés  
A vizsgált anyagot 20  o C-os hőmérséklet ű desztillált vízzel keverik, 
és a gázfejl ődés sebességét 7 órán keresztül mérik, 1 órás id őközön­
ként. Amennyiben a gázfejl ődés sebessége egyenetlen vagy növek ­
szik, 7 óra után a mérési id őt meg kell növelni maximum 5 napra. A 
vizsgálat megállítható, ha a sebesség bármikor az 1 liter/kg/órát 
meghaladja.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs megadva.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincs megadva.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK LEÍRÁSA  
1.6.1.  1. lépés  
1.6.1.1.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálatot szobah őmérsékleten (körülbelül 20  o C-on) hajtják 
végre.  
1.6.1.2.  A vizsgálat végrehajtása  
Desztillált vizet tartalmazó tálba kismennyiség ű (körülbelül 2 mm 
átmérőjű) vizsgált anyagot kell helyezni. Figyelni kell, hogy i) fejl ő­
dik-e gáz; és hogy ii) meggyullad-e a gáz. Amennyiben a gáz 
meggyullad, nincs szükség az anyag további vizsgálatára, mivel az 
anyagot veszélyesnek kell tekinteni.  
1.6.2.  2. lépés  
1.6.2.1.  Készülék  
Valamilyen alkalmas tartályban, például egy 100 mm átmér őjű lepár­
lóedényben lév ő desztillált víz felszínén sz űrőpapírt lebegtetnek.  
1.6.2.2.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálatot szobah őmérsékleten (körülbelül 20  o C-on) hajtják 
végre.  
1.6.2.3.  A vizsgálat végrehajtása  
A szűrőpapír közepére kismennyiség ű (körülbelül 2 mm átmér őjű) 
vizsgált anyagot helyeznek. Figyelni kell, hogy i. fejl ődik-e gáz; és 
hogy ii. meggyullad-e. Amennyiben a gáz meggyullad, nincs szükség 
az anyag további vizsgálatára, mivel az anyagot veszélyesnek kell tekinteni.
 
1.6.3.  3. lépés  
1.6.3.1.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálatot szobah őmérsékleten (körülbelül 20  o C-on) hajtják 
végre.  
1.6.3.2.  A vizsgálat végrehajtása  
A vizsgált anyagot körülbelül 2 cm magasságú és 3 cm átmér őjű, a 
tetején mélyedéssel ellátott halomba helyezik. Néhány csepp vizet adnak a bemélyedt részhez, és figyelik, hogy i. fejl ődik-e gáz; és 
hogy ii. meggyullad-e. Amennyiben a gáz meggyullad, az anyag 
további vizsgálatára nincs szükség, mivel az anyagot veszélyesnek 
kell tekinteni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  4. lépés  
1.6.4.1.  Készülék  
A készülék felépítését az ábra mutatja.  
1.6.4.2.  Vizsgálati körülmények  
Vizsgálni kell a vizsgált anyagot tartalmazó tartályt, hogy van-e 
benne 500 μm-nél kisebb (részecskeméret ű) por. Amennyiben a 
por a teljes anyag több mint 1 tömegszázaléka, vagy ha a minta 
morzsálódik, akkor a teljes anyagot porrá kell őrölni vizsgálat el őtt 
a tárolás és kezelés alatti részecskeméret csökkenésének figyelembe ­
vétele érdekében; egyébként az anyagot olyan állapotban kell 
megvizsgálni, ahogyan átvették. A vizsgálatot szobah őmérsékleten 
(körülbelül 20  o C-on) és légköri nyomáson kell végrehajtani.  
1.6.4.3.  A vizsgálat végrehajtása  
10–20 ml vizet öntenek a készülék csepegtet őtölcsérébe, és 10 
gramm anyagot helyeznek a kúp alakú lombikba. A fejl ődő gáz 
térfogata bármilyen, erre alkalmas eszközzel mérhet ő. Kinyitják a 
csepegtetőtölcsér elzárócsapját, hogy beengedjék a vizet a kúp 
alakú lombikba, és elindítanak egy stopperórát. A gázfejl ődést órán ­
ként mérik a 7 órás id őtartam során. Amennyiben ez alatt az 
időtartam alatt a gázfejl ődés egyenetlen, vagy ha az id őtartam 
végén növekszik a gázfejl ődés sebessége, a méréseket folytatni 
kell, legfeljebb öt napig. Amennyiben a mérés során bármikor a gázfejlődés sebessége meghaladja az 1 liter/kg/órát, a vizsgálat 
megszakítható. Ezt a vizsgálatot háromszor kell elvégezni.
 
Amennyiben ismeretlen a gáz kémiai összetétele, elemezni kell a 
gázt. Amennyiben a gáz t űzveszélyes komponenseket tartalmaz, és 
nem ismert, hogy a teljes keverék t űzveszélyes-e, vagy sem, ugyan ­
olyan összetétel ű keveréket kell készíteni, és megvizsgálni az A. 11. 
módszernek megfelel ően. 
2. ADATOK  
Az anyagot veszélyesnek kell tekinteni, ha:  
— öngyulladás jön létre a vizsgálati eljárás bármelyik lépésében,  
vagy  
— 1 liter/kg anyag/óránál nagyobb sebességgel fejl ődik kismér ­
tékben tűzveszélyes gáz.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a vizsgált anyag minden el őkészítésének részleteit,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— a vizsgálatok eredményeit (1., 2., 3. és 4. lépés),  
— a fejlődő gáz kémiai összetételét,  
— a gázfejl ődés sebességét, ha a 4. lépést (1.6.4.) végrehajtják,  
— az eredmények értelmezéséhez lényeges minden további 
megjegyzést.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Recommendation on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Függelék  
Ábra  
Készülék
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  SZILÁRD ANYAGOK ÉS FOLYADÉKOK ÖNGYULLADÁSI 
KÉPESSÉGE  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
A vizsgálati eljárás olyan szilárd vagy folyékony anyagoknál alkal ­
mazható, amelyek kis mennyiségekben öngyulladással meggyul ­
ladnak rövid id ővel azután, hogy érintkezésbe lépnek a szobah őmér­
sékletű (körülbelül 20  o C-os) leveg ővel. 
Azokra az anyagokra, amelyeket a gyulladás bekövetkezése el őtt 
órákon vagy napokon át szobah őmérséklet vagy magas h őmérséklet 
hatásának kell kitenni, e vizsgálati módszer nem vonatkozik.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Azok az anyagok tekinthet ők pirofórosnak, amelyek meggyulladnak, 
vagy az 1.6. pontban leírt feltételek mellett szenesedést okoznak.  
Folyadékoknál lehet, hogy az öngyulladást is meg kell vizsgálni az 
öngyulladási h őmérséklet (folyadékok és gázok) cím ű A.15. módszer 
segítségével.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs megadva.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A szilárd vagy folyékony anyagot hozzáadják egy inert hordozó ­
anyaghoz, és környezeti h őmérsékleten érintkezésbe hozzák a leve ­
gővel 5 perces id őtartamig. Amennyiben a folyékony anyagok nem 
gyulladnak meg ilyen körülmények között, azokat sz űrőpapírral 
felitatják, és környezeti h őmérsékleten (körülbelül 20  o C-on) leveg ő 
hatásának teszik ki 5 percre. Amennyiben a szilárd vagy folyékony 
anyag meggyullad, vagy a folyékony anyag meggyújtja vagy elsze ­
nesíti a sz űrőpapírt, akkor az anyagot pirofórosnak tekintik.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Ismételhet őség: a biztonsággal kapcsolatos jelent ősége miatt egyetlen 
pozitív eredmény elegend ő ahhoz, hogy az anyagot pirofórosnak 
tekintsék.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Készülék  
Egy körülbelül 10 cm átmér őjű porceláncsészét szobah őmérsékleten 
(körülbelül 20  o C-on) megtöltenek kovafölddel körülbelül 5 mm 
magasságig.  
Megjegyzés:  
A kovaföldet vagy bármilyen más, ehhez hasonló inert anyagot, 
amely könnyen beszerezhet ő, úgy kell kiválasztani, hogy olyan 
talajra legyen reprezentatív, amelyre a vizsgált anyag baleset esetén 
kifolyhat.  
Száraz sz űrőpapír szükséges olyan folyadékok vizsgálatához, 
amelyek leveg ővel érintkezve nem gyulladnak meg inert hordozó ­
anyaggal történ ő érintkezéskor.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  A vizsgálat végrehajtása  
a) Porszer ű szilárd anyagok  
A vizsgálandó porszer ű anyagból 1–2 cm  3 -t kiöntenek körülbelül 
1 méter magasságról egy nem éghet ő felületre, és figyelik, hogy 
meggyullad-e az anyag a leejtés során vagy az öntést ől számított 5 
percen belül.  
A vizsgálatot hat alkalommal hajtják végre, kivéve ha meggyullad az 
anyag.  
b) Folyadékok  
Körülbelül 5 cm  3 vizsgált folyadékot öntenek az el őkészített porce ­
láncsészébe, és figyelik, hogy 5 percen belül meggyullad-e az anyag.  
Amennyiben nem gyullad meg a hatszor elvégzett vizsgálat során, a 
következő vizsgálatokat hajtják végre:  
Fecskend őből 0,5 ml vizsgált anyagot helyeznek egy bevagdosott 
szűrőpapírra, és figyelik, hogy megyullad-e, illetve elszenesedik-e a 
szűrőpapír a folyadék hozzáadásától számított 5 percen belül. A 
vizsgálatot háromszor hajtják végre, kivéve ha meggyullad vagy 
elszenesedik a sz űrőpapír.  
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
A vizsgálat abbahagyható, amennyiben valamelyik vizsgálat ered ­
ménye pozitív.  
2.2. ÉRTÉKELÉS  
Amennyiben valamely inert hordozóanyaghoz való hozzáadás és 
levegő hatásának való expozíció után az anyag 5 percen belül 
meggyullad, vagy valamely folyékony anyag a leveg ő hatásának 
való expozíció után 5 percen belül elszenesít vagy meggyújt egy szűrőpapírt, az anyagot pirofórosnak tekintik.
 
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a vizsgálatok eredményeit,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  ROBBANÁSI TULAJDONSÁGOK  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
A módszer egy vizsgálatvázlatot ismertet annak meghatározására, 
hogy robbanásveszélyes-e valamely szilárd vagy pépes anyag, 
amikor láng (h őérzékenység), illetve ütés vagy súrlódás (mechanikai 
hatással szembeni érzékenység) hatásának van kitéve, és hogy robba ­
násveszélyes-e valamely folyékony anyag, amikor láng vagy ütés 
hatásának van kitéve.  
A módszer három részb ől áll:  
a) hőérzékenység vizsgálata (1);  
b) ütéssel kapcsolatos mechanikai hatással szembeni érzékenység 
vizsgálata (1);  
c) súrlódással kapcsolatos mechanikai hatással szembeni érzé ­
kenység vizsgálata (1).  
A módszer bizonyos általános határ segítségével adatokat ad meg a 
robbanás bekövetkezése valószín űségének meghatározására. A 
módszert nem annak megállapítására tervezték, hogy bizonyos körül ­
mények között képes-e az anyag robbanásra.  
A módszer alkalmas annak meghatározására, hogy az anyag robba ­
násveszélyes-e (h ő- és mechanikai hatással szembeni érzékenység) az 
irányelvben el őírt különleges körülmények között. A módszer alapja 
számos, nemzetközileg széles körben használt készüléktípus (1), amelyek rendszerint kielégít ő eredményeket adnak. Ismert, hogy a 
módszer nem ad végleges eredményt. A megadott készülék helyett 
használható más készülék, feltéve hogy az nemzetközileg elismert, és 
hogy az eredmények összeegyeztethet ők a megadott készülékkel 
kapott eredményekkel.
 
A vizsgálatokat nem kell végrehajtani, amikor a rendelkezésre álló 
termodinamikai információk (például képz ődéshő, bomlásh ő) és/vagy 
a szerkezeti képletben egyes reakcióképes csoportok hiánya (2) vitat ­
hatatlanul bizonyossá teszi, hogy az anyag nem képes gázkép ­
ződéssel vagy h őfelszabadulással járó gyors bomlásra (vagyis az 
anyag nem jelent semmilyen robbanásveszélyt). Folyadékoknál 
nincs szükség súrlódással kapcsolatos mechanikai hatással szembeni 
érzékenységvizsgálatra.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Robbanásveszélyes:  
Azok az anyagok, amelyek láng hatására robbanhatnak, vagy 
amelyek a megadott készülékben az ütésre vagy rázásra érzékenyek 
(vagy mechanikai hatással szemben érzékenyebbek, mint az 1,3- dinitro-benzol az alternatív készülékben).
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
1,3-dinitro-benzol, 0,5 mm-es szitán átszitált, rostált, kristályos tech ­
nikai termék, a súrlódást és ütést vizsgáló módszerekhez.  
Vizes ciklohexánonból átkristályosított, nedvesen szitált, 250 μm 
nyíláson átmen ő és 150 μm nyílásméret ű szitán visszamaradó, 103 
± 2  o C hőmérsékleten (4 órán át) szárított Perhidro-1,3,5-trinitro- 
1,3,5-triazin (RDX, hexogén, ciklonit – CAS 121-82-4) a második 
súrlódás- és ütésvizsgálat-sorozathoz.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Előzetes vizsgálatok szükségesek a három érzékenységvizsgálat 
végrehajtása érdekében a biztonságos körülmények létrehozásához.  
1.4.1.  Biztonság a kezelés során – vizsgálatok (3)  
Biztonsági okok miatt a f ő vizsgálatok végrehajtása el őtt kismeny ­
nyiségű (körülbelül 10 mg) anyagmintát – anélkül, hogy gázlángba 
beleérne – hevítenek, alkalmas formájú készülékben ütéssel, és egy üllőn fakalapács használatával vagy súrlódást létrehozó géppel 
súrlódás hatásának teszik ki. E vizsgálat célja meggy őződni arról, 
hogy érzékeny-e és robbanásveszélyes-e annyira az anyag, hogy az előírt érzékenységi vizsgálatokat, különösen a h őhatással szembeni 
érzékenységvizsgálatot, különleges óvintézkedések mellett kell-e 
végrehajtani a vizsgálatot végz ő személy sérülésének elkerülésére.
 
1.4.2.  Hőérzékenység  
A módszer magában foglalja az anyagnak a különböz ő nyílását­
mérőjű mérőperemek által lezárt acélcs őben történ ő melegítését 
annak meghatározására, hogy hajlamos-e robbanásra az anyag er ős 
hevítés és meghatározott mérték ű fojtás mellett.  
1.4.3.  Mechanikai hatással szembeni érzékenység (ütés)  
A módszer magában foglalja az anyag expozícióját olyan ütés hatá ­
sának, amelyet egy megadott magasságról leejtett, megadott tömeg 
hoz létre.  
1.4.4.  Mechanikai hatással szembeni érzékenység (súrlódás)  
A módszer magában foglalja a szilárd vagy pépes anyagok expozí ­
cióját súrlódás hatásának, szabványosított felületek között, el őírt 
terheléssel és relatív elmozdulással.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincs megadva.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Hőérzékenység (láng hatása)  
1.6.1.1.  Készülék  
A készülék egy f űtő- és védőkészülékbe szerelt, újra fel nem hasz ­
nálható acélcs őből, valamint annak újrahasználható zárószerkezetéb ől 
áll (1. ábra). Valamennyi cs ő acéllemezb ől, mélyhúzással készült 
(lásd a függeléket), 24 mm bels ő átmérőjű, 75 mm hosszúságú és 
0,5 mm falvastagságú. A csövek a nyitott végükön peremmel vannak ellátva azért, hogy lezárhatók legyenek a zárólemez-szerkezettel. Ez 
egy központi furattal rendelkez ő, a csőhöz kétrészes csatlakozással 
(anya és menetes gy űrű) szorosan rögzített, nyomásálló zárólemezb ől 
áll. Az anya és a menetes gy űrű króm-mangán acélból készült (lásd a 
függeléket), amely egészen 800
 o C hőmérsékletig szikramentes. A 
zárólemezek 6 mm vastagságú, h őálló acélból készültek (lásd a 
függeléket), és különböz ő nyílásátmér ővel rendelkeznek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Vizsgálati körülmények  
Az anyagot az átvételkor rendszerint megvizsgálják, bizonyos esetek ­
ben, például préselt, öntött, vagy más módon tömörített anyagok esetében, szükség lehet az anyag aprítás utáni vizsgálatára.
 
Szilárd anyagok esetében az egyes vizsgálatok során használandó 
anyag mennyiségét kétszakaszos száraz futtatási eljárás segítségével határozzák meg. Egy kitáralt csövet, amelynek el őzőleg megmérték 
az önsúlyát, megtöltenek 9 cm
 3 anyaggal, és az anyagot tömörítik a 
cső teljes keresztmetszetére ható 80 N er ővel. Biztonsági okokból 
vagy olyan esetekben, ahol összenyomással változtatható a minta fizikai alakja, más töltési eljárások is használhatók; például ha az anyag nagyon érzékeny a súrlódásra, a tömörítés nem megfelel ő. 
Amennyiben az anyag összenyomható, addig folytatják a további 
anyagbevitelt és tömörítést, amíg a cs ő felső vége alatt 55 mm-re 
van feltöltve. Meghatározzák a cs ő 55 mm-es szintjéig a feltöltéshez 
használt össztömeget, és hozzáadnak két további adagot, mindkett őt 
80 N erővel tömörítve. Ezután szükség szerint, tömörítéssel hozzá ­
adnak vagy kivesznek anyagot úgy, hogy a töltési szint a cs ő felső 
végétől 15 mm-re legyen. A második száraz futtatást, az els ő száraz 
futtatásban megállapított teljes tömeg egyharmadának tömörített 
mennyiségével kezdik el. Hozzáadnak két további ilyen adagot 80 
N tömörítéssel, és a cs őben az anyagszintet a cs ő felső végétől 
15 mm-re állítják be, szükség szerint anyag hozzáadásával vagy elvételével. A második száraz futtatásban meghatározott anyagmeny ­
nyiséget használják minden egyes vizsgálathoz; a megtöltést három 
egyenlő mennyiségben hajtják végre, mindegyiket 9 cm
 3 -re sűrítik 
össze olyan er ővel, amely ehhez szükséges. (Ez megkönnyíthet ő 
menetes gy űrűk segítségével.)  
Folyadékokat és géleket 60 mm-es magasságig töltenek be a cs őbe, a 
gélek esetében különös gondossággal kell eljárni annak megaka ­
dályozása érdekében, hogy üregek alakuljanak ki. A menetes gy űrűt 
alulról a cs őre csúsztatják, behelyezik a megfelel ő zárólemezt, és 
meghúzzák az anyát valamennyi molibdén-diszulfid bázisú ken ő­
anyag felvitele után. Lényeges annak ellen őrzése, hogy nem került 
anyag a karima és a lemez közé vagy a menetekbe.  
A hevítést nyomásszabályozóval (60–70 mbar) felszerelt ipari 
palackból egy áramlásmér őn átvezetett és a négy ég őhöz elosztó ­
csövön keresztül egyenletesen elosztott (amelyet az ég őkből a lángok 
vizuális megfigyelése jelez) propán biztosítja. Az ég őket az 1. 
ábrának megfelel ően a vizsgálati kamra köré helyezték el. A négy 
gázégő együttes fogyasztása körülbelül 3,2 liter propán/perc. Hasz ­
nálhatók más éghet ő gázok és ég ők, de a hevítési sebességnek a 3. 
ábrán megadottnak kell lennie. Minden készülék esetében a hevítési sebességet rendszeres id őközönként ellen őrizni kell dibutil-ftaláttal 
megtöltött csövek segítségével a 3. ábrának megfelel ően.
 
1.6.1.3.  A vizsgálatok végrehajtása  
Minden egyes vizsgálatot addig kell végezni, amíg a cs ő szét nem 
esik, vagy már 5 percig nem hevítették. Amennyiben a cs ő három 
vagy több darabra törik szét, amelyek néhány esetben a 2. ábrának megfelelően keskeny fémcsíkokkal összekapcsolhatók, ezt úgy érté ­
kelik, hogy robbanás történt. Az olyan vizsgálatokat, amelyeknél 
kevesebb töredék jön létre, vagy egyáltalán nem törik szét a cs ő, 
úgy tekintik, hogy nem eredményeznek robbanást.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Először egy három vizsgálatból álló vizsgálatsorozatot hajtanak 
végre 6,0 mm átmér őjű zárólemezzel, és ha nem történik robbanás, 
egy második, három vizsgálatból álló vizsgálatsorozat hajtanak végre 2,0 mm átmér őjű mérőperemmel. Amennyiben a két vizsgálatsorozat 
végrehajtása során valamelyiknél robbanás történik, nincs szükség 
további vizsgálatokra.
 
1.6.1.4.  Kiértékelés  
A vizsgálat eredményét pozitívnak tekintik, ha a fenti vizsgálatsoro ­
zatok valamelyikében robbanás történt.  
1.6.2.  Mechanikai hatással szembeni érzékenység (ütés)  
1.6.2.1.  Készülék (4. ábra)  
Egy jellegzetes ejt őkalapácsos készülék lényeges részei egy alap ­
lappal ellátott öntöttacél tömb, üll ő, oszlop, vezet ők, ejtősúlyok, 
kioldó készülék és egy mintatartó. A 100 mm (átmér őjű) × 70 mm 
(magasságú) acélüll őt a 450 mm (hosszúságú) × 450 mm (széles ­
ségű) × 60 mm (magasságú) öntött alaplappal ellátott, 230 mm 
(hosszúságú) × 250 mm (szélesség ű) × 200 mm (magasságú) acél ­
tömb tetejéhez csavarozzák. Egy varratmentes húzott acélcs őből 
készült oszlopot rögzítettek az acéltömb hátsó részéhez csavarozott 
tartóba. Négy csavar rögzíti a készüléket egy tömör, 60 × 60 × 60 cm-es betontömbhöz úgy, hogy a vezet ő sínek tökéletesen függ ő­
legesek, és az ejt ősúly szabadon esik. A vizsgálathoz 5 és 10 kg-os, 
tömör acélból készült súlyokat alkalmaznak. Minden egyes súly 
ütőfeje HRC 60–63 keménység ű és 25 mm-es minimális átmér őjű 
edzett acél.
 
A vizsgált mintát két koaxiális, egymás fölött elhelyezett, tömör 
acélhengerb ől álló ütőkészülékbe zárják egy hengeres acél vezet ő­
gyűrű bemélyedésében. A tömör acélhengerek 10 (- 0,003, - 0,005) 
mm átmér őjűek és 10 mm magasságúak, és felületük csiszolt, szélük 
lekerekített (0,5 mm-es görbületi sugár), és HRC 58–65 keménysé ­
gűek. A hengermélyedés küls ő átmérője 16 mm, magassága 13 mm, 
és egy 10 (+ 0,005, + 0,010) mm-es csiszolt furattal kell rendelkez ­
nie. Az üt őkészüléket acélból készült (26 mm átmér őjű és 26 mm 
magasságú), közbees ő üllőre szerelték, és egy, a füstgázok távozását 
lehetővé tevő, perforált gy űrűvel állítják középpontba.  
1.6.2.2.  Vizsgálati körülmények  
A minta térfogata 40 mm  3 vagy valamilyen alternatív készülékhez 
megfelelő térfogatú legyen. A szilárd anyagokat száraz állapotban 
kell vizsgálni, és a következ őképpen kell el őkészíteni:  
a) a por alakú anyagokat szitálják (0,5 mm-es szitaméret); a szitán 
átjutó anyagot használják a vizsgálathoz;  
b) a préselt, öntött vagy más módon tömörített anyagokat kis dara ­
bokra törik és szitálják; a 0,5 és 1 mm közötti átmér őjű szitált 
frakciót használják a vizsgálathoz, a szitált frakciónak az eredeti 
anyagra reprezentatívnak kell lennie.  
Az általában pép formájában szállított anyagokat, amennyiben lehet ­
séges, száraz állapotban, vagy minden esetben a lehet ő legnagyobb 
mennyiség ű oldószer eltávolítását követ ően kell vizsgálni. A folyé ­
kony anyagokat a fels ő és alsó acélhengerek között 1 mm-es réssel 
vizsgálják.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  A vizsgálatok végrehajtása  
Hat vizsgálatból álló vizsgálatsorozatot hajtanak végre, a 10 kg-os 
tömeget 0,40 méterr ől (40 J) ejtik le. Amennyiben robbanás követ ­
kezik be a 40 J-lal végrehajtott hat vizsgálat valamelyike során, 
további hat vizsgálatból álló vizsgálatsorozatot kell végrehajtani, 
ahol 5 kg-os tömeget kell leejteni 0,15 méterr ől (7,5 J). Más készü ­
lékekben a mintát összehasonlítják a kiválasztott referenciaanyaggal egy meghatározott eljárás (például fel-le módszer stb.) segítségével.
 
1.6.2.4.  Értékelés  
A vizsgálat eredményét pozitívnak tekintik, ha az el őírt ütőkészü­
lékkel végrehajtott vizsgálatok bármelyikében legalább egyszer 
robbanás következik be (ezzel egyenérték ű a lángba borulás és/vagy 
durranás), vagy a minta érzékenyebbnek bizonyul, mint az 1,3- dinitro-benzol vagy az RDX valamelyik alternatív ütésvizsgálatban.
 
1.6.3.  Mechanikai hatással szembeni érzékenység (súrlódás)  
1.6.3.1.  Készülék (5. ábra)  
A súrlódásérzékenységet vizsgáló berendezés egy öntöttacél alaple ­
mezből áll, amelyre a súrlódási érzékenységet vizsgáló készüléket 
felszerelték. Ez a készülék egy rögzített porcelánhengerb ől és egy 
mozgó porcelánlapból áll. A porcelánlapot egy kocsin tartják, amely két csúszópályán fut. A kocsit hajtórúd, hüvelyvonó karom és alkalmas hajtóm ű csatlakoztatja a villamos motorhoz úgy, hogy a 
porcelánlap csak egyszer mozdul el őre és hátra 10 mm-t a porcelán ­
henger alatt. A porcelánhenger terhelhet ő, például 120 vagy 360 
newtonnal.
 
A porcelánlapok fehér ipari porcelánból (9–32 μm érdesség) készül ­
tek, és 25 mm (hosszúság) × 25 mm (szélesség) × 5 mm (magasság) méretűek. A porcelánhenger ugyancsak fehér ipari porcelánból 
készült, és ez 15 mm hosszú, 10 mm átmér őjű és 10 mm görbületi 
sugarú, érdesített gömbszeletekkel rendelkezik.
 
1.6.3.2.  Vizsgálati körülmények  
A minta térfogata 10 mm  3 vagy az adott alternatív berendezésnek 
megfelelő térfogatú legyen.  
A szilárd anyagokat száraz állapotban vizsgálják, és a következ ő­
képpen készítik el ő: 
a) a por alakú anyagokat szitálják (0,5 mm-es szitaméret); a szitán 
átjutó anyagot használják a vizsgálathoz;  
b) a préselt, öntött vagy más módon tömörített anyagokat darabokra 
törik és szitálják; a < 0,5 mm átmér őjű szitált frakciót használják 
vizsgálathoz.  
Az általában pép formában szállított anyagokat, amennyiben lehet ­
séges, száraz állapotban kell megvizsgálni. Amennyiben az anyag száraz állapotban nem készíthet ő el, a pépet (a lehet ő legnagyobb 
oldószermennyiség eltávolítása után) egy formával készített, 0,5 mm 
vastag, 2 mm széles, 10 mm hosszú filmként vizsgálják.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  A vizsgálatok végrehajtása  
A porcelánhengert a vizsgált mintára helyezik, és ráadják a terhelést. 
A vizsgálat végrehajtásakor a porcelánlap porozitási jelzésének harántirányban kell állnia a mozgás irányával. Ügyelni kell arra, 
hogy amikor a hengert a mintára helyezik, elegend ő vizsgált anyag 
legyen a henger alatt, és a lap megfelel ően mozogjon a henger alatt. 
Pépes anyagokhoz egy 2 × 10 mm-es nyílású, 0,5 mm vastag mérőeszközt használnak az anyag lapra történ ő felvitelére. A porce ­
lánlapnak 10 mm-t kell el őre és visszafelé mozognia a porcelán ­
henger alatt 0,44 másodpercen belül. A lap és henger felületének minden részét csak egyszer szabad használni; a henger két vége 
két vizsgálathoz, a lap két felülete felületenként három vizsgálathoz 
használható.
 
Hat vizsgálatból álló vizsgálatsorozatot hajtanak végre 360 N terhe ­
léssel. Amennyiben pozitív eredményt kapnak ez alatt a hat vizsgálat 
alatt, további hat vizsgálatból álló vizsgálatsorozatot kell végrehajtani 120 N terheléssel. Egy másik készülékben a mintát összehasonlítják a kiválasztott referenciaanyaggal egy erre meghatározott eljárás (pél ­
dául fel-le módszer) segítségével.
 
1.6.3.4.  Értékelés  
A vizsgálati eredmény akkor tekinthet ő pozitívnak, ha az el őírt súrló­
dási érzékenységet vizsgáló berendezéssel végrehajtott vizsgálatok 
valamelyikében legalább egyszer robbanás jön létre (a robbanással 
egyenérték ű a sercegés és/vagy a csattanás vagy lángba borulás), 
vagy egy alternatív súrlódásvizsgálat során teljesül az ezzel egyen ­
értékű követelmény.  
2. ADATOK  
Elvben az anyagot az irányelv értelmében robbanásveszélyesnek kell 
tekinteni, ha a h ő, ütés vagy súrlódási érzékenység vizsgálata során 
pozitív eredményt kapnak.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— a vizsgált anyag azonosítását, összetételét, tisztaságát, nedvesség ­
tartalmát stb.,  
— a minta fizikai jellemz őit, és annak feltüntetését, hogy őrölték, 
aprították és/vagy szitálták-e az anyagot,  
— a hőérzékenységi vizsgálatok során tett megfigyeléseket (például 
a minta tömege, száma stb.),  
— a mechanikai hatással szembeni érzékenységvizsgálatok során tett 
megfigyeléseket (például jelent ős mennyiség ű füst képz ődése 
vagy teljes elbomlás csattanás nélkül, lángok, szikra, csattanás, sistergés, ropogás stb.),
 
— minden egyes típusú vizsgálat eredményét,  
— ha alternatív készüléket használtak, meg kell adni az adott készü ­
lékkel kapott eredmények és az egyenérték ű készülékkel kapott 
eredmények közötti korreláció tudományos indoklását, valamint 
prioritását,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— minden hasznos megjegyzést, ilyen például a hivatkozás a 
hasonló termékekkel végrehajtott vizsgálatokra, amely lényeges 
lehet az eredmények megfelel ő értelmezéséhez,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ÉS ÉRTÉKELÉSE  
A vizsgálati jelentésnek tartalmaznia kell minden hamis, rendellenes, 
illetve nem jellemz ő eredményt. Amennyiben a vizsgálatok közül 
bármelyiket figyelmen kívül kell hagyni, meg kell adni annak 
magyarázatát és minden alternatív vagy kiegészít ő vizsgálat eredmé ­
nyeit. A rendellenes eredményt el kell fogadni névértéken, és az anyagot ennek megfelel ően osztályozni kell, kivéve ha az eredmény 
megmagyarázható.
 
4. SZAKIRODALOM  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H. Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6–13 and 30–42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use – 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Függelék  
Példa az anyag meghatározására a h őérzékenységvizsgálathoz (lásd a DIN 
1623 szabványt)  
(1) Cső: 1.0336.505 g számú anyagmeghatározás.  
(2) Zárólemez: 1.4873 számú anyagmeghatározás.  
(3) Menetes gy űrű és anya: 1.3817 számú anyagmeghatározás.  
1. ábra  
Hőérzékenységet vizsgáló készülék  
(minden méret mm-ben van megadva)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
2. ábra  
Hőérzékenység-vizsgálat  
Példák a széttörésre
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
3. ábra  
Hevítési sebesség kalibrációja a h őérzékenység-vizsgálathoz
  
Egy zárt (1,5 mm-es zárólemez) cs őben 3,2 liter/perces áramlási sebesség ű propán segítségével 
dibutil-ftalát (27 cm  3 ) melegítésekor kapott h őmérséklet/id ő görbe. A h őmérsékletet egy 1 mm 
átmérőjű, középre, 43 mm-rel a cs ő pereme alá helyezett rozsdamentes acéllal bevont kromel/ ­
alumel termoelemmel mérik. 135  o C és 285  o C között a hevítési sebességnek 185 és 215 
K/perc között kell lennie.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
4. ábra  
Ütési érzékenységet vizsgáló készülék  
(minden méret mm-ben van megadva)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
4. ábra  
Folytatás
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
5. ábra  
Súrlódási érzékenységet vizsgáló készülék
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  ÖNGYULLADÁSI H ŐMÉRSÉKLET (FOLYADÉKOK ÉS 
GÁZOK)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Robbanásveszélyes és környezeti h őmérsékleten leveg ővel érintkezve 
öngyulladó anyagokat nem lehet ezen eljárással vizsgálni. A vizs ­
gálati eljárás olyan gázokhoz, folyadékokhoz és g őzökhöz alkalmaz ­
ható, amelyek forró felülettel érintkezve meggyulladhatnak.  
Az öngyulladási h őmérsékletet jelent ős mértékben csökkentheti a 
katalitikus szennyez ődések jelenléte, a felület anyaga vagy a vizs ­
gálati tartály nagyobb térfogata.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az öngyulladási képesség mértéke az öngyulladási h őmérséklet 
segítségével fejezhet ő ki. Az öngyulladási h őmérséklet az a legala ­
csonyabb h őmérséklet, amelyen a vizsgált anyag leveg ővel keverve 
meggyullad a vizsgálati módszerben meghatározott körülmények között.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
A szabványok tartalmazzák a referenciaanyagokat (lásd az 1.6.3. 
pontot). Ezeknek els ősorban a módszer megfelel őségének id őnkénti 
ellenőrzésére és a más módszerekkel kapott eredményekkel való 
összehasonlítás lehet ővé tételére kell szolgálniuk.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A módszer meghatározza valamely körülkerített tér bels ő felületének 
azt a minimális h őmérsékletét, amelynél meggyullad az e térbe fecs ­
kendezett gáz, g őz vagy folyadék.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Az ismételhet őség az öngyulladási h őmérsékletek tartományának és 
az alkalmazott vizsgálati módszernek megfelel ően változik.  
Az érzékenység és specifikusság az alkalmazott vizsgálati 
módszertől függ.  
1.6. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Készülék  
A készüléket az 1.6.3. pontban említett módszer írja le.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgált anyagmintát az 1.6.3. pontban említett módszernek 
megfelelően vizsgálják.  
1.6.3.  A vizsgálat végrehajtása  
Lásd az IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, 
NF T 20-037 szabványokat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. ADATOK  
Regisztrálni kell a vizsgálati h őmérsékletet, a légköri nyomást, a 
felhasznált minta mennyiségét és a gyulladás bekövetkezéséig eltelt holtidőt.
 
3. JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— az anyag pontos leírását (azonosítás és szennyez ődések),  
— a felhasznált minta mennyiségét, a légköri nyomást,  
— a vizsgálathoz használt készüléket,  
— a mérések eredményeit (vizsgálati h őmérsékletek, gyulladással 
kapcsolatos eredmények, megfelel ő holtidők), 
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést.  
4. SZAKIRODALOM  
Nincs.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  SZILÁRD ANYAGOK RELATÍV ÖNGYULLADÁSI 
HŐMÉRSÉKLETE  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Robbanásveszélyes és környezeti h őmérsékleten leveg ővel érintkezve 
öngyulladó anyagokat nem szabad alávetni ennek a vizsgálatnak.  
A vizsgálat célja el őzetes információk biztosítása szilárd anyagok 
magas hőmérsékleteken bekövetkez ő öngyulladásáról.  
Amennyiben az anyagnak oxigénnel történ ő reakciója, vagy az 
exoterm bomlás során fejl ődő hő nem elég gyorsan áramlik a 
környezetbe, öngyulladáshoz vezet ő önmelegedés jön létre. Az 
öngyulladás tehát akkor következik be, amikor a h őtermelés üteme 
meghaladja a h őveszteség ütemét.  
A vizsgálati eljárás hasznos mint el őzetes szűrővizsgálat szilárd 
anyagoknál. Tekintettel a szilárd anyagok gyulladásának és égésének 
bonyolult természetére, e vizsgálati módszernek megfelel ően 
meghatározott öngyulladási h őmérsékletet csak összehasonlítási 
célokra szabad használni.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az e módszerrel kapott öngyulladási h őmérséklet az a  o C-ban kife ­
jezett minimális környezeti h őmérséklet, amelynél meghatározott 
körülmények között meghatározott mennyiség ű anyag meggyullad.  
1.3 REFERENCIAANYAG  
Nincs.  
1.4 A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Meghatározott térfogatú vizsgált anyagot szobah őmérséklet ű kemen­
cébe helyeznek; majd regisztrálják a minta közepére vonatkozó 
hőmérséklet/id ő görbét, miközben a kemence h őmérsékletét 0,5  o C/­
perc sebességgel 400  o C-ra vagy olvadáspontra emelik, amennyiben 
az kisebb 400  o C-nál. E vizsgálat alkalmazásában öngyulladási 
hőmérséklet a kemencének az a h őmérséklete, amelynél a minta 
hőmérséklete önmelegedéssel eléri a 400  o C-t. 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincs.  
1.6. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Készülék  
1.6.1.1.  Kemence  
Természetes leveg őkeringtetéssel és robbanás elleni szeleppel ellá ­
tott, hőmérsékletprogramozott laboratóriumi kemence (körülbelül 2 
liter térfogatú). A lehetséges robbanásveszély elkerülése érdekében 
nem szabad engedni, hogy bármilyen gáz-halmazállapotú bomlás ­
termék kapcsolatba lépjen az elektromos f űtőelemekkel.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Drótháló kocka  
Az 1. ábrán látható mintának megfelel ő 0,045 mm-es nyílásokkal 
rendelkez ő, rozsdamentes acél dróthálót kell kivágni. A hálót össze 
kell hajtogatni nyitott tetej ű kockává, és huzallal rögzíteni kell.  
1.6.1.3.  Termoelemek  
Alkalmas termoelemek.  
1.6.1.4.  Regisztráló készülék  
Bármely, 0-tól 600  o C-ig vagy ennek megfelel ő feszültségre kalib ­
rált, kétcsatornás regisztráló készülék.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
Az anyagokat az átvételüknek megfelel ő állapotukban vizsgálják.  
1.6.3.  A vizsgálat végrehajtása  
A kockát megtöltik a vizsgált anyaggal, és gyenge ütögetéssel tömö ­
rítik, majd további anyagot adnak hozzá, amíg teljesen meg nem telik a kocka. A kockát ezután szobah őmérsékleten felfüggesztik a 
kemence közepén. Az egyik termoelemet a kocka közepére helyezik, 
a másikat a kocka és a kemence fala közé a kemence h őmérsékle­
tének regisztrálására.
 
A kemence és a minta h őmérsékletét folyamatosan regisztrálják, 
miközben 0,5  o C/perc sebességgel 400  o C-ra, vagy ha az olvadási 
pont ennél alacsonyabb, akkor az olvadási pontra növelik a kemence hőmérsékletét.
 
Amennyiben az anyag meggyullad, a mintában lév ő termoelem 
nagyon hirtelen h őmérsékletnövekedést fog mutatni a kemence 
hőmérsékletéhez képest.  
2. ADATOK  
Az értékeléshez lényeges a kemencének az a h őmérséklete, amelynél 
a minta h őmérséklete önmelegedéssel eléri a 400  o C-ot (lásd a 2. 
ábrát).  
3. JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— a vizsgált anyag leírását,  
— a mérés eredményeit, a h őmérséklet/id ő görbét is ideértve,  
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést.  
4. SZAKIRODALOM  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
1. ábra  
20 mm-es vizsgálati kocka sémája
  
2. ábra  
Jellegzetes h őmérséklet/id ő görbe
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  OXIDÁLÓ TULAJDONSÁGOK (SZILÁRD ANYAGOK)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat végrehajtásához hasznos el őzetes információkat szerezni 
az anyag minden lehetséges robbanási tulajdonságáról.  
Ez a vizsgálat nem alkalmazható folyadékokhoz, gázokhoz, robba ­
násveszélyes vagy t űzveszélyes anyagokhoz vagy szerves peroxi ­
dokhoz.  
A vizsgálatot nem kell végrehajtani, ha a szerkezeti képlet vizsgálata 
minden kétség nélkül kimutatja, hogy az anyag nem képes exoterm reakcióba lépni éghet ő anyaggal.
 
Előzetes vizsgálatot kell végrehajtani annak megállapítására, hogy 
különleges óvintézkedésekkel kell-e végrehajtani a vizsgálatot.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁS ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Égési idő: az 1.6. pontban leírt eljárást követve, az a másodpercben 
meghatározott reakcióid ő, amely alatt a reakciózónában az égés az 
anyagnyaláb mentén szétterjed.  
Égési sebesség: milliméter/szekundumban kifejezve.  
Maximális égési sebesség: 10–90 tömegszázalékban oxidálószert 
tartalmazó keverékekkel kapott égési sebességek közül a legna ­
gyobb érték.  
1.3. REFERENCIAANYAG  
A vizsgálathoz és az el őzetes vizsgálathoz referenciaanyagként (ana ­
litikai tisztaságú) bárium-nitrátot használnak.  
A referenciakeverék az a bárium-nitrátnak cellulózporral alkotott, az 
1.6. pontnak megfelel ően elkészített (rendszerint 60 tömegszázalékos 
bárium-nitrátot tartalmazó) keveréke, amelynek maximális az égési 
sebessége.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Biztonsági okokból el őzetes vizsgálatot hajtanak végre. Nincs 
szükség további vizsgálatra, amennyiben az el őzetes vizsgálat vilá ­
gosan jelzi, hogy a vizsgált anyagnak oxidáló tulajdonságai vannak. Ellenkező esetben az anyagot teljes vizsgálatnak kell alávetni.
 
A teljes vizsgálat során a vizsgált anyag és valamilyen meghatározott 
éghető anyag különböz ő arányú keverékét kell alkalmazni. Ezután 
minden egyes keverékb ől kialakítanak egy halmot, és a halmot az 
egyik végén meggyújtják. A meghatározott maximális égési sebes ­
séget összehasonlítják a referenciakeverék maximális égési sebes ­
ségével.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Amennyiben szükséges, az őrlés és keverés bármilyen módszere 
megfelel, feltéve hogy a hat különálló vizsgálatban a maximális 
égési sebesség 10 %-nál nem nagyobb mértékben tér el a számtani 
középértékt ől. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészítés  
1.6.1.1.  A vizsgált anyag  
A vizsgált anyagot < 0,125 mm-es részecskeméret űre őrlik a követ ­
kező eljárás segítségével: a vizsgált anyag szitálása, a visszamaradó 
anyag őrlése, az eljárás megismétlése, amíg a teljes vizsgált anyag 
keresztül nem halad a szitán.  
A minőségi követelménynek megfelel ő bármilyen őrlési és szitálási 
módszer használható.  
A keverék el őkészítése el őtt az anyagot 105  o C hőmérsékleten 
súlyállandóságig szárítják. Amennyiben a vizsgált anyag bomlási 
hőmérséklete 105  o C alatt van, az anyagot alacsonyabb h őmérsék­
leten kell megszárítani.  
1.6.1.2.  Éghet ő anyag  
Éghető anyagként por alakú cellulózt használnak. A cellulóznak 
vékonyfilm- vagy oszlopkromatográfiához használt típusúnak kell 
lennie. A szálhosszúság több mint 85 %-a 0,020 és 0,075 mm között 
legyen. A cellulózport egy 0,125 mm nyílásméret ű szitán áttörik. 
Ugyanabból a gyártási sorozatból származó cellulózt kell használni a teljes vizsgálat során.
 
A keverék el őkészítése el őtt a porított cellulózt 105  o C-on súlyállan ­
dóságig szárítják.  
Amennyiben falisztet használnak az el őzetes vizsgálatnál, akkor puha 
falisztet kell készíteni, amely átmegy egy 1,6 mm nyílásméret ű 
szitán, ezt alaposan meg kell keverni, majd 105  o C hőmérsékleten 
4 órán át kell szárítani 25 mm-nél nem vastagabb rétegben. Ezután le kell hűteni, és amíg szükséges – legfeljebb a szárítástól számított 24 
órán keresztül – légmentes tartályban kell tárolni, amelyet a lehet ő 
legjobban meg kell tölteni.
 
1.6.1.3.  Gyújtóforrás  
Gyújtóforrásként gázég őből (minimális átmér ője 5 mm) kiáramló 
forró lángot kell használni. Amennyiben más gyújtóforrást hasz ­
nálnak (például inert légkörben végrehajtott vizsgálatkor), a jelen ­
tésben meg kell adni annak leírását és indoklását.  
1.6.2.  A vizsgálat végrehajtása  
Megjegyzés:  
Az oxidálószereknek cellulózzal vagy faliszttel alkotott keverékeit 
robbanásveszélyesnek kell tekinteni, és kell ő gondossággal kell 
kezelni.  
1.6.2.1.  Előzetes vizsgálat  
A szárított anyagot alaposan összekeverik szárított cellulózzal vagy 
faliszttel 2 vizsgáltanyag-tömegrész – 1 cellulóz- vagy faliszt-tömeg ­
rész arányban, és a keveréket kis, kúp alakú, 3,5 cm (az alap átmérője) × 2,5 cm-es (magasság) halomba formálják egy kúp 
alakú forma (például lezárt szárú laboratóriumi üvegtölcsér) tömö ­
rítés nélküli megtöltésével.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
A halmot egy hideg, nem éghet ő, nem porózus és alacsony h őve­
zető-képesség ű alaplemezre helyezik. A vizsgálatot az 1.6.2.2. 
pontnak megfelel ően füstszekrényben kell végrehajtani.  
A gyújtóforrást érintkezésbe hozzák a kúppal. Megfigyelik és 
regisztrálják az ennek eredményeként létrejöv ő reakció er őteljességét 
és időtartamát.  
Az anyagot oxidálónak kell tekinteni, ha er őteljes a reakció.  
Minden esetben, ahol kételyek merülnek fel az eredménnyel 
kapcsolatban, végre kell hajtani az alábbiakban leírt teljes vizs ­
gálatsorozatot.  
1.6.2.2.  Vizsgálatsorozat  
10 %-os intervallumokban, 10–90 tömegszázalékban oxidálószert 
tartalmazó oxidálószer/cellulózkeverékeket készítenek. Határese ­
tekhez közbens ő oxidáló szer/cellulózkeverékeket kell használni 
azért, hogy pontosabb legyen a kapott maximális égési sebesség.  
A halmot forma segítségével alakítják ki. A háromszög keresztmet ­
szetű forma fémb ől készült, hossza 250 mm, bels ő magassága 
10 mm és bels ő szélessége 20 mm. A forma mindkét oldalán hossz ­
irányban két fémlemezt szereltek fel oldallapként, amelyek 2 mm-rel túlnyúlnak a háromszög alakú keresztmetszet fels ő szélén (lásd az 
ábrát). Ezt az eszközt lazán megtöltik a szükségesnél kissé több 
keverékkel. Miután a formát egyszer 2 cm-es magasságból szilárd 
felületre ejtették, a megmaradó felesleges anyagot lekaparják egy ferdén elhelyezett lappal. Az oldallapokat eltávolítják, és a megmaradt por felületét kisimítják egy henger segítségével. Ezután 
a forma tetejére nem éghet ő, nem porózus és alacsony h ővezető- 
képességű alaplemezt helyeznek, a készüléket megfordítják, és eltá ­
volítják a formát.
 
A halmot a füstszekrény huzatába helyezik.  
A levegő sebességének elegend őnek kell lennie ahhoz, hogy 
megakadályozza az égéstermékek laboratóriumba szökését, és azt a 
vizsgálat során megváltoztatni nem szabad. A berendezés köré huza ­
tellenzőt kell szerelni.  
A cellulóz és néhány vizsgált anyag vízfelvev ő képessége miatt a 
vizsgálatot a lehet ő leggyorsabban kell végrehajtani.  
Meggyújtják a halom egyik végét úgy, hogy hozzáérintik a lángot.  
A reakcióid őt 200 mm-es távolság mentén mérik, miután a reakció ­
zóna már 30 mm távolságra terjedt.  
A vizsgálatot a referenciaanyaggal és a vizsgált anyagnak a 
cellulózzal alkotott keverékei mindegyikével legalább egyszer 
végrehajtják.  
Amennyiben megállapítják, hogy a maximális égési sebesség 
lényegesen nagyobb, mint amelyet a referenciakeverékb ől kaptak, 
a vizsgálat megszakítható; egyébként a vizsgálatot ötször meg 
kell ismételni a legnagyobb égési sebességet adó három keverék 
mindegyikével.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Amennyiben az eredmény gyaníthatóan hamis pozitív, a vizsgálatot 
meg kell ismételni cellulóz helyett ehhez hasonló részecskeméret ű 
inert anyag, például kovaföld segítségével. Más megoldásként a legnagyobb égési sebesség ű vizsgált anyag/cellulózkeveréket újra 
meg kell vizsgálni inert légkörben (< 2 térfogatszázalék oxigéntar ­
talom).
 
2. ADATOK  
Biztonsági okokból a maximális égési sebességet – és nem a közép ­
értéket – kell a vizsgált anyag jellemz ő oxidáló tulajdonságának 
tekinteni.  
Az értékeléshez adott keverék hat vizsgálatából álló vizsgálatsoro ­
zatán belül az égési sebesség legnagyobb értéke a fontos.  
Fel kell rajzolni minden egyes keverék legnagyobb égési sebes ­
ségének görbéjét az oxidálószer koncentrációja függvényében. A görbéből kell megállapítani a maximális égési sebességet.
 
A maximális égési sebesség ű keverék vizsgálatából kapott hat mért 
égési sebesség értékének nem szabad 10 %-nál nagyobb mértékben eltérnie a számtani középértékt ől; ellenkez ő esetben javítani kell az 
őrlési és keverési módszereken.
 
Össze kell hasonlítani a kapott maximális égési sebességet a referen ­
ciaanyag maximális égési sebességével (lásd az 1.3. pontot).  
Amennyiben a vizsgálatokat inert légkörben hajtják végre, a maxi ­
mális reakciósebességet összehasonlítják a referenciakeverék inert légkörben kapott maximális reakciósebességével.
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek, amennyiben lehetséges, a következ ő infor­
mációkat kell tartalmaznia:  
— a vizsgált anyag azonosságát, összetételét, tisztaságát, nedvesség ­
tartalmát stb.,  
— a vizsgált minta minden kezelését (például őrlés, szárítás, …),  
— a vizsgálatok során használt gyújtóforrást,  
— a mérések eredményeit,  
— a reakció módját (például felvillanással égés a felületen, a teljes 
tömegen keresztüli égés, az égéstermékekre vonatkozó minden információ, …),
 
— az eredmények értelmezése szempontjából lényeges minden 
további megjegyzést, ilyen például a hevesség (lángolás, szikrá ­
zás, füstölgés, lassú izzás stb.) leírása, és mind a vizsgált, mind a 
referenciaanyag el őzetes biztonsági/sz űrési vizsgálata során 
kapott közelít ő időtartam,  
— inert anyaggal végrehajtott vizsgálatokból kapott eredményeket, 
amennyiben van ilyen,  
— inert légkörben végrehajtott vizsgálatokból kapott eredményeket, 
amennyiben van ilyen.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. AZ EREDMÉNY ÉRTELMEZÉSE  
Valamely anyagot oxidáló anyagnak kell tekinteni, amikor:  
a) az előzetes vizsgálat során er őteljes reakció jön létre;  
b) a teljes vizsgálat során a vizsgált keverékek maximális égési 
sebessége nagyobb vagy egyenl ő, mint a cellulóz és a bárium- 
nitrát alkotta referenciakeverék maximális égési sebessége.  
A hamis pozitív eredmény elkerülése érdekében az inert anyaggal 
kevert anyag vizsgálatakor és/vagy inert légkörben végrehajtott vizs ­
gálatkor kapott eredményeket figyelembe kell venni az eredmények 
értelmezésekor.  
4. SZAKIRODALOM  
NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Függelék  
Ábra  
Forma és tartozékok a halom elkészítéséhez  
(Minden méret mm-ben van megadva)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  A POLIMEREK SZÁMÁTLAG SZERINTI MOLEKULATÖ ­
MEGE ÉS MOLEKULATÖMEG-ELOSZLÁSA  
1. MÓDSZER  
E gél permeációs kromatográfiás módszer megfelel az OECD 
TG 118-nak (1996). Az alapelvek és további technikai információk 
az 1. hivatkozásban találhatók.  
1.1. BEVEZETÉS  
Mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen 
egyetlen módszert leírni, pontosan felsorolva az elválasztás és kiérté ­
kelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztá ­
sánál előforduló eshet őséget és különlegességet. Különösen a kompl ­
expolimer rendszereknél gyakran nem használható a gél permeációs kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a mole ­
kulatömeg más módszerekkel határozható meg (lásd a függeléket). 
Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi rész ­
letét és igazolását.
 
A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN 
szabványban található részletes információ a kísérletek kivitelezé ­
séről és az adatkiértékelésr ől. Amennyiben a kísérleti körülmények 
módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány 
is használható, amennyiben teljes kör ű hivatkozással rendelkezik. A 
leírt módszer kalibrációra ismert polidiszperzitású polisztirol mintákat használ, és esetleg módosítani kell, hogy megfelel ő legyen 
bizonyos polimereknél, pl.: vízben oldható és hosszú láncú elágazó 
polimerek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az M  n számátlag molekulatömeget és az M  w tömegátlag molekula ­
tömeget az alábbi egyenletekkel lehet meghatározni: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
ahol 
H i a detektorjel szintje az alapvonaltól V  i retenciós térfogatra,  
M i a polimerfrakció molekulatömege V  i retenciós térfogatnál, és  
n az adatpontok száma.  
A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszper ­
zitásának mértéke, az M  w /M n arány adja meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny 
eloszlású, lineárisan felépített, ismert M  n és M  w átlagos molekulatö ­
megű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat 
használnak e célra. Az ismeretlen minta molekulatömegének 
meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, ameny ­
nyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva.
 
A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott 
kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körülményei között érvényes. 
A körülmények magukban foglalják mindenek felett a h őmérsékletet, 
az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat.
 
A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és 
„polisztirol ekvivalens molekulatömeg”-ként írták le őket. Ez azt 
jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbsége ­
itől függően a molekulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltér ­
hetnek az abszolút értékt ől. Amennyiben más standardokat használ ­
tak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliak ­
rilsav, azt meg kell indokolni.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek 
(M n , M  w ) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatog ­
ráfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodina ­
mikai térfogata szerint választódik el (2).  
Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel 
töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák 
be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és els őként eluálódnak. A közepes 
méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és kés őbb 
eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidro ­
dinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára.
 
Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete 
szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elkerülni valamely abszorpciós 
hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holttérfogat 
ronthatja a helyzetet (2).  
A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyelés ­
sel, és egyszer ű eloszlási görbét eredményez. Azonban ahhoz, hogy a 
tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az 
oszlopot kalibrálni kell ismert molekulatömeg ű és ideális esetben 
nagyjából hasonló szerkezet ű polimerek, pl. különböz ő polisztirol 
standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függ őleges tengely 
a különböz ő eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét, a 
vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát mutatja.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, 
RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát bels ő standarddal való korrekcióval kell biztosí ­
tani, amennyiben a kromatogramot az id ő függvényében értékelik ki, 
és nem felel meg a fent említett követelménynek (1). A polidiszper ­
zitás függ a standardok molekulatömegét ől. Polisztirol standardoknál 
a tipikus értékek: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál)  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  A standard polisztirol oldatok készítése  
A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott 
eluensben. A gyártó ajánlásait számításba kell venni az oldatok készítésénél.
 
A választott standardok koncentrációja különböz ő faktoroktól függ, 
pl. injektált térfogat, az oldat viszkozitása és az elemz ő detektor 
érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es oszlopú GPC-vel történ ő analitikai elválasztásoknál a jellemz ő injek­
tált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is 
elképzelhet ő, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalib ­
rációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a koncentráció 
optimális arányát.
 
1.6.2.  A mintaoldat elkészítése  
Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények 
érvényesek. A mintát megfelel ő oldószerben pl. tetrahidro-furán 
(THF) óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között 
sem szabad ultrahangos fürd őben feloldani. Amennyiben szükséges, 
az oldat tisztítható 0,2–2 μm-es pórusméret ű membránsz űrővel. 
A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömeg ű fajták 
miatt fordulhatnak el ő, fel kell jegyezni a végleges jelentésben. A 
feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására megfelel ő 
módszert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel kell használni.  
1.6.3.  Készülék  
— oldószertartály,  
— gáztalanító (szükség szerint),  
— pumpa,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— rezgéscsillapító (szükség szerint),  
— injektáló rendszer,  
— kromatográfiás oszlopok,  
— detektor,  
— áramlásmér ő (szükség szerint),  
— adat rögzít ő-feldolgozó,  
— hulladéktároló.  
Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldó ­
szerekkel szemben (pl. THF oldószernél acélkapillárisok használata).  
1.6.4.  Injektáló és oldószerszállító rendszer  
A minta oldatának meghatározott térfogatát automataadagolóval vagy 
kézzel töltik az oszlopra egy pontosan meghatározott zónába. Amennyiben kézzel végzik, a fecskend ő dugattyújának túl gyors 
benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban 
változásokat okozhat. Az oldószert szállító rendszernek, amennyire 
csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrend ű.
 
1.6.5.  Oszlop  
A mintától függ ően a polimert egy egyszer ű, vagy több, sorba kötött 
oszlopot használva jellemeznek. Számos meghatározott tulajdonsá ­
gokkal (pl. pórusméret, szelektivitási határérték) rendelkez ő porózus 
oszlopanyag elérhet ő a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy az 
oszlophossz megválasztása a minta tulajdonságaitól (pl. hidrodina ­
mikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos 
körülményeit ől, pl. oldószer, h őmérséklet és áramlási sebesség is 
függ (1) (2) (3).  
1.6.6.  Elméleti tányérszám  
Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elmé ­
leti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében 
ez magában foglalja etil-benzol vagy más, megfelel ő nem poláris 
oldat töltését ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot a következ ő egyenlet adja meg: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
vagy N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
ahol:  
N = az elméleti tányérszám  
V e = az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = az alapvonal csúcsszélesség  
W 1/2 = a csúcsszélesség félmagasságnál.  
1.6.7.  Az elválasztás hatékonysága  
Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó 
mennyiség, az elválasztás hatékonyságának is van szerepe, amit a 
kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási hatékonyságát a következ ő kapcsolat adja meg:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
az oszlop keresztmet szetének t erülete ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
ahol:  
V e, Mx = az M  x molekulatömeg ű polisztirol elúciós térfogata  
V e,(10.Mx)  = a 10-szer nagyobb molekulatömeg ű polisztirol elúciós 
térfogata.  
A rendszer felbontása általában így definiált:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
Ahol  
V e1 , V e2 = két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaxi ­
mumnál  
W 1 , W  2 = az alapvonal csúcsszélességei  
M 1 , M  2 = a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es 
faktorral térjenek el).  
Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie 
mint 1,7 (4).  
1.6.8.  Oldószerek  
Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-b ől 
99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldószertartálynak (inertgáz- atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lenni az 
oszlop kalibrálásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert 
gáztalanítani kell, miel őtt a pumpával az oszlopra juttatják.
 
1.6.9.  Hőmérséklet-szabályozás  
A kritikus bels ő komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, 
csövezés) h őmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak 
megfelelő értéken kell tartani.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyi ­
ségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a detektorcella küvetta térfogatának a lehet ő legkisebbnek kell lenni. 
Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás ­
detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmutató-mérést szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer sajátos tulajdonságai megkövetelik, más detektortípusok is használ ­
hatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitásdetektor stb.
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉS  
2.1. ADATOK  
A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követel ­
ménynél éppúgy, mint az adatgy űjtéssel és -feldolgozással kapcso ­
latos követelményeknél.  
Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön 
kell azokat elemezni.  
M n -t, M  w -t, M  w /M n -t és M  p -t meg kell adni minden mérésnél. Fontos 
egyértelm űen jelezni, hogy a mért értékek a használt standard mole ­
kulatömegével ekvivalens relatív értékek.  
A retenciós térfogatok, vagy a retenciós id ők (lehetőleg belső stan­
dardot használva korrigáltak) meghatározása után a log M  p értékek 
(M p a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva egyikük 
függvényében. Molekulatömeg-dekádonként legalább két kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, aminek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs 
görbe kis molekulatömeg ű végpontját n-hexil-benzol, vagy más 
megfelelő nem poláris oldott anyag definiálja. A számátlag és a 
tömegátlag molekulatömeget általában elektronikus adatfeldolgozás ­
sal, az 1.2. pont képletei alapján határozzák meg. A kézi digitalizálás 
esetében az ASTM D 3536-91 használható (3).
 
Az eloszlási görbét táblázat vagy ábra (differenciális frekvencia, 
vagy összegszázalék a log M függvényében) formájában kell megadni. Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak álta ­
lában kb. 4 cm szélesnek kell lennie, a csúcsmaximumnak pedig kb. 
8 cm magasnak kell lennie. Integrál eloszlási görbék esetében az 
ordinátában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni.
 
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia:  
2.2.1.  Vizsgált anyag  
— elérhet ő információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalék ­
anyag, szennyez ő anyag),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása.  
2.2.2.  Műszerezettség  
— eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens össze ­
tétele, szennyez ők, 
— pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer,  
— elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemz őiről minden 
információ, mint pórusméret, az elválasztó anyag fajtája stb., a használt oszlopok száma, hossza és elrendezése),
 
— az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elvá ­
lasztás hatékonysága (a rendszer felbontása),  
— információ a csúcsok szimmetriájáról,  
— oszloph őmérséklet, h őmérséklet-szabályozás módja,  
— detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat),  
— áramlásmér ő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv),  
— adatrögzít ő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver).  
2.2.3.  A rendszer kalibrálása  
— a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes 
leírása,  
— információk a módszer min őségi követelményeir ől (pl. korrelá ­
ciós együttható, eltérés négyzetösszege stb.),  
— információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése 
és feldolgozása során alkalmazott extrapolációról, feltételezésr ől 
és közelítésr ől, 
— a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést 
dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs 
pont esetében az alábbiakat tartalmazza:  
— a minta neve,  
— a minta gyártója,  
— az M  p , M  n , M  w , és M  w /M n standardok jellemz ő értékei, 
ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsátotta, vagy az azt 
követő mérésekb ől következnek, a meghatározási módszer 
részleteivel együtt,  
— injektálási térfogat és koncentráció,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— a kalibrációhoz használt M  p érték,  
— a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat, vagy korrigált 
retenciós id ő, 
— a csúcsmaximumnál számított M  p , 
— a számított M  p és a kalibrációs érték százalékos hibája.  
2.2.4.  Kiértékelés:  
— időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság bizto ­
sítására használt módszerek (korrekciós módszer, bels ő standard 
stb.),  
— információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat vagy a 
retenciós id ő alapján történt,  
— információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek 
egy csúcsot teljesen,  
— a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek,  
— minta-el őállítási és -el őkezelési eljárások,  
— feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak,  
— injektálási térfogat ( μl) és injektálási koncentráció (mg/ml),  
— az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezet ő hatásokat jelz ő 
megfigyelések,  
— a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása,  
— a hibatartományok részletei,  
— az eredmények értelmezésére vonatkozó bármely egyéb infor ­
máció és megfigyelés.  
3. IRODALOMJEGYZÉK  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, 1. rész.  
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). 
Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley 
and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Mole ­
cular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by 
Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chroma ­
tography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Mole ­
cular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of 
Polistyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatog ­
raphy. American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Függelék  
Példák polimerek számátlag molekulatömege (M  n ) meghatározásának más 
módszereire  
M n meghatározására a gél permeációs kromatográfia (GPC) az el őnyben része ­
sített módszer, különösen, ha elérhet ő a polimeréhez hasonló szerkezet ű standard­
készlet. Azonban, ha gyakorlati nehézségekbe ütközik a GPC használata, vagy 
amennyiben számítani lehet arra, hogy nincs megfelel ő érték az M  n számára (és 
ami igazolást igényel), alternatív módszerek alkalmazhatók, úgymint:  
1. A kolligatív tulajdonságok felhasználása  
1.1. Ebullioszkópia/krioszkópia:  
az oldószer polimer hozzáadásával kiváltott forráspont-emelkedé ­
sének (ebullioszkópia), vagy fagypont-csökkenésének (krioszkópia) 
mérése. A módszer azon a tényen alapul, hogy az oldott polimer hatása a folyadék forrás/fagypontjára a polimer molekulatömegét ől 
függ (1) (2).
 
Alkalmazhatóság: M  n < 20 000.  
1.2. G őznyomás csökkentése:  
a kiválasztott referenciafolyadék g őznyomásának mérése ismert 
mennyiség ű polimer hozzáadása el őtt és után (1) (2).  
Alkalmazhatóság: M  n < 20 000 (elméletben; gyakorlatban azonban 
korlátozott érték ű). 
1.3. Membrán ozmometria:  
az ozmózis elvén alapul, azaz, hogy az oldószer-molekulák hajla ­
mosak híg oldatból a tömény oldatba átmenni egy félig átereszt ő 
membránon keresztül, hogy egyensúly jöjjön létre. A vizsgálatnál a híg oldat nulla koncentrációjú, a tömény oldat pedig a polimert tartalmazza. Az oldószer átvándorlása a membránon keresztül 
nyomáskülönbséget okoz, amely az oldat koncentrációjától és a 
polimer molekulatömegét ől függ (1) (3) (4).
 
Alkalmazhatóság: M  n 20 000–200 000 között.  
1.4. G őzfázis ozmometria:  
tiszta oldószer aeroszol párolgási sebességének összehasonlítása 
legalább három eltér ő koncentrációban polimert tartalmazó aero ­
szolhoz képest (1) (5) (6).  
Alkalmazhatóság: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Végcsoport analízis  
A módszer alkalmazásához a polimer általános szerkezetének és a 
láncot lezáró végcsoportok szerkezetének (aminek a f ő váztól pl. 
NMR-rel vagy titrálással/származékképzéssel megkülönböztethet őnek 
kell lenni) ismerete szükséges. A polimerben jelen lév ő végcsoportok 
molekulakoncentrációjának meghatározása a molekulatömeg érté ­
kéhez vezethet (7) (8) (9).  
Alkalmazhatóság: M  n 50 000-ig (csökken ő megbízhatósággal).  
3. Irodalomjegyzék  
(1) Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd. 
Edn., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Memb ­
rane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A. R. Copper ed., J. Wiley and Sons, 
pp. 25–52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.
 
(6) Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: 
Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 
3. In: Polymer Molecular Weighs, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
pp. 2139–2146.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  POLIMEREK KIS MOLEKULATÖMEG-TARTALMA  
1. MÓDSZER  
Ez a gél permeációs kromatográfiás módszer az OECD TG 119-nek 
megfelelője (1996). Az alapelvek és további technikai információk 
az 1. hivatkozásban találhatók.  
1.1. BEVEZETÉS  
Mivel a polimerek tulajdonságai olyan változatosak, lehetetlen 
egyetlen módszert leírni, pontosan felsorolva az elválasztás és kiérté ­
kelés feltételeit, amelyek lefednek minden, a polimerek elválasztá ­
sánál előforduló eshet őséget és különlegességet. Különösen a kompl ­
expolimer rendszereknél gyakran nem használható a gél permeációs 
kromatográfia (GPC). Amennyiben a GPC nem használható, a mole ­
kulatömeg más módszerekkel határozható meg (lásd a függeléket). Ilyen esetekben meg kell adni a használt módszer valamennyi rész ­
letét és igazolását.
 
A leírt módszer az 55672 DIN szabványon alapul (1). Ebben a DIN 
szabványban található részletes információ a kísérletek kivitelezé ­
séről és az adatkiértékelésr ől. Amennyiben a kísérleti körülmények 
módosítása szükséges, a változtatásokat igazolni kell. Más szabvány is használható, ha teljes kör ű hivatkozással rendelkezik. A leírt 
módszer ismert polidiszperzitású polisztirol kalibrációs mintákat 
használ, és esetleg módosítani kell, hogy megfelel ő legyen bizonyos 
polimereknél, pl. vízben oldható és hosszú láncú elágazó polimerek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A kis molekulatömeget önkényesen 1 000 dalton alattiként definiál ­
ták. 
Az M  n számátlag molekulatömeget és az M  w tömegátlag molekula ­
tömeget a következ ő egyenletekkel lehet meghatározni: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
ahol:  
H I = a detektorjel szintje az alapvonaltól V  i retenciós térfogatra  
M i = a polimerfrakció molekulatömege V  i retenciós térfogatnál, és 
n az adatpontok száma.  
A molekulatömeg eloszlásának szélességét, ami a rendszer diszper ­
zitásának mértéke, az M  w /M n arány adja meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Kalibrációt kell készíteni, mert a GPC relatív módszer. Keskeny 
eloszlású, lineárisan felépített, ismert M  n és M  w átlagos molekulatö ­
megű, és ismert molekulatömeg eloszlású polisztirol standardokat 
használnak e célra. Az ismeretlen minta molekulatömegének 
meghatározására a kalibrációs görbe csak akkor használható, ameny ­
nyiben a minta és a standardok elválasztásának körülményei azonos módon lettek kiválasztva.
 
A molekulatömeg és az elúciós térfogat között meghatározott 
kapcsolat csak az adott kísérlet sajátos körülményei között érvényes. 
A körülmények magukban foglalják mindenek felett a h őmérsékletet, 
az oldószert (vagy oldószerkeveréket), a kromatográfiás feltételeket és az elválasztó oszlopot vagy oszlopokat.
 
A minta így meghatározott molekulatömegei relatív értékek és 
„polisztirol ekvivalens molekulatömeg”-ként írták le őket. Ez azt 
jelenti, hogy a minta és a standard szerkezeti és kémiai különbsége ­
itől függően a molekulatömegek kisebb-nagyobb mértékben eltér ­
hetnek az abszolút értékt ől. Amennyiben más standardokat használ ­
tak, pl. polietilén-glikol, polietilén-oxid, polimetil-metakrilát, poliak ­
rilsav, azt meg kell indokolni.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A minta molekulatömeg-eloszlása és az átlagos molekulatömegek 
(M n , M  w ) GPC-vel meghatározhatók. A GPC a folyékony kromatog ­
ráfia speciális típusa, aminél a minta az egyes alkotók hidrodina ­
mikai térfogata szerint választódik el (2).  
Az elválasztás a minta porózus anyaggal, tipikusan szerves géllel 
töltött oszlopon való áthaladásakor valósul meg. Kis molekulák 
be tudnak hatolni a pórusokba, a nagy molekulák nem. A nagy molekulák útja ezért rövidebb, és els őként eluálódnak. A közepes 
méretű molekulák a pórusok egy részébe behatolnak, és kés őbb 
eluálódnak. A legkisebb, a gél pórusainál kisebb átlagos hidro ­
dinamikai sugarú molekulák minden pórusba be tudnak hatolni. Ezek eluálódnak utoljára.
 
Ideális helyzetben az elválasztást teljesen a molekulafajták mérete 
szabja meg, de a gyakorlatban nehéz elkerülni valamely abszorpciós 
hatás közrehatását. A nem egyenletes oszlopfeltöltés és a holt 
térfogat ronthatja a helyzetet (2).  
A detektálás megvalósul pl. a törésmutatóval vagy az UV-elnyelés ­
sel, és egyszer ű eloszlási görbét eredményez. Azonban ahhoz, hogy a 
tényleges molekulatömeg-értékeket a görbéhez lehessen rendelni, az 
oszlopot kalibrálni kell ismert molekulatömeg ű és ideális esetben 
nagyjából hasonló szerkezet ű polimerek, pl. különböz ő polisztirol 
standardok futtatásával. Tipikusan Gauss-görbe kapható, néha a kis molekulatömeg oldalán kis farokkal eltorzítva, a függ őleges tengely 
a különböz ő eluált molekulafajták tömeg szerinti mennyiségét 
mutatja, a vízszintes tengely a molekulatömeg logaritmusát.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
A kis molekulatömeg-tartalmat ebb ől a görbéb ől származtatjuk. A 
számítás csak akkor lehet pontos, amennyiben az alacsony moleku ­
latömegű fajták a polimerre, mint egészre ekvivalensen, tömeg 
szerinti alapon hatnak vissza.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Az elúciós térfogat reprodukálhatósága (relatív standard deviáció, 
RSD) 0,3 %-nál jobb kell, hogy legyen. Az analízis megkövetelt reprodukálhatóságát bels ő standarddal való korrekcióval kell biztosí ­
tani, amennyiben a kromatogramot az id ő függvényében értékelik ki, 
és nem felel meg a fent említett követelménynek (1). A polidiszper ­
zitás függ a standardok molekulatömegét ől. Polisztirol standardoknál 
a tipikus értékek: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p a standard molekulatömege a csúcsmaximumnál)  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  A standard polisztirol oldatok készítése  
A polisztirol standardokat óvatosan keverve oldják fel a választott 
eluensben. A gyártó ajánlásait számításba kell venni az oldatok készítésénél.
 
A választott standardok koncentrációja különböz ő faktoroktól függ, 
pl. injektált térfogat, az oldat viszkozitása, és az elemz ő detektor 
érzékenysége. A túltöltés elkerülése érdekében a maximális injektált 
térfogatot az oszlop hosszához kell igazítani. 30 cm × 7,8 mm-es 
oszlopú GPC-vel történ ő analitikai elválasztásoknál a jellemz ő injek­
tált térfogat rendesen 40 és 100 μl között van. Nagyobb térfogat is 
elképzelhet ő, de nem lépheti túl a 250 μl-t. Az oszlop aktuális kalib ­
rációja előtt meg kell határozni az injektált térfogat és a koncentráció 
optimális arányát.  
1.6.2.  A mintaoldat készítése  
Elvben a mintaoldatok elkészítésére is ugyanezek a követelmények 
érvényesek. A mintát megfelel ő oldószerben, pl. tetrahidro-furán 
(THF), óvatos rázással oldják fel. Semmilyen körülmények között sem szabad ultrahangos fürd őben feloldani. Amennyiben szükséges, 
az oldat tisztítható 0,2–2 μm-es pórusméret ű membránsz űrővel.
 
A feloldatlan részecskék jelenlétét, amik nagy molekulatömeg ű fajták 
miatt fordulhatnak el ő, fel kell jegyezni a végleges jegyz őkönyvben. 
A feloldott részecskék tömegszázalékának meghatározására 
megfelelő módszert kell alkalmazni. Az oldatot 24 órán belül fel 
kell használni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  A szennyez őanyag- és adalékanyag-tartalom korrekciója  
Rendszerint szükséges az M < 1 000 fajta tartalmának korrekciója a 
nem polimer fajtájú jelen lév ő komponensek (pl. szennyez ő anyagok, 
és/vagy adalékanyagok) járulékára, kivéve ha a mért tartalom már < 
1 %. Ezt a polimer oldat, vagy a GPC eluátum közvetlen analízisével 
érik el.  
Amennyiben az oszlopon való áthaladás után az eluátum túl híg a 
további analízishez, töményíteni kell. Szükséges lehet az eluátum beszáradásig való párologtatása és újraoldása. Az eluátum töményí ­
tésének olyan körülmények között kell történnie, amelyek biztosítják, 
hogy az eluátumban nem történik változás. A GPC lépés utáni 
eluátumkezelés függ a mennyiségi meghatározás használt analitikus módszerét ől.
 
1.6.4.  Készülék  
A GPC készülék a következ ő komponensekb ől áll:  
— oldószertartály,  
— gáztalanító (szükség szerint),  
— pumpa,  
— rezgéscsillapító (szükség szerint),  
— injektáló rendszer,  
— kromatográfiás oszlopok,  
— detektor,  
— áramlásmér ő (szükség szerint),  
— adatrögzít ő, -feldolgozó,  
— hulladéktároló.  
Biztosítani kell, hogy a GPC rendszer inert legyen a használt oldó ­
szerekkel szemben (pl. THF oldószernél acélkapillárisok használata).  
1.6.5.  Injektáló és oldószerszállító rendszer  
A minta oldatának meghatározott térfogatát automataadagolóval vagy 
kézzel töltik az oszlopra egy pontosan meghatározott zónába. 
Amennyiben kézzel végzik, a fecskend ő dugattyújának túl gyors 
benyomása vagy kihúzása a megfigyelt molekulatömeg-eloszlásban változásokat okozhat. Az oldószert szállító rendszernek, amennyire csak lehet, lüktetésmentesnek kell lenni, ideálisan rezgéscsillapítót 
magában foglalva. Az áramlási sebesség 1 ml/perc nagyságrend ű.
 
1.6.6.  Oszlop  
A mintától függ ően a polimert egy egyszer ű, vagy több, sorba kötött 
oszlopot használva jellemeznek. Számos meghatározott tulajdonsá ­
gokkal (pl. pórusméret, kizárási határérték) rendelkez ő porózus 
oszlopanyag elérhet ő a kereskedelemben. Az elválasztó gél vagy 
az oszlophossz megválasztása a minta tulajdonságaitól (pl. hidrodi ­
namikai térfogatok, molekulatömeg-eloszlás) és az elválasztás sajátos 
körülményeit ől, pl. oldószer, h őmérséklet és áramlási sebesség is 
függ (1) (2) (3).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Elméleti tányérszám  
Az elválasztásra használt oszlopot vagy oszlopkombinációt az elmé ­
leti tányérszámmal kell jellemezni. A THF eluáló oldószer esetében ez magában foglalja etil-benzol, vagy más megfelel ő nem poláris 
oldat töltését ismert hosszúságú oszlopra. Az elméleti tányérszámot 
a következ ő egyenlet adja meg: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
vagy N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
Ahol:  
N = az elméleti tányérszám  
V e = az elúciós térfogat a csúcsmaximumnál  
W = az alapvonal csúcsszélessége  
W 1/2 = a csúcsszélesség félmagasságnál  
1.6.8.  Az elválasztás hatékonysága  
Az elméleti tányérszámon kívül, ami a sávszélességet meghatározó 
mennyiség, az elválasztás hatékonyságának is van szerepe, amit a 
kalibrációs görbe meredeksége határoz meg. Egy oszlop elválasztási 
hatékonyságát a következ ő kapcsolat adja meg:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
as oszlop keresztmetszetének területe ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
ahol:  
Ve, Mx = az M  x molekulatömeg ű polisztirol elúciós térfogata  
V e,(10.Mx)  = a 10-szer nagyobb molekulatömeg ű polisztirol elúciós 
térfogata  
A rendszer felbontása általában így definiált:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
ahol:  
Ve1, V  e2 = két polisztirol standard elúciós térfogata a csúcsmaxi ­
mumnál  
W 1 , W  2 = az alapvonal csúcsszélességei  
M 1 , M  2 = a molekulatömegek a csúcsmaximumnál (10-es 
faktorral térjenek el).  
Az oszloprendszerre az R-értéknek nagyobbnak kell lennie mint 
1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Oldószerek  
Minden oldószernek nagy tisztaságúnak kell lennie (THF-b ől 
99,5 %-os tisztaságút használnak). Az oldószertartálynak (inertgáz- atmoszférában, amennyiben szükséges) elég nagynak kell lennie az 
oszlop kalibrálásához és néhány mintaanalízishez. Az oldószert 
gáztalanítani kell, miel őtt a pumpával az oszlopra juttatják.
 
1.6.10.  Hőmérséklet-szabályozás  
A kritikus bels ő komponensek (injektáló hurok, oszlopok, detektor, 
csövezés) h őmérsékletét állandó és az oldószerválasztásnak 
megfelelő értéken kell tartani.  
1.6.11.  Detektor  
A detektor célja az oszlopról eluált minta koncentrációjának mennyi ­
ségi rögzítése. A csúcsok szükségtelen szélesedésének elkerülésére a 
detektorcella küvettatérfogatának a lehet ő legkisebbnek kell lenni. 
Nem lehet nagyobb 10 μl-nél, kivéve a fényszórási és viszkozitás ­
detektoroknál. A detektálásra differenciális törésmutató mérést 
szokás használni. Azonban, ha a minta vagy az elúciós oldószer 
sajátos tulajdonságai megkövetelik, más detektortípusok is használ ­
hatók, pl. UV/látható fény, IR, viszkozitásdetektor stb.  
2. ADATOK ÉS JELENTÉS  
2.1. ADATOK  
A DIN szabványra (1) kell hivatkozni a részletes értékelési követel ­
ménynél éppúgy, mint az adatgy űjtéssel és -feldolgozással kapcso ­
latos követelményeknél.  
Minden mintánál két független kísérletet kell végezni. Külön-külön 
kell azokat elemezni. Minden esetben elengedhetetlen a mintával azonos körülmények között kezelt vakpróbákból származó adatokat 
is meghatározni.
 
Fontos egyértelm űen jelezni, hogy a mért értékek a használt standard 
molekulatömegével ekvivalens relatív értékek.  
A retenciós térfogatok vagy a retenciós id ők (lehetőleg belső stan­
dardot használva korrigáltak) meghatározása után a log M  p értékek 
(M p a kalibráló standard csúcsmaximuma) lesznek ábrázolva 
egyikük függvényében. Molekulatömeg-dekádonként legalább két 
kalibrációs pont szükséges, és legalább öt mérési pont kell a teljes görbéhez, aminek le kell fedni a minta becsült molekulatömegét. A kalibrációs görbe kis molekulatömeg ű végpontját n-hexil-benzol, 
vagy más megfelel ő nem poláris oldott anyag definiálja. A 
görbének az 1 000-nél kisebb molekulatömegeknek megfelel ő 
részét a szennyez ő és adalékanyagoknak megfelel ően határozták 
meg és korrigálták. Az elúciós görbéket általában elektronikus 
adatfeldolgozás útján értékelik ki. A kézi digitalizálás esetében 
az ASTM D 3536-91 használható (3).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Amennyiben az oszlopon visszamaradt bármilyen nem oldható poli ­
mer, molekulatömege valószín űleg nagyobb az oldható frakcióénál, 
és amennyiben ezt figyelmen kívül hagyják, az az alacsony moleku ­
latömeg-tartalom túlbecsülését eredményezi. A kis molekulatömeg- tartalmú nem oldható polimer korrekciójára vonatkozó útmutatás a 
függelékben található.
 
Az eloszlási görbét táblázat vagy ábra (differenciális frekvencia vagy 
összegszázalék a log M függvényében) formájában kell megadni. 
Grafikus ábrázolásnál egy molekulatömeg-dekádnak általában kb. 4 cm szélesnek kell lennie, a csúcsmaximumnak pedig kb. 8 cm magasnak kell lenni. Integrális eloszlási görbék esetében az ordiná ­
tában a különbségnek 0 és 100 % között kb. 10 cm-esnek kell lenni.
 
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia:  
2.2.1.  Vizsgált anyag  
— elérhet ő információk a vizsgált anyagról (azonosság, adalékanya ­
gok, szennyez ő anyagok),  
— a mintakezelés, megfigyelések, problémák leírása.  
2.2.2.  Műszerezettség  
— eluens tartály, inert gáz, az eluens gáztalanítása, az eluens össze ­
tétele, szennyez ők, 
— pumpa, rezgéscsillapító, injektáló rendszer,  
— elválasztó oszlopok (a gyártó, az oszlop jellemz őiről minden 
információ, mint pórusméret, az elválasztó anyag fajtája stb., a 
használt oszlopok száma, hossza és elrendezése),  
— az oszlop (vagy oszlopkombináció) elméleti tányérszáma, elvá ­
lasztás hatékonysága (a rendszer felbontása),  
— információ a csúcsok szimmetriájáról,  
— oszloph őmérséklet, h őmérséklet-szabályozás módja,  
— detektor (mérési elv, típus, küvettatérfogat),  
— áramlásmér ő, amennyiben használva lett (gyártó, mérési elv),  
— adatrögzít ő és -feldolgozó rendszer (hardver és szoftver).  
2.2.3.  A rendszer kalibrálása  
— a kalibrációs görbék megalkotásához használt módszer részletes 
leírása,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— információk a módszer min őségi követelményeir ől (pl. korrelá ­
ciós együttható, eltérés négyzetösszege stb.),  
— információk minden, a kísérleti eljárás és az adatok kiértékelése 
és feldolgozása során alkalmazott extrapolációról, feltételezésr ől 
és közelítésr ől, 
— a kalibrációs görbék megalkotásához használt minden mérést 
dokumentálni kell egy táblázatban, amely minden kalibrációs pont esetében az alábbiakat tartalmazza:
 
— a minta neve,  
— a minta gyártója,  
— az M  p , M  n , M  w , és M  w /M n standardok jellemz ő értékei, 
ahogy azokat a gyártó rendelkezésre bocsátotta, vagy az azt 
követő mérésekb ől következnek, a meghatározási módszer 
részleteivel együtt,  
— injektálási térfogat és koncentráció,  
— a kalibrációhoz használt M  p érték,  
— a csúcsmaximumoknál mért elúciós térfogat vagy korrigált 
retenciós id ő, 
— a csúcsmaximumnál számított M  p , 
— a számított M  p és a kalibrációs érték százalékos hibája.  
2.2.4.  Információ a kis molekulatömeg ű polimertartalomról  
— az analízishez használt módszerek és a kísérletek kivitelezési 
módjának leírása,  
— információ a teljes mintára vonatkozó kis molekulatömeg ű frak­
ciók százalékos (w/w) tartalmáról,  
— információ a teljes mintára vonatkozó szennyez ő, adalékanyagok ­
ról, és más nem polimer frakcióról, tömegszázalékban kifejezve.  
2.2.5.  Kiértékelés:  
— időn alapuló kiértékelés: a megkövetelt reprodukálhatóság 
biztosítására használt módszerek (korrekciós módszer, bels ő 
standard stb.),  
— információ arról, hogy a kiértékelés az elúciós térfogat vagy a 
retenciós id ő alapján történt,  
— információ a kiértékelés korlátairól, amennyiben nem elemeztek 
egy csúcsot teljesen,  
— a kiegyenlítési módszerek leírása, amennyiben használva lettek,  
— minta-el őállítási és minta-el őkezelési eljárások,  
— feloldatlan részecskék jelenléte, amennyiben voltak,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— injektálási térfogat ( μl) és injektálási koncentráció (mg/ml),  
— az ideális GPC profiltól való eltéréshez vezet ő hatásokat jelz ő 
megfigyelések,  
— a vizsgálati eljárások minden módosításának részletes leírása,  
— a hibatartományok részletei,  
— az eredmények értelmezésre vonatkozó bármely egyéb infor ­
máció és megfigyelés.  
3. IRODALOMJEGYZÉK  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, 1. rész.  
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Függelék  
Útmutató a kis molekulatömeg-tartalom korrekciójához a nem oldható 
polimerfrakciók vonatkozásában  
Amennyiben nem oldható polimer van jelen a mintában, tömegveszteséget okoz a 
GPC analízis során. A nem oldható polimer irreverzibilisen visszamarad az 
oszlopon vagy a mintasz űrőn, míg a minta oldható része áthalad az oszlopon. 
Amennyiben a polimer törésmutató növekedése (dn/dc) megbecsülhet ő vagy 
mérhető, meg lehet becsülni a minta tömegvesztését az oszlopon. Ekkor az ismert 
koncentrációjú standard anyagokkal való küls ő kalibrálás és a dn/dc használatával 
korrekciót alkalmaznak a refraktométer válaszának kalibrálására. Az alábbi 
példában poli(metil-metakrilát) (pMMA) standardot használtak.  
Az akril polimerek analízisénél a küls ő kalibráció során ismert koncentrációjú 
tetrahidro-furánban oldott pMMA standardot analizálnak GPC-vel, és a kapott adatok használhatók a refraktométer-állandó megállapításához, a következ ő 
egyenlet szerint:
 
K = R/(C x V x dn/dc)  
ahol 
K = a refraktométer-állandó (mikrovoltszekundum/ml-ben),  
R = a pMMA standard válasza (mikrovoltszekundumban),  
C = a pMMA standard koncentrációja (mg/ml-ben),  
V = az injektált térfogat (ml-ben) és  
dn/dc = a törésmutató növekedése pMMA-ra tetrahidro-furánban (ml/mg- 
ban).  
A következ ő adatok tipikusak a pMMA standardra:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 x 10  -5 ml/mg  
Az eredményül kapott K értéket (3,05 × 10  11 ezután az elméleti detektorválasz 
kiszámítására lehet használni, amennyiben az injektált polimer 100 %-a eluáló ­
dott a detektoron.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  POLIMEREK OLDÓDÁS/EXTRAKCIÓ VISELKEDÉSE 
VÍZBEN  
1. MÓDSZER  
A leírt módszer megfelel az OECD TG 120-nak (1997). Az 
alapelvek és további technikai információk az (1) hivatkozásban 
találhatók.  
1.1. BEVEZETÉS  
Bizonyos polimereknél, pl. emulziós polimereknél, kezdeti el őkészítő 
munkára lehet szükség, miel őtt az alább leírt módszert használni 
lehetne. A módszer nem alkalmazható folyékony polimerek és a 
vizsgálati körülmények között vízzel reagáló polimerek esetében.  
Amennyiben a módszer nem praktikus vagy nem lehetséges, az 
oldódási/extrakciós viselkedés más módszerekkel is vizsgálható. 
Ilyen esetben meg kell adni a használt módszer minden részletét és 
igazolását.  
1.2 REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.3 A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A polimerek vizes közegben való oldódási/extrakciós viselkedése 
lombik módszerrel (ld. A.6 oldhatóság vízben, lombik módszer) határozható meg, az alább leírt módosításokkal.
 
1.4 MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.5 A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  Berendezés  
A következ ő berendezés szükséges a módszerhez:  
— aprítóeszköz, pl. őrlőmalom ismert méret ű részecskék el őállítá­
sára, 
— rázókészülék, h őmérséklet-szabályozási lehet őséggel,  
— membránsz űrő-rendszer,  
— megfelel ő analitikai berendezés,  
— standardizált sz űrők. 
1.5.2  Mintakészítés  
Egy reprezentatív mintát el őször 0,125 és 0,25 mm közötti részecske 
méretűre kell csökkenteni megfelel ő szűrőket használva. A minta 
stabilitásához vagy az őrlési folyamatnál szükség lehet h űtésre. 
Gumiszer ű anyagok folyékonynitrogén-h őmérsékleten apríthatók (1).  
Amennyiben a megkövetelt részecskeméret-frakció nem érhet ő el, a 
részecskeméretet annyira le kell csökkenteni, amennyire csak lehet ­
séges, és jegyz őkönyvezni kell az eredményt. A jegyz őkönyvben fel 
kell tüntetni az aprított minta vizsgálat el őtti tárolási módját.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Eljárás  
A vizsgált anyagból három 10 g-os mintát kell bemérni egyenként, 
három üvegdugós edénybe, és 1 000 ml vizet kell adni mindegyik ­
hez. Amennyiben 10 g polimer kezelése kivihetetlen, a következ ő 
legnagyobb kezelhet ő mennyiséget kell használni, és a víz mennyi ­
ségét ehhez kell igazítani.  
Az edényeket szorosan le kell zárni és 20  o C-on felrázni. Állandó 
hőmérsékleten m űködni képes rázó- vagy kever őeszközt kell hasz ­
nálni. 24 órás id őtartam elteltével az edények tartalmát centrifugálni 
vagy szűrni kell, és a polimer koncentrációját a tiszta vizes fázisban 
megfelelő analitikai módszerrel meg kell határozni. Amennyiben a 
vizes fázishoz nincs megfelel ő analitikai módszer, a teljes 
oldhatóság/extrahálhatóság megbecsülhet ő a szűrési maradék vagy 
centrifugálási csapadék száraz tömegéb ől. 
Rendszerint szükség van egyrészt a szennyez ő anyagok és az adalék ­
anyagok, másrészt a kis molekulatömeg ű fajták közti mennyiségi 
megkülönböztetésre. Gravimetriás meghatározásnál vizsgált anyag használata nélküli vakpróba elvégzése is szükséges, hogy a kísérleti 
eljárásból származó maradékokkal is el lehessen számolni.
 
A polimerek oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása 
vízben 37  o C-on 2-es és 9-es pH-nál, a 20  o C-on történ ő 
kísérlet leírása szerint végezhet ő. A pH-értékek alkalmas pufferek 
vagy megfelel ő savak és bázisok, mint sósav, ecetsav, analitikai 
tisztaságú nátrium-, vagy kálium-hidroxid, vagy NH  3 hozzáadá­
sával állíthatók be.  
A használt analitikai módszert ől függően egy vagy két vizsgálatot 
kell elvégezni. Amennyiben a vizes fázis polimertartalmának közvetlen analízisére megfelel ő sajátos módszerek állnak rendelke ­
zésre, egy, a fent leírtak szerinti vizsgálatnak kielégít őnek kell lenni. 
Amennyiben ilyen módszerek nem állnak rendelkezésre és a polimer 
oldódási/extrakciós viselkedésének meghatározása csak a vizes extraktum teljes szervesszéntartalmának (TOC) meghatározásával végzett közvetett analízisre korlátozott, még egy további vizsgálatot 
kell elvégezni. Ezt a további vizsgálatot is háromszor kell elvégezni, 
10-szer kisebb polimermintákkal és az els ő vizsgálatban használttal 
azonos vízmennyiséggel.
 
1.5.4.  Analízis  
1.5.4.1.  Egy mintamérettel végzett vizsgálat  
A vizes fázisú polimer komponenseinek közvetlen analízisére 
módszerek állhatnak rendelkezésre. Alternatív lehet őségként megfon ­
tolható az oldott/extrahált polimerkomponensek közvetett analízise a teljes oldhatórész-tartalom meghatározásával és a nem polimerspeci ­
fikus komponensekre vonatkozó korrekcióval.
 
A vizes fázis analízise az összes polimerfajta esetében lehetséges:  
vagy elegend ően érzékeny módszerrel, pl.  
— TOC, CO  2 -ot fejleszt ő perszulfát vagy dikromát feltárással, amit 
IR-rel vagy kémiai analízissel történ ő becslés követ,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomabszorpciós spektrometria (AAS), vagy induktív csatolású 
plazmaemissziós (ICP) ekvivalense szilícium- vagy fémtartalmú 
polimereknél,  
— UV abszorpció vagy spektrofluorimetria aril polimereknél,  
— LC-MS alacsony molekulatömeg ű mintáknál,  
vagy a vizes extraktum száradásig történ ő vákuumpárologtatásával és a 
maradék spektroszkópiás (IR, UV, stb.) vagy AAS/ICP analízisével.  
Amennyiben a vizes fázis ily módon történ ő analízise nem kivitelez ­
hető, a vizes kivonatot vízzel nem vegyíthet ő szerves oldószerrel, pl. 
klórozott szénhidrogénnel kell extrahálni. Az oldószert ezután el kell 
párologtatni, és a maradékot a fentiek szerint, a megadott polimer ­
tartalomnak megfelel ően kell analizálni. Bármilyen szennyez őként 
vagy adalékként azonosított komponenst ebben a maradékban le 
kell vonni a polimerre magára jellemz ő oldódási/extrakciós fok 
meghatározásának céljából.  
Amennyiben ezen anyagok viszonylag nagy mennyiségben vannak 
jelen, szükséges lehet a maradékot például HPLC- vagy GC-analí ­
zisnek alávetni annak érdekében, hogy megkülönbözethet ők 
legyenek a szennyez ők a jelen lév ő monomer és monomerszárma ­
zék-fajtáktól, és így az utóbbiak valódi tartalma meghatározható 
legyen.  
Néhány esetben elegend ő lehet a szerves oldószer egyszer ű szára­
dásig történ ő elpárologtatása és a száraz maradék lemérése.  
1.5.4.2.  Két különböz ő mintamérettel végzett vizsgálat  
Minden vizes extraktum TOC-ra nézve analizált.  
A minta nem oldódott/nem extrahált részén gravimetriás meghatá ­
rozást végeznek. Amennyiben az egyes edények tartalmának centri ­
fugálása vagy sz űrése után polimermaradékok maradnak az edény 
falához tapadva, az edényt a sz űrlettel kell öblíteni, amíg az edény 
megtisztul minden látható maradéktól. Ezt követ ően a szűrletet újra ­
centrifugálják, vagy sz űrik. A sz űrőn vagy a centrifugacs őben 
maradó maradékokat 40  o C-on vákuumban szárítják, és lemérik. A 
szárítást állandó tömeg eléréséig kell folytatni.  
2. ADATOK  
2.1. EGY MINTAMÉRETTEL VÉGZETT VIZSGÁLAT  
Mind a három lombik eredményeit és az átlagértékeket is meg kell 
adni, és tömeg per az oldat térfogatban (tipikusan mg/l), vagy tömeg 
per polimerminta-tömegben (tipikusan mg/g) kell kifejezni. Továbbá 
a minta tömegvesztését (számítása: az oldott anyag tömege osztva a kiindulási minta tömegével) is meg kell adni. Ki kell számolni a relatív standard deviációkat (RSD). Egyedi számokat kell megadni 
a teljes anyagra (polimer + alapvet ő adalékok stb.) és csak a poli ­
merre (azaz az ilyen adalékok levonása után).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. KÉT KÜLÖNBÖZ Ő MINTAMÉRETTEL VÉGZETT VIZSGÁLAT  
Meg kell adni a két három párhuzamossal végzett kísérlet vizes 
extraktumainak egyedi TOC-értékeit és valamennyi kísérlet átlagérté ­
két, tömeg per az oldat térfogata (tipikusan mgC/l) és tömeg per 
kiindulási mintatömeg (tipikusan mgC/g) egységekben is kifejezve.  
Amennyiben nincs különbség a nagy és kis minta/víz arány eredmé ­
nyeiben, ez azt jelezheti, hogy valamennyi extrahálható komponens tényleg extrahálva lett. Ebben az esetben a közvetlen analízis álta ­
lában nem szükséges.
 
A maradékok egyedi tömegeit meg kell adni, és a minták kiindulási 
tömegének százalékában kell kifejezni. Átlagokat kísérletenként kell számolni. A 100 és a talált százalék különbsége az eredeti mintában lévő oldható és extrahálható anyag százalékát képviseli.
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésben az alábbi információkat kell tartalmazni:  
3.1.1.  Vizsgált anyag  
— a vizsgált anyagról rendelkezésre álló információk (azonosság, 
adalékok, szennyez ők, alacsony molekulatömeg ű fajok tartalma).  
3.1.2.  Kísérleti körülmények  
— a használt eljárások és kísérleti körülmények leírása,  
— az analitikai és detektálási módszerek leírása.  
3.1.3.  Eredmények  
— oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/l-ben; a különböz ő 
oldatokbeli extrakciós tesztek egyedi és átlagértékei, polimertar ­
talom és szennyez ő anyagok, adalékanyagok stb. szerint bontva,  
— oldhatósági/extrahálhatósági eredmények mg/polimer g-ban,  
— a vizes extraktumok TOC-értékei, az oldott anyag tömege és a 
számolt százalékok, amennyiben mérik,  
— az egyes minták pH-ja,  
— információ a vakpróbaértékekr ől, 
— irodalmi hivatkozások a vizsgált anyag kémiai instabilitásról a 
vizsgálati és az analitikai eljárás alatt, amennyiben szükséges,  
— valamennyi, az eredmények értelmezéséhez fontos információ.  
4. IRODALOMJEGYZÉK  
DIN 5377 (1976) Zerkleinerung von Kunstofferzeugnissen für Prüfz ­
wecke.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  OXIDÁLÓ TULAJDONSÁGOK (FOLYADÉKOK)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Ezzel a vizsgálati módszerrel egy folyékony anyag azon képességét 
mérhetjük, hogy milyen mértékben képes egy éghet ő anyag égésének 
sebességét vagy intenzitását növelni, vagy olyan keveréket képezni egy éghet ő anyaggal, amely spontán öngyulladásra képes, ha a két 
anyagot alaposan összekeverik. A módszer az oxidáló folyadékok 
vizsgálatára szolgáló ENSZ-módszeren (1) alapul, illetve egyenérték ű 
azzal. Mivel azonban az A21. módszer els ősorban arra szolgál, hogy 
kielégítse az 1907/2006 rendelet követelményeit, csak egyetlen refe ­
renciaanyaggal kell az összehasonlítást elvégezni. Más referencia ­
anyagok vizsgálatára és összehasonlítására akkor lehet szükség, ha a vizsgálatok eredményeit várhatóan más célokra használják fel (
 1 ). 
Nem kell elvégezni ezt a vizsgálatot, ha a szerkezeti képlet alapján 
kétségkívül megállapítható, hogy az anyag nem képes exoterm reak ­
cióba lépni egy éghet ő anyaggal.  
Hasznos, ha a vizsgálat elvégzése el őtt rendelkezünk el őzetes 
információkkal az anyag potenciális robbanásveszélyességi tulaj ­
donságairól.  
Nem alkalmazható a vizsgálat szilárd anyagokra, gázokra, robbanás ­
veszélyes vagy er ősen tűzveszélyes anyagokra vagy szerves peroxi ­
dokra.  
Előfordulhat, hogy nem kell elvégezni ezt a vizsgálatot, ha az 
oxidáló folyadékok vizsgálatára szolgáló ENSZ-módszerrel (1) már megvizsgálták az anyagot, és rendelkezésre állnak ennek eredményei.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS EGYSÉGEK  
„Átlagos nyomásemelkedési id ő”: az a mért átlagos id ő, amely alatt 
a vizsgált keverék nyomása a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 
2 070 kPa-ra emelkedik.  
1.3. REFERENCIAANYAG  
Referenciaanyagként 65 tömegszázalékos vizes salétromsav (anali ­
tikai minőségű) szükséges (  2 ). ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Ahogyan például az ENSZ szállítási rendeleteinek keretében. 
( 2 ) A savat a vizsgálat el őtt titrálni kell annak érdekében, hogy ellen őrizzük a koncentráci ­
óját.
 Adott esetben, ha a vizsgáló el őre tudja, hogy a vizsgálat eredmé ­
nyeit végül más célokra használhatják (  1 ), célszer ű lehet további 
referenciaanyagokat is megvizsgálni (  2 ). 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó folyadékot 1:1 tömegarányban összekeverjük rostos 
cellulózzal és nyomástartó edénybe tesszük. Ha a keverés vagy betöltés során spontán öngyulladás lép fel, nincs szükség további 
vizsgálatra.
 
Ha nem lép fel spontán öngyulladás, az egész vizsgálatot el kell 
végezni. A keveréket a nyomástartó edényben hevíteni kell, majd meg kell mérni, hogy átlagosan mennyi id ő szükséges ahhoz, 
hogy a nyomás a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2 070 
kPa-ra emelkedjen. Ezt kell azután összehasonlítani a referencia ­
anyag(ok) és cellulóz 1:1 arányú keverékével kapott átlagos nyomásemelkedési id ővel.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Egyetlen anyagon elvégzett öt kísérletben egyik eredmény sem térhet 
el 30 %-nál nagyobb mértékben a számtani átlagtól. Az átlaghoz 
képest 30 %-nál nagyobb eltérést mutató eredményeket el kell vetni, 
tökéletesíteni kell a keverési és betöltési eljárást, majd meg kell ismételni a vizsgálatot.
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészítés  
1.6.1.1.  Az éghet ő anyag  
Éghető anyagként 50–250 μm szálhosszúságú és 25 μm átlagos 
szálátmér őjű ( 3 ) száraz, rostos cellulózt kell használni. Maximum 
25 mm vastag rétegben, 105  o C-on, 4 órán át, tömegállandóságig 
kell szárítani, majd leh űlésig, illetve felhasználásig nedvszívó anyag 
jelenlétében a szárítóberendezésben kell tartani. A száraz cellulóz 
víztartalmának a száraz tömeg (  4 ) 0,5 %-a alatt kell lennie. Ennek 
eléréséhez szükség esetén hosszabb szárítási id őt kell alkalmazni (  5 ). 
A vizsgálat során ugyanazt a tétel cellulózt kell használni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Ahogyan például az ENSZ szállítási rendeleteinek keretében. 
( 2 ) Például 50 w/w %-os perklórsav és 40 w/w %-os nátrium-klorát kerül használatra az (1) 
hivatkozásban. 
( 3 ) Páldául Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalógusszám: 
4021 050. 
( 4 ) Például Karl–Fisher titrálással ellen őrizve. 
( 5 ) Ez a víztartalom szintén elérhet ő például 24 órás 105  o C-on vákuum alatt történ ő mele­
gítéssel.
 1.6.1.2.  A berendezés  
1.6.1.2.1. A n y o m á s t a r t ó e d é n y  
Szükség van egy nyomástartó edényre. Az edény henger alakú, acél 
nyomástartó edény, amelynek hossza 89 mm, küls ő átmérője pedig 
60 mm (lásd az 1. ábrát). A két ellentétes oldalon sík felület van kialakítva (itt az edény keresztmetszeti mérete 50 mm-re csökken), 
amely megkönnyíti a kezelést, amikor becsavarják a gyújtódugót és a 
szellőződugót. Az edényen átmen ő 20 mm átmér őjű furatot az egyik 
végén 19 mm mélységben kib ővítik, és abba 1''-os cs őmenetet (Bri ­
tish Standard Pipe = BSP) vagy azzal egyenérték ű metrikus menetet 
vágnak. A nyomáselvezet ő, amely egy oldalág, a nyomástartó edény 
ívelt falába van becsavarozva, 35 mm-re az edény egyik végét ől, és 
90
 o -os szögben a megmunkált sík felülethez képest. Az erre a célra 
szolgáló menetes furat 12 mm mély, és 1/2''-os cs őmenettel (vagy 
ezzel egyenérték ű metrikus menettel) van ellátva az oldalág végén 
levő menetnek megfelel ően. Ha szükséges, a gáztömörség érdekében 
egy inert tömítés is beilleszthet ő. A 6 mm átmér őjű átmenő furattal 
ellátott oldalág 55 mm-re nyúlik ki a nyomástartó edényb ől. Az 
oldalág végén a furat fel van b ővítve, és csavarmenettel van ellátva 
membrános nyomásátalakító számára. Bármilyen nyomásmér ő 
eszköz alkalmazható, feltéve hogy ellenáll a forró gázoknak vagy bomlástermékeknek, és legfeljebb 5 ms alatt képes 690–2 070 kPa 
nyomásemelkedést érzékelni.
 
A nyomástartó edénynek az oldalágtól távolabbi vége gyújtódugóval 
van lezárva, amelyben két elektróda van, amelyek közül az egyik 
szigetelve van a dugó testét ől, a másik pedig azzal elektromosan 
érintkezik. A nyomástartó edény másik vége egy hasadótárcsával van lezárva (hasadó nyomása körülbelül 2 200 kPa), amelyet egy 
20 mm-es furattal ellátott rögzít ődugó tart a helyén. Szükség esetén 
a gáztömörség biztosítására a gyújtódugóhoz inert tömítés alkalmaz ­
ható. A használat során a szerelvényt egy állványzat (2. ábra) tartja megfelelő helyzetben. Ez általában egy 235 mm × 184 mm × 6 mm 
méretű lágyacél alaplapból és egy 185 mm hosszúságú 70 mm × 
70 mm × 4 mm-es zárt szelvényb ől áll.
 
A zárt szelvény egyik végén a két szemben lev ő oldalból egy-egy 
szakaszt kivágnak úgy, hogy két lapos lábrész jöjjön létre, amely felett 86 mm hosszúságban megmarad az érintetlen zárt szelvény. Ezeknek a lapos részeknek a végét a zárt szelvény hossztengelyéhez 
képest 60°-os szögben levágják és az alaplaphoz hegesztik. A zárt 
szelvény fels ő végén az egyik oldalba 22 mm széles és 46 mm mély 
hornyot vágnak úgy, hogy ha a nyomástartó edény szerelvényt a gyújtódugóval lefelé a zárt szelvénybe belehelyezik, az oldalág a 
horonyba illeszkedik. Távtartóként 30 mm széles és 6 mm vastag 
acéldarabot hegesztenek a zárt szakasz alul lev ő belső felületére. Két 
ellentétes oldalon egy-egy 7 mm-es füles csavar rögzíti a nyomás ­
tartó edényt a helyén. Egy-egy 12 mm széles és 6 mm vastag acél ­
szalag van hozzáhegesztve a két lapos lábhoz a zárt szakasz alsó 
végénél, amely a nyomástartó edényt alulról támasztja meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. A g y ú j t ó r e n d s z e r  
A gyújtórendszer 25 cm hosszú, 0,6 mm átmér őjű és 3,85 ohm/m 
ellenállású Ni/Cr huzalból áll. A huzalt egy 5 mm átmér őjű rúd 
segítségével tekercs alakúra kell csavarni, és a gyújtódugóban lév ő 
elektródákhoz kell kapcsolni. A tekercset a 3. ábrán bemutatottak valamelyikének megfelel ően kell kialakítani. Az edény alja és a 
gyújtótekercs alja közötti távolságnak 20 mm-nek kell lennie. Ha 
az elektródák nem állíthatók, a gyújtóhuzalnak a tekercs és az edény alja közötti végeit kerámiaköpennyel kell szigetelni. A huzalt egy legalább 10 A-t szolgáltató állandó áramú tápegységgel kell 
fűteni.
 
1.6.2.  A vizsgálat elvégzése  ( 1 ) 
A nyomásátalakító és a f űtőrendszer felszerelése után, de még a 
hasadótárcsa behelyezése el őtt, a berendezést úgy kell tartani, hogy 
a gyújtódugó alul legyen. Egy üveg f őzőpohárban egy kever őbot 
segítségével a vizsgálandó folyadékból 2,5 g-ot össze kell keverni 2,5 g száraz cellulózzal (
 2 ). Biztonsági okokból a keverést úgy kell 
végezni, hogy a vizsgálatot végz ő személy és a keverék között 
legyen egy biztonsági véd őlemez. Ha a keverék a keverés vagy 
betöltés során meggyullad, nincs szükség további vizsgálatokra. A keveréket kisebb adagokban és ütögetve a nyomástartó edénybe kell tölteni, vigyázva arra, hogy a keverék a gyújtótekercs körül gy űljön 
össze, és megfelel ően érintkezzen azzal. Fontos, hogy a betöltés 
során a tekercs ne torzuljon, mivel ez hibás eredményekhez vezethet (
 3 ). Ezt követ ően be kell tenni a hasadótárcsát a helyére, 
majd szorosan be kell csavarozni a tartódugót. A megtöltött edényt 
a hasadótárcsával felfelé a robbantó állványra kell helyezni, amelyet 
egy megfelel ő, fémborítású füstkamrában vagy robbantókamrában 
kell elhelyezni. Az áramforrást a gyújtódugó küls ő csatlakozóihoz 
kell kapcsolni, és 10 A áramot kell rákapcsolni. A keverés megkez ­
dése és az áram bekapcsolása között nem telhet el 10 percnél 
hosszabb id ő. 
A nyomásátalakító által létrehozott jelet megfelel ő rendszerrel rögzí ­
teni kell, amely lehet ővé teszi mind az eredmény kiértékelését, mind 
pedig a nyomás változásának folyamatos rögzítését az id ő függ­
vényében (pl. egy szalagos íróm űszerhez kapcsolt tranziens íróm ű­
szer). A keveréket addig kell hevíteni, amíg a hasadótárcsa el nem 
törik, vagy legalább 60 másodpercig. Ha a hasadótárcsa nem törik el, meg kell várni, amíg a keverék leh űl, majd a megfelel ő óvintézke ­
dések betartásával, az esetleges nyomásnövekedésre számítva, 
óvatosan szét kell szerelni a berendezést. A vizsgálandó anyaggal 
és a referenciaanyaggal vagy referenciaanyagokkal is öt kísérletet kell végezni. Fel kell jegyezni azt az id őt, amely alatt a nyomás a 
légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2 070 kPa-ra emelkedik. Ki kell 
számítani az átlagos nyomásemelkedési id őt.
 
Bizonyos esetekben az anyagok olyan (vagy túl magas vagy túl 
alacsony) nyomásemelkedést idézhetnek el ő, amelyet nem az anyag 
oxidáló tulajdonságait jellemz ő kémiai reakciók okoznak. Ilyen 
esetekben szükség lehet arra, hogy a vizsgálatot cellulóz helyett egy inert anyaggal, pl. kovafölddel megismételjük, és így tisztázzuk a reakció jellegét.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Az oxidálószerek cellulózzal készített keverékeit potenciálisan robbanásveszélyesnek kell 
tekinteni, és ennek megfelel ő óvatossággal kell kezelni. 
( 2 ) A gyakorlatban ez úgy érhet ő el, hogy a vizsgálandó folyadékból és a cellulózból a 
kísérlethez szükségesnél nagyobb mennyiségben készítjük el az 1:1 arányú keveréket, 
majd 5 ± 0,1 g-ot teszünk bel őle a nyomástartó edénybe. A keveréket minden egyes 
kísérlethez frissen kell elkészíteni. 
( 3 ) Különösen kerülni kell, hogy a tekercs egymással szomszédos menetei egymáshoz érje ­
nek.
 2. ADATOK  
Nyomásemelkedési id ő mind a vizsgálandó anyag, mind a referencia ­
anyag(ok) esetében. Nyomásemelkedési id ő az inert anyaggal végzett 
vizsgálat esetén, ha ilyen is történt.  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Mind a vizsgálandó anyag, mind a referenciaanyag(ok) esetében ki 
kell számítani az átlagos nyomásemelkedési id őt. 
Ki kell számítani az átlagos nyomásemelkedési id őt az inert anyaggal 
végzett vizsgálat esetén (ha ilyen is történt).  
Az 1. táblázatban a kapott eredményekre láthatunk példát.  
1. táblázat  
Példák az eredményekre  ( a ) 
Anyag (  b ) Átlagos nyomásemelkedési id ő cellulózzal készített 1:1 
arányú keverékben 
(ms) 
Ammónium-dikromát, telített vizes oldat 20 800 
Kalcium-nitrát, telített vizes oldat 6 700 Vas(III)-nitrát, telített vizes oldat 4 133 Lítium-perklorát, telített vizes oldat 1 686 Magnézium-perklorát, telített vizes oldat 777 
Nikkel-nitrát, telített vizes oldat 6 250 
Salétromsav, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perklórsav, 50 % 121 (  c ) 
Perklórsav, 55 % 59 Kálium-nitrát, 30 %-os vizes oldat 26 690 Ezüst-nitrát, telített vizes oldat – (
 d ) 
Nátrium-klorát, 40 %-os vizes oldat 2 555 (  c ) 
Nátrium-nitrát, 45 %-os vizes oldat 4 133  
Inert anyag  
Víz: cellulóz – (  d ) 
( a ) Az ENSZ szállítási rendszer szerinti osztályozást lásd az (1) hivatkozásban. 
( b ) A telített oldatokat 20 °C-on kell elkészíteni. 
( c ) Laboratóriumok közötti összehasonlító vizsgálatokból kapott átlagérték. 
( d ) Nem érte el a 2 070 kPa-os maximális nyomást.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
— a vizsgált anyag neve, összetétele, tisztasága stb.,  
— a vizsgált anyag koncentrációja,  
— a cellulóz szárítására alkalmazott módszer,  
— az alkalmazott cellulóz víztartalma,  
— a mérések eredményei,  
— az inert anyaggal kapott vizsgálatok eredményei, ha történt ilyen,  
— a számított átlagos nyomásemelkedési id ők, 
— az ett ől a módszert ől való bármely eltérés és annak okai,  
— az eredmények értékelése szempontjából lényeges összes egyéb 
információ.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE (  1 ) 
A vizsgálatok eredményeit a következ ők alapján kell értelmezni:  
a) a vizsgált anyagból és cellulózból készített keverékben fellép-e 
spontán öngyulladás; és  
b) a nyomásnak a légköri nyomás felett 690 kPa-ról 2 070 kPa-ra 
való emelkedéséhez szükséges átlagos id ő összehasonlítása a refe ­
renciaanyag(ok) esetén mért értékekkel.  
Oxidáló hatásúnak kell tekinteni egy folyékony anyagot, ha:  
a) cellulózzal alkotott 1:1 tömegarányú keverékében spontán 
öngyulladás lép fel; vagy  
b) cellulózzal alkotott 1:1 tömegarányú keverékében az átlagos 
nyomásemelkedési id ő kisebb vagy egyenl ő a 65 tömegszáza ­
lékos vizes salétromsav és cellulóz 1:1 tömegarányú keverékében 
mérttel.  
A téves pozitív eredmények elkerülése érdekében az eredmények 
értelmezésekor szükség esetén figyelembe kell venni a folyadék inert anyaggal történ ő vizsgálatakor kapott eredményeket is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Az ENSZ szállítási rendeletek szerinti, több referenciaanyaggal mért eredmények értel ­
mezéséhez lásd az (1) hivatkozást.
 4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publica ­
tion No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: 
Test for oxidizing liquids.  
1. ábra  
A nyomástartó edény
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
2. ábra  
Az állványzat
  
3. ábra  
A gyújtórendszer
  
Megjegyzés: a fenti elrendezések bármelyike alkalmazható.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  ROSTOK HOSSZAL SÚLYOZOTT ÁTLAGOS GEOMETRIAI 
ÁTMÉRŐJE 
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a módszer a mesterséges ásványi rostok (MMMF) hosszal súlyo ­
zott átlagos geometriai átmér őjének (LWGMD) mérési módszerét írja 
le. Mivel a minta sokaság hosszal súlyozott átlagos geometriai átmérője 95 %-os valószín űséggel a 95 %-os konfidenciaszinteken 
belül lesz (LWGMD ± két standard hiba), a jelentett érték (a vizs ­
gálati érték) a minta alsó 95 %-os konfidenciahatára lesz (azaz 
LWGMD – 2 két standard hiba). A módszer egy HSE ipari eljárás ­
tervezet frissítésén alapul (1994. június), melyet az ECFIA és a HSE Chester tartott megbeszélésén fogadott el, 1993. szeptember 26-án, 
és egy második laboratóriumközi vizsgálat részére készült, illetve 
abból dolgozták ki (1, 2). Ez a mérési módszer az ömlesztett anyagok vagy a mesterséges ásványi szálakat, beleértve a refraktor kerámia rostokat (RCF), mesterséges üvegszálakat (MMVF), kristá ­
lyos és polikristályos szálakat tartalmazó termékek rostátmér őjének 
jellemzésére használható.
 
A hosszal történ ő súlyozás az anyagok mintavételezésekor vagy 
mozgatásakor a hosszú rostok törése által okozott átmér ő eloszlásra 
gyakorolt hatást egyenlíti ki. Az MMMF átmér ők méreteloszlásának 
méréséhez geometriai statisztikát (geometriai átlag) alkalmaznak, mert ezeknek az átmér őknek a méreteloszlása rendszerint a logarit ­
miko-normális eloszláshoz közelít.
 
A hossz és az átmér ő mérése egyaránt unalmas és id őigényes, de 
csak ha azokat a rostokat mérik, melyek érintik a SEM látómez ő egy 
végtelenül vékony vonalát, egy adott rost kiválasztásának lehet ősége 
arányos annak hosszával. Mivel a hosszal súlyozott számításokban ez figyelemmel van a hosszra, az egyetlen megkívánt mérés az átmér ő 
mérése, és a LWGMD-2SE a leírtak szerint számítható.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Részecske : Olyan tárgy, melynél a hossznak a szélességhez viszo ­
nyított aránya kisebb mint 3:1.  
Rost : Olyan tárgy, melynél a hossznak a szélességhez viszonyított 
aránya (méretarány) legalább 3:1.  
1.3. ALKALMAZÁSI TERÜLET ÉS KORLÁTOK  
A módszer a 0,5 μm és 6 μm közti átlagátmér őjű átmérő eloszlás 
vizsgálatára született. A nagyobb átmér ők kisebb SEM nagyítással 
vizsgálhatóak, de a módszer növekv ő mértékben korlátozóvá válik a 
finomabb rosteloszlás esetében és 0,5 μm alatti átlagátmér ő esetében 
TEM (transzmissziós elektronmikroszkóp) mérés javasolt.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A rostpaplanból vagy a szabad ömlesztett rostból több reprezentatív 
magmintát vesznek. Az ömlesztett rostok hosszát aprítási eljárással csökkentik és a reprezentatív almintát vízben oszlatják el. Az aliquo ­
tokat kivonatolják és 0,2 μm pórusméret ű, polikarbonát sz űrőn átszű­
rik, majd el őkészítik a pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) techni ­
kájú vizsgálatra. A rostátmér őket 10 000-szeres vagy nagyobb képer ­
nyőnagyítással mérik (
 1 ), egyenes metszés módszer alkalmazásával, 
az átlagátmér ő torzítatlan becslése végett. A kisebb 95 % konfiden ­
ciaintervallumot (egyoldalas vizsgálaton alapulva) számítják, és az eredmény az anyag átlag geometriai rostátmér őjének legkisebb 
becsült értéke.
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  Biztonság/óvintézkedések  
A lebegő rostoknak történ ő személyi kitettséget minimalizálni kell, 
és a száraz rostok mozgatásakor füstszekrényt vagy keszty űs mani­
pulátort kell használni. A módszerek hatékonyságának meghatározá ­
sára időszakos személyi kitettség monitoringot kell végezni. Mester ­
séges ásványi rostok mozgatásakor a b őrirritációk csökkentésére és a 
kereszt-szennyez ődés megel őzése érdekében eldobható keszty űt kell 
viselni.  
1.5.2.  Készülék / berendezés  
— Présel ő és sajtoló (10 MPa el őállítására képes).  
— 0,2 μm pórusméret ű polikarbonát kapilláris pórus sz űrők (25 mm 
átmérő). 
— 5 μm pórusméret ű cellulózészter membránsz űrő alátétszűrőnek. 
— Üveg sz űrőberendezés (vagy eldobható sz űrőrendszerek) 25 mm 
átmérőjű szűrőkhöz (pl. Millipore üveg mikroanalízis készlet, 
XX10 025 00 típusú).  
— Mikroorganizmusok eltávolítására 0,2 μm pórusátmér őjű szűrőn 
átszűrt, frissen desztillált víz.  
— Katódbevonó arany vagy arany/palládium anyaggal.  
— Pásztázó elektronmikroszkóp, mely 10 nm felbontású és 10 000- 
szeres nagyításra képes.  
— Vegyes: spatulák, 24-es típusú szikepenge, csipeszek, SEM 
tárgylemezek, szén ragasztó vagy szén tapadó szalag, ezüst vezető.
 
— Ultrahangos szonda vagy asztali ultrahangos fürd ő. 
— Fúró mintavev ő vagy dugófúró, a mesterséges ásványi szál 
paplanból történ ő magmintavételre.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Ez a nagyítási érték 3 μm rostokhoz javasolt, a 6 μm rostok esetében 5 000-szeres 
nagyítás megfelel őbb lehet.
 1.5.3.  A vizsgálat kivitelezése  
1.5.3.1.  Mintavétel  
Paplanok és lapok esetében egy 25 mm-es magfúróval vagy dugó ­
fúróval vesznek mintákat a keresztmetszetb ől. Ezek a paplanok egy 
rövid hosszoldalán, annak szélességében egyenl ő távolságra kell, 
hogy elhelyezkedjenek, vagy pedig véletlenszer űen kell venni őket, 
amennyiben elegend ő hosszú hosszdarabok áll rendelkezésre. 
Ugyanezt a berendezést szabad rostokból történ ő véletlenszer ű 
minták vételére is lehet használni. Lehet őség szerint hat mintát kell 
venni, az ömlesztett anyag térbeli eltéréseinek tükrözése céljából.  
A hat magmintát 50 mm átmér őjű sajtolóban, 10 MPa-on kell össze ­
törtni. Az anyagot egy spatulával kell összekeverni, majd 10 MPa-on 
újra összenyomni. Ezután az anyag kikerül a sajtolóból és lezárt üvegben kerül tárolásra.
 
1.5.3.2.  A minta el őkészítése  
Ha szükséges, a szerves köt őanyag eltávolítható a rostnak körülbelül 
egy órára 450 °C-os kemencébe történ ő helyezésével.  
A mintát kúp alakúra kell formálni, majd negyedelve szétosztani (ezt 
porkamrában kell végezni).  
Spatula segítségével adjuk a minta egy kis mennyiségét (< 0,5 g) 
100 ml frissen desztillált, 0,2 μm-es membránsz űrőn átszűrt vízhez 
(ha kielégít őnek bizonyulnak, más, alternatív ultratiszta víz forrá ­
sokat is lehet használni). 100 W teljesítményen m űködtetett, kavitá ­
cióra beállított ultrahangos szondával alaposan oszlassuk el. (Ha nem 
áll rendelkezésre szonda, a következ ő módszert alkalmazzuk: ismé ­
telten rázzuk és invertáljuk 30 másodpercig; asztali ultrahangos fürdőben ultrahangozzuk öt percig; majd ismételten rázzuk és inver ­
táljuk további 30 másodpercig).
 
Rögtön a rost szétoszlatását követ ően vegyünk ki több aliquotot (pl. 
három darab, 3, 6 és 10 ml aliquot) egy széles szájú pipetta segít ­
ségével (2–5 ml kapacitás).  
Mindegyik aliquotot vákuumsz űrőzzük át egy 0,2 μm polikarbonát 
szűrőn, melyet egy 5 μm pórusú MEC alátét sz űrővel egészít ki, egy 
25 mm-es hengeres tartályos, üvegsz űrős tölcsérrel. Körülbelül 5 ml 
szűrt desztillált vizet kell a tölcsérbe helyezni, és az aliquotot lassan 
át kell pipettázni át a vízbe, a pipetta csúcsát a meniszkusz alatt 
tartva. A pipettázást követ ően a pipettát és a tartályt alaposan át 
kell öblíteni, mivel a vékony rostok hajlamosak inkább a felületen maradni.
 
Óvatosan távolítsuk el a sz űrőt és válasszuk el az alátét sz űrőtől, 
mielőtt egy tartályba helyeznénk szárítani.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
24-es típusú szikével a sz űrt üledékb ől vágjunk egy negyed vagy 
fél szűrőrészt, ide-oda mozgó mozdulatokkal. A kivágott részt 
óvatosan helyezzük a SEM tárgylemezre, szén ragasztószalaggal vagy szénragasztóval rögzítve. A sz űrő széleinek és a tárgylemez 
villamos érintkezésének javítása érdekében legalább három helyen 
ezüst vezet őt kell alkalmazni. Amikor a ragasztó/ezüst vezet ő 
száraz, szórással vonja be az üledék felületét körülbelül 50 nm arany/palládium bevonattal.
 
1.5.3.3.  SEM kalibrálása és m űködtetése  
1.5.3.3.1. K a l i b r á l á s  
A SEM kalibrálását legalább hetente egyszer ellen őrizni kell (ideá ­
lisan naponta egyszer), hitelesített kalibrációs ráccsal. A kalibrációt össze kell hasonlítani egy hitelesített standarddal és ha a mért érték 
(SEM) nincs a hitelesített érték ± 2 %-án belül, a SEM kalibrációt be 
kell állítani és újra kell ellen őrizni.
 
A SEM-nek legalább látható 0,2 μm átmérő felbontással kell rendel ­
keznie, valós minta mátrixot alkalmazva, 2 000-szeres nagyításon.  
1.5.3.3.2. M ű k ö d t e t é s  
A SEM-et 10 000-szeres nagyításon kell m űködtetni (  1 ), olyan körül ­
ményeket alkalmazva, melyek jó felbontást és elfogadható képet adnak lassú, például 5 másodperc per kép letapogatási sebességnél. 
Bár a különböz ő SEM-ek üzemeltetési követelményei eltérhetnek, 
általánosságban a legjobban látható és legjobb felbontás érdekében, viszonylag alacsony atomsúlyú anyagokkal 5–10 keV gyorsítófe ­
szültséget kell alkalmazni kis fénypont mérettel és rövid m űködési 
távolsággal. Mivel lineáris metszést végzünk, 0
 o -os dőlést kell alkal ­
mazni a minimális újrafókuszáláshoz, vagy, ha az SEM-nek van eucentrikus állapota, az eucentrikus m űködési távolságot kell hasz ­
nálni. Kisebb nagyítás alkalmazható, ha az anyag nem tartalmaz kis 
(átmérőjű) rostokat, és a rostok átmér ője nagy (> 5 μm).
 
1.5.3.4.  Méretezés  
1.5.3.4.1. K i s e b b n a g y í t á s ú v i z s g á l a t a m i n t a é r t é k e l é s é r e  
A mintát el őször kis nagyítással kell vizsgálni összetapadt nagy 
rostok jeleit keresve, és a rostok s űrűségét vizsgálva. Túlzott tapadás 
esetén javasolt új minta készítése.  
A statisztikai pontosság érdekében fontos egy minimum számú rost 
mérése, és kívánatos a magas rosts űrűség, mivel az üres mez ők vizs­
gálata időigényes és nem segíti az elemzést. Ugyanakkor, ha a sz űrő 
túltöltött, nehézkes az összes mérhet ő rost mérése, mert a kis 
rostokat eltakarhatják a nagyobbak, ezért ezek esetleg figyelmen 
kívül maradnak.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) A 3 μm rostok esetében lásd az el őző jegyzetet.
 Az LWGMD túlbecslése annak eredménye lehet, ha a lineáris átlón a 
rostsűrűség meghaladja millimétereként a 150 rostot. Másrészr ől az 
alacsony rostkoncentrációk növelik az elemzés idejét, és gyakran költséghatékonyabb az optimálishoz közeli rosts űrűségű minta készí ­
tése, mint az alacsony koncentrációjú sz űrők számolgatásához 
ragaszkodás. Az optimális rosts űrűség esetén 5 0000-szeres nagyí ­
tásnál egy látómez őben átlag egy vagy két megszámlálható rost 
található. Ugyanakkor az optimum s űrűség függ a rostok méretét ől 
(átmérő), ezért fontos, hogy a m űveletet végz ő személy szakszer űen 
döntsön arról, hogy a rosts űrűség optimálishoz közeli-e vagy sem.
 
1.5.3.4.2. A r o s t á t m é r ő k h o s s z a l t ö r t é n ő s ú l y o z á s a  
Csak azokat a rostokat kell számolni, melyek a SEM képerny őjén 
lévő (végtelenül) vékony vonalat érintik (vagy keresztezik). Ebb ől az 
okból kifolyólag a képerny ő közepén egy vízszintes (vagy függ őle­
ges) vonal húzódik.  
Alternatívaként a képerny ő közepén egyetlen pont található, és a 
szűrőn keresztül egy irányban zajlik a folyamatos pásztázás. Minden 
olyan rost átmér ője, melynek méretaránya nagyobb mint 3:1, és 
érinti, vagy keresztezi ezt a pontot, mérésre és rögzítésre kerül.  
1.5.3.4.3. R o s t o k m é r e t e z é s e  
Minimum 300 rost mérése javasolt. Minden rostot csak egyszer, a 
képen lév ő vonallal vagy ponttal kapott metszéspontban mérünk 
(vagy ha a rost végei takarva vannak, a metszésponthoz közel). Ha 
nem szokványos keresztmetszet ű rostok fordulnak el ő, a rost átlag 
átmérőjét képvisel ő mérést kell alkalmazni. Gondosan kell eljárni a 
végek meghatározásakor, illetve a rost végei közötti legrövidebb távolság mérésekor. A méretezés végezhet ő on-line vagy pedig a 
tárolt képekkel vagy fotókkal off-line. Félautomatikus képi mérési 
rendszerek – melyek az adatokat közvetlenül egy táblázatba töltik le – használata ajánlott, mivel ezek id őt takarítanak meg, kiküszöbölik 
az elírási hibákat és a számítások automatikusak.
 
A hosszú rostok végeit kis nagyítással kell ellen őrizni, meggy őződve 
arról, hogy azok nem göndörödnek vissza a mérési látómez őbe és 
csak egyszer kerülnek mérésre.  
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
A rostátmér ők rendszerint nem mutatnak normális eloszlást. Ugyan ­
akkor a logtranszformáció elvégzésével a normálishoz közelít ő elosz­
lást nyerhetünk.  
Kiszámítjuk az n rostátmér ők (D) természetes e alapú logaritmusa 
(lnD) számtani átlagát (mean lnD) és standard eltérését (SD  lnD ): 
mean lnD ¼ ∑ lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ ðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
A standard hiba (SE  lnD ) meghatározásához a standard eltérést 
elosztjuk a mérések számának (n) négyzetgyökével. 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Az átlagból kivonjuk a standard hiba kétszeresét, és kiszámítjuk az 
érték (mínusz két standardhiba) exponenciálisát, így megkapjuk a 
geometriai átlag mínusz két standard hiba értéket. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek legalább a következ ő információt kell tartal ­
maznia:  
— Az LWGMD-2SE értéke.  
— Bármilyen eltérés és különösen azok, melyek hatással lehetnek 
az eredmények precízségére vagy pontosságára, megfelel ő 
indoklással.  
4. HIVATKOZÁSOK  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: 
Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  MEGOSZLÁSI HÁNYADOS (1-OKTANOL/VÍZ): LASSÚ 
KEVERÉSES MÓDSZER  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 123. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2006) leírt módszerrel. A lassú keveréses módszert sikerrel alkal ­
mazták az 1-oktanol/víz megoszlási hányados (P  OW ) pontos meghatározására 
log P  OW = 8,2 értékig (1). Ez a kísérleti megközelítés éppen ezért alkalmas 
az erősen hidrofób anyagok P  OW értékének közvetlen meghatározására.  
2. Az 1-oktanol/víz megoszlási hányados (P  OW ) meghatározásának egyéb 
módszerei a lombikrázásos módszer (2), valamint a P  OW fordított fázisú 
nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) kapott retencióból történ ő 
meghatározása (3). A lombikrázásos módszernél az oktanol-mikrocseppek vizes fázisba való átkerülése miatt fennáll a torzított mérési eredmények 
veszélye. Minél nagyobb a P
 OW értéke, annál inkább el őfordulhat e cseppek 
vizes fázisban való jelenléte miatt a vizsgált anyag vízben oldott koncent ­
rációjának túlbecslése. Éppen ezért e módszer alkalmazása a 4-nél kisebb log P
 OW értékű anyagokra korlátozódik. A második módszer közvetlen 
módon meghatározott, konkrét P  OW -adatokat használ a HPLC technikával 
megállapított retenciós viselkedés és a mért P  OW értékek közötti összefüggés 
kalibrálással való meghatározásához. Az ionizálható anyagok 1-oktanol/víz megoszlási hányadosának meghatározásához állt ugyan rendelkezésre 
OECD-iránymutatástervezet (4), ez azonban már nem alkalmazható.
 
3. A jelen vizsgálati módszert Hollandiában dolgozták ki. Az itt leírt vizs ­
gálatok precizitását egy 15 laboratórium részvételével végzett validációs 
körvizsgálati tanulmány keretében validálták és optimalizálták (5).  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
Szignifikancia és alkalmazási terület  
4. Inert szerves anyagoknál er ősen szignifikáns összefüggést mutattak ki az 1- 
oktanol/víz megoszlási hányados (P  OW ) és az anyag halakban történ ő 
bioakkumulációja között. Ezen túlmen ően összefüggést találtak a P  OW és 
a halakra gyakorolt toxikus hatás, valamint a vegyi anyagok szilárd anya ­
gok, például talaj és üledékek általi felvétele között. A hivatkozott irodalom 
(6) széles kör ű áttekintést nyújt ezen összefüggésekr ől. 
5. Számos különböz ő összefüggést állapítottak meg az 1-oktanol/víz megosz ­
lási hányados és az anyagok környezeti toxikológia és kémia szempontjából 
lényeges egyéb tulajdonságai között. Ennek következtében az 1-oktanol/víz 
megoszlási hányados meghatározó paraméterré vált a vegyi anyagok környe ­
zeti kockázatának értékelése, valamint a vegyi anyagok környezeti sorsának előrejelzése szempontjából.
 
Alkalmazási kör  
6. A lassú keveréses kísérlet során feltételezhet ően kisebb mérték ű a mikro ­
cseppek 1-oktanol-cseppekb ől való képz ődése a vizes fázisban. Ennek 
következtében nem fordul el ő a vízben oldott koncentrációnak a vizsgált 
anyag e cseppekhez köt ődő molekulái miatti túlbecslése. A lassú keveréses 
módszer éppen ezért különösen alkalmas az 5 vagy annál nagyobb várt log 
P OW értékű anyagok P  OW értékének meghatározására, amelyeknél a lombik ­
rázásos módszer (2) gyakran ad hibás eredményeket.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁS ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
7. Egy adott anyag víz és lipofil oldószer (1-oktanol) közötti megoszlási 
hányadosa a vegyi anyag két fázis közötti egyensúlyi megoszlását írja le. A víz és 1-oktanol közötti megoszlási hányados (P
 OW ) a vizsgált anyag 
vízzel telített 1-oktanolban (C  O ) és 1-oktanollal (C  W ) telített vízben fennálló 
egyensúlyi koncentrációinak hányadosát jelenti.  
P OW ¼ C O=C W 
Koncentrációhányados lévén dimenzió nélküli szám. A legtöbb esetben 10- 
es alapú logaritmusként (log P  OW ) adják meg. A P  OW hőmérsékletfügg ő, 
ezért a jegyz őkönyvezett adatok között szerepelnie kell a mérési h őmérsék­
letnek.  
A MÓDSZER ELVE  
8. A megoszlási hányados meghatározásához a vizet, az 1-oktanolt és a vizs ­
gált anyagot állandó h őmérsékleten egyensúlyba hozzuk egymással. Ezt 
követően meghatározzuk a vizsgált anyag koncentrációját a két fázisban.  
9. Az itt javasolt lassú keveréses módszerrel csökkenthet ők a lombikrázásos 
kísérlet során jelentkez ő mikrocseppképz ődéssel összefügg ő kísérleti nehéz ­
ségek. A lassú keveréses kísérlet során vizet, 1-oktanolt és vizsgált anyagot 
hozunk egyensúlyba egy termosztátos kever őreaktorban. A fázisok közötti 
anyagmozgást keveréssel gyorsítjuk. A keverés korlátozott turbulenciával jár, ami mikrocseppek képz ődése nélkül fokozza az 1-oktanol és a víz 
közötti anyagmozgást (1).
 
A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
10. Mivel a vizsgált anyagtól eltér ő anyagok jelenléte befolyásolhatja a vizsgált 
anyag aktivitási együtthatóját, a vizsgált anyagot tiszta formában kell vizs ­
gálni. Az 1-oktanol/víz kísérlethez a kereskedelmi forgalomban kapható legnagyobb tisztaságú anyagot kell felhasználni.
 
11. A jelen módszer tiszta anyagokra vonatkozik, amelyeknél nem figyelhet ő 
meg disszociáció vagy asszociáció, illetve jelent ős mérték ű határfelületi 
aktivitás. A módszerrel az ilyen anyagok, valamint a keverékek 1-okta ­
nol/víz megoszlási hányadosa határozható meg. Amennyiben a módszert 
keverékeknél alkalmazzuk, a megállapított 1-oktanol/víz megoszlási 
hányados feltételesnek tekintend ő, és függ a vizsgált keverék kémiai össze ­
tételétől, valamint a vizes fázisként alkalmazott elektrolit-összetételt ől. A 
módszer disszociáló vagy asszociáló vegyületekre is alkalmazható, ugyan ­
akkor ez esetben további m űveleteket kell elvégezni (12. bekezdés).  
12. Mivel a disszociáló anyagok – például szerves savak és fenolok, szerves 
lúgok, valamint szerves fémvegyületek – 1-oktanol/víz megoszlása során vízben és 1-oktanolban több egyensúlyi állapot jön létre, az 1-oktanol/víz 
megoszlási hányados feltételes állandó, amely nagymértékben függ az elekt ­
rolit összetételét ől (7) (8). Az 1-oktanol/víz megoszlási hányados meghatá ­
rozásához éppen ezért a kísérlet során szabályozni és jegyz őkönyvezni kell 
a pH-t és az elektrolit összetételét. E megoszlási hányadosok értékelésekor 
szakértői megítélésre kell támaszkodni. A disszociációs állandó(k) értéke 
alapján alkalmas pH-értékeket kell kiválasztani úgy, hogy minden egyes ionizációs állapothoz meghatározható legyen a megoszlási hányados. A szerves fémvegyületek vizsgálatához olyan puffereket kell használni 
amelyekben nem képz ődnek komplex vegyületek (8). A kísérleti feltételeket 
a vizes fázisról rendelkezésre álló kémiai ismeretek (komplexképzési állan ­
dók, disszociációs állandók) figyelembevételével oly módon kell kiválasz ­
tani, hogy megbecsülhet ő legyen a vizsgált anyagból a vizes fázisban kelet ­
kező változatok megjelenése. Háttérelektrolit használatával minden kísérlet 
során azonos ioner ősséget kell biztosítani.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Alacsony vízoldékonysággal vagy magas P  OW értékkel rendelkez ő anyagok 
vizsgálata során nehézségek merülhetnek fel, mivel a vízben oldott koncent ­
ráció ez esetben olyan alacsony, hogy nehéz pontosan meghatározni. Ez a vizsgálati módszer útmutatást ad az említett probléma kezeléséhez.
 
INFORMÁCIÓK A VIZSGÁLT ANYAGRÓL  
14. Analitikai vagy annál nagyobb tisztasági fokú kémiai reagenseket kell alkal ­
mazni. Javasolt jelöletlen, ismert kémiai összetétel ű, lehetőség szerint 
legalább 99 %-os tisztaságú vizsgált anyagokat, vagy radioaktívan jelölt, ismert kémiai összetétel ű, radiokémiai tisztaságú vizsgált anyagokat hasz ­
nálni. Rövid felezési idej ű nyomjelz ő elem használata esetén korrekciókat 
kell végezni a bomlás figyelembevétele érdekében. Radioaktívan jelölt vizs ­
gált anyag esetén az adott vegyi anyagra specifikus analitikai módszert kell alkalmazni annak érdekében, hogy a mért radioaktivitás közvetlenül a vizs ­
gált anyaghoz köt ődjön.
 
15. A log P  OW becslése kereskedelmi forgalomban kapható, a log P  OW becs­
lésére szolgáló szoftverrel, vagy a két oldószerben mérhet ő oldékonyság 
hányadosa alapján végezhet ő el. 
16. A P  OW meghatározására szolgáló, lassú keveréses kísérlet elvégzése el őtt a 
vizsgált anyagról az alábbi információknak kell rendelkezésre állniuk:  
a) szerkezeti képlet;  
b) az anyag vízben és 1-oktanolban oldott koncentrációjának meghatározá ­
sára alkalmas analitikai módszerek;  
c) ionizálható anyagok esetén a disszociációs állandó(k) (112. 
OECD-iránymutatás (9));  
d) vízoldékonyság (10);  
e) abiotikus hidrolízis (11);  
f) gyors biológiai lebonthatóság (12);  
g) gőznyomás (13).  
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Felszerelések és készülékek  
17. Általános laboratóriumi felszerelések, így különösen a következ ők szüksége ­
sek: 
— mágneses kever ők és teflonbevonatú mágneses kever őrudak a vizes fázis 
keveréséhez,  
— a vizsgált anyag várható koncentrációjának meghatározására alkalmas 
analitikai m űszerek,  
— alul csappal ellátott kever őedény. A becsült log P  OW értéktől és a vizs ­
gált vegyület kimutatási határától (LOD) függ ően megfontolandó egy 
ugyanolyan geometriai kialakítású, 1 liternél nagyobb kapacitású reak ­
cióedény használata, hogy kell ő mennyiség ű víz álljon rendelkezésre a 
kémiai extraháláshoz és elemzéshez. Ez magasabb koncentrációt ered ­
ményez a kivett vízmintában, és következésképpen megbízhatóbb anali ­
tikai meghatározást tesz lehet ővé. A szükséges térfogat becsült minimális 
értékét, a vegyület LOD-ját és becsült log P  OW értékét, valamint vízoldé ­
konyságát az 1. függelék táblázata tartalmazza. A táblázat a log P  OW és 
az oktanolban és vízben való oldhatóság hányadosa közötti, Pinsuwan és munkatársai által bemutatott összefüggésen (14) alapul:
 
log P  OW ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
ahol 
SR ¼ S oktanol =S víz (molaritásban kifejezve),  
a táblázat alapjául szolgál továbbá a Lyman által a vízoldékonyság 
előrejelzéséhez megadott összefüggés (15) is. Az 1. függelékben 
szereplő egyenlettel kiszámított vízoldékonysági értékeket els ő közelí­
tésnek kell tekinteni. Megjegyzend ő, hogy a vizsgálatot végz ő személy 
a vízoldékonyságot bármilyen, a víztaszító képesség és az oldékonyság 
közötti kapcsolat ábrázolására alkalmasabbnak tekintett összefüggés alapján is megbecsülheti. Szilárd vegyületek esetén például ajánlott az oldékonyság el őrejelzése során az olvadáspontot is figyelembe venni. 
Módosított egyenlet alkalmazása esetén meg kell bizonyosodni arról, 
hogy az oktanolban való oldhatóság számítására szolgáló egyenlet módosítva is érvényes. A 2. függelék tartalmazza egy körülbelül 1 liter térfogatú, kett ősfalú üveg kever őedény vázlatrajzát. A 2. függe ­
lékben ábrázolt edény arányai el őnyösnek bizonyultak, és eltér ő méretű 
eszköz használata esetén is célszer ű megtartani azokat,
 
— a lassú keveréses kísérlet során alapvet ő fontosságú az állandó h őmér­
sékletet biztosító eszköz használata.  
18. Inert anyagból készült edényeket kell használni, hogy az edény felületén 
elhanyagolható mérték ű adszorpció jelentkezzen.  
A vizsgált oldatok el őkészítése  
19. A P  OW meghatározásához a kereskedelmi forgalomban kapható legnagyobb 
(legalább 99 %-os) tisztaságú 1-oktanolt kell használni. Ajánlott az 1-okta ­
nolt savval, lúggal és vízzel végzett extrakció, majd pedig szárítás útján tisztítani. Az 1-oktanol ezenkívül desztillálással is tisztítható. A tisztított 1-oktanolt a vizsgált anyagok standard oldatainak elkészítésére kell felhasz ­
nálni. A P
 OW meghatározásához üveg- vagy kvarcedényben desztillált, vagy 
tisztítórendszerrel nyert vizet kell használni, illetve használható HPLC-tisztaságú víz is. Desztillált víz esetén 0,22 μm-es szűrővel végzett 
szűrés szükséges, továbbá vakmintákat is kell készíteni annak ellen őrzése 
érdekében, hogy a koncentrált kivonatokban nincs-e jelen a vizsgált anyagot 
esetlegesen befolyásoló szennyez ődés. Üvegszálas sz űrő használata esetén a 
szűrőt három órán keresztül 400 °C h őmérsékleten végzett h őkezeléssel kell 
tisztítani.
 
20. A kísérlet el őtt mindkét oldószert kölcsönösen telítsük egymással úgy, hogy 
megfelelő méretű edényben egyensúlyi állapotba hozzuk azokat. Ez a kétfá ­
zisú rendszer két napon át tartó lassú keverésével történik.  
21. Válasszuk ki a vizsgált anyag megfelel ő koncentrációját, és ennek megfelel ő 
anyagmennyiséget oldjunk fel (vízzel telített) 1-oktanolban. Az 1-oktanol/víz 
megoszlási hányadost híg 1-oktanolos és vizes oldatban kell meghatározni. 
A vizsgált anyag koncentrációja ezért az egyes fázisokban nem haladhatja meg az oldhatóság 70 %-át, és legfeljebb 0,1 mól lehet (1). A kísérlet során használt 1-oktanol-oldatok nem tartalmazhatnak lebeg ő, szilárd vizsgált 
anyagot.
 
22. Megfelel ő mennyiség ű vizsgált anyagot oldjunk fel (vízzel telített) 1-okta ­
nolban. Ha a log P  OW becsült értéke 5-nél nagyobb, ügyelni kell arra, hogy 
a kísérlet során használt 1-oktanolos oldatok ne tartalmazzanak lebeg ő, 
szilárd vizsgált anyagot. Ennek érdekében az 5-nél nagyobb becsült log 
P OW értékű vegyi anyagok esetében az alábbi eljárást kell alkalmazni:  
— a vizsgált anyagot oldjuk fel (vízzel telített) 1-oktanolban,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— várjuk meg, amíg az oldatból a lebeg ő szilárd anyag kiülepedik. Az 
ülepítés ideje alatt kísérjük figyelemmel a vizsgált anyag koncentrációját,  
— miután az 1-oktanolos oldatban mért koncentráció megállapodik egy 
stabil értéken, a törzsoldatot hígítsuk megfelel ő mennyiség ű 1-oktanollal,  
— mérjük meg a hígított törzsoldat koncentrációját. Ha a mért koncentráció 
összhangban van a hígítás mértékével, a hígított törzsoldat felhasznál ­
ható a lassú keveréses kísérlethez.  
A minták extrahálása és elemzése  
23. Az anyag vizsgálatához validált analitikai módszert kell alkalmazni. A vizs ­
gálatot végz ő személyeknek bizonyítaniuk kell, hogy a vízzel telített 1-okta ­
nol, valamint az 1-oktanollal telített víz fázisban a kísérlet során mért 
koncentrációk az alkalmazott analitikai eljárások mennyiségi kimutatásának módszertani határértéke fölött vannak. Amennyiben extrahálási módszerek 
szükségesek, a vizsgált anyag vizes és 1-oktanolos fázisból történ ő analitikai 
visszanyerését a kísérlet el őtt meg kell állapítani. Az analitikai jelet vakmin ­
tákkal korrigálni kell, és ügyelni kell arra, hogy az analit ne kerüljön át az egyik mintából a másikba.
 
24. A hidrofób vizsgált anyagok vizes fázisban fennálló meglehet ősen alacsony 
koncentrációja miatt az elemzés el őtt valószín űleg el kell végezni a vizes 
fázis szerves oldószerrel történ ő extrahálását, és az extraktumot be kell 
töményíteni. Ugyanezen okból csökkenteni kell az esetleges vakminták 
koncentrációját. Ennek érdekében magas tisztasági fokú, lehet őség szerint 
szermaradék-elemzésre szolgáló oldószereket kell alkalmazni. A kereszt ­
szennyeződés ezenkívül el őzőleg alaposan megtisztított(például oldószerrel 
kimosott vagy magas h őmérsékleten h őkezelt) üvegeszközök használatával 
is elkerülhet ő. 
25. A log P  OW becsült értéke becslési programmal vagy szakért ői megítélés 
alapján kapható meg. Ha az érték 6-nál nagyobb, a vakmintákkal való 
korrekciókat és az analit áthordását szorosan figyelemmel kell kísérni. 
Hasonlóképpen, ha a log P  OW 6-nál nagyobb, a magas betöményítési 
tényezők elérése érdekében kötelez ő helyettesít ő standardot alkalmazni a 
visszanyeréssel való korrekciókhoz. A kereskedelmi forgalomban több szoft ­
verprogram is kapható a log P  OW becsléséhez, (  1 ) például Clog P (16), 
KOWWIN (17), ProLogP (18) és ACD log P (19). A becslési módszerek leírása a hivatkozott irodalomban olvasható (20–22).
 
26. A vizsgált anyag 1-oktanolban és vízben oldott mennyiségének megállapítá ­
sához használt mennyiségi meghatározási határértékeket (LOQ) elfogadott módszerek alapján kell meghatározni. Általános szabályként a mennyiségi meghatározás módszerspecifikus határértéke akként a vízben vagy 1-okta ­
nolban oldott koncentrációként határozható meg, amely 10-es jel/zaj arányt 
eredményez. Megfelel ő extrahálási és betöményítési módszert kell kiválasz ­
tani, továbbá meg kell határozni az analitikai visszanyeréseket is. Megfelel ő 
betöményítési tényez őt válasszunk ki annak érdekében, hogy az analitikai 
meghatározás eredményeként szükséges nagyságú jelet kapjunk.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Ezek az információk csupán a felhasználók kényelmét szolgálják. Más, egyenérték ű 
számítógépes programok is használhatók, amennyiben bizonyítottan képesek azonos 
eredmények el őállítására.
 27. Az analitikai módszer paraméterei és a várt koncentrációk alapján hatá ­
rozzuk meg a vegyület pontos koncentrációjának megállapításához szük ­
séges hozzávet őleges mintaméretet. Kerülend ő az olyan vizes minták hasz ­
nálata, amelyek túl kis mennyiség űek ahhoz, hogy megfelel ő analitikai jelet 
adjanak. Kerülend ő továbbá a túl nagy méret ű vízminták használata, mivel 
ellenkező esetben túl kevés víz maradhat a minimális számú (n = 5) elemzés 
elvégzéséhez. Az 1. függelék az edény térfogatának, valamint a vizsgált anyag LOD értékének és oldhatóságának függvényében adja meg a mini ­
mális mintamennyiséget.
 
28. A vizsgált anyagok mennyiségi meghatározása az adott vegyület kalibrálási 
görbéivel való összehasonlítás alapján történik. Az elemzett mintákban 
oldott koncentrációknak a standardok koncentrációi közé kell esniük.  
29. Hatnál nagyobb becsült log P  OW értékű vizsgált anyagok esetén az 
extrahálás el őtt helyettesít ő standardot kell a vízmintához adni, hogy a 
vízminták extrahálása és betöményítése során történ ő veszteségek észlel ­
hetők legyenek. A visszanyeréssel való pontos korrekció érdekében a helyet ­
tesítő standardoknak a vizsgált anyagéihoz nagyon hasonló vagy azokkal 
azonos tulajdonságokkal kell rendelkezniük. Erre a célra lehet őség szerint 
a vizsgált anyagok izotóppal jelölt (stabil) (például deutériumos vagy C  13 
izotóppal jelölt) analógjait kell használni. Amennyiben jelölt stabil izotópok 
– azaz C  13 vagy H  2 – használatára nincs lehet őség, a szakirodalomban 
közzétett megbízható adatok alapján igazolni kell, hogy a helyettesít ő stan­
dard fizikai és kémiai tulajdonságai nagyon hasonlóak a vizsgált anyagéihoz. 
A vizes fázis folyadék-folyadék extrakciója során emulziók képz ődhetnek. 
Ez csökkenthet ő, ha sót adunk a mintához, és hagyjuk az emulziót egy 
éjszakán át ülepedni. A minták extrahálására és betöményítésére alkalmazott módszereket jegyz őkönyvezni kell.
 
30. Az 1-oktanolos fázisból nyert minták elemzés el őtt megfelel ő oldószerrel 
szükség szerint hígíthatók. Ezen túlmen ően javasolt a helyettesít ő stan­
dardok visszanyeréssel való korrekció érdekében történ ő alkalmazása az 
olyan anyagok esetén, amelyeknél a visszanyerési kísérletek tekintetében nagymérték ű variáció (10 %-nál nagyobb relatív szórás) volt tapasztalható.
 
31. Az analitikai módszer részleteit jegyz őkönyvezni kell. Ebbe beleértend ő az 
extrakciós módszer, a betöményítési és hígítási tényez ő, a műszerek para ­
méterei, a kalibrálási eljárás, a kalibrálási tartomány, a vizsgált anyag vízb ől 
való analitikai visszanyerése, helyettesít ő standardok visszanyeréssel való 
korrekció céljából történ ő alkalmazása, a vakminták értékei, kimutatási 
határok és mennyiségi meghatározási határértékek.  
A vizsgálat végrehajtása  
Optimális 1-oktanol/víz térfogatarányok  
32. A víz és az 1-oktanol térfogatának kiválasztásakor figyelembe kell venni az 
1-oktanolra és vízre vonatkozó LOQ-t, a vizes mintákra alkalmazott betö ­
ményítési tényez őket, az 1-oktanolból és vízb ől vett minták térfogatát, vala ­
mint a várt koncentrációkat. A lassú keveréses rendszerben alkalmazott 1- 
oktanol térfogatát a kísérlettel összefügg ő okokból úgy kell kiválasztani, 
hogy az 1-oktanol-réteg kell ően vastag (> 0,5 cm) legyen ahhoz, hogy az 
1-oktanolos fázisból annak felkavarása nélkül lehessen mintát venni.  
33. A 4,5 vagy annál nagyobb log P  OW értékű vegyületek meghatározásához 
jellemzően használt fázisarány 20–50 ml 1-oktanol és 950–980 ml víz 1 
literes edényben.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Vizsgálati körülmények  
34. A vizsgálat során a reakcióedényt termosztáttal szabályozzuk, hogy a 
hőmérséklet-ingadozás 1 °C alá csökkenjen. A vizsgálatot 25 °C-on kell 
elvégezni.  
35. A kísérleti rendszert vagy a kísérlet sötétkamrában való elvégzésével, vagy a 
reakcióedény alufóliával való bevonásával védeni kell a napfényt ől. 
36. A kísérletet (a lehet őségekhez mérten) pormentes környezetben kell elvé ­
gezni.  
37. Az 1-oktanol–víz rendszert az egyensúlyi állapot létrejöttéig keverjük. Egy 
lassú keveréses kísérletet, valamint a vízb ől és az 1-oktanolból történ ő, 
rendszeres id őközönkénti mintavételt magában foglaló el őkísérlettel mérjük 
fel az egyensúlyba hozatalhoz szükséges id őt. A mintavételi id őpontok 
között legalább öt órának kell eltelnie.  
38. Minden egyes P  OW -meghatározást legalább három, egymástól független 
lassú keveréses kísérlettel kell elvégezni.  
Az egyensúlyba hozatali id ő meghatározása  
39. Abból kell kiindulni, hogy az egyensúlyi állapot akkor jön létre, amikor az 
1-oktanol/víz koncentrációs arány id ő függvényében meghatározott regresz ­
sziójának négy megfigyelési id őpontot magában foglaló id őtartam alatti 
meredeksége 0,05 érték ű p-szint mellett nem tér el szignifikáns mértékben 
a nullától. A mintavétel megkezdése el őtti minimális egyensúlyba hozatali 
idő egy nap. Általános szabályként az 5-nél kisebb becsült log P  OW értékű 
anyagok mintavételezése a második és a harmadik napon végezhet ő. Vízta­
szítóbb vegyületek esetén az egyensúlyba hozatalhoz hosszabb id őre lehet 
szükség. Egy 8,23-nál nagyobb log P  OW értékű vegyület (dekaklór-bifenil) 
esetén 144 óra elegend őnek bizonyult az egyensúlyi állapot kialakulásához. 
Az egyensúly értékelése egyetlen edényb ől végzett ismételt mintavétellel 
történik.  
A kísérlet megkezdése  
40. A kísérlet kezdetekor a reakcióedényt töltsük meg 1-oktanollal telített vízzel. 
Kellő időt kell hagyni a termosztált h őmérséklet eléréséhez.  
41. A kívánt mennyiség ű (szükséges térfogatnyi, vízzel telített 1-oktanolban 
feloldott) vizsgált anyagot óvatosan töltsük a reakcióedénybe. Ez a kísérlet 
kritikus lépése, ugyanis kerülend ő a két fázis turbulens keveredése. Éppen 
ezért az 1-oktanolos fázist lassan, a kísérleti edény fala mentén, a vízfelü ­
lethez közelr ől kell pipettával csepegtetni. Az anyag ezt követ ően lefolyik az 
üvegfal mentén, és a vizes fázis felett vékony réteget képez. Feltétlenül 
kerülendő az 1-oktanol közvetlenül a lombikba történ ő átöntése; az 1-okta ­
nol-cseppek nem hullhatnak közvetlenül a vízbe.  
42. A keverés megkezdését követ ően a keverési sebességet lassan növelni kell. 
Ha a kever őmotorok nem állíthatók be megfelel ően, transzformátor alkal ­
mazását kell megfontolni. A keverési sebességet úgy kell beállítani, hogy a 
víz és az 1-oktanol határfelületénél 0,5 és legfeljebb 2,5 cm közötti mély ­
ségű örvény alakuljon ki. Ha az örvény mélysége meghaladja a 2,5 cm-t, a 
keverési sebességet csökkenteni kell, máskülönben az 1-oktanol-cseppekb ől 
mikrocseppek képz ődhetnek a vizes fázisban, ami a vizsgált anyag vízben 
oldott koncentrációjának túlbecsléséhez vezet. A 2,5 cm mélység ű örvényt 
eredményez ő keverési sebesség a validációs körvizsgálati tanulmány (5) 
eredményei alapján ajánlott. Ez a sebesség kompromisszumot jelent az 
egyensúlyi állapot gyors elérése és az 1-oktanol-mikrocseppek keletkezé ­
sének korlátozása között.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Mintavétel és a minták kezelése  
43. A kever őt a mintavétel el őtt ki kell kapcsolni, és meg kell várni, amíg a 
folyadékok mozgása megáll. A mintavétel befejeztével a kever őt alacsony 
sebességen, a fent leírtaknak megfelel ően indítsuk újra, majd a keverési 
sebességet fokozatosan növeljük.  
44. A vizes fázisból való mintavétel a reakcióedény alján található üvegcsapon 
keresztül történik. A csapok holttérfogatából származó vizet (a 2. függe ­
lékben ábrázolt edény esetén ez körülbelül 5 ml) nem szabad felhasználni. 
A csapokban lév ő víz nem keveredik, így nincs egyensúlyban az elegy 
főtömegével. A vizes minták térfogatát fel kell jegyezni, és ügyelni kell 
arra, hogy a fel nem használt vízben lév ő vizsgált anyagot figyelembe 
vegyük az anyagmérleg meghatározásakor. Az elpárolgással járó veszte ­
ségeket minimalizálni kell azáltal, hogy a vizet óvatosan, a víz–1-oktanol réteg felkavarása nélkül engedjük a választótölcsérbe áramolni.
 
45. Az 1-oktanol mintavételezése kis mennyiség ű (kb. 100 μl) aliquotnak az 1- 
oktanol-rétegb ől 100 mikroliteres színüveg-fém fecskend ővel való felszívá ­
sával történik. Ügyelni kell arra, hogy ne kavarjuk fel a határfelületet. A folyadékminta térfogatát jegyezzük fel. Kis mennyiség ű aliquot elegend ő, 
mivel az 1-oktanol-mintát hígítani fogjuk.
 
46. Kerülend ő a minta szükségtelen átöntése. A minta térfogatát éppen ezért 
gravimetriai módszerrel kell meghatározni. Vízminták esetén ez a vízmin ­
tának a szükséges mennyiség ű oldószert már tartalmazó választótölcsérbe 
való gyűjtésével érhet ő el. 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
47. A jelen vizsgálati módszer szerint a P  OW meghatározása érdekében három 
lassú keveréses kísérletet (három kísérleti egységet) végzünk azonos körül ­
mények között a vizsgált vegyületen. Az egyensúlyi állapot létrejöttének 
igazolására használt regressziónak legalább négy, egymást követ ő időpon­
tokban végzett C  O -/C W -meghatározás eredményein kell alapulnia. Ez lehe ­
tővé teszi az egyes kísérleti egységek révén kapott átlagérték bizonytalan ­
ságának mércéjeként szolgáló szórásnégyzet kiszámítását.  
48. A P  OW az egyes kísérleti egységek révén nyert adatok szórásnégyzetével 
jellemezhet ő. Ezen információk alapján számítjuk ki a P  OW -t az egyes kísér ­
leti egységek eredményeinek súlyozott átlagaként. Ehhez a kísérleti 
egységek eredményei szórásnégyzetének reciprokát használjuk súlyozási 
tényezőként. Ennek eredményeként a nagy (szórásnégyzetként kifejezett) 
változékonyságú, tehát kisebb megbízhatóságú adatok kevésbé befolyásolják 
az eredményt, mint az alacsony szórásnégyzet ű adatok.  
49. Ezzel analóg módon kell kiszámítani a súlyozott szórást. Ez a P  OW -mérés 
ismételhet őségét jellemzi. A kis súlyozott szórás azt jelenti, hogy a P  OW - 
meghatározás egy adott laboratóriumon belüli ismételhet ősége igen magas. 
Az adatok formális statisztikai feldolgozásának menete az alábbiakban 
olvasható.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Az eredmények feldolgozása  
Az egyensúlyi állapot létrejöttének igazolása  
50. Minden egyes mintavételi id őponthoz számítsuk ki a vizsgált anyag 1-okta ­
nolban és vízben oldott koncentrációja hányadosának logaritmusát (log (C  o / 
C w )). A kémiai egyensúly létrejöttét e logaritmus id ő függvényében való 
ábrázolásával igazoljuk. Ha az így kapott görbén legalább négy egymást 
követő időpontot magában foglaló plató figyelhet ő meg, az egyensúlyi 
állapot létrejött, és a vegyület ténylegesen feloldódott az 1-oktanolban. Ellenkező esetben a vizsgálatot addig kell folytatni, amíg a görbe négy 
egymást követ ő időpont között olyan meredekséget nem ad, amely 0,05- 
ös p-szint mellett nem tér el szignifikánsan a 0-tól, ami arra utal, hogy a log 
C
 o /C w független az id őtől. 
A log P  OW kiszámítása  
51. Az adott kísérleti egység log P  OW értékét a log C  o /C w idő függvényében 
ábrázolt görbéje azon része log C  o /C w értékeinek súlyozott átlagaként kell 
kiszámítani, amelynél az egyensúlyi állapot fennállását igazoltuk. A súlyo ­
zott átlagot az adatoknak a szórásnégyzet reciprokával történ ő súlyozásával 
kell kiszámítani annak érdekében, hogy az adatok végeredményre gyakorolt 
hatása fordítottan arányos legyen azok bizonytalanságával.  
A log P  OW átlagértéke  
52. A különböz ő kísérleti egységek log P  OW értékének átlagát az egyes kísérleti 
egységek eredményei átlagának az azokhoz tartozó szórásnégyzettel való súlyozásával kell kiszámítani.
 
A számítás a következ őképpen történik:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
ahol 
log P  OW,i = az i-edik önálló kísérleti egység log P  OW értéke,  
log P  OW,Av  = az egyes log P  OW -meghatározások súlyozott átlagértéke,  
w i = az i-edik kísérleti egység log P  OW értékéhez rendelt statisz ­
tikai súlyozási faktor.  
A log P  OW,i szórásnégyzetének reciprokát használjuk w  i -ként 
(w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ) 
53. A log P  OW átlagának hibáját az egyes kísérleti egységekben az egyensúlyi 
fázis során meghatározott log C  o /C w ismételhet őségeként becsüljük meg. Ezt 
az értéket a log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ) súlyozott szórásaként fejezik ki, amely 
pedig a log P  OW,Av  értékhez kapcsolódó hiba mértéke. A súlyozott szórás a 
súlyozott szórásnégyzetb ől (var  log Pow,Av  ) a következ őképpen számítható ki:  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Az n a kísérleti egységek számát jelöli.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
54. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyag:  
— közhasználatú név, kémiai elnevezés, CAS-szám, szerkezeti képlet 
(radioaktívan jelölt anyag használata esetén a jelölés pozíciójának feltün ­
tetésével), valamint a vonatkozó fizikai és kémiai tulajdonságok (lásd a 
17. bekezdést),  
— a vizsgált anyag tisztasága (szennyez ődései),  
— a jelölt vegyi anyagok jelöl őanyagának tisztasága és moláris aktivitása 
(ha szükséges),  
— a log P  ow előzetes becslése, valamint ezen érték levezetésének módszere.  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgálatok elvégzésének id őpontja,  
— kísérleti h őmérséklet,  
— az 1-oktanol és a víz térfogata a vizsgálat kezdetekor,  
— a kivett 1-oktanol- és vízminták térfogata,  
— a reakcióedényekben hátramaradó 1-oktanol és víz térfogata,  
— a reakcióedény és a keverési körülmények leírása (a kever őrúd és a 
reakcióedény geometriai jellemz ői, az örvény magassága mm-ben, vala ­
mint adott esetben a keverési sebesség),  
— a vizsgált anyag meghatározásához használt analitikai módszerek és a 
mennyiségi meghatározás módszerspecifikus határértéke,  
— mintavételi id őpontok,  
— a vizes fázis pH-ja és a felhasznált pufferek, ha a pH-t ionizálható 
molekulák miatt be kellett állítani,  
— a párhuzamos mérések száma.  
Eredmények:  
— az alkalmazott analitikai módszerek ismételhet ősége és érzékenysége,  
— a vizsgált anyag 1-oktanolban és vízben meghatározott koncentrációja az 
idő függvényében,  
— az anyagmérleg bemutatása,  
— hőmérséklet és annak szórása, vagy a kísérlet során fennálló h őmérsék­
leti tartomány,  
— a koncentrációarány regressziója az id ő függvényében,  
— a log P  ow,Av  átlagértéke és annak standard hibája,  
— az eredmények szöveges értékelése és értelmezése,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— példák a reprezentatív elemzés alapadataira (az összes alapadatot a 
helyes laboratóriumi gyakorlat [GLP] szabályainak megfelel ően kell 
tárolni), beleértve a helyettesít ő standardok visszanyerését, valamint a 
kalibráláshoz használt szintek számát (a kalibrációs görbe korrelációs együtthatójára vonatkozó kritériumokkal együtt), továbbá a min őségbiz­
tosítás/min őség-ellenőrzés (QA/QC) eredményeit,
 
— amennyiben rendelkezésre áll: a vizsgálati eljárás validációs jelentése (a 
hivatkozások között feltüntetend ő). 
SZAKIRODALOM  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
 
(2) E melléklet A.8., Megoszlási hányados cím ű fejezete.  
(3) E melléklet A.8., Megoszlási hányados cím ű fejezete.  
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
(10) E melléklet A.6., Oldhatóság vízben cím ű fejezete.  
(11) E melléklet C.7., Lebomlás – abiotikus lebomlás: hidrolízis a pH függ ­
vényében cím ű fejezete.  
(12) E melléklet C.4., A „gyors” biológiai lebonthatóság meghatározása cím ű 
fejezetének II–VII. része (A–F. módszer).  
(13) E melléklet A.4., G őznyomás cím ű fejezete.  
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623-626.  
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479-488.  
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen 
Chemie : 386-390.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
1. függelék  
Táblázat a különböz ő LOG P  OW értékű vizsgált anyagok vizes fázisban való 
kimutatásához szükséges legkisebb víztérfogatok kiszámításához  
Feltételezések:  
— Az egyes aliquotok maximális térfogata = a teljes térfogat 10 %-a; 5 aliquot 
= a teljes térfogat 50 %-a.  
— A vizsgált anyagok koncentrációja  ¼ 0; 7 Ü oldhatóság bármelyik fázisban. 
Alacsonyabb koncentráció esetén nagyobb térfogat szükséges.  
— Az LOD meghatározásához használt térfogat = 100 ml.  
— A log P  ow –log S  w és log P  ow –SR (S  oct /S w ) görbékkel a vizsgált anyagokra 
vonatkozó összefüggések elfogadhatóan megjeleníthet ők. 
Az S  w becslése  
log P  ow Egyenlet log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Az S  oct becslése  
log P  ow Egyenlet S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Vizsgált anyag 
összes tömege 
(mg) Tömeg  okt /tömeg  víz Tömeg  H2O 
(mg) Konc.  H2O 
(mg/l) Tömeg  okt 
(mg) Konc.  okt 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
A térfogatok kiszámítása  
A H  2 O fázis egyes LOD-koncentrációk mellett szükséges minimális térfogata  
log K  ow LOD (mikrogramm/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
LOD-hez hasz ­
nált térfogat (l) 0,1 
Jelmagyarázat a számításokhoz  
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 1 literes reakcióedényben.  
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 2 literes reakcióedényben.  
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 5 literes reakcióedényben.  
A vizes fázis teljes térfogatának < 10 %-a 10 literes reakcióedényben.  
A 10 literes reakcióedény 10 %-ánál is nagyobb.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
A vízoldékonyság és a log P  ow függvényében meghatározott szükséges térfogatok áttekintése  
A H  2 O fázis egyes LOD-koncentrációk mellett szükséges minimális térfogata (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramm/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogramm/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
LOD-hez használt térfogat 
(l) 0,1 
2. függelék  
Példa egy kett ősfalú üveg reakcióedényre a P  OW meghatározására szolgáló 
lassú keveréses kísérlethez
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
B. RÉSZ: MÓDSZEREK A TOXICITÁS ÉS EGYÉB EGÉSZSÉGÜGYI 
HATÁSOK MEGHATÁROZÁSÁRA  
TARTALOMJEGYZÉK 
ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS 
B.1a. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – RÖGZÍTETT DÓZISÚ 
ELJÁRÁS 
B.1b. AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY 
MÓDSZER 
B.2. AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS B.3. AKUT TOXICITÁS (DERMÁLIS) 
B.4. AKUT TOXICITÁS: B ŐRIRRITÁCIÓ/B ŐRKORRÓZIÓS 
HATÁS 
B.5. AKUT TOXICITÁS: SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓS 
HATÁS 
B.6. A B ŐR ÉRZÉKENNYÉ TÉTELE 
B.7. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ, 28 NAPOS ORÁLIS TOXICITÁSI 
VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON 
B.8. SZUBAKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 28 NAPOS VIZS ­
GÁLAT 
B.9. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁS 
(DERMÁLIS) 
B.10. MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK  
IN VITRO  VIZSGÁLATA EML ŐSÖKÖN 
B.11. MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK  
IN VIVO  VIZSGÁLATA EML ŐSÖKÖN 
B.12. MUTAGENITÁS –  IN VIVO  EMLŐS ERITROCITA MIKRO ­
NUKLEUSZ VIZSGÁLAT 
B.13/14. MUTAGENITÁS: REVERZ MUTAGENITÁSI VIZSGÁLAT 
BAKTÉRIUMOKKAL 
B.15. MUTAGENITÁSVIZSGÁLAT ÉS A RÁKKELT Ő HATÁS 
SZŰRÉSE GÉNMUTÁCIÓ VIZSGÁLATA  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE -BEN 
B.16. MITOTIKUS REKOMBINÁCIÓ-VIZSGÁLAT  SACHA ­
ROMYCES CEREVISIAE - BEN 
B.17. MUTAGENITÁS –  IN VITRO  GÉNMUTÁCIÓ VIZSGÁLAT 
EMLŐSSEJTEKEN 
B.18. DNS-KÁROSODÁS ÉS -REPARÁCIÓ – NEM TERVEZETT 
DNS-SZINTÉZIS (UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS, UDS) – EMLŐSSEJTEK  IN VITRO  
B.19.  IN VITRO  EMLŐSSEJTTESTVÉR-KROMATIDKICSERÉ ­
LŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE, 
SCE) VIZSGÁLAT 
B.20. NEMHEZ KÖTÖTT RECESSZÍV LETÁLIS VIZSGÁLAT  
DROSOPHILA MELANOGASTERBEN
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21.  IN VITRO  EML ŐSSEJT-TRANSZFORMÁCIÓS VIZS ­
GÁLATOK 
B.22. DOMINÁNS LETÁLIS VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON 
B.23. EML ŐS SPERMIOGONIÁLIS KROMOSZÓMA-RENDELLE ­
NESSÉG VIZSGÁLAT 
B.24. EGÉRFOLT- (SPOT) TESZT 
B.25. EGÉREN VÉGZETT ÖRÖKLETES TRANSZLOKÁCIÓS VIZS ­
GÁLAT 
B.26. SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, 
RÁGCSÁLÓKON VÉGZETT 90 NAPOS, ISMÉTELT ADAGO ­
LÁSÚ ORÁLISTOXICITÁS-VIZSGÁLAT 
B.27. SZUBKRÓNIKUSORÁLIS-TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, 90 
NAPOS, ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ ORÁLISTOXICITÁSI VIZSGÁLAT NEM RÁGCSÁLÓKON 
B.28. SZUBKRÓNIKUS DERMÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT 90 
NAPOS, ISMÉTELT DERMÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓFAJOKON 
B.29. SZUBKRÓNIKUS INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 90 NAPOS 
VIZSGÁLAT 
B.30. KRÓNIKUS TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK 
B.31. PRENATÁLIS FEJL ŐDÉSI TOXICITÁSVIZSGÁLAT 
B.32. A RÁKKELT Ő HATÁS VIZSGÁLATA 
B.33. A KRÓNIKUS TOXICITÁS ÉS A RÁKKELT Ő HATÁS 
EGYÜTTES VIZSGÁLATA 
B.34. EGYGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZS ­
GÁLAT 
B.35. KÉTGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZS ­
GÁLAT 
B.36. TOXIKOKINETIKAI VIZSGÁLAT 
B.37. SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT AKUT 
KÉSLELTETETT NEUROTOXICITÁS 
B.38. SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT 
KÉSLELTETETT NEUROTOXOCITÁS-VIZSGÁLAT, 28 
NAPOS ISMÉTELT ADAGOLÁS ESETÉN 
B.39. NEM ÜTEMEZETT DNS-SZINTÉZIS (UDS)  IN 
VIVO  VIZSGÁLAT EML ŐS MÁJSEJTEKKEL 
B.40.  IN VITRO  BŐRKORRÓZIÓ: TRANSZKUTÁN ELEKTROMOS 
REZISZTENCIA VIZSGÁLAT (TER) 
B.40 A.  IN VITRO  BŐRKORRÓZIÓ: EMBERI B ŐRMODELLEN 
VÉGZETT VIZSGÁLAT
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOXICITÁS-VIZSGÁLAT 
B.42. B ŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER 
B.43. NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKBAN 
B.44. B ŐRÖN ÁT TÖRTÉN Ő FELSZÍVÓDÁS:  IN VIVO  MÓDSZER 
B.45. B ŐRÖN ÁT TÖRTÉN Ő FELSZÍVÓDÁS:  IN VITRO  MÓDSZER 
B.46.  IN VITRO  BŐRIRRITÁCIÓ: REKONSTRUÁLT EMBERI 
FELHÁMON VÉGZETT VIZSGÁLATI MÓDSZER 
B.47. SZARVASMARHA-SZARUHÁRTYA OPACITÁSÁNAK ÉS 
PERMEABILITÁSÁNAK MÉRÉSÉN ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZER A SZEMKORRÓZIÓT ÉS A SÚLYOS SZEMIRRI ­
TÁCIÓT OKOZÓ ANYAGOK AZONOSÍTÁSÁRA 
B.48. IZOLÁLT CSIRKESZEM VIZSGÁLATÁN ALAPULÓ VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER A SZEMKORRÓZIÓT ÉS A SÚLYOS 
SZEMIRRITÁCIÓT OKOZÓ ANYAGOK AZONOSÍTÁSÁRA 
B.49.  IN VITRO  CELLULÁRIS MIKRONUKLEUSZ-VIZSGÁLAT 
EMLŐSÖKÖN 
B.50. B ŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER (LLNA): DA 
B.51. B ŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER (LLNA): BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS 
OSZTÁLY MÓDSZER  
▼M5 
B.53. FEJL ŐDÉSI NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT 
B.54. UTEROTROFIKUS BIOLÓGIAI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓK ­
BAN: GYORS SZ ŰRŐVIZSGÁLAT AZ ÖSZTROGÉNSZER Ű 
TULAJDONSÁGOK KIMUTATÁSÁRA 
B.55. HERSHBERGER BIOASSAY PATKÁNYOKBAN: GYORS 
SZŰRŐVIZSGÁLAT AZ (ANTI)ANDROGÉN TULAJDON ­
SÁGOK KIMUTATÁSÁRA 
B.56. KIB ŐVÍTETT EGYGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICI ­
TÁSI VIZSGÁLAT 
B.57. H295R SZTEROIDOGENEZIS-VIZSGÁLAT 
B.58. TRANSZGENIKUS RÁGCSÁLÓ SZOMATIKUS ÉS CSÍRA ­
SEJT GÉNMUTÁCIÓS VIZSGÁLATOK  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS  
A. A VIZSGÁLT ANYAG JELLEMZÉSE  
A vizsgált anyag összetételét – beleértve a f őbb szennyez ő anyagokat 
és a lényeges fizikaikémiai tulajdonságait, ill. az anyag stabilitását – 
a toxicitás-vizsgálat megkezdése el őtt ismerni kell.  
A vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságai dönt ő fontosságúak az 
adagolási mód kiválasztásánál, az egyes vizsgálatok megtervezésénél, a vizsgált anyag kezelésénél és tárolásánál.
 
A vizsgált anyagnak (amennyiben lehetséges, a legfontosabb szeny ­
nyezésekkel együtt) az adagolási közegben és a biológiai anyagban 
történő mennyiségi és min őségi vizsgálatára vonatkozó analitikai 
módszer kifejlesztése megel őzi a vizsgálatok megkezdését.  
Az azonosításra, a fizikai-kémiai tulajdonságok meghatározására, a 
tisztaságra és a vizsgált anyag viselkedésére vonatkozó összes infor ­
mációnak szerepelnie kell a vizsgálati jelentésben.  
B. AZ ÁLLATOK GONDOZÁSA  
A környezeti feltételek szigorú szabályozása és az állatoknak a 
fajnak megfelel ő gondozása nagyon lényeges a toxicitásvizsgála ­
toknál.  
i. Tartási körülmények  
A kísérleti állatok elhelyezésének környezeti körülményit az adott faj 
igényeihez kell igazítani. Patkányok, egerek és tengerimalacok 
számára a megfelel ő körülmények: 22 ± 3  o C szobah őmérséklet, 
30–70 százalékos relatív páratartalom mellett; míg nyulak számára a megfelel ő körülmények: 20 ± 3
 o C hőmérséklet, 30–70 százalékos 
relatív páratartalom.  
Néhány kísérleti eljárás különösen érzékeny a h őmérsékleti hatá ­
sokra, ezekben az esetekben a megfelel ő környezeti körülményekre 
vonatkazó részleteket a vizsgálati módszer leírása tartalmazza. A toxikus hatások kutatása során, a h őmérsékletet és a páratartalmat 
minden esetben figyelni és rögzíteni kell és meg kell adni a vizs ­
gálati jelentésben.
 
A világítás mesterséges, a világos és sötét szakaszok 12 óránként 
váltják egymást. A világításra vonatkozó adatokat feljegyzik és megadják a vizsgálati jelentésben.
 
Hacsak a módszer leírásában más nem szerepel, az állatok egyenként 
tartandók, vagy kis, azonos nem ű egyedekb ől álló csoportokban 
összezárhatók; csoportos tartás esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható.
 
Az állatkísérletekr ől szóló jelentésében fontos megadni az állatok 
ketrecének típusát és az egyes ketrecekben tartott állatok számát, a 
vegyszer hatásának kitett id őszak és az azt követ ő megfigyelés alatt 
egyaránt.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii. Etetési körülmények  
Az alkalmazott tápláléknak meg kell felelnie a vizsgált fajnak 
megfelelő, a táplálkozástudomány által meghatározott követelmé ­
nyeknek. Amikor a vizsgált anyagokat az állatok táplálékában 
adják be, akkor a tápértéket az anyag és a táplálék összetev őinek 
kölcsönhatása csökkentheti. Egy ilyen kölcsönhatás lehet őségét 
figyelembe kell venni a vizsgálat eredményeinek értelmezése során. Hagyományos laboratóriumi táplálás alkalmazható korlátozás nélküli 
ivóvízellátással. A táplálék típusának kiválasztását befolyásolhatja, 
hogy a tápláléknak és a vizsgált anyagnak a megfelel ő keverékét 
kell biztosítani, ha ilyen módon adagolják a vizsgált anyagot.
 
A táplálék olyan szennyezései, amelyekr ől ismert, hogy befolyá ­
solják a toxicitást, nem lehetnek jelen zavaró nagyságú koncentrá ­
cióban.  
C. ALTERNATÍV VIZSGÁLATI MÓDSZEREK  
Az Európai Unió elkötelezett olyan alternatív módszerek kifejlesztése 
és jóváhagyása támogatására, amelyek az ismereteket ugyanolyan szinten biztosítják, mint a jelenlegi állatkísérletek, azonban kevesebb 
állatot használnak fel, kevesebb szenvedést okoznak az állatoknak 
vagy teljesen kiküszöbölik az állatok alkalmazását.
 
Ilyen módszerek alkalmazását (amint elérhet ővé válnak), ahol csak 
lehet, meg kell fontolni, a veszély jellemzésével, az azt követ ő osztá­
lyozással, címkézéssel és az anyag bels ő tulajdonságaiból adódó 
veszély jelölésével kapcsolatos eljárásokban.  
D. KIÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
A vizsgálatok kiértékelésekor és értelmezésekor figyelembe kell 
venni azt, hogy az állati és az  in vitro  vizsgálatok eredményét milyen 
mértékben lehet közvetlenül kiterjeszteni az emberre, és ezért az emberre káros hatás bizonyítékait, ahol rendelkezésre állnak, fel 
lehet használni a vizsgálati eredmények meger ősítésére.
 
E. SZAKIRODALOM  
Ezeknek a módszereknek a többségét a Vizsgálati irányelvek elne ­
vezésű OECD-program keretében fejlesztették ki, és azokat a 
Helyes Laboratóriumi Gyakorlat alapelveivel összhangban kell alkalmazni, az „adatok kölcsönös elfogadásának” széles kör ű bizto­
sítása érdekében.
 
További tájékoztatás található az OECD-irányelvekben megadott 
szakirodalom jegyzékekben, illetve az egyéb helyeken kiadott vonat ­
kozó irodalomban.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1a.  AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – RÖGZÍTETT DÓZISÚ ELJÁRÁS  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 420 (2001) 
módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az akut toxicitás megállapítására szolgáló hagyományos módszerek 
esetében a vizsgálat végpontját az állatok elpusztulása jelenti. A Brit 
Toxikológiai Társaság 1984-ben új megközelítést javasolt az akut 
toxicitás vizsgálatára, amely egy sor rögzített nagyságú dózis beadásán alapul (1). Ennél a megközelítésnél nem az állatok elpusz ­
tulása jelenti a vizsgálat végpontját, hanem a rögzített nagyságú 
dózisok valamelyikénél megfigyelt egyértelm ű mérgezési tünetekre 
támaszkodtak. Az Egyesült Királyságban (2) és nemzetközileg (3) végzett  in vivo  validálási vizsgálatok után az eljárást 1992-ben 
hagyták jóvá mint vizsgálati módszert. Ezt követ ően egy vizsgálati 
sorozat (4)(5)(6) keretében matematikai modellek segítségével 
megvizsgálták a rögzített dózisú eljárás statisztikai tulajdonságait. Az in vivo  és a modellvizsgálatok együttesen igazolták, hogy az 
eljárás reprodukálható, kevesebb kísérleti állatra van szükség hozzá, 
és kevesebb szenvedést okoz, mint a hagyományos módszerek, 
továbbá hasonló módon képes min ősíteni az anyagokat, mint az 
egyéb akut toxicitási vizsgálati módszerek.
 
Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelel őbb vizsgálati 
módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (7) 
található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is 
tartalmaz az 1Ba. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezé ­
sével kapcsolatosan.  
A módszer egyik alapelve, hogy a f ő vizsgálatban csak közepesen 
toxikus dózisokat alkalmaznak, és hogy kerülni kell az olyan dózisok alkalmazását, amelyek várhatóan letálisak. Nincs szükség továbbá 
olyan dózisok alkalmazására sem, amelyek korróziós vagy súlyosan 
irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullás közelében lév ő állatokat vagy azokat, amelyek nyilván ­
valóan fájdalmakkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás 
jeleit mutatják, humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy 
kell figyelembe venni őket a vizsgálati eredmények értelmezésekor, 
mint azokat az állatokat, amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli elhullás felismerését segít ő iránymutatás, 
valamint az elhullás közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok 
exterminálására vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmuta ­
tóban (8) találhatók.
 
A módszer adatokat szolgáltat az anyag veszélyes tulajdonságairól és 
lehetővé teszi, hogy az anyagot az akut toxicitást okozó anyagok 
besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (Globally 
Harmonised System, GHS) szerint min ősítsék és sorolják be (9).  
A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgálandó 
anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figye ­
lembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal 
elvégzett  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálat eredményei; szer ­
kezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai és az anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggy őződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az 
emberi egészség védelme szempontjából, és el ősegíti majd a 
megfelelő kezdődózis kiválasztását.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Akut orális toxicitás:  a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán 
belül többszöri dózisának szájon át történ ő beadását követ ően jelent­
kező káros hatások.  
Késleltetett elhullás:  egy állat 48 órán belül nem hull el, illetve nem 
tűnik elhullásközeli állapotban lév őnek, de kés őbb, a 14 napos 
megfigyelési id őszak során elpusztul.  
Dózis:  a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizs ­
gálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (pl. mg/kg) fejezik ki.
 
Nyilvánvaló toxicitás:  a vizsgálandó anyag beadását követ ően jól 
látható mérgezési tüneteket leíró általános kifejezés (a példákat lásd a (3) hivatkozásban), amelynél a következ ő legmagasabb rögzített 
dózis esetében a legtöbb állatnál súlyos fájdalom vagy súlyos 
szorongás tartós jelei, elhullásközeli állapot (az ezzel kapcsolatos kritériumok a Humane Endpoints Guidance Documentben (8) szere ­
pelnek), vagy valószín ű elhullás várható.
 
GHS:  Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anya ­
gokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), 
az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakért ői Bizottsága 
(fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek közötti program a vegyi anyagok helyes kezelésére (Interorganisation Prog ­
ramme of the Sound Management of Chemicals, IOMC) koordinál.
 
Közeli elhullás:  amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés 
időpontja el őtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás 
várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az oldalhelyzet, a fekv őhelyzet és a remegés. (A további részleteket lásd 
a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).
 
LD 50 : (közepes letális dózis): a vizsgálandó anyag statisztikailag 
levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 
50 %-ának elhullását okozza. Az LD  50 -értéket a vizsgálandó 
anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében (mg/kg) fejezik ki.
 
Határdózis:  egy, a vizsgálhatóság fels ő határánál lév ő dózis (2 000 
vagy 5 000 mg/kg).  
Elhullásközeli állapot:  az esetleges kezelés ellenére is az elhullás 
közelében lév ő állapot vagy túlélésre való képtelenség. (A további 
részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).  
Megjósolható elhullás:  a kísérlet tervezett vége el őtt, a jövőben egy 
ismert id őpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, 
például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. (A további 
részleteket lásd Humane Endpoints Guidance Documentben (8)).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Azonos ivarba tartozó állatok csoportjainak egy lépcs őzetes eljárás 
során 5, 50, 300 és 2 000 mg/kg-os rögzített dózisok alkalmazásával kell beadni a vizsgálandó anyagot (kivételes esetben egy további, 
5 000 mg/kg-os rögzített dózis is alkalmazható; lásd az 1.6.2. 
szakaszt). A kiindulási dózist a dózisbehatároló vizsgálat alapján kell megválasztani úgy, hogy az várhatóan mérgezési tüneteket ered ­
ményezzen, de ne okozzon súlyos mérgezést vagy elhullást. A fájda ­
lomhoz, szenvedéshez és közeli elhulláshoz társuló klinikai tüneteket 
és állapotot részletesen egy külön OECD Útmutató (8) ismerteti. A mérgezési tünetek megjelenését ől vagy az elhullás bekövetkeztét ől 
vagy ezek elmaradásától függ ően további állatcsoportok is kezel ­
hetők magasabb vagy alacsonyabb rögzített dózissal. Az eljárást 
folytatni kell, amíg meg nem találják azt a dózist, amely nyilvánvaló toxicitást vagy legfeljebb egy elhullást okoz, vagy ha a legmagasabb 
dózisnál nem figyelnek meg semmilyen hatást, vagy ha a legalacso ­
nyabb dózisnál elhullanak állatok.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.4.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmaz ­
hatók. Általában n őstényeket használnak (7). Ennek az az oka, hogy 
a hagyományos LD  50 -vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekin ­
tése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhet ő különbség, 
a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (10). Azonban ha a 
szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzé ­
kenysége valószín űsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfele ­
lően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.
 
Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, 
fiatal feln őtt állatokat kell alkalmazni. Olyan n őstényeket kell válasz ­
tani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az 
adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.
 
1.4.2.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
A kísérleti állatokat 22  o C (± 3  o C) hőmérséklet ű helyiségben kell 
tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja 
meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A 
világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét peri ­
ódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takar ­
mány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. 
Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az 
egy ketrecben lév ő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az 
ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.
 
1.4.3.  Az állatok el őkészítése  
Az állatokat véletlenszer űen kell kiválasztani, majd egyedi azonosí ­
tóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése el őtt legalább 5 napig a 
ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laborató ­
riumi körülményekhez.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon 
belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény koncentrációját változtatják. Azonban ha folyékony végterméket 
vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követ ő kockázatértékelés 
szempontjából megfelel őbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítat ­
lanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes szabá ­
lyozó hatóságok ezt írják el ő. A maximálisan beadható dózistérfo ­
gatot azonban egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre 
maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretét ől függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem 
haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt: vizes oldatok 
esetében azonban 2 ml/100 g testtömegarány is megfontolható. A dóziskészítmény formulázásakor – ahol lehet – a vizes oldatok/ ­
szuszpenziók/emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos 
(pl. kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, 
és harmadsorban esetlegesen más viv őanyagokban elkészített olda ­
tok. A vízt ől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a viv őanyag 
toxikológiai tulajdonságait. A dózisokat a beadás el őtt rövid id ővel 
kell elkészíteni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készít ­
mény stabilitása az alkalmazás id őtartama alatt.
 
1.5. ELJÁRÁS  
1.5.1.  A dózisok beadása  
A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy 
megfelelő intubációs kanülön át történ ő táplálással kell beadni. 
Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkal ­
mazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó id őtartam alatt kisebb 
részletekben is beadható.  
A kezelés el őtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy 
éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A 
koplaltatási id őszakot követ ően meg kell mérni az állatok testtöme ­
gét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni -patkány esetében 3–4 órára, egér 
esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás 
időtartamától függ ően menet közben szükség lehet arra, hogy az 
állatoknak táplálékot és vizet adjanak.
 
1.5.2.  Dózisbehatároló vizsgálat  
A dózisbehatároló vizsgálat célja, hogy ki lehessen választani a 
megfelelő kezdődózist a f ő vizsgálathoz. A vizsgálandó anyagot az 
1. függelékben bemutatott folyamatábra szerint egymás után kell 
beadni egy-egy állatnak. A dózisbehatároló vizsgálat akkor fejez ődik 
be, amikor meghozható a döntés a f ő vizsgálatban alkalmazandó 
kezdődózisról (vagy ha a legalacsonyabb rögzített dózisnál elhullás 
történik).  
A dózisbehatároló vizsgálatban a kezd ődózist a következ ő rögzített 
dózisok közül választják ki: 5, 50, 300 és 2 000 mg/kg aszerint, hogy 
a lehetőleg ugyanezzel az anyaggal vagy szerkezetileg rokon anya ­
gokkal kapott  in vivo  vagy  in vitro  adatok alapján várhatóan melyik 
eredményez nyilvánvaló toxicitást. Ilyen információk hiányában a 
kezdődózist 300 mg/kg-ban kell megállapítani.  
Az egyes állatok kezelése között legalább 24 órának el kell telnie. 
Minden állatot legalább 14 napig megfigyelés alatt kell tartani.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét jogszabályi köve ­
telmény indokolja, megfontolás tárgyává lehet tenni egy további, 
5 000 mg/kg-os fels ő rögzített dózis alkalmazását (lásd a 3. függe ­
léket). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2 000–5 000 mg/kg tartomány) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, 
és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószí ­
nűsége, hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelen őséggel 
bírnak az emberi vagy állati egészség, illetve a környezet védelme szempontjából.
 
Olyan esetekben, amikor a dózisbehatároló vizsgálatban a legalacso ­
nyabb rögzített dózissal (5 mg/kg) kezelt állat elhullik, az általános 
eljárás szerint be kell fejezni a vizsgálatot és az anyagot a GHS 1. 
kategóriába kell besorolni (ahogyan az az 1. függelékben látható). Ha azonban szükség van a besorolás további meger ősítésére, az alábbiak 
szerinti opcionális kiegészít ő eljárás alkalmazható. Egy második 
állatnak is beadjuk az 5 mg/kg-os dózist. Ha ez is elhullik, akkor 
az megerősíti a GHS 1. kategóriába való besorolást, és a vizsgálatot 
azonnal be kell fejezni. Ha a második állat életben marad, akkor legfeljebb három további állaton kell elvégezni az 5 mg/kg-os 
dózissal történ ő vizsgálatot. Mivel nagy az elhullás kockázata, az 
állatok kímélete érdekében egymás után kell őket kezelni. Az 
egyes állatok kezelése között eltelt id őt úgy kell megválasztani, 
hogy elegend ő legyen annak megállapítására, hogy az el őzőleg kezelt 
állat valószín űleg életben marad. Ha egy második állat is elhullik, 
azonnal be kell fejezni a kezeléseket, és több állatnak már nem szabad beadni az anyagot. Mivel a második elhullás bekövetkezte miatt (függetlenül attól, hogy a vizsgálatok befejezéséig hány állatot 
kezeltek) az „A” eredményhez jutnak (legalább 2 elhulláseset), a 2. 
függelék 5 mg/kg-os rögzített dózisánál érvényes besorolási szabályt kell követni (ha legalább 2 elhullás történt, akkor 1. kategória, ha legfeljebb 1 elhullás történt, akkor 2. kategória). A 4. függelékben 
pedig azzal kapcsolatos útmutatást tartalmaz, hogy az új GHS beve ­
zetéséig az anyagokat hogyan kell az EU-rendszer szerinti kategóri ­
ákba besorolni.
 
1.5.3.  Fő vizsgálat  
1.5.3.1.  Az állatok száma és a dózisok  
A kezdődózissal történ ő vizsgálat utáni teend őket a 2. függelékben 
található folyamatábra mutatja. Három lehetséges alternatíva létezik: vagy le kell állítani a vizsgálatot, és be kell sorolni az anyagot a 
megfelelő veszélyességi kategóriába, vagy magasabb rögzített 
dózissal kell folytatni a vizsgálatot, vagy alacsonyabb rögzített dózis ­
sal. Az állatok védelme érdekében azonban a f ő vizsgálatban már 
nem szabad olyan dózissal kísérletezni, amely a dózisbehatároló 
vizsgálatban elhullást okozott (lásd a 2. függeléket). A tapasztalatok 
azt mutatják, hogy a kezd ődózissal végzett vizsgálatok legvalószí ­
nűbb eredménye, hogy az anyagot be lehet valamilyen kategóriába 
sorolni és nincs szükség további vizsgálatokra.
 
Általában összesen öt-öt, azonos ivarú állatnak kell beadni az egyes 
vizsgált dózisokat. Ebb ől az öt állatból egyet a dózisbehatároló vizs ­
gálat során kezelnek az adott dózissal, és ehhez járul a további négy 
állat (kivéve abban a szokatlan esetben, ha a f ő vizsgálatban használt 
dózist nem alkalmazták a dózisbehatároló vizsgálatban).  
Az egyes dózisok vizsgálata közötti id őtartamot a mérgezési tünetek 
megjelenésének id őpontja, id őtartama és súlyossága határozza meg. 
Az állatok következ ő dózissal történ ő kezelését nem szabad megkez ­
deni mindaddig, amíg meg nem bizonyosodtak arról, hogy az 
előzőleg kezelt állatok életben maradnak. Szükség esetén ajánlott 
ez egyes dózisokkal való kezelések között 3 vagy 4 napos szünetet tartani, hogy meg lehessen figyelni a késleltetett toxicitást. Ennek 
időtartama szükség esetén – pl. nem meggy őző válasz esetében 
–módosítható.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Ha egy fels ő, 5 000 mg/kg-os dózis alkalmazást is tervbe vesznek, a 
3. függelékben vázolt eljárást kell követni (lásd még az 1.6.2. 
szakaszt).  
1.5.3.2.  Határérték-vizsgálat  
Határérték-vizsgálatot els ősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha 
a kísérletet végz őnek olyan információi vannak, amelyek szerint a 
vizsgálandó anyag valószín űleg nem toxikus, azaz csak a hatósági 
határértékdózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhet ő információ, figyelembe véve a toxikológiai 
szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. 
Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos infor ­
máció, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó 
anyag várhatóan toxikus, a f ő vizsgálatot kell elvégezni.
 
Ezen iránymutatás céljára határérték-vizsgálatként a normál eljárás 
alkalmazásával történ ő, 2 000 mg/kg-os (vagy kivételes esetben 
5 000 mg/kg-os) kezd ődózissal végzett dózisbehatároló vizsgálat, 
majd ezt követ ően további négy állat ugyanezzel a dózissal történ ő 
kezelése szolgál.  
1.6. MEGFIGYELÉSEK  
Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, 
legalább az els ő 30 percben, azután az els ő 24 órában rendszeres 
időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni 
az első 4 órában, majd ezt követ ően naponta, összesen 14 napon át, 
kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálat ­
ból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés id őtartamát azonban nem szabad mereven meghatá ­
rozni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és 
időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén 
meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megsz űnésének id őpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek 
inkább késleltetve jelentkeznek (11). Minden megfigyelést szisztema ­
tikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében 
önálló adatsort vesznek fel.
 
Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szük ­
ség. Meg kell figyelni a b őr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahár ­
tyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a visel ­
kedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, 
görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma el őfordulására 
is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alap ­
elveket és követelményeket is figyelembe kell venni (8). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lév ő állatokat, 
illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit 
mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehet ő legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás 
időpontját is.
 
1.6.1.  Testtömeg  
Röviddel a vizsgálandó anyag beadása el őtt és legalább egy héttel 
utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtö ­
meg-változást ki kell számítani és fel kell jegyezni. A vizsgálat 
végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd 
humánus módon exterminálni kell őket. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Kórbonctani vizsgálat  
Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni 
(azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden állat 
esetében az összes makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegy ­
ezni. A kezd ődózis beadása után legalább 24 óráig túlél ő állatok 
esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos 
információk nyerhet ők.
 
2. ADATOK  
Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett 
az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lév ő 
kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél 
mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak 
vagy humánus módon exterminálásra kerültek, az egyes állatok elhullásának id őpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli lefolyását 
és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek megfelel ő módon a következ ő információkat 
kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulaj ­
donságok (ezen belül az izomerizáció is),  
— azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.  
Vivőanyag (szükség esetén):  
— ha a viv őanyag nem víz, akkor ennek indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj/törzs,  
— az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert,  
— az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben 
annak oka, hogy n őstények helyett miért hímeket alkalmaztak),  
— az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.  
Kísérleti körülmények:  
— a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen 
belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok,  
— a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen 
belül a beadott térfogat és a beadás id őpontja,  
— a táplálék és a víz min ősége (ezen belül a takarmány típusa/ ­
forrása, a víz forrása),  
— a kezd ődózis kiválasztásának indoklása.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Eredmények:  
— a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történ ő 
megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és elhullt állatokra; a hatások jellege, súlyossága és időtartama),
 
— a testtömegadatok és a testtömegváltozások táblázatos formában 
történő megadása,  
— az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt köve ­
tően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás id őpontjá­
ban, 
— a tervezett exterminálás el őtti elhullás napja és ideje,  
— a mérgezési tünetek megjelenése és id őbeli lefolyása, valamint 
esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan,  
— a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok ered ­
ményei minden egyes állatra vonatkozóan.  
Az eredmények diszkussziója és értelmezése.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, 85-92.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of subs ­
tances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, 279-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, 
A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.
 
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 
323. Human Exptl. Toxicol.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statis ­
tical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. 
Toxicol., 21, 183-196.  
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment N. 24. Paris.  
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/ ­
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I. Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33,223-231.
 
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxi ­
city and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxi ­
cology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. 
New York, USA.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
1. FÜGGELÉK  
A DÓZISBEHATÁROLÓ VIZSGÁLAT FOLYAMATÁBRÁJA

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
2. FÜGGELÉK:  
A FŐ VIZSGÁLAT FOLYAMATÁBRÁJA

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
3. FÜGGELÉK  
A VÁRHATÓAN 2 000 MG/KG FELETTI LD  50 -ÉRTÉKKEL 
RENDELKEZ Ő VIZSGÁLANDÓ ANYAGOK VIZSGÁLATOK 
NÉLKÜLI OSZTÁLYOZÁSÁNAK KRITÉRIUMAI  
Az 5. veszélyességi kategória kritériumait úgy állapították meg, hogy lehet ővé 
tegyék azoknak a vizsgálandó anyagoknak a meghatározását, amelyek akut toxi ­
citási kockázata viszonylag alacsony, de bizonyos körülmények között veszélyt jelenthetnek az érzékeny populációkra. Az ilyen anyagok orális vagy dermális LD50-értéke várhatóan 2 000 és 5 000 mg/kg közötti tartományban van, vagy 
ezzel egyenérték ű dózisoknak megfelel ő az egyéb beadási módok esetében. A 
vizsgálandó anyagokat az alábbi esetekben lehet a 2 000 mg/kg < LD
 50 < 5 000 
mg/kg veszélyességi kategóriába (GHS 5. kategória) sorolni:  
a) ha a 2. függelékben bemutatott, az elhullási gyakoriságon alapuló vizsgálati 
sémák bármelyike szerint ebbe a kategóriába kell sorolni;  
b) ha hitelt érdeml ő bizonyíték van már arra, hogy az anyag LD50-értéke az 5. 
kategóriában megadott tartományba esik; vagy más állatkísérletek vagy humán toxikus hatások akut jelleg ű humán egészségügyi veszélyt jeleznek;
 
c) adatok extrapolálásával, becslésével vagy mérésével, ha egy veszélyesebb 
osztályba való besorolás nem indokolt, és  
— hitelt érdeml ő információk állnak rendelkezésre, amelyek emberben 
jelentős toxikus hatásokra utalnak, vagy  
— a legfeljebb a 4. kategóriának megfelel ő értékekkel elvégzett, orális 
beadási móddal történ ő vizsgálatok során elhullás történt, vagy  
— ha legfeljebb a 4. kategóriának megfelel ő értékekkel elvégzett vizsgálat 
alapján a szakért ők véleménye meger ősíti a toxicitás szignifikáns klinikai 
tüneteit, kivéve a hasmenést, sz őrmeredezést vagy gondozatlan megjele ­
nést, vagy  
— ha a szakért ők véleménye meger ősíti azokat a hitelt érdeml ő információ ­
kat, amelyek más állatkísérletekben tapasztalt szignifikáns akut hatásokat valószínűsítenek.
 
2 000 MG/KG FELETTI DÓZISOKKAL TÖRTÉN Ő VIZSGÁLAT  
Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha ezt konkrét jogszabályi követelmény 
indokolja, tervbe lehet venni egy további fels ő, 5 000 mg/kg-os rögzített dózis 
alkalmazást. Az állatok jólétének védelme iránti igényt elismerve nem ajánlott az 
5 000 mg/kg-os dózis alkalmazása, és csak akkor szabad fontolóra venni, ha nagy a valószín űsége, hogy az ilyen vizsgálatok eredményei közvetlen jelent őséggel 
bírnak az állati vagy emberi egészség védelme szempontjából (9).
 
Dózisbehatároló vizsgálat  
Az 1. függelékben bemutatott lépcs őzetes eljárás során irányadó döntési szabá ­
lyokat ki lehet terjeszteni úgy, hogy 5 000 mg/kg-os dózisszintet is lehessen 
alkalmazni. Ha tehát a dózisbehatároló vizsgálathoz 5 000 mg/kg-os kezd ődózist 
alkalmaznak, az „A” eredmény (elhullás) esetén egy második állatnak 2 000 mg/kg-os dózist kell beadni. „B” vagy „C” eredmény esetén (nyilvánvaló toxi ­
citás vagy nincs toxicitás) a f ő vizsgálatban 5 000 mg/kg-os kezd ődózis is alkal ­
mazható. Hasonló módon, ha az 5 000 mg/kg-os dózistól eltér ő kezdődózist 
alkalmaznak, a 2 000 mg/kg-os dózis alkalmazásakor kapott „B” vagy „C” ered ­
mény esetén a vizsgálatot 5 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni. Ha ezt követ ően 
az „A” eredményhez jutnak, a f ő vizsgálatban 2 000 mg/kg-os kezd ődózist kell 
alkalmazni, „B” vagy „C” eredmény esetén pedig 5 000 mg/kg-os kezd ődózist.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Fő vizsgálat  
A 2. függelékben bemutatott lépcs őzetes eljárás során irányadó döntési szabá ­
lyokat ki lehet terjeszteni úgy, hogy 5 000 mg/kg-os dózisszintet is lehessen alkalmazni. Ha tehát a f ő vizsgálathoz 5 000 mg/kg-os kezd ődózist alkalmaznak, 
az „A” eredmény (> 2 elhullás) esetén egy második csoportnak 2 000 mg/kg-os 
dózist kell beadni. „B” eredmény (nyilvánvaló toxicitás és/vagy < 1 elhullás) 
vagy „C” eredmény (nincs toxicitás) esetén az anyagot a GHS rendszer szerint be nem soroltnak kell tekinteni. Hasonló módon, ha az 5 000 mg/kg-os dózistól eltérő kezdődózist alkalmaznak, a 2 000 mg/kg-os dózis alkalmazásakor kapott 
„C” eredmény esetén a vizsgálatot 5 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni. Ha ezt 
követően az „A” eredményhez jutnak, az anyagot a GHS 5. kategóriába kell 
sorolni, „B” vagy „C” eredmény esetén pedig be nem soroltnak kell tekinteni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
4. FÜGGELÉK  
B.la. VIZSGÁLATI MÓDSZER  
Útmutató az EU-rendszer szerinti besoroláshoz a Globálisan harmonizált osztályozási rendszer (GHS) teljes kör ű bevezetéséig tartó átmeneti id őszakban (a (8) hivatkozásból)

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1b.  AKUT ORÁLIS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY 
MÓDSZER  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 423 (2001) 
módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
Az itt ismertetett akut toxikus osztály módszer (1) egy lépcs őzetes 
eljárás, amelyben lépésenként három azonos ivarú állatot használnak. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli állapotától 
függően átlagosan 2–4 lépésre lehet szükség a vizsgálandó anyag 
akut toxicitásának megítéléséhez. Az eljárás reprodukálható, nagyon kevés állatot kell használni hozzá, és hasonló módon lehet vele minősíteni az anyagokat, mint a többi akut toxicitás vizsgálati 
módszerrel. Az akut toxikus osztály módszer rögzített dózisokkal 
végzett biometriai vizsgálatokon (2)(3)(4)(5) alapul, amelyek megfelelően el vannak választva egymástól, hogy lehet ővé tegyék 
az anyag besorolási és veszélyfelmérési célokra történ ő minősítését. 
Az 1996-ban jóváhagyott módszert széles körben validálták a szak ­
irodalomból vett  in vivo  LD
 50 -adatokkal szemben mind nemzeti (6), 
mind pedig nemzetközi (7) szinten.  
Arról, hogy egy adott célra melyik a legmegfelel őbb vizsgálati 
módszer, az Akut Orális Toxicitási Vizsgálatok Útmutatójában (8) 
található iránymutatás. Ez az útmutató további információkat is tartalmaz a B.1c. vizsgálati módszer alkalmazásával és értelmezé ­
sével kapcsolatosan.
 
Nincs szükség a vizsgálandó anyagok olyan dózisokban történ ő 
alkalmazására, amelyek korróziós vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt kifejezett fájdalmat vagy szorongást okoznak. Az elhullásközeli állapotban lév ő állatokat vagy azokat, amelyek nyilvánvalóan fájdal ­
makkal küszködnek, vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutatják, 
humánus módon exterminálni kell, és ugyanúgy kell figyelembe venni őket az eredmények értelmezésekor, mint azokat az állatokat, 
amelyek elhullottak a vizsgálatok során. A megjósolható vagy közeli 
elhullás felismerését segít ő iránymutatás, valamint az elhullás 
közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok exterminálására 
vonatkozó döntési kritériumok egy másik útmutatóban (9) találhatók.
 
A módszer el őre meghatározott dózisok alkalmazásán alapul, és a 
kapott eredmények lehet ővé teszik, hogy az anyagot az akut toxici ­
tást okozó anyagok besorolására szolgáló Globálisan harmonizált rendszer (GHS) szerint min ősítsük és soroljuk be (10).
 
A módszer elvben nem alkalmas az LD  50 pontos kiszámítására, de 
lehetővé teszi azoknak az expozíciós tartományoknak a meghatározá ­
sát, amelyeknél letalitás várható, mivel a f ő végpont ebben a vizs ­
gálatban is az állatok egy részének elhullása. Ez a módszer csak akkor teszi lehet ővé az LD
 50 -érték meghatározását, ha legalább két 
dózis 0 %-nál magasabb, de 100 %-nál alacsonyabb elhullási arányt 
eredményez. A vizsgálandó anyagtól függetlenül az el őre meghatá ­
rozott dózisok alkalmazása és a kifejezetten a különféle állapotokban megfigyelt állatok számához köt ődő besorolás növeli a laboratóri ­
umok által készített jelentések egységességét és a vizsgálatok ismé ­
telhetőségét.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgálandó 
anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figye ­
lembe kell vennie. Ilyen információk az anyag megjelölése és kémiai szerkezete; fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, az anyaggal elvégzett  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálat eredményei; szer ­
kezetileg rokon anyagok toxikológiai adatai; valamint az anyag 
várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggy őződjön arról, hogy a vizsgálat releváns 
az emberi egészség védelme szempontjából, és el ősegíti majd a 
legmegfelel őbb kezdődózis kiválasztását.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Akut orális toxicitás:  a vizsgálandó anyag egyszeri vagy 24 órán 
belül többszöri dózisának szájon át történ ő beadását követ ően jelent­
kező káros hatások.  
Késleltetett elhullás:  egy állat 48 órán belül nem hull el vagy nem 
tűnik elhullásközeli állapotban lév őnek, de kés őbb, a 14 napos 
megfigyelési id őszak során elpusztul.  
Dózis:  a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist a vizs ­
gálandó anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított 
tömegében (mg/kg) fejezik ki.  
GHS:  Globálisan harmonizált osztályozási rendszer vegyi anya ­
gokhoz és keverékekhez. Az OECD (emberi egészség és környezet), az ENSZ Veszélyes Anyagok Szállításának Szakért ői Bizottsága 
(fizikai-kémiai tulajdonságok) és az ILO (veszély nyilvánosságra 
hozatala) közös tevékenysége, amelyet a Szervezetek Közötti 
Program a Vegyi Anyagok Helyes Kezelésére (IOMC) koordinál.
 
Közeli elhullás:  amikor a legközelebbi tervezett megfigyelés 
időpontja el őtt elhullásközeli állapot kialakulása vagy elhullás 
várható. Rágcsálók esetében erre utaló jelek lehetnek a görcsök, az 
oldalhelyzet, a fekv őhelyzet és a remegés. (A további részleteket lásd 
a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).  
LD 50 (közepes letális orális dózis): a vizsgálandó anyag statisztika ­
ilag levezetett egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD
 50 -értéket a vizsgálandó 
anyagnak a kísérleti állatok testtömegegységére számított tömegében 
(mg/kg) fejezik ki.  
Határdózis:  egy, a vizsgálhatóság fels ő határánál lév ő dózis (2 000 
vagy 5 000 mg/kg).  
Elhullásközeli állapot:  az esetleges kezelés ellenére is elhullás 
közelében lév ő állapot vagy túlélésre való képtelenség. (A további 
részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).  
Megjósolható elhullás:  a kísérlet tervezett vége el őtt, a jövőben egy 
ismert id őpontban való elhullásra utaló klinikai tünetek megléte, 
például: a víz vagy az élelem elérésére való képtelenség. (A további 
részleteket lásd a Humane Endpoints Guidance Documentben (9)).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. A VIZSGÁLAT ELVE  
A vizsgálat alapelve, hogy a lépésenként minimális számú állatot 
alkalmazó lépcs őzetes eljárás alapján elegend ő információ nyerhet ő 
a vizsgálandó anyag akut toxicitásáról ahhoz, hogy be lehessen azt 
sorolni. Az anyagot szájon át és a meghatározott dózisok egyikét 
alkalmazva adják be a kísérleti állatok egy csoportjának. Az anyagot lépcsőzetes eljárással vizsgálják, ahol minden lépésben három azonos 
ivarú (általában n őstény) állatot használnak. A kezelt állatokban az 
anyaggal összefügg ő elhullás vagy annak hiánya határozza meg a 
következő lépést, azaz:
 
— nincs szükség további vizsgálatra,  
— további három állat vizsgálata történik ugyanazzal a dózissal,  
— további három állat vizsgálata történik a következ ő nagyobb vagy 
kisebb dózissal.  
A vizsgálati eljárás további részletei az 1. függelékben találhatók. A 
módszer alkalmazásával döntést lehet hozni arról, hogy a vizs ­
gálandó anyag a rögzített LD  50 -határértékek segítségével megálla ­
pított toxicitási osztályok melyikébe sorolható be.  
1.4. A MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.4.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A preferált rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmaz ­
hatók. Általában n őstényeket használnak (9). Ennek az az oka, hogy 
a hagyományos LD  50 -vizsgálatokra vonatkozó szakirodalom áttekin ­
tése alapján általában kicsi a különbség a nemek érzékenysége 
között, de azokban az esetekben, amikor megfigyelhet ő különbség, 
a nőstények általában valamivel érzékenyebbek (11). Azonban ha a 
szerkezetileg rokon vegyületek toxikológiai vagy toxikokinetikai 
tulajdonságaival kapcsolatos adatok szerint a hímek nagyobb érzé ­
kenysége valószín űsíthető, akkor hímeket kell alkalmazni. Megfele ­
lően meg kell indokolni, ha a vizsgálatot hímekkel végzik.  
Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, 
fiatal feln őtt állatokat kell alkalmazni. Olyan n őstényeket kell válasz ­
tani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolás megkezdésekor az állatoknak 8–12 hetesnek kell lenniük, és testtömegük nem térhet el ± 20 %-nál többel az esetlegesen 
korábban kezelt állatok testtömegének átlagától.
 
1.4.2.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
A kísérleti állatokat 22  o C (± 3  o C) hőmérséklet ű helyiségben kell 
tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja 
meg a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A 
világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét peri ­
ódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takar ­
mány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. 
Az állatokat lehet vizsgált dózisonként egy ketrecben tartani, de az 
egy ketrecben lév ő állatok számát úgy kell megválasztani, hogy az 
ne zavarja az egyes állatok megfigyelését.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Az állatok el őkészítése  
Az állatokat véletlenszer űen kell kiválasztani, majd egyedi azonosí ­
tóval kell ellátni, és a kezelés megkezdése el őtt legalább 5 napig a 
ketrecükben kell tartani őket, hogy hozzászokhassanak a laborató ­
riumi körülményekhez.  
1.4.4.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgálandó anyagokat általában a vizsgálandó dózistartományon 
belül állandó térfogatban kell beadni úgy, hogy a dóziskészítmény 
koncentrációját változtatják. Ha azonban egy folyékony végterméket 
vagy keveréket vizsgálnak, a vizsgálatot követ ő kockázatértékelés 
szempontjából megfelel őbb lehet, ha a vizsgálandó anyagot hígítat ­
lanul, azaz állandó koncentrációban alkalmazzák, illetve egyes ható ­
ságok ezt írják el ő. A maximálisan beadható dózistérfogatot azonban 
egyik esetben sem szabad túllépni. Az, hogy egyszerre maximálisan mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, a kísérleti állat méretét ől 
függ. Rágcsálók esetében a térfogat általában nem haladhatja meg az 
1 ml/100 g testtömegarányt: vizes oldatok esetében azonban 2 ml/ ­
100 g testtömegarány is megfontolható. A dóziskészítmény formulá ­
zása tekintetében – ahol lehet – a vizes oldatok/szuszpenziók/ ­
emulziók alkalmazása javasolt, másodsorban az olajos (pl. kukorica ­
csíra-olajban elkészített) oldatok/szuszpenziók/emulziók, és harmad ­
sorban esetlegesen más viv őanyagokban elkészített oldatok. A vízt ől 
eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a viv őanyag toxikológiai 
tulajdonságait. A dózisokat a beadás el őtt rövid id ővel kell elkészí ­
teni, kivéve, ha ismert és igazoltan elfogadható a készítmény stabi ­
litása az alatt az alkalmazás id őtartama alatt.
 
1.5. ELJÁRÁS  
1.5.1.  A dózisok beadása  
A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban, gyomorszondán vagy egy 
megfelelő intubációs kanülön át történ ő táplálással kell beadni. 
Abban a rendkívüli esetben, ha nem lehetséges egyetlen dózist alkal ­
mazni, a dózis egy 24 órát nem meghaladó id őtartam alatt kisebb 
részletekben is beadható.  
A kezelés el őtt az állatokat éheztetni kell (pl. patkány esetében egy 
éjszakán át meg kell vonni a táplálékot, de a vizet nem; egér esetében 3–4 órára kell megvonni a táplálékot, de a vizet nem). A 
koplaltatási id őszakot követ ően meg kell mérni az állatok testtöme ­
gét, majd be kell adni a vizsgálandó anyagot. Az anyag beadása után a táplálékot újra meg lehet vonni –patkány esetében 3–4 órára, egér esetében 1–2 órára. Ha egy dózist részletekben adnak be, a beadás 
időtartamától függ ően menet közben szükség lehet arra, hogy az 
állatoknak táplálékot és vizet adjanak.
 
1.5.2.  Az állatok száma és a dózisok  
Minden lépésben három állatot kell alkalmazni. A kezd ődózist az 5, 
50, 300 és 2 000 mg/testtömeg-kg-os négy rögzített dózis közül kell 
kiválasztani. Azt a dózist kell kezd ődózisként kiválasztani, 
amelyiknél a legvalószín űbb, hogy a kezelt állatok egy részénél 
elhullást okoz. Az 1. függelékben látható folyamatábrák ismertetik az egyes kezd ődózisok esetén követend ő eljárást. A 4. függelék 
pedig azzal kapcsolatosan ad iránymutatást, hogy a GHS bevezeté ­
séig hogyan kell az EU-rendszer szerint elvégezni a besorolást.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Ha a rendelkezésre álló információ alapján a legmagasabb kezd ő­
dózis (2 000 mg/testtömeg-kg) valószín űleg nem okoz elhullást, 
akkor határérték-vizsgálatot kell végezni. Ha a vizsgálandó anyagról nincs információ, állatjóléti okokból a 300 mg/testtömeg-kg-os kezdődózis alkalmazása javasolt.
 
Az egyes dózisok vizsgálata közötti id őtartamot a mérgezési tünetek 
megjelenésének id őpontja, id őtartama és súlyossága határozza meg. 
Az állatok következ ő dózissal történ ő kezelését nem szabad megkez ­
deni mindaddig, amíg meg nem gy őződnek arról, hogy az el őzőleg 
kezelt állatok életben maradnak.  
Kivételes esetben és kizárólag akkor, ha konkrét szabályozási ható ­
sági követelmények indokolják, megfontolás tárgyává lehet tenni 
egy további, 5 000 mg/kg-os fels ő dózis alkalmazását (lásd a 2. 
függeléket). Az állatok kímélete érdekében a GHS 5. kategóriában (2 000–5 000 mg/kg) nem ajánlott állatokkal kísérletezni, és csak abban az esetben szabad ilyet tervezni, ha nagy a valószín űsége, 
hogy egy ilyen vizsgálat eredményei közvetlen jelen őséggel bírnak 
az emberi vagy állati egészség vagy a környezet védelme szem ­
pontjából.
 
1.5.3.  Határérték-vizsgálat  
Határérték-vizsgálatot els ősorban olyan helyzetekben kell végezni, ha 
a kísérletet végz őnek olyan információi vannak, amelyek szerint a 
vizsgálandó anyag valószín űleg nem toxikus, azaz csak a hatósági 
határértékdózisok felett toxikus. A vizsgálandó anyag toxicitásával kapcsolatban információ hasonló vegyületek vagy keverékek vagy termékek vizsgálataiból szerezhet ő, figyelembe véve a toxikológiai 
szempontból fontos komponenseket, illetve azok százalékos arányát. 
Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos infor ­
máció, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó anyag várhatóan toxikus, a f ő vizsgálatot kell elvégezni.
 
Végezhet ő határérték-vizsgálat egyetlen, 2 000 mg/testtömeg-kg-os 
dózissal, összesen hat (lépésenként három-három) állat alkalmazásá ­
val. Kivételes esetben végezhet ő határértékvizsgálat egyetlen, 5 000 
mg/kg-os dózissal is, amikor összesen három állatot alkalmaznak (lásd a 2. függeléket). A vizsgálandó anyaggal összefügg ő elhullás 
esetén szükséges lehet a következ ő alacsonyabb dózissal tovább foly ­
tatni a vizsgálatokat.
 
1.6. MEGFIGYELÉSEK  
Az állatokat a dózis beadása után egyedileg kell megfigyelni, 
legalább az els ő 30 percben, azután az els ő 24 órában rendszeres 
időközönként, amelynek során különös figyelemmel kell őket kísérni 
az első 4 órában, majd ezt követ ően naponta, összesen 14 napon át, 
kivéve, ha az állatot állatjóléti okok miatt ki kell venni a vizsgálat ­
ból, és humánus módon exterminálni kell, vagy ha az állat elhullik. A megfigyelés id őtartamát azonban nem szabad mereven meghatá ­
rozni. Ezt a mérgezési reakciók, illetve a gyógyulás kezdete és 
időtartama alapján kell meghatározni, és ilyen módon szükség esetén 
meg lehet hosszabbítani. Fontos a mérgezési tünetek megjelenésének, illetve megsz űnésének id őpontja, különösen, ha a mérgezési tünetek 
inkább késleltetve jelentkeznek (12). Minden megfigyelést szisztema ­
tikusan rögzíteni kell úgy, hogy minden állat esetében önálló adatsort 
kell felvenni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Ha a mérgezési tünetek tartósak, további megfigyelésekre van szük ­
ség. Meg kell figyelni a b őr és a szőrzet, a szemek és a nyálkahár ­
tyák, valamint a légzési és a keringési rendszer, az autonóm és a központi idegrendszer, illetve a szomatomotoros aktivitás és a visel ­
kedési mintázatok változásait. Figyelemmel kell lenni remegés, 
görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, alvás és kóma el őfordulására 
is. A Humane Endpoints Guidance Documentben összefoglalt alap ­
elveket és követelményeket is figyelembe kell venni (9). Humánus módon exterminálni kell az elhullásközeli állapotban lév ő állatokat, 
illetve azokat, amelyek súlyos fájdalom vagy tartós szorongás jeleit 
mutatják. Ha az állatokat humánus okok miatt exterminálni kell, vagy elhullanak, a lehet ő legpontosabban fel kell jegyezni az elhullás 
időpontját is.
 
1.6.1.  Testtömeg  
Röviddel a vizsgálandó anyag beadása el őtt és legalább egy héttel 
utána minden állat testtömegét egyenként meg kell mérni. A testtö ­
megváltozást ki kell számítani, és rögzíteni kell. A vizsgálat végén az életben maradt állatokat újra meg kell mérni, majd humánus 
módon exterminálni kell őket.
 
1.6.2.  Kórbonctani vizsgálat  
Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni 
(azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt ki kellett venni a vizsgálatból). Minden egyes 
állat esetében minden makroszkópos kórtani elváltozást fel kell jegy ­
ezni. A kezd ődózis beadása után legalább 24 óráig túlél ő állatok 
esetében tervbe lehet venni a makroszkópos kórtani elváltozást mutató szervek mikroszkópos vizsgálatát is, mivel abból hasznos 
információk nyerhet ők.
 
2. ADATOK  
Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett 
az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy minden vizsgálati csoportra vonatkozóan mutassa a csoportban lév ő 
kísérleti állatok számát, valamint azoknak a számát, amelyeknél 
mérgezési tünetek láthatók, amelyek a vizsgálat során elhullottak, vagy amelyeket humánus módon extermináltak, az egyes állatok elhullásának id őpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli lefolyását 
és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
 
3. JELENTÉS  
3.1. Vizsgálati jelentés  
A vizsgálati jelentésnek megfelel ő módon a következ ő információkat 
kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai megjelenés, tisztaság és ha releváns, a fizikai-kémiai tulaj ­
donságok (ezen belül az izomerizáció is),  
— azonosító adatok, ezen belül a CAS-szám.  
Vivőanyag (ha szükséges):  
— ha a viv őanyag nem víz, akkor ennek indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj/törzs,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— az állatok mikrobiológiai státusza, feltéve, hogy ismert,  
— az állatok száma, életkora és ivara (ezen belül adott esetben 
annak indoklása, hogy n őstények helyett miért hímeket alkal ­
maztak),  
— az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.  
Kísérleti körülmények:  
— a vizsgálandó anyag formulázására vonatkozó információk, ezen 
belül a beadott anyag fizikai formájával kapcsolatos adatok,  
— a vizsgálandó anyag beadására vonatkozó információk, ezen 
belül a beadott térfogat és a beadás id őpontja,  
— a táplálék és a víz min ősége (ezen belül a takarmány típusa/ ­
forrása, a víz forrása),  
— a kezd ődózis kiválasztásának indoklása.  
Eredmények:  
— a válaszadatok és a dózisok táblázatos formában történ ő 
megadása minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési 
tüneteket mutató, ezen belül elhullt állatokra; a hatások jellege, 
súlyossága és id őtartama),  
— a testtömegadatok és a testtömegváltozások táblázatos formában 
történő megadása,  
— az egyes állatok testtömege a dózis beadásának napján, azt 
követően hetente, valamint az elhullás vagy exterminálás 
időpontjában,  
— a tervezett exterminálás el őtti elhullás napja és ideje,  
— a mérgezési tünetek megjelenése és id őbeli lefolyása, valamint 
esetleges visszafordíthatósága minden egyes állatra vonatkozóan,  
— a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok ered ­
ményei minden egyes állatra vonatkozóan.  
Az eredmények diszkussziója és értelmezése.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86
 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.  
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method- 
An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/ ­
oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14- no-24-no-0,FRF.html]
 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.
 
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. 
Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
1. FÜGGELÉK  
AZ EGYES KEZD ŐDÓZISOK ESETÉBEN KÖVETEND Ő ELJÁRÁS  
ÁLTALÁNOS MEGJEGYZÉSEK  
Minden egyes kezd ődózis esetén az ebben a függelékben bemutatott megfelel ő 
vizsgálati sémák határozzák meg a követend ő eljárást.  
— 1A. függelék: a kezd ődózis 5 mg/testtömeg-kg,  
— 1B. függelék: a kezd ődózis 50 mg/testtömeg-kg,  
— 1C. függelék: a kezd ődózis 300 mg/testtömeg-kg,  
— 1D. függelék: a kezd ődózis 2 000 mg/testtömeg-kg.  
A humánus módon exterminált vagy elhullott állatok számától függ ően a vizs ­
gálati eljárás a jelzett nyilakat követi  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
1A. FÜGGELÉK  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 5 MG/TESTTÖMEG-KG KEZD ŐDÓZIS ESETÉN

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
1B. Függelék  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 50 MG/TESTTÖMEG-KG KEZD ŐDÓZIS ESETÉN

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
1C. FÜGGELÉK  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS 300 MG/TESTTÖMEG-KG KEZD ŐDÓZIS ESETÉN

 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
1D. FÜGGELÉK  
VlZSGÁLATI ELJÁRÁS 2 000 MG/TESTTÖMEG-KG KEZD ŐDÓZIS ESETÉN

 2. FÜGGELÉK  
A VÁRHATÓAN 2 000 MG/KG FELETTI LD  50 -ÉRTÉKKEL 
RENDELKEZ Ő VIZSGÁLANDÓ ANYAGOK VIZSGÁLATOK 
NÉLKÜLI OSZTÁLYOZÁSÁNAK KRITÉRIUMAI  
Az 5. veszélyességi kategória kritériumait úgy állapították meg, hogy tegyék 
lehetővé azoknak a vizsgálandó anyagoknak a meghatározását, amelyek akut 
toxicitási kockázata viszonylag alacsony, de bizonyos körülmények között veszélyt jelenthetnek az érzékeny populációkra. Az ilyen anyagok orális vagy dermális LD
 50 -értéke várhatóan 2 000 és 5 000 mg/kg közötti tartományban 
található, vagy ezzel egyenérték ű dózisoknak megfelel ő az egyéb beadási 
módok esetében. A vizsgálandó anyagokat az alábbi esetekben kell a 2 000 mg/kg < LD
 50 < 5 000 mg/kg veszélyességi kategóriába (GHS 5. kategória) 
sorolni:  
a) ha az 1A–1D. függelékben bemutatott, az elhullási gyakoriságon alapuló vizs ­
gálati sémák bármelyike szerint ebbe a kategóriába kell sorolni;  
b) ha hitelt érdeml ő bizonyíték van már arra, hogy az anyag LD  50 -értéke az 5. 
kategóriában megadott tartományba esik; vagy más állatkísérletek vagy humán toxikus hatások szerint a humán egészségügyi veszély akut jelleg ű;
 
c) adatok extrapolálásával, becslésével vagy mérésével, ha egy veszélyesebb 
osztályba való besorolás nem indokolt, és  
— hitelt érdeml ő információk emberben jelent ős toxikus hatásokra utalnak, 
vagy  
— a legfeljebb 4. kategóriának megfelel ő értékekkel elvégzett orális beadási 
móddal történ ő vizsgálatok során elhullás történt, vagy  
— ha a legfeljebb 4. kategóriának megfelel ő értékekkel elvégzett vizsgálat 
alapján a szakért ők véleménye meger ősíti a toxicitás szignifikáns klinikai 
tüneteit, kivéve a hasmenést, sz őrmeredezést vagy gondozatlan megjele ­
nést, vagy  
— ha a szakért ők véleménye meger ősíti azokat a hitelt érdeml ő információ ­
kat, amelyek más állatkísérletekben tapasztalt szignifikáns akut hatásokat 
valószínűsítenek.  
2 000 MG/KG FELETTI DÓZISOKKAL TÖRTÉN Ő VIZSGÁLAT  
Az állatok jólétének védelme iránti igényt elismerve nem ajánlott, hogy állat ­
okat az 5. kategória tartományában (5 000 mg/kg) vizsgálják, és csak akkor 
szabad fontolóra venni, ha nagy a valószín űsége, hogy az ilyen vizsgálatok 
eredményei közvetlen jelent őséggel bírnak az állati vagy emberi egészség 
védelme szempontjából (10). Nem szabad további vizsgálatokat végezni 
ennél magasabb dózisokkal.  
Ha vizsgálatot kell végezni, csak egy lépés (azaz három állat), az 5 000 mg/kg-os 
dózis alkalmazása szükséges. Ha az els ő kezelt állat elhullik, akkor az 1. függe ­
lékben bemutatott folyamatábrának megfelel ően a kezelést a 2 000 mg/kg-os 
dózissal kell folytatni. Ha az els ő állat életben marad, két további állatot kell 
kezelni. Ha a három állat közül csak egy hullik el, az LD  50 -érték várhatóan 
meghaladja az 5 000 mg/kg-ot. Ha mindkét állat elhullik, akkor a vizsgálatot a 2 000 mg/kg-os dózissal kell folytatni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
3. FÜGGELÉK  
B1c. VIZSGÁLATI MÓDSZER: Útmutató az EU-rendszer szerinti besoroláshoz a Globálisan 
harmonizált osztályozási rendszer (GHS) teljes kör ű bevezetéséig tartó átmeneti id őszakban (a 
(8) hivatkozásból)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 403. vizsgálati iránymuta ­
tásban (2009) (1) leírt módszerrel. Az akut inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 403. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen felülvizs ­
gált B.2. vizsgálati módszert (a felülvizsgált 403. vizsgálati iránymutatás 
megfelelőjeként) a nagyobb rugalmasságot, az állatkísérletek csökkentését 
és a szabályozási igények kielégítését szem el őtt tartva dolgozták ki. A 
felülvizsgált vizsgálati módszer kétféle tanulmányt foglal magában: egy 
hagyományos LC
 50 -protokollt és egy koncentráció x id ő (C x t) protokollt. 
E vizsgálati módszer f ő jellemzői, hogy alkalmas a nem halálostól a halálos 
kimenetelig terjed ő koncentráció-hatás összefüggésnek a medián halálos 
koncentráció (LC  50 ), a nem halálos küszöbérték-koncentráció (például 
LC01) és a meredekség levezetése érdekében történ ő meghatározására, vala ­
mint a nemek szerint esetlegesen eltér ő érzékenység megállapítására. A C x 
t protokoll abban az esetben alkalmazandó, ha meghatározott szabályozási vagy tudományos igény miatt, így többek között veszélyhelyzeti intézke ­
dések tervezéséhez (például akut expozíciós iránymutatási szintek [AEGL], 
vészhelyzeti intézkedési tervezési iránymutatások [ERPG] vagy akut expo ­
zíciós küszöbértékek [AETL] levezetéséhez) vagy területrendezési célból van szükség több id őtartamon át végzett állatkísérletekre.
 
2. A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok végrehajtásával és értelme ­
zésével kapcsolatos útmutatás az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokra 
vonatkozó (39. számú) iránymutatásban (2) található.  
3. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatá ­
rozása a jelen fejezet végén, valamint a 39. iránymutatásban (2) található.  
4. Ez a vizsgálati módszer lehet ővé teszi a vizsgált vegyi anyag jellemzését és 
mennyiségi kockázatértékelését, valamint a vizsgált anyagoknak az 1272/2008/EK rendelet (3) szerinti rangsorolását és osztályozását. A 
megfelelő vizsgálati módszer akut hatások vizsgálatához történ ő kiválasztá ­
sához a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás. Ha csak osztályozással és címkézéssel kapcsolatos információk szükségesek, általában e melléklet 
B.52. fejezetét (4) javasolt alkalmazni (lásd a 39. iránymutatást (2)). A jelen 
B.2. vizsgálati módszer nem kifejezetten különleges anyagok – például alacsony oldhatóságú izometrikus vagy rostos anyagok, illetve mesterséges nanoanyagok – vizsgálatára szolgál.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
5. A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok elvégzésének mérlegelése 
előtt a vizsgálati laboratóriumnak az állatkísérletek minimalizálása érde ­
kében figyelembe kell vennie a vizsgált vegyi anyagról rendelkezésre álló 
összes információt, beleértve az olyan meglév ő tanulmányokat (például az e 
melléklet B.52. fejezetében (4) leírtakat), amelyek adatai a további vizs ­
gálatok elvégzésének mell őzését támasztják alá. A legalkalmasabb faj, törzs, 
nem, expozíciós mód és a megfelel ő vizsgálati koncentrációk kiválasztását 
esetlegesen segít ő információk közé tartozik a vizsgált vegyi anyag azonos ­
sága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az eset ­
leges  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható 
felhasználási területek és a humán expozíció lehet ősége, a szerkezetileg 
rokon anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok (lásd 
a 39. iránymutatást (2)).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Amennyire csak lehet, kerülend ő a maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok 
olyan koncentrációban történ ő vizsgálata, amely el őreláthatóan súlyos 
fájdalmat és/vagy szorongást okozna. Annak megállapítása érdekében, hogy a további vizsgálatoktól el lehet-e tekinteni, szakért ői megítélés alapján 
értékelni kell a lehetséges maró, illetve irritáló hatást, olyan bizonyítékokra 
támaszkodva, mint az embereknél és állatoknál (például nem maró, illetve 
nem irritáló koncentráció mellett ismételt dózisokkal végzett vizsgálatok során) tapasztalt hatások, meglév ő in vitro  adatok (például az e melléklet 
B.40. (5) és B.40A. fejezetében (6) vagy az OECD 435. vizsgálati irány ­
mutatásában (7) leírtak), pH-értékek, hasonló anyagokra vonatkozó adatok 
vagy bármely egyéb kapcsolódó adat. A jelen vizsgálati módszer meghatá ­
rozott szabályozási igények esetén (például vészhelyzeti tervezési célokból) alkalmazható állatok ilyen anyagoknak való expozíciójára, mivel a vizsgálat ­
vezető vagy a vezet ő kutató számára irányítást biztosít a célkoncentrációk 
kiválasztása felett. A célkoncentrációk azonban nem okozhatnak súlyos irri ­
táló, illetve maró hatást, ugyanakkor elegend őnek kell lenniük ahhoz, hogy a 
koncentráció-hatás görbét a vizsgálat szabályozási és tudományos céljának 
megfelelő szintekre kiterjesszék. Ezeket a koncentrációkat eseti alapon kell 
kiválasztani, és a választást indokolni kell (lásd a 39. iránymutatást (2)).
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
7. A jelen felülvizsgált B.2. vizsgálati módszert a vizsgált vegyi anyag akut 
toxicitására vonatkozó elegend ő, az anyag osztályozását lehet ővé tevő infor­
máció megszerzése, valamint a mennyiségi kockázatértékelés elvégzéséhez szükséges, az egyik vagy mindkét nemre vonatkozó letalitási adatok (például LC
 50 , LC  01 és meredekség) biztosítása érdekében dolgozták ki. A vizsgálati 
módszer két módszert foglal magában. Az els ő egy hagyományos protokoll, 
amelynek során állatok csoportjait tesszük ki egy határkoncentrációnak (határérték-vizsgálat) vagy fokozatosan növeked ő koncentrációk sorozatának 
előre meghatározott, általában 4 órás id őtartamra. Meghatározott szabályo ­
zási célok elérése érdekében más expozíciós id őtartamok is alkalmazhatók. 
A másik módszer egy (C x t) protokoll, amelynek során állatok csoportjait tesszük ki egy határkoncentrációnak vagy fokozatosan növeked ő koncentrá ­
ciók sorozatának több id őtartamon keresztül.
 
8. Az elhullásközeli állapotban lév ő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszköd ő 
vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el 
kell pusztítani, és a vizsgálat eredményeinek értelmezésekor a vizsgálat során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósol ­
ható vagy közeli elhullás felismerését segít ő iránymutatás, valamint az 
elhullás közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok elpusztítására vonat ­
kozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló 19. OECD-iránymutatásban (8) találhatók.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
9. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett állatokat kell alkalmazni. A javasolt állatfaj a patkány, más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
 
Az állatok el őkészítése  
10. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és 
nem vemhesek. Az expozíció napján az állatoknak 8–12 hetes fiatal, ivaré ­
rett egyedeknek kell lenniük, a testsúlyuk pedig a korábbi expozíciókkal érintett, azonos életkorú állatok nemenkénti átlagos testsúlyától legfeljebb 
± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszer űen kell kiválasztani, és 
egyedi azonosítás céljából meg kell jelölni. Az állatokat a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése el őtt 
legalább 5 napig tartsuk a ketrecükben. Az állatokat a vizsgálatot megel ő­
zően rövid ideig szoktatni kell a vizsgálati eszközökhöz, mivel ezzel csök ­
kenthető az új környezet okozta stressz.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Az állatok tartása  
11. A kísérleti állatok tartására használt helyiség h őmérséklete 22 ± 3 °C kell, 
hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tarto ­
mányban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha viv ő­
anyagként vizet használunk. Az expozíció el őtt és után az állatokat általában 
nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a 
marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át 
történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indo ­
kolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A 
lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testh őmérséklet 
(hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendel ­
kezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem 
lépnek fel számottev ő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez 
való előzetes szoktatás mell őzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön 
kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a vizsgált aeroszol ne sz űrődhessen át a többi állat sz őrzetén. Hagyományos és 
minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció 
időtartama alatt –, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A vilá ­
gítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
 
Inhalációs kamrák  
12. Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi 
anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az el őnyben részesítend ő expozíciós 
mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, 
orrot vagy szájat érint ő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció álta ­
lában előnyben részesítend ő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a 
lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök vizsgálata esetén. El őfordul­
hat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expo ­
zíció alkalmazásával hatékonyabban elérhet ők, ezt azonban indokolni kell a 
vizsgálati jegyz őkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szol ­
gáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a 
vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 
5 %-át. A csak orron át történ ő és az egész testfelületen keresztüli expozí ­
ciós technikák elveit, valamint azok különös el őnyeit és hátrányait a 39. 
iránymutatás (2) ismerteti.  
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK  
A koncentrációk beadása  
13. Csak orron át történ ő expozíció esetén az expozíció id őtartama patkányoknál 
6 óráig terjedhet. Egerek csak orron át történ ő expozíciója esetén az expo ­
zíciós id őtartam általában nem haladhatja meg a 4 órát. Amennyiben 
hosszabb vizsgálati id őtartam szükséges, a döntést indokolni kell (lásd a 
39. iránymutatást (2)). Az egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamrában aeroszoloknak kitett állatokat külön ketrecben kell tartani, hogy az állatok egymás tisztogatása során ne nyelhessék le a vizsgált vegyi anyagot. 
Az expozíció id őtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt. Az 
állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes id őtartama 
alatt adható.
 
14. Az állatokat gáz, g őz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a 
vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi 
anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól 
és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel el őforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és 
kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz leveg ős körülmé ­
nyek között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk kelet ­
kezésének elkerülésére.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Részecskeméret-eloszlás  
15. Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök 
esetén részecskeméretezést kell végezni. A légz őrendszer összes lényeges 
részének expozíciója érdekében 1 és 4 μm közötti tömegfelez ő aerodina ­
mikai átmér ővel (MMAD) rendelkez ő, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba 
eső geometriai szórású ( σ g ) aeroszolok használata javasolt (2) (9) (10). 
Habár ésszer ű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfele ­
lésre, szakért ői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehet őség. A 
fémgőzök részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, 
míg a töltéssel rendelkez ő részecskék, a rostok és a higroszkopikus anyagok 
(amelyek részecskemérete a légz őrendszer nedves környezetében n ő) 
meghaladhatják azt.  
A vizsgált vegyi anyag el őkészítése viv őanyagban  
16. A vizsgált vegyi anyag megfelel ő légköri koncentrációjának és részecskemé ­
retének eléréséhez viv őanyag alkalmazható. F őszabályként a víz részesí ­
tendő előnyben. A részecskéket képz ő anyagok mechanikai eljárásoknak 
vethetők alá a szükséges részecskeméret-eloszlás elérése érdekében, ugyan ­
akkor ügyelni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag ne induljon bomlásnak és ne módosuljon. Amennyiben úgy véljük, hogy a mechanikai folyamatok 
(például a túlzott őrlésből adódó súrlódás miatt kialakult széls őséges hőmér­
séklet) megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételét analitikai úton ellen őrizni kell. Kell ő figyelmet kell fordí ­
tani a vizsgált vegyi anyag szennyez ődésének elkerülésére. A nem morzsá ­
lódó, szándékosan belélegezhetetlen összetétellel készült szemcsés anya ­
gokat nem szükséges vizsgálni. Kopásvizsgálattal kell igazolni, hogy a szemcsés anyag kezelése során nem keletkeznek belélegezhet ő részecskék. 
Ha a kopásvizsgálat során belélegezhet ő anyagok keletkezését észleljük, 
inhalációs toxicitási vizsgálatot kell végezni.
 
Kontrollállatok  
17. Negatív (leveg ővel kezelt) kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata nem szük ­
séges. Amennyiben a vizsgálati légkör létrehozása során vízt ől eltérő vivő­
anyagot alkalmazunk, viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportra csak akkor van 
szükség, ha nem állnak rendelkezésre múltbeli inhalációs toxicitási adatok. 
Ha a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag a toxicitási vizsgálat alapján 
nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a viv őanyag sem 
tekintendő toxikusnak, tehát nincs szükség viv őanyaggal kezelt kontrollra.  
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE  
Kamrabeli légáramlás  
18. A kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan 
nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell 
jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy stabilitás) nyomon köve ­
tése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett lehetőséget nyújt a légkör el őállítása szempontjából lényeges összes dina ­
mikus paraméter szabályozására. Különös figyelmet kell fordítani a csak 
orron át történ ő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerü ­
lésére, amennyiben az expozíciós rendszeren keresztüli légáramlás nem elegendő a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó légkör dinamikus áramlásának 
biztosítására. El őírt módszerek állnak rendelkezésre annak igazolására, hogy 
a választott m űködési körülmények között nem történik újbóli belélegzés (2) 
(11). Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén- dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben bármilyen 
okból feltételezhet ő, hogy ezek a szabványok nem teljesíthet ők, az oxigén- 
és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
A kamra h őmérséklete és relatív páratartalma  
19. A kamra h őmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési 
zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történ ő és az 
egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt nyomon kell követni, 
és legfeljebb 4 órás id őtartamú expozíciók esetén legalább háromszor, rövi ­
debb időtartamok esetén pedig óránként fel kell jegyezni. A relatív páratar ­
talmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhet ő el (például vízalapú keverékek vizs ­
gálata esetén), vagy nem mérhet ő a vizsgált vegyi anyag vizsgálati 
módszerrel való interferenciája miatt.
 
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció  
20. Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehet őség szerint ki 
kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk 
meg, hogy az el őállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk a kamrarend ­
szeren áthaladt leveg ő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az 
állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhet ő a vizsgálati rend ­
szer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az el őállítással összefügg ő prob­
lémák.
 
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció  
21. A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán 
belül, az állatok belégzési zónájában fennálló koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció specifikus módszerekkel (például közvetlen mintavé ­
tellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módszerekkel, 
valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerek ­
kel, például gravimetriai sz űrőelemzéssel határozható meg. A gravimetriai 
elemzés csak egykomponens ű por alakú aeroszolok, illetve alacsony illé ­
konyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkalmazását a vizs ­
gált vegyi anyag megfelel ő, a vizsgálat el őtt végzett jellemzésével kell 
alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponens ű por alakú aero ­
szolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. Ebben az 
esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a leveg őben 
lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Amennyiben ilyen 
információ nem áll rendelkezésre, a (lehet őleg leveg őben lebeg ő) vizsgált 
vegyi anyag rendszeres id őközönként végzett újbóli elemzésére lehet 
szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek 
elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát. A cél-, a névleges és a tényleges koncentrációt fel kell tüntetni a vizsgálati jegyz őkönyvben, 
azonban a letális koncentráció értékének kiszámításához csak a tényleges 
koncentrációkat kell felhasználni.
 
22. Lehet őség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni, és a 
vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy meg őrződjön 
annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatá ­
rozva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag 
lehetséges, az észlelt szennyez ő anyagok és szennyez ődések azonosságát 
és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következ ő 
adatokkal mutatható ki: retenciós id ő és relatív csúcsterület, tömegspektrosz ­
kópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel meghatározott molekulatömeg, 
illetve más becslések. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása 
nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) meggy őződni a megbízó által adott jellemzés 
helytállóságáról.
 
23. Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani, 
továbbá az analitikai módszert ől függően folyamatosan és/vagy id őszakosan 
ellenőrizni kell. Id őszakos mintavétel esetén a kamrából a négyórás vizsgálat 
során legalább kétszer kell légköri mintát venni. Ha az alacsony légáramlási 
sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, a teljes expozíciós időszak alatt egy mintavétel végezhet ő. Ha jelent ős ingadozás figyelhet ő 
meg az egyes minták között, a következ őnek vizsgált koncentrációkat expo ­
zíciónként négy minta alapján kell vizsgálni. Az egyes kamrakoncentráció- 
minták gázok és g őzök esetében legfeljebb ± 10 %-kal, folyékony vagy
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
szilárd aeroszolok esetében pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el az 
átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kialakulásához szük ­
séges időt (t 95 ) ki kell számítani és fel kell jegyezni. Egy adott expozíció 
időtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag el őállításának idejét, 
utóbbihoz pedig figyelembe kell venni a t  95 eléréséhez szükséges id őt. A 
t 95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.  
24. A nagyon összetett, gázokból/g őzökből és aeroszolokból álló keverékek 
(például égésterekb ől származó, valamint meghatározott célra szolgáló 
végfelhasználói termékekb ől/készülékekb ől kibocsátott vizsgált vegyi anya ­
gok) esetén az egyes fázisok eltér ően viselkedhetnek az inhalációs kamrá ­
ban, ezért mindegyik fázishoz (gáz/g őz és aeroszol) legalább egy indikátor ­
anyagot (analitot) – általában a keverék els ődleges hatóanyagát – kell kivá ­
lasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncent ­
rációt a keverék, nem pedig csak a hatóanyag vagy összetev ő (analit) vonat ­
kozásában kell a jegyz őkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrációról 
további információ a 39. iránymutatásban található (2).  
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás  
25. Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik 4 órás expozíció során 
legalább kétszer meg kell határozni sorozatos ütközésmér ő vagy alternatív 
műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó segítségével. Ha 
bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmér ővel és az alternatív m űszerrel 
kapott eredmények egyeznek, az alternatív m űszer a teljes vizsgálat 
folyamán használható. Az els ődleges műszerrel párhuzamosan egy második 
eszközt, például gravimetriai sz űrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell 
használni az els ődleges m űszer mintavételi hatékonyságának ellen őrzésére. 
A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a sz űrőelem­
zéssel kapott tömegkoncentrációt ésszer ű mértékben meg kell közelítenie 
(lásd a 39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában egyezés 
mutatható ki, a további ellen őrző mérések mell őzhetők. Az állatok jóléte 
érdekében intézkedéseket kell tenni az expozíció eseteges megismétlését szükségessé tev ő kétes adatok el őfordulásának minimalizálása érdekében. 
Gőzök esetében a részecsekeméret-eloszlást mesterségesen kell beállítani, 
ha fennáll annak a lehet ősége, hogy a g őz lecsapódásával aeroszol keletkez ­
het, vagy ha vegyes fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a g őzat­
moszférában (lásd a 15. bekezdést).
 
ELJÁRÁS  
26. Az alábbiakban kétféle vizsgálatot ismertetünk: a hagyományos és a C × t 
protokollt. Mindkét protokoll magában foglalhat egy dózisbehatároló vizs ­
gálatot, egy f ő vizsgálatot és/vagy egy határérték-vizsgálatot (hagyományos 
protokoll) vagy egy határkoncentráció mellett végzett vizsgálatot (C × t). Ha 
ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált anyagra, a vizsgálat ­
vezető dönthet úgy, hogy a vizsgálatokat csak az érzékenyebb nemen kell 
elvégezni. Patkányoktól eltér ő rágcsálófajok csak orron át történ ő expozí­
ciója esetén az expozíció maximális id őtartama kiigazítható a fajspecifikus 
szorongás minimalizálása érdekében. A vizsgálat megkezdése el őtt minden 
rendelkezésre álló adatot figyelembe kell venni az állatkísérletek számának minimalizálására. Az e melléklet B.52. fejezetét (4) alkalmazva el őállított 
adatok például szükségtelenné tehetik a dózisbehatároló vizsgálat elvégzését, 
valamint azt is kimutathatják, hogy valamelyik nem érzékenyebb-e a vizs ­
gált anyagra (lásd a 39. iránymutatást (2)).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
HAGYOMÁNYOS PROTOKOLL:  
Általános megfontolások: hagyományos protokoll  
27. A hagyományos vizsgálat keretében állatok csoportjait tesszük ki meghatá ­
rozott (általában 4 órás) id őtartamra a vizsgált vegyi anyagnak, vagy csak 
orron keresztüli, vagy az egész testfelületen át történ ő expozícióra szolgáló 
kamrában. Az állatokat vagy határkoncentrációnak (határérték-vizsgálat), 
vagy legalább három, fokozatosan növekv ő koncentrációnak tesszük ki (f ő 
vizsgálat). A f ő vizsgálat el őtt dózisbehatároló vizsgálat végezhet ő, hacsak 
nem állnak már rendelkezésre bizonyos információk a vizsgált vegyi anyag ­
ról, például egy korábbi, a B.52. fejezet szerint végzett vizsgálat alapján 
(lásd a 39. iránymutatást (2)).  
Dózisbehatároló vizsgálat: hagyományos protokoll  
28. A dózisbehatároló vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag hatóképességének 
becslése, a vegyi anyagra való érzékenység tekintetében a nemek között fennálló különbségek meghatározása, valamint a f ő vizsgálat és a határ ­
érték-vizsgálat során alkalmazott koncentrációszintek kiválasztásának el őse­
gítése. A dózisbehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek 
kiválasztásakor fel kell használni minden rendelkezésre álló információt, beleértve a rendelkezésre álló (Q)SAR-adatokat és a hasonló vegyi anyagok adatait. Mindegyik koncentrációnak legfeljebb három hím és három n őstény 
tehető ki (a nemek közötti különbség megállapításához nemenként 3 állat 
vizsgálatára lehet szükség). A dózisbehatároló vizsgálat vonatkozhat egyetlen koncentrációra, de szükség esetén több koncentráció is vizsgálható. A dózisbehatároló vizsgálat során nem vizsgálható annyi állat és koncent ­
ráció, hogy az már egy f ő vizsgálathoz legyen hasonló. Dózisbehatároló 
vizsgálat helyett alkalmazhatók egy, a B.52. módszer (4) szerint elvégzett korábbi vizsgálat adatai (lásd a 39. iránymutatást (2)).
 
Határérték-vizsgálat: hagyományos protokoll  
29. Határérték-vizsgálatot akkor kell végezni, ha a vizsgált vegyi anyagról 
ismert vagy várható, hogy gyakorlatilag nem mérgez ő, azaz csak a hatósá ­
gilag előírt határkoncentráció felett idéz el ő toxikus reakciót. A határérték- 
vizsgálat során egyetlen, három hímb ől és három n őstényből álló csoportot 
teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak határkoncentráció mellett. A vizsgált vegyi anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vizsgált vegyi anyagokra 
vonatkozó adatokból nyerhet ők információk, figyelembe véve a toxikológiai 
szempontból fontos komponenseket, valamint azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a vizsgálandó vegyi anyag 
várhatóan toxikus, a f ő vizsgálatot kell elvégezni.
 
30. A határkoncentrációk kiválasztását általában a szabályozási követelmények 
határozzák meg. Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 
mg/l (vagy az elérhet ő legnagyobb koncentráció) (3). Bizonyos vizsgált 
vegyi anyagok, különösen a g őzök és az aeroszolok határkoncentrációjának 
előállítása technikai szempontból kihívást jelenthet. Aeroszolok vizsgálata 
esetén az els ődleges cél a belélegezhet ő részecskeméret (1–4 μm-es 
MMAD) elérése. Ez a legtöbb vizsgált vegyi anyag esetén 2 mg/l koncent ­
rációnál érhet ő el. Aeroszolok 2 mg/l feletti koncentrációnál történ ő vizs­
gálatát csak akkor szabad megkísérelni, ha ezzel elérhet ő a belélegezhet ő 
részecskeméret (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az 1272/2008/EK rendelet 
szerint az állatok jóléte érdekében a határkoncentráció felett végzett vizs ­
gálatok ellenjavallottak (3). A határkoncentráció alkalmazását csak abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat eredménye nagy valószínűséggel közvetlen jelent őséggel bírna az emberi egészség védelme 
szempontjából (3), továbbá ha mindezt a vizsgálati jegyz őkönyvben indo ­
koljuk. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi anyagok esetén ügyelni kell a robbanást el ősegítő körülmények elkerülésére. A szükségtelen állatkísérletek 
elkerülése végett a határérték-vizsgálatot megel őzően állatok nélküli próba ­
vizsgálatot kell végezni annak érdekében, hogy a kamrában elérhet ők 
legyenek a határérték-vizsgálathoz szükséges körülmények.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Ha a határkoncentrációnál állatok elhullását vagy elhullásközeli állapotát 
figyeljük meg, a határérték-vizsgálat eredményei dózisbehatároló vizsgálat ­
ként használhatók más koncentrációknál végzett további vizsgálatokhoz (lásd a fő vizsgálatról szóló részt). Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai vagy 
kémiai tulajdonságaiból adódóan a határkoncentráció nem érhet ő el, a 
legmagasabb elérhet ő koncentrációt kell vizsgálni. Ha az elhullási arány 
az elérhet ő legnagyobb koncentráció mellett 50 %-nál alacsonyabb, nincs 
szükség további vizsgálatok elvégzésére. Ha a határkoncentrációt nem sike ­
rült elérni, a vizsgálati jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell ennek magyaráza ­
tát, valamint az alátámasztó adatokat. Ha egy g őz legnagyobb elérhet ő 
koncentrációja nem vált ki toxikus reakciót, a vizsgált vegyi anyag folyé ­
kony aeroszoljának el őállítására lehet szükség.
 
Fő vizsgálat: hagyományos protokoll  
32. A fő vizsgálatot általában koncentrációszintenként öt hímen és öt n őstényen 
végezzük el (vagy a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 5 egyedén, ameny ­
nyiben az ismert) legalább három koncentrációszinten. A megalapozott statisztikai elemzés érdekében elegend ő számú koncentrációszintet kell 
alkalmazni. Az egyes expozíciós csoportok vizsgálata közötti id őtartamot 
a mérgezési tünetek megjelenésének id őpontja, id őtartama és súlyossága 
határozza meg. Az állatok következ ő koncentrációszintnek való expozícióját 
addig kell halasztani, amíg ésszer ű biztonsággal nem várható az el őzőleg 
vizsgált állatok túlélése. Ez lehet ővé teszi a vizsgálatvezet ő számára a követ ­
kező expozíciós csoport célkoncentrációjának kiigazítását. Mivel mindez 
összetett technológiát igényel, inhalációs vizsgálatok esetén nem feltétlenül praktikus, ezért az állatok következ ő koncentrációszintnek való expozícióját 
korábbi tapasztalatokra és tudományos mérlegelésre kell alapozni. Keve ­
rékek vizsgálata esetén a 39. iránymutatás (2) alkalmazandó.
 
KONCENTRÁCIÓ × ID Ő (C × T) PROTOKOLL  
Általános megfontolások: C × t protokoll  
33. Az inhalációs toxicitás értékeléséhez a hagyományos protokoll helyett 
megfontolható egy fokozatos C x t vizsgálat elvégzése (12) (13) (14). Ez 
a módszer lehet ővé teszi az állatok vizsgált vegyi anyagnak több koncent ­
rációszinten és több id őtartamon keresztül történ ő expozícióját. Minden vizs ­
gálatot csak orron át történ ő expozícióra szolgáló kamrában végzünk el (az 
egész testfelületen keresztüli expozícióra szolgáló kamrák alkalmazása ennél 
a protokollnál nem praktikus). A protokollt az 1. függelékben található folyamatábra szemlélteti. Szimulációs elemzéssel megállapították, hogy mind a hagyományos, mind a C × t protokoll alkalmas megalapozott 
LC
 50 értékek meghatározására, azonban a megalapozott LC  01 és LC  10 
értékek meghatározására általában alkalmasabb a C × t protokoll (15).  
34. Szimulációs elemzéssel igazolták, hogy C × t-intervallumonként két állat 
(mindkét nem vizsgálata estén nemenként egy, vagy a vizsgált anyagra érzékenyebb nemb ől két példány) általában elegend ő, ha a fő vizsgálat 
során 4 koncentrációt és 5 expozíciós id őtartamot vizsgálunk. Bizonyos 
körülmények között a vizsgálatvezet ő döntése alapján minden C × 
t-intervallumhoz nemenként két patkány alkalmazható (15). Ha minden koncentrációhoz és id őponthoz nemenként 2 állatot alkalmazunk, csök ­
kenhet a becslések torzítása és variabilitása, n őhet a sikeres becslések 
aránya, és javulhat a konfidenciaintervallum lefedettsége. A becsléshez hasz ­
nált adatokhoz való nem kell ően szoros illeszkedés esetén azonban (ameny ­
nyiben nemenként egy állatot vagy az adott anyagra érzékenyebb nemb ől 
két példányt vizsgálunk) egy 5. expozíciós koncentráció használata is elég 
lehet. A C × t vizsgálat során használandó állatok és koncentrációk 
számával kapcsolatban a 39. iránymutatás tartalmaz további útmutatást (2).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Dózisbehatároló vizsgálat: C × t protokoll  
35. A dózisbehatároló vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag hatóképességének 
becslése és a f ő vizsgálat során alkalmazott koncentrációszintek kiválasztá ­
sának elősegítése. A f ő vizsgálat során alkalmazandó megfelel ő kiindulási 
koncentráció kiválasztása, valamint a vizsgált állatok számának minimalizá ­
lása érdekében nemenként és koncentrációnként legfeljebb három állatot alkalmazó dózisbehatároló vizsgálatra lehet szükség (részleteket lásd a 39. iránymutatás III. függelékében (2)). A nemek közötti eltérés megállapítá ­
sához nemenként három állat vizsgálata lehet szükséges. Ezeket az állatokat 
egyetlen, általában 240 perces id őtartamra kell kitenni a vizsgált anyagnak. 
A megfelel ő vizsgálati légkörök el őállításának megvalósíthatóságát az álatok 
nélkül végzett el őzetes műszaki vizsgálatok során kell felmérni. Általában 
nem szükséges dózisbehatároló vizsgálatot végezni, ha elhullási adatok állnak rendelkezésre egy, a B.52. módszer szerint végzett vizsgálat alapján (4). A kiindulási célkoncentráció B.2. módszer szerinti vizsgálat során való 
kiválasztásakor a vizsgálatvezet őnek figyelembe kell vennie az esetlegesen 
rendelkezésre álló, B.52. módszer szerinti vizsgálatok (4) során mindkét nem és minden vizsgált koncentráció tekintetében megfigyelt elhullási mintákat (lásd a 39. iránymutatást (2)).
 
Kiindulási koncentráció: C × t protokoll  
36. Kiindulási koncentrációként (I. expozíciós szakasz) (1. függelék) vagy határ ­
koncentrációt, vagy egy, a vizsgálatvezet ő által a dózisbehatároló vizsgálat 
alapján kiválasztott koncentrációt alkalmazunk. Ennek a koncentrációnak nemenként 1 állatot teszünk ki több id őtartamra (például 15, 30, 60, 120 
vagy 240 percre), így az állatok teljes száma 10 (ezt nevezik az I. expozíciós 
szakasznak) (1. függelék).
 
37. A határkoncentrációk kiválasztását általában a szabályozási követelmények 
határozzák meg. Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, 
gőzök és aeroszolok határkoncentrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 
mg/l (vagy az elérhet ő legnagyobb koncentráció) (3). Bizonyos vizsgált 
vegyi anyagok, különösen a g őzök és az aeroszolok határkoncentrációjának 
előállítása technikai szempontból kihívást jelenthet. Aeroszolok vizsgálata 
esetén a cél a belélegezhet ő részecskeméret (azaz 1–4 μm-es MMAD) 
elérése 2 mg/l határkoncentráció mellett. Ez a legtöbb vizsgált vegyi anyag esetén elérhet ő. Aeroszolok 2 mg/l feletti koncentrációnál történ ő 
vizsgálatát csak akkor szabad megkísérelni, ha ezzel elérhet ő a belélegezhet ő 
részecskeméret (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az 1272/2008/EK rendelet szerint az állatok jóléte érdekében a határkoncentráció felett végzett vizs ­
gálatok ellenjavallottak (3). A határkoncentráció feletti vizsgálatot csak 
abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat ered ­
ménye nagy valószín űséggel közvetlen jelent őséggel bírna az emberi 
egészség védelme szempontjából (3); a vizsgálati jegyz őkönyvben mindezt 
indokolni kell. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi anyagok esetén ügyelni 
kell a robbanást el ősegítő körülmények elkerülésére. A szükségtelen állatkí ­
sérletek elkerülése végett a kiindulási koncentráció melletti vizsgálatot megelőzően állatok nélküli próbavizsgálatot kell végezni annak érdekében, 
hogy a kamrában elérhet ők legyenek az e koncentrációhoz szükséges körül ­
mények.
 
38. Ha a kiindulási koncentrációnál állatok elhullását vagy elhullásközeli álla ­
potát figyeljük meg, az e koncentráció mellett kapott eredmények felhasz ­
nálhatók más koncentrációk mellett végzett további vizsgálatok kiinduló ­
pontjaként (lásd a f ő vizsgálatról szóló részt). Ha a vizsgált vegyi anyag 
fizikai vagy kémiai tulajdonságaiból adódóan a határkoncentráció nem érhető el, a legmagasabb elérhet ő koncentrációt kell vizsgálni. Ha az elhul ­
lási arány az elérhet ő legnagyobb koncentráció mellett 50 %-nál alacso ­
nyabb, nincs szükség további vizsgálatok elvégzésére. Ha a határkoncentrá ­
ciót nem sikerült elérni, a vizsgálati jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell ennek 
magyarázatát, valamint az alátámasztó adatokat. Ha egy g őz legnagyobb 
elérhető koncentrációja nem vált ki toxikus reakciót, a vizsgált vegyi 
anyag folyékony aeroszoljának el őállítására lehet szükség.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Fő vizsgálat: C x t protokoll  
39. A fő vizsgálat során vizsgált kiindulási koncentrációként (I. expozíciós 
szakasz) (1. függelék) vagy határkoncentrációt, vagy egy, a vizsgálatvezet ő 
által a dózisbehatároló vizsgálat alapján kiválasztott koncentrációt alkalma ­
zunk. Ha az I. expozíciós szakasz során vagy azt követ ően állatok elhullását 
figyeljük meg, az elhullást okozó minimális koncentrációt (C x t) kell alapul venni a II. expozíciós szakasz során alkalmazandó koncentrációk és expo ­
zíciós időtartamok meghatározásához. Minden soron következ ő expozíciós 
szakaszt az azt megel őző szakasz határoz meg (lásd az 1. függeléket).
 
40. Számos vizsgált vegyi anyag esetében a kiindulási koncentráció mellett 
kapott eredmények, valamint három további, kisebb id őbeli távolságú 
(azaz az expozíciós id őtartamok közötti, két egymást követ ő időtartam – 
általában √2 értékű – tényez ője által kifejezett geometriai távolságú) expo ­
zíciós szakasz eredményei elegend ők a C x t és az elhullás közötti össze ­
függés meghatározására (15), azonban egy 5. expozíciós koncentráció alkal ­
mazása el őnyökkel járhat (lásd az 1. függeléket és a 39. iránymutatást (2)). 
A C x t protokoll eredményeinek matematikai feldolgozását az 1. függelék 
ismerteti.  
MEGFIGYELÉSEK  
41. Az expozíció id őtartama alatt az állatokat gyakori klinikai megfigyeléseknek 
kell alávetni. Az expozíciót követ ően az expozíció napján legalább kétszer, 
vagy – amennyiben az állatok kezelésre adott reakciója ezt indokolja – annál gyakrabban, az azt követ ő 14 nap során pedig naponta legalább egyszer 
klinikai megfigyeléseket kell végezni. A megfigyelés id őtartama nem rögzí ­
tett, hanem a klinikai tünetek jellege és jelentkezésének ideje, valamint a 
felépülés id őtartama alapján határozandó meg. Fontos a toxicitási tünetek 
megjelenésének és megsz űnésének id őpontja, különösen, ha fennáll a toxi ­
citási tünetek késleltetett megjelenésének tendenciája. Minden megfigyelést 
szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében 
önálló adatsort veszünk fel. Állatjóléti okokból humánus módon el kell pusztítani az elhullásközeli állapotban lév ő, valamint súlyos fájdalom 
és/vagy tartós és súlyos szorongás jeleit mutató állatokat. A toxicitás klinikai 
tünetei el őfordulásának vizsgálata során ügyelni kell arra, hogy az expozí ­
ciós eljárás okozta kezdeti beteges megjelenést és átmeneti légúti változá ­
sokat ne azonosítsuk tévesen a vizsgált vegyi anyaggal összefügg ő, az 
állatok id ő előtti elpusztítását szükségessé tev ő toxicitásként. A humánus 
végpontokról szóló (19. számú) iránymutatásban összegzett elveket és köve ­
telményeket is figyelembe kell venni (7). Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehet ő legpontosabban fel 
kell jegyezni az elhullás id őpontját.
 
42. A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a b őr és a 
szőrzet, a szem és a nyálkahártya, valamint a légz őrendszer, a keringési 
rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszer, továbbá a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Lehet őség szerint fel kell 
jegyezni, ha különbséget lehet tenni a helyi és szisztémás hatások között. 
Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, 
alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért h őmérséklet bizonyítékot 
szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára.
 
Testsúly  
43. Az egyes állatok súlyát a szoktatási id őszak során egy alkalommal, az 
expozíció napján (0. nap) az expozíció el őtt, valamint legalább az 1., 3. 
és 7. napon (azt követ ően pedig hetente) egy-egy alkalommal, továbbá az 
1. napon túli elhullás vagy elpusztítás id őpontjában fel kell jegyezni. A 
testsúly a toxicitás kulcsfontosságú indikátorának számít, ezért a vizsgálat előtti értékekhez képest legalább 20 %-os tartós súlycsökkenést mutató állat ­
okat szorosan figyelemmel kell kísérni. Az expozíciót követ ő időszak végén 
az életben maradt állatokat újra megmérjük, majd humánus módon elpusz ­
títjuk.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patológia  
44. Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni, azokat is, 
amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett pusztítani és ki kellett vonni a vizsgálatból. Ha a boncolás nem 
végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot 
hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kell ően 
alacsony h őmérsékleten. A boncolást a lehet ő leghamarabb, általában egy 
vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni 
minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légz ő­
rendszert érint ő változásokra.
 
45. A vizsgálat értelmez ő értékének fokozása érdekében el őzetesen, terv szerint 
kilátásba helyezhet ők olyan további vizsgálatok, mint az életben maradt 
patkányok tüdeje súlyának megmérése és/vagy az irritációnak a légz őrend­
szer mikroszkópos vizsgálatával való igazolása. Megvizsgálhatók azok a 
szervek is, amelyek makroszkopikus patológia jeleit mutatják 24 óráig 
vagy annál tovább életben maradt állatoknál, valamint olyan szervek, amelyekről ismert vagy várható, hogy a vizsgált anyag hatást gyakorolt 
azokra. A teljes légz őrendszer mikroszkópos vizsgálata hasznos informáci ­
ókkal szolgálhat a vízzel könnyen reagáló vizsgált vegyi anyagokról, például 
a savakról és higroszkópos vegyi anyagokról.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
46. Meg kell adni az egyes állatok testsúlyával és boncolási eredményeivel 
kapcsolatos adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában 
össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban 
lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a 
vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának id őpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli 
lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
47. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell értelemszer űen 
tartalmaznia:  
Kísérleti állatok és azok tartása  
— a ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következ őket: az állatok 
ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, környezeti h őmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás id őtar­
tama, valamint a takarmány meghatározása,
 
— a vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltér ő faj alkalmazásának indo ­
kolása,  
— az állatok száma, kora és neme,  
— a véletlen kiválasztás módszere,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány 
típusa/eredete, a víz eredete),  
— a vizsgálat el őtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, 
a karantént és a betegség kezelését,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Vizsgált vegyi anyag  
— fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulaj ­
donságok (beleértve az izomerizációt),  
— azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási 
Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám),  
Vivőanyag  
— a vivőanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a 
vivőanyag nem víz),  
— múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a 
vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét,  
Inhalációs kamra  
— az inhalációs kamra leírása, beleértve annak méreteit és térfogatát,  
— az állatok expozíciójához és a légkör el őállításához használt berende ­
zések eredete és leírása,  
— a hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció 
mérésére szolgáló berendezések,  
— a leveg ő forrása és a bevitt/elszívott leveg ő kezelése, valamint a kondi ­
cionáló rendszer,  
— az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történ ő 
kalibrálására alkalmazott módszerek,  
— nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív),  
— expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), 
az állatok helye a rendszerben (egész testfelületen keresztüli expozíció),  
— a vizsgálati légkör id őbeli homogenitása/stabilitása,  
— a hőmérséklet- és páratartalom-érzékel ők, valamint a vizsgálati légkör 
mintavételének helye a kamrában,  
— légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként 
(csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként 
(egész testfelületen keresztüli expozíció),  
— adott esetben az oxigén és a szén-dioxid mérésére használt eszközökre 
vonatkozó információk,  
— az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges id ő 
(t 95 ), 
— a térfogatváltozások óránkénti száma,  
— mérőberendezések (ha vannak),  
Expozíciós adatok  
— a fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása,  
— névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra el őállí­
tott vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt leveg ő 
térfogatával),  
— a vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gy űjtött tény­
leges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, g őz, aeroszol) 
felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhet ő, ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— minden leveg őbeli koncentrációt tömegegységekben (például mg/l, 
mg/m  3 stb.) kell megadni; zárójelben a térfogategységekben (például 
ppm, ppb stb.) kifejezett értékek is feltüntethet ők; 
— részecskeméret-eloszlás, tömegfelez ő aerodinamikai átmér ő (MMAD), 
valamint geometriai szórás ( σg), beleértve azok kiszámításának módját. 
Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket,  
Vizsgálati körülmények  
— a vizsgált vegyi anyag el őkészítésének részletei, beleértve a szilárd 
anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi 
anyag oldatainak készítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részleteit. Amennyiben a mechanikai folyamatok megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételének ellen őrzése 
érdekében végzett elemzések eredményeit is fel kell tüntetni,
 
— a vizsgálati légkör el őállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való 
kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehet őség szerint vázlatrajz ­
zal), 
— az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának 
részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegb ől való 
visszanyerésének hatásfokát),  
— a vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása,  
Eredmények  
— a kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos összefog ­
lalása,  
— a kamra névleges és tényleges koncentrációs adatainak táblázatos össze ­
foglalása,  
— részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai 
mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és a σ
 g számításait,  
— a válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden 
egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és köztük az elhullt állatok, a hatások jellege, súlyossága, megjelenésének 
időpontja és id őtartama),
 
— az egyes állatok vizsgálat során mért testsúlya, az elhullás dátuma és 
időpontja, amennyiben az a tervszer ű elpusztítást megel őzően történt, a 
toxicitási tünetek megjelenésének id őbeli alakulása, valamint annak 
megjelölése, hogy azok visszafordíthatók voltak-e az egyes állatoknál,  
— a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei 
minden egyes állatra vonatkozóan,  
— letalitási becslések (például LC  50 , LD  01 ), beleértve a 95 %-os konfiden ­
ciahatárokat és a meredekséget (amennyiben az értékelési módszerrel meghatározható),
 
— statisztikai reláció, beleértve az n exponens becslését (C × t protokoll). 
Fel kell tüntetni az alkalmazott statisztikai szoftver nevét,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése  
— különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – 
például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására,
 
— ki kell térni a részecskék belélegezhet őségére az általános megállapítások 
tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel nem telje ­
sült, 
— magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról 
szóló OECD-iránymutatás (8) szerinti kritériumok alapján humánus 
módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszköd ő vagy súlyos és 
tartós szorongás jeleit mutató állatokat,  
— amennyiben az e melléklet B.52. fejezete (4) szerinti vizsgálatot felfüg ­
gesztettük, hogy helyette a jelen B.2. vizsgálati módszert alkalmazzuk, a 
döntést indokolni kell,  
— a vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tény ­
leges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisztenciá ­
ját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést,  
— ki kell térni az elhullás valószín ű okára, valamint az els ődleges hatás ­
mechanizmusra (szisztémás vagy helyi).  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
(3) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK 
rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatá ­
lyon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, 
HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  
(4) E melléklet B.52., Akut inhalációs toxicitás – Akut toxikus osztály (ATC) 
módszer cím ű fejezete.  
(5) E melléklet B.40., In vitro b őrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia 
vizsgálat (TER) cím ű fejezete.  
(6) E melléklet B.40A., In vitro b őrkorrózió: emberi b őrmodellen végzett vizs ­
gálat cím ű fejezete.  
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corro ­
sion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. AppéldáulToxicol. 18: 321-327.
 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. AppéldáulToxicol. 27: 
160-167.  
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
1. függelék  
C × t PROTOKOLL  
1. Az inhalációs toxicitás értékeléséhez a hagyományos protokoll helyett 
megfontolható egy fokozatos koncentráció × id ő (C × t) vizsgálat elvégzése 
(12) (13) (14). Ez a vizsgálat lehet őség szerint abban az esetben végzend ő 
el, ha meghatározott szabályozási vagy tudományos igény miatt, például 
veszélyhelyzeti intézkedések tervezéséhez vagy területrendezéshez több 
időtartamon át végzett állatkísérletekre van szükség. A módszer általában 
egy határkoncentráción végzett vizsgálattal kezd ődik (I. expozíciós szakasz), 
amelynek során az állatokat a vizsgált anyagnak öt id őtartamra (például 15, 
30, 60, 120 és 240 percre) tesszük ki úgy, hogy egyetlen expozíciós szakasz 
során több id őtartamot vizsgálunk (lásd az 1. ábrát). Az 1272/2008/EK 
rendelet alkalmazása esetén a gázok, g őzök és aeroszolok határkoncentrá ­
ciója rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l. Ezek a szintek kizárólag akkor 
léphetők túl, ha az adott szinteken történ ő vizsgálatot szabályozási vagy 
tudományos igény indokolja (lásd a B.2. fejezet f ő szövegének 37. bekez ­
dését).  
2. Amennyiben kevés a vizsgált vegyi anyag toxicitásával kapcsolatos infor ­
máció, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, dózisbehatároló vizsgálatot 
kell végezni, amelynek során nemenként legfeljebb 3 állatból álló csopor ­
tokat teszünk ki a vizsgálatvezet ő által kiválasztott célkoncentrációknak, 
általában 240 percre.  
3. Ha az I. expozíciós szakasz során határkoncentrációt vizsgálunk, és az 
elhullási arány 50 % alatti, nincs szükség további vizsgálatokra. Ameny ­
nyiben szabályozási vagy tudományos igény mutatkozik a koncentráció, az idő és a válasz közötti összefüggésnek a megjelölt határkoncentrációt 
meghaladó szinten történ ő meghatározására, a következ ő expozíciót maga ­
sabb szinten, például határkoncentráció kétszeresénél kell végrehajtani (lásd 
az 1. ábrán a 2L szintet).
 
4. Ha a határkoncentrációnál toxicitást figyelünk meg, további vizsgálat (f ő 
vizsgálat) elvégzése szükséges. Ezeket a további expozíciókat vagy alacso ­
nyabb koncentrációk mellett (az 1. ábrán a II., III. vagy IV’. expozíciós 
szakasz), vagy magasabb koncentrációk mellett, rövidebb id őtartamon át (az 
1. ábrán a IV. expozíciós szakasz) kell elvégezni, kiigazított és egymástól kevésbé távoli id őtartamok alkalmazásával.
 
5. A vizsgálatot (kiindulási koncentráció és további koncentrációk mellett) 
nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1 állaton, vagy koncentrá ­
ciónként és id őpontonként a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 2 példányán 
végezzük el. Bizonyos körülmények között a vizsgálatvezet ő nemenként, 
koncentrációnként és id őpontonként 2 patkány (vagy koncentrációnként és 
időpontonként a vizsgált anyagra érzékenyebb nem 4 példányának) vizs ­
gálata mellett is dönthet (15). Ha minden koncentrációhoz és id őponthoz 
nemenként 2 állatot alkalmazunk, általában csökkenthet ő a becslések torzí ­
tása és variabilitása, növelhet ő a sikeres becslések aránya, és javítható a 
konfidenciaintervallum lefedettsége az itt ismertetett protokollhoz viszo ­
nyítva. További részletek a 39. iránymutatásban (2) olvashatók.  
6. Ideális esetben mindegyik expozíciós szakaszt ugyanazon a napon hajtjuk 
végre. Ez lehet ővé teszi, hogy a következ ő expozíciót addig halasszuk, amíg 
ésszerű biztonsággal nem várható az állatok túlélése, valamint a vizsgálat ­
vezető számára lehet őséget biztosít a következ ő expozíciós szakasz célkon ­
centrációjának kiigazítására. Javasolt mindegyik expozíciós szakaszt azzal a 
csoporttal kezdeni, amelynek expozíciója a leghosszabb ideig fog tartani, például a 240 perces expozíciós csoporttal, folytatva a 120 perces expozíciós csoporttal stb. Ha például a 240 perces csoportban vizsgált állatok 90 perc 
elteltével elpusztulnak vagy a toxicitás súlyos tüneteit mutatják (például a 
légzésritmus széls őséges változásait, beleértve a nehéz légzést), a következ ő 
csoportot nem volna célszer ű 120 perces expozíciónak kitenni, mivel az 
elhullási arány feltehet ően 100 %-os lenne. A vizsgálatvezet őnek javasolt 
tehát rövidebb (például 90, 65, 45, 33 és 25 perces) expozíciós id őtarta­
mokat választania az adott koncentrációhoz.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. A kamrabeli koncentrációt gyakran kell mérni az egyes expozíciós id őtar­
tamok időarányosan súlyozott átlagkoncentrációjának meghatározása érdeké ­
ben. Lehet őség szerint minden egyes állat elhullásának id őpontját (nem 
pedig az expozíciós id őtartamot) kell a statisztikai elemzés során felhasz ­
nálni.  
8. Az els ő négy expozíciós szakasz eredményeit megvizsgálva meg kell hatá ­
rozni a koncentráció-id ő görbe azon részét, amelyen az adatok hiányosak 
(lásd az 1. ábrát). Nem megfelel ő illeszkedés esetén egy további (5. 
koncentráció melletti) expozíció végezhet ő. Az 5. expozícióhoz használt 
koncentrációt és id őtartamokat úgy kell megválasztani, hogy lefedjék e 
hiányzó adatokat.  
9. Mindegyik expozíciós szakaszt (beleértve az els őt is) felhasználjuk a 
koncentráció-id ő-válasz összefüggés statisztikai elemzés útján történ ő 
meghatározására (16). Lehet őség szerint minden egyes C × 
t-intervallumhoz az id őarányosan súlyozott átlagkoncentrációt és (ameny ­
nyiben az elhullás az expozíció során következik be) az elhullásig eltelt expozíciós id őt kell felhasználni.
 
1. ábra  
Patkányoknál megfigyelt koncentráció-id ő-elhullás összefüggés hipotetikus 
ábrája
  
Üres szimbólumok = életben maradt állatok; teli szimbólumok = elhullott 
állatok  
Háromszög = n őstény; kör = hím  
Összefügg ő vonal = LC  50 értékek (tartomány: 7,5–240 perc) n = 1 érték ű 
hímeknél  
Szaggatott vonal = LC  50 értékek (tartomány: 7,5–240 perc) n = 1 érték ű 
nőstényeknél  
Pontozott vonal = hipotetikus LC  50 értékek vonala hímek és n őstények 
vonatkozásában, ha az n értéke 2 lett volna (12).  
Glosszárium  
koncentráció:  
expozíciós id ő: ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Az alábbi példa egy lépésenkénti folyamatot szemléltet:  
I. expozíciós szakasz – határkoncentrációnál végzett vizsgálat (lásd az 
1. ábrát)  
— Nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1, összesen 10 állat (  a ) 
— Célkoncentráció (  b ) = határkoncentráció.  
— Állatok öt csoportját tesszük ki a célkoncentrációnak 15, 30, 60, 120, 
illetve 240 percre.  
↓ 
II. expozíciós szakasz  ( c ) – fő vizsgálat  
— Nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1, összesen 10 állat.  
— Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (  d ) (1/2L), 
némileg hosszabb ( √2 tényezővel elválasztott) expozíciós id őtartamokra 
(lásd az 1. ábrát).  
↓ 
III. expozíciós szakasz – f ő vizsgálat  
— Nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1, összesen 10 állat.  
— Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (  d ) (1/4L), 
némileg hosszabb ( √2 tényezővel elválasztott) expozíciós id őtartamokra 
(lásd az 1. ábrát).  
↓ 
IV’. expozíciós szakasz – f ő vizsgálat  
— Nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1, összesen 10 állat.  
— Állatok öt csoportját tesszük ki alacsonyabb koncentrációnak (  d ) (1/8L), 
némileg hosszabb ( √2 tényezővel elválasztott) expozíciós id őtartamokra 
(lásd az 1. ábrát).  
↓ vagy  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Amennyiben nem áll rendelkezésre információ az anyagra való érzékenység tekintetében 
a nemek között fennálló különbségr ől, mindkét nemhez tartozó patkányokat, azaz nemen ­
ként és koncentrációnként 1 állatot vizsgálunk. Meglév ő információk alapján, vagy ha 
ezen expozíciós szakasz során nyilvánvalóvá válik, hogy az egyik nem érzékenyebb a 
vizsgált anyagra, a további vizsgálatok során mindegyik koncentrációszintnél az érzéke ­
nyebb nem 10 egyedét vizsgáljuk (koncentrációnként és id őpontonként 2 állatot). 
( b ) Az 1272/2008/EK rendelet alkalmazása esetén a gázok, g őzök és aeroszolok határkon ­
centrációja rendre 20 000 ppm, 20 mg/l és 5 mg/l. Várható toxicitás esetén vagy a 
dózisbehatároló vizsgálat eredményei alapján alacsonyabb kiindulási koncentrációkat kell választani. Szabályozási vagy tudományos igény esetén magasabb koncentráció is 
alkalmazható. 
(
 c ) Az állatok következ ő koncentrációszintnek való expozícióját ideális esetben addig kell 
halasztani, amíg ésszer ű biztonsággal nem várható az el őzőleg kezelt állatok túlélése. Ez 
lehetővé teszi a vizsgálatvezet ő számára a következ ő expozíciós szakasz célkoncentráci ­
ójának és id őtartamainak kiigazítását. 
( d ) A kiindulási koncentráció mellett (az I. expozíciós szakaszban) elhullást okozó legala ­
csonyabb dózist (koncentráció × id ő) vesszük alapul a koncentráció és az expozíciós 
időtartamok következ ő kombinációjának meghatározásakor. A koncentrációt általában 
felezzük (1/2L), és az állatokat új, az els ő expozíció során megfigyelt minimális halálos 
dózisszint (id ő × koncentráció) ideje körül 1,4-es tényez ő (√2, lásd a 11. hivatkozást) 
alapján geometriailag elosztott expozíciós id őtartamokból álló, s űrűbb felosztású id őtar­
tomány folyamán tesszük ki a vizsgált anyagnak. Ezen az ábrán (1. ábra) az I. expozíciós 
szakaszban el őször 15 percnél figyeltek meg elhullást; a II. szakasz id őtartamait ezért a 
30 perces id őtartam körül határozzák meg 15, 21, 30, 42 és 60 percben. Az els ő két 
expozíciót követ ően határozottan javasolt az adatokat egy, a fentihez hasonló grafikonon 
ábrázolni, és ellen őrizni, hogy a koncentráció és az id ő közötti összefüggés 45 fokos 
szöget zár be (n = 1), vagy a koncentráció-id ő-válasz összefüggés meredeksége kisebb 
(például n = 2), illetve nagyobb (például n = 0,8). Az utóbbi esetekben er ősen javasolt a 
következő koncentrációkat és id őtartamokat ennek megfelel ően kiigazítani.
 IV. expozíciós szakasz – f ő vizsgálat  
— Nemenként, koncentrációnként és id őpontonként 1, összesen 10 állat.  
— Állatok öt csoportját tesszük ki magasabb koncentrációnak (  e ) (2L), 
némileg rövidebb ( √2 tényezővel elválasztott) expozíciós id őtartamokra 
(lásd az 1. ábrát).  
A C × t protokoll eredményeinek matematikai feldolgozása  
11. Egy 4 vagy 5 expozíciós koncentrációra és 5 id őtartamra kiterjed ő C × t 
eljárással 20 vagy 25 adatpont kapható. Ezen adatpontok alapján statisztikai 
elemzéssel (16) kiszámítható a C × t összefüggés:  
1. egyenlet:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
ahol C = koncentráció; t = az expozíció id őtartama, vagy  
2. egyenlet:  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
ahol n ¼ b 1=b 2: 
Az 1. egyenlettel kiszámítható az LC  50 értéke egy adott id őtartamra (például 
4 órára, 1 órára, 30 percre vagy a vizsgált id őtartamok tartományán belüli 
bármely id őtartamra) a P = 5 (50 %-os válasz) értéket alkalmazva. Megjegy ­
zendő, hogy a Haber-szabály csak akkor alkalmazható, ha n = 1. Az LC  01 a 
P = 2,67 érték segítségével számítható ki.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) Bizonyos esetekben a koncentráció növelésére (2L) lehet szükség új, az els ő expozíció 
során megfigyelt minimális halálos koncentrációszint ideje körül 1,4-es tényez ő (√2) 
alapján geometriailag elosztott expozíciós id őtartamokból álló, még s űrűbb felosztású 
időtartományt alkalmazva. Az expozíció minimális id őtartamának lehet őség szerint meg 
kell haladnia az 5 percet, az expozíció maximális id őtartama nem lehet több 8 óránál.
 B.3. AKUT TOXICITÁS (DERMÁLIS)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (A).  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (B).  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta, a b őrre kell adagolni fokozatos 
adagokban több kísérleti állatcsoportnak, csoportonként egy adagot használva. Ezt követ ően megfigyelik a hatásokat és a halálesetek 
előfordulását. A vizsgálat során elpusztult állatokat és a vizsgálat 
végéig életben maradó állatokat is fel kell boncolni.
 
A súlyos és tartós betegség, illetve fájdalom jeleit mutató állatokat 
humánus módon el lehet pusztítani. A vizsgált anyagokat nem szabad olyan módon adagolni, amelyr ől ismert, hogy jelent ős szen­
vedést és fájdalmat okoz maró vagy irritatív tulajdonsága miatt.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
Az állatokat a vizsgálat el őtt legalább öt napig a vizsgálat tartási és 
takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges fiatal 
állatokat a vizsgálat megkezdése el őtt véletlenszer ű kiválasztással 
csoportokba kell osztani. A vizsgálat el őtt körülbelül 24 órával el 
kell távolítani a sz őrzetet az állatok törzsének hátulsó területér ől 
nyírással vagy borotválással. A sz őrzet nyírásakor vagy borotválá ­
sakor óvatosan kell eljárni, nehogy olyan b őrsérülést okozzanak, ami 
a felszívódást befolyásolhatja. A testfelület legalább 10 %-át szabaddá kell tenni a vizsgált anyag alkalmazásához. Ha szilárd anyagot vizsgálnak, amelyet adott esetben porítani is lehet, az 
anyagot vízzel kell ően át kell nedvesíteni, vagy szükség esetén viv ő­
anyagot kell alkalmazni annak biztosítására, hogy jól tapadjon a bőrhöz. Viv őanyag használatakor figyelembe kell venni a viv őanyag 
hatását a vizsgált anyag b őrbe való behatolására. A folyékony vizs ­
gált anyagokat rendszerint hígítás nélkül kell adagolni.
 
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
1.6.2.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
Kifejlett patkány vagy nyúl használható. Más faj is használható, de 
azok használatát meg kell indokolni. Kísérleti célokra tenyésztett, laboratóriumi állattörzsekb ől származó állatokat kell alkalmazni. A 
vizsgálat kezdetén az állatok súlya minimálisan, az átlagértékt ől 
maximum ± 20 %-kal térhet el egymástól.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Az állatok száma és neme  
Minden koncentrációnál legalább öt állatot kell vizsgálni. Az állat ­
oknak azonos nem űnek kell lenniük. A n őstényeknél követelmény, 
hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Amennyiben rendel ­
kezésre áll olyan információ, amely szerint valamelyik nem lénye ­
gesen érzékenyebben reagál, akkor ilyen nem ű állatokat kell alkal ­
mazni.  
Megjegyzés: A rágcsálóknál magasabb rend ű állatokkal végrehajtott 
akuttoxicitás-vizsgálatokban meg kell fontolni kisebb számú állat 
használatának lehet őségét. A dózisokat gondosan kell kiválasztani, 
és minden er őfeszítést meg kell tenni arra, hogy azok ne lépjék túl a 
közepesen toxikus dózisokat. Ilyen vizsgálatoknál el kell kerülni a 
vizsgált anyag letális dózisának beadását.  
1.6.2.3.  Dózisok  
E szinteknek elegend ő számúaknak, legalább háromnak, és megfele ­
lően elosztottnak kell lenniük ahhoz, hogy a vizsgált csoportokban 
toxikus hatások és halálozási arányok egész sorát hozzák létre. Minden irritatív vagy maró hatást figyelembe kell venni a dózisok 
megállapításakor. Az adatoknak elegend őnek kell lenniük a 
koncentráció/hatás görbe létrehozására, és ahol lehetséges, lehet ővé 
kell tenniük az LD
 50 elfogadható meghatározását.  
1.6.2.4.  Határérték-vizsgálat  
A határérték-vizsgálatot el lehet végezni egyetlen, legalább 2 000 
mg/testsúly kg dózissal adagolt 5 hím és 5 n őstény rágcsálóból 
álló csoporttal a fent leírt eljárások végrehajtásával. Ha a vizsgált 
anyaggal kapcsolatos halálozás figyelhet ő meg, akkor szükség lehet a 
teljes kör ű vizsgálat elvégzésére.  
1.6.2.5.  Megfigyelési id őszak 
A megfigyelési id őszaknak legalább 14 napnak kell lennie. Azonban 
a megfigyelés id őtartamát nem kell szigorúan értelmezni. Ezt a 
toxikus reakciók megjelenésének módja, a tünetek megjelenésének 
időpontja és a felépülési id őtartam hosszúsága alapján kell meghatá ­
rozni; ebb ől következ ően ezen id őtartam szükség esetén meghosz ­
szabbítható. Fontos az az id őpont, amikor a toxicitás jelei 
megjelennek és elt űnnek, valamint a halál bekövetkezésének ideje, 
különösen, ha tendencia figyelhet ő meg a halál késedelmes bekövet ­
kezésére.  
1.6.3.  A kísérlet végrehajtása  
Az állatokat egyesével kell a ketrecekben elhelyezni. A vizsgált 
anyagot a testfelület megközelít őleg 10 %-át kitev ő felületen 
egyenletesen elosztva kell felvinni az állat b őrére. Erősen mérgez ő 
anyagoknál a felület lehet ennél kisebb, de a felület lehet ő legna­
gyobb részét a lehet ő legvékonyabb és legegyenletesebb bevonattal 
kell ellátni.  
A 24 órás expozíció ideje alatt a vizsgált anyagot a b őrrel porózus 
gézkötés és nem irritáló ragtapasszal kell érintkezésben tartani. A 
vizsgált területet megfelel ő módon be kell fedni, azért hogy 
megmaradjon rajta a vizsgált anyag és a gézkötés, és az állatok ne nyalhassák le a vizsgált anyagot. Mozgásgátló szerkezeteket lehet 
használni annak megakadályozására, hogy az állat a vizsgált anyagot 
lenyelje, de a teljes immobilizáció mint módszer nem javasolt.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Az expozíciós id ő leteltével a maradék vizsgált anyagot lehet őség 
szerint el kell távolítani a b őr felületének vízzel vagy más megfelel ő 
módon történ ő megtisztítása útján.  
A megfigyeléseket szisztematikusan fel kell jegyezni. Külön feljegy ­
zést kell vezetni minden egyes állatról. Az els ő nap során gyakran 
kell végrehajtani a megfigyeléseket. Minden munkanapon legalább egyszer gondos klinikai vizsgálatot kell végrehajtani, más megfigye ­
léseket naponta kell végezni, azon megfelel ő tevékenységek végre ­
hajtása mellett, amelyek célja a vizsgálatban részt vev ő állatok elhul ­
lásának minimalizálása, ilyen például a holtan talált állatok boncolása vagy lehűtése, vagy a gyenge vagy haldokló állatok elkülönítése 
vagy elpusztítása.
 
A megfigyeléseknek ki kell terjednie a b őr és a sz őrzet, a kezelt 
bőrfelület, a szem és a nyálkahártya, valamint a légz ő- és keringési 
rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszeri funkciók, valamint a szomatomotoros aktivitás és viselkedési minta változásaira. Külön figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, 
letargia, alvás és kóma megfigyelésére. A halál id őpontját a lehet ő 
legpontosabban kell feljegyezni. A vizsgálat során elpusztult állat ­
okat és a vizsgálat befejezéséig életben maradt állatokat fel kell boncolni. Fel kell jegyezni minden jelent ős patológiás elváltozást. 
Amennyiben szükséges, szövetmintákat kell venni a kórszövettani 
vizsgálathoz.
 
Toxicitás meghatározása a másik nemnél  
Az egyik nemmel végzett vizsgálat befejezése után a másik nemb ől 
kiválasztott, legalább öt állatból álló csoport számára kell adagolni az anyagot annak megállapítására, hogy az e nemhez tartozó állatok 
nem érzékenyebbek-e jelent ősebb mértékben a vizsgált anyagra. 
Bizonyos esetekben indokolható lehet kevesebb állat használata. Ahol megfelel ő információ áll rendelkezésre annak bizonyítására, 
hogy a vizsgált nemhez tartozó állatok jelent ősen érzékenyebbek, 
elhagyható a másik nemhez tartozó állatokkal végzett vizsgálat.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, megadva minden 
egyes csoportnál az állatok számát a vizsgálat kezdetekor, az egyes 
állatok halálának id őpontját, a toxicitás más jeleit mutató állatok 
számát, a toxikus hatások leírását és a boncolási leleteket. Egyenként meg kell határozni az állatok tömegét, és fel kell ezt jegyezni 
röviddel a vizsgált anyag beadása el őtt, ezután minden héten és a 
halál bekövetkeztekor; ki kell számítani és fel kell jegyezni a tömeg ­
változásokat, ha az állat egy napnál tovább maradt életben. A vizs ­
gált anyaggal összefügg ő szenvedés és fájdalom miatt humánusan 
elpusztított állatok halálát az anyaggal kapcsolatos halálként kell 
feljegyezni. Az LD
 50 valamely elismert módszer segítségével hatá ­
rozható meg.  
Az értékelésnek tartalmaznia kell – amennyiben ez lehetséges – a 
dózis és a rendellenességek fellépése és súlyossága közötti kapcso ­
latot, ideértve a magatartási rendellenességeket, a klinikai tüneteket, 
a jelentős sérüléseket, testsúlyváltozásokat, a halálozást és minden 
más toxikus tünetet is.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— a használt fajt, törzset, az állatok származását, a tartási körülmé ­
nyeket, az étrendet stb.,  
— a vizsgálati körülményeket (beleértve a b őrtisztítás módszerét és 
a kötszer típusát: zárt vagy nem zárt),  
— a dózisokat (beleértve a viv őanyagot is, ha van és koncent ­
rációk),  
— a kezelt állatok nemét,  
— az adatok táblázatos összefoglalását nem és koncentráció szerint 
(azaz a vizsgálat során elhullott vagy elpusztított állatok száma; a 
toxicitás jeleit mutató állatok száma; az exponált állatok száma),  
— az anyag adagolása során vagy azt követ ően bekövetkez ő 
halál időpontját, az állatok humánus elpusztításának okait és 
kritériumait,  
— minden megfigyelést,  
— a 14 napban meghatározott teljes vizsgálat alá vont nemnél 
kapott LD  50 - érték (az alkalmazott számítási módszer 
megadásával),  
— az LD  50 -hez tartozó 95 %-os konfidenciaintervallumot (ahol ez 
megadható),  
— a dózis/mortalitás görbét és ennek meredekségét (ahol ezt 
megengedi a meghatározás módszere),  
— a boncolási leleteket,  
— a kórszövettani vizsgálatok eredményeit,  
— a másik nemmel végrehajtott vizsgálatok eredményeit,  
— az eredmények kiértékelését (külön figyelmet kell szentelni 
annak a hatásnak, amelyet a vizsgálat során az állatok humánus 
leölése gyakorolhat a kiszámított LD  50 -értékre),  
— az eredmények értelmezését.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (D).  
4. SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (E).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. AKUT TOXICITÁS: B ŐRIRRITÁCIÓ/B ŐRKORRÓZIÓS HATÁS  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer egyenérték ű az OECD TG 404 (2002) módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
Ennek a továbbfejlesztett módszernek a kidolgozása során külön 
figyelmet szenteltek az állatjóléti szempontokkal kapcsolatos lehet ­
séges javító beavatkozásoknak és a vizsgálandó anyaggal kapcso ­
latban rendelkezésre álló összes információ kiértékelésének, hogy 
ezáltal elkerülhet ő legyen a laboratóriumi állatokon történ ő szükség­
telen kísérletezés. A módszer ajánlást fogalmaz meg arra nézve, hogy az anyag korrorróziós vagy irritáló hatásának vizsgálatára el őírt in 
vivo kísérlet elvégzése el őtt el kell végezni a rendelkezésre álló 
adatok bizonyító erejének elemzését (weight-of-the-evidence analy ­
sis). Ha nem áll rendelkezésre elegend ő adat, akkor ezek mennyisége 
lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával növelhet ő (1). A vizsgálati 
stratégia részét képezi validált és elfogadott  in vitro  vizsgálatok 
végzése, amelyek a módszerhez csatolt függelékben kerülnek ismer ­
tetésre. Emellett javasolt, hogy – ahol lehet – a kiindulási  in vivo  
vizsgálat során az állatra ne egyszerre, hanem id őben egymás után 
helyezzék fel a három teszttapaszt.
 
A tudományos ésszer űség és az állatok kímélete érdekében nem 
szabad  in vivo  vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg az anyag 
potenciális korróziós/b őrirritáló hatására vonatkozó összes rendelke ­
zésre álló adaton el nem végezték azok bizonyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy laboratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, a szerkezetileg rokon anyagok vagy 
elegyeik korróziós/irritáló hatásaival kapcsolatos bizonyítékok, az 
anyag erős savasságát vagy lúgosságát igazoló adatok (2)(3), vala ­
mint a validált és elfogadott  in vitro  vagy ex vivo vizsgálatokból 
kapott eredmények (4)(5)(5a). Az elemzésnek csökkentenie kell az  in 
vivo bőrkorróziós/b őrirritációs vizsgálatok iránti igényt azoknak az 
anyagoknak az esetében, amelyekre az említett két végpont tekinte ­
tében más vizsgálatokból elegend ő bizonyíték áll rendelkezésre.
 
A preferált lépcs őzetes vizsgálati stratégia, amely validált és elfoga ­
dott in vitro  vagy ex vivo korróziós/irritációs vizsgálatok elvégzését 
is magában foglalja, a módszerhez csatolt függelékben kerül ismer ­
tetésre. A stratégiát egy OECD-munkaértekezlet (6) résztvev ői 
dolgozták ki, javasolták egyhangúlag, majd fogadták el mint a Globálisan harmonizált rendszer (GHS) a vegyi anyagok osztályozá ­
sára (7) ajánlott vizsgálati stratégiáját. Az  in vivo  vizsgálatok elvég ­
zése előtt ezt a vizsgálati stratégiát javasolt követni. Új anyagok 
esetében ez az ajánlott lépcs őzetes vizsgálati megközelítés a tudomá ­
nyos szempontból megfelel ő adatok gy űjtésére az anyag korróziós/ ­
irritáló hatásaival kapcsolatosan. Ismert anyagok esetében, ha nem áll 
rendelkezésre elegend ő adat a b őrkorróziós/b őrirritáló hatásokról, 
ennek a stratégiának az alkalmazásával kell pótolni a hiányzó adato ­
kat. Megfelel ően meg kell indokolni az ett ől eltérő vizsgálati stra ­
tégia vagy eljárás alkalmazását, vagy ha úgy döntenek, hogy nem 
használják a lépcs őzetes vizsgálati megközelítést.
 
Ha a korróziós vagy irritáló hatásokat nem lehet meghatározni az 
adatok bizonyító erejének elemzésével, a lépcs őzetes vizsgálati stra ­
tégiával összhangban fontolóra kell venni  in vivo  vizsgálatok elvég ­
zését (lásd a függelékben).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Bőrirritáció:  a vizsgálandó anyag alkalmazását követ ően 4 órán 
belül megjelen ő, visszafordítható b őrkárosodás.  
Bőrkorróziós hatás:  a vizsgálandó anyag alkalmazását követ ően 
négy órán belül megjelen ő, visszafordíthatatlan b őrkárosodás, azaz 
a felhámon át az irhára is átterjed ő látható szövetelhalás. A korróziós 
reakciót fekélyek, vérzés, véres var, illetve a 14 napos megfigyelési időszak végén a b őr kifehéredése miatti elszínez ődések, teljesen sz őr­
telen területek és hegek jellemzik. A problémás léziók kiértékelése 
érdekében fontolóra kell venni kórszövettani vizsgálatok elvégzését.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísér ­
leti állat b őrén; a vizsgált állat nem kezelt b őrfelületei szolgálnak 
kontrollként. Az irritáció/korrózió mértékét meghatározott id őkö­
zönként kell ellen őrizni és értékelni, továbbá a hatások teljes 
kiértékelése érdekében részletesebben is ismertetni. A vizsgálat 
időtartamának elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy meg 
lehessen határozni a megfigyelt hatások visszafordíthatóságát vagy visszafordíthatatlanságát.
 
A vizsgálat bármely fázisában tartós súlyos szorongás és/vagy 
fájdalom jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell, 
és az anyagot ennek megfelel ően kell értékelni. Az elhullás 
közelében lév ő és súlyosan szenved ő állatok humánus módon történ ő 
exterminálásáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok a (8) hivat ­
kozásban találhatók.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.4.1.  Az  in vivo  vizsgálat el őkészítése  
1.4.1.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal 
felnőtt állatokat kell alkalmazni. Más fajok alkalmazását megfelel ően 
indokolni kell.  
1.4.1.2.  Az állatok el őkészítése  
A vizsgálat el őtt körülbelül 24 órával el kell távolítani az állat sz őr­
zetét úgy, hogy teljesen le kell nyírni az állat törzsének dorzális területét. Vigyázni kell arra, hogy eközben ne dörzsöljék ki az 
állat bőrét, és csak olyan állatokat szabad alkalmazni, amelyek 
bőre ép és egészséges.
 
Egyes nyúltörzsek sz őrzete sűrű foltokban n ő, amelyek az év egyes 
szakaszaiban még szembet űnőbbek. Nem szabad vizsgálati terület ­
ként használni az ilyen s űrű szőrzetnövekedéssel jellemzett részeket.  
1.4.1.3.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
Az állatokat egyedileg kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti 
helyiség h őmérsékletének 20  o C (± 3  o C)-nak kell lennie. Bár a 
helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, 
illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg 
a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok 
váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány 
alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  A vizsgálati eljárás  
1.4.2.1.  A vizsgálandó anyag alkalmazása  
A vizsgálandó anyagot egy kis (körülbelül 6 cm  2 -es) bőrterületre kell 
kijuttatni, majd egy géztapasszal le kell takarni, és nem irritáló 
ragasztószalaggal kell a helyén rögzíteni. Olyan esetekben, amikor 
a közvetlen alkalmazás nem megoldható (pl. folyadékok vagy egyes masszák esetében), a vizsgálandó anyagot el őször a géztapaszra kell 
felvinni, és azután azt kell a b őrre tenni. Az expozíciós id ő tartamára 
a tapaszt lazán kell a b őrre rögzíteni egy megfelel ő félig záró kötés 
alkalmazásával. Amennyiben a vizsgálandó anyagot a tapaszra viszik fel, úgy kell a b őrre rögzíteni, hogy megfelel ő legyen a kontaktus, és 
az anyag egyenletesen oszoljon el a b őrön. Gondoskodni kell arról, 
hogy az állat ne férjen hozzá a tapaszhoz és ne nyelje le vagy lélegezze be a vizsgálandó anyagot.
 
A folyékony vizsgálandó anyagokat általában hígítatlanul kell alkal ­
mazni. Szilárd anyagok vizsgálatakor (amelyeket szükség esetén 
porrá lehet őrölni) a vizsgálandó anyagot a lehet ő legkisebb, de a 
bőrrel való megfelel ő kontaktus biztosításához elegend ő mennyiség ű 
vízzel (vagy ha szükséges, más megfelel ő vivőanyaggal) meg kell 
nedvesíteni. Ha vízt ől eltérő vivőanyagot alkalmaznak, a viv őanyag 
legfeljebb minimális mértékben befolyásolhatja a vizsgálandó anyag által gyakorolt irritáló hatást.
 
Ha megoldható, az általában 4 órás expozíciós id ő végén az adott 
esetben megmaradt vizsgálandó anyagot vízzel vagy más megfelel ő 
oldószerrel el kell távolítani, de vigyázni kell arra, hogy ezzel ne 
legyenek hatással a meglév ő válaszreakciókra vagy a felhám 
épségére.  
1.4.2.2.  A dózisok  
A vizsgálati helyre 0,5 ml folyadékot vagy 0,5 g szilárd anyagot 
vagy masszát kell felvinni.  
1.4.2.3.  Kiindulási vizsgálat ( in vivo  bőrirritációs/b őrkorróziós vizsgálat egy 
állat felhasználásával)  
Nyomatékosan ajánlott, hogy az  in vivo  vizsgálatot el őször egy 
állaton végezzék el, különösen akkor, ha az anyag gyaníthatóan korróziós hatású. Ez összhangban áll a lépcs őzetes vizsgálati straté ­
giával (lásd az 1. függeléket).
 
Ha az adatok bizonyító erejének elemzése alapján az anyag korróziós 
hatásúnak min ősül, nincsen szükség további állatkísérletekre. A 
legtöbb gyaníthatóan korróziós hatású anyag esetében általában szük ­
ségtelen további  in vivo  vizsgálatokat végezni. Ha azonban nincs 
elegendő bizonyíték, és emiatt indokoltnak látszik a további adat ­
gyűjtés, az alábbi eljárás alkalmazásával korlátozott állatkísérletek 
végezhetők: az állatra egymást követ ően legfeljebb három tapaszt 
kell felhelyezni. Az els ő tapaszt három perc után el kell távolítani, 
és ha nem láthatók súlyos b őrreakciók, a második tapaszt is fel kell 
helyezni, majd egy óra elteltével ezt is el kell távolítani. Ha a 
megfigyelések ebben a szakaszban azt mutatják, hogy humánusan 
megengedhet ő az expozíció négy órára történ ő meghosszabbítása, 
egy harmadik tapaszt is fel lehet helyezni, majd négy óra múlva 
eltávolítani és kiértékelni a válaszreakciót.  
Ha a három egymás utáni expozíció bármelyike után korróziós hatást 
tapasztalható, a vizsgálatot azonnal be kell fejezni. Ha az utolsó tapasz eltávolítása után sem figyelhet ő meg korróziós hatás, az 
állatot 14 napon át meg kell figyelni, kivéve, ha el őbb jelentkezik 
korróziós hatás.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Azokban az esetekben, amikor a vizsgálandó anyag várhatóan nem 
okoz korróziós hatást, de irritáló lehet, négy órára kell felhelyezni 
egyetlen tapaszt egy állatra.  
1.4.2.4.  Ellen őrző vizsgálat ( in vivo  bőrirritációs/b őrkorróziós vizsgálat 
további állatok alkalmazásával)  
Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhet ő meg korróziós hatás, 
legfeljebb további két állaton egy-egy tapasz és négyórás expozíciós 
idő alkalmazásával meg kell er ősíteni az irritációt vagy a negatív 
válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során irritációs választ figyeltek meg, az ellen őrző vizsgálatok lépcs őzetesen is elvégezhe ­
tők, vagy úgy, hogy két további állatot egyszerre kezelnek. Abban a 
kivételes esetben, ha nem végeznek kiindulási vizsgálatot, két vagy három állatot lehet kezelni egy-egy tapasszal, amelyet négy óra után távolítanak el. Ha két állatot használnak, és mindkett ő ugyanolyan 
válaszreakciót mutat, nincs szükség további vizsgálatokra. Egyéb 
esetben egy harmadik állatot is be kell vonni a vizsgálatba. A nem egyértelm ű válaszokat esetleg további állatok alkalmazásával kell 
értékelni.
 
1.4.2.5.  Megfigyelési id őszak 
A megfigyelési id őszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy 
elegendő legyen a megfigyelt hatások visszafordíthatóságának teljes 
kiértékelésére. A vizsgálatot azonban azonnal meg kell szakítani, ha az állat tartósan súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutatja. A 
hatások visszafordíthatóságának meghatározásához az állatokat a 
tapaszok eltávolítása után legfeljebb 14 napig meg kell figyelni. Ha a visszafordíthatóság a 14 napos id őszak vége el őtt bebizonyo ­
sodik, a kísérletet ekkor kell befejezni.
 
1.4.2.6.  Klinikai megfigyelések és a b őrreakciók értékelése  
Minden állatnál meg kell vizsgálni a b őrpír (eritéma) vagy vizeny ő 
(ödéma) jeleit, továbbá a tapasz eltávolítása után 60 perccel, majd 24, 48 és 72 órával értékelni kell a válaszreakciókat. Az egy állattal végzett kiindulási vizsgálatban a vizsgálati területet a tapasz eltávo ­
lítása után azonnal is meg kell vizsgálni. A b őrreakciókat a csatolt 
táblázatban megadottak szerint kell értékelni és jegyz őkönyvezni. Ha 
72 óránál sem irritációként, sem korrózióként nem értékelhet ő bőrká­
rosodás látható, a hatások visszafordíthatóságának meghatározásához 
szükség lehet arra, hogy a megfigyeléseket a 14. napig folytassák. 
Az irritáció megfigyelésén kívül minden lokális toxikus hatást, mint például a b őr zsírtartalmának csökkentését, és bármely káros szisz ­
témás hatást (pl. a mérgezés klinikai tüneteire és a testtömegre 
gyakorolt hatást) részletesen le kell írni, és fel kell jegyezni. A 
nem egyértelm ű eredmények tisztázása érdekében fontolóra kell 
venni kórszövettani vizsgálatok elvégzését is.
 
A bőrreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A b őrreakciók 
értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a 
megfigyelésekben és azok értékelésében részt vev ők segítése érde ­
kében a megfigyeléseket végz ő személyzetet megfelel ően ki kell 
képezni az alkalmazott értékel ő rendszer (lásd a csatolt táblázatot) 
használatára. Hasznos lehet egy, a b őrirritációk és más léziók érté ­
kelését ismertet ő, illusztrált útmutató is (9).  
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK BEMUTATÁSA  
A végleges vizsgálati jelentésben a vizsgálatok eredményeit táblá ­
zatos formában kell összefoglalni, amelynek a 3.1 szakaszban felso ­
rolt tételek mindegyikét tartalmaznia kell.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
A bőrirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, 
illetve visszafordíthatóságával vagy visszafordíthatatlanságával összefüggésben kell értékelni. Az egyes pontszámok nem jelentenek 
abszolút normát egy anyag irritációs tulajdonságai tekintetében, 
mivel a vizsgálandó anyag egyéb hatásait is értékelni kell. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, amelyeket a vizsgálat során tett összes egyéb megfigyeléssel együt ­
tesen kell értékelni.
 
Az irritációs válaszok értékelésekor figyelembe kell venni a b őrlé­
ziók visszafordíthatóságát. Ha az olyan válaszok, mint a sz őrhiány 
(korlátozott területen), kóros elszarusodás (hiperkeratózis), a szövet ­
szaporodás (hiperplázia) vagy a hámlás a 14 napos megfigyelési 
időszak végére sem múlnak el, a vizsgálandó anyagot irritálónak 
kell tekinteni.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Az in vivo  vizsgálatok indoklása: a korábban rendelkezésre álló vizs ­
gálati adatok, ezen belül a lépcs őzetes vizsgálati stratégia során nyert 
adatok bizonyító erejének elemzése:  
— a korábbi vizsgálatból rendelkezésre álló adatok ismertetése,  
— a vizsgálati stratégia egyes szakaszaiban nyert adatok,  
— az elvégzett  in vitro  vizsgálatok, ezen belül az eljárások, illetve a 
vizsgálandó anyaggal és a referenciaanyagokkal a kapott eredmé ­
nyek részleteinek ismertetése,  
— az adatok bizonyító erejének elemzése az  in vivo  vizsgálat elvég ­
zéséhez.  
Vizsgálandó anyag:  
— azonosító adatok (pl. CAS-szám; eredet; tisztaság; ismert szeny ­
nyezők; tételszám),  
— fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. pH, illé ­
konyság, oldhatóság, stabilitás),  
— elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek 
egymáshoz viszonyított aránya.  
Vivőanyag:  
— megjelölés, (adott esetben) koncentráció, alkalmazott térfogat,  
— a vivőanyag megválasztásának indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj/törzs, adott esetben az albínó nyúltól eltér ő faj 
alkalmazásának indoklása,  
— az állatok száma ivaronként,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat el őtt és után,  
— életkor a vizsgálat kezdetén,  
— az állatok származása, tartásuk körülményei, takarmánya stb.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Kísérleti körülmények:  
— a tapasz helyének el őkészítésére alkalmazott technika,  
— a tapasz anyagának és a felhelyezési technika részletes ismer ­
tetése,  
— a vizsgálandó anyagból el őállított készítménynek, az alkalmazás 
és az eltávolítás a részletes ismertetése.  
Eredmények:  
— az irritációs/korróziós válaszok pontszámainak táblázatos 
formában történ ő megadása minden egyes állatra és minden 
egyes mérési id őpontra vonatkozóan,  
— az összes megfigyelt lézió ismertetése,  
— a megfigyelt irritáció vagy korrózió jellegének és mértékének, 
illetve az esetleges kórszövettani eredmények leíró jelleg ű ismer­
tetése,  
— a bőrirritáción és korróziós hatáson kívüli egyéb káros hatások 
(pl. a bőr zsírtartalmának csökkenése) és szisztémás hatások 
ismertetése.  
Az eredmények diszkussziója.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, 
Brussels.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  in vitro  12, pp. 483-524.
 
(5a) B40. vizsgálati módszer, B őrkorrózió.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:/ ­
/www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/ ­
test/monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
(Kérésre az OECD Titkárságon rendelkezésre áll.)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
I. táblázat  
A BŐRREAKCIÓK ÉRTÉKELÉSE  
Bőrpír (eritéma) és pörkképz ődés 
Nincs bőrpír . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nagyon enyhe b őrpír (alig észlelhet ő) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Jól kifejezett b őrpír . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Közepes-súlyos mérték ű bőrpír . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Pörkképz ődésig fokozódó súlyos b őrpír (céklavörös szín), amely lehe ­
tetlenné teszi a b őrpír osztályozását . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Lehetséges maximum: 4  
Vizenyőképződés 
Nincs vizeny ő . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Nagyon enyhe vizeny ő (alig észlelhet ő) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Enyhe vizeny ő (a terület szélei az egyértelm ű kiemelkedések miatt jól 
kifejezettek) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  2 
Közepes súlyosságú vizeny ő (körülbelül 1 mm-re emelkedik ki) . . . . . 3 
Súlyos vizeny ő (több mint 1 mm-re emelkedik ki és nagyobb, mint az 
expozíciós terület) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Lehetséges maximum: 4 A  
Nem egyértelm ű válaszokat kórszövettani vizsgálattal lehet tisztázni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
FÜGGELÉK  
Lépcsőzetes vizsgálati stratégia b őrirritációs és b őrkorróziós vizsgálatokhoz  
ÁLTALÁNOS MEGFONTOLÁSOK  
A tudományos ésszer űség és az állatok kímélete érdekében fontos, hogy elkerül ­
hető legyen az állatokkal való szükségtelen kísérletezés, illetve minimálisra 
lehessen csökkenteni azokat a vizsgálatokat, amelyek valószín űleg súlyos válasz ­
reakciókat váltanak ki a kísérleti állatokban. Az  in vivo  vizsgálatok fontolóra 
vétele előtt minden, az anyag potenciális b őrkorróziós/b őrirritáló hatásával össze ­
függő információt ki kell értékelni. Lehet, hogy elegend ő bizonyíték van a vizs ­
gálandó anyag b őrkorróziós és b őrirritációs potenciál alapján történ ő besorolására 
anélkül, hogy laboratóriumi állatokon kísérleteket kellene végezni. Az adatok bizonyító erejének elemzésével és a lépcs őzetes vizsgálati stratégia alkalmazá ­
sával tehát minimálisra csökkenthet ő az in vivo  vizsgálatok iránti igény, különö ­
sen, ha az anyag valószín űleg súlyos reakciókat okoz.
 
Az anyagok b őrirritáló és b őrkorróziós hatásával kapcsolatban rendelkezésre álló 
információk értékelésére célszer ű elvégezni az adatok bizonyító erejének elem ­
zését annak érdekében, hogy meg lehessen határozni, hogy az  in vivo  bőrvizs­
gálatokon kívül szükség van-e egyéb vizsgálatokra az irritáló/korróziós potenciál 
jellemzéséhez. Ha további vizsgálatokra van szükség, a kísérleti adatok össze ­
gyűjtéséhez, a lépcs őzetes vizsgálati stratégiát javasolt alkalmazni. Az olyan 
anyagok esetében, amelyeket korábban nem vizsgáltak, az anyag b őrkorróziós/ ­
bőrirritáló potenciáljának értékeléséhez szükséges adatsor el őállításához a lépcs ő­
zetes vizsgálati stratégiát kell alkalmazni. Az ebben a függelékben ismertetett vizsgálati stratégiát egy OECD-munkaértekezleten (1) dolgozták ki, majd kés őbb 
jóváhagyták, és a Harmonizált integrált veszélyosztályozási rendszer a vegyi 
anyagok humán egészségügyi és környezeti hatásainak osztályozására keretében 
kibővítették, és 1998 novemberében a Vegyi Anyag Bizottság és a Vegyi Anyag 
Munkacsoport 28. együttes ülésén jóváhagyták (2).
 
Bár ez a lépcs őzetes vizsgálati stratégia nem képezi szerves részét a B4. vizs ­
gálati módszernek, kifejezésre juttatja a b őrirritáció/b őrkorrózió jellemz őinek 
meghatározására ajánlott megközelítést. Ez a megközelítés testesíti meg a legjobb gyakorlatot, és etikai szempontból is irányadó az  in vivo  bőrirritációs/ ­
bőrkorróziós vizsgálatokhoz. A vizsgálati módszer útmutatást ad az  in vivo  vizs­
gálatok elvégzéséhez, és összefoglalja azokat a tényez őket, amelyeket az ilyen 
vizsgálatok megkezdése el őtt fontolóra kell venni. A stratégia megközelítést 
biztosít a vizsgálandó anyag b őrirritáló/b őrkorróziós tulajdonságaival kapcsolatos 
meglévő adatok értékeléséhez, és lépcs őzetes megközelítést jelent az olyan anya ­
gokra vonatkozó adatok összegy űjtéséhez, amelyekhez további vizsgálatokra van 
szükség, vagy amelyeket korábban egyáltalán nem vizsgáltak. Javaslatot tesz továbbá validált és elfogadott  in vitro  vagy ex vivo b őrirritációs/b őrkorróziós 
vizsgálatok meghatározott körülmények esetén történ ő elvégzésére.
 
AZ ÉRTÉKELÉSI ÉS VIZSGÁLATI STRATÉGIA ISMERTETÉSE  
A vizsgálatoknak a lépcs őzetes vizsgálati stratégia (ábra) keretében történ ő elvég­
zése előtt minden rendelkezésre álló információt ki kell értékelni annak meghatá ­
rozása érdekében, hogy szükség van-e  in vivo  bőrvizsgálatokra. Bár egy-egy 
paraméter (pl. széls őséges pH-érték) vizsgálatából is jelent ős mennyiség ű infor­
máció nyerhet ő, az összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell venni. 
A kérdéses anyag vagy analógjai hatásaival kapcsolatos összes adatot értékelni 
kell azok bizonyító erejér ől való döntés meghozatalakor, és meg is kell indokolni 
ezt a döntést. Els ődleges hangsúlyt kell fektetni az anyaggal kapcsolatban rendel ­
kezésre álló humán és állatkísérletes adatokra, ezt követ ően az  in vitro  vagy ex 
vivo vizsgálatok eredményére. Lehet őség szerint kerülni kell a korróziós hatású 
anyagok  in vivo  vizsgálatát. A vizsgálati stratégia során figyelembe veend ő 
tényezők a következ ők: ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
A rendelkezésre álló humán és állatkísérletes adatok értékelése (1. lépés).  Első 
lépésben a rendelkezésre álló humán adatokat, pl. klinikai vagy munka-egészség ­
ügyi vizsgálatokat, valamint esettanulmányokat és/vagy állatkísérletes adatokat, pl. egyszeri vagy ismételt b őrexpozíciós toxicitási vizsgálatokat kell kiértékelni, 
mivel ezek a b őrre gyakorolt hatásokra közvetlenül vonatkozó információkat 
szolgáltatnak. Az ismerten irritáló vagy korróziós hatású anyagokat, illetve 
azokat, amelyek esetében egyértelm űen bizonyítható az ilyen hatások hiánya, 
nem szükséges  in vivo  vizsgálni
 
A szerkezetaktivitási összefüggések (SAR) elemzése (2. lépés).  Ha vannak, fonto ­
lóra kell venni szerkezetileg rokon anyagok vizsgálatát. Ha a szerkezetileg rokon 
anyagokkal vagy elegyeikkel kapcsolatban elegend ő olyan humán és/vagy állat ­
kísérletes adat áll rendelkezésre, amely valószín űsíti a bőrkorróziós/b őrirritációs 
potenciált, feltételezhet ő, hogy az értékelés alatt álló vizsgálandó anyag ugyan ­
ilyen válaszreakciókat vált ki. Ilyen esetekben el őfordulhat, hogy a vizsgálandó 
anyagot nem kell megvizsgálni. A lépcs őzetes vizsgálati stratégia értelmében a 
szerkezetileg rokon anyagok vagy elegyeik vizsgálatából származó negatív adatok nem jelentenek elegend ő bizonyítékot arra nézve, hogy az anyag nem 
korróziós hatású vagy nem irritáló. A b őrkorróziós és b őrirritáló potenciál 
meghatározására validált és elfogadott SAR-megközelítéseket kell alkalmazni.
 
Fizikai-kémiai tulajdonságok és kémiai reaktivitás (3. lépés). A  szélsőséges, 
például pH < 2,0 és > 11,5 kémhatású anyagok er őteljes lokális hatást gyako ­
rolhatnak. Ha a széls őséges pH-érték az alapja annak, hogy egy anyagot korró ­
ziós hatásúnak min ősítsünk, akkor az anyag sav/alkáli tartalékát (vagy pufferka ­
pacitását) is figyelembe lehet venni (3)(4). Ha a pufferkapacitás alapján való ­
színűsíthető, hogy az anyag nem b őrkorróziós hatású, akkor ennek meger ősíté­
sére további vizsgálatokat kell végezni, lehet őleg validált és elfogadott  in vitro  
vagy ex vivo módszerek alkalmazásával (lásd az 5. és 6. lépést).  
Dermális toxicitás (4. lépés).  Ha egy vegyültr ől kiderül, hogy dermális alkal ­
mazás esetén nagyon toxikus, el őfordulhat, hogy az anyag  in vivo  bőrirritációs/ ­
bőrkorróziós vizsgálata nem oldható meg, mivel a vizsgálandó anyag szokásosan 
alkalmazott mennyisége meghaladhatja a nagyon mérgez ő dózist, és ennek követ ­
keztében az állatok elhullását vagy súlyos szenvedését okozhatja. Emellett, ha a 2 000 mg/testtömeg-kg-os határdózisig vagy annál magasabb dózisok alkalmazá ­
sával korábban már végeztek albínó nyulakban  in vivo  dermális toxicitási vizs ­
gálatokat, és nem tapasztaltak b őrirritációt vagy b őrkorróziót, el őfordulhat, hogy 
nem lesz szükség további b őrirritációs/b őrkorróziós vizsgálatokra. A korábbi 
vizsgálatok akut dermális toxicitási eredményeinek értékelésekor egy sor megfon ­
tolást kell figyelembe venni. El őfordulhat például, hogy a b őrléziókkal kapcso ­
latos adatok hiányosak. Esetleg nem nyúlon végezték a vizsgálatokat és a megfigyeléseket, és a különböz ő állatfajokban nagyon eltér ő lehet a válaszreak ­
ciók érzékenysége. Illetve lehetséges, hogy az állatokon alkalmazott vizsgálandó 
anyag formája nem volt alkalmas a b őrirritáció/b őrkorrózió vizsgálatára (pl. a 
dermális toxicitási vizsgálatokban alkalmazott hígítás miatt (5)). Azokban az esetekben azonban, ahol jól megtervezett és lefolytatott dermális toxicitási vizs ­
gálatokat végeztek nyulakon, a negatív eredményeket elegend ő bizonyítéknak 
tekinthetjük arra, hogy az anyag nem korróziós hatású és nem irritáló.
 
In vitro vagy ex vivo vizsgálatok eredményei (5. és 6. lépés).  Nem kell állatokon 
kísérletezni olyan anyagokkal, amelyek e konkrét hatások meghatározására terve ­
zett, validált és elfogadott módszerekkel végzett  in vitro  vagy ex vivo vizsgála ­
tokban (6)(7) korróziós vagy súlyos irritáló hatásokat mutattak. Ilyen esetben fel 
lehet tételezni, hogy az anyag  in vivo  is hasonlóan súlyos hatásokat vált ki.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo vizsgálat nyulakban (7. és 8. lépés).  Ha az adatok bizonyító erejének 
elemzése alapján hozott döntés szerint  in vivo  vizsgálatokat kell végezni, els ő 
lépésben egyetlen állattal kiindulási vizsgálatot kell végezni. Ha e vizsgálat eredménye szerint az anyag b őrkorróziós hatású, nem szabad további vizsgála ­
tokat végezni. Ha a kiindulási vizsgálatban nem tapasztalható korróziós hatás, az 
irritációs vagy negatív választ legfeljebb két további állat négyórás expozíciójával 
ellenőrizni kell. Ha a kiindulási vizsgálatban irritáció tapasztalható, az ellen őrző 
vizsgálat végezhet ő lépcsőzetesen is, vagy úgy is, hogy a két további állatot 
egyszerre kezelnek.
 
HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22- 
24 January 1996(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Healthand Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ ­
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for SkinCorrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic  In vitro , 2 (1) 
pp 19-26.  
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and  In 
vitro  Test Methodsfor Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli 
and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition 
ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-436.  
(6) B40. vizsgálati módszer  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., 
Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The 
ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  in vitro  12, 
pp. 483-524.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Ábra  
VIZSGÁLATI ÉS KIÉRTÉKELÉSI STRATÉGIA A B ŐRIRRITÁCIÓ, ILLETVE A 
BŐRKORRÓZIÓ VIZSGÁLATÁHOZ
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. AKUT TOXICITÁS: SZEMIRRITÁCIÓ/SZEMKORRÓZIÓS 
HATÁS  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer egyenérték ű az OECD TG 405 (2002) módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
Ennek a továbbfejlesztett módszernek a kidolgozása során külön 
figyelmet szenteltek a vizsgálandó anyaggal kapcsolatban rendelke ­
zésre álló összes információ kiértékelése révén lehetségessé váló 
javító beavatkozásoknak, hogy ezáltal elkerülhet ő legyen a laborató ­
riumi állatokon történ ő szükségtelen kísérletezés, és így tiszteletben 
lehessen tartani az állatjóléti szempontokat is. A módszer ajánlást fogalmaz meg arra nézve, hogy az anyag akut szemkorróziós vagy 
szemirritáló hatásának vizsgálatára el őírt in vivo  kísérlet elvégzése 
előtt el kell végezni a rendelkezésre álló adatok bizonyító erejének 
elemzését (1). Ha nem áll rendelkezésre elegend ő adat, akkor ajánlott 
lépcsőzetes vizsgálatok alkalmazásával b ővíteni ezeket (2)(3). A 
vizsgálati stratégia részét képezi validált és elfogadott  in vitro  vizs­
gálatok végzése, amelyek a vizsgálati módszer függelékeként kerülnek ismertetésre. Ajánlott továbbá, hogy az  in vivo  szemvizs ­
gálatok tervbevétele el őtt a szemkorróziós hatás el őrejelzésére végez ­
zenek  in vivo  bőrirritációs/b őrkorróziós vizsgálatot.
 
A tudományos ésszer űség és az állatok kímélete érdekében nem 
szabad  in vivo  vizsgálatokat végezni mindaddig, amíg az anyag 
potenciális szemkorróziós/irritáló hatására vonatkozó összes rendel ­
kezésre álló adatra vonatkozóan el nem végezték az adatok bizo ­
nyító erejének elemzését. Ilyen adatok az embereken és/vagy labo ­
ratóriumi állatokon elvégzett vizsgálatok eredményei, a szerkeze ­
tileg rokon anyagok vagy elegyeik korróziós/irritáló hatásaival 
kapcsolatos tények, az anyag er ős savasságát vagy lúgosságát 
igazoló adatok (4)(5), valamint a validált és elfogadott  in vitro  
vagy ex vivo b őrkorróziós és b őrirritációs vizsgálatokból kapott 
eredmények (6)(6a). El őfordulhat, hogy a vizsgálatokat már az 
adatok bizonyító erejének elemzése el őtt elvégezték vagy éppen 
annak eredményeként végzik el.  
Bizonyos anyagok esetében az ilyen elemzés annak a szükségét 
jelezheti, hogy el kell végezni az anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának  in vivo  vizsgálatát. Minden ilyen esetben, az  in vivo  
szemvizsgálat alkalmazásának tervbevétele el őtt először lehet őleg el 
kell végezni, és ki kell értékelni egy  in vivo  vizsgálatot az anyag 
bőrre gyakorolt hatásainak meghatározására a B4. vizsgálati módszer 
(7) alkalmazásával. Az adatok bizonyító erejének elemzése és a lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazása csökkenti az  in vivo  
szemkorróziós/szemirritációs vizsgálatok szükségességét azoknak az 
anyagoknak az esetében, amelyekhez más vizsgálatokból elegend ő 
bizonyíték áll rendelkezésre. Ha a lépcs őzetes stratégia alkalmazá ­
sával nem határozható meg a szemkorróziós/irritációs potenciál, még 
az in vivo  bőrkorróziós és irritációs vizsgálat elvégzése után sem, 
elvégezhet ő egy in vivo  szemkorróziós/szemirritációs vizsgálat.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
A preferált lépcs őzetes vizsgálati stratégia, amely magában foglalja 
validált  in vitro  vagy ex vivo korróziós/irritációs vizsgálatok elvég ­
zését is, az e vizsgálati módszerhez csatolt függelékben kerül ismer ­
tetésre. A stratégiát egy OECD-munkaértekezlet (8) résztvev ői 
dolgozták ki, javasolták egyhangúlag, majd fogadták el mint a 
Globálisan harmonizált rendszer (GHS) a vegyi anyagok osztályozá ­
sára (9) ajánlott vizsgálati stratégiáját. Az  in vivo  vizsgálatok elvég ­
zése előtt ezt a vizsgálati stratégiát javasolt követni. Új anyagok 
esetében ez az ajánlott lépcs őzetes vizsgálati megközelítés az 
anyag korróziós/irritáló hatásaira vonatkozó, tudományos szem ­
pontból megfelel ő adatok gy űjtésére. Ismert anyagok esetében, ha 
nem áll rendelkezésre elegend ő adat a szemkorróziós/szemirritáló 
és bőrkorróziós/b őrirritáló hatásokról, ennek a stratégiának az alkal ­
mazásával kell pótolni a hiányzó adatokat. Megfelel ően meg kell 
indokolni, ha ett ől eltérő vizsgálati stratégiát vagy eljárást alkalmaz ­
nak, vagy ha úgy döntenek, hogy nem használják a lépcs őzetes vizs ­
gálati megközelítést.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Szemirritáció:  a vizsgálandó anyagnak a szem elüls ő felszínén 
történő alkalmazását követ ően megjelen ő és az alkalmazástól 
számított 21 napon belül teljes mértékben visszafordítható szemel ­
változások.  
Szemkorróziós hatás:  a vizsgálandó anyagnak a szem elüls ő 
felszínén történ ő alkalmazását követ ően megjelen ő és az alkalma ­
zástól számított 21 napon belül nem teljes mértékben visszafordítható szövetkárosodások a szemben, vagy súlyos fizikai látóképesség- romlás.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó anyagot egyetlen dózisban kell alkalmazni a kísérleti 
állat egyik szemén; a másik, nem kezelt szem szolgál kontrollként. A szemirritáció/szemkorrózió mértékét meghatározott id őközönként a 
kötőhártya, szaruhártya és szivárványhártya lézióinak pontozásával 
kell kiértékelni. A hatások teljes kiértékelése érdekében részletesen 
ismertetni kell a szemre gyakorolt egyéb hatásokat és a káros szisz ­
témás hatásokat is. A vizsgálat id őtartamának elég hosszúnak kell 
lennie ahhoz, hogy meg lehessen határozni a hatások visszafordítha ­
tóságát vagy visszafordíthatatlanságát.
 
A vizsgálat bármely fázisában tartósan súlyos szorongás és/vagy 
fájdalom jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell, és az anyagot ennek megfelel ően kell értékelni. Az elhullás 
közelében lév ő és súlyosan szenved ő állatok humánus módon történ ő 
exterminálásáról szóló döntéssel kapcsolatos kritériumok a (10) hivatkozásban találhatók.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.4.1.  Az  in vivo  vizsgálat el őkészítése  
1.4.1.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A preferált laboratóriumi állatfaj az albínó nyúl, és egészséges, fiatal 
felnőtt állatokat kell alkalmazni. Más fajok alkalmazását megfelel ően 
indokolni kell.  
1.4.1.2.  Az állatok el őkészítése  
A vizsgálat el őtt legfeljebb 24 órával a vizsgálatra el őzetesen kivá ­
lasztott kísérleti állat mindkét szemét meg kell vizsgálni. Nem szabad 
olyan állatot használni, amely szemirritációt, szemhibákat vagy 
korábban szerzett szaruhártya-sérülést mutat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
Az állatokat egyedileg kell elhelyezni. Nyulak esetében a kísérleti 
helyiség h őmérsékletének 20  o C (± 3  o C)-nak kell lennie. Bár a 
helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, 
illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg 
a 70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány 
alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 
1.4.2.  Vizsgálati eljárás  
1.4.2.1.  A vizsgálandó anyag alkalmazása  
A vizsgálandó anyagot az alsó szemhéj óvatos elhúzása után az állat 
egyik szemének köt őhártyazsákjába kell bejuttatni. Ezt követ ően 
körülbelül egy másodpercig óvatosan össze kell fogni a szemhéjakat, hogy az anyag ki ne essen vagy folyjon. A másik, nem kezelt szem 
kontrollként szolgál.
 
1.4.2.2.  Öblögetés  
A kísérleti állatok szemét a vizsgálandó anyag becseppentése után 
legalább 24 órán át nem szabad kimosni, kivéve szilárd anyagok 
alkalmazása esetén (lásd 1.4.2.3.2. szakasz), illetve ha azonnali korróziós hatás vagy irritáció tapasztalható. Ha szükségnek t űnik, 
24 óra múlva ki lehet mosni az állatok szemét.
 
Nem javasolt kontrollcsoport alkalmazása a mosás hatásának vizs ­
gálatára, kivéve, ha az tudományosan indokolt. Ha kontrollcsoport 
szükséges, akkor ehhez két nyulat kell használni. A mosás körülmé ­
nyeit, pl. a mosás id őpontját, a mosóoldat összetételét és h őmérsék­
letét, a mosás id őtartamát és sebességét, valamint az alkalmazott 
térfogatot részletesen dokumentálni kell.  
1.4.2.3.  A dózisok  
1.4.2.3.1.  Folyadékok vizsgálata  
Folyadékok vizsgálata esetén 0,1 ml-es dózist kell alkalmazni. 
Pumpás spray-ket nem szabad az anyag közvetlenül a szembe való permetezésére használni. A sprayt ki kell fújni, és tartalmát egy 
edényben össze kell gy űjteni, miel őtt 0,1 ml-t az állat szemébe csep ­
pentenének.
 
1.4.2.3.2.  Szilárd anyagok vizsgálata  
Szilárd anyagok, masszák és szemcsés anyagok vizsgálata esetén az 
alkalmazott mennyiségnek 0,1 ml térfogatúnak kell lennie, illetve tömege nem haladhatja meg a 100 mg-ot. A vizsgálandó anyagot 
finom porrá kell őrölni és térfogatmérés el őtt óvatosan össze kell 
tömöríteni, pl. úgy, hogy a mér őedényt megkocogtatják. Ameny ­
nyiben az els ő megfigyelési id őpontban vagy a kezelés után 1 órával 
azt tapasztalják, hogy a szilárd vizsgálandó anyagot a fiziológiai 
mechanizmusok nem távolították el a kísérleti állat szeméb ől, a 
szemet sóoldattal vagy desztillált vízzel ki lehet öblögetni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Aeroszolok vizsgálata  
Ajánlatos minden pumpás spray tartalmát és aeroszolt összegy űjteni, 
mielőtt a szembe cseppentenék. Az egyetlen kivételt ez alól a túlnyo ­
másos aeroszolos flakonokban lév ő anyagok képezik, amelyeket a 
párolgás miatt nem lehet összegy űjteni. Ilyen esetekben az állat 
szemét nyitva kell tartani, és a vizsgálandó anyagot úgy kell a 
szembe juttatni, hogy a flakont 10 cm távolságban közvetlenül a 
szem előtt tartva és körülbelül egy másodpercig m űködtetve egyszer 
belefújnak az állat szemébe. A spray nyomásától és tartamától függően a távolság ett ől eltérő is lehet. Vigyázni kell arra, hogy a 
spray nyomása ne okozzon szemkárosodást. Megfelel ő esetekben 
szükség lehet arra is, hogy a spray okozta „mechanikai” szemkáro ­
sodás lehet őségét is vegyék figyelembe.
 
Az aeroszol dózisát úgy lehet megbecsülni, hogy a vizsgálatot az 
alábbiak szerint szimulálják. Az anyagot mér őpapírra permetezik egy 
olyan, közvetlenül a papír elé helyezett nyíláson keresztül, amelynek 
mérete megegyezik a nyúl szemének méretével. A papír tömegének növekedését használják fel a szembe permetezett mennyiség közelít ő 
becslésére. Illékony anyagok esetében a dózist úgy lehet 
megbecsülni, hogy vizsgálandó anyag eltávolítása el őtt és után is 
megmérik a befogadó edény tömegét.
 
1.4.2.4.  Kiindulási vizsgálat (in vivo szemirritációs/szemkorróziós vizsgálat 
egy állat alkalmazásával)  
Ahogyan az a lépcs őzetes vizsgálati stratégiában (lásd 1. függelék) is 
kifejtésre kerül, nyomatékosan ajánlott, hogy az  in vivo  vizsgálatot 
először egy állaton végezzék el, különösen akkor, ha az anyag 
gyaníthatóan korróziós hatású.  
Ha e vizsgálat eredményei szerint az ismertetett eljárás alkalmazá ­
sával az anyag korróziós hatású vagy súlyosan irritálja a szemet, nem 
szabad további szemirritációs vizsgálatokat végezni.  
1.4.2.5.  Helyi érzéstelenít őszerek  
Esetenként helyi érzéstelenít őszerek is alkalmazhatók. Ha az adatok 
bizonyító erejének elemzése szerint az anyag fájdalmat okozhat, vagy ha a kiindulási vizsgálat alapján fájdalmas reakció várható, a vizsgálandó anyag becseppentése el őtt helyi érzéstelenít őszer alkal ­
mazható. A helyi érzéstelenít őszer típusát, koncentrációját és dózisát 
körültekint ően kell megválasztani, hogy alkalmazása miatt nehogy 
megváltozzon a vizsgálandó anyag által kiváltott reakció. A kontroll ­
szemet ugyanígy érzésteleníteni kell.
 
1.4.2.6.  Ellen őrző vizsgálat (in vivo szemirritációs vizsgálat további állatok 
alkalmazásával)  
Ha a kiindulási vizsgálat során nem figyelhet ő meg korróziós hatás, 
legfeljebb további két állat alkalmazásával ellen őrizni kell az irritá ­
ciós vagy negatív válaszreakciókat. Ha a kiindulási vizsgálat során súlyos irritációs választ figyeltek meg, amely valószín űsíti, hogy az 
ellenőrző vizsgálatban er őteljes (visszafordíthatatlan) hatás jelentkez ­
het, ajánlatos az ellen őrző vizsgálatot lépcs őzetesen, egyszerre egy 
állat alkalmazásával végezni ahelyett, hogy a két további állatot egyszerre kezelnének. Ha a második állat korróziós vagy súlyos, irritáló hatásokat jelez, nem szabad folytatni a vizsgálatokat. A 
gyenge vagy közepes mérték ű irritáció meger ősítéséhez további 
állatok vizsgálatára lehet szükség.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Megfigyelési id őszak 
A megfigyelési id őszak hosszát úgy kell megválasztani, hogy 
elegendő legyen a megfigyelt hatások mértékének és visszafordítha ­
tóságának teljes kiértékelésére. A vizsgálatot azonban azonnal meg 
kell szakítani, ha az állat tartósan súlyos fájdalom vagy szorongás 
jeleit mutatja (9). A hatások visszafordíthatóságának meghatározá ­
sához az állatokat általában a vizsgálandó anyag alkalmazása után 21 napig kell megfigyelni. Ha a visszafordíthatóság a 21 napos 
időszak vége el őtt bebizonyosodik, a kísérletet ekkor be kell fejezni.
 
1.4.2.7.1.  Klinikai megfigyelések és a b őrreakciók értékelése  
A szemeket a vizsgálandó anyag alkalmazása után 1, 24, 48 és 72 
órával kell megvizsgálni. Ha már megvan a dönt ő információ, az 
állatokat nem szabad a szükségesnél hosszabb ideig a kísérletben tartani. A tartósan súlyos fájdalmat vagy szorongást mutató állatokat 
haladéktalanul és humánus módon exterminálni kell, és az anyagot 
ennek megfelel ő kell értékelni. A vizsgálandó anyag becseppentése 
után az alábbi szemléziókat mutató állatokat humánus módon exter ­
minálni kell: szaruhártya-perforálódás vagy jelent ős mértékű szaru­
hártya-fekélyesdés, ezen belül staphyloma (a szaruhártya rendellenes 
kidomborodása); vér jelenléte a szem elüls ő szemzugában; 48 órán át 
tartó negyedfokú szaruhártya-homály; a fényreflex 72 órán át tartó hiánya (másodfokú szivárványhártya-válaszreakció); a köt őhártya 
fekélyesedése; a köt őhártyában vagy a pislogóhártyában jelentkez ő 
szövetelhalás; vagy pörkképz ődés. Erre azért van szükség, mert az 
ilyen léziók általában nem visszafordíthatók.
 
A szemléziókat nem mutató állatokat legkorábban a becseppentés 
után 3 nappal lehet exterminálni. Az enyhe vagy közepes léziókat mutató állatokat legalább addig megfigyelés alatt kell tartani, amíg a léziók meg nem sz űnnek, vagy legfeljebb 21 napig, amikor a vizs ­
gálatot be kell fejezni. A 7., 14. és 21. napon kell megfigyeléseket 
végezni a léziók állapotának és visszafordíthatóságának vagy vissza ­
fordíthatatlanságának meghatározására.
 
Minden egyes vizsgálatkor min ősíteni kell, és fel kell jegyezni a 
szemreakciókat (köt őhártya-, szaruhártya- és szivárványhártya-reak ­
ciók) (I. táblázat). A szem bármely egyéb lézióját (pl. pannus, elszí ­
neződés) vagy a káros szisztémás hatásokat is fel kell jegyezni.  
A reakciók vizsgálatát megkönnyítheti egy binokuláris kézi 
nagyító, egy kézi vonalfénylámpa, egy biomikroszkóp vagy bármely más megfelel ő eszköz alkalmazása. A 24 óra után tett 
megfigyelések rögzítése után a szemeket fluoreszcein segítségével 
is megvizsgálhatjuk.
 
A szemreakciók értékelése elkerülhetetlenül szubjektív. A szemreak ­
ciók értékelésének harmonizálása és a vizsgáló laboratóriumok, illetve a megfigyelésekben és azok értékelésében részt vev ők segítése 
érdekében a megfigyeléseket végz ő személyzetet megfelel ően ki kell 
képezni az alkalmazott értékel ő rendszer használatára.
 
2. ADATOK  
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
A szemirritációs pontszámokat a léziók jellegével és súlyosságával, 
illetve visszafordíthatóságukkal vagy visszafordíthatatlanságukkal 
összefüggésben kell meghatározni. Az egyes pontszámok nem jelen ­
tenek abszolút normát egy anyag irritációs tulajdonságai tekintetében, mivel a vizsgálandó anyag egyéb hatásait is értékelni kell. Az egyes pontszámokat ehelyett referenciaértékeknek kell tekinteni, 
amelyeknek csak akkor van jelent őségük, ha az összes megfigyelés 
ismertetése és értékelése alátámasztja ezeket.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Az in vivo  vizsgálatok indoklása: a korábban rendelkezésre álló vizs ­
gálati adatok, ezen belül a lépcs őzetes vizsgálati stratégia során nyert 
adatok bizonyító erejének elemzése:  
— a korábbi vizsgálatból rendelkezésre álló vonatkozó adatok 
ismertetése,  
— a vizsgálati stratégia egyes szakaszaiban nyert adatok,  
— az elvégzett  in vitro  vizsgálatok, ezen belül az eljárások, illetve a 
vizsgálandó anyaggal és a referenciaanyagokkal a kapott eredmé ­
nyek részleteinek ismertetése,  
— az elvégzett  in vivo  bőrirritációs/b őrkorróziós vizsgálatok és a 
kapott eredmények ismertetése,  
— az adatok bizonyító erejének elemzése az  in vivo  vizsgálat elvég ­
zéséhez.  
Vizsgálandó anyag:  
— azonosító adatok (pl. CAS-szám, eredet, tisztaság, ismert szeny ­
nyezők, tételszám),  
— fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. pH, illé ­
konyság, oldhatóság, stabilitás, vízzel való reakcióképesség),  
— elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek 
egymáshoz viszonyított aránya,  
— helyi érzéstelenít ő alkalmazása esetén a szer neve, tisztasága, 
típusa, dózisa, valamint a vizsgálandó anyaggal való esetleges kölcsönhatása.
 
Vivőanyag:  
— név, (adott esetben) koncentráció, alkalmazott térfogat,  
— a vivőanyag megválasztásának indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj/törzs, adott esetben az albínó nyúltól eltér ő faj 
alkalmazásának indoklása,  
— az egyes állatok életkora a vizsgálat kezdetén,  
— az állatok száma ivaronként a vizsgálati és kontrollcsoportokban 
(ha szükséges),  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat el őtt és után,  
— származás, tartási körülmények, takarmány stb.  
Eredmények:  
— az irritáció pontozására az egyes megfigyelési id őpontokban 
alkalmazott módszer (pl. kézi vonalfénylámpa, biomikroszkóp, 
fluoreszcein) ismertetése,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— az irritációs/korróziós válaszreakció-adatok táblázatos megjelení ­
tése minden állatra vonatkozóan minden megfigyelési id őpontban 
egészen az állatoknak a vizsgálatból való kivételéig,  
— a megfigyelt irritáció vagy korrózió jellegének és mértékének 
leíró jelleg ű ismertetése,  
— a szemben megfigyelt bármely egyéb lézió (pl. vaszkularizáció, 
pannusképz ődés, összetapadások, elszínez ődés) ismertetése,  
— a szemen kívül jelentkez ő káros lokális és szisztémás hatások, 
illetve adott esetben a kórszövettani eredmények ismertetése.  
Az eredmények diszkussziója.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A laboratóriumi állatokon végzett szemirritációs vizsgálatok eredmé ­
nyeinek emberre extrapolálása csak korlátozott érvényesség ű. Az 
albínó nyúl sok esetben érzékenyebb a szemirritáló vagy -korróziós anyagokra, mint az ember.
 
Vigyázni kell, hogy az adatok értelmezése során kizárható legyen a 
másodlagos fert őzés eredményeként jelentkez ő irritáció lehet ősége.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., 
Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In vitro , 2, 19 – 26.
 
(5) Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  in vitro  12, pp. 483-524.
 
(6a) B40. vizsgálati módszer, B őrkorróziós hatás.  
(7) B4. vizsgálati módszer, Akut toxicitás: b őrirritáció/korrózió.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:/ ­
/www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm).
 
(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
I. táblázat  
A SZEMLÉZIÓK OSZTÁLYOZÁSA  
Szaruhártya  
Homályosság: a homályosság mértéke (az érték megállapításához a legs űrűbb 
területet kell venni) (*) 
Nem észlelhet ő fekélyesedés vagy homályosság . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Szórványos vagy diffúz homályos területek (a megszokott csillogás 
enyhe tompulásán kívül), a szivárványhártya részletei tisztán láthatók 1 
Könnyen kivehet ő áttetsző terület; a szivárványhártya részletei kissé 
elhomályosodottak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Gyöngyházfény ű terület; a szivárványhártya semmilyen részlete nem 
látható; a pupilla mérete alig észlelhet ő . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Nem átlátszó szaruhártya; a szivárványhártya egyáltalán nem látható . 4  
Lehetséges maximum: 4  
MEGJEGYZÉSEK  
(*) A szaruhártya homályos területének nagyságát kell feljegyezni  
Szivárványhártya  
Normális . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Észrevehet ően mélyebb red ők, vérbőség, duzzanat, mérsékelt vérb őség a 
szaruhártya körül; vagy belövelltség; a szivárványhártya fényre reagál (a 
lassú reakció is pozitív) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Vérzés, nagymérv ű roncsolódás, vagy nem reagál a fényre . . . . . . . . . . 2  
Lehetséges maximum: 2  
Kötőhártya  
Vörösödés (a szemhéjak és a szemgolyó köt őhártyájára vonatkozik; kivéve a 
szaruhártyát és a szivárványhártyát) 
Normális . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Egyes vérerek vérteltek (belövelltek) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Diffúz, bíborvörös szín; az egyes vérerek nehezen kivehet ők . . . . . . . . 2 
Diffúz er őteljes vörös . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Lehetséges maximum: 3  
Kötőhártya-vizeny ő (chemosis)  
Duzzanat (a szemhéjak és/vagy a pislogóhártyák esetében) 
Normális . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
A normálisnál kissé duzzadtabb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Nyilvánvaló duzzanat, a szemhéjak részleges kifordulásával . . . . . . . . . . 2 
Duzzanat, nagyjából félig zárt szemhéjakkal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Duzzanat, és a szemhéjak több mint félig zárva vannak . . . . . . . . . . . . . 4
 
Lehetséges maximum: 4  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
FÜGGELÉK  
Lépcsőzetes vizsgálati stratégia szemirritáció és szemkorróziós hatás 
vizsgálatához  
ÁLTALÁNOS MEGFONTOLÁSOK  
A tudományos ésszer űség és az állatok kímélete érdekében fontos, hogy elkerül ­
hető legyen az állatokkal való szükségtelen kísérletezés, illetve minimálisra 
lehessen csökkenteni azoknak a vizsgálatoknak a számát, amelyek valószín űleg 
súlyos válaszreakciókat váltanak ki a kísérleti állatokban. Az  in vivo  vizsgálatok 
fontolóra vétele el őtt minden, az anyag potenciális szemirritáló-korróziós hatá ­
sával összefügg ő információt ki kell értékelni. Lehet, hogy elegend ő bizonyíték 
van a vizsgálandó anyag szemirritációs vagy -korróziós potenciál szempontjából történő besorolására anélkül, hogy laboratóriumi állatokon kísérleteket kellene 
végezni. Az adatok bizonyító erejének elemzésével és a lépcs őzetes vizsgálati 
stratégia alkalmazásával tehát minimálisra csökkenthet ő az in vivo  vizsgálatok 
szükségszer űsége, különösen, ha az anyag valószín űleg súlyos reakciókat okoz.
 
Az anyagok szemirritáló és -korróziós hatásával kapcsolatban rendelkezésre álló 
információk értékelésre javasolt elvégezni az adatok bizonyító erejének elemzését annak érdekében, hogy meg lehessen határozni hogy az  in vivo  szemvizsgála ­
tokon kívül szükség van-e egyéb vizsgálatokra az irritáló/korróziós potenciál 
jellemzéséhez. Ha további vizsgálatokra van szükség, a vonatkozó kísérleti 
adatok összegy űjtésiéhez a lépcs őzetes vizsgálati stratégiát javasolt alkalmazni. 
Az olyan anyagok esetében, amelyeket korábban nem vizsgáltak, az anyag szemkorróziós/szemirritációs potenciáljának értékeléséhez szükséges adatsor 
előállításához a lépcs őzetes vizsgálati stratégiát kell alkalmazni. Az ebben a 
függelékben ismertetett vizsgálati stratégiát egy OECD-munkaértekezleten (1) dolgozták ki, majd kés őbb jóváhagyták, és a Harmonizált integrált veszélyosz ­
tályozási rendszer a vegyi anyagok humán egészségügyi és környezeti hatásainak 
osztályozására keretében kib ővítették és 1998 novemberében a Vegyi Anyag 
Bizottság és a Vegyi Anyag Munkacsoport 28. együttes ülésén jóváhagyták (2).
 
Bár ez a vizsgálati stratégia nem képezi szerves részét a B5. vizsgálati módszer ­
nek, kifejezésre juttatja a szemirritációs/szemkorróziós sajátosságok meghatározá ­
sára ajánlott megközelítést. Ez a megközelítés testesíti meg a legjobb gyakorlatot, és etikai szempontból is irányadó az  in vivo  szemirritációs/szemkorróziós vizs ­
gálatokhoz. A vizsgálati módszer útmutatást ad az  in vivo  vizsgálatok elvégzé ­
séhez és összefoglalja azokat a tényez őket, amelyeket az ilyen vizsgálatok 
megkezdése el őtt fontolóra kell venni. A lépcs őzetes vizsgálati stratégia az adatok 
bizonyító erején alapuló megközelítést tesz lehet ővé az anyagok szemirritációs/ ­
szemkorróziós tulajdonságaival kapcsolatos meglév ő adatok értékeléséhez, és 
lépcsőzetes megközelítést azon anyagok vonatkozó adatainak osszegy űjtéséhez, 
amelyekhez további vizsgálatokra van szükség, vagy amelyeket korábban egyál ­
talán nem vizsgáltak. A stratégia magában foglalja továbbá, hogy el őször validált 
és elfogadott  in vitro  vagy ex vivo vizsgálatokat kell végezni, majd meghatá ­
rozott körülmények esetén a B4. b őrirritációs/b őrkorróziós vizsgálati módszerrel 
további vizsgálatokat (3) (4) kell lefolytatni.
 
A LÉPÉSENKÉNTI VIZSGALATI STRATÉGIA ISMERTETÉSE  
A vizsgálatoknak a lépcs őzetes vizsgálati stratégia (ábra) keretében történ ő elvég­
zése előtt minden rendelkezésre álló információt ki kell értékelni annak meghatá ­
rozása érdekében, hogy szükség van-e  in vivo  szemvizsgálatokra. Bár egy-egy 
paraméter (pl. széls őséges pH-érték) vizsgálatából is jelent ős mennyiség ű infor­
máció nyerhet ő ki, az összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell 
venni. A kérdéses anyag vagy szerkezeti analógjai hatásaival kapcsolatos összes 
vonatkozó adatot értékelni kell az adatok bizonyító erejér ől való döntés 
meghozatalakor, és meg is kell indokolni ezt a döntést. Els ődleges hangsúlyt 
kell fektetni az anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló humán és állatkísérletes adatokra, ezt követ ően az  in vitro  vagy ex vivo vizsgálatok eredményére. Lehe ­
tőség szerint kerülni kell korróziós hatású anyagok  in vivo  vizsgálatát. A vizs ­
gálati stratégia során figyelembe veend ő tényezők a következ ők:
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
A rendelkezésre álló humán és állatkísérletes adatok értékelése (1. lépés).  Első 
lépésben a rendelkezésre álló humán adatokat, pl. klinikai vagy munkaegészség ­
ügyi vizsgálatokat, valamint esettanulmányokat és/vagy állatokban végzett szem ­
vizsgálatok adatait kell kiértékelni, mivel ezek a szemre gyakorolt hatásokkal közvetlenül összefügg ő információkat szolgáltatnak. Ezt követ ően a rendelke ­
zésre álló b őrkorróziós/b őrirritációs humán vizsgálatok és/vagy állatkísérletek 
adatait kell kiértékelni. Az ismerten szemkorróziós hatású vagy súlyosan szemir ­
ritáló anyagokat nem szabad állatok szemébe cseppenteni, ahogyan ab őrre korró­
ziós hatású vagy irritáló anyagokat sem; az ilyen anyagokat úgy kell tekinteni, 
hogy a szemre is korróziós hatásúak és/vagy irritálok. Nem szabad  in vivo  
szemvizsgálatokat végezni olyan anyagokkal sem, amelyek esetében korábbi szemvizsgálatok alapján elegend ő bizonyíték van az ilyen hatások hiányára.
 
A szerkezet-aktivitási összefüggések (SAR) elemzése (2. lépés).  Ha vannak, fonto ­
lóra kell venni szerkezetileg rokon anyagok vizsgálatát. Ha a szerkezetileg rokon 
anyagokkal vagy elegyeikkel kapcsolatban elegend ő olyan humán és/vagy állat ­
kísérletes adat áll rendelkezésre, amely valószín űsíti a szemkorróziós/ ­
szemirritációs potenciált, feltételezhet ő, hogy a vizsgálandó anyag ugyanilyen 
válaszreakciókat vált ki. Ilyen esetekben a vizsgálandó anyagot esetleg nem 
kell megvizsgálni. A lépcs őzetes vizsgálati stratégia értelmében a szerkezetileg 
rokon anyagok vagy elegyeik vizsgálatából származó negatív adatok nem jelen ­
tenek elegend ő bizonyítékot arra, hogy az anyag nem korróziós hatású vagy nem 
irritáló. A b őrre és a szemre gyakorolt hatások vonatkozásában is validált és 
elfogadott SAR-megközelítéseket kell alkalmazni a korróziós és irritáló potenciál meghatározására.
 
Fizikai-kémiai tulajdonságok és kémiai reaktivitás (3. lépés). A  szélsőséges, 
például a pH ≤ 2,0 és ≥ 11,5 kémhatású anyagok er őteljes lokális hatást gyako ­
rolhatnak. Ha a széls őséges pH-érték az alapja annak, hogy egy anyagot korró ­
ziós hatásúnak min ősítsenek, akkor figyelembe lehet venni az anyag sav/alkáli 
tartalékát (vagy pufferkapacitását) is (5)(6). Ha a pufferkapacitás alapján való ­
színűsíthető, hogy az anyag  nem szemkorróziós hatású, akkor ennek meger ősíté­
sére további vizsgálatokat kell végezni, lehet őleg validált és elfogadott  in vitro  
vagy ex vivo módszerek alkalmazásával (lásd az 5. és 6. lépést).  
Más meglév ő információk fontolóra vétele (4. lépés).  Ebben a fázisban a dermális 
alkalmazás esetén jelentkez ő szisztémás toxicitással kapcsolatban rendelkezésre 
álló összes információt ki kell értékelni. A vizsgálandó anyag akut dermális 
toxicitását is fontolóra kell venni. El őfordulhat, hogy nem kell a szemben 
megvizsgálni egy anyagot, ha igazolták, hogy dermális alkalmazás esetén er ősen 
mérgező. Bár nem feltétlenül van összefüggés az akut dermális toxicitás és a 
szemirritáció/szemkorrózió között, fel kell tételezni, hogy ha egy szer dermálisan alkalmazva er ősen mérgez ő, a szembe cseppentve is nagyon mérgez ő lesz. Az 
ilyen adatokat a 2. és a 3. lépés között is figyelembe lehet venni.
 
In vitro vagy ex vivo vizsgálatok eredményei (5. és 6. lépés).  Nem kell állatokon 
kísérletezni olyan anyagokkal, amelyek validált és kimondottan a szem vagy a 
bőr korróziójának/irritációjának értékelésére elfogadott módszerekkel végzett in  
vitro  vagy ex vivo vizsgálatokban (7)(8) korróziós vagy súlyos irritáló hatást 
mutattak. Ilyen esetben fel lehettételezni, hogy az anyag  in vivo  is hasonlóan 
súlyos hatásokat vált ki. Ha nem állnak rendelkezésre validált és elfogadott  
in vitro / ex vivo vizsgálatok, át lehet ugorni az 5. és a 6. lépést és közvetlenül 
a 7. lépéshez lépni.  
Az anyag in vivo b őrirritáló vagy b őrkorróziós hatásának vizsgálata (7. lépés).  
Ha a fent felsorolt vizsgálatok adatai alapján nincs elegend ő bizonyíték, amellyel 
meggyőző módon el lehetne végezni az anyag szemirritációs/szemkorróziós 
potenciáljának az adatok bizonyító erején alapuló elemzését, el őször az  in vivo  
bőrirritációs/b őrkorróziós potenciált kell a B4. vizsgálati módszer (4) és az ahhoz 
csatolt függelék (9) segítségével kiértékelni. Ha kimutatható, hogy az anyag 
bőrkorróziót vagy súlyos b őrirritációt okoz, más következtetést alátámasztó infor ­
mációk hiányában az anyagot korróziós hatású szemirritáló anyagnak kell tekin ­
teni. Ilyen módon tehát nem kell  in vivo  szemvizsgálatot végezni. Ha az anyag 
nem bőrkorróziós vagy súlyosan b őrirritáló hatású,  in vivo  szemvizsgálatot kell 
végezni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo vizsgálat nyulakban  (8. és 9. lépés). Az  in vivo  szemvizsgálatokat 
egyetlen állatot alkalmazó kiindulási vizsgálattal kell kezdeni. Ha ennek eredmé ­
nyei szerint az anyag súlyosan szemirritáló vagy szemkorróziós hatású, nem szabad további vizsgálatokat végezni. Ha a kiindulási vizsgálat nem mutat ki semmilyen korróziós vagy súlyosan irritáló hatást, két további állat alkalmazá ­
sával ellen őrző vizsgálatot kell végezni.
 
HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance 
Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ ­
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.  
(4) B4. vizsgálati módszer, Akut toxicitás: b őrirritáció/korrózió.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential 
of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 
12, 227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. {1998} The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  in 
vitro  12, pp. 48 3-524.
 
(8) B40. vizsgálati módszer, B őrkorróziós hatás.  
(9) A B4. vizsgálati módszer függeléke: Lépcs őzetes vizsgálati stratégia b őrir­
ritációhoz és b őrkorrózióhoz.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Ábra  
Vonatkozó vizsgálati és kiértékelési stratégia szemirritáció, illetve szemkorróziós hatás 
vizsgálatához
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. A B ŐR ÉRZÉKENNYÉ TÉTELE  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Megjegyzések:  
Az érzékenységnek, illetve a vizsgálatok azon képességének, hogy 
felderítik az emberek b őrét potenciálisan érzékennyé tev ő anyagokat, 
nagy jelent ősége van a toxicitás közegészségügyi osztályozási rend ­
szerében.  
Nincs olyan vizsgálati eljárás, amely a potenciálisan az emberi b őrt 
érzékennyé tev ő összes anyagot megfelel ően kimutatja, illetve amely 
az összes anyag tekintetében megfelel ően alkalmazható.  
Az anyag fizikai tulajdonságait, beleértve a b őrön való áthatolás 
képességét és egyéb tényez őket is, meg kell fontolni egy vizsgálat 
kiválasztása során.  
Kétféle vizsgálatot dolgoztak ki tengerimalacokhoz: az egyik a hatás ­
javító típusú vizsgálat, amelyikben az allergiás állapot esetleges el ői­
dézése FCA-ban (Freunds Complete Adjuvant) való feloldás vagy szuszpendálás segítségével történik; a másik a nem hatásjavító típusú 
vizsgálat.
 
A hatásjavító típusú vizsgálatok valószín űleg pontosabbak egyes 
anyagok emberek b őrén érzékenységet el őidéző hatásának el őrejel­
zésére, mint azok a módszerek, amelyek nem alkalmazzák az FCA-t, ezért ezek a módszerek el őnyben részesülnek.
 
A tengerimalac leger ősebb ingerlési vizsgálata (Guinea-Pig Maximi ­
sation Test, GMPT) széles körben alkalmazott hatásjavító típusú vizsgálat. Bár számos másik módszer is alkalmazható egy anyag lehetséges, a b őrt érzékennyé tev ő hatásának megállapítására, a 
GPMT a leginkább javasolt hatásjavító típusú módszer.
 
Sok vegyianyagosztály esetében a nem hatásjavító vizsgálatok (ame ­
lyek közül a leginkább javasolt a Bühler-vizsgálat) az általános véle ­
mény szerint kevésbé érzékenyek.  
Egyes esetekben megfelel ő indokok állnak fenn a küls őleg történ ő 
adagolással végzett Bühler-vizsgálat választásához, a b őrbe befecs ­
kendezéses GPMT vizsgálat alkalmazása helyett. A Bühler-vizsgálat 
alkalmazását tudományosan indokolni kell.  
Az alábbi módszer ismerteti a GPMT és a Bühler-vizsgálatot. Más 
módszerek is alkalmazhatók, ha alkalmazásuk jóváhagyott és tudo ­
mányosan alátámasztottak.  
Amennyiben egy elismert sz űrővizsgálat pozitív eredményt ad, a 
vizsgált anyagot potencionális érzékenyít őként kell megjelölni. 
További vizsgálatot tengerimalacokkal nem szükséges végezni. Azonban, ha negatív eredményt ad a sz űrő vizsgálat, akkor az itt 
leírt eljárásnak megfelel ően kell a vizsgálatot a tengerimalacokkal 
elvégezni.
 
Lásd továbbá a B. rész Általános bevezetését.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Bőr érzékennyé tétele: (allergén kontakt dermatitis) a vizsgált 
anyagra adott, az immunrendszer által irányított b őrválasz. Ember ­
eknél a válasz jellemz ő tünetei: viszketés, b őrpirosság, ödéma, 
kiütés, hólyag, vagy ezen jelenségek valamilyen kombinációja. 
Más fajoknál a reakciók különbözhetnek, és esetleg csak b őrpirosság 
és ödéma jelentkezik.  
Indukciós expozíció: kísérleti eljárás, amikor a kísérlet alanyát kite ­
szik egy vizsgált anyag hatásának, azzal a céllal, hogy túlérzékeny 
állapotot idézzenek el ő. 
Indukciós fázis: legalább egyhetes id őtartam az indukciós expozíciót 
követően, ami alatt a túlérzékeny állapot kialakulhat.  
Kiváltó expozíció: kísérleti expozíció, amikor az el őzetesen kezelt 
kísérleti állatot kiteszik a vizsgált anyag hatásának az indukciós időszak után azzal a céllal, hogy meghatározzák túlérzékeny 
módon reagál-e.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
A kísérleti eljárás érzékenységét és megbízhatóságát felmérik minden 
hat hónapban, olyan anyagok felhasználásával, amelyeknek ismerten 
gyenge, vagy közepes b őrérzékenyít ő hatásuk van.  
Helyesen lefolytatott vizsgálat esetén, hatásjavító vizsgálatban 
legalább 30 százalékban, nem hatásjavító vizsgálat esetén legalább 15 százalékban jelentkeznie kell a gyenge/közepes válasznak.
 
A következ ő anyagok alkalmazása javasolt:  
CAS-szám EINECS-szám EINECS megnevezés Közismert név  
101-86-0 202-983-3 alfa-Hexilfahéjaldehid α-hexil-cinnamaldehid 
149-30-4 205-736-8 benzotiazol-2-tiol (2-Merkap ­
tobenztiazol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzokain nordkain  
Meghatározott körülmények között megfelel ő indoklással olyan más 
ellenőrző anyagokat is fel lehet használni, amelyek megfelelnek a 
fenti követelményeknek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALAPELVE  
A kísérleti állatokat el őször alávetik a vizsgált anyag hatásának intra ­
dermális befecskendezés és/vagy epidermális adagolás útján (induk ­
ciós expozíció). Egy 10–14 napos pihentetési id őszak után (induk ­
ciós fázis), amely alatt az immunválasz kifejl ődhet, a kísérleti állatok 
megkapják a kiváltó dózist. A kísérleti állatoknak a kiváltó expozí ­
cióra adott reakciójának kiterjedtségét és mértékét összehasonlítják a kontrollcsoport tagjainak reakciójával, amelyeket látszólagos induk ­
ciónak vetettek alá, és amelyek megkapták a kiváltó expozíciót.
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK LEÍRÁSA  
Ha a vizsgált anyag eltávolítása szükségesnek t űnik, akkor azt víz, 
vagy valamilyen megfelel ő oldószer alkalmazásával hajtható végre, a 
létrejött reakció, vagy az epidermisz épségének befolyásolása nélkül.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Tengerimalac leger ősebb ingerlési vizsgálata (GPMT)  
1.5.1.1. E l ő k é s z ü l e t e k  
Az egészséges, fiatal feln őtt albinó tengerimalacokat a vizsgálat 
megkezdése el őtt legalább öt napon át a laboratóriumi körülmé ­
nyekhez kell szoktatni. A vizsgálat el őtt véletlenszer űen kiválasztják, 
és a kezelési csoportokba osztják az állatokat. A sz őrzet eltávolítását 
nyírással, borotválással vagy esetleg kémiai sz őrtelenítéssel végzik, 
az alkalmazott vizsgálati eljárástól függ ően. Gondosan el kell kerülni 
a bőr felhorzsolását. Az állatok tömegét megmérik a vizsgálat 
kezdete el őtt és a befejezését követ ően. 
1.5.1.2. V i z s g á l a t i k ö r ü l m é n y e k  
1.5.1.2.1. Kísérleti állatok  
Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumban szaporított 
albinó tengerimalacokat alkalmaznak.  
1.5.1.2.2. Az állatok száma és neme  
Hím és n őstény egyedek egyaránt használhatók. A n őstényeknél 
követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek.  
Legalább 10 állatot kell alkalmazni a kezelt csoportban és 5-öt a 
kontrollcsoportban. Ha kevesebb, mint 20 tengerimalacot használtak 
a vizsgálati csoportban és kevesebb mint 10-et a kontrollcsoportban, 
és nem lehet azt a következtetést levonni, hogy a vizsgált anyag érzékenységet okoz, akkor a kísérleti állatok számát legalább 20-ra, a kontrollcsoportban lév ő állatok számát legalább 10-re növelve, 
további kísérlet elvégzése célszer ű.
 
1.5.1.2.3. Adagolási szintek  
Az indukciós expozícióhoz felhasznált vizsgált anyag koncentrációja 
legyen megfelel ően elviselhet ő és a lehet ő legmagasabb, ami még 
csak gyenge közepes b őrirritációt okoz. A kiváltó expozíciónál alkal ­
mazott koncentráció a legmagasabb, még nem irritatív dózis legyen. 
Ha szükséges, akkor a megfelel ő koncentrációk két vagy három állat 
alkalmazásával végzett el ővizsgálattal meghatározhatók. Megfonto ­
landó az FCA-val kezelt állatok e célra való felhasználása.  
1.5.1.3. A k í s é r l e t v é g r e h a j t á s a  
1.5.1.3.1. Indukció  
Kezelt csoport, 0-dik nap  
Három pár injekció beadása intradermálisan, 0,1 ml térfogattal, a váll 
környékére, amelyet el őzőleg megtisztítottak a sz őrzettől, olyan 
módon, hogy minden párból egy a középvonal egyik, egy a másik oldalára esik.
 
Injekció 1.1:1 keverék (v/v) FCA/víz, vagy fiziológiás sóoldat.  
Injekció 2. a vizsgált anyag, megfelel ő vivőanyagban, a kiválasztott 
koncentrációban.  
Injekció 3. a vizsgált anyag a kiválasztott koncentrációban, 
amelyet FCA/víz vagy, fiziológiás sóoldat 1:1 keverékében (v/v) készítenek el.
 
A harmadik injekciónál a vízben oldható anyagokat feloldják a vizes 
fázisban, miel őtt az FCA-val összekevernék. A vizes fázis hozzáa ­
dása előtt a zsírban oldódó, illetve az oldhatatlan anyagokat szusz ­
pendálják FCA-ban. A vizsgált anyag végs ő koncentrációja 
megegyezik a 2. injekció során alkalmazottal.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
A 1. és a 2. injekciót egymáshoz közel adják be a fejhez legköze ­
lebbre, míg a harmadikat a vizsgálati terület farok felé es ő részén 
kell beadni.  
Kontrollcsoport, 0-dik nap  
Három pár injekció beadása 0,1 ml térfogattal, ugyanarra a helyre, 
mint a kezelés alatt álló állatoknál.  
Injekció 1.1:1 keverék (v/v) FCA/víz, vagy fiziológiás sóoldat.  
Injekció 2. hígítatlan viv őanyag.  
Injekció 3. 50 % m/v viv őanyag-készítmény FCA/víz, vagy fizioló ­
giás sóoldat 1:1 keverékében (v/v).  
Kezelt és kontrollcsoport, 5–7. nap  
Körülbelül 24 órával a helyi indukciós alkalmazás megkezdése el őtt, 
ha az anyag nem irritatív hatású, a vizsgálati területet rövid sz őr­
zetnyírás és/vagy borotválás után 0,5 ml 10 százalékos nátrium- lauril-szulfát vazelines elegyével kezelik, a helyi irritáció kiváltása 
érdekében.
 
Kezelt csoport, 6–8. nap  
A vizsgálati felületet ismét megtisztítják a sz őrzettől. Egy szűrőpapírt 
(2 × 4 cm) telítenek a vizsgált anyag alkalmas viv őanyaggal képzett 
oldatával, azt alkalmazzák a vizsgált felületen, és azzal szigetel ő 
kötés alkalmazásával, 48 órán keresztül szoros érintkezésben tartják. A vivőanyag kiválasztását indokolni kell. Szilárd anyagokat finomra 
porítják, és a megfelel ő vivőanyaggal elegyítik. A folyadékok adott 
esetben hígítás nélkül is alkalmazhatóak.
 
Kontrollcsoport, 6–8. nap  
A vizsgálati felületet ismét megtisztítják a sz őrzettől. A vivőanyagot 
önmagában viszik fel azonos eljárással a vizsgált felületre, és azzal 
szigetelő kötés alkalmazásával, 48 órán keresztül szoros érintke ­
zésben tartják.  
1.5.1.3.2. Kiváltás  
Kezelt és kontrollcsoport, 20–22. nap  
A hasszéleket megtisztítják a sz őrzettől, mind a kezelt, mind a kont ­
rollcsoport esetében. Egy tapaszt, vagy egy tokot helyeznek fel az állatok hasának egyik szélére, amelyet megtöltenek a vizsgált anyag ­
gal, és ha lehetséges, akkor egy tokot vagy egy tapaszt alkalmaznak, 
helyeznek fel a másik hasszélen, amelyet megtöltenek a viv őanyag­
gal. A tapaszokat szigetel ő kötés segítségével, 24 órán keresztül 
szoros érintkezésben tartják a b őrrel.
 
1.5.1.3.3. Megfigyelés és értékelés: kezelt és kontrollcsoport  
— a tapasz eltávolítása után, hozzávet őleg 21 órával a felületet 
megtisztítják és rövidre nyírják és/vagy leborotválják, és sz őrte­
lenítik, ha szükséges,  
— nagyjából 3 órával kés őbb (hozzávet őleg 48 órával a kiváltó 
expozíció kezdete után) megfigyelik és feljegyzik a b őrreakciót 
a függelékben megadott fokozatoknak megfelel ően, 
— hozzávet őleg 24 órával ez után a megfigyelés után egy második 
megfigyelést is végeznek (72 órával a kísérlet kezdete után) és ezt is feljegyzik.
 
Javasolt a kezelt és a kontrollállatok vakpróbával történ ő 
megfigyelése.  
Ha szükséges az els ő kiváltás eredményeinek pontosítása, akkor – 
szükség esetén – egy második kiváltás (azaz újbóli kiváltás) alkal ­
mazása megfontolandó egy új kontrollcsoporton, hozzávet őleg egy 
héttel az els ő után. Újbóli kiváltást az eredeti kontrollcsoporton is 
végre lehet hajtani.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Minden b őrreakciót és minden észlelhet ő leletet, beleértve a szisz ­
témás reakciókat, amelyek az indukció és a kiváltás hatására jönnek 
létre, megfigyelnek és feljegyeznek a Magnusson/Kligman-féle érté ­
kelési skála szerint (lásd: Függelék). Egyéb eljárások (pl. kórszövet ­
tani vizsgálatok, a b őrön található ráncok mélységének mérése) is 
elvégezhet ők, a kétséges reakciók tisztázása érdekében.  
1.5.2.  Bühler-vizsgálat  
1.5.2.1. E l ő k é s z ü l e t e k  
Az egészséges, fiatal feln őtt albinó tengerimalacokat a vizsgálat 
megkezdése el őtt legalább öt napon át a laboratóriumi körülmé ­
nyekhez kell szoktatni. A vizsgálat el őtt véletlenszer űen kiválasztják, 
és a kezelési csoportokba osztják az állatokat. A sz őrzet eltávolítását 
nyírással, borotválással vagy esetleg kémiai sz őrtelenítéssel végzik, 
az alkalmazott vizsgálati eljárástól függ ően. Gondosan el kell kerülni 
a bőr felhorzsolását. Az állatok tömegét megmérik a vizsgálat 
kezdete el őtt és a befejezését követ ően. 
1.5.2.2. V i z s g á l a t i k ö r ü l m é n y e k  
1.5.2.2.1. Kísérleti állatok  
Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumban szaporított 
albinó tengerimalacokat alkalmaznak.  
1.5.2.2.2. Az állatok száma és neme  
Hím és n őstény egyedek egyaránt használhatók. A n őstényeknél 
követelmény, hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek.  
Legalább 20 állatot kell alkalmazni a kezelt csoportban és 10-et a 
kontrollcsoportban.  
1.5.2.2.3. Adagolási szintek  
Az indukciós expozícióhoz felhasznált vizsgált anyag koncentrációja 
legyen a lehet ő legmagasabb, ami gyenge, ill. nem túl er ős bőrirri­
tációt okoz. A kiváltó expozíciónál alkalmazott koncentráció a legmagasabb, még nem irritatív dózis legyen. Ha szükséges, akkor 
a megfelel ő koncentrációk két vagy három állat alkalmazásával 
végzett el őzetes vizsgálattal meghatározhatók.
 
Vízoldékony vizsgálati anyagoknál célszer ű vizet, vagy nem irritatív 
hatású felszínkezel ő oldatot használni viv őanyagként. Más vizsgált 
anyagokhoz 80 % etanol/víz ajánlott az indukcióhoz, és aceton a kiváltáshoz.
 
1.5.2.3. A k í s é r l e t v é g r e h a j t á s a  
1.5.2.3.1. Indukció  
Kezelt csoport, 0-dik nap  
Az egyik hasszélt megtisztítják a sz őrzettől (rövidre nyírják). Egy 
tapaszt helyeznek fel, amelyet teljesen telítenek a megfelel ő vivő­
anyagban elegyített vizsgálati anyaggal (a viv őanyag kiválasztását 
indokolni kell, folyékony vizsgált anyagok felvihet ők adott esetben 
hígítás nélkül is).  
A vizsgálati tapaszt felhelyezik a vizsgálat felületre, és egy megfelel ő 
szigetelő tapasszal, vagy tokkal, szigetel ő kötés segítségével 6 órán 
keresztül érintkezésben tartják a kísérleti állat b őrével.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
A vizsgálati tapasznak szigetel őnek kell lennie. Egy kerek vagy 
négyzet alakú vattakötés alkalmas, aminek legalább 4–6 cm  2 terüle­
tűnek kell lennie. A zártság biztosítására megfelel ő leszorító eszköz 
alkalmazása javasolt. Ha pólyát alkalmaznak, akkor bizonyos körül ­
mények között további expozícióra lehet szükség.  
Kontrollcsoport, 0-dik nap  
Az egyik hasszélt megtisztítják a sz őrzettől (rövidre nyírják). A viv ő­
anyagot önmagában helyezik fel, azonos módon, mint ahogy az a 
kezelt csoportnál történik. A vizsgálati tapaszt felhelyezik a vizsgálat felületre, és egy megfelel ő szigetelő tapasszal, vagy tokkal, szigetel ő 
kötés segítségével 6 órán keresztül érintkezésben tartják a kísérleti 
állat bőrével.
 
Kezelt és kontrollcsoport, 6–8. és 13–15. nap  
A 0-dik napon végzettel megegyez ő eljárást kell végrehajtani, ugyan ­
azon a vizsgálati felületen (sz őrnyírás, ha szükséges) ugyanazon a 
hasszélen a 6–8. napon és megismételve a 13–15. napon.  
1.5.2.3.2. Kiváltás  
Kezelt és kontrollcsoport, 27–29. nap  
A kezeletlen hasszélt megtisztítják a sz őrzettől (rövidre nyírják), 
mind a kezelt, mind a kontrollcsoport esetében. Egy szigetel őtapaszt 
vagy egy tokot helyeznek fel a kezelt és kontrollcsoportba tartozó állatok hátsó, kezeletlen hasszélére, amelyet megtöltenek a megfelel ő 
mennyiség ű, legnagyobb, de nem irratív koncentrációjú vizsgált 
anyaggal.
 
Adott esetben csak viv őanyaggal átitatott szigetel őtapaszt vagy -tokot 
helyeznek fel a kezelt és a kontrollcsoportba tartozó állatok elüls ő, 
kezeletlen hasszélére. A tapaszt vagy tokot megfelel ő kötés segít ­
ségével, 6 órán keresztül szoros érintkezésben tartják a kísérleti állat bőrével.
 
1.5.2.3.3. Megfigyelés és értékelés  
— a tapasz eltávolítása után hozzávet őleg 21 órával a felületet 
megtisztítják a sz őrzettől, 
— hozzávet őleg 3 órával kés őbb (körülbelül 30 órával a kiváltó 
tapasz alkalmazása után) a b őr reakcióját megfigyelik és 
feljegyzik a függelékben megadott fokozatoknak megfelel ően, 
— hozzávet őleg 24 órával ezen megfigyelés után (nagyjából 54 
órával a kiváltó tapasz alkalmazása után) a b őr reakcióját ismét 
megfigyelik és feljegyzik.  
Javasolt a kezelt és a kontrollállatok vakpróbával történ ő 
megfigyelése.  
Ha szükséges az els ő kiváltás eredményeinek pontosítása, akkor – 
szükség esetén – egy második kiváltás (azaz újbóli kiváltás) alkal ­
mazása megfontolandó egy új kontrollcsoporton, hozzávet őleg egy 
héttel az els ő után. Újbóli kiváltást az eredeti kontrollcsoporton is 
végre lehet hajtani.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Minden b őrreakciót és minden észlelhet ő leletet, beleértve a szisz ­
témás reakciókat, amelyek az indukció és a kiváltás hatására jönnek 
létre, megfigyelnek és feljegyeznek a Magnusson/Kligman-féle érté ­
kelési skála szerint (lásd: Függelék). Egyéb eljárások (pl. kórszövet ­
tani vizsgálatok, a b őrön található ráncok mélységének mérése) is 
elvégezhet ők a kétséges reakciók tisztázása érdekében.  
2. ADATOK (GPMT és Bühler vizsgálatok)  
Minden adatot táblázat formájában összesítenek, amely tartalmazza 
minden állat tekintetében az egyes megfigyelési id őpontok alkal ­
mával észlelt b őrreakciókat.  
3. ZÁRÓVIZSGÁLATI JELENTÉS (GPMT ÉS BÜHLER VIZS ­
GÁLAT)  
Ha szűrő próbát végeznek a tengerimalac-vizsgálat el őtt (pl. helyi 
nyirokcsomópróba [LLNA], egérfüldaganat-vizsgálat [MEST]), akkor vizsgálat leírását ill. az irodalmi hivatkozásokat, beleértve az eljárás részleteit is meg kell adni a kapott eredményekkel és a vizsgált és az 
összehasonlító anyaggal együtt.
 
Vizsgálati jelentés (GPMT és Bühler vizsgálatok)  
A vizsgálati jelentésben – amennyiben lehetséges – az alábbi infor ­
mációknak kell szerepelniük:  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott tengerimalactörzs,  
— az állatok száma, életkora és neme,  
— az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor.  
Vizsgálati körülmények:  
— az állat azon testrészének el őkészítése, ahová felhelyezik a vizs ­
gált anyagot,  
— a felhasznált tapasz típusának és a tapaszolási eljárásnak a rész ­
letes leírása,  
— az előzetes vizsgálat eredménye, a vizsgálatban alkalmazandó 
indukciós és kiváltó koncentrációra vonatkozó következtetésekkel együtt,
 
— a vizsgált anyag el őkészítésének, alkalmazásának és eltávolítá ­
sának részletei,  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  
— a viv ő és a vizsgált anyag koncentrációja az indukciós és a 
kiváltó eljárásban, és a két eljárás során összesen felhasznált 
vizsgált anyag mennyisége.  
Eredmények:  
— a legutolsó, a vizsgálat érzékenységét és megbízhatóságát ellen ­ 
őrző eljárás (ld. 1.3.) eredményeinek összefoglalása, beleértve az 
ehhez felhasznált anyagokra, koncentrációkra és viv őanyagra 
vonatkozó információkat is,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— az egyes állatok megfigyelésének eredményei, beleértve az érté ­
kelő rendszerre vonatkozó adatokat,  
— a megfigyelt hatások jellegének és fokozatának részletes leírása,  
— bármely kórszövettani megfigyelés.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZÁSOK  
Ez a módszer megfelel az OECD TG 406-nak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Függelék  
TÁBLÁZAT:  
Magnusson/Kligman-féle értékelési skála a kiváltó tapaszos vizsgálatra adott 
reakciók értelmezéséhez  
0 = nincs látható változás  
1 = enyhe, vagy foltos börpirosság  
2 = mérsékelt és összefügg ő bőr pirosság  
3 = élénk b őrpirosság és duzzanat”  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ, 28 NAPOS ORÁLIS TOXICITÁSI 
VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 407. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2008) leírt módszerrel. Az eredeti 407. vizsgálati iránymutatást 
1981-ben fogadták el. 1995-ben felülvizsgált változatot fogadtak el, amely ­
lyel további információk nyerhet ők a vizsgált állatokról, különösen neuro ­
toxicitási és immuntoxicitási szempontból.  
2. 1998-ban az OECD a meglév ő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, 
valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító anyagok kisz űrésére és 
vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított (8). A tevékenység részeként az „ismételt adagolású, 28 napos orális toxicitási vizsgálat rágcsálókon” elne ­
vezésű eljárásra vonatkozó (407. számú) OECD-iránymutatást a vizsgált 
vegyi anyagok endokrin aktivitásának észlelésére alkalmas paraméterekkel frissítették. Az eljárást átfogó nemzetközi program keretében vizsgálták, hogy megállapítsák az új paraméterek relevanciáját és gyakorlati alkalmaz ­
hatóságát, a paraméterek (anti)ösztrogén, (anti)androgén és (anti)tiroid 
hatású vegyi anyagok tekintetében nyújtott teljesítményét, a laboratóriumon belüli és laboratóriumközi ismételhet őséget, valamint azt, hogy az új para ­
méterek mennyiben akadályozzák a 407. vizsgálati iránymutatást megel ő­
zően előírt paraméterek alkalmazását. Az így kapott nagy mennyiség ű adatot 
egy átfogó OECD-jelentésben (9) foglalták össze és értékelték részletesen. Ez a frissített (a 407. vizsgálati iránymutatással egyenérték ű) B.7. vizsgálati 
módszer a nemzetközi vizsgálati program tapasztalatain és eredményein 
alapul. A jelen vizsgálati módszer lehet ővé teszi bizonyos, az endokrin 
rendszer útján kifejtett hatások egyéb toxikológiai hatások összefüggésében történő értékelését.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
3. Egy vegyi anyag toxikus jellemz őinek értékelése és felmérése során az 
ismételt adagolású orális toxicitást azután lehet meghatározni, hogy az 
akut toxicitási vizsgálatok kezdeti eredményei már rendelkezésre állnak. A 
jelen vizsgálati módszer célja a hatásoknak a lehetséges toxicitási célok igén széles körénél történ ő vizsgálata. A módszer információkkal szolgál a 
viszonylag rövid id őn belüli ismételt expozíció valószín ű egészségügyi 
kockázatairól, beleértve az idegrendszerre, az immunrendszerre és az 
endokrin rendszerre gyakorolt hatásokat. E meghatározott végpontok tekin ­
tetében rendszerint azonosítja azokat a neurotoxikus potenciállal rendelkez ő 
vegyi anyagokat, amelyek e tekintetben további, részletes vizsgálatokat 
indokolhatnak, valamint a pajzsmirigyet fiziológiai szempontból befolyásoló 
vegyi anyagokat. Adatokkal szolgálhat emellett a fiatal ivarérett állatok hím és/vagy n őstény szaporítószerveire hatást gyakorló vegyi anyagokról, 
továbbá jelezheti azok immunológiai hatásait.
 
4. A jelen B.7. vizsgálati módszerrel kapott eredmények a veszélyek azonosí ­
tására és kockázatértékelésre használandók. Az endokrin rendszerrel kapcso ­
latos paraméterek alkalmazásával kapott eredményeket az OECD endokrin rendszert károsító anyagok vizsgálatára és értékelésére vonatkozó elvi keret ­
rendszerének összefüggésében kell értelmezni (11). A módszer egy alapvet ő, 
ismételt adagolású toxicitási vizsgálatot foglal magában, amely a 90 napos vizsgálatot nem igényl ő vegyi anyagok esetén (például abban az esetben, ha 
az előállított mennyiség nem halad meg bizonyos határértékeket), vagy egy 
hosszú távú vizsgálat el őzetes vizsgálataként alkalmazható. Az expozíció 
időtartama 28 nap.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. A vizsgált vegyi anyag endokrin aktivitásának esetleges észlelésére alkalmas 
paraméterek validálása érdekében folytatott nemzetközi program során 
kimutatták, hogy a jelen B.7. vizsgálati módszerrel kapott adatok min ősége 
jelentős mértékben függ a vizsgálati laboratórium tapasztalatától. Ez konk ­
rétan a n őstény szaporítószervek ciklikus változásainak kórszövettani 
meghatározásához, valamint a kisméret ű, nehezen boncolható hormonfügg ő 
szervek súlyának meghatározásához kapcsolódik. A kórszövettani vizs ­
gálathoz iránymutatást dolgoztak ki (19). Az iránymutatás elérhet ő az 
OECD vizsgálati iránymutatásokkal foglalkozó nyilvános weboldalán. Célja, 
hogy segítse a kórboncnokok vizsgálatait, valamint fokozza a vizsgálat 
érzékenységét. Több paraméterr ől találták úgy, hogy alkalmas az endokrin 
rendszerrel kapcsolatos toxicitás kimutatására, és ezeket belefoglalták a vizs ­
gálati módszerbe. Azokat a paramétereket, amelyekr ől nem állt rendelke ­
zésre elegend ő adat azok hasznosságának igazolására, vagy amelyek 
endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásának el ősegítésére való képes ­
ségéről a validációs program során csekély bizonyítékot találtak, a módszer 
opcionális végpontként javasolja (lásd a 2. függeléket).  
6. A validációs folyamat során el őállított adatok alapján hangsúlyozandó, hogy 
e vizsgálat nem kell ően érzékeny valamennyi (anti)androgén és (anti)öszt ­
rogén hatásmechanizmusú anyag azonosítására (9). A jelen vizsgálati módszer nem alkalmazandó az endokrin rendszert károsító hatásokra legin ­
kább érzékeny életszakaszban. A vizsgálati módszerrel a validációs folyamat 
során ennek ellenére azonosítottak a pajzsmirigy m űködésére gyenge és er ős 
hatást gyakorló anyagokat, valamint er ős és mérsékelt, ösztrogén vagy 
androgén receptorokon keresztül ható endokrin hatóanyagokat, ugyanakkor 
a legtöbb esetben nem sikerült azzal azonosítani az ösztrogén vagy androgén 
receptorokra gyenge hatást gyakorló endokrin hatóanyagokat. Éppen ezért a vizsgálat nem nevezhet ő az endokrin aktivitás sz űrésére szolgáló vizsgálat ­
nak.
 
7. Következésképpen az e hatásmechanizmusokkal összefügg ő hatások hiánya 
nem tekinthet ő az endokrin rendszerre gyakorolt hatások hiánya bizonyíté ­
kának. Az endokrin rendszer által közvetített hatások tekintetében az anyag jellemzését éppen ezért nem szabad kizárólag az e vizsgálati módszerrel 
kapott eredményekre alapozni, hanem azokat az adatok bizonyító erejének 
súlyozásához kell felhasználni, a lehetséges endokrin aktivitás jellemzéséhez figyelembe véve a vegyi anyagról rendelkezésre álló összes adatot. Éppen ezért az endokrin aktivitásra (az anyag jellemzésére) vonatkozó szabályozói 
döntéshozatalnak átfogó alapokon kell nyugodnia, és nem alapulhat kizá ­
rólag az e vizsgálati módszer alkalmazásával kapott eredményeken.
 
8. Elismerik, hogy minden, állatkísérleteken alapuló eljárást az állatgondozásra 
vonatkozó helyi szabványoknak megfelel ően kell végrehajtani; az alábbi ­
akban foglalt, gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális telje ­
sítményszabványok, amelyeket a szigorúbb helyi szabályozások felülbírál ­
nak. Az állatokkal való humánus bánásmódról további iránymutatás a megfelelő OECD-kiadványban található (14).
 
9. Az alkalmazott fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.  
A VIZSGÁLAT ELVE  
10. A vizsgált vegyi anyagot naponta, szájon át adjuk be több kísérleti állat ­
csoportnak, csoportonként más-más adagolási szinten, 28 napon keresztül. 
Az anyag beadásának id őszakában az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése 
érdekében minden nap gondosan megfigyeljük. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után 
az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk. A 28 napos 
vizsgálat információkkal szolgál az ismételt orális expozíció hatásairól, és
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
jelezheti a további, hosszú távú vizsgálatok szükségességét. Információkat 
biztosíthat továbbá a hosszabb távú vizsgálatokhoz használandó koncentrá ­
ciók kiválasztásához. A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával kapott adatok lehet ővé teszik a vizsgált vegyi anyag toxicitásának jellemzését, a 
dózis-válasz összefüggés kimutatását, valamint a még nem észlelhet ő káros 
hatásszint (NOAEL) meghatározását.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
11. A javasolt rágcsálófaj a patkány, bár más rágcsálófajok is alkalmazhatók. Ha 
a jelen B.7. vizsgálati módszerben meghatározott paramétereket más rágcsá ­
lófajon vizsgáljuk, a döntést részletesen indokolni kell. Bár biológiailag 
elképzelhet ő, hogy más fajok a patkányhoz hasonlóan reagálnak a toxikus 
anyagokra, a kisebb méret ű fajok alkalmazása nagyobb variabilitáshoz 
vezethet a kisebb szervek boncolásával összefügg ő technikai nehézségek 
miatt. A nemzetközi validációs programban a patkány volt az endokrin 
rendszert károsító anyagok kimutatására használt egyetlen faj. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, ivarérett állat ­
okat kell alkalmazni. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még 
egyszer sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolást az elválasztás után 
a lehető legrövidebb id őn belül célszer ű elkezdeni, de mindenképpen az 
állatok 9 hetes kora el őtt. A vizsgálat megkezdésekor az egyes kísérleti 
állatok testsúlyának csak minimális mértékben szabad különböznie egymás ­
tól, és egyik nem esetében sem térhet el ± 20 %-nál nagyobb mértékben a 
nem átlagától. Amennyiben az ismételt orális adagolást egy hosszabb távú vizsgálat el őzetes vizsgálataként végezzük, lehet őség szerint azonos törzsb ől 
való, azonos eredet ű állatokat kell alkalmazni mindkét vizsgálathoz.
 
Az állatok tartása és etetése  
12. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonat ­
kozó helyi szabványoknak. A kísérleti állatok tartására használt helyiség 
hőmérséklete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív 
páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától 
eltekintve – lehet őség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a 
célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 
12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű 
ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgált vegyi 
anyaggal való megfelel ő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgált 
vegyi anyagot a takarmánnyal adjuk be. Az állatokat nemek szerint elkülö ­
nítve, kis csoportokban kell tartani; tudományos szempontból indokolt esetekben az állatok egyenként is elhelyezhet ők. Ketrecben való csoportos 
elhelyezés esetén egy ketrecben legfeljebb öt állat tartható.
 
13. Rendszeresen ellen őrizni kell, hogy a takarmány nem tartalmaz-e szennyez ő 
anyagokat. A takarmányból egy mintát a jegyz őkönyv véglegesítéséig meg 
kell őrizni.  
Az állatok el őkészítése  
14. Egészséges, fiatal, ivarérett állatokat osztunk véletlenszer űen a kontroll- és 
kezelt csoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra 
lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az állat ­
okat az egyedi azonosíthatóság céljából megjelöljük, és a vizsgálat megkez ­
dése előtt legalább öt napig a ketrecükben tartjuk a laboratóriumi körülmé ­
nyekhez való szoktatás céljából.  
A dózisok el őkészítése  
15. A vizsgált vegyi anyagot gyomorszondán át, vagy az állatok táplálékába 
vagy ivóvizébe keverve adjuk be. A szájon át történ ő beadás módszerét a 
vizsgálat céljától, valamint a vizsgált vegyi anyag fizikai, kémiai és toxiko ­
kinetikai tulajdonságaitól függ ően választjuk meg.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk 
alkalmas viv őanyagban. Lehet őség szerint els ősorban vizes oldatot/emulziót 
ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más viv őanya­
gokban elkészített oldatot. Amennyiben nem víz a viv őanyag, a viv őanyag 
toxikus tulajdonságainak ismertnek kell lenniük. Meg kell határozni azt is, 
hogy a vizsgált vegyi anyag mennyire stabil az adott viv őanyagban.
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
17. Minden egyes adagolási szinthez legalább 10 állatot (5 hímet és 5 n őstényt) 
kell alkalmazni. Ha id őközi elpusztítást tervezünk, a létszámot annyival kell 
megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése el őtt el szándékozunk pusz ­
títani. Meg kell fontolni egy további, tíz állatból (nemenként öt példányból) álló kísér ő csoport alkalmazását a kontrollcsoportban és a legnagyobb 
adaggal kezelt csoportban, amelyen a kezelés id őszakát követ ően legalább 
14 napig megfigyeljük a toxikus hatás visszafordíthatóságát, tartósságát vagy késleltetett kialakulását.
 
Adagolás  
18. Általában legalább három vizsgálati és egy kontrollcsoport alkalmazandó, 
azonban ha más adatok értékelése alapján 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap 
adag esetén nem várható hatás, határérték-vizsgálat végezhet ő. Ha nem 
állnak rendelkezésre megfelel ő adatok, az alkalmazandó dózisok meghatá ­
rozása céljából tartománybehatároló vizsgálat végezhet ő (azonos törzsb ől 
való, azonos eredet ű állatokon). A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizs ­
gált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint 
a vizsgálati csoportokban lév őket. Ha a vizsgált vegyi anyag beadásához 
vivőanyagot alkalmazunk, a kontrollcsoportnak a viv őanyagból a felhasznált 
legnagyobb mennyiséget kell kapnia.  
19. Az adagolási szintek kiválasztásánál figyelembe kell venni a vizsgált, vagy 
azzal rokon vegyi anyagok toxicitására és (toxiko)kinetikájára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. A legmagasabb dózist úgy kell kiválasztani, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált vagy súlyos szen ­
vedést a kísérleti állatoknak. Ezután az adagokat fokozatosan csökkentjük, 
azzal a céllal, hogy a legalacsonyabb adagolási szinten kimutassuk az dózistól függ ő hatásokat és a nem észlelhet ő káros hatásszintet (NOAEL). 
A csökken ő dózisszintek beállításához gyakran optimális a 2–4-szeres inter ­
vallumok alkalmazása, a dózisok közötti nagyon nagy intervallumok (pél ­
dául 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran előnyben részesítend ő egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása.
 
20. Ha általános toxicitást (például testsúlycsökkenést, a májra, a szívre, a 
tüdőre vagy a vesére kifejtett hatásokat stb.) vagy egyéb, nem feltétlenült 
toxikus reakcióra utaló változásokat (például csökkent táplálékfogyasztást, májmegnagyobbodást) figyelünk meg, az immun-, ideg- és endokrin rend ­
szer szempontjából érzékeny végpontok tekintetében megfigyelt hatások 
értelmezésekor óvatosan kell eljárni.
 
Határérték-vizsgálat  
21. Ha a vizsgálat során egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap 
adagolási szint, vagy a takarmányban vagy ivóvízben beadott anyagmeny ­
nyiség ennek megfelel ő (a testsúly alapján végzett számításokon alapuló) 
százaléka, és az e vizsgálathoz leírt eljárás betartása mellett a vizsgált anyag 
nem okoz észlelhet ő toxikus hatásokat, valamint ha a szerkezetileg rokon 
vegyi anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is várható a toxicitás bekö ­
vetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvég ­
zése nem feltétlenül tekintend ő szükségesnek. A határérték-vizsgálat alkal ­
mazandó, kivéve, ha az emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint 
használatát indokolja.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
A dózisok beadása  
22. Az állatoknak 28 napon keresztül naponta, a hét 7 napján adjuk be a vizs ­
gált vegyi anyagot. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, lehetőleg egyetlen adagban kell gyomorszondán vagy megfelel ő intubációs 
kanülön át beadni. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális 
mennyisége a kísérleti állat méretét ől függ. E mennyiség nem haladhatja 
meg az 1 ml/100 testsúlygramm arányt, kivéve vizes oldatok esetében, amelyeknél 2 ml/100 testsúlygramm is alkalmazható. A magasabb koncent ­
rációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró 
vegyi anyagok kivételével a koncentráció megfelel ő beállításával a minimá ­
lisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy a 
mennyiség valamennyi adagolási szinten konstans legyen.
 
23. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos 
biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja 
meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizs ­
gált vegyi anyagot a takarmánnyal juttatjuk be, akkor vagy állandó takar ­
mánykoncentráció (ppm), vagy az állatok testsúlyára kiszámított állandó 
dózisszint alkalmazható, és meg kell jelölni, hogy melyik alternatívát alkal ­
mazzuk. A szondával bejuttatott vegyi anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló id őszakában kell beadni, és szükség szerint ki kell igazítani 
ahhoz, hogy az állat testsúlyához viszonyítva állandó értéken lehessen 
tartani. Ha az ismételt adagolású vizsgálatot egy hosszú távú vizsgálat el őta­
nulmányaként végezzük, mindkét vizsgálatban hasonló takarmányt kell alkalmazni.
 
Megfigyelések  
24. A megfigyelési id őszak 28 nap. A kísér ő csoportban lév ő állatokat, 
amelyekkel további megfigyeléseket tervezünk, még legalább további 14 
napig kell kezelés nélkül tartani, hogy a toxikus hatások késleltetett el őfor­
dulását, megmaradását vagy visszafordíthatóságát megfigyeljük.  
25. Naponta legalább egyszer, lehet őleg minden nap ugyanazon id őpont(ok)ban 
általános klinikai megfigyelést kell végezni, figyelembe véve az adagolást követően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát. Fel kell jegyezni 
a kísérleti állatok klinikai kórállapotát. Naponta legalább kétszer meg kell 
vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából.
 
26. Az els ő expozíció el őtt egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdeké ­
ben), azt követ ően pedig legalább hetente egyszer az összes állatot részletes 
klinikai vizsgálatoknak kell alávetni. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt ketreceken kívül, lehet őleg egy szabványos karámban, 
minden alkalommal a nap hasonló id őszakában kell elvégezni. A megfigye ­
léseket gondosan fel kell jegyezni, lehet őleg a vizsgálatokat végz ő labora­
tórium által kifejezetten meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények 
közötti eltérések, és hogy a megfigyeléseket lehet őleg olyan megfigyel ők 
végezzék, akik nem tudnak a kezelésr ől. A feljegyzett észleléseknek ki kell 
terjedniük többek között a b őr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák 
állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok el őfordulása, valamint az 
autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet felborzolódása, pupillaméret, 
szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhet ő változásokra. A 
járás, a testtartás és a kézbevételre adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip viselkedés (például túlzott 
mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (például 
öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (2).
 
27. Az expozíció negyedik hetében a különböz ő típusú ingerekre (2) (például 
hallószervi, vizuális és önérzékelési ingerekre) (3) (4) (5) mutatott reakciókat vizsgáljuk, felmérjük a szorítás erejét (6) és a motoros aktivitást (7). A követendő eljárásokkal kapcsolatban további részletek a vonatkozó szakiro ­
dalomban találhatók. Ett ől függetlenül a hivatkozottaktól eltér ő alternatív 
eljárások is alkalmazhatók.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Az expozíció negyedik hetében mell őzhetők a funkcionális megfigyelések, 
ha a vizsgálatot egy azt követ ő (90 napos) szubkrónikus toxicitási vizsgálat 
előzetes vizsgálataként végezzük. Ebben az esetben a funkcionális megfigye ­
léseket az utóbbi vizsgálat részeként kell elvégezni. Másrészt az ismételt adagolású vizsgálat során végzett funkcionális megfigyelések adatainak 
megléte segítheti az azt követ ő szubkrónikus toxicitási vizsgálat során a 
dózisok kiválasztását.
 
29. Kivételes esetekben a funkcionális megfigyelések elhagyhatók azon csopor ­
toknál is, amelyek egyébként olyan mérték ű toxicitási tüneteket mutatnak, 
hogy az jelent ős mértékben megzavarná a funkcionális vizsgálat eredmé ­
nyeit.  
30. A boncolásnál minden n őstény ivari ciklusa meghatározható hüvelykenet 
alapján (nem kötelez ő). E megfigyelések információkkal szolgálnak az 
ivari ciklus elpusztítás id őpontjában fennálló stádiumáról, és segíthetik az 
ösztrogénre érzékeny szövetek szövettani értékelését (lásd a szövettanra 
vonatkozó iránymutatást (19)).  
Testsúly és táplálék-/vízfogyasztás  
31. Minden állat súlyát hetente legalább egyszer le kell mérni. A felvett táplálék 
mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. Amennyiben a vizsgált vegyi anyagot az ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást is legalább hetente 
le kell mérni.
 
Hematológia  
32. A vizsgálati id őszak végén a következ ő hematológiai vizsgálatokat kell 
elvégezni: hematokrit, hemoglobinkoncentráció, vörösvértestszám, retikulo ­
citák, teljes és differenciált vérkép, trombocitaszám és a véralvadási id ő/ké­
pesség mérése. Ha a vizsgált vegyi anyagról vagy annak vélt metabolitjairól 
ismert vagy feltételezhet ő, hogy oxidáló tulajdonságokkal rendelkeznek, az 
említett vizsgálatokon kívül többek között a methemoglobinkoncentrációt és a Heinz-testek el őfordulását is meg kell határozni.
 
33. A vérmintákat egy megnevezett helyr ől kell venni, közvetlenül az állatok 
elpusztítása el őtt vagy aközben, és azokat megfelel ő körülmények között 
kell tárolni. Az állatokat az elpusztítás el őtti éjszaka koplaltatni kell (  1 ). 
Klinikai biokémiai vizsgálatok  
34. A klinikai biokémiai értékeknek a szövetekben jelentkez ő fontosabb toxikus 
hatások és különösen a vesére és a májra gyakorolt hatások vizsgálata érdekében végzett meghatározását a közvetlenül az állatok elpusztítása előtt vagy annak részeként elvégzett vérvétel során valamennyi állattól 
vett mintákon kell elvégezni (eltekintve az elhullásközeli állapotban lév ő 
és/vagy id őközben elpusztított egyedekt ől). A vérplazma- és vérszérum- 
meghatározások során vizsgálandó anyagok közé tartozik a nátrium, a kálium, a vércukor, az összkoleszterin, a karbamid, a kreatinin, az össz ­
protein és az albumin, továbbá legalább két, májsejti hatásokat jelz ő 
enzim (például alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, alkáli foszfatáz, γ-glutamil-transzpeptidáz és glutamát-dehidrogenáz), valamint az 
epesavak. Bizonyos körülmények között hasznos információk nyerhet ők 
további (májból vagy máshonnan származó) enzimek, valamint a bilirubin 
méréséből.
 
35. Kiegészítésként a vizsgálat utolsó hetében a vizeletet el őre meghatározott 
időpontokban való gy űjtése mellett a vizelet alábbi tulajdonságainak 
meghatározása is elvégezhet ő: megjelenés, mennyiség, ozmolalitás vagy 
fajsúly, pH-érték, fehérjék, glukóz és vér/vérsejtek.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Bizonyos szérum- és a plazmavizsgálatok, f őleg a glükóz meghatározása esetén ajánlatos 
a vizsgálat el őtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek f ő indoka az, hogy a vizsgála ­
tokat megel őző koplaltatás mell őzése szükségszer űen növelné a kapott eredmények vari ­
abilitását, ami így megnehezítené a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelme ­
zését. Másrészr ől az éjszakai koplaltatás befolyásolhatja az állatok általános anyagcseré ­
jét, valamint – különösen azon vizsgálatok esetében, amelyeknél a vizsgált anyagot a 
táplálékkal adagolják – megzavarhatja a vizsgált vegyi anyagnak való napi expozíciót. 
Ha az éjszakai koplaltatás mellett döntünk, a klinikai biokémiai paramétereket a vizsgálat 
negyedik hetében, a funkcionális megfigyeléseket követ ően kell meghatározni.
 36. Ezeken túlmen ően megfontolandó az általános szöveti roncsolódás plazma- 
vagy szérummarkereinek vizsgálata. Más vizsgálatokat is el kell végezni, ha 
a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai hatással vannak vagy lehetnek a kapcsolódó anyagcsere-folyamatokra; ilyen például a kalcium, a foszfát, a trigliceridek, egyes hormonok, valamint a kolinészteráz mérése. Ezeket az 
értékeket az egyes besorolási osztályokhoz tartozó vegyi anyagokra nézve 
vagy eseti alapon kell meghatározni.
 
37. Bár az endokrin rendszerrel kapcsolatos végpontok nemzetközi értékelése 
során nem nyert egyértelm ű bizonyítást, hogy ez a pajzsmirigyhormonok 
(T3, T4) és a pajzsmirigyserkent ő hormon (TSH) meghatározása tekinte ­
tében előnyös, hasznos lehet plazma- vagy szérummintákat meg őrizni a 
T3, a T4 és a TSH (nem kötelez ő) mérése érdekében, amennyiben az 
agyalapi mirigy-pajzsmirigy tengelyre kifejtett hatásra utaló jeleket tapasz ­
talunk. E minták tárolás céljából -20 °C h őmérsékletre fagyaszthatók. A 
hormonok meghatározásának variabilitását és az azzal kapott abszolút 
koncentrációt az alábbi tényez ők befolyásolhatják:  
— az elpusztítás id őpontja, tekintettel a hormonkoncentrációk nap folyamán 
tapasztalható ingadozására,  
— az állatot ér ő indokolatlan stressz elkerülése érdekében alkalmazott 
elpusztítási mód, amely hatással lehet a hormonkoncentrációkra,  
— a hormonmeghatározásokhoz alkalmazott, standard görbéjük tekintetében 
esetlegesen eltér ő vizsgálati készletek.  
A pajzsmirigyre ható vegyi anyagok egyértelm ű azonosítása kórszövettani 
vizsgálat útján hatékonyabban elvégezhet ő, mint hormonszintek alapján.  
38. A kifejezetten hormon-meghatározási célra szánt plazmamintákat a nap 
hasonló id őpontjában kell gy űjteni. Javasolt megfontolni a T3, T4 és TSH 
pajzsmirigyi kórszövettani elváltozások esetén végzett meghatározását. A 
kereskedelmi fogalomban kapható különböz ő vizsgálati készletek eltér ő 
számszerű értékeket adnak a hormonkoncentrációk elemzése során. Követ ­
kezésképpen nem feltétlenül lehet teljesítménykritériumokat megadni egységes múltbeli adatok alapján. Másik lehet őségként a laboratóriumoknak 
törekedniük kell arra, hogy a T3 és a T4 variációs együtthatója 25 alatt, a 
TSH-é pedig 35 alatt maradjon. Minden koncentrációt ng/ml-ben kell feljegyezni.
 
39. Ha a rendelkezésre álló kiinduló adatok nem bizonyulnak elegend őnek, 
megfontolandó a hematológiai és klinikai biokémiai változók meghatározása az adagolás kezdete el őtt, lehetőség szerint az állatok egy, a kísérleti csopor ­
tokba nem tartozó csoportjánál.
 
PATOLÓGIA  
Autopszia  
40. A vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autopsziának kell 
alávetni, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő felszíne, az 
összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. Az 
összes állat  máját,  veséit,  mellékveséit,  heréit,  mellékheréit,  prosztatáját és  
ondóhólyagját a koaguláló mirigyekkel együtt,  csecsem őmirigyét,  lépét,  
agyát és  szívét (eltekintve az elhullásközeli és/vagy a vizsgálat befejeztét 
megelőzően elpusztított egyedekéit ől) megfelel ően megtisztítjuk minden 
rátapadt szövett ől, és azok nedves súlyát a boncolást követ ően a lehet ő 
legrövidebb id őn belül megmérjük, miel őtt azok kiszáradnának. A prosztata 
és a kapcsolódó szervek megtisztítása során ügyelni kell arra, hogy ne szúrjuk át a folyadékkal teli ondóhólyagokat. Másik lehet őségként az ondó ­
hólyagok és a prosztata megtisztítása és megmérése a fixálást követ ően is 
elvégezhet ő.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Ezenkívül nem kötelez ő jelleggel két további szövet is megmérhet ő a bonco­
lást követ ő lehető legrövidebb id őn belül, miel őtt kiszáradna: páros pete ­
fészkek (nedves súly), valamint méh, beleértve a méhnyakat (a méhszövet eltávolítása és súlymérésre való el őkészítése tekintetében az OECD 440. 
vizsgálati iránymutatása (18) nyújt útmutatást).
 
42. A pajzsmirigy súlya (nem kötelez ő) a fixálást követ ően is meghatározható. 
A megtisztítás a szövetkárosodás elkerülése érdekében ez esetben is igen óvatosan, kizárólag a fixálást követ ően végzend ő el. A szövetkárosodás 
veszélyeztetheti a kórszövettani elemzést.
 
43. Az alábbi testszöveteket mind a szövet típusa, mind pedig a szándékolt 
későbbi kórszövettani vizsgálatok (lásd a 47. fejezetet) szempontjából 
legmegfelel őbb fixálóközegben kell tartósítani: minden  szövet, amelyen 
makroszkopikus elváltozás figyelhet ő meg, az  agy (jellemz ő részek, például 
a nagyagy, a kisagy és a nyúltagyi híd),  a gerincvel ő, a szem,  a gyomor,  a 
vékony- és vastagbél (beleértve a Peyer-plakkot),  a máj,  a vesék,  a mellék ­ 
vesék,  a lép,  a szív,  a csecsem őmirigy,  a pajzsmirigy,  a légcső és a tüdők 
(ezeket el őször megtöltjük fixálószerrel, és azután merítjük alá),  az ivarmi ­ 
rigyek (herék és petefészkek),  a járulékos nemi szervek (a méh és a 
méhnyak, a mellékherék, a prosztata és az ondóhólyagok a koaguláló miri ­
gyekkel együtt),  a hüvely,  a húgyhólyag,  a nyirokcsomók (a legközelebbi 
elvezető nyirokcsomón kívül egy további nyirokcsomót is ki kell venni a 
laboratórium tapasztalatainak megfelel ően (15)),  perifériás idegek (csíp ő 
vagy sípcsont környéki), lehet őleg az izomzathoz közeli helyr ől véve,  
harántcsíkolt izom, valamint  csont csontvel ővel (metszet vagy másik lehe ­
tőségként egy friss, csontvel őből felszívott minta formájában). A herék 
fixálását javasolt Bouin- vagy módosított Davidson-féle fixálószerbe merí ­
téssel végezni (16) (17). A tunica albugineán a fixálószer gyors bejutása 
érdekében t űvel óvatosan sekély szúrást kell ejteni a szerv mindkét végén. A 
klinikai és más jelleg ű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata 
is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni minden olyan más szervet 
is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdonságai alapján valószín űleg 
célszervnek tekinthet ő. 
44. Az alábbi szövetek értékesek lehetnek az endokrin rendszerrel kapcsolatos 
hatások kimutatása szempontjából: Az ivarmirigyek (herék és petefészkek), 
a járulékos nemi szervek (a méh, beleértve a méhnyakat, a mellékherék, az 
ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel együtt, a dorsolateralis és a hasoldali prosztata), a hüvely, az agyalapi mirigy, a hím eml őmirigy, a pajzsmirigy és 
a mellékvese. A hím eml őmirigyek elváltozásairól nem áll rendelkezésre 
kellő dokumentáció, azonban ez a paraméter igen érzékeny lehet az öszt ­
rogén hatású anyagokra. A 43. bekezdésben fel nem sorolt szervek, illetve szövetek megfigyelése nem kötelez ő (lásd a 2. függeléket).
 
45. A kórszövettani iránymutatás (19) további információkat tartalmaz az 
endokrin szövetek boncolásával, fixálásával, metszeteinek elkészítésével és 
kórszövettani vizsgálatával kapcsolatban.  
46. A nemzetközi vizsgálati program szolgált némi bizonyítékkal arra, hogy a 
nemi hormonok homeosztázisára gyakorolt hatás tekintetében kismérték ű 
potenciállal rendelkez ő vegyi anyagok endokrin rendszerre kifejtett, kevésbé 
szembetűnő hatásai az ivari ciklus különböz ő szövetekben végbemen ő 
szinkronizálásának zavarai alapján ismerhet ők fel, semmint a n ői ivarszervek 
nyilvánvaló kórszövettani elváltozásai alapján. Ugyan e hatásokra nem 
találtak egyértelm ű bizonyítékot, a petefészkek (tüsz ő-, theca és granulosa 
sejtek), a méh, a méhnyak és a hüvely kórszövettani eredményeinek értel ­
mezése során javasolt figyelembe venni az ivari ciklus esetleges aszinkro ­
nizmusának bizonyítékait. Ha értékeltük, a ciklus hüvelykenet alapján 
megállapított stádiuma is felhasználható ezen összehasonlítás során.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Kórszövettani vizsgálatok  
47. A tartósított szerveket és szöveteket mind a kontrollcsoportok, mind a magas 
dózissal kezelt csoportok összes egyede esetében teljes kórszövettani vizs ­
gálatnak kell alávetni. Ha a magas dózissal kezelt csoport egyedei esetében a 
kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyelhet ők meg, e vizsgálatot az 
összes többi, különböz ő dózissal kezelt csoport egyedeire is ki kell terjesz ­
teni. 
48. Minden makroszkopikus elváltozást meg kell vizsgálni.  
49. Kísér ő csoport használata esetén azon szerveken és szöveteken kell kórszö ­
vettani vizsgálatot végezni, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozásokat lehetett kimutatni.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
50. Az adatokat minden egyes állattal kapcsolatban rögzíteni kell. Ezenfelül az 
összes adatot táblázat formájában összegezni kell, a vizsgált állatok minden 
csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, 
hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy elpusztítás id őpontját; a 
toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, 
ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, 
az elváltozásokat mutató állatok számát, az elváltozások típusát, súlyosságát és az egyes elváltozástípusokat mutató állatok százalékos arányát.
 
51. A számszer ű eredményeket lehet őség szerint megfelel ő és általánosan elfo ­
gadott statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A hatás dózistar ­
tomány mentén történ ő összehasonlításaival kiküszöbölhet ő a több t-próba 
alkalmazása. A statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell 
megválasztani.  
52. A min őség-ellenőrzéshez javasolt múltbeli kontrolladatokat gy űjteni, a 
számszerű adatokhoz pedig kiszámítani a variációs együtthatót, különösen 
az endokrin rendszert károsító anyagok kimutatásával összefügg ő paramé­
terek tekintetében. Ezek az adatok felhasználhatók összehasonlítási célokra a 
tényleges vizsgálatok kiértékelése során.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
53. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— fizikai jelleg, tisztaság, fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok.  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag kiválasztásának indokolása, ha az nem víz.  
Kísérleti állatok:  
— használt faj/törzs,  
— az állatok száma, kora és neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,  
— patkánytól eltér ő faj alkalmazásának indokolása.  
Vizsgálati körülmények:  
— az adagolási szintek kiválasztásának indokai,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázásával/a takarmány el őkészítésével, az 
elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával 
kapcsolatos adatok,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,  
— átszámítás a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez 
alkalmazható,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok.  
Vizsgált opcionális végpontok  
— a vizsgált opcionális végpontok felsorolása.  
Eredmények:  
— testsúly és annak változásai,  
— táplálék- és vízfogyasztásra vonatkozó adatok, ha alkalmazható,  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatok nemek és adagolási szintek szerinti 
csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,  
— a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és id őtartama (a változások 
visszafordíthatók-e vagy sem),  
— az érzékszervi aktivitás, a szorítási er ősség és a motoros aktivitás érté ­
kelése,  
— hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszonyítási értékek ­
kel, 
— a klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszonyítási 
értékekkel,  
— az állatok testsúlya az elpusztításkor és a szerveik súlya,  
— boncolási eredmények,  
— a kórszövettani vizsgálatok összes eredményének részletes ismertetése,  
— abszorpciós adatok, ha rendelkezésre állnak,  
— adott esetben az eredmények statisztikai feldolgozása.  
Az eredmények tárgyalása.  
Következtetések.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Androgenitás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerveze ­
tében természetes androgén hormonokhoz (például a tesztoszteronhoz) hasonló hatást fejtsen ki.
 
Antiandrogenitás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerve ­
zetében a természetes androgén hormonok (például a tesztoszteron) hatását 
gátolja.  
Antiösztrogenitás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerve ­
zetében a természetes ösztrogén hormonok (például a 17ß-ösztradiol) hatását gátolja.
 
Antitiroid hatás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerveze ­
tében a természetes pajzsmirigyhormon (például a T  3 ) hatását gátolja.  
Adagolás:  általános fogalom, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát 
és időtartamát foglalja magában.  
Dózis:  a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége. A dózist a vizsgált vegyi 
anyag súlyának és a kísérleti állat egységnyi testsúlyának napi hányadosaként 
(például mg/testsúlykilogramm/nap), vagy a takarmányban lév ő állandó koncent ­
rációként fejezik ki.  
Nyilvánvaló toxicitás:  általános fogalom, amely a toxicitás vizsgált vegyi anyag 
beadását követ ően kialakuló egyértelm ű tüneteire vonatkozik. E tüneteknek 
elegendőnek kell lenniük a veszély felméréséhez, továbbá olyan szintet kell 
képviselniük, amelynél a beadott dózis növelése várhatóan a toxicitás súlyos jeleinek kialakulásához és valószín ű elhulláshoz vezet.
 
NOAEL:  a »no-observed-adverse-effect level« (nem észlelhet ő káros hatásszint) 
rövidítése. Ez a legmagasabb dózisszint, amelynél még nem figyelhet ők meg a 
kezelés okozta káros hatások.  
Ösztrogenitás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerveze ­
tében a természetes ösztrogén hormonokhoz (például a 17ß-ösztradiolhoz) hasonló hatást fejtsen ki.
 
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  
Tiroid hatás:  egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szervezetében 
a természetes pajzsmirigyhormonhoz (például a T  3 -hoz) hasonló hatást gyako ­
roljon.  
Validáció:  tudományos folyamat, amelynek célja egy adott vizsgálati módszer 
működési követelményeinek és korlátjainak jellemzése, valamint megbízhatósá ­
gának és egy adott célhoz kapcsolódó relevanciájának igazolása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
2. függelék  
Az endokrin rendszert károsító anyagok jelen B.7. Vizsgálati 
módszerrel történ ő kimutatásához javasolt végpontok  
Kötelező végpontok Nem kötelez ő végpontok 
Súly 
— herék 
— mellékherék 
— mellékvesék 
— prosztata és az ondóhólyagok a 
koaguláló mirigyekkel együtt — petefészkek 
— méh, beleértve a méhnyakat 
— pajzsmirigy  
Kórszövettani vizsgálatok  
— ivarmirigyek: 
— herék és — petefészkek 
— járulékos nemi szervek: 
— mellékherék, — prosztata és az ondóhólyag a 
koaguláló mirigyekkel együtt 
— méh, beleértve a méhnyakat 
— mellékvese — pajzsmirigy 
— hüvely — hüvelykenet 
— hím eml őmirigyek 
— agyalapi mirigy
 
Hormonokkal kapcsolatos mérések  
— a T3 és a T4 szintje a keringési 
rendszerben 
— a TSH szintje a keringési rend ­
szerben  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60
 
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. AppéldáulPharmacol. 108: 267-283.  
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
(11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l
 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterot ­
rophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of 
Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. SZUBAKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 28 NAPOS VIZSGÁLAT  
ÖSSZEFOGLALÁS  
A jelen felülvizsgált B.8. vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy azzal teljes 
körűen jellemezhet ő legyen a rövidebb id őn (28 napon) belüli ismételt expozíci ­
óval, belégzés útján bejuttatott vizsgált vegyi anyag toxicitása, valamint adatokat 
lehessen gy űjteni a mennyiségi inhalációs kockázatértékelésekhez. Legalább 5 
hím és 5 n őstény rágcsálóból álló csoportokat teszünk ki 28 napon át napi 6 
órára a) a vizsgált vegyi anyagnak legalább három koncentrációs szinten, b) sz űrt 
levegőnek (negatív kontroll) és/vagy c) a viv őanyagnak (viv őanyaggal kezelt 
kontroll). Az állatok expozíciója általában heti 5 napon történik, azonban a hét 7 napján történ ő expozíció is megengedett. Mindig kell hímeket és n őstényeket is 
vizsgálni, azonban az egyes nemek különböz ő koncentrációszinteknek is kitehe ­
tők, amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi 
anyagra. Ez a módszer lehet őséget biztosít a vizsgálatvezet őnek, hogy a vizsgált 
vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében kísér ő (a visszafordít ­
hatóság vizsgálatára alkalmazott) csoportokat, bronchoalveoláris átmosást (BAL), 
neurológiai vizsgálatokat, valamint további klinikai kórtani és kórszövettani érté ­
keléseket is belefoglaljon a vizsgálatba.
 
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 412. vizsgálati iránymuta ­
tásával (2009). A szubakut inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 412. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el (1). A jelen B.8. (a felülvizs ­
gált 412. vizsgálati iránymutatással egyenérték ű) vizsgálati módszert a tudo ­
mány jelenlegi állásának megfelel ően, valamint a jelenlegi és jöv őbeli szabá ­
lyozási igények kielégítése érdekében frissítették.
 
2. Ez a módszer lehet ővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak 28 napon át belégzés 
útján történ ő, naponta ismételt expozíció nyomán kialakuló káros hatások 
jellemzését. A 28 napos szubakut inhalációs toxicitási vizsgálatok során kapott adatok felhasználhatók mennyiségi kockázatelemzési célokra (ha nem követi azokat 90 napos szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálat 
[lásd e melléklet B.29. fejezetét]). Ezen adatok információkkal szolgálhatnak 
továbbá a hosszabb távú vizsgálatok, például a 90 napos szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálat során használandó koncentrációk kiválasztá ­
sához is. E vizsgálati módszer nem kifejezetten nanoanyagok vizsgálatára 
szolgál. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak 
meghatározása a jelen fejezet végén, valamint a 39. iránymutatásban (2) található.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
3. A vizsgálat min őségének fokozása és az állatkísérletek minimalizálása érde ­
kében a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése el őtt figyelembe 
kell vennie a vizsgálandó vegyi anyagról rendelkezésre álló minden infor ­
mációt. A megfelel ő vizsgálati koncentrációk kiválasztását segít ő informá­
ciók közé tartozhat a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges  in vitro  vagy  in vivo  
toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a 
humán expozíció lehet ősége, a szerkezetileg rokon anyagokról rendelkezésre 
álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok, valamint az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokból származó adatok. Ha a vizsgálat során neurotoxicitás várható 
vagy figyelhet ő meg, a vizsgálatvezet ő dönthet úgy, hogy a vizsgálat része ­
ként megfelel ő értékeléseket is kell végezni, például funkcionális megfigye ­
lési vizsgálatot (FOB) és a motoros aktivitás mérését. Az expozícióknak az egyes vizsgálatokhoz viszonyított id őzítése ugyan kritikus lehet, e kiegészít ő 
tevékenységek azonban nem szabad, hogy akadályozzák az vizsgálat alap ­
vető tervezését.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. A maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok vizsgálhatók hígítva, olyan 
koncentrációban, amellyel elérhet ő a kívánt mérték ű toxicitás (lásd a 39. 
iránymutatást (2)). Az állatok ezen anyagoknak való expozíciója során a célkoncentrációknak kell ően alacsonynak kell lenniük ahhoz, hogy ne okoz ­
zanak jelent ős fájdalmat és szorongást, ugyanakkor elegend őnek kell lenniük 
ahhoz, hogy a koncentráció-hatás görbe kiterjeszthet ő legyen a vizsgálat 
szabályozási és tudományos céljának megfelel ő szintekre. E koncentrációkat 
eseti alapon kell kiválasztani, lehet őleg egy megfelel ően megtervezett tarto ­
mánybehatároló vizsgálat alapján, amely információkkal szolgál a kritikus 
végpontról, az esetleges irritációs küszöbértékr ől, valamint a hatás kezde ­
tének idejér ől (lásd a 11–13. bekezdést). A választott koncentrációt indo ­
kolni kell.
 
5. Az elhullásközeli állapotban lév ő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszköd ő 
vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani. Az elhullásközeli állapotban lév ő állatokat a vizsgálat során 
elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható 
vagy közeli elhullás felismerését segít ő iránymutatás, valamint az elhullás 
közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok elpusztítására vonatkozó 
döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatásban (3) találhatók.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
6. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett rágcsálókat kell alkalmazni. A javasolt faj a patkány. Más faj 
használata esetén a döntést indokolni kell.  
Az állatok el őkészítése  
7. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és 
nem vemhesek. A véletlen kiválasztás napján az állatoknak 7–9 hetes fiatal, 
ivarérett egyedeknek kell lenniük. A testsúlyuk a nemenkénti átlagos test ­
súlytól legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszer űen 
választjuk ki, egyedi azonosítóval látjuk el, és a laboratóriumi körülmé ­
nyekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése el őtt legalább 5 
napig a ketrecükben tartjuk.  
Az állatok tartása  
8. Az állatokat a megfigyelések megkönnyítése és összetévesztésük elkerülése 
érdekében egyedi azonosítóval, lehet őleg bőr alatti jeladóval kell ellátni. A 
kísérleti állatok tartására használt helyiség h őmérséklete 22 ± 3 °C kell, 
hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tarto ­
mányban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha viv ő­
anyagként vizet használunk. Az expozíció el őtt és után az állatokat általában 
nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, 
azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át 
történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. 
Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indo ­
kolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testh őmérséklet 
(hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendel ­
kezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottev ő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez 
való előzetes szoktatás mell őzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön 
kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a 
vizsgált aeroszol ne sz űrődhessen át a többi állat sz őrzetén. Hagyományos és 
minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció 
időtartama alatt –, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A vilá ­
gítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák 
egymást.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalációs kamrák  
9. Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi 
anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az el őnyben részesítend ő expozíciós 
mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, 
orrot vagy szájat érint ő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció álta ­
lában előnyben részesítend ő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a 
lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök vizsgálata esetén. El őfordul­
hat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expo ­
zíció alkalmazásával hatékonyabban elérhet ők, ezt azonban indokolni kell a 
vizsgálati jegyz őkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szol ­
gáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a 
vizsgált állatok összesített „térfogata” nem haladhatja meg a kamra térfoga ­
tának 5 %-át. A csak orron át történ ő és az egész testfelületen keresztüli 
expozíciós technikák elveivel, valamint azok különös el őnyeivel és hátrá ­
nyaival a 39. iránymutatás (2) foglalkozik.  
TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK  
Határkoncentrációk  
10. Az akut vizsgálatoktól eltér ően a 28 napos szubakut inhalációs toxicitási 
vizsgálatok esetén nincsenek meghatározott határkoncentrációk. A maxi ­
mális vizsgált koncentráció kiválasztásakor a következ őket kell figyelembe 
venni: 1) az elérhet ő maximális koncentráció, 2) a legrosszabb esetben fenn ­
álló humán expozíció szintje, 3) a megfelel ő oxigénellátás biztosításának 
szükségessége és/vagy 4) állatjóléti szempontok. Amennyiben nincsenek adatokon alapuló határértékek, az 1272/2008/EK rendeletben (13) szerepl ő 
akut határértékek alkalmazhatók (azaz aeroszolok esetén legfeljebb 5 mg/l, 
gőzök esetén 20 mg/l, gázok esetén pedig 20 000 ppm); lásd a 39. irány ­
mutatást (2). Amennyiben gázok vagy er ősen illékony anyagok (például 
hűtőfolyadékok) vizsgálata esetén e határértékeket túl kell lépni, a döntést 
indokolni kell. A határkoncentrációnak egyértelm ű toxicitást kell el őidéznie 
anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
 
Tartománybehatároló vizsgálat  
11. A fő vizsgálat megkezdése el őtt tartománybehatároló vizsgálat elvégzése 
lehet szükséges. A tartománybehatároló vizsgálat átfogóbb a dózisbehatároló vizsgálatnál, mivel nem korlátozódik a koncentráció kiválasztására. A tarto ­
mánybehatároló vizsgálat révén szerzett információk hozzájárulhatnak a f ő 
vizsgálat sikeréhez. A tartománybehatároló vizsgálat például technikai jellegű információkkal szolgálhat az analitikai módszerek, a részecskemére ­
tezés, a toxikus hatásmechanizmusok felismerése, a klinikai kórtani és 
kórszövettani adatok, valamint a f ő vizsgálat lehetséges NOAEL- és 
MTC-koncentrációinak becslése vonatkozásában. A vizsgálatvezet ő a tarto­
mánybehatároló vizsgálatot alkalmazhatja a légz őrendszer irritációs küszöb ­
értékének (például a légz őrendszer kórszövettani elemzése, a tüd ő működé­
sének vizsgálata vagy bronchoalveoláris átmosás útján történ ő) meghatá ­
rozása, az állatoknak indokolatlan stresszt nem okozó, elfogadható maxi ­
mális koncentráció, valamint a vizsgált vegyi anyag toxicitását legjobban jellemző paraméterek meghatározása céljából.
 
12. A tartománybehatároló vizsgálat egy vagy több koncentrációszintre is kiter ­
jedhet. Mindegyik koncentrációszintnek legfeljebb három hím és három 
nőstény tehet ő ki. A tartománybehatároló vizsgálatnak legalább 5 napig 
kell tartania, és általában nem tarthat tovább 14 napnál. A vizsgálati jegy ­
zőkönyvnek tartalmaznia kell a f ő vizsgálathoz kiválasztott koncentrációk 
indokolását. A f ő vizsgálat célja a koncentráció-válasz összefüggésnek a 
feltételezett legérzékenyebb végpont alapján történ ő kimutatása. Alsó 
koncentrációként lehet őleg olyan koncentráció választandó, amelynél nem 
észlelhető káros hatás, míg a fels ő koncentrációnak egyértelm ű toxicitást 
kell előidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna 
vagy befolyásolná az élettartamukat (3).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. A tartománybehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek 
kiválasztásakor figyelembe kell venni minden rendelkezésre álló informá ­
ciót, beleértve a szerkezet-aktivitás összefüggéseket és a hasonló vegyi anyagok adatait (lásd a 3. bekezdést). A tartománybehatároló vizsgálat megerősítheti, illetve megcáfolhatja a legérzékenyebbnek vélt mechanisztikai 
alapú végpontokat, például az organofoszfátok kolineszterázgátló hatását, a 
vörösvérsejtekre toxikus anyagok okozta methemoglobinképz ődést, a pajzs ­
mirigyre toxikus anyagok esetén a pajzsmirigyhormonokat (T
 3 , T 4 ), a fehér ­
jét, az LDH-t, vagy az ártalmatlan, nehezen oldható részecskék vagy a tüd őt 
irritáló aeroszolok esetén a bronchoalveoláris átmosási folyadékban lév ő 
neutrofileket.  
Fő vizsgálat  
14. A fő szubakut toxicitási vizsgálat általában három koncentrációszintre, vala ­
mint szükség szerint azokkal párhuzamos negatív (leveg ővel kezelt) és/vagy 
vivőanyaggal kezelt kontrollokra terjed ki (lásd a 17. bekezdést). A 
megfelelő expozíciós szintek kiválasztásának el ősegítéséhez fel kell hasz ­
nálni minden rendelkezésre álló adatot, beleértve a szisztémás toxicitási 
vizsgálatok eredményeit, az anyagcserére vonatkozó és kinetikai adatokat (különös hangsúlyt kell fektetni a kinetikai folyamatokat telít ő magas 
koncentrációszintek elkerülésére). Mindegyik vizsgált csoport legalább 10 
rágcsálóból (5 hím és 5 n őstény egyedb ől) áll, amelyeket heti 5 napon 
napi 6 órára teszünk ki a vizsgált vegyi anyagnak 4 héten keresztül (a vizsgálat teljes id őtartama 28 nap). Az állatok heti 7 napon is kitehet ők a 
vizsgált anyagnak (például belélegezhet ő gyógyszerek vizsgálata esetén). 
Amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi 
anyagra, az egyes nemek különböz ő koncentrációszinteknek is kitehet ők a 
15. bekezdésben ismertetett koncentráció-válasz összefüggés optimális feltá ­
rása érdekében. Patkányoktól eltér ő rágcsálófajok csak orron át történ ő 
expozíciója esetén az expozíció maximális id őtartama kiigazítható a fajs ­
pecifikus szorongás minimalizálása érdekében. Napi 6 óránál rövidebb expo ­
zíciós idő alkalmazása vagy hosszabb id őtartamú (például napi 22 órás), 
egész testfelületen keresztüli expozíciós vizsgálat szükségessége esetén indo ­
kolást kell adni (lásd a 39. iránymutatást (2)). Az expozíció id őtartama alatt 
az állatok nem kaphatnak takarmányt, kivéve, ha az id őtartam meghaladja a 
6 órát. Az állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes időtartama alatt adható.
 
15. A célkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy azonosítható(k) 
legyen(ek) a célszerv(ek) és egyértelm ű koncentráció-válasz összefüggés 
legyen kimutatható:  
— A fels ő koncentrációszintnek toxikus hatásokat kell el őidéznie anélkül, 
hogy késleltetett tüneteket vagy elhullást okozna, ami kizárná az érdemi 
értékelést.  
— A köztes koncentrációszint(ek)et úgy kell felosztani, hogy a toxikus 
hatások fokozatosan növekedjenek az alsó és a fels ő koncentrációszint 
között.  
— Az alsó koncentrációszint nem, vagy csak kis mértékben idézheti el ő 
toxicitás jeleit.  
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat  
16. Kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálat végezhet ő a toxicitás visszafordítha ­
tóságának, elhúzódó vagy késve fellép ő voltának a kezelést követ ő 
megfelelő hosszúságú, de legalább 14 napos id őszak során történ ő 
megfigyelése érdekében. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz hasz ­
nált csoportok öt hímb ől és öt n őstényből állnak, amelyeket a f ő vizs­
gálatban megfigyelt kísérleti állatokkal egyidej űleg teszünk ki a vizsgált 
vegyi anyagnak. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt 
csoportokat a legnagyobb koncentrációban kell kitenni a vizsgált vegyi anyagnak, és ezzel párhuzamosan szükség szerint leveg ővel és/vagy viv ő­
anyaggal kezelt kontrollok vizsgálatát is el kell végezni (lásd a 17. bekez ­
dést).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontrollállatok  
17. A párhuzamosan vizsgált negatív (leveg ővel kezelt) kontrollállatokat a vizs ­
gált csoportokban lév ő állatokkal azonos módon kell kezelni, azzal a 
különbséggel, hogy a vizsgált vegyi anyag helyett sz űrt levegőnek tesszük 
ki azokat. Amennyiben vizet vagy más anyagot használunk a vizsgálati 
légkör létrehozásának el ősegítésére, a vizsgálathoz negatív (leveg ővel kezelt) 
kontrollcsoport helyett viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkal ­
mazni. Viv őanyagként lehet őség szerint vizet kell használni. Ha a viv őanyag 
víz, a kontrollállatokat ugyanolyan relatív páratartalmú leveg őnek kell 
kitenni, mint a vizsgált anyagnak kitett csoportokat. Az alkalmas viv őanyag 
kiválasztásának megfelel ően elvégzett el őzetes vizsgálaton vagy múltbeli 
adatokon kell alapulnia. Ha a viv őanyag toxicitásáról nincsenek részletes 
információk, a vizsgálatvezet ő dönthet úgy, hogy negatív (leveg ővel kezelt) 
és vivőanyaggal kezelt kontrollt egyaránt alkalmazni kell, ez azonban er ősen 
ellenjavallt. Ha a múltbeli adatok alapján a viv őanyag nem toxikus, nincs 
szükség negatív (leveg ővel kezelt) kontrollcsoportra, és ez esetben csak 
vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Amennyiben a viv ő­
anyaggal kevert vizsgált vegyi anyag az el őzetes vizsgálat alapján nem 
bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a viv őanyag sem tekin ­
tendő toxikusnak, és ezt a viv őanyagkontrollt kell használni.  
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK  
A koncentrációk beadása  
18. Az állatokat gáz, g őz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a 
vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb 
valószínűséggel el őforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és 
kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz leveg ős körülmé ­
nyek között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk kelet ­
kezésének elkerülésére. A részecskéket képz ő anyagok mechanikai eljárá ­
soknak vethet ők alá a részecskeméret csökkentése érdekében. További 
útmutatás a 39. iránymutatásban (2) olvasható.
 
Részecskeméret-eloszlás  
19. Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök 
esetén részecskeméretezést kell végezni. A légz őrendszer összes lényeges 
részének expozíciója érdekében 1 és 3 μm közötti tömegfelez ő aerodina ­
mikai átmér ővel (MMAD) rendelkez ő, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba 
eső geometriai szórású ( σ g ) aeroszolok használata javasolt (4). Habár ésszer ű 
keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakért ői 
megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehet őség. A fémg őzök 
részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, míg a töltéssel 
rendelkez ő részecskék és a rostok meghaladhatják azt.  
A vizsgált vegyi anyag el őkészítése viv őanyagban  
20. A vizsgált vegyi anyag ideális esetben viv őanyag nélkül vizsgálandó. Ha a 
vizsgált vegyi anyag megfelel ő koncentrációjának és részecskeméretének 
előállításához viv őanyag alkalmazása szükséges, a víz részesítend ő előny­
ben. Ha a vizsgált vegyi anyagot viv őanyagban oldjuk fel, minden esetben 
igazolni kell annak stabilitását.  
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE  
Kamrabeli légáramlás  
21. Az expozíciós kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, 
folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább 
óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy id őbeli 
stabilitás) valós idej ű nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter 
globális mérését jelenti, és közvetett lehet őséget nyújt valamennyi lényeges 
dinamikus inhalációs paraméter szabályozására. A koncentráció valós idej ű 
nyomon követése esetén a légáramlásokat elegend ő expozíciónként és 
naponként egy alkalommal mérni. Különös figyelmet kell fordítani a csak  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
orron át történ ő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerü ­
lésére. Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén- 
dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben feltételezhet ő, 
hogy ez a szabvány nem teljesíthet ő, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrá ­
ciót mérni kell. Ha az expozíció els ő napján végzett mérések azt mutatják, 
hogy e gázok szintje megfelel ő, rendszerint nincs szükség további méré ­
sekre.  
A kamra h őmérséklete és relatív páratartalma  
22. A kamra h őmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési 
zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történ ő és az 
egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt folyamatosan nyomon kell követni, és lehet őség szerint minden expozíció során óránként 
fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat lehet őség szerint 30–70 %-os tarto ­
mányban kell tartani, ugyanakkor el őfordulhat, hogy ez vagy nem érhet ő el 
(például vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhet ő a vizsgált 
vegyi anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.
 
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció  
23. Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehet őség szerint ki 
kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk 
meg, hogy az el őállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk az inhalációs 
kamrarendszeren áthaladt leveg ő össztérfogatával. A névleges koncentráció 
nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges 
és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhet ő a vizsgálati 
rendszer el őállítási hatásfoka, és így feltárhatók az el őállítással összefügg ő 
problémák.  
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció  
24. A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán 
belül, az állatok belégzési zónájában végzett mintavétellel megállapított 
koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módsze ­
rekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióké ­
pességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai sz űrőelemzéssel 
határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponens ű, por alakú 
aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfo ­
gadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelel ő, a vizsgálat el őtt 
végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkom ­
ponensű, por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén 
alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasz ­
tani, hogy a leveg őben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagé ­
hoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehet őleg leve­
gőben lebeg ő) vizsgált vegyi anyag rendszeres id őközönként végzett újbóli 
elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát.
 
25. Lehet őség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni a 
vizsgálat teljes id őtartama alatt, és a vizsgált mintát olyan körülmények 
között kell tárolni, hogy meg őrződjön annak tisztasága, homogenitása és 
stabilitása. A vizsgálat megkezdését megel őzően el kell végezni a vizsgált 
vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, 
valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyez ő anyagok 
és szennyez ődések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem 
kizárólag – a következ ő adatokkal mutatható ki: retenciós id ő és relatív 
csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, 
illetve más becslésekkel meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban 
legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) 
megerősíteni a megbízó által adott jellemzést.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani. 
Az expozíciós körülmények stabilitásának bizonyítására valós idej ű 
nyomonkövetési eszköz – például aeroszolok esetén aeroszolfotométer, vagy gőzök esetén az összes szénhidrogéntartalmat elemz ő műszer – alkal ­
mazható. A kamrabeli tényleges koncentrációt minden expozíciós napon 
minden expozíciós szint tekintetében legalább háromszor meg kell mérni. 
Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, expozíciós id őszakonként egy mintavétel is elfogadható. Ideális 
esetben ezt a mintavételt a teljes expozíciós id őszak folyamán kell elvé ­
gezni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és g őzök esetén legfeljebb 
± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyen ­
súlyi állapotának kialakulásához szükséges id őt (t
 95 ) ki kell számítani és 
jegyzőkönyvezni kell. Egy adott expozíció id őtartama magában foglalja a 
vizsgált vegyi anyag el őállításának idejét. Ehhez figyelembe kell venni a 
kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez és a bomláshoz szükséges id őt 
(t 95 ). A t  95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.  
27. A nagyon összetett, gázokból/g őzökből és aeroszolokból álló keverékek 
(például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasz ­
nálói termékekb ől/készülékekb ől kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén 
az egyes fázisok eltér ően viselkedhetnek az inhalációs kamrában. Éppen 
ezért mindegyik fázishoz (gáz/g őz és aeroszol) legalább egy indikátor ­
anyagot (analitot) – általában a keverék els ődleges hatóanyagát – kell kivá ­
lasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncent ­
rációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetev ő vagy az indikátor ­
anyag (analit) vonatkozásában kell a jegyz őkönyvben feltüntetni. A tény ­
leges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (2).  
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás  
28. Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik koncentrációszint tekin ­
tetében legalább hetente meg kell határozni sorozatos ütközésmér ő vagy 
alternatív m űszer, például aerodinamikai részecskeméret- 
meghatározó (APS) segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközés ­
mérővel és az alternatív m űszerrel kapott eredmények egyeznek, az alter ­
natív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható.  
29. Az els ődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravi ­
metriai sz űrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az els ődleges 
műszer mintavételi hatékonyságának meger ősítése érdekében. A részecs ­
keméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a sz űrőelemzéssel 
kapott tömegkoncentrációt ésszer ű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 
39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában vizsgált összes 
koncentrációnál bizonyítható az egyezés, a további meger ősítő mérések 
mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni a vizs ­
gálat eseteges megismétlését szükségessé tev ő kétes adatok el őfordulásának 
minimalizálása érdekében.  
30. Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a lehet ő­
sége, hogy a g őz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes 
fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a g őzatmoszférában.  
MEGFIGYELÉSEK  
31. Az állatokat expozíciós id őtartam el őtt, alatt és után klinikai megfigyelé ­
seknek kell alávetni. Az állatok expozíció során megfigyelt reakciójától függően gyakoribb megfigyelések is kilátásba helyezhet ők. Ha az állatok 
megfigyelését az azok lefogására szolgáló csövek használata, az egész test ­
felületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra rossz megvilágítása vagy az átlátszatlan légkör akadályozza, az állatokat az expozíció után alapos megfigyelésnek kell alávetni. A következ ő napi expozíció el őtt végzett 
megfigyelésekkel felmérhet ő a toxikus hatások visszafordíthatósága vagy 
súlyosbodása.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Minden megfigyelést rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat 
esetében önálló adatsort veszünk fel. Ha az állatokat humánus okok miatt 
el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehet ő legpontosabban fel kell 
jegyezni az elhullás id őpontját.  
33. A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a b őr és a 
szőrzet, a szem és a nyálkahártya, a légz ő-, keringési és idegrendszer, vala ­
mint a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. 
Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, 
alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért h őmérséklet bizonyítékot 
szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára. A vizsgálati protokollba további értékelések is felvehe ­
tők, ilyenek például a kinetikai vizsgálatok, a biomonitoring, a tüd őműködés 
vizsgálata, a tüd őszövetben felgyüleml ő, rosszul oldható anyagok vissza ­
maradásának vizsgálata, valamint a viselkedésbeli változások megfigyelése.
 
TESTSÚLY  
34. Az egyes állatok súlyát röviddel az els ő expozíció (0. nap) el őtt, azt köve ­
tően pedig hetente kétszer (például az expozíció nélküli hétvégén végbement 
felépülés bizonyítása céljából pénteken és hétf őn, vagy a szisztémás toxi ­
citás felmérését lehet ővé tevő időközönként), valamint az elhullás vagy 
elpusztítás id őpontjában fel kell jegyezni. Amennyiben az els ő 2 héten 
semmilyen hatás nem figyelhet ő meg, a vizsgálat hátralev ő részében a test ­
súly heti rendszerességgel is mérhet ő. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizs ­
gálatban alkalmazott állatok (ha vannak) súlyának heti rendszerességgel 
végzett mérését a felépülési id őszak során is folytatni kell. A vizsgálat 
lezárásakor minden állat súlyát meg kell mérni röviddel az elpusztítás el őtt, 
hogy torzításmentesen kiszámítható legyen a szervek súlyának testsúlyhoz viszonyított aránya.
 
TÁPLÁLÉK- ÉS VÍZFOGYASZTÁS  
35. A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. A felvett 
víz mennyisége szintén mérhet ő. 
KLINIKAI PATOLÓGIA  
36. Minden állaton – beleértve a kontroll- és kísér ő (visszafordíthatósági) 
csoportokba tartozókat – klinikai patológiai értékelést kell végezni az elpusztításkor. Az expozíció vége és a vérvétel között eltelt id őt fel kell 
jegyezni, különösen ha az adott végpontra gyors regeneráció jellemz ő. A 
rövid plazmabeli felezési idej ű paramétereknél (például COHb, CHE és 
MetHb) az expozíció végét követ ően végzend ő mintavétel.
 
37. A minden toxikológiai vizsgálathoz általánosan el őírt klinikai patológiai para ­
méterek felsorolása az 1. táblázatban található. Rendszeres vizeletelemzés nem kötelez ő, de elvégezhet ő, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás alapján 
célszerűnek ítéljük. A vizsgálatvezet ő a vizsgált vegyi anyag toxicitásának 
alaposabb jellemzése érdekében további paraméterek értékelése mellett dönthet (például kolineszteráz, lipidek, hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin vagy Heinz-testek, kreatin-kináz, csontvel ő/eritroid arány, 
troponinok, artériás vérgáz, laktát-dehidrogenáz, szorbit-dehidrogenáz, gluta ­
mát-dehidrogenáz és gamma-glutamil-transzpeptidáz).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
1. táblázat  
Szabványos klinikai patológiai paraméterek  
Hematológiai paraméterek  
vörösvértestszám 
hematokrit 
hemoglobinkoncentráció 
átlagos korpuszkuláris hemoglobin átlagos korpuszkuláris térfogat 
átlagos korpuszkuláris hemoglobin ­
koncentráció 
retikulociták teljes vérkép 
differenciált vérkép 
trombocitaszám 
véralvadási képesség (a követ ­
kezők egyikét kell választani): 
— prothrombin id ő 
— véralvadási id ő 
— részleges prothrombin id ő
 
Klinikai kémiai paraméterek  
glükóz (*) 
összes koleszterin trigliceridek 
a vérben lév ő karbamid-nitrogén 
összes bilirubin kreatinin összes fehérje 
albumin 
globulin alanin-aminotranszferáz 
aszpartát-aminotranszferáz alkáli foszfatáz 
kálium 
nátrium kalcium foszfor 
klorid
 
Vizeletelemzés (nem kötelez ő) 
megjelenés (szín és zavarosság) 
térfogat fajsúly vagy ozmolaitás 
pH összes fehérje 
glükóz vér/vérsejtek
 
(*) Mivel a hosszas koplaltatás torzíthatja a kezelt állatok glükózszintjének a kont ­
rollállatokéhoz viszonyítva mért értékét, a vizsgálatvezet őnek döntenie kell, hogy 
célszerű-e az állatokat koplaltatni. Koplaltatási id ő alkalmazása esetén annak a 
vizsgált fajhoz kell igazodnia, patkány esetén például 16 óra lehet (éjszakai 
koplaltatás). A koplaltatás mellett mérhet ő glükózszint meghatározása az utolsó 
expozíciós héten történ ő éjszakai koplaltatás után, vagy a boncolás el őtti éjszakai 
koplaltatás után végezhet ő el (utóbbi esetben az összes többi klinikai patológiai 
paraméterrel együtt kell meghatározni).  
38. Amennyiben arra utaló bizonyítékot találunk, hogy az alsó légutak (azaz az 
alveolusok) jelentik a lerakódás és a visszamaradás els ődleges helyét, a 
bronchoalveoláris átmosás (BAL) lehet a legalkalmasabb technika a hipoté ­
zisen alapuló dózis-hatás paraméterek alveolitiszre, tüd őgyulladásra és fosz ­
folipidózisra összpontosító mennyiségi elemzéséhez. Ez lehet ővé teszi az 
alveolusok károsodása dózis-válasz és id ő-lefolyás típusú változásainak 
megfelelő vizsgálatát. A BAL eljárás útján nyert folyadék elemezhet ő teljes 
és differenciált vérkép, összes fehérje, valamint laktát-dehidrogenáz tekinte ­
tében. Figyelembe vehet ők továbbá egyéb, lizoszómakárosodásra, foszfoli ­
pidózisra, fibrózisra, valamint irritáció okozta vagy allergiás gyulladásra 
utaló paraméterek is, ami magában foglalhatja a gyulladást serkent ő citoki­
nek/kemokinek meghatározását. A BAL-mérések általában kiegészítik a kórszövettani vizsgálatok eredményeit, azonban nem helyettesíthetik azokat. A tüdőátmosás elvégzéséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MAKROSZKOPIKUS PATOLÓGIA ÉS A SZERVEK SÚLYA  
39. Minden kísérleti állaton teljes kivéreztetést és (ha lehetséges) makroszko ­
pikus boncolást kell végezni, beleértve azokat is, amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett távolítani a 
vizsgálatból. Minden egyes állatnál fel kell jegyezni az utolsó expozíció 
és az elpusztítás között eltelt id őt. Ha a boncolás nem végezhet ő el rögtön 
azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot h űtve (nem 
fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kell ően alacsony 
hőmérsékleten. A boncolást a lehet ő leghamarabb, általában egy vagy két 
napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légz őrendszert 
érintő változásokra.
 
40. A makroszkopikus boncolás során kórszövettani vizsgálat céljából megfelel ő 
közegben meg őrizendő szervek és szövetek felsorolása a 2. táblázatban 
található. A [szögletes zárójelben] feltüntetett szervek és szövetek, valamint 
bármely egyéb szerv és szövet meg őrzéséről a vizsgálatvezet ő saját mérle ­
gelése alapján dönthet. A  félkövérrel  szedett szerveket a kiszáradás elkerü ­
lése érdekében a boncolás után a lehet ő legrövidebb id őn belül meg kell 
tisztítani, és azok nedves súlyát meg kell mérni. A pajzsmirigy és a mellék ­
herék súlyát csak akkor javasolt megmérni, ha szükséges, mivel az azok megtisztítása során keletkez ő mesterséges elváltozások akadályozhatják a 
kórszövettani értékelést. A szöveteket és a szerveket közvetlenül a boncolás 
után, és az alkalmazandó fixálószert ől függően legalább 24–48 órával a 
megtisztítás el őtt 10 %-os pufferelt formalinban vagy egyéb, megfelel ő fixá­
lószerben fixálni kell.
 
2. táblázat  
A makroszkopikus boncolás során meg őrizendő szervek és szövetek  
Mellékvesék  
Csontvelő (és/vagy friss felszívott minta)  
Agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a 
nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)  
[Szemek (retina, látóideg) és szemhéjak]  
Szív 
Vesék  
Gégefő (3 szinten, amelyek egyikének tartal ­
maznia kell a gégefed ő alapját)  
Máj 
Tüdő (egy szinten készített metszet mind ­
egyik lebenyr ől, beleértve a f ő hörgőket) 
Nyirokcsomók a tüd ő hilusok körüli részér ől, 
különösen nehezen oldható, szemcsés vizsgált vegyi anyagok esetén. Alaposabb vizsgálatok és/vagy immunológiára összpontosító tanul ­
mányok esetében további nyirokcsomók 
megőrzése is megfontolható, például a gátori, 
nyaki/állkapocs alatti és/vagy fülcse körüli részekről.
 
Orr-garati szövetek (legalább 4 szinten, 
amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr- 
garati csatornát és az orrhoz társuló nyirok ­
szövetet [NALT])  
Nyelőcső 
[Szaglógumó]  
Petefészkek  Ondóhólyagok  
Gerincoszlop (nyaki, mellkasi középs ő és 
ágyéki szakasz)  
Lép 
Gyomor  
Herék  
Csecsemőmirigy  
Pajzsmirigy  
Légcső (legalább 2 szinten, beleértve egy 
hosszirányú metszetet a carinán keresztül, 
valamint egy keresztmetszetet)  
[Húgyhólyag]  
Méh 
Minden makroszkopikus elváltozás  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. A tüd őt sértetlenül kell eltávolítani, le kell mérni, és a tüd ő szerkezetének 
megőrzése érdekében megfelel ő fixálószert kell belecsepegtetni 20-30 cm 
víznek megfelel ő nyomáson (5). Mindegyik lebenyr ől metszetet kell készí ­
teni egy szinten, beleértve a f ő hörgőket, ugyanakkor tüd őátmosás alkalma ­
zása esetén az át nem mosott lebenyr ől három szinten kell metszetet készí ­
teni (nem sorozatos metszeteket).  
42. Az orr-garati szöveteket legalább 4 szinten kell vizsgálni, amelyek egyi ­
kének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát (5, 6, 7, 8, 9), lehet ővé 
téve a laphámsejtes, átmeneti (csillósz őrrel nem borított légúti), légúti (csil ­
lószőrrel borított) és szaglóhámszövet, valamint az elvezet ő nyirokszövet 
(NALT, 10, 11) megfelel ő vizsgálatát. A gégef őt három szinten kell vizs ­
gálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell a gégefed ő alapját (12). A 
légcsövet legalább két szinten kell vizsgálni, beleértve egy hosszirányú 
metszetet az extrapulmonális hörg ők elágazásánál lév ő carinán keresztül, 
valamint egy keresztmetszetet.  
KÓRSZÖVETTANI VIZSGÁLATOK  
43. A 2. táblázatban felsorolt összes szerv és szövet kórszövettani vizsgálatát el 
kell végezni a kontrollcsoportoknál és a magas koncentrációnak kitett csoportoknál, valamint a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított összes 
állatnál. Különös figyelmet kell fordítani a légz őrendszerre, a célszervekre, 
valamint a makroszkopikus elváltozásokra. Azon szerveket és szöveteket, amelyeken a magas koncentrációnak kitett csoportnál elváltozások figyel ­
hetők meg, mindegyik csoportnál meg kell vizsgálni. A vizsgálatvezet ő a 
koncentráció-válasz összefüggés egyértelm ű kimutatása érdekében dönthet 
úgy, hogy további csoportoknál is végezni kell kórszövettani értékelést. Kísérő (visszafordíthatóság vizsgálatára szolgáló) csoport alkalmazása esetén 
minden olyan szerv és szövet kórszövettani értékelését el kell végezni, 
amelynél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozások figyelhet ők 
meg. Ha a magas koncentrációnak kitett csoportnál túlzott mérték ű idő előtti 
elhullás vagy egyéb problémák veszélyeztetik az adatok szignifikanciáját, az eggyel alacsonyabb koncentrációra vonatkozóan kell kórszövettani vizs ­
gálatot végezni. Meg kell kísérelni a makroszkopikus és mikroszkopikus 
megfigyelések közötti összefüggések feltárását.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
44. Meg kell adni az egyes állatok testsúlyára, táplálékfelvételére, klinikai pato ­
lógiai eredményeire, makroszkopikus boncolási eredményeire, szerveinek súlyára, valamint kórszövettani eredményeire vonatkozó adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes 
vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lév ő állatok számát, a specifikus 
mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli lefolyását és visszafordítható ­
ságát, valamint a boncolások eredményeit. Mind a számszer ű, mind a járu ­
lékos eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell kiértékelni. 
Bármilyen általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazható, és a statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell kiválasztani.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
45. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell értelemszer űen 
tartalmaznia:  
Kísérleti állatok és azok tartása  
— A ketrecben való tartás körülményei, beleértve különösen az állatok 
ketrecenkénti számát (vagy számának változását), az alom anyagát, a 
környezeti h őmérsékletet és a relatív páratartalmat, a megvilágítás id őtar­
tamát, valamint a takarmány meghatározását.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— A vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltér ő faj alkalmazásának 
indokolása. Forrás és múltbéli adatok is megadhatók, amennyiben azokat 
hasonló expozíciós, tartási és koplaltatási körülményeknek kitett állat ­
okon gyűjtötték.  
— Az állatok száma, kora és neme.  
— A véletlen kiválasztás módszere.  
— A vizsgálat el őtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmá ­
nyozást, a karantént és a betegségek kezelését.  
Vizsgált vegyi anyag  
— Fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai 
tulajdonságok (beleértve az izomerizációt).  
— Azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási 
Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).  
Vivőanyag  
— A viv őanyag használatának, valamint megválasztásának indokolása (ha a 
vivőanyag nem víz).  
— Múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a 
vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét.  
Inhalációs kamra  
— Az inhalációs kamra részletes leírása, beleértve annak térfogatát és 
vázlatrajzát is.  
— Az állatok expozíciójához és a légkör el őállításához használt berende ­
zések eredete és leírása.  
— A hőmérséklet, a páratartalom, a részecskeméret és a tényleges koncent ­
ráció mérésére szolgáló berendezések.  
— A leveg ő forrása és a kondicionáló rendszer.  
— Az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történ ő 
kalibrálására alkalmazott módszerek.  
— Nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív).  
— Expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), 
az állatok helye a kamrában (egész testfelületen keresztüli expozíció).  
— A vizsgálati légkör stabilitása.  
— A hőmérséklet- és páratartalom-érzékel ők, valamint a vizsgálati légkör 
mintavételének helye a kamrában.  
— A bevitt/elszívott leveg ő kezelése.  
— Légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként 
(csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként 
(egész testfelületen keresztüli expozíció).  
— Az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges id ő 
(t95).  
— A térfogatváltozások óránkénti száma.  
— Mérőberendezések (ha vannak).  
Expozíciós adatok  
— A fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra el őállí­
tott vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt leveg ő 
térfogatával).  
— A vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gy űjtött tény­
leges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, g őz, aeroszol) 
felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhet ő. 
— Minden leveg őbeli koncentrációt tömegegységekben (mg/l, mg/m  3 stb.), 
nem pedig térfogategységekben (ppm, ppb stb.) kell megadni.  
— Részecskeméret-eloszlás, tömegfelez ő aerodinamikai átmér ő (MMAD), 
valamint geometriai szórás ( σ g ), beleértve kiszámításuk módját is. Jegy ­
zőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket.  
Vizsgálati körülmények  
— A vizsgált vegyi anyag el őkészítésének részletei, beleértve a szilárd 
anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi 
anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részle ­
teit is.  
— A vizsgálati légkör el őállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való 
expozíciójára alkalmazott berendezések leírása (lehet őség szerint vázlat ­
rajzzal).  
— A kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás megfigyelésére 
használt berendezések részletei (kalibrációs görbe meghatározása).  
— A kamrabeli koncentráció és részecskeméret-eloszlás meghatározásához 
alkalmazott minták gy űjtésére használt berendezések részletei.  
— Az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának 
részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegb ől való 
visszanyerésének hatásfokát is).  
— Az állatok vizsgálati és kontrollcsoportokba való besorolásához alkalma ­
zott véletlen kiválasztási módszer.  
— A táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takar ­
mány típusa/eredete, a víz eredete).  
— A vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása.  
Eredmények  
— A kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás értékeinek táblá ­
zatos összefoglalása.  
— A kamrabeli névleges és tényleges koncentráció adatainak táblázatos 
összefoglalása.  
— Részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai 
mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és 
a σ g számításait is.  
— A válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása 
minden egyes állatra (azaz a mérgezési tüneteket mutató és köztük az 
elhullt állatokra) vonatkozóan (ideértve a hatások jellegét, súlyosságát, 
megjelenésének id őpontját és id őtartamát is).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Az egyes állatok súlyának táblázatos összefoglalása.  
— A táplálékfelvétel táblázatos összefoglalása.  
— A klinikai patológiai adatok táblázatos összefoglalása.  
— A boncolások és, ha rendelkezésre állnak, a kórszövettani vizsgálatok 
eredményei minden egyes állatra vonatkozóan.  
— Minden egyéb mért paraméter táblázatos összefoglalása.  
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése  
— Különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszerben – például a 
határkoncentráció vagy a részecskeméret kapcsán – el őírt feltételeknek 
való megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására.  
— Ki kell térni a részecskék belélegezhet őségére az általános megálla ­
pítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltételek 
nem teljesültek.  
— A vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a 
tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek következe ­
tességét, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti össze ­
függést.  
— Ki kell térni az elhullás valószín ű okára, valamint az els ődleges hatás ­
mechanizmusra (szisztémás vagy helyi).  
— Magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról 
szóló OECD-iránymutatás (3) szerinti kritériumok alapján humánus módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszköd ő vagy súlyos és 
tartós szorongás jeleit mutató állatokat.
 
— Meg kell jelölni a célszerve(ke)t.  
— Meg kell határozni a NOAEL és a LOAEL értékét.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test 
Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesti ­
cide Programs, United States Environmental Protection Agency.  
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appéldául Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diag ­
rams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. 
Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK 
rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatá ­
lyon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, 
HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ (28 NAPOS) TOXICITÁS 
(DERMÁLIS)  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (A).  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (B).  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta adagolják a b őrre, fokozatosan növekv ő 
dózisokban több kísérleti állatcsoportnak, 28 napon keresztül. A 
vizsgálati id őszak alatt az állatokat naponta kell vizsgálni a toxicitás 
tüneteinek észlelése érdekében. A vizsgálat során elpusztult állatokat és a vizsgálat végéig életben maradó állatokat is fel kell boncolni.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
Az állatokat a vizsgálat el őtt legalább öt napig a vizsgálat tartási és 
takarmányozási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése el őtt véletlenszer ű kiválasztással 
kezelt és kontrollcsoportokba kell osztani. A vizsgálat megkezdése 
előtt nem sokkal le kell nyírni a sz őrt a törzs háti oldaláról. Borot ­
válni is lehet, de azt a vizsgálat megkezdése el őtt megközelít őleg 24 
órával kell elvégezni. A vizsgálat során általában ismételt nyírás és borotválás szükséges, rendszerint heti id őközönként. A nyírás vagy 
borotválás során gondosan ügyelni kell arra, hogy a b őr ne sérüljön 
meg. A testfelület legalább 10 %-át szabaddá kell tenni a vizsgált anyag alkalmazásához. Az állat súlyát is tekintetbe kell venni, amikor a lecsupaszítandó felületr ől, illetve a kezelt felület nagysá ­
gáról döntenek. Ha szilárd anyagot vizsgálnak, amelyet adott esetben 
porítani is lehet, az anyagot vízzel kell ően át kell nedvesíteni, vagy 
szükség esetén viv őanyagot kell alkalmazni annak biztosítására, hogy 
az minél jobban tapadjon a b őrhöz. A folyékony vizsgált anyagokat 
rendszerint hígítás nélkül kell adagolni. Az adagolás heti öt-hét alka ­
lommal történik.
 
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
1.6.2.1.  A kísérlethez használt állatok  
Kifejlett patkány, nyúl vagy tengerimalac használható. Más faj is 
használható, de azok használatát meg kell indokolni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehet őleg csak minimálisan, az 
átlagértékt ől maximum ± 20 %-kal térhet el.  
1.6.2.2.  Az állatok száma és neme  
Minden adagolási szinthez legalább 10 egészséges b őrű állatot (öt 
hímet és öt n őstényt) kell felhasználni. A n őstényeknél követelmény, 
hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ha id őközi elpusztítást 
terveznek, akkor a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot 
a vizsgálat befejezése el őtt el szándékoznak pusztítani. Ezenkívül 
még egy 10 f ős (nemenként öt állat) kísér ő állatcsoportot is kezel ­
hetnek a legnagyobb adaggal 28 napon át a toxikus hatás visszafor ­
díthatóságának, elhúzódó vagy késve fellép ő voltának megfigyelé ­
sére 14 nappal a kezelés után. 10 kontrollállatból (nemenként öt állat) álló kísér ő csoportot is használni kell.
 
1.6.2.3.  Dózisok  
Legalább három dózist és egy kontrollt kell használni, illetve egy 
vivőanyag-kontrollt, ha van viv őanyag. Az expozíciós id ő legalább 
napi hat óra legyen. A vizsgált anyagot minden nap hasonló időpontban kell alkalmazni, az alkalmazott mennyiséget pedig 
meghatározott id őközönként (hetente vagy hetente kétszer) hozzá 
kell igazítani az állatok növekedéséhez, hogy az állatok testsú ­
lyához viszonyított mennyiséget fenn lehessen tartani. A vizsgált anyaggal történ ő kezelést kivéve a kontrollcsoportban lév ő állat­
okkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, mint a vizsgálati 
csoportok állataival. Olyan esetekben, amikor az adagolás megkönnyítésére viv őanyagot alkalmaznak, a kontrollcsoportot 
ugyanúgy kell a viv őanyaggal kezelni, mint a kezelt csoportokat, 
és ugyanannyi viv őanyagot kell kapniuk, mint a legnagyobb 
adaggal kezelt csoportnak. A legnagyobb dózist úgy kell kiválasz ­
tani, hogy annak hatására az azzal kezelt csoportban jelentkezzenek a toxicitás jelei, de elhullás lehet őleg ne, vagy csak minimális 
mértékben jelentkezzen. A legkisebb adagot úgy kell kiválasztani, 
hogy az ne okozzon toxikus tüneteket. Ha használható becslés áll rendelkezésre az emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvez ő esetben a középs ő 
adaggal kezelt csoportnál minimális toxikus hatás észlelhet ő. Ha 
egynél több közbees ő dózist alkalmaznak, akkor azokat úgy kell 
kiválasztani, hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki. Az alacsony és közbees ő dózissal kezelt csopotokban, illetve a kont ­
rollcsoportban az elpusztult állatok száma minimális legyen, hogy 
az eredmények értelmezhet ő értékelése lehetséges legyen.
 
Ha a vizsgált anyag alkalmazása súlyos b őrirritációt okoz, a 
koncentrációt csökkenteni kell, ami az egyéb toxikus hatások 
mértékének csökkenésével vagy elt űnésével járhat a legnagyobb 
adaggal kezelt csoportban. Ha a b őr súlyosan károsodott, szük ­
ségessé válhat a vizsgálat leállítása és egy új vizsgálat megkezdése 
kisebb koncentrációk mellett.  
1.6.2.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha az el őzetes vizsgálat során napi 1 000 mg/testsúlykilogrammal 
adagolt vizsgált anyag vagy – ha a lehetséges emberi expozíció 
mértéke ismert – ennél magasabb dózis semmilyen toxikus hatást 
nem vált ki, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthet ők. 
1.6.2.5.  Megfigyelési id őszak 
Az összes állatot meg kell vizsgálni naponta a toxikus hatások 
megjelenésének észlelése érdekében. Fel kell jegyezni az elpusztulás 
időpontját, valamint azt az id őpontot, amikor a toxikus hatás jelei 
mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  A kísérlet végrehajtása  
Az állatokat egyesével kell a ketrecekben elhelyezni. Ideális esetben 
a vizsgált anyagot heti hét alkalommal kell az állatoknak beadni, 28 napon keresztül. A kísér ő csoportokban a nyomon követ ő megfigye ­
lésekre kiválasztott állatokat további 14 napig kell tartani kezelés 
nélkül, hogy a toxikus hatás visszafordíthatóságát, illetve elhúzódását ki lehessen mutatni. Az expozíció id őtartama napi hat óra.
 
A vizsgált anyagot a testfelület megközelít őleg 10 %-át kitev ő felü­
leten egyenletesen elosztva kell felvinni az állat b őrére. Erősen 
mérgező anyagoknál a felület lehet ennél kisebb, de a felület lehet ő 
legnagyobb részét a lehet ő legvékonyabb és legegyenletesebb bevo ­
nattal kell ellátni.  
Az expozíció ideje alatt a vizsgált anyagot a b őrrel porózus gézkö ­
téssel és nem irritáló ragtapasszal kell érintkezésben tartani. A vizs ­
gált területet megfelel ő módon be kell fedni, azért, hogy 
megmaradjon rajta a vizsgált anyag és a gézkötés, és az állatok ne nyalhassák le a vizsgált anyagot. Mozgásgátló szerkezeteket lehet használni annak megakadályozására, hogy az állat a vizsgált anyagot 
lenyelje, de a teljes immobilizáció mint módszer nem javasolt. Alter ­
natív megoldás lehet az ún. nyakörv védelmi eszköz használata.
 
Az expozíciós id ő leteltével a maradék vizsgált anyagot lehet őség 
szerint el kell távolítani a b őr felületének vízzel vagy más megfelel ő 
módon történ ő megtisztítása útján.  
Az összes állatot meg kell vizsgálni naponta, és a toxikus hatások 
megjelenését, súlyosságát és id őtartamát rögzíteni kell. A 
megfigyelésnek ki kell terjednie a b őr és a sz őrzet, a szem és a 
nyálkahártya, valamint a légz ő-, keringési rendszer, a vegetatív és 
a központi idegrendszer, valamint a szomatomotoros tevékenység 
és viselkedési minta változásaira. Hetente mérni kell az állatok 
súlyát. Ajánlott a takarmányfogyasztást is hetente mérni. Az állatok rendszeres megfigyelésére azért van szükség, hogy megel őzzük a 
kísérleti állatok kannibalizmus, szöveti autolízis, illetve rossz 
elhelyezés következtében történ ő elhullását. A vizsgálati id őszak 
végeztével a kísér ő csoportban lév ő állatok kivételével minden 
túlélő állatot fel kell boncolni. A súlyos és tartós betegség, illetve 
fájdalom jeleit mutató állatokat el kell távolítani, kíméletes módon 
leölni, és felboncolni.
 
A következ ő vizsgálatokat kell végrehajtani a vizsgálat végén 
minden állaton, a kontrollállatokat is ideértve:  
1) vérkép, amely magában foglalja legalább a hematokrit-értéket, a 
hemoglobin-koncentrációt, a vörösvértestszámot, a teljes és a fehérvérsejtszámot, a min őségi vérképet, az alvadási képességet, 
beleértve az alvadási id őt;
 
2) a vér klinikai-kémiai vizsgálata, amely magában foglalja a máj- és 
vesefunkció legalább egy paraméterét: szérum alanin-aminot ­
ranszferáz (korábban glutamát-piruvát- transzaminázként volt 
ismert), szérum aszpartát-aminotranszferáz (korábban glutamát- oxálecetsav-transzaminázként volt ismert), karbamid-nitrogén, az albumin, a kreatinin, az össz-bilirubin és szérum összfehérjeszint ­
jének mérését.
 
További meghatározások, amelyekre a pontos toxicitás értékeléséhez 
még szükség lehet: kalcium-, foszfor-, klorid-, nátrium-, káliumszint, 
éhgyomorra mért glükózszint, lipidek, hormonok, sav-bázis egyen ­
súly, methemoglobin és a kolineszterázaktivitás.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, 
további klinikai-kémiai vizsgálatokat is lehet végezni.  
1.6.4.  Autopszia  
A vizsgálatban részt vett minden állatot teljes boncolásnak kell 
alávetni. A májat, a veséket, a mellékveséket és a heréket a kimet ­
szés után minél el őbb, még nedvesen le kell mérni a kiszáradás 
elkerülése miatt. A szerveket és szöveteket (máj, vese, lép, herék, 
mellékvesék, szív és minden jelent ős sérülést vagy méretváltozást 
mutató szerv) alkalmas közegben fixálni kell az esetleges jöv őbeni 
kórszövettani vizsgálathoz.  
1.6.5.  Kórszövettani vizsgálat  
A nagy adaggal kezelt csoportban és a kontrollcsoportban szövettani 
vizsgálatot kell végrehajtani a tartósított szerveken és szöveteken. 
Azon szerveket és szöveteket, amelyek a legnagyobb dózisnál vizs ­
gált anyagnak tulajdonítható károsodásokat mutatnak, minden alacso ­
nyabb dózissal kezelt csoportban meg kell vizsgálni. Minden, a kísérő csoportba tartozó állatnál szövettani vizsgálatot kell végezni, 
külön hangsúlyt helyezve azon szervekre és szövetekre, amelyekr ől 
megállapítást nyert, hogy más kezelt csoportokban toxikus hatásokat mutatnak.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, minden egyes 
vizsgált csoporthoz megadva az állatok számát a vizsgálat kezdetén és az egyes sérüléstípusokat mutató állatok számát.
 
Minden megfigyelt eredményt megfelel ő statisztikai módszerrel ki 
kell értékelni. Bármilyen elismert statisztikai módszer használható.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a használt fajt, törzset, az állatok származását, a tartási körülmé ­
nyeket, az étrendet,  
— a vizsgálati körülményeket (ideértve a kötszer típusát is: zárt 
vagy nem zárt),  
— az adagolást (beleértve a viv őanyagot is, ha van) és a koncent ­
rációkat,  
— azt a szintet, amikor még nincs toxikus hatás (NEL),  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatokat, nemek és adagolás szerinti 
csoportosításban,  
— az elpusztulás idejét a vizsgálat során, illetve hogy az állatok 
megélték-e a vizsgálat végét,  
— a toxikus és más hatások leírását,  
— az egyes toxikus tünetek megfigyelésének id őpontját és a 
megfigyelést követ ő változásukat,  
— a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos 
adatokat,  
— az elvégzett hematológiai vizsgálatokat és azok valamennyi ered ­
ményét,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatokat és azok vala ­
mennyi eredményét (beleértve az esetleges vizeletelemzés 
eredményeit is),  
— a boncolási leleteket,  
— a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetését,  
— az eredmények statisztikai feldolgozását, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatását,  
— az eredmények értelmezését.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (D).  
4. SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét (E).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK  IN 
VITRO  VIZSGÁLATA EML ŐSÖKÖN  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 473-nak, kromoszóma-rendelle ­
nességek  in vitro  vizsgálata eml ősökön (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
Az in vitro  kromoszóma-rendellenesség vizsgálat célja azon anyagok 
meghatározása, amelyek szerkezeti kromoszóma-rendellenességeket okoznak tenyésztett eml ősállatsejtekben (1), (2), (3). A szerkezeti 
rendellenességek kétféle típusúak lehetnek, kromoszóma vagy 
kromatid. A mutációt el őidéző kémiai anyagok többsége esetében 
az előidézett rendellenességek kromatid típusúak, de kromoszóma 
típusúak is el őfordulnak. A poliploida gyakoriságának növekedése 
azt jelentheti, hogy valamely kémiai anyag potenciálisan el őidézhet 
számszerű rendellenességeket. Azonban e módszert nem számszer ű 
rendellenességek mérésére tervezték, és rendesen nem is erre a célra használják. A kromoszómamutációk és ehhez hasonló folyamatok számos emberi genetikai betegség okozói, bizonyítékok szólnak 
amellett, hogy a kromoszómamutáció és az ehhez hasonló folyama ­
tok, amelyek változásokat okoznak az onkogénekben és a tumor szuppresszor génekben, szerepet játszanak a rák el őidézésében 
emberekben és kísérleti állatokban.
 
A kromoszóma-rendellenességek  in vitro  vizsgálata megállapodott 
sejtvonalakon, sejttörzseken vagy primer sejtkultúrákon végezhet ő. 
A vizsgálathoz használt sejteket a tenyészetben a növekedési képes ­
ség, a kariotípus stabilitása, a kromoszómaszám, kromoszómák alaki változatossága és a kromoszóma-rendellenességek spontán gyakori ­
sága alapján kell kiválasztani.
 
Az in vitro  végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a 
metabolikus aktiválás valamilyen küls ő forrásának használatát. Ezen 
metabolikus aktiváló rendszer nem tudja teljesen utánozni az eml ő­
sállatokban  in vivo  meglévő körülményeket. Körültekint ően kell 
eljárni, el kell kerülni azon körülményeket, amelyek olyan pozitív 
eredményekhez vezethetnének, amelyek nem tükrözik a bels ő muta­
genitást, és a pH-érték, ill. ozmolalitás változásából vagy a magas citotoxicitási szintb ől származhatnak (4) (5).
 
E vizsgálatot azon anyagok sz űrésére lehet használni, amelyek mutá ­
ciót idézhetnek el ő (potenciális mutagének) és rákot okozhatnak (kar ­
cinogének) eml ősállatok esetében. Az e vizsgálatban pozitív ered ­
ményt adó számos vegyület eml ősállatok esetében rákkelt ő vegyület; 
azonban nincs tökéletes korreláció az itt ismertetett vizsgálat és a karciogenitás között. A korreláció függ a vizsgált anyag kémiai 
osztályától és egyre több bizonyíték van arra, hogy léteznek olyan 
rákkeltő anyagok, amelyeket e vizsgálat nem észlel, mivel úgy t űnik, 
hogy ezek nem a közvetlen DNS-károsító hatás révén, hanem más mechanizmussal fejtik ki a hatásukat.
 
Lásd még az Általános bevezetés B részét is.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Kromatid típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakárosodás, 
amely egy kromatid törésében vagy kromatidok közötti törésben és 
újraegyesítésben nyilvánul meg.  
Kromoszóma típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakároso ­
dás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy 
törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-repli ­
kációt követ ően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy 
másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16, … kromatiddal rendel ­
kező kromoszómák.  
Gap: egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok mini ­
mális átrendez ődését okozó akromatikus sérülés.  
Mitotikus index : a metafázisban lév ő sejtek és a sejtpopuláció 
összes sejtjének aránya; e populáció proliferációja mértékének 
jelzése.  
Számszer ű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a 
felhasznált sejteket jellemz ő normál számértékt ől. 
Poliploida : a haploid kromoszómaszám (n) egész számú, de nem 
diploid (azaz 3n, 4n, és így tovább) megsokszorosódása.  
Szerkezeti rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszko ­
pikus vizsgálata során észlelhet ő változás a kromoszóma szerkezeté ­
ben, mint a delíciók és fragmentumok, a kromoszómán belüli vagy a 
kromoszómák közötti átrendez ődés. 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Sejttenyészeteket kezelnek a vizsgált anyaggal mind metabolikus 
aktiválóval, mind anélkül. Meghatározott id őközönként metafázis 
blokkoló szerrel (például Colcemid® vagy kolchicin) kezelik a sejte ­
ket, majd az összegy űjtött, megfestett és metafázisban lév ő sejteket 
mikroszkóp segítségével elemezni kell, azért hogy a kromoszóma- 
rendellenességet megvizsgáljuk.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  Sejtek  
Különféle törzsek, sejtvonalak vagy primer sejttenyészetek, emberi 
sejteket is ideértve, használhatók (például kínai hörcsög fibroblasz ­
tok, ember vagy más eml ős perifériás limfociták).  
1.4.1.2.  Tápfolyadékok és tenyésztési körülmények  
Megfelelő tápfolyadékokat és inkubációs feltételeket (tenyészt ő 
edények, CO  2 -koncentráció, h őmérséklet és páratartalom) kell alkal ­
mazni a tenyészetek fenntartására. A megállapodott sejtvonalaknál és -törzseknél rendszeresen ellen őrizni kell a modális kromoszómaszám 
stabilitását és a mycoplazma fert őzöttségét, nem szabad a 
mycoplazmát használni, ha fert őzött. Ismerni kell a kiválasztott sejtek 
normális sejtciklus id őtartamát az adott inkubációs feltételek mellett.
 
1.4.1.3.  A tenyészetek el őkészítése  
Megállapodott sejtvonalak és -törzsek: a sejteket törzstenyészetekb ől 
fel kell szaporítani, majd leültetni tápfolyadékba olyan sejtszámmal, 
hogy a tenyészetek ne érjék el a konfluens állapotot az összegy űjtés 
ideje előtt, és ezeket 37  o C hőmérsékleten inkubálni kell.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfociták: alvadásgátlóval (például heparin) kezelt teljes vért vagy 
egészséges donoroktól nyert szeparált limfocitákat adnak hozzá mito ­
géntartalmú táptalajhoz (például phytohaemagglutinin), és 37  o C 
hőmérsékleten inkubálják.  
1.4.1.4.  Metabolikus aktiválás  
A sejteket exponálni kell a vizsgált anyaggal mind egy megfelel ő 
metabolikus aktiválóval, mind anélkül. A legáltalánosabban használt 
rendszer a rágcsálóknak enziminducerrel (ilyen például az Aroclor 
1254 (6), (7), (8), (9) vagy fenobarbiturát és ß-naftoflavon kombiná ­
ciójával (10), (11), (12)) kezelt májából elkészített, kofaktor-kiegé ­
szítésű posztmitokondriális frakció (S9).  
A posztmitokondriális frakciót rendszerint 1–10 térfogatszázalék 
tartományba es ő koncentrációkban kell használni a végtérfogatban. 
Valamely metabolikus aktiváló rendszer állapota függhet a vizsgált kémiai anyag osztályától. Néhány esetben célszer ű a posztmitokond ­
riális frakció egynél több koncentrációjának használata.
 
Számos fejlesztés, ideértve a specifikus aktiváló enzimeket tartal ­
mazó genetikailag módosított sejtvonalak létrehozását is, biztosíthatja az endogénaktiválás lehet őségét. A használt sejtvonalak kiválasztását 
tudományosan indokolni kell (például a vizsgált anyag anyagcseré ­
jéhez a citokrom P450-es izoenzim alkalmazásának relevanciáját).
 
1.4.1.5.  Vizsgált anyag/el őkészület  
A szilárd vizsgált anyagokat a sejtek kezelése el őtt fel kell oldani 
vagy szuszpendálni megfelel ő oldószerekben és hígítani kell, ha 
szükséges. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül hozzáadhatók a vizsgálati rendszerekhez és/vagy hígíthatók kezelés el őtt. A vizsgált 
anyagból friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve, ha a stabilitási 
adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer/Viv őanyag  
Az oldószernek/viv őanyagnak nem szabad olyan anyagnak lennie, 
amelyről feltehető, hogy kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal, 
és nem befolyásolhatja a sejtek túlélését és az S9-es aktivitást. Jól 
ismert oldószerekt ől/vivőanyagoktól eltér ő oldószerek/viv őanyagok 
használatakor azok használatát alá kell támasztani a kompatibilitá ­
sukat jelz ő adatokkal. Ahol csak lehetséges, el őször valamilyen 
vizes oldószer/viv őanyag használatát kell megfontolni. Vízben 
instabil anyagok vizsgálatakor a használt szerves oldószereknek vízmenteseknek kell lenniük. A víz molekuláris sz űrő segítségével 
távolítható el.
 
1.4.2.2.  Expozíciós koncentráció  
A legnagyobb koncentráció meghatározásakor figyelembe veend ő 
kritériumok többek között a citotoxicitás, oldhatóság a vizsgálati 
rendszerben és pH-érték, ill. az ozmolalitás változásai.  
A citotoxicitást a f ő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül 
kell meghatározni a sejtintegritás és szaporodás megfelel ő mutatóit 
használva; ilyenek például a konfluencia mértéke, életképes sejtek 
száma vagy a mitotikus index. Hasznosnak bizonyul, ha a citotoxi ­
tást és oldhatóságot el őzetes kísérletben meghatározzuk.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Legalább három elemezhet ő koncentrációt kell használni. Ha az 
anyag citotoxikus, e koncentrációknak át kell fogniuk egy a maxi ­
málistól a már csak kissé vagy az egyáltalán nem toxikusig terjed ő 
tartományt; ez rendszerint azt jelenti, hogy a koncentrációk nem több, mint 2 és √10 közötti tényez ővel különböznek egymástól. A 
sejtek begy űjtéskor a legnagyobb koncentrációnak jelent ős csökke­
nést kell mutatnia a konfluencia mértékében, a sejtszámban vagy mitiotikus indexben (mindegyik nagyobb, mint 50 %). A mitiotikus index a citotoxikus/citosztatikus hatásokat csak közvetett módon 
jelzi, és függ attól, hogy a kezelés után mennyi id ő telt el. Azonban 
a mitiotikus index elfogadható olyan szuszpenziós kultúráknál, amelyekben a toxicitásmérések nagyon körülményesek és gyakorla ­
tilag megvalósíthatatlanok lehetnek. A sejtciklus kinetikára vonat ­
kozó információk, ilyen például az átlagos generációs id ő (average 
generation time, AGT), kiegészít ő információkként használhatók. 
Azonban az AGT általános átlag, amely nem mindig fedi fel a megkésett szubpopulációk létezését, és még a kismérték ű átlagos 
generációsid ő-növekedés is nagyon jelent ős késedelmet okozhat a 
rendellenességek optimális kimutatásának idejében.
 
A relatíve nem citotoxikus anyagok esetében a maximális vizsgált 
koncentrációnak 5 μl/ml-nek, 5 mg/ml-nek vagy 0,01 M-nek kell 
lennie, attól függ ően, hogy ezen értékek közül melyik a legalacso ­
nyabb.  
A relatíve rosszul oldódó anyagok esetében, amelyek a nem oldódó 
koncentrációnál alacsonyabb koncentrációkban nem toxikusak, a legnagyobb használt adagnak a kezelési id őszak végén a végleges 
médiumban az oldékonyság határa fölötti koncentrációban kell 
lennie. Néhány esetben (például amikor a toxicitás csak a legalacso ­
nyabb nem oldódó koncentrációnál magasabb koncentrációban jön létre) ajánlatos a vizsgálatot egynél több, látható csapadékot képez ő 
koncentrációval végrehajtani. Hasznosnak bizonyulhat az oldékony ­
ságot a kezelés elején és végén meghatározni, mivel az változhat a vizsgálati rendszerben az expozíció id őtartama során a sejtek, S9-es 
szérum stb. jelenléte miatt. A kicsapódás szabad szemmel észlelhet ő. 
A kicsapódásnak nem szabad befolyásolnia az értékelést.
 
1.4.2.3.  Negatív és pozitív kontrollok  
Minden egyes kísérletben egyidej űleg negatív és pozitív (oldószer és 
vivőanyag) kontrollt használunk, mindkett őt metabolikus aktiválással 
és anélkül is. Metabolikus aktiváló alkalmazásakor a pozitív kont ­
rollanyagnak olyannak kell lennie, amely a mutagén reakció kivál ­
tásához aktiválást igényel.  
Pozitív kontrollanyagnak ismert klasztogént kell alkalmazni expozí ­
ciókoncentrációban annak érdekében, hogy reprodukálható és észlel ­
hető növekedést okozzon (a háttérhez képest), amely a vizsgálati 
rendszer érzékenységét mutatja.  
A pozitív kontrollkoncentrációkat úgy választjuk ki, hogy a hatás 
egyértelm ű legyen, de ne leplez ődjön le azonnal a kódolt tárgy ­
lemezek identitása a leolvasásnál. A következ ő pozitív kontroll ­
anyagok jöhetnek szóba:  
Metabolikus aktiválás Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Exogén metabolikus aktiválás 
nélkül Metil-metán-szulfonát 66-27-3 200-625-0 
Etil-metán-szulfonát 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metabolikus aktiválás Anyag CAS-szám EINECS-szám  
N-etil-N-nitrozo-karbamid 759-73-9 212-072-2 
Mitomycin-C 50-07-7 200-008-6 
4-Nitro-kinolin-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Exogén metabolikus aktiválással Benz[a]pirén 50-32-8 200-028-5 
Ciklofoszfamid 
Ciklofoszfamid monohidrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Más megfelel ő pozitív kontrollanyagok is használhatók. Adott 
esetben azon pozitív kontrollanyagok használatát kell megfontolni, 
amelyek a vizsgált anyaggal azonos osztályba tartoznak.  
Minden begy űjtés alkalmával negatív kontrollanyagokat kell hasz ­
nálni, amelyeknél csak oldószert és viv őanyagot alkalmaznak a 
kezelt médiumban, és a kezelésük ugyanolyan módon történik, mint a kezelt tenyészeteké. Ezenkívül nem kezelt kontrollanyagokat 
is fel kell használni, kivéve, ha léteznek olyan történeti kontrollada ­
tok, amelyek azt mutatják, hogy semmilyen ártalmas, mutagén hatást nem hoz létre a kiválasztott oldószer.
 
1.4.3.  A kísérlet végrehajtása  
1.4.3.1.  Kezelés a vizsgált anyaggal  
A proliferáló sejteket a vizsgált anyaggal kell kezelni valamilyen 
metabolikus aktiváló rendszer jelenlétében és e nélkül. A limfociták kezelése a mitogén stimuláció után körülbelül 48 órával kezd ődik.
 
1.4.3.2. Rendszerint két tenyészetet használnak minden egyes koncentráci ­
ónál és nagyon ajánlatos negatív (oldószer) kontrolltenyészetek hasz ­
nálata. Ahol a történeti adatokból minimális eltérés mutatható ki a két tenyészet között (13), (14), elfogadható egyetlen tenyészet hasz ­
nálata minden egyes koncentrációnál.
 
A gázokat vagy illékony anyagokat megfelel ő módszerekkel, például 
légmentesen lezárt tenyészt őedényekben kell vizsgálni (15) (16).  
1.4.3.3.  Tenyészetbegy űjtési idő 
Az első kísérletben a sejteket 3–6 órára kell kitenni a vizsgált anyag 
hatásának, mind metabolikus aktiválással, mind anélkül, a kezelés kezdete után körülbelül 1,5 normál sejtciklusid ő letelte után kezd ődik 
a feldolgozás (12). Ha e módszer negatív eredményeket ad mind 
metabolikus aktiválással, mind anélkül, végre kell hajtani egy további kísérletet aktiválás nélkül, folyamatos kezeléssel körülbelül az 1,5 normál sejtciklus-id őtartammal egyenl ő idő letelte után végre ­
hajtott mintavételig. Bizonyos kémiai anyagok lehet, hogy 
könnyebben észlelhet ők 1,5 ciklusnál hosszabb kezelési/mintavételi 
idő alkalmazása esetén. A metabolikus aktiválással kapott negatív 
eredményeket esetenkénti vizsgálattal kell meger ősíteni. Azokban 
az esetekben, ahol a negatív eredmények meger ősítését nem tekintjük 
szükségesnek, közljük ennek indokait.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Kromoszómapreparálás  
A sejttenyészeteket rendszerint 1-3 órán át kezelni kell Colcemid®- 
dal vagy kolchicinnel begy űjtésük el őtt. Minden sejttenyészetet 
külön kell begy űjteni és feldolgozni a kromoszómák preparálásához. 
A kromoszómapreparáció a sejtek hipotonikus oldattal való kezelé ­
sét, fixálását és megfestését foglalja magában.  
1.4.3.5.  Elemzés  
Minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollanyagokét is 
ideértve, önálló kódolással kell ellátni a mikroszkópos elemzés el őtt. 
Mivel a fixálási eljárások gyakran a metafázisban lév ő sejtek egy 
részének széttörését eredményezik, mely kromoszómaveszteséggel jár, ezért a kiértékelt sejtek tartalmaznak egy centromer számot, amely minden sejttípus esetében megfelel a ± 2 modális értéknek. 
Legalább 200, jól kiterült metafázist kell értékelni koncentrációnként 
és kontrollanyagonként, egyenl ő arányban elosztva a megkett őzött 
minták között. E szám csökkenthet ő, amikor nagyszámú rendelle ­
nesség figyelhet ő meg.
 
Bár a vizsgálat célja a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek 
észlelése, fontos a poliploidok és az endoreduplikáció feljegyzése 
is, amennyiben ezek láthatók.  
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK MEGÁLLAPÍTÁSA  
A kísérleti egység a sejt, ebb ől következ ően meg kell állapítani a 
szerkezeti kromoszóma-rendellenességgel rendelkez ő sejtek arányát. 
Fel kell sorolni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek külön ­
böző típusait arányaikkal és gyakoriságukkal együtt, kísérleti és 
kontrolltenyészetenként. A gap külön kerül feljegyzésre és szerepel 
a jelentésben, de rendszerint azokat nem kell beleszámolni a rend ­
ellenességek összgyakoriságba.  
A rendellenességek megállapítására irányuló f ő kísérletekben egyide ­
jűleg minden kezelt és negatív kontrolltenyészet esetében fel kell 
jegyezni a citotoxicitás meghatározására irányuló tevékenységeket.  
Az egyes tenyészetekhez tartozó adatokat meg kell adni. Ezenkívül 
minden adatot táblázat formájában kell összefoglalni.  
Nem követelmény az egyértelm űen pozitív reakció igazolása. A nem 
egyértelm ű eredményeket további vizsgálattal kell tisztázni, 
amelyhez lehet őleg módosítani kell a kísérleti körülményeket. A 
negatív eredmények meger ősítésének szükségességét az 1.4.3.3. 
tárgyalja. Az ellen őrző (utólagos) kísérleteknél mérlegelni kell a 
vizsgálati paraméterek módosítását a kiértékelt feltételek tartomá ­
nyának kiterjesztésére. A módosítható vizsgálati paraméterek, többek 
között, a koncentrációk felosztása és a metabolikus aktiválási körül ­
mények.  
2.2. EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Több különböz ő kritérium létezik valamely pozitív eredmény 
meghatározására, ilyen például a kromoszóma-rendellenességeket 
mutató sejtek számának koncentrációval összefügg ő vagy reprodu ­
kálható növekedése. El őször az eredmények biológiai jelent őségét 
kell fontolóra venni. Statisztikai módszerek használhatók a vizsgálati eredmények értékelésének el ősegítésére (3) (13). Valamely pozitív 
reagálás tekintetében nem szabad, hogy a statisztikai szignifikancia 
legyen az egyetlen meghatározó tényez ő.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
A poliploid sejtek számának növekedése azt jelezheti, hogy a vizs ­
gált anyag potenciálisan gátolhatja a mitiotikus folyamatokat és 
számos kromoszóma-rendellenességet idézhet el ő. Az endoredupli ­
kált kromoszómákkal rendelkez ő sejtek számának növekedése azt 
jelezheti, hogy a vizsgált anyag potenciálisan gátolhatja a sejtciklus 
végbemenetelét (17), (18).  
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételik meg a kísérletet.
 
Az in vitro  kromoszóma-rendellenesség vizsgálatból kapott pozitív 
eredmények azt jelzik, hogy a vizsgált anyag szerkezeti kromo ­
szóma-rendellenességeket idéz el ő emlős szomatikus sejtek tenyésze ­
tében. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmé ­
nyek mellett a vizsgált anyag nem idéz el ő kromoszóma-rendelle ­
nességeket eml ős szomatikus sejtek tenyészetében.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldékonysága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Sejtek:  
— sejtek típusa és eredete,  
— a felhasznált sejttípus kariotípus jellemz ői és alkalmassága,  
— mikoplazma hiánya, ha el őfordul ilyen,  
— a sejtciklus hosszúságára vonatkozó információ,  
— vérdonorok neme, teljes vér vagy elkülönített limfociták, használt 
mitogén,  
— passzálások száma, ha vannak ilyenek,  
— a sejttenyészet fenntartásának módszerei, ha vannak ilyenek,  
— modális kromoszómaszám.  
Vizsgálati körülmények:  
— metafázis-blokkoló szer meghatározása, annak koncentrációja és 
behatásának id őtartama,  
— koncentrációk és tenyészetek száma kiválasztásának indoklása, 
beleértve például a citotoxicitási adatokat és oldékonysági hatá ­
rokat, ha rendelkezésre állnak,  
— tápfolyadék összetétele, CO  2 -koncentráció, ha van ilyen,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— a vizsgált anyag koncentrációja,  
— a vivőanyag és a hozzáadott vizsgált anyag térfogata,  
— inkubációs h őmérséklet,  
— inkubációs id ő, 
— kezelés id őtartama,  
— sejtsszám a leültetéskor, az adott esett ől függően, 
— metabolikus aktiváló rendszer típusa és összetétele, az elfogad ­
hatósági kritériumot is ideértve,  
— pozitív és negatív kontrollanyagok,  
— tárgylemez preparálásának módszerei,  
— rendellenességek értékelésének kritériumai,  
— elemzett metafázisok száma,  
— a toxicitás meghatározásához használt módszerek  
— kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok pozi ­
tívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhet őnek tekin ­
tendők-e, 
Eredmények:  
— toxicitás jelei, például konfluencia mértéke, sejtciklusadatok, sejt ­
számok, mitiotikus index,  
— kicsapódás jelei,  
— a kezelt médium pH-jával és ozmolalitásával kapcsolatos adatok, 
ha meghatároztuk azokat,  
— rendellenességek (gap-et is beleértve) meghatározása,  
— kromoszóma-rendellenességeket mutató sejtek száma és a kromo ­
szóma rendellenességek típusa, minden egyes kezelt és kontroll ­
tenyészethez külön megadva,  
— ploidok megfigyelt változásai,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzés, ha van ilyen,  
— párhuzamos negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív kontrolla ­
datok,  
— történeti negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív kontrolladatok, 
átlagokkal és standard eltérésekkel.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Evans, H. J. (1976) Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29
 
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985) The  In vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978) Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: 
Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 
(suppl.10), pp. 1-175
 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res, 257, pp. 147-204
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res, 268, pp. 297-305  
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364
 
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res, 113, pp. 173-215
 
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/ ­
Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In 
Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence 
of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In vitro , Mutation Res., 66, pp. 277-290  
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., 
Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Envi ­
ronmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1245-induced S9 in  In vitro  Genotoxicity Assays, 
Mutagenesis, 7, pp. 175-177
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds),  In vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, pp. 85-88
 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261  
(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from  
In vitro  Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University 
Press, Cambridge, pp. 141-154  
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  In vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149  
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds), Genotoxic Effects of Airbone Agents, New York, 
Plenum, pp. 91-103
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagene ­
sis, 5, pp. 795-801
 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha- radiation induced G2 arrest, Mutation Res. 
119, pp. 403-413  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res. 43, pp. 1362-1364
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENITÁS – KROMOSZÓMA-RENDELLENESSÉGEK  IN 
VIVO  VIZSGÁLATA EML ŐSÖKÖN  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 475-nek, kromoszóma-rendelle ­
nességek  in vitro  vizsgálata eml ősökön (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
A kromoszóma-rendellenességek  in vitro  vizsgálatot állatok, rend ­
szerint rágcsálók, csontvel ősejtjeiben a vizsgált anyag által el őidézett 
szerkezeti kromoszóma-rendellenességek észlelésére használjuk (1), 
(2), (3), (4). A szerkezeti kromoszóma-rendellenességek kétféle típu ­
súak lehetnek, kromoszóma vagy kromatid. A poliploida gyakorisá ­
gának növekedése bizonyíték lehet arra, hogy valamely kémiai anyag 
számos rendellenességet idézhet el ő. A mutációit el őidéző kémiai 
anyagok többsége esetében az el őidézett rendellenességek kromatid 
típusúak, de kromoszóma típusú rendellenességek is el őfordulnak. A 
kromoszómamutációk és ehhez hasonló folyamatok számos emberi 
genetikai betegségek okai. Néhány érv a mellett szól, hogy a kromo ­
szómamutációk és ehhez hasonló folyamatok, amelyek változásokat okoznak az onkogénekben és a tumorszuppresszor génekben, szerepet játszanak az emberekben és a kísérleti rendszerekben a 
rák kialakulásában és megsz űnésében.
 
E vizsgálatban rendszerint rágcsálókat kell használni. A csontvel ő a 
vizsgált f ő szövet, mivel ez gazdagon vaszkularizált, és olyan 
gyorsan szaporodó sejtek populációját tartalmazza, amelyek könnyen izolálhatók és preparálhatók. Más kísérleti állatok és célszövetek nem képezik e módszer tárgyát.
 
E kromoszómarendellenesség-vizsgálat különösen alkalmas a rele ­
váns mutagéntulajdonságok értékelésére annyiban, hogy lehet ővé 
teszi az  in vivo  metabolizmus, farmakokinetika és DNS-reparációs 
folyamatok tényez őinek vizsgálatát, bár ezek különböz őek az egyes 
fajok és különböz ő szövetek tekintetében. Az  in vivo  vizsgálat a 
valamely  in vitro  vizsgálat által észlelt, mutagén hatás további vizs ­
gálatához is hasznos.  
Ha bizonyos jelek utalnak arra, hogy a vizsgált anyag, vagy vala ­
mely reaktív metabolitja nem éri el a célszövetet, akkor e vizsgálat nem megfelel ő.
 
Lásd még az Általános bevezetés B. részét is.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Kromatid típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakárosodás, 
amely egy kromatid törésében vagy kromatidok közötti törésben és 
újraegyesítésben nyilvánul meg.  
Kromoszóma típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakároso ­
dás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésében, vagy törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.
 
Endoreduplikáció : az a folyamat, amely során valamely DNS-repli ­
kációt követ ően a sejtmag nem lép be a mitózis fázisába, hanem egy 
másik S fázist indít. Az eredmény 4, 8, 16,… kromatiddal rendel ­
kező kromoszómák.  
Gap: egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok mini ­
mális átrendez ődését okozó akromatikus sérülés.  
Számszer ű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a 
felhasznált sejteket jellemz ő normál számértékt ől. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploida : a haploid kromoszómaszám (n) egész számú, de nem 
diploid (azaz 3n, 4n, és így tovább) megsokszorosódása.  
Szerkezeti rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszko ­
pikus vizsgálata során észlelhet ő változás a kromoszóma szerkezeté ­
ben, mint a delíciók és fragmentumok, a kromoszómán belüli vagy a 
kromoszómák közötti átrendez ődés. 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az állatoknak a vizsgált anyagot a megfelel ő módon kell adagolni, 
majd a kezelés után megfelel ő időpontokban el kell pusztítani azokat. 
Az elpusztítás el őtt az állatokat metafázis-blokkoló szerrel (például 
kolchicin vagy Colcemid®) kell kezelni. Ezután kromoszómakészít ­
ményeket kell létrehozni a csontvel ősejtekből és megfesteni azokat, 
majd elemezni kell a metafázisú sejteket kromoszóma-rendellenes ­
ségek megállapítása céljából.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
Rendszerint patkányokat, egereket és kínai hörcsögöket kell hasz ­
nálni, jóllehet bármilyen megfelel ő emlős használata lehetséges. 
Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra tenyésztett laborató ­
riumi állattörzsekb ől származó állatokat kell használni. A vizsgálat 
kezdetén az állatok súlya lehet őleg csak minimálisan térjen el 
egymástól, és a nemenkénti átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal 
különbözhet.  
1.4.1.2.  Tartási és etetési körülmények  
Az Általános bevezetés B. részében ismertetett általános körülmé ­
nyeket kell alkalmazni, bár a relatív páratartalom értékének 50–60 % között kell lennie.
 
1.4.1.3.  Az állatok el őkészítése  
Az egészséges, fiatal, ivarérett állatokat véletlenszer űen kontroll- és 
kezelt csoportokba osztják. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek az elhelyezés miatti esetleges hatások. Ezt követően az állatokat egyenként azonosítják. Az állatokat legalább 
öt napig szoktatják a laboratóriumi körülményekhez.
 
1.4.1.4.  Dózisok el őkészítése  
Az adagolás el őtt a szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy 
szuszpendálni megfelel ő oldószerekben vagy viv őanyagokban, és 
hígítani, ha szükséges. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül 
adagolhatók vagy hígíthatók. A vizsgált anyagból mindig friss készít ­
ményeket kell alkalmazni, kivéve, ha az anyag tárolás során való stabilitása bizonyított.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer/viv őanyag  
Az oldószer nem okozhat toxikus hatásokat a kiválasztott dózisok 
mellett, valamint nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan 
kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal. Jól ismert oldószerekt ől 
eltérő oldószerek/viv őanyagok használatakor azok felhasználását alá 
kell támasztani az összeegyeztethet őségüket bizonyító adatokkal. 
Amennyiben lehetséges, el őször valamilyen vizes oldószer/viv őanyag 
használatát kell megfontolni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrollok  
Mindkét nemhez és minden kísérlethez egyidej űleg pozitív és 
negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollokat alkalmaznak. A vizsgált 
anyaggal való kezelés kivételével a kontrollcsoportokba beosztott 
állatokat azonos bánásmódban kell részesíteni a kezelt csoportokban 
lévő állatokkal.  
A pozitív kontrolloknak  in vivo  szerkezeti rendellenességeket kell 
létrehozni expozíciós koncentrációban úgy, hogy észlelhet ő legyen 
a növekedés (a háttérhez viszonyítva). A pozitív kontrollkoncentrá ­
ciókat úgy választják ki, hogy a hatás egyértelm ű legyen, de ne 
lepleződjön le azonnal a kódolt tárgylemezek identitása a leolvasás ­
nál. Elfogadható, hogy a pozitív kontroll beadása a vizsgált anyag beadási módjától eltérjen, és hogy csak egyetlen mintavételre 
kerüljön sor. Adott esetben azon pozitív kontrollanyagok használatát 
kell megfontolni, amelyek a vizsgált anyaggal azonos osztályba tartoznak. A következ ő pozitív kontrollanyagok jöhetnek szóba:
 
Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Etil-metán-szulfonát 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozo-karbamid 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 
Ciklofoszfamid 
Ciklofoszfamid monohidrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilén-melamin 51-18-3 200-083-5
 
Minden mintavétel alkalmával a negatív kontrollcsoportban lév ő 
állatokat is figyelembe kell venni, amelyeknek csupán oldószert 
adagolunk, egyébként azonos bánásmódban részesítjük azokat a kezelt állatokkal, kivéve ha a történeti kontrolladatokból elfogadható 
értékek állnak rendelkezésre a kromoszóma-rendellenességeket 
mutató sejtek állaton belüli sokfélesége és gyakorisága tekintetében. Ha a negatív kontrolloknál csak egyetlen mintavételezést kell alkal ­
mazni, ennek legmegfelel őbb ideje az els ő mintavételi id ő. Ezenkívül 
használnak nem kezelt kontrollállatokat, kivéve, ha vannak olyan 
történeti vagy nyilvánosságra hozott kontrolladatok, amelyek azt mutatják, hogy a kiválasztott oldószer/viv őanyag semmilyen ártalmas 
vagy mutagén hatást nem hoz létre.
 
1.5. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  Állatok száma és neme  
Minden egyes kezelt és kontrollcsoport nemenként legalább öt 
elemezhet ő állatot tartalmaz. Ha a tanulmány végrehajtásakor rendel ­
kezésre állnak olyan adatok azonos fajták és azonos expozíciós mód használata mellett, amelyek azt mutatják, hogy nincsenek jelent ős 
különbségek a nemek között a toxicitás tekintetében, elegend ő lesz 
egyetlen nem vizsgálata. Ahol az emberek esetében az expozíció 
nemre jellemz ő lehet, mint például néhány gyógyszeranyag esetében, 
a vizsgálatot a megfelel ő nemű állatokkal kell elvégezni.
 
1.5.2.  Kezelés lefolytatása  
A vizsgált anyagot lehet őleg egyetlen alkalommal adják be. A vizs ­
gált anyagot két adagban is be lehet adni, ugyanazon a napon két alkalommal néhány órás id őközzel, nagy mennyiség ű anyag beadá ­
sának megkönnyítésére. Más adagolási módok alkalmazását tudomá ­
nyosan indokolni kell.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Ha a vizsgált anyagot ugyanazon napon adják be, mintákat két 
különböző időpontban kell venni. Rágcsálók esetében az els ő minta­
vétel a kezelést követ ő 1,5 normál sejtciklusid ő letelte után történik 
(az utóbbi rendszerint 12–18 óra között van). Mivel a vizsgált anyag felvételéhez és anyagcseréjéhez, valamint ennek a sejtciklus-kineti ­
kára gyakorolt hatásának a bekövetkeztéhez szükséges id ő befolyá­
solhatja a kromoszóma-rendellenesség észlelésének optimális időpontját, ezért ajánlott az els ő mintavétel után 24 órával ismételten 
mintát venni. Ha olyan adagolási módszert választanak, ahol nem 
egyetlen nap adagolják a vizsgált anyagot, akkor a mintavételt, az 
utolsó kezelés után 1,5 normál sejtciklusid ő elteltekor kell elvégezni.
 
Az állatok elpusztítása el őtt a hasüregébe adott injekcióval megfelel ő 
adag metafázis-blokkoló szert (például Colcemid® vagy kolchicin) 
fecskendeznek be. Ezután az állatokból mintákat kell venni 
megfelelő időközönként. Egerek esetében ez az id őköz körülbelül 
3–5 óra; kínai hörcsögök esetében körülbelül 4–5 óra. A sejteket ki kell nyerni a csontvel őből, majd elemezni kell azokat a kromo ­
szóma-rendellenességek megállapítása céljából.
 
1.5.3.  Dózisok  
Ha dózisbehatároló vizsgálatot végeznek, mert nem állnak rendelke ­
zésre alkalmas adatok, ezt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon 
fajták, törzsek, nemek és kezelési eljárás alkalmazásával hajtják 
végre, mint amelyet a f ő vizsgálatban alkalmaznak (5). Ha észlelhet ő 
toxicitás, akkor három dózist használnak az els ő mintavételhez. E 
dózisoknak át kell fogniuk egy a maximálistól a már csak kissé 
vagy az egyáltalán nem toxikusig terjed ő tartományt. A kés őbbi 
mintavételnél csak a legmagasabb dózist kell használni. A legmaga ­
sabb adag az a dózis, ami olyan egyértelm ű toxicitásjeleket vált ki, 
hogy annál magasabb adagok, azonos adagolás mellett, várhatóan 
halált okoznak. Specifikus biológiai hatású anyagok alacsony, nem 
toxikus adagok mellett (ilyenek például a hormonok és mutagének) adott esetben lehetséges, hogy nem felelnek meg az adagolási krité ­
riumoknak, ezért ezeket eseti alapon kell értékelni. A legmagasabb 
adag olyan dózisként is definiálható, amely létrehoz valamilyen toxi ­
citási jeleket a csontvel őben (például 50 %-nál nagyobb csökkenést a 
mitiotikus indexben).
 
1.5.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egyetlen alkalommal vagy ugyanazon a napon két adagban 
beadott, legalább 2 000 mg/kg testsúlydózis mellett végrehajtott vizs ­
gálat semmilyen megfigyelhet ő toxikus hatásokat nem hoz létre, és 
ha nem várható genotoxicitás szerkezetileg rokon anyagokkal kapcsolatos adatok alapján, akkor nem szükséges a három dózis 
használatával végrehajtott teljes vizsgálat. Hosszabb id őtartamú vizs ­
gálatok esetében a határadag 2 000 mg/kg/testsúly/nap legfeljebb 14 napos kezelés, és 1 000 mg/kg/testsúly/nap 14 napnál hosszabb kezelés esetében. A várt expozíciós hatások az embernél a határ ­
érték-vizsgálatban valamilyen magasabb dózis használatának szük ­
ségességét jelezhetik.
 
1.5.5.  Adagolás  
A vizsgált anyagot rendszerint gyomorszondán át, inkubációs kanül 
segítségével vagy hasüregbe adott injekció segítségével adják be. 
Elfogadhatók egyéb expozíciós módok, amennyiben azok indokolha ­
tók. A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maxi ­
mális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretét ől függ. A térfogata 
nem haladhatja meg a 2 ml/100g testsúly mennyiséget. Ennél 
nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. Magasabb 
koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irri ­
tatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelel ő beál­
lításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyi ­
ségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyi ­
séget lehessen adagolni a kísérleti állatoknak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Kromoszómapreparáció  
Közvetlenül az elpusztítás után csontvel őt kell venni, és hipotoniás 
oldatba tenni, majd fixálni. A sejteket ezután tárgylemezekre kell teríteni és megfesteni.
 
1.5.7.  Elemzés  
Meg kell határozni a mitiotikus indexet a citotoxicitás megállapítá ­
sához állatonként legalább 1 000 sejtben, minden kezelt állat (pozitív 
kontrollállatokat is ideértve) és nem kezelt, negatív kontrollcsoportba 
beosztott állat esetében.  
Legalább 100 metafázist kell elemezni minden egyes állatnál. Ez a 
szám csökkenthet ő amennyiben nagyszámú rendellenességet 
figyelnek meg. Minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokat is ideértve, egymástól függetlenül kezelni kell a mikroszkópos 
elemzés el őtt. Mivel a fixálási eljárások gyakran a metafázisban 
lévő sejtek egy részének széttörését eredményezik, mely kromoszó ­
maveszteséggel jár, ezért a kiértékelt sejtek tartalmaznak egy cent ­
romer számot, amely megfelel a 2n ± 2 értéknek.
 
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK MEGÁLLAPÍTÁSA  
Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. A kísér ­
leti egység maga az állat. Minden egyes állat esetében fel kell jegy ­
ezni az értékelt sejtek számát, a sejtenkénti rendellenességek számát és a szerkezeti kromoszóma-rendellenességget mutató sejtek arányát. Fel kell sorolni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek külön ­
böző típusait a számukkal és gyakoriságukkal együtt kezelt és kont ­
rollcsoportonként. A gap külön kerül feljegyzésre és szerepel a jelen ­
tésben, de rendszerint azokat nem kell beleszámolni a rendellenes ­
ségek összgyakoriságba. Ha semmilyen bizonyíték nincs arra, hogy 
eltérés van a két nem között a reakciók tekintetében, összevonhatók 
a nemekhez kapott adatok a statisztikai elemzés céljából.
 
2.2. EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározá ­
sára, ilyen például a kromoszóma-rendellenességekkel rendelkez ő 
sejtek számának növekedése a dózis függvényében, vagy egyetlen mintavétel alkalmával egy meghatározott dózis mellett a rendellenes ­
séget mutató sejtek számának egyértelm ű növekedése. El őször meg 
kell vizsgálni az eredmények biológiai jelent őségét. Statisztikai 
módszerek használhatók a vizsgálati eredmények értékelésének elősegítésére (6). Valamely pozitív reagálás tekintetében nem szabad, 
hogy a statisztikai szignifikancia legyen az egyetlen meghatározó 
tényező. A többféleképpen magyarázható eredményeket további vizs ­
gálattal kell tisztázni, lehet őleg a kísérleti körülményeket módosítva.
 
A poliploida gyakoriságának növekedése azt jelezheti, hogy a vizs ­
gált anyag számos kromoszóma-rendellenességet idézhet el ő. A 
reduplikáció növekedése azt jelezheti, hogy a vizsgált anyag 
akadályozza a sejtciklus el őrehaladást (7), (8).  
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételjük 
meg a kísérletet.  
Az in vivo  kromoszómarendellenesség-vizsgálatból kapott pozitív 
eredmények azt jelzik, hogy valamely anyag kromoszóma-rendelle ­
nességeket idéz el ő a vizsgált állatfajták csontvel őjében. Negatív 
eredmények azt jelzik, hogy a vizsgált körülmények mellett a vizs ­
gált anyag nem idéz el ő kromoszóma-rendellenességeket a kísérleti 
állatok csontvel őjében.  
Értékeli kell annak a valószín űségét, hogy a vizsgált anyag vagy 
annak metabolitjai eljutnak-e az általános keringési rendszerbe, illetve kifejezetten a célszövetbe (például szisztematikus toxicitás).
 
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldékonysága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Kísérleti állatok:  
— használt fajok/törzs,  
— állatok száma, kora és neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az állatok súlya a vizsgálat kezdetekor, az egyes csoportok 
esetében a testsúlytartományt, átlagokat és a standard eltérést is 
ideértve.  
Vizsgálati körülmények:  
— pozitív és negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollanyagok,  
— a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen 
vizsgálat,  
— a dózisok kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag el őkészítésére vonatkozó részletek,  
— a vizsgált anyag beadására vonatkozó részletek,  
— a beadási mód megindokolása,  
— módszerek annak ellen őrzésére, hogy elérte-e a vizsgált anyag az 
általános keringési rendszert vagy célszövetet, ha vannak ilyenek,  
— átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható,
 
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó részletek,  
— kezelési és mintavételi menetrend részletes leírása,  
— toxicitás meghatározásának módszerei,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— metafázis-blokkoló szer meghatározása, annak koncentrációja és 
kezelés id őtartama,  
— tárgylemez preparálásának módszerei,  
— rendellenességek értékelésének kritériumai,  
— az elemzett sejtek száma (állatonként),  
— azok a kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok 
pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhet őnek 
tekintendők-e. 
Eredmények:  
— toxicitás jelei,  
— mitiotikus index,  
— rendellenességek típusa és száma, minden egyes állat tekinte ­
tében külön megadva,  
— csoportonként a rendellenességek össz-száma átlagértékekkel és 
standard eltérésekkel,  
— csoportonként a rendellenességeket mutató sejtek száma átlag ­
értékekkel és standard eltérésekkel,  
— ploidok megfigyelt változásai,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzések, ha vannak,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív kontrollokra vonatkozó adatok,  
— történeti negatív kontrolladatok tartományokkal, átlagértékekkel 
és standard eltérésekkel,  
— az egyidej űleg elvégzett pozitív kontrollokra vonatkozó adatok.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306
 
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. and Shelby, M. (1987), Mammalian  In vitro  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165
 
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Boot ­
man, J. and Henderson, L., (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays, 
in: D. J. Kirkland (ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing, Report, Part I revised. Camb ­
ridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141
 
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., 
F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., 
Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the  in vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312
 
(5) Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. andRichold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose setting in  In vivo  Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7. pp. 313-319
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cytoge­
netic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, pp. 184-232
 
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha- radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413
 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer 
Res., 43, pp. 1362-1364  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENITÁS –  IN VIVO  EMLŐS ERITROCITA MIKRO ­
NUKLEUSZ VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 474-nek, eml ős eritrocita mikro ­
nukleusz vizsgálat (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
Az emlős mikronukleusz  in vivo  vizsgálatot rendszerint rágcsálók 
csontvelőjéből és/vagy perifériás véréb ől vett mintákban az eritro ­
citák elemzésével annak a károsodásnak az észlelésére használják, 
amelyet a vizsgált anyag idéz el ő a kromoszómákban vagy az erit ­
rociták mitiotikus rendszerében.  
A mikronukleusz vizsgálat célja azon anyagok meghatározása, 
amelyek olyan citogenetikai károsodást okoznak, amelyek ered ­
ménye visszamaradó kromoszómatöredékeket vagy egész kromoszó ­
mákat tartalmazó mikronukleuszok kialakulása.  
Amikor a csontvel ői eritroblasztból kifejl ődik a polikromáziás erit ­
rocita, a f ő sejtmag kilök ődik; minden, már létrejött mikronukleusz 
hátramaradhat a sejtmagmentes citoplazmában. E sejtekben a f ő 
sejtmag hiánya miatt könnyebb a mikronukleusz láthatóvá tétele. A kezelt állatokban a mikronukleált polikromáziás eritrociták gyakori ­
ságának növekedése az el őidézett kromoszómakárosodás jelzése.
 
E vizsgálatban általában rágcsálók csontvel őjét használják, mivel e 
szövetben termel ődnek a polikromáziás eritrociták. A perifériás 
vérben lév ő, mikronukleált polikromáziás eritrociták mérése is elfo ­
gadható minden olyan állatfajta esetében, amelynél már bebizonyo ­
sodott, hogy a lép képtelen eltávolítani a mikronukleált eritrocitákat 
vagy amelyek megfelel ő érzékenységet mutattak a szerkezeti vagy 
számszerű kromoszóma-rendellenességeket okozó anyagok észlelé ­
sére. A mikronukleusz számos kritérium segítségével ismerhet ő fel. 
Ezek közé tartozik a mikronukleuszban egy kinetochor vagy a cent ­
romer DNS jelenlétének vagy hiányának megállapítása. A f ő végcél 
a mikronukleusszal rendelkez ő polikromáziás eritrociták gyakorisá ­
gának meghatározása. A kiértékelés végcéljaként a perifériás vérben 
adott számú érett eritrocita közül azon normokromáziás eritrociták 
száma is használható, amelyek mikronukleuszt tartalmaznak, amikor az állatokat négy hétig vagy ennél hosszabb ideig kezelik.
 
Az in vivo  emlős mikronukleusz vizsgálat különösen lényeges a 
mutagén veszély becslésében annyiban, hogy lehet ővé teszi az  in 
vivo metabolizmus, farmakokinetikai és DNS-reparációs folyamatok 
tényezőinek vizsgálatát, bár ezek eltér őek lehetnek a különböz ő 
fajok, a különböz ő szövetek és a különböz ő genetikai végpontok 
között. Az  in vivo  kísérlet is hasznos a valamely  in vitro  rendszer 
által észlelt mutagén hatás további vizsgálatához.  
Ha bizonyíték van arra, hogy a vizsgált anyag vagy egy reaktív 
metabolitja nem éri el a célszövetet, akkor nem megfelel ő e 
vizsgálat.  
Lásd még az Általános bevezetés B. részét is.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Centroméra (Kinetokór) : valamely kromoszóma olyan régiója 
(régiói), amelyhez orsórostok kapcsolódnak a sejtosztódás során, lehetővé téve a leánykromoszómák szabályos mozgását a leánysejtek 
pólusaihoz.
 
Mikronukleusz : a sejtek f ő magjától elkülönült kis járulékos mag, 
amelyet a mitózis (meiózis) telofázisa során hoznak létre vissza ­
maradó kromoszóma töredékek vagy teljes kromoszómák.  
Normokromáziás eritrocita : érett, riboszómákat már nem tartal ­
mazó eritrocita, amely a riboszómákra szelektív festéssel különböz ­
tethető meg a polikromáziás eritrocitától.  
Polikromáziás eritrocita : éretlen eritrocita, közbens ő fejlődési 
szakaszban, amely még mindig tartalmaz riboszómákat, és ezért a riboszómákra szelektív festésekkel különböztethet ő meg az érett, 
normokromáziás eritrocitától.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot megfelel ő módon kell az állatoknak adagolni. 
Csontvelő használatakor az állatokat a kezelés után, megfelel ő 
időpontokban elpusztítják, a csontvel őt kivonják, preparálják, majd 
megfestik (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7). Perifériás vér használatakor a vért a kezelés után megfelel ő időpontokban össze kell gy űjteni és 
kenetpreparátumokat kell létrehozni, majd meg kell festeni azokat 
(4), (8), (9), (10). Perifériás vérrel végrehajtott vizsgálatok esetén a 
lehető legkisebb id őnek szabad csak eltelnie az utolsó expozíció és a 
sejtek összegy űjtése között. A preparátumokat elemezni kell a mikro ­
nukleusz jelenlétének megállapítása céljából.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
Csontvelő használatakor egerek vagy patkányok javasoltak, jóllehet 
bármilyen megfelel ő emlősfaj használható. Perifériás vér használa ­
takor az egér az ajánlott kísérleti állat. Azonban bármilyen megfelel ő 
emlősfaj használható, feltéve, hogy az olyan faj, amelyben a lép nem 
távolítja el a mikronukleusszal rendelkez ő eritrocitákat, vagy olyan 
faj, amely megfelel ő érzékenységet mutatott az olyan anyagok észle ­
lésére, amelyek szerkezeti vagy számszer ű kromoszóma-rendellenes ­
ségeket okoznak. Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra 
tenyésztett laboratóriumi állattörzsekb ől származó állatokat haszná ­
lunk. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehet őleg csak minimá ­
lisan térjen el egymástól és a nemenkénti átlagos értékt ől legfeljebb 
± 20 %-kal különbözhet.  
1.4.1.2.  Tartási és etetési körülmények  
Az Általános bevezetés B. részében ismertetett általános körülmé ­
nyeket kell alkalmazni, bár a relatív páratartalom értékének 
50–60 % között kell lennie.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Az állatok el őkészítése  
Az egészséges, fiatal, ivarérett állatokat véletlenszer űen kontroll- és 
kezelt csoportokba kell osztani. Az állatokat egyenként azonosítani kell. Az állatokat legalább öt napig szoktatni kell a laboratóriumi 
körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak 
legyenek a ketrec elhelyezéséb ől adódó esetleges hatások.
 
1.4.1.4.  Adagok el őkészítése  
Az adagolás el őtt a szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy 
szuszpendálni megfelel ő oldószerekben vagy viv őanyagokban, és 
hígítani, ha szükséges. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül adagolhatók vagy hígíthatók. A vizsgált anyagból mindig friss készít ­
ményeket kell alkalmazni, kivéve, ha az anyag tárolás során való 
stabilitása bizonyított.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer/Viv őanyag  
Az oldószer nem okozhat toxikus hatásokat a kiválasztott dózisok 
mellett, valamint nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal. Jól ismert oldószerekt ől 
eltérő oldószerek/viv őanyagok használatakor azok felhasználását alá 
kell támasztani a kompatibilitásukat bizonyító adatokkal.
 
1.4.2.2.  Kontrollanyagok  
Mindkét nemhez és minden kísérlethez egyidej űleg pozitív és 
negatív kontrollokat alkalmaznak. A vizsgált anyaggal való kezelés kivételével a kontrollcsoportokba beosztott állatokat azonos bánás ­
módban kell részesíteni a kezelt csoportokban lév ő állatokkal.
 
A pozitív kontrolloknak  in vivo  mikronukleuszokat kell létrehozniuk 
expozíciós koncentrációban úgy, hogy észlelhet ő legyen a növekedés 
(a háttérhez viszonyítva). A pozitív kontrollkoncentrációkat úgy 
választjuk ki, hogy a hatás egyértelm ű legyen, de ne leplez ődjön 
le azonnal a kódolt tárgylemezek identitása a leolvasásnál. Elfogad ­
ható, hogy a pozitív kontrollanyag beadása a vizsgált anyag beadási 
módjától eltér ő módon történjen, és hogy a mintavételezésre csak 
egyetlen id őpontban kerüljön sor. Adott esetben azon pozitív kont ­
rollanyagok használatát kell megfontolni, amelyek a vizsgált 
anyaggal azonos osztályba tartoznak. A következ ő pozitív kontroll ­
anyagok jöhetnek szóba:  
Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Etil-metán-szulfonát 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozo-karbamid 759-73-9 212-072-2 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Ciklofoszfamid 
Ciklofoszfamid monohidrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietilén-melamin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Minden mintavétel alkalmával a negatív kontrollcsoportban lév ő 
állatokat is figyelembe kell venni, amelyeknek csupán oldószert 
adagolnak, egyébként azonos bánásmódban kell részesíteni azokat a kezelt állatokkal, kivéve, ha a történeti kontrolladatokból elfogad ­
ható értékek állnak rendelkezésre a kromoszóma-rendellenességeket 
mutató sejtek állaton belüli sokfélesége és gyakorisága tekintetében. 
Ha a negatív kontrolloknál csak egyetlen mintavételezést alkalmaz ­
nak, ennek legmegfelel őbb ideje az els ő mintavételi id ő. Ezenkívül 
használnak nem kezelt kontrollállatokat, kivéve, ha vannak olyan 
történeti vagy nyilvánosságra hozott kontrolladatok, amelyek azt 
mutatják, hogy a kiválasztott oldószer/viv őanyag semmilyen ártalmas 
vagy mutagén hatást nem hoz létre.
 
Perifériás vér használatakor el őkezelt minta is elfogadható párhu ­
zamos negatív kontrollként, de csak a rövid perifériás vérvizsgála ­
tokban (például 1–3 adagos kezelés), amikor az ebb ől kapott adatok 
a történeti kontrollanyagok várt tartományában vannak.  
1.5. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  Állatok száma és neme  
Minden egyes kezelt és kontrollcsoport nemenként legalább öt 
elemezhet ő állatot tartalmaz (11). Ha a tanulmány végrehajtásakor 
rendelkezésre állnak olyan adatok azonos fajták és azonos expozíciós mód használata mellett, amelyek azt mutatják, hogy nincsenek 
jelentős különbségek a nemek között a toxicitás tekintetében, 
elegendő lesz egyetlen nem vizsgálata. Ahol az emberek esetében 
az expozíció nemre jellemz ő lehet, mint például néhány gyógyszer ­
anyag esetében, a vizsgálatot a megfelel ő nemű állatokkal kell elvé ­
gezni.
 
1.5.2.  A kezelés lefolytatása  
Semmilyen standard kezelési menetrend (azaz egy, kett ő vagy több 
kezelés 24 órás id őközönként) nem javasolható. A hosszabb adagolás 
alkalmával véletlenszer űen vett minták mindaddig elfogadhatók, 
amíg bebizonyosodik annak pozitív hatása erre a vizsgálatra, vagy 
negatív vizsgálat esetében mindaddig, amíg bebizonyosodik, hogy létrejött toxicitás vagy a határadagot használtak, és az adagolás a mintavétel idejéig folytatódott. A vizsgált anyagot két adagban is 
be lehet adni, ugyanazon a napon két alkalommal néhány órás 
időközzel, a nagy mennyiség ű anyag beadásának megkönnyítésére.
 
A vizsgálat kétféle módon hajtható végre:  
a) az állatokat egyszer kell kezelni a vizsgált anyaggal. Legalább 
kétszer kell csontvel őmintákat venni, a kezelés után 24 óránál 
nem korábban, de a kezelés utáni 48 órát nem meghaladó időpontban, a minták közötti megfelel ő időközökkel. A kezelés 
utáni 24 óránál korábbi mintavételt meg kell indokolni. Legalább 
kétszer kell perifériás vérmintákat venni, a kezelés utáni 36 óránál nem korábban kezdve, az els ő mintát követ ő megfelel ő időközök­
kel, de 72 órát nem meghaladó id őpontban. Ha valamely minta ­
vétel alkalmával pozitív reakciót tapasztalunk, akkor nincs 
szükség további mintavételre;
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) ha naponként kett ő vagy több alkalommal adagoljuk a vizsgált 
anyagot (például kett ő vagy több kezelés 24 órás id őközönként), 
egyszer kell mintákat gy űjteni az utolsó kezelést követ ő 18 és 24 
óra között a csontvel ő, és egyszer az utolsó kezelést követ ő 36 és 
48 óra között a perifériás vér vizsgálata esetében (12).  
Ezenkívül alkalmazhatók más mintavételi id ők is, amikor ez az adott 
esetben megfelel ő. 
1.5.3.  Dózisok  
Ha dózisbehatároló vizsgálatot végeztek, mert nem állnak rendelke ­
zésre alkalmas adatok, ezt ugyanabban a laboratóriumban, ugyanazon 
fajták, törzs, nem és kezelési eljárás alkalmazásával hajtják végre, 
mint amelyet a f ő vizsgálatban alkalmaznak (13). Ha észlelhet ő toxi­
citás, három dózist kell használni az els ő mintavételhez. E dózi ­
soknak át kell fogniuk egy a maximálistól a már csak kissé vagy 
az egyáltalán nem toxikusig terjed ő tartományt. A kés őbbi mintavé ­
telnél csak a legmagasabb adagot használják. A legmagasabb adag az a dózis, amely olyan egyértelm ű toxicitási jeleket vált ki, hogy annál 
magasabb adagok, azonos adagolás mellett, várhatóan halált okoz ­
nak. Specifikus biológiai hatású anyagok alacsony, nem toxikus 
adagok mellett (ilyenek például a hormonok és mutagének) adott esetben lehetséges, hogy nem felelnek meg az adagolási kritériumok ­
nak, ezért ezeket eseti alapon kell értékelni. A legmagasabb adag 
olyan adagként is definiálható, amely létrehoz valamilyen toxicitási 
jeleket (például a csontvel őben vagy a perifériás vérben az összes 
eritrocita között az éretlen eritrociták arányának csökkenése).
 
1.5.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egyetlen alkalommal vagy ugyanazon a napon két adagban 
beadott, legalább 2 000 mg/kg testsúlydózis mellett végrehajtott vizs ­
gálat semmilyen megfigyelhet ő toxikus hatásokat nem hoz létre, és 
ha nem várható genotoxicitás szerkezetileg rokon anyagokkal 
kapcsolatos adatok alapján, akkor nem szükséges a három dózis használatával végrehajtott teljes vizsgálat. Hosszabb id őtartamú vizs ­
gálatok esetében a határadag 2 000 mg/kg/testsúly/nap legfeljebb 14 
napos kezelés, és 1 000 mg/kg/testsúly/nap 14 napnál hosszabb 
kezelés esetében. A várt expozíciós hatások az embernél a határ ­
érték-vizsgálatban valamilyen magasabb dózis használatának szük ­
ségességét jelezhetik.
 
1.5.5.  Adagolás  
A vizsgált anyagot rendszerint gyomorszondán át inkubációs kanül 
segítségével, vagy hasüregbe adott injekció segítségével adják be. 
Elfogadhatók egyéb expozíciós módok, amennyiben azok indokolha ­
tók. A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maxi ­
mális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretét ől függ. A térfogata 
nem haladhatja meg a 2 ml/l00 g testsúly mennyiséget. Ennél 
nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb 
koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irri ­
tatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelel ő beál­
lításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyi ­
ségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyi ­
séget lehessen adagolni a kísérleti állatoknak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Csontvel ő/vér preparálása  
A csontvel ősejteket rendszerint a femurokból vagy tibiákból kell 
venni közvetlenül az állatok elpusztítása után. A sejteket el kell távolítani a combcsontokból vagy sípcsontokból, preparálni kell 
azokat és megfesteni már ismert módszerek segítségével. A perifériás 
vért a farokvénából vagy más megfelel ő érből kell venni. A vérsej ­
teket azonnal, szupravitálisan meg kell festeni (8) (9) (10) vagy kenetpreparátumokat kell létrehozni, és ezután kell elvégezni a 
festést. A DNS-specifikus festékek (például akridinnarancs (14) 
vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (15)) használata kiküszöbölhet néhányat a DNS-re nem jellemz ő festőanyag használatával mester ­
ségesen el őidézett változás közül. Ez az el őny nem zárja eleve ki a 
hagyományos festékek (például Giemsa) használatát. További rend ­
szerek (például cellulózoszlopok a magvas sejtek eltávolítására (16)) is használhatók, feltéve, hogy már bebizonyosodott e rendszerekr ől, 
hogy megfelel ően működnek a laboratóriumban mikronukleált sejtek 
preparációjánál.
 
1.5.7.  Elemzés  
Minden egyes állatnál meg kell határozni az összes (éretlen + érett) 
eritrocitához viszonyítottan az éretlenek arányát, csontvel ő esetében 
összesen legalább 200 eritrocita és perifériás vér esetében legalább 1 000 eritrocita megszámlálásával (17). Minden tárgylemezt, a 
pozitív és negatív kontrollanyagokét is, kódolni kell a mikroszkópos 
elemzés el őtt. Allatonként legalább 2 000 éretlen mikronukleuszt kell 
kiértékelni a mikronukleusszal rendelkez ő éretlen eritrociták el őfor­
dulásának megállapítása céljából. További információk kaphatók az 
érett eritrociták értékelésével abból a szempontból, hogy tartalmaz ­
nak-e mikronukleuszt. A tárgylemezek elemzésekor az összes eritro ­
citát tekintve, az éretlen eritrociták arányának nem szabad a kont ­
rollérték 20 %-ánál kisebbnek lennie. Amikor az állatokat folyama ­
tosan kezeljük négy hétig vagy ennél hosszabb ideig, állatonként legalább 2 000 érett eritrocita is kiértékelhet ő a mikronukleusz jelen ­
létének megállapítása céljából. Automatizált elemz ő rendszerek 
(képanalizáló és áramlási citometria sejtszuszpenziókra) a kézi érté ­
kelés elfogadható alternatívái, ha alkalmazásuk megfelel ően indokolt 
és e rendszerek érvényesítettek.
 
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell összefoglalni. A 
kísérleti egység maga az állat. Minden egyes állat esetében külön 
kell feljegyezni a kiértékelt éretlen eritrociták számát, a mikronukle ­
usszal rendelkez ő éretlen eritrociták számát és az összes eritrociták 
közül az éretlenek számát. Amikor az állatokat folyamatosan négy hétig vagy ennél hosszabb ideig kezeljük, az érett eritrocitákra vonat ­
kozó adatokat is meg kell adni, ha azok megállapításra kerültek. 
Minden egyes állat tekintetében meg kell adni az összes eritrociták között az éretlenek arányát és, adott esetben, a mikronukleusszal rendelkez ő eritrociták arányát. Ha semmilyen bizonyíték nincs arra, 
hogy eltérés van a két nem között a reakciók tekintetében, összevon ­
hatók a nemekhez kapott adatok a statisztikai elemzés céljából.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározá ­
sára, ilyen például a mikronukleusszal rendelkez ő sejtek számának 
növekedése a dózis függvényében vagy egyetlen mintavétel alkal ­
mával egy meghatározott dózis mellett a mikronukleusszal rendel ­
kező sejtek számának egyértelm ű növekedése. El őször meg kell vizs ­
gálni az eredmények biológiai jelent őségét. Statisztikai módszerek 
használhatók a vizsgálati eredmények értékelésének el ősegítésére 
(18) (19). Valamely pozitív reagálás tekintetében nem szabad, 
hogy a statisztikai szignifikancia legyen az egyetlen meghatározó tényező. A többféleképpen magyarázható eredményeket további vizs ­
gálattal kell tisztázni, lehet őleg a kísérleti körülményeket módosítva.
 
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló adatok 
alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcsolatban egyér ­
telműen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az eredmények több ­
féleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők maradhatnak, 
tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismétlik meg a kísérletet.  
A mikronukleusz vizsgálat pozitív eredményei azt jelzik, hogy a 
vizsgált anyag létrehoz olyan mikronukleuszt, amely a vizsgált fajok eritrocitáiban a mitiotikus rendszer károsodásának vagy kromo ­
szómakárosodásnak az eredménye. A negatív eredmények azt jelzik, 
hogy a vizsgálati körülmények között a vizsgált anyag nem indukál mikronukleuszokat a vizsgált fajok éretlen eritrocitáiban.
 
Értékelni kell annak a valószín űségét, hogy a vizsgált anyag vagy 
annak metabolitjai eljutnak-e az általános keringési rendszerbe, ill. 
kifejezetten a célszövetbe (például szisztematikus toxicitás).  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldékonysága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Kísérleti állatok:  
— használt fajok/törzs,  
— állatok száma, kora és neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az állatok súlya a vizsgálat kezdetekor, az egyes csoportok 
esetében a testsúlytartományt, átlagértéket és a standard eltérést is ideértve.
 
Vizsgálati körülmények:  
— pozitív és negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollanyagok,  
— a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen 
vizsgálat,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— a dózisok kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag el őkészítésére vonatkozó részletek,  
— a vizsgált anyag beadására vonatkozó részletek,  
— a beadási mód megindoklása,  
— módszerek annak ellen őrzésére, hogy elérte-e a vizsgált anyag 
az általános keringési rendszert vagy cél szövetet, ha vannak ilyenek,
 
— átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), 
ha ez alkalmazható,  
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó részletek,  
— kezelési és mintavételi menetrendek részletes leírása,  
— a tárgylemez preparálásának módszerei,  
— toxicitás mérésének módszerei,  
— mikronukleusszal rendelkez ő éretlen eritrociták értékelésének 
kritériumai,  
— az elemzett sejtek száma (állatonként),  
— azok a kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok 
pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhet őnek 
tekintendők-e. 
Eredmények:  
— toxicitás jelei,  
— éretlen eritrociták aránya az összes eritrocitához képest,  
— mikronukleusszal rendelkez ő éretlen eritrociták száma, minden 
egyes állat tekintetében külön megadva,  
— csoportonként a mikronukleusszal rendelkez ő éretlen eritrociták 
átlagértéke ± standard eltérés,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzések és alkalmazott módszerek,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív kontrollokra vonatkozó adatok 
és történeti negatív adatok,  
— az egyidej űleg elvégzett pozitív kontrollokra vonatkozó adatok.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
pp. 9-15  
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavo ­
urnin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The 
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Muta ­
tion Res., 123, pp. 61-118  
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, 
M. F. and Heddle, J. A. (1990), The  In vivo  Micronucleus 
Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. 
Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558
 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, 
pp. 103-112
 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. 
E. (1990), The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol., 14, pp. 513-522
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249
 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992), Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278. pp. 83-98
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis 
Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) 
(1995), Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159  
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pcchic ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994),  in vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Muta ­
tion Res. 312, pp. 293-304  
(12) Higashikuni, N. and Sotou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10. pp. 313-319  
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose setting in  In vivo  Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7. pp. 313-319
 
(14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An 
Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247
 
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y. Mutation Res., 120, pp. 269-275
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for 
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97-99  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.). Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommendes Procedures, UKEMS Subcommittee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing, Report, Part 1. revised, Camb ­
ridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, pp. 115-141
 
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cyto­
genetic Assays, in: UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENITÁS: REVERZ MUTAGENITÁSI VIZSGÁLAT 
BAKTÉRIUMOKKAL  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 471-nek, reverz mutagenitási 
vizsgálat baktériumokkal (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
A bakteriális reverz mutagenitás vizsgálat a  Salmonella typhimurium  
és Escherichia coli  aminosavat igényl ő törzseit használja pontmutá ­
ciók észlelésére, amelyek magukban foglalják egy vagy néhány DNS 
bázispár szubsztitúcióját, addícióját vagy delícióját (1), (2), (3). E 
bakteriális reverz mutagenitás vizsgálatnak az az elve, hogy észleli azon mutációkat, amelyek revertálják a kísérleti törzsekben jelen lév ő 
mutációkat, és helyreállítja a baktériumoknak egy esszenciális 
aminosavat szintetizáló képességét. A revertált baktérium észlelése 
azon képességének a segítségével történik, hogy az növekedni tud, amikor nincs jelen a vizsgálati anyatörzs által igényelt aminosav.
 
A pontmutációk sok emberi genetikai betegség okozói, és számos 
bizonyíték van arra, hogy a testi sejtek onkogénjeinek és tumor ­
szuppresszor génjeinek a pontmutációi szerepet játszanak a daganat 
képződésben emberekben és kísérleti állatokban. A reverz mutáció 
vizsgálatot baktériumokkal gyors, olcsó és viszonylag könny ű végre­
hajtani. E törzsek közül sok törzs rendelkezik néhány olyan jellem ­
zővel, amelyek érzékenyebbekké teszik azokat mutációk észlelésé ­
hez; ilyenek a reverzió helyének DNS-szekvenciája, nagyobb mole ­
kulák iránti fokozott sejtpermeabilitás, bizonyos DNS-reparációs rendszerek kiiktatása, vagy a hibára hajlamos DNS-reparációs folya ­
matok serkentése. A kísérleti törzsek sajátossága néhány hasznos 
információt szolgáltathat a genotoxikus anyagok által el őidézett 
mutációk típusairól. Szerkezetek sokféle változatához kapott eredmé ­
nyek bő adatbázisa áll rendelkezésre baktériális reverz mutagenitás 
vizsgálatokhoz; jól megalapozott metodikákat fejlesztettek ki külön ­
böző fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkez ő kémiai anyagok, 
beleértve az illékony vegyületeket is, vizsgálatához.
 
Lásd még az Általános bevezetés B. részét is.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
A reverz mutagenitás vizsgálat  vagy  Salmonella typhimurium -mal 
vagy  Escherichia coli -val elvégezve, azon mutációkat igazolja, 
amelyek valamely aminosavat (hisztidin, illetve triptofán) igényl ő 
törzsben lépnek fel és egy olyan törzs kialakulásához vezetnek, ami a küls ő aminosav-ellátástól független.
 
Bázispárcserét okozó mutagének  azok a hatóanyagok, amelyek 
alapvető bázisváltozást okoznak a DNS-ben. A reverziós vizs ­
gálatban e változás az eredeti mutáció helyén vagy a baktérium ­
genom egy másik helyén.  
Frameshift mutagének  azok a hatóanyagok, amelyek egy vagy több 
bázispár addícióját vagy delícióját okozzák a DNS-ben, ezzel 
megváltoztatva a leolvasó keretet a ribonukleinsavban.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. ALAPVET Ő MEGFONTOLÁSOK  
A bakteriális reverz mutagenitás vizsgálat prokarióta sejteket használ, 
amelyek az olyan tényez őkben térnek el az eml őssejtektől, mint 
például a kémiai anyagok felvétele, metabolizmus, kromoszómaszer ­
kezet és DNS-reparációs folyamatok. Az  in vitro  végrehajtott vizs ­
gálatok rendszerint a metabolikus aktiválás valamilyen kívülr ől ható 
forrásának használatát teszik szükségessé. Az  in vitro  metabolikus 
aktiváló rendszerek nem tudják teljesen szimulálni az eml ős in vivo  
körülményeket. Ebb ől következ ően a vizsgálat nem ad közvetlen 
tájékoztatást az eml ősök esetében valamely anyag mutációt el őidéző 
és daganatkelt ő potenciáljáról.  
A bakteriális reverz mutagenitás vizsgálatot rendszerint a genoto ­
xikus aktivitás és különösen a pontmutáció-el őidéző aktivitás els ő 
szűrőjeként alkalmazzák. A terjedelmes adatbázis bebizonyította, 
hogy sok olyan kémiai anyag, amely e vizsgálatban pozitívnak bizo ­
nyult, más vizsgálatokban is mutagénnek bizonyul. Léteznek példák olyan mutációt el őidéző hatóanyagokra, amelyeket nem észlel e vizs ­
gálat; e hiányosságok okai a vizsgált végpont különleges természe ­
tének, a metabolikus aktiválásban el őforduló különbségeknek, vagy a 
biológiai elérhet őségben lév ő különbségeknek tulajdoníthatók. 
Másrészről, azon tényez ők, amelyek növelik a bakteriális reverz 
mutagenitás vizsgálat érzékenységét, a mutagén aktivitás túlbecs ­
léséhez vezethetnek.
 
A bakteriális reverz mutagenitás vizsgálat lehet, hogy nem bizonyul 
megfelelőnek bizonyos kémiai anyagosztályok értékeléséhez, ilyenek 
például az er ősen baktericid vegyületek (például bizonyos antibioti ­
kumok) és azok, amelyek vélhet ően (vagy bizonyítottan) kifejezetten 
zavaró hatással vannak az eml őssejt replikációs rendszerére (például 
néhány topoizomeráz gátló szer és néhány nukleozid analóg). Ilyen esetekben megfelel őbbnek bizonyulhatnak az eml ős mutagenitási 
vizsgálatok.
 
Sok olyan vegyület van, amely pozitív eredményt mutat e vizs ­
gálatban és az eml ősökben rákkelt ő, a korreláció mégsem abszolút. 
Mérvadó a kémiai anyag osztálya, és léteznek olyan karcinogén anyagok, amelyeket nem észlel e vizsgálat, mivel azok más, nem genotoxikus mechanizmusokon, vagy olyan mechanizmusokon 
keresztül fejtik ki a hatásukat, amelyek nincsenek jelen baktériu ­
mokban.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Baktériumsejtek szuszpenzióit kezelik a vizsgált anyaggal exogén 
metabolikus aktiváló rendszer jelenlétében és anélkül. A lemezön ­
téses (plate incorporation) módszernél e szuszpenziókat közvetlenül be kell keverni a felülönt ő agarba, és minimális táptalajra helyezni. 
Az előinkubációs módszer esetében az expozíciós keveréket inku ­
bálni kell, és csak ezután kell azt bekeverni a felül önt ő agarba a 
minimál táptalajra helyezés el őtt. Mindkét módszer alkalmazásakor 
két vagy három napig tartó inkubálás után meg kell számolni a 
revertáns telepeket, és össze kell hasonlítani azt az oldószer kont ­
roll-lemeztenyészeteken lév ő spontán revertáns telepek számával.
 
Már több különböz ő eljárást írtak le a bakteriális reverz mutagenitás 
vizsgálat végrehajtására. A leggyakrabban használt eljárások közé tartoznak a lemezöntéses módszer (1), (2), (3), (4) az el őinkubációs 
módszer (2), (3), (5), (6), (7), (8) a fluktuációs módszer (9), (10) és a 
szuszpenziós módszer (11). Már leírtak módosított változatokat 
gázok vagy g őzök vizsgálatához (12).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
A módszerben leírt eljárások els ősorban a lemezöntéses és az el őin­
kubációs módszerekhez tartoznak. Ezek közül bármelyik alkalmas 
kísérletek végrehajtására, mind metabolikus aktiválással, mind anél ­
kül. Néhány anyag hatékonyabban észlelhet ő az előinkubációs 
módszer segítségével. Ezen anyagok olyan kémiai anyagosztály ­
okhoz tartoznak, amelyek rövid szénláncú alifás nitrozaminokat, 
kétvegyérték ű fémeket, aldehideket, azo festékeket és diazo-vegyü ­
leteket, pirrlizidin alkaloidokat, allil és nitrovegyületeket tartal ­
maznak (3). Azt is felismerték, hogy a mutagének bizonyos osztályai 
nem mindig észlelhet ők az olyan szokásos eljárásokkal, mint például 
a lemezöntéses vagy el őinkubációs módszer. Ezeket „különleges 
eseteknek” kell tekinteni és észlelésükre alternatív eljárásokat kell használni. A következ ő „különleges esetek” azonosíthatók (az észle ­
lésükhöz használható eljárásokra adott példákkal együtt): azo 
festékek és diazo-vegyül etek (3), (5), (6), (13), gázok és illékony kémiai anyagok (12), (14), (15), (16) és glikozidok (17), (18). A standard eljárástól való eltérést tudományosan meg kell indokolni.
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  Előkészületek  
1.5.1.1.  Baktériumok  
Friss baktériumtenyészeteket kell létrehozni a tenyésztés kés ői loga­
ritmikus vagy korai stacioner fázisáig (körülbelül 10  9 sejt/ml). Kés ői 
stacioner fázisban lév ő tenyészeteket nem szabad használni. Lénye ­
ges, hogy a kísérletben használt tenyészetek nagy arányban tartal ­
mazzanak életképes baktériumokat. Ezt az arányt vagy történeti kont ­
rolladatokból, vagy minden egyes vizsgálatban külön kiszélesztéssel az életképes sejtek számának meghatározásával lehet megadni.
 
A javasolt inkubációs h őmérséklet 37  o C. 
Legalább öt baktériumtörzset kell használni. Ezek közül négy törzs 
az S. typhinuriumhoz (TA 1535; TA 1537 vagy TA97a vagy TA97; TA98; és TA100) tartozik, amelyekr ől már bebizonyosodott, hogy 
megbízhatóan és reprodukálhatóan reagálnak a különböz ő laborató­
riumokban. E négy  S. typhimurium  törzsnek GC bázispárjai vannak a 
primer reverziós helyen, és ismert, hogy esetleg nem mutatnak ki bizonyos oxidatív mutagéneket, keresztköt ő ágenseket és hidrazino ­
kat. Az ilyen anyagok  E. coli  WP2 törzsekkel vagy  S. typhimurium  
TA102-vel (19) észlelhet ők, amelyek egy AT bázispárral rendel ­
keznek a primer reverziós helyen. Ezért tehát a következ ő törzsek 
kombinációja javasolt:
 
— S. typhimurium TA 1535, és  
— S. typhimurium TA1537 vagy TA97 vagy TA97a, és  
— S. typhimurium TA98, és  
— S. typhimurium TA100, és  
— E. coli WP2 uvrA, vagy E. coli WP2 uvrA (pKM101), vagy S. 
typhimurium TA102.  
A keresztköt ő mutagének észleléséhez el őnyben részesíthet ő a 
TA102 használata, vagy az E. coli-nak egy DNS-reparációban kivá ­
lónak bizonyuló törzse (ilyen például az E. coli WP2 vagy E. coli 
WP2 (pKM10l)) alkalmazása.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
A törzstenyészet elkészítéséhez, az indikátor ellen őrzéséhez és tárolá ­
sához elfogadott eljárásokat kell használni. Minden fagyasztott törzs ­
tenyészet-készítmény esetében igazolni kell a tenyésztéshez szük ­
séges aminosavat (hisztidin  S. typhimurium  törzsek és triptofán  E. 
coli törzsek esetében). Más fenotípus-jellemz őket hasonlóképpen kell 
ellenőrizni, nevezetesen: R-faktor plazmidok jelenlétét vagy hiányát, 
ahol szükséges (azaz ampicillin rezisztenciát TA98, TA100 és TA97a vagy TA97, WP2 uvrA és WP2 uvrA (pKM10l) törzsekben és amplicin plusz tetraciklin rezisztenciát TA102-es törzsben); a 
specifikus mutációk jelenléte (azaz rfa mutáció  S. typhimurium -ban 
kristályibolyára való érzékenységen keresztül és uvrA mutáció  E. 
coli-ban vagy uvrB mutáció  S. typhimurium -ban, ibolyántúli fényre 
való érzékenységen keresztül) (2), (3). A törzseknek a laboratórium 
történeti kontrolladataiból várt gyakoriság tartományokon belüli és 
lehetőleg a szakirodalomban közölt tartományon belüli spontán 
revertáns telep lemeztenyésztési számokat is kell adniuk.
 
1.5.1.2.  Táptalaj  
Megfelelő minimál agart (például Vogel-Bonner minimál E ingredi ­
enseket és glukózt tartalmazót) és hisztidint, biotint vagy tiptofánt 
tartalmazó felülönt ő agart alkalmazunk, azért hogy több sejtosztódást 
lehessen megfigyelni (1), (2), (9).  
1.5.1.3.  Metabolikus aktiválás  
A baktériumot kezelni kell a vizsgált anyaggal, mind megfelel ő 
metabolikus aktiváló rendszer jelenlétében, mind anélkül. A legálta ­
lánosabban használt rendszer a kofaktorral kiegészített posztmito ­
kondriális frakció (S9), amelyet enziminducerrel, ilyen például az 
Aroclor 1254 (1), (2), vagy a fenobarbiturát és ß-naftoflavon (18), 
(20), (21) kombinációjával kezelt rágcsálók májából készítették. A poszt-mitokondriális frakciót rendszerint 5-t ől 30 térfogatszázalékig 
terjedő koncentrációkban használják az S9-keverékben. Valamely 
metabolikus aktiváló rendszer kiválasztása és állapota függhet a vizs ­
gálatra kerül ő kémiai anyag osztályától. Meghatározott esetekben 
megfelelőnek bizonyulhat a poszt-mitokondriális felülúszás egynél 
több koncentrációjának használata. Azofestékek és diazo-vegyületek 
esetében megfelel őbbnek bizonyulhat valamilyen redukciós metabo ­
likus aktiváló rendszer használata (6) (13).
 
1.5.1.4.  Vizsgált anyag/el őkészítés  
A szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni 
megfelelő oldószerekben, vagy ha szükséges, hígítani kell a bakté ­
rium kezelése el őtt. A folyékony vizsgált anyagokat közvetlenül 
hozzá lehet adni a vizsgált rendszerekhez és/vagy hígíthatók kezelés előtt. Friss készítményeket kell használni, kivéve, ha a stabilitási 
adatok a tárolás elfogadhatóságát jelzik.
 
Oldószerként nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan 
kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal, és kompatibilisnek kell 
lennie a baktérium túlélésével és az S9-es aktivitással (22). Ha a 
jól ismert oldószert ől eltérő oldószereket használnak, ezek haszná ­
latát alá kell támasztania az összeegyeztethet őségüket jelz ő adatok­
kal. Elsőként valamilyen vizes oldószer használatát kell megfontolni. 
Vízzel instabil anyagok vizsgálatakor a használt szerves oldósze ­
reknek vízmenteseknek kell lenniük.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Vizsgálati körülmények  
1.5.2.1.  Vizsgált törzsek (lásd az 1.5.1.1. alatt)  
1.5.2.2.  Expozíciós koncentráció  
A vizsgált anyag legnagyobb koncentrációjának meghatározásakor 
figyelembe veend ő kritériumok közé tartozik többek között a citoto ­
xicitás és az oldékonyság a végs ő keverékben.  
Hasznosnak bizonyulhat a toxicitás és az oldékonyság meghatározása 
egy előzetes kísérletben. A citotoxicitás a revertáns telepek számának 
csökkenésével, a háttér táptalaj kitisztulásának vagy csökkenésének, 
vagy a kezelt tenyészetek túlélési rátájának segítségével észlelhet ő. 
Valamely anyag citotoxicitása valószín űleg megváltozik metabolikus 
aktiváló rendszerek jelenlétében. Az oldhatatlanságot a végs ő keve­
rékben a tényleges vizsgálati körülmények között szabad szemmel 
látható csapadék képz ődéseként lehet felismerni.  
Oldható, nem citotoxikus anyagok esetében a javasolt maximális 
kísérleti koncentráció 5 mg/lemez vagy 5 μl/lemez. Az 5 mg/lemeznél 
vagy 5 μl/lemeznél nem oldódó, nem citotoxikus anyagok esetében 
egy vagy több kísérleti koncentrációnak nem oldódónak kell lennie a 
végső keverékben. Azon vizsgált anyagokat, amelyek már 5 mg/ ­
lemez vagy 5 ul/lemez alkalmazása esetén citotoxikusak, egészen a citotoxikus koncentrációig kell vizsgálni. A kicsapódás nem zavar ­
hatja az értékelést.
 
A vizsgált anyag legalább öt különböz ő elemezhet ő koncentrációját 
használják körülbelül fél log-fázis (azaz √10) intervallumokkal az 
első kísérletben. Megfelel őek lehetnek ennél kisebb intervallumok 
valamilyen koncentráció-hatás viszony vizsgálatakor. Megfontolható 
5 mg/lemez, vagy 5 μl/lemez koncentrációt meghaladó vizsgálat 
jelentős mennyiség ű potenciálisan mutagén szennyez ődéseket tartal ­
mazó anyagok értékelésekor.  
1.5.2.3.  Negatív és pozitív kontrollok  
Minden egyes vizsgálatban egyidej űleg, törzsre jellemz ő pozitív és 
negatív (oldószer) kontrollanyagokat alkalmaznak, mind metabolikus 
aktiválással, mind anélkül. Olyan pozitív kontrollanyag-koncentráci ­
ókat kell kiválasztani, amelyek bizonyítják az egyes vizsgálatok haté ­
konyságát.  
Metabolikus aktiváló rendszert alkalmazó vizsgálatok esetében a 
pozitív kontroll referenciaanyagot (anyagokat) a használt baktérium ­
törzsek típusa alapján kell kiválasztani.  
A következ ő anyagok példaként szolgálnak a metabolikus aktivá ­
lással végrehajtott vizsgálathoz alkalmas pozitív kontrollanyagokra:  
CAS-szám EINECS-szám Név  
781-43-1 212-308-4 9,10- Dimetil-antracén 
57-97-6 200-359-5 7,12- Dimetilbenz[a]antracén 
50-32-8 200-028-5 Benzo[a]pirén 
613-13-8 210-330-9 2-aminoanthracene  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
CAS-szám EINECS-szám Név  
50-18-0 Ciklofoszfamid 
6055-19-2 200-015-4 Ciklofoszfamid monohidrát  
A következ ő anyag alkalmas pozitív kontrollanyag reduktív metabo ­
likus aktiváló módszerhez:  
CAS-szám EINECS-szám Név  
573-58-0 209-358-4 Kongó vörös  
A 2-Amino-antracént nem szabad használni az S9-es keverék haté ­
konyságának egyetlen indikátoraként. Ha használunk 2-Amino-antra ­
cént, akkor az S9 minden egyes adagját egy olyan mutagénnel is 
jellemezni kell, amely mikroszómális enzimekkel, ilyen például a 
Benzo[a]pirén, Dimetil-benzantracén, történ ő metabolikus aktiválást 
igényel.  
A következ ő anyagok példák a törzsre jellemz ő pozitív kontrollanya ­
gokra azon kísérletekben, amelyeket exogén metabolikus aktiváló 
rendszer nélkül hajtunk végre.  
CAS-szám EINECS-szám Anyag Törzs  
26628-22-8 247-852-1 Nátrium-azid TA 1535 és TA 100 
607-57-8 210-138-5 2-Nitro-fluorén TA 98 
90-45-9 201-995-6 9-Amino-akridin TA 1537, TA 97 és TA 97a 
17070-45-0 241-129-4 ICR 191 TA 1537, TA 97 és TA 97a 
80-15-9 201-254-7 Kumén-hidroperoxid TA 102 
50-07-7 200-008-6 Mitomicin C WP2 uvrA és TA 102 70-25-7 200-730-1 l-etil-3-nitro-l-N-nitrozo- 
guanidin WP2, WP2uvrA és WP2uv ­
rA(pK M101) 
56-57-5 200-281-1 4-nitroquinoline-l -oxide WP2, WP2uvrA és WP2uv ­
rA(pK M101) 
3688-53-7 Furil-furamid (AF2) Plazmidhordozó törzsek
 
Használhatók más megfelel ő pozitív kontroll referenciaanyagok is. 
Olyan pozitív kontrollanyagok használatát kell mérlegelni, amelyek 
ugyanazon kémiai osztályba tartoznak, mint a vizsgált anyag, ha 
rendelkezésre állnak ilyenek.  
A vizsgálatba bevonják a vizsgált anyagot nem tartalmazó, egyedül 
oldószerb ől vagy viv őanyagból álló és egyébként a kezelt csopor ­
tokkal azonos módon kezelt negatív kontrollanyagokat. Ezenkívül nem kezelt kontrollokat is használnak, kivéve, ha vannak olyan törté ­
neti kontrolladatok, amelyek bizonyítják, hogy semmilyen káros 
vagy mutagén hatást nem idéz el ő a kiválasztott oldószer.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  A kísérlet végrehajtása  
A lemezöntéses módszer (1), (2), (3), (4) esetében metabolikus akti ­
válás nélkül, rendszerint 0,05 ml vagy 0,1 ml vizsgált oldatot, 0,1 ml friss baktériumtenyészetet (amely körülbelül 10
 8 életképes sejtet 
tartalmaz) és 0,5 ml steril pufferoldatot összekevernek 2,0 ml rétegelt 
felülöntő agarral. Metabolikus aktiválással végrehajtott vizsgálathoz 
rendszerint megfelel ő mennyiség ű posztmitokondriális frakciót (a 
metabolikus aktiváló keverékben 5-t ől 30 térfogatszázalékig terjed ő 
tartományban) tartalmazó 0,5 ml metabolikus aktiváló keveréket 
összekevernek felülönt ő agarral (2,0 ml), a baktériummal és vizsgált 
anyaggal/vizsgált oldattal együtt. Összekeverjük minden egyes 
kémcső tartalmát, és egy minimális felülönt ő agar felületére öntjük. 
Engedjük, hogy az agar inkubálás el őtt megszilárduljon.  
Előinkubációs módszer (2), (3), (5), (6) esetében a vizsgált anyagot/ ­
vizsgált oldatot el őinkubálják a vizsgált törzzsel (körülbelül 10  8 élet­
képes sejtet tartalmaz) és steril pufferoldattal vagy a metabolikus aktiváló rendszerrel (0,5 ml), rendszerint 20 percig vagy ennél 
hosszabb ideig 30–37
 o C hőmérsékleten a felülönt ő agarral való 
összekeverés és minimális agar lemez felületére öntés el őtt. Rend­
szerint 0,05 vagy 0,1 ml vizsgált anyagot/vizsgált oldatot, 0,1 ml baktériumot és 0,5 ml S9 keveréket vagy steril pufferoldatot keve ­
rünk 2 ml felülönt ő agarhoz. A kémcsöveket leveg őztetjük az el őin­
kubálás során rázókészülék segítségével.
 
A változás megfelel ő becsléséhez három lemezt kell használni 
minden egyes dózisszinten. Ha tudományosan indolkolt, két lemez használata elfogadható. Valamely lemez esetenkénti elvesztése nem 
szükségképpen érvényteleníti a vizsgálatot.
 
Gázok vagy illékony anyagok megfelel ő módszerekkel, például 
légmentesen zárt edényekben, vizsgálhatók (12), (14), (15), (16).  
1.5.4.  Inkubálás  
Egy adott vizsgálatban részt vev ő minden lemezt 37  o C hőmérsék­
leten 48-–2 órán át inkubálnak. Az inkubációs id őtartam után meg 
kell számolni lemezenként a revertáns telepek számát.  
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az adatokat a lemezenkénti revertáns telepek számaként kell 
megadni. Mind a negatív (oldószerkontroll és nem kezelt kontroll, 
ha használatra került) mind a pozitív kontroll-lemezeken lév ő rever­
táns telepek számát is fel kell jegyezni. Meg kell adni az egyes lemezekhez tartozó számokat, lemezenként a revertáns telepek átlag ­
értékét és a standard eltérést a vizsgált anyaghoz és a pozitív és 
negatív (nem kezelt és/vagy oldószer) kontrollokhoz képest.
 
A nyilvánvalóan pozitív reakció igazolása nem szükséges. A több ­
féleképpen magyarázható eredményeket további, lehet őleg a kísérleti 
körülmények módosításával végrehajtott vizsgálattal kell tisztázni. A negatív eredményeket külön kísérletekkel kell meger ősíteni. Azon 
esetekben, ahol nem tekintjük szükségesnek a negatív eredmények 
megerősítését, meg kell indokolni e döntést. Megfontolandó az 
utólagos ellen őrző kísérletekben a vizsgált körülmények tartomá ­
nyának kiterjesztése érdekében a vizsgálati paraméterek módosítása. A módosítható vizsgálati paraméterek, többek között a koncentráció ­
felosztás, a kezelés módszere (lemezöntéses vagy folyadék el őinku­
bációs) és a metabolikus aktiválási körülmények lehetnek.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározá ­
sára, ilyen például a metabolikus aktiváló rendszer használatával vagy anélkül legalább egy törzsben a lemezenkénti revertáns telepek 
számának koncentrációval kapcsolatos növekedése a vizsgált tarto ­
mányban és/vagy reprodukálható növekedése egy vagy több koncentráció mellett (23). El őször meg kell vizsgálni az eredmények 
biológiai jelent őségét. Statisztikai módszerek használhatók a vizs ­
gálati eredmények értékelésének el ősegítésére (24). Valamely pozitív 
reagálás tekintetében nem szabad, hogy a statisztikai szignifikancia legyen az egyetlen meghatározó tényez ő.
 
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételjük meg a kísérletet.
 
A bakteriális reverz mutagenitás vizsgálatból kapott pozitív eredmé ­
nyek azt jelzik, hogy az anyag bázis szubsztitúcióval vagy keretel ­
tolásokkal (frameshift) pontmutációkat idéz el ő a Salmonella typhi ­
murium  és/vagy az  Escherichia coli  génállományában. A negatív 
eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények között a vizs ­
gált anyag nem mutagén a vizsgált fajokban.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Törzsek:  
— használt törzsek,  
— sejtek száma tenyészetenként,  
— a törzs jellemz ői. 
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgált anyag lemezenkénti mennyisége (mg/lemez vagy μl/­
lemez), és a koncentrációnként használt lemezek számának, vala ­
mint az alkalmazott dózisok indoklása,  
— használt táptalajok,  
— metabolikus aktiváló rendszer típusa és összetétele, az elfogad ­
hatósági kritériumot is ideértve,  
— kezelési eljárások.  
Eredmények:  
— toxicitás jelei,  
— kicsapódás jelei,  
— az egyes lemezek számértékei,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— lemezenként a revertáns telepek átlagértéke és a standard eltérés,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzések, ha vannak,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív 
kontrolladatok, tartományokkal, átlagértékekkel és standard elté ­
résekkel,  
— történeti negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív kontrolladatok, 
tartományokkal, átlagértékekkel és standard eltérésekkel.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, 
pp. 347-364  
(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res, 113, 
pp. 173-215  
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233  
(4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mannalian Microsomal Assay: A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program, Mutation Res. 168, pp. 69-240
 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, 
pp. 91-96  
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin-Heidelberg-New-York, pp. 273-285
 
(7) Gatehouse, D. G, Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirk ­
land, Cambridge University Press, pp. 13-61
 
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, 
pp. 167-177  
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of muta ­
gens, Mutation Res., 38, pp. 33-42  
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, 
J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. 
J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amster ­
dam-New York-Oxford, pp. 141-161
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3, pp. 453-465  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Rec. 307, pp. 335-344
 
(13) Prival, M. J., Bell. S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaugham, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modi ­
fied Salmonella Assay, Mutation Res. 136, pp. 33-47  
(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor. T. and 
Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests, V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen. 19, pp. 2-141
 
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., 
Sobels (eds) Elsevier, Amsterdam, pp. 247-258
 
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M. Monteith, I. G. and Claxton, L. 
D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/ ­
Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occur ­
ring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782
 
(18) Tamura, G, Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980). 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinel Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965
 
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G 
(1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291
 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et 
al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88
 
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G, Gibson, G G, Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxi ­
city Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ 
Microsome Test, Mutation Res. 88. pp. 343-350  
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella 
typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity, Mutation Res. 189, pp. 83-91  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II, Statistical Evalu ­
ation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Camb ­
ridge University Press, pp. 28-65
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  MUTAGENITÁSVIZSGÁLAT ÉS A RÁKKELT Ő HATÁS 
SZŰRÉSE GÉNMUTÁCIÓ VIZSGÁLATA  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE -BEN  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A Saccharomyces cerevisiae  nevű élesztőgomba számos haploid, 
illetve diploid törzse használható fel arra, hogy a vizsgált vegyület által metabolikus aktivációval, illetve a nélkül kiváltott génmutáció 
jelenléte kimutatható legyen.
 
Haploid törzsekben kialakított, el őrehaladó mutációs rendszereket 
kell felhasználni, például a vörös, adeninfügg ő élesztőgombák 
(ade-1, ade-2) mutációját, illetve kett ős adeninfügg ő fehér mutánso ­
kat, illetve olyan szelektív rendszereket, mint a kanavnain és a ciklo ­
heximid rezisztenciaindukciója.  
A leginkább értékelt reverz mutációs rendszer a haploid XV 185-14C 
törzset alkalmazza, amely az  ade  2-1,  arg 4-17,  lys l-l és  trp 5-48 
„ochre” nonszensz mutációkat hordozza; ezek bázis-szubsztitúció típusú mutációt kiváltó mutagénekkel visszafordíthatók, amelyek helyspecifikus, illetve „ochre” szupresszor mutációkat váltanak ki. 
Az XV 185-14C jelzés ű élesztőgombatörzs hordozza a  his 1-7 
markert is, egy f őként második helyet érint ő mutációkkal visszafor ­
dítható „missense” mutációt, valamint a  hom  3-10 markert, amelyet 
kereteltolódást („frameshift”) okozó mutagének fordítanak meg.
 
Diploid  S. cerevisiae  törzsekben az egyetlen általánosan használt 
törzs a D  7 , amely az  ilv 1-92 mutációra homozigóta.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
A vizsgált vegyületek oldatait és a kontrollt a megfelel ő vivőanyag 
felhasználásával közvetlenül a vizsgálat megkezdése el őtt kell elké ­
szíteni. Vízben nem oldódó szerves vegyületek esetében 2 térfogat ­
százalékos koncentrációt nem meghaladó szerves oldószer, például etanol, aceton vagy dimetil-szulfoxid (DMSO) használható. A viv ő­
anyag a végs ő koncentrációban nem befolyásolhatja jelent ősen a 
sejtek életképességét és növekedési jellemz őit.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
A z a n y a g c s e r e a k t i v á l á s a  
A sejteket a vizsgált vegyület hatásának egy megfelel ő exogén 
anyagcsere-aktiváló rendszer jelenlétében és hiányában is ki kell tenni.
 
A leggyakrabban használt rendszer az enzimindukáló szerrel el őke­
zelt rágcsálómáj szövetb ől készített poszt-mitokondriális frakció ko- 
faktorral kiegészítve. Az anyagcsere-aktiválásra más fajok, szöve ­
tek, poszt-mitokondriális frakciók vagy eljárások használata is alkalmas lehet.
 
Vizsgálati körülmények  
I n d i k á t o r t ö r z s e k  
A génmutációs vizsgálatok során leggyakrabban alkalmazott törzs a 
haploid XV 185-14C és a diploid, D  7 jelzésű törzs. Más törzsek is 
megfelelőek lehetnek.  
T á p o l d a t o k  
A mutáns- és a túlél ősejt-számok meghatározásához a megfelel ő 
tenyésztési tápoldatokat kell alkalmazni.  
P o z i t í v é s n e g a t í v k o n t r o l l o k h a s z n á l a t a  
Pozitív, kezeletlen és oldószeres kontrollokat egyidej űleg kell alkal ­
mazni. Minden egyes mutációs végponthoz a megfelel ő pozitív kont ­
rollvegyületeket kell használni.  
E x p o z í c i ó s k o n c e n t r á c i ó  
A vizsgált anyagnak legalább öt, egyenletesen elosztott koncentráci ­
óját kell alkalmazni. Mérgez ő anyagoknál a legnagyobb vizsgált 
koncentráció a túlélési arányt nem csökkentheti 5–10 %-ot meghaladó mértékben. Vízben viszonylag rosszul oldódó anyagokat a megfelel ő eljárások alkalmazásával oldhatóságuk határáig kell vizs ­
gálni. A vízben jól oldódó és nem mérgez ő anyagok fels ő koncent­
rációját esetenként kell meghatározni.
 
I n k u b á c i ó s k ö r ü l m é n y e k  
A lemezeket négy-hét napig 28–30  o C hőmérsékleten, sötétben kell 
inkubálni.  
S p o n t á n m u t á c i ó s g y a k o r i s á g  
Az általánosan elfogadott normál tartományon belüli spontán mutá ­
ciós gyakorisággal rendelkez ő szubkultúrákat kell használni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
A l e m e z e k s z á m a  
A génmutációval el őállított prototrófok, illetve a sejtéletképesség 
vizsgálatára valamennyi koncentráció esetében legkevesebb három lemezt kell alkalmazni. A  hom  3-10-hez hasonló alacsony mutációs 
gyakoriságú markereket használó meghatározások során azonban 
meg kell növelni a lemezek számát, hogy statisztikailag értékelhet ő 
mennyiség ű adatot kapjunk.
 
A kísérlet végrehajtása  
A S. cerevisiae  törzsek kezelését rendszerint folyékony közeges 
eljárással végezzük, amely stabil vagy növekedési fázisban lev ő 
sejteket alkalmaz. Az induló vizsgálatokat osztódó sejteken kell végezni: folyamatos rázás mellett 1-5 × 10
 7 sejt/ml koncentrációjú 
élesztőgombát kezelnek a vizsgált anyaggal legfeljebb 18 órán át, 
28–37  o C hőmérsékleten; ha szükséges, a megfelel ő mennyiségben 
anyagcsere-aktiváló rendszert is adnak hozzá kezelés közben. A kezelés végén a sejteket centrifugálják, kimossák, és megfelel ő tápta­
lajon szétterítik. Inkubáció után a lemezeken kell megszámolni a 
túlélő sejteket és a génmutáció kialakulását. Ha az els ő vizsgálat 
negatív eredményt ad, egy második meghatározást is kell végezni, stabil, nem osztódó sejtek felhasználásával. Ha az els ő vizsgálat 
pozitív, azt egy megfelel ő független kísérlettel kell meger ősíteni.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, megadva a 
megszámolt telepek számát, a mutánsok számát, a túlélési arányt 
és a mutációs gyakoriságot. Valamennyi eredményt független vizs ­
gálatokkal kell meger ősíteni. Az eredményeket megfelel ő statisztikai 
módszerrel kell értékelni.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a felhasznált törzs,  
— a vizsgálat körülményei: stabil, nem osztódó állapotú vagy 
osztódó sejtek, a tápfolyadékok összetétele, az inkubációs h őmér­
séklet és id őtartam, az anyagcsereaktiváló rendszer,  
— kezelési körülmények: koncentrációk, a kezelési eljárás és id őtar­
tama, a kezelési h őmérséklet, a pozitív és negatív kontrollok,  
— a megszámolt telepek mennyisége, a mutánsok száma, a túlélési 
arány és a mutációs gyakoriság, a dózis-hatás összefüggés, ha alkalmas, az adatok statisztikai értékelése,
 
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOTIKUS REKOMBINÁCIÓ-VIZSGÁLAT  SACHA ­
ROMYCES CEREVISIAE -BEN  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A Saccharomyces cerevisiae  élesztőgomba esetében a mitotikus 
rekombináció két gén között (vagy még gyakrabban egy gén és annak centrom erje között), illetve géneken belül mutatható ki. A két gén közötti eseményt mitotikus átkeresztez ődésnek (crossing 
over) nevezzük, és eredménye egy reciprok termék, míg a génkon ­
verziónak nevezett, génen belüli esemény leggyakrabban nem reciprok jelleg ű. Az átkeresztez ődés rendszerint recesszív homozi ­
góta telepek vagy szektorok el őállításával mutatható ki heterozigóta 
törzsekben, míg a génkonverzió ugyanazon gén két hibás alléljét hordozó auxotróf heteroallélikus törzsben el őállított prototróf rever ­
táns révén vizsgálható. A mitotikus génkonverzió kimutatásához 
leggyakrabban alkalmazott törzs a D
 4 (ade 2 és  trp 5 lokuszon 
heteroallélikus), a D  7 (a trp 5 lokuszon heteroallélikus), a BZ  34 
(heteroallélikus az  arg 4 lokuszon) és a JD1 (heteroallélikus a  his 
4 és trp 5 lokuszon). A vörös és a rózsaszín homozigóta szektorokat 
termelő mitotikus átkeresztez ődés kimutatására a D  5 vagy a D  7 
jelzésű törzset használhatjuk (amelyek egyaránt kimutatják a mito ­
tikus génkonverziót és az  ilv 1-92 helyen kialakuló reverz mutációt 
is). Mindkét törzs heteroallélikus az  ade  2 komplementer alléljai 
szempontjából.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
A vizsgált vegyületek oldatait és a kontrollt a megfelel ő vivőanyag 
felhasználásával közvetlenül a vizsgálat megkezdése el őtt kell elké ­
szíteni. Vízben nem oldódó szerves vegyületek esetében 2 térfogat ­
százalékos koncentrációt nem meghaladó szerves oldószer, például etanol, aceton vagy dimetil-szulfoxid (DMSO) használható. A viv ő­
anyag a végs ő koncentrációban nem befolyásolhatja jelent ősen a 
sejtek életképességét és növekedési jellemz őit.
 
A z a n y a g c s e r e a k t i v á l á s a  
A sejteket a vizsgált vegyület hatásának egy megfelel ő exogén 
anyagcsere-aktiváló rendszer jelenlétében és hiányában is ki kell 
tenni. A leggyakrabban használt rendszer az enzimindukáló szerrel előkezelt rágcsálómáj szövetb ől készített poszt-mitokondriális frakció 
ko-faktorral kiegészítve. Az anyagcsere-aktiválásra más fajok, szöve ­
tek, poszt-mitokondriális frakciók vagy eljárások használata is 
alkalmas lehet.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Vizsgálati körülmények  
I n d i k á t o r t ö r z s e k  
A leggyakrabban alkalmazott törzs a diploid D  4 , D  5 , D  7 és JD1 
jelzésű törzsek. Más törzsek is megfelel őek lehetnek.  
T á p o l d a t o k  
A túlélő sejtek és a mitotikus rekombináció gyakoriságának 
meghatározásához a megfelel ő tenyésztési tápoldatokat kell alkal ­
mazni.  
P o z i t í v é s n e g a t í v k o n t r o l l o k h a s z n á l a t a  
Pozitív, kezeletlen és oldószeres kontrollokat egyidej űleg kell alkal ­
mazni. Minden egyes rekombinációs végponthoz a megfelel ő pozitív 
kontrollvegyül eteket kell használni.  
E x p o z í c i ó s k o n c e n t r á c i ó  
A vizsgált anyagnak legalább öt, egyenletesen elosztott koncentráci ­
óját kell alkalmazni. A figyelembe veend ő tényezők közé tartozik a 
citotoxicitás és az oldhatóság. A legalacsonyabb koncentráció nem 
befolyásolhatja a sejtek életképességét. Mérgez ő anyagoknál a legna ­
gyobb vizsgált koncentráció nem csökkentheti a túlélési arányt 5–10 %-ot meghaladó mértékben. Vízben viszonylag rosszul oldódó anyagokat a megfelel ő eljárások alkalmazásával oldhatóságuk 
határáig kell vizsgálni. A vízben jól oldódó és nem mérgez ő anyagok 
felső koncentrációját esetenként kell meghatározni.
 
A sejteket nyugalmi, nem osztódó állapotban vagy osztódáskor kell a 
vizsgált anyaggal legfeljebb 18 órán keresztül kezelni. Mindazonáltal a hosszú kezelési id ők alatt a sejtkultúrát mikroszkóppal kell vizs ­
gálni, hogy nem képz ődtek-e spórák, amelyek jelenléte érvénytelenné 
teszi a vizsgálatot.
 
I n k u b á c i ó s k ö r ü l m é n y e k  
A lemezeket négy-hét napig 28–30  o C hőmérsékleten, sötétben kell 
inkubálni. A mitotikus átkeresztez ődés révén képz ődött vörös és 
rózsaszín homozigóta szektorok kimutatására használt lemezeket 
még további egy vagy két napig kell h űtve (körülbelül 4  o C-on) 
tartani a számlálás el őtt a megfelel ő, pigmentált telepek kifejl ődése 
érdekében.  
S p o n t á n m i t o t i k u s r e k o m b i n á c i ó s g y a k o r i s á g  
Általánosan elfogadott, normál spontán mitotikus rekombinációs 
gyakorisággal rendelkez ő szubkultúrákat kell használni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
A l e m e z e k s z á m a  
A génmutáció révén keletkezett prototrófok, illetve a sejtéletképesség 
vizsgálatára valamennyi koncentráció esetében legkevesebb három lemezt kell egyidej űleg alkalmazni. A mitotikus átkeresztez ődés 
által létrehozott recesszív homozigózis vizsgálatakor azonban meg 
kell növelni a lemezek számát, hogy megfelel ő mennyiség ű telepet 
kapjunk.
 
A kísérlet végrehajtása  
A S.cerevisiae  törzsek kezelését rendszerint folyékony közeges eljá ­
rással kell végezni, amely stabil vagy növekedési fázisban lev ő 
sejteket alkalmaz. Az induló vizsgálatokat osztódó sejteken kell 
végezni: folyamatos rázás mellett 1-5 × 10  7 sejt/ml koncentrációjú 
élesztőgombát kell kezelni a vizsgált anyaggal legfeljebb 18 órán át, 
28–37  o C hőmérsékleten; ha szükséges, a megfelel ő mennyiségben 
anyagcsere-aktiváló rendszert is adunk hozzá kezelés közben.  
A kezelés végén a sejteket centrifugálni kell, ki kell mosni, és 
megfelelő táptalajon szét kell teríteni. Inkubáció után a lemezeken 
meg kell számolni a túlél ő sejteket és a génmutáció kialakulását.  
Ha az els ő vizsgálat negatív eredményt ad, egy második meghatá ­
rozást is kell végezni, stabil, nem osztódó sejtek felhasználásával. Ha 
az első vizsgálat pozitív, azt egy megfelel ő független kísérlettel kell 
megerősíteni.  
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, megadva a 
megszámolt telepek számát, a rekombinánsok számát, a túlélési arányt és a rekombinációs gyakoriságot.
 
Valamennyi eredményt független vizsgálatokkal kell meger ősíteni.  
Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell értékelni.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a felhasznált törzs,  
— a vizsgálat körülményei: stabil, nem osztódó állapotú vagy 
osztódó sejtek, a tápfolyadékok összetétele, az inkubációs h őmér­
séklet és id őtartam, az anyagcsere-aktiváló rendszer,  
— kezelési körülmények: koncentrációk, a kezelési eljárás és id őtar­
tama, a kezelési h őmérséklet, a pozitív és negatív kontrollok,  
— a megszámolt telepek mennyisége, a rekombinánsok száma, a 
túlélési arány és a rekombinációs gyakoriság, a dózis-hatás össze ­
függés, ha alkalmas, az adatok statisztikai értékelése,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENITÁS –  IN VITRO  GÉNMUTÁCIÓ-VIZSGÁLAT 
EMLŐSSEJTEKEN  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 476-nak,  in vitro  génmutáció- 
vizsgálat eml őssejteken (1977).  
1.1. BEVEZETÉS  
Az in vitro  génmutáció-vizsgálat eml őssejteken kémiai anyagok által 
előidézett génmutációk észlelésére használható. Alkalmas sejtvonalak 
például az L5178Y egér limfomasejtek, a CHO, CHO-AS52-es és V79-es kínai hörcsög sejtvonalak és a TK6-os emberi limfoblasztoid törzsek (1). E törzsekben a legáltalánosabban használt genetikai 
végpontok a mutációt a timidin kinázban (TK) hipoxantin-guanin 
foszforibozil-transzferázban (HPRT) és a xantin-guanin foszforibo ­
zil-transzferáz (XPRT) transz-génjében mérik. A TK, HPRT és XPRT mutáció vizsgálatok a genetikai események különböz ő spekt­
rumát észlelik. A TK és XPRT autosom helye lehet ővé teheti az X- 
kromoszómákon a HPRT helyen nem észlelt genetikai események (például nagy delíciók) észlelését (2), (3), (4), (5), (6).
 
Az emlőssejteken végzett  in vivo  sejt génmutáció vizsgálatban 
megállapodott sejtvonalak és törzsek tenyészetei használhatók. A felhasznált sejtek a tenyészetben való növekedési képesség és a 
spontán mutációs gyakoriság stabilitása alapján kerülnek kivá ­
lasztásra.
 
Az in vitro  végrehajtott vizsgálatokhoz rendszerint a metabolikus 
aktiválás valamilyen exogén forrásának használata szükséges. E metabolikus aktiváló rendszer nem tudja teljes mértékben utánozni 
az emlős in vivo  körülményeket. Ki kell sz űrni azon körülményeket, 
amelyek fennállása esetén olyan pozitív eredmények születnek, amelyek nem tükrözik a bels ő mutációt el őidéző képességet és való ­
színűleg a pH, ill. az ozmolalitás változásából vagy a magas citoto ­
xicitási szintb ől származnak (7).
 
E vizsgálat azon anyagok kisz űrésére használható, amelyek mutációt 
idézhetnek el ő és rákot okozhatnak eml ősállatok esetében. Az e vizs ­
gálatban pozitív eredményt adó számos vegyület eml ősállatok 
esetében rákkelt ő vegyület; azonban nincs tökéletes korreláció az 
itt ismertetett vizsgálat és a rákkelt ő képesség között. A korreláció 
függ a vizsgált anyag kémiai osztályától és egyre több bizonyíték 
van arra, hogy léteznek olyan karcinogén anyagok, amelyeket e vizs ­
gálat nem észlel, mivel úgy t űnik, hogy más, nem genotoxikus 
mechanizmusokon keresztül vagy olyan mechanizmusokon keresztül 
fejtik ki a hatásukat, amelyek nincsenek jelen baktériumokban (6).  
Lásd még az Általános bevezetés B részét is.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Előre/oda (forward) mutáció : a mutáns alak szül őktől származó 
típusától eltér ő olyan génmutáció, amely a kódolt protein enzimakti ­
vitásának változását vagy elvesztését eredményezi.  
Báziscserét okozó mutagének : azok az anyagok, amelyek egy vagy 
több bázispár szubsztitúcióját okozzák a DNS-ben.  
Frameshift mutagének : azok az anyagok, amelyek egy vagy több 
bázispár addícióját vagy delícióját okozzák a DNS molekulához vagy 
molekulából.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fenotípusos expressziós id ő: z az id őtartam, amely során a meg 
nem változott (eredeti) géntermékek kiürülnek az újonnan mutálódott 
sejtekből. 
Mutációs gyakoriság : a megfigyelt mutáns sejtek aránya az élet ­
képes sejtek számával osztva.  
Relatív össznövekedés : a sejtek számának növekedése az id ő függ­
vényében a sejtek kontrollpopulációjával összehasonlítva; ez a 
negatív kontrollhoz viszonyított szuszpenziós növekedés és a negatív 
kontrollhoz viszonyított klónképz ő készség szorzata.  
Relatív szuszpenziós növekedés : a sejtszám növekedése az expres ­
siós időtartam során a negatív kontrollhoz viszonyítva.  
Életképesség : a kezelt sejtek klónozási hatékonysága szelektív körül ­
mények között, szelektív médiumba való leültetés idején, az expresz ­
sziós időszak után.  
Túlélési ráta : a kezelt sejtek klónképz ő készsége a kezelési id őszak 
végén; a túlélést rendszerint a kontroll sejtpopuláció túléléséhez 
viszonyítva fejezik ki.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A TK  +/– > TK  –/– mutáció miatt timidin kináz deficiens sejtek ellen ­
állnak a pirimidin bázisanalóg trifluoro-timidin (TFT) citotoxikus 
hatásainak. A timidin-kináz proficiens sejtek érzékenyek a TFT-re, ami a celluláris metabolizmus gátlását okozza, és megállítja a további sejtosztódást. Így tehát a mutáns sejtek képesek sejtburjánzásra TFT 
jelenlétében, míg a normál sejtek, amelyek timidin-kinázt tartalmaz ­
nak, nem képesek erre. Ehhez hasonlóan, a HPRT vagy XPRT defi ­
ciens sejtek 6-thioguaninnal (TG) vagy 8-azaguaninnal (AG) szem ­
beni rezisztencia alapján választhatók ki. A vizsgált anyag tulajdon ­
ságait gondosan szemügyre kell venni, ha bázisanalógot vagy a 
szelektív ágenshez hasonló vegyületet vizsgálunk az eml őssejt 
génmutáció vizsgálatok valamelyikében. Például megvizsgáljuk a vizsgált anyag által gyaníthatóan okozható szelektív toxicitást a 
mutáns és nem mutáns sejtek tekintetében. Így kell meger ősíteni a 
kiválasztó rendszer/hatóanyag megfelel őségét a szelektív ágenshez 
szerkezetileg hasonló kémiai anyagok vizsgálatakor (8).
 
Szuszpenzióban vagy egy rétegben növ ő tenyészetben (monolayer) 
lévő sejteket kezelünk a vizsgált anyaggal, metabolikus aktiválással 
és anélkül, megfelel ő időtartamig, a citotoxicitás meghatározására és 
a fenotipusos expresszió lehet ővé tételére a mutáns kiválasztása el őtt 
(9), (10), (11), (12), (13). A citotoxicitást rendszerint a kezelési 
időtartam után a tenyészetek relatív klónképz ő készségnek (túlélési 
ráta) vagy relatív össznövekedésnek mérésével lehet meghatározni. A kezelt tenyészeteket elegend ő időtartamig, amely a kiválasztott loku ­
szok és sejttípusok jellemz ője, tartjuk a tápfolyadékban az el őidézett 
mutációk közel optimális fenotipusos expressziójának lehet ővé téte­
lére. A mutációs gyakoriságot úgy határozzuk meg, hogy leültetünk ismert számú sejtet a szelekciós ágenst tartalmazó tápfolyadékba a 
mutáns sejtek kimutatására, valamint a szelekciós ágenst nem tartal ­
mazó tápfolyadékban lév ő ismert számú sejtre a klónképz ő készség 
(életképesség) meghatározására. Megfelel ő inkubációs id ő után 
megszámolják a telepeket. A mutációs gyakoriságot a szelektív 
médiumban lév ő mutáns telepek és a nem szelektív táptalajban 
lévő telepek számából határozzák meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  Sejtek  
Különböz ő sejttípusok állnak rendelkezésre e vizsgálathoz, ilyenek 
például az L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 vagy TK6-os sejtek 
szubklónjai. Az e vizsgálatban használt sejttípusoknak bizonyítottan érzékenyeknek kell lenniük a kémiai mutagén anyagokra, magas klónképző készséggel és alacsony spontán mutációs gyakorisággal 
kell rendelkezniük. A sejteket ellen őrizni kell mikoplazma-szeny ­
nyeződés szempontjából, és nem szabad használni azokat, ha 
szennyezettek.
 
A vizsgálatot úgy kell megtervezni, hogy el őre meghatározott érzé ­
kenységű és hatásosságú legyen. A sejtek számának, tenyészeteknek 
és a használt vizsgált anyag koncentrációinak e meghatározott para ­
métereket kell tükrözniük (14). A kezelést túlél ők és az e vizs ­
gálatban az egyes szakaszokban használt életképes sejtek minimális számának a spontán mutációs gyakoriságon kell alapulnia. Általános 
iránymutatás, hogy olyan sejtszámot kell használni, amely legalább 
10-szerese a spontán mutációs gyakoriság inverzének. Azonban aján ­
latos legalább 10
 6 sejt használata. A használt sejtrendszerre vonat ­
kozó megfelel ő történeti adatoknak kell rendelkezésre állniuk a vizs ­
gálat ellentmondásmentességének igazolására.  
1.4.1.2.  Tápfolyadék és tenyésztési körülmények  
Megfelelő tápfolyadékot és inkubációs körülményeket (tenyészt ő 
edények, h őmérséklet, CO  2 -koncentráció és páratartalom) kell bizto ­
sítani. A tápfolyadékot az e vizsgálatban használt szelekciós rend ­
szereknek és sejttípusnak megfelel ően választják ki. Olyan inkubá ­
ciós körülményeket kell létrehozni, hogy biztosítva legyen a sejtek növekedése az expressziós id őszak során és mind a mutáns, mind a 
nem mutáns sejtek kolóniaképzése optimális legyen.
 
1.4.1.3.  Tenyészetek el őkészítése  
A sejteket törzstenyészetekr ől kell felszaporítani, leültetni tápfolya ­
dékba és 37  o C hőmérsékleten inkubálni. A tenyészeteket, miel őtt e 
vizsgálatban felhasználnák, lehet hogy meg kell tisztítani az el őze­
tesen már létez ő mutáns sejtekt ől. 
1.4.1.4.  Metabolikus aktiválás  
A sejteket a vizsgált anyaggal kezelik, mind megfelel ő metabolikus 
aktiváló rendszer jelenlétében, mind anélkül. A legáltalánosabban használt rendszer a kofaktorral kiegészített posztmitokondriális frakció (S9), amelyet enziminducerrel, ilyen például az Aroclor 
1254 (15), (16), (17), (18), vagy a fenobarbiturát és β-naftoflavon 
(19), (20) kombinációjával kezelt rágcsálók májából készítettek.
 
A posztmitokondriális frakciót rendszerint 1–10 térfogatszázalék 
koncentráció tartományban használják a végtérfogatban. Valamely metabolikus aktiváló rendszer kiválasztása és állapota függhet a vizs ­
gálatra kerül ő kémiai anyag osztályától. Meghatározott esetekben 
megfelelőnek bizonyulhat a posztmitokondriális frakció egynél több 
koncentrációjának használata.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Számos fejlesztés, beleértve a speciális aktiváló enzimeket eltávolító, 
genetikailag szerkesztett törzsek létrehozását is, biztosíthatja az 
endogén aktiválás lehet őségét. A használt törzsek kiválasztását tudo ­
mányosan indokolni kell (például a vizsgált anyag anyagcseréjéhez a citokróm P450-es izoenzim alkalmazásának relevanciájával).
 
1.4.1.5.  A vizsgált anyag/el őkészítés  
A szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni 
megfelelő oldószerekben, vagy ha szükséges, hígítani kell a bakté ­
rium kezelése el őtt. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül 
hozzáadhatók a vizsgált rendszerekhez és/vagy hígíthatók kezelés előtt. Friss készítményeket kell használni, kivéve ha a stabilitási 
adatok a tárolás elfogadhatóságát jelzik.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer  
Oldószerként nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan 
kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal, és összeegyeztethet őnek 
kell lennie a baktérium túlélésével és az S9-es aktivitással. Ha a jól ismert oldószert ől eltérő oldószereket használnak, ezek haszná ­
latát alá kell támasztani a kompatibilitásukat jelz ő adatokkal. Els ő­
ként valamilyen vizes oldószer használatát kell megfontolni. Vízben instabil anyagok vizsgálatakor a használt szerves oldószereknek 
vízmenteseknek kell lenniük. A víz valamilyen molekulasz űrő alkal­
mazásával távolítható el.
 
1.4.2.2.  Expozíciós koncentrációk  
A legnagyobb koncentráció meghatározásakor megfontolandó krité ­
riumok közé a következ ők tartoznak: citotoxicitás, a vizsgálati rend ­
szerben való oldhatóság és pH-érték vagy ozmolalitás változások.  
A citotoxicitást a f ő kísérletben metabolikus aktiválással és anélkül 
határozzák meg a sejtintegritás és szaporodás olyan megfelel ő muta­
tóinak segítségével, mint például a relatív klónképz ő készség (túl ­
élési ráta) vagy a relatív össznövekedés. Hasznosnak bizonyulhat a citotoxicitás és az oldékonyság meghatározása el őzetes kísérletben.
 
Legalább négy elemezhet ő koncentrációt kell használni. Ahol létezik 
citotoxicitás, e koncentrációknak át kell fogniuk egy a maximálistól a 
már csak kissé vagy az egyáltalán nem toxikusig terjed ő tartományt; 
ez rendszerint azt fogja jelenteni, hogy a koncentrációszinteket nem nagyobb, mint egy 2 és √10 közötti tényez ő választja el egymástól. 
Ha a legnagyobb koncentráció a citotoxicitáson alapul, ennek körül ­
belül 10–20 % (de nem kevesebb, mint 10 %) relatív túlélést (relatív klónképző készséget) vagy relatív össznövekedést kell eredményez ­
nie. Viszonylag nem citotoxikus anyagok esetében a legnagyobb 
vizsgált koncentrációnak 5 mg/ml-nek, 5 μl/ml-nek vagy 1,01 M- 
nak, amelyik ezek közül a legkisebb, kell lennie.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
A rosszul oldódó anyagokat a tenyésztési körülmények melletti oldé ­
konyságuk határáig vagy azon túl kell vizsgálni. Meg kell határozni 
az oldhatatlanság bizonyítékát abban a végs ő kezelési médiumban, 
amely hatásainak a sejtek ki vannak téve. Hasznosnak bizonyulhat az oldékonyság értékelése a kezelés kezdetén és végén, mivel az oldé ­
konyság változhat a vizsgálati rendszerben az expozíció során a 
sejtek, S9, és a szérum stb. jelenléte miatt. Az oldódás hiánya szabad szemmel észlelhet ő. A kicsapódás nem befolyásolhatja az értékelést.
 
1.4.2.3.  Kontrollanyagok  
Minden kísérletben negatív és pozitív (oldószer/viv őanyag) kontroll ­
anyagot használnak egyidej űleg, metabolikus aktiválással és anélkül. 
Metabolikus aktiválás alkalmazásakor a pozitív kontroll kémiai anyagnak olyannak kell lennie, amely a mutagén reakció kiváltá ­
sához aktiválást igényel.
 
A következ ő pozitív kontrollanyagok jöhetnek szóba:  
Aktivációs körülmé ­
nyek Lokusz Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Exogén metabo ­
likus aktiválás 
nélkül HPRT Etil-metán-szulfonát 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozo-karbamid 759-73-9 212-072-2 
TK (kicsi és 
nagy telepek) Metil-metán-szulfonát 66-27-3 200-625-0 
XPRT Etil-metán-szulfonát 62-50-0 200-536-7 
N-etil-N-nitrozo-karbamid 759-73-9 212-072-2 
Exogén metabo ­
likus aktiválással HPRT 3 -Metil -kol antrén 56-49-5 200-276-4 
N-nitrozo-dimetil-amin 62-75-9 200-549-8 
7,12-Dimetil-benz[a]antracén 57-97-6 200-359-5 
TK (kicsi és 
nagy telepek Ciklofoszfamid 50-18-0 200-015-4 
Ciklofoszfamid monohidrát 6055-19-2 Benz[a]pirén 50-32-8 200-028-5 3 -Metil -kol antrén 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-nitrozo-dimetil-amin (magas 
S9-es szintekhez) 62-75-9 200-549-8 
Benz[a]pirén 50-32-8 200-028-5
 
Használhatók más megfelel ő pozitív kontroll referenciaanyagok, 
például ha valamely laboratórium rendelkezik 5-Bróm 2'-dezoxi- 
uridinre vonatkozó (Cas-száma 59-14-3, Einecs-száma 200-415-9) történeti adatbázissal, e referenciaanyag is használható. Azon pozitív kontroll kémiai anyagok használatát is meg kell fontolni, amelyek a 
vizsgált anyaggal azonos kémiai osztályba tartoznak, ha rendelke ­
zésre állnak ilyenek.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Használni kell negatív kontrollanyagokat, amelyek csak oldószert 
vagy viv őanyagot tartalmaznak a kezelési médiumban, és a keze ­
lésük ugyanolyan módon történik, mint a kezelt csoportoké. Ezen ­
kívül nem kezelt kontrollokat is használni kell, kivéve, ha léteznek olyan történeti kontrolladatok, amelyek azt mutatják, hogy semmi ­
lyen káros vagy mutagén hatása nincs a kiválasztott oldószernek.
 
1.4.3.  A kísérlet végrehajtása  
1.4.3.1.  Kezelés a vizsgált anyaggal  
A proliferáló sejteket kezelni kell a vizsgált anyaggal, mind metabo ­
likus aktiválással, mind anélkül. Az expozíciónak alkalmas id őtar­
tamig kell tartania (ez rendszerint 3–6 óra). Az expozíciós id ő kiter­
jedhet egyetlen vagy több sejtciklusra.  
Minden egyes vizsgált koncentrációhoz két párhuzamos vagy egy 
(szimpla) kezelt tenyészet használható. Szimpla tenyészetek haszná ­
latakor meg kell növelni a koncentrációk számát az elemzéshez 
megfelelő számú tenyészet biztosítása érdekében (legalább 8 elemez ­
hető koncentráció létezzen). Két párhuzamos negatív (oldószer) kont ­
rolltenyészetet kell használni.  
Gázok vagy illékony anyagok megfelel ő módszerekkel, például 
légmentesen zárt edényekben vizsgálhatók (21), (22).  
1.4.3.2.  A túlélési ráta, az életképesség és mutációs gyakoriság meghatá ­
rozása  
Az expozíciós id őszak végén a sejteket le kell mosni, begy űjteni és 
leültetni a klónképz ő készség meghatározása és a mutáns fenotípusok 
eltávolításának érdekében. A citotoxicitás mérését a tenyészetek relatív klónképz ő készségének (túlélési ráta) vagy a relatív össznöve ­
kedésének meghatározásával, rendszerint a kezelési id őtartam után 
kell megkezdeni.
 
Minden egyes lokusznak szüksége van egy meghatározott minimális 
időre az újonnan indukált mutánsok közel optimális fenotípusos 
kifejlődéséhez (a HPRT és XTRT legalább 6–8 napot és a TK 
legalább 2 napot igényel). A sejteket szelektív ágenst tartalmazó 
tápfolyadékban kell tenyészteni a mutánsok számának, illetve a klón ­
képző készség hatékonyságának meghatározása céljából. Az életké ­
pesség (amelyet a mutációs gyakoriság kiszámítására használunk) mérése az expressziós id ő végén kezd ődik nem szelektív médiumba 
való ültetéssel.
 
Ha a vizsgált anyag az L5178Y TK  +/– vizsgálatban pozitív ered ­
ményt ad, telepméretmegállapítást kell végezni a vizsgált tenyészetek 
közül legalább egynél (a legnagyobb pozitív koncentrációnál) és a negatív és pozitív kontrolloknál. Ha a vizsgált anyag az L5178Y TK
 +/– vizsgálatban negatív eredményt ad, a telepméret-megállapítást 
a negatív és pozitív kontrollokon kell végrehajtani. A TK6TK  +/– -t 
használó vizsgálatokban is végrehajtható telepméret megállapítás.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Meg kell adni a citotoxicitást és az életképességet, telepszámokat és 
mutációs gyakoriságot a kezelt és kontrolltel epek tekintetében. Ha 
az L5178Y TK  +/– vizsgálat pozitív eredményt ad, a telepeket a kis és 
nagy telepek kritériuma segítségével értékelik a vizsgált anyag legalább egy koncentrációja (legnagyobb pozitív koncentráció) mellett és a negatív és pozitív kontroll esetében. Már részletesen 
megvizsgálták mind a nagy, mind a kis telepmutánsok molekuláris 
és citogenetikus természetét (23) (24). A TK
 +/– vizsgálatban a tele ­
peket a normálisan növekv ő (nagy) és lassan növekv ő (kis) telepek 
kritériuma segítségével értékelik (25). A jelent ős mértékű genetikai 
károsodást szenvedett mutáns sejtek esetében meghosszabbodtak a kétszerezési id ők, és így ezek kis telepeket alkotnak. E károsodás 
jellemzően a teljes génveszteségekt ől a kariotípusosan felismerhet ő 
kromoszóma-rendellenességekig terjed. A kis telepmutánsok létre ­
jötte nagymérték ű kromoszóma-rendellenességeket el őidéző kémiai 
anyagokkal volt kapcsolatos (26). A kevésbé súlyosan érintett mutáns sejtek a szül ősejtekhez hasonló ütemben növekednek és 
nagy telepeket alkotnak.
 
Meg kell adni a túlélési rátát (relatív klónképz ő készség) vagy a 
relatív össznövekedést. A mutációs gyakoriságot a mutáns sejtek 
száma és a túlél ő sejtek száma hányadosaként kell kifejezni.  
Fel kell jegyezni az egyes tenyészetek adatait. Ezen adatokat táblázat 
formájában kell összefoglalni.  
A nyilvánvalóan pozitív reakció igazolása nem szükséges. A több ­
féleképpen magyarázható eredményeket további, lehet őleg a kísérleti 
körülmények módosításával végrehajtott vizsgálattal kell tisztázni. A negatív eredményeket külön kísérletekkel kell meger ősíteni. Azon 
esetekben, ahol nem tekintik szükségesnek a negatív eredmények 
megerősítését, meg kell indokolni e döntést. Megfontolandó az 
utólagos ellen őrző kísérletekben a vizsgált körülmények tartomá ­
nyának kiterjesztése érdekében a vizsgálati paraméterek módosítása. A módosítható vizsgálati paraméterek, többek között, a koncentráció 
intervallumok és a metabolikus aktiválás.
 
2.2. EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározá ­
sára, ilyen például a mutációs gyakoriság koncentrációval kapcso ­
latos növekedése vagy reprodukálható növekedése. El őször meg 
kell vizsgálni az eredmények biológiai jelent őségét. Statisztikai 
módszerek használhatók a vizsgálati eredmények kiértékelésének elősegítésére. Valamely pozitív reagálás tekintetében nem szabad, 
hogy a statisztikai szignifikancia legyen az egyetlen meghatározó 
tényező.
 
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételjük 
meg a kísérletet.  
Az emlős in vitro  sejt génmutáció vizsgálatból kapott pozitív ered ­
mények azt jelzik, hogy a vizsgált anyag génmutációkat idéz el ő a 
felhasznált, tenyésztett eml őssejtekben. A reprodukálható pozitív 
koncentráció-hatás viszonynak van a legnagyobb jelent ősége. A 
negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati körülmények között 
a vizsgált anyag nem idéz el ő génmutációkat a felhasznált, tenyész ­
tett emlőssejtekben.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Sejtek:  
— sejtek típusa és eredete,  
— sejttenyészetek száma,  
— passzálások száma, ha van ilyen,  
— sejttenyészet fenntartásának módszerei, ha van ilyen,  
— micoplazma hiánya.  
Vizsgálati körülmények:  
— koncentrációk és tenyészetek száma kiválasztásának indoklása, 
beleértve például a citotoxicitási adatokat és az oldékonysági 
határokat, ha rendelkezésre állnak,  
— tápfolyadék összetétele, CO  2 -koncentráció,  
— a vizsgált anyag koncentrációja,  
— az oldószer és a hozzáadott vizsgált anyag mennyisége,  
— inkubációs h őmérséklet,  
— inkubációs id ő, 
— kezelés id őtartama,  
— sejtsűrűség a kezelés id őtartama alatt,  
— metabolikus aktiváló rendszer típusa és összetétele, az elfogad ­
hatósági kritériumot is ideértve,  
— pozitív és negatív kontrollok,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— expressziós id őtartam hosszúsága (beleértve a leültetett sejtek 
számát, szubtenyészeteket és tápfolyadékok cseréjét),  
— szelekciós ágens,  
— kritériumok, amelyek eldöntik, hogy a vizsgálatok pozitívnak, 
negatívnak vagy többféleképpen magyarázhatónak tekintend ők-e, 
— az életképes és mutáns sejtek számának megállapítására használt 
módszerek,  
— azon telepek meghatározása, amelyek méretét és típusát figye ­
lembe vettük (beleértve a „kis” és „nagy” telepekre vonatkozó kritériumokat is).
 
Eredmények:  
— toxicitás jelei,  
— kicsapódás jelei,  
— a kezelési médium pH-jára és ozmolalitására vonatkozó adatok, 
ha ezek meghatározásra kerültek,  
— telepméret, ha kiértékelésre került legalább a pozitív és negatív 
kontrollok esetében,  
— a laboratórium alkalmassága a kis telepmutánsok észlelésére az 
L5178Y TK  +/– rendszerrel, ahol szükséges,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzés, ha van ilyen,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív 
kontroll adatai,  
— történeti negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív kontroll adatok, 
tartományokkal, átlagértékekkel és standard eltérésekkel.  
— mutációs gyakoriság.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, 
K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
 
(2) Chu, E. H. Y. and Mailing H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
61, pp. 1306-1312  
(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, 
Mutation Res. 94, pp. 467-485  
(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfi ­
eld, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 
4, pp. 394-403  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128  
(6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G, Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312., pp. 235-239
 
(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R, Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavo ­
urnin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells 
in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, pp. 225-251
 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections 
Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36
 
(10) Li. A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. V., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine 
Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res,. 189, pp. 135-141
 
(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A 
Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT 
Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences 
are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res. 216, pp. 9-17
 
(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal., K. R. and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res. 160, pp. 133-147
 
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure 
for the L5178Y/TK  +/– -TK  +/– Mouse Lymphoma Cell Mutage ­
nicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Muta ­
genicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New 
York, pp. 239-268  
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based Upon Colony Forma ­
tion, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirk ­
land, D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101  
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R.., Loprieno, 
N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373
 
(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, 
pp. 347-364  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK  +/– – Mouse Lymphoma Mutagen Assay 
System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108  
(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113. 
pp. 173-215  
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G, Gibson, G. G, Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in:  In vitro  Genoto­
xicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177
 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in:  In vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J. Fouts, 
J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds). Elsevier, North 
Holland, pp. 85-88
 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Ticce, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. 
(eds), Genotoxic Effects of Airbone Agents, New York, 
Plenum, pp. 91-103  
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagene ­
sis, 5, pp. 795-801  
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B. Burrell, A. and 
Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87, pp. 51-55  
(24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, 
A. G, Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Truf ­
luoronthymidine, Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- 
Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174  
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), 
Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation 
Res. 229, pp. 89-102
 
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/– – 3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNS-KÁROSODÁS ÉS -REPARÁCIÓ – NEM TERVEZETT 
DNS-SZINTÉZIS (UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS, UDS) – 
EMLŐSSEJTEK  IN VITRO  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A nem szabályszer ű DNS-szintézis- („unscheduled DNA synthesis”, 
UDS) vizsgálat a kémiai vagy fizikai hatással indukált károsodás 
területéről kimetszett és eltávolított DNS-szakasz helyreállításához 
szükséges DNS-szintézist vizsgálja. A meghatározás alapja a tríci ­
ummal jelölt timidin (  3 H-TdR) beépülése olyan eml őssejtek DNS- 
molekuláiba, amelyek nem a sejtciklus S fázisában vannak. A  3 H- 
TdR felvétele a kezelt sejtek DNS-molekuláiba autoradiográfiás tech ­
nikával vagy folyadékszcintillációval (LSC = liquid scintillation counting) mérhet ő. Azt az esetet kivéve, amikor primer patkány 
máj sejtet alkalmaznak, a kultúrában tenyésztett eml őssejteket 
exogén anyagcsere-aktiváló rendszer jelenlétében, illetve hiányában 
kezelik a vizsgált anyaggal. Az UDS folyamata  in vivo  rendsze­
rekben is mérhet ő.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
A vizsgált anyagokat, a kontroll-, illetve a referenciaanyagokat a 
sejtek kezelését megel őzően tápfolyadékban kell el őkészíteni, vagy 
a megfelel ő vivőanyagban feloldani, illetve szuszpendálni, majd a 
tápfolyadékban tovább hígítani a vizsgálathoz használatos mértékben. A vivőanyag végs ő koncentrációja a kultúrában nem befolyásolhatja 
a sejtek életképességét.
 
A vizsgálathoz patkánymájsejtek, illetve emberi limfociták primer 
kultúrái vagy stabil sejtvonalak (például emberi diploid fibroblasz ­
tok) használhatók.  
A sejteket a vizsgált vegyület hatásának megfelel ő emlősanyagcsere- 
aktiváló rendszer jelenlétében és hiányában is ki kell tenni.  
Vizsgálati körülmények  
A k u l t ú r á k s z á m a  
Legalább két kultúra kell minden vizsgálati ponton az autoradiogá ­
fiás mérésekhez és hat kultúra (vagy ennél kevesebb, ha tudomá ­
nyosan megindokolható) az LSC UDS-meghatározáshoz.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
P o z i t í v é s n e g a t í v k o n t r o l l o k h a s z n á l a t a  
Minden vizsgálathoz alkalmazni kell egyidej űleg pozitív és negatív 
(kezeletlen és/vagy viv őanyag-) kontrollt, metabolikus aktiválással és 
a nélkül.  
A patkánymájsejt-vizsgálat pozitív kontrolijai sorában említend ő a 
7,12-dimetil-benzantracén (7,12-DMBA), illetve a 2-acetilamin- 
fluorén (2-AAF). Stabil sejtvonalak használata esetén a 4-nitrokino ­
lin-N-oxid (4-NQO) lehet példa a pozitív kontrollra mind az auto ­
radiográfiás, mind a folyadékszcintillációs módszer számára metabo ­
likus aktiválás nélkül; ha metabolikus aktiválórendszereket is alkal ­
mazunk, az N-dimetil-nitrózamin lehet a pozitív kontroll.  
E x p o z í c i ó s k o n c e n t r á c i ó  
A vizsgált anyagnak több, egyenletesen elosztott koncentrációját kell 
alkalmazni. A legnagyobb vizsgált koncentráció bizonyos fokú cito ­
toxicitást kell, hogy mutasson. Vízben viszonylag rosszul oldódó 
anyagokat a megfelel ő eljárások alkalmazásával oldhatóságuk 
határáig szükséges vizsgálni. A vízben jól oldódó és nem mérgez ő 
anyagok fels ő koncentrációját esetenként kell meghatározni.  
S e j t e k  
A sejtkultúrák fenntartását a megfelel ő tápfolyadékban, CO  2 - 
koncentráció, páratartalom és h őmérséklet mellett kell végezni. A 
stabil sejtvonalakat id őnként ellen őrizni kell a Mycoplasma-szeny ­
nyeződés szempontjából.  
A n y a g c s e r e - a k t i v á l á s  
Metabolikus aktiválórendszert primer máj sejteken nem kell alkal ­
mazni. A stabil sejtvonalakat és a limfocitákat a vizsgált anyaggal 
mind a megfelel ő metabolikus aktiváló rendszer jelenlétében, mind 
annak hiányában kezelni kell.  
A kísérlet végrehajtása  
A s e j t k u l t ú r á k e l k é s z í t é s e  
Stabil sejtvonalakat kell törzstenyészetekb ől (például tripszines 
emésztéssel vagy rázassál) létrehozni, ezeket megfelel ő sűrűségben 
tenyésztőedényekbe kell áttenni, és 37  o C-on inkubálni.  
Patkánymájsejtek rövid távú tenyészeteit úgy hozzák létre, hogy a 
frissen disszociált májsejteket megfelel ő tápfolyadékban hagyják 
megtapadni a növekedési felületen.  
Emberi limfocitatenyészeteket hozunk létre a megfelel ő technikák 
alkalmazásával.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
A s e j t t e n y é s z e t e k k e z e l é s e a v i z s g á l t a n y a g g a l  
Primer patkánymájsejtek  
Frissen izolált patkánymájsejteket megfelel ő időn keresztül  3 H-TdR-t 
tartalmazó tápfolyadékban kezelik a vizsgált anyaggal. A kezelési idő végén a tápfolyadékot leszívják a sejtekr ől, amelyeket leöblíte ­
nek, fixálnak és megszárítanak. A tárgylemezeket autoradiográfiás 
emulzióba merítik (vagy filmcsíkokat is használhatunk), exponálják, előhívják, megfestik és kiértékelik.
 
Stabil sejtvonalak és limfociták  
Autoradiográfiás technikák: A sejttenyészetet a megfelel ő ideig 
kezeljük a vizsgált anyaggal, majd ezt követ ően 3 H-TdR-el. A keze ­
lési idő a vizsgált anyag jellegét ől, a metabolizáló rendszerek akti ­
vitásától és a sejtek típusától függ. Az UDS maximumának észlelé ­
séhez a vizsgált anyaggal együtt vagy néhány perccel a vizsgált 
anyag adása után  3 H-TdR-t adnak a rendszerhez. A kétféle eljárás 
közötti választás attól függ, van-e kölcsönhatás a vizsgált anyag és a  
3 H-TdR között. Az UDS és a félig konzervatív DNS-replikáció 
közötti különbségtétel érdekében az utóbbi például argininhiányos 
tápoldattal, alacsony szérumtartalommal vagy a tápoldathoz adott hidroxi-karbamiddal gátolható.
 
Az UDS folyadékszcintillációval történ ő (LSC) mérése: A vizsgált 
anyaggal való kezelést megel őzően a sejtek S fázisba lépését a fent 
leírtak szerint kell gátolni; majd az autoradiográfiás módszernél leírtak szerint kell a sejteket kezelni a vizsgált anyaggal. Az inkubá ­
ciós idő végén a DNS-t kivonják a sejtekb ől, és meghatározzák a 
teljes DNS-tartalmat, illetve a
 3 H-TdR-beépülés mértékét.  
Megjegyzend ő, hogy a fenti technikák során – ha emberi limfoci ­
tákat használnak – a nem stimulált tenyészetekben a félig konzer ­
vatív DNS-replikáció gátlása szükségtelen.  
Elemzés  
A u t o r a d i o g r á f i á s m e g h a t á r o z á s o k  
Az UDS-nek a sejttenyészetben való meghatározásához az S-fázisú 
magokat nem kell számításba venni. Koncentrációnként legalább 50 
sejtet számolnak. A tárgylemezeket számlálás el őtt kóddal látják el. 
Minden lemezen több, véletlenszer űen választott, egymástól távol 
eső látóteret számolnak meg. A  3 H-TdR beépülését a citoplazmába 
úgy határozzák meg, hogy minden megszámolt sejtben három, 
sejtmag nagyságú citoplazma-látóteret számolnak meg.  
L S C - m ó d s z e r r e l v é g z e t t m e g h a t á r o z á s o k  
Az LSC-vel végzett UDS-meghatározások során minden koncent ­
ráció és kontroll esetében megfelel ő mennyiség ű tenyészetet hasz ­
nálnak fel.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Valamennyi eredményt független vizsgálatokkal kell meger ősíteni.  
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni.  
2.1. AUTORADIOGRÁFIÁS MEGHATÁROZÁSOK  
A citoplazmában megfigyelhet ő 3 H-TdR-beépülés mértékét és a 
sejtmag felett található szemcsék számát külön kell feljegyezni.  
Átlagos, közepes és modulált értéket használhatunk a  3 H-TdR- 
citoplazma eloszlási mértékének, valamint a magonként látható szemcsék számának jellemzésére.
 
2.2. LSC-MÓDSZERREL VÉGZETT MEGHATÁROZÁSOK  
Az LSC-módszerrel végzett meghatározások esetén a  3 H-TdR- 
beépülést dpm/ μg DNS-ben fejezzük ki. Az átlagos dpm/ μg 
DNS-érték a normál szórással együtt felhasználható a beépülés 
eloszlásának leírására.  
Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell értékelni.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a felhasznált sejtek, a sejtek s űrűsége és a passzálások száma 
kezeléskor, a sejtkultúrák száma,  
— a sejtkultúrák fenntartásához használt módszerek: tápfolyadékok, 
hőmérséklet, szén-dioxidkoncentráció,  
— a vizsgált anyag, a viv őanyag, koncentrációik és a vizsgálathoz 
használt koncentrációk indokolása,  
— a felhasznált metabolikus aktiválórendszerrel kapcsolatos adatok,  
— a kezelési protokoll,  
— a pozitív és a negatív kontrollok,  
— a használt autoradiográfiás eljárás,  
— a sejtek S fázisba lépésének megakadályozására használt 
eljárások,  
— a DNS kivonására és a teljes DNS-tartalom meghatározására 
használt eljárások az LSC technika során,  
— a dózis-hatás összefüggés, ha lehetséges,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  IN VITRO  EMLŐSSEJTTESTVÉR-KROMATIDKICSERÉL Ő­
DÉS-(SISTER CHROMATID EXCHANGE, SCE) VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A testvérkromatidcsere- (SCE = Sister Chromatid Exchange) vizs ­
gálat a megkett őződő kromoszóma két testvérkromoszóma-állománya 
(kromatidja) közötti reciprok DNS-csere kimutatására szolgáló, rövid távú módszer. Az SCE technika gyakorlatilag homológ lokuszok közötti DNS-replikációs termékek cseréjét jelenti. A csere feltehet ően 
a DNS-lánc eltörését és újbóli összeforrását is magában foglalja, bár 
a jelenség molekuláris háttere kevéssé ismert. Az SCE jelenségének észleléséhez a testvérkromoszóma-állományok eltér ő jelölésére van 
szükség, amely úgy valósítható meg, hogy két sejtcikluson át 
bróm-dezoxi-uridint (BrdU) építenek be a kromoszomális DNS- molekulába.
 
Az emlőssejteket  in vitro , metabolikus aktiválórendszer jelenlétében, 
illetve a nélkül kezelik a vizsgált anyaggal, amennyiben ez 
megfelelő, majd a sejteket két replikációs cikluson keresztül 
tenyésztik BrdU-t tartalmazó tápoldatban. Az orsóképz ődést gátló 
anyaggal való kezelést (pl. kolchicin) követ ően, amely azt a célt 
szolgálja, hogy a sejteket a mitózisnak egy metafázisszer ű szaka­
szában (c-metafázis) gy űjtse össze, a sejteket összegy űjtik, és kromo ­
szómakészítményeket állítanak el ő. 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
— A vizsgálathoz primer tenyészetek (emberi limfociták) vagy stabil 
sejtvonalak (pl. kínaihörcsögpetefészek-sejtek) használhatók. A sejtvonalakat ellen őrizzük Mycoplasma-szennyez ődés szempont ­
jából.
 
— Megfelel ő tápoldatot és inkubációs feltételeket (pl. h őmérséklet, 
tenyésztőedény, CO  2 -koncentráció, páratartalom) kell biztosítani.  
— A vizsgált anyagot tápoldatban készítik el, vagy a sejtek keze ­
lését megel őzően a megfelel ő vivőanyagban oldják, illetve szusz ­
pendálják. A viv őanyag végleges koncentrációja a tápközegben 
nem befolyásolhatja jelent ős mértékben a sejtek életképességét, 
illetve szaporodását, az SCE gyakoriságára gyakorolt hatását 
pedig oldószeres kontrollal kell ellen őrizni. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— A sejteket a vizsgált vegyület hatásának megfelel ő anyagcsere- 
aktiváló rendszer jelenlétében és hiányában egyaránt ki kell tenni. 
A másik lehet őség, hogy bels ő metabolikus aktivitással rendel ­
kező sejttípusokat használnak, ám ilyenkor az aktivitás jellegét és 
mértékét ismerni kell, hogy az megfeleljen a vizsgált kémiai 
osztálynak.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
K u l t ú r á k s z á m a  
Minden vizsgálati ponthoz legalább két kultúrát kell használni.  
P o z i t í v é s n e g a t í v k o n t r o l l o k h a s z n á l a t a  
Minden vizsgálatnak pozitív kontrollként tartalmaznia kell egy 
közvetlenül ható vegyületet és egy metabolikus aktiválást igényl ő 
vegyületet is; ezenkívül negatív (viv őanyag-) kontrollt is kell 
használni.  
Néhány példa a pozitív kontrollként felhasználható anyagokra:  
— közvetlenül ható vegyületek:  
— etil-metán-szulfonát,  
— közvetve ható vegyületek:  
— ciklofoszfamid.  
Ahol szükséges, alkalmazni lehet még egy pozitív kontrollt is, amely 
a vizsgált anyaggal egyez ő vegyületosztályba tartozik.  
E x p o z í c i ó s k o n c e n t r á c i ó k  
A vizsgált anyagnak legalább három, egyenletesen elosztott koncent ­
rációját kell alkalmazni. A legnagyobb vizsgált koncentrációnak 
jelentős toxikus hatást kell kiváltania, de ezzel együtt megfelel ő 
mértékű sejtosztódást kell lehet ővé tennie. Vízben viszonylag rosszul 
oldódó anyagokat a megfelel ő eljárások alkalmazásával oldhatóságuk 
határáig kell vizsgálni. A vízben jól oldódó és nem mérgez ő anyagok 
felső koncentrációját esetenként kell meghatározni.  
1.6.3.  A kísérlet végrehajtása  
S e j t t e n y é s z e t e k k é s z í t é s e  
Stabil sejtvonalakat hoznak létre törzstenyészetekb ől (például trip ­
szines emésztéssel vagy rázassál), ezeket megfelel ő sűrűségben 
tenyésztőedényekbe teszik át, és 37  o C-on inkubálják. Egy sejtréteg ű 
(monolayer) kultúrákhoz a tenyészt őedényenkénti sejtszámot úgy 
kell beállítani, hogy a tenyésztési id őszak végén (az összegy űjtéskor) 
a sejtréteg folyamatossága ne haladja meg jelent ősen az 50 %-os 
arányt. A sejteket másik lehet őségként szuszpenziós tenyészetben is 
tarthatják. Az emberi limfocitatenyészeteket heparinnal kezelt vérb ől 
állítják el ő a megfelel ő technikával, és 37  o C-on inkubálják.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
K e z e l é s  
Az exponenciális osztódási szakaszban lév ő sejteket a vizsgált 
anyaggal megfelel ő időn keresztül kezelik; a legtöbb esetben egy 
vagy két óra elegend ő, de a kezelés bizonyos esetekben meg is 
hosszabbítható két teljes sejtciklus erejéig. A megfelel ő szintű saját 
metabolikus aktivitással nem rendelkez ő sejteket a vizsgált anyaggal 
a megfelel ő metabolikus aktiválórendszer jelenlétében, illetve a 
nélkül is kezelni kell. A kezelés végén a sejtek környezetéb ől 
kimossák a vizsgált anyagot, majd BrdU jelenlétében két replikációs 
cikluson keresztül folytatják a tenyésztést. A kezelés másik lehet ő­
sége, hogy a sejteket két teljes sejtcikluson át egyszerre kezeljük a vizsgált anyaggal és a BrdU-val.
 
Az emberi limfocitatenyészeteket akkor kezelik, amikor azok 
félszinkron állapotban vannak.  
A sejtek elemzésére a kezelést követ ő második osztódáskor kerül sor, 
így biztosítják, hogy a legérzékenyebb osztódási szakaszok során 
fejthesse ki a vegyi anyag a hatását. Minden olyan sejttenyészetet, 
amelyhez BrdU-t adtunk, sötétben vagy tompa fénynél kell tartani a tenyésztési id őszak végéig, hogy csökkentsük a BrdU-t tartalmazó 
DNS fotolízisét.
 
A s e j t e k ö s s z e g y ű j t é s e  
A tenyészeteket egy-négy órával a sejtek összegy űjtése előtt orsó­
képződést gátló vegyülettel (pl. kolchicinnel) kezeljük. Valamennyi 
tenyészetet külön-külön gy űjtjük be és dolgozzuk fel a kromoszó ­
mapreparáláshoz.  
K r o m o s z ó m a - e l ő k é s z í t é s é s - f e s t é s  
A kromoszómakészítményeket standard citogenetikai módszerekkel 
állítják el ő. A lemezek megfestése az SCE-jelenség kimutatására 
többféle technikával is elvégezhet ő (pl. fluoreszcens és Giemsa- 
festés).  
E l e m z é s  
Az elemzett sejtek számát az SCE-jelenség spontán gyakorisága 
alapján kell meghatározni. Rendszerint minden tenyészetb ől legalább 
25, jól szétterült metafázist elemeznek az SCE-k szempontjából. Az elemzéshez a tárgylemezeket kóddal látják el. Az emberi limfoci ­
tákban csak a 46 centromert tartalmazó metafázisokat elemezzük. 
Stabil sejtvonalak esetében csak a modális szám ± 2 centromert tartalmazó metafázisokat elemeznek. Fel kell tüntetni, hogy a jelzés centromerikus váltását SCE-nek vesszük-e, vagy sem. Az eredmé ­
nyeket további független vizsgálattal kell meger ősíteni.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni. Az SCE-k 
számát metafázisónként és az egyes metafázisokban kimutatható 
SCE-k számát kromoszómánként minden kezelt és kontrolltenyészet esetében külön meg kell adni.
 
Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell értékelni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a felhasznált sejtek, sejtkultúrák fenntartásának módszere,  
— a vizsgálat körülményei: a tápoldatok összetétele, a szén-dioxid- 
koncentráció, a vizsgált anyag koncentrációja, a felhasznált viv ő­
anyag, az inkubációs h őmérséklet, a kezelés id őtartama, a 
felhasznált orsóképz ődést gátló vegyület, annak koncentrációja 
és az azzal történ ő kezelés id őtartama, a felhasznált aktiválórend ­
szer, a pozitív és a negatív kontrollok,  
— a sejtkultúrák száma vizsgálati pontonként,  
— a lemezkészítéshez használt technika részletes leírása,  
— az elemzett metafázisok száma (az adatokat külön kell megadni 
minden sejtkultúrára),  
— az SCE átlagos száma sejtenként és kromoszómánként (az 
adatokat külön kell megadni minden sejtkultúrára),  
— az SCE-számolás/besorolás kritériumai,  
— a dózisok megválasztásának indokai,  
— a dózis-hatás összefüggés, ha van,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  NEMHEZ KÖTÖTT RECESSZÍV LETÁLIS VIZSGÁLAT  
DROSOPHILA MELANOGASTERBEN  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A nemhez kötött, recesszív letális (SLRL Test = sex-linked recessive 
lethal test) vizsgálat Drosophila melanogaster használatával mutációk 
jelenlétét – pont mutációkat vagy kisebb törléseket – mutatja ki a 
rovar csíravonalában. A vizsgálattal az el őrehaladó mutáció követ ­
hető, és az X kromoszóma mintegy 800 lokuszán van lehet őség a 
mutációk sz űrésére; ez az X-kromoszóma összes lokuszának mintegy 
80 %-át jelenti. Az X kromoszóma pedig a teljes haploid genom 
mintegy egyötödét képviseli.  
A Drosophila melanogaster X-kromoszómájának mutációi fenotípu ­
sosan a mutáns gént hordozó hímeken jelennek meg. Ha valamely mutáció hemizigóta állapotban halálos, annak jelenlétére a heterozi ­
góta nőstények által normál esetben kiköltött két hím osztály egyi ­
kének hiánya utal. Az SLRL-vizsgálattal különleges módon megjelölt és elrendezett kromoszómák segítségével fel lehet ismerni az említett sajátosságokat.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
T ö r z s e k  
Jól jellemzett, vad típusú törzshöz tartozó hímek és a Muller-5 elne ­
vezésű törzsből származó n őstények használhatók. Más, megfelel ően 
jelölt nőstény törzsek is használhatók, ha van többszörös inverz X- 
kromoszómájuk.  
V i z s g á l t a n y a g  
A vizsgált anyagokat vízben oldják. A vízben nem oldódó anyagokat 
a megfelel ő vivőanyagban is lehet oldani vagy szuszpendálni (pl. 
etanol és Tween-60, illetve Tween-80 keverékében), majd vízzel, 
illetve sóoldattal hígítani a beadás el őtt. A dimetil-szulfoxidot 
(DMSO) lehet őleg ne használják viv őanyagként.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
A z á l l a t o k s z á m a  
A vizsgálatot el őre meghatározott érzékenységgel és felbontóképes ­
séggel kell megtervezni. A megfelel ő kontroliban megfigyelt spontán 
mutációs gyakoriság jelent ősen befolyásolja az elemzésre szánt 
kezelt kromoszómák számát.  
A z a d a g o l á s m ó d j a  
Az anyagot szájon át, injekcióval, illetve gázzal vagy párával való 
expozíció útján adagolhatjuk. A vizsgált anyagot táplálékként cuko ­
roldatban adhatók be. Szükség esetén az anyagokat 0,7 %-os NaCl- 
oldatban is feloldhatjuk, és azt a mellkasba vagy a hasüregbe fecs ­
kendezhetjük.  
N e g a t í v é s p o z i t í v k o n t r o l l o k a l k a l m a z á s a  
Negatív (viv őanyag-) és pozitív kontrollokat is alkalmazni kell. Ha 
azonban megfelel ő történeti laboratóriumi adatok állnak rendelke ­
zésre, kontrollokra nincs szükség.  
E x p o z í c i ó s s z i n t e k  
Három expozíciós szintet kell alkalmazni. El őzetes felmérésre a vizs ­
gált anyag egyetlen koncentrációját használják, ez lehet a legnagyobb 
elviselhet ő koncentráció, vagy pedig az, amely a toxicitás bizonyos 
jeleit kiváltja. A nem mérgez ő anyagoknál a legnagyobb, gyakorla ­
tilag még megvalósítható koncentrációt használják.  
A kísérlet végrehajtása  
A vizsgált anyaggal vad típusú (három-öt napos) hímeket kezelnek, 
majd egyenként pároztatják a Muller-5 törzsb ől vagy más, megfele ­
lően jelölt törzsb ől származó sz űz nőstényekkel (a törzsekben több ­
szörös inverz X-kromoszómának kell lennie). A n őstényeket két- 
háromnaponta friss sz űz állatokra cserélik le, hogy a teljes csírasejt ­
ciklust le tudják fedni. E n őstények utódait megvizsgálják a halálos 
hatások szempontjából, amelyek megnyilvánulhatnak a kezelés alatt 
az érett spermára, a középs ő szakaszban és a kései stádiumban lév ő 
spermatidákra, a korai spermatidákra, illetve az el ősejtekre és az ős- 
ondósejtekre gyakorolt hatásban.  
A fenti keresztezésekb ől származó heterozigóta F1 n őstényeket 
engedik egyedenként párzani (vagyis csoportonként egy n őstényt) a 
testvéreikkel. Az F2 nemzedékben minden tenyészetben meghatá ­
rozzák a vad típusú hímek hiányát. Ha egy tenyészet minden jel szerint a szül ői X-kromoszómában a halálos gént hordozó F1 
nősténytől származik (vagyis egyetlen hímet sem találtak a kezelt 
kromoszómával), annak a n ősténynek az azonos genotípusú leányait 
is vizsgálni kell annak bizonyítására, hogy a letalitás megismétl ődik- 
e a következ ő generációban.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni a vizsgált X- 
kromoszómák, a terméketlen hímek, valamint a halálos kromo ­
szómák számának az egyes adagolási koncentrációknál, illetve páro ­
sítási időszakoknál az egyes kezelt hímekre történ ő bemutatásához. 
A hímenként észlelhet ő eltérő nagyságú csoportok (klaszterek) 
számát rögzíteni kell. Ezen eredményeket külön vizsgálattal is meg 
kell erősíteni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Megfelelő statisztikai módszerek alkalmazásával kell értékelni a 
nemhez kötött, recesszív halálos mutációs vizsgálatokat. Az egy 
hímtől eredő recesszív letális mutációk csoportjait a megfelel ő 
statisztikai módszerekkel kell vizsgálni és értékelni.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— törzs: a használt Drosophila törzsek és fajták, a rovarok kora, a 
kezelt hímek száma, a steril hímek száma, a létrejött F2 tenyé ­
szetek száma, a leszármazottak nélküli F2 tenyészetek száma, az egyes csírasejtstádiumokban észlelt, halálos génmutációt hordozó 
kromoszómák száma,
 
— a kezelt csoportok méretének meghatározásához használt kritéri ­
umok,  
— a vizsgálati feltételek: a kezelési és a mintavételi ütemterv rész ­
letes ismertetése, az expozíciós szintek, a toxicitási adatok, a 
negatív (oldószeres) és a pozitív kontrollok, ha szükséges,  
— a letális mutációk számlálásának kritériumai,  
— dózis-hatás összefüggés, ha van,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  IN VITRO  EML ŐSSEJT-TRANSZFORMACIÓS VIZS ­
GÁLATOK  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az emlőssejtkultúra-rendszerek felhasználhatók a rosszindulatú  in 
vivo átalakulással összefüggésbe hozott kémiai vegyületek által 
kiváltott  in vitro  fenotípusos változások kimutatására. A széles 
körben alkalmazott sejtvonalak közé tartozik a C3H10T  1/2 , a 3T3, 
az SHE, a Fischer jelzés ű patkánysejtvonal; a vizsgálatok a sejtek 
morfológiai változásain, fókuszképz ődésén vagy félszilárd agaron 
való megtelepedésiképesség-változásain alapulnak. Kevésbé széles körben használt rendszerek is léteznek, amelyek más fiziológiai 
vagy morfológiai változásokat mutatnak ki a sejtekben, a rákkelt ő 
anyagokkal történ ő kezelést követ ően. Az  in vitro  vizsgálatok 
egyetlen végpontja esetében sem bizonyított az a mechanizmus, amely a hatás és a karcinogén folyamat összefüggését magyarázza. 
Egyes vizsgálati rendszerek alkalmasak tumorpromoterek kimutatá ­
sára. A citotoxicitást a vizsgált anyagnak a kolóniaképz ő képességre 
(klónozási hatékonyság) vagy a kultúrák növekedési sebességére gyakorolt hatásával határozhatják meg. A citotoxicitás mérése azt a 
célt szolgálja, hogy megállapítsák, a vizsgált anyag adagja toxikoló ­
giailag releváns volt-e, de nem használható minden mérésnél a transzformációs gyakoriság kiszámítására, hiszen egyes vizsgálatok esetében hosszabb inkubációra és/vagy ismételt szélesztésre van 
szükség.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
S e j t e k  
Az alkalmazott transzformációs vizsgálattól függ ően számos sejt ­
vonal vagy primer sejttenyészet jöhet szóba. A vizsgálatot végz ő 
személynek biztosítania kell, hogy az elvégzend ő vizsgálat során a 
megfelelő fenotípusos változás következik be az ismert rákkelt ő 
hatású anyaggal való expozíciót követ ően, és hogy a vizsgálatot 
végző személy által vezetett kutatólaboratóriumban végzett vizsgálat 
megbízhatósága és érvényessége bizonyított és dokumentálható.  
T á p f o l y a d é k  
Olyan tápfolyadékot és vizsgálati körülményeket kell alkalmazni, 
amelyek a legjobban illenek a használt transzformációs vizsgálathoz.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
V i z s g á l t a n y a g  
A vizsgált anyagokat a sejtek kezelését megel őzően tápfolyadékban 
vagy megfelel ő vivőanyagban kell el őkészíteni vagy feloldani, illetve 
szuszpendálni. A viv őanyag végs ő koncentrációja a kultúrában nem 
befolyásolhatja a sejtek életképességét, növekedési sebességét vagy a 
transzformáció el őfordulási gyakoriságát.  
A n y a g c s e r e - a k t i v á l á s  
A sejteket a vizsgált vegyület hatásának megfelel ő anyagcsere-akti ­
váló rendszer jelenlétében és hiányában egyaránt ki kell tenni. A 
másik lehet őség, hogy bels ő metabolikus aktivitással rendelkez ő sejt­
típusokat használunk, ám ilyenkor az aktivitás jellegét és mértékét ismerni kell, hogy az megfeleljen a vizsgált kémiai osztálynak.
 
Vizsgálati körülmények  
P o z i t í v é s n e g a t í v k o n t r o l l o k h a s z n á l a t a  
Minden vizsgálatnak pozitív kontrollként tartalmaznia kell egy 
közvetlenül ható vegyületet és egy metabolikus aktiválást igényl ő 
vegyületet is; ezenkívül negatív (viv őanyag-) kontrollt is kell 
használni.  
Néhány példa a pozitív kontrollként felhasználható anyagokra:  
— közvetlenül ható vegyületek:  
— etil-metán-szulfonát,  
— béta-propiol akton,  
— közvetve ható vegyületek:  
— 2-acetoamin-fluorén,  
— 4-dimetil-amino-azo-benzén,  
— 7,12-dimetil-benzantracén.  
Ahol szükséges, alkalmazni lehet még egy pozitív kontrollt is, amely 
a vizsgált anyaggal egyez ő vegyületosztályba tartozik.  
E x p o z í c i ó s k o n c e n t r á c i ó  
A vizsgált anyag több koncentrációját kell alkalmazni. E mennyi ­
ségeknek koncentrációfügg ő mérgező hatást kell eredményezniük, 
amelyek jellemz ője, hogy a legnagyobb vizsgált koncentrációval 
alacsony túlélési arány jár, míg a legalacsonyabb koncentrációval 
kezelt csoportban a túlélés megközelít őleg megegyezik a negatív 
kontrollcsoportéval. Vízben viszonylag rosszul oldódó anyagokat a megfelelő eljárások alkalmazásával oldhatóságuk határáig szükséges 
vizsgálni. A vízben jól oldódó és nem mérgez ő anyagok fels ő 
koncentrációját esetenként kell meghatározni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
A kísérlet végrehajtása  
A sejteket a felhasznált vizsgálati rendszer függvényében megfelel ő 
ideig kezelik az anyaggal, ami adott esetben a tápfolyadék cseréjét követő ismételt adagolást jelenthet (és szükség esetén friss anyag ­
csere-aktiváló keveréket), hosszabb expozíció esetében. A szük ­
séges bels ő metabolikus aktivitással nem rendelkez ő sejteket a 
megfelelő metabolikus akti válórendszer jelenlétében, illetve 
hiányában is kezelni kell a vizsgált anyaggal. A kezelés végén a sejtek környezetéb ől kimossák az anyagot, és olyan, megfelel ő 
körülmények között tenyésztik, amelyek mellett a vizsgált, transz ­
formált fenotípus megjelenhet, és a transzformáció el őfordulási 
gyakorisága meghatározható. Valamennyi eredményt független vizsgálattal kell meger ősíteni.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely számos 
fajtát jelenthet attól függ ően, hogy milyen meghatározást végzünk, 
pl. telepszám, pozitív telepek, illetve a transzformált sejtek száma. Ahol szükséges, a túlélési arányt a kontrollértékek százalékában, a transzformációs gyakoriságot pedig a túlél ő sejtekre es ő transzfor ­
mált sejtek számának arányában kell megadni. Az eredményeket 
megfelelő statisztikai módszerrel kell értékelni.
 
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a felhasznált sejttípus, a sejtkultúrák száma, a sejtkultúrák fenn ­
tartásának módszere,  
— a vizsgálat körülményei: a vizsgált anyag koncentrációja, a 
felhasznált viv őanyag, az inkubációs id ő, a kezelés gyakorisága 
és időtartama, a sejts űrűség a kezelés alatt, a felhasznált küls ő 
anyagcsere-aktiváló rendszer, a pozitív és negatív kontrollok, a 
megfigyelt fenotípus leírása, a használt szelektív rendszer (ha 
alkalmazható), a dózisok megválasztásának indokolása,  
— az életképes és transzformált sejtek megszámlálásához használt 
módszer,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  DOMINÁNS LETÁLIS VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKON  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A domináns letális (halálos) hatások embrionális, illetve magzati 
elhalást okoznak. A domináns letális hatások indukálása azt jelzi, hogy az illet ő vizsgált anyag a vizsgált állatfaj esetében hatást 
gyakorolt a csíraszövetekre. Az általánosan elfogadott nézet szerint 
a domináns letális hatások kromoszómakárosodásra vezethet ők 
vissza (szerkezeti és számbeli rendellenességek). N őstény állatok 
kezelése esetén az embrió elpusztulása az anyag toxikus hatása miatt is bekövetkezhet.
 
Általában hím állatokat kezelnek a vizsgált anyaggal, és a kezelt 
állatokat kezeletlen sz űz nőstényekkel pároztatják. A különféle csíra ­
sejtstádiumok külön vizsgálhatók, ha egymás után következ ő pároz­
tatási időközöket alkalmazunk. Az egy n őstényre jutó élettelen, 
beágyazódott embriók számának növekedése a kezelt csoportban a kontrollcsoportban tapasztalható hasonló adathoz képest a beágya ­
zódás utáni veszteséget tükrözi. A beágyazódás el őtti veszteségeket 
a sárgatestek száma alapján vagy a kezelt és kontrollcsoportokban az összes beágyazódott embriók számának összehasonlításából lehet kiszámítani. Az összes domináns letális hatás a beágyazódás el őtti 
és utáni elhalás összegéb ől adódik. Az összes domináns letális hatás 
kiszámítása a kezelt csoportban az egy n őstényre jutó él ő, beágya­
zódott embriók számának a kontrollcsoportban egy n őstényre jutó, 
élő beágyazódott embriók számával történ ő egybevetésén alapul. A 
beágyazódott embriók számának csökkenése bizonyos id őközönként 
sejtpusztulás eredménye is lehet (azaz spermatociták és/vagy ondó ­
sejt-előalakok pusztulásáé).
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
Ahol lehet, a vizsgált anyagokat izotóniás sóoldatban kell feloldani 
vagy szuszpendálni. A vízben oldhatatlan vegyi anyagokat a megfelelő vivőanyagban lehet feloldani vagy szuszpendálni. Az 
alkalmazott viv őanyag nem lehet hatással a vizsgált anyagra, és 
nem okozhat toxikus hatást. A vizsgált vegyi anyag friss készítmé ­
nyeit kell használni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Vizsgálati körülmények  
A z a d a g o l á s m ó d j a  
A vizsgált vegyületet rendszerint csak egyszer kell beadni. Toxiko ­
lógiai információk alapján ismételt kezelés is lehetséges. Az általá ­
nosan alkalmazott adagolási módok a szájon át történ ő intubálás és 
az intraperitoneális injekció. Más alkalmazási módok is megfelel őek 
lehetnek.  
A k í s é r l e t h e z f e l h a s z n á l t á l l a t o k  
A javasolt kísérleti állat a patkány vagy az egér. Az egészséges, 
ivarérett állatokat véletlenszer ű kiválasztással kezelt és kontrollcso ­
portokba kell beosztani.  
A z á l l a t o k s z á m a é s n e m e  
Megfelelő létszámban kell kezelt hímeket felhasználni, figyelembe 
véve az értékelni kívánt biológiai jellemz ő spontán variációit. A 
létszám meghatározása során a kimutatás korábban már meghatá ­
rozott érzékenységi szintjét és a szignifikancia mértékét kell alapul venni. Egy tipikus vizsgálatban például minden adagolási 
csoportban a hímek számának elegend őnek kell lennie ahhoz, 
hogy minden párzási id őszakban 30 és 50 közötti n ősténynél 
alakuljon ki vemhesség.
 
N e g a t í v é s p o z i t í v k o n t r o l l o k a l k a l m a z á s a  
Minden vizsgálatban negatív (viv őanyag-) és pozitív kontrollokat is 
kell alkalmazni. Ha azonban elfogadható pozitív kontrolleredmé ­
nyek állnak rendelkezésre ugyanazon laboratóriumban nemrégiben elvégzett vizsgálatokból, ezeket fel lehet használni az egyidej ű 
kontrollok alkalmazása helyett. A pozitív kontrollanyagokat csak 
megfelelően alacsony dózisban lehet alkalmazni (pl. MMS, intra ­
peritoneálisan, 10 mg/kilogramm dózisban) a vizsgálat érzékeny ­
ségének kimutatására.
 
A d a g o l á s i s z i n t e k ( d ó z i s )  
Rendszerint három adagolási szintet (dózis) alkalmazunk. A nagy 
dózisnak toxikus tüneteket vagy csökkent termékenységet kell okoznia a kezelt állatokon. Egyes esetekben egyetlen nagy dózis is 
elegendő lehet.
 
H a t á r é r t é k - v i z s g á l a t  
A nem mérgez ő anyagokat egyszeri beadással 5 gramm/kg mennyi ­
ségben vagy ismételt beadással 1 gramm/kg/nap dózisban kell 
adagolni.  
A kísérlet végrehajtása  
Számos kezelési protokoll áll rendelkezésre. A leginkább elterjedt 
módszer a vizsgált anyag egyszeri beadása. Más kezelési protokoll 
is alkalmazható.  
A kezelést követ ően minden egyes hímet megfelel ő időközönként 
egymás után egy vagy két kezeletlen sz űz nősténnyel pároztatnak. 
A nőstényeket legalább egy ivarzási ciklus erejéig a hímekkel kell 
tartani, illetve addig, amíg a párzásra sor nem került, ami a 
hüvelyben a sperma jelenlétéb ől, illetve a hüvelyi dugó megjelené ­
séből határozható meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
A kezelést követ ő párzások számát a kezelési protokoll határozza 
meg, és azt úgy kell kialakítani, hogy a kezelés után a csírasejtkép ­
ződés összes fázisából lehessen mintát venni.  
A nőstényeket a vemhesség második felében pusztítják el, és a méh 
tartalmát megvizsgálva megállapítják az él ő és elhalt implantátumok 
számát. A petefészkek vizsgálatával meghatározható a sárgatestek 
száma.  
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, bemutatva a 
hímek számát, a vemhes n őstények számát, valamint a nem vemhes 
nőstények számát. Minden párzás eredményét egyedileg kell jegy ­
zőkönyvezni, egyenként azonosítva a hímet és a n őstényt. Minden 
nőstény esetében fel kell jegyeznünk a párzás hetét, a hím állatnak 
beadott dózist és az él ő és az elhalt implantátumok gyakoriságát.  
A teljes domináns letális hatás kiszámítása a kezelt csoportban egy 
nőstényre jutó él ő, beágyazódott embriók számának a kontrollcso ­
portban egy n őstényre jutó él ő, beágyazódott embriók számával 
történő egybevetésén alapul. Az elhalt és az élettelen implantátumok 
arányát hasonlítjuk össze a kezelt és a kontrollcsoport között a 
beágyazódás utáni veszteség elemzése céljából.  
Ha az adatokat korai és kései elhalásként értékelték, azt a tábláza ­
tokban világosan jelezni kell. Ha vizsgálták a beágyazódás el őtti 
veszteséget is, akkor azt is jegyz őkönyvezni kell. A beágyazódás 
előtti veszteségeket a sárgatestek számának és az implantátumok 
számának eltéréséb ől vagy a méhenkénti átlagos implantátumszám 
fogyatkozásából számíthatják ki a kontrollpárzásokhoz viszonyítva.  
Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell értékelni.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a kísérlethez felhasznált állatok fajtája, törzse, kora és súlya, 
mindkét nembeli állatok száma a vizsgálati és a kontrollcsopor ­
tokban,  
— a vizsgált anyag, a viv őanyag, a vizsgált dózisok és azok kivá ­
lasztásának indokolása, a pozitív és a negatív kontrollok, a toxi ­
citási adatok,  
— az adagolás módja és a kezelés ütemezése,  
— párzási ütemterv,  
— a párzás igazolására használt módszer,  
— az elpusztítás id őpontja,  
— a domináns letális mutációk számlálásának kritériumai,  
— a dózis-hatás összefüggés, ha van,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  EML ŐS SPERMIOGONIÁLIS KROMOSZÓMA-RENDELLE ­
NESSÉG VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 483-nak, eml ős spermiogoniális 
kromoszómarendellenesség-vizsgálat (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
Az emlős spermiogoniális kromoszómarendellenesség-vizsgálat célja 
azon anyagok azonosítása, amelyek strukturális kromoszóma-rend ­
ellenességeket okoznak eml ősök spermiogonális sejtjeiben (1), (2), 
(3), (4), (5). A strukturális rendellenességek kétféle típusúak lehet ­
nek, kromoszóma vagy kromatid. A kémiai mutagének többsége esetében az el őidézett rendellenességek kromatid típusúak, de kromo ­
szóma típusú rendellenességek is el őfordulnak. E módszert nem a 
számszerű rendellenességek mérésére tervezték és szokásosan nem is 
e célra használják. A kromoszómamutációk és ehhez hasonló folya ­
matok számos emberi genetikai betegség okozói.
 
E vizsgálat a spermiogoniális ivarsejtekben a kromoszómális törté ­
néseket mutatja ki, és ezért várhatóan el őre jelezheti az ivarsejtek 
öröklődő mutációjának indukcióját.  
E vizsgálathoz általában rágcsálókat kell használni. Ez az  in vivo  
citogenetikus vizsgálat észleli a kromoszóma-rendellenességeket a 
spermiogoniális mitózisokban. Más célsejtek nem képezik tárgyát e 
módszernek.  
A spermiogoniumokban a kromatid típusú rendellenességek észlelé ­
séhez a kezelést követ ő első mitiotikus sejtosztódást az el őtt kell 
megvizsgálni, miel őtt elvesznének ezen elváltozások az azt követ ő 
sejtosztódásokban. A kezelt spermiogonium őssejtekről további 
információk kaphatók a diakinezi s-m etafázis I-ben, a kromoszóma 
típusú rendellenességek meiótikus kromoszómaelemzésével.  
Ezt az  in vivo  vizsgálatot annak vizsgálatára tervezték, hogy az 
ivarsejtekben is aktívak-e a testi sejtek mutagénei. Ezenkívül a sper ­
miogonium-vizsgálat a mutációs kockázat kiértékeléséhez is lényeges 
annyiban, hogy lehet ővé teszi az  in vivo  metabolizmus, farmakoki ­
netika és DNS-reparáció tényez őinek vizsgálatát.  
A herékben a spermiogoniumok számos generációja van jelen, amik 
a kémiai anyaggal szembeni érzékenység egész spektrumát átfogják. Így tehát az észlelt rendellenességek a kezelt spermiogonium-popu ­
lációk halmozott reakcióját jelentik az egyre nagyobb számú diffe ­
renciált spermiogonium-sejtek predominanciájával. A heréken belüli 
helyzetükt ől függően, a spermiogoniumok különböz ő generációi 
exponálódhatnak vagy nem a keringés révén a fizikai és fiziológiai Sertoli sejtgát és a vér-here gát miatt.
 
Ha bizonyos jelek utalnak arra, hogy a vizsgált anyag vagy valamely 
reaktív metabolitja nem éri el a célszövetet, akkor e vizsgálat nem megfelelő.
 
Lásd még az Általános bevezetés B. részét is.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Kromatid típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakárosodás, 
amely egy kromatid törésében vagy kromatidok közötti törésben és újraegyesítésben nyilvánul meg.
 
Kromoszóma típusú rendellenesség : szerkezeti kromoszómakároso ­
dás, amely a két kromatid azonos helyén történt törésben, vagy 
törésben és újraegyesülésben nyilvánul meg.  
Gap: egyetlen kromatid szélességénél kisebb és a kromatidok mini ­
mális átrendez ődését okozó akromatikus sérülés.  
Számszer ű rendellenesség : a kromoszómák számának eltérése a 
felhasznált sejteket jellemz ő normál számértékt ől. 
Poliploida : a haploid kromoszómaszám (n) egészszámú, de nem 
diploid (azaz 3n, 4n, és így tovább) megsokszorosódása.  
Szerkezeti rendellenesség : a sejtosztódás metafázisának mikroszko ­
pikus vizsgálata során észlelhet ő változás a kromoszóma szerkezeté ­
ben, mint a delíciók és fragmentumok, a kromoszómán belüli vagy a kromoszómák közötti átrendez ődés.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az állatoknak megfelel ő expozíciós módon adagolják a vizsgált 
anyagot és a kezelés után megfelel ő időpontokban elpusztítjuk 
őket. Az elpusztítás el őtt az állatokat metafázis-blokkoló szerrel (pél ­
dául kolchicin vagy Colcemid®) kell kezelni. Ezután kromoszóma ­
készítményeket hozunk létre az ivarsejtekb ől és megfestjük azokat, 
majd elemezni kell a metafázisú sejteket a kromoszóma-rendellenes ­
ségek megállapítására.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
Rendszerint patkányokat, egereket és kínai hörcsögöket használnak, 
jóllehet bármilyen megfelel ő emlős használata szóba jöhet. Fiatal, 
egészséges, ivarérett, kísérleti célokra tenyésztett laboratóriumi állat ­
törzsekből származó állatokat kell használni. A vizsgálat kezdetén az 
állatok súlya lehet őleg csak minimálisan térjen el egymástól és a 
nemenkénti átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal különbözhet.  
1.4.1.2.  Tartási és etetési körülmények  
Az Általános bevezetés B. részében ismertetett általános körülmé ­
nyeket kell alkalmazni, bár a páratartalom értékének 50–60 % között 
kell lennie.  
1.4.1.3.  Az állatok el őkészítése  
Az egészséges, fiatal, ivarérett állatokat véletlenszer űen kontroll- és 
kezelt csoportokba osztják. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek az elhelyezés miatti esetleges hatások. Ezt 
követően az állatokat egyenként kell azonosítani. Az állatokat 
legalább öt napig szoktatják a laboratóriumi körülményekhez.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Dózisok el őkészítése  
Az adagolás el őtt a szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy 
szuszpendálni megfelel ő oldószerekben vagy viv őanyagokban, és 
hígítani, ha szükséges. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül 
adagolhatók vagy hígíthatók. A vizsgált anyagból mindig friss készít ­
ményeket kell alkalmazni, kivéve, ha az anyag tárolás során való stabilitása bizonyított.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer/viv őanyag  
Az oldószer nem okozhat toxikus hatásokat a kiválasztott dózisok 
mellett, valamint nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan 
kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal. Jól ismert oldószerekt ől 
eltérő oldószerek/viv őanyagok használatakor azok felhasználását alá 
kell támasztani a kompatibilitásukat bizonyító adatokkal. Ameny ­
nyiben lehetséges, el őször valamilyen vizes oldószer/viv őanyag hasz ­
nálatát kell megfontolni.  
1.4.2.2.  Kontrollok  
Mindkét nemhez és minden kísérlethez egyidej űleg pozitív és 
negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollokat kell alkalmazni. A vizsgált 
anyaggal való kezelés kivételével a kontrollcsoportokba beosztott állatokat azonos bánásmódban kell részesíteni a kezelt csoportokban 
lévő állatokkal.
 
A pozitív kontrolloknak  in vivo  szerkezeti rendellenességeket kell 
létrehozniuk expozíciós koncentrációban úgy, hogy észlelhet ő legyen 
a növekedés (a háttérhez viszonyítva).  
A pozitív kontrollkoncentrációkat úgy választjuk ki, hogy a hatás 
egyértelm ű legyen, de ne leplez ődjön le azonnal a kódolt tárgy ­
lemezek identitása a leolvasásnál. Elfogadható, hogy a pozitív kont ­
roll beadása a vizsgált anyag beadási módjától eltérjen, és hogy csak 
egyetlen mintavételre kerüljön sor. Adott esetben azon pozitív kont ­
rollanyagok használatát kell megfontolni, amelyek a vizsgált anyaggal azonos osztályba tartoznak. A következ ő pozitív kontroll ­
anyagok jöhetnek szóba:
 
Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Ciklofoszfamid 
Ciklofoszfamid monohidrát 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Ciklohexil-amin 108-91-8 203-629-0 
Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 Akrilamid monomer 79-06-1 201-173-7 Trietilén-melamin 51-18-3 200-083-5
 
Minden mintavétel alkalmával a negatív kontrollcsoportban lév ő 
állatokat is figyelembe kell venni, amelyeknek csupán oldószert adagolnak, egyébként azonos bánásmódban kell részesíteni azokat a kezelt állatokkal, kivéve, ha a történeti kontrolladatokból elfogad ­
ható értékek állnak rendelkezésre a kromoszóma-rendellenességeket 
mutató sejtek állaton belüli sokfélesége és gyakorisága tekintetében. Ezenkívül használunk nem kezelt kontrollállatokat, kivéve, ha vannak olyan történeti vagy nyilvánosságra hozott kontrolladatok, 
amelyek azt mutatják, hogy a kiválasztott oldószer/viv őanyag 
semmilyen ártalmas vagy mutagén hatást nem hoz létre.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  Állatok száma  
Minden egyes kezelt- és kontrollcsoport legalább öt elemezhet ő hím 
állatot tartalmaz.  
1.5.2.  Kezelés lefolytatása  
A vizsgált anyagot lehet őleg egyetlen alkalommal adják be. A vizs ­
gált anyagot két adagban is be lehet adni, ugyanazon a napon két alkalommal néhány órás id őközzel, nagy mennyiség ű anyag beadá ­
sának megkönnyítésére. Más adagolási módok alkalmazását tudomá ­
nyosan indokolni kell.
 
A legnagyobb adaggal kezelt csoportnál a kezelés után két külön ­
böző időpontban mintát kell venni. Mivel a sejtciklus kinetikájára 
hatással lehet a vizsgált anyag, körülbelül 24 és 48 órával a kezelés 
után kell mintát venni. Az egyéb adagok estében a kezelés utáni 24 
órában vagy 1,5 sejtciklusid ő eltelte után kell mintát venni, kivéve 
ha más id őpontról bebizonyosodott, hogy az megfelel őbb a hatások 
észlelésére (6).  
Ezenkívül más mintavételi id ők is alkalmazhatók. Olyan kémiai 
anyagok esetében, amelyek kromoszóma-visszamaradást idézhetnek 
elő vagy amelyek S fázistól független hatásokat fejthetnek ki, 
megfelelőbbnek bizonyulhatnak a korábbi mintavételi id ők (1).  
Valamely megismételt kezelés célszer űségét eseti alapon kell 
megállapítani. Megismételt kezelés esetén az állatokat 24 órával 
(1,5 sejtciklusid ő) az utolsó kezelés után elpusztítják. További minta ­
vételi idők alkalmazhatók, ahol szükséges.  
Elpusztítás el őtt az állatok hasüregébe adott injekcióval megfelel ő 
adag metafázist blokkoló szert (például Colcemid® vagy kolchicin) 
fecskendezünk be. Ezután az állatokból mintákat kell venni megfelelő időközönként. Egerek esetében ez az id őköz körülbelül 
3–5 óra; kínai hörcsögök esetében ez az id őköz körülbelül 4–5 óra.
 
1.5.3.  Dózisok  
Ha dózisbehatároló vizsgálatot végeznek, mert nem állnak rendel ­
kezésre alkalmas adatok, ezt ugyanabban a laboratóriumban, 
ugyanazon fajták, törzsek, nemek és kezelési menetrend alkalma ­
zásával hajtják végre, mint amelyet a f ő vizsgálatban 
alkalmaznak (7). Ha észlelhet ő toxicitás, három dózist használnak 
az első mintavételhez. E dózisoknak át kell fogniuk egy, a maxi ­
málistól a már csak kissé vagy az egyáltalán nem toxikusig terjed ő 
tartományt. A kés őbbi mintavételnél csak a legmagasabb adagot 
használják. A legmagasabb adag az a dózis, amely olyan egyér ­
telmű toxicitásjeleket vált ki, hogy annál magasabb adagok, azonos 
adagolás mellett, várhatóan halált okoznak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Specifikus biológiai hatású anyagok alacsony, nem toxikus adagok 
mellett (ilyenek például a hormonok és mutagének) adott esetben 
lehetséges, hogy nem felelnek meg az adagolási kritériumoknak, ezért ezeket eseti alapon kell értékelni. A legmagasabb adag olyan adagként is definiálható, amely létrehoz valamilyen toxicitási jelet a 
spermiogonium-sejtekben (például az els ő és második meiotikus 
metafázis esetében a spermiogonium mitózis arányának csökkenése; e csökkenésnek nem szabad 50 %-nál nagyobbnak lennie).
 
1.5.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egyetlen alkalmommal vagy ugyanazon a napon két adagban 
beadott, legalább 2 000 mg/kg testsúly dózis mellett végrehajtott vizsgálat semmilyen megfigyelhet ő toxikus hatásokat nem hoz létre, 
és ha nem várható genotoxicitás szerkezetileg rokon anyagokkal 
kapcsolatos adatok alapján, akkor nem szükséges a három dózisszint használatával végrehajtott teljes vizsgálat. A várt expozíciós hatások az embernél a határérték-vizsgálatban valamilyen magasabb dózis 
használatának szükségességét jelezhetik.
 
1.5.5.  Adagolás  
A vizsgált anyagot rendszerint gyomorszondán át inkubációs kanül 
segítségével, vagy hasüregbe adott injekció segítségével adják be. 
Elfogadhatók egyéb expozíciós módok, amennyiben azok indokolha ­
tók. A gyomorszondán át vagy injekcióval egyszerre beadható maxi ­
mális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretét ől függ. A térfogata 
nem haladhatja meg a 2 ml/l00 g testsúly mennyiséget. Ennél 
nagyobb mennyiségek használatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékek esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irri ­
tatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelel ő beál­
lításával a minimálisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyi ­
ségének változásait, hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyi ­
séget lehessen adagolni a kísérleti állatoknak.
 
1.5.6.  Kromoszómapreparáció  
Közvetlenül az elpusztítás után sejtszuszpenziót vesznek mindkét 
heréből, azokat hipotonizálni kell, majd fixálni. A sejteket ezután 
elterítjük a tárgylemezen és megfestjük.  
1.5.7.  Elemzés  
Minden egyes állat esetében legalább 100 jól kiterült metafázist kell 
elemezni (azaz csoportonként minimum 500 metafázist). E szám csökkenthet ő, amennyiben nagyszámú rendellenesség figyelhet ő 
meg. Minden tárgylemezt, a pozitív és negatív kontrollokat is 
ideértve, önállóan kódolni kell a mikroszkópos elemzés el őtt. 
Mivel a fixálási eljárások gyakran a metafázisban lév ő sejtek egy 
részének széttörését eredményezik, mely kromoszóma veszteséggel 
jár, ezért a kiértékelt sejtek tartalmaznak egy centromer számot, 
amely megfelel a 2n ± 2 értéknek.
 
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az egyes állatok adatait táblázat formájában kell megadni. A kísér ­
leti egység maga az állat. Minden egyes állat esetében fel kell jegy ­
ezni a strukturális kromoszóma-rendellenességekkel rendelkez ő 
sejtek számát és a sejtenkénti kromoszóma-rendellenességek számát. 
Fel kell sorolni a szerkezeti kromoszóma-rendellenességek külön ­
böző típusait a számukkal és gyakoriságukkal együtt kezelt és kont ­
rollcsoportonként. A gap külön kerül feljegyzésre és szerepel a jelen ­
tésben, de rendszerint azokat nem kell beleszámolni a rendellenes ­
ségek összgyakoriságba.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Ha mitózist, valamint meiózist figyelnek meg, meg kell határozni a 
spermiogonium-mitózisok arányát az els ő és második meiotikus 
metafázisokhoz viszonyítva, állatonként 100 osztódó sejt összes mintájában valamennyi kezelt és negatív kontrollállathoz tartozó cito ­
toxicitás méréseként az esetleges citotoxikus hatás megállapítása 
érdekében. Ha csak mitózist figyelnek meg, a mitózisindexet állat ­
onként legalább 1 000 sejtben kell meghatározni.
 
2.2. EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározá ­
sára, ilyen például a kromoszóma-rendellenességeket mutató sejtek 
relatív számának növekedése a dózis függvényében, vagy egy meghatározott id őben történ ő mintavétel alkalmával egyetlen dózis ­
csoportban a rendellenességet mutató sejtek számának egyértelm ű 
növekedése. El őször meg kell vizsgálni az eredmények biológiai 
jelentőségét. Statisztikai módszerek használhatók a vizsgálati ered ­
mények kiértékelésének el ősegítésére (8). Valamely pozitív reagálás 
tekintetében nem szabad, hogy a statisztikai szignifikancia legyen az 
egyetlen meghatározó tényez ő. A többféleképpen magyarázható ered ­
ményeket további vizsgálattal kell tisztázni, lehet őleg a kísérleti 
körülményeket módosítva.
 
E rendszerben nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált 
anyag, amelyhez tartozó eredmények nem elégítik ki a fenti kritéri ­
umokat.  
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételjük 
meg a kísérletet.  
Az in vivo  spermiogonium kromoszómarendellenesség-vizsgálatból 
kapott pozitív eredmények azt jelzik, hogy valamely anyag struktu ­
rális kromoszóma-rendellenességeket idéz el ő a kísérleti állatfajták 
ivarsejtjeiben. A negatív eredmények azt jelzik, hogy a vizsgált 
körülmények mellett, a vizsgált anyag nem idéz el ő kromoszóma- 
rendellenességeket a kísérleti állatfajták ivarsejtjeiben.  
Értékelni kell annak a valószín űségét, hogy a vizsgált anyag vagy 
annak metabolitjai eljutnak-e a célszövetbe.  
3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/ ­
vivőanyagban, ha ismert.  
Kísérleti állatok:  
— használt fajok/törzs,  
— állatok száma, kora,  
— az állatok származása, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az állatok súlya a vizsgálat kezdetekor, az egyes csoportok 
esetében a testsúlytartományt, átlagértéket és a standard eltérést 
is ideértve.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Vizsgálati körülmények:  
— a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen 
vizsgálat,  
— a dózisok kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag beadási módjának indoklása,  
— a vizsgált anyag el őkészítésére vonatkozó adatok,  
— a vizsgált anyag beadására vonatkozó adatok,  
— a kiválasztott elpusztítási id őpontok indoklása,  
— átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), ha ez alkalmazható
 
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó részletek,  
— kezelési és mintavételi menetrend részletes leírása,  
— toxicitás meghatározásának módszerei,  
— metafázis-blokkoló szer azonosítása, annak koncentrációja és 
kezelési id őtartama,  
— tárgylemez preparálásának módszerei,  
— rendellenességek értékelésének kritériumai,  
— az elemzett sejtek száma (állatonként),  
— azon kritériumok, amelyek meghatározzák, hogy a vizsgálatok 
pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen értelmezhet őnek 
tekintendők-e. 
Eredmények:  
— toxicitás jelei,  
— mitotikus index,  
— spermiogonium mitózisok aránya az els ő és második meiotikus 
metafázisokhoz viszonyítva,  
— rendellenességek száma és típusa az egyes állatokban,  
— csoportonként a rendellenességek össz-száma,  
— csoportonként a rendellenességeket mutató sejtek száma,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzések, ha vannak,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív kontrollokra vonatkozó adatok,  
— történeti negatív kontrolladatok tartományokkal, átlagértékekkel 
és standard eltérésekkel,  
— az egyidej űleg elvégzett pozitív kontrollokra vonatkozó adatok,  
— ploidia megfigyelt változásai.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. SZAKIRODALOM  
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fication, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477–484
 
(2) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275–306  
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Tests, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289–294
 
(4) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays in: 
D. J. Kirkland (ed.). Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures, UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing, Report, Part 1. revised, Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbo ­
urne, Sydney, pp. 115–141  
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y, (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, 
Mutation Res., 52, pp. 207–209  
(6) Adler, I. D. Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), Inter ­
national Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test 
Procedures. Summary Report of the Working Group on 
Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res. 312, pp. 313–318  
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G, Hodson-Walker, G, Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In vivo  Mutagenicity Assays, 
Mutagenesis, 7. pp. 313–319
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report Part III, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 184–232
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  EGÉRFOLT- (SPOT) TESZT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Ez egy  in vivo  vizsgálat egéren, amelynek során fejl ődő embriókat 
kezelnek a vizsgált vegyülettel. A fejl ődő embrióban a célsejtek a 
melanoblasztok, a célgének pedig azok, amelyek a hátsz őrzet 
pigmentációjáért felel ősek. A fejl ődő embriók több ilyen, a sz őrszínt 
kódoló génre heterozigóták. Ha valamely pigmentsejt egy ilyen génjében mutáció következik be, vagy elvész a domináns alléi (különböz ő genetikai események hatására), az utódsejtben a recesszív 
fenotípus jelenik meg, aminek az a következménye, hogy a szület ő 
egér szőrzete egy foltban eltér ő színű lesz. Meghatározzák az ilyen 
foltokkal született mutáns egerek számát, és gyakoriságukat összeha ­
sonlítják a csak oldószerrel kezelt embriókból keletkez ő utódnemze ­
dékben el őforduló foltosodási gyakorisággal. Az egérfoltosodási 
vizsgálat a magzati sejtek feltételezett szomatikus mutációinak kimu ­
tatására alkalmas.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
Ahol lehet, a vizsgált anyagokat izotóniás sóoldatban kell feloldani 
vagy szuszpendálni. A vízben oldhatatlan vegyi anyagokat a megfelelő vivőanyagban lehet feloldani vagy szuszpendálni. Az 
alkalmazott viv őanyag nem lehet hatással a vizsgált anyagra, és 
nem okozhat toxikus hatást. A vizsgált vegyi anyag friss készítmé ­
nyeit kell használni.
 
A k í s é r l e t h e z f e l h a s z n á l t á l l a t o k  
A T törzshöz tartozó (nonagouti, a/a; csincsilla, rózsaszín szem ű, 
c ch p/c ch p; barna, b/b; halvány, rövid fül ű, d se/d se; tarka foltos, 
s/s) egereket vagy a HT törzshöz tartozó egerekkel (halvány, nona ­
gouti, rövid lábú, pa a bp/pa a bp; szürke pihés, ln fz/ln fz; gyöngy pe/pe) vagy a C57BL (nonagouti, a/a) törzshöz tartozó egerekkel pároztatnak. Más megfelel ő keresztezés, például az NMRI (nonago ­
uti, a/a; albínó, c/c) és a DBA (nonagouti, a/a; barna, b/b; halvány 
d/d) törzsek között is használható, ha nonagouti utódaik lesznek.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
A z á l l a t o k s z á m a é s n e m e  
Megfelelő számú vemhes n őstényt kezelnek, hogy elegend ő túlélő 
utód legyen minden dózishoz. A minta nagyságát a kezelt egereken megfigyelt foltok száma és a kontrolladatok nagyságrendje határozza meg. A negatív eredmény csak akkor fogadható el, ha a legnagyobb 
dózissal kezelt csoport n őstényeitől származó legalább 300 utódot 
vizsgáltak meg.
 
N e g a t í v é s p o z i t í v k o n t r o l l o k a l k a l m a z á s a  
Olyan egyidej űleg alkalmazott kontrollegércsoport adatainak is 
rendelkezésre kell állniuk, amelyeket csak viv őanyaggal (negatív 
kontroll) kezeltek. A vizsgálat érzékenységének növelése érdekében az ugyanazon laboratóriumból származó történeti kontrolladatokat lehet összesíteni, ha azok homogének. Ha az aktuális vizsgálat 
nem mutatott ki mutagenitást a vizsgált anyagra, olyan pozitív kont ­
rollvizsgálat eredményeinek kell rendelkezésre állniuk, amelyet nemrégiben végeztek ugyanazon laboratóriumban valamely ismert, mutagén hatású vegyülettel.
 
A z a d a g o l á s m ó d j a  
Általánosan alkalmazott módszer a vemhes n őstények szájon át 
történő intubálása vagy az intraperitoneális injekció. Belélegeztetés 
vagy egyéb módszer is alkalmazható, ha szükséges.  
A d a g o l á s i s z i n t e k ( d ó z i s o k )  
Legalább két adagolási szintet kell alkalmazni, amelyek közül az 
egyik toxikus tüneteket okoz, vagy csökkentett alomszámot eredmé ­
nyez. A nem mérgez ő anyagoknál a gyakorlatban kivitelezhet ő 
legnagyobb dózist kell használni.  
A kísérlet végrehajtása  
A vemhesség 8., 9., illetve 10. napján egyszeri dózist adnak, a 
vemhesség els ő napjának a hüvelyi dugó megjelenését tekintve. E 
napok a fogamzás utáni 7,25., 8,25. és 9,25. napnak felelnek meg. Az említett napokat követ ően is alkalmazható további kezelés.
 
E l e m z é s  
Az utódokat kóddal látják el, és a születés utáni harmadik és 
negyedik hét között megszámolják foltjaikat. Háromfajta foltot különböztetnek meg:
 
a) fehér foltok a hasfal középvonalától számított 5 mm-en belül, 
amelyek feltehet őleg a sejtpusztulás következményei (WMVS);  
b) sárga, agouti-szer ű foltokat az eml ők, a nemi szervek, a torok, a 
váll és a lágyék területein, valamint a homlokon, amelyek való ­
színűleg a hibás differenciáció (MDS) következményei; és  
c) pigmentált és fehér foltokat véletlenszer űen elszórtan a sz őrzeten, 
amelyek valószín űleg szomatikus mutáció (RS) következményei.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Mindhárom csoportban megszámolják a foltokat, de genetikai szem ­
pontból csak az utolsó, az RS játszik szerepet. Az MDS és az RS 
közötti különbségtételnél problémás esetekben a sz őrminta fluoresz ­
cens mikroszkóp alatti vizsgálata dönt.  
Az utódok nyilvánvaló makroszkópos morfológiai rendellenességeit 
fel kell jegyezni.  
2. ADATOK  
Az adatokat feltüntetésekor meg kell adni az összes vizsgált utód és 
az egy vagy több vélt szomatikus mutációs foltot mutató egyedek 
számát. A kezelt és a negatív kontrollcsoportok adatait összevetik megfelelő statisztikai módszerek alkalmazásával. Az adatokat almon ­
ként is megadják.
 
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a keresztezéshez használt törzsek,  
— a vemhes n őstények száma a vizsgálati és a kontrollcsopor ­
tokban,  
— az átlagos alomszám a vizsgálati és a kontrollcsoportokban szüle ­
téskor és a szoptatástól való elválasztáskor,  
— a vizsgált anyag dózisa(i),  
— a felhasznált oldószer,  
— a vemhesség napja, amikor a n őstény megkapta a kezelést,  
— az anyag adagolásának módja,  
— az összes utód száma, a WMVS, MDS és RS típusú eltérésekkel 
rendelkez ő utódok száma a vizsgálati és a kontrollcsoportban,  
— jelentős morfológiai rendellenességek,  
— az RS-eltéréssel rendelkez ő állatok dózis-hatás összefüggései, ha 
lehetséges,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  EGÉREN VÉGZETT ÖRÖKLETES TRANSZLOKÁCIÓS 
VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az egéren végzett örökletes transzlokációs vizsgálat az els ő utód­
nemzedékb ől kinyerhet ő szerkezeti és számbeli kromoszómaváltozá ­
sokat mutatja ki. A kimutatott kromoszómaváltozások típusai a reciprok transzlokáció és – ha n őstény utódokat is vizsgálunk – az 
X-kromoszóma-veszteség. A transzlokáció-hordozók és az XO-n ősté­
nyek csökkent termékenységgel rendelkeznek, ezen állatokat az F1 utódnemzedékb ől ennek alapján válogatjuk ki a citogenetikai elem ­
zéshez. Bizonyos transzlokáció-típusok teljes sterilitást eredmé ­
nyeznek (X-autoszóma és c-t típus). A transzlokációk citogenetikai 
vizsgálattal hím állatok (vagy F1 hímek vagy F1 n őstények hím 
utódai) meiotikus sejtjeiben a diakinézis-I. metafázisban figyelhet ők 
meg. Az XO-n őstények a csontvel ői sejtek mitózisa során megfigyel ­
hető, mindössze 39 kromoszóma jelenléte alapján azonosíthatók.
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Előkészületek  
Ahol lehet, a vizsgált anyagokat izotóniás sóoldatban kell feloldani 
vagy szuszpendálni. A vízben oldhatatlan vegyi anyagokat a megfelelő vivőanyagban lehet feloldani vagy szuszpendálni. A vizs ­
gált vegyi anyag friss készítményeit kell használni. Az alkalmazott 
vivőanyag nem lehet hatással a vizsgált anyagra, és nem okozhat 
toxikus hatást.
 
A z a d a g o l á s m ó d j a  
A vizsgált anyagot orális intubálással vagy intraperitoneális injekci ­
óval kell bejuttatni. Más alkalmazási módok is megfelel őek lehetnek.  
A k í s é r l e t h e z f e l h a s z n á l t á l l a t o k  
A tenyésztés megkönnyítése és a citológiai meger ősítő vizsgálatok 
miatt e vizsgálatokat egereken végzik. Nincs szükség különleges 
egértörzsre. Mindazonáltal a törzs átlagos alomszáma nyolcnál nagyobb és viszonylag állandó legyen.
 
Egészséges, ivarérett állatokra van szükség.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
A z á l l a t o k s z á m a é s n e m e  
Az állatok száma a spontán transzlokáció gyakoriságától és a pozitív 
eredmény eléréséhez szükséges minimális indukciós aránytól függ.  
A vizsgálatot rendszerint F1 hím utódok elemzésével végzik. Dózi ­
sonként legalább 500 hím F1 utódot kell megvizsgálni. Ha F1 nőstény utódokat is használunk, 300 hímre és 300 n őstényre van 
szükség.
 
N e g a t í v é s p o z i t í v k o n t r o l l o k a l k a l m a z á s a  
Egyidejűleg végzett vizsgálatokból és történeti kontrollvizsgálatokból 
megfelelő kontrolladatoknak kell rendelkezésre állniuk. Ha nemrégen 
ugyanezen laboratóriumban elvégzett vizsgálatokból elfogadható pozitív kontrolleredmények állnak rendelkezésre, egyidej űleg alkal­
mazott kontrollok helyett ezek is használhatók.
 
A d a g o l á s i s z i n t e k ( d ó z i s o k )  
Egy adagolási szintet vizsgálnak, rendszerint azt a legnagyobb 
dózist, amely minimális toxikus hatást fejt ki, de még nem befolyá ­
solja a szaporodási viselkedést vagy a túlélést. A dózis-hatás össze ­
függés megállapításához még legalább két alacsonyabb adaggal 
kezelt csoportra is szükség van. Nem mérgez ő anyagoknál a legna ­
gyobb megengedhet ő adagot használják.  
A kísérlet végrehajtása  
K e z e l é s é s p á r o z t a t á s  
Kétféle kezelési protokoll áll rendelkezésre. A leggyakrabban alkal ­
mazott a vizsgált anyag egyszeri adagolása. Másik lehet őség a vizs ­
gált anyag adagolása heti hét napon át, 35 napon keresztül. A keze ­
lések utáni pároztatások számát a kezelési protokoll határozza meg, amelynek biztosítania kell, hogy a csírasejtképz ődés minden kezelt 
fázisából legyen mintavétel. A párzási id őszak végén a n őstényeket 
egyedileg ketrecbe kell zárni. Elléskor feljegyzik a napot, az alom ­
számot és az utódok nemét. Valamennyi hím utódot elválasztják, és a nőstény utódokkal nem foglalkoznak, hacsak nem akarják felhasz ­
nálni azokat is a vizsgálatban.
 
A t r a n s z l o k á c i ó - h e t e r o z i g ó c i a v i z s g á l a t a  
Az alábbi két módszer egyike használható:  
— az F1 utódok termékenységének vizsgálata és a lehetséges transz ­
lokációk utólagos igazolása citogenetikai elemzéssel,  
— valamennyi hím F1 utód citogenetikai vizsgálata termékenység ­
vizsgálattal végzett el őzetes kiválogatás nélkül.  
a) Termékenységvizsgálat  
Az F1 utód csökkent termékenységét az alomszám megfigyelé ­
sével és/vagy az ezen állattal pároztatott n őstények méhtartal ­
mának vizsgálatával mutathatják ki.  
A normális, illetve csökkent termékenység kritériumait a felhasz ­
nált egértörzs sajátságainak megfelel ően kell meghatározni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Alomszám-megfigyelések: A vizsgálandó F  1 hímeket ugyanazon 
vizsgálatból vagy ugyanazon tenyészetb ől származó n őstényekkel 
együtt ketrecekbe zárják. A ketreceket a párzás utáni 18. naptól kezdődően naponta megvizsgálják. Az alom létszámát és az F
 2 
utódok nemét elléskor feljegyzik, az almot ezután eltávolítják. Ha 
F 1 nőstény utódokat vizsgálnak, a kis almok F  2 utódait további 
vizsgálatok céljaira megtartják. A n őstény transzlokációhordo ­
zókat bármely hím utódjuk transzlokációs citogenetikai vizsgála ­
tával azonosíthatják. Az XO-n őstényeket az utódok ivari megosz ­
lásának változásából ismerhetik fel, a hímek és n őstények aránya 
1:1-ről l:2-re változik. A normál F  1 állatokat egy több egymást 
követő lépésből álló eljárásban kivonják a vizsgálatból, ha az 
első F 2 alom létszáma eléri vagy meghaladja az el őre meghatá ­
rozott normál értéket, ellenkez ő esetben viszont a második vagy 
harmadik F  2 almot is megfigyelik.  
Azon F  1 állatokat, amelyeket még a harmadik F  2 alom után sem 
lehet normálisnak tekinteni, vagy tovább vizsgálják a velük 
pároztatott n őstények méhtartalmának elemzésével, vagy rögtön 
citogenetikai vizsgálatnak vetik alá.  
A méhtartalom elemzése: A transzlokáció-hordozók alomlétszá ­
mának csökkenése az embrionális elhalálozásnak tudható be, 
ezért nagyszámú elhalt implantátum jelzi a vizsgált állatban kialakult transzlokációt. A vizsgálandó F
 1 hímeket két-három 
nősténnyel pároztatjuk. A fogamzás napját a hüvelyi dugó regge ­
lente történ ő, napi vizsgálatával állapítják meg. A n őstényeket 
14–16 nappal kés őbb elpusztítják, és méhükben meghatározzák 
és feljegyzik az él ő, illetve elhalt embriók számát.  
b) Citogenetikai elemzés  
Levegőn végzett szárítás módszerével herepreparátumokat állí ­
tunk elő. A transzlokációhordozókat a primer spermatociták I. 
típusú diakinézis-metafázisban megjelen ő polivalens konfigurá ­
ciói alapján azonosítjuk. Legalább két sejtet kell találni poliva ­
lens asszociációval ahhoz, hogy kijelenthessük, a vizsgált állat transzlokáció-hordozó.
 
Ha nem végeztünk tenyésztési szelekciót, minden F  1 hímet egyen ­
ként kell citogenetikailag megvizsgálni. Hímenként legkevesebb 25 I. típusú diakinézis-metafázisban lev ő sejtet kell mikroszkóposan 
megvizsgálni. A kis herékkel, illetve a diakinézis el őtti meiotikus 
károsodással rendelkez ő F
 1 hímeknél, valamint azon F  1 nőstények­
nél, amelyeknél felmerül az XO-károsodás gyanúja, el kell végezni a spermatogoniumsejtek vagy a csontvel ői sejtek mitotikus metafázi ­
sainak vizsgálatát is. Egy szokatlanul hosszú és/vagy rövid kromo ­
szóma jelenléte mind a tíz sejtben egy bizonyos, hímsterilitást okozó 
transzlokációra utal (c-t típus). Egyes X-autoszóma-transzlokációkat, amelyek szintén hímsterilitást okoznak, csak a mitotikus kromo ­
szómák sávos elemzésével lehet kimutatni. Ha mind a 
10 mitózisban 39 kromoszómát találunk, az a n őstény XO-kromo ­
szóma eltérését bizonyítja.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni.  
Minden párzási id őszakra megadják a szül ői párosításból származó 
átlagos alomszámot és a nemek arányát születéskor és a szoptatástól 
való elválasztáskor.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Az F  1 állatok termékenységvizsgálatát, a normálpárok átlagos alom ­
számát és az F  1 transzlokáció-hordozók egyedenkénti alomszámát is 
bemutatják. A méhtartalom-elemzésnél a normálpárok él ő és elhalt 
implantátumainak átlagos számát viszonyítják az F  1 transzlokáció ­
hordozók párosításából származó él ő és elhalt implantátumok egye ­
denkénti számához.  
Az I. típusú diakinézis-metafázis citogenetikai elemezésekor a külön ­
féle típusú polivalens konfigurációk számát és a teljes sejtszámot 
sorolják fel minden transzlokáció-hordozó esetében.  
A steril F  1 egyedeknél a teljes párzási számot és a párosodási 
időszak hosszát jegyzik fel. Megadják a herék súlyának és a citoge ­
netikai elemzés eredményének adatait.  
Az XO-n őstények esetében az átlagos alomszámot, az F  2 nemzedék 
ivararányát és a citogenetikai elemzés eredményeit kell megadni.  
Ha az F  1 transzlokáció-hordozókat termékenységvizsgálattal el ősze­
lektáljuk; ilyenkor a táblázatoknak azt is be kell mutatniuk, hogy ezek közül hány állat bizonyult heterozigótának a transzlokáció 
szempontjából.
 
A negatív és a pozitív kontrollvizsgálatok adatait egyaránt jegy ­
zőkönyvezni kell.  
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— az egértörzs neve, az állatok kora, a kezelt állatok testsúlya,  
— a szül ő állatok száma nemenként a vizsgálati és a kontrollcso ­
portokban,  
— a vizsgálati feltételek, a kezelés részletes leírása, dózisok, oldó ­
szerek, a párzási ütemterv,  
— az utódok száma és neme n őstényenként, a transzlokáció-elem ­
zésre szánt utódok száma és neme,  
— a transzlokáció-elemzés id őpontja és kritériumai,  
— a transzlokáció-hordozók száma és részletes ismertetése, bele ­
értve a tenyésztési adatokat és a méhtartalom adatait is, ha alkal ­
mazhatók,  
— a citogenetikai eljárások és a mikroszkópos elemzés részletei, 
lehetőség szerint képekkel,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, 
RÁGCSÁLÓKON VÉGZETT 90 NAPOS, ISMÉTELT 
ADAGOLÁSÚ ORÁLISTOXICITÁS-VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
E szubkrónikusorálistoxicitás-vizsgálat megfelel az OECD TG 408- 
nak (1998).  
1.1. BEVEZETÉS  
Egy vegyi anyag toxikus jellemz őinek értékelése és felmérése során 
az ismételt adagolású szubkrónikus orális toxicitást azután lehet meghatározni, hogy az akut vagy a 28 napos ismételt adagolású toxicitásvizsgálatok kezdeti eredményei már rendelkezésre állnak. 
A 90 napos vizsgálat a szoptatási id őszak befejeztét ől a felnőttkorba 
váltás periódusát is átfogó id őszakban a hosszabb ideig tartó, ismételt 
expozícióból adódó lehetséges egészségkárosodásra vonatkozó infor ­
mációkat tárja fel. A vizsgálat tájékoztat a fontosabb toxikus hatá ­
sokról, jelzi a célszerveket és a felhalmozódás lehet őségét, és becs ­
lést ad az expozíció kimutatható káros hatással nem járó szintjére (NOAEL) nézve, amit fel lehet használni a krónikustoxicitás-vizs ­
gálatok dózisszintjeinek kiválasztásához és az emberi expozíció 
biztonsági kritériumainak megállapításához.
 
A módszer nagy hangsúlyt fektet a neurológiai végpontokra, és jelzi 
az immunrendszerre és a szaporodásra gyakorolt hatásokat. Szintén 
hangsúlyt kap a kísérleti állatok gondos klinikai megfigyelésének szükségessége is a lehet ő legtöbb információ megszerzése érdekében. 
E vizsgálat lehet ővé teszi azon vegyi anyagok körének megállapítá ­
sát, amelyek potenciálisan neurotoxikus hatásokkal járnak, vagy 
kedvezőtlen hatásokat gyakorolnak az immunrendszerre vagy a 
szaporítószervekre, és ennélfogva további, mélyreható kutatások és vizsgálatok elvégzését indokolják.
 
Lásd még az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Dózis : a vizsgált anyag beadott mennyisége. A dózis mennyiségét 
tömegben (gramm vagy milligramm) vagy a vizsgált anyag és a vizsgált állat tömegének hányadosában (pl. milligramm anyag/ ­
testtömeg kilogramm), vagy állandó táplálékbeli koncentráció formá ­
jában (ppm vagy milligramm/táplálék-kilogramm) fejezik ki.
 
Adagolás : általános meghatározás, ami a dózist, az adagolás gyako ­
riságát és id őtartamát tartalmazza.  
NOAEL : a „kimutatható káros hatással nem járó dózisszint” (no 
observed adverse effect level) rövidítése, és azon legmagasabb 
adagolási szintet jelöli, amelynél még nem észlelhet ő a kezeléssel 
összefüggésben lév ő kedvezőtlen hatás.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta, szájon át adják be több kísérleti állat ­
csoportnak, csoportonként más-más adagolási szinten, 90 napon keresztül. A szer beadásának id őszakában az állatokat a toxicitás 
jeleinek észlelése érdekében gondosan megfigyelik. Az elpusztult, 
illetve az elpusztított állatokat felboncolják, illet őleg a vizsgálat befe ­
jezése után a túlél ő állatokat is elpusztítják és felboncolják.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Az állatok el őkészítése  
A laboratóriumi körülményekhez legalább öt napon keresztül 
hozzászoktatott és korábbi kísérleti eljárásoknak még alá nem vetett, 
egészséges állatokat használnak. A kísérleti állatokat faj, törzs, 
eredet, nem, súly és/vagy életkor szerint leírják. Az állatokat vélet ­
lenszerűen kezelt és kontrollcsoportokba osztják be. A ketreceiket 
olyan módon helyezik el, hogy az elhelyezésükb ől adódó lehetséges 
hatásokat a minimumra lehessen csökkenteni. Minden állatot 
számmal jelölnek meg az egyedi azonosíthatóság céljából.  
1.4.2.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgált anyagot gyomorszondán át, az állatok táplálékába vagy az 
ivóvízbe keverve adják be. A szájon át történ ő beadás módszerét a 
vizsgálat céljától, valamint a vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdon ­
ságaitól függ ően választják meg.  
Szükség esetén a vizsgált anyagot feloldják vagy szuszpendálják 
alkalmas viv őanyagban. Amennyiben lehetséges, úgy els ősorban a 
vizes oldat/szuszpenzió használata javasolt, másodsorban az olajos 
(pl. kukoricaolaj) oldat/szuszpenzió alkalmazása jöhet számításba, 
és ezt követheti a másfajta viv őanyagokban történ ő feloldás. Ameny ­
nyiben nem víz a viv őanyag, akkor a viv őanyag toxikus tulajdonsá ­
gainak ismertnek kell lenniük. Meghatározzák a vizsgált anyag stabi ­
litását a beadás körülményei között.  
1.4.3.  Vizsgálati körülmények  
1.4.3.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
A javasolt faj a patkány, de a rágcsálók más fajai (pl. egerek) is 
felhasználhatók. Kísérleti célokra általánosan használt, laboratóriumi 
törzsekből származó fiatal, egészséges, feln őtt állatokat használnak. 
A nőstényeknél követelmény, hogy nem lehetnek leellettek (nullipa ­
rák) vagy vemhesek. Az adagolást az elválasztás után a lehet ő legrö­
videbb id őn belül célszer ű elkezdeni, de mindenképpen az állatok 
kilenchetes kora el őtt. A vizsgálat kezdetén az állatok testtömege 
csak minimálisan térhet el egymástól, és a nemenkénti átlagos értéktől maximum ± 20 %-kal különbözhet. Ha a vizsgálatot egy 
hosszú távú krónikustoxicitás-vizsgálat el őkísérleteként végzik el, 
akkor mindkét kísérlethez ugyanabból a törzsb ől való, azonos 
eredetű állatokat használnak.
 
1.4.3.2.  Az állatok száma és neme  
Minden egyes dózisszinthez legalább 20 állatot (10 hímet és 10 
nőstényt) alkalmaznak. Ha id őközi elpusztítást terveznek, akkor a 
csoport létszámát a kísérlet során elpusztítani szándékozott állatok számával megnövelik. A vegyi anyagra vagy annak egy közeli analó ­
giájára vonatkozó korábbi ismeretekre alapozva fontolóra lehet venni 
egy további, 10 állatból (5 hím és 5 n őstény) álló ún. kísér őcsoport 
használatát a kontrollcsoportban és a legnagyobb adaggal kezelt csoportban, hogy a kezelés id őszakát követ ően meg lehessen figyelni 
a toxikus hatás reverzibilitását vagy tartósságát. Az ilyen, kezelés 
utáni időszak hosszát a megfigyelt hatások figyelembevételével hatá ­
rozzák meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Dózisszintek  
Legalább három dózisszintet és egy párhuzamos kontrollszintet alkal ­
maznak, kivéve, ha határérték-vizsgálatra kerül sor (lásd az 1.4.3.4. pontot). A dózisszintet ismételt dózis- vagy dózisbehatároló vizs ­
gálatok eredményeire lehet alapozni, figyelembe véve minden 
korábbi, a vizsgált vagy azzal rokon anyagokra vonatkozó, rendel ­
kezésre álló toxikológiai és toxikokinetikai adatot. Ha a vizsgált anyag fizikai-kémiai tulajdonságai vagy biológiai hatásai nem 
szabnak korlátokat, akkor a legmagasabb adagolási szintet úgy 
választják ki, hogy az az állat halála vagy súlyos szenvedése nélkül idézze elő a toxicitást. Ezután az adagokat fokozatosan csökkentik, 
azzal a céllal, hogy bemutassák a dózisszintt ől függő hatásokat és a 
kimutatható káros hatással nem járó dózisszintet (NOAEL). A csök ­
kenő dózisok beállításához gyakran kétszeres-négyszeres hosszúságú 
időszakok bizonyulnak optimálisnak, és sokszor tanácsos egy 
negyedik kezelt csoport alkalmazása, igen nagy dózisbeli különbség 
(pl. több mint 6–10-szeres) alkalmazásával.
 
A kontrollcsoport vagy kezeletlen állatokból áll, vagy a viv őanyag 
ellenőrzésére szolgál, ha a vizsgált anyag adagolásának el ősegítésére 
vivőanyagot használnak. A vizsgált anyaggal való kezelést ől elte­
kintve a kontrollcsoportban lév ő állatokat a kezelt csoportba beosz ­
tottakkal azonos bánásmódban részesítik. Ha viv őanyagot használnak 
a vizsgált anyag beadásához, akkor a kontrollcsoport a viv őanyagot a 
legnagyobb alkalmazott mennyiségben kapja. Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal viszik be, és emiatt az állatok kevesebb táplálékot 
vesznek magukhoz, akkor egy párhuzamosan táplált kontrollcsoport 
használata hasznos lehet annak megállapításához, hogy a csökkent étvágy a táplálék ízletességével vagy a vizsgálati modellben beállt toxikológiai változásokkal áll-e összefüggésben.
 
Figyelembe veszik a viv őanyag és – esett ől függően – más adalék ­
anyagok alábbi jellemz őit: a felszívódásra, eloszlásra vagy anyagcse ­
rére gyakorolt hatás, a vizsgált anyagnak a szervezetben való vissza ­
tartására, ill. a vizsgált anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatás, amely módosíthatja a toxikus jellemz őket; és az állatok táplálék- és 
vízfelvételére vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatás.
 
1.4.3.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha a kísérlet során a legalább 1 000 mg/testtömeg kg/nap dózisszint, 
ill. a táplálékban vagy ivóvízben beadott anyagmennyiség megfelel ő 
koncentrációja (a testtömeg alapján végzett számítások szerint) és az e vizsgálat lefolytatására el őírt eljárás betartása mellett a vizsgált 
anyag nem okoz észlelhet ő toxikus hatásokat, és ha a szerkezet 
tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is 
várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthet ő. A 
határértékvizsgálat alkalmazható, kivéve, ha emberi expozíció ennél 
nagyobb adagolási szint használatát indokolja.
 
1.5. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  A dózisok beadása  
A kísérleti állatoknak a vizsgált anyagot 90 napon keresztül heti hét 
napon át, naponta adagolják. Bármely más adagolási rendszer – pl. heti öt nap – célszer űségét indokolni kell. Ha a vizsgált anyagot 
gyomorszondán át adják be, akkor ennek vagy egy megfelel ő intu­
bációs kanülnek a segítségével egyetlen adagban juttatják be a szert. 
Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretét ől függ. E mennyiség nem haladhatja meg az 
1 ml/100 g testtömeget, kivéve a vizes oldatok esetében, amikor 
2 ml/100g testtömeg adható. A magasabb koncentrációértékek esetén 
rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró anyagok kivételével a koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra 
kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy 
valamennyi adagolási szinten konstans mennyiséget lehessen 
adagolni a kísérleti állatoknak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
A táplálékkal vagy ivóvízzel adagolt anyagok esetében fontos bizto ­
sítani, hogy a vizsgált anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a 
szokásos táplálékfelvételt és a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal együtt adják be, akkor vagy állandó koncent ­
rációban (ppm) keverik be, vagy az állat testsúlyától függ ő, állandó 
nagyságú dózisban adagolják. A kiválasztott módszert megjelölik. 
Gyomorszondán át történ ő adagolás esetén a dózist minden nap 
azonos id őpontban adják be, mennyiségét a kísérleti állat testtöme ­
géhez igazítják, és azonos mennyiséget adnak be minden alkalom ­
mal. Ha a 90 napos vizsgálatot egy hosszan tartó krónikustoxicitás- 
vizsgálat el őkísérleteként végzik, akkor a két kísérletben azonos 
étrendet alkalmaznak.
 
1.5.2.  Megfigyelések  
A megfigyelési id őszak legalább 90 nap. A kísér őcsoportban lév ő 
állatokat, amelyekkel további megfigyeléseket terveznek, megfelel ő 
hosszúságú id őszakra kezelés nélkül tartják, hogy a toxikus hatások 
késleltetett el őfordulását vagy megmaradását, vagy visszafordítható ­
ságát megfigyeljék.  
Általános klinikai megfigyelést végeznek naponta legalább egyszer, 
lehetőleg minden nap ugyanazon id őpont(ok)ban, figyelembe véve az 
adagolást követ ően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát. 
Feljegyezik a kísérleti állatok klinikai kórállapotát. Naponta legalább 
kétszer, rendszerint a nap elején és végén megvizsgálják az összes 
állatot, hogy nem mutatják-e a morbiditás és mortalitás jeleit.  
A vizsgált anyag hatásának való els ő expozíció el őtt legalább 
egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), azt követ ően 
hetente egyszer az összes állatot részletes klinikai vizsgálatoknak 
vetik alá. E megfigyeléseket azon ketreceken kívül, ahol egyébként tartják őket, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal 
a nap hasonló id őszakában végzik el. A megfigyeléseket gondosan 
feljegyzik, lehet őleg a vizsgálatot végz ő laboratórium által meghatá ­
rozott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy a megfigyelési feltételek változatlanok legyenek. A feljegyzett észlelé ­
seknek ki kell terjedniük, de nem korlátozandók a következ őkre: a 
bőr, a bunda, a szemek és a nyálkahártyák állapotának, a vizelet- és 
ürülékkiválasztás és az autonóm mozgások (pl. könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupilla mérete, szokatlan légzési ritmusok) változá ­
saira. A testtartás, a járás bizonytalansága, a kézbevételre bekövet ­
kezett változások, valamint a tónusos vagy klónusos görcsök, szte ­
reotip viselkedés (pl. túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (pl. öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is feljegyezik (1).
 
A vizsgált anyag beadását szemtükörrel vagy más, egyenérték ű 
eszközzel végzett szemészeti vizsgálat el őzi meg, amelyet a vizs ­
gálatsorozat végén megismételnek, lehet őleg az összes állaton, de 
legalább a nagy dózist kapott egyedeken és a kontrollcsoport tagjain. 
Ha a szemben elváltozást tapasztalnak, az összes állatot megvizs ­
gálják.  
Az expozíciós id őszak vége felé és a 11. hétnél semmiképpen sem 
korábban elvégezik a különböz ő típusú (1) ingerekre (hallószervi, 
vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott reakciók vizsgálatát (2), (3), (4), a fogás/szorítás erejének becslését (5) és a motoros aktivitás felmérését (6). A követend ő eljárások további részletei a megfelel ő 
szakirodalomban találhatók. Ett ől függetlenül a hivatkozottaktól 
eltérő alternatív eljárásokat is lehet alkalmazni.
 
A vizsgálatsorozat végén lefolytatott funkcionális megfigyelésekt ől el 
lehet tekinteni, ha ilyen jelleg ű adatok más vizsgálatok alapján 
rendelkezésre állnak, és a napi klinikai megfigyelések nem tártak 
fel funkcionális hiányosságokat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Kivételesen a funkcionális megfigyelésekt ől azon csoportok esetében 
is el lehet tekinteni, amelyek egyébként olyan mérték ű toxicitás jeleit 
produkálják, ami már jelent ős mértékben megzavarná a funkcionális 
vizsgálat eredményeit.  
1.5.2.1.  Testtömeg és táplálék-/vízfogyasztás  
Minden állatot hetente legalább egyszer lemérnek. A felvett táplálék 
mennyiségét hetente legalább egyszer lemérik. Ha a vizsgált anyagot az ivóvízbe keverik, akkor a vízfogyasztást is legalább hetente lemé ­
rik. A vízfogyasztás a táplálékkal és a gyomorszondával történ ő 
bejuttatásra alapozott vizsgálatoknál is figyelembe vehet ő tényező, 
mivel ezek során az ivási szokások megváltozhatnak.
 
1.5.2.2.  Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok  
Vérmintákat vesznek egy megnevezett helyr ől és – amennyiben 
lehetséges – ezeket megfelel ő körülmények között tárolják. A vizs ­
gálati időszak végén az állatok elpusztítása el őtt vagy annak része ­
ként vérmintát vesznek.  
A vizsgálati id őszak végén és az esetleges id őközi vérmintavétel 
alkalmával a következ ő hematológiai vizsgálatokat végzik el: hema ­
tokrit, hemoglobin koncentráció, vörösvértestszám, leukocitaszám (teljes és differenciált vérkép), trombocitaszám és a véralvadási id ő/­
képesség mérése.
 
A szövetekben jelentkez ő fontosabb toxikus hatások és különösen a 
vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai 
biokémiai értékek meghatározását közvetlenül az állatok elpusztítása 
előtt vagy annak részeként elvégzett vérvétel során szerzett mintán 
végzik el (eltekintve a haldokló és/vagy id őközben leölt egyedekt ől). 
A hematológiai vizsgálatokhoz hasonló módon id őközbeni mintavé ­
telt lehet végezni klinikai biokémiai vizsgálatok céljaira. A vérvétel 
előtti éjszaka ajánlatos az állatokat koplaltatni (  1 ). A vérplazma-és 
vérszérummeghatározások során vizsgálandó elemek: nátrium, kálium, vércukor, összkoleszterin, karbamid, vér karbamid-nitrogén 
szintje, kreatinin, összprotein és albumin, továbbá több mint két, 
májkárosodást jelz ő enzim (pl. alanin-aminotranszferáz, aszpartát- 
aminotranszferáz, alkalikus foszfatáz, gamma-glutamil-transzpeptidáz és szorbit-dehidrogenáz). További enzimek vizsgálatát (májjal vagy 
más szervekkel kapcsolatosakat), és az epesavak mérését, amelyek 
bizonyos körülmények között hasznos információkkal szolgálhatnak, szintén be lehet vonni a vizsgálatok körébe.
 
Kiegészítésként, a vizsgálatok utolsó hetében, amikor a vizeletet 
előre meghatározott id őpontokban gy űjtik, az alábbi vizeletminta- 
vizsgálatokat lehet elvégezni: megjelenés, mennyiség, ozmolalitás 
vagy fajsúly, pH-érték, fehérjék, glukóz és vér/vérsejtek.  
Ezeken túlmen ően megfontolható az általános szöveti roncsolódás 
szérummarkereinek vizsgálata. Más vizsgálatokat is elvégeznek, ha a vizsgált anyagnak ismert vagy feltételezhet ő hatása van a kapcso ­
lódó anyagcsere-folyamatokra; ilyen pl. a kalcium, a foszfát, éhgyo ­
morra mért triglicerid, specifikus hormonok, a methemoglobin és a 
kolinészteráz mérése. Ezeket az értékeket az egyes besorolási osztá ­
lyokhoz tartozó vegyi anyagokra nézve vagy eseti alapon célszer ű 
meghatározni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) A szérum- és a plazmavizsgálatok, de f őleg a glükóz meghatározása miatt ajánlatos a 
vizsgálat el őtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek f ő indoka az, hogy ha a vizs ­
gálatokat megel őző koplaltatás nélkül végzik, akkor a kapott eredmények meglehet ősen 
változatosak lennének, ami így a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelmezését 
megnehezítené. Más oldalról megközelítve a kérdést, azt is el kell ismerni, hogy a 
koplaltatás befolyásolja a kísérleti állatok (rendes) anyagcseréjét, különösen azon tanul ­
mányok esetében, ahol a vizsgált anyagot a táplálékkal adagolják, és így következik be 
az expozíció. Ha mégis az éjszakai koplaltatás mellett döntenek, akkor a tanulmány 
negyedik hetében, a funkcionális megfigyeléseket követ ően meg kell határozni a klinikai 
biokémiai paramétereket.
 Rugalmas hozzáállásra van szükség, amely vizsgált fajtól és az adott 
vizsgált anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ.  
Ha a rendelkezésre álló kiinduló adatok nem bizonyulnak 
elegendőnek, akkor megfontolandó a hematológiai és klinikai bioké ­
miai változók meghatározása az adagolás kezdete el őtt. Általában 
nem javasolt az ilyen adatok meghatározása a kezelés megkezdése előtt (7).
 
1.5.2.3.  Autopszia  
A vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autopszi ­
ának vetik alá, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és 
ezek szervei. Az összes állat máját, veséit, mellékveséit, heréit és mellékheréit, méhét, petefészkeit, csecsem őmirigyét, lépét, agyát és 
szívét (eltekintve a haldokló és/vagy id őközben leölt egyedekt ől) 
megtisztítják minden rátapadt szövett ől, és a boncolást követ ően a 
lehető legrövidebb id őn belül megmérik a kiszáradás megel őzése 
érdekében.
 
Az alábbi testszöveteket mind a szövetek típusának megállapítása, 
mind pedig a szándékolt kés őbbi kórszövettani vizsgálatok szem ­
pontjából célszer ű fixálni: minden szövetet, amin van makroszkó ­
pikus változás, az agyat (a reprezentatív részek között a nagyagyat, 
kisagyat és a nyúltagyat/nyúltagyi hidat), a gerincvel őt (három 
szinten: nyaki, mellkasi középs ő szakasz és ágyéktájék), a hipofí ­
zist, a pajzsmirigyet és mellékpajzsmirigyet, a csecsem őmirigyet, a 
nyelőcsövet, a nyálmirigyeket, a gyomrot, a vékony- és vastagbelet 
(beleértve a Peyer-plakkot), a májat, a hasnyálmirigyet, a veséket, a mellékveséket, a lépet, szívet, a légcsövet és a tüd őket (ezeket 
felfújt állapotban kell rögzíteni és fixálni), az aortát, ivarmirigye ­
ket, a méhet, a járulékos ivarszerveket, a n őstények eml őmirigyeit, 
a prosztatát, a húgyhólyagot, az epehólyagot (egérnél), a nyirok ­
csomókat (egyet lehet őleg a vizsgált anyag beadási útvonalába es ő, 
egyet pedig egy attól távoli helyr ől véve, a keringési rendszerre 
gyakorolt hatások megállapításához), a perifériás idegeket (csíp ő 
vagy sípcsont környéki), lehet őleg az izomzathoz közeli helyr ől 
véve, egy metszetet a csontvel őből (és/vagy egy, friss csontvel őből 
felszívott mintát), a b őrt és a szemeket (ha a szemészeti vizs ­
gálatok elváltozásokat jeleztek). A klinikai és más jelleg ű 
megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is szük ­
ségesnek t űnhet. A fentieken túl meg őriznek minden olyan más 
szervet is, amelyek a vizsgált anyag ismert tulajdonságai alapján 
valószínűleg célszerveknek tekinthet ők.
 
1.5.2.4.  Kórszövettani vizsgálatok  
A tartósított szerveket és szöveteket mind a kontrollcsoport, mind a 
magas dózissal kezelt csoport összes egyede esetében teljes kórszö ­
vettani vizsgálatnak vetik alá. Ha a magas dózissal kezelt csoport egyedei esetében a kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyel ­
hetők meg, e vizsgálatot az összes többi, különböz ő dózissal kezelt 
csoport egyedeire is kiterjesztik.
 
Minden makroszkopikus eltávozást megvizsgálnak.  
Ún. kiegészít ő csoport használata esetén az egyedek azon szerveit és 
szöveteit vizsgálják meg, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei 
esetében elváltozásokat lehetett kimutatni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. ADATOK  
Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az 
összes adatot táblázat formájában összegzik, a vizsgált állatok 
minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult 
a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a kísérlet során, valamint az elpusztulás és az elpusztítás id őpontját; hány egyed mutatta toxicitás jeleit, a 
megfigyelt toxicitás jeleinek leírását, ideértve bármely toxikus hatás 
kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat 
mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elválto ­
zástípusokat mutató állatok százalékos arányát.
 
Amennyiben lehetséges, a nyers adatokat megfelel ő, általánosan elfo ­
gadott statisztikai módszerrel értékelik ki. A statisztikai módszert már a vizsgálat tervezésének idején kiválasztják.
 
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – tartalmazza a követ ­
kező információkat:  
2.2.1.  A vizsgált anyag  
— fizikai megjelenése, tisztasága és fizikai-kémiai tulajdonságai,  
— azonosító adatok,  
— vivőanyag (ha van): a viv őanyag – ha az nem víz – kiválasztá ­
sának indoklása.  
2.2.2.  A vizsgált fajok  
— a felhasznált állatok faja és törzse,  
— az állatok száma, életkora és neme,  
— az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálatok kezdetekor.  
2.2.3.  Vizsgálati körülmények  
— a dózisszintek megválasztásának indokai,  
— a vizsgált anyag formulálásának/étrendbe való beillesztésére 
vonatkozó részletek, a készítmény koncentrációja, stabilitása és 
homogenitása,  
— a vizsgált anyag adagolásának részletei,  
— átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/testtömeg kg/ ­
nap), ha ez alkalmazható,  
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó adatok.  
2.2.4.  Eredmények  
— az egyedek testsúlya és annak változásai,  
— táplálék-/vízfogyasztásra vonatkozó adatok,  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatok, nemek és adagolási szint 
szerinti csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— a megfigyelt klinikai tünetek természete, súlyossága és tartama 
(reverzibilisek vagy nem);  
— a szemészeti vizsgálatok eredményei,  
— érzékszervek m űködése, szorítás er őssége, motoros aktivitás érté ­
kelése (ahol ilyen adatok rendelkezésre állnak),  
— hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszonyítási 
értékekkel,  
— a klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszo­
nyítási értékekkel,  
— a végs ő testtömeg, szervtömegek és a szervtömeg/testtömeg 
hányadosok,  
— boncolási leletek,  
— az összes kórszövettani lelet részletes leírása,  
— abszorpciós adatok, ha ilyenek rendelkezésre állnak,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, amennyiben lehetséges.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) IPCS (1986). PRinciples and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.  
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.  
(4) Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. 
Pharmacol., 108, pp. 267-283.
 
(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
 
(6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. 
W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
pp. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198- 201.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  SZUBKRÓNIKUS ORÁLIS TOXICITÁSI VIZSGÁLAT, 90 
NAPOS, ISMÉTELT ADAGOLÁSÚ ORÁLIS TOXICITÁSI 
VIZSGÁLAT NEM RÁGCSÁLÓKON  
1. MÓDSZER  
E szubkrónikusorálistoxicitás-vizsgálat megfelel az OECD TG 409- 
nek (1998).  
1.1. BEVEZETÉS  
Egy vegyi anyag toxikus jellemz őinek értékelése és felmérése során 
az ismételt adagolású szubkrónikus orális toxicitást azután lehet meghatározni, hogy az akut vagy 28 napos ismételt adagolású toxi ­
citásvizsgálatok kezdeti eredményei már rendelkezésre állnak. A 90 
napos vizsgálat olyan hosszabb id őtartamú ismételt expozícióból 
származó lehetséges egészségkárosodás veszélyeir ől szolgáltat infor ­
mációkat, ami id őben átfogja a fiatal feln őttkorig terjed ő gyors növe ­
kedés szakaszát. A vizsgálat tájékoztat a fontosabb toxikus hatások ­
ról, jelzi a célszerveket és a felhalmozódás lehet őségét, és becslést ad 
az expozíció kimutatható káros hatással nem járó szintjére (NOAEL) nézve, amit fel lehet használni a krónikustoxicitás-vizsgálatok során az adagolási szintjeinek kiválasztásához és az emberi expozíció 
biztonsági kritériumainak megállapításához.
 
A vizsgálati módszer, amely lehet ővé teszi a vegyi anyagoknak való 
kitettség kedvez őtlen hatásainak meghatározását nem rágcsálókon, 
csak az alábbi esetekben használandó:  
— ha más vizsgálatok megállapításai jelzik annak szükségességét, 
hogy egy második, nem rágcsáló fajon végzett kísérlettel kell tisztázni/leírni az eredményeket,
 
— ha a toxikokinetikai vizsgálatok arra utalnak, hogy a laborató ­
riumi kísérletek céljaira egy specifikus nem rágcsáló típusú faj lenne a legmegfelel őbb kísérleti állat,
 
— ha más, különleges okok indokolják egy nem rágcsáló faj hasz ­
nálatát.  
Lásd még az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Dózis : a vizsgált anyag beadott mennyisége. A dózis mennyiségét 
tömegben (gramm vagy milligramm) vagy a vizsgált anyag és a vizsgált állat tömegének hányadosában (pl. milligramm anyag/ ­
testtömeg kilogramm), vagy állandó táplálékbeli koncentráció formá ­
jában (ppm vagy milligramm/táplálék-kilogramm) fejezik ki.
 
Adagolás : általános meghatározás, ami a dózist, az adagolás gyako ­
riságát és id őtartamát tartalmazza.  
NOAEL : a „kimutatható káros hatással nem járó dózisszint” (no 
observed adverse effect level) rövidítése, azon legmagasabb dózisz ­
szintet jelöli, amelynél nem észlelhet ő a kezeléssel összefügg ő 
kedvezőtlen hatás.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta szájon át adják be több kísérleti állat ­
csoportnak, csoportonként más-más adagolási szinten, 90 napon keresztül. A szer beadása id őszakában az állatokat a toxicitás jele ­
inek észlelése érdekében gondosan megfigyelik. Az elpusztult, illetve 
az elpusztított állatokat felboncolják, illet őleg a vizsgálat befejezése 
után a túlél ő állatokat is elpusztítják és felboncolják.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  A faj kiválasztása  
A nem rágcsáló fajok közül a leggyakrabban használt a kutya, annak 
is egy meghatározott fajtája; ez rendszerint a beagle kutya. Más 
állatfajok is használhatók, pl. a sertés vagy a törpemalac. F őemlősök 
használata nem javasolt, külön indoklást igényel. Fiatal, egészséges állatokat használnak; a kutya esetében a vizsgált anyag adagolását 4–6 hónapos életkorban, de kilenc hónapos kornál nem kés őbb 
célszerű megkezdeni. Ha a vizsgálatot egy hosszú távú krónikusto ­
xicitás-vizsgálat el őkísérleteként végzik el, akkor mindkét kísérlethez 
ugyanazon törzsb ől való, azonos eredet ű állatokat használnak.
 
1.4.2.  Az állatok el őkészítése  
A laboratóriumi körülményekhez hozzászoktatott és korábbi kísérleti 
eljárásoknak még alá nem vetett, egészséges, fiatal állatokat hasz ­
nálnak fel. Az akklimatizáció id őtartama a kísérlethez kiválasztott 
fajtól és az állatok eredetét ől függ. Kutyák és a helyben, e célra 
tenyésztett sertések esetében legalább öt nap, míg a küls ő forrásból 
beszerzett állatoknál legalább két hét szoktatási id őtartam ajánlott. A 
kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, testtömeg és/vagy életkor 
szerint leírják. Az állatokat véletlenszer űen kezelt és kontrollcsopor ­
tokba osztják be. A ketreceiket olyan módon helyezik el, hogy az elhelyezésükb ől adódó lehetséges hatásokat a minimumra lehessen 
csökkenteni. Minden állatot számmal jelölnek meg az egyedi azono ­
síthatóság céljából.
 
1.4.3.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgált anyagot gyomorszondán át, az állatok táplálékába vagy az 
ivóvízbe keverve vagy kapszulákban adják be. A szájon át történ ő 
beadás módszerét a vizsgálat céljától, valamint a vizsgált anyag fizi ­
kai-kémiai tulajdonságaitól függ ően választják meg.  
Szükség esetén a vizsgált anyagot feloldják vagy szuszpendálják 
alkalmas viv őanyagban, amennyiben lehetséges, els ősorban a vizes 
oldat/szuszpenzió használata javasolt, másodsorban az olajos oldat/ ­
emulzió (pl. kukoricaolaj) alkalmazása jöhet számításba, és ezt követheti a másfajta viv őanyagokban való feloldás. Amennyiben 
nem víz a viv őanyag, akkor a viv őanyag toxikus tulajdonságainak 
ismertnek kell lenniük. Meghatározzák a vizsgált anyag stabilitását a beadás körülményei között.
 
1.5 A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  Az állatok száma és neme  
Minden dózisszinthez legalább 8 állatot (4 hímet és 4 n őstényt) 
alkalmaznak. Ha id őközi elpusztítást terveznek, akkor a csoport 
létszámát a kísérlet során elpusztítani szándékozott állatok számával 
megnövelik. A kísérlet végére életben maradó állatok száma elég ­
séges kell, hogy legyen a toxikus hatások értékeléséhez. A vegyi anyagra vagy annak egy közeli analógiájára vonatkozó korábbi isme ­
retekre alapozva fontolóra lehet venni egy további, 8 állatból (4 hím 
és 4 nőstény) álló ún. kísér őcsoport használatát a kontrollcsoportban 
és a legnagyobb adaggal kezelt csoportban, hogy a kezelés id őszakát 
követően meg lehessen figyelni a toxikus hatás reverzibilitását vagy 
tartósságát. Az ilyen, kezelés utáni id őszak hosszát a megfigyelt 
hatások figyelembevételével határozzák meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Adagolási szintek  
Legalább három dózisszintet és egy párhuzamos kontrollszintet alkal ­
maznak, kivéve, ha határérték-vizsgálatra kerül sor (ld. 1.5.3. pont). A dózisszintet ismételt dózis vagy dózisbehatároló vizsgálatok ered ­
ményeire lehet alapozni, figyelembe véve minden korábbi, a vizsgált 
vagy azzal rokon anyagok toxicitására és a toxiko-kinetikára vonat ­
kozóan rendelkezésre álló adatokat. Ha a vizsgált anyag fizikai- kémiai tulajdonságai vagy biológiai hatásai nem szabnak korlátokat, 
akkor a legmagasabb adagolási szintet úgy választják ki, hogy az az 
állat halála vagy komoly szenvedése nélkül idézze el ő a toxicitást. 
Ezután az adagokat fokozatosan csökkentik azzal a céllal, hogy 
bemutassák a dózisszintt ől függő hatásokat és a kimutatható káros 
hatással nem járó dózisszintet (NOAEL). A csökken ő dózisok beál ­
lításához gyakran kétszeres-négyszeres hosszúságú id őszakok bizo ­
nyulnak optimálisnak, és sokszor tanácsos egy negyedik kezelt 
csoport alkalmazása, igen nagy dózisbeli különbség (pl. több mint 
6–10-szeres) alkalmazásával.
 
A kontrollcsoport vagy kezeletlen állatokból áll, vagy a viv őanyag 
ellenőrzésére szolgál, ha a vizsgált anyag adagolásának el ősegítésére 
vivőanyagot használnak. A vizsgált anyaggal való kezelést ől elte­
kintve a kontrollcsoportban lév ő állatokat a kezelt csoportba beosz ­
tottakkal azonos bánásmódban részesítik. Ha viv őanyagot használnak 
a vizsgált anyag beadásához, akkor a kontrollcsoport a viv őanyagot a 
legnagyobb alkalmazott mennyiségben kapja. Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal viszik be, és emiatt az állatok kevesebb táplálékot vesznek magukhoz, akkor egy párhuzamosan táplált kontrollcsoport 
használata hasznos lehet annak megállapításához, hogy a csökkent 
étvágy a táplálék ízletességével vagy a vizsgálati modellben beállt toxikológiai változásokkal áll-e összefüggésben.
 
Figyelembe veszik a viv őanyag és – esett ől függően – más adalék ­
anyagok alábbi jellemz őit: a felszívódásra, eloszlásra vagy anyagcse ­
rére gyakorolt hatás, a vizsgált anyagnak a szervezetben való vissza ­
tartására, ill. a vizsgált anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatás, 
amely módosíthatja a toxikus jellemz őket; és az állatok táplálék- és 
vízfelvételére vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatás.  
1.5.3.  Határérték-vizsgálat  
Ha a kísérlet során a legalább 1 000mg/testtömeg kg/nap dózisszint 
és az e vizsgálat lefolytatására el őírt eljárás betartása mellett a vizs ­
gált anyag nem okoz észlelhet ő toxikus hatásokat, és ha a szerkezet 
tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok alapján nem is 
várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási 
szintet átfogó vizsgálat elvégzése szükségtelennek tekinthet ő. A 
határérték-vizsgálat alkalmazható, kivéve, ha emberi expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja.
 
1.5.4.  A dózisok beadása  
A kísérleti állatoknak a vizsgált anyagot 90 napon keresztül heti hét 
napon át, naponta adagolják. Bármely más adagolási rendszer – pl. heti öt nap – célszer űségét indokolni kell. Ha a vizsgált anyagot 
gyomorszondán át adják be, akkor ennek vagy egy megfelel ő intu­
bációs kanülnek a segítségével egyetlen adagban juttatják be a szert. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretét ől függ. Ennek a mennyiségnek lehet őség 
szerint alacsonynak kell lennie. A magasabb koncentrációértékek 
esetén rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelel ő beállításával a mini ­
málisra kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, 
hogy valamennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen 
adagolni a kísérleti állatoknak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
A táplálékkal vagy ivóvízzel adagolt anyagok esetében fontos bizto ­
sítani, hogy a vizsgált anyag beadott mennyisége ne zavarja meg a 
szokásos táplálékfelvételt és a vízháztartás egyensúlyát. Ha a vizsgált anyagot a táplálékkal együtt adják be, akkor vagy állandó koncent ­
rációban (ppm) keverik be, vagy az állat testsúlyától függ ő, állandó 
nagyságú dózisban adagolják. A kiválasztott módszert megjelölik. 
Gyomorszondán át vagy kapszulával történ ő adagolás esetén a dózist 
minden nap azonos id őpontban adják be, mennyiségét a kísérleti állat 
testtömegéhez igazítják, és azonos mennyiséget adnak be minden 
alkalommal. Ha a 90 napos vizsgálatot egy hosszan tartó krónikus ­
toxicitás-vizsgálat el őkísérleteként végzik, akkor a két kísérletben 
azonos étrendet alkalmaznak.
 
1.5.5.  Megfigyelések  
A megfigyelési id őszak legalább 90 nap. A kísér őcsoportban lév ő 
állatokat, amelyekkel további megfigyeléseket terveznek, megfelel ő 
hosszúságú id őszakra kezelés nélkül tartják, hogy a toxikus hatások 
késleltetett el őfordulását vagy megmaradását, vagy visszafordítható ­
ságát megfigyeljék.  
Általános klinikai megfigyelést végeznek naponta legalább egyszer, 
lehetőleg minden nap ugyazon id őpont(ok)ban, figyelembe véve az 
adagolást követ ően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát. 
Feljegyzik a kísérleti állatok klinikai kórállapotát. Naponta legalább kétszer, rendszerint a nap elején és végén megvizsgálják az összes állatot, hogy nem mutatják-e a morbiditás és mortalitás jeleit.
 
A vizsgált anyag hatásának való els ő expozíció el őtt legalább 
egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás érdekében), azt követ ően 
hetente egyszer az összes állatot részletes klinikai vizsgálatoknak vetik alá. E megfigyeléseket azon ketreceken kívül, ahol egyébként 
tartják őket, lehetőleg egy szabványos karámban, minden alkalommal 
a nap hasonló id őszakában végzik el. A megfigyeléseket gondosan 
feljegyzik, beleértve jelentkezésük id őpontját, méretüket és tartalmu ­
kat. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük, de nem korláto ­
zandók a következ őkre: a bőr, a bunda, a szemek és a nyálkahártyák 
állapotának, a vizelet- és ürülékkiválasztás és az autonóm mozgások (pl. könnyezés, sz őrzet felborzolódása, pupilla mérete, szokatlan 
légzési ritmusok) változásaira. A testtartás, a járás bizonytalansága, 
a kézbevétel, valamint a tónusos vagy klónusos görcsök, sztereotip 
viselkedés (pl. túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr viselkedésmód (pl. öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is feljegyezik.
 
A vizsgált anyag beadását szemtükörrel vagy más, egyenérték ű 
eszközzel végzett szemészeti vizsgálat el őzi meg, amelyet a vizs ­
gálatsorozat végén megismételnek, lehet őleg az összes állaton, de 
legalább a nagy dózist kapott egyedeken és a kontrollcsoport tagjain. Ha a szemben elváltozást tapasztalnak, az összes állatot 
megvizsgálják.
 
1.5.5.1.  Testtömeg és táplálék-/vízfogyasztás  
Minden állatot hetente legalább egyszer lemérnek. A felvett táplálék 
mennyiségét hetente legalább egyszer lemérik. Ha a vizsgált anyagot az ivóvízbe keverik, akkor a vízfogyasztást is legalább hetente lemé ­
rik. A vízfogyasztás a táplálékkal és a gyomorszondával történ ő 
bejuttatásra alapozott vizsgálatoknál is figyelembe vehet ő tényező, 
mivel ezek során az ivási szokások megváltozhatnak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok  
Vérmintákat vesznek egy megnevezett helyr ől és – amennyiben 
lehetséges – ezeket megfelel ő feltételek mellett tárolják. A vizsgálati 
időszak végén az állatok elpusztítása el őtt vagy annak részeként 
vérmintát vesznek.  
A vizsgálatok elején, majd vagy havi rendszerességgel, vagy a vizs ­
gálati időszak közepe táján és végül a vizsgálati id őszak végén a 
következőkre kiterjed ő hematológiai vizsgálatokat végezik el: hema ­
tokrit, hemoglobin-koncentráció, vörösvértestszám, leukocitaszám (teljes és differenciált vérkép), trombocitaszám, illetve a véralvadási idő/képesség mérése, protrombinid ő vagy tromboplasztinid ő mérése.
 
A szövetekben jelentkez ő fontosabb toxikus hatások és különösen a 
vesékre és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását minden állat vérmintáján elvégzik a vizsgálatok elején, majd vagy havi rendszerességgel, vagy a vizs ­
gálati időszak közepe táján, és végül a vizsgálati id őszak végén. A 
vizsgálatok az alábbi területekre terjednek ki: elektrolit-egyensúly, szénhidrát-anyagcsere, valamint máj- és vesefunkció. Az elvégzend ő 
vizsgálatok kiválasztása függ a vizsgált anyag hatásmechanizmusa 
megfigyelésének módjaitól. Az állatokat a fajra meghatározott 
megfelelő ideig koplaltatják a vérvétel el őtt. A vizsgálandó elemek: 
kalcium, foszfor, klorid, nátrium, kálium, éhgyomorra mért vércukor, alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, ornitin-dekarbo ­
xiláz, gamma-glutamil-transzpeptidáz, karbamid nitrogén, albumin, 
vérkreatinin, összes bilirubin és összes szérumprotein.
 
Legalább a vizsgálatok elejére, közepére, majd a végére id őzített 
vizeletgyűjtéssel az alábbi vizeletminta-vizsgálatokat végezik el: 
megjelenés, mennyiség, ozmolaritás vagy fajsúly, pH-érték, fehérjék, 
glukóz és vér/vérsejtek. Szükség szerint további paraméterek vizs ­
gálatát is be lehet vezetni, a megfigyelt hatás(ok) vizsgálati körének bővítése érdekében.
 
Ezenfelül célszer ű lehet elvégezni az általános jelleg ű szövetsérü ­
lések szérumjelz őinek a vizsgálatát. A megfelel ő toxikológiai értéke ­
léshez még esetlegesen szükséges további mérések és vizsgálatok közé tartozik a lipidek, hormonok elemzése, sav/bázis egyensúly, 
methemoglobin- és kolineszteráz-inhibitáció. A megfigyelt hatások 
vizsgálati körének b ővítése érdekében további klinikai biokémiai 
vizsgálatokat lehet bevezetni. Ezeket az egyes besorolási osztá ­
lyokhoz tartozó vegyi anyagokra nézve vagy eseti alapon célszer ű 
meghatározni.
 
Rugalmas hozzáállásra van szükség, amely a vizsgált fajtól és az 
adott vizsgált anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egya ­
ránt függ.  
1.5.5.3.  Autopszia  
A vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autopszi ­
ának vetik alá, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg és a hasüreg és ezek szervei. Az összes állat máját az epehólyaggal együtt, veséit, 
mellékveséit, heréit és mellékheréit, méhét, petefészkeit, pajzsmiri ­
gyét (a mellékpajzsmirigyekkel együtt), csecsem őmirigyét, lépét, 
agyát és szívét (eltekintve a haldokló és/vagy id őközben leölt egye ­
dektől) megtisztítják minden rátapadt szövett ől, és a boncolást 
követő lehető legrövidebb id őn belül megmérik a kiszáradás megel ő­
zése érdekében.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Az alábbi testszöveteket mind a szövetek típusának megállapítása, 
mind pedig a szándékolt kés őbbi kórszövettani vizsgálatok szem ­
pontjából célszer ű konzerválni a legmegfelel őbb fixálószerben: 
minden szövetet, amin van makroszkópikus elváltozás, az agyat (a reprezentatív részek között a nagyagyat, kisagyat és a 
nyúltagyat/nyúltagyi hidat), a gerincvel őt (három szinten: nyaki, 
mellkasi középs ő szakasz és ágyéktájék), a hipofízist, a szemeket, 
a pajzsmirigyet és mellékpajzsmirigyet, a csecsem őmirigyet, a 
nyelőcsövet, a nyálmirigyeket, a gyomrot, a vékony- és vastagbelet 
(beleértve a Peyer-plakkot), a májat, az epehólyagot, a hasnyálmi ­
rigyet, a veséket, a mellékveséket, a lépet, a szívet, a légcsövet és a tüdőket, az aortákat, ivarmirigyeket, a méhet, a járulékos ivar ­
szerveket, a n őstények eml őmirigyeit, a prosztatát, a húgyhólyagot, 
a nyirokcsomókat (egyet lehet őleg a vizsgált anyag beadási útvona ­
lába eső, egyet pedig egy attól távoli helyr ől véve, a keringési 
rendszerre gyakorolt hatások megállapításához), a perifériás idegeket (csíp ő vagy sípcsont környéki), lehet őleg az izomzathoz 
közeli helyr ől véve, egy metszetet a csontvel őből (és/vagy egy, 
friss csontvel őből felszívott mintát) és a b őrt. A klinikai és más 
jellegű megfigyelések alapján további testszövetek vizsgálata is 
szükségesnek t űnhet. A fentieken túl meg őriznek minden olyan 
más szervet is, amelyek a vizsgált anyag ismert tulajdonságai 
alapján valószín űleg célszerveknek tekinthet ők.
 
1.5.5.4.  Kórszövettani vizsgálatok  
A tartósított szerveket és szöveteket mind a kontrollcsoport, mind a 
magas dózissal kezelt csoport összes egyede esetében teljes kórszö ­
vettani vizsgálatnak vetik alá. Ha a magas dózissal kezelt csoport 
egyedei esetében a kezelésnek tulajdonítható elváltozások figyel ­
hetők meg, ezt a vizsgálatot az összes többi, különböz ő dózissal 
kezelt csoport egyedeire is kiterjesztik.  
Minden makroszkópikus elváltozást megvizsgálnak.  
Ún. kiegészít ő csoport használata esetén az egyedek azon szerveit és 
szöveteit vizsgálják meg, amelyeknél a kezelt csoportok egyedei 
esetében elváltozásokat lehetett kimutatni.  
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. ADATOK  
Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az 
összes adatot táblázat formájában összegzik, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult 
a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani 
humánus okokból a kísérlet során, valamint az elpusztulás és az elpusztítás id őpontját; hány egyed mutatta toxicitás jeleit, a 
megfigyelt toxicitás jeleinek leírását, ideértve bármely toxikus hatás 
kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat 
mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elválto ­
zástípusokat mutató állatok százalékos arányát.
 
Amennyiben lehetséges, a nyers adatokat megfelel ő, általánosan elfo ­
gadott statisztikai módszerrel értékelik ki. A feldolgozandó adatokat 
és statisztikai módszereket már a vizsgálat tervezésének idején kivá ­
lasztják.  
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – tartalmazza a követ ­
kező információkat:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  A vizsgált anyag  
— fizikai megjelenése, tisztasága és fizikai-kémiai tulajdonságai,  
— azonosító adatok,  
— vivőanyag (ha van): a viv őanyag – ha az nem víz – kiválasztá ­
sának indoklása.  
2.2.2.  A vizsgált fajok  
— a felhasznált állatok faja és törzse,  
— az állatok száma, életkora és neme,  
— az állatok eredete, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálatok kezdetekor.  
2.2.3.  Vizsgálati körülmények  
— a dózisszintek megválasztásának indokai,  
— a vizsgált anyag formulálásának/étrendbe való beillesztésére 
vonatkozó részletek, a készítmény koncentrációja, stabilitása és homogenitása,
 
— a vizsgált anyag adagolásának részletei,  
— a tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) és az étrendbe illesztett, 
illetve vízzel beadott vizsgált anyag koncentrációjának (ppm) a 
tényleges dózisra való átváltási tényez ője, ha ilyen értelmezhet ő a 
vizsgálatok során,  
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó részletek.  
2.2.4.  Eredmények  
— az egyedek testtömege és annak változásai,  
— táplálék-/vízfogyasztásra vonatkozó adatok,  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatok, nemek és adagolási szint 
szerinti csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,  
— a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és id őtartama (a 
változások reverzibilisek-e vagy sem)  
— a szemészeti vizsgálatok eredményei,  
— a hematológiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszonyítási 
értékekkel,  
— a klinikai biokémiai vizsgálatok eredményei, a megfelel ő viszo­
nyítási értékekkel,  
— a végs ő testtömeg, szervtömegek és a szervek/ ­
testtömeghányadosok,  
— boncolási leletek,  
— az összes kórszövettani lelet részletes leírása,  
— abszorbciós adatok, ha ilyenek rendelkezésre állnak,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, amennyiben lehetséges.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  SZUBKRÓNIKUS DERMÁLIS TOXICITÁSVIZSGÁLAT, 90 
NAPOS, ISMÉTELT DERMÁLIS ADAGOLÁSÚ VIZSGÁLAT 
RÁGCSÁLÓFAJOKON  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta a b őrre adagoljuk, fokozatosan növekv ő 
dózisokban több kísérleti állatcsoportnak, 90 napon keresztül. A 
vizsgálati id őszak alatt az állatokat naponta kell vizsgálni a mérgezés 
jeleinek észlelése érdekében. A vizsgálat ideje alatt elpusztult állat ­
okat fel kell boncolni, a vizsgálat lezárásakor pedig a túlél ő állatokat 
is el kell pusztítani, és fel kell boncolni.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
Az állatokat a vizsgálat el őtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat 
tartási és táplálási körülményei között kell tartani. Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése el őtt véletlenszer ű kiválasz ­
tással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani. A vizsgálat 
megkezdése el őtt nem sokkal a törzs háti felületén le kell nyírni az 
állatok sz őrét. Borotválni is lehet, de azt a vizsgálat megkezdése el őtt 
megközelít őleg 24 órával kell elvégezni. A vizsgálat során általában 
ismételt nyírás és borotválás szükséges, rendszerint heti id őközön­
ként. A nyírás vagy borotválás során gondosan ügyelni kell arra, hogy a bőrt ne sértsük meg. A testfelület legalább 10 %-át szabaddá 
kell tenni a vizsgált anyag alkalmazásához. Az állat testsúlyát is 
tekintetbe kell venni, amikor a megtisztítandó felületr ől, illetve a 
fedőkötés méretér ől döntünk. Ha szilárd anyagot vizsgálunk, amelyet 
adott esetben porítani is lehet, az anyagot vízzel kell ően át kell 
nedvesíteni, vagy szükség esetén viv őanyagot kell alkalmazni 
annak biztosítására, hogy a b őrrel megfelel ő módon érintkezzen. A 
folyékony vizsgálati anyagokat rendszerint hígítás nélkül kell adagolni. Az adagolás heti öt-hét alkalommal történik.
 
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
1.6.2.1. A k í s é r l e t h e z f e l h a s z n á l t á l l a t o k  
Kifejlett patkány, nyúl vagy tengerimalac használható. Más faj is 
használható, de azok használatát meg kell indokolni. A vizsgálat 
kezdetén az állatok súlya lehet őleg csak minimálisan térjen el 
egymástól, az átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal különbözhet. 
Ha a szubkrónikus dermális vizsgálatot valamely hosszú távú vizs ­
gálat előzetes vizsgálataként végezzük, mindkét vizsgálathoz ugyan ­
azon fajt, illetve kísérleti állattörzset kell felhasználni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2. A z á l l a t o k s z á m a é s n e m e  
Minden adagolási szinthez legalább 20 egészséges b őrű állatot (10 
hímet és 10 n őstényt) kell felhasználni. A n őstényeknél követelmény, 
hogy nem lehetnek leellettek vagy vemhesek. Ha id őközi elpusztítást 
tervezünk, akkor a létszámot annyival kell megnövelni, ahány állatot 
a vizsgálat befejezése el őtt el akarunk pusztítani. Ezenkívül még egy 
20 fős (nemenként 10 állat) kísér ő állatcsoportot is kezelhetünk a 
legnagyobb adaggal 90 napon át, amelyeknek állatain a kezelés után 
28 nappal megfigyelhetjük a toxikus hatás visszafordíthatóságát, 
elhúzódó vagy késve fellép ő voltát.  
1.6.2.3. A d a g o l á s i s z i n t e k ( d ó z i s o k )  
Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollt kell 
használni, illetve egy viv őanyagkontrollt, ha van viv őanyag. Az 
expozíciós id ő legalább napi hat óra legyen. A vizsgált anyagot 
minden nap hasonló id őpontban kell alkalmazni, az alkalmazott 
mennyiséget pedig meghatározott id őközönként (hetente vagy 
kéthetente) hozzá kell igazítani az állatok növekedéséhez, hogy 
az állatok testsúlyához viszonyított mennyiséget fenn lehessen 
tartani. A vizsgált anyaggal történ ő kezelést kivéve a kontrollcso ­
portban lév ő állatokkal pontosan ugyanolyan módon kell bánni, 
mint a vizsgálati csoportok állataival. Olyan esetekben, amikor 
az adagolás megkönnyítésére viv őanyagot alkalmazunk, a kontroll ­
csoportot ugyanúgy kell a viv őanyaggal kezelni, mint a kezelt 
csoportokat, és ugyanannyi viv őanyagot kell kapniuk, mint a 
legnagyobb adaggal kezelt csoportnak. A legnagyobb adagot úgy 
kell kiválasztani, hogy abban jelentkeznie kell a toxikus hatásnak, 
de elhullások lehet őleg ne, vagy csak minimális mértékben legye ­
nek. A legkisebb adaggal kezelt csoportban nem lehetnek a toxi ­
citásra utaló jelek. Ha használható becslés áll rendelkezésre az 
emberi expozícióra vonatkozóan, a legkisebb adagnak ennél nagyobbnak kell lennie. Kedvez ő esetben a középs ő adaggal kezelt 
csoportnál minimális toxikus hatás észlelhet ő. Ha egynél több 
közbeeső dózist alkalmazunk, akkor azokat úgy kell kiválasztani, 
hogy fokozódó toxikus hatást váltsanak ki. Az alacsony és közbeeső dózisú, illetve a kontrollcsoportban az elpusztult állatok 
száma minimális legyen, hogy az eredmények értelmezhet ő értéke­
lése lehetséges legyen.
 
Ha a vizsgált anyag alkalmazása súlyos b őrirritációt okoz, a 
koncentrációt csökkenteni kell, ami az egyéb toxikus hatások mértékének csökkenésével vagy elt űnésével járhat a legnagyobb 
adaggal kezelt csoportban. Ha a b őr súlyosan károsodott, szük ­
ségessé válhat a vizsgálat leállítása és egy új vizsgálat megkezdése kisebb koncentrációk mellett.
 
1.6.3.  Határérték-vizsgálat  
Ha az el őzetes vizsgálat során napi 1 000 mg/testsúlykilogrammal 
adagolt vizsgált anyag vagy – ha a lehetséges emberi expozíció 
mértéke ismert – ennél magasabb dózis semmilyen toxikus hatást nem vált ki, a további vizsgálatok szükségtelennek tekinthet ők.
 
1.6.4.  Megfigyelési id őszak  
Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni a toxikus hatások 
megjelenésének észlelése érdekében. Fel kell jegyezni az elpusztulás 
időpontját, valamint azt az id őpontot, amikor a toxikus hatás jelei 
mutatkozni kezdenek, illetve elmúlnak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5.  A kísérlet végrehajtása  
Az állatokat egyesével kell a ketrecekben elhelyezni. Ideális esetben 
a vizsgált anyagot heti hét alkalommal kell az állatoknak beadni, 90 napon keresztül.
 
A kísérő csoportokban a nyomon követ ő megfigyelésekre kiválasz ­
tott állatokat további 28 napig kell tartani kezelés nélkül, hogy a toxikus hatás visszafordíthatóságát, illetve elhúzódását ki lehessen mutatni. Az anyaggal való érintkezés ideje napi hat óra.
 
A vizsgált anyagot a testfelület megközelít őleg 10 %-át kitev ő felü­
leten egyenletesen elosztva kell felvinni az állat b őrére. Erősen 
mérgező anyagoknál a felület lehet ennél kisebb, de a felület lehet ő 
legnagyobb részét a lehet ő legvékonyabb és legegyenletesebb bevo ­
nattal kell ellátni.  
Az expozíció ideje alatt a vizsgált anyagot a b őrrel egy lyukacsos 
gézlap segítségével és nem irritáló ragasztószalaggal kell érintke ­
zésben tartani. A vizsgált területet megfelel ő módon be kell fedni 
azért, hogy megmaradjon rajta a vizsgált anyag és a gézkötés, és az 
állatok ne nyalhassák le a vizsgált anyagot. Mozgásgátló szerkeze ­
teket lehet használni annak megakadályozására, hogy az állat a vizs ­
gált anyagot lenyelje, de a teljes immobilizáció mint módszer nem javasolt.
 
Az expozíciós id ő leteltével a maradék vizsgált anyagot lehet őség 
szerint el kell távolítani a b őr felületének vízzel vagy más megfelel ő 
módon történ ő megtisztítása útján.  
Az összes állatot naponta meg kell vizsgálni, és a toxikus hatások 
megjelenését, súlyosságát és id őtartamát rögzíteni kell. A ketrecben 
tartott állatok megfigyelésekor a b őr- és szőrelváltozásokra, a szemek 
és a nyálkahártyák változásaira, valamint a légzési, a keringési rend ­
szerre, az autonóm és a központi idegrendszer m űködésére, a szoma ­
tomotoros tevékenységekre, valamint a viselkedési mintákra kell 
figyelemmel lenni. Hetente mérni kell a takarmányfogyasztást, vala ­
mint az állatok súlyát. Az állatok rendszeres megfigyelésére azért van szükség, hogy megel őzzük a kísérleti állatok kannibalizmus, 
szöveti autolízis, illetve rossz elhelyezés következtében történ ő elhul­
lását. A vizsgálati id őszak végeztével a kísér ő csoportban lév ő 
állatok kivételével minden túlél ő állatot fel kell boncolni. A haldokló 
állatokat eltávolításuk után el kell pusztítani, és fel kell boncolni.
 
Az alábbi vizsgálatokat rendszeresen el kell végezni az összes 
állaton, beleértve a kontrollcsoport egyedeit is:  
a) Lehetőleg minden állatot, de legalább a legnagyobb adaggal 
kezelt és a kontrollcsoportban lév ő állatokat szemvizsgálatnak 
kell alávetni szemtükör vagy ezzel egyenérték ű, megfelel ő 
készülék segítségével az expozíciót megel őzően és a vizsgálat 
végeztével. Ha a szemen elváltozás észlelhet ő, akkor minden 
állatot meg kell vizsgálni.  
b) A hematológiai vizsgálat részeként a vizsgálati id őszak végeztével 
mérni kell a hematokrit-értéket, a hemoglobin-koncentrációt, a vörösvértestszámot, a min őségi és a teljes fehérvérsejtszámot, az 
alvadási képességet, beleértve az alvadási id őt, a protrombin id őt, 
a tromboplasztin id őt, illetve a trombocitaszámot.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) A vizsgálati id őszak végeztével a vérmintákat klinikai-kémiai 
vizsgálatoknak is alá kell vetni. Fontos megvizsgálni az elekt ­
rolit-egyensúlyt, a szénhidrát-anyagcserét, a máj-, illetve a vese ­
funkciót. Az egyes vizsgálatok kiválasztását a vizsgált anyag hatásmechanizmusával kapcsolatos megfigyelések befolyásolják. 
Javasolt meghatározni: a kalcium, a foszfor, a klorid, a nátrium, 
a kálium szintjét, éhgyomorra kell mérni a glükózszintet (az adott fajra jellemz ő és megfelel ő éheztetési id ő után), a szérum gluta ­
minsav sz őlősav transzamináz (GPT) (
 1 ), a szérum glutaminsav 
oxálsav transzamináz (GOT) (  2 ), az ornitin dekarboxiláz, a 
gamma glutamil-transzpeptidáz, a karbamid nitrogén, az albumin, a kreatinin, az összes bilirubin és az összes szérumfehérje szintjét szintén meg kell határozni. További meghatározások, amelyekre a 
pontos toxicitás értékeléséhez még szükség lehet: lipidelemzés, 
hormonok, sav-bázis egyensúly, methemoglobin- és kolineszte ­
ráz-aktivitás mérése. Ahol a megfigyelt hatások vizsgálatának kiterjesztéséhez szükséges, további klinikai-kémiai vizsgálatokat 
is lehet végezni.
 
d) Vizeletelemzésre általában nincs szükség, csak akkor, ha a várt 
vagy megfigyelt toxicitás ezt indokolja.  
Ha a korábbi kísérletekb ől származó adatok nem megfelel őek, mérle ­
gelendő a hematológiai és klinikai-kémiai paraméterek meghatá ­
rozása az adagolás megkezdése el őtt. 
A u t o p s z i a  
Minden állaton teljes kör ű makroszkópos boncolást kell végezni, 
amely a test küls ő felületének, a testnyílásoknak, valamint a kopo ­
nya-, mell- és hasüregnek, illetve a bennük található szerveknek a feltárásából és vizsgálatából áll. A májat, a veséket, a mellékveséket 
és a heréket a kimetszés után minél el őbb még nedvesen le kell 
mérni, a kiszáradás elkerülése miatt. Az alábbi szerveket kell megfelelő közegben tartósan tárolni egy esetleges kés őbbi kórszövet ­
tani vizsgálat céljaira: valamennyi olyan szerv, amelyen makroszko ­
pikus elváltozás található, az agy – beleértve a nyúltagy, a híd, a 
kisagykéreg, a nagyagykéreg és az agyalapi mirigy metszeteit, a pajzsmirigy és a mellékpajzsmirigy, bármilyen jelen lev ő csecsemő­
mirigy, a légcs ő és a tüdő, a szív, az aorta, (a nyálmirigyek), a máj, a 
lép, a vesék, a mellékvesék, a hasnyálmirigy, az ivarmirigyek, a méh, 
(a járulékos nemi szervek), az epehólyag, ha megtalálható, a nyel ő­
cső, a gyomor, a patkóbél, az éhbél, a csíp őbél, a vakbél, a vastag ­
bél, a végbél, a húgyhólyag, a reprezentatív nyirokcsomók, (a n ői 
emlőmirigy), (a combizomzat), a perifériás idegek, (a szemek), 
(a szegycsont a csontvel ővel), (a combcsont az ízületi felülettel 
együtt), (a gerincoszlop három szinten – nyaki, mellkasközéptáji és ágyéki csigolyáknál), valamint (a szemüregen kívüli könnymirigyek). 
A zárójelben említett szöveteket csak akkor kell megvizsgálni, ha 
célszervként szerepelnek, illetve, ha a toxicitás tünetei ezt indokolják.
 
K ó r s z ö v e t t a n i v i z s g á l a t o k  
a) Teljes kör ű kórszövettani vizsgálatot kell végezni a kontrollcso ­
port és a legnagyobb adaggal kezelt csoport állatainak b őrén, 
szervein és szövetein.  
b) Az összes olyan szervet, amelyen makroszkopikus elváltozás 
található, meg kell vizsgálni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Ma szérum alanin aminotranszferáz néven ismert. 
( 2 ) Ma szérum aszparaginsav aminotranszferáz néven ismert.
 c) A többi dóziscsoport állatainak célszerveit is meg kell vizsgálni.  
d) Ha patkányokat használunk, a kis, illetve közepes dózissal kezelt 
csoportok állatainak tüdejét kórszövettani vizsgálatnak kell 
alávetni a fert őzés jeleit keresve, ez ugyanis az állat egészségi 
állapotának alkalmas értékelésére szolgál. E csoportok állatainál további kórszövettani vizsgálatokra rutinszer űen nincs szükség, de 
minden esetben vizsgálatokat kell végezni az olyan szerveken, 
amelyek az elváltozás jeleit mutatták a legnagyobb dózissal kezelt 
csoportban.
 
e) Ha kísér ő csoportot is használunk, azokon a szöveteken és szer ­
veken, amelyek a kezelt csoportokban elváltozásokat mutattak, itt is el kell végezni a kórszövettani vizsgálatokat.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden 
vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, az elváltozásokat mutató állatok számát, valamint az elváltozások 
egyes típusait, illetve az elváltozást mutató állatok százalékos 
arányát. Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell érté ­
kelni. Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.
 
3. ZÁRÓ VIZSGÁLATI JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— használt faj, törzs, az állatok származása, tartási körülmények, 
étrend,  
— vizsgálati körülmények,  
— adagolás (beleértve a viv őanyagot is, ha van) és koncentrációk,  
— a toxikus reakciók nemenként és dózisonként,  
— lehetőség szerint az a szint, amikor még nincs toxikus hatás,  
— az elpusztulás ideje a vizsgálat során, illetve hogy az állatok 
megélték-e a vizsgálat végét,  
— a toxikus és más hatások leírása,  
— az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének id őpontja és a 
megfigyelést követ ő változásuk,  
— a takarmány fogyasztásával és a testsúly változásával kapcsolatos 
adatok,  
— szemészeti leletek,  
— az elvégzett hematológiai vizsgálatok és azok valamennyi ered ­
ménye,  
— az elvégzett klinikai-kémiai vizsgálatok és azok valamennyi ered ­
ménye (beleértve az esetleges vizeletelemzés eredményeit is),  
— boncolási leletek,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— a kórszövettani vizsgálatok eredményének részletes ismertetése,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  SZUBKRÓNIKUS INHALÁCIÓS TOXICITÁS: 90 NAPOS 
VIZSGÁLAT  
ÖSSZEFOGLALÁS  
A jelen felülvizsgált B.29. vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy azzal 
teljes kör űen jellemezhet ő legyen a szubkrónikus id őtartamon (90 napon) át, 
belégzés útján bejuttatott vizsgált vegyi anyag toxicitása, valamint megbízható 
adatokat lehessen gy űjteni a mennyiségi inhalációs kockázatértékelésekhez. 10 
hím és 10 n őstény rágcsálóból álló csoportokat teszünk ki 90 napon (13 héten) át 
napi 6 órára a) a vizsgált vegyi anyagnak legalább három koncentrációszinten, b) 
szűrt levegőnek (negatív kontroll) és/vagy c) a viv őanyagnak (viv őanyaggal 
kezelt kontroll). Az állatok expozíciója általában heti 5 napon történik, azonban a hét 7 napján történ ő expozíció is megengedett. Mindig kell hímeket és n ősté­
nyeket is vizsgálni, azonban az egyes nemek különböz ő koncentrációszinteknek 
is kitehet ők, amennyiben ismert, hogy valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált 
vegyi anyagra. Ez a módszer lehet őséget biztosít a vizsgálatvezet őnek, hogy a 
vizsgált vegyi anyag toxicitásának alaposabb jellemzése érdekében kísér ő (a 
visszafordíthatóság vizsgálatára alkalmazott) csoportokat, id őközi elpusztításokat, 
bronchoalveoláris átmosást (BAL), neurológiai vizsgálatokat, valamint további 
klinikai kórtani és kórszövettani értékeléseket is belefoglaljon a vizsgálatba.
 
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 413. vizsgálati iránymuta ­
tásával (2009). A szubkrónikus inhalációs toxicitásra vonatkozó eredeti 413. 
vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el (1). A jelen B.29. (a felülvizs ­
gált 413. vizsgálati iránymutatással [2009] egyenérték ű) vizsgálati módszert 
a tudomány jelenlegi állásának megfelel ően, valamint a jelenlegi és jöv őbeli 
szabályozási igények kielégítése érdekében frissítették.  
2. A szubkrónikus inhalációs toxicitási vizsgálatok els ődleges célja a munka ­
helyi környezetben a munkavállalókra nézve fennálló kockázat értékeléséhez használt hatósági koncentrációk meghatározása. Emellett a lakossági, közle ­
kedési és környezeti humán kockázatok értékelésére is alkalmazzák azokat. 
Ez a módszer lehet ővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak 90 napon (a patká ­
nyok élettartamának körülbelül 10 %-án) át belégzés útján történ ő, naponta 
ismételt expozíció nyomán kialakuló káros hatások jellemzését. A szubkró ­
nikus inhalációs toxicitási vizsgálatok során kapott adatok felhasználhatók 
mennyiségi kockázatértékelési célokra, valamint a krónikus vizsgálatok 
során alkalmazott koncentrációk kiválasztásához is. E vizsgálati módszer nem kifejezetten nanoanyagok vizsgálatára szolgál. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatározása a jelen fejezet végén, 
valamint a 39. iránymutatásban (2) található.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
3. A vizsgálat min őségének fokozása és az állatkísérletek minimalizálása érde ­
kében a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése el őtt figyelembe 
kell vennie a vizsgálandó vegyi anyagról rendelkezésre álló minden infor ­
mációt. A megfelel ő vizsgálati koncentrációk kiválasztását segít ő informá­
ciók közé tartozhat a vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges  in vitro  vagy  in vivo  
toxicitási vizsgálatok eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a 
humán expozíció lehet ősége, a szerkezetileg rokon anyagokról rendelkezésre 
álló (Q)SAR- és toxikológiai adatok, valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. Ha a vizsgálat során neurotoxicitás várható 
vagy figyelhet ő meg, a vizsgálatvezet ő dönthet úgy, hogy a vizsgálat része ­
ként megfelel ő értékeléseket is kell végezni, például funkcionális megfigye ­
lési vizsgálatot (FOB) és a motoros aktivitás mérését. Az expozícióknak az egyes vizsgálatokhoz viszonyított id őzítése ugyan kritikus lehet, e kiegészít ő 
tevékenységek azonban nem szabad, hogy akadályozzák az vizsgálat alap ­
vető tervezését.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. A maró vagy irritáló hatású vegyi anyagok vizsgálhatók hígítva, olyan 
koncentrációban, amellyel elérhet ő a kívánt mérték ű toxicitás. További 
információ a 39. iránymutatásban (2) található. Az állatok ezen anyagoknak való expozíciója során a célkoncentrációknak kell ően alacsonynak kell 
lenniük ahhoz, hogy ne okozzanak jelent ős fájdalmat és szorongást, ugyan ­
akkor elegend őnek kell lenniük ahhoz, hogy a koncentráció-hatás görbe 
kiterjeszthet ő legyen a vizsgálat szabályozási és tudományos céljának 
megfelelő szintekre. E koncentrációkat eseti alapon kell kiválasztani, lehe ­
tőleg egy megfelel ően megtervezett tartománybehatároló vizsgálat alapján, 
amely információkkal szolgál a kritikus végpontról, az esetleges irritációs 
küszöbértékr ől, valamint a hatás kezdetének idejér ől (lásd a 11–13. bekez ­
dést). A választott koncentrációt indokolni kell.
 
5. Az elhullásközeli állapotban lév ő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszköd ő 
vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani. Az elhullásközeli állapotban lév ő állatokat a vizsgálat során 
elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósolható 
vagy közeli elhullás felismerését segít ő iránymutatás, valamint az elhullás 
közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok elpusztítására vonatkozó 
döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló OECD-iránymutatásban (3) találhatók.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
6. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett rágcsálókat kell alkalmazni. A javasolt faj a patkány. Más faj 
használata esetén a döntést indokolni kell.  
Az állatok el őkészítése  
7. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és 
nem vemhesek. A véletlen kiválasztás napján az állatoknak 7–9 hetes fiatal, 
ivarérett egyedeknek kell lenniük. A testsúlyuk a nemenkénti átlagos test ­
súlytól legfeljebb ± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszer űen 
választjuk ki, egyedi azonosítóval látjuk el, és a laboratóriumi körülmé ­
nyekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése el őtt legalább 5 
napig a ketrecükben tartjuk.  
Az állatok tartása  
8. Az állatokat a megfigyelések megkönnyítése és összetévesztésük elkerülése 
érdekében egyedi azonosítóval, lehet őleg bőr alatti jeladóval kell ellátni. A 
kísérleti állatok tartására használt helyiség h őmérséklete 22 ± 3 °C kell, 
hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tarto ­
mányban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha viv ő­
anyagként vizet használunk. Az expozíció el őtt és után az állatokat általában 
nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, 
azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át 
történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. 
Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indo ­
kolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testh őmérséklet 
(hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendel ­
kezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem lépnek fel számottev ő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez 
való előzetes szoktatás mell őzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön 
kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a 
vizsgált aeroszol ne sz űrődhessen át a többi állat sz őrzetén. Hagyományos és 
minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció 
időtartama alatt –, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A vilá ­
gítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák 
egymást.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalációs kamrák  
9. Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi 
anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az el őnyben részesítend ő expozíciós 
mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, 
orrot vagy szájat érint ő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció álta ­
lában előnyben részesítend ő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a 
lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök vizsgálata esetén. El őfordul­
hat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expo ­
zíció alkalmazásával hatékonyabban elérhet ők, ezt azonban indokolni kell a 
vizsgálati jegyz őkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szol ­
gáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a 
vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 
5 %-át. A csak orron át történ ő és az egész testfelületen keresztüli expozí ­
ciós technikák elveivel, valamint azok különös el őnyeivel és hátrányaival a 
39. iránymutatás (2) foglalkozik.  
TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK  
Határkoncentrációk  
10. Az akut vizsgálatoktól eltér ően a szubkrónikus inhalációs toxicitási vizs ­
gálatok esetén nincsenek meghatározott határkoncentrációk. A maximális vizsgált koncentráció kiválasztásakor a következ őket kell figyelembe venni: 
1) az elérhet ő maximális koncentráció, 2) a legrosszabb esetben fennálló 
humán expozíció szintje, 3) a megfelel ő oxigénellátás biztosításának szük ­
ségessége és/vagy 4) állatjóléti szempontok. Amennyiben nincsenek adatokon alapuló határértékek, az 1272/2008/EK rendeletben (13) szerepl ő 
akut határértékek alkalmazhatók (azaz aeroszolok esetén legfeljebb 5 mg/l, 
gőzök esetén 20 mg/l, gázok esetén pedig 20 000 ppm); lásd a 39. irány ­
mutatást (2). Amennyiben gázok vagy er ősen illékony anyagok (például 
hűtőfolyadékok) vizsgálata esetén e határértékeket túl kell lépni, a döntést 
indokolni kell. A határkoncentrációnak egyértelm ű toxicitást kell el őidéznie 
anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
 
Tartománybehatároló vizsgálat  
11. A fő vizsgálat megkezdése el őtt általában tartománybehatároló vizsgálat 
elvégzése szükséges. A tartománybehatároló vizsgálat átfogóbb a dózisbe ­
határoló vizsgálatnál, mivel nem korlátozódik a koncentráció kiválasztására. 
A tartománybehatároló vizsgálat révén szerzett információk hozzájárulhatnak 
a fő vizsgálat sikeréhez. A tartománybehatároló vizsgálat például technikai 
jellegű információkkal szolgálhat az analitikai módszerek, a részecskemére ­
tezés, a toxikus hatásmechanizmusok felismerése, a klinikai kórtani és 
kórszövettani adatok, valamint a f ő vizsgálat lehetséges NOAEL- és 
MTC-koncentrációinak becslése vonatkozásában. A vizsgálatvezet ő a tarto­
mánybehatároló vizsgálatot alkalmazhatja a légz őrendszer irritációs küszöb ­
értékének (például a légz őrendszer kórszövettani elemzése, a tüd ő működé­
sének vizsgálata vagy bronchoalveoláris átmosás útján történ ő) meghatá ­
rozása, az állatoknak indokolatlan stresszt nem okozó, elfogadható maxi ­
mális koncentráció, valamint a vizsgált vegyi anyag toxicitását legjobban jellemző paraméterek meghatározása céljából.
 
12. A tartománybehatároló vizsgálat egy vagy több koncentrációszintre is kiter ­
jedhet. A választott végponttól függ ően mindegyik koncentrációszintnek 3–6 
hímet és 3–6 n őstényt kell kitenni. A tartománybehatároló vizsgálatnak 
legalább 5 napig kell tartania, és általában nem tarthat tovább 28 napnál. A vizsgálati jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell a f ő vizsgálathoz kiválasztott 
koncentrációk indokolását. A f ő vizsgálat célja a koncentráció-válasz össze ­
függésnek a feltételezett legérzékenyebb végpont alapján történ ő kimutatása. 
Alsó koncentrációként lehet őleg olyan koncentráció választandó, amelynél 
nem észlelhet ő káros hatás, míg a fels ő koncentrációnak egyértelm ű toxici­
tást kell el őidéznie anélkül, hogy az állatoknak indokolatlan stresszt okozna 
vagy befolyásolná az élettartamukat (3).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. A tartománybehatároló vizsgálat során alkalmazandó koncentrációszintek 
kiválasztásakor figyelembe kell venni minden rendelkezésre álló informá ­
ciót, beleértve a szerkezet-aktivitás összefüggéseket és a hasonló vegyi anyagok adatait (lásd a 3. bekezdést). A tartománybehatároló vizsgálat megerősítheti, illetve megcáfolhatja a legérzékenyebbnek vélt mechanisztikai 
alapú végpontokat, például az organofoszfátok kolineszterázgátló hatását, a 
vörösvérsejtekre toxikus anyagok okozta methemoglobinképz ődést, a pajzs ­
mirigyre toxikus anyagok esetén a pajzsmirigyhormonokat (T
 3 , T 4 ), a fehér ­
jét, az LDH-t, vagy az ártalmatlan, nehezen oldható részecskék vagy a tüd őt 
irritáló aeroszolok esetén a bronchoalveoláris átmosási folyadékban lév ő 
neutrofileket.  
Fő vizsgálat  
14. A fő szubkrónikus toxicitási vizsgálat általában három koncentrációszintre, 
valamint szükség szerint azokkal párhuzamosan vizsgált negatív (leveg ővel 
kezelt) és/vagy viv őanyaggal kezelt kontrollokra terjed ki (lásd a 18. bekez ­
dést). A megfelel ő expozíciós szintek kiválasztásának el ősegítéséhez fel kell 
használni minden rendelkezésre álló adatot, beleértve a szisztémás toxicitási 
vizsgálatok eredményeit, az anyagcserére vonatkozó és kinetikai adatokat 
(különös hangsúlyt kell fektetni a kinetikai folyamatokat telít ő magas 
koncentrációszintek elkerülésére). Mindegyik vizsgált csoport 10 hím és 10 nőstény rágcsálóból áll, amelyeket hetente 5 napon napi 6 órára teszünk 
ki a vizsgált vegyi anyagnak 13 héten keresztül (a vizsgálat teljes id őtartama 
90 nap). Az állatok heti 7 napon is kitehet ők a vizsgált anyagnak (például 
belélegezhet ő gyógyszerek vizsgálata esetén). Amennyiben ismert, hogy 
valamelyik nem érzékenyebb a vizsgált vegyi anyagra, az egyes nemek 
különböző koncentrációszinteknek is kitehet ők a 15. bekezdésben ismertetett 
koncentráció-válasz összefüggés optimális feltárása érdekében. Patkányoktól eltérő rágcsálófajok csak orron át történ ő expozíciója esetén az expozíció 
maximális id őtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása 
érdekében. Napi 6 óránál rövidebb expozíciós id ő alkalmazása vagy 
hosszabb id őtartamú (például napi 22 órás), egész testfelületen keresztüli 
expozíciós vizsgálat szükségessége esetén indokolást kell adni (lásd a 39. iránymutatást) (2). Az expozíció id őtartama alatt az állatok nem kaphatnak 
takarmányt, kivéve, ha az id őtartam meghaladja a 6 órát. Az állatoknak víz 
az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes id őtartama alatt adható.
 
15. A célkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy azonosítható(k) 
legyen(ek) a célszerv(ek) és egyértelm ű koncentráció-válasz összefüggés 
legyen kimutatható:  
— A fels ő koncentrációszintnek toxikus hatásokat kell el őidéznie anélkül, 
hogy késleltetett tüneteket vagy elhullást okozna, ami kizárná az érdemi értékelést.
 
— A köztes koncentrációszint(ek)et úgy kell felosztani, hogy a toxikus 
hatások fokozatosan növekedjenek az alsó és a fels ő koncentrációszint 
között.  
— Az alsó koncentrációszint nem, vagy csak kis mértékben idézheti el ő 
toxicitás jeleit.  
Időközi elpusztítás  
16. Ha id őközi elpusztítást tervezünk, az egyes expozíciós szintekhez tartozó 
állatok számát annyival kell megnövelni, ahány állatot a vizsgálat befejezése 
előtt el szándékozunk pusztítani. Az id őközi elpusztítást indokolni kell, és a 
statisztikai elemzések során megfelel ően figyelembe kell venni.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Kísérő (visszafordíthatósági) vizsgálat  
17. Kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálat végezhet ő a toxicitás visszafordítha ­
tóságának, elhúzódó vagy késve fellép ő voltának a kezelést követ ő 
megfelelő hosszúságú, de legalább 14 napos id őszak során történ ő 
megfigyelése érdekében. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz hasz ­
nált csoportok 10 hímb ől és 10 n őstényből állnak, amelyeket a f ő vizs­
gálatban megfigyelt kísérleti állatokkal egyidej űleg teszünk ki a vizsgált 
vegyi anyagnak. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizsgálathoz használt 
csoportokat a legnagyobb koncentrációban kell kitenni a vizsgált vegyi 
anyagnak, és ezzel párhuzamosan szükség szerint leveg ővel és/vagy viv ő­
anyaggal kezelt kontrollok vizsgálatát is el kell végezni (lásd a 18. bekez ­
dést).  
Kontrollállatok  
18. A párhuzamosan vizsgált negatív (leveg ővel kezelt) kontrollállatokat a vizs ­
gált csoportokban lév ő állatokkal azonos módon kell kezelni, azzal a 
különbséggel, hogy a vizsgált vegyi anyag helyett sz űrt levegőnek tesszük 
ki azokat. Amennyiben vizet vagy más anyagot használunk a vizsgálati 
légkör létrehozásának el ősegítésére, a vizsgálathoz negatív (leveg ővel kezelt) 
kontrollcsoport helyett viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkal ­
mazni. Viv őanyagként lehet őség szerint vizet kell használni. Ha a viv őanyag 
víz, a kontrollállatokat ugyanolyan relatív páratartalmú leveg őnek kell 
kitenni, mint a vizsgált anyagnak kitett csoportokat. Az alkalmas viv őanyag 
kiválasztásának megfelel ően elvégzett el őzetes vizsgálaton vagy múltbeli 
adatokon kell alapulnia. Ha a viv őanyag toxicitásáról nincsenek részletes 
információk, a vizsgálatvezet ő dönthet úgy, hogy negatív (leveg ővel kezelt) 
és vivőanyaggal kezelt kontrollt egyaránt kell alkalmazni, ez azonban er ősen 
ellenjavallt. Ha a múltbeli adatok alapján a viv őanyag nem toxikus, nincs 
szükség negatív (leveg ővel kezelt) kontrollcsoportra, és ez esetben csak 
vivőanyaggal kezelt kontrollcsoportot kell alkalmazni. Amennyiben a viv ő­
anyaggal kevert vizsgált vegyi anyag az el őzetes vizsgálat alapján nem 
bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a viv őanyag sem tekin ­
tendő toxikusnak, és ezt a viv őanyagkontrollt kell használni.  
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK  
A koncentrációk beadása  
19. Az állatokat gáz, g őz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a 
vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi 
anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációktól és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel el őforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és 
kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz leveg ős körülmé ­
nyek között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk kelet ­
kezésének elkerülésére. A részecskéket képz ő anyagok mechanikai eljárá ­
soknak vethet ők alá a részecskeméret csökkentése érdekében. További 
útmutatás a 39. iránymutatásban (2) olvasható.
 
Részecskeméret-eloszlás  
20. Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök 
esetén részecskeméretezést kell végezni. A légz őrendszer összes lényeges 
részének expozíciója érdekében 1 és 3 μm közötti tömegfelez ő aerodina ­
mikai átmér ővel (MMAD) rendelkez ő, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba 
eső geometriai szórású ( σ g ) aeroszolok használata javasolt (4). Habár ésszer ű 
keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfelelésre, szakért ői 
megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehet őség. A fémg őzök 
részecskéi például kisebbek e szabványos méretnél, míg a töltéssel rendel ­
kező részecskék és a rostok meghaladhatják azt.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
A vizsgált vegyi anyag el őkészítése viv őanyagban  
21. A vizsgált vegyi anyag ideális esetben viv őanyag nélkül vizsgálandó. Ha a 
vizsgált vegyi anyag megfelel ő koncentrációjának és részecskeméretének 
előállításához viv őanyag alkalmazása szükséges, a víz részesítend ő előny­
ben. Ha a vizsgált vegyi anyagot viv őanyagban oldjuk fel, minden esetben 
igazolni kell annak stabilitását.  
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE  
Kamrabeli légáramlás  
22. Az expozíciós kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, 
folyamatosan nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy id őbeli 
stabilitás) valós idej ű nyomon követése valamennyi dinamikus paraméter 
globális mérését jelenti, és közvetett lehet őséget nyújt valamennyi lényeges 
dinamikus inhalációs paraméter szabályozására. A koncentráció valós idej ű 
nyomon követése esetén a légáramlásokat elegend ő expozíciónként és 
naponként egy alkalommal mérni. Különös figyelmet kell fordítani a csak 
orron át történ ő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerü ­
lésére. Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén- 
dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben feltételezhet ő, 
hogy ez a szabvány nem teljesíthet ő, az oxigén- és szén-dioxid-koncentrá ­
ciót mérni kell. Ha az expozíció els ő napján végzett mérések azt mutatják, 
hogy e gázok szintje megfelel ő, rendszerint nincs szükség további méré ­
sekre.
 
A kamra h őmérséklete és relatív páratartalma  
23. A kamra h őmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési 
zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történ ő és az 
egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt folyamatosan 
nyomon kell követni, és lehet őség szerint minden expozíció során óránként 
fel kell jegyezni. A relatív páratartalmat lehet őleg 30–70 %-os tartományban 
kell tartani, ugyanakkor el őfordulhat, hogy ez vagy nem érhet ő el (például 
vízalapú keverékek vizsgálata esetén), vagy nem mérhet ő a vizsgált vegyi 
anyag vizsgálati módszerrel való interferenciája miatt.  
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció  
24. Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehet őség szerint ki 
kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az el őállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk az inhalációs 
kamrarendszeren áthaladt leveg ő össztérfogatával. A névleges koncentráció 
nem az állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhet ő a vizsgálati 
rendszer el őállítási hatásfoka, és így feltárhatók az el őállítással összefügg ő 
problémák.
 
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció  
25. A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán 
belül, az állatok belégzési zónájában végzett mintavétellel megállapított koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módsze ­
rekkel (például közvetlen mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióké ­
pességet vizsgáló módszerekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai sz űrőelemzéssel 
határozható meg. A gravimetriai elemzés csak egykomponens ű, por alakú 
aeroszolok, illetve alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfo ­
gadható, és alkalmazását a vizsgált vegyi anyag megfelel ő, a vizsgálat el őtt
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
végzett jellemzésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkom ­
ponensű, por alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén 
alkalmazható. Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasz ­
tani, hogy a leveg őben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagé ­
hoz. Amennyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehet őleg leve­
gőben lebeg ő) vizsgált vegyi anyag rendszeres id őközönként végzett újbóli 
elemzésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát.
 
26. Lehet őség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni a 
vizsgálat teljes id őtartama alatt, és a vizsgált mintát olyan körülmények 
között kell tárolni, hogy meg őrződjön annak tisztasága, homogenitása és 
stabilitása. A vizsgálat megkezdését megel őzően el kell végezni a vizsgált 
vegyi anyag jellemzését, meghatározva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag lehetséges, az észlelt szennyez ő anyagok 
és szennyez ődések azonosságát és mennyiségét. Ez többek között – de nem 
kizárólag – a következ ő adatokkal mutatható ki: retenciós id ő és relatív 
csúcsterület, tömegspektroszkópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, illetve más becslésekkel meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált 
minta azonosságának meghatározása nem tartozik a vizsgálati laboratórium 
feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon (például szín, fizikai jelleg stb. alapján) megerősíteni a megbízó által adott jellemzést.
 
27. Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani. 
Az expozíciós körülmények stabilitásának bizonyítására valós idej ű 
nyomonkövetési eszköz – például aeroszolok esetén aeroszolfotométer, 
vagy gőzök esetén az összes szénhidrogéntartalmat elemz ő műszer – alkal ­
mazható. A kamrabeli tényleges koncentrációt minden expozíciós napon minden expozíciós szint tekintetében legalább háromszor meg kell mérni. 
Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem 
megoldható, expozíciós id őszakonként egy mintavétel is elfogadható. Ideális 
esetben ezt a mintavételt a teljes expozíciós id őszak folyamán kell elvé ­
gezni. Az egyes kamrakoncentráció-minták gázok és g őzök esetén legfeljebb 
± 10 %-kal, folyékony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb 
± 20 %-kal térhetnek el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyen ­
súlyi állapotának kialakulásához szükséges id őt (t
 95 ) ki kell számítani és 
jegyzőkönyvezni kell. Egy adott expozíció id őtartama magában foglalja a 
vizsgált vegyi anyag el őállításának idejét. Ehhez figyelembe kell venni a 
kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez és a bomláshoz szükséges id őt 
(t 95 ). A t  95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.  
28. A nagyon összetett, gázokból/g őzökből és aeroszolokból álló keverékek 
(például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasz ­
nálói termékekb ől/készülékekb ől kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén 
az egyes fázisok eltér ően viselkedhetnek az inhalációs kamrában. Éppen 
ezért mindegyik fázishoz (gáz/g őz és aeroszol) legalább egy indikátor ­
anyagot (analitot) – általában a keverék els ődleges hatóanyagát – kell kivá ­
lasztani. Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncent ­
rációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetev ő vagy az indikátor ­
anyag (analit) vonatkozásában kell a jegyz őkönyvben feltüntetni. A tény ­
leges koncentrációról további információ a 39. iránymutatásban található (2).  
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás  
29. Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik koncentrációszint tekin ­
tetében legalább hetente meg kell határozni sorozatos ütközésmér ő vagy 
alternatív m űszer, például aerodinamikai részecskeméret- 
meghatározó (APS) segítségével. Ha bizonyítható, hogy a sorozatos ütközés ­
mérővel és az alternatív m űszerrel kapott eredmények egyeznek, az alter ­
natív műszer a teljes vizsgálat folyamán használható.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Az els ődleges műszerrel párhuzamosan egy második eszközt, például gravi ­
metriai sz űrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell használni az els ődleges 
műszer mintavételi hatékonyságának meger ősítése érdekében. A részecs ­
keméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a sz űrőelemzéssel 
kapott tömegkoncentrációt ésszer ű mértékben meg kell közelítenie (lásd a 
39. iránymutatást (2)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában vizsgált összes 
koncentrációnál bizonyítható az egyezés, a további meger ősítő mérések 
mellőzhetők. Az állatok jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni a vizs ­
gálat eseteges megismétlését szükségessé tev ő kétes adatok el őfordulásának 
minimalizálása érdekében.  
31. Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a lehet ő­
sége, hogy a g őz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes 
fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a g őzatmoszférában.  
MEGFIGYELÉSEK  
32. Az állatokat az expozíciós id őtartam előtt, alatt és után klinikai megfigye ­
léseknek kell alávetni. Az állatok expozíció során megfigyelt reakciójától 
függően gyakoribb megfigyelések is kilátásba helyezhet ők. Ha az állatok 
megfigyelését az azok lefogására szolgáló csövek használata, az egész test ­
felületen keresztüli expozícióra szolgáló kamra rossz megvilágítása vagy az 
átlátszatlan légkör akadályozza, az állatokat az expozíció után alapos 
megfigyelésnek kell alávetni. A következ ő napi expozíció el őtt végzett 
megfigyelésekkel felmérhet ő a toxikus hatások visszafordíthatósága vagy 
súlyosbodása.  
33. Minden megfigyelést rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat 
esetében önálló adatsort veszünk fel. Ha az állatokat humánus okok miatt el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehet ő legpontosabban fel kell 
jegyezni az elhullás id őpontját.
 
34. A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a b őr és a 
szőrzet, a szem és a nyálkahártya, a légz ő-, keringési és idegrendszer, vala ­
mint a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, 
alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért h őmérséklet bizonyítékot 
szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára. A vizsgálati protokollba további értékelések is felvehe ­
tők, ilyenek például a kinetikai vizsgálatok, a biomonitoring, a tüd őműködés 
vizsgálata, a tüd őszövetben felgyüleml ő, rosszul oldható anyagok vissza ­
maradásának vizsgálata, valamint a viselkedésbeli változások megfigyelése.
 
TESTSÚLY  
35. Az egyes állatok súlyát röviddel az els ő expozíció (0. nap) el őtt, azt köve ­
tően pedig hetente kétszer (például az expozíció nélküli hétvégén végbement 
felépülés bizonyítása céljából pénteken és hétf őn, vagy a szisztémás toxi ­
citás felmérését lehet ővé tevő időközönként), valamint az elhullás vagy 
elpusztítás id őpontjában kell feljegyezni. Amennyiben az els ő 4 héten 
semmilyen hatás nem figyelhet ő meg, a vizsgálat hátralev ő részében a test ­
súly heti rendszerességgel is mérhet ő. A kísér ő (visszafordíthatósági) vizs ­
gálatban alkalmazott állatok (ha vannak) súlyának heti rendszerességgel 
végzett mérését a felépülési id őszak során is folytatni kell. A vizsgálat 
lezárásakor minden állat súlyát meg kell mérni röviddel az elpusztítás el őtt, 
hogy torzításmentesen kiszámítható legyen a szervek súlyának testsúlyhoz 
viszonyított aránya.  
TÁPLÁLÉK- ÉS VÍZFOGYASZTÁS  
36. A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. A felvett 
víz mennyisége szintén mérhet ő. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINIKAI PATOLÓGIA  
37. Minden állaton – beleértve a kontrollokat és a kísér ő (visszafordíthatósági) 
csoportokba tartozókat – klinikai patológiai értékelést kell végezni az elpusztításkor. Az expozíció vége és a vérvétel között eltelt id őt fel kell 
jegyezni, különösen ha az adott végpontra gyors regeneráció jellemz ő. A 
rövid plazmabeli felezési idej ű paramétereknél (például COHb, CHE és 
MetHb) az expozíció végét követ ően végzend ő mintavétel.
 
38. A minden toxikológiai vizsgálathoz általánosan el őírt klinikai patológiai para ­
méterek felsorolása az 1. táblázatban található. Rendszeres vizeletelemzés 
nem kötelez ő, de elvégezhet ő, ha a várt vagy megfigyelt toxicitás alapján 
célszerűnek ítéljük. A vizsgálatvezet ő a vizsgált vegyi anyag toxicitásának 
alaposabb jellemzése érdekében további paraméterek értékelése mellett 
dönthet (például kolineszteráz, lipidek, hormonok, sav-bázis egyensúly, 
methemoglobin vagy Heinz-testek, kreatin-kináz, csontvel ő/eritroid arány, 
troponinok, artériás vérgáz, laktát-dehidrogenáz, szorbit-dehidrogenáz, gluta ­
mát-dehidrogenáz és gamma-glutamil-transzpeptidáz).  
1. táblázat  
Szabványos klinikai patológiai paraméterek  
Hematológiai paraméterek  
vörösvértestszám 
hematokrit hemoglobinkoncentráció 
átlagos korpuszkuláris hemoglobin 
átlagos korpuszkuláris térfogat átlagos korpuszkuláris hemoglobin ­
koncentráció 
retikulociták teljes vérkép 
differenciált vérkép trombocitaszám 
véralvadási képesség (a követ ­
kezők egyikét kell választani): 
— prothrombin id ő 
— véralvadási id ő 
— részleges prothrombin id ő
 
Klinikai kémiai paraméterek  
glükóz (*) 
összes koleszterin 
trigliceridek a vérben lév ő karbamid-nitrogén 
összes bilirubin 
kreatinin 
összes fehérje albumin 
globulin alanin-aminotranszferáz 
aszpartát-aminotranszferáz 
alkáli foszfatáz kálium nátrium 
kalcium 
foszfor klorid
 
Vizeletelemzés (nem kötelez ő) 
megjelenés (szín és zavarosság) 
térfogat 
fajsúly vagy ozmolaitás 
pH összes fehérje 
glükóz 
vér/vérsejtek  
(*) Mivel a hosszas koplaltatás torzíthatja a kezelt állatok glükózszintjének a kont ­
rollállatokéhoz viszonyítva mért értékét, a vizsgálatvezet őnek döntenie kell, hogy 
célszerű-e az állatokat koplaltatni. Koplaltatási id ő alkalmazása esetén annak a 
vizsgált fajhoz kell igazodnia, patkány esetén például 16 óra lehet (éjszakai 
koplaltatás). A koplaltatás mellett mérhet ő glükózszint meghatározása az utolsó 
expozíciós héten történ ő éjszakai koplaltatás után, vagy a boncolás el őtti éjszakai 
koplaltatás után végezhet ő el (utóbbi esetben az összes többi klinikai patológiai 
paraméterrel együtt kell meghatározni).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Amennyiben arra utaló bizonyítékot találunk, hogy az alsó légutak (azaz az 
alveolusok) jelentik a lerakódás és a visszamaradás els ődleges helyét, a 
bronchoalveoláris átmosás (BAL) lehet a legalkalmasabb technika a hipoté ­
zisen alapuló dózis-hatás paraméterek alveolitiszre, tüd őgyulladásra és fosz ­
folipidózisra összpontosító mennyiségi elemzéséhez. Ez lehet ővé teszi az 
alveolusok károsodása dózis-válasz és id ő-lefolyás típusú változásainak 
megfelelő vizsgálatát. A BAL eljárás útján nyert folyadék elemezhet ő teljes 
és differenciált vérkép, összes fehérje, valamint laktát-dehidrogenáz tekinte ­
tében. Figyelembe vehet ők továbbá egyéb, lizoszómakárosodásra, foszfoli ­
pidózisra, fibrózisra, valamint irritáció okozta vagy allergiás gyulladásra 
utaló paraméterek is, ami magában foglalhatja a gyulladást serkent ő citoki­
nek/kemokinek meghatározását. A BAL-mérések általában kiegészítik a kórszövettani vizsgálatok eredményeit, azonban nem helyettesíthetik azokat. 
A tüdőátmosás elvégzéséhez a 39. iránymutatásban (2) található útmutatás.
 
SZEMÉSZETI VIZSGÁLAT  
40. A vizsgált vegyi anyag beadása el őtt az összes állaton, továbbá az összes, 
magas koncentrációnak kitett és kontrollcsoport esetén a vizsgálat lezárá ­
sakor oftalmoszkóppal vagy azzal egyenérték ű eszközzel el kell végezni a 
szemfenék, a fénytör ő közegek, a szivárványhártya és a köt őhártya szemé ­
szeti vizsgálatát. Amennyiben a szem elváltozásait észleljük, a többi 
csoportba tartozó összes állatot is meg kell vizsgálni, beleértve a kísér ő 
(visszafordíthatósági) csoportba tartozókat.  
MAKROSZKOPIKUS PATOLÓGIA ÉS A SZERVEK SÚLYA  
41. Minden kísérleti állaton teljes kivéreztetést és (ha lehetséges) makroszko ­
pikus boncolást kell végezni, beleértve azokat is, amelyek a vizsgálat során 
elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett távolítani a vizsgálatból. Minden egyes állatnál fel kell jegyezni az utolsó expozíció és az elpusztítás között eltelt id őt. Ha a boncolás nem végezhet ő el rögtön 
azután, hogy az elpusztult állatot észrevettük, az állatot h űtve (nem 
fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kell ően alacsony 
hőmérsékleten. A boncolást a lehet ő leghamarabb, általában egy vagy két 
napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden 
makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légz őrendszert 
érintő változásokra.
 
42. A makroszkopikus boncolás során kórszövettani vizsgálat céljából megfelel ő 
közegben meg őrizendő szervek és szövetek felsorolása a 2. táblázatban 
található. A  [szögletes zárójelben ] feltüntetett szervek és szövetek, valamint 
bármely egyéb szerv és szövet meg őrzéséről a vizsgálatvezet ő saját mérle ­
gelése alapján dönthet. A  félkövérrel  szedett szerveket a kiszáradás elkerü ­
lése érdekében a boncolás után a lehet ő legrövidebb id őn belül meg kell 
tisztítani, és azok nedves súlyát meg kell mérni. A pajzsmirigy és a mellék ­
herék súlyát csak akkor javasolt megmérni, ha szükséges, mivel az azok 
megtisztítása során keletkez ő mesterséges elváltozások akadályozhatják a 
kórszövettani értékelést. A szöveteket és a szerveket közvetlenül a boncolás után, és az alkalmazandó fixálószert ől függően legalább 24–48 órával a 
megtisztítás el őtt 10 %-os pufferelt formalinban vagy egyéb, megfelel ő fixá­
lószerben fixálni kell.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
2. táblázat  
A makroszkopikus boncolás során meg őrizendő szervek és szövetek  
Mellékvesék  
Aorta  
Csontvelő (és/vagy friss felszívott minta)  
Agy (beleértve a nagyagy, a kisagy és a 
nyúltvelő/nyúltagyi híd metszeteit)  
Vakbél  
Vastagbél  
Patkóbél  
[Mellékherék ] 
[Szemek (retina, látóideg) és szemhéjak]  
Combcsont és térdízület  
Epehólyag (ha van)  
[Harder-mirigyek]  
Szív 
Csípőbél 
Éhbél  
Vesék  
[Könnymirigyek (szemüregen kívüli)]  
Gégefő (3 szinten, beleértve a gégefed ő alap­
ját) 
Máj 
Tüdő (egy szinten készített metszet mind ­
egyik lebenyr ől, beleértve a f ő hörgőket) 
Nyirokcsomók a tüd ő hilusok körüli részér ől, 
különösen nehezen oldható, szemcsés vizsgált vegyi anyagok esetén. Alaposabb vizsgálatok 
és/vagy immunológiára összpontosító tanul ­
mányok esetében további nyirokcsomók megőrzése is megfontolható, például a gátori, 
nyaki/állkapocs alatti és/vagy fülcse körüli 
részekről.
 
Nyirokcsomók (a bejutás helyét ől távoli hely ­
ről) 
Emlőmirigy (n őstény)  
Izomszövet (comb)  
Orr-garati szövetek (legalább 4 szinten, 
amelyek egyikének tartalmaznia kell az orr- 
garati csatornát és az orrhoz társuló nyirok ­
szövetet [NALT])  Nyelőcső 
[Szaglógumó]  
Petefészkek  
Hasnyálmirigy  
Mellékpajzsmirigyek  
Perifériás ideg (csíp ő vagy sípcsont 
környéki, lehet őleg az izomzathoz közeli 
helyről véve)  
Agyalapi mirigy  
Prosztata  
Végbél  
Nyálmirigyek  
Ondóhólyagok  
Bőr 
Gerincoszlop (nyaki, mellkasi középs ő és 
ágyéki szakasz)  
Lép 
Szegycsont  
Gyomor  
Fogazat  
Herék  
Csecsemőmirigy  
Pajzsmirigyek  
[Nyelv]  
Légcső (legalább 2 szinten, beleértve egy 
hosszirányú metszetet a carinán keresztül, valamint egy keresztmetszetet)
 
[Húgyvezeték]  
[Húgycső] 
Húgyhólyag  
Méh  
Célszervek  
Minden makroszkopikus elváltozás és 
szövetszaporulat  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. A tüd őt sértetlenül kell eltávolítani, le kell mérni, és a tüd ő szerkezetének 
megőrzése érdekében megfelel ő fixálószert kell belecsepegtetni 20–30 cm 
víznek megfelel ő nyomáson (5). Mindegyik lebenyr ől metszetet kell készí ­
teni egy szinten, beleértve a f ő hörgőket, ugyanakkor tüd őátmosás alkalma ­
zása esetén az át nem mosott lebenyr ől három szinten kell metszetet készí ­
teni (nem sorozatos metszeteket).  
44. Az orr-garati szöveteket legalább 4 szinten kell vizsgálni, amelyek egyi ­
kének tartalmaznia kell az orr-garati csatornát (5) (6) (7) (8) (9), lehet ővé 
téve a laphámsejtes, átmeneti (csillósz őrrel nem borított légúti), légúti (csil ­
lószőrrel borított) és szaglóhámszövet, valamint az elvezet ő 
nyirokszövet (NALT) (10) (11) megfelel ő vizsgálatát. A gégef őt három 
szinten kell vizsgálni, amelyek egyikének tartalmaznia kell a gégefed ő 
alapját (12). A légcsövet legalább két szinten kell vizsgálni, beleértve egy 
hosszirányú metszetet az extrapulmonális hörg ők elágazásánál lév ő carinán 
keresztül, valamint egy keresztmetszetet.  
KÓRSZÖVETTANI VIZSGÁLATOK  
45. A 2. táblázatban felsorolt összes szerv és szövet kórszövettani vizsgálatát el 
kell végezni a kontrollcsoportoknál és a magas koncentrációnak kitett csoportoknál, valamint a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított összes 
állatnál. Különös figyelmet kell fordítani a légz őrendszerre, a célszervekre, 
valamint a makroszkopikus elváltozásokra. Azon szerveket és szöveteket, amelyeken a magas koncentrációnak kitett csoportnál elváltozások figyel ­
hetők meg, mindegyik csoportnál meg kell vizsgálni. A vizsgálatvezet ő a 
koncentráció-válasz összefüggés egyértelm ű kimutatása érdekében dönthet 
úgy, hogy további csoportoknál is végezni kell kórszövettani értékelést. Kísérő (visszafordíthatóság vizsgálatára szolgáló) csoport alkalmazása esetén 
minden olyan szerv és szövet kórszövettani értékelését el kell végezni, 
amelynél a kezelt csoportok egyedei esetében elváltozások figyelhet ők 
meg. Ha a magas koncentrációnak kitett csoportnál túlzott mérték ű idő előtti 
elhullás vagy egyéb problémák veszélyeztetik az adatok szignifikanciáját, az eggyel alacsonyabb koncentrációra vonatkozóan kell kórszövettani vizs ­
gálatot végezni. Meg kell kísérelni a makroszkopikus és mikroszkopikus 
megfigyelések közötti összefüggések feltárását.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
46. Meg kell adni az egyes állatok testsúlyára, táplálékfelvételére, klinikai pato ­
lógiai eredményeire, makroszkopikus boncolási eredményeire, szerveinek súlyára, valamint kórszövettani eredményeire vonatkozó adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában össze kell foglalni, minden egyes 
vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lév ő állatok számát, a specifikus 
mérgezési tüneteket mutató, valamint a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, az egyes állatok elhullásának időpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli lefolyását és visszafordítható ­
ságát, valamint a boncolások eredményeit. Mind a számszer ű, mind a járu ­
lékos eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell kiértékelni. 
Bármilyen általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazható, és a statisztikai módszereket a vizsgálat tervezésekor kell kiválasztani.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
47. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell értelemszer űen 
tartalmaznia:  
Kísérleti állatok és azok tartása  
— A ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következ őket: az 
állatok ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, 
környezeti h őmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás id őtar­
tama, valamint a takarmány meghatározása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— A vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltér ő faj alkalmazásának 
indokolása. Forrás- és múltbéli adatok is megadhatók, amennyiben 
azok hasonló expozíciós, tartási és koplaltatási körülmények között kitett állatokra vonatkoznak.
 
— Az állatok száma, kora és neme.  
— A véletlen kiválasztás módszere.  
— A vizsgálat el őtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, 
a karantént és a betegség kezelését.  
Vizsgált vegyi anyag  
— Fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai 
tulajdonságok (beleértve az izomerizációt).  
— Azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási 
Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám).  
Vivőanyag  
— A viv őanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a 
vivőanyag nem víz).  
— Múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a 
vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét.  
Inhalációs kamra  
— Az inhalációs kamra részletes leírása, beleértve annak térfogatát és 
vázlatrajzát.  
— Az állatok expozíciójához és a légkör el őállításához használt berende ­
zések eredete és leírása.  
— A hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció 
mérésére szolgáló berendezések.  
— A leveg ő forrása és a kondicionáló rendszer.  
— Az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történ ő 
kalibrálására alkalmazott módszerek.  
— Nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív).  
— Expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), 
az állatok helye a kamrában (egész testfelületen keresztüli expozíció).  
— A vizsgálati légkör stabilitása.  
— A hőmérséklet- és páratartalom-érzékel ők, valamint a vizsgálati légkör 
mintavételének helye a kamrában.  
— A bevitt/elszívott leveg ő kezelése.  
— Légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként 
(csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként 
(egész testfelületen keresztüli expozíció).  
— Az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges id ő 
(t95).  
— A térfogatváltozások óránkénti száma.  
— Mérőberendezések (ha vannak).  
Expozíciós adatok  
— A fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra el őállí­
tott vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt leveg ő 
térfogatával).  
— A vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gy űjtött tény­
leges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, g őz, aeroszol) 
felvevő keverékek esetén mindegyik külön elemezhet ő. 
— Minden leveg őbeli koncentrációt tömegegységekben (mg/l, mg/m  3 stb.), 
nem pedig térfogategységekben (ppm, ppb stb.) kell megadni.  
— Részecskeméret-eloszlás, tömegfelez ő aerodinamikai átmér ő (MMAD), 
valamint geometriai szórás ( σ g ), beleértve azok kiszámításának módját. 
Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket.  
Vizsgálati körülmények  
— A vizsgált vegyi anyag el őkészítésének részletei, beleértve a szilárd 
anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi 
anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részle ­
teit. 
— A vizsgálati légkör el őállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való 
kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehet őség szerint vázlatrajz ­
zal). 
— A kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás (azaz a kalibrációs 
görbe kialakulásának) megfigyelésére használt berendezések részletei.  
— A kamrabeli koncentráció és részecskeméret-eloszlás meghatározásához 
alkalmazott minták gy űjtésére használt berendezések részletei.  
— Az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának 
részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegb ől való 
visszanyerésének hatásfokát).  
— Az állatok vizsgálati és kontrollcsoportokba való besorolásához alkalma ­
zott véletlen kiválasztási módszer.  
— A táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takar ­
mány típusa/eredete, a víz eredete).  
— A vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása.  
Eredmények  
— A kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos össze ­
foglalása.  
— A kamrabeli névleges és tényleges koncentráció adatainak táblázatos 
összefoglalása.  
— Részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai 
mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és 
a σ g számításait.  
— A válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása 
minden egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató 
és köztük az elhullt állatok, a hatások jellege, súlyossága, megjelené ­
sének időpontja és id őtartama).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Az egyes állatok súlyának táblázatos összefoglalása.  
— A táplálékfelvétel táblázatos összefoglalása.  
— A klinikai patológiai adatok táblázatos összefoglalása.  
— A boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei 
minden egyes állatra vonatkozóan.  
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése  
— Különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – 
például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való 
megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására.  
— Ki kell térni a részecskék belélegezhet őségére az általános megálla ­
pítások tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel 
nem teljesült.  
— A vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a 
tényleges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisz ­
tenciáját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti össze ­
függést.  
— Ki kell térni az elhullás valószín ű okára, valamint az els ődleges hatás ­
mechanizmusra (szisztémás vagy helyi).  
— Magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról 
szóló OECD-iránymutatás (3) szerinti kritériumok alapján humánus 
módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszköd ő vagy súlyos és 
tartós szorongás jeleit mutató állatokat.  
— Meg kell jelölni a célszerve(ke)t.  
— Meg kell határozni a NOAEL és a LOAEL értékét.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test 
Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(4) Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appéldául Toxicol. 1: 309-312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231-238.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diag ­
rams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. 
Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
(13) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK 
rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatá ­
lyon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, 
HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  KRÓNIKUS TOXICITÁSI VIZSGÁLATOK  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 452. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2009) leírt módszerrel. Az eredeti 452. vizsgálati iránymutatást 
1981-ben fogadták el. A jelen felülvizsgált B.30. vizsgálati módszer kidol ­
gozását az állatjóllét és a szabályozási követelmények terén az elmúlt időszakban bekövetkezett változások figyelembevétele érdekében tartották 
szükségesnek (1) (2) (3) (4). E B.30. vizsgálati módszer frissítése e 
melléklet B.32., A rákkelt ő hatás vizsgálata cím ű és B.33., A krónikus 
toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizsgálata cím ű fejezetének felülvizs ­
gálatával párhuzamosan történt meg a vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk megszerzése, valamint a dózis kiválasztá ­
sával kapcsolatos további részletek biztosítása céljából. A jelen vizsgálati 
módszer vegyi anyagok széles skálájának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvéd ő szereket és az ipari vegyszereket.
 
2. A krónikus toxicitási vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, ezért a 
jelen vizsgálati módszer els ősorban az e fajokon végzett vizsgálatokra alkal ­
mazandó. Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltér ő fajokon 
kell elvégezni, a megfelel ő módosításokkal a jelen vizsgálati módszerben 
vázolt elvek és eljárások is alkalmazhatók, az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejeze­
tében (5) vázoltakkal együtt, a krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkelt ő 
hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésére és elvégzésére vonat ­
kozó 116. OECD-iránymutatásban leírtak szerint (6).
 
3. A krónikus toxicitási vizsgálatok során alkalmazott három f ő beadási mód 
az orális, a dermális és az inhalációs. A beadási mód kiválasztása függ a 
vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció jellemz ő módjától. Az expozíciós mód kiválasztására vonatkozó 
további információk a 116. OECD-iránymutatásban találhatók (6).
 
4. A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a 
krónikus toxicitási vizsgálatok során a leggyakrabban alkalmazott mód. Az 
emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabá ­
lyozási rendszerek el őírásai alapján dermális vagy inhalációs expozíciót 
alkalmazó, hosszú távú krónikus toxicitási vizsgálatok elvégzésére is 
szükség lehet ugyan, azonban technikai szempontból e két expozíciós mód 
mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgálatokat eseti alapon kell megter ­
vezni, bár az itt ismertetett, a krónikus toxicitás orális beadás útján történ ő 
meghatározására és értékelésére szolgáló vizsgálati módszer a kezelési 
időszakokra, klinikai és patológiai paraméterekre stb. vonatkozó ajánlások 
tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizsgált vegyi anyagok inhalációs (6) (7) és dermális (6) módon történ ő beadásával kapcsolatban 
OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet B.8. (8) és B.29. 
fejezetét (9), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (7) kifejezetten alkalmazni kell az inhalációs expozí ­
ciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A dermális 
beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét (10) kell 
alkalmazni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. A krónikus toxicitási vizsgálat információt szolgáltat az ismételt, a vizsgált 
faj élettartamának jelent ős részére kiterjed ő expozícióból valószín űsíthetően 
fakadó egészségügyi kockázatokról. A vizsgálat információkkal szolgál a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, jelzi a célszerveket és a felhalmo ­
zódás lehet őségét. Becslést adhat továbbá az észlelhet ő káros hatással nem 
járó szintre is, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó 
biztonsági kritériumok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az állatok lehet ő legtöbb információ megszerzése érdekében történ ő körülte­
kintő klinikai vizsgálatának szükségessége is.
 
6. A jelen vizsgálati módszerben ismertetett vizsgálatok célkit űzései többek 
között a következ ők: 
— a vizsgált vegyi anyag krónikus toxicitásának meghatározása,  
— a célszervek meghatározása,  
— a dózis-válasz összefüggés jellemz őinek meghatározása,  
— a nem észlelhet ő káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark- 
dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatá ­
rozása,  
— a krónikus toxicitás hatásainak el őrejelzése az emberi expozíciós szintek 
vonatkozásában,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges 
adatok biztosítása (6).  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
7. A vizsgált vegyi anyag toxikológiai jellemz őinek vizsgálata és értékelése 
során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó 
összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat megkezdését megel őzően annak érdekében, hogy a vizsgálati terv a vizsgált 
vegyi anyag lehetséges krónikus toxicitásának hatékonyabb vizsgálatára 
összpontosítson, valamint hogy az állatkísérleteket minimálisra csökkentsük. 
A vizsgálat megtervezését segít ő információk többek között a vizsgált vegyi 
anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonsá ­
gai, a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ, bármely  in vitro  
vagy  in vivo  toxicitási vizsgálat eredményei, a várható felhasználási terü ­
let(ek) és az emberi expozíció lehet ősége, a szerkezetileg rokon vegyi 
anyagok rendelkezésre álló (Q)SAR- és toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok (egyszeri dózisra és adott esetben ismételt 
dózisra vonatkozó kinetikai adatok), valamint egyéb ismételt expozíciós 
vizsgálatokból származó adatok. A krónikus toxicitás meghatározása csak a toxicitásra vonatkozó, 28 napos vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból származó kezdeti információk megszerzését követ ően 
végzendő el. Az adott vizsgált vegyi anyag lehetséges egészségkárosító 
hatásai átfogó vizsgálatának részeként a krónikus toxicitás vizsgálatának fokozatos megközelítését kell megfontolni (11) (12) (13) (14).
 
8. Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelel őbb statisztikai módsze ­
reket az adott kísérleti tervre és célkit űzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét 
megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, 
hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, vala ­
mint egy vagy több csoport id ő előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. 
A megfelel ő statisztikai elemzésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a 
nemzetközileg elfogadott statisztikai módszerekre vonatkozó f őbb hivatko ­
zásokat a 116. iránymutatás (6), valamint a krónikus toxicitás és a rákkelt ő 
hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elemzésével és értékelésével 
kapcsolatos 35. iránymutatás (15) tartalmazza.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. A krónikus toxicitási vizsgálatok elvégzése során a klinikai tünetek mint a 
biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjai 
felismerésér ől, értékelésér ől és használatáról szóló 19. 
OECD-iránymutatásban (16), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés 
szerint: „ Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat 
progresszív, az állapot további romlásához vezet ő klinikai tüneteket mutat, 
tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén 
szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha 
úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrá ­
nyosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüne ­
teltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati 
dózis csökkentése. ”
 
10. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizs ­
gálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes 
útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (6), valamint a 
Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (17) (18). A fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat els ődleges célkit űzésétől vagy 
célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelel ő dózisszintek kiválasztásakor 
egyensúlyt kell találni egyfel ől a veszélyesség vizsgálata, másfel ől az 
alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálata (e melléklet B.33. fejezete) esetében (11. bekezdés).
 
11. Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálatának elvégzését (e melléklet B.33. fejezete) a krónikus toxicitási vizs ­
gálat (a jelen B.30. vizsgálati módszer) és a rákkelt ő hatás vizsgálatának (e 
melléklet B.32. fejezete) külön-külön történ ő elvégzése helyett. A két külön 
vizsgálat elvégzéséhez viszonyítva az együttes vizsgálat id ő- és költségha ­
tékonyabb anélkül, hogy befolyásolná az adatok min őségét a krónikus 
fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő 
hatás együttes vizsgálata során (e melléklet B.33. fejezete) azonban körülte ­
kintően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (9. és 20–25. bekez ­
dés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási keret ­
rendszerek a vizsgálatok külön-külön történ ő elvégzését írhatják el ő. 
12. A jelen vizsgálati módszer összefüggésében használt fogalmak meghatá ­
rozása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (6).  
A VIZSGÁLAT ELVE  
13. A vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk be fokozatos dózisokban a kísérleti 
állatok több csoportjának, általában 12 hónapig, bár hosszabb és rövidebb 
időtartam is választható a szabályozási követelményekt ől függően (lásd a 33. 
bekezdést). A kiválasztott id őtartamnak elég hosszúnak kell lennie ahhoz, 
hogy lehet ővé tegye a kumulatív toxicitás esetleges hatásainak megjelenését 
a geriátriai változások zavaró hatásai nélkül. A 12 hónapos expozíciós 
időtartamtól való eltérést indokolni kell, különösen a rövidebb id őtartamok 
esetében. A vizsgált vegyi anyagot általában orális úton juttatjuk be, azonban az inhalációs vagy dermális bejuttatással történ ő vizsgálat is 
megfelelő lehet. A vizsgálati terv egy vagy több id őközi elpusztítást is 
tartalmazhat, például a 3. és a 6. hónapot követ ően, és állatok további 
csoportjai vonhatók be ennek kiegyenlítése érdekében (lásd a 19. bekezdést). Az anyag beadásának id őszakában az állatokat a toxicitás jeleinek észlelése 
érdekében gondosan megfigyeljük. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusz ­
tított állatokat felboncoljuk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben 
maradt állatokat is elpusztítjuk és felboncoljuk
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
14. A jelen vizsgálati módszer els ősorban a krónikus toxicitás rágcsálókban 
történő vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (lásd a 2. bekezdést), 
ugyanakkor tudatában kell lenni annak, hogy bizonyos szabályozási rend ­
szerek hasonló vizsgálatok nem rágcsálókon történ ő elvégzését írhatják el ő. 
A faj kiválasztását indokolni kell. A rágcsálóktól eltér ő fajokon végzett 
krónikus toxicitási vizsgálatok tervezésének és elvégzésének adott esetben a jelen vizsgálati módszerben ismertetett elveken, valamint az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsá ­
lókon cím ű fejezetében (5) leírtakon kell alapulnia. A faj és törzs kiválasz ­
tására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (6).
 
15. A jelen vizsgálati módszer szerint el őnyben részesítend ő rágcsálófaj a 
patkány, de más rágcsálófaj, például az egér is használható. A patkányok 
és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógyszerészeti és toxikológiai 
vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumorindukcióra való fogékonyságuk, valamint a megfelel ően jellemzett törzsek rendelkezésre állása miatt preferált 
kísérleti modellek. E tulajdonságok eredményeképpen nagy mennyiség ű 
információ áll rendelkezésre fiziológiájukról és patológiájukról. Általánosan 
használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, ivarérett állat ­
okat kell alkalmazni. A krónikus toxicitás vizsgálatát olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb id őtartamú 
előzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban felhasznált állatokéval. Olyan n ősté­
nyeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és nem vemhesek.
 
Tartási és etetési körülmények  
16. Az állatokat külön, vagy azonos nem ű egyedekb ől álló kis csoportokban 
kell tartani; a külön történ ő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az 
tudományos szempontból indokolt (19) (20) (21). A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének 
lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmérsék­
lete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartal ­
mának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától elte ­
kintve – lehet őség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 
50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos 
és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosí ­
tása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes 
tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló takar ­
mány-szennyez ődések mennyiségének – beleértve többek között a növény ­
védőszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyez ő anyagokat, a fito ­
ösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehet ő legalacso ­
nyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lév ő szennyez ő 
anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat id őszakos jelleggel kell 
meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás következik be a felhasznált adagban, és ezeket az információkat a zárójelen ­
tésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre vonatkozó anali ­
tikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag táplálékkal történ ő beadása esetén a takarmány megválasztását befolyásol ­
hatja annak szükségessége, hogy az megfelel ően keveredjen el a takarmány ­
nyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
 
Az állatok el őkészítése  
17. A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges 
állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljá ­
rásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történ ő adagolást az elválasztást 
és szoktatást követ ően a lehet ő leghamarabb, és lehet őleg az állatok 8 hetes 
kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly 
és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az 
egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
használt összes állat súlyának átlagos értékét ől pedig legfeljebb ± 20 %-kal 
különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszer űen kell beso ­
rolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszer ű kiválasztást követ ően 
nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak el ő, a 
véletlenszer ű kiválasztás lépését lehet őség szerint meg kell ismételni. 
Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, mikrochip-beültetés vagy más megfelel ő módszer segítségével.
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
18. A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelel ő számú állatot 
kell használni, hogy a vizsgálat végén mindegyik csoportban elegend ő állat 
álljon rendelkezésre az alapos biológiai és statisztikai értékeléshez. 
Rágcsálók esetén az egyes dózisszintekhez általában nemenként és csopor ­
tonként legalább 20 állat, nem rágcsálók esetén pedig nemenként és csopor ­
tonként legalább 4 állat javasolt. Az egerekkel végzett vizsgálatok esetében további állatok bevonása lehet szükséges minden egyes dóziscsoportban az 
összes előírt hematológiai meghatározás elvégzése céljából.
 
Időközi elpusztításra, kísér ő csoportokra és jelz őállatokra vonatkozó 
rendelkezések  
19. Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a toxikoló ­
giai változások alakulására vonatkozó és mechanisztikai információk megszerzése céljából el őírhatja az id őközi elpusztítást (legalább 10 állat/ 
nem/csoport esetén), például a 6. hónapban. Abban az esetben, ha ilyen 
információk a vizsgált vegyi anyaggal végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelkezésre állnak, az id őközi elpusztítás 
tudományos szempontból nem feltétlenül indokolt. Kísér ő csoportok is 
bevonhatók a vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai 
változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából; ezek vizsgálata általában a vizsgálat legnagyobb dózisával való kezelésre és kontrollvizs ­
gálatra korlátozódik. Szükség szerint egy jelz őállatokból álló további (jel ­
lemzően nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség álla ­
potának a vizsgálat közben történ ő megfigyelése céljából (22). Ha id őközi 
elpusztítás vagy kísér ő, illetve jelz őcsoportok alkalmazását tervezzük, az 
állatok vizsgálati tervben szerepl ő létszámát annyival kell megnövelni, 
ahány állatot a vizsgálat befejezése el őtt el szándékozunk pusztítani. Ezeket 
az állatokat általában ugyanazoknak a megfigyeléseknek kell alávetni, mint a fő vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált állatokat, beleértve a 
testsúlyra, táplálék-/vízfogyasztásra, hematológiára és klinikai kémiára 
vonatkozó méréseket, valamint patológiai vizsgálatokat, de el őírható (az 
időközi elpusztítás céljából bevont csoportoknál), hogy a mérések csak 
bizonyos f őbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy az immunto ­
xicitásra korlátozódjanak.
 
Dóziscsoportok és adagolás  
20. A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára 
vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban (6) található. Legalább három 
dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni, kivéve, ha 
határérték-vizsgálatot végzünk (lásd a 27. bekezdést). A dózisszintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy tartomány ­
behatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi 
anyagra vagy rokon vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló bármi ­
lyen toxikológiai és toxikokinetikai adatot.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai 
nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet általában olyan 
módon kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az els ődleges célszervek 
és toxikus hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhet ő legyen a szen ­
vedés, a súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A 22. bekezdésben 
bemutatott tényez ők figyelembevétele mellett a legmagasabb dózisszintet 
úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható.
 
22. A vizsgálat célkit űzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást 
bizonyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz el ő, amely azonban csak kismér ­
tékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt. A maximális dózis 
nem haladhatja meg az 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap értéket (határdózis, lásd a 27. bekezdést).
 
23. A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható 
legyen a dózis-válasz összefüggés és a NOAEL, vagy a vizsgálat egyéb tervezett kimenetele, például a legalacsonyabb dózisszinten megfigyelhet ő 
BMD (lásd a 25. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kiválasztása során figye ­
lembe veend ő tényezők többek között a dózis-válasz görbe várható mere ­
deksége, azok a dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metabolizmusban vagy a toxikus hatás mechanizmusában, amelyeknél 
küszöbérték várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis extrapolálásához 
használható kiindulási pont várható.
 
24. A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag 
jellemzőitől, és nem írható el ő a jelen vizsgálati módszerben, ugyanakkor 
csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres 
intervallumok alkalmazása, az adagolások közötti nagyon nagy interval ­
lumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával 
szemben pedig gyakran el őnyben részesítend ő egy negyedik vizsgálati 
csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófaktorokat általában kerülni kell, és használatukat meg kell indokolni.
 
25. A 116. iránymutatásban (6) részletesebben leírtak szerint a dózis kiválasz ­
tásakor figyelembe veend ő szempontok többek között a következ ők: 
— ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis- 
válasz görbén,  
— toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a 
metabolikus indukció, a telítettség vagy a küls ő és belső dózisok közötti 
nemlinearitás el őfordul, vagy nem fordul el ő, 
— prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a f őbb mögöttes biológiai 
folyamatok m űködésének mutatói,  
— A hatásmechanizmus f őbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a 
dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormon ­
szintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,  
— A dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szük ­
séges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományá ­
ban, 
— a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag 
beadásához viv őanyagot használunk, egy viv őanyaggal kezelt kontrollcso ­
port alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizs ­
gálati csoportokban lév őket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcso ­
portban a viv őanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyi ­
ségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelent ősen 
csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a 
megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
 
27. Ha el őzetes vizsgálatokból származó információk alapján el őre jelezhet ő, 
hogy az egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap dózisnak 
megfelelő dózisszinttel, az e vizsgálathoz leírt eljárásokat követve végzett 
vizsgálat valószín űleg nem okoz kedvez őtlen hatásokat, valamint a szerke ­
zetileg rokon vegyi anyagokra vonatkozó adatok alapján nem várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó vizs ­
gálat elvégzése nem feltétlenül szükséges. 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap 
határadag alkalmazható, kivéve, ha a humán expozíció magasabb dózisszint használatát indokolja.
 
A dózisok el őkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása  
28. A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvíz ­
zel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és 
módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (6). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhet őségétől, vala­
mint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás 
útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszer űen tükrözi 
a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplá ­
lékban vagy környezetben el őforduló vegyi anyagok, többek között a 
növényvéd ő szerek esetében a beadás jellemz ően a táplálékon vagy az 
ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi 
expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelel őbbnek 
bizonyulhatnak.
 
29. A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk 
alkalmas viv őanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a viv őanyag 
és más adalékanyagok következ ő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag 
felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyako ­
rolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon 
hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemz őit, valamint az 
állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. Lehet őség szerint els ősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos 
alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) 
oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más viv őanyagokban elkészí ­
tett oldatot. A vízt ől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a viv őanyag 
toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények közötti (például takarmánnyal történ ő beadás során fennálló) stabilitására 
és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homoge ­
nitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
 
30. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos 
biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja 
meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takar ­
mánnyal történ ő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok 
esetében a takarmányban lév ő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a 
kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem halad ­
hatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takar ­
mányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/ takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendsze ­
rességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmaz ­
ható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Orális úton történ ő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az 
állatoknak beadni (heti hét napon keresztül) általában 12 hónapon át (lásd 
még a 33. bekezdést), bár a szabályozási követelményekt ől függően 
hosszabb id őtartam is szükséges lehet. Bármely más adagolási rendszer – 
például heti öt napon történ ő beadás – használatát indokolni kell. Dermális 
úton történ ő beadás esetén az állatokat az e melléklet B.9. fejezetében (10) 
meghatározottak szerint általában legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 12 hónapon át. Az inhaláció útján történ ő expozíciót napi 6 órán keresztül, heti 7 nap kell elvégezni, de 
indokolt esetben heti 5 napos expozíció is alkalmazható. Az expozíció 
időtartama általában 12 hónap. Patkányoktól eltér ő rágcsálófajok csak 
orron át történ ő expozíciója esetén az expozíció maximális id őtartama kiiga ­
zítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A napi 6 óránál 
rövidebb expozíciós id őtartam alkalmazását indokolni kell. Lásd még e 
melléklet B.8. fejezetét (8).
 
32. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap 
hasonló id őszakában, gyomorszondán vagy megfelel ő intubációs kanülön át 
kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, 
a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az 
egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretétől függ. A mennyiséget a lehet ő legalacsonyabb szinten kell tartani, 
és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúly ­
gramm térfogatot (22). A koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra 
kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy vala ­
mennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó 
anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdeké ­
ben. Kerülni kell az emészt őrendszerben valószín űsíthetően maró vagy irri ­
tatív hatást kiváltó koncentrációkkal történ ő vizsgálatokat.
 
A vizsgálat id őtartama  
33. A jelen vizsgálati módszert ugyan els ődlegesen 12 hónapos krónikus toxi ­
citási vizsgálatként dolgozták ki, a vizsgálati terv azonban az adott szabá ­
lyozási rendszer követelményeit ől vagy bizonyos mechanisztikai céloktól 
függően lehetővé teszi a rövidebb (például 6 vagy 9 hónapos) vagy 
hosszabb (például 18 vagy 24 hónapos) id őtartamú vizsgálatokat, illetve 
alkalmazható ilyen id őtartamú vizsgálatok során is. A 12 hónapos expozí ­
ciós időtartamtól való eltérést indokolni kell, különösen a rövidebb id őtar­
tamok esetében. A vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikoló ­
giai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából bevont kísér ő 
csoportokat az expozíció megszüntetését követ ően legalább 4 hétig, de 
legfeljebb a vizsgálat teljes id őtartamának egyharmadáig fenn kell tartani 
adagolás nélkül. További, többek között a vizsgálat során életben maradt 
állatok figyelembevételével kapcsolatos útmutatás a 116. iránymutatásban (6) található.
 
MEGFIGYELÉSEK  
34. Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepna ­
pokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbete ­
gedés jeleit vagy nem hullott-e el. Általános klinikai megfigyelést naponta legalább egyszer kell végezni, lehet őleg minden nap ugyanazon 
időpont(ok)ban, szondával történ ő adagolás esetén figyelembe véve az 
adagolást követ ően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Az els ő expozíció el őtt legalább egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás 
érdekében), a vizsgálat els ő hetének végén, azt követ ően pedig havonta 
egyszer az összes állatot részletes klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. A megfigyelési protokollt úgy kell kialakítani, hogy az egyes megfigyel ők 
közötti különbségek minimálisak legyenek, és függetlenek legyenek a vizs ­
gált csoportoktól. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt 
ketreceken kívül, lehet őleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a 
nap hasonló id őszakában kell elvégezni. A megfigyeléseket gondosan fel 
kell jegyezni, lehet őleg a vizsgálatokat végz ő laboratórium által kifejezetten 
meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy a 
megfigyelési körülmények közötti különbségek minimálisak legyenek. A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a b őr, a szőrzet, 
a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok 
előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupillaméret, valamint szokatlan légzési ritmusok) tekinte ­
tében megfigyelhet ő változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre 
adott reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, 
sztereotip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen 
bizarr viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (24).
 
36. A vizsgált vegyi anyag els ő beadását szemtükörrel vagy más, megfelel ő 
eszközzel végzett szemészeti vizsgálat el őzi meg, amelyet az összes állaton 
el kell végezni. E vizsgálatot a vizsgálatsorozat végén meg kell ismételni, lehetőleg az összes állaton, de legalább a magas dózissal kezelt és kontroll ­
csoportok tagjain. Ha a szemben a kezeléssel összefügg ő elváltozást tapasz ­
talunk, az összes állatot meg kell vizsgálni. Ha szerkezeti elemzés vagy 
egyéb információ szemtoxicitásra utal, a szemvizsgálatot gyakrabban kell elvégezni.
 
37. Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 
28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges neurotoxikus hatásokat jeleztek, a vizsgálat megkezdését megel őzően, valamint a vizsgálat 
kezdetét követ ő 12. hónap végéig 3 hónapos id őközönként, továbbá a vizs ­
gálat végén (ha az tovább tart 12 hónapnál) elvégezhet ő a különböz ő típusú 
ingerekre (24) (például hallószervi, vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott érzékszervi reakciók vizsgálata (25), (26), (27), a szorítás erejének értékelése (28) és a motoros aktivitás felmérése (29). A követend ő eljárásokkal kapcso ­
latban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ett ől 
függetlenül a hivatkozottaktól eltér ő alternatív eljárások is alkalmazhatók.
 
38. Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 
28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges immuntoxikus 
hatásokat jeleztek, e végpont további vizsgálatát lehet végezni a vizsgálat 
végén.  
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség  
39. A kezelés kezdetekor, az els ő 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután 
pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat els ő 13 
hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább havonta egyszer kell 
mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat els ő 13 hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább 
havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok 
esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megvál ­
toznak.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok  
40. A rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében csoportonként legalább 10 hím 
és 10 nőstény állaton hematológiai vizsgálatokat kell végezni a 3., 6. és 12. 
hónapban, valamint a vizsgálat végén (ha az hosszabb, mint 12 hónap), 
mindegyikhez ugyanazokat az állatokat használva. Az egereken végzett vizs ­
gálatok esetében kísér ő csoportra lehet szükség az összes el őírt hematológiai 
vizsgálat elvégzése céljából (lásd a 18. bekezdést). A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél 
például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi id őpon­
tokban, valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem 
mutattak változást a hematológiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 
3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. Vérmintákat meghatározott helyr ől kell venni, például a 
szívből vagy a szemgolyó mögötti üregb ől altatás alatt.
 
41. Az alábbi paramétereket kell vizsgálni (30): teljes és differenciált 
leukocitaszám, eritrocitaszám, trombocitaszám, hemoglobinkoncentráció, hematokrit (vérsejtsüllyedés), átlagos sejttérfogat (MCV), eritrociták 
átlagos hemoglobintartalma (MCH), eritrociták átlagos hemoglobin ­
koncentrációja (MCHC), prothrombin id ő, valamint aktivált parciális trom ­
boplasztin id ő. A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függ ően szükség szerint 
egyéb hematológiai paramétereket, például Heinz-testeket vagy egyéb 
atipikus eritrocitamorfológiát vagy methemoglobint is lehet mérni. Általá ­
nosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ. Ha a vizsgált vegyi anyag a vérképz ő rendszerre hat, a retikulocita ­
szám és a csontvel őcitológia is feltüntethet ő, habár ezek vizsgálatát nem 
szükséges rutinszer űen elvégezni.
 
42. A szövetekben jelentkez ő fontosabb toxikus hatások és különösen a vesékre 
és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek 
meghatározását legalább 10 hím és 10 n őstény állattól vett vérmintákból kell 
elvégezni a hematológiai vizsgálatokhoz meghatározott id őközönként, 
minden esetben ugyanazokat az állatokat használva. Az egereken végzett 
vizsgálatok esetében kísér ő csoportra lehet szükség az összes el őírt klinikai 
biokémiai vizsgálat elvégzése céljából. A nem rágcsálókon végzett vizs ­
gálatok esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi id őpontokban, 
valamint a vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a 
korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a klinikai biokémiai paraméterek vonatkozásában, a vizs ­
gálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb 
fajok esetében sem. A vérvétel el őtti éjszaka javasolt az állatokat koplaltatni 
(kivéve egerek esetében). A következ ő paramétereket kell vizsgálni (30): 
glükóz, karbamid (karbamid-nitrogén), kreatinin, teljes fehérje, albumin, kalcium, nátrium, kálium, teljes koleszterin, legalább két értékelhet ő minta 
a májsejtek értékeléséhez (alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotransz ­
feráz, glutamát-dehidrogenáz, teljes epesav) (31), valamint legalább két érté ­
kelhető minta a máj és az eperendszer értékeléséhez (alkáli foszfatáz, 
gamma-glutamil-transzpeptidáz, 5’-nukleotidáz, teljes bilirubin, teljes 
epesav) (31). A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függ ően szükség szerint 
más klinikai kémiai paraméterek, például az éhgyomorra mért trigliceridek, bizonyos hormonok és a kolinészterázszint mérése is elvégezhet ő. Általá­
nosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely 
az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt 
függ.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Vizeletelemzést legalább 10 hím és 10 n őstény állaton kell végezni a hema ­
tológiai és klinikai kémiai vizsgálatokhoz meghatározott id őközönként levett 
mintákon. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizs ­
gálatok nem mutattak változást a vizeletelemzés vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szükséges méréseket végezni. A klinikai patológiai vizs ­
gálatra vonatkozó szakért ői ajánlás a következ ő vizsgálandó paramétereket 
tartalmazza (30): küllem, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, összes fehérje, valamint glükóz. Az egyéb mérések közé tartozik a keton, az urobilinogén, a bilirubin és a vizeletben jelen lév ő vér vizsgálata. 
Szükség szerint további paraméterek vizsgálatát is be lehet vezetni a 
megfigyelt hatás(ok) vizsgálati körének b ővítése érdekében.
 
44. Általánosan elfogadott, hogy kutyákon végzett vizsgálatok esetében a 
kezelés el őtt kiinduló hematológiai és klinikai biokémiai változókra van 
szükség, rágcsálok vizsgálatánál azonban ez nem szükséges (30). Ha azonban a rendelkezésre álló kiinduló adatok (lásd az 50. bekezdést) nem bizonyulnak elegend őnek, megfontolandó ezen adatok meghatározása.
 
Patológia  
Autopszia  
45. Általában a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autop ­
sziának kell alávetni, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. El őírható ugyanakkor (az id őközi elpusztítás céljából bevont 
vagy kísér ő csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos f őbb paraméte ­
rekre, például a neurotoxicitásra vagy immuntoxicitásra korlátozódjanak (lásd a 19. bekezdést). Ezeket az állatokat nem kell alávetni boncolásnak és az azt követ ő, a következ ő bekezdésekben ismertetett eljárásoknak. A 
jelzőállatok esetében a vizsgálatvezet ő döntésétől függően eseti alapú bonco ­
lásra lehet szükség.
 
46. A 45. bekezdés utóbbi részében kivételként megjelölt állatokéin kívül az 
összes állat szerveinek súlyát meg kell mérni. Az összes állat (eltekintve az elhullásközeli állapotban lév ő és/vagy a vizsgálat befejeztét megel őzően 
elpusztított egyedekt ől) mellékveséit, agyát, mellékheréit, szívét, veséit, 
máját, petefészkeit, lépét, heréit, pajzsmirigyét (amelyet fixálás után mérünk 
meg a mellékpajzsmirigyekkel együtt) és méhét megfelel ően meg kell tisz ­
títani minden rátapadt szövett ől, és azok nedves súlyát a boncolást követ ően 
a lehető legrövidebb id őn belül meg kell mérni, miel őtt azok kiszáradnának. 
Egereken végzett vizsgálat esetén a mellékvese megmérése nem kötelez ő.
 
47. Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a kés őbb elvégezni kívánt kórszö ­
vettani vizsgálat szempontjából legmegfelel őbb fixálóanyaggal kell tartósítani 
(32) (a szögletes zárójelben megadott szövetek meg őrzése nem kötelez ő): 
minden makroszkopikus 
elváltozás szív hasnyálmirigy gyomor (el őgyomor, mirigy ­
gyomor) 
mellékvese csíp őbél mellékpajzsmirigy [fogazat] 
aorta éhbél perifériás idegek here 
agy (beleértve a nagyagy, a 
kisagy és a nyúltvel ő/nyúl­
tagyi híd metszeteit) vese agyalapi mirigy csecsem őmirigy 
vakbél könnymirigy (szem ­
üregen kívüli) prosztata pajzsmirigy 
méhnyak máj végbél [nyelv]  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
koaguláló mirigy tüd ő nyálmirigy légcs ő 
vastagbél nyirokcsomók (felszíni 
és mély) ondóhólyag húgyhólyag 
patkóbél eml őmirigy (n ősté­
nyeknél kötelez ő, 
hímeknél csak ha látha ­
tóan kimetszhet ő) harántcsíkolt izom méh (beleértve a méhnyakat) 
mellékhere [fels ő légutak, beleértve 
az orrot, az orrkagylókat 
és az orrmelléküregeket] bőr [húgyvezeték] 
szem (beleértve a retinát) nyel őcső gerincvel ő (három szin ­
ten: nyaki, mellkasi 
középső és ágyéki 
szakasz) [húgycső] 
[combcsont az ízületi felü ­
lettel együtt] [szaglógumó] lép hüvely 
epehólyag (patkánytól eltér ő 
fajoknál) petefészek [szegycsont] metszet a csontvel őből és/ 
vagy egy friss, csontvel őből 
felszívott minta 
Harder-mirigy  
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
tartósítani kell. A klinikai és más jelleg ű megfigyelések alapján további 
testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni 
minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdon ­
ságai alapján valószín űleg célszervnek tekinthet ő. A dermális úton történ ő 
bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történ ő beadásnál 
felsorolt szerveket kell tartósítani, továbbá elengedhetetlen a b őrből történő 
mintavétel a beadás helyér ől és e minta tartósítása. Inhalációs vizsgálatok 
esetében a légz őrendszerb ől származó tartósított és vizsgált szövetek felso ­
rolásának követnie kell az e melléklet B.8. (8) és B.29. fejezetében (9) tett 
ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légz őrendszerb ől 
származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történ ő beadásnál felsorolt 
szerveket kell vizsgálni.  
Kórszövettani vizsgálatok  
48. A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára 
vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (32). Legalább a következ ő 
szöveteket kell kórszövettani vizsgálatnak alávetni:  
— a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó 
összes szövet,  
— a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes 
szövet,  
— a makroszkopikus rendellenességeket mutató összes szövet,  
— a célszöveteket, vagy azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal 
kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható elváltozásokat mutatnak, az 
összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,  
— páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
vizsgálni kell.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
49. Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat 
esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában össze ­
gezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett 
elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás 
vagy humánus okokból való elpusztítás id őpontját, a toxicitás jeleit mutató 
állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat 
mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípu ­
sokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegz ő adattáblázatoknak 
tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok eseté ­
ben), valamint az elváltozások osztályozását.
 
50. A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a 
korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontr ­
ollokból származó adatok vélhet ően lényegesen eltolódottak az ugyanabban 
a vizsgálati létesítményben/kolóniában lév ő kontrollállatoktól származó 
újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon 
laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe 
tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megel őző öt évből származó 
adatokat kell felhasználni.  
51. A számszer ű eredményeket adott esetben megfelel ő és általánosan elfogadott 
statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módsze ­
reket és az elemezend ő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani 
(8. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint el ő kell írni a túlélésre 
vonatkozó kiigazításokat.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
52. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok,  
— a vegyi anyag származási helye,  
— gyártási szám,  
— kémiai elemzésr ől szóló tanúsítvány.  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz).  
Kísérleti állatok:  
— a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,  
— az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,  
Vizsgálati körülmények:  
— a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,  
— az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány el őkészítésére vonat ­
kozó részletes adatok,  
— a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására 
vonatkozó analitikai adatok,  
— a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó rész ­
letes adatok,  
— inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a 
bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,  
— tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi 
anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglév ő koncentrációjáról (mg/kg 
vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási 
tényező, ha ez alkalmazható,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok.  
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra 
vonatkozó adatokat is meg kell adni):  
— túlélési adatok,  
— testsúly és annak változásai,  
— takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos 
számítások, ha vannak, valamint adott esetben vízfogyasztás,  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatok nemek és adagolási szintek szerinti 
csoportosításban, beleértve a toxicitás jeleit,  
— a megfigyelt klinikai tünetek jellege, el őfordulása (valamint ha pontoz ­
zuk, súlyossága) és id őtartama (átmeneti vagy állandó),  
— szemészeti vizsgálat,  
— hematológiai vizsgálatok,  
— klinikai biokémiai vizsgálatok,  
— vizeletelemzés,  
— az esetleges neurotoxicitási vagy immuntoxicitási vizsgálatok eredmé ­
nye, 
— testsúly elpusztuláskor,  
— szervek súlya (és ezek aránya, ha alkalmazható),  
— boncolási eredmények,  
— a kórszövettani vizsgálatok összes, kezeléssel összefügg ő eredményének 
részletes ismertetése,  
— abszorpciós adatok, ha rendelkezésre állnak.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható  
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következ őket: 
— dózis-válasz összefüggések,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,  
— az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,  
— BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,  
— korábbi kontrolladatok,  
— humán relevancia.  
Következtetések  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.  
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Prog ­
ramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
(5) E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismé ­
telt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejezete.  
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(8) E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat cím ű 
fejezete.  
(9) E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat 
című fejezete.  
(10) E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) cím ű 
fejezete.  
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization 
of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to 
LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69-98.  
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(18) ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(19) Az Európai Parlament és a Tanács 2010/63/EU irányelve (2010. szep ­
tember 22.) a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.  
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appéldául Pharmacol. 108: 267-283.  
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appéldául Toxicol. 29: 198-201.  
(31) EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 
131. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  PRENATÁLIS FEJL ŐDÉSI TOXICITÁSVIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer az OECD TG 414 (2001) módszer megfelel ője. 
1.1. BEVEZETÉS  
E fejlődési toxicitási vizsgálati módszer segítségével általános infor ­
mációk nyerhet ők a vemhes kísérleti állatot és a méhben fejl ődő élő 
szervezetet ér ő prenatális expozíció hatásaival kapcsolatosan, és 
magában foglalhatja az anyai hatások, továbbá a magzatelhalás, a magzatban fellép ő strukturális rendellenességek vagy rendellenes 
növekedés vizsgálatát. A funkcionális defektusok, bár a fejl ődés 
szempontjából igen fontosak, nem képezik szerves részét ennek a módszernek. Az ilyen hatások külön vizsgálat vagy e módszerhez kapcsolódóan kiegészít ő vizsgálat keretében tanulmányozhatók a 
fejlődési neurotoxicitási vizsgálati módszer alkalmazásával. A funk ­
cionális defektusok és más posztnatális hatások vizsgálatára vonat ­
kozó információkkal kapcsolatban a kétgenerációs reprodukciós toxi ­
citási vizsgálati módszert, valamint a fejl ődési neurotoxicitási vizs ­
gálati módszert kell segítségül hívni adott esetben.
 
E vizsgálati módszert esetenként a vizsgálandó anyaggal, így például 
annak fizikai-kémiai vagy toxikológiai tulajdonságaival kapcsolatos konkrét ismeretek alapján egyedi esetekhez kell adaptálni. Az ilyen adaptáció akkor elfogadható, ha meggy őző tudományos bizonyítékok 
szerint informatívabb vizsgálatot eredményez. Ilyen esetben a tudo ­
mányos bizonyítékokat részletesen ismertetni kell a vizsgálati jelen ­
tésben.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Fejlődési toxikológia:  a fogantatás el őtt vagy a prenatális fejl ődés 
során, vagy a születés és szexuális érés közötti id őszakban (poszt ­
natálisan) történ ő expozícióból származó, a fejl ődő élő szervezetet 
érő káros hatások vizsgálata. A fejl ődési toxicitás f ő megnyilvánulá ­
sai: 1. az él ő szervezet elhalása/elhullása; 2. strukturális rendellenes ­
ség; 3. rendellenes növekedés; és 4. funkcionális defektus. A fejl ő­
dési toxikológia korábban teratológia néven volt ismert.  
Káros hatás:  a normálhoz képest bármilyen, a kezeléssel összefügg ő 
elváltozás, amely csökkenti az él ő szervezet túlélésre, szaporodásra 
vagy környezethez való alkalmazkodásra való képességét. A fejl ő­
dési toxikológia területén a legszélesebb értelemben véve ide tartozik 
bármely olyan hatás, amely megzavarja a konceptus normális fejl ő­
dését a születés el őtt és után.  
Rendellenes növekedés:  az utód szerveinek vagy testének töme ­
gében vagy méretében bekövetkez ő elváltozás.  
Elváltozások (rendellenességek):  strukturális elváltozások a fejl ődés 
során, amelyek magukban foglalják mind a deformitásokat, mind az eltéréseket (28).
 
Deformitás/súlyos fejl ődési rendellenesség:  az állatra ártalmasnak 
(vagy akár letálisnak) tartott strukturális változás, amely általában 
ritka. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Eltérés/kisebb fejl ődési rendellenesség:  az állatra kisfokban ártal ­
masnak vagy ártalmatlannak tartott strukturális változás; lehet 
átmeneti jelleg ű, és viszonylag gyakran el őfordulhat a kontroll ­
populációban.  
Konceptus:  a megtermékenyített petesejt származékainak összessége 
a fejlődés bármely szakaszában a megtermékenyítést ől a születésig, 
amely magában foglalja az extraembrionális burkokat és az embriót vagy magzatot is.
 
Beágyazódás:  a blasztocisztának a méh hámrétegéhez való kapcso ­
lódása, amely magában foglalja a méh hámszövetén történ ő áthato­
lást és méhnyálkahártyába történ ő beágyazódását.  
Embrió:  az élő szervezet korai vagy fejl ődő stádiuma, mégpedig a 
megtermékenyített petesejtb ől kialakuló fejl ődési produktum a 
hosszanti tengely megjelenése után, és amíg és az összes f őbb struk­
túra ki nem alakul.  
Embriotoxicitás:  ártalmas hatás az embrió normál struktúrájára, 
fejlődésére, növekedésére és/vagy életképességére.  
Magzat:  a posztembrionális szakaszban lév ő, meg nem született 
utód.  
Magzati toxicitás:  ártalmas hatás a magzat normál struktúrájára, 
fejlődésére, növekedésére és/vagy életképességére.  
Abortusz:  a fogantatás produktumának, azaz az embriónak vagy egy 
életképtelen magzatnak a méhb ől történő idő előtti kilökődése/­
eltávolítása.  
Felszívódás:  a méhbe beágyazódott, majd elhalt konceptus felszí ­
vódik vagy felszívódott.  
Korai felszívódás:  a beágyazódás nyoma felismerhet ő embrió/ ­
magzat nélkül.  
Késői felszívódás:  elhalt embrió vagy magzat küls ő degeneratív 
változásokkal.  
NOAEL:  a nem észlelhet ő káros hatás szintjének (no-observed- 
adverse-effect-level) rövidítése, amely azt a legmagasabb dózisszintet 
vagy expozíciós szintet jelöli, amelynél nem figyelhet ők meg a keze ­
léssel összefügg ő káros hatások.  
1.3. REFERENCIAANYAG  
Nincs.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó anyagot általában vemhes állatoknak adagolják 
legalább a beágyazódástól az exterminálás tervezett id őpontját 
megelőző napig, amelynek a lehet ő legközelebb kell esnie az ellés 
normál napjához anélkül, hogy az id ő előtti ellés miatt felmerülne az 
adatok elvesztésének kockázata. A vizsgálati módszerrel nemcsak az 
organogenezis id őszakát (pl. rágcsálókban az 5. és 15. nap közötti 
időszak, nyúlban pedig a 6. és 18. nap közötti id őszak) lehet vizs ­
gálni, hanem már a beágyazódás el őtti időszaktól kezdve adott 
esetben az egész vemhességen át a császármetszés el őtti napig jelent ­
kező hatásokat is. Röviddel a császármetszés el őtt a nőstényeket 
exterminálni kell, és meg kell vizsgálni a méhtartalmat, a magzatok esetében pedig meg kell vizsgálni a küls őleg látható rendellenessége ­
ket, valamint a lágyszövetben és vázrendszerben észlelhet ő elválto­
zásokat.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.5.1.  Az állatfaj kiválasztása  
Ajánlatos a vizsgálatot az erre legalkalmasabb fajban végezni, és 
olyan laboratóriumi fajt és törzset alkalmazni, amelyet széles körben 
használnak prenatális fejl ődési toxicitási vizsgálatokhoz. A preferált 
rágcsálófaj a patkány, a preferált nem rágcsálófaj pedig a nyúl. Az ettől eltérő fajok alkalmazását megfelel ően indokolni kell.
 
1.5.2.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
Rágcsálók esetében a kísérleti helyiség h őmérsékletének 22  o C 
(± 3  o C)-nak, nyulak esetében pedig 18  o C (± 3  o C)-nak kell lennie. 
Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 
70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás 
legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány 
alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 
A pároztatásokat erre a célra alkalmas ketrecekben kell végezni. Bár 
előnyösebb a pároztatott állatokat egyedileg tartani, kis számban 
csoportos tartás is elfogadható.  
1.5.3.  Az állatok el őkészítése  
Legalább 5 napon át a laboratórium körülményeihez szoktatott, 
egészséges állatokat kell alkalmazni, amelyek korábban nem voltak 
más kísérlet alanyai. A kísérleti állatok jellemzésekor meg kell adni 
az állat faját, törzsét, származását, ivarát, testtömegét és/vagy életko ­
rát. Amennyire csak megoldható, az állatok az összes vizsgálati csoportban legyenek azonos testtömeg űek és korúak. Minden 
dózishoz még egyszer sem ellett, fiatal feln őtt nőstényeket kell hasz ­
nálni. A n őstényeket azonos fajú és azonos törzsb ől származó 
hímekkel kell pároztatni, és kerülni kell a testvérek pároztatását. Rágcsálók esetében a vemhesség 0. napja az, amikor hüvelydugó 
és/vagy sperma észlelhet ő; nyulak esetében a 0. nap általában a 
párzás vagy a mesterséges megtermékenyítés napja, ha ezt a tech ­
nikát alkalmazzák. A pároztatott n őstényeket torzítatlan módon kell a 
kontroll- és a kezelési csoportokba beosztani. A ketreceket úgy kell 
elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelye ­
zése jelentette lehetséges hatásokat. Minden állatot egyedi azonosí ­
tószámmal kell ellátni. A pároztatott n őstényeket torzítatlan módon 
kell beosztani a kontroll- és a kezelési csoportokba, és ha a n ősté­
nyeket csoportosan pároztatják, az egyes pároztatási csoportokból 
származó állatokat egyenletesen kell elosztani a kezelési és kontroll ­
csoportokban. Az azonos hímmel pároztatott n őstényeket is egyenle ­
tesen kell szétosztani a különböz ő csoportokba.
 
1.6. ELJÁRÁS  
1.6.1.  Az állatok száma és ivara  
Minden vizsgálati és kontrollcsoportba elegend ő számú nőstényt kell 
beosztani ahhoz, hogy legalább körülbelül 20 olyan n őstény álljon 
rendelkezésre, amelyekben a boncoláskor beágyazódási helyek talál ­
hatók. A 16-nál kevesebb n őstényt – amelyekben beágyazódási 
helyek találhatók – tartalmazó csoportok esetleg nem megfelel őek 
a vizsgálatra. Az anyaállatok elhullása nem feltétlenül teszi érvény ­
telenné a vizsgálatot, feltéve hogy az arány nem haladja meg a 
körülbelül 10 %-ot.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  A dózisok el őkészítése  
Ha a beadás megkönnyítése érdekében viv őanyagot vagy más 
adalékot alkalmaznak, a következ ő jellemzőket kell figyelembe 
venni: a vizsgálandó anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmu ­
sára és visszatartására vagy kiürülésére gyakorolt hatások; a vizs ­
gálandó anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatások, amelyek megváltoztathatják annak toxikus jellemz őit; valamint az állatok 
táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt 
hatások. A viv őanyag nem lehet fejl ődésre toxikus, és nem lehet 
hatással a szaporodásra sem.
 
1.6.3.  Adagolás  
A vizsgálandó anyagot általában naponta kell beadni, a beágyazó ­
dástól (pl. a pároztatás utáni 5. naptól) a császármetszés tervezett időpontja előtti napig. Ha az esetlegesen végzett el őzetes vizsgálatok 
szerint nincs nagy valószín űsége a beágyazódás el őtti veszteségnek, 
a kezelést az egész vemhességi id őszakra ki lehet terjeszteni, azaz a 
pároztatástól egészen az exterminálás tervezett id őpontja előtti napig. 
Jól ismert, hogy a vemhesség során a nem megfelel ő bánásmód vagy 
stressz prenatális veszteséghez vezethet. A kezeléssel nem össze ­
függő tényezők miatti prenatális veszteség kivédése érdekében 
kerülni kell a vemhes állatok szükségtelen kezelését, valamint a külső tényezők, így például zaj miatti stresszt.
 
Legalább három dózisszintet és ezzel párhuzamos kontrollt kell 
alkalmazni. A kezelési és kontrollcsoportokba egészséges állatokat 
kell torzítatlan módon beosztani. A dózisszinteket úgy kell 
megválasztani, hogy biztosítsák a kiváltott toxikus hatások fokoza ­
tosságát. Hacsak a vizsgálandó anyag fizikai/kémiai jellege vagy biológiai tulajdonságai nem szabnak ennek határt, a legmagasabb 
dózist úgy kell megválasztani, hogy valamilyen mérték ű fejlődési 
és/vagy anyai toxicitást (klinikai tünetek vagy testtömegcsökkenés) idézzen el ő, de ne okozzon elhullást vagy súlyos szenvedést. A 
legalább egy köztes dózist úgy kell megválasztani, hogy minimális 
mértékű észlelhet ő toxikus hatást váltson ki. Végül a legalacsonyabb 
dózist úgy kell megválasztani, hogy semmilyen anyai vagy fejl ődési 
toxicitásra utaló tünetet ne okozzon. A dózisok csökken ő sorrendjét 
úgy kell megválasztani, hogy demonstrálhassák az esetleges dózis ­
függő válaszokat és a nem észlelhet ő káros hatás szintjét (NOAEL). 
A csökken ő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4- 
szeres intervallumok alkalmazása és nagyon nagy intervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása, esetén gyakran el őnyös 
a dózisok közé egy negyedik vizsgálati csoportot is beiktatni. Bár a 
cél az anyai NOAEL meghatározása, olyan vizsgálatok is elfogadha ­
tók, amelyben nem határozzák meg ezt (1).
 
A dózisszintek megválasztásakor figyelembe kell venni mind az 
esetleg rendelkezésre álló toxicitási adatokat, mind a vizsgálandó 
anyag vagy rokon anyagok metabolizmusával vagy toxikokinetiká ­
jával kapcsolatos további információkat. Ezek az információk segítik majd az adagolási rend megfelel ő voltának igazolását is.
 
Szükség van egy párhuzamos kontrollcsoportra is. Ez a csoport egy 
placebóval kezelt kontrollcsoport, vagy ha a vizsgálandó anyag beadásához viv őanyagot használnak, akkor egy viv őanyaggal kezelt 
kontrollcsoport. Minden csoportban ugyanolyan térfogatú vizs ­
gálandó anyagot vagy viv őanyagot kell beadni. A kontrollcso ­
port(ok)ba tartozó állatokat ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lév őket. A viv őanyaggal kezelt kontrollcso ­
portokban a legnagyobb alkalmazott mennyiségben kell beadni a 
vivőanyagot (ahogyan a legalacsonyabb dózisú kezelési csoportban).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egy egyetlen, legalább 1 000 mg/testtömeg-kg/nap orális dózis 
alkalmazásával történ ő és az itt ismertetett eljárások szerint elvégzett 
vizsgálat sem a vemhes állatokban, sem utódaikban nem idéz el ő 
észlelhető toxicitást, és ha egy hatás a rendelkezésre álló adatok 
(pl. szerkezetileg és/vagy metabolizmus szempontjából rokon vegyü ­
letekkel kapcsolatos adatok) alapján nem várható, a három dózisszint alkalmazásával történ ő teljes vizsgálatot esetenként szükségtelen 
elvégezni. A várható humán expozíció magasabb orális dózis alkal ­
mazását teszi esetleg szükségessé a határérték-vizsgálat során. Más típusú beadási módok, így például inhalálás vagy dermális alkal ­
mazás esetén a vizsgálandó anyag fizikai-kémiai tulajdonságai 
gyakran el őre jelezhetik, illetve behatárolhatják a lehetséges expozí ­
ciós szint maximumát (például a dermális alkalmazás nem okozhat súlyos lokális toxicitást).
 
1.6.5.  A dózisok beadása  
A vizsgálandó anyagot vagy viv őanyagot általában orálisan, intubá ­
lással adagolják. Ha más beadási módot alkalmaznak, a vizsgálatot 
végzőnek ezt részletesen indokolnia kell, és szükség lehet ennek 
megfelelő módosításokra is (2) (3) (4). A vizsgálandó anyagot 
minden nap körülbelül ugyanabban az id őpontban kell beadni.  
Az egyes állatoknak beadandó dózist általában a legutóbbi testtö ­
megmérés eredménye alapján kell meghatározni. A vemhesség utolsó 
trimeszterében azonban óvatosan kell eljárni a dózis beállításakor. A 
túlzott anyai toxicitás megel őzése érdekében a dózisok megválasztá ­
sához fel kell használni a meglév ő adatokat. Ha azonban túlzott 
toxicitást észlelnek a kezelt anyaállatokban, humánus módon exter ­
minálni kell őket. Ha több vemhes állatban is a túlzott toxicitás jelei 
észlelhetők, meg kell fontolni az adott dóziscsoport kezelésének leál ­
lítását. Ha az anyagot mesterséges táplálással adagoljuk, a dózist lehetőleg egyszerre kell egy gyomorszondán vagy megfelel ő intubá­
ciós kanülön át beadni az állatnak. Az, hogy egyszerre maximálisan 
mekkora térfogatú folyadékot lehet beadni, az állat méretét ől függ. A 
térfogat nem haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt, kivéve vizes oldatok esetében, amikor 2 ml/100 g testtömegarány is alkal ­
mazható. Ha viv őanyagként kukoricacsíra-olajat alkalmaznak, az 
egyszerre beadott térfogat nem lehet több mint 0,4 ml/100 g testtö ­
meg. A koncentrációk megfelel ő beállításával minimalizálni kell a 
beadott térfogat variabilitását, és így kell biztosítani, hogy minden 
dózisszintnél azonos legyen a térfogat.
 
1.6.6.  Az anyaállatok megfigyelése  
Legalább naponta egyszer el kell végezni, és le kell jegyezni a 
klinikai megfigyeléseket, mégpedig lehet őleg a mindig ugyanabban 
az időpontban vagy id őpontokban, amihez figyelembe kell venni azt 
is, hogy a beadás után várt hatások mikor érik el a maximumukat. 
Rögzíteni kell az állatok állapotát, ezen belül elhullását, elhullás 
közelében lév ő állapotát, lényeges viselkedésbeli változásait, illetve 
a szemmel látható toxicitás minden jelét.  
1.6.7.  Testtömeg és táplálékfogyasztás  
A vemhesség 0. napján, vagy ha küls ő forrásból beszerzett, adott 
időben pároztatott állatokat alkalmaznak, akkor legkés őbb a 
vemhesség 3. napján, majd a kezelés els ő napján és azt követ ően a 
kezelési id őszakban legalább 3 naponta, továbbá az exterminálás 
tervezett napján meg kell mérni az állatok testtömegét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
A táplálékfogyasztást háromnaponta kell feljegyezni, ezen belül is 
ugyanazon a napon, amikor a testtömegméréseket végzik.  
1.6.8.  Post mortem vizsgálat  
A nőstényeket az ellés várható id őpontját megel őző napon kell exter ­
minálni. Az exterminálás tervezett id őpontja el őtt abortusz vagy 
koraellés jeleit mutató n őstényeket exterminálni kell, majd a tete ­
meket alapos makroszkópos vizsgálatnak kell alávetni.  
A vizsgálat befejezésekor vagy a vizsgálat során bekövetkez ő 
elhullás során makroszkóposan meg kell vizsgálni az anyaállatban 
az esetleges strukturális rendellenességeket vagy patológiás elválto ­
zásokat. A torzítások minimalizálása érdekében a császármetszés során az anyaállatok, majd ezt követ ően a magzatok vizsgálatát lehe ­
tőleg anélkül kell végezni, hogy tudható lenne, melyik kezelési vagy 
kontrollcsoportból származnak.
 
1.6.9.  A méhtartalom vizsgálata  
A vizsgálat befejezésekor vagy az elhullás után amilyen gyorsan 
csak lehet, ki kell venni az állatok méhét, és ellen őrizni kell, hogy 
vemhesek voltak-e. Azokat a méheket, amelyek nem t űnnek vemhes ­
nek, további vizsgálatoknak (pl. rágcsálók esetében ammónium-szul ­
fid-festésnek, nyulak esetében pedig Salewski-festésnek vagy más megfelelő eljárásnak) kell alávetni annak igazolása érdekében, 
hogy az állat valóban nem volt vemhes (5).
 
A vemhes méheket a méhnyakkal együtt meg kell mérni. Nem kell 
megmérni azoknak a vemhes méheknek a tömegét, amelyeket a vizs ­
gálat során elhullott állatokból vettek ki.  
A vemhes állatokban meg kell határozni a sárgatestek számát is.  
A méhtartalom vizsgálatakor meg kell határozni, hogy hány embrió 
vagy magzat halt el, illetve hogy hány életképes magzatot tartalmaz. Le kell írni a felszívódás mértékét, hogy megbecsülhet ő legyen a 
konceptus elhalásának relatív id őpontja (lásd 1.2. szakasz).
 
1.6.10.  A magzatok vizsgálata  
Minden magzat esetében meg kell határozni a magzat ivarát és test ­
tömegét.  
Minden magzat esetében meg kell továbbá vizsgálni, hogy vannak-e 
külső elváltozások (6).  
A magzatokban meg kell vizsgálni, hogy vannak-e vázrendszeri és 
lágyszöveti elváltozások (pl. eltérések és deformitások vagy rendelle ­
nességek) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). El őnyös, de nem feltétlenül szükséges a 
magzati elváltozások kategorizálása. Ha elvégezzük a kategorizálást, 
világosan meg kell jelölni az egyes kategóriák meghatározásának kritériumait. Különös figyelmet kell szentelni a szaporítószervek vizsgálatának, és ezen belül a rendellenes fejl ődés jeleinek.
 
Rágcsálók esetében körülbelül az alom felét kell el őkészíteni a 
vázrendszeri, a maradékot pedig a lágyszöveti elváltozások vizsgála ­
tára, ahol az utóbbihoz elfogadott és megfelel ő sorozatmetszési 
módszereket vagy óvatos makroszkópos boncolási technikákat kell 
alkalmazni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Nem rágcsálók, pl. nyulak esetében, minden magzatban meg kell 
vizsgálni mind a lágyszöveti, mind pedig a vázrendszeri elváltozá ­
sokat. A lágyszöveti elváltozások vizsgálatához a magzatok testét óvatos boncolás segítségével kell értékelni, amely magában foglal ­
hatja a bels ő szívstruktúra további tanulmányozását is (25). Az így 
megvizsgált magzatok felénél el kell távolítani a fejet, és el ő kell 
készíteni az abban lév ő lágy szövetek (szem, agy, orrjáratok és 
nyelv) vizsgálatára, amelyhez standard sorozatmetszési módszereket (26) vagy más, ugyanilyen érzékeny módszert kell alkalmazni. A 
testeket, illetve a fennmaradó ép magzatok testét el ő kell készíteni 
a vázrendszeri elváltozások vizsgálatára, amelyhez ugyanazokat a módszereket kell használni, mint rágcsálók esetében.
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az adatokat mind az anyaállatok, mind utódaik esetében egyedileg 
kell a jelentésben rögzíteni, majd táblázatos formában is össze kell 
foglalni, amelyben minden egyes vizsgálati csoport és generáció esetében fel kell tüntetni az állatok számát a vizsgálat kezdetén, a vizsgálat során elpusztult vagy humánus okok miatt exterminált 
állatok számát, valamint az elhullások és a humánus exterminációk 
időpontját, a vemhes n őstények számát, a toxicitás jeleit mutató 
állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ezen belül bármely toxikus tünet megjelenésének id őpontját, valamint ezek 
időtartamát és súlyosságát, az embriókkal/magzatokkal kapcsolatos 
megfigyeléseket és az almokra vonatkozó minden vonatkozó adatot.
 
A számszer ű eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell 
kiértékelni, amelynél az adatanalízishez használt egység az alom. Általánosan elfogadott statisztikai módszert kell használni; a vizs ­
gálat megtervezése során kell azt kiválasztani, és a választást meg 
kell indokolni. A jelentésben fel kell tüntetni azoknak az állatoknak az adatait is, amelyek nem maradtak életben a tervezett exterminá ­
lásuk időpontjáig. Adott esetben a csoportátlagok számításához is fel 
lehet használni ezeket az adatokat. Az ilyen állatokból nyert adatok 
alkalmazhatóságát, és így a csoportátlag(ok)ba való beszámításukat vagy abból való kizárásukat minden esetben egyedileg kell meghatá ­
rozni, és megfelel ően indokolni is kell.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
A prenatális fejl ődési toxicitási vizsgálat eredményeit a megfigyelt 
hatások szempontjából kell értékelni. Az értékelés az alábbi informá ­
ciókat foglalja magában:  
— az anyaállatok és az embriók/magzatok vizsgálatainak eredmé ­
nyei, ezen belül az állat expozíciója és az egyes hatások gyako ­
risága vagy súlyossága közötti összefüggések vagy azok 
hiányának értékelése,  
— a magzatok küls ő, lágyszöveti és vázrendszeri elváltozásainak 
esetleges kategorizálásánál alkalmazott kritériumok,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— a vizsgálat eredményeinek értelmezését javítandó, adott esetben 
korábbi kontrolladatok,  
— az összes százalék és mér őszám számításához felhasznált szám ­
adatok,  
— adott esetben a vizsgálat eredményeinek megfelel ő statisztikai 
elemzése, amelynek elegend ő információt kell tartalmaznia az 
elemzési módszerrel kapcsolatban ahhoz, hogy egy független bíráló vagy statisztikus újra tudja értékelni vagy rekonstruálni tudja az elemzést.
 
Bármely olyan vizsgálatban, amely a toxikus hatások hiányát 
igazolja, további vizsgálatokat kell végezni a vizsgálandó anyag 
felszívódásának és biológiai hozzáférhet őségének meghatározására.  
2.3. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A prenatális fejl ődési toxicitási vizsgálatokkal a vemhesség során 
egy anyaggal történ ő ismételt expozíciónak az anyaállatra és utódai 
méhen belüli fejl ődésére gyakorolt hatásai tanulmányozhatóak. A 
vizsgálat eredményeit a szubkrónikus, reprodukciós, toxikokinetikai és egyéb vizsgálatok eredményeivel összefüggésben kell értel ­
mezni. Mivel mind az általános toxicitásra (az anyai toxicitás 
révén), mind pedig a fejl ődési toxicitási végpontokra hangsúly 
kerül, a vizsgálat eredményei bizonyos mértékig lehet ővé teszik 
az általános toxicitás hiányában is fellép ő, a fejlődésre gyakorolt 
hatások megkülönböztetését azoktól, amelyeket az anyaállatra is 
toxikus szintek idéznek el ő (27).
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A jelentésnek az alábbi konkrét információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai jelleg és ahol fontos, fizikai-kémiai tulajdonságok,  
— megjelölés, és ezen belül – ha ismert, vagy meghatározták – a 
CAS-szám,  
— tisztaság.  
Vivőanyag (ha szükséges):  
— ha a viv őanyag nem víz, akkor ennek indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj és törzs,  
— az állatok száma és életkora,  
— származás, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetén.  
Kísérleti körülmények:  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása,  
— a vizsgálandó anyag formulázásával/a táplálék el őkészítésével, az 
elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitá ­
sával kapcsolatos információk,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— a vizsgálandó anyag adagolásának adatai,  
— adott esetben a vizsgálandó anyag táplálékban/ivóvízben lév ő 
koncentrációjának (ppm) átszámítása a tényleges dózisra (mg/ ­
testtömeg-kg/nap),  
— környezeti feltételek,  
— a táplálék és az ivóvíz min őségével kapcsolatos adatok.  
Eredmények:  
Anyai toxikus válaszadatok a dózis függvényében, ezen belül többek 
között:  
— az állatok száma a vizsgálat kezdetén, az életben maradt állatok 
száma, továbbá a vemhes, az abortáló és a koraell ő állatok 
száma,  
— az esetleges vizsgálat közbeni elhullás id őpontja, vagy hogy az 
állat életben maradt-e az exterminálás id őpontjáig,  
— a tervezett exterminálás el őtt elpusztult állatok adatait is bele kell 
foglalni a jelentésbe, de a csoportok közötti statisztikai összeha ­
sonlításokba nem,  
— az egyes rendellenes klinikai tünetek megfigyelésének id őpontja, 
valamint ezek kés őbbi lefolyása,  
— testtömeg, testtömegváltozás és a vemhes méhek tömege, ezen 
belül adott esetben a vemhes méh tömegével korrigált testtömeg ­
változás,  
— táplálékfogyasztás és, ha mérve volt, vízfogyasztás,  
— boncolási eredmények, ezen belül a méh tömege,  
— a jelentésben fel kell tüntetni az anyai és fejl ődési hatásokra 
vonatkozó NOAEL-értékeket is.  
Fejlődési végpontok a dózis függvényében azokra az almokra vonat ­
kozóan, ahol beágyazódás történt, ezen belül:  
— a sárgatestek száma,  
— a beágyazódások száma, az él ő és elhalt magzatok és a felszívó ­
dások száma, valamint százalékos aránya,  
— a beágyazódás el őtti és után veszteségek száma és százalékos 
aránya.  
Fejlődési végpontok a dózis függvényében azokra az almokra vonat ­
kozóan, ahol él ő magzatok vannak, ezen belül:  
— az élő utódok száma és százalékos aránya,  
— ivararány,  
— a magzatok testtömege, lehet őleg ivaronként külön, és együtt is,  
— külső, lágyszöveti és vázrendszeri deformitások, valamint más 
lényeges elváltozások,  
— adott esetben a kategorizálás kritériumai,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— a küls ő, lágyszöveti és vázrendszeri elváltozásokat mutató 
magzatok és almok összesített száma és százalékos aránya, vala ­
mint az egyedi rendellenességek és más lényeges elváltozások típusa és gyakorisága.
 
Az eredmények diszkussziója.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996). A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410.  
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990). Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386–398.
 
(3) Wong, B.A., et al. (1997). Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985). Subpart E- 
Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
 
(5) Salewski, E. (1964). Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie  247:367.  
(6) Edwards, J.A. (1968). The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.
 
(7) Inouye, M. (1976). Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171–173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992). Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32;:381–391.  
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993). Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47:229–242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988). Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.  
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969). A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127:291–306.  
(12) Fritz, H. (1974). Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313–320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966). Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398–408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973). Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309–316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992). Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169–181.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965). Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual , pp. 163–173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928). The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41; 411–445.  
(18) Staples, RE. and Schnell, V.L. (1964). Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61–63.  
(19) Strong, R.M. (1928). The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313–355.
 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984). Fresh Visceral 
Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogeni ­
city Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  
4; 181–188.  
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957).  The Genesis of the 
Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965). Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology : Principles and Techniques, Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251–277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977).  Handbook of Tera ­
tology , Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980). Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung . 28; 233–239.  
(25) Staples, R.E. (1974). Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; 37–38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977). A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, H.J. and Kwasigroch, TE. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, pp. 126–144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991). Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997). Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1)  
Teratology  55; 249–292.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  A RÁKKELT Ő HATÁS VIZSGÁLATA  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 451. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2009) leírt módszerrel. A rákkelt ő hatás vizsgálatára vonatkozó 
eredeti 451. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el. A jelen felülvizs ­
gált B.32. vizsgálati módszer kidolgozását az állatjóllét és a szabályozási 
követelmények terén az elmúlt id őszakban bekövetkezett változások figye ­
lembevétele érdekében tartották szükségesnek (2) (3) (4) (5) (6). E B.32. vizsgálati módszer frissítése e melléklet B.30., Krónikus toxicitási vizs ­
gálatok cím ű és B.33., A krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes 
vizsgálata cím ű fejezetének felülvizsgálatával párhuzamosan történt meg a 
vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk megszer ­
zése, valamint a dózis kiválasztásával kapcsolatos további részletek biztosí ­
tása céljából. A jelen B.32. vizsgálati módszer vegyi anyagok széles skálá ­
jának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvéd ő szereket és az ipari vegy ­
szereket. Meg kell jegyezni azonban, hogy gyógyszeranyagok esetében néhány részlet és követelmény eltér ő lehet (lásd: International Conference 
on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of 
Pharmaceuticals).
 
2. A rákkelt ő hatással foglalkozó vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, 
ezért a jelen vizsgálati módszer els ősorban az e fajokon végzett vizsgála ­
tokra alkalmazandó. Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltér ő 
fajokon kell elvégezni, a megfelel ő módosításokkal a jelen vizsgálati 
módszerben vázolt elvek és eljárások alkalmazandók, az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon című fejezetében (6) vázoltakkal együtt. További útmutatás a krónikus toxi ­
citási vizsgálatok és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok 
tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban (7) talál ­
ható.
 
3. A rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során alkalmazott 
három fő beadási mód az orális, a dermális és az inhalációs. A beadási 
mód kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonsá ­
gaitól, valamint az emberi expozíció jellemz ő módjától. Az expozíciós mód 
kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban talál ­
hatók (7).  
4. A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a 
rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során a leggyakrabban 
alkalmazott mód. Az emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabályozási rendszerek el őírásai alapján dermális vagy 
inhalációs expozíciót alkalmazó, rákkelt ő hatás meghatározására irányuló 
vizsgálatok elvégzésére is szükség lehet ugyan, azonban technikai szem ­
pontból e két expozíciós mód mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgála ­
tokat eseti alapon kell megtervezni, bár az itt ismertetett, a rákkelt ő hatás 
orális beadás útján történ ő meghatározására és értékelésére szolgáló vizs ­
gálati módszer a kezelési id őszakokra, klinikai és patológiai paraméterekre 
stb. vonatkozó ajánlások tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizsgált vegyi anyagok dermális (7) és inhalációs (7) (8) módon történ ő beadásával kapcsolatban 
OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet B.8. (9) és B.29. 
fejezetét (10), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (8) kifejezetten alkalmazni kell az inhalációs expozí ­
ciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A dermális 
beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét (11) kell 
alkalmazni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. A rákkelt ő hatás vizsgálata információt szolgáltat az ismételt, a vizsgált 
fajok élettartamának akár egészére is kiterjed ő expozícióból valószín űsíthe­
tően fakadó egészségügyi kockázatokról. A vizsgálat információkkal szolgál 
a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, beleértve a lehetséges rákkelt ő 
hatást, továbbá jelezheti a célszerveket és a felhalmozódás lehet őségét. 
Becslést adhat a toxikus hatások észlelhet ő káros hatással nem járó szintjére, 
valamint a nem genotoxikus karcinogének esetében a tumorválaszra nézve, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó biztonsági kritéri ­
umok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az állatok lehet ő legtöbb 
információ megszerzése érdekében történ ő körültekint ő klinikai vizsgála ­
tának szükségessége is.
 
6. A jelen vizsgálati módszerben ismertetett, rákkelt ő hatás meghatározására 
irányuló vizsgálatok célkit űzései többek között a következ ők: 
— a vizsgált vegyi anyag rákkelt ő tulajdonságainak meghatározása, 
amelyek a párhuzamos kontrollcsoportokhoz viszonyítva megnövelik a neoplazmák gyakoriságát, megnövelik a rosszindulatú neoplazmák arányát vagy lerövidítik a neoplazmák megjelenéséhez szükséges id őt,
 
— a rákkelt ő hatás célszervének (célszerveinek) meghatározása,  
— a neoplazmák megjelenési idejének meghatározása,  
— a tumorok kialakulásával kapcsolatos dózis-válasz összefüggés jellemz ő­
inek meghatározása,  
— a nem észlelhet ő káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark- 
dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatá ­
rozása,  
— a rákkelt ő hatások extrapolálása az alacsony dózisú emberi expozíciós 
szintekre,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges 
adatok biztosítása (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
7. A vizsgált vegyi anyag potenciális rákkelt ő hatásának vizsgálata és értéke ­
lése során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat 
megkezdését megel őzően annak érdekében, hogy a vizsgálati terv a lehet ­
séges rákkelt ő hatás hatékonyabb vizsgálatára összpontosítson, valamint 
hogy az állatkísérleteket minimálisra csökkentsük. A feltételezett karcinogén hatásmechanizmusára vonatkozó információk és a hatásmechanizmus figye ­
lembevétele (2) (7) (12) (13) (14) (15) különösen fontos, mivel az optimális 
terv eltér ő lehet attól függ ően, hogy a vizsgált vegyi anyag ismert vagy 
feltételezett genotoxikus karcinogén-e. A hatásmechanizmus figyelembevé ­
telére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban (7) szerepel.
 
8. A vizsgálat megtervezését segít ő információk többek között a vizsgált vegyi 
anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonsá ­
gai, bármely  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálat eredményei, beleértve 
a genotoxicitási vizsgálatokéit, a várható felhasználási terület(ek) és az emberi expozíció lehet ősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagok rendelke ­
zésre álló (Q)SAR-adatai, mutagenitásra/genotoxicitásra, rákkelt ő hatásra 
vonatkozó és egyéb toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai 
adatok (egyszeri dózisra és lehet őség szerint ismételt dózisra vonatkozó
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
kinetikai adatok), valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból szár ­
mazó adatok. A rákkelt ő hatás értékelése a toxicitásra vonatkozó, 28 napos 
vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitásvizsgálatokból származó kezdeti információk megszerzését követ ően végezend ő el. A rák el őidézésére, illetve 
elősegítésére vonatkozó rövid távú vizsgálatok szintén hasznos informáci ­
ókat szolgáltathatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag lehetséges egészségká ­
rosító hatásai átfogó vizsgálatának részeként a rákkelt ő hatás vizsgálatának 
fokozatos megközelítését kell megfontolni (16) (17) (18) (19).
 
9. Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelel őbb statisztikai módsze ­
reket az adott kísérleti tervre és célkit űzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét 
megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, 
hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, a 
kumulatív tumorkockázat túlélési id őtartamhoz viszonyított elemzését, a 
tumor kialakulási idejének elemzését, valamint egy vagy több csoport id ő 
előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. A megfelel ő statisztikai elem ­
zésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a nemzetközileg elfogadott statisz ­
tikai módszerekre vonatkozó f őbb hivatkozásokat a 116. iránymutatás (7), 
valamint a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló 
vizsgálatok elemzésével és értékelésével kapcsolatos 35. iránymutatás (20) 
tartalmazza.  
10. A rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elvégzése során a 
klinikai tünetek mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok 
humánus végpontjai felismerésér ől, értékelésér ől és használatáról szóló 19. 
OECD-iránymutatásban (21), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés szerint: „ Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat 
progresszív, az állapot további romlásához vezet ő klinikai tüneteket mutat, 
tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén 
szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha 
úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrá ­
nyosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüne ­
teltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati 
dózis csökkentése. ”
 
11. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizs ­
gálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes 
útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (7), valamint a Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (22) (23). A fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat els ődleges célkit űzésétől vagy 
célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelel ő dózisszintek kiválasztásakor 
egyensúlyt kell találni egyfel ől a veszélyesség vizsgálata, másfel ől az 
alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez 
különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálata (e melléklet B.33. fejezete) esetében (12. bekezdés).
 
12. Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálatának elvégzését (e melléklet B.33. fejezete) a krónikus toxicitási vizs ­
gálat (e melléklet B.30. fejezete) és a rákkelt ő hatás vizsgálatának (a jelen 
B.32. vizsgálati módszer) külön-külön történ ő elvégzése helyett. A két külön 
vizsgálat elvégzéséhez viszonyítva az együttes vizsgálat id ő- és költségha ­
tékonyabb anélkül, hogy befolyásolná az adatok min őségét a krónikus 
fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő 
hatás együttes vizsgálata során (e melléklet B.33. fejezete) azonban körülte ­
kintően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (11. és 22–25. bekez ­
dés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási keret ­
rendszerek a vizsgálatok külön-külön történ ő elvégzését írhatják el ő. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. A jelen vizsgálati módszerrel összefüggésében használt fogalmak meghatá ­
rozása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (7).  
A VIZSGÁLAT ELVE  
14. A vizsgált vegyi anyagot naponta, fokozatosan emelked ő dózisokban, álta ­
lában orális úton adjuk be a vizsgált állatok több csoportjának az élettar ­
tamuk jelent ős részén keresztül. Inhalációs vagy dermális bejuttatással 
történő vizsgálat is megfelel ő lehet. Az állatokat gondosan megfigyeljük a 
toxicitás jeleinek és a neoplasztikus elváltozások kialakulásának észlelése érdekében. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncol ­
juk, továbbá a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is 
elpusztítjuk és felboncoljuk.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
15. A jelen vizsgálati módszer els ősorban a rákkelt ő hatás rágcsálókban történ ő 
vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (2. bekezdés). A rágcsálóktól eltérő fajok használata fontolóra vehet ő, ha a rendelkezésre álló adatok 
arra utalnak, hogy az ilyen fajok relevánsabbak az emberekre gyakorolt 
egészségi hatások el őrejelzése tekintetében. A faj kiválasztását indokolni 
kell. Az el őnyben részesítend ő rágcsálófaj a patkány, de más rágcsálófaj, 
például az egér is használható. Habár az egér használatának hasznossága a rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok során korlátozott lehet 
(24) (25) (26), néhány jelenlegi szabályozási program megköveteli a 
rákkeltő hatás egereken történ ő vizsgálatát, hacsak nem nyert megállapítást, 
hogy az ilyen vizsgálat tudományos szempontból nem szükséges. A patká ­
nyok és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógyszerészeti és toxi ­
kológiai vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumorindukcióra való fogé ­
konyságuk, valamint a megfelel ően jellemzett törzsek rendelkezésre állása 
miatt preferált kísérleti modellek. E tulajdonságok eredményeképpen nagy mennyiség ű információ áll rendelkezésre fiziológiájukról és patológiájukról. 
A faj és törzs kiválasztására vonatkozó további információk a 116. irány ­
mutatásban találhatók (7).
 
16. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett állatokat kell alkalmazni. A rákkelt ő hatás vizsgálatát lehet őleg 
olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb id őtartamú el őzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban felhasznált állatoké ­
val, habár ha ismert, hogy az ehhez a törzshöz tartozó és ilyen eredet ű 
állatoknál problémák jelentkeznek a hosszú távú vizsgálatok esetében álta ­
lánosan elfogadott túlélési szempontok teljesítése tekintetében (lásd a 116. iránymutatást (7)), fontolóra kell venni egy, a hosszú távú vizsgálatok 
esetében elfogadható túlélési aránnyal rendelkez ő állattörzs használatát. 
Olyan nőstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és 
nem vemhesek.
 
Az állatok tartása és etetése  
17. Az állatokat külön, vagy azonos nem ű egyedekb ől álló kis csoportokban 
kell tartani; a külön történ ő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az 
tudományos szempontból indokolt (27) (28) (29). A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására használt helyiség h őmérsék­
lete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartal ­
mának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától elte ­
kintve – lehet őség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 
50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos 
és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos 
laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosí ­
tása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló 
takarmány-szennyez ődések mennyiségének – beleértve többek között a 
növényvéd őszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyez ő anyagokat,
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
a fitoösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehet ő legala­
csonyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lév ő szeny­
nyező anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat id őszakos 
jelleggel kell meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás következik be a felhasznált adagban, és ezeket az informá ­
ciókat a zárójelentésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre 
vonatkozó analitikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag táplálékkal történ ő beadása esetén a takarmány megválasztását 
befolyásolhatja annak szükségessége, hogy az megfelel ően keveredjen el a 
takarmánnyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
 
Az állatok el őkészítése  
18. A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges 
állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljá ­
rásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történ ő adagolást az elválasztást 
és szoktatást követ ően a lehet ő leghamarabb, és lehet őleg az állatok 8 hetes 
kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly 
és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban 
használt összes állat súlyának átlagos értékét ől pedig legfeljebb ± 20 %-kal 
különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszer űen kell beso ­
rolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszer ű kiválasztást követ ően 
nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos 
testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak el ő, a 
véletlenszer ű kiválasztás lépését lehet őség szerint meg kell ismételni. 
Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, 
mikrochip-beültetés vagy más megfelel ő módszer segítségével.
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
19. A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelel ő számú állatot 
kell használni az alapos biológiai és statisztikai értékelés lehet ővé tétele 
érdekében. Éppen ezért minden egyes dóziscsoport és kísér ő kontrollcsoport 
nemenként legalább 50 állatból kell álljon. A vizsgálat céljától függ ően a 
főbb becslések statisztikai ereje növelhet ő lehet az állatok különböz ő dózis­
csoportokba történ ő egyenlőtlen elosztásával oly módon, hogy több mint 50 
állatnak kell lennie az alacsony dózisú csoportokban, például az alacsony dózisok karcinogenitásának becslése céljából. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csoport méretének mérsékelt növelése viszonylag kis mértékben 
növeli a vizsgálat statisztikai erejét. A vizsgálat statisztikai tervezésér ől és 
a dózisszinteknek a statisztikai er ő maximális szintre való növelése érde ­
kében történ ő kiválasztásáról további információk a 116. iránymutatásban 
(7) találhatók.
 
Időközi elpusztítás és kísér ő (jelző-) csoportok alkalmazásának el őírása  
20. Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a neoplasz ­
tikus elváltozások alakulására vonatkozó és mechanisztikai információk megszerzése céljából el őírhatja az id őközi elpusztítást, például a 12. hónap ­
ban. Abban az esetben, ha ilyen információk a vizsgált vegyi anyaggal 
végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelke ­
zésre állnak, az id őközi elpusztítás tudományos szempontból nem feltétlenül 
indokolt. Ha a vizsgálati terv id őközi elpusztítást tartalmaz, az id őközben 
elpusztítandó állatok száma minden egyes dóziscsoportban rendszerint 
nemenként 10, a vizsgálati tervben szerepl ő állatok teljes számát pedig 
annyival kell megnövelni, ahány állat elpusztítását tervezzük a vizsgálat befejezése el őtt. Szükség szerint egy jelz őállatokból álló további (jellemz ően 
nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség állapotának a 
vizsgálat közben történ ő megfigyelése céljából (30). További útmutatás a 
116. iránymutatásban (7) található.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dóziscsoportok és adagolás  
21. A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára 
vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Legalább három dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni. A dózisz ­
szintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy 
tartománybehatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi anyagra vagy rokon vegyi anyagokra vonatkozóan rendelke ­
zésre álló bármilyen toxikológiai és toxikokinetikai adatot.
 
22. Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai 
nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet olyan módon kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az els ődleges célszervek és toxikus 
hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhet ő legyen a szenvedés, a 
súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A 23. bekezdésben bemuta ­
tott tényez ők figyelembevétele mellett a legmagasabb dózisszintet általában 
úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható. A vizs ­
gálat célkit űzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást bizo ­
nyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz el ő, amely azonban csak kismér ­
tékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt.
 
23. A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható 
legyen a dózis-válasz összefüggés, valamint a vizsgált vegyi anyag hatás ­
mechanizmusától függ ően a NOAEL vagy a vizsgálat egyéb tervezett kime ­
netele, például a legalacsonyabb dózisszinten megfigyelhet ő BMD (lásd a 
25. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kiválasztása során figyelembe veend ő 
tényezők többek között a dózis-válasz görbe várható meredeksége, azok a 
dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metaboliz ­
musban vagy a toxikus hatás mechanizmusában, amelyeknél küszöbérték 
várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis extrapolálásához használható 
kiindulási pont várható.  
24. A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag 
jellemzőitől, és nem írható el ő a jelen vizsgálati módszerben, ugyanakkor 
csökkenő dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres 
intervallumok alkalmazása, az adagolások közötti nagyon nagy interval ­
lumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran el őnyben részesítend ő egy negyedik vizsgálati 
csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófaktorokat általában kerülni 
kell, és használatukat meg kell indokolni.
 
25. A 116. iránymutatásban (7) részletesebben kifejtettek szerint a dózis kivá ­
lasztásakor figyelembe veend ő szempontok többek között a következ ők: 
— ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis- 
válasz görbén,  
— toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a 
metabolikus indukció, a telítettség vagy a küls ő és belső dózisok közötti 
nemlinearitás el őfordul, vagy nem fordul el ő, 
— prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a f őbb mögöttes biológiai 
folyamatok m űködésének mutatói,  
— a hatásmechanizmus f őbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a 
dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormon ­
szintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— a dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szük ­
séges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományá ­
ban, 
— a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele.  
26. Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag 
beadásához viv őanyagot használunk, egy viv őanyaggal kezelt kontrollcso ­
port alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi 
anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizs ­
gálati csoportokban lév őket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcso ­
portban a viv őanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyi ­
ségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és 
emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelent ősen 
csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
 
A dózisok el őkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása  
27. A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvíz ­
zel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és 
módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhet őségétől, vala­
mint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás 
útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszer űen tükrözi 
a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplá ­
lékban vagy környezetben el őforduló vegyi anyagok, többek között a 
növényvéd ő szerek esetében a beadás jellemz ően a táplálékon vagy az 
ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi 
expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelel őbbnek 
bizonyulhatnak.
 
28. A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk 
alkalmas viv őanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a viv őanyag 
és más adalékanyagok következ ő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag 
felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyako ­
rolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon 
hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemz őit, valamint az 
állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. Lehet őség szerint els ősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos 
alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) 
oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más viv őanyagokban elkészí ­
tett oldatot. A vízt ől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a viv őanyag 
toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények közötti (például takarmánnyal történ ő beadás során fennálló) stabilitására 
és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homoge ­
nitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
 
29. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos 
biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja 
meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takar ­
mánnyal történ ő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok 
esetében a takarmányban lév ő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a 
kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem halad ­
hatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takar ­
mányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/ takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendsze ­
rességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmaz ­
ható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Orális úton történ ő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az 
állatoknak beadni (heti hét napon keresztül), rágcsálóknál általában 24 
hónapon át (lásd még a 32. bekezdést). Bármely más adagolási rendszer – például heti öt napon történ ő beadás – használatát indokolni kell. Dermális 
úton történ ő beadás esetén az állatokat az e melléklet B.9. fejezetében (11) 
meghatározottak szerint általában legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 
napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 24 hónapon át. Az inhaláció útján történ ő expozíciót napi 6 órán keresztül, heti 7 nap kell elvégezni, de 
indokolt esetben heti 5 napos expozíció is alkalmazható. Az expozíció 
időtartama általában 24 hónap. Patkányoktól eltér ő rágcsálófajok csak 
orron át történ ő expozíciója esetén az expozíció maximális id őtartama kiiga ­
zítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A napi 6 óránál rövidebb expozíciós id őtartam alkalmazását indokolni kell. Lásd még e 
melléklet B.8. fejezetét (9).
 
31. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap 
hasonló id őszakában, gyomorszondán vagy megfelel ő intubációs kanülön át 
kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta 
egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat 
méretétől függ. A mennyiséget a lehet ő legalacsonyabb szinten kell tartani, 
és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúly ­
gramm térfogatot (31). A koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra 
kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy vala ­
mennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek 
alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdeké ­
ben. Kerülni kell az emészt őrendszerben valószín űsíthetően maró vagy irri ­
tatív hatást kiváltó koncentrációkkal történ ő vizsgálatokat.
 
A vizsgálat id őtartama  
32. A vizsgálat id őtartama rágcsálók esetében általában 24 hónap, amely a 
felhasznált állatok normális élettartamának legnagyobb részére kiterjed. A vizsgált állattörzs élettartamától függ ően rövidebb vagy hosszabb vizsgálati 
időtartamok is alkalmazhatók, de ezt meg kell indokolni. Bizonyos egértör ­
zsek, például az AKR/J, a C3H/J vagy a C57BL/6J törzs esetében a 18 
hónapos id őtartam megfelel őbb lehet. A következ őkben iránymutatás olvas ­
ható a vizsgálat idejével és befejezésével, valamint a túléléssel kapcsolatban; további, többek között a negatív karcinogenitás túlélési arányhoz viszonyí ­
tott elfogadhatóságának megfontolásával kapcsolatos útmutatás a krónikus 
toxicitási vizsgálatok és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizs ­
gálatok tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban 
(7) található.
 
— Meg kell fontolni a vizsgálat befejezését, ha az életben maradt állatok 
száma az alacsonyabb dózissal kezelt csoportokban vagy a kontrollcso ­
portban 25 százalék alá csökken.  
— Abban az esetben, ha csak a magas dózissal kezelt csoportban figyelhet ő 
meg idő előtti elhullás a toxicitás következtében, a vizsgálatot nem kell 
befejezni.  
— Az életben maradt egyedek számát nemenként külön-külön kell figye ­
lembe venni.  
— A vizsgálat nem tarthat tovább annál a pontnál, amikor a vizsgálat révén 
nyert adatok már nem elegend őek a statisztikailag érvényes értékelés 
lefolytatásához.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
MEGFIGYELÉSEK  
33. Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepna ­
pokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbete ­
gedés jeleit vagy nem hullott-e el. Ezen túlmen ően az állatokat naponta 
egyszer meg kell vizsgálni, hogy mutatnak-e meghatározott, toxikológiai 
szempontból lényeges tüneteket, szondával történ ő adagolás esetén figye ­
lembe véve az adagolást követ ően várható hatások érvényesülésének csúcs ­
időszakát. Külön figyelmet kell fordítani a daganatképz ődésre; minden, 
szemmel látható vagy kitapintható daganat megjelenésének idejét, helyét, 
méreteit, megjelenési formáját és növekedését fel kell jegyezni.  
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség  
34. A kezelés kezdetekor, az els ő 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután 
pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat els ő 13 
hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább havonta egyszer kell 
mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a 
vizsgálat els ő 13 hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább 
havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megvál ­
toznak.
 
Hematológiai, klinikai biokémiai és egyéb mérések  
35. A vizsgálatból nyerhet ő lehető legtöbb információ megszerzése érdekében – 
különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos szempontok meghatározása 
céljából – a vizsgálatvezet ő mérlegelése szerint vérminták vehet ők a hema ­
tológiai és klinikai biokémiai vizsgálatokhoz. Vizeletelemzés elvégzése is célszerű lehet. Az ilyen minták karcinogenitási vizsgálat részeként történ ő 
levételének értékére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban 
található (7). Amennyiben megfelel őnek ítéljük, a hematológiai és klinikai 
kémiai meghatározások céljából végzett vérvétel, valamint a vizeletelemzés valamelyik id őközi elpusztítás (20. bekezdés) részeként, továbbá a vizsgálat 
befejezésekor végezhet ő el, nemenként és csoportonként legalább 10 állaton. 
Vérmintákat meghatározott helyr ől kell venni, például a szívb ől vagy a 
szemgolyó mögötti üregb ől altatás alatt, és adott esetben a megfelel ő körül­
mények között kell tárolni. Vérkenet is készíthet ő vizsgálat céljára, külö ­
nösen akkor, ha a csontvel ő tűnik a célszervnek, bár az ilyen jelleg ű vizs­
gálatnak a karcinogén/onkogén hatás meghatározása szempontjából képviselt értéke megkérd őjelezhető (32).
 
PATOLÓGIA  
Autopszia  
36. A jelz őállatok (lásd a 20. bekezdést) és a kísér ő csoportba tartozó többi állat 
kivételével a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autop ­
sziának kell alávetni, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek 
tartalma. A jelz őállatok és a kísér ő csoportba tartozó többi állat esetében 
a vizsgálatvezet ő döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség. A 
szervek súlyának mérése általában nem képezi a rákkelt ő hatás meghatá ­
rozására irányuló vizsgálatok részét, mivel a geriátriai változások és – a 
későbbi szakaszokban – a tumorok kifejl ődése zavaró tényez ők lehetnek a 
szervek súlyával kapcsolatos adatok hasznosságát illet ően. Ezek a mérések 
azonban kritikusak lehetnek az adatok bizonyító erejének mérlegelése során és különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos megfontolások tekinteté ­
ben. Ha a szervek súlyának mérése kísér ő vizsgálat részét képezi, a mérést 
legkésőbb a vizsgálat megkezdése után egy évvel el kell végezni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a kés őbb elvégezni kívánt kórszö ­
vettani vizsgálat szempontjából legmegfelel őbb fixálóanyaggal kell tartósítani 
(33) (a szögletes zárójelben megadott szövetek meg őrzése nem kötelez ő): 
minden makroszkopikus 
elváltozás szív hasnyálmirigy gyomor (el őgyomor, mirigy ­
gyomor) 
mellékvese csíp őbél mellékpajzsmirigy [fogazat] 
aorta éhbél perifériás idegek here 
agy (beleértve a nagyagy, a 
kisagy és a nyúltvel ő/nyúl­
tagyi híd metszeteit) vese agyalapi mirigy csecsem őmirigy 
vakbél könnymirigy (szem ­
üregen kívüli) prosztata pajzsmirigy 
méhnyak máj végbél [nyelv] 
koaguláló mirigy tüd ő nyálmirigy légcs ő 
vastagbél nyirokcsomók (felszíni 
és mély) ondóhólyag húgyhólyag 
patkóbél eml őmirigy (n ősté­
nyeknél kötelez ő, 
hímeknél csak ha látha ­
tóan kimetszhet ő) harántcsíkolt izom méh (beleértve a méhnyakat) 
mellékhere [fels ő légutak, beleértve 
az orrot, az orrkagylókat 
és az orrmelléküregeket] bőr [húgyvezeték] 
szem (beleértve a retinát) nyel őcső gerincvel ő (három szin ­
ten: nyaki, mellkasi 
középső és ágyéki 
szakasz) [húgycső] 
[combcsont az ízületi felü ­
lettel együtt] [szaglógumó] lép hüvely 
epehólyag (patkánytól eltér ő 
fajoknál) petefészek [szegycsont] metszet a csontvel őből és/ 
vagy egy friss, csontvel őből 
felszívott minta 
Harder-mirigy  
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
tartósítani kell. A klinikai és más jelleg ű megfigyelések alapján további 
testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni 
minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdon ­
ságai alapján valószín űleg célszervnek tekinthet ő. A dermális úton történ ő 
bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történ ő beadásnál 
felsorolt szerveket kell tartósítani, továbbá elengedhetetlen a b őrből történő 
mintavétel a beadás helyér ől és e minta tartósítása. Inhalációs vizsgálatok 
esetében a légz őrendszerb ől származó tartósított és vizsgált szövetek felso ­
rolásának követnie kell az e melléklet B.8. és B.29. fejezetében tett ajánlá ­
sokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légz őrendszerb ől szár­
mazó tartósított szöveteken túl) az orális úton történ ő beadásnál felsorolt 
szerveket kell vizsgálni.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Kórszövettani vizsgálatok  
38. A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára 
vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (33). Legalább az alábbi szöve ­
teket kell vizsgálni:  
— a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó 
összes szövet,  
— a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes 
szövet,  
— a makroszkopikus rendellenességeket, többek között tumorokat mutató 
összes szövet,  
— azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a 
kezelésnek tulajdonítható kórszövettani elváltozásokat mutatnak, az 
összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,  
— páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
vizsgálni kell.  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
39. Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat 
esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában össze ­
gezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás 
vagy humánus okokból való elpusztítás id őpontját, a toxicitás jeleit mutató 
állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely toxikus hatás kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat 
mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípu ­
sokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegz ő adattáblázatoknak 
tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok eseté ­
ben), valamint az elváltozások osztályozását.
 
40. A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a 
korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontr ­
ollokból származó adatok vélhet ően lényegesen eltolódottak az ugyanabban 
a vizsgálati létesítményben/kolóniában lév ő kontrollállatoktól származó 
újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megel őző öt évből származó 
adatokat kell felhasználni.
 
41. A számszer ű eredményeket adott esetben megfelel ő és általánosan elfogadott 
statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módsze ­
reket és az elemezend ő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani 
(9. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint el ő kell írni a túlélésre 
vonatkozó kiigazításokat.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
42. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— a vegyi anyag származási helye,  
— gyártási szám,  
— kémiai elemzésr ől szóló tanúsítvány,  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz),  
Kísérleti állatok:  
— a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,  
— az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,  
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor,  
Vizsgálati körülmények:  
— a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,  
— az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány el őkészítésére vonat ­
kozó részletes adatok,  
— a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására 
vonatkozó analitikai adatok,  
— a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó rész ­
letes adatok,  
— inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a 
bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,  
— tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi 
anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglév ő koncentrációjáról (mg/kg 
vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási 
tényező, ha ez alkalmazható,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok,  
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra 
vonatkozó adatokat is meg kell adni)  
Általános  
— túlélési adatok,  
— testsúly és annak változásai,  
— takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos 
számítások, ha vannak, valamint vízfogyasztás, ha alkalmazható,  
— toxikokinetikai adatok (ha rendelkezésre állnak),  
— oftalmoszkópia (ha rendelkezésre áll),  
— hematológia (ha rendelkezésre áll),  
— klinikai kémia (ha rendelkezésre áll),  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinikai leletek  
— toxicitási tünetek,  
— az esetleges rendellenességek el őfordulása (és – ha pontozzuk – azok 
súlyossága),  
— a megfigyelt klinikai tünetek jellege, súlyossága és id őtartama (átmeneti 
vagy állandó),  
Boncolási adatok  
— testsúly elpusztuláskor,  
— szervek súlya és ezek aránya, ha alkalmazható,  
— boncolási eredmények, rendellenességek el őfordulása és súlyossága,  
Kórszövettani vizsgálatok  
— nem neoplasztikus kórszövettani leletek,  
— neoplasztikus kórszövettani leletek,  
— a makroszkopikus és mikroszkopikus vizsgálatok leletei közötti össze ­
függés,  
— a kezeléssel összefügg ő összes kórszövettani lelet részletes leírása, bele ­
értve a súlyossági fokokat,  
— a tárgylemezek szakért ői felülvizsgálatáról szóló jelentés,  
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható  
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következ őket: 
— az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,  
— dózis-válasz összefüggések,  
— korábbi kontrolladatok,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,  
— BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,  
— humán relevancia.  
Következtetések  
IRODALOM  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Prog ­
ramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismé ­
telt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejezete.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
(9) E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat cím ű 
fejezete.  
(10) E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat 
című fejezete.  
(11) E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) cím ű 
fejezete.  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to LIFE 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(23) ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
(27) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU 
irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől, HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of 
Health and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.  
(32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appéldául Toxicol. 29: 198- 
201. 
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  A KRÓNIKUS TOXICITÁS ÉS A RÁKKELT Ő HATÁS 
EGYÜTTES VIZSGÁLATA  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 453. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2009) leírt módszerrel. Az eredeti 453. vizsgálati iránymutatást 
1981-ben fogadták el. A jelen frissített B.33. vizsgálati módszer kidolgo ­
zását az állatjóllét és a szabályozási követelmények terén az elmúlt időszakban bekövetkezett változások figyelembevétele érdekében tartották 
szükségesnek (1) (2) (3) (4) (5). E B.33. vizsgálati módszer frissítése e 
melléklet B.32., A rákkelt ő hatás vizsgálata cím ű és B.30., Krónikus toxi ­
citási vizsgálatok cím ű fejezetének felülvizsgálatával párhuzamosan történt 
meg a vizsgálatban alkalmazott állatokra vonatkozó további információk 
megszerzése, valamint a dózis kiválasztásával kapcsolatos további részletek 
biztosítása céljából. A jelen vizsgálati módszer vegyi anyagok széles skálá ­
jának vizsgálatára szolgál, beleértve a növényvéd ő szereket és az ipari vegy ­
szereket. Meg kell azonban jegyezni, hogy gyógyszeranyagok esetében 
néhány részlet és követelmény eltér ő lehet (lásd: International Conference 
on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals).
 
2. A krónikus toxicitási vizsgálatok és a rákkelt ő hatás meghatározására 
irányuló vizsgálatok többségét rágcsálófajokon végzik, ezért a jelen vizsgálati módszer els ősorban az e fajokon végzett vizsgálatokra alkalmazandó. 
Amennyiben az ilyen vizsgálatokat rágcsálóktól eltér ő fajokon kell elvégezni, 
a megfelel ő módosításokkal az itt vázolt elvek és eljárások is alkalmazhatók, 
az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejezetében (6) vázoltakkal együtt, a krónikus toxici ­
tási vizsgálatok és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok 
tervezésére és elvégzésére vonatkozó 116. OECD-iránymutatásban leírtak 
szerint (7).
 
3. A krónikus toxicitási vizsgálatok, illetve a rákkelt ő hatás meghatározására 
irányuló vizsgálatok során alkalmazott három f ő beadási mód az orális, a 
dermális és az inhalációs. A beadási mód kiválasztása függ a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, valamint az emberi expozíció 
jellemző módjától. Az expozíciós mód kiválasztására vonatkozó további 
információk a 116. iránymutatásban találhatók (7).
 
4. A jelen vizsgálati módszer az orális expozíciós módra összpontosít, amely a 
krónikus toxicitási és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok 
során a leggyakrabban alkalmazott mód. Az emberi egészségre jelentett kockázat értékeléséhez és/vagy bizonyos szabályozási rendszerek el őírásai 
alapján dermális vagy inhalációs expozíciót alkalmazó, hosszú távú vizs ­
gálatok elvégzésére is szükség lehet ugyan, azonban technikai szempontból 
e két expozíciós mód mindegyike igen összetett. Az ilyen vizsgálatokat eseti alapon kell megtervezni, bár az itt ismertetett, a krónikus toxicitás és a rákkeltő hatás orális beadás útján történ ő meghatározására és értékelésére 
szolgáló vizsgálati módszer a kezelési id őszakokra, klinikai és patológiai 
paraméterekre stb. vonatkozó ajánlások tekintetében alapul szolgálhat az inhalációs és/vagy dermális vizsgálatokra vonatkozó protokollhoz. A vizs ­
gált vegyi anyagok inhalációs (7) (8) és dermális (7) módon történ ő beadá­
sával kapcsolatban OECD-iránymutatások állnak rendelkezésre. E melléklet 
B.8. (9) és B.29. fejezetét (10), valamint az akut inhalációs vizsgálatra vonatkozó OECD-iránymutatást (8) kifejezetten alkalmazni kell az inhalá ­
ciós expozíciót alkalmazó, hosszabb távú vizsgálatok tervezése során. A 
dermális beadással végzett vizsgálatok esetében e melléklet B.9. fejezetét 
(11) kell alkalmazni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizsgálata információt 
szolgáltat az ismételt, a vizsgált fajok élettartamának akár egészére is kiter ­
jedő expozícióból valószín űsíthetően fakadó egészségügyi kockázatokról. A 
vizsgálat információkkal szolgál a vizsgált vegyi anyag toxikus hatásairól, beleértve a lehetséges rákkelt ő hatást, jelzi a célszerveket és a felhalmozódás 
lehetőségét. Becslést adhat a toxikus hatások észlelhet ő káros hatással nem 
járó szintjére, valamint a nem genotoxikus karcinogének esetében a tumor ­
válaszra nézve, amely felhasználható az emberi expozícióra vonatkozó biztonsági kritériumok meghatározásához. Hangsúlyos szerepet kap az 
állatok lehet ő legtöbb információ megszerzése érdekében történ ő körülte­
kintő klinikai vizsgálatának szükségessége is.
 
6. A jelen vizsgálati módszerben ismertetett, krónikus toxicitás, illetve rákkelt ő 
hatás meghatározására irányuló vizsgálatok célkit űzései többek között a 
következők: 
— a vizsgált vegyi anyag rákkelt ő tulajdonságainak meghatározása, 
amelyek a párhuzamos kontrollcsoportokhoz viszonyítva megnövelik a neoplazmák gyakoriságát, megnövelik a rosszindulatú neoplazmák arányát vagy lerövidítik a neoplazmák megjelenéséhez szükséges id őt,
 
— a neoplazmák megjelenési idejének meghatározása,  
— a vizsgált vegyi anyag krónikus toxicitásának meghatározása,  
— a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás célszervének (célszerveinek) 
meghatározása,  
— a dózis-válasz összefüggés jellemz őinek meghatározása,  
— a nem észlelhet ő káros hatás szintjének (NOAEL) vagy a benchmark- 
dózis (BMD) meghatározásához szükséges kiindulópontnak a meghatá ­
rozása,  
— a rákkelt ő hatások extrapolálása az alacsony dózisú emberi expozíciós 
szintekre,  
— a krónikus toxicitás hatásainak el őrejelzése az emberi expozíciós szintek 
vonatkozásában,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó hipotézisek vizsgálatához szükséges 
adatok biztosítása (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
7. A vizsgált vegyi anyag potenciális rákkelt ő hatásának és krónikus toxicitá ­
sának vizsgálata és értékelése során a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált 
vegyi anyagra vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat megkezdését megel őzően annak érdekében, hogy a 
vizsgálati terv a vizsgált vegyi anyag toxikológiai tulajdonságainak hatéko ­
nyabb vizsgálatára összpontosítson, valamint hogy az állatkísérleteket mini ­
málisra csökkentsük. A feltételezett karcinogén hatásmechanizmusára vonat ­
kozó információk és a hatásmechanizmus figyelembevétele (2) (7) (12) (13) (14) (15) különösen fontos, mivel az optimális terv eltér ő lehet attól 
függően, hogy a vizsgált vegyi anyag ismert vagy feltételezett genotoxikus 
karcinogén-e. A hatásmechanizmus figyelembevételére vonatkozó további útmutatás a 116. iránymutatásban szerepel (7).
 
8. A vizsgálat megtervezését segít ő információk többek között a vizsgált vegyi 
anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonsá ­
gai, a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ, bármely  in vitro  
vagy  in vivo  toxicitási vizsgálat eredményei, beleértve a genotoxicitási vizs ­
gálatokéit, a várható felhasználási terület(ek) és az emberi expozíció lehet ő­
sége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagok rendelkezésre álló (Q)SAR- adatai, mutagenitásra/genotoxicitásra, rákkelt ő hatásra vonatkozó és egyéb 
toxikológiai adatai, a rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok (egyszeri 
dózisra és lehet őség szerint ismételt dózisra vonatkozó kinetikai adatok), 
valamint egyéb ismételt expozíciós vizsgálatokból származó adatok. A
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
krónikus toxicitást/rákkelt ő hatás meghatározása csak a toxicitásra vonat ­
kozó, 28 napos vagy 90 napos ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból 
származó kezdeti információk megszerzését követ ően végzend ő el. A rák 
előidézésére, illetve el ősegítésére vonatkozó rövid távú vizsgálatok szintén 
hasznos információkat szolgáltathatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag lehet ­
séges egészségkárosító hatásai átfogó vizsgálatának részeként a rákkelt ő 
hatás vizsgálatának fokozatos megközelítését kell megfontolni (16) (17) (18) (19).
 
9. Az eredmények elemzése szempontjából legmegfelel őbb statisztikai módsze ­
reket az adott kísérleti tervre és célkit űzésekre tekintettel a vizsgálat kezdetét 
megelőzően kell meghatározni. A megfontolandó kérdések közé tartozik, 
hogy tartalmazzanak-e a statisztikák a túléléssel kapcsolatos kiigazítást, a kumulatív tumorkockázat túlélési id őtartamhoz viszonyított elemzését, a 
tumor kialakulási idejének elemzését, valamint egy vagy több csoport id ő 
előtti megszüntetése esetén végzett elemzést. A megfelel ő statisztikai elem ­
zésekre vonatkozó útmutatást, továbbá a nemzetközileg elfogadott statisz ­
tikai módszerekre vonatkozó f őbb hivatkozásokat a 116. iránymutatás (7), 
valamint a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló 
vizsgálatok elemzésével és értékelésével kapcsolatos 35. iránymutatás (20) 
tartalmazza.
 
10. A rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok elvégzése során a 
klinikai tünetek mint a biztonsági értékeléshez használt kísérleti állatok 
humánus végpontjai felismerésér ől, értékelésér ől és használatáról szóló 
OECD-iránymutatásban (21), különösen annak 62. bekezdésében ismertetett vezérelveket és szempontokat minden esetben követni kell. E bekezdés szerint: „ Ha az ismételt adagolást alkalmazó vizsgálatok során egy állat 
progresszív, az állapot további romlásához vezet ő klinikai tüneteket mutat, 
tájékozott döntést kell hozni az állat humánus elpusztítására vonatkozóan. A döntéshozatal során mérlegelni kell az állat vizsgálatának folytatása révén szerezhető információk értékét az állat általános állapotához viszonyítva. Ha 
úgy döntünk, hogy az állatot továbbra is vizsgálni kell, a megfigyelések 
gyakoriságát szükség szerint növelni kell. Ha ez nem befolyásolja hátrá ­
nyosan a vizsgálat céljának elérését, lehetséges az adagolás átmeneti szüne ­
teltetése – ha ez csökkenti a fájdalmat vagy a szorongást – vagy a vizsgálati 
dózis csökkentése. ”
 
11. A krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizs ­
gálatok során alkalmazott dózisok kiválasztásnak elveire vonatkozó részletes útmutatás és ezen elvek leírása a 116. iránymutatásban (7), valamint a 
Nemzetközi Élettudományi Intézet két kiadványában található (22) (23). A 
fő dózis-kiválasztási stratégia a vizsgálat els ődleges célkit űzésétől vagy 
célkitűzéseitől függ (6. bekezdés). A megfelel ő dózisszintek kiválasztásakor 
egyensúlyt kell találni egyfel ől a veszélyesség vizsgálata, másfel ől az 
alacsony dózisra adott válaszok jellemzése és azok relevanciája között. Ez 
különösen lényeges a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálata esetében.
 
12. Meg kell fontolni a krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizs ­
gálatának elvégzését a krónikus toxicitási vizsgálat (e melléklet B.30. feje ­
zete) és a rákkelt ő hatás vizsgálatának (e melléklet B.32. fejezete) külön- 
külön történ ő elvégzése helyett. A két külön vizsgálat elvégzéséhez viszo ­
nyítva az együttes vizsgálat id ő- és költséghatékonyabb, valamint a használt 
állatok számának némi csökkenésével jár, anélkül hogy befolyásolná az 
adatok min őségét a krónikus fázisban vagy a karcinogenitási fázisban. A 
krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizsgálata során azonban 
körültekint ően figyelembe kell venni a dóziskiválasztás elveit (11. és 22–26. 
bekezdés), továbbá azt is meg kell jegyezni, hogy bizonyos szabályozási 
keretrendszerek a vizsgálatok külön-külön történ ő elvégzését írhatják el ő. A 
krónikus toxicitás és a rákkelt ő hatás együttes vizsgálatának oly módon 
történő megtervezésére vonatkozóan, hogy az állatok száma csökkentésének 
lehetősége szempontjából és a különböz ő kísérleti eljárások egyszer űsítése 
révén elérhet ő legyen a vizsgálat maximális hatékonysága, a 116. irány ­
mutatás (7) tartalmaz további útmutatást.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. A jelen vizsgálati módszerrel összefüggésében használt fogalmak meghatá ­
rozása a jelen fejezet végén és a 116. iránymutatásban található (7).  
A VIZSGÁLAT ELVE  
14. A vizsgálati terv két párhuzamos fázist tartalmaz: egy krónikus fázist és egy 
rákkeltő fázist (az id őtartamot lásd a 34. és a 35. bekezdésben). A vizsgált 
vegyi anyagot általában orális úton juttatjuk be, azonban az inhalációs vagy 
dermális bejuttatással történ ő vizsgálat is megfelel ő lehet. A krónikus fázis 
esetében a vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk be fokozatos dózisokban a kísérleti állatok több csoportjának, csoportonként egy dózisszintet alkal ­
mazva, általában 12 hónapig, bár hosszabb és rövidebb id őtartam is választ ­
ható a szabályozási követelményekt ől függően (lásd a 34. bekezdést). A 
kiválasztott id őtartamnak elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy lehet ővé 
tegye a kumulatív toxicitás esetleges hatásainak megjelenését a geriátriai 
változások zavaró hatásai nélkül. A vizsgálati terv egy vagy több id őközi 
elpusztítást is tartalmazhat, például a 3. és a 6. hónapot követ ően, és állatok 
további csoportjai vonhatók be ennek kiegyenlítése érdekében (lásd a 20. bekezdést). A rákkelt ő fázis esetében a vizsgált vegyi anyagot naponta adjuk 
be a vizsgált állatok több csoportjának az élettartamuk jelent ős részén 
keresztül. Az állatokat mindkét fázisban gondosan megfigyeljük a toxicitás jeleinek és a neoplasztikus elváltozások kialakulásának észlelése érdekében. A vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokat felboncoljuk, továbbá 
a vizsgálat befejezése után az életben maradt állatokat is elpusztítjuk és 
felboncoljuk.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
15. A jelen vizsgálati módszer els ősorban a krónikus toxicitás és a rákkelt ő 
hatás rágcsálókban történ ő vizsgálatával és értékelésével foglalkozik (2. 
bekezdés). A rágcsálóktól eltér ő fajok használata fontolóra vehet ő, ha a 
rendelkezésre álló adatok arra utalnak, hogy az ilyen fajok relevánsabbak az emberekre gyakorolt egészségi hatások el őrejelzése tekintetében. A faj 
kiválasztását indokolni kell. Az el őnyben részesítend ő rágcsálófaj a patkány, 
de más rágcsálófaj, például az egér is használható. Habár az egér használa ­
tának hasznossága a rákkelt ő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok 
során korlátozott lehet (24) (25) (26), néhány jelenlegi szabályozási program megköveteli a rákkelt ő hatás egereken történ ő vizsgálatát, hacsak nem nyert 
megállapítást, hogy az ilyen vizsgálat tudományos szempontból nem szük ­
séges. A patkányok és az egerek a viszonylag rövid élettartamuk, gyógy ­
szerészeti és toxikológiai vizsgálatokban elterjedt használatuk, a tumor ­
indukcióra való fogékonyságuk, valamint a megfelel ően jellemzett törzsek 
rendelkezésre állása miatt preferált kísérleti modellek. E tulajdonságok ered ­
ményeképpen nagy mennyiség ű információ áll rendelkezésre fiziológiájukról 
és patológiájukról. A rágcsálótól eltér ő fajokon történ ő, krónikus toxicitás/ 
rákkeltő hatás meghatározására irányuló vizsgálatok tervezésének és elvég ­
zésének adott esetben a jelen vizsgálati módszerben ismertetett elveken, 
valamint az e melléklet B.27., 90 napos, ismételt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejezetében (6) leírtakon kell alapulnia. A 
faj és törzs kiválasztására vonatkozó további információk a 116. iránymuta ­
tásban találhatók (7).
 
16. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett állatokat kell alkalmazni. A krónikus toxicitás/rákkelt ő hatás 
együttes vizsgálatát olyan állatokon kell elvégezni, amelyek törzse és eredete megegyezik a rövidebb id őtartamú el őzetes toxicitási vizsgálat(ok)ban 
felhasznált állatokéval, habár ha ismert, hogy az ehhez a törzshöz tartozó 
és ilyen eredet ű állatoknál problémák jelentkeznek a hosszú távú vizsgálatok 
esetében általánosan elfogadott túlélési szempontok teljesítése tekintetében (lásd a 116. iránymutatást (7)), fontolóra kell venni egy, a hosszú távú vizsgálatok esetében elfogadható túlélési aránnyal rendelkez ő állattörzs hasz ­
nálatát. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellet ­
tek, és nem vemhesek.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Tartási és etetési körülmények  
17. Az állatokat külön, vagy azonos nem ű egyedekb ől álló kis csoportokban 
kell tartani; a külön történ ő tartást csak akkor kell fontolóra venni, ha az 
tudományos szempontból indokolt (27) (28) (29). A ketreceket úgy kell 
elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének 
lehetséges hatásait. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmérsék­
lete 22 °C (± 3 °C) kell, hogy legyen. Noha a helyiség relatív páratartal ­
mának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától elte ­
kintve – lehet őség szerint nem szabad meghaladnia a 70 %-ot, a célértéknek 
50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez hagyományos 
laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosí ­
tása mellett. A takarmánynak meg kell felelnie a vizsgált faj összes tápanyagigényének, és a vizsgálat eredményét esetlegesen befolyásoló takar ­
mány-szennyez ődések mennyiségének – beleértve többek között a növény ­
védőszer-maradványokat, a perzisztens szerves szennyez ő anyagokat, a fito ­
ösztrogéneket, a nehézfémeket és a mikotoxinokat – a lehet ő legalacso ­
nyabbnak kell lennie. A tápanyagokban és takarmányokban lév ő szennyez ő 
anyagok szintjére vonatkozó analitikai információkat id őszakos jelleggel kell 
meghatározni, legalább a vizsgálat kezdetekor, valamint amikor változás 
következik be a felhasznált adagban, és ezeket az információkat a zárójelen ­
tésben közölni kell. A vizsgálat során felhasznált ivóvízre vonatkozó anali ­
tikai információkat hasonló módon kell megadni. A vizsgált vegyi anyag 
táplálékkal történ ő beadása esetén a takarmány megválasztását befolyásol ­
hatja annak szükségessége, hogy az megfelel ően keveredjen el a takarmány ­
nyal és kielégítse az állatok táplálkozási igényeit.
 
Az állatok el őkészítése  
18. A laboratóriumi körülményekhez legalább 7 napig szoktatott, egészséges 
állatokat kell használni, amelyek korábban nem voltak kitéve kísérleti eljá ­
rásoknak. Rágcsálók esetében az állatoknak történ ő adagolást az elválasztást 
és szoktatást követ ően a lehet ő leghamarabb, és lehet őleg az állatok 8 hetes 
kora előtt meg kell kezdeni. A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, súly 
és életkor szerint kell jellemezni. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya az egyes nemeken belül csak minimálisan térhet el egymástól, a vizsgálatban 
használt összes állat súlyának átlagos értékét ől pedig legfeljebb ± 20 %-kal 
különbözhet mindkét nem esetében. Az állatokat véletlenszer űen kell beso ­
rolni a kontroll- és kezelt csoportokba. A véletlenszer ű kiválasztást követ ően 
nem lehet lényeges különbség az egyes nemeken belül a csoportok átlagos 
testsúlya között. Ha statisztikailag szignifikáns különbségek fordulnak el ő, a 
véletlenszer ű kiválasztás lépését lehet őség szerint meg kell ismételni. 
Minden egyes állatnak egyedi azonosító számot kell kapnia, és minden egyes állatot maradandóan meg kell jelölni ezzel a számmal tetoválás, 
mikrochip-beültetés vagy más megfelel ő módszer segítségével.
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
19. A vizsgálathoz mindkét nemet fel kell használni. Megfelel ő számú állatot 
kell használni az alapos biológiai és statisztikai értékelés lehet ővé tétele 
érdekében. Rágcsálók esetében ezért a vizsgálat karcinogenitási fázisára 
szánt minden egyes dóziscsoport (a 22. bekezdésben leírtak szerint) és 
kísérő kontrollcsoport nemenként legalább 50 állatból kell álljon. A vizs ­
gálat céljától függ ően a főbb becslések statisztikai ereje növelhet ő lehet az 
állatok különböz ő dóziscsoportokba történ ő egyenlőtlen elosztásával oly 
módon, hogy több mint 50 állatnak kell lennie az alacsony dózisú csopor ­
tokban, például az alacsony dózisok karcinogenitásának becslése céljából. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csoport méretének mérsékelt növelése viszonylag kis mértékben növeli a vizsgálat statisztikai erejét. Rágcsálók 
esetében a vizsgálat krónikus toxicitási fázisára szánt minden egyes 
dóziscsoport (a 22. bekezdésben leírtak szerint) és kísér ő kontrollcsoport
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
nemenként legalább 10 állatból kell álljon. Meg kell jegyezni, hogy ez a 
szám alacsonyabb, mint a krónikus toxicitási vizsgálatnál (e melléklet B.30. 
fejezete). Az együttes vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált, csoportonként kisebb számú állattól származó adatok értelmezését ugyan ­
akkor a vizsgálat karcinogenitási fázisában vizsgált, nagyobb számú állattól 
származó adatokkal lehet alátámasztani. Az egerekkel végzett vizsgálatok 
esetében a krónikus toxicitási fázisban további állatok bevonása lehet szük ­
séges minden egyes dóziscsoportban az összes el őírt hematológiai meghatá ­
rozás elvégzése céljából. A vizsgálat statisztikai tervezésér ől és a dózisz ­
szinteknek a statisztikai er ő maximális szintre való növelése érdekében 
történő kiválasztásáról további információk a 116. iránymutatásban (7) talál ­
hatók.
 
Időközi elpusztításra, kísér ő csoportra és jelz őállatokra vonatkozó 
rendelkezések  
20. Amennyiben ez tudományos szempontból indokolt, a vizsgálat a nem 
neoplasztikus elváltozások alakulására vonatkozó és mechanisztikai informá ­
ciók megszerzése céljából el őírhatja az id őközi elpusztítást, például a 
krónikus toxicitási fázis esetén a 6. hónapban. Abban az esetben, ha ilyen információk a vizsgált vegyi anyaggal végzett korábbi, ismételt adagolású toxicitási vizsgálatokból már rendelkezésre állnak, az id őközi elpusztítás 
tudományos szempontból nem feltétlenül indokolt. A vizsgálat krónikus 
toxicitási fázisában általában 12 hónapon keresztül használt állatok (34. bekezdés) id őközi elpusztítással kapcsolatos adatokat szolgáltatnak a vizs ­
gálat karcinogenitási fázisához, ezzel csökkentve az összesen felhasznált 
állatok számát. Kísér ő csoportok is bevonhatók a vizsgálat krónikus toxici ­
tási fázisába a vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából. E csoportok vizs ­
gálata korlátozódhat a vizsgálat legnagyobb dózisával való kezelésre és 
kontrollvizsgálatra. Szükség szerint egy jelz őállatokból álló további (jellem ­
zően nemenként 5 állatból álló) csoport is bevonható a betegség állapotának 
a vizsgálat közben történ ő megfigyelése céljából (30). A vizsgálat id őközi 
elpusztításokat, kísér ő csoportokat és jelz őállatokat magában foglaló, és 
egyúttal az összesen felhasznált állatok számát minimálisra csökkent ő 
megtervezésével kapcsolatban a 116. iránymutatásban (7) található további útmutatás.
 
21. Ha a vizsgálati terv kísér ő csoportot és/vagy id őközi elpusztítást tartalmaz, 
az erre a célra bevont állatok száma rendszerint minden egyes dóziscso ­
portban nemenként 10, a vizsgálati tervben szerepl ő állatok teljes számát 
pedig annyival kell megnövelni, ahány állat elpusztítását tervezzük a vizs ­
gálat befejezése el őtt. Az időközben elpusztított és a kísér ő csoportban lév ő 
állatokat általában ugyanazoknak a megfigyeléseknek kell alávetni, mint a f ő 
vizsgálat krónikus toxicitási fázisában vizsgált állatokat, beleértve a test ­
súlyra, táplálék-/vízfogyasztásra, hematológiára és klinikai kémiára vonat ­
kozó méréseket, valamint patológiai vizsgálatokat, de el őírható (az id őközi 
elpusztítás céljából bevont csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos főbb paraméterekre, például a neurotoxicitásra vagy az immuntoxicitásra 
korlátozódjanak.
 
Dóziscsoportok és adagolás  
22. A dózis kiválasztásának és a dózisszintek felosztásának összes szempontjára 
vonatkozó útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Legalább három 
dózisszintet és egy ezzel párhuzamos kontrollt kell alkalmazni, a krónikus és 
a karcinogenitási fázishoz egyaránt. A dózisszintek megválasztása általában a rövidebb távú ismételt adagolású vagy tartománybehatároló vizsgálatok eredményein alapul, figyelembe véve a vizsgált vegyi anyagra vagy rokon 
vegyi anyagokra vonatkozóan rendelkezésre álló bármilyen toxikológiai és 
toxikokinetikai adatot.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. A vizsgálat krónikus toxicitási fázisa esetében a három dózisszintet alkal ­
mazó teljes vizsgálat nem feltétlenül szükséges, ha el őre jelezhet ő, hogy az 
egyetlen, legalább 1 000 mg/testsúlykilogramm/nap dózisnak megfelel ő 
dózisszinttel végzett vizsgálat valószín űleg nem okoz kedvez őtlen hatásokat. 
Ennek az el őrejelzésnek el őzetes vizsgálatokból származó információkon, 
valamint azon a megfontoláson kell alapulnia, hogy a szerkezetileg rokon 
anyagokkal kapcsolatos adatok alapján nem várható toxicitás. 1 000 mg/test ­
súlykilogramm/nap határadag alkalmazható, kivéve, ha a humán expozíció magasabb dózisszint használatát indokolja.
 
24. Ha a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai jellege vagy biológiai hatásai 
nem szabnak ennek korlátot, a legmagasabb dózisszintet olyan módon kell 
kiválasztani, hogy az alkalmas legyen az els ődleges célszervek és toxikus 
hatások meghatározására, ugyanakkor elkerülhet ő legyen a szenvedés, a 
súlyos toxicitás, a morbiditás vagy az elhullás. A legmagasabb dózisszintet általában úgy kell megválasztani, hogy toxicitást váltson ki, amely például a 
testsúly növekedésének (körülbelül 10 %-os) visszaesésével bizonyítható. A 
vizsgálat célkit űzéseitől függően azonban (lásd a 6. bekezdést) a toxicitást 
bizonyíthatóan kiváltó dózisnál alacsonyabb maximális dózis is választható, például ha egy dózis káros hatást idéz el ő, amely azonban csak kismér ­
tékben befolyásolja az élettartamot vagy a testsúlyt.
 
25. A dózisszintek és azok felosztása megválasztható úgy, hogy meghatározható 
legyen a dózis-válasz összefüggés, valamint a vizsgált vegyi anyag hatás ­
mechanizmusától függ ően a NOAEL vagy a vizsgálat egyéb tervezett kime ­
netele, például a BMD (lásd a 27. bekezdést). Az alacsonyabb dózis kivá ­
lasztása során figyelembe veend ő tényezők többek között a dózis-válasz 
görbe várható meredeksége, azok a dózisok, amelyeknél fontos változások következhetnek be a metabolizmusban vagy a toxikus hatás mechanizmusá ­
ban, amelyeknél küszöbérték várható, vagy amelyeknél az alacsony dózis 
extrapolálásához használható kiindulási pont várható. A rákkelt ő hatás/kró ­
nikus toxicitás együttes vizsgálatának els ődleges célja a karcinogenitási 
kockázatértékelést szolgáló információk megszerzése, a krónikus toxicitásra vonatkozó információk megszerzése pedig rendszerint másodlagos cél. Ezt 
szem előtt kell tartani a vizsgálat dózisszintjeinek és a dózisszintek felosz ­
tásának kiválasztásakor.
 
26. A dózisszintek felosztásának kiválasztása függ a vizsgálat célkit űzéseitől és 
a vizsgált vegyi anyag jellemz őitől, és nem írható el ő részletesen a jelen 
vizsgálati módszerben, ugyanakkor csökken ő dózisszintek meghatározásához 
gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalmazása, az adagolások 
közötti nagyon nagy intervallumok (például körülbelül 6–10-nél magasabb 
szorzófaktor) alkalmazásával szemben pedig gyakran el őnyben részesítend ő 
egy negyedik vizsgálati csoport beiktatása. A 10-nél magasabb szorzófakto ­
rokat általában kerülni kell, és használatukat meg kell indokolni.  
27. A 116. iránymutatásban részletesebben leírtak szerint (7) a dózis kiválasz ­
tásakor figyelembe veend ő szempontok többek között a következ ők: 
— ismert vagy feltételezett nemlinearitások vagy elhajlási pontok a dózis- 
válasz görbén,  
— toxikokinetika, valamint azok a dózistartományok, amelyek esetében a 
metabolikus indukció, a telítettség vagy a küls ő és belső dózisok közötti 
nemlinearitás el őfordul, vagy nem fordul el ő, 
— prekurzor elváltozások, hatásmarkerek vagy a f őbb mögöttes biológiai 
folyamatok m űködésének mutatói,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— a hatásmechanizmus f őbb (vagy feltételezett) aspektusai, például azok a 
dózisok, amelyeknél megjelenik a citotoxicitás, felborulnak a hormon ­
szintek és a homeoszatikus mechanizmusok stb.,  
— a dózis-válasz görbe azon területei, ahol különösen pontos becslés szük ­
séges, például a várt BMD vagy egy feltétezett küszöbérték tartományá ­
ban, 
— a várható humán expozíciós szintek figyelembevétele, különösen a 
közepes és alacsony dózis kiválasztása során.  
28. Kontrollcsoportként egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgált vegyi anyag 
beadásához viv őanyagot használunk, egy viv őanyaggal kezelt kontrollcso ­
port alkalmazandó. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizs ­
gálati csoportokban lév őket. Vivőanyag alkalmazása esetén a kontrollcso ­
portban a viv őanyagot a dóziscsoportokban alkalmazott legnagyobb mennyi ­
ségben kell beadni. Ha a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal adjuk be, és emiatt a táplálékfogyasztás a táplálék lecsökkent ízletessége miatt jelent ősen 
csökken, hasznos lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazása a 
megfelelőbb kontroll biztosítása érdekében.
 
A dózisok el őkészítése és a vizsgált vegyi anyag beadása  
29. A vizsgált vegyi anyagot általában orálisan, a takarmánnyal vagy az ivóvíz ­
zel, vagy gyomorszonda segítségével adjuk be. A bejuttatás útvonalára és 
módjára vonatkozó további információk a 116. iránymutatásban találhatók (7). A bejuttatás útvonala és módja függ a vizsgálat céljától, a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságaitól, biológiai hozzáférhet őségétől, vala­
mint az emberi expozíció meghatározó útvonalától és módjától. A bejuttatás 
útvonalának és módjának kiválasztását indokolni kell. Állatjóléti okokból gyomorszonda rendszerint csak olyan hatóanyagoknál alkalmazandó, amelyek esetében a bejuttatásnak ez az útvonala és módja ésszer űen tükrözi 
a lehetséges humán expozíciót (például gyógyszerek esetében). A táplá ­
lékban vagy környezetben el őforduló vegyi anyagok, többek között a 
növényvéd ő szerek esetében a beadás jellemz ően a táplálékon vagy az 
ivóvízen keresztül történik. Néhány forgatókönyv, például a munkahelyi 
expozíció esetében ugyanakkor a beadás egyéb útvonalai megfelel őbbnek 
bizonyulhatnak.
 
30. A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén feloldjuk vagy szuszpendáljuk 
alkalmas viv őanyagban. Adott esetben figyelembe kell venni a viv őanyag 
és más adalékanyagok következ ő tulajdonságait: a vizsgált vegyi anyag 
felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszamaradására gyako ­
rolt hatások, a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemz őit, valamint az 
állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt 
hatások. Lehet őség szerint els ősorban vizes oldatot/szuszpenziót ajánlatos 
alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmadsorban más viv őanyagokban elkészí ­
tett oldatot. A vízt ől eltérő vivőanyagok esetében ismerni kell a viv őanyag 
toxikológiai tulajdonságait. A vizsgált vegyi anyag beadási körülmények 
közötti (például takarmánnyal történ ő beadás során fennálló) stabilitására 
és (adott esetben) a beadáshoz használt oldatok vagy takarmányok homoge ­
nitására vonatkozó információknak rendelkezésre kell állniuk.
 
31. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos 
biztosítani, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége ne zavarja 
meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. A takar ­
mánnyal történ ő beadást alkalmazó hosszú távú toxicitási vizsgálatok 
esetében a takarmányban lév ő vizsgált vegyi anyag koncentrációja a 
kiegyensúlyozatlan táplálkozás elkerülése érdekében általában nem halad ­
hatja meg a teljes takarmány 5 %-át. Ha a vizsgált vegyi anyagot a takar ­
mányba keverve adjuk be, akkor vagy állandó takarmánykoncentráció (mg/ takarmánykilogramm vagy ppm), vagy az állatok testsúlyára heti rendsze ­
rességgel kiszámított állandó dózisszint (mg/testsúlykilogramm) alkalmaz ­
ható. A kiválasztott alternatívát meg kell nevezni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Orális úton történ ő beadás esetén a vizsgált vegyi anyagot naponta kell az 
állatoknak beadni (heti hét napon keresztül) 12 hónapon (krónikus toxicitási 
fázis) vagy 24 hónapon át (karcinogenitási fázis), lásd még a 33. és a 34. bekezdést. Bármely más adagolási rendszer – például heti öt napon történ ő 
beadás – használatát indokolni kell. Dermális úton történ ő beadás esetén az 
állatokat az e melléklet B.9. fejezetében meghatározottak szerint általában 
legalább napi 6 órán keresztül, heti 7 napon kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni 12 hónapon (krónikus toxicitási fázis) vagy 24 hónapon át (karci ­
nogenitási fázis). Az inhaláció útján történ ő expozíciót napi 6 órán keresztül, 
heti 7 nap kell elvégezni, de indokolt esetben heti 5 napos expozíció is 
alkalmazható. Az expozíció id őtartama általában 12 hónap (krónikus toxici ­
tási fázis) vagy 24 hónap (karcinogenitási fázis). Patkányoktól eltér ő rágcsá­
lófajok csak orron át történ ő expozíciója esetén az expozíció maximális 
időtartama kiigazítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. 
A napi 6 óránál rövidebb expozíciós id őtartam alkalmazását indokolni kell. 
Lásd még e melléklet B.8. fejezetét (9).
 
33. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, a dózist mindig a nap 
hasonló id őszakában, gyomorszondán vagy megfelel ő intubációs kanülön át 
kell beadni az állatoknak. Általában egyetlen dózist kell beadni naponta egyszer; abban az esetben, ha a vegyi anyag például helyi irritációt okoz, a napi dózisarány fenntartható lehet elosztott (napi kétszeri) beadással. Az 
egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat 
méretétől függ. A mennyiséget a lehet ő legalacsonyabb szinten kell tartani, 
és rágcsálók esetében általában nem haladhatja meg az 1 ml/100 testsúly ­
gramm térfogatot (31). A koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra 
kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy vala ­
mennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni. A fentiek alól kivételt jelentenek az esetlegesen maró vagy irritatív hatást kiváltó anyagok, amelyeket hígítani kell a súlyos helyi hatások elkerülése érdeké ­
ben. Kerülni kell az emészt őrendszerben valószín űsíthetően maró vagy irri ­
tatív hatást kiváltó koncentrációkkal történ ő vizsgálatokat.
 
A vizsgálat id őtartama  
34. Az adagolási id őszak és a vizsgálat krónikus toxicitási fázisának id őtartama 
általában 12 hónap, bár a vizsgálati terv az adott szabályozási rendszer 
követelményeit ől vagy bizonyos mechanisztikai céloktól függ ően lehetővé 
teszi a rövidebb (például 6 vagy 9 hónapos) vagy hosszabb (például 18 vagy 24 hónapos) id őtartamú vizsgálatokat, illetve alkalmazható ilyen id őtartamú 
vizsgálatok során is. A 12 hónapos expozíciós id őtartamtól való eltérést 
indokolni kell, különösen a rövidebb id őtartamok esetében. Az ehhez a 
fázishoz hozzárendelt összes dóziscsoportot a krónikus toxicitás értékelése és a nem neoplasztikus patológiai vizsgálatok céljából meg kell szüntetni a meghatározott id őpontban. A vizsgált vegyi anyag által esetlegesen okozott 
toxikológiai változások visszafordíthatóságának megfigyelése céljából 
bevont kísér ő csoportokat az expozíció megszüntetését követ ően legalább 
4 hétig, de legfeljebb a vizsgálat teljes id őtartamának egyharmadáig fenn 
kell tartani adagolás nélkül.
 
35. A vizsgálat karcinogenitási fázisának id őtartama rágcsálók esetében álta ­
lában 24 hónap, amely a felhasznált állatok normális élettartamának legna ­
gyobb részére kiterjed. A vizsgált állattörzs élettartamától függ ően rövidebb 
vagy hosszabb vizsgálati id őtartamok is alkalmazhatók, de ezt meg kell 
indokolni. Bizonyos egértörzsek, például az AKR/J, a C3H/J vagy a 
C57BL/6J törzs esetében a 18 hónapos id őtartam megfelel őbb lehet. A 
következőkben iránymutatás olvasható a vizsgálat idejével és befejezésével, 
valamint a túléléssel kapcsolatban; további, többek között a negatív karci ­
nogenitás túlélési arányhoz viszonyított elfogadhatóságának megfontolásával 
kapcsolatos útmutatás a 116. iránymutatásban (7) található:  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Meg kell fontolni a vizsgálat befejezését, ha az életben maradt állatok 
száma az alacsonyabb dózissal kezelt csoportokban vagy a kontrollcso ­
portban 25 százalék alá csökken.  
— Abban az esetben, ha csak a magas dózissal kezelt csoportban figyelhet ő 
meg idő előtti elhullás a toxicitás következtében, a vizsgálatot nem kell 
befejezni.  
— Az életben maradt egyedek számát nemenként külön-külön kell figye ­
lembe venni.  
— A vizsgálat nem tarthat tovább annál a pontnál, amikor a vizsgálat révén 
nyert adatok már nem elegend őek a statisztikailag érvényes értékelés 
lefolytatásához.  
MEGFIGYELÉSEK (KRÓNIKUS TOXICITÁSI FÁZIS)  
36. Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepna ­
pokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbete ­
gedés jeleit vagy nem hullott-e el. Általános klinikai megfigyelést naponta legalább egyszer kell végezni, lehet őleg minden nap ugyanazon 
időpont(ok)ban, szondával történ ő adagolás esetén figyelembe véve az 
adagolást követ ően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát.
 
37. Az els ő expozíció el őtt legalább egyszer (az egyedek közötti összehasonlítás 
érdekében), a vizsgálat els ő hetének végén, azt követ ően pedig havonta 
egyszer az összes állatot részletes klinikai megfigyeléseknek kell alávetni. 
A megfigyelési protokollt úgy kell kialakítani, hogy az egyes megfigyel ők 
közötti különbségek minimálisak legyenek, és függetlenek legyenek a vizs ­
gált csoportoktól. E megfigyeléseket az állatok tartására egyébként használt 
ketreceken kívül, lehet őleg egy szabványos karámban, minden alkalommal a 
nap hasonló id őszakában kell elvégezni. A megfigyeléseket gondosan fel 
kell jegyezni, lehet őleg a vizsgálatokat végz ő laboratórium által kifejezetten 
meghatározott pontozásos rendszer segítségével. Törekedni kell arra, hogy a 
megfigyelési körülmények közötti különbségek minimálisak legyenek. A 
feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a b őr, a szőrzet, 
a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok 
előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében megfigyelhet ő változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott 
reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztereotip 
viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr 
viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni (32).
 
38. A vizsgált vegyi anyag els ő beadását szemtükörrel vagy más, megfelel ő 
eszközzel végzett szemészeti vizsgálat el őzi meg, amelyet az összes állaton 
el kell végezni. E vizsgálatot a vizsgálatsorozat végén meg kell ismételni, lehetőleg az összes állaton, de legalább a magas dózissal kezelt és kontroll ­
csoportok tagjain. Ha a szemben a kezeléssel összefügg ő elváltozást tapasz ­
talunk, az összes állatot meg kell vizsgálni. Ha szerkezeti elemzés vagy 
egyéb információ szemtoxicitásra utal, a szemvizsgálatot gyakrabban kell elvégezni.
 
39. Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 
28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges neurotoxikus hatásokat jeleztek, a vizsgálat megkezdését megel őzően, valamint a vizsgálat 
kezdetét követ ő 12. hónap végéig 3 hónapos id őközönként, továbbá a vizs ­
gálat végén (ha az tovább tart 12 hónapnál) elvégezhet ő a különböz ő típusú 
ingerekre (32) (például hallószervi, vizuális, önérzékelési ingerek) mutatott érzékszervi reakciók vizsgálata (33) (34) (35), a szorítás erejének értékelése (36) és a motoros aktivitás felmérése (37). A követend ő eljárásokkal kapcso ­
latban további részletek a vonatkozó szakirodalomban találhatók. Ett ől 
függetlenül a hivatkozottaktól eltér ő alternatív eljárások is alkalmazhatók.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Az olyan vegyi anyagok esetében, amelyeknél a korábbi, ismételt adagolású, 
28 napos és/vagy 90 napos toxicitási vizsgálatok lehetséges immuntoxikus 
hatásokat jeleztek, e végpont további vizsgálatát lehet végezni a vizsgálat végén.
 
Testsúly, táplálék-/vízfogyasztás és táplálékhasznosítási képesség  
41. A kezelés kezdetekor, az els ő 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután 
pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A 
táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat els ő 13 
hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább havonta egyszer kell 
mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a 
vizsgálat els ő 13 hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább 
havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megvál ­
toznak.
 
Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok  
42. A rágcsálókon végzett vizsgálatok esetében az összes vizsgált állaton (cso ­
portonként 10 hímen és 10 n őstényen) hematológiai vizsgálatokat kell 
végezni a 3., 6. és 12. hónapban, valamint a vizsgálat végén (ha az 
hosszabb, mint 12 hónap). Az egereken végzett vizsgálatok esetében kísér ő 
csoportra lehet szükség az összes el őírt hematológiai vizsgálat elvégzése 
céljából (lásd a 19. bekezdést). A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok 
esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 
4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi id őpontokban, valamint a 
vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a 
hematológiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem 
szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. Vérmintákat meghatározott helyr ől kell venni, például a szívb ől vagy a 
szemgolyó mögötti üregb ől altatás alatt.
 
43. Az alábbi paramétereket kell vizsgálni (38): teljes és differenciált 
leukocitaszám, eritrocitaszám, trombocitaszám, hemoglobinkoncentráció, 
hematokrit (vérsejtsüllyedés), átlagos sejttérfogat (MCV), eritrociták 
átlagos hemoglobintartalma (MCH), eritrociták átlagos hemoglobin ­
koncentrációja (MCHC), prothrombin id ő, valamint aktivált parciális trom ­
boplasztin id ő. A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függ ően szükség szerint 
egyéb hematológiai paramétereket, például Heinz-testeket vagy egyéb 
atipikus eritrocitamorfológiát vagy methemoglobint is lehet mérni. Általá ­
nosságban elmondható, hogy rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt 
függ. Ha a vizsgált vegyi anyag a vérképz ő rendszerre hat, a retikulocita ­
szám és a csontvel őcitológia is feltüntethet ő, habár ezek vizsgálatát nem 
szükséges rutinszer űen elvégezni.
 
44. A szövetekben jelentkez ő fontosabb toxikus hatások és különösen a vesékre 
és a májra gyakorolt hatás vizsgálata érdekében a klinikai biokémiai értékek meghatározását az összes vizsgált állattól (csoportonként 10 hím és 10 
nőstény egyedt ől) vett vérmintákból kell elvégezni a hematológiai vizsgála ­
tokhoz meghatározott id őközönként. Az egereken végzett vizsgálatok 
esetében kísér ő csoportra lehet szükség az összes el őírt klinikai biokémiai 
vizsgálat elvégzése céljából. A nem rágcsálókon végzett vizsgálatok 
esetében kisebb számú (kutyákon végzett kísérleteknél például nemenként 
4) állattól kell mintát venni köztes mintavételi id őpontokban, valamint a 
vizsgálat végén, a rágcsálók esetében leírtak szerint. Ha a korábbi, hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak változást a 
klinikai biokémiai paraméterek vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában 
nem szükséges méréseket végezni, rágcsálók és egyéb fajok esetében sem. A
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
vérvétel el őtti éjszaka ajánlatos az állatokat koplaltatni (kivéve egerek eseté ­
ben) (  1 ). A következ ő paramétereket kell vizsgálni (38): glükóz, karbamid 
(karbamid-nitrogén), kreatinin, teljes fehérje, albumin, kalcium, nátrium, kálium, teljes koleszterin, legalább két értékelhet ő minta a májsejtek értéke ­
léséhez (alanin-aminotranszferáz, aszpartát-aminotranszferáz, glutamát- 
dehidrogenáz, teljes epesav) (39), valamint legalább két értékelhet ő minta 
a máj és az eperendszer értékeléséhez (alkáli foszfatáz, gamma-glutamil- transzpeptidáz, 5’-nukleotidáz, teljes bilirubin, teljes epesav) (39). A vizsgált vegyi anyag toxicitásától függ ően szükség szerint más klinikai kémiai para ­
méterek, például az éhgyomorra mért trigliceridek, bizonyos hormonok és a 
kolinészterázszint mérése is elvégezhet ő. Általánosságban elmondható, hogy 
rugalmas megközelítés alkalmazandó, amely az adott vizsgált vegyi anyag megfigyelt és/vagy várható hatásaitól egyaránt függ.
 
45. Vizeletelemzést az összes vizsgált állaton (csoportonként 10 hím és 10 
nőstény egyeden), a hematológiai és klinikai kémiai vizsgálatokhoz 
meghatározott id őközönként levett mintákon kell elvégezni. Ha a korábbi, 
hasonló dózisszintekkel elvégzett 90 napos vizsgálatok nem mutattak válto ­
zást a vizeletelemzés vonatkozásában, a vizsgálat 3. hónapjában nem szük ­
séges méréseket végezni. A klinikai patológiai vizsgálatra vonatkozó szak ­
értői ajánlás a következ ő vizsgálandó paramétereket tartalmazza (38): 
küllem, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, összes fehérje, vala ­
mint glükóz. Az egyéb mérések közé tartozik a keton, az urobilinogén, a 
bilirubin és a vizeletben jelen lév ő vér vizsgálata. Szükség szerint további 
paraméterek vizsgálatát is be lehet vezetni a megfigyelt hatás(ok) vizsgálati körének b ővítése érdekében.
 
46. Általánosan elfogadott, hogy kutyákon végzett vizsgálatok esetében a 
kezelés el őtt meg kell határozni a kiinduló hematológiai és klinikai bioké ­
miai változókat, rágcsálok vizsgálatánál azonban ez nem szükséges (38). Ha azonban a rendelkezésre álló kiinduló adatok (lásd az 58. bekezdést) nem 
bizonyulnak elegend őnek, megfontolandó ezen adatok meghatározása.
 
PATOLÓGIA  
Autopszia  
47. Általában a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autop ­
sziának kell alávetni, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek 
tartalma. El őírható ugyanakkor (az id őközi elpusztítás céljából bevont 
vagy kísér ő csoportoknál), hogy a mérések csak bizonyos f őbb paraméte ­
rekre, például a neurotoxicitásra vagy immuntoxicitásra korlátozódjanak 
(lásd a 21. bekezdést). Ezeket az állatokat nem kell alávetni boncolásnak 
és az azt követ ő, a következ ő bekezdésekben ismertetett eljárásoknak. A 
jelzőállatok esetében a vizsgálatvezet ő döntésétől függően eseti alapú bonco ­
lásra lehet szükség.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Bizonyos szérum- és a plazmavizsgálatok, f őleg a glükóz meghatározása esetén ajánlatos 
a vizsgálat el őtti éjszaka koplaltatni az állatokat. Ennek f ő indoka az, hogy a vizsgála ­
tokat megel őző koplaltatás mell őzése szükségszer űen növelné a kapott eredmények vari ­
abilitását, ami így megnehezítené a kevésbé jellegzetes hatások felismerését és értelme ­
zését. Meg kell jegyezni azonban, hogy az éjszakai koplaltatás megzavarhatja az állatok 
általános anyagcseréjét és – különösen azon vizsgálatok esetében, amelyeknél a vizsgált 
anyagot a táplálékkal adagolják – megzavarhatja a vizsgált vegyi anyagnak való napi 
expozíciót. Az összes állatot ugyanabban a fiziológiai állapotban kell megvizsgálni, és 
ezért a részletes vagy neurológiai vizsgálatokat lehet őleg más napra kell ütemezni, mint a 
klinikai biokémiai vizsgálatokhoz szükséges mintavételt.
 48. A 47. bekezdés utóbbi részében kivételként megjelölt állatokéin kívül az 
összes állat szerveinek súlyát meg kell mérni. Az összes állat (eltekintve az 
elhullásközeli állapotban lév ő és/vagy a vizsgálat befejeztét megel őzően 
elpusztított egyedekt ől) mellékveséit, agyát, mellékheréit, szívét, veséit, 
máját, petefészkeit, lépét, heréit, pajzsmirigyét (amelyet fixálás után mérünk 
meg a mellékpajzsmirigyekkel együtt) és méhét megfelel ően meg kell tisz ­
títani minden rátapadt szövett ől, és azok nedves súlyát a boncolást követ ően 
a lehető legrövidebb id őn belül meg kell mérni, miel őtt azok kiszáradnának.  
49. Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a kés őbb elvégezni kívánt kórszö ­
vettani vizsgálat szempontjából legmegfelel őbb fixálóanyaggal kell tartósítani 
(40) (a szögletes zárójelben megadott szövetek meg őrzése nem kötelez ő): 
minden makroszkopikus 
elváltozás szív hasnyálmirigy gyomor (el őgyomor, mirigy ­
gyomor) 
mellékvese csíp őbél mellékpajzsmirigy [fogazat] 
aorta éhbél perifériás idegek here agy (beleértve a nagyagy, a 
kisagy és a nyúltvel ő/nyúl­
tagyi híd metszeteit) vese agyalapi mirigy csecsem őmirigy 
vakbél könnymirigy (szem ­
üregen kívüli) prosztata pajzsmirigy 
méhnyak máj végbél [nyelv] 
koaguláló mirigy tüd ő nyálmirigy légcs ő 
vastagbél nyirokcsomók (felszíni 
és mély) ondóhólyag húgyhólyag 
patkóbél eml őmirigy (n ősté­
nyeknél kötelez ő, 
hímeknél csak ha látha ­
tóan kimetszhet ő) harántcsíkolt izom méh (beleértve a méhnyakat) 
mellékhere [fels ő légutak, beleértve 
az orrot, az orrkagylókat 
és az orrmelléküregeket] bőr [húgyvezeték] 
szem (beleértve a retinát) nyel őcső gerincvel ő (három szin ­
ten: nyaki, mellkasi középső és ágyéki 
szakasz) [húgycső] 
[combcsont az ízületi felü ­
lettel együtt] [szaglógumó] lép hüvely 
epehólyag (patkánytól eltér ő 
fajoknál) petefészek [szegycsont] metszet a csontvel őből és/ 
vagy egy friss, csontvel őből 
felszívott minta 
Harder-mirigy
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
tartósítani kell. A klinikai és más jelleg ű megfigyelések alapján további 
testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni 
minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdon ­
ságai alapján valószín űleg célszervnek tekinthet ő. A dermális úton történ ő 
bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történ ő beadásnál 
felsorolt szerveket kell vizsgálni, továbbá a b őrből mintát kell venni a 
beadás helyér ől, és ezt a mintát tartósítani kell. Inhalációs vizsgálatok 
esetében a légz őrendszerb ől származó tartósított és vizsgált szövetek felso ­
rolásának követnie kell az e melléklet B.8. (9) és B.29. fejezetében (10) tett 
ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légz őrendszerb ől 
származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történ ő beadásnál felsorolt 
szerveket kell vizsgálni.  
Kórszövettani vizsgálatok  
50. A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára 
vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (40). Legalább a következ ő 
szöveteket kell kórszövettani vizsgálatnak alávetni:  
— a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó 
összes szövet,  
— a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes 
szövet,  
— a makroszkopikus rendellenességeket mutató összes szövet,  
— a célszöveteket, vagy azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal 
kezelt csoportnál a kezelésnek tulajdonítható elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
 
— páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
vizsgálni kell.  
MEGFIGYELÉSEK (KARCINOGENITÁSI FÁZIS)  
51. Rendszerint a nap elején és végén – beleértve a hétvégéket és az ünnepna ­
pokat is – az összes állatot meg kell vizsgálni, hogy nem mutatja-e megbete ­
gedés jeleit vagy nem hullott-e el. Ezen túlmen ően az állatokat naponta 
egyszer meg kell vizsgálni, hogy mutatnak-e meghatározott, toxikológiai 
szempontból lényeges tüneteket. A gyomorszondát alkalmazó vizsgálatok esetében az állatokat közvetlenül az adagolás után meg kell vizsgálni. 
Külön figyelmet kell fordítani a daganatképz ődésre; minden, szemmel 
látható vagy kitapintható daganat megjelenésének idejét, helyét, méreteit, megjelenési formáját és növekedését fel kell jegyezni.
 
52. A kezelés kezdetekor, az els ő 13 hét során legalább hetente egyszer, ezután 
pedig legalább havonta egyszer meg kell mérni az összes állat testsúlyát. A táplálékfogyasztást és a táplálékhasznosítási képességet a vizsgálat els ő 13 
hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább havonta egyszer kell 
mérni. Ha a vizsgált vegyi anyagot ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást a vizsgálat els ő 13 hetében legalább hetente, azt követ ően pedig legalább 
havonta egyszer kell mérni. A vízfogyasztás mérését olyan vizsgálatok 
esetében is fontolóra kell venni, amelyek során az ivási szokások megvál ­
toznak.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematológiai, klinikai biokémiai és egyéb mérések  
53. A vizsgálatból nyerhet ő lehető legtöbb információ megszerzése érdekében – 
különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos szempontok meghatározása céljából – vérminták vehet ők a hematológiai és klinikai biokémiai vizsgála ­
tokhoz, habár ez a vizsgálatvezet ő döntésén múlik. Vizeletelemzés elvégzése 
is célszer ű lehet. Ezekr ől a paraméterekr ől a vizsgálat rendszerint 12 
hónapig tartó (lásd a 34. bekezdést) krónikus toxicitási fázisában használt állatokra vonatkozó adatok szolgáltatnak információt. Az ilyen minták karci ­
nogenitási vizsgálat részeként történ ő levételének értékére vonatkozó további 
útmutatás a 116. iránymutatásban található (7). Vérminták levétele esetén ezeket a mintákat a vizsgálati id őszak végén kell levenni, közvetlenül az 
állatok elpusztítása el őtt vagy ennek részeként. Vérmintákat meghatározott 
helyről kell venni, például a szívb ől vagy a szemgolyó mögötti üregb ől 
altatás alatt. Vérkenet is készíthet ő vizsgálat céljára, különösen akkor, ha 
a csontvel ő tűnik a célszervnek, bár a vérkenetek karcinogenitási fázisban 
történő ilyen jelleg ű vizsgálatának a karcinogén/onkogén hatás meghatá ­
rozása szempontjából képviselt értéke megkérd őjelezhető (38).
 
PATOLÓGIA  
Autopszia  
54. A jelz őállatok és a kísér ő csoportba tartozó többi állat kivételével (lásd a 20. 
bekezdést) a vizsgálatokba bevont összes állatot teljes kör ű, beható autop ­
sziának kell alávetni, ideértve a következ ők alapos vizsgálatát: a test küls ő 
felszíne, az összes testnyílás, a koponya, a mellüreg, a hasüreg és ezek tartalma. A jelz őállatok és a kísér ő csoportba tartozó többi állat esetében 
a vizsgálatvezet ő döntésétől függően eseti alapú boncolásra lehet szükség. A 
szervek súlyának mérése általában nem képezi a rákkelt ő hatás meghatá ­
rozására irányuló vizsgálatok részét, mivel a geriátriai változások és – a későbbi szakaszokban – a tumorok kifejl ődése zavaró tényez ők lehetnek a 
szervek súlyával kapcsolatos adatok hasznosságát illet ően. Ezek a mérések 
azonban kritikusak lehetnek az adatok bizonyító erejének mérlegelése során 
és különösen a hatásmechanizmussal kapcsolatos megfontolások tekinteté ­
ben. Ha a szervek súlyának mérése kísér ő vizsgálat részét képezi, a mérést 
legkésőbb a vizsgálat megkezdése után egy évvel el kell végezni.
 
55. Az alábbi szöveteket a szövet típusa és a kés őbb elvégezni kívánt kórszö ­
vettani vizsgálat szempontjából legmegfelel őbb fixálóanyaggal kell tartósítani 
(40) (a szögletes zárójelben megadott szövetek meg őrzése nem kötelez ő): 
minden makroszkopikus 
elváltozás szív hasnyálmirigy gyomor (el őgyomor, mirigy ­
gyomor) 
mellékvese csíp őbél mellékpajzsmirigy [fogazat] 
aorta éhbél perifériás idegek here agy (beleértve a nagyagy, a 
kisagy és a nyúltvel ő/nyúl­
tagyi híd metszeteit) vese agyalapi mirigy csecsem őmirigy 
vakbél könnymirigy (szem ­
üregen kívüli) prosztata pajzsmirigy 
méhnyak máj végbél [nyelv] 
koaguláló mirigy tüd ő nyálmirigy légcs ő 
vastagbél nyirokcsomók (felszíni 
és mély) ondóhólyag húgyhólyag
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
patkóbél eml őmirigy (n ősté­
nyeknél kötelez ő, 
hímeknél csak ha látha ­
tóan kimetszhet ő) harántcsíkolt izom méh (beleértve a méhnyakat) 
mellékhere [fels ő légutak, beleértve 
az orrot, az orrkagylókat 
és az orrmelléküregeket] bőr [húgyvezeték] 
szem (beleértve a retinát) nyel őcső gerincvel ő (három szin ­
ten: nyaki, mellkasi 
középső és ágyéki 
szakasz) [húgycső] 
[combcsont az ízületi felü ­
lettel együtt] [szaglógumó] lép hüvely 
epehólyag (patkánytól eltér ő 
fajoknál) petefészek [szegycsont] metszet a csontvel őből és/ 
vagy egy friss, csontvel őből 
felszívott minta 
Harder-mirigy  
Páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
tartósítani kell. A klinikai és más jelleg ű megfigyelések alapján további 
testszövetek vizsgálata is szükséges lehet. A fentieken túl meg kell őrizni 
minden olyan más szervet is, amely a vizsgált vegyi anyag ismert tulajdon ­
ságai alapján valószín űleg célszervnek tekinthet ő. A dermális úton történ ő 
bejuttatást alkalmazó vizsgálatok esetében az orális módon történ ő beadásnál 
felsorolt szerveket kell vizsgálni, továbbá a b őrből mintát kell venni a 
beadás helyér ől, és ezt a mintát tartósítani kell. Inhalációs vizsgálatok 
esetében a légz őrendszerb ől származó tartósított és vizsgált szövetek felso ­
rolásának követnie kell az e melléklet B.8. (8) és B.29. fejezetében (9) tett 
ajánlásokat. Egyéb szervek/szövetek esetében (valamint a légz őrendszerb ől 
származó tartósított szöveteken túl) az orális úton történ ő beadásnál felsorolt 
szerveket kell vizsgálni.  
Kórszövettani vizsgálatok  
56. A toxikológiai patológiai vizsgálatok elvégzésének legjobb gyakorlatára 
vonatkozóan iránymutatás áll rendelkezésre (40). Legalább az alábbi szöve ­
teket kell vizsgálni:  
— a magas dózissal kezelt csoportból és a kontrollcsoportokból származó 
összes szövet,  
— a vizsgálat során elpusztult vagy elpusztított állatokból származó összes 
szövet,  
— a makroszkopikus rendellenességeket, többek között tumorokat mutató 
összes szövet,  
— azon szöveteket, amelyek a legnagyobb dózissal kezelt csoportnál a 
kezelésnek tulajdonítható kórszövettani elváltozásokat mutatnak, az összes többi dóziscsoport összes állatánál meg kell vizsgálni,
 
— páros szervek, például vesék, mellékvesék esetében mind a két szervet 
vizsgálni kell.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS (KARCINOGENITÁS ÉS 
KRÓNIKUS TOXICITÁS)  
Adatok  
57. Az összes értékelt paraméterre vonatkozó adatokat minden egyes állat 
esetében rögzíteni kell. Ezenfelül az összes adatot táblázat formájában össze ­
gezni kell, a vizsgált állatok minden csoportja tekintetében bemutatva, hogy 
hány egyeddel indult a vizsgálat, hány állat pusztult el, illetve hányat kellett 
elpusztítani humánus okokból a vizsgálat során, valamint az elpusztulás vagy humánus okokból való elpusztítás id őpontját, a toxicitás jeleit mutató 
állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ideértve bármely 
toxikus hatás kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát, az elváltozásokat 
mutató állatok számát, az elváltozások típusát és az egyes elváltozástípu ­
sokat mutató állatok százalékos arányát. Az összegz ő adattáblázatoknak 
tartalmazniuk kell a toxikus hatásokat vagy elváltozásokat mutató állatokra 
vonatkozó átlagértékeket és szórásokat (folyamatos vizsgálati adatok eseté ­
ben), valamint az elváltozások osztályozását.
 
58. A vizsgálat eredményeinek értékelése szempontjából hasznosak lehetnek a 
korábbi kontrolladatok, például abban az esetben, ha a párhuzamos kontr ­
ollokból származó adatok vélhet ően lényegesen eltolódottak az ugyanabban 
a vizsgálati létesítményben/kolóniában lév ő kontrollállatoktól származó 
újabb adatokhoz képest. Korábbi kontrolladatok elemzése esetén ugyanazon laboratórium által benyújtott, ugyanolyan korú és ugyanabba a törzsbe tartozó állatokra vonatkozó, az adott vizsgálatot megel őző öt évből kell 
származó adatokat kell felhasználni.
 
59. A számszer ű eredményeket adott esetben megfelel ő és általánosan elfogadott 
statisztikai módszer alkalmazásával kell kiértékelni. A statisztikai módsze ­
reket és az elemezend ő adatokat a vizsgálat tervezése során kell kiválasztani 
(9. bekezdés). A kiválasztás során szükség szerint el ő kell írni a túlélésre 
vonatkozó kiigazításokat.  
60. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— fizikai jelleg, tisztaság, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok,  
— a vegyi anyag származási helye,  
— gyártási szám,  
— kémiai elemzésr ől szóló tanúsítvány.  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag kiválasztásának indokolása (ha az nem víz).  
Kísérleti állatok:  
— a felhasznált faj/törzs, és a választás indokolása,  
— az állatok száma, életkora és neme a vizsgálat kezdetekor,  
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Vizsgálati körülmények:  
— a beadási mód és a dózis kiválasztásának indokolása,  
— az adatok elemzéséhez adott esetben használt statisztikai módszerek,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázására/a takarmány el őkészítésére vonat ­
kozó részletes adatok,  
— a készítmény elért koncentrációjára, stabilitására és homogenitására 
vonatkozó analitikai adatok,  
— a beadási mód és a vizsgált vegyi anyag bejuttatására vonatkozó rész ­
letes adatok,  
— inhalációs vizsgálatok esetében információ arra vonatkozóan, hogy a 
bejuttatás csak orron vagy a teljes testfelületen keresztül történt-e,  
— tényleges dózisok (mg/testsúlykilogramm/nap), valamint a vizsgált vegyi 
anyagnak a takarmányban/ivóvízben meglév ő koncentrációjáról (mg/kg 
vagy ppm) a tényleges dózisra való átszámításhoz használt átszámítási tényező, ha ez alkalmazható,
 
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok.  
Eredmények (az adatok táblázatos összefoglalását és az egyes állatokra 
vonatkozó adatokat is meg kell adni):  
Általános  
— túlélési adatok,  
— testsúly/testsúlyban bekövetkezett változások,  
— takarmányfogyasztás, a táplálékhasznosítási képességgel kapcsolatos 
számítások, ha vannak, valamint adott esetben vízfogyasztás,  
— toxikokinetikai adatok, ha rendelkezésre állnak,  
— oftalmoszkópia (ha rendelkezésre áll),  
— hematológia (ha rendelkezésre áll),  
— klinikai kémia (ha rendelkezésre áll).  
Klinikai leletek  
— toxicitási tünetek,  
— az esetleges rendellenességek el őfordulása (és – ha pontozzuk – azok 
súlyossága),  
— a megfigyelt klinikai tünetek jellege, súlyossága és id őtartama (átmeneti 
vagy állandó).  
Boncolási adatok  
— testsúly elpusztuláskor,  
— szervek súlya és ezek aránya, ha alkalmazható,  
— boncolási eredmények; rendellenességek el őfordulása és súlyossága.  
Kórszövettani vizsgálatok  
— nem neoplasztikus kórszövettani leletek,  
— neoplasztikus kórszövettani leletek,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— a makroszkopikus és mikroszkopikus vizsgálatok leletei közötti össze ­
függés,  
— a kezeléssel összefügg ő összes kórszövettani lelet részletes leírása, bele ­
értve a súlyossági fokokat,  
— a tárgylemezek szakért ői felülvizsgálatáról szóló jelentés.  
Az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható  
Az eredmények tárgyalása, beleértve a következ őket: 
— az esetlegesen alkalmazott modellezési megközelítések tárgyalása,  
— dózis-válasz összefüggések,  
— korábbi kontrolladatok,  
— a hatásmechanizmusra vonatkozó bármely információ figyelembevétele,  
— BMD, NOAEL vagy LOAEL meghatározása,  
— humán relevancia.  
Következtetések  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Prog ­
ramme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445  
(6) E melléklet B.27., Szubkrónikus orális toxicitási vizsgálat, 90 napos, ismé ­
telt adagolású orális toxicitási vizsgálat nem rágcsálókon cím ű fejezete.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ env/testguidelines.
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(9) E melléklet B.8., Szubakut inhalációs toxicitás: 28 napos vizsgálat cím ű 
fejezete.  
(10) E melléklet B.29., Szubkrónikus inhalációs toxicitás: 90 napos vizsgálat 
című fejezete.  
(11) E melléklet B.9., Ismételt adagolású (28 napos) toxicitás (dermális) cím ű 
fejezete.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Moderniza ­
tion of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.  
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.  
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
 
(23) ILSI (International LIFE Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1): 214.  
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.  
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105: 1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU 
irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and 
Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experi ­
ments. ISBN 3-906255-06-9.  
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory 
animals in various housing systems.  
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15-23.
 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appéldául Pharmacol. 108: 267-283.  
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
 
(38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appéldául Toxicol. 29: 198-201.  
(39) EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 
131. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  EGYGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZS ­
GÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincsenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta szájon át, fokozatosan növekv ő 
adagokban adjuk be több kísérleti állatcsoportnak, hímeknek és 
nőstényeknek. A hímeknek a növekedés ideje alatt és legalább 
egy teljes csírasejtképzési cikluson keresztül (egérben megközelí ­
tőleg 56 nap, patkányban 70 nap) kell adni a vizsgált anyagot, 
hogy annak a csírasejtképzésre gyakorolt esetleges kedvez őtlen 
hatása kifejl ődhessen.  
A szülői (P) nemzedék n őstényeinek legalább két teljes párzási 
időszakon keresztül kell adagolni a vizsgált anyagot, hogy annak 
az ivarzási ciklusra gyakorolt esetleges kedvez őtlen hatása kifejl őd­
hessen. Ezután a kísérleti állatokat pároztatják. A vizsgált anyagot a 
párzási id őszak alatt mindkét nemnek adagolni kell, azt követ ően 
csak a nőstényeknek a vemhesség ideje alatt, valamint a szoptatás 
időszakában. Az anyag inhalációs adagolásához a módszer módosí ­
tást igényel.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Nincsenek.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
Az egészséges, fiatal állatokat a vizsgálat megkezdése el őtt véletlen ­
szerű kiválasztással kezelt és kontrollcsoportokba kell beosztani. Az 
állatokat a vizsgálat el őtt legalább öt napon keresztül a vizsgálat 
tartási és takarmányozási körülményei között kell tartani. A vizsgált 
anyag ajánlott adagolási módja: a takarmánnyal vagy az ivóvízzel. Más alkalmazási módok is elfogadhatók. A vizsgált anyagokat vala ­
mennyi állatnak azonos módszerrel kell adagolni a vizsgálat teljes 
időtartama alatt. Ha az adagolás megkönnyítésére viv őanyagot vagy 
más adalékanyagot használnak, meg kell bizonyosodni arról, hogy azok nem rendelkeznek toxikus hatással.
 
Az adagolást heti hét napon kell végezni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2.  A kísérlethez felhasznált állatok  
A faj kiválasztása  
A javasolt faj a patkány vagy az egér. Korábban vizsgálatban még 
részt nem vett, egészséges állatokat kell használni. Ne használjunk rossz termékenység ű törzseket. Az állatokat faj, törzs, nem, súly 
és/vagy kor szerint kell jellemezni.
 
A termékenység megállapítása érdekében mind a hím, mind a 
nőstény állatokat meg kell vizsgálni. Mind a kontroll-, mind a kísér ­
leti csoportban csak az elválasztást követ ően lehet megkezdeni a 
vizsgált anyag adagolását.  
Az állatok száma és neme  
Minden adagolási és kontrollcsoportnak elegend ő állatot kell tartal ­
maznia ahhoz, hogy legalább 20 vemhes, illetve az elléshez közel 
álló nőstény legyen benne.  
A cél az, hogy megfelel ő mennyiség ű vemhességet és utódot 
hozzanak létre ahhoz, hogy felmérhessük az anyag hatását a termé ­
kenységre, a vemhességre és az anyai viselkedésre a szül ői (P) 
nemzedékben, valamint a szopásra, a növekedésre és a fejl ődésre 
az F1 utódnemzedékben a fogamzástól a szoptatástól való elválasz ­
tásig.  
1.6.3.  Vizsgálati körülmények  
Annyi élelmet és vizet kell adni, amennyire csak szükség van (ad 
libitum). Az ellés el őtt a vemhes n őstényeket el kell különíteni, 
elletőketrecekbe kell rakni, és az alom kialakításához használt (fésze ­
képítő) anyaggal is el lehet látni.  
1.6.3.1. A d a g o l á s i s z i n t e k ( d ó z i s o k )  
Legalább három adagolási szintet (dózist) és egy kontrollt kell hasz ­
nálni. Ha az anyag beadásához viv őanyagot alkalmaznak, akkor a 
kontrollcsoportnak a viv őanyagból a felhasznált legnagyobb mennyi ­
séget kell kapnia. Ha a vizsgált anyag csökkent táplálékfelvételt, illetve táplálékhasznosítást vált ki, szükség lehet egy korlátozott etetéssel tartott kontrollcsoport beállítására. Ideális esetben, ha azt a 
vizsgált anyag biológiai, illetve fízikokémiai tulajdonságai lehet ővé 
teszik, a legnagyobb adaggal kezelt csoport szül ő állataiban (P) 
ugyan jelentkeznie kell a toxikus hatásnak, de elhullásnak nem. A közepes adaggal kezelt csoport(ok)ban a vizsgált anyagnak tulajdo ­
nítható toxikus hatás minimális jeleinek kell megjelenni, és az 
alacsony adaggal kezelt csoportban az anyag nem okozhat észreve ­
hető kedvezőtlen hatást sem a szül őknél, sem az utódoknál. Ha az 
állatok gyomorszondával vagy kapszulában kapják az adagot, azt az 
adott állat testsúlyára számítva kell adni, és azt hetente a testsúly 
változásaihoz kell igazítani. A vemhesség alatt a n őstények adagja 
szükség esetén a vemhesség nulladik, illetve hatodik napján mért testsúlyra számítható ki.
 
1.6.3.2. H a t á r é r t é k - v i z s g á l a t  
Alacsony toxicitású anyagoknál, ha az 1 000 mg/testsúlykilogramm, 
illetve az azt meghaladó dózis nem okoz semmilyen zavart a szapo ­
rodási képességben, a többi adagolási szinten végzett vizsgálatok 
szükségtelennek tekinthet ők. Ha a nagy dózissal kezelt csoportban 
az anyára gyakorolt toxikus hatást egyértelm űen mutató el őzetes 
vizsgálatban nem volt észlelhet ő kedvezőtlen hatás a termékenység 
vonatkozásában, akkor a többi adagolási szinten végzett vizsgálat 
szükségtelennek tekinthet ő. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3. A k í s é r l e t v é g r e h a j t á s a  
V i z s g á l a t i ü t e m t e r v  
A szülői (P) nemzedék hímjeinél a napi adagolást az állatok öt- és 
kilenchetes kora között kell megkezdeni, miután a szoptatott állat ­
okat elválasztották, és legalább öt napon keresztül a vizsgálati körül ­
mények mellett tartották. A patkányoknál az adagolást a párzási 
időszak előtt 10 héten át kell folytatni (egér esetében ez az id ő 
nyolc hét). A hímeket vagy a párzási id őszakot követ ően kell elpusz ­
títani és megvizsgálni, vagy a vizsgálati étrend mellett kell azokat 
tovább tartani egy esetleges második alom létrehozásához, majd nem 
sokkal a vizsgálat vége el őtt kell elpusztítani és megvizsgálni. A 
szülői nemzedék (P) n őstényeinél az ötnapos szoktatást követ ően 
kell megkezdeni a vizsgált anyag adagolását, és legalább a párzást 
két héttel megel őző időpontig kell folytatni. A P n őstényeknél a napi 
adagolást folytatni kell az egész, háromhetes párzási id őszak során és 
a vemhesség alatt, amíg az F1 utódnemzedéket el nem választjuk. Az adagolás ütemezése szükséges lehet akkor, ha más információ is 
rendelkezésre áll a vizsgált anyagról, például annak anyagcsere- 
fokozó hatásairól vagy biológiai felhalmozódásáról.
 
P á r o z t a t á s  
A reprodukciós toxicitásvizsgálatokban vagy 1:1 (egy hím-egy 
nőstény) vagy 1:2 (egy hímkét n őstény) párosítást alkalmazhatunk.  
Az 1:1 arányú pároztatás esetén egy n őstényt addig kell ugyanazon 
hímmel együtt tartani, míg teherbe nem esett, vagy három hét időtartamig. A n őstényt minden reggel megvizsgáljuk a sperma 
vagy a hüvelydugó jelenléte szempontjából. A vemhesség nulladik 
napjának azt a napot tekintjük, amikor a hüvelydugó vagy a sperma megtalálható.
 
A sikertelen párokat megvizsgálják annak megállapítása érdekében, 
hogy mi az oka a terméketlenségnek.  
Ez adott esetben azt jelentheti, hogy tovább kell pároztatni az állatot 
olyan hímekkel vagy anyaállatokkal, amelyek termékenységér ől már 
meggyőződtek, illetve a szaporítószerveket mikroszkóppal megvizs ­
gálják, illetve az ivarzási ciklust vagy az ondóképz ődést ellen őrzik. 
A l o m s z á m  
A termékenységi vizsgálat alatt kezelt állatokat a szokványos módon 
hagyják megelleni, és bárminem ű külső beavatkozás nélkül hagyják, 
hogy utódaikat az elválasztásig neveljék.  
Ha standardizálunk, az alábbi eljárás javasolt. Az ellés utáni els ő és 
negyedik nap között módosíthatjuk az egyes almok egyedszámát a létszám fölötti kölykök eltávolításával, hogy az eredmény – ameny ­
nyire lehetséges – almonként négy hím és négy n őstény utód legyen.
 
Ha a hím és n őstény utódok száma nem teszi lehet ővé a nemenként 
négy azonos nem ű utódot tartalmazó almok kialakítását, részleges 
kiegyenlítés is elfogadható (például öt hím és három n őstény). A 
nyolcnál kevesebb egyedet számláló almokban a kiegyenlítés nem 
lehetséges.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4.  Megfigyelések  
A vizsgálati id őszak folyamán minden állatot naponta legalább 
egyszer meg kell figyelni. Feljegyzést kell készíteni a lényeges magatartászavarokról, az elhúzódó vagy nehéz ellés jeleir ől, valamint 
a toxikus hatásra utaló minden egyéb tünetr ől, beleértve az elhullást 
is. A pároztatás el őtt és a pároztatási id őszak alatt a takarmányfo ­
gyasztást naponta kell mérni. Az ellés után és a szoptatás alatt a takarmányfogyasztás mérését (és az ivóvízfogyasztás mérését, ha a 
vizsgált anyagot az ivóvízben adtuk be) ugyanazon a napon kell 
elvégezni, mint az utódok testsúlymérését. A P generáció hímjeinek és nőstényeinek testsúlyát az adagolás megkezdésének napján kell 
megmérni, és ezt követ ően hetente meg kell ismételni a mérést. E 
megfigyeléseket minden feln őtt állatnál egyedenként kell rögzíteni.
 
A terhességi (gesztációs) id őszakot a vemhesség nulladik napjától 
kell számolni. Minden utódot az ellést követ ően a lehet ő leghama ­
rabb meg kell vizsgálni, és meg kell állapítani a kicsinyek számát és 
nemét, a halvaszületések arányát, valamint a durva rendellenességek jelenlétét.
 
A halva született és a negyedik napig elpusztított utódokat meg kell 
őrizni, és meg kell vizsgálni az esetleges születési rendellenességek 
szempontjából. Az él ő utódokat az ellést követ ő reggelen meg kell 
számolni és testsúlymérést is kell végezni, majd ezt meg kell ismé ­
telni előbb a negyedik és hetedik napon, majd a vizsgálat végéig 
hetente, egyedileg mérve az állatokat.  
Az anyaállatokon vagy az utódokon észlelt fizikai és magatartásbeli 
rendellenességeket fel kell jegyezni.  
1.6.5.  Kórtan  
1.6.5.1. A u t o p s z i a  
A P generációhoz tartozó állatokat, ha azokat elpusztítják, illetve 
azok elpusztulnak a vizsgálat során, makroszkópos vizsgálatnak kell alávetni rendellenességeket vagy patológiás elváltozásokat keresve, különös tekintettel a szaporodási rendszer szerveire. Az 
elhullott, illetve haldokló kicsinyeket a rendellenességek szempont ­
jából kell megvizsgálni.
 
1.6.5.2. K ó r s z ö v e t t a n  
A P generációhoz tartozó állatok petefészkeit, méhét, méhnyakát, 
hüvelyét, heréit, mellékheréjét, ondóhólyagját, prosztatáját, alvadék ­
képző mirigyét, agyalapi mirigyét és cél szervét/cél szerveit el kell 
tenni mikroszkópos vizsgálatok céljaira. Abban az esetben, ha más, többféle dózissal végzett vizsgálatokban e szerveknek a vizsgálata nem történt meg, akkor valamennyi nagy adaggal kezelt és kont ­
rollállat szóban forgó szerve esetében el kell végezni a mikroszkópos 
vizsgálatot, és – ha a gyakorlatban megoldható – ugyanez vonatkozik a menet közben elpusztult állatokra is.
 
Azon szerveket, amelyek az említett állatokban rendellenességeket 
mutatnak, a továbbiakban az összes többi P állatban is meg kell 
vizsgálni. Ezen esetekben az összes olyan szövetet mikroszkópos szövettani vizsgálatnak kell alávetni, amelyeken felt űnő kóros elvál ­
tozások mutatkoztak. Amint az a pároztatási eljárások ismertetése 
során javasolt volt, a feltehet ően terméketlen állatok szervei esetében 
is elvégezhet ő a mikroszkópos vizsgálat.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely minden 
vizsgálati csoportban megadja az állatok számát a vizsgálat kezdetén, a termékeny hím állatok számát, a vemhes n őstények számát, az 
elváltozások típusait és az egyes elváltozási fajtákat mutató állatok 
százalékos arányát.
 
Az eredményeket megfelel ő statisztikai módszerrel kell értékelni. 
Bármely elfogadott statisztikai módszer használható.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— felhasznált faj, törzs,  
— a toxikus reakciók adatai nemenként és dózisonként, beleértve a 
termékenységet, a gesztációs id őt és az életképességet is,  
— az elhullás ideje a vizsgálat során, illetve, hogy az állatok 
megélték-e az elpusztítás tervezett id őpontját, illetve a vizsgálat 
végét,  
— egy táblázat az utódok súlyáról, a kicsinyek átlagos súlyáról, 
valamint a vizsgálat végén az egyes utódok súlyáról,  
— a szaporodásra, az utódokra, illetve a születés utáni fejl ődésre 
gyakorolt toxikus és egyéb hatások leírása,  
— az egyes mérgezési tünetek megfigyelésének id őpontja és a 
megfigyelést követ ő változásuk,  
— testsúlyadatok a P generációnál,  
— boncolási leletek,  
— valamennyi mikroszkópos lelet részletes leírása,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ahol lehetséges,  
— az eredmények megvitatása,  
— az eredmények értelmezése.  
3.2. ÉRTÉKELÉS ÉS ÉRTELMEZÉS  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  KÉTGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSVIZS ­
GÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer az OECD TG 416 (2001) módszer megfelel ője. 
1.1. BEVEZETÉS  
E kétgenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálati módszer segít ­
ségével általános információk nyerhet ők egy vizsgálandó anyagnak 
a hím és n ői szaporítórendszer épségére és teljesít őképességére, 
ezen belül az ivarmirigyek m űködésére, az ivari ciklusra, a párzási 
viselkedésre, a fogantatásra, a vemhességre, az ellésre, a szopta ­
tásra és az elválasztásra, valamint az utódok növekedésére és fejl ő­
désére gyakorolt hatásaival kapcsolatosan. A vizsgálat emellett információkat nyújthat a vizsgálandó anyagnak az újszülött kori 
morbiditásra, mortalitásra gyakorolt hatásaival kapcsolatosan, 
előzetes adatokat szolgáltathat a prenatális és posztnatális fejl ődési 
toxicitásról, illetve útmutatóként szolgálhat a kés őbbi vizsgála ­
tokhoz is. Az F1 generáció növekedésének és fejl ődésének tanul ­
mányozásán kívül e vizsgálati módszer segítségével a hím és n ői 
szaporítórendszer épsége és teljesít őképessége, valamint az F2 
generáció növekedése és fejl ődése is tanulmányozható. A fejl ődési 
toxicitással és a funkcionális defektusokkal kapcsolatban további 
információk úgy szerezhet ők, ha ezt az eljárást adott esetben a 
fejlődési toxicitási és/vagy fejl ődési neurotoxicitási módszereket 
segítségül híva további vizsgálati protokollokkal egészítik ki, de az említett végpontok a megfelel ő vizsgálati módszerek alkalmazá ­
sával külön vizsgálatokban is tanulmányozhatók.
 
1.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó anyagot fokozatosan növekv ő dózisokban kell 
adagolni hím és n őstény állatok több csoportjának. A P generációba 
tartozó hímeknek egyrészt a növekedés során, másrészt legalább egy 
teljes spermaképz ődési ciklus során (egérben körülbelül 56 nap, 
patkányban pedig körülbelül 70 nap) kell adagolni az anyagot ahhoz, hogy bármilyen, a spermaképz ődésre gyakorolt káros hatást ki 
lehessen váltani. A spermára gyakorolt hatásokat egy sor spermap ­
araméter (pl. spermamorfológia és -motilitás), valamint szövetprepa ­
rátumok és részletes kórszövettani vizsgálatok segítségével kell meghatározni. Ha rendelkezésre állnak megfelel ő időtartamú, pl. 
legalább 90 napos ismételt dózisú vizsgálatokból származó, a sper ­
maképződéssel kapcsolatos adatok, a P generációba tartozó hímeket 
nem kell bevonni az értékelésbe. A spermamintákat vagy az azokról készült digitális felvételeket azonban ajánlatos az esetleges kés őbbi 
értékelések céljára meg őrizni, illetve elmenteni. A P generációba 
tartozó n őstényeknek egyrészt a növekedés során, másrészt több 
teljes ivari ciklus során kell adagolni a vizsgálandó anyagot ahhoz, hogy észlelhet ők legyenek az ivari ciklus szabályosságára kifejtett 
esetleges káros hatások. A vizsgálandó anyagot a párzás és az 
ennek eredményeként létrejöv ő vemhesség során, s őt egészen az 
F1 utódok elválasztásának ideje alatt is kell adagolni a szül őknek 
(azaz a P generációba tartozó állatoknak). Az elválasztáskor a keze ­
lést az F1 utódokon kell folytatni, egészen feln őtté válásukig, párzá ­
sukig, illetve az F2 generáció létrejöttéig, amíg meg nem történik az 
F2 generáció elválasztása.
 
Minden állaton klinikai megfigyeléseket és kórbonctani vizsgálatokat 
kell végezni a toxicitás jeleinek kimutatása érdekében, és külön 
hangsúlyt kell fektetni a hím és n ői szaporítórendszer épségére és 
teljesítőképességére, valamint az utódok növekedésére és fejl ődésére.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.3.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A vizsgálatok céljára a preferált állatfaj a patkány. Ett ől eltérő fajok 
alkalmazását megfelel ően indokolni kell, és a megfelel ő módosítá ­
sokra is szükség lesz. Nem szabad olyan törzseket alkalmazni, 
amelyek kevéssé termékenyek, vagy amelyekben magas a fejl ődési 
defektusok el őfordulási gyakorisága. A vizsgálat megkezdésekor az 
egyes kísérleti állatok testtömegének csak minimális mértékben 
szabad különböznie egymástól, és egyik ivar esetében sem térhet 
el 20 %-nál magasabb mértékben az ivar átlagától.  
1.3.2.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
A kísérleti helyiség h őmérsékletének 22  o C (± 3  o C)-nak kell lennie. 
Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 
70 %-ot, a célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás 
legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. Az etetéshez standard laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A 
takarmány megválasztását az is befolyásolhatja, hogy ha a vizs ­
gálandó anyagot táplálékkal adják be, akkor azok megfelel ő módon 
keveredjenek el egymással.
 
Az állatok egyedileg vagy azonos ivarú egyedekb ől álló kisebb 
csoportokban is tarthatók. A pároztatásokat erre a célra alkalmas 
ketrecekben kell végezni. Ha meggy őződtek a párzás megtörténtér ől, 
a pároztatott n őstényeket egyedileg kell elhelyezni ellet ő vagy fiaz ­
tató ketrecekben. A pároztatott patkányokat kis csoportokban is lehet tartani, de az ellés el őtt egy vagy két nappal külön kell választani 
őket. Az ellés közeledtével a pároztatott állatok számára megfelel ő és 
meghatározott fészekrakó anyagot kell biztosítani.
 
1.3.3.  Az állatok el őkészítése  
Legalább 5 napon át a laboratórium körülményeihez szoktatott, 
egészséges állatokat kell alkalmazni, amelyek korábban nem voltak más kísérletnek alanyai. A kísérleti állatok jellemzésekor meg kell 
adni az állat faját, törzsét, származását, ivarát, testtömegét és/vagy 
életkorát. Ismerni kell, hogy mely állatok között áll fenn testvéri viszony, hogy elkerülhet ő legyen ezek pároztatása. Az állatokat 
véletlenszer űen kell beosztani a kontroll- és a kezelési csoportokba. 
A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csök ­
kenteni a ketrec elhelyezése jelentette lehetséges hatásokat. Minden állatot egyedi azonosító számmal kell ellátni. A P generáció esetében ezt még a kezelés megkezdése el őtt meg kell tenni. Az F1 generáció 
esetében a kés őbbi pároztatásra kiválasztott állatokat az elválasz ­
táskor egyedi azonosítóval kell ellátni. Minden kiválasztott F1 állat esetében meg kell őrizni azokat az adatokat, amelyek rögzítik, hogy 
az állat melyik alomból származik. Ha az utódok testtömegének 
mérését vagy bármely más funkcionális vizsgálat elvégzését is fonto ­
lóra veszik, akkor ajánlatos a születés után a lehet ő leghamarabb 
azonosítóval ellátni a kölyköket.
 
A kezelés megkezdésekor a szül őknek (P generáció) körülbelül 5–9 
hetesnek kell lenniük. Amennyire csak megoldható, az állatoknak az 
összes vizsgálati csoportban nagyjából azonos testtömeg űnek és 
korúnak kell lenniük.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. ELJÁRÁS  
1.4.1.  Az állatok száma és ivara  
Minden kezelési és kontrollcsoportban elegend ő számú állatnak kell 
lennie ahhoz, hogy az elléskor vagy akörül lehet őleg legalább 20 
vemhes n őstény tartozzon egy-egy csoportba. A kezeléssel összefüg ­
gésben nemkívánatos hatásokat (pl. sterilitást vagy magas dózisban túlzott toxicitást) kiváltó anyagok esetében el őfordulhat, hogy ezt 
nem lehet megoldani. A cél az, hogy elegend ő számú vemhesség 
jöjjön létre az anyagnak a termékenységre, a vemhességre, az 
anyai viselkedésre és szoptatásra, az F1 utódoknak a fogantatástól az ivarérettségig történ ő növekedésére és fejl ődésére, valamint az F2 
utódoknak az elválasztásig tartó id őszakban történ ő fejlődésére 
gyakorolt esetleges hatások értékeléséhez. Nem feltétlenül teszi érvénytelenné tehát a vizsgálatot az, ha nem lehet megoldani, hogy a kívánt számú (azaz 20) vemhes állat álljon rendelkezésre, és ennek 
jelentőségét minden egyes esetben külön-külön kell értékelni.
 
1.4.2.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgálandó anyagot ajánlatos orálisan adagolni (a táplálékkal, az 
ivóvízzel vagy mesterséges táplálással), kivéve, ha más beadási 
módot (pl. dermális vagy inhalálásos alkalmazást) tartanak megfele ­
lőbbnek.  
Ahol szükséges, a vizsgálandó anyagot megfelel ő vivőanyagban kell 
feloldani vagy szuszpendálni. Ahol lehet, els ősorban vizes oldatot/ ­
szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (pl. kukorica ­
csíra-olajban elkészített) oldatot vagy emulziót, és csak harmad ­
sorban más viv őanyagokban elkészített oldatot. A vízt ől eltérő vivő­
anyagok esetében ismerni kell a viv őanyag toxikus jellemz őit. Meg 
kell határozni továbbá azt is, hogy a vizsgálandó anyag mennyire 
stabil az adott viv őanyagban.  
1.4.3.  Adagolás  
Legalább három dózist és ezzel párhuzamos kontrollt kell alkal ­
mazni. Hacsak a vizsgálandó anyag fizikai-kémiai jellege vagy biológiai hatásai nem szabnak ennek határt, a legmagasabb dózist úgy kell megválasztani, hogy toxicitást idézzen el ő, de ne okozzon 
elhullást vagy súlyos szenvedést. Váratlan elhullások esetén, ha a 
szülői (P) generáció elhullási aránya alacsonyabb, mint körülbelül 
10 százalék, a vizsgálat még általában elfogadható. A dózisok csökkenő sorrendjét úgy kell megválasztani, hogy kimutathatók 
legyenek az esetleges dózisfügg ő hatások és a nem észlelhet ő 
káros hatás szintje (NOAEL). A csökken ő dózisszintek meghatá ­
rozásához gyakran optimális a 2–4-szeres intervallumok alkalma ­
zása, és nagyon nagy intervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzó ­
faktor) alkalmazása esetén gyakran el őnyös a dózisok közé egy 
negyedik vizsgálati csoportot is beiktatni. A táplálékkal való beadást alkalmazó vizsgálatok esetében a dózisintervallum nem lehet háromszorosnál nagyobb. A dózisszinteket a korábbi toxici ­
tási adatok és különösen az ismételt dózisú vizsgálatok eredménye ­
inek figyelembevételével kell megválasztani. A vizsgálandó vegyület és a szerkezetileg rokon anyagok metabolizmusával és kinetikájával kapcsolatban rendelkezésre álló összes információt is 
figyelembe kell venni. Ezek az információk segítik majd az adago ­
lási rend megfelel ő voltának igazolását is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
A kontrollcsoport egy kezeletlen csoport, vagy ha a vizsgálandó 
anyag beadásához viv őanyagot használnak, akkor egy viv őanyaggal 
kezelt kontrollcsoport. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizs ­
gálandó anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lév őket. Vivőanyag alkalmazása 
esetén a kontrollcsoportban a legnagyobb alkalmazott mennyiségben 
kell beadni a viv őanyagot. Ha a vizsgálandó anyagot a táplálékkal 
adják be, és emiatt csökken a táplálékfogyasztás vagy hasznosítás, akkor szükség lehet egy párban etetett kontrollcsoport alkalmazására 
is. A párhuzamos párban etetett kontrollcsoport helyett felhasznál ­
hatók olyan kontrollcsoportokkal végzett vizsgálatokból származó adatok is, amelyek célja a csökkent táplálékfogyasztás reproduktív paraméterekre gyakorolt hatásának értékelése.
 
A vivőanyagok vagy egyéb adalékok esetében a következ ő jellem­
zőket kell figyelembe venni: a vizsgálandó anyag felszívódására, 
eloszlására, metabolizmusára vagy visszatartására gyakorolt hatások; 
a vizsgálandó anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatások, 
amelyek módosíthatják annak toxikus jellemz őit; valamint az állatok 
táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások.
 
1.4.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egy egyetlen, legalább 1 000 mg/testtömeg-kg/nap orális dózis 
felhasználásával végzett, vagy táplálékkal vagy ivóvízzel történ ő 
beadás esetén a táplálékban vagy ivóvízben ezzel egyenérték ű száza­
lékos arány alkalmazásával történ ő és az itt ismertetett eljárások 
szerint lefolytatott vizsgálat sem a szül őkben, sem utódaikban nem 
idéz elő észlelhet ő toxicitást, és ha a szerkezetileg és/vagy metabo ­
lizmus szempontjából rokon vegyületekkel kapcsolatos adatok alapján nem várható toxicitás, megfontolható a több dózisszinttel 
végzett teljes vizsgálat elhagyása. Határérték-vizsgálatot kell minden 
esetben alkalmazni, kivéve, ha a humán expozíció magasabb orális dózis alkalmazását teszi szükségessé. Más típusú beadási módok, így 
például inhalálás vagy dermális alkalmazás esetén a vizsgálandó 
anyag fizikai-kémiai tulajdonságai – így például oldhatósága – gyakran el őre jelezhetik, illetve korlátozhatják a lehetséges expozí ­
ciós szint maximumát.
 
1.4.5.  A dózisok beadása  
Az állatoknak a hét minden napján adagolni kell a vizsgálandó 
anyagot. A preferált beadási mód az orális (táplálékkal, ivóvízzel vagy mesterséges táplálással történ ő bevitel). Az ett ől eltérő beadási 
módok használatát meg kell indokolni, és ennek megfelel ő módosí­
tásokra is szükség lehet. A megfelel ő hosszúságú kísérleti id őszak 
során minden állatnak azonos módszerrel kell beadni az anyagot. Ha a vizsgálandó anyagot mesterséges táplálással juttatják be, gyomor ­
szondát kell alkalmazni. Az egyszerre beadott folyadéktérfogat nem 
haladhatja meg az 1 ml/100 g testtömegarányt (kukoricacsíra-olajban 
történő adagolás esetén a maximum a 0,4 ml/100 g testtömegarány), 
kivéve vizes oldatok esetében, amikor 2 ml/100 g testtömegarány is alkalmazható. Az irritáló vagy korróziós hatású anyagok kivételével, 
amelyek esetében a magasabb koncentrációk súlyosabb hatásokat 
okoznak, minimálisra kell csökkenteni a térfogatbeli eltéréseket, amihez a koncentrációt kell úgy beállítani, hogy minden dózisszinten állandó térfogatot lehessen biztosítani. A mesterséges táplálást alkal ­
mazó vizsgálatokban a kölykök általában mindaddig csak közvetve, 
az anyatejen keresztül kapják a vizsgálandó anyagot, amíg az elvá ­
lasztáskor meg nem kezd ődik a közvetlen adagolás. A táplálékkal 
vagy ivóvízzel történ ő adagolást alkalmazó vizsgálatok esetében a 
kölykök közvetlenül is megkapják a vizsgálandó anyagot, amikor a 
szoptatási id őszak utolsó hetében önállóan is elkezdenek táplálkozni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
A táplálékkal vagy ivóvízzel bejuttatott anyagok esetében fontos, 
hogy a vizsgálandó anyag mennyisége ne zavarja a normál táplálko ­
zást vagy vízháztartást. Ha a vizsgálandó anyagot táplálékkal juttatják be, vagy a táplálékbeli koncentrációt (ppm), vagy pedig az állat testtömegére számított dózist kell állandó értéken tartani, 
és meg kell adni, hogy melyik alternatívát alkalmazzák. A mester ­
séges táplálással bejuttatott anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló id őszakában kell beadni, és legalább hetente újra be kell 
állítani ahhoz, hogy az állat testtömegéhez viszonyítva állandó 
értéken lehessen tartani. A mesterséges táplálással bejuttatott és test ­
tömegen alapuló dózis beállításakor figyelembe kell venni a méhle ­
pénybeli eloszlással kapcsolatos információkat is.
 
1.4.6.  A kísérleti program  
A P generációba tartozó hímek és n őstények napi kezelését 5–9 hetes 
korukban kell elkezdeni. Az F1 hímek és n őstények napi kezelését az 
elválasztáskor kell elkezdeni; nem szabad megfeledkezni arról, hogy ha vizsgálandó anyagot táplálékkal vagy ivóvízzel adagolják, az F1 utódok közvetlen expozíciója már a szoptatási id őszakban megkez ­
dődhet. Az adagolást mindkét ivar (P és F1) esetében legalább 10 
héten át folytatni kell a párzási id őszak előtt. Az adagolást a 2 hetes 
pároztatási id őszakban sem szabad abbahagyni egyik ivar esetében 
sem. Amikor a reproduktív hatások értékelése szempontjából már 
nincs szükség a hím állatokra, humánus módon exterminálni kell 
őket, és megvizsgálni. A szül ői (P) generációba tartozó n őstények 
esetében az adagolást a vemhesség ideje alatt is folytatni kell, 
egészen az F1 generáció elválasztásáig. Fontolóra kell venni az 
adagolási rend módosítását a vizsgálandó anyaggal, ezen belül a meglévő toxicitási adatokkal, az anyagcsere fokozódásával vagy 
biológiai felhalmozódással kapcsolatban rendelkezésre álló informá ­
ciók alapján. Az egyes állatoknak beadandó dózist általában a 
legutóbbi testtömegmérés eredménye alapján kell meghatározni. A vemhesség utolsó trimeszterében azonban óvatosan kell eljárni a dózis beállításakor.
 
A P és F1 hímek és n őstények kezelését exterminálásukig kell foly ­
tatni. Minden feln őtt P és F1 hímet és n őstényt humánus módon 
exterminálni kell, ha már nincs rájuk szükség a reproduktív hatások 
értékeléséhez. Az elválasztás után a pároztatásra ki nem választott F1 
utódokat és minden F2 utódot humánus módon exterminálni kell elválasztásukat követ ően.
 
1.4.7.  A pároztatási eljárás  
1.4.7.1.  A szül ői (P) generáció pároztatása  
Minden egyes pároztatáskor a n őstényt egy azonos dózissal kezelt 
hímmel kell összerakni (1:1 pároztatás), és addig kell együtt hagyni őket, amíg a párzás meg nem történik, vagy 2 hét el nem telik. 
Minden nap meg kell vizsgálni, hogy a n őstényben észlelhet ő-e 
ondó vagy hüvelydugó. A vemhesség 0. napja definíció szerint az 
a nap, amikor hüvelydugó vagy ondó figyelhet ő meg a n őstényben. 
Ha a pároztatás sikertelen volt, fontolóra kell venni a n őstények 
újrapároztatását egy azonos csoportbeli és már sikeresen pároztatott 
hímmel. Az adatok között egyértelm űen fel kell tüntetni a pároztatott 
párokat. Kerülni kell a testvérek pároztatását.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  F1 pároztatás  
Az F1 utódok pároztatásakor minden alomból legalább egy hím és 
egy nőstény állatot kell kiválasztani az elválasztáskor, hogy kés őbb 
egy másik alomból származó, de azonos csoportba tartozó állattal 
pároztatva létrejöjjön az F2 generáció. A kölykök kiválasztását 
minden egyes alomban véletlenszer űen kell elvégezni, feltéve, 
hogy nincs szignifikáns különbség az egy alomba tartozó állatok testtömege vagy küls ő megjelenése között. Ha azonban van különb ­
ség, akkor minden alomból a legreprezentatívabb egyedet kell kivá ­
lasztani. A gyakorlatban ezt a testtömeg alapján lehet a legjobban elvégezni, de esetenként megfelel őbb lehet a küls ő megjelenés 
alapján tenni ezt. Mindaddig nem szabad pároztatni az F1 utódokat, 
amíg teljesen ivaréretté nem válnak.
 
Az utód nélküli pároknál meg kell vizsgálni a látszólagos terméket ­
lenség okát. Ennek keretében lehet őség biztosítható számukra más 
olyan hímekkel vagy n őstényekkel való párzásra, amelyeket már 
sikeresen pároztattak, vagy el lehet végezni a szaporítószervek 
mikroszkópos vizsgálatát, vagy meg lehet vizsgálni az ivari ciklust vagy a spermaképz ődést.
 
1.4.7.3.  Második pároztatás  
Bizonyos esetekben, így például ha az alomméret a kezeléssel össze ­
függésben megváltozik, vagy ha az els ő pároztatáskor nem egyér ­
telmű hatásokat figyelnek meg, ajánlatos a feln őtt P és F1 állatokat 
újrapároztatni, és így egy második almot kialakítani. Ajánlatos újra ­
pároztatni azokat a hímeket és n őstényeket is, amelyek bizonyítottan 
nemzőképes ellenkez ő nemű partnerekkel sem hoztak utódokat. Ha a 
két generáció bármelyikében szükségesnek látszik egy második alom 
kialakítása, az állatokat körülbelül egy héttel az utolsó alom elvá ­
lasztása után kell újrapároztatni.  
1.4.7.4.  Az alom mérete  
Hagyni kell, hogy az állatok a szokásos módon elljék és neveljék 
utódaikat az elválasztásig. Az alomméret standardizálása nem köte ­
lező. Ha azonban elvégezzük a standardizálást, részletesen ismertetni 
kell az erre alkalmazott módszert.  
1.5. MEGFIGYELÉSEK  
1.5.1.  Klinikai megfigyelések  
Minden nap klinikai megfigyelést kell végezni, és a mesterséges 
táplálással való adagolás beadás id őpontjának meghatározásakor azt 
is figyelembe kell venni, hogy a beadás után a hatások várhatóan mikor érik el a maximumukat. A viselkedésbeli változásokat, a nehéz 
vagy hosszan tartó ellés jeleit és a toxicitás minden tünetét rögzíteni 
kell a jegyz őkönyvben. Legalább hetente egyszer alaposabban is meg 
kell vizsgálni az állatokat, célszer űen akkor, amikor a testtömegmé ­
résre kerül sor. Naponta kétszer, illetve a hétvégeken adott esetben 
naponta egyszer meg kell vizsgálni az állatokat megbetegedés és 
elhullás szempontjából.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  A szül ők testtömege, valamint táplálék- és vízfogyasztása  
A kezelés els ő napján, majd azt követ ően legalább hetente egyszer 
meg kell mérni a szül ők (P és Fl) testtömegét. Az anyaállatokat (P és 
F1) legalább a vemhesség 0., 7., 14. és 20. vagy 21. napján kell 
megmérni, a szoptatás id őszakában pedig ugyanazokon a napokon, 
amikor az utódokat is megmérik, valamint az állatok exterminálá ­
sának napján is. A megfigyeléseket minden egyes feln őtt állat 
esetében külön-külön kell rögzíteni. A pároztatás el őtti időszakban 
és a vemhesség alatt legalább hetente meg kell mérni a táplálékfo ­
gyasztást. Ha a vizsgálandó anyagot az ivóvízzel adagolják, legalább hetente egyszer a vízfogyasztást is meg kell mérni.
 
1.5.3.  Ivari ciklus  
Az ivari ciklus hosszát és szabályosságát hüvelykenet alkalmazásával 
kell meghatározni a P és F1 n őstényekben a pároztatás el őtt és adott 
esetben a pároztatás során mindaddig, amíg be nem bizonyosodik, 
hogy párzás történt. A hüvelyi/méhnyaki sejtek vétele során vigyázni 
kell arra, hogy meg ne sérüljön a nyálkahártya, és ezáltal nehogy álvemhesség alakuljon ki (1).
 
1.5.4.  Spermaparaméterek  
A vizsgálat befejezésekor minden P és F1 hím esetében meg kell 
mérni a here és a mellékhere, valamint a kórszövettani vizsgálatokra megőrzött minden szerv közül az egyiknek a tömegét (lásd 1.5.7. és 
1.5.8.1. szakasz). A P és F1 hímek minden egyes csoportjából egy- 
egy, legalább tíz hímb ől álló részhalmaz esetében a megmaradó 
heréket és mellékheréket a homogenizálásnak ellenálló spermatidák és mellékhere farki részében tárolt ondósejtek számlálására kell felhasználni. A hímek ugyanezen részhalmazában spermát kell gy űj­
teni a mellékhere farki részéb ől vagy az ondóvezetékb ől, amelyet a 
spermamotilitás és -morfológia vizsgálatára kell felhasználni. Ha kezeléssel összefügg ő hatásokat észlelnek, vagy ha más vizsgálatok 
eredményei a spermaképz ődésre gyakorolt lehetséges hatásokra utal ­
nak, a sperma értékelését az összes dóziscsoportban minden hímben 
el kell végezni; egyéb esetben elegend ő lehet, ha a számlálást csak a 
kontroll- és a magas dózissal kezelt P és F1 hímekben végzik el.
 
Meg kell határozni a herében lév ő homogenizálásnak ellenálló sper ­
matidák és a mellékhere farki részében található ondósejtek teljes számát (2) (3). A mellékhere farki részében lév ő ondókészlet nagy ­
ságát a kvalitatív értékelésekhez használt szuszpenzióban lév ő ondó 
koncentrációja és mennyisége, valamint a fennmaradt mellékhere farki részéb ől kinyert szövet ezt követ ő darálásával és/vagy homo ­
genizálásával kinyert ondósejtek száma alapján lehet meghatározni. 
Az összes kezelési csoportban közvetlenül az exterminálás után kell 
elvégezni a számlálást a hímek e kiválasztott részhalmazában, kivéve, ha video- vagy digitális felvételt készítenek, vagy ha a mintákat kés őbbi elemzésig lefagyasztják. Ilyen esetekben a kontroll- 
és a magas dózissal kezelt csoportot célszer ű először megvizsgálni. 
Ha nem észlelhet ő kezeléssel összefügg ő hatás (pl. az ondósejt ­
számra, valamint a motilitásra és morfológiára gyakorolt hatás), a többi dóziscsoportot nem kell megvizsgálni. Ha a magas dózissal 
kezelt csoportban kezeléssel összefügg ő hatásokat észlelünk, akkor 
az alacsonyabb dóziscsoportokat is meg kell vizsgálni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Az exterminálás után azonnal értékelni kell vagy videofelvételen 
rögzíteni kell a mellékheréb ől (vagy ondózsinórból) kinyert ondó ­
sejtek motilitását. A spermát a károsodások minimális szintre szorí ­
tása mellett kell kinyerni, majd elfogadható módszerek segítségével kell hígítani a motilitásvizsgálathoz (4). Az el őre haladó mozgást 
mutató ondósejtek százalékos arányát vagy szubjektíven, vagy objek ­
tíven kell meghatározni. Ha számítógéppel támogatott motilitásvizs ­
gálatot alkalmaznak (5) (6) (7) (8) (9) (10), az el őre haladó mozgás 
levezetése az átlagos pályasebesség és egyenes vonalú mozgás vagy 
lineáris index felhasználó által beállított küszöbértékein alapul. Ha a 
boncoláskor a mintákról videofelvételt (11) készítenek, vagy a képeket más módon rögzítik, esetleg csak a kontroll- és a nagy dózissal kezelt P és F1 hímek esetében kell további elemzést 
végezni, kivéve ha kezeléssel összefügg ő hatásokat észlelnek; 
ebben az esetben ugyanis az alacsonyabb dózissal kezelt csoportokat is értékelni kell. Videofelvétel vagy digitális képek hiányában a boncoláskor az összes kezelési csoportba tartozó valamennyi állat 
mintáját ki kell elemezni.
 
Egy mellékheréb ől (vagy ondóvezetékb ől) származó spermaminta 
morfológiai értékelését is el kell végezni. Az ondósejteket (mintán ­
ként legalább 200-at) fixált nedves preparátum (12) formájában kell megvizsgálni, és normálnak vagy rendellenesnek kell min ősíteni. A 
morfológiai sperma-rendellenességek közé tartoznak például a fúzió, 
az izolált fejek és a torz fej és/vagy farok. Az értékelést a hímeknek 
az egyes dóziscsoportból kiválasztott részhalmazán, az állatok exter ­
minálása után azonnal, vagy a video- vagy digitális felvételek alapján 
egy későbbi időpontban kell elvégezni. Fixálás után a keneteket is el 
lehet tenni kés őbbi elemzésre. Ilyen esetekben a kontroll- és magas 
dózissal kezelt csoportokat célszer ű először megvizsgálni. Ha nem 
észlelnek kezeléssel összefügg ő hatásokat (pl. az ondósejtek morfo ­
lógiájára gyakorolt hatásokat), akkor nem kell elvégezni a többi 
dóziscsoport elemzését. Ha a magas dózissal kezelt csoportban keze ­
léssel összefügg ő hatásokat tapasztalnak, akkor az alacsonyabb 
dózissal kezelt csoportokat is ki kell értékelni.
 
Ha a fenti spermavizsgálati paramétereket egy legalább 90 napos 
szisztémás toxicitási vizsgálatban már meghatározták, akkor a kétge ­
nerációs vizsgálatban nem kell ezt feltétlenül megismételni. A P 
generáció spermamintáit vagy az azokról készült digitális felvételeket azonban, ha szükséges, ajánlatos az esetleges kés őbbi értékelések 
céljára meg őrizni, illetve elmenteni.
 
1.5.5.  Az utódok  
Az ellés után minden almot a lehet ő leghamarabb meg kell vizsgálni 
(0. szoptatási nap) a kölykök számának és ivarának, a halvaszüle ­
tések és élveszületések számának, valamint a makroszkópos rendelle ­
nességeknek a megállapítására. Ha nem történt maceráció, a 0. napon elhalva talált kölykökben lehet őség szerint meg kell vizsgálni az 
esetleges defektusokat, és meg kell állapítani az elhullás okát, 
majd konzerválni kell őket. Az él ő kölyköket meg kell számolni, 
és meg kell mérni a testtömegüket a születéskor (0. szoptatási nap), vagy az 1. napon, majd ezt követ ően a rendszeres testtömeg ­
mérési napokon, azaz pl. a szoptatás 4., 7., 14. és 21 napján. Az 
anyaállatokban vagy az utódokban megfigyelt fizikai vagy viselke ­
désbeli rendellenességeket is fel kell jegyezni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Az utódok fizikai fejl ődését főleg a testtömeg-gyarapodás alapján 
kell nyomon követni. Az egyéb fizikai paraméterek (pl. a fülek és 
a szemek kinyílása, fogzás, sz őrnövekedés) kiegészít ő információkat 
szolgáltathatnak, de ezeket az adatokat lehet őleg a szexuális éréssel 
összefüggésben kell értékelni (pl. kor és testtömeg a hüvelykinyílás 
vagy a makk-fityma szétválás id őpontjában) (13). Ha nem történtek 
korábban külön ilyen vizsgálatok, akkor ajánlatos az elválasztás el őtt 
és/vagy után funkcionális vizsgálatokat (pl. motoros aktivitás, szen ­
zoros működés, a reflexek kifejl ődése) is végezni az F1 utódokon, 
különösen a szexuális éréssel kapcsolatos vizsgálatokat. Az elválasz ­
tott és pároztatásra kiválasztott F1 utódok esetében meg kell hatá ­
rozni azt az életkort, amikor a hüvelykinyílás, illetve a fitymaelválás megtörténik. Ha az F1 generáció ivararányában vagy az ivarérés 
idejében észlelt változások azt indokolják, a születés utáni 0. 
napon meg kell mérni az anogenitális távolságot az F2 utódokban.
 
Kihagyhatók a funkcionális vizsgálatokból azok a csoportok, 
amelyek egyébként egyértelm űen káros hatások tüneteit mutatják 
(pl. a testtömeg-gyarapodás szignifikáns lassulása stb.). Funkcionális 
vizsgálatok végzése esetén a pároztatásra kiválasztott kölyköket nem szabad e vizsgálatokba bevonni.
 
1.5.6.  Makroszkópos boncolás  
A vizsgálat befejezésekor vagy a vizsgálat során történt elhullás 
esetén minden szül ő (P és F1 állatok), minden küls ő rendellenességet 
vagy klinikai tüneteket mutató kölyök, valamint az F1 és az F2 generációból is egy-egy véletlenszer űen kiválasztott kölyök/ivar/alom 
esetében makroszkópos vizsgálatot kell végezni az esetleges struktu ­
rális rendellenességek vagy kórbonctani elváltozások feltárására. 
Külön figyelmet kell szentelni a szaporítószerveknek. Az elhullás ­
közeli állapotba került, és ezért humánus módon exterminált vagy a nem macerált, elpusztult kölykökben meg kell határozni az esetleges 
defektusokat és/vagy az elhullás okát, majd konzerválni kell őket.
 
Az először ellő nőstények méhében kórszövettani értékelés nélkül 
kell megvizsgálni a beágyazódási helyek jelenlétét és számát.  
1.5.7.  A szervek tömege  
A vizsgálat befejezésekor a P és F1 állatoknál meg kell határozni a 
testtömeget, valamint az alábbi szervek tömegét (a páros szervek 
tagjait külön-külön kell megmérni):  
— méh, petefészkek,  
— herék, mellékherék (teljes és farki rész),  
— prosztata,  
— ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel és váladékukkal, valamint 
a prosztata (egy egységként),  
— agy, máj, vese, lép, agyalapi mirigy, pajzsmirigy és mellékvese, 
valamint az ismert célszervek.  
Meg kell határozni a boncolásra kiválasztott F1 és F2 kölykök végs ő 
testtömegét. Az egyetlen véletlenszer űen kiválasztott kölyök/ivar/ ­
alom (lásd 1.5.6. szakasz) esetében az alábbi szervek tömegét kell 
megmérni: agy, lép és csecsem őmirigy.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Ha megoldható, a makroszkópos boncolási eredményeket és a szerv ­
tömeg-adatokat a más, ismételt dózisú vizsgálatokban tett megfigye ­
lésekkel összefüggésben kell értékelni.  
1.5.8.  Kórszövettan  
1.5.8.1.  A szül őállatok  
A szülőállatokban (P és F1) a következ ő szerveket és szöveteket 
vagy az ezekb ől készített reprezentatív mintákat fixálni kell a kórszö ­
vettani vizsgálatokhoz, majd megfelel ő közegben el kell eltárolni:  
— hüvely, méh és méhnyak, valamint petefészkek (megfelel ő rögzí­
tőszerrel fixálva),  
— egy here (Bouin-féle vagy hasonló rögzít őszerben tartósítva), egy 
mellékhere, ondóhólyagok, prosztata és koaguláló mirigy,  
— a pároztatásra kiválasztott összes P és F1 állatból származó, 
korábban meghatározott célszerv(ek).  
Minden kontroll- és nagy dózissal kezelt csoportban el kell végezni a 
pároztatásra kiválasztott P és F1 állatok fent felsorolt és konzervált 
szerveinek és szöveteinek teljes kör ű kórszövettani vizsgálatát. A P 
állatok petefészkének vizsgálata nem kötelez ő. A NOAEL meghatá ­
rozásának el ősegítése érdekében a kezeléssel összefügg ő változásokat 
mutató szerveket az alacsony és közepes dózissal kezelt csopor ­
tokban is meg kell vizsgálni. El kell végezni továbbá azon alacsony és közepes dózissal kezelt állatok szaporítószerveinek kórszövettani vizsgálatát, amelyek gyaníthatóan csökkent termékenységgel bírnak, 
így például azok esetében, amelyek nem tudtak párzani, megfoganni, 
utódokat nemzeni vagy egészséges utódokat a világra hozni, vagy amelyeknél az ivari ciklusra vagy a spermaszámra, spermamotilitásra vagy spermamorfológiára gyakorolt hatásokat észleltek. Minden 
makroszkópos léziót, így például atrófiát vagy daganatot is meg 
kell vizsgálni.
 
A kezeléssel összefügg ő hatások, így például a visszatartott sperma ­
tidák, hiányzó csírasejtrétegek vagy típusok, sokmagvú óriássejtek, vagy a spermaképz ő sejtek leválása és lumenbe kerülésének azono ­
sítása érdekében el kell végezni a here részletes kórszövettani vizs ­
gálatát (pl. Bouin-féle rögzít őszer, paraffinba ágyazás és 4–5 μm 
vastag harántmetszetek) (14). Az ép mellékhere vizsgálatának ki kell terjednie a mellékhere feji részére, testére és farki részére, 
amelyet egy hosszanti metszet értékelésével lehet elvégezni. A 
mellékherében meg kell vizsgálni a leukocita infiltrációt, a sejttí ­
pusok gyakoriságában bekövetkez ő változásokat, az abnormális sejt ­
típusokat, valamint az ondósejek fagocitózisát. A hím szaporító ­
szervek vizsgálatára PAS- és hematoxilin-festés alkalmazható.
 
A szoptatási id őszak után a petefészeknek tüsz őkezdeményeket és 
növekvő tüszőket kell tartalmaznia, valamint egy nagyméret ű laktá­
ciós sárgatestet. A kórszövettani vizsgálat során meg kell vizsgálni a tüszőkezdemény-állomány kvalitatív deplécióját. Az F1 n őstények 
esetében el kell végezni a tüsz őkezdemények kvantitatív értékelését 
is; az állatok számának, a kiválasztott petefészekmetszeteknek és 
-metszetmintáknak az alkalmazott értékelési eljáráshoz statisztikai szempontból adekvátnak kell lennie. A kezelt és kontrollpetefészkek összehasonlításához a vizsgálatoknak ki kell terjedniük a tüsz őkez­
demények összeszámlálására, amelyekhez hozzá lehet venni a kis 
növekvő tüszőket is (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Az elválasztott állatok  
A külső rendellenességeket vagy klinikai tüneteket mutató összes 
kölykök, valamint az F1 és az F2 generációból az egy véletlensze ­
rűen kiválasztott és pároztatásra ki nem jelölt kölyök/ivar/alom 
makroszkóposan rendellenes szöveteit és célszerveit fixálni kell, 
majd megfelel ő közegben el kell ezeket tárolni a kórszövettani vizs ­
gálatokhoz. A konzervált szövetek teljes kórszövettani vizsgálatát úgy kell elvégezni, hogy külön hangsúlyt kell fektetni a szaporító ­
szervekre.
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az adatokat egyedileg kell a jelentésben rögzíteni, majd táblázatos 
formában is össze kell foglalni, amelyben minden egyes vizsgálati csoport és generáció esetében fel kell tüntetni az állatok számát a 
vizsgálat kezdetén, a vizsgálat során elpusztult vagy humánus okok 
miatt exterminált állatok számát, az elhullások és humánus okok miatti exterminálások id őpontját, a termékeny állatok számát, a 
vemhes n őstények számát, a toxicitás jeleit mutató állatok számát, 
a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, ezen belül bármely toxikus 
tünet megjelenésének id őpontját, valamint ezek id őtartamát és 
súlyosságát, a szül őkkel és az utódokkal kapcsolatos megfigyelések 
típusait, a kórszövettani változások típusait és az almokra vonatkozó 
minden idevágó adatot.
 
A számszer ű eredményeket megfelel ő, általánosan elfogadott statisz ­
tikai módszerrel kell kiértékelni; a statisztikai módszereket a vizs ­
gálat megtervezésének keretében kell kiválasztani, és meg is kell azt indokolni. Az adatok elemzéséhez célszer ű lehet dózis-válasz statisz ­
tikai modelleket alkalmazni. A jelentésnek elegend ő információt kell 
tartalmaznia az alkalmazott elemzési módszerrel és számítógépes programmal kapcsolatban ahhoz, hogy egy független bíráló vagy statisztikus újra tudja értékelni vagy rekonstruálni tudja az elemzést.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
A kétgenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat eredményeit a 
megfigyelt hatások, ezen belül a boncolási és mikroszkópos eredmé ­
nyek szempontjából kell értékelni. Az értékelés során ki kell térni a 
vizsgálandó anyag dózisa és a rendellenességek, ezen belül a makroszkópos léziók, az azonosított célszervek, a csökkent termé ­
kenység, a klinikai rendellenességek, a csökkent reproduktív teljesít ­
mény vagy alomszám, a testtömegváltozások, a mortalitásra gyako ­
rolt hatások és egyéb toxikus hatások megléte vagy hiánya, illetve gyakorisága és súlyossága közötti összefüggésekre vagy ezek 
hiányára. A vizsgálati eredmények értékelésekor figyelembe kell 
venni a vizsgálandó anyag fizikai-kémiai tulajdonságait és az esetle ­
gesen rendelkezésre álló toxikokinetikai adatokat is.
 
Egy megfelel ően elvégzett reprodukciós toxicitási vizsgálat alapján 
kielégítő becslés tehet ő a hatást nem okozó szintre vonatkozóan, és 
megismerhet ők a reprodukcióra, ellésre, szoptatásra, posztnatális 
fejlődésre, ezen belül a növekedésre és szexuális fejl ődésre gyakorolt 
hatások.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A kétgenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat információkkal 
szolgál valamely anyagnak a szaporodási ciklus összes fázisában történő, ismételt expozíciója hatásairól. A vizsgálat különösen a 
reproduktív paraméterekkel, valamint az utódok fejl ődésével, növe ­
kedésével, érésével és túlélésével kapcsolatban ad információkat. A vizsgálat eredményeit a szubkrónikus, prenatális fejl ődési, toxikoki ­
netikai és egyéb vizsgálatok eredményeivel összefüggésben kell 
értelmezni. A vizsgálat eredményeit fel lehet használni annak felmé ­
résére is, hogy szükség van-e egy vegyület további vizsgálataira. A vizsgálat eredményeinek emberre történ ő extrapolálása csak korláto ­
zott mértékben érvényes. A vizsgálat leginkább arra alkalmazható, 
hogy információt nyerjünk a hatást nem okozó szintekkel és megengedhet ő humán expozícióval kapcsolatban (20) (21) (22) (23).
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai jelleg és ahol fontos, fizikai-kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok,  
— tisztaság.  
Vivőanyag (ha szükséges):  
— ha a viv őanyag nem víz, akkor ennek indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— a felhasznált faj/törzs,  
— az állatok száma, életkora és ivara,  
— származás, tartási körülmények, takarmány, fészekrakó 
anyagok stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetén.  
Kísérleti körülmények:  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása;  
— a vizsgálandó anyag formulázásával/a táplálék el őkészítésével, az 
elért koncentrációval kapcsolatos információk;  
— a készítmény stabilitása és homogenitása,  
— a vizsgálandó anyag adagolására vonatkozó adatok,  
— adott esetben a vizsgálandó anyag táplálékban/ivóvízben lév ő 
koncentrációjának (ppm) átszámítása a tényleges dózisra (mg/ ­
testtömeg-kg/nap),  
— a táplálék és az ivóvíz min őségével kapcsolatos információk.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Eredmények:  
— táplálékfogyasztási és – ha van – vízfogyasztási adatok, táplálék ­
hasznosítási képesség (egy gramm elfogyasztott táplálékra számí ­
tott testtömeg-növekedés) és vizsgálandó anyag felvétele a P és 
F1 állatok esetében, kivéve az együttes tartás id őszakát és 
legalább a szoptatási id őszak utolsó harmadát,  
— felszívódási adatok (ha vannak),  
— a pároztatásra kiválasztott P és F1 állatok testtömegadatai,  
— az almok és a kölykök testtömegadatai,  
— a testtömeg az extermináláskor, valamint a szül ői generáció 
abszolút és relatív szervtömegadatai,  
— a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és id őtartama (visz ­
szafordíthatóság),  
— a vizsgálat során bekövetkez ő elhullás id őpontja, illetve hogy az 
állatok életben maradtak-e az exterminálásig,  
— toxikus válaszadatok ivaronként és dózisonként, ezen belül a 
párzás, a termékenység, a vemhesség, a születés, az életképesség és a szoptatás mér őszámai; a jelentésben fel kell tüntetni a 
mérőszámok kiszámításához felhasznált adatokat,
 
— a szaporodásra, az utódokra, a posztnatális növekedésre stb. 
gyakorolt toxikus vagy egyéb hatások,  
— boncolási eredmények,  
— az összes kórszövettani lelet részletes ismertetése,  
— a szabályos ciklust mutató P és F1 n őstények száma, és a 
ciklusok id őtartama,  
— teljes ondósejtszám a mellékhere farki részében, az el őrehaladó 
mozgást végz ő ondósejtek százalékos aránya, morfológiailag 
normál ondósejtek százalékos aránya és az azonosított rendelle ­
nességet mutató ondósejtek százalékos aránya,  
— a pároztatás id őtartama, ezen belül a párzásig eltelt napok száma,  
— a vemhesség id őtartama,  
— a beágyazódások és sárgatestek száma, az almok mérete,  
— az élveszületések száma és a beágyazódás utáni veszteség,  
— a makroszkóposan látható rendellenességeket mutató kölykök 
száma, és ha meghatározták, akkor a csökött utódok számát is fel kell tüntetni a jelentésben,
 
— a kölykökben meghatározott fizikai tájékozódási pontokkal 
kapcsolatos adatok és más posztnatális fejl ődési adatok; a kiérté ­
kelt fizikai tájékozódási pontokat meg is kell indokolni,  
— adott esetben a kölykökben és feln őtt állatokban végzett funkci ­
onális megfigyelésekkel kapcsolatos adatok,  
— adott esetben az eredmények statisztikai elemzése.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Az eredmények diszkussziója.  
Következtetések, ezen belül az anyai és utódhatásokra vonatkozó 
NOAEL-értékek.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduc ­
tion in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston 
and R. V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of 
Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Develop ­
ment and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxi ­
cology 12:92–108.  
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and 
Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. 
Journal of Reproduction and Fertility 54:103–107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. 
Reproductive Toxicology 5:39 44.  
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237–244.
 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility. Reproductive Toxicology 6:267–273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409–421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449–458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxi ­
cology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319–333.
 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admi ­
nistration: Methodologic and Statistical Considerations.  
Journal of Andrology  10: 401–415.  
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility.  Journal of 
Andrology  8:330–337.  
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491–505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17:298303.  
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
 
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421–426.
 
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379–383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. 
and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Prin ­
ciples and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOXIKOKINETIKAI VIZSGÁLAT  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 417. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2010) leírt módszerrel. A vizsgált vegyi anyag toxikokinetikai vizs ­
gálatára irányuló tanulmányok célja a vegyi anyag felszívódásával, eloszlá ­
sával, biotranszformációjával (azaz metabolizmusával) és kiürülésével 
kapcsolatos megfelel ő információk megszerzése, a megfigyelt toxicitás és 
a koncentráció vagy a dózis közötti összefüggés meghatározásának, valamint a toxicitás mechanizmusa megértésének el ősegítése. A toxikokinetika a vizs ­
gált állatok vizsgált vegyi anyagnak való szisztémás kitettségének bizonyí ­
tása, valamint a keringésbe került molekularészek (kiindulási vegyi anyagok/ metabolitok) meghatározása révén hozzájárulhat a toxikológiai vizsgálatok értelmezéséhez. Az e vizsgálatok alapján meghatározott alapvet ő toxikoki ­
netikai paraméterek információt szolgáltatnak továbbá a vizsgált vegyi 
anyag szövetekben és/vagy szervekben történ ő felhalmozódásra, valamint 
a vizsgált vegyi anyagnak való kitettség eredményeként bekövetkez ő biot­
ranszformáció el őidézésére való képességér ől.
 
2. A toxikokinetikai adatok hozzájárulhatnak az állati toxicitással kapcsolatos 
adatok emberi veszély- és/vagy kockázatértékelés céljából történ ő extrapo­
lálásra való alkalmasságának és relevanciájának értékeléséhez. A toxikoki ­
netikai vizsgálatok hasznos információt szolgáltathatnak továbbá a toxicitási 
vizsgálatokhoz szükséges dózisszintek (lineáris, illetve nem lineáris kineti ­
ka), a beadási módok okozta hatások, a biológiai hozzáférhet őség, valamint 
a vizsgálati tervvel kapcsolatos kérdések meghatározásához. A toxikokine ­
tikai adatok bizonyos típusai felhasználhatók élettani alapú 
toxikokinetikai (PBTK) modellek kidolgozásához.  
3. A metabolit-/toxikokinetikai adatok fontos felhasználási területei közé 
tartozik például a lehetséges toxicitások és hatásmechanizmusok feltárása, valamint ezek dózisszinthez és expozíciós útvonalhoz való viszonyának meghatározása. A metabolizmussal kapcsolatos adatok emellett olyan infor ­
mációkat szolgáltathatnak, amelyek hasznosak lehetnek a vizsgált vegyi 
anyag exogén módon termelt metabolitjainak való kitettség toxikológiai jelentőségének értékelésében.
 
4. A megfelel ő toxikokinetikai adatok hasznosak lehetnek a mennyiségi 
szerkezet-hatás összefüggések, a vegyi anyagok biztonsági értékelése csoportosításos vagy read across módszer alapján történ ő megközelítése 
további elfogadhatóságának és alkalmazhatóságának támogatása szempont ­
jából. A kinetikai adatok felhasználhatók továbbá egyéb (például  in vivo /in 
vitro ) vizsgálatok toxikológiai relevanciájának értékelésében is.
 
5. Amennyiben a szöveg más bejuttatási útvonalat nem említ (lásd különösen a 
74–78. bekezdést), a jelen vizsgálati módszert a vizsgált vegyi anyag szájon át történő bejuttatására kell alkalmazni.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
6. A szabályozási rendszerek különböz ő követelményeket és igényeket támasz ­
tanak a vegyi anyagok különböz ő osztályainak (például növényvéd ő szerek, 
biocid anyagok, ipari vegyszerek) toxikokinetikájával kapcsolatos végpontok és paraméterek mérésével szemben. A legtöbb vizsgálati módszerrel ellen ­
tétben ez a vizsgálati módszer toxikokinetikai vizsgálatot határoz meg, 
amely több mérést és végpontot foglal magában. A jöv őben több új vizs ­
gálati módszer és/vagy iránymutatás kidolgozására kerülhet sor minden egyes végpont külön-külön és részletesebben történ ő leírása érdekében. A 
jelen vizsgálati módszer esetében az elvégzend ő vizsgálatokat vagy értéke ­
léseket az egyes szabályozási rendszerek követelményei és/vagy igényei 
határozzák meg.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Számos vizsgálat végezhet ő el egy vizsgált vegyi anyag toxikokinetikai 
viselkedésének szabályozási célú értékelése érdekében. Meghatározott szabá ­
lyozási igényekt ől vagy helyzetekt ől függően azonban nem feltétlenül szük ­
séges az összes lehetséges vizsgálatot elvégezni a vizsgált vegyi anyag értékeléséhez. A toxikokinetikai vizsgálatok tervezését rugalmasan, a szóban 
forgó vizsgált vegyi anyag jellemz őinek figyelembevételével kell megköze ­
líteni. Bizonyos esetekben csak néhány kérdést szükséges feltárni a vizsgált vegyi anyaggal összefüggésbe hozható veszélyességi vagy kockázati prob ­
lémák megoldásához. Bizonyos helyzetekben a toxikokinetikai adatok egyéb 
toxikológiai vizsgálatok értékelésének részeként gy űjthetők össze. Más 
esetekben további és/vagy kiterjedtebb toxikokinetikai vizsgálatok szük ­
ségesek a szabályozási igényekt ől függően és/vagy ha új kérdések merülnek 
fel a vizsgált vegyi anyag értékelése során.
 
8. A vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgálati laboratóriumnak a vizsgált vegyi 
anyagra, valamint az ahhoz kapcsolódó metabolitokra és analóg vegyüle ­
tekre vonatkozó összes rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie a vizsgálat min őségének javítása és a szükségtelen állatkísérletek 
elkerülése érdekében. Ebbe beletartozhatnak egyéb releváns vizsgálati 
módszerek ( in vivo  vizsgálatok,  in vitro  vizsgálatok és/vagy  in silico  érté­
kelések) adatai. A fizikai és kémiai tulajdonságok – úgymint a (log P
 OW - 
ként kifejezett) oktanol-víz megoszlási hányados, a pKa, a vízoldékonyság, a 
gőznyomás, valamint a vegyi anyag molekulatömege – hasznosak lehetnek a 
vizsgálat tervezése és az eredmények értelmezése szempontjából. Ezek a megfelelő vizsgálati módszereknél leírt módszerek használatával határoz ­
hatók meg.
 
KORLÁTOK  
9. Ez a vizsgálati módszer nem alkalmas speciális körülmények között, például 
vemhes vagy szoptató állatoknál vagy fiatal állatoknál, vagy a vizsgált anyagnak kitett élelmiszertermel ő állatokban lév ő lehetséges maradványok 
értékelése céljából való alkalmazásra. A B.36. vizsgálatból szerzett adatok 
azonban háttér-információt szolgáltathatnak az ilyen vizsgálatokhoz szükséges 
konkrét tanulmányok tervezéséhez. A jelen vizsgálati módszer nem nano ­
anyagok vizsgálatára szolgál. Az OECD vizsgálati iránymutatásainak nano ­
anyagokra történ ő alkalmazhatóságára vonatkozó el őzetes felülvizsgálatról 
szóló jelentés szerint a 147. vizsgálati iránymutatás (amely a jelen B.36. 
vizsgálati módszerrel egyenérték ű) nem alkalmazható nanoanyagokra (1).
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
10. A jelen vizsgálati módszer alkalmazásában használt fogalommeghatározások 
a függelékben találhatók.  
ÁLLATJÓLLÉTI SZEMPONTOK  
11. Az állatokkal való kíméletes bánásmódra vonatkozóan az OECD 19. irány ­
mutatásában (2) található útmutatás. Ajánlott az OECD 19. iránymutatá ­
sának alkalmazása a jelen vizsgálati módszerben meghatározott összes  in 
vivo és in vitro  vizsgálat esetében.  
A MÓDSZEREK LEÍRÁSA  
Előzetes vizsgálatok  
12. A toxikokinetikai vizsgálatok kísérleti paramétereinek megválasztása érde ­
kében (például metabolizmus, tömegmérleg, analitikai eljárások, dózismeg ­
határozás, CO  2 kilégzése stb.) el őzetes vizsgálatok elvégzése javasolt. E 
paraméterek némelyikének jellemzése nem feltétlenül teszi szükségessé a 
radioizotóppal megjelölt vegyi anyagok használatát.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Az állatok kiválasztása  
Faj 
13. A toxikokinetikai vizsgálatokhoz használt állatfaj (és törzs) lehet őleg 
ugyanaz legyen, mint amelyet az adott vizsgált vegyi anyaggal elvégzett egyéb toxikológiai vizsgálatokhoz használunk. Általában a patkányt kell használni, mivel ezt a fajt széles körben alkalmazzák a toxikológiai vizs ­
gálatokhoz. Egyéb vagy további fajok használata abban az esetben indokolt, 
ha kritikus toxikológiai vizsgálatok bizonyítják az e fajokban megfigyelhet ő 
jelentős toxicitást, vagy ha e fajok toxicitási/toxikokinetikai szempontból 
hasonlóbbak az emberhez. Az állatfaj és a törzs megválasztását indokolni 
kell.
 
14. Amennyiben a vizsgálati módszer más fajt nem említ, a jelen vizsgálati 
módszer alkalmazásában vizsgálati faj alatt a patkány értend ő. A módszer 
egyes szempontjai más vizsgálati fajok használata esetén módosításra szorul ­
hatnak.  
Életkor és törzs  
15. Egészséges, fiatal, ivarérett (általában az adagolás id őpontjában 6–12 hetes) 
állatokat kell használni a vizsgálat során (lásd még a 13. és 14. bekezdést). Amennyiben az állatok nem fiatal, ivarérett egyedek, használatukat indo ­
kolni kell. Az összes állatnak hasonló életkorúnak kell lennie a vizsgálat 
kezdetekor. Az egyes állatok súlya nem térhet el ± 20 %-nál nagyobb 
mértékben a vizsgált csoport átlagértékét ől. A használt törzsnek ideális 
esetben meg kell egyeznie a vizsgált vegyi anyag toxikológiai adatbázisának előállításához használt törzzsel.
 
Az állatok száma és neme  
16. Minden egyes vizsgált dózishoz legalább négy, azonos nem ű állat szük ­
séges. A felhasznált állatok nemére vonatkozó döntést indokolni kell. Meg 
kell fontolni mindkét nem (négy hím és négy n őstény) használatát, ha a 
nemek között jelent ős különbségek bizonyíthatóak a toxicitás vonatkozásá ­
ban. 
Tartási és etetési körülmények  
17. A vizsgálati id őszak alatt az állatokat általában külön-külön kell tartani. 
Különleges körülmények között indokolt lehet a csoportos tartás. A világítás 
legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmérséklete 22 °C 
(± 3 °C), relatív páratartalma 30–70 % között kell, hogy legyen. Az 
etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan 
mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 
Vizsgált vegyi anyag  
18. A tömegmérleg és a metabolitok meghatározásához C  14 radioizotóppal 
megjelölt vizsgált vegyi anyagot kell használni, azonban nem szükséges a radioizotóppal megjelölt vizsgált vegyi anyag használata, ha az alábbiak 
bizonyíthatók:
 
— a tömegmérleg- és metabolitmeghatározás megfelel ően értékelhet ő a nem 
jelölt vizsgált vegyi anyag használatával,  
— a nem radioaktív vizsgált vegyi anyag használatán alapuló módszer 
analitikai specifikussága és érzékenysége megegyezik vagy nagyobb 
annál, amelyet a radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag használatával 
lehetett volna elérni.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
Egyéb radioaktív és stabil izotópok is használhatók, különösen abban az 
esetben, ha az adott elem a vizsgált vegyi anyag toxikus részéért felel ős 
vagy annak részét képezi. Amennyiben lehetséges, a radioizotópos jelö ­
lésnek a molekula olyan, központi részében kell elhelyezkednie, amely metabolikusan stabil (nem kicserélhet ő, anyagcsere útján nem távozik 
CO
 2 -ként, és nem válik a szervezet egy szénatomos csoportjának részévé). 
A vizsgált vegyi anyag metabolikus útjának nyomon követése céljából a molekula több területének vagy meghatározott régióinak jelölése is szük ­
séges lehet.
 
19. A radioizotóppal jelölt és nem jelölt vizsgált vegyi anyagokat a megfelel ő 
módszerek alkalmazásával kell elemezni a tisztaság és az azonosság meghatározása érdekében. A radioaktív vizsgált vegyi anyag radiokémiai 
tisztaságának az adott vizsgált vegyi anyagnál elérhet ő legmagasabbnak 
(ideális esetben 95 %-nál nagyobbnak) kell lennie, és ésszer ű erőfeszítéseket 
kell tenni a 2 %-os vagy annál nagyobb arányú szennyez ődések azonosítása 
érdekében. A tisztaságot, valamint minden azonosított szennyez ődés 
meghatározását és arányát jegyz őkönyvezni kell. Egyes szabályozási prog ­
ramok további iránymutatást adhatnak a keverékekb ől összetev ődő vizsgált 
vegyi anyagok meghatározásának és specifikációjának, valamint a tisztaság meghatározására szolgáló módszerek kialakításának támogatása érdekében.
 
A dózis megválasztása  
Előzetes vizsgálat  
20. Általában egyetlen, szájon át beadott dózis elegend ő az előzetes vizsgálat ­
hoz. A dózis nem lehet toxikus, de elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a kiürül ő anyagokból (és adott esetben plazmából) történ ő 
metabolitmeghatározást, valamint ahhoz, hogy megfeleljen az el őzetes vizs ­
gálat kitűzött céljának a jelen vizsgálati módszer 12. bekezdése szerint.
 
Fő vizsgálatok  
21. A fő vizsgálatokhoz legalább két dózis javasolt, mivel a legalább két dózis ­
csoportból nyert információk segítséget nyújthatnak a dózisok más toxiko ­
lógiai vizsgálatokban történ ő meghatározásához, valamint segíthetnek a már 
rendelkezésre álló toxicitási vizsgálatok dózis-válasz összefüggésének érté ­
kelésében.  
22. Két dózis bejuttatása esetén mindkét dózisnak elég magasnak kell lennie 
ahhoz, hogy lehet ővé tegye a szervezetb ől kiürülő anyagokból (és adott 
esetben plazmából) történ ő metabolitmeghatározást. A dózis megválasztá ­
sakor figyelembe kell venni a rendelkezésre álló toxicitási adatokból szár ­
maztatott információkat. Ha nem áll rendelkezésre információ (például a 
toxicitás klinikai tüneteit rögzít ő akut orális toxicitási vizsgálatokból vagy 
ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból), a magasabb dózisként egy, a becsült LD
 50 értéknél (szájon át vagy b őrön át történ ő bejuttatás) vagy 
LC 50 értéknél (belégzésen keresztül történ ő bejuttatás) alacsonyabb, vagy 
az akut toxicitási tartomány legkisebb becsült értékénél alacsonyabb érték fontolható meg. Az alacsonyabb dózisnak a magasabb dózis valamely hányadának kell lennie.
 
23. Amennyiben csak egy dózisszintet vizsgálunk, a dózisnak ideális esetben 
elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy lehet ővé tegye a kiürül ő anyagokból 
(és adott esetben plazmából) történ ő metabolitmeghatározást anélkül, hogy 
megfigyelhet ő toxicitást okozna. A második dózisszint kihagyását indokolni 
kell. 
24. Ha a dózis kinetikai folyamatokra gyakorolt hatását kell meghatározni, lehet ­
séges, hogy két dózis nem elegend ő, és legalább az egyik dózisnak elég 
magasnak kell lennie e folyamatok telítéséhez. Ha a plazmakoncentráció-id ő 
görbe alatti terület a f ő vizsgálatban használt valamely két dózisszint között 
nem lineáris, az annak a határozott jele, hogy egy vagy több kinetikai 
folyamat telít ődése valahol a két dózisszint között következik be.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Az alacsony toxicitású vizsgált vegyi anyagok esetében a maximális dózis 
1 000 mg/testsúlykilogramm (szájon és b őrön át történ ő bejuttatás) (belégzés 
útján történ ő bejuttatás esetén e melléklet B.2. fejezete ad iránymutatást, az 
ez esetben alkalmazott dózis általában nem haladja meg a 2 mg/l mennyi ­
séget). Az adott vegyi anyaggal összefügg ő szempontok a szabályozási 
igényektől függően magasabb dózist tehetnek szükségessé. A dózis 
megválasztását minden esetben indokolni kell.  
26. A felhalmozódás és/vagy maradandóság lehet őségének meghatározásához 
elegendőek lehetnek az egyszeri dózisú vizsgálatokból származó toxikoki ­
netikai és szöveti eloszlási adatok. Bizonyos körülmények között azonban ismételt dózis bejuttatása válhat szükségessé i. a felhalmozódás és/vagy 
maradandóság vagy a toxikokinetikai változások (azaz például az enzimind ­
ukció és -inhibíció) lehet őségének teljesebb kör ű meghatározása céljából, 
vagy ii. ha az alkalmazandó szabályozási rendszer megköveteli. Az ismételt adagolású vizsgálatok esetében az ismételt alacsony dózis beadása ugyan 
általában elegend ő, bizonyos körülmények között azonban a magas dózis 
megismétlése is szükséges lehet (lásd még az 57. bekezdést).
 
A vizsgált vegyi anyag bejuttatása  
27. A vizsgált vegyi anyagot homogén módon kell feloldani vagy szuszpendálni 
a vizsgált vegyi anyaggal elvégzett más orális szondás toxicitási vizsgála ­
toknál alkalmazott viv őanyagban, amennyiben a viv őanyagra vonatkozó 
információk rendelkezésre álnak. A viv őanyag megválasztását indokolni 
kell. A választott viv őanyagot és a dózis mértékét figyelembe kell venni a 
vizsgálat tervezésekor. A hagyományos bejuttatási módszer a szájon át 
történő szondatáplálás, azonban bizonyos helyzetekben el őnyös lehet a 
zselatinkapszulával vagy étrendi keverékként történ ő bejuttatás (mindkét 
esetben indokolás szükséges). Az egyes állatoknak ténylegesen beadott dózist meg kell er ősíteni.
 
28. A szájon át történ ő szondatáplálás révén egyszerre bejuttatandó folyadék 
maximális mennyisége a vizsgált állatok méretét ől, a dózis viv őanyagának 
típusától, valamint attól függ, hogy az etetést felfüggesztjük-e a vizsgált 
vegyi anyag bejuttatása el őtt. Az adagolás el őtti etetést vagy annak korlá ­
tozását indokolni kell. A mennyiséget általában a lehet ő legalacsonyabb 
szinten kell tartani a vizes és nem vizes viv őanyagok esetében is. Rágcsálók 
esetében a dózis mennyisége rendszerint nem haladhatja meg a 10 ml/test ­
súlykilogrammot. A zsírban jobban oldódó vizsgált vegyi anyagokhoz hasz ­
nált vivőanyag mennyisége 4 ml/testsúlykilogrammnál is kezd ődhet. Ismételt 
adagolás esetén, amikor a napi táplálékmegvonás nem javasolt, alacsonyabb 
dózismennyiségek (például 2-4 ml/testsúlykilogramm) alkalmazását kell 
megfontolni. Amennyiben lehetséges, megfontolható a vizsgált vegyi anyaggal elvégzett egyéb, szájon át történ ő szondatáplálásos vizsgálatok 
során bejuttatott dózisnak megfelel ő mennyiség használata.
 
29. A biológiai hozzáférhet őség vagy a szájon át történ ő relatív felszívódás 
meghatározásához alkalmazható a vizsgált vegyi anyag intravénás bejutta ­
tása, valamint a vizsgált vegyi anyag vérben és/vagy kiürül ő anyagokban 
történő mérése. Az intravénás vizsgálat esetében a vizsgált vegyi anyag 
egyszeri (az alacsonyabb, szájon át bejuttatott dózissal általában megegyez ő, 
de azt meg nem haladó – lásd a dózis megválasztására vonatkozó részt) 
dózisát juttatjuk be a megfelel ő vivőanyag használatával. Ezt az anyagot a 
megfelelő mennyiségben (például 1 ml/testsúlykilogramm) kell bejuttatni 
legalább négy, megfelel ő nemű állat választott bejuttatási területén (indokolt 
esetben mindkét nem is használható, lásd a 16. bekezdést). A vizsgált vegyi 
anyag intravénás bejuttatásához teljesen feloldódott vagy szuszpendált dózis ­
készítmény szükséges. Az intravénás bejuttatáshoz használt viv őanyag nem  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
befolyásolhatja a vér integritását vagy a véráramlást. Ha a vizsgált vegyi 
anyagot infúzióval juttatjuk be, az infúzió adagolását jegyz őkönyvezni és az 
egyes állatok között egységesíteni kell, feltéve, hogy infúziós pumpát hasz ­
nálunk. Érzéstelenítést kell használni, ha kanült helyezünk a nyaki vénába (a vizsgált vegyi anyag bejuttatásához és/vagy vérvételhez), vagy ha a vegyi 
anyagot a combver őéren keresztül juttatjuk be. Az érzéstelenítés típusára 
kellő figyelmet kell fordítani, mivel hatással lehet a toxikokinetikára. Az 
állatok számára lehet ővé kell tenni a megfelel ő felépülést a vizsgált vegyi 
anyag és a viv őanyag bejuttatását megel őzően.
 
30. Bizonyos vizsgált vegyi anyagok esetében egyéb bejuttatási útvonalak – 
például a b őrön vagy belégzésen keresztüli bejuttatás (lásd a 74–78. bekez ­
dést) – alkalmazhatók azok fizikai és kémiai tulajdonságainak, valamint a 
várt emberi használat vagy kitettség figyelembevételével.  
Mérések  
Tömegmérleg  
31. A tömegmérleget a bejuttatott (radioaktív) dózis vizelettel, széklettel és 
kilélegzett leveg ővel kiürül ő százalékának, valamint a szövetekben, elhullott 
állatokban és ketreclemosóban jelen lév ő százalékának összeadásával hatá ­
rozzuk meg (lásd a 46. bekezdést). Általában a bejuttatott vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) 90 %-nál nagyobb mennyiségének visszanyerése tekinthető megfelel őnek.
 
Felszívódás  
32. A felszívódás kezdeti becslése úgy kapható meg, hogy kihagyjuk a dózis 
emésztőrendszerben és/vagy a székletben lév ő százalékát a tömegmérleg 
meghatározásából. A felszívódás százalékos arányának számítási módját 
lásd a 33. bekezdésben. A kiürülés vizsgálatához lásd a 44–49. bekezdést. Ha a szájon át történ ő adagolást követ ő felszívódás pontos mértékét nem 
lehet meghatározni a tömegmérleg-vizsgálatokkal (például ha a bejuttatott 
dózis több mint 20 %-a található meg a székletben), további vizsgálatok 
lehetnek szükségesek. Ezek a vizsgálatok vagy 1) a vizsgált vegyi anyag beadásából és a vizsgált vegyi anyag epében történ ő méréséből, vagy 2) a 
vizsgált vegyi anyag szájon át vagy intravénásan történ ő bejuttatásából és a 
vizsgált vegyi anyag vizeletben, valamint a kilélegzett leveg őben és az 
elhullott állatokban jelen lév ő nettó mennyiségének mindkét bejuttatási 
mód tekintetében történ ő méréséb ől állnak. Mindkét vizsgálati tervben a 
vizsgált vegyi anyag és a metabolitok vegyszerspecifikus elemzésére szol ­
gáló helyettesít ő módszerként elvégezzük a radioaktivitás mérését.
 
33. Az epén keresztüli kiürülés vizsgálata során általában a szájon át történ ő 
bejuttatást alkalmazzuk. A vizsgálat során kanült kell vezetni legalább négy, megfelelő nemű (vagy indokolt esetben mindkét nemb ől választott) állat 
epevezetékébe, és a vizsgált vegyi anyag egyszeri dózisát kell bejuttatni. 
A vizsgált vegyi anyag bejuttatását követ ően a radioaktivitás/vizsgált 
vegyi anyag epén keresztüli kiürülését addig kell megfigyelni, ameddig az szükséges a bejuttatott dózis ezen útvonalon kiürül ő százalékának becslésé ­
hez, amely alapján a következ őképpen közvetlenül kiszámítható a szájon át 
történő felszívódás mértéke:
 
Százalékos felszívódás  ¼ ðepében þ vizeletben þ kilélegzett leveg őben þ elhullott 
állatokban lév ő mennyiség ; az emészt őrendszerben 
lévő mennyiséget leszámítva Þ=bejuttatottmennyiség  Ü 100 
34. A vizsgált vegyi anyagok néhány osztálya esetében a felszívódott dózis 
közvetlen kiürülése fordulhat el ő a bélcsatorna membránjai között. Ilyen 
esetekben a százalékos dózis azon patkány székletében a szájon át történ ő 
adagolást követ ően végzett mérése, amelynek az epevezetékébe kanült vezet ­
tünk, nem tekinthet ő reprezentatívnak a nem felszívódott dózis szempontjából. 
Amennyiben vélhet ően bélcsatornán keresztüli kiürülés is el őfordulhat, aján ­
lott a dózis százalékos felszívódását a szájon át történ ő és az intravénás 
bejuttatást követ ő kiürülés (érintetlen vagy kanülözött epevezeték ű patkány) 
összehasonlításából kiszámított felszívódás alapján meghatározni (lásd a 35. bekezdést). Amennyiben a bélcsatornán keresztüli kiürülés mennyiségének 
meghatározását szükségesnek ítéljük, ajánlott a kanülözött epevezeték ű 
patkányból történ ő kiürülés intravénás bejuttatást követ ő mérése is.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biológiai hozzáférhet őség 
35. A biológiai hozzáférhet őséget az orális és intravénás csoportok plazmájának/ 
vérének kinetikája alapján lehet meghatározni az 50–52. bekezdésben leírtak szerint, a vizsgált vegyi anyag és/vagy a megfelel ő metabolitok speciális 
kémiai elemzése útján, így ez esetben nincs szükség radioizotóppal jelölt 
vizsgált vegyi anyag használatára. A vizsgált vegyi anyag vagy a megfelel ő 
metabolit(ok) biológiai hozzáférhet ősége (F) a következ őképen számítható ki:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDúzis  IV=Dúzis  exp Þ 
ahol az AUC a plazmakoncentráció-id ő görbe alatti terület, az exp pedig a 
kísérleti útvonal (szájon át, b őrön át vagy belégzéssel történ ő adagolás).  
36. A szisztémás hatások kockázatfelmérésében történ ő használatkor a toxikus 
összetevő biológiai hozzáférhet ősége általában els őbbséget élvez a száza ­
lékos felszívódással szemben az állatkísérletekb ől megállapított szisztémás 
koncentrációk és a munkahelyi kitettséggel kapcsolatos vizsgálatokból szár ­
mazó analóg biomonitoring-adatok összehasonlítása során. A helyzet össze ­
tettebbé válhat, ha a dózisok a nem lineáris tartományban vannak, fontos tehát, hogy a toxikokinetikai sz űréssel a lineáris tartományban lév ő dózi­
sokat határozzuk meg.
 
Szöveti eloszlás  
37. A vizsgált vegyi anyag és/vagy metabolitjai szövetekben történ ő eloszlá­
sának ismerete fontos a célszövetek meghatározása, valamint a toxicitás 
mögöttes mechanizmusainak megértése szempontjából, továbbá a vizsgált 
vegyi anyag és a metabolit felhalmozódási vagy megmaradási képességével kapcsolatos információk megszerzése céljából. A teljes (radioaktív) dózis szövetekben, valamint az elhullott állatokban lév ő százalékos arányát 
legalább a kiürülési kísérlet befejezésekor (például általában az adagolást 
követő 7 napig, vagy a vizsgált vegyi anyagra jellemz ő viselkedést ől 
függően rövidebb ideig) kell mérni. Ha a vizsgálat befejezésekor nem észlel ­
hető vizsgált vegyi anyag a szövetekben (például mert a vizsgált vegyi 
anyag annak rövid felezési ideje miatt kiürülhetett a vizsgálat befejezése 
előtt), megfelel ő körültekintéssel kell eljárni az adatok félreértelmezésének 
megelőzése érdekében. Ebben a helyzetben a szöveti eloszlást akkor kell 
vizsgálni, amikor a vizsgált vegyi anyag (és/vagy metabolit) plazmában/ 
vérben lév ő koncentrációja a legmagasabb (T
 max ), vagy amikor a vizeleten 
keresztül történ ő kiürülés mennyisége a legmagasabb (lásd a 38. bekezdést). 
A vizsgált vegyi anyag és/vagy metabolitjai szövetekben történ ő eloszlá­
sának meghatározása, (adott esetben) az id őtől való függ őség értékelése, a 
tömegmérleg meghatározásának el ősegítése érdekében és/vagy az illetékes 
hatóság el őírásai szerint a szövetek további id őpontokban történ ő gyűjtésére 
is szükség lehet. A begy űjtendő szövetek közé tartoznak a májszövetek, a 
zsírszövetek, az emészt őrendszerb ől származó szövetek, a vese-, lép-, teljes ­
vér-szövetek, az elpusztult állatokból származó szövetek, a célszervb ől szár­
mazó szövetek, valamint bármely egyéb szövet (például pajzsmirigyszöve ­
tek, eritrociták, szaporítószervekb ől származó szövetek, b őrszövetek, szem ­
szövetek [különösen a pigmentált állatokból]), amely jelent őséggel bírhat a 
vizsgált vegyi anyag toxikológiai értékelése szempontjából. Meg kell 
fontolni további szövetek ugyanazon id őpontokban történ ő elemzését az 
állatok lehet ő legteljesebb felhasználása céljából, valamint abban az esetben, 
ha célszervi toxicitás figyelhet ő meg szubkrónikus és krónikus toxicitási 
vizsgálatokban. A (radioaktív) maradvány koncentrációját, valamint a 
szövet-plazma (vér) arányt is jegyz őkönyvezni kell.  
38. Szükséges lehet, vagy az illetékes hatóság el őírhatja, hogy a plazma/vér 
megfelelő kinetikai vagy kiürülési kísérletei alapján megállapított szöveti 
eloszlást további id őpontokban is értékeljük, például akkor, amikor a plaz ­
mában  / vérben lév ő koncentráció a legmagasabb (például T  max ), vagy amikor 
a vizeleten keresztül történ ő kiürülés mennyisége a legmagasabb. Ezen 
információk hasznosak lehetnek a toxicitás megértése, valamint a vizsgált vegyi anyag és a metabolit felhalmozódási és megmaradási képességének meghatározása szempontjából. A minták megválasztását indokolni kell; az 
elemzend ő mintáknak általában meg kell egyezniük a fent említettekkel 
(lásd a 37. bekezdést).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. A radioaktivitás szöveti eloszlási vizsgálatokhoz szükséges mennyiségi 
meghatározását szervboncolás, homogenizáció, oxidáció és/vagy oldhatóvá 
tétel segítségével lehet elvégezni, amelyet a befogott maradványok folya ­
dékszcintillációs számlálása (LSC) követ. Bizonyos, jelenleg a fejlesztés különböző stádiumaiban lév ő technikák – például a mennyiségi egésztest- 
autoradiográfia és a mikroszkópos receptor-autoradiográfia – hasznosnak 
bizonyulhatnak a vizsgált vegyi anyag szervekben és/vagy szövetekben történő eloszlásának maghatározása szempontjából (3) (4).
 
40. A szájon át történ ő bejutás kivételével az expozíciós útvonalak tekintetében 
meghatározott szöveteket kell gy űjteni és elemezni, például tüd őszöveteket 
az inhalációs vizsgálatok során és b őrszöveteket a b őrön át történ ő 
bejutással kapcsolatos vizsgálatok során. Lásd a 74–78. bekezdést.  
Metabolizmus  
41. A változatlan vizsgált vegyi anyag, valamint a metabolitok azonosításához 
és mennyiségének meghatározásához a kiürül ő anyagok (és adott esetben 
plazma) összegy űjtése szükséges a 44–49. bekezdésben leírtak szerint. A 
kiürülő anyagok metabolitok egy adott dóziscsoporton belüli meghatározá ­
sának elősegítése céljából történ ő összevonása megengedhet ő. Ajánlatos az 
egyes időszakokból származó metabolitok profiljának meghatározása. Ha 
azonban a minta és/vagy radioaktivitás hiánya ezt kizárja, a több id őpontban 
gyűjtött vizelet és széklet összevonása megengedhet ő, de a több nemhez 
vagy dózishoz tartozó vizeleté és székleté nem. Megfelel ő minőségi és 
mennyiségi módszerek használata szükséges a kezelt állatok vizeletének, székletének, kiürült radioaktivitásának és adott esetben epéjének vizsgálatá ­
hoz.
 
42. Ésszer ű erőfeszítéseket kell tenni a bejuttatott dózis 5 vagy nagyobb száza ­
lékában jelen lév ő összes metabolit azonosságának meghatározása, valamint 
a vizsgált vegyi anyag metabolikus rendszerének meghatározása érdekében. A kiürülő anyagokban a bejuttatott dózis 5 vagy több százalékában jelen 
lévő vizsgált vegyi anyagoknakmeg kell határozni az azonosságát. Az 
azonosság meghatározása az összetev ők pontos strukturális meghatározását 
jelenti. Az azonosság meghatározása általában vagy a metabolit ismert stan ­
dardokkal való, két lényegileg különböz ő rendszer használatával végzett 
együttes kromatográfiájával, vagy pozitív strukturális azonosításra alkalmas 
technikákkal, például tömegspektrometriával, magmágneses rezonanciával (NMR) stb. történik. Együttes kromatográfia esetén nem 
tekinthetők a metabolit azonossága megfelel ő kétmódszeres ellen őrzési 
módszerének azok a kromatográfiai technikák, amelyek ugyanazt az állófá ­
zist használják két különböz ő oldószerrendszerrel, mivel a két módszer nem 
független egymástól. Az azonosság együttes kromatográfiával történ ő 
meghatározását két különböz ő, analitikailag egymástól független rendszerrel, 
például reverz és normál fázisú vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) vagy nagy teljesítmény ű folyadékkromatográfiával (HPLC) kell elvégezni. Spekt ­
roszkópiai módszerekkel végzett további meger ősítés nem szükséges, ha a 
kromatográfiai szeparáció megfelel ő minőségű. Alternatív módszerként az 
azonosság egyértelm ű meghatározása strukturális információkat szolgáltató 
módszerek, például folyadékkromatográfia/tömegspektrometria (LC-MS), vagy folyadékkromatográfia/tandem tömegspektrometria (LC-MS/MS), 
gázkromatográfia/tömegspektrometria (GC-MS) és NMR-spektometria alkal ­
mazásával is elvégezhet ő.
 
43. Ha a bejuttatott dózis 5 vagy nagyobb százalékában jelen lév ő metabolitok 
azonosságának meghatározása nem lehetséges, a zárójelentésben ezt meg kell indokolni/magyarázni. Ahhoz, hogy a vizsgált vegyi anyaggal kapcso ­
latos veszélyek és/vagy kockázatok elemzéséhez az anyagcsere-útvonalakat 
alaposabban is megismerhessük, helyénvaló lehet a bejuttatott dózis keve ­
sebb mint 5 %-át kitev ő mennyiségben jelen lév ő metabolitok azonosságát 
is meghatározni. Ahol csak lehetséges, strukturális meger ősítést is kell 
végezni. Ez magában foglalhatja a plazmában vagy vérben, vagy más szöve ­
tekben történ ő profilmeghatározást.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Kiürülés  
44. A bejuttatott dózis kiürülésének sebességét és mértékét a vizeletb ől, szék­
letből és kilélegzett leveg őből visszanyert (radioaktív) dózis százalékos 
arányának mérésével kell meghatározni. Ezek az adatok segítenek a tömeg ­
mérleg meghatározásában is. A vizeleten, székleten és kilélegzett leveg őn 
keresztül távozó vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) mennyiségét megfelel ő 
időközönként kell meghatározni (lásd a 47–49. bekezdést). Az ismételt 
dózisú kísérleteket úgy kell megtervezni, hogy azok a 26. bekezdésben 
meghatározott célkit űzések elérése érdekében lehet ővé tegyék a kiürülési 
adatok összegy űjtését. Ez lehet ővé teszi az egyszeri dózisú kísérletekkel 
történő összehasonlítást.  
45. Ha az el őzetes vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy nem ürül ki jelent ős 
mennyiség ű vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) a kilélegzett leveg ővel (a 
49. bekezdés szerint), akkor a f ő vizsgálat során nem szükséges a kilélegzett 
levegő összegyűjtése.  
46. A kiürül ő anyagok (vizelet, széklet, kilélegzett leveg ő) gyűjtéséhez minden 
állatot külön metabolikus egységbe kell helyezni. Az egyes gy űjtési 
időszakok végén (lásd a 47–49. bekezdést) a metabolikus egységeket át 
kell mosni megfelel ő oldószerrel (úgynevezett „ketreclemosóval”) a vizsgált 
vegyi anyag (radioaktivitás) maximális visszanyerése érdekében. A kiürül ő 
anyagok gy űjtésével 7 nap után kell felhagyni, vagy azután, hogy a bejut ­
tatott dózis legalább 90 %-át visszanyertük, attól függ ően, hogy melyik 
következik be el őbb. 
47. A vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) vizeletben jelen lév ő teljes mennyi ­
ségét a gy űjtés első napján legalább két id őpontban kell meghatározni, 
amelyek közül az egyiknek az adagolást követ ő 24. órában kell történnie, 
azt követően pedig a vizsgálat befejezéséig naponta. Az els ő napon érdemes 
lehet kett őnél több mintavételi id őpontot is kijelölni (például a 6., a 12. és a 
24. órában). Az alternatív, illetve a további gy űjtési időpontokat az el őzetes 
vizsgálatok eredményei alapján kell kijelölni. A gy űjtés ütemezését indo ­
kolni kell.  
48. A vizsgált vegyi anyag (radioaktivitás) székletben jelen lév ő teljes mennyi ­
ségét, hacsak az el őzetes vizsgálatok eltér ő vagy további gy űjtési időpon­
tokat nem indokolnak, naponta kell meghatározni a vizsgálat befejezéséig, 
első alkalommal az adagolást követ ő 24. órában. Az ett ől eltérő gyűjtési 
ütemezést indokolni kell.  
49. A kilélegzés útján távozó CO  2 és egyéb illékony anyagok gy űjtését meg kell 
szakítani az adott vizsgálatban, ha egy 24 órás gy űjtési időszak alatt a 
bejuttatott dózis kevesebb mint 1 %-át találjuk a kilélegzett leveg őben. 
Az időbeli lefolyással kapcsolatos vizsgálatok  
A plazma/vér kinetikája  
50. E vizsgálatok célja a vizsgált vegyi anyag alapvet ő toxikokinetikai paramé ­
tereinek (például C  max , T  max , felezési id ő [t 1/2 ], AUC) becslése. Ezek a 
vizsgálatok egy dózissal, vagy – gyakrabban – két vagy több dózissal végezhetők el. A dózis beállítását a kísérlet jellege és/vagy a vizsgálat 
célja határozza meg. A kinetikai adatok olyan kérdések megválaszolásához 
lehetnek szükségesek, mint a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhet ő­
sége és/vagy a dózis kiürülésre gyakorolt hatásának meghatározása (például annak meghatározása, hogy a kiürülés dózistól függ ően telítődik-e).
 
51. Ezekhez a vizsgálatokhoz dóziscsoportonként legalább négy, azonos nem ű 
állatot kell használni. A felhasznált állatok nemére vonatkozó döntést indo ­
kolni kell. Meg kell fontolni mindkét nem (négy hím és négy n őstény) 
használatát, ha a rendelkezésre álló adatok alapján a nemek között jelent ős 
különbségek feltételezhet ők a toxicitás vonatkozásában.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. A (radioizotóppal jelölt) vizsgált vegyi anyag bejuttatása után megfelel ő 
mintavételi módszertan alkalmazásával megfelel ő időpontokban minden 
állattól vérmintát kell venni. Az állatonként levehet ő vérminták mennyiségét 
és számát korlátozhatja az ismételt mintavételnek az állat egészségére/fizio ­
lógiájára gyakorolt lehetséges hatása és/vagy az analitikai módszer érzékeny ­
sége. A mintákat minden egyes állatra vonatkozóan kell elemezni. Bizonyos 
körülmények között (például a metabolitok jellemz őinek meghatározásakor) 
több állattól származó minták összevonására lehet szükség. Az összevont mintákat egyértelm űen azonosítani kell, és az összevonást indokolni kell. 
Amennyiben radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyagot használunk, 
megfelelő lehet a jelen lév ő teljes radioaktivitás elemzése. Ebben az esetben 
a teljes radioaktivitást a teljes vérben és plazmában, vagy a plazmában és a vörösvérsejtekben kell elemezni, ami lehet ővé teszi a vér/plazma arány 
kiszámítását. Más körülmények között a kiindulási vegyület és/vagy a meta ­
bolitok azonosítását igényl ő konkrétabb vizsgálatok, vagy a fehérjekötés 
vizsgálatának elvégzése lehet szükséges.
 
Egyéb szövetek kinetikája  
53. E vizsgálatok célja id őbeli lefolyással kapcsolatos információk megszerzése 
olyan szempontokkal összefügg ő kérdéseknek a vizsgált vegyi anyag külön ­
böző szövetekben lév ő szintjeinek meghatározása révén történ ő megválaszo ­
lása céljából, mint a toxikus hatásmechanizmus, a bioakkumuláció és a bioperzisztencia. A szövetek megválasztása és az értékelt id őpontok száma 
a megválaszolandó kérdést ől és a vizsgált vegyi anyagra vonatkozó toxiko ­
lógiai adatbázistól függ. E további, szövetek kinetikájával kapcsolatos vizs ­
gálatok megtervezésekor figyelembe kell venni a 37–40. bekezdésben leírtak szerint összegy űjtött információkat. Ezek a vizsgálatok egyszeri vagy ismé ­
telt adagolással végezhet ők el. A választott megközelítést részletesen indo ­
kolni kell.
 
54. A szövetek kinetikájával kapcsolatos egyéb vizsgálatok elvégzésének okai 
többek között a következ ők lehetnek:  
— bizonyíték a vérben megfigyelhet ő hosszabb felezési id őre, ami a vizs ­
gált vegyi anyag különböz ő szövetekben történ ő lehetséges felhalmozó ­
dására utal, vagy  
— annak vizsgálatához f űződő érdek, hogy kialakult-e egy állandósult 
állapot bizonyos szövetekben (az ismételt dózisú vizsgálatokban például annak ellenére, hogy a vizsgált vegyi anyag nyilvánvaló állandósult álla ­
pota már kialakulhatott a vérben, érdekek f űződhetnek annak meger ő­
sítéséhez, hogy a célszövetekben is kialakult az állandósult állapot).
 
55. Az ilyen típusú, id őbeli lefolyással kapcsolatos vizsgálatok esetén a vizsgált 
vegyi anyag megfelel ő dózisát id őpontonként és dózisonként legalább négy 
állatnak kell szájon át beadni, és az eloszlás id őbeli lefolyását meg kell 
figyelni a választott szövetekben. Csak az egyik nem egyedei használhatók, hacsak nem figyelhet ő meg egy adott nemre jellemz ő toxicitás. A megvála ­
szolandó kérdést ől is függ, hogy a teljes radioaktivitást, vagy a kiindulási 
vegyületet és/vagy a metabolitokat elemezzük-e. A szöveteken belüli elosz ­
lást a megfelel ő technikák alkalmazásával kell vizsgálni.
 
Enzimindukció/-inhibíció  
56. A vizsgált vegyi anyag enzimindukciójának/-inhibíciójának vagy biotransz ­
formációjának lehetséges hatásaival foglalkozó vizsgálatokra akkor lehet szükség, ha az alábbi feltételek közül egy vagy több fennáll:
 
1. a rendelkezésre álló bizonyítékok a vizsgált vegyi anyag biotranszformá ­
ciója és a megnövekedett toxicitás közötti kapcsolatra utalnak;  
2. a rendelkezésre álló toxicitási adatok a dózis és a metabolizmus közötti 
nem lineáris kapcsolatra utalnak;  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. a metabolitok azonosítására irányuló vizsgálatok egy potenciálisan 
toxikus metabolit meghatározását eredményezték, amelyet a vizsgált 
vegyi anyag által el őidézett enzimfolyamat hozhatott létre;  
4. olyan hatásokra keresünk magyarázatot, amelyek feltételezhet ően enzi­
mindukciós jelenségekkel függnek össze;  
5. ha a vizsgált vegyi anyag metabolitprofiljában különböz ő fajokkal vagy 
különböző körülmények között elvégzett  in vitro  vagy  in vivo  kísérletek 
révén toxikológiai szempontból jelent ős váltakozások figyelhet őek meg, 
szükség lehet az érintett enzim(ek) (például 1-es fázisú enzimek, úgymint 
a citokróm P450-függ ő monooxigenáz rendszer izoenzimei, 2-es fázisú 
enzimek, úgymint a szulfotranszferáz vagy az uridin-difoszfát-glükuro ­
niltranszferáz izoenzimei, vagy bármely más, ide tartozó enzim) jellem ­
zőinek meghatározására. Ezek az információk felhasználhatók a fajok 
közötti extrapoláció megfelel őségének értékeléséhez.  
57. A vizsgált vegyi anyaggal összefügg ő toxikokinetikai változások értékelé ­
sére megfelel ően validált és indokolt vizsgálati protokollokat kell alkal ­
mazni. A példaként megemlíthet ő vizsgálati tervek a jelöletlen vizsgált 
vegyi anyag ismételt adagolását, azt követ ően pedig a radioizotóppal jelölt 
vizsgált vegyi anyag 14. napon történ ő egyszeri adagolását, vagy a radio ­
izotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag ismételt adagolását és az 1., 7. és 14. napon a metabolitprofilok meghatározása céljából végzett mintavételt 
foglalják magukban. A radioizotóppal jelölt vizsgált vegyi anyag ismételt 
adagolása információkat szolgáltathat a bioakkumulációról is (lásd a 26. bekezdést).
 
KIEGÉSZÍT Ő MEGKÖZELÍTÉSEK  
58. A jelen vizsgálati módszerben leírt  in vivo  kísérleteken túlmutató kiegészít ő 
megközelítések hasznos információkat szolgáltathatnak a vizsgált vegyi 
anyag bizonyos fajokban végbemen ő felszívódásával, eloszlásával, metabo ­
lizmusával vagy kiürülésével kapcsolatban.  
In vitro  információk használata  
59. A vizsgált vegyi anyag metabolizmusával kapcsolatos számos kérdés 
megválaszolható megfelel ő vizsgálati rendszereket alkalmazó  in vitro  vizs­
gálatok segítségével. A májból származó, frissen izolált vagy tenyésztett 
hepatociták és szubcelluláris frakciók (például mikroszómák és citoszol 
vagy S9 frakció) felhasználhatók az esetleges metabolitok vizsgálatához. A célszervben, például a tüd őben végbemen ő helyi metabolizmus vizsgálata 
hasznos lehet a kockázatértékelés szempontjából. Ebb ől a célból hasznosak 
lehetnek a célszövetek mikroszómás frakciói. A mikroszómákkal végzett 
vizsgálatok hasznosak lehetnek a lehetséges nembeli és életkorbeli különb ­
ségek meghatározása, valamint az enzimparaméterek (K
 m és V  max ) jellem­
zőinek meghatározása szempontjából, amelyek segítséget nyújthatnak a 
metabolizmus dózisfügg őségének kitettségi szintek vonatkozásában történ ő 
vizsgálatához. A mikroszómák hasznosak lehetnek továbbá a vizsgált vegyi anyag metabolizmusában részt vev ő egyes mikroszómás enzimek azonosítá ­
sában, ami a fajok közötti extrapoláció szempontjából lehet lényeges (lásd 
még az 56. bekezdést). A biotranszformáció el őidézésének lehet ősége is 
vizsgálható a szóban forgó vizsgált vegyi anyaggal el őkezelt állatok májából 
származó szubcelluláris frakciók (például mikroszómák és citoszol) haszná ­
latával,  in vitro  kísérletekben hepatocitaindukció alapján, vagy a megfelel ő 
enzimeket kimutató egyes sejtvonalakon keresztül. Bizonyok körülmények 
között és a megfelel ő feltételek mellett emberi szövetekb ől származó szub ­
celluláris frakciók használatát is fontolóra lehet venni a biotranszformációval kapcsolatban a fajok között esetlegesen fennálló különbségek meghatározá ­
sához. Az  in vitro  vizsgálatok eredményei hasznosak lehetnek a PBTK- 
modellek kidolgozása szempontjából is (5).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. A b őrön keresztüli felszívódással kapcsolatos  in vitro  vizsgálatok 
kiegészítő információkat szolgáltathatnak a felszívódás jellemz őinek 
meghatározásához (6).  
61. A májsejtekb ől származó els ődleges sejttenyészetek és a friss szövetszeletek 
felhasználhatók a májmikroszómákra vonatkozókhoz hasonló kérdések megválaszolásához. Bizonyos esetekben meghatározott kérdések a megfelel ő 
enzimet határozottan kimutató sejtvonalak vagy mesterséges sejtvonalak 
használatával is megválaszolhatók lehetnek. Bizonyos esetekben hasznos lehet egyes citokróm P450 izoenzimek (például CYP1A1, 2E1, 1A2 és más enzimek) és/vagy 2-es fázisú enzimek kiindulási vegyület általi inhibí ­
ciójának és indukciójának  in vitro  kísérletek révén történ ő vizsgálata. Az így 
szerzett információk hasznosak lehetnek a hasonló szerkezet ű vegyületek 
szempontjából.
 
Toxicitásvizsgálatokból származó toxikokinetikai adatok kiegészít ő 
információként történ ő használata  
62. A bármely más toxicitásvizsgálat során gy űjtött vér-, szövet-, és/vagy kiürü ­
lőanyag-minták elemzése adatokat szolgáltathat a biológiai hozzáférhet őség­
ről, a plazmakoncentráció id őbeli változásáról (AUC, C  max ), a bioakkumu ­
lációs képességr ől, a kiürülési sebességr ől, valamint a metabolizmus és 
kinetika nemt ől vagy életkortól függ ő változásairól.  
63. A vizsgálati terv figyelembevétele felhasználható az alábbiakkal kapcsolatos 
kérdések megválaszolásához: a felszívódás telít ődése, biotranszformáció vagy 
kiürülési útvonalak magasabb dózisszinteknél, új anyagcsere-útvonalak működése magasabb dózisoknál, valamint a toxikus metabolitok korlátozása 
magasabb dózisoknál.
 
64. Az egyéb veszélyértékelési megfontolások közé tartozhatnak a következ ők: 
— életkorral összefügg ő érzékenység a vér-agy gát, a vese és/vagy a deto ­
xikációs képesség állapotában fennálló különbségek miatt,  
— szubpopulációra jellemz ő érzékenység a biotranszformációs képességben 
fennálló vagy egyéb toxikokinetikai különbségek miatt,  
— a magzat vagy újszülött kitettsége a vegyszerek placentán, illetve szop ­
tatáson keresztüli átvitele révén.  
Toxikokinetikai modellezés alkalmazása  
65. A toxikokinetikai modellek hasznosak lehetnek a veszélyesség- és kockázat ­
értékelés különböz ő szempontjai, például a szisztémás kitettség és a bels ő 
szövetdózis el őrejelzése tekintetében. Ezenkívül a hatásmechanizmussal 
kapcsolatos egyes kérdések is megválaszolhatók, és ezek a modellek a 
fajok közötti extrapoláció, az expozíciós útvonalak, az adagolási sémák és 
a humán kockázatértékelés alapjául szolgálhatnak. Az adott vizsgált vegyi anyag bármely fajra vonatkozó PBTK-modelljeinek kidolgozásához többek között a következ ő adatok lehetnek hasznosak: 1) megoszlási hányadosok, 
2) biokémiai állandók és fiziológiai paraméterek, 3) útvonalspecifikus felszí ­
vódási paraméterek és 4) a modellek értékeléséhez használt  in vivo  kinetikai 
adatok (például a megfelel ő [> 10 %] kiválasztódási folyamatokhoz tartozó 
kiürülési paraméterek, a metabolizmus vonatkozásában a K
 m és a V  max ). A 
modellek kidolgozásához felhasznált kísérleti adatokat tudományos szem ­
pontból megalapozott módszerekkel kell el őállítani, és az el őállított model ­
leket validálni kell. A vizsgált vegyi anyagtól és a fajtól függ ő paramétere ­
ket, például a felszívódási arányokat, a vér-szövet megoszlást és a metabo ­
lizmus gyorsaságának állandóit gyakran határozzuk meg a nem kompartment 
és az élettani alapú modellek kidolgozásának el ősegítése céljából (7).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
66. Ajánlott tartalomjegyzéket készíteni a vizsgálati jegyz őkönyvhöz.  
A jegyzőkönyv törzse  
67. A jegyz őkönyv törzsének a jelen vizsgálati módszerben leírt információkat 
kell tartalmaznia, amelyeket az alábbiak szerint kell szakaszokra és bekez ­
désekre tagolni:  
Összefoglalás  
68. A vizsgálati jegyz őkönyv e részének tartalmaznia kell a vizsgálati terv 
összefoglalását, valamint az alkalmazott módszerek leírását. Az összefogla ­
lásban ki kell emelni a tömegmérleggel, a metabolitok jellegével és mennyi ­
ségével, a szövetmaradványokkal, a kiürülés sebességével, a bioakkumulá ­
ciós képességgel, a nemek szerinti különbségekkel stb. kapcsolatos f ő 
megállapításokat is. Az összefoglalásnak kell ően részletesnek kell lennie 
ahhoz, hogy lehet ővé tegye a megállapítások értékelését.  
Bevezetés  
69. A jegyz őkönyv e részének tartalmaznia kell a vizsgálat célkit űzéseit, indo ­
kolását és tervét, valamint a megfelel ő hivatkozásokat és az esetleges el őz­
ményeket.  
Anyagok és módszerek  
70. A jegyz őkönyv e részének tartalmaznia kell az összes lényeges információ, 
többek között az alábbiak részletes leírását:  
a) Vizsgált vegyi anyag  
Ennek az alszakasznak tartalmaznia kell a vizsgált vegyi anyag meghatá ­
rozását: kémiai név, molekuláris szerkezet, a kémiai összetétel min őségi 
és mennyiségi meghatározása, kémiai tisztaság, valamint lehet őség 
szerint az esetleges szennyez ődések típusa és mennyisége. Információkat 
kell tartalmaznia továbbá a fizikai/kémiai tulajdonságokkal, többek 
között a fizikai halmazállapottal, színnel, bruttó oldhatósággal és/vagy 
megoszlási hányadossal, stabilitással, valamint adott esetben a maró hatással kapcsolatban. Adott esetben az izomerekkel kapcsolatos infor ­
mációkat is fel kell tüntetni. Ha a vizsgált vegyi anyag radioizotóppal 
jelölt, ennek az alszakasznak a következ őkre vonatkozó információkat is 
tartalmaznia kell: a radioizotóp típusa, a jelölés helye, fajlagos aktivitás és radiokémiai tisztaság.
 
A vizsgált vegyi anyag bejuttatásához használt bármilyen viv őanyag, 
hígítószer, szuszpendáló anyag és emulgeálószer, vagy más anyag típusát vagy leírását is meg kell adni.
 
b) Kísérleti állatok  
Ennek az alszakasznak a kísérleti állatokra vonatkozó információkat kell 
tartalmaznia, beleértve a faj, a törzs és a vizsgálat kezdetekori életkor megválasztását és ennek indokolását, az állatok nemét, valamint testsú ­
lyát, egészségi állapotát és az állattartás módját.
 
c) Módszerek  
Ennek az alszakasznak részleteznie kell a vizsgálati tervet és az alkal ­
mazott módszertant. Tartalmaznia kell az alábbiak leírását:  
(1) adott esetben az expozíciós útvonal és expozíciós körülmények 
bármilyen módosításának indokolása;  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
(2) a dózisszintek megválasztásának indokolása;  
(3) az utóvizsgálatok kísérleti tervezéséhez használt el őzetes vizs ­
gálatok leírása, ha voltak ilyenek. Be kell nyújtani az el őzetes vizs ­
gálatot alátámasztó adatokat;  
(4) az adagoló oldat elkészítésének módja, valamint a felhasznált oldó ­
szer vagy viv őanyag típusa, ha van ilyen;  
(5) a kezelt csoportok száma és az állatok száma csoportonként;  
(6) adagolási szintek és mennyiségek (valamint radioaktivitás haszná ­
lata esetén a dózis fajlagos aktivitása);  
(7) bejuttatási útvonal(ak) és módok;  
(8) az adagolás gyakorisága;  
(9) táplálékmegvonási id őszak (ha van ilyen);  
(10) teljes radioaktivitás állatonként;  
(11) az állatok tartása;  
(12) a minták gy űjtése és kezelése;  
(13) a metabolitok szétválasztásához, mennyiségének meghatározásához 
és azonosításához használt analitikai módszerek;  
(14) az alkalmazott módszerek kimutatási határa;  
(15) az alkalmazott egyéb kísérleti mérések és eljárások (beleértve a 
metabolitelemzéshez használt módszerek validációját).  
d) Statisztikai elemzés  
Ha a vizsgálat megállapításait statisztikai elemzés útján értékeljük, 
elegendő információt kell megadni az elemzési módszerre és az alkalma ­
zott számítógépes programra vonatkozóan ahhoz, hogy egy független bíráló/statisztikus újra tudja értékelni vagy rekonstruálni tudja az elem ­
zést.
 
A rendszermodellezési vizsgálatok, például a PBTK-vizsgálatok esetében 
a modellek bemutatásának tartalmaznia kell a modell teljes leírását a 
modell független rekonstrukciójának és validációjának lehet ővé tétele 
érdekében (lásd a 65. bekezdést és a Függelék: Fogalommeghatározások című részt).
 
Eredmények  
71. Ebben a szakaszban az összes adatot össze kell foglalni és táblázatba kell 
rendezni a megfelel ő statisztikai értékeléssel együtt, valamint szövegesen le 
kell írni. A radioaktivitás számlálásával kapcsolatos adatokat a vizsgálatnak 
megfelelő módon kell összefoglalni és bemutatni, általában mikrogramm 
vagy milligramm egyenérték/minta tömege egységekben, de más egységek is használhatók. Ennek a szakasznak tartalmaznia kell a megállapítások 
grafikus ábrázolását, a reprezentatív kromatográfiai és spektrometriai adatok 
reprodukcióját, a metabolitok meghatározását/számszer űsítését, valamint a 
várható anyagcsere-útvonalakat, beleértve a metabolitok molekuláris szerke ­
zetét. Ennek a szakasznak adott esetben az alábbi információkat is tartal ­
maznia kell:
 
(1) A vizeletb ől, székletb ől, kilélegzett leveg őből, valamint a ketreclemo ­
sóban talált vizeletb ől és székletb ől visszanyert radioaktivitás mennyi ­
sége és százalékos aránya.  
— Bőrvizsgálatok esetén a kezelt b őrből, bőrlemosókból visszanyert 
vizsgált vegyi anyaggal, valamint a b őrt takaró eszközön és a meta ­
bolikus egységen visszamaradt radioaktivitással kapcsolatos adato ­
kat, továbbá a b őrlemosási vizsgálat eredményeit is meg kell adni. 
További részleteket lásd a 74–77. bekezdésben.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Inhalációs vizsgálatok esetén a tüd őből és az orrszövetekb ől vissza­
nyert vizsgált vegyi anyaggal kapcsolatos adatokat is meg kell adni 
(8). További részleteket lásd a 78. bekezdésben.  
(2) A bejuttatott dózis százalékaként kifejezett szöveti eloszlás és koncent ­
ráció (mikrogramm egyenértékek/a szövet grammban kifejezett súlya), valamint a szövet-vér vagy szövet-plazma arány,
 
(3) a testszövetek és kiürül ő anyagok vizsgálatát magában foglaló egyes 
vizsgálatokból kiszámított anyagmérleg,  
(4) plazmakoncentráció és toxikokinetikai paraméterek (biológiai hozzáfér ­
hetőség, AUC, Cmax, Tmax, kiürülés, felezési id ő) a megfelel ő expo­
zíciós útvonal(ak)on keresztül történ ő bejuttatást követ ően, 
(5) a vizsgált vegyi anyag felszívódásának sebessége és mértéke a 
megfelelő expozíciós útvonal(ak)on keresztül történ ő bejuttatást köve ­
tően, 
(6) a vizsgált vegyi anyag és metabolitok kiürül ő anyagokból gy űjtött 
mennyisége (a bejuttatott dózis százalékában kifejezve),  
(7) hivatkozás a függelék adataira, amelyek magukban foglalják az egyes 
állatok összes mérési végpontra vonatkozó adatait (például dózis bejut ­
tatása, százalékos visszanyerés, koncentrációk, toxikokinetikai paramé ­
terek stb.),  
(8) a várható anyagcsere-útvonalakat és a metabolitok molekuláris szerke ­
zetét bemutató ábra.  
Tárgyalás és következtetések  
72. Ebben a szakaszban a szerz őnek 
(1) be kell mutatnia a várható anyagcsere-útvonalakat a vizsgált vegyi 
anyag metabolizmusa és eloszlása vizsgálatának eredményei alapján,  
(2) tárgyalnia kell a vizsgált vegyi anyag eloszlásával és/vagy biotransz ­
formációjával kapcsolatos, fajjal és nemmel összefügg ő lehetséges elté ­
réseket,  
(3) táblázatba kell foglalnia és tárgyalnia kell a metabolitok meghatározását 
és mennyiségét, a kiürülés sebességét, a bioakkumulációs képességet, 
valamint a kiindulási vegyület és/vagy a metabolitok szövetekben jelen lévő maradványait, továbbá a toxikokinetikai paraméterek lehetséges, 
dózistól függ ő változásait, ha vannak,
 
(4) bele kell foglalnia ebbe a szakaszba a toxicitásvizsgálatok elvégzése 
során szerzett bármely lényeges toxikokinetikai adatot,  
(5) röviden össze kell foglalnia a vizsgálat megállapításaival alátámasztható 
következtetéseket,  
(6) további szakaszokat kell beillesztenie (ha szükséges vagy helyénvaló).  
73. Az alátámasztó szakirodalmi információknak, táblázatoknak, ábráknak, 
függelékeknek stb. további szakaszokban kell helyet kapniuk.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATÍV EXPOZÍCIÓS ÚTVONALAK  
Bőrön át történ ő expozíció  
Bőrön át történ ő kezelés  
74. Ez a szakasz a vizsgált vegyi anyag b őrön keresztüli toxikokinetikájának 
vizsgálatával kapcsolatos konkrét információkat tartalmaz. A b őrön keresz ­
tüli felszívódással kapcsolatban az e melléklet B.44. fejezetében (B őrön át 
történő felszívódás:  in vivo  módszer (9)) találhatók információk. Egyéb 
végpontokkal, például az eloszlással és a metabolizmussal kapcsolatban a 
jelen B.36. vizsgálati módszer használható. A b őrön át történ ő kezelés során 
a vizsgált vegyi anyagot egy vagy több dózisszinten kell bejuttatni. A vizs ­
gált vegyi anyagnak (például a b őrön alkalmazott, vizsgált vegyi anyagot 
tartalmazó tiszta, hígított vagy kevert anyagnak) meg kell egyeznie azzal az 
anyaggal, amelynek az emberek vagy más lehetséges célfajok ki lehetnek 
téve (vagy ennek reális helyettesít őjének kell lennie). A dózisszint(ek)et a 
jelen vizsgálati módszer 20–26. bekezdésében leírtaknak megfelel ően kell 
megválasztani. A b őrön át bejuttatott dózis megválasztásakor figyelembe 
vehető tényezők többek között a várható humán kitettség és/vagy olyan 
dózisok, amelyeknél toxicitást figyeltek meg más dermális toxicitási vizs ­
gálatok során. A b őrön át bejuttatott dózis(oka)t szükség szerint fel kell 
oldani megfelel ő vivőanyagban, és olyan mennyiségben kell felvinni, 
amely elegend ő a dózis bejuttatásához. Röviddel a vizsgálat megkezdése 
előtt a törzs háti felületén le kell nyírni a kísérleti állatok sz őrét. Borotválás 
is alkalmazható, de azt a vizsgálat megkezdése el őtt megközelít őleg 24 
órával kell elvégezni. A sz őrzet nyírásakor vagy borotválásakor ügyelni 
kell arra, nehogy lehorzsoljuk a b őrt, mert az megváltoztathatja a b őr 
áteresztő képességét. A vizsgált vegyi anyag felviteléhez a testfelület körül ­
belül 10 %-át kell megtisztítani. Er ősen toxikus vegyi anyagok esetében a 
lefedett testfelület 10 %-nál kevesebb is lehet, de a felület lehet ő legnagyobb 
részét le kell fedni egy vékony és egységes filmréteggel. Ugyanazt a kezelt 
felületrészt kell használni az összes b őrvizsgálati csoportnál. A kezelt terü ­
leteket megfelel ő, rögzített borítással kell védeni. Az állatokat külön kell 
tartani.  
75. Bőrlemosási vizsgálatot kell végezni a vizsgált vegyi anyag felvitt dózisa 
azon mennyiségének megállapítása érdekében, amelyet el lehet távolítani a 
bőrről a kezelt b őrfelület kímél ő szappannal és vízzel történ ő lemosásával. 
Ez a vizsgálat a vizsgált vegyi anyag b őrön keresztüli bejuttatása esetén a 
tömegmérleg meghatározásában is segíthet. E b őrlemosási vizsgálathoz a 
vizsgált vegyi anyag egyszeri dózisát kell két állatra felvinni. A dózisszintet 
a jelen vizsgálati módszer 23. bekezdésének megfelel ően kell megválasztani 
(lásd még a b őrrel való érintkezés id őtartamát tárgyaló 76. bekezdést). A 
vizsgált vegyi anyag lemosókból visszanyert mennyiségét meg kell határozni 
a vizsgált vegyi anyag lemosási eljárással történ ő eltávolítása hatékonysá ­
gának értékelése céljából.  
76. Amennyiben a maró hatás ezt nem zárja ki, a felvitt vizsgált vegyi anyagot 
legalább 6 órán keresztül kell a b őrön hagyni. A véd őborítás eltávolításakor 
a kezelt területet a b őrlemosási vizsgálatnál leírtak szerint le kell mosni az 
eljárást követ ően (lásd a 75. bekezdést). A véd őborítást és a lemosókat is 
elemezni kell a visszamaradt vizsgált vegyi anyag kimutatása céljából. A vizsgálat befejezésekor minden állatot humánus módon el kell pusztítani a (2) kiadványnak megfelel ően, és a kezelt b őrt el kell távolítani. A kezelt b őr 
megfelelő részét elemezni kell a visszamaradt vizsgált vegyi anyag (radio ­
aktivitás) meghatározása céljából.
 
77. Gyógyszerészeti készítmények toxikokinetikai értékeléséhez a vonatkozó 
szabályozási rendszernek megfelel ően eltérő eljárások lehetnek szükségesek.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Belélegeztetés  
78. A vizsgált vegyi anyag egyszeri (vagy szükség esetén többszöri) koncent ­
rációját kell alkalmazni. A koncentráció(ka)t a jelen vizsgálati módszer 20–26. bekezdésében leírtaknak megfelel ően kell megválasztani. A beléle ­
geztetéses kezelést orrtölcséres vagy csak fejen alkalmazott berendezés 
segítségével kell elvégezni annak érdekében, hogy megel őzhető legyen az 
alternatív expozíciós útvonalakon keresztüli felszívódás (8). Ha egyéb belé ­
legeztetési expozíciós körülményeket alkalmazunk, a módosítás indokolását 
dokumentálni kell. A belélegeztetés általi expozíció id őtartamát meg kell 
határozni; az expozíció jellemz ő időtartama 4–6 óra.
 
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, 
Paris.
 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
 
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 
25-40.  
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. 
Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
 
(6) E melléklet B.45., B őrön át történ ő felszívódás:  In vitro  módszer cím ű 
fejezete.  
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety.  
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
(9) E melléklet B.44., B őrön át történ ő felszívódás:  In vivo  módszer cím ű 
fejezete.  
(10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
 
(11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Felszívódás : Vegyi anyagok szövetekbe vagy szöveteken keresztül történ ő felvé­
telének folyamata(i). A felszívódás a kiindulási vegyületre és annak összes meta ­
bolitjára vonatkozik. Nem összetévesztend ő a biológiai hozzáférhet őség fogalmá ­
val. 
Felhalmozódás  (bioakkumuláció): A vizsgált vegyi anyag mennyiségének 
időbeli növekedése a szöveteken belül (általában zsírszövetekben, az ismételt 
expozíciót követ ően); ha a vizsgált vegyi anyag nagyobb mennyiségben jut be 
a testbe, mint amennyi kiürül, a szervezet felhalmozza a vizsgált vegyi anyagot, és a vizsgált vegyi anyag toxikus koncentrációi lehetnek megfigyelhet ők.
 
ADME : Az angol »Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion« (felszívó ­
dás, eloszlás, metabolizmus, kiürülés) szavak rövidítése.  
AUC  (a plazmakoncentráció-id ő görbe alatti terület): A vizsgált vegyi anyag 
plazmában lév ő koncentrációját az id ő függvényében bemutató ábrán a görbe 
alatti terület. A testben el őre meghatározott id őtartamon belül felszívódott vizs ­
gált vegyi anyag teljes mennyiségét jelenti. Lineáris feltételek mellett az AUC (a 
nullától a végtelenig) a felszívódás sebességét ől függetlenül arányos a testben 
felszívódott vizsgált vegyi anyag teljes mennyiségével.  
Autoradiográfia  (egésztest-autoradiográfia): Radioaktív vizsgált vegyi anyagok 
szöveteken belüli lokalizációjának min őségi és/vagy mennyiségi meghatározására 
szolgáló technika, amely röntgenfilmet, vagy az utóbbi id őben digitális foszforos 
képalkotást alkalmaz a radioizotóppal jelölt molekulák vagy molekulafragmen ­
tumok láthatóvá tételére oly módon, hogy rögzíti a vizsgált tárgyon belül kibo ­
csátott sugárzást. A mennyiségi egésztest-autoradiográfia el őnyökkel járhat a 
szerv feltárásával szemben a vizsgált vegyi anyag eloszlásának értékelése, vala ­
mint a szövetekben lév ő radioaktív anyag általános visszanyerésének és bomlá ­
sának vizsgálata szempontjából. A módszer egyik jelent ős előnye például, hogy 
felhasználható egy pigmentált állatokat alkalmazó modellben a vizsgált vegyi anyag a bizonyos molekulák megkötésére képes melaninnal történ ő lehetséges 
összekapcsolódásának vizsgálatához. Ugyanakkor bár megfelel ő képet nyújthat az 
egész testr ől a nagy kapacitású és alacsony affinitású kötési helyek vonatkozá ­
sában, a technológia korlátokba ütközhet olyan konkrét célterületek felismerése ­
kor, mint a receptorkötési területek, ahol viszonylag nagy felbontás és magas 
érzékenység szükséges az észleléshez. Az autoradiográfia használata esetén a 
bejuttatott vegyület tömegmérlegének meghatározására irányuló kísérleteket különálló csoportként vagy külön vizsgálat során kell elvégezni, nem a szöveti 
eloszlást vizsgáló kísérlet részeként, ahol az összes kiürül ő anyagot (amely 
magában foglalhatja a kilélegzett leveg őt is) és egész testeket homogenizálunk 
és vizsgálunk folyadékszcintillációs számlálás segítségével.
 
Epén keresztüli kiürülés : Kiválasztódás az epevezetékeken keresztül.  
Bioakkumuláció : Lásd: »Felhalmozódás«.  
Biológiai hozzáférhet őség: A bejuttatott dózis azon frakciója, amely eléri a 
szisztémás keringést, vagy amely elérhet ővé válik a fiziológiai hatás helyén. 
Egy vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhet ősége általában a kiindulási vegyü ­
letre vonatkozik, de vonatkozhat annak metabolitjára is. Csak az egyik kémiai formát veszi figyelembe.  Nota bene:  a biológiai hozzáférhet őség és a felszívódás 
nem ugyanaz. A szájon át történ ő felszívódás (azaz a bélfalon és a portális 
keringésben való jelenlét) és a biológiai hozzáférhet őség (azaz a szisztémás 
vérben és szövetekben való jelenlét) közötti különbség például a kémiai lebom ­
lásból adódhat a bélfali anyagcsere vagy a bél bels ő részébe történ ő kiáramló 
szállítás vagy a májban végbemen ő preszisztémás metabolizmus, vagy más 
tényezők miatt (10). A toxikus összetev ő (kiindulási vegyület vagy metabolit) 
biológiai hozzáférhet ősége kritikus paraméter a humán kockázat értékelése (a 
magasról az alacsony dózisra való extrapoláció, útvonalak közötti extrapoláció) 
során a bels ő értékek küls ő NOAEL vagy BMD (alkalmazott dózis) alapján 
történő kiszámítása szempontjából. A májra szájon át történ ő bejuttatás nyomán 
gyakorolt hatások tekintetében a szájon át történ ő felszívódás vizsgálata 
elegendő. A bejutás helyén jelentkez ő hatások kivételével azonban a biológiai 
hozzáférhet őség általában az összes hatás szempontjából megbízhatóbb paraméter 
a kockázatértékelésben történ ő további használatra, mint a felszívódás.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Bioperzisztencia : Lásd: »Perzisztencia«.  
Biotranszformáció : Az adott vizsgált vegyi anyag (általában enzimatikus) kémiai 
átalakulása egy másik vegyi anyaggá a testen belül. A metabolizmus szinonimája.  
C max : Vagy a bejuttatást követ ő maximális (legmagasabb) koncentráció a vérben 
(plazmában/szérumban), vagy a bejuttatást követ ő maximális (legnagyobb 
mértékű) kiürülés (vizeletben vagy székletben).  
Kiürülési sebesség : A vizsgált vegyi anyag vérb ől, plazmából vagy egy bizonyos 
szövetből egy egységnyi id ő alatt történ ő távozása mértékének mennyiségi 
meghatározása.  
Kompartment : A test, szövet, vagy sejt strukturális vagy biokémiai része (vagy 
egysége), amely független a többit ől. 
Detoxikációs útvonalak : A toxikus vegyi anyagok testb ől történő, metabolikus 
változás vagy kiürülés útján végbemen ő kiürüléséhez vezet ő lépések sorozata.  
Eloszlás : A vizsgált vegyi anyag és származékainak eloszlása a szervezet egészé ­
ben. 
Enzimek/izoenzimek : Kémiai reakciókat katalizáló fehérjék. Az izoenzimek 
hasonló kémiai reakciókat katalizáló, de aminosav-szekvenciájukban különböz ő 
enzimek.  
Enzimatikus paraméterek : K  m : Michaelis-állandó, valamint V  max : maximális 
sebesség.  
Kiürülés : Azon folyamat(ok), amely(ek) révén a bejuttatott vizsgált vegyi anyag 
és/vagy annak metabolitjai távoznak a szervezetb ől. 
Exogén : A szervezeten vagy rendszeren kívülr ől bejuttatott vagy ott termelt.  
Extrapoláció : Egy vagy több ismeretlen értékre való következtetés ismert vagy 
megfigyelt adatok alapján.  
Felezési id ő (t 1/2 ): Egy adott kompartmentben lév ő vizsgált vegyi anyag koncent ­
rációjának felére való csökkenéséhez szükséges id ő. Általában a plazmabeli 
koncentrációra vagy a vizsgált vegyi anyag egész testben jelen lév ő mennyi­
ségére vonatkozik.  
Indukció/enzimindukció : Környezeti inger vagy indukáló molekula hatására 
lezajló enzimszintézis.  
Linearitás/lineáris kinetika : Egy folyamat kinetikai szempontból akkor lineáris, 
ha a kompartmentek közötti átvitel sebessége arányos a jelen lév ő mennyi­
ségekkel vagy koncentrációkkal, azaz els őrendű. Következésképpen a kiürülési 
és eloszlási mennyiségek, valamint a felezési id ők is állandók. Az elért koncent ­
rációk arányosak az adagolás mértékével (expozícióval), és a felhalmozódás is könnyebben el őre jelezhet ő. A linearitás/nemlinearitás a vonatkozó paraméterek, 
például a különböz ő dózisok utáni vagy egyszeri, illetve ismételt expozíció utáni 
AUC összehasonlításával vizsgálható. A dózistól való függ őség hiánya a 
vegyület metabolizmusában részt vev ő enzimek telít ődésére, az AUC ismételt 
expozíciót követ ő, egyszeri expozícióhoz képesti növekedése pedig a metabo ­
lizmus akadályozására utalhat, míg az AUC csökkenése a metabolizmus induk ­
cióját jelezheti (lásd még: (11)).
 
Tömegmérleg : A vizsgált vegyi anyag szervezetbe bejutott és onnan távozó 
mennyiségének mérlege.  
Anyagmérleg : Lásd: »Tömegmérleg«.  
Toxicitás mechanizmusa (módja)/hatásmechanizmus (-mód) : A hatásmecha ­
nizmus azokat a meghatározott biokémiai interakciókat jelenti, amelyek révén a 
vizsgált vegyi anyag kifejti hatását. A hatás módja a vizsgált vegyi anyag toxi ­
citásához vezet ő általánosabb folyamatokat jelenti.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Metabolizmus : A biotranszformáció szinonimája.  
Metabolitok : A metabolizmus vagy a metabolikus folyamatok termékei.  
Szájon át történ ő felszívódás : A vizsgált vegyi anyag dózisának a bejuttatás 
helyén (például az emészt őrendszerben) felszívódott százaléka. Ez a kritikus 
paraméter felhasználható a bejuttatott vizsgált vegyi anyag azon frakciójának megismeréséhez amely eléri a portális vénát, majd a májat.
 
Megoszlási hányados : Más néven megoszlási együttható; egy vegyi anyag két 
oldószerben fennálló különböz ő oldhatóságát fejezi ki.  
Vérben (plazmában/szérumban) megfigyelhet ő legmagasabb szintek : A bejut­
tatást követ ő maximális (legmagasabb) koncentráció a vérben (plazmában/szé ­
rumban) (lásd még: »C  max «). 
Perzisztencia (bioperzisztencia) : Az adott vegyi anyag hosszú távú jelenléte 
(egy biológiai rendszerben) a lebomlásnak/eltávolításnak való ellenállás követ ­
keztében.  
Read-across módszer : Egy vagy több vegyi anyag végponti információinak 
felhasználása a célvegyszer végpontjának el őrejelzéséhez.  
Receptoros mikroszkopikus autoradiográfia  (vagy receptoros mikroautoradio ­
gráfia): Ez a technológia a meghatározott szöveti helyekkel vagy sejtpopuláci ­
ókkal történ ő xenobiotikus interakció vizsgálatára használható, például a recep ­
torkötéssel vagy meghatározott hatásmóddal foglalkozó vizsgálatok során, 
amelyek nagy felbontást és magas fokú érzékenységet igényelhetnek, és amelyek 
más technológiákkal, például egésztest-autoradiográfiával nem megvalósíthatók.  
Bejuttatási útvonal  (szájon át történ ő, intravénás, b őrön át történ ő, belélegezte ­
téssel történ ő stb.): A vegyi anyagok testbe történ ő bejuttatásának módját jelenti 
(például szájon át szondatáplálással, szájon át táplálékkal, b őrön át, belélegezte ­
téssel, intravénásan stb.).  
Telítettség : Az az állapot, amikor egy vagy több kinetikai folyamat (például 
felszívódás, metabolizmus vagy kiürülés) eléri a maximumát (azaz »telítetté« válik).
 
Érzékenység : Egy módszer vagy eszköz azon képessége, hogy meg tudja külön ­
böztetni az adott változó különböz ő szintjeire utaló mérési eredményeket.  
Állandósult vér- (plazma-) szintek : Egy nyílt rendszer nem egyensúlyi állapota, 
amelyben a rendszerre ható összes hatást pontosan kiegyenlítik az ellentétes 
hatások, oly módon, hogy a rendszer összes összetev őjének koncentrációja 
állandó annak ellenére, hogy a rendszeren anyag áramlik keresztül.  
Rendszermodell  (élettani alapú toxikokinetikai, farmakokinetikai alapú, élettani 
alapú farmakokinetikai, biológiai alapú stb.): Egy rendszer viselkedését a mate ­
matika nyelvén leíró absztrakt modell.  
Célszövet : Az a szövet, amelyben egy toxikus anyag valamely els ődleges negatív 
hatása megmutatkozik.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Vizsgált vegyi anyag : A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely vegyi anyag vagy keverék.  
Szöveti eloszlás : A vizsgált vegyi anyagnak a test egyik helyér ől a másikra 
történő, visszafordítható mozgása. A szöveti megoszlás a szerv feltárása, homo ­
genizáció, oxidáció és folyadékszcintillációs számlálás, vagy min őségi és/vagy 
mennyiségi egésztest-autoradiográfia segítségével vizsgálható. Az el őbbi hasznos 
az ugyanazon állatok szöveteib ől és maradványaiból visszanyert vizsgált vegyi 
anyag koncentrációjának és százalékos arányának meghatározásához, de felbon ­
tása nem feltétlenül megfelel ő az összes szövet vizsgálatához, és lehet, hogy 
általánosságban nem képes elérni a visszanyert vegyi anyag ideális mennyiségét 
(< 90 %). Az utóbbi meghatározását lásd fent.  
T max : A C  max eléréséhez szükséges id ő. 
Toxikokinetika  (farmakokinetika): Vegyi anyagok id őbeli felszívódásának, 
eloszlásának, metabolizmusának és kiürülésének vizsgálata.  
Modellek validációja : Egy modell rendelkezésre álló toxikokinetikai adatok 
konzisztens leírására való megfelel ősége értékelésének folyamata. A modelleket 
azok előrejelzéseinek a kísérleti értékekkel történ ő statisztikai és vizuális össze ­
hasonlításával lehet értékelni egy közös, független változó (például az id ő) alap­
ján. Az értékelés mértékét indokolni kell a modell tervezett használata vonatko ­
zásában.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT AKUT 
KÉSLELTETETT NEUROTOXICITÁS  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Az egyes anyagok toxikus hatásainak felbecslése és kiértékelése 
során fontos azt figyelembe venni, hogy az anyagok egyes osztályai bizonyos típusú neurotoxicitást okozhatnak, amelyet esetleg nem lehet bebizonyítani más típusú toxicitásvizsgálatokkal, de szükséges 
a vizsgálata. Egyes foszfororganikus vegyületek a korábbi megfigye ­
lések szerint késleltetett neurotoxikus hatásokat okoznak, ezek azok az anyagok, amelyeknek az e (alábbiakban ismertett) módszer 
szerinti vizsgálata szóba jöhet.
 
In vitro  szűrővizsgálatokat lehet alkalmazni azoknak az anyagoknak 
a meghatározása céljából, amelyek késleltetett polyneuropathiát okozhatnak; mindazonáltal az  in vitro  vizsgálatok negatív eredménye 
nem biztosíték arra, hogy az anyag nem idegméreg.
 
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
A foszfororganikus vegyületekhez tartoznak azok a telítetlen foszfo ­
rorganikus észterek, a tioészterek vagy a szerves foszforsavak, a 
foszfonsavak és a foszforamid-savak anhidridjei, illetve a rokon fosz ­
fortiosav, foszfontiosav vagy foszfortioamid-sav, továbbá egyéb anyagok, amelyek ebbe a vegyületosztályba tartoznak, és olykor megfigyelhet ő késleltetett neurotoxicitást okozhatnak.
 
Késleltetett neurotoxicitás az a tünetcsoport, amely a hosszan késlel ­
tetett végtagmozgási zavarokkal (ataxia), a gerincvel ő és a környéki 
(perifériás) idegek távoli köt ődéseivel és az idegszövetben lév ő 
neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlásával vagy öregedésével kapcsolatos.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Egy referenciaanyagot meg lehet vizsgálni egy pozitív kontrollcso ­
port segítségével azzal a céllal, hogy bemutassák, hogy laboratóriumi 
vizsgálati körülmények között a kísérleti fajok reakciója nem 
változik lényegesen.  
Példa egy széleskör űen alkalmazott idegméregre a tri-o-tolil-foszfát 
(CAS 78-30-8, EINECS 210-103-5, CAS-elnevezése: Foszforsav- trisz(4-metilfenil)-észter, más néven Trikrezil-foszfát.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot egy dózisban, szájon keresztül adják be házityú ­
koknak, amelyeket szükség esetén megóvtak az akut kolinerg hatá ­
soktól. Az állatokat 21 napon keresztül figyelik meg viselkedési 
rendellenességek, ataxia és paralízis szempontjából. A biokémiai 
paramétereket, különösen a neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlását minden csoportból véletlenszer űen kiválasztott tyúkokon 
mérik, általában az adagolás után 24–48 órával. Az adagolás után 
21 nappal az életben maradt tyúkokat elpusztítják, és egyes idegszö ­
vetek kórszövettani vizsgálatát elvégzik.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  Előkészületek  
Egészséges, fiatal, feln őtt tyúkokkal kísérleteznek, amelyek mentesek 
a zavaró vírusos betegségekt ől és gyógykezelést ől, továbbá nincs 
járászavaruk; az állatokat véletlenszer űen kezelt és kontrollcsoportba 
osztják és a vizsgálat megkezdése el őtt legalább öt napig hagyják 
őket a laboratóriumi körülményekhez alkalmazkodni.  
Olyan ketrecet vagy karámot használnak, amely elég nagy ahhoz, 
hogy lehet ővé tegye a tyúkok szabad mozgását és a járáskép könny ű 
megfigyelését.  
A vizsgált anyagot orálisan adják be, gyomorszonda segítségével, 
vagy zselatin kapszulák alkalmazásával vagy egyéb hasonló eljárás ­
sal. A folyadékokat hígítás nélkül vagy megfelel ő vivőanyagban, pl. 
kukoricaolajban feloldva adják be; a szilárd anyagokat lehet őség 
szerint feloldják, mivel a zselatin kapszulába helyezett nagy mennyi ­
ségű szilárd anyag esetleg nem szívódik fel teljesen. Amennyiben 
nem víz a viv őanyag, akkor a viv őanyag toxikus tulajdonságainak 
ismertnek kell lenniük, eltér ő esetben e tulajdonságokat a vizsgálat 
megkezdése el őtt meghatározzák.  
1.5.2.  Vizsgálati körülmények  
1.5.2.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
A fiatal feln őtt, 8–12 hónapos házi tojótyúk ( Gallus gallus domesti ­
cus) használata ajánlott. A szokásos méret ű fajtákat használják, olyan 
tyúkokat, amelyeket szabad mozgást biztosító körülmények között tenyésztettek.
 
1.5.2.2.  Az állatok száma és neme  
A kezelt csoport mellett mind viv őanyagos kontrollcsoportot, mind 
pozitív kontrollcsoportot vizsgálnak. A viv őanyagos kontrollcso ­
portban lév ő állatokat a vizsgált anyag beadásától eltekintve a kezelt 
csoportba beosztottakkal azonos bánásmódban részesítik.  
Az egyes csoportokban lév ő állatok számát oly módon határozzák 
meg, hogy legalább hat madarat el lehessen pusztítani a biokémiai paraméterek meghatározásaihoz (hármat-hármat a két külön 
megfigyelési id őpontban); továbbá hat madár túlélje a 21 napos 
megfigyelési id őszakot, mert ezeken patológiai vizsgálatokat 
végeznek majd.
 
A pozitív kontrollcsoportot lehet egyidej űleg vizsgálni, vagy ez lehet 
egy korábbi, már vizsgált kontrollcsoport is. Ez a csoport legalább hat tyúkból áll, amelyeket egy ismert, késleltetett hatású idegmé ­
reggel kezelnek. Az állatok közül hármat biokémiai, hármat patoló ­
giai vizsgálatok céljára szánnak. A korábbi adatok rendszeres aktu ­
alizálása javasolt. Új pozitív kontrolladatokat vesznek fel, ha a vizs ­
gálat lefolytatásának valamilyen fontos eleme (pl. származás, táplá ­
lék, tartási körülmények) megváltozik a vizsgálatot végz ő laborató­
riumban.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Adagolási szintek  
Az előzetes tanulmány során megfelel ő számú állatnak és adagolási 
csoportnak a f ő kísérletben alkalmazott dózist adagolják. Csekély 
számú kísérleti állat elhullása általában szükséges ebben az el őzetes 
tanulmányban, a f ő vizsgálat megfelel ő dózisszintjeinek kiválasztá ­
sához. Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkez ő elhullások 
megakadályozása érdekében atropint vagy egyéb olyan véd ő ható­
anyagot alkalmazhatnak, amely közismerten nem befolyásolja a 
késleltetett neurotoxikus hatásokat. Többféle vizsgálati módszer 
alkalmazható a vizsgált anyag legnagyobb nem halálos dózisának meghatározásához (lásd B.l.A. módszer). A tyúkokra vonatkozó 
korábbi adatok vagy egyéb toxikológiai adatok is hasznosnak bizo ­
nyulhatnak a dózis kiválasztása során.
 
A fő vizsgálat során alkalmazott vizsgált anyag dózisa az el őzetes 
dózisbehatároló vizsgálat eredményeinek figyelembevételével meghatározott lehet ő legmagasabb legyen, 2 000 mg/kg testsúly 
felső határ mellett. Esetleg el őforduló id őközbeni elhullás nem gátol ­
hatja meg a szükséges mennyiség ű állat túlélését a biokémiai (hat) és 
a szövettani (hat) vizsgálatokhoz a 21. napon. Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkez ő elhullást atropinnal vagy egyéb véd ő 
hatóanyag alkalmazásával kerülik el, amely bizonyított módon nem 
gyakorol befolyást a késleltetett neurotoxikus hatásokra.
 
1.5.2.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha a kísérlet során a legalább 2 000 mg/kg testsúly/nap adagolási 
szint, illetve az e vizsgálat lefolytatására el őírt eljárás betartása 
mellett a vizsgált anyag nem okoz észlelhet ő toxikus hatásokat, és 
ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok 
alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. A határérték-vizsgálat alkalmazható, kivéve ha emberi 
expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja.
 
1.5.3.  Megfigyelési id őszak  
A megfigyelési id őszak 21 nap.  
1.5.4.  A kísérlet végrehajtása  
Az akut kolinerg hatások miatt bekövetkez ő elhullás megakadályo ­
zása érdekében alkalmazott véd ő anyag beadása után a vizsgált 
anyagot egyszeri dózisban adják be.  
M e g f i g y e l é s e k  
A megfigyelés mindjárt közvetlenül az expozíció után megkezd ődik. 
Az első 2 napon minden tyúkot többször gondosan megfigyelnek, 
majd ezt követ ően 21 napon keresztül vagy a tervezett elpusztításig, 
legalább naponta egyszer. A toxicitás minden tünetét gondosan feljegyzik, beleértve a viselkedési rendellenesség kialakulásának 
időpontját, típusát, súlyosságát és tartamát. A végtagok mozgási 
zavarát (ataxia) skálán mérik, amely legalább négy szintet tartalmaz, továbbá a bénulást (paralízis) is feljegyzik. Hetente legalább kétszer kiveszik a ketrecb ől azokat a tyúkokat, amelyeket patológiai vizs ­
gálatoknak szándékoznak alávetni, és egy meghatározott id őre foko­
zott motoros tevékenységet váltanak ki (pl. létramászás), hogy már a legkisebb jelentkez ő toxikus hatások megfigyelhet őségét megköny ­
nyítsék. A haldokló állatokat és súlyosan szenved ő, vagy fájda ­
lommal küszköd ő állatokat az állatvédelmi el őírásoknak megfelel ően 
elpusztítják, majd felboncolják.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
T e s t s ú l y  
Minden tyúkot lemérnek közvetlenül a vizsgált anyag beadása el őtt, 
majd ezután legalább hetente egyszer.  
B i o k é m i a i v i z s g á l a t o k  
Minden kezelt és viv őanyag kontrollcsoportból hat tyúkot, a pozitív 
kontrollcsoportból hármat (ha egyidej űleg ezt a csoportot is vizsgál ­
ják) véletlenszer űen kiválasztanak és a vizsgált anyag beadása után 
pár nappal elpusztítanak, azért hogy az agyat és a lumbális gerinc ­
velőt preparálják, és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló 
aktivitást megmérik. Ezen túlmen ően hasznos lehet az ül őideg kiké ­
szítése és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló aktivitá ­
sának megmérése. Általában három madarat pusztítanak el mind a kezelt csoportokban, mind a negatív kontrollcsoportban az utolsó dózis után 24 órával, és másik hármat 48 órával kés őbb, a pozitív 
kontrollcsoportból származó három kísérleti állatot 24 órával kés őbb 
pusztítják el. Ha az intoxikáció klinikai tüneteinek megfigyeléséb ől 
(pl. a kolinerg tünetek id őbeli jelentkezésének megfigyeléséb ől) arra 
lehet következtetni, hogy a toxikus hatóanyag kifejezetten lassan hat, 
akkor ajánlatos mind a három állattól két alakalommal 24–72 órával 
a vizsgált anyag adagolását követ ően szövetmimtákat venni.
 
Acetil-kolin észteráz (AChE) elemzését is el lehet végezni ezeken a 
mintákon, ha az célszer űnek tűnik. Figyelembe kell azonban venni az 
AChE spontán újraaktiválódását, amely  in vivo  előfordulhat, és így 
az anyag AChE gátló hatásának alulértékelését okozhatja.  
A u t o p s z i a  
Minden (a tervezett módon és a haldoklás miatt állatvédelmi okokból 
elpusztított) állat agyát és gerincvel őjét boncolásnak vetik alá.  
K ó r s z ö v e t t a n i v i z s g á l a t  
A vizsgálati id őszakot túlél ő és azon állatok idegszöveteit, amelyeket 
nem biokémiai kísérleteknek vetnek alá, mikroszkóppal megvizsgál ­
ják. A szöveteket perfúziós módszerrel természetes helyzetben ( in 
situ) tartósítják. A metszetek tartalmazzák a kisagyat (középs ő 
hosszanti szinten), a nyúltagyat, a gerincvel őt és a környéki (perifé ­
riás) idegeket. Gerincvel ő-metszeteket a fels ő nyaki, a középs ő mell­
kasi és az ágyékkeresztcsonti szakaszból veszik. A környéki idegi metszeteket a sípcsonti ideg és gyomorizomhoz tartó elágazásaiból és az ülőidegből veszik. A metszeteket megfestik a megfelel ő mielinre 
és axonra érzékeny festékkel. El őször elvégzik a mikroszkópos vizs ­
gálatot minden állat tartósított szövetein a kontroll- és a legnagyobb adagolású csoportnál. Ha bizonyítható a hatás a legnagyobb adago ­
lású csoportnál, akkor elvégzik a mikroszkópos vizsgálatot a középs ő 
és az alacsony adagolású csoport állatainak szövetein is.
 
2. ADATOK  
Az ebben a módszerben a kiválasztott végpontokon kapott negatív 
eredmények (biokémia, kórszövettan és viselkedési megfigyelések) általános esetben nem igényelnek további vizsgálatot a késleltetett neurotoxicitás vonatkozásában. Bizonytalan vagy nem meggy őző 
eredmények esetén szükség lehet további vizsgálatokra.
 
Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az 
összes adatot táblázat formájában összegzik. Ebb ől a kísérleti állatok 
minden csoportja tekintetében kiderül: a kísérlethez felhasznált álltok száma a vizsgálat elején, a sérült állatok száma, viselkedési vagy biokémiai hatások, a sérülések, illetve hatások típusa, súlyossága 
és az egyes sérüléseket vagy hatásokat mutató állatok százalékos 
eloszlása, típus és súlyosság szerint csoportosítva.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
E vizsgálat eredményeit az egyes kezelt és kontrollcsoportok tekin ­
tetében viselkedési, biokémiai és kórszövettani hatások gyakorisága, 
súlyossága, korrelációja, valamint bármely más megfigyelt hatás alapján értékelik ki.
 
A számszer ű eredményeket megfelel ő, általánosan elfogadott statisz ­
tikai módszerekkel értékelik ki. Az alkalmazott statisztikai módsze ­
reket a vizsgálat tervezése során választják ki.  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – tartalmazza a követ ­
kező információkat:  
3.1. Kísérleti állatok  
— a felhasznált állatok faja,  
— az állatok száma és életkora,  
— az állatok eredete, tartási körülmények stb.,  
— az egyes állatok súlya a vizsgálat kezdetekor.  
3.2. Vizsgálati körülmények  
— a vizsgált anyag el őkészítésére, stabilitására és homogenitására 
vonatkozó részletek,  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag beadására vonatkozó adatok,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok,  
— a dózis kiválasztásának indoka,  
— a beadott dózisok jellemzése, beleértve a viv őanyagot, térfogatot 
és a beadott anyag fizikai formáját,  
— bármely beadott véd őanyag nevét, illetve beadására vonatkozó 
adatokat.  
3.3. Eredmények  
— testsúlyadatok,  
— a toxikus reakciókra vonatkozó adatok csoportonként, beleértve 
az elhullást,  
— a megfigyelt klinikai tünetek természete, súlyossága és tartama 
(reverzibilisek vagy nem),  
— a biokémiai módszerek részletes leírása és eredményei,  
— boncolási eredmények,  
— az összes kórszövettani lelet részletes leírása,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható.  
Az eredmények tárgyalása  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZÁSOK  
Ez a módszer megfelel az OECD TG 418-nak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  SZERVES FOSZFORVEGYÜLETEKKEL KIVÁLTOTT 
KÉSLELTETETT NEUROTOXOCITÁS-VIZSGÁLAT, 28 
NAPOS ISMÉTELT ADAGOLÁS ESETÉN  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
Az egyes anyagok toxikus hatásainak felbecslése és kiértékelése 
során fontos azt figyelembe venni, hogy az anyagok egyes osztályai bizonyos típusú neurotoxicitást okozhatnak, amelyet esetleg nem 
lehet bebizonyítani más típusú toxicitásvizsgálatokkal, de szükséges 
a vizsgálata. Egyes foszfororganikus vegyületek a korábbi megfigye ­
lések szerint késleltetett neurotoxikus hatásokat okoznak, ezek azok 
az anyagok, amelyeknek az e (alábbiakban ismerteti) módszer 
szerinti vizsgálata szóba jöhet.
 
In vitro  szűrővizsgálatokat lehet alkalmazni azoknak az anyagoknak 
a meghatározása céljából, amelyek késleltetett polyneuropathiát okozhatnak; mindazonáltal az  in vitro  vizsgálatok negatív eredménye 
nem biztosíték arra, hogy az anyag nem idegméreg.
 
Ez a 28 napos késleltetett neurotoxicitást vizsgáló tanulmány isme ­
reteket szolgáltat azokról a lehetséges egészségügyi veszélyekr ől, 
amelyek adott id őn keresztül ismétl ődő expozíció során fennállhat ­
nak. Ezen vizsgálat eredményeib ől következtetéseket lehet levonni a 
dózis-hatás viszonyra, valamint lehet ővé teszi annak a küszöbdó ­
zisnak a meghatározását, amelynél nem észlelhet ő kedvezőtlen 
hatás (NOAEL), és amely hasznos lehet az emberi expozíció bizton ­
sági kritériumainak meghatározása során.  
Lásd az Általános bevezetés B. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
A foszfororganikus vegyületekhez tartoznak azok a telítetlen foszfo ­
rorganikus észterek, a tioészterek vagy a szerves foszforsavak, a 
foszfonsavak és a foszforamid-savak anhidridjei, illetve a rokon fosz ­
fortiosav, foszfontiosav vagy foszfortioamid-sav, továbbá egyéb anyagok, amelyek ebbe a vegyületosztályba tartoznak, és olykor 
megfigyelhet ő késleltetett neurotoxicitást okozhatnak.
 
Késleltetett idegmérgezés az a tünetcsoport, amely a hosszan késlel ­
tetett végtagmozgási zavarokkal (ataxia), a gerincvel ő és a környéki 
(perifériás) idegek távoli köt ődéseivel és az idegszövetben lév ő 
neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlásával vagy öregedésével kapcsolatos.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot naponta egyszer, szájon át adják be házityú ­
koknak 28 napon keresztül. Az állatokat az utolsó dózis beadását követően 14 napon keresztül figyelik, legalább naponta egyszer a 
viselkedési rendellenességek, ataxia és paralízis szempontjából. A 
biokémiai paramétereket, különösen a neuropathiás cél-észterázok (NTE) gátlását minden csoportból véletlenszer űen kiválasztott 
tyúkokon mérik, általában az adagolás után 24–48 órával. Az 
adagolás után két héttel az életben maradt tyúkokat elpusztítják, és 
az egyes idegszövetek kórszövettani vizsgálatát elvégzik.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
Egészséges, fiatal, feln őtt tyúkokkal kísérleteznek, amelyek mentesek 
a zavaró vírusos betegségekt ől és gyógykezelést ől, továbbá nincs 
járászavaruk; az állatokat véletlenszer űen kezelt és kontrollcsoportba 
osztják, és a vizsgálat megkezdése el őtt legalább öt napig hagyják 
őket a laboratóriumi körülményekhez alkalmazkodni.  
Olyan ketrecet vagy karámot használnak, amely elég nagy ahhoz, 
hogy lehet ővé tegye a tyúkok szabad mozgását és a járáskép könny ű 
megfigyelését.  
A vizsgált anyagot heti hét napon át orálisan adják be, gyomor ­
szonda segítségével, vagy zselatin kapszulák alkalmazásával. A folyadékokat hígítás nélkül vagy megfelel ő vivőanyagban, pl. kuko ­
ricaolajban feloldva adják be; a szilárd anyagokat lehet őség szerint 
feloldják, mivel a zselatin kapszulába helyezett nagy mennyiség ű 
szilárd anyag esetleg nem szívódik fel teljesen. Amennyiben nem víz a viv őanyag, akkor a viv őanyag toxikus tulajdonságainak 
ismertnek kell lenniük, eltér ő esetben e tulajdonságokat a vizsgálat 
megkezdése el őtt meghatározzák.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Kísérlethez felhasznált állatok  
A fiatal feln őtt, 8–12 hónapos házi tojótyúk ( Gallus gallus domesti ­
cus) használata ajánlott. A szokásos méret ű fajtákat használják, olyan 
tyúkokat, amelyeket szabad mozgást biztosító körülmények között 
tenyésztettek.  
1.4.2.2.  Az állatok száma és neme  
Általában a három kezelt csoport mellett viv őanyagos kontrollcso ­
portot is vizsgálnak. A viv őanyagos kontrollcsoportban lév ő állatokat 
a vizsgált anyag beadásától eltekintve a kezelt csoportba beosztot ­
takkal azonos bánásmódban részesítik.  
Az egyes csoportokban lév ő állatok számát oly módon határozzák 
meg, hogy legalább hat madarat el lehessen pusztítani a biokémiai 
paraméterek meghatározásaihoz (hármat-hármat a két külön 
megfigyelési id őpontban); továbbá hat madár túlélje 14 nappal az 
utolsó beadott adagot, mert ezeken patológiai vizsgálatokat végeznek majd.
 
1.4.2.3.  Adagolási szintek  
Az adagolási szintek kiválasztásánál figyelembe veszik a késleltetett 
neurotoxicitás (akut) megállapítására elvégzett vizsgálat eredményeit 
és a vizsgált anyag toxicitásra, illetve kinetikájára vonatkozóan 
rendelkezésre álló adatokat. A legmagasabb dózist úgy választják ki, hogy az toxikus tüneteket keltsen, de ne okozzon halált, vagy súlyos szenvedést a kísérleti állatoknak. Ezután az adagokat fokoza ­
tosan csökkentik, azzal a céllal, hogy bemutassák az adagolási 
szinttől függő hatásokat és a nem észlelhet ő kedvezőtlen hatás szintet.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha a kísérlet során a legalább 1 000 mg/kg testsúly/nap adagolási 
szint, illetve az e vizsgálat lefolytatására el őírt eljárás betartása 
mellett a vizsgált anyag nem okoz észlelhet ő toxikus hatásokat, és 
ha a szerkezet tekintetében rokon anyagokra vonatkozó adatok 
alapján nem is várható a toxicitás bekövetkezése, akkor a teljes, három adagolási szintet átfogó tanulmány elvégzése szükségtelennek tekinthető. A határérték-vizsgálat alkalmazható, kivéve ha emberi 
expozíció ennél nagyobb adagolási szint használatát indokolja.
 
1.4.2.5.  Megfigyelési id őszak 
Minden állatot legalább naponta megfigyelnek az expozíció id őszaka 
alatt, majd azt követ ően 14 napon keresztül, kivéve ha tervezett 
boncolást hajtanak végre.  
1.4.3.  A kísérlet végrehajtása  
Az állatoknak 28 napon keresztül hetente hétszer adják be a vizs ­
gálati anyagot.  
M e g f i g y e l é s e k  
A megfigyelés mindjárt közvetlenül a kezelés kezdetét ől tart. A 
kezelés mind a 28 napján majd az utolsó adag beadását követ ően 
14 napon át vagy a tervezett elpusztításig legalább naponta egyszer megfigyelnek minden állatot. A toxicitás minden tünetét gondosan 
feljegyzik, beleértve kialakulásuk id őpontját, a típust, súlyosságot és 
tartamot. A megfigyelések kiterjednek viselkedési rendellenességekre is. A végtagok mozgási zavarát (ataxia) skálán mérik, amely legalább négy szintet tartalmaz, továbbá a bénulást (paralízis) is feljegyzik. 
Hetente legalább kétszer kiveszik a ketrecb ől az állatokat, és egy 
meghatározott id őre fokozott motoros tevékenységet váltanak ki 
(pl. létramászás), hogy már a legkisebb jelentkez ő toxikus hatások 
megfigyelhet őségét megkönnyítsék. A haldokló állatokat és súlyosan 
szenvedő vagy fájdalommal küszköd ő állatokat az állatvédelmi 
előírásoknak megfelel ően elpusztítják, majd felboncolják.
 
T e s t s ú l y  
Minden tyúkot lemérnek közvetlenül a vizsgált anyag beadása el őtt, 
majd ezután legalább hetente egyszer.  
B i o k é m i a i v i z s g á l a t o k  
Minden kezelt és viv őanyag kontrollcsoportból hat tyúkot kiválasz ­
tanak véletlenszer űen, és a vizsgált anyag utolsó beadása után pár 
nappal elpusztítanak, azért hogy az agyat és a lumbális gerincvel őt 
preparálják, és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló aktivi ­
tást megmérjék. Ezen túlmen ően hasznos lehet az ül őideg kikészítése 
és abban a neuropathiás cél-észteráz (NTE) gátló aktivitásának megmérése. Általában három madarat pusztítanak el mind a kezelt csoportokban, mind a kontrollcsoportban az utolsó dózis után 24 
órával és másik hármat 48 órával kés őbb. Ha az akut vizsgálatból 
vagy más kísérletekb ől (pl. toxikokinetikai) arra lehet következtetni, 
hogy az utolsó adag beadását követ ően a fentiekt ől eltérő időpontban 
fognak mutatkozni a pusztulás jelei, akkor a kísérlet menetét ennek 
megfelelően megváltoztatják, és meg is indokolják a döntést.
 
Az acetil-kolin-észteráz (AChE) elemzését is el lehet végezni a 
mintákon, ha az célszer űnek látszik. Figyelembe kell azonban 
venni az AChE spontán újraaktiválódását, amely  in vivo  előfordulhat, 
és így az anyag AChE gátló hatásának alulértékelését okozhatja.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
A u t o p s z i a  
Minden (a tervezett módon és a haldoklás miatt állatvédelmi okokból 
elpusztított) állat agyát és gerincvel őjét boncolásnak vetik alá.  
K ó r s z ö v e t t a n i v i z s g á l a t o k  
A vizsgálati id őszakot túlél ő és azon állatok idegszöveteit, amelyeket 
nem biokémiai kísérleteknek vetnek alá, mikroszkóppal megvizsgál ­
ják. A szöveteket perfúziós módszerrel természetes helyzetben ( in 
situ) tartósítják. A metszetek tartalmazzák a kisagyat (középs ő 
hosszanti szinten), a nyúltagyat, a gerincvel őt és a környéki (perifé ­
riás) idegeket. Gerincvel ő-metszeteket a fels ő nyaki, a középs ő mell­
kasi és az ágyékkeresztcsonti szakaszból veszik. A környéki idegi 
metszeteket a sípcsonti ideg és gyomorizomhoz tartó elágazásaiból és az ülőidegből veszik. A metszeteket megfestik a megfelel ő mielinre 
és axonra érzékeny festékkel. El őször elvégzik a mikroszkópos vizs ­
gálatot minden állat tartósított szövetein a kontroll- és a legnagyobb 
adagolású csoportnál. Ha bizonyítható a hatás a legnagyobb adago ­
lású csoportnál, akkor elvégzik a mikroszkópos vizsgálatot a középs ő 
és az alacsony adagolású csoport állatainak szövetein is.
 
2. ADATOK  
Az ebben a módszerben a kiválasztott végpontokon kapott negatív 
eredmények (biokémia, kórszövettan és viselkedési megfigyelések) 
általános esetben nem igényelnek további vizsgálatot a késleltetett 
neurotoxicitás vonatkozásában. Bizonytalan vagy nem meggy őző 
eredmények esetén szükség lehet további vizsgálatokra.  
Minden egyes állattal kapcsolatban rögzítik az adatokat. Ezenfelül az 
összes adatot táblázat formájában összegzik. Ebb ől a kísérleti állatok 
minden csoportja tekintetében kiderül: a kísérlethez felhasznált álltok 
száma a vizsgálat elején, a sérült állatok száma, viselkedési vagy biokémiai hatások, a sérülések, illetve hatások típusa, súlyossága és az egyes sérüléseket vagy hatásokat mutató állatok százalékos 
eloszlása, típus és súlyosság szerint csoportosítva.
 
E vizsgálat eredményeit az egyes kezelt és kontrollcsoportok tekin ­
tetében viselkedési, biokémiai és kórszövettani hatások gyakorisága, súlyossága, korrelációja, valamint bármely más megfigyelt hatás alapján értékelik ki.
 
A számszer ű eredményeket megfelel ő, általánosan elfogadott statisz ­
tikai módszerekkel értékelik ki. Az alkalmazott statisztikai módsze ­
reket a vizsgálat tervezése során választják ki.  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés – amennyiben lehetséges – a következ ő infor­
mációkat tartalmazza:  
3.1. Kísérleti állatok  
— a felhasznált állatok faja,  
— az állatok száma és életkora,  
— az állatok eredete, tartási körülmények stb.,  
— az egyes állatok súlya a vizsgálat kezdetekor.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Vizsgálati körülmények  
— a vizsgált anyag el őkészítésére, stabilitására és homogenitására 
vonatkozó részletek,  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgálati anyag beadására vonatkozó adatok,  
— táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok,  
— a dózis kiválasztásának indoka,  
— a beadott dózisok jellemzése, beleértve a viv őanyagot, térfogatot 
és a beadott anyag fizikai formáját,  
— a biokémiai paraméterek meghatározásra választott id őpontok 
indoklása, ha az 24 és 48 órától eltér.  
3.3. Eredmények  
— testsúlyadatok,  
— a toxikus reakciókra vonatkozó adatok csoportonként, beleértve 
az elhullást,  
— nem észlelhet ő kedvezőtlen hatás, NOAEL,  
— a megfigyelt klinikai tünetek természete, súlyossága és tartama 
(reverzibilisek, vagy nem),  
— a biokémiai módszerek részletes leírása és eredményei,  
— boncolási eredmények,  
— az összes kórszövettani lelet részletes leírása,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, ha alkalmazható.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZÁSOK  
Ez a módszer megfelel az OECD TG 419-nek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  NEM ÜTEMEZETT DNS-SZINTÉZIS (UDS)  IN 
VIVO  VIZSGÁLAT EML ŐS MÁJSEJTEKKEL  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 486-nak, eml ősmáj-sejtekkel 
végrehajtott nem ütemezett DNS-szintézis (UDS)  in vivo  vizs­
gálat (1997).  
1.1. BEVEZETÉS  
Az emlősmáj-sejtekkel végzett nem ütemezett DNS-szintézis (UDS)  
in vivo  vizsgálat célja azon anyagok meghatározása, amelyek DNS- 
reparációt váltanak ki a kezelt állatok májsejtjeiben (1) (2) (3) (4).  
Ez az  in vivo  vizsgálat lehet ővé teszi a kémiai anyagoknak a májban 
okozott genotoxikus hatásainak vizsgálatát. A vizsgált végpont 
következtetni enged a májsejtekben a DNS-károsodásra és az ezt követő reparációra. A máj rendszerint az abszorbeált vegyületek 
metabolizmusának f ő helyszíne. Ebb ől következ ően megfelel ő hely 
DNS-károsodás  in vivo  vizsgálatára.
 
Ha bizonyos jelek utalnak arra, hogy a vizsgált anyag nem éri el a 
célszövetet, akkor e vizsgálat nem megfelel ő. 
A nem ütemezett DNS-szintézis (UDS) végpontját a megjelölt nukle ­
ozidok felvételének meghatározásával lehet mérni azon sejtekben, amelyek nem mennek keresztül az ütemezett (S fázisú) DNS-szinté ­
zisen. A legelterjedtebben használt módszer a tríciummal megjelölt 
timidin (
 3 H-TdR) felvételének meghatározása autoradiográfiával. Az  
in vivo  UDS-vizsgálatokban lehet őleg patkánymájat kell használni. 
Májszövetekt ől eltérő szövetek is használhatók, de ezek nem képezik 
e módszer tárgyát.  
Az UDS-reakció észlelése a károsodás helyén a kivágott és helyet ­
tesített DNS-bázisok számától függ. Ezért tehát az UDS-vizsgálat 
különösen értékes az anyag által indukált hosszú szakaszú („long- 
patch reparáció” 20–30 bázispár) észlelésére. Ezzel ellentétben a rövid szakaszú („short-patch reparáció” 1–3 bázis) jóval kisebb érzé ­
kenységgel észlelhet ő. Ezenkívül mutagén hatások jöhetnek létre 
DNS-elváltozások helyre nem állítása, nem megfelel ő helyreállítása 
vagy hibás replikációja miatt. Az UDS-reakció mértéke nem ad jelzést a reparációs folyamat megbízhatóságáról. Ezenkívül el őfordul­
hat, hogy valamely mutagén reakcióba lép a DNS-sel, de nem 
történik meg a DNS-károsodás helyreállítása kivágásos reparáció 
révén (excision repair). A mutagénaktivitással kapcsolatban az UDS-vizsgálat által biztosított speciális információk hiányát e végpontnak a potenciális érzékenysége kompenzálja, mivel ennek 
mérése a teljes genomban történik.
 
Lásd még az Általános bevezetés B. részét is.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Reparálódó sejtek:  a vizsgálatot végz ő laboratórium által el őre 
megadott értéknél magasabb nettó sejtmagi szemcseszám (net nuclear 
grain, NNG).  
Nettó sejtmagi szemcseszám (NNG):  az autoradiográfiás UDS- 
vizsgálatokban az UDS-aktivitás kvantitatív mértéke, amit úgy 
lehet megkapni, hogy a sejtmagi szemcsék számából (NG) le kell vonni a sejtmaggal azonos terület ű citoplazmára es ő szemcsék 
számát(CG): NNG = NG – CG. Minden egyes sejthez ki kell 
számítani az NNG-számokat, majd valamennyi tenyészetre és a 
párhuzamos tenyészetre is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Nem ütemezett DNS-szintézis (UDS):  kémiai anyagok vagy fizikai 
ágensek által indukált DNS-károsodást tartalmazó szakasz kivágása 
és eltávolítása után végbemen ő reparációs DNS-szintézis.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az emlősmáj-sejtekkel végrehajtott  in vivo  UDS-vizsgálat a kémiai 
anyagok vagy fizikai ágensek által indukált DNS-károsodást tartal ­
mazó szakasz kivágása és eltávolítása után végbemen ő reparációs 
DNS-szintézis. A vizsgálat rendszerint  3 H-TdR-nek a májsejtek 
DNS-ébe való beépítésén alapul, ahol csak kisszámú sejt található az S-fázisban. A
 3 H-TdR felvételét rendszerint autoradiográfiásan 
határozzuk meg, mivel e módszer kevésbé érzékeny az S-fázisú 
sejtek zavaró hatására, mint például a folyadékszcintillációs módszer.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  A kísérlethez felhasznált állatok  
Rendszerint patkányokat használnak, de bármilyen megfelel ő emlős 
használata szóba jöhet. Fiatal, egészséges, ivarérett, kísérleti célokra 
tenyésztett laboratóriumi állattörzsekb ől származó állatokat használ ­
nak. A vizsgálat kezdetén az állatok súlya lehet őleg csak minimá ­
lisan térjen el egymástól, és a nemenkénti átlagos értékt ől maximum 
± 20 %-kal különbözhet.  
1.4.1.2.  Tartási és etetési körülmények  
Az Általános bevezetés B. részében ismertetett általános körülmé ­
nyeket kell alkalmazni, bár a páratartalom értékének 50–60 % között 
kell lennie.  
1.4.1.3.  Az állatok el őkészítése  
Az egészséges, fiatal, ivarérett állatokat véletlenszer űen kontroll- és 
kezelt csoportokba osztják. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisak legyenek az elhelyezés miatti esetleges hatások. Ezt 
követően az állatokat egyenként kell azonosítani. Az állatokat 
legalább öt napig szoktatják a laboratóriumi körülményekhez.
 
1.4.1.4.  Vizsgált anyag/el őkészület  
Az adagolás el őtt a szilárd vizsgált anyagokat fel kell oldani vagy 
szuszpendálni megfelel ő oldószerekben vagy viv őanyagokban, és 
hígítani, ha szükséges. A folyékony vizsgált anyagok közvetlenül 
adagolhatók vagy hígíthatók. A vizsgált anyagból mindig friss készít ­
ményeket kell alkalmazni, kivéve ha az anyag tárolás során való stabilitása bizonyított.
 
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  Oldószer/viv őanyag  
Az oldószer nem okozhat toxikus hatásokat a kiválasztott dózisok 
mellett, valamint nem alkalmazható olyan anyag, amely gyaníthatóan 
kémiai reakcióba lép a vizsgált anyaggal. Jól ismert oldószerekt ől 
eltérő oldószerek/viv őanyagok használatakor azok felhasználását alá 
kell támasztani a kompatibilitásukat bizonyító adatokkal. Ameny ­
nyiben lehetséges, el őször valamilyen vizes oldószer/viv őanyag hasz ­
nálatát kell megfontolni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrollok  
Minden kísérlethez egyidej űleg pozitív és negatív (oldószer/ ­
vivőanyag) kontrollokat alkalmazunk. A vizsgált anyaggal való 
kezelés kivételével a kontrollcsoportokba beosztott állatokat azonos 
bánásmódban kell részesíteni a kezelt csoportokban lév ő állatokkal.  
A pozitív kontrollanyagoknak olyan anyagoknak kell lenniük, 
amelyekről ismert, hogy létrehoznak UDS-t olyan expozíciós szinten 
való beadáskor, amelyr ől várható, hogy a háttérszintet meghaladó 
észlelhető növekedést biztosít. Azon pozitív kontrollokat, amelyek 
metabolikus aktiválást igényelnek, olyan dózisban kell alkalmazni, 
ami mérsékelt reakciót vált ki (4). A dózisokat úgy választjuk ki, 
hogy a hatás egyértelm ű legyen, de ne leplez ődjön le azonnal a 
kódolt tárgylemezek identitása a leolvasásnál. A következ ő pozitív 
kontrollanyagok jöhetnek szóba:  
Mintaveteli id ők Anyag CAS-szám EINECS-szám  
Korai mintavételi id ők (2–4 óra) N-Nitrozo-dimetil-amin 62-75-9 200-249-8 
Késői mintavételi id ők (12–16 óra) 2-acetamido-fluorén (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Más megfelel ő pozitív kontrollanyagok is használhatók. Elfogad ­
ható a pozitív kontrollanyagok vizsgált anyagtól eltér ő módon való 
adagolása.  
1.5. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.5.1.  Állatok száma és neme  
Megfelelő számú állatot kell használni, azért hogy a vizsgált anyagra 
adott reakció során a természetes biológiai eltérést figyelembe lehessen venni. Csoportonként legalább három elemezhet ő állatnak 
kell lennie. Ahol az eddigiek során már jelent ős adatbázist gy űjtöt­
tünk össze, csak egy vagy két kísérleti állat szükséges az egyidej űleg 
alkalmazott negatív és pozitív kontrollcsoportokhoz.
 
Ha a tanulmány végrehajtásakor rendelkezésre állnak olyan adatok 
azonos fajták és azonos expozíciósmód használata mellett, amelyek azt mutatják, hogy nincsenek jelent ős különbségek a nemek között a 
toxicitás tekintetében, elegend ő lesz egyetlen nemhez tartozó állatok, 
lehetőleg a hímek vizsgálata. Ahol az emberek esetében az expozíció 
nemre jellemz ő lehet, mint például néhány gyógyszer esetében, a 
vizsgálatot a megfelel ő nemű állatokkal kell elvégezni.
 
1.5.2.  Kezelési menetrend  
A vizsgált anyagot rendszerint egyetlen adagban adjuk be.  
1.5.3.  Dózisok  
Rendszerint legalább két dózist használnak. A legmagasabb adag az 
a dózis, ami olyan egyértelm ű toxicitásjeleket vált ki, hogy annál 
magasabb adagok, azonos adagolás mellett, várhatóan halált okoz ­
nak. Az alacsonyabb dózis a legmagasabb dózis 25–50 %-a.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Specifikus biológiai hatású anyagok alacsony, nem toxikus adagok 
mellett (ilyenek például a hormonok és mutagének), adott esetben 
lehetséges, hogy nem felelnek meg az adagolási kritériumoknak, ezért ezeket eseti alapon kell értékelni. Ha dózisbehatároló vizs ­
gálatot végeznek, mivel nem állnak rendelkezésre megfelel ő adatok, 
ezt ugyanazon laboratóriumban, ugyanazon fajok, törzs, nem és 
kezelési rendszer használatával kell elvégezni, mint amelyet a f ő 
vizsgálatban alkalmazunk.
 
A legnagyobb adag olyan adagként határozható meg, amely a 
májban a toxicitás valamilyen jelzését (például piknotikus nukleusz) 
váltja ki.  
1.5.4.  Határérték-vizsgálat  
Ha egyetlen alkalmommal vagy ugyanazon a napon két adagban 
beadott, legalább 2 000 mg/kg testsúlydózis mellett végrehajtott vizs ­
gálat semmilyen megfigyelhet ő toxikus hatást nem hoz létre, és ha 
nem várható genotoxicitás szerkezetileg rokon anyagokkal kapcso ­
latos adatok alapján, akkor nem szükséges a teljes vizsgálatot elvé ­
gezni. A várt expozíciós hatások az embernél a határérték-vizs ­
gálatban valamilyen magasabb dózis használatának szükségességét jelezhetik.
 
1.5.5.  Adagolás  
A vizsgált anyagot rendszerint gyomorszondán át inkubációs kanül 
segítségével, vagy hasüregbe adott injekció segítségével adják be. 
Elfogadhatók egyéb expozíciós módok, amennyiben azok indokolha ­
tók. Azonban a hasüregbe való beadás nem ajánlott, mivel ez közvet ­
lenül teheti ki a májat a vizsgált anyag hatásának ahelyett, hogy ez a 
keringési rendszeren keresztül történne. A gyomorszondán át vagy 
injekcióval egyszerre beadható maximális folyadékmennyiség a kísérleti állat méretét ől függ. A térfogata nem haladhatja meg a 
2 ml/100 g testsúly mennyiséget. Ennél nagyobb mennyiségek hasz ­
nálatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációértékek esetén 
rendszerint fokozottabb hatást kiváltó irritatív vagy maró anyagok kivételével, a koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra 
kell csökkenteni a vizsgált anyag mennyiségének változásait, hogy 
valamennyi dózisszinten konstans mennyiséget lehessen adagolni a 
kísérleti állatoknak.
 
1.5.6.  Májsejtek preparációja  
Májsejteket rendszerint 12–16 órával az adagolás után kell venni a 
kezelt állatokból. Általában szükség van egy további korai mintavé ­
telre (rendszerint a kezelés után 2–4 órával), ha nem jön létre egyér ­
telmű, pozitív reagálás a kezelés után 12–16 órával. Azonban hasz ­
nálhatók más mintavételi id ők, amikor ez indokolt a toxikokinetikai 
adatok alapján.  
Az emlősmáj-sejtek rövid idej ű (short term) tenyészeteit rendszerint 
úgy hozzák létre, hogy a májon  in situ  átáramoltatnak kollagenázt, és 
lehetővé teszik, hogy a frissen disszociált májsejtek hozzátapadjanak 
valamilyen alkalmas felülethez. A negatív kontrollállatokból szár ­
mazó májsejteknek legalább 50 %-os életképesség űeknek kell 
lenniük (5).  
1.5.7.  UDS meghatározása  
Frissen izolált eml ősmáj-sejteket inkubálunk  3 H-TdR-t tartalmazó 
táptalajjal megfelel ő időtartamig, például 3–8 órán át. Az inkubációs 
időszak végén a tápfolyadékot el kell távolítani a sejtekb ől, amely 
ekkor többlet, nem megjelölt timidint tartalmazó tápfolyadékkal inkubálható a be nem épült radioaktivitás eltávolítása érdekében 
(„cold chase”). A sejteket ezután le kell öblíteni, fixálni és szárítani. 
Hosszabb inkubációs id ők esetén a cold chase elmaradhat. A leme ­
zeket autoradiografiás emulzióba kell meríteni, sötétben tárolni (pél ­
dául 7–14 napig h űtött helyen tartják), el őhívni, megfesteni, majd 
meg kell számolni az exponált ezüstszemcséket. 2–3 lemezt kell 
preparálni minden egyes állathoz.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Elemzés  
A tárgylemez-preparátumoknak elegend ő normál morfológiájú sejtet 
kell tartalmazniuk ahhoz, hogy elvégezhet ő legyen az UDS (hely ­
zetet hűen kifejez ő) kiértékelése. A készítményeket mikroszkóp 
segítségével vizsgálják meg a nyilvánvaló citotoxicitás jeleit (például 
piknózis, radioaktív-jelölés csökkent értékei) keresve.  
A tárgylemezeket kódolni kell a szemcseszámlálás el őtt. Rendszerint 
100 sejtet kell kiértékelni minden egyes állat esetében legalább két 
tárgylemezr ől; indokolni kell az állatonként kevesebb mint 100 sejt 
értékelését. Az S-fázisú sejtmagok felett nem kell szemcséket számolni, de feljegyezhet ő az S-fázisú sejtek aránya.
 
Alkalmas módszerekkel meg kell határozni a  3 H-TdR beépülési 
arányát a morfológiailag normál sejtek sejtmagjába és citoplazmájába 
úgy, ahogyan azt az ezüstszemcsék lerakódása mutatja.  
2. ADATOK  
2.1. EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Meg kell adni az egyes tárgylemezekhez és állatokhoz tartozó adato ­
kat. Ezenkívül táblázat formájában össze is kell foglalni minden adatot. Minden egyes sejthez, minden állathoz és minden adaghoz 
és időhöz ki kell számítani a nettó sejtmagi szemcseszámokat 
(NNG), amelyet a CG-számoknak az NG-számokból való kivoná ­
sával kapunk meg. Ha megszámláljuk a „helyreállított sejteket”, indokoltnak és történeti vagy párhuzamos negatív kontrolladatokon 
alapulónak kell lennie a „helyreállított sejtek” kifejezés meghatá ­
rozása kritériumának. A számszer ű eredmények statisztikai módsze ­
rekkel kiértékelhet ők. Ha használunk statisztikai vizsgálatokat, 
azokat még a kísérlet elvégzése el őtt kell kiválasztani, és azt indo ­
kolni kell.
 
2.2. EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
Példák a pozitív/negatív reakció meghatározásának kritériumára: 
pozitív i. laboratóriumi történeti adatok alapján indo ­
kolt, előre beállított küszöbérték fölötti 
NNG-értékek vagy 
ii. az egyidej űleg elvégzett kontrollnál lénye ­
gesen nagyobb NNG-értékek; 
negatív i. a történeti kontroll küszöbérték alatti NNG- 
értékek; vagy 
ii. az egyidej űleg elvégzett kontrollnál nem 
lényegesen nagyobb NNG-értékek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Meg kell vizsgálni az adatok biológiai jelent őségét, azaz figye ­
lembe kell venni az olyan paramétereket, mint például az állatok 
közötti eltérés, dózis-reakció viszony és citotoxicitás. Statisztikai módszerek használhatók a vizsgálati eredmények kiértékelésének elősegítésére. Azonban nem szabad, hogy a statisztikai szignifi ­
kancia legyen az egyetlen meghatározó tényez ő valamely pozitív 
reagálás megállapítására.
 
Bár a legtöbb kísérlet egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmé ­
nyeket hoz, ritka esetben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló 
adatok alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcso ­
latban egyértelm űen állást foglalni. El őfordul az is, hogy az ered ­
mények többféleképpen magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők 
maradhatnak tekintet nélkül arra, hogy hány alkalommal ismételjük meg a kísérletet.
 
Az emlősmáj-sejtekkel végrehajtott  in vivo  UDS-vizsgálatból kapott 
pozitív eredmény azt jelzi, hogy valamely vizsgált anyag olyan  in 
vivo DNS-károsodást idéz el ő emlősmáj-sejtekben, amely  in vitro  
reparálható nem ütemezett DNS-szintézissel. A negatív eredmény azt jelzi, hogy a vizsgálati körülmények között a vizsgált anyag nem idéz el ő e vizsgálattal észlelhet ő DNS-károsodást.
 
Értékelni kell annak a valószín űségét, hogy a vizsgált anyag vagy 
annak metabolitjai eljutnak-e az általános keringési rendszerbe, 
illetve kifejezetten a célszövetbe (például szisztematikus toxicitás).  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés tartalmazza a következ ő információkat:  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/viv ő­
anyagban, ha ismert.  
Kísérleti állatok:  
— használt fajok/törzs,  
— állatok száma, kora és neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, étrend stb.,  
— az állatok súlya a vizsgálat kezdetekor, az egyes csoportok 
esetében a testsúlytartományt, átlagértéket és a standard eltérést 
is ideértve.  
Vizsgálati körülmények:  
— pozitív és negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollanyagok,  
— a dózisbehatároló vizsgálatból kapott adatok, ha történt ilyen 
vizsgálat,  
— a dózisok kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag el őkészítésére vonatkozó részletek,  
— a vizsgált anyag beadására vonatkozó részletek,  
— a beadási mód megindoklása,  
— módszerek annak ellen őrzésére, hogy elérte-e a vizsgált anyag 
az általános keringési rendszert vagy cél szövetet, ha vannak 
ilyenek,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— átszámítás a vizsgált anyagnak a táplálékban/ivóvízben meglév ő 
koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/kg testsúly/nap), 
ha ez alkalmazható,  
— a táplálék és víz min őségére vonatkozó részletek,  
— kezelési és mintavételi menetrendek részletes leírása,  
— toxicitás mérésének módszerei,  
— májsejt preparálásának és tenyésztésének módszere,  
— a használt autoradiográfiás módszer,  
— elkészített tárgylemezek száma és értékelt sejtek száma,  
— értékelési kritériumok,  
— az arra vonatkozó kritériumok, hogy mikor kell a vizsgálatokat 
pozitívnak, negatívnak vagy többféleképpen magyarázhatónak 
tekinteni.  
Eredmények:  
— lemezenkénti, állatonlénti és csoportonkénti sejtmagi és 
citoplazmai szemcseszámátlagok, nettó sejtmagi szemcseszámát ­
lagok,  
— dózis-reakció viszony, ahol lehetséges,  
— statisztikai elemzések, ha vannak,  
— toxicitás jelei,  
— az egyidej űleg elvégzett negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív 
kontrollokra vonatkozó adatok,  
— történeti negatív (oldószer/viv őanyag) és pozitív kontrolladatok 
tartományokkal, átlagértékekkel és standard eltérésekkel,  
— a „helyreállított” sejtek száma, ha meghatározásra került,  
— az S-fázisú sejtek száma, ha meghatározásra került,  
— a sejtek életképessége.  
Az eredmények tárgyalása.  
Összefoglaló megállapítások  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. és Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In vivo  Rat. Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156., pp. 1–18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the  In vivo  Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, 
Mutation Res., 189., pp. 123–133.  
(3) Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993),  In 
vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II. revised. Cambridge 
University Press. Cambridge, New York, Port Chester, Melbo ­
urne, Sydney, pp. 52–77.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlin ­
son, B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, 
C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In vitro  and  In Vivo , Mutation 
Res., 312, pp. 263–285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the  In Vivo /In vitro  DNA Repair Assay (UDS), Muta ­
tion Res., 291, pp. 21–27.
 
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. 
(1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In 
Vivo/In vitro  Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. 
Mutagen, 4, pp. 553–562.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  IN VITRO  BŐRKORRÓZIÓ: TRANSZKUTÁN ELEKTROMOS 
REZISZTENCIA VIZSGÁLAT (TER)  
1. MÓDSZER  
Ez a kísérleti módszer egyenérték ű az OECD TG 430 (2004) 
módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
A bőrkorrózió egy vizsgált anyag felvitelét követ ően a bőrben történt 
irreverzibilis szövetkárosodás (a veszélyes anyagok és keverékek 
osztályozásának és címkézésének globális harmonizált rendszere [GHS] meghatározása szerint) (1). Ez a módszer egy olyan eljárást tesz lehet ővé, amely során a vizsgálatot nem él ő állatokon végzik.
 
A bőrkorrózió vizsgálata jellemz ően kísérleti állatokon történ ő vizs­
gálatot kíván meg (2). A B.4. vizsgálati módszer felülvizsgálata 
során figyelembe vették az eljárással az állatoknak okozott fájdalom és szenvedés miatti aggodalmakat, és a felülvizsgált módszer már lehetővé teszi a b őrkorrózió alternatív,  in vitro , fájdalom és szen ­
vedés okozása nélküli módszerekkel történ ő meghatározását.
 
A szabályozási célokból végzett b őrkorrózió-vizsgálathoz használ ­
ható alternatív vizsgálatok meghatározása felé az el ővalidálási tanul ­
mányok készítése jelentette az els ő lépést (3). Ezt követ ően folyt le a 
bőrkorrózió vizsgálatára szolgáló  in vitro  módszerek (4) (5) hivatalos 
hitelesítési vizsgálata (6) (7) (8). E tanulmányok és más publikált 
szakirodalom következtetései vezettek ahhoz a ajánláshoz, hogy az  in 
vivo bőrkorrózió-vizsgálatokhoz (9) (10) (11) a következ ő vizs­
gálatok használhatók: az emberi b őrmodellen alapuló vizsgálat 
(lásd a B.40a vizsgálati módszert) és a transzkután elektromos rezisz ­
tenciavizsgálat (ez a módszer).  
Egy validálási tanulmány és más publikált tanulmányok arról 
számoltak be, hogy a patkányb őr esetében a transzkután elektromos 
rezisztenciára (TER) vonatkozó vizsgálattal (12) (13) megbízhatóan megkülönböztethet ők a bőrkorróziót okozó és b őrkorróziót nem 
okozó ismert anyagok (5) (9).
 
Az ebben a módszerben leírt vizsgálat lehet ővé teszi a korrozív vegyi 
anyagok és keverékek meghatározását. Lehet ővé teszi továbbá a nem 
korrozív anyagok és keverékek meghatározását, ha más létez ő infor­
mációkon alapuló meghatározások bizonyítási súlya ezt alátámasztja 
(pl. pH, szerkezet-hatás kapcsolat, emberekre és/vagy állatokra 
vonatkozó adatok) (1) (2) (11) (14). Ez a módszer nem nyújt infor ­
mációt a b őrirritációra vonatkozóan, és nem teszi lehet ővé a korrozív 
anyagoknak a Globális Harmonizált Osztályozási Rendszer (GHS) 
alapján megengedett alkategóriákba sorolását (1).  
Egyetlen b őrexpozíció után a b őrt ért helyi hatások teljes kiértékelé ­
sére ajánlatos a B.4 vizsgálati módszer (2) függeléke szerinti és a 
Globális Harmonizált Rendszer (GHS) (1) által meghatározott szek ­
venciális vizsgálati stratégiát folytatni. E vizsgálati stratégia el őírja, 
hogy  in vitro  bőrkorróziós (az ebben a módszerben leírtak szerint) és 
bőrirritációs vizsgálatokat kell lefolytatni, miel őtt az élő állatokon 
végzett vizsgálatokat fontolóra lehetne venni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
In vivo  bőrkorrózió : a bőr irreverzibilis károsodása: nevezetesen 
egy vizsgálati anyag négy órán át tartó alkalmazását követ ően látható 
szövetelhalás az epidermiszen át és a dermiszben. A korrozív reak ­
ciókat jellemzik a fekélyek, vérzés, véres var és a 14 napos 
megfigyelés végén a b őr kifehéredése miatti elszíntelenedés, teljes 
területek sz őrtelensége és hegek. A kérdéses károsodás értékeléséhez 
figyelembe kell venni a szövetkórtant.  
Transzkután elektromos rezisztencia (TER) : a bőr látszólagos 
elektromos rezisztenciájának mérése rezisztenciaértékként, kilo ­
ohmban kifejezve. A barrierfunkció vizsgálatának egy egyszer ű és 
nagy teljesítmény ű módszere, amely során az ionok b őrön történ ő 
áthaladását egy Wheatstone-híd segítségével rögzítik.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
1. táblázat  
Referencia-vegyszerek  
Név EINECS-szám CAS-szám  
1,2-diaminopropán 201-155-9 78-90-0 Er ősen korrozív 
Akrilsav 201-177-9 79-10-7 Er ősen korrozív 
2-tert-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Korrozív Kálium-hidroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korrozív Kénsav (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korrozív Oktánsav (kaprilsav) 204-677-5 124-07-02 Korrozív 
4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Nem korrozív 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Nem korrozív Fenetil bromid 203-130-8 103-63-9 Nem korrozív Tetraklór-etilén 204-825-9 27-18-4 Nem korrozív Izosztearinsav 250-178-0 30399-84-9 Nem korrozív 4-(metiltio)-benzaldehid 222-365-7 3446-89-7 Nem korrozív
 
A felsorolt vegyszerek többsége az ECVAM nemzetközi validálási 
tanulmányhoz válogatott vegyszerek listájából származik (4). Kivá ­
lasztásuk a következ ő ismérvek alapján történt:  
i. egyenlő számú korrozív és nem korrozív anyag;  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii. kereskedelmi forgalomban kapható vegyszerek, amelyek lefedik 
a legtöbb vonatkozó vegyszerosztályt;  
iii. erősen korrozív és a kevésbé korrozív anyagokat is tartalmaz 
annak érdekében, hogy lehet ővé váljon a korrózióhatás szerinti 
megkülönböztetés;  
iv. olyan vegyszerek kiválasztása, amelyek a korrózió kivételével 
komolyabb kockázat nélkül kezelhet ők laboratóriumban.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot 24 órán át a b őrkorongok epidermális felületén 
alkalmazzák egy kétkamrás vizsgálati rendszerben, amelyben a 
bőrkorongok a két kamra elválasztására szolgálnak. A b őrkorongok 
kíméletes módon leölt, 28–30 napos patkányokról származnak. A korrozív anyagok azok, amelyek a normál  stratum corneum  integri­
tásának és barrierfunkciójának elvesztését okozzák, amit a TER 
meghatározott határérték alá történ ő csökkenésével mérnek (12). A 
patkány TER esetében az 5 k Ω határérték került kiválasztásra a 
széles tartományt felölel ő vegyszerek nagyszámú adataiból, ahol az 
értékek túlnyomó többsége vagy világosan ezen érték felett (gyakran 
> 10 kΩ) vagy jóval alatta (gyakran < 3 k Ω) volt (12). Általában 
azok az anyagok, amelyek az állatokra nézve nem korrozívak, de irritatívak vagy nem irritatívak, nem csökkentik a TER-t e határérték alá. Továbbá más b őrkészítmények vagy más berendezés használata 
módosíthatja a határértéket, ami további validálásokat tesz szük ­
ségessé.
 
A TER-ben a pozitív értékek – beleértve az 5 k Ω körülieket is – 
kontrollvizsgálata céljából a vizsgálati eljárás részét képezi egy 
festékmegkötést biztosító lépés is. A festékmegkötést biztosító 
lépés meghatározza, hogy az ionátereszt ő képesség fokozódását a  
stratum corneum  fizikai károsodása okozza-e. A patkányb őrt alkal­
mazó TER módszer a B.4. vizsgálati módszer (2) alapján vizsgált 
nyúlban el őre jelezte az  in vivo  korrozivitást. Meg kell jegyezni, 
hogy az emberi b őrpróbával való összehasonlításban a nyúlon 
végzett  in vivo  vizsgálat a b őrkorrózió és a b őrirritáció tekintetében 
erősen konzervatív (15).  
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  Állatok  
A patkányokra esett a választás, mert a b őrük vegyszerekkel szem ­
beni érzékenysége ebben a vizsgálatban már korábban bebizonyoso ­
dott (10). A patkányok kora (a b őr begyűjtésének id őpontjában) és 
származása különösen fontos annak biztosítására, hogy a sz őrtüszők 
nyugvó fázisban legyenek, miel őtt a felnőtt szőr nőni kezd.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
A fiatal, körülbelül 22 napos, hím vagy n őstény patkányok (Wistar 
vagy hasonló törzs) háton és horpaszon lév ő szőrét kis nyírógéppel 
óvatosan eltávolítják. Azután az állatokat óvatosan törölgetve megmossák, miközben a lenyírt területet antibiotikumot tartalmazó oldatba merítik (amely a baktériumok növekedését hatékonyan gátló 
koncentrációban például sztreptomicint, penicillint, klóramfenikolt és 
amfotericint tartalmaz). Az állatokat az els ő mosást követ ő harmadik 
vagy negyedik napon ismételten megmossák antibiotikummal, és a második mosást követ ő három napon belül felhasználják őket, 
amikor a  stratum corneum  megerősödött a sz őrtelenítés után.
 
1.5.2.  A b őrkorongok el őkészítése  
Az állatokat 28–30 napos korukban kíméletes módon leölik; ez a kor 
kritikus. Ezután minden állatról eltávolítják a dorsolaterális b őrt, és a 
bőrtől való óvatos elválasztással lefejtik a felesleges szubkután zsírt. 
Egyenként körülbelül 20 mm-es átmér őjű bőrkorongokat távolítanak 
el. A bőrt a korongok felhasználása el őtt tárolni lehet, ha kimutat ­
ható, hogy a pozitív és negatív kontrolladatok megegyeznek a friss bőrnél kapott adatokkal.
 
Minden b őrkorongot egy PTFE (politetrafluoroetilén) cs ő vége fölé 
helyeznek, biztosítva, hogy az epidermális felület érintkezzen a csővel. Egy „O” gumigy űrűt pontosan a cs ő végére illesztenek, 
hogy a helyén tartsa a b őrt, és hogy a felesleges szövetet levágja. 
A cső és az „O” gy űrű méreteit a 2. ábra mutatja. Az „O” gumi ­
gyűrűt aztán vazelinnel óvatosan tömítik a PTFE cs ő végéhez. A 
csövet egy rugós csipesz tartja, amelynek belsejében egy MgSO
 4 - 
oldatot (154 mM) tartalmazó (1. ábra) befogadókamra van. A b őrko­
rongot teljesen bele kell meríteni a MgSO  4 -oldatba. Egyetlen 
patkánybőrből 10–15 b őrkorongot lehet készíteni.  
A vizsgálat kezdete el őtt az egyes állati b őrök minőség-ellenőrzése 
céljából megmérik két b őrkorong elektromos rezisztenciáját. Mindkét 
korongnak 10 k Ω-nál nagyobb rezisztenciaértéket kell mutatni ahhoz, 
hogy a többi korongot fel lehessen használni a vizsgálathoz. Ha a rezisztencia értéke kisebb mint 10 k Ω, e bőrdarabnak a többi 
korongját ki kell dobni.
 
1.5.3.  A vizsgálat alkalmazása és a kontrollanyagok  
A vizsgálati modell megfelel ő elvégzése érdekében minden vizs ­
gálathoz egyidej ű pozitív és negatív kontrollértékeket kell használni. 
Egyetlen állatról származó b őrkorongokat kell használni. Az ajánlott 
pozitív és negatív anyagok: 10 M sósav, illetve desztillált víz.  
A folyékony vizsgálati anyagokat (150 μl) a cső belsejében egyen ­
letesen viszik fel az epidermális felületre. Szilárd anyagokkal történ ő 
vizsgálat esetén megfelel ő mennyiség ű szilárd anyagot egyenletesen 
visznek fel a korongra annak biztosítására, hogy az epidermisz teljes 
felületét beborítsa. A szilárd anyagra deionizált vizet (150 μl) önte­
nek, és a csövet óvatosan felrázzák. A b őrrel való maximális érint ­
kezés elérése érdekében a szilárd anyagot 30  o C-ra lehet 
felmelegíteni olvadás vagy lágyítás céljából, vagy őrölni vagy porí ­
tani kell.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Minden egyes vizsgálathoz és kontrollanyaghoz három b őrkorongot 
használnak. A vizsgált anyagot 24 órán át alkalmazzák 20–23  o C-on. 
A vizsgált anyagot legfeljebb 30  o C-os csapvízsugárral addig 
mossák, amíg már nem lehet további anyagot eltávolítani.  
1.5.4.  TER-mérések  
A bőr ellenállásának TER-ként történ ő mérése egy kisfeszültség ű, 
váltakozó áramú Wheatstone-híd segítségével történik (13). A 
mérőeszköz általános jellemz ői: 1–3 Volt üzemi feszültség, 
50–1 000 Hz-es szinusz- vagy négyszöghullámú váltakozó áram és legalább 0,1–30 k Ω mérési tartomány. A validálási vizsgálatban 
használt mér őeszköz az induktivitást, kapacitást és rezisztenciát 
sorrendben 2 000 H, 2 000 μF és 2 M Ω értékekig méri 100 Hz-es 
vagy 1 kHz-es frekvencián, soros vagy párhuzamos értékek felhasz ­
nálásával. A TER-mérések céljára a korrozivitásra vonatkozó vizs ­
gálati méréseket elektromos ellenállásban rögzítik 100 Hz-es frek ­
vencián és soros értékeket felhasználva. Az elektromos ellenállás 
mérése el őtt a bőr felületi feszültségét megfelel ő mennyiség ű 
70 %-os etil-alkohollal csökkentik, amely beborítja az epidermiszt. Néhány másodperc elteltével az etil-alkoholt eltávolítják a cs őről, 
majd azután a szövetet 3 ml MgSO
 4 -oldat (154 mM) hozzáadásával 
hidratálják. Az ellenállás k Ω/bőrkorongban való méréséhez a 
Wheatstone-híd elektródáit ráhelyezik a b őrkorong mindkét oldalára 
(1. ábra). Az elektródaméreteket és a krokodilcsipesz alá helyezett 
elektróda hosszúságát a 2. ábra mutatja. A bels ő elektródához csatolt 
csipesz az ellenállás mérésekor a PTFE cs ő tetején található annak 
biztosítására, hogy állandó hosszúságú elektróda merüljön az MgSO
 4 -oldatba. A küls ő elektródát a befogadó kamra belsejébe 
úgy helyezik el, hogy az a kamra aljáig érjen. A rugós csipesz és 
a PTFE cs ő alja közötti távolságot állandó értéken tartják (2. ábra), 
mivel ez a távolság befolyásolja a kapott rezisztencia értékét. Követ ­
kezésképpen a bels ő elektróda és a b őrkorong közötti távolságnak 
állandónak és minimálisnak kell lenni (1–2 mm).  
Ha a mért rezisztencia értéke nagyobb mint 20 k Ω, ezt valószín űleg 
a bőrkorong epidermális felületét borító vizsgált anyag maradványa 
okozhatja. Ennek a bevonatnak a további eltávolítását meg lehet 
próbálni például úgy, hogy a PTFE csövet keszty űs hüvelykujjal 
befogják, és körülbelül 10 másodpercig rázogatják; az MgSO  4 - 
oldatot eltávolítják és a rezisztenciamérést friss MgSO  4 -gyel 
megismétlik.  
A vizsgálati m űszer jellemz ői és méretei, valamint a használt vizs ­
gálati eljárás befolyásolhatja a kapott TER-értékeket. Az 5 k Ω korró­
ziós határértéket az ebben a módszerben leírt különleges m űszerrel és 
eljárással kapott adatokból számolják ki. Ha a vizsgálati feltételek megváltoznak, vagy más készüléket használnak, akkor eltér ő határ- 
és kontrollértékeket lehet alkalmazni. Ezért ajánlatos a módszert és 
az ellenállás határértékét a hitelesítési vizsgálatban (4) (5) használt kémiai anyagokból vagy a vizsgált kémiai anyagokhoz hasonló kémiai osztályú vegyi anyagokból kiválasztott referenciaszabványok 
sorozatának vizsgálatával meghatározni. A megfelel ő referencia- 
vegyszerek jegyzéke az 1. táblázatban található.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Festékanyag-megköt ő módszerek  
Bizonyos nem korrozív anyagoknak való expozíció eredményezheti a 
rezisztencia 5 k Ω határérték alá történ ő csökkenését, ami lehet ővé 
teszi az ionoknak a  stratum corneumon  való áthatolását, csökkentve 
ezáltal az elektromos rezisztenciát (5). Például felületaktív és 
semleges szerves anyagok és vegyszerek (beleértve a tisztítószereket, emulgeálószereket és más hatóanyagokat) eltávolíthatják a b őrzsírt, 
ezáltal a barrier az ionok számára áthatolhatóbbá válik. Így ha a 
vizsgált anyagok TER-értékei alacsonyabbak mint 5 k Ω vagy akörül 
vannak, ha nincs látható károsodás, akkor a kontrollon és kezelt szöveteken festékpenetrációs vizsgálatot kell végezni annak megálla ­
pítására, hogy a kapott TER-érték a b őr fokozottabb átereszt ő képes­
ségének vagy a b őrkorróziónak az eredménye-e (3) (5). Ez utóbbi 
esetén, amikor a  stratum corneum  szétrepedt, ha a b őrfelszínre szul ­
forhodamin B festéket visznek fel, ez gyorsan áthatol, és megfesti az 
alatta lévő szövetet. Ez a különleges festékanyag a vegyszerek széles 
skálájának ellenáll, és nem érinti a lent leírt kivonási eljárás.
 
1.5.5.1.  Szulforhodamin B festékanyag alkalmazása és eltávolítása  
A TER-vizsgálatot követ ően a magnézium-szulfátot eltávolítják a 
csőből, és gondosan megvizsgálják, hogy a b őrön látható-e károso ­
dás. Ha nincs nagyobb látható károsodás, akkor szulforhodamin B festékanyag (Acid Red 52; C.I. 45100; EINECS-szám: 222-529-8; CAS-szám: 3520-42-1), 150 μl 10 tömegszázalékos desztillált vizes 
hígítású oldatát alkalmazzák minden b őrkorong epidermális felületén 
2 órán át. Ezeket a b őrkorongokat azután a felesleges/meg nem 
tapadt festékanyag eltávolítása érdekében körülbelül 10 másodpercig legfeljebb szobah őmérséklet ű csapvízben lemossák. 
Minden b őrkorongot óvatosan eltávolítanak a PTFE cs őről, és egy 
deionizált vizet tartalmazó (8 ml) ampullába helyezik (pl. egy 20 ml üveg szcintillációs ampulla). Az ampullákat óvatosan 5 percen át rázogatják minden felesleges/meg nem tapadt festékanyag eltávolí ­
tása érdekében. Ezt az öblítési eljárást aztán megismétlik, azután a 
bőrkorongokat kiveszik, és desztillált vízben lév ő 5 ml 30 tömeg ­
százalékos nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) tartalmazó ampullába helyezik, és egy éjszakán át 60
 o C -on inkubálják.  
Az inkubálást követ ően minden b őrkorongot eltávolítanak és kidob ­
nak, és a fennmaradó oldatot 8 percen át 21  o C -on centrifugálják 
(relatív centrifugális er ő ~175 × g). 1 ml felszínen úszó mintát 
felhígítanak 1:5 (v/v) [azaz 1 ml + 4 ml] arányban 30 tömegszáza ­
lékos SDS-szel desztillált vízben. Megmérik az oldat optikai s űrű­
ségét (OD) 565 nm-nél.  
1.5.5.2.  A festékanyag-tartalom kiszámítása  
A szulforhodamin B festékanyagot korongonként az OD-értékekb ől 
számítják ki (5) (szulforhodamin B festékanyag moláris extinkciós együtthatója 565 nm = 8,7 × 10
 4 ; molekulatömeg = 580). A festék ­
anyag-tartalmat minden egyes b őrkorong esetében megfelel ő kalib­
rációs görbe használatával határozzák meg, és azután az ismétlé ­
sekhez átlagos festékanyag-tartalmat kalkulálnak.  
2. ADATOK  
A vizsgált anyagokra, valamint a pozitív és negatív kontrollokra 
vonatkozó rezisztenciaértékeket (k Ω) és átlagos festékanyag-tartalom 
értékekeit ( μg/korong) adott esetben táblázatos formában kell 
megadni (egyedi vizsgálati adatok és átlagok ± S.D.), beleértve a 
párhuzamos/megismételt kísérleteknél kapott adatokat, átlagértékeket 
és az egyedi értékeket.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
Az átlag TER-eredmények akkor elfogadhatók, ha az egyidej ű 
pozitív és negatív kontrollértékek a vizsgálati laboratóriumban a módszer elfogadható tartományába esnek. A fent leírt, módszertanra 
és készülékre vonatkozó elfogadható ellenállás-tartományokat az 
alábbi táblázat tartalmazza:
 
Kontroll Anyagok Ellenállás-tarto ­
mány (kΩ) 
Pozitív 10 M sósav 0,5—1,0 
Negatív Desztillált víz 10–25  
Az átlagos festékanyag-megkötési eredmények azzal a feltétellel 
fogadhatók el, hogy az egyidej ű kontrollértékek a módszer elfogad ­
ható tartományába esnek. A fent leírt, a módszertan és a készülék 
esetében a kontrollanyagokra javasolt elfogadható festéktartalomtar ­
tományokat az alábbi táblázat tartalmazza:  
Kontroll Anyagok Festéktartalom 
tartománya ( μg/ 
korong)  
Pozitív 10 M sósav 40–100 
Negatív Desztillált víz 15–35  
A vizsgált anyagnak a b őrre nincs korrozív hatása:  
i. ha a vizsgált anyagra kapott átlagos TER-érték nagyobb mint 5 
kΩ; vagy  
ii. az átlagos TER érték kisebb mint 5 k Ω vagy azzal egyenl ő; és 
— a bőrkorong nem mutat látható károsodást, és  
— a korong átlagos festéktartalma jóval az egyidej űleg a 10M 
HCl pozitív kontrollnál megállapított átlagos b őrkorong- 
festéktartalom alatt van.  
A vizsgált anyagnak a b őrre korrozív hatása van:  
i. ha az átlagos TER-érték kisebb mint 5 k Ω vagy azzal egyenl ő, és 
a bőrkorong láthatóan károsodott; vagy  
ii. az átlagos TER érték kisebb mint 5 k Ω vagy azzal egyenl ő, és 
— a bőrkorong nem mutat látható károsodást, de  
— a korong átlagos festéktartalma megegyezik az egyidej űleg a 
10M HCl pozitív kontrollnál megállapított átlagos b őrkorong- 
festéktartalommal, vagy annál nagyobb.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgálati és kontrollanyagok:  
— a vegyszer(ek) neve, mint IUPAC- vagy CAS-név és CAS-szám, 
ha ismert,  
— az anyag vagy készítmény tisztasága és összetétele (tömegszáza ­
lékban) és fizikai sajátossága,  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából lényeges fizikai-kémiai tulaj ­
donságok, mint fizikai állapot, pH, szilárdság, vízben való oldha ­
tóság,  
— adott esetben a vizsgálati/kontrollanyagok kezelése a vizsgálatot 
megelőzően (pl. melegítés, őrlés),  
— stabilitás, ha ismert.  
Kísérleti állatok:  
— a használt törzs és nem,  
— az állatok kora, ha donorállatként használják őket, 
— származás, tartási feltétel, étrend, stb.,  
— a bőrpreparátumra vonatkozó részletek.  
Vizsgálati feltételek:  
— a vizsgálati eszközökre vonatkozó kalibrálási görbék,  
— a festékanyag-megköt ő vizsgálatra vonatkozó görbék,  
— a TER-méréshez használt vizsgálati eljárás részletei,  
— a festékanyag-megköt ő vizsgálatához használt vizsgálati eljárás 
részletei; adott esetben,  
— a vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása,  
— a használt értékelési ismérvek leírása.  
Eredmények:  
— az egyedi állatokra és az egyedi b őrmintákra vonatkozó, TER-b ől 
származó adatok és a festékanyag-megköt ő vizsgálat adatainak 
táblázatba foglalása (adott esetben);  
— bármilyen megfigyelt jelenség leírása.  
Az eredmények értékelése.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assess ­
ment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. 
olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM inter ­
national validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic.  in 
vitro  12, 471–482.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G, and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  in vitro  12, 483–524.
 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, p. 62.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf  
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275–280.  
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In vitro  
test methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  
In vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
 
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test-modifications and validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507–512.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro : results of an inter ­
laboratory trial. Toxic.  in vitro  6, 191–194.  
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the 
Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: 709–720.  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845–852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An  In 
vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic.  in vitro . 2, 7–17.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
1. ábra  
A patkányb őr TER-vizsgálatára szolgáló m űszer
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
2. ábra  
Az alkalmazott politetrafluoroetilén- (PTFE) és befogadó csövek, valamint az elektródák 
méretei
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
A fent ábrázolt eszközök legfontosabb elemei:  
— a PTFE cs ő belső átmérője, 
— az elektródák PTFE cs őhöz és befogadó cs őhöz viszonyított 
hosszúsága olyan legyen, hogy az elektródák ne érintkezzenek 
a bőrkoronggal, és hogy állandó hosszúságú elektróda legyen az 
MgSO  4 -oldatban,  
— az MgSO  4 -oldat befogadó cs őben lévő mennyisége a PTFE 
csőben lévő szinthez viszonyítva adjon egy bizonyos folyadék ­
mélységet, ahogyan azt az 1. ábra mutatja,  
— a bőrkorongot kell ő erősséggel kell a PTFE cs őhöz rögzíteni úgy, 
hogy az elektromos ellenállás a b őr tulajdonságaira vonatkozóan 
valós értéket adjon.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B. 40A.  IN VITRO  BŐRKORRÓZIÓ: EMBERI B ŐRMODELLEN 
VÉGZETT VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a kísérleti módszer egyenérték ű az OECD TG 431 (2004) 
módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
A bőrkorrózió egy vizsgált anyag felvitelét követ ően a bőrben történt 
irreverzibilis szövetkárosodás (a veszélyes anyagok és keverékek 
osztályozásának és címkézésének globális harmonizált rendszere 
[GHS] meghatározása szerint) (1). Ez a vizsgálati módszer a b őrkor­
rózió értékeléséhez nem kívánja meg él ő állatok vagy állati szövetek 
használatát.  
A bőrkorrózió vizsgálata jellemz ően kísérleti állatokon történ ő vizs­
gálatot foglal magában (2). A B.4. vizsgálati módszer felülvizsgálata során figyelembe vették az eljárással az állatoknak okozott fájdalom 
és szenvedés miatti aggodalmakat, és a felülvizsgált módszer már 
lehetővé teszi a b őrkorrózió alternatív,  in vitro , fájdalom és szen ­
vedés okozása nélküli módszerekkel történ ő meghatározását.
 
A szabályozási célokból végzett b őrkorrózió-vizsgálathoz használ ­
ható alternatív vizsgálatok meghatározása felé az el ővalidálási tanul ­
mányok készítése jelentette az els ő lépést (3). Ezt követ ően zajlott le 
a bőrkorrózió vizsgálatára szolgáló  in vitro  módszerek (4) (5) hiva ­
talos hitelesítési vizsgálata (6) (7) (8). E tanulmányok és más publi ­
kált szakirodalom (9) következtetései vezettek ahhoz az ajánláshoz, hogy az  in vivo  bőrkorróziós vizsgálatokhoz (10) (11) (12) (13) a 
következő vizsgálatok alkalmazhatók: az emberi b őrmodellen alapuló 
vizsgálat (e módszer) és a transzkután elektromos rezisztenciavizs ­
gálat (lásd B.40. vizsgálati módszer).
 
A validálási tanulmányok szerint az emberi b őrmodelleket használó 
vizsgálatokkal (3) (4) (5) (9) megbízhatóan megkülönböztethet ők a 
bőrkorróziót okozó és a b őrkorróziót nem okozó ismert anyagok. A 
vizsgálati jegyz őkönyv útbaigazítást adhat az er ős és a kevésbé er ős 
bőrkorróziót okozó szerek közötti különbségtételre is.  
Az ebben a módszerben leírt vizsgálat lehet ővé teszi a korrozív vegyi 
anyagok és keverékek meghatározását. Lehet ővé teszi továbbá a nem 
korrozív anyagok és keverékek azonosítását, ha más létez ő informá­
ciókon alapuló meghatározások bizonyítási súlya ezt alátámasztja (pl. 
pH, szerkezet-hatás kapcsolat, emberekre és/vagy állatokra vonat ­
kozó adatok) (1) (2) (13) (14). Ez a módszer általában nem nyújt megfelelő információt a b őrirritációra vonatkozóan, és nem teszi 
lehetővé a korrozív anyagok Globális Harmonizált Osztályozási 
Rendszere (GHS) (1) által megengedett alkategóriákba történ ő 
sorolását.
 
Egyetlen b őrexpozíció után a b őrt ért helyi hatások teljes értékelésére 
ajánlatos a B.4. vizsgálati módszer (2) függeléke szerinti és a 
Globális Harmonizált Rendszer (GHS) (1) által meghatározott szek ­
venciális vizsgálati stratégiát folytatni. Ez a vizsgálati stratégia előírja, hogy  in vitro  bőrkorróziós (az ebben a módszerben leírtak 
szerint) és b őrirritációs vizsgálatokat kell lefolytatni miel őtt az élő 
állatokon végzett vizsgálatokat fontolóra lehetne venni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
In vivo  bőrkorrózió:  a bőr irreverzibilis károsodása: nevezetesen 
vizsgálati anyag négy órán át tartó alkalmazását követ ően látható 
szövetelhalás az epidermiszen át és a dermiszben. A korrozív reak ­
ciókat jellemzik a fekélyek, vérzés, véres var és a 14 napos 
megfigyelés végén a b őr kifehéredése miatti elszíntelenedés, teljes 
területek sz őrtelensége és hegek. A kérdéses károsodás értékeléséhez 
figyelembe kell venni a szövetkórtant.  
Sejt-életképesség:  egy sejtpopuláció teljes aktivitását mér ő para­
méter (pl. a sejtes mitokondriális dehidrogenázok képessége az élet ­
fontosságú MTT-festékanyag csökkenésére), amely a mért végponttól és az alkalmazott vizsgálat felépítését ől függően korrelál a sejtek 
teljes számával és/vagy az életképességükkel.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
1. táblázat  
Referencia-vegyszerek  
Név EINECS-szám CAS-szám  
1,2-diaminopropán 201-155-9 78-90-0 Er ősen korrozív 
Akrilsav 201-177-9 79-10-7 Er ősen korrozív 
2-tert-butilfenol 201-807-2 88-18-6 Korrozív Kálium-hidroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korrozív 
Kénsav (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korrozív 
Oktánsav (kaprilsav) 204-677-5 124-07-02 Korrozív 4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Nem korrozív Eugenol 202-589-1 97-53-0 Nem korrozív Fenetil bromid 203-130-8 103-63-9 Nem korrozív Tetraklór-etilén 204-825-9 27-18-4 Nem korrozív 
Izosztearinsav 250-178-0 30399-84-9 Nem korrozív 
4-(Metilthio)-benzaldehid 222-365-7 3446-89-7 Nem korrozív
 
A felsorolt vegyszerek többsége az ECVAM nemzetközi validálási 
tanulmányhoz válogatott vegyszerek listájából származik (4). Kivá ­
lasztásuk a következ ő ismérvek alapján történt:  
i. egyenlő számú korrozív és nem korrozív anyag;  
ii. kereskedelmi forgalomban kapható vegyszerek, amelyek lefedik 
a legtöbb vonatkozó vegyszerosztályt;  
iii. erősen korrozív és kevésbé korrozív anyagokat is tartalmaz annak 
érdekében, hogy lehet ővé váljon a korrózióhatás szerinti 
megkülönböztetés;  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv. olyan vegyszerek kiválasztása, amelyek a korrózió kivételével 
komolyabb kockázat nélkül kezelhet ők laboratóriumban.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot helyileg egy háromdimenziós emberi b őrmodellre 
viszik fel, amely tartalmaz legalább egy funkcionális  stratum corne ­
ummal  rendelkez ő rekonstruált epidermiszt. A korrozív anyagot 
azáltal azonosítják, hogy egy megadott expozíciós id őtartam alatt 
képes-e a meghatározott határérték alá csökkenteni a sejt életképes ­
ségét (amelyet például az MTT-csökkenésvizsgálat segítségével hatá ­
roznak meg [15]). Az emberi b őrmodell vizsgálatának alapelve azon 
a feltételezésen alapul, hogy a korrozív anyagok diffúzióval vagy 
erózióval képesek áthatolni a  stratum corneumon , és az alatta lév ő 
sejtrétegekre citotoxikus hatást gyakorolnak.  
1.4.1.  Az eljárás  
1.4.1.1.  Emberib őr-modell  
Emberibőr-modelleket el lehet készíteni vagy kereskedelmi forga ­
lomban be lehet szerezni (pl. az EpiDerm  TM és EPISKIN  TM model­
lek) (16) (17) (18) (19), illetve kifejleszthet ők vagy elkészíthet ők 
vizsgálati laboratóriumban (20) (21). Természetesen az emberi b őr 
használata esetén figyelembe kell venni a nemzeti és nemzetközi 
etikai szempontokat és feltételeket. Minden új modellt hitelesíteni kell (legalább az 1.4.1.1.2 pontban leírtaknak megfelel ő mértékben). 
Az ehhez a vizsgálathoz használt emberib őr-modelleknek a követke ­
zőknek kell megfelelni:
 
1.4.1.1.1. A m o d e l l r e v o n a t k o z ó á l t a l á n o s f e l t é t e l e k :  
Az epitélium felépítéséhez emberi keratinsejteket kell használni. Él ő 
epitélsejtek több rétegének kell jelen lenni a funkcionális  stratum 
corneum  alatt. A b őrmodellnek lehet egy stromális összetev ő rétege 
is. A  stratum corneumnak  többréteg űnek kell lennie, és megfelel ő 
lipidszelvénnyel kell rendelkeznie, hogy nagy ellenállóképességgel funkcionális barriert képezzen a citotoxikus markerek gyors áthato ­
lása ellen. A modell visszaszorító tulajdonságainak meg kell 
akadályozni, hogy az anyag áthatoljon a  stratum corneum  körül az 
élő szövetbe. A vizsgált vegyszerek  stratum corneum  körül történ ő 
áthatolása a b őr expozíciójának gyenge modellezését eredményezi. A 
bőrmodellnek baktériumfert őzéstől mentesnek (beleértve a mikoplaz ­
mát) és gombamentesnek kell lennie.
 
1.4.1.1.2. F u n k c i o n á l i s m o d e l l f e l t é t e l e k :  
Az életképesség terjedelmének mennyiségi meghatározása általában 
MTT segítségével, vagy más metabolikusan átalakított él ő festék­
anyaggal történik. Ezekben az esetekben a negatív kontrollszövetb ől 
kivont (szolibilizált) festékanyag optikai s űrűségének (OD) az 
extrahálásra használt oldószer OD-jénél legalább 20-szor 
nagyobbnak kell lennie (összefoglalásként lásd [22]). A negatív kont ­
rollszövetnek a vizsgálati expozíciós id őszak alatt állandónak kell 
lennie a tenyészetben (hasonló életképesség-mérést nyújt). A stratum 
corneumnak kell ően erősnek kell lennie annak érdekében, hogy bizo ­
nyos citotoxikus markervegyszerek (pl. 1 % Triton X-100) gyors áthatolásának ellenálljon. Ezt a tulajdonságot a sejt életképességének 50 %-kal való csökkentéséhez (ET
 50 ) szükséges expozíciós id ővel 
lehet meghatározni (pl. az EpiDerm  TM és EPISKIN  TM modellek 
esetében ez > 2 óra). A szövetnek id ővel és lehet őleg laboratóriumok 
között reprodukálhatónak kell lennie. Ezenkívül, ha kiválasztott vizs ­
gálati eljárásban használjuk, akkor képesnek kell lennie arra, hogy 
előre jelezze a referencia-vegyszer korróziós képességét (lásd 1. 
táblázat).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  A vizsgálat alkalmazása és a kontrollanyagok  
Valamennyi kezeléshez (expozíciós id őhöz) két szövetpéldányt kell 
használni, a kontrollt is beleértve. Folyékony anyagok esetén a b őr 
felületére egyenletesen elosztva elegend ő vizsgált anyagot kell 
felvinni: minimum 25 μl/cm  2 -t kell használni. Szilárd anyagok esetén 
a bőrön egyenletesen elosztva elegend ő vizsgált anyagot használjunk, 
és deionizált vagy desztillált vízzel nedvesítsük be a b őrrel való jó 
érintkezés biztosítására. Ahol szükséges, a szilárd anyagok alá a 
felvitel el őtt púdert kell tenni. A felvitel módjának meg kell felelnie 
a vizsgált anyagnak (lásd például az 5. referenciát). Az expozíciós idő lejártával a vizsgált anyagot megfelel ő pufferrel vagy 0,9 % 
NaCl-dal óvatosan le kell mosni a b őrről.
 
A vizsgálati modell megfelel ő teljesítménye érdekében minden vizs ­
gálathoz egyidej űleg pozitív és negatív kontrollértékeket kell hasz ­
nálni. A javasolt pozitív kontrollanyag jégecet vagy 8N KOH. A javasolt negatív kontrollok 0,9 % NaCl vagy víz.
 
1.4.1.3.  A sejtek életképességének mérése  
Csak kvantitatív, hitelesített módszereket lehet a sejt életképes ­
ségének mérésére használni. Továbbá az életképesség mérésének 
egy háromdimenziós szövetkonstrukcióban történ ő használattal kell 
összeegyeztethet őnek lennie. A nem specifikus festékanyagkötés nem 
akadályozhatja az életképesség mérését. A fehérjeköt ő festékanyagok 
és azok, amelyek nem mennek át metabolikus átalakuláson (pl. neut ­
rálvörös) ezért nem megfelel ők. A leggyakrabban használt vizsgálat 
az MTT [3-(4,5-Dimetilthiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólium bromid, Tiazolil kék: EINECS-szám: 206-069-5, CAS-szám: 298-93-1)] 
redukció, amelyr ől kimutatták, hogy pontos és megismételhet ő ered­
ményeket nyújt (5), de más vizsgálat is használható. A b őrmintát 3 
órára egy megfelel ő inkubációs h őmérséklet ű, megfelel ő koncentrá ­
ciójú MTT–oldatba (pl. 0,3–1 mg/ml) teszik. A kicsapódott kék 
formazán terméket aztán oldószer (izopropanol) használatával eltávo ­
lítják, és 540 és 595 nm hullámhossz között az OD-meghatározása útján megmérik a formazán koncentrációját.
 
A vizsgált anyagnak az él ő festékanyagra gyakorolt vegyi hatása 
hasonlíthat a sejtmetabolizmus-hatásra, ami az életképesség téves 
megállapításához vezet. Ennek bekövetkezését mutatták ki, amikor 
az ilyen vizsgált anyagot öblítéssel nem távolították el teljesen a bőrről (9). Ha a vizsgált anyag közvetlenül az él ő festékanyagra 
hat, további ellen őrzéseket kell alkalmazni annak megállapítására, 
hogy a vizsgált anyag befolyásolja-e az életképesség mérését, illetve el kell végezni megfelel ő korrekciókat (9) (23).
 
2. ADATOK  
Minden egyes szövet esetében a vizsgált anyagra vonatkozó OD- 
értékeket és a százalékban meghatározott sejtéletképesség-értékeket, valamint a pozitív és negatív kontrollokat táblázatba foglaltan kell 
megadni, beleértve adott esetben a párhuzamos/megismételt kísér ­
letek során kapott adatokat, az átlagértékeket és az egyedi adatokat.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
Minden vizsgált mintára vonatkozó OD-értéket fel lehet használni az 
önkényesen 100 %-nak vett negatív kontrollhoz viszonyított száza ­
lékos életképesség kiszámításához. A sejtéletképesség százalékban 
megállapított határértékét, amely megkülönbözteti a korrozív és 
nem korrozív vizsgált anyagot (vagy a korrozív osztályokat) vagy azt a statisztikai módszert (módszereket), amelyet az eredmények kiértékelésére és a korrozív anyagok azonosítására használnak, 
pontosan meg kell határozni, dokumentálni kell, valamint igazolni 
kell az értékek megfelel őségét. Általában ezeket a határértékeket a 
vizsgálat optimalizálása során állapítják meg, amit egy el ővalidálási 
szakaszban tesztelnek, és egy hitelesítési vizsgálatban igazolnak. 
Például az EpiDerm™ modellel összefüggésben a korróziós képesség előrejelzése a következ ő (9):
 
A vizsgált anyagnak a b őrre korrozív hatása van:  
i. ha az életképesség 3 perces expozíció elteltével kisebb mint 
50 %, vagy  
ii. ha az életképesség 3 perces expozíció elteltével 50 % vagy annál 
nagyobb, és az életképesség egy óra expozíció elteltével kisebb 
mint 15 %.  
A vizsgált anyagnak a b őrre nincs korrozív hatása:  
i. ha az életképesség 3 perces expozíció elteltével 50 % vagy annál 
nagyobb, és az életképesség egy óra expozíció elteltével nagyobb mint 15 % vagy azzal egyenl ő.
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált és kontrollanyag:  
— a vegyszer(ek) neve, mint IUPAC- vagy CAS-név és CAS-szám, 
amennyiben ismert,  
— az anyag vagy a készítmény tisztasága és összetétele (tömegszá ­
zalékban),  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából lényeges fizikai-kémiai tulaj ­
donságok, mint fizikai állapot, pH, stabilitás, vízben való oldha ­
tóság,  
— a vizsgálati/kontrollanyagok kezelése a vizsgálatot megel őzően, 
ha alkalmazásra került (pl. melegítés, őrlés),  
— stabilitás, ha ismert.  
A használt b őrmodell és protokoll indoklása.  
Vizsgálati körülmények:  
— használt sejtrendszer,  
— a sejt életképességének mérésére használt eszköz (pl. spektrofo ­
tométer) bemérésére vonatkozó kalibrálási információk,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— a használt specifikus b őrmodellre vonatkozó teljes háttérinformá ­
ció, beleértve annak érvényességét,  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás részletei,  
— a használt vizsgálati dózisok,  
— a vizsgálati eljárás bármely módosításának leírása,  
— hivatkozás a modell történeti adataira,  
— a használt értékelési ismérvek leírása.  
Eredmények:  
— az egyedi vizsgálati minták adatainak táblázatba foglalása,  
— a megfigyelt egyéb jelenségek leírása.  
Az eredmények értékelése.  
Következtetés.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical 
Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:/ ­
/www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono 
(2001)6.
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report recommendations of EC VAM Workshop 6 ATLA 23, 219–255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM inter ­
national validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic.  In 
vitro  12, 471–482.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  In vitro  12, 483–524.
 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, p. 62.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// ­
iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371–401.
 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275–280.  
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.  
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation 
of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay:  In vitro  
test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology 
Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// ­
iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  
In vitro  Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st- 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat.
 
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709–720.
 
(15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J. Immunol. Meth. 65, 55–63.  
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy 
testing. Toxic.  In vitro  8, 889–891.  
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of 
Pharmaceutics. 203, 211–225.  
(18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis  in vitro . In In vitro  Skin Toxicology. 
Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 
133–140.
 
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991).  In vitro  and post-transplantation differentia ­
tion of human keratinocytes grown on the human type IV 
collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310–319.
 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human 
skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163–171.
 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, 747–756.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A 
critical assessment of the use of microculture tetrazolium 
assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69–84.
 
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, 
J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic.  In vitro  15, 57–93.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  IN VITRO  3T3 NRU FOTOTOXICITÁS-VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 432 (2004) 
számú vizsgálattal.  
1.1. BEVEZETÉS  
A fototoxicitás a b őrnek először bizonyos vegyi anyagoknak, majd 
ezt követ ően (kisebb dózisoknál látható) fénynek való expozíciója 
után bekövetkez ő, vagy hasonlóan, valamely vegyi anyag szisztema ­
tikus alkalmazása után a b őr besugárzásával el őidézett vagy feler ő­
sített toxikus reagálása.  
Az in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálat a vizsgált anyag 
fénynek való expozíció következtében aktivált vegyi anyag által kiváltott fototoxikusságának meghatározására szolgál. A vizsgálat a 
vegyi anyagnak kitett sejtek életképességében fény jelenlétében, 
illetve hiányában bekövetkez ő relatív csökkenés által méri a foto- 
citotoxicitást. A vizsgálattal fototoxikusnak talált anyag valószín űleg 
a bőrre történő szisztematikus felvitelt és elosztást, illetve helyi alkal ­
mazást követ ően, in vivo  is fototoxikus.
 
Számos különböz ő vegyi anyagról megállapították, hogy fototoxikus 
hatást váltanak ki (1) (2) (3) (4). Ezek közös tulajdonsága, hogy képesek a napfénytartományon belül fényenergiát elnyelni. A foto ­
kémia els ő törvénye (a Grotthaus–Draper-törvény) szerint a fotore ­
akcióhoz elegend ő fénykvantum abszorpciójára van szükség. Ezért 
bármely biológiai vizsgálat elvégzése el őtt az OECD 101. vizsgálati 
iránymutatásának megfelel ően meg kell határozni a vizsgált vegyi 
anyag UV/látható fény abszorpciós spektrumát. Egyes javaslatok 
szerint ha a molekuláris extinkciós/abszorpciós együttható kisebb mint 10 liter × mol
 –1 × cm  –1 , akkor a vegyi anyag valószín űleg 
nem fotoreaktív. Az ilyen vegyi anyagot nem valószín ű, hogy a 
káros fotokémiai hatások kimutatása céljából az  in vitro  3T3 NRU 
fototoxicitás-vizsgálattal vagy más biológiai vizsgálattal tesztelni kell (1) (5). Lásd az 1. függeléket is.
 
Az in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálat megbízhatósága és 
alkalmassága nemrégiben értékelésre került (6) (7) (8) (9). Az  in 
vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálatról kimutatták, hogy el őre 
jelzi az állatokban és az emberben  in vivo  jelentkez ő akut fototoxikus 
hatásokat. A vizsgálat nem alkalmas egyéb olyan káros hatások 
kimutatására, amelyek vegyi anyagok és a fény együttes hatása 
alapján jelentkezhetnek, például nem mutatja ki a fotogenotoxicitást, a fotoallergiát vagy a fotokarcinogenitást, és nem alkalmas a fototo ­
xikusság mennyiségi kifejezésére. A vizsgálatnak nem célja a foto ­
toxicitás indirekt mechanizmusainak, a vizsgálati anyag metabolitjai 
által kiváltott hatásoknak vagy az elegyek hatásainak mérése sem.
 
Bár az anyagcserét folytató szervezetek használata általános követel ­
mény minden genotoxikus és rákkelt ő hatás el őrejelzését célzó  in 
vitro  vizsgálat esetében, a fototoxicitás esetében mindeddig csak 
elenyésző számú esetben találták úgy, hogy anyagcseretranszfor ­
máció szükséges ahhoz, hogy a vegyi anyag  in vivo  vagy  in vitro  
fototoxinként viselkedjen. Így nem szükséges és tudományos szem ­
pontból sem indokolt, hogy a jelen vizsgálatot anyagcsereaktív szer ­
vezettel kelljen elvégezni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Irradiancia:  valamely felületre es ő ultraibolya (UV) vagy látható 
beeső fény intenzitása, W/m  2 -ben vagy mW/cm  2 -ben mérve.  
Fénydózis:  valamely felületre es ő ultraibolya (UV) vagy látható 
beeső sugárzás mennyisége (= intenzitás × id ő), Joule (= W × s) 
per felületegységben (pl. J/m  2 vagy J/cm  2 ) kifejezve.  
UV-fény-hullámsávok:  a CIE (Nemzetközi Világítástechnikai 
Bizottság) ajánlása szerinti jelölések: UVA (315–400 nm), UVB (280–315 nm) és UVC (100–280 nm). Más jelölések is használato ­
sak; az UVB és UVA közötti választóvonalat gyakran 320 nm-re 
teszik, és az UVA felosztható UV-Al-re és UV-A2-re, ahol a határ ­
vonal körülbelül 340 nm.
 
A sejt életképessége:  valamely sejtpopuláció teljes aktivitását mér ő 
paraméter (pl. a vitális neutrálvörös festékanyag felvétele a sejtek lizoszómájába), amely a mérési végponttól és az alkalmazott vizs ­
gálat felépítését ől függően korrelál a sejtek összmennyiségével és/ ­
vagy vitalitásával.
 
Relatív sejtéletképesség:  a sejt életképessége a teljes vizsgálati eljá ­
ráson (vagy +Irr vagy –Irr) keresztülvitt, de a vizsgált vegyi 
anyaggal nem kezelt (negatív) kontrolloldószerekhez képest kife ­
jezve.  
PIF (fotoirritációs tényez ő): a vizsgált vegyi anyag nem citotoxikus 
UV A/látható fénnyel való besugárzás hiányában (–Irr) és annak jelenlétében (+Irr) el őállított két, egyenl ően hatékony citotoxikus 
koncentrációjának (IC
 50 ) összehasonlításával meghatározott tényez ő. 
IC 50 : a vizsgált vegyi anyag azon koncentrációja, amelynél a sejt 
életképessége 50 %-ra esik vissza.  
MPE (átlagos fényhatás):  nem citotoxikus UV A/látható fénnyel 
való besugárzás hiányában (–Irr) és annak jelenlétében (+Irr) el őál­
lított koncentráció-válaszgörbék matematikai elemzéséb ől származta ­
tott jellemz ő. 
Fototoxicitás:  olyan akut toxikus reakció, amelyet a b őr előbb bizo­
nyos vegyi anyagoknak, majd azután fénynek való expozíciója idéz elő, vagy amelyet hasonlóan, valamely vegyi anyag szisztematikus 
alkalmazása után a b őr besugárzása idézi el ő.
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálat egy vegyi anyagnak a 
szimulált napfény nem citotoxikus dózisának jelenlétében és anélkül 
való expozíciója során kimutatott citotoxicitásának összehasonlításán 
alapul. A citotoxicitást ebben a vizsgálatban a vitális neutrálvörös festékanyag felvételének koncentrációfügg ő csökkenésével fejezik ki, 
amelyet 24 órával a vizsgálati vegyi anyaggal való kezelés és a 
besugárzás után mérnek (10). Az NR (neutrálvörös) egy gyengén 
kationos festékanyag, amely diffúzió nélkül könnyedén áthatol a sejthártyán, majd a sejten belül a lizoszómában összegy űlik. Az 
érzékeny lizoszómamembrán felületének módosulásai a lizoszóma 
törékenységéhez és egyéb elváltozásaihoz vezetnek, amelyek egyre 
inkább visszafordíthatatlanná válnak. Ezeknek a xenobiotikumok által előidézett változásoknak a következménye, hogy az NR felvé ­
tele és megkötése lecsökken. Így lehet őség van az életképes, a sérült 
vagy a halott sejtek megkülönböztetésére, ami ennek a vizsgálatnak 
az alapja.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c 3T3 sejteket 24 órán át tenyésztenek monorétegek képz ődé­
sének céljából. Vizsgált vegyi anyagonként két 96 lyukú lemezt egy 
órán keresztül el őinkubálnak a vizsgálati anyag nyolc különböz ő 
koncentrációjával. Ezek után a két lemez közül az egyiket a legna ­
gyobb dózisú nem citotoxikus sugárzásnak teszik ki, miközben a 
másik lemezt sötétben tartják. Ezt követ ően mindkét lemezen a keze ­
lési közeget tenyészt őközegre cserélik, és további 24 órás inkubációs 
idő elteltével meghatározzák a sejt életképességét a neutrálvörös 
felvétele alapján. A sejt életképességét a kezeletlen kontrolloldószer 
százalékában fejezik ki, és minden vizsgálati koncentrátumra vonat ­
kozóan kiszámítják. A fototoxicitás meghatározása érdekében össze ­
hasonlítják a besugárzás jelenlétében vagy annak hiányában kapott koncentrációtól függ ő reakciókat, általában IC
 50 szinten, azaz a sejt 
életképességét 50 %-ra csökkent ő koncentráció összehasonlítva a 
kezeletlen kontollanyaggal.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Előkészületek  
1.4.1.1.  Sejtek  
A validálási célú vizsgálat során az Amerikai Fajtakultúra Gy űjte­
ményből (ATCC, Manassas, VA, USA), illetve az Európai Sejtkul ­
túra Gyűjteményből (ECACC, Salisbury, Wiltshire, Egyesült Király ­
ság) származó állandó egér fibroblaszt sejtvonal (Balb/c 3T3) 31. sz. 
klónját használták, ezért ajánlatos jól min ősített sejtlerakatból ilyen 
sejteket beszerezni. Ugyanebben a vizsgálati eljárásban más sejtek vagy sejtvonalak is használhatók, de a tenyésztés feltételeit hozzá kell igazítani a sejtek egyedi igényeihez, és ki kell mutatni az egyen ­
értékűséget.
 
A sejteket rendszeresen ellen őrizni kell, hogy nem történt-e 
mikoplazma-fert őzés, és csak azok a sejtek használhatók fel, 
amelyekben ilyet nem találtak (11).  
Fontos, hogy az ebben a módszerben leírt min őség-ellenőrzési eljá­
rásnak megfelel ően rendszeresen ellen őrizzék a sejtek UV-érzékeny ­
ségét. Mivel a sejtek UVA-érzékenysége a passzázsok számával nőhet, a lehet ő legkisebb, lehet őleg 100-nál kisebb passzázsszámú 
Balb/c 3T3 sejteket kell használni (lásd az 1.4.2.2.2. szakaszt és a 2. 
függeléket).
 
1.4.1.2.  Tenyészt őközegek és tenyésztési körülmények  
A rutinszer ű szaporítás és a vizsgálati eljárás során megfelel ő 
tenyésztőközeget és inkubálási körülményeket kell alkalmazni, 
például a Balb/c 3T3 sejtek esetében ez DMEM (Dulbecco's Modi ­
fied Eagle's Medium) kiegészítve 10 % újszülöttborjú-szérummal, 4mM glutamin, penicillin (100 IU) és sztreptomicin (100 μg/ml), 
valamint párásított inkubálás 37
 o C-on, 5–7,5 % CO  2 a puffertől 
függően (lásd az 1.4.1.4. szakasz második bekezdését.). Különösen 
fontos, hogy a sejttenyésztés körülményei a használt sejtek vagy sejtvonalak normál sejtciklusidején belüli id őtartamot biztosítsanak.
 
1.4.1.3.  A tenyészetek elkészítése  
Fagyasztott sejtkultúra-állományból származó sejteket megfelel ő 
sűrűségben ráoltanak a tenyészt őközegre, és az  in vitro  3T3 NRU 
fototoxicitás-vizsgálatban történ ő felhasználást megel őzően legalább 
egyszer másodlagos tenyészetet hoznak létre.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
A fototoxicitás-vizsgálathoz használt sejteket olyan s űrűségben oltják 
rá a tápoldatra, hogy mindaddig ne következzen be a tenyészetek 
konfluenciája, amíg a sejtráoltás után 48 órával meg nem határozzák a sejtek életképességét. A 96 lyukú lemezeken tenyésztett Balb/c 3T3 sejtek esetében a javasolt elhelyezési s űrűség 1 × 10
 4 sejt/lyuk.  
Minden egyes vizsgálandó vegyi anyag esetében a sejteket két darab 
96 lyukú lemezre kell ráoltani, amelyeket azután párhuzamosan, a 
teljes vizsgálati eljárás folyamán egyforma tenyésztési feltételek között kell tartani, kivéve azt az id őszakot, amikor az egyik lemezt 
besugározzák (+Irr), míg a másikat sötétben tartják (–Irr).
 
1.4.1.4.  A vizsgálandó anyag elkészítése  
A vizsgálandó anyagokat frissen, közvetlenül a felhasználás el őtt kell 
elkészíteni, kivéve akkor, ha a tárolás során való stabilitásukat 
adatok igazolják. Ajánlatos minden vegyi kezelést és a sejtek kezdeti 
kezelését olyan fényviszonyok mellett elvégezni, hogy a besugárzást megelőzően ne következhessen be a vizsgálandó anyag fotoaktivitása 
vagy degradációja.
 
A vizsgálandó vegyi anyagokat pufferolt sóoldatban, például Earle- 
féle kiegyenlített sóoldatban (EBSS) vagy egyéb fiziológiailag kiegyenlített pufferoldatban fel kell oldani; az oldatok nem tartalmaz ­
hatnak fehérjekomponenseket, fény elnyel ő komponenseket (pl. pH- 
jelző színeket és vitaminokat) annak érdekében, hogy elkerülhet ő 
legyen a besugárzás alatti interferencia. Mivel a besugárzás során a sejteket mintegy 50 percig a CO
 2 -inkubátoron kívül tartják, ügyelni 
kell arra, hogy ne következhessen be alkalizáció. Gyenge puffer, 
például EBSS használata esetén ez a sejtek 7,5 % CO  2 -ban való 
inkubációjával érhet ő el. Ha a sejteket csak 5 % CO  2 -ban inkubáljuk, 
akkor erősebb puffert kell választani.  
A vízben kevéssé oldódó vizsgálandó vegyi anyagokat megfelel ő 
oldószerben kell feloldani. Ha oldószert használnak, akkor annak 
állandó mennyiségben kell jelen lennie minden tenyészetben, azaz 
a negatív kontrollban (kontrolloldatban) éppúgy, mint a vizsgált vegyi anyag minden koncentrációjában, továbbá ebben a koncentrá ­
cióban nem szabad citotoxikusnak lennie. A vizsgált vegyi anyag 
koncentrációit úgy kell megválasztani, hogy a csapadékképz ődés és 
az oldat zavarossága elkerülhet ő legyen.
 
A javasolt oldószerek a dimetil-szulfoxid (DMSO) és az etanol 
(ETOH). Más kis citotoxicitású oldószerek is alkalmasak lehetnek. A használat el őtt az oldószereket jellegzetes tulajdonságaik szem ­
pontjából meg kell vizsgálni, például reakció a vizsgálandó vegyi 
anyaggal, a fototoxikus hatás elfojtása, radikális tisztítási jellemz ők 
és/vagy kémiai stabilitás az oldószerben.
 
Az oldódás örvényes elegyítéssel és/vagy szonikus beavatkozással 
és/vagy megfelel ő hőmérsékletre történ ő felmelegítéssel el ősegít­
hető, kivéve akkor, ha ez a vizsgálandó vegyi anyag stabilitását 
befolyásolja.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Besugárzási körülmények  
1.4.1.5.1. F é n y f o r r á s  
A fototoxicitás-vizsgálat során nagyon lényeges szempont a 
megfelelő fényforrás és sz űrők megválasztása. Az  in vivo  fototoxikus 
reakciók általában az UVA-fényhez és a látható tartományokhoz kapcsolódnak (3) (12), míg az UVB általában kisebb jelent őségű, 
de erősen citotoxikus; a citotoxicitás 1 000-szeresére n ő, ha a 
hullámhossz 313 nm-r ől 280 nm-re változik (13). A megfelel ő fény­
forrás kiválasztása során kritériumként azt a követelményt is figye ­
lembe kell venni, hogy a fényforrás által kibocsátott hullámhosszt a 
vizsgált vegyi anyagnak el kell nyelnie (abszorpciós spektrum), és a 
fény (ésszer ű expozíciós id ő alatt elérhet ő) dózisának elegend őnek 
kell lennie az ismert fotocitotoxikus vegyi anyagok kimutatásához. Ezenkívül az alkalmazott hullámhossz és dózis indokolatlanul nem 
károsíthatja a vizsgálati rendszert, például a h őkibocsátást (infravörös 
tartomány).
 
Optimális mesterséges fényforrásnak a napfény napfényszimulátorral 
történő szimulációja tekinthet ő. A szűrtnapfény-szimulátor spektrális 
energiaeloszlásának a szabadtéri nappali fény (14) szerinti spektrális energiaeloszlása közelében kell lennie. Napfényszimulátorként xenon ívfényeket és (bevont) higany-fém halogenid ívfényeket használnak 
(15). Ez utóbbiaknak az az el őnye, hogy kevesebb h őt sugároznak és 
olcsóbbak, de a napfényhez nem hasonlítanak olyan tökéletesen, mint a xenon ívfények. Mivel minden napfényszimulátor jelent ős 
mennyiség ű UVB-t bocsát ki, a nagy citotoxicitású UVB-hullám ­
hosszok csökkentése érdekében megfelel ő szűrést kell alkalmazni. 
Mivel a sejtkultúra m űanyag anyagai UV-stabilizátorokat tartalmaz ­
nak, a spektrumot ugyanolyan 96 lyukú lemezfedélen át kell mérni, mint amilyet a vizsgálat során használnak. Függetlenül attól, hogy a 
spektrum egyes részeit milyen módszerrel sz űrjük ki, illet őleg 
függetlenül az alkalmazott eszközök elkerülhetetlen sz űrőhatásától, 
a szűrők mögött regisztrált spektrum nem térhet el a szabványos 
szabadtéri nappali fényét ől (14). A (8) és a (16) irodalomban talál ­
ható egy példa az  in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálat validálási 
vizsgálatában használt sz űrtnapfény-szimulátor spektrális irradiancia ­
eloszlására. Lásd még a 2. függelék 1. ábráját is.
 
1.4.1.5.2. D o z i m e t r i a  
Minden fototoxicitás-vizsgálat el őtt megfelel ő széles sávú UV- 
mérővel rendszeresen ellen őrizni kell a fény intenzitását (az irradi ­
anciát). Az intenzitást ugyanolyan 96 lyukú lemezfedélen át kell 
mérni, mint amilyet a vizsgálat során használnak. Az UV-mér őt a 
fényforráshoz kell kalibrálni. Ellen őrizni kell az UV-mér ő viselkedé ­
sét, erre a célra ajánlatos ugyanolyan típusú és ugyanúgy kalibrált másik UV-mér őt használni. Ideális esetben nagyobb id őközönként 
spektroradiométerrel meg kell mérni a sz űrt fényforrás spektrális 
irradianciáját, illet őleg ellenőrizni kell a széles sávú UV-mér ő kalib­
rálását.
 
A vizsgálatok szerint az 5 J/cm  2 dózis (az UVA-tartományban 
mérve) a Balb/c 3T3 sejtekre nézve nem citotoxikus, és kell ően 
hatékony ahhoz, hogy aktiválja a vegyi anyagokat a fototoxikus reakció kiváltására (6) (17), például 5 J/cm
 2 50 perc alatt történ ő 
eléréséhez 1,7 mW/cm  2 irradianciát kellett beállítani. Lásd a 2. 
függelék 2. ábráját. Másik sejtvonal vagy másik fényforrás haszná ­
lata esetén el őfordulhat, hogy a sugárdózist úgy kell kalibrálni, hogy 
olyan sugárzási dózist lehessen kiválasztani, hogy az ne károsítsa a sejteket, de elegend ő legyen ahhoz, hogy szabályszer ű fototoxicitást 
váltson ki. A fénynek való expozíció idejét a következ őképpen kell 
kiszámítani:
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðpercÞ ¼ sugárdózis ðJ= cm  2 Þ Ü 1000 
irradiancia ðmW = cm  2 Þ Ü 60 (1J=1 Wsec)  
1.4.2.  Vizsgálati körülmények  
1.4.2.1.  A vizsgált anyag koncentrációi  
A fény jelenlétében (+Irr) vagy hiányában (–Irr) vizsgált vegyi anyag 
koncentrációinak alkalmas tartományát dózistartomány-meghatá ­
rozási kísérletek során kell meghatározni. Az oldhatóságot érdemes 
lehet kétszer: az els ő alkalom után 60 perc (vagy bármilyen más 
kezelési id ő) elteltével másodszor is megállapítani, mivel az oldha ­
tóság időben, illetve az expozíció során megváltozhat. A nem 
megfelelő tenyésztési feltételek, illetve az er ősen savas vagy lúgos 
vegyi anyagok által kiváltott toxicitás elkerülése érdekében a vizsgált 
vegyi anyaggal kezelt sejtkultúrák pH-jának a 6,5–7,8 tartományban kell lennie.
 
A vizsgált anyag legnagyobb koncentrációjának a fiziológiai vizs ­
gálati feltételeken belül kell lennie, például az ozmotikus és a pH- feszültséget kerülni kell. A vizsgált vegyi anyagtól függ ően szük­
séges lehet más olyan fizikai-kémiai tulajdonságokat is figyelembe 
venni, amelyek behatárolják a legnagyobb vizsgálati koncentrációt. A telítettségi pontnak megfelel ő koncentrációig nem toxikus, 
viszonylagosan oldhatatlan anyagok esetében a fizikailag lehetséges 
legnagyobb koncentrációt kell vizsgálni. Általánosságban a vizsgált 
vegyi anyag kicsapódását minden vizsgálati koncentrációban kerülni kell. A vizsgált anyag maximális koncentrációja ne haladja meg a 1 000 μg/ml-t; az ozmolalitás ne haladja meg a 10 mmolart. 
Nyolc vizsgálati koncentrációból álló, konstans hígítási tényez őjű 
geometriai oldatsorozatot kell használni (lásd a 2.1. szakasz második bekezdését).
 
Ha a dózistartomány-meghatározási vizsgálat azt jelzi, hogy a vizs ­
gálandó vegyi anyag a sötétben végzett kísérletben (–Irr) a koncent ­
rációs határig nem citotoxikus, de besugárzás hatására (+Irr) er ősen 
citotoxikus, az adatmin őségi követelmény teljesítéséhez a (+Irr) 
kísérletek céljára kiválasztott koncentrációs tartományok különböz ­
hetnek a (–Irr) kísérletekhez kiválasztottaktól.  
1.4.2.2.  Ellen őrzések  
1.4.2.2.1. A s e j t e k s u g á r é r z é k e n y s é g e , t ö r t é n e t i a d a t o k 
e l ő á l l í t á s a  
A sejteket a fényforrásra való érzékenységük tekintetében életképes ­
ségük meghatározásával, növekv ő dózisú besugárzás alkalmazásával 
rendszeresen ellen őrizni kell (körülbelül minden ötödik passzázs 
után). Ebben a kiértékelésben több besugárzási dózist kell alkal ­
mazni, köztük a 3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálathoz használt 
szintnél jóval nagyobbakat is. E dózisok nagysága a legkönnyebben a fényforrás UV-részének mérésével határozható meg. A sejteket az  
in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálatban használt s űrűségben kell 
behelyezni, majd másnap besugárzásnak kell őket alávetni. Ezután 
egy nappal a neutrálvörös felvétele alapján meghatározható a sejt életképessége. Ki kell mutatni, hogy a keletkez ő legnagyobb nem 
citotoxikus dózis (pl. a validálási vizsgálatban: 5 J/cm
 2 [UVA]) 
elegendő a referenciavegyianyagok besorolásának helyes megálla ­
pításához (1. táblázat).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S u g á r é r z é k e n y s é g , a z a k t u á l i s v i z s g á l a t e l l e n ­ 
ő r z é s e  
A vizsgálat abban az esetben felel meg a min őségi követelménynek, 
ha a sugárkezelt negatív/kontrolloldószerek a nem sugárkezelt negatív/oldószerrel összehasonlítva 80 %-nál nagyobb életképességet mutatnak.
 
1.4.2.2.3. A k o n t r o l l o l d ó s z e r e k é l e t k é p e s s é g e  
A kontrolloldószerekb ől kivont neutrálvörös abszolút optikai s űrű­
sége (OD  540 NRU  ) jelzi, hogy a lyukanként elhelyezett 1x10  4 sejt a 
vizsgálat két napja alatt a rendes megkett őződési időnek megfelel ően 
fejlődött-e. A vizsgálat akkor felel meg az elfogadási kritériumnak, 
ha a kezeletlen kontollok OD  540 NRU  átlaga ≥ 0,4 (azaz körülbelül 
hússzorosa a háttéroldószer felszívóképességének).  
1.4.2.2.4. P o z i t í v k o n t r o l l  
Minden  in vitro  3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálattal párhuzamosan 
egy ismert fototoxikus vegyi anyagot is vizsgálni kell. Ajánlatos a klórpromazin (CPZ) használata. Az  in vitro  3T3 NRU fototoxicitás- 
vizsgálatban a standard protokoll szerint megvizsgált CPZ esetében a 
következő elfogadási kritériumok kerültek meghatározásra: sugárke ­
zelt (+Irr) CPZ: IC
 50 = 0,1 μg/ml-től 2,0 μg/ml-ig, nem sugárkezelt 
(–Irr) CPZ: IC  50 = 7,0 μg/ml-től 90,0 μg/ml-ig. A fotoirritációs 
tényezőnek (PIF) 6-nál nagyobbnak kell lennie. A pozitív kontroll 
történeti viselkedését ugyancsak vizsgálni kell.  
Klórpromazin helyett párhuzamos pozitív kontrollként más, a vizs ­
gált vegyi anyag kémiai osztályához vagy oldhatósági jellemz őihöz 
illő fototoxikus vegyi anyagok is használhatók.  
1.4.3.  Vizsgálati eljárás (6) (7) (8) (16) (17):  
1.4.3.1.  1. nap:  
Adagoljunk 100 μl tenyészt őközeget egy 96 lyukú szövetkultúra 
mikrotiter lemezének periférikus lyukaiba (= üres lyukak). A fenn ­
maradó lyukakba tegyünk 100 μl térfogatú, 1x10  5 sejt/ml sejtet 
tartalmazó szuszpenziót (= lxl0  4 sejt/lyuk). A vizsgálandó anyag 
koncentrációinak minden egyes sorozatához, valamint a kontrollol ­
dószerhez és a pozitív kontollokhoz két-két lemezt kell elkészíteni.  
Inkubáljuk a sejteket 24 óráig (lásd az 1.4.1.2. szakaszt), míg félig 
konfluens monoréteget nem alkotnak. Ez az inkubációs id ő lehetővé 
teszi a sejtek számára a megújulást, az adhéziót és az exponenciális 
növekedést.  
1.4.3.2.  2. nap:  
Az inkubációt követ ően a sejteket távolítsuk el a tenyészt őközegből, 
és óvatosan mossuk meg 150 μl, az inkubációhoz használt puffe ­
roldattal. Adjunk hozzá 100 μl olyan puffert, amely megfelel ő 
koncentrációban tartalmazza a vizsgálandó vegyi anyagot vagy az 
oldószert (kontrolloldószert). A vizsgálandó vegyi anyag 8 külön ­
böző koncentrációját alkalmazzuk. A vizsgálandó anyaggal 60 
percen át sötétben inkubáljuk a sejteket (lásd az 1.4.1.2. szakaszt 
és az 1.4.1.4. szakasz második bekezdését).  
A vizsgált anyagok koncentrációinak minden egyes sorozatához és a 
kontrollokhoz elkészített két-két lemezb ől általában véletlenszer űen 
válasszunk ki egyet-egyet a citotoxicitás meghatározásához (–Irr) (ez 
lesz a kontroll-lemez), és egyet (ez lesz a kezelt lemez) a fotocito ­
toxicitás meghatározásához (+Irr).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
A +Irr expozíció elvégzéséhez a sejtek besugárzását szobah őmér­
sékleten 50 percen át végezzük a 96 lyukú lemez fedelén keresz ­
tül, a legnagyobb olyan sugárdózissal, amely még nem citotoxikus (lásd a 2. függeléket is). A nem sugárkezelt lemezt (–Irr) ugyan ­
csak tartsuk 50 percig szobah őmérsékleten egy sötét dobozban (= 
fényexpozíciós id ő).
 
Szűrjük le a tesztoldatot, és óvatosan mossuk kétszer 150 μl, az 
inkubációhoz használt, de a vizsgált anyagot nem tartalmazó puffe ­
roldattal. Helyettesítsük a puffert tenyészt őközeggel és inkubáljuk 
(lásd az 1.4.1.2. szakaszt) egy éjszakán át (18–22 h).  
1.4.3.3.  3. nap:  
1.4.3.3.1. M i k r o s z k ó p o s é r t é k e l é s  
A sejteket a növekedés, a morfológia és a monoréteg integritása 
tekintetében fáziskontrasztos mikroszkóppal kell megvizsgálni. A 
sejtek morfológiájában bekövetkezett változásokat és a sejtek növe ­
kedésében tapasztalt jelenségeket fel kell jegezni.  
1.4.3.3.2. A n e u t r á l v ö r ö s - f e l v é t e l v i z s g á l a t a  
Mossuk meg a sejteket 150 μl előmelegített pufferrel. Gyenge ütöge ­
téssel távolítsuk el a mosószert. Adjunk hozzá 100 μl 50 μg/ml 
neutrálvöröst (NR) (3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazin-hidroklo ­
rid, EINECS-szám: 209-035-8; CAS-szám: 553-24-2; C.I.: 50040) 
tartalmazó szérum nélküli közeget (16), és az oldatot inkubáljuk az 
1.4.1.2. bekezdésben leírtak szerint 3 órán át. Az inkubáció után távolítsuk el az NR közeget, és mossuk meg a sejteket 150 μl 
pufferrel. Sz űrjük le, és szárítással vagy centrifugálással távolítsuk 
el a felesleges puffert.
 
Adjunk hozzá pontosan 150 μl NR deszorpciós oldatot (frissen 
készítve 49 rész víz + 50 rész etanol + 1 rész ecetsav).  
Egy mikrotiter rázólemezen 10 percen át óvatosan rázzuk a mikro ­
titer lemezt, mindaddig, amíg az NR elválik a sejtekt ől, és homogén 
oldatot nem képez.  
Egy spektrofotométerben 540 nm-en, az üres lapokat referenciaként 
használva mérjük meg az NR-kivonat optikai s űrűségét. Az adatokat 
további elemzés céljából megfelel ő elektronikus fájlformátumban 
mentsük el.  
2. ADATOK  
2.1. AZ ADATOK MIN ŐSÉGE ÉS MENNYISÉGE  
A vizsgálat adatainak lehet ővé kell tenniük a sugárzás jelenlétében és 
annak hiányában kapott koncentráció-válasz adatok elemzését, és 
amennyiben lehetséges, a vizsgált anyag azon koncentrációjának meghatározását, amelynél a sejt életképessége 50 %-ra csökken (IC
 50 ). Ha citotoxicitást találunk, a koncentrációk tartományát és az 
egyedi koncentrációértékeket úgy kell felvenni, hogy a vizsgálati 
adatokra görbe legyen fektethet ő. 
Az egyértelm űen pozitív és az egyértelm űen negatív eredmények 
esetében is (lásd a 2.3. szakasz els ő bekezdését) elegend ő lehet az 
első vizsgálat, amelyet el őzetes dózistartománykeres ő kísérlet(ek) 
előz(nek) meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
A kétes eredményeket, a határeseteket és a nem egyértelm ű eredmé­
nyeket további vizsgálatok során tisztázni kell (lásd még a 2.4. 
szakasz második bekezdését). Ilyen esetekben fontolóra kell venni a vizsgálati körülmények módosítását. Azok a vizsgálati körülmé ­
nyek, amelyek módosulhatnak, magukban foglalják a koncentrációk 
tartományát és konkrét értékeit, az el őinkubációs id őt és a sugárzási- 
expozíciós id őt. Vízben instabil viselkedés ű vegyi anyagok esetében 
rövidebb expozíciós id őt érdemes alkalmazni.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
Az adatok értékeléséhez a fotoirritációs tényez őt (PIF) vagy az 
átlagos fényhatást (MPE) célszer ű meghatározni.  
A fotocitotoxicitás-értékek kiszámításához (lásd lent) a diszkrét 
koncentráció-válasz értékpárokat folyamatos koncentráció-válasz görbével (modell) kell közelíteni. A görbének az adatokra való illesz ­
tése általában valamilyen nemlineáris regressziós módszerrel történik 
(18). Az adatokra illesztett görbéhez képest a tényleges adatok elté ­
réseinek hatását „bootstrap” eljárással célszer ű vizsgálni.
 
A fotoirritációs tényez ő (PIF) a következ ő képlet segítségével 
számítható ki:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Ha a fény jelenlétében vagy hiányában az IC  50 nem számítható ki, a 
vizsgált anyag PIF értéke nem határozható meg. Az átlagos fényhatás (MPE) kiszámítása a teljes koncentráció-válasz görbék összehasonlí ­
tásán alapul (19). Ez a mennyiség definíció szerint a fényhatás ­
értékek reprezentatív csoportján vett súlyozott átlagot jelenti:
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
A PE  C fényhatás bármely C koncentrációban az RE  C válaszhatás 
és a DE  C dózishatás szorzata: PE  c = RE  c × DE  c . Az RE  c válasz­
hatás a fény jelenlétében és hiányában megfigyelt válaszok különb ­
sége: RE  c = R  c (–Irr) – R  c (+Irr). A dózishatást a következ ő 
összefüggés adja:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
ahol C* az egyenérték-koncentráció, azaz az a koncentráció, 
amelynél C koncentráció esetén a +Irr válasz megegyezik a –Irr 
válasszal. Ha C* nem határozható meg, mert a +Irr görbe válasz ­
értékei rendszeresen nagyobbak vagy kisebbek mint RC(–Irr), a dózishatást l-nek kell tekintetni. A wi súlyozó tényez őt a legnagyobb 
válaszérték adja, azaz w
 i = MAX {R  i (+Irr), R  i (–Irr) }. A C  i 
koncentrációértékeket úgy kell megválasztani, hogy a vizsgált 
koncentrációértékek által kijelölt minden egyes intervallumba ugyan ­
annyi pont essen. Az MPE kiszámítása azon koncentrációmaxi ­
mumra korlátozódik, amelynél a két görbe közül legalább az egyik 
még legalább 10 % válaszértéket mutat. Ha ez a koncentrációma ­
ximum nagyobb, mint a +Irr vizsgálat során alkalmazott legnagyobb koncentráció, akkor úgy kell tekinteni, hogy a +Irr görbe maradék részén a válaszérték nulla. A vegyi anyagot attól függ ően tekintjük 
fototoxikusnak, hogy az MPE érték nagyobb-e, mint egy gondosan 
megválasztott kritikus érték (MPE
 C = 0,15).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
A PIF és az MPE kiszámításához rendelkezésre áll egy szoftver ­
csomag (20).  
2.3. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A validálási vizsgálat alapján (8), ha a vizsgált anyagra PIF < 2 vagy 
MPE < 0,1, akkor „nincs fototoxicitás”. Ha PIF > 2 és < 5 vagy MPE > 0,1 és < 0,15, akkor „lehetséges a fototoxicitás”; ha PIF > 5 
vagy MPE > 0,15, akkor „van fototoxicitás”.
 
Minden olyan laboratóriumnak, amely el őször végzi ezt a vizsgála ­
tot, a fototoxicitás-vizsgálat keretében a vizsgálandó anyagok teszte ­
lése előtt meg kell vizsgálnia az 1. táblázatban felsorolt referencia ­
anyagokat. A PIF és az MPE értékeknek az 1. táblázatban található értékek közelében kell lenniük.
 
1. táblázat  
Kémiai név EINECS-szám CAS-szám PIF MPE Felszívodás 
maximuma Oldószer (  1 ) 
Amiodaron- 
hidroklorid 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(irányváltás) etanol 
Klórpromazin- 
hidroklorid 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33–0,63 309 nm etanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316 nm acetonitril 
Antracén 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm acetonitril Protoporfirin 
IX, Dinátrium 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54–0,74 402 nm etanol 
L-Hisztidin [7006-35-1] nincs 0,05–0,10 211 nm víz 
Hexaklorofén 200-733-8 [70-30-4] 1,1-1,7 0,00–0,05 299 nm 
317nm 
(irányváltás) etanol 
Nátrium-lauril- 
szulfát 205-788-1 [151-21-3] 1,0-1,9 0,00–0,05 Nincs felszí ­
vódás víz
 
( 1 ) A felszívódás méréséhez használt oldószer.  
2.4. AZ ADATOK KIÉRTÉKELÉSE  
Ha a fototoxikus hatás csak a legnagyobb vizsgálati koncentrációban 
figyelhető meg (különösen a vízben oldódó vizsgált vegyi anyagok ­
nál), a kockázatok értékeléséhez további szempontok is szükségesek 
lehetnek. Ilyen szempont lehet a b őrön keresztül történ ő felszívó­
dásra, valamint a b őrben való vegyianyag-felhalmozódásra vonat ­
kozó adatok és/vagy más kísérletekb ől származó adatok, például a 
vegyi anyagnak  in vitro  állati vagy emberi b őrön, illetve b őrmodel­
leken történ ő vizsgálata.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Ha nem mutatható ki toxicitás (+Irr és –Irr) és ha a gyenge oldha ­
tóság behatárolta a vizsgálható koncentrációk számát, akkor megkér ­
dőjelezhető, hogy a vizsgálat alkalmas-e a kérdéses anyag tesztelé ­
sére, és meg kell fontolni ellen őrző vizsgálatok elvégzését, például 
másik modell használatát.  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek legalább a következ ő információkat kell 
tartalmaznia:  
Vizsgált anyag:  
— azonosítási adatok, közhasználatú generikus név és IUPAC- és 
CAS-szám, ha ismert,  
— fizikai tulajdonságok és tisztaság,  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából lényeges fizikai-kémiai tulaj ­
donságok,  
— UV/látható fény-abszorpciós spektrum,  
— szilárdság és fotostabilitás, ha ismert.  
Oldószer:  
— az oldószer kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált vegyi anyag oldószerben való oldhatósága,  
— a kezelési közegben lév ő oldószer aránya.  
Sejtek:  
— a sejtek típusa és eredete,  
— a mikoplazma hiánya,  
— a sejtpasszázsok száma, ha ismert,  
— a sejtek sugárérzékenysége, amelyet az  in vitro  3T3 NRU foto ­
toxicitás-vizsgálatban használt sugárkezel ő eszközzel kell 
meghatározni.  
Vizsgálati körülmények (1);  inkubáció a kezelés el őtt és után:  
— a tenyészt őközeg típusa és összetétele,  
— inkubációs körülmények (CO  2 -koncentráció; h őmérséklet; pára ­
tartalom),  
— az inkubáció id őtartama (el őkezelés; utókezelés).  
Vizsgálati körülmények (2);  a vegyi anyaggal történ ő kezelés:  
— a sugárzás jelenléte vagy hiánya esetén használt vizsgálati vegyi ­
anyag-koncentrációk kiválasztásának magyarázata,  
— a vizsgált vegyi anyag korlátozott oldhatósága és a citotoxicitás 
hiánya esetén: a vizsgált legnagyobb koncentráció magyarázata,  
— a kezelési közeg típusa és összetétele (puffersóoldat),  
— a vegyi kezelés id őtartama.  
Vizsgálati körülmények (3);  besugárzás:  
— a használt fényforrás kiválasztásának magyarázata,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— a fényforrás és a sugárzásmér ő gyártója és típusa,  
— a fényforrás spektrális irradiancia jellemz ői, 
— a használt sz űrő(k) átviteli és abszorpciós jellemz ői, 
— a sugárzásmér ő jellemzői és kalibrálásának részletei,  
— a fényforrás távolsága a vizsgálati rendszert ől, 
— UVA-sugárzás ezen a távolságon, mW/cm  2 -ben kifejezve,  
— az UV/látható fénynek való expozíció id őtartama,  
— UVA-dózis (irradiancia × id ő), J/cm  2 -ben kifejezve,  
— a sejtkultúrák besugárzás alatti, valamint az ezzel párhuzamosan 
sötétben tartott sejtkultúrák h őmérséklete.  
Vizsgálati körülmények (4);  neutrálvörös életképességi vizsgálat:  
— a neutrálvörös kezelési közeg összetétele,  
— a neutrálvörös inkubáció id őtartama,  
— inkubációs körülmények (CO  2 -koncentráció; h őmérséklet; pára ­
tartalom),  
— a neutrálvörös kivonásának körülményei (kivonó oldat; id őtar­
tam),  
— a neutrálvörös optikai s űrűségének leolvasásához használt spekt ­
rofotométer hullámhossza,  
— második hullámhossz (referencia), ha használják,  
— a spektrofotométer üreslap-tartalma, ha használják.  
Eredmények:  
— a vizsgált vegyi anyag minden egyes koncentrációja esetén a sejt 
életképessége a párhuzamos kontrolloldószerek átlagos életképes ­
ségének százalékában kifejezve,  
— koncentráció-válasz görbék (a vizsgált vegyi anyag koncentrá ­
ciója függvényében a relatív sejtéletképesség), amelyet párhuza ­
mosan végzett +Irr és –Irr kísérletek során nyertek,  
— a koncentráció-válasz görbék elemzése: ha lehetséges, az IC  50 
(+Irr) és IC  50 (–Irr) kiszámítása,  
— a sugárzás jelenlétében és hiányában nyert két koncentráció- 
válasz görbe összehasonlítása vagy a fotoirritációs tényez ő 
(PIF) vagy az átlagos fényhatás (MPE) kiszámításával,  
— a vizsgálat elfogadási kritériumai; párhuzamos kontrolloldószer,  
— a sugárkezelt és nem sugárkezelt sejtek abszolút életképessége (a 
neutrálvörös kivonat optikai s űrűsége),  
— a negatív kontroll és a kontrolloldószer történeti adatai; átlag ­
értékek és szórások,  
— a vizsgálat elfogadási kritériumai; párhuzamos pozitív kontroll,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— a pozitív kontrollanyag IC  50 (+Irr) és IC  50 (–Irr), valamint 
PIF/MPE értéke,  
— a pozitív kontrollanyagokra vonatkozó történeti adatok: 
IC 50 (+Irr) és IC  50 (–Irr), valamint PIF/MPE; átlagértékek és 
szórások.  
Az eredmények értékelése.  
Összefoglaló megállapítások.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of subs ­
tances for photoallergenic potential. Toxic.  In vitro  7: 95–102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI–XXXV.
 
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
314–348.
 
(4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p. 79–110.  
(5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
(6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and 
Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic.  In vitro  8, 793–796.
 
(7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26, 7–8.  
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, 
P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/ ­
COLIPA  In vitro  phototoxicity validation study: results of 
phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic.  In vitro  12, 305–327.
 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The  
In vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, 
Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary 
Report, 15th March 2002, OECD ENV7EHS, available upon 
request from the Secretariat.  
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.  
(11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control 
for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p. 515–530.
 
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
(14) ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
 
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275.
 
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 Septem ­
ber, 1998. 18 pgs.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G, Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, 
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 
679–708.
 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. 
Systems 3, 127–138.  
(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 
25, 445–462.
 
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34 377 
_2349687_l_l_l_l,00.html  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
1. FÜGGELÉK  
A 3T3 NRU PT szerepe a vegyi anyagok fototoxicitás-vizsgálatának szekvenciális 
megközelítésében
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
2. FÜGGELÉK  
1. ábra  
A szűrtnapfény-szimulátor spektrális energiaeloszlása
  
(lásd az 1.4.1.5. szakasz második bekezdését)  
Az 1. ábrán példa található a sz űrtnapfény-szimulátor elfogadható spektrális irradianciaeloszlására. 
A fényforrás a 3T3 NRU PT validálási vizsgálata során használt bevont fém-halogenid forrás (6) (8) (17). A görbén megfigyelhet ő a két különböz ő szűrő hatása és a 96 lyukú sejtkultúralemez fede ­
lének további sz űrőhatása. A H2 sz űrőt csak olyan vizsgálati rendszerrel használták, amely nagyobb 
UVB-értéket is képes elviselni (b őrmodellvizsgálat és vörösvérsejt fotohemolízisének vizsgálata). A 
3T3 NRU-PT-ben a H1 sz űrőt használták. Az ábra azt mutatja, hogy a lemezfedél további sz űrő­
hatását főként az UVB-tartományban figyelték meg, és ez még elég UVB-t hagyott a sugárzási 
spektrumban ahhoz, hogy aktiválja a jellegzetesen az UVB-tartományban abszorbeáló vegyi anya ­
gokat, mint amilyen az amiodaron (lásd az 1. táblázatot).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
2. ábra  
Balb/c 3T3 sejtek sugárérzékenysége (az UVA-tartományban mérve)  
Sejtéletképesség ( % a sötét kontrollok neutrálvörös felvétele)
  
(lásd az 1.4.1.5.2. szakasz második bekezdését, valamint az 1.4.2.2.1. és az 1.4.2.2.2. szakaszt)  
A Balb/c 3T3 sejteknek a 3T3 NRU fototoxicitás-vizsgálat validálási vizsgálatában használt 
napfényszimulátorral történ ő sugárzás hatása nyomán kialakuló érzékenysége az UVA-tartományban 
mérve. Az ábra a prevalidálási vizsgálat során 7 különböz ő laboratóriumban kapott eredményeket 
mutatja (1). Míg a két üres szimbólumú görbét öreg sejtekkel nyerték (nagy passzázsszám), amelyeket új sejttörzsekkel kellett helyettesíteni, addig a satírozott szimbólumú görbék olyan 
sejteket mutatnak, amelyeknek a sugártoleranciája elfogadható.
 
Ezekből az adatokból származtatták az 5 J/cm  2 legnagyobb nem citotoxikus sugárdózist (függ őleges 
szaggatott vonal). A vízszintes szaggatott vonal emellett az 1.4.2.2. szakaszban megadott maximális elfogadható sugárhatást mutatja.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  BŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER  
BEVEZETÉS  
1. Az OECD vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó iránymutatásait és az 
ezeken alapuló uniós vizsgálati módszereket id őnként felülvizsgálják a tudo ­
mányos fejl ődés, a változó szabályozási igények és állatjóléti megfontolások 
fényében. A b őrszenzibilizáció egereken történ ő meghatározására irányuló 
eredeti vizsgálati módszert, a lokális nyirokcsomó-vizsgálati módszer (LLNA; az OECD 429. vizsgálati iránymutatása; e melléklet B.42. fejezete) már korábban elfogadásra került (1). Az LLNA hitelesítésére vonatkozó 
információk és az ezzel kapcsolatos munka áttekintése a (2), (3), (4), (5), 
(6), (7), (8), (9), (10), (11) hivatkozásban található. Az aktualizált LLNA a tapasztalatok és tudományos adatok értékelésén alapul (12). Ez a második olyan vizsgálati módszer, amely a vegyi anyagok (anyagok és keverékek) 
bőrszenzibilizációt okozó hatásának állatokon történ ő vizsgálatára szolgál. 
A másik vizsgálati módszer (vagyis az OECD 406. vizsgálati iránymutatása; e melléklet B.6. fejezete) tengerimalacon végzett vizsgálatokat alkalmaz, nevezetesen a tengerimalac-maximizációs módszert és a Bühler-vizsgálatot 
(13). Az állatjólét szempontjából az LLNA el őnyösebb a B.6. fejezetben és 
az OECD 406. vizsgálati iránymutatásában szerepl ő módszereknél (13). Ez 
az aktualizált LLNA vizsgálati módszer több olyan teljesítményszabványt (1. függelék) foglal magában, amelyek alkalmazhatók az LLNA-hoz funk ­
cionálisan és módszertanilag hasonló új és/vagy módosított vizsgálati 
módszerek hitelesítési státusának az OECD 34. iránymutatásában foglalt elvekkel összhangban történ ő értékeléséhez (14).
 
2. Az LLNA a b őrszenzibilizáció indukciós fázisát vizsgálja, és a dózis-válasz 
vizsgálathoz alkalmazható kvantitatív adatokat szolgáltat. Megjegyzend ő, 
hogy azok az enyhén/közepesen szenzibilizáló anyagok, amelyeket 
a tengerimalac-vizsgálati módszerekhez pozitív kontrollanyagként ajánlanak 
(vagyis B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (13), az LLNA-nál is alkalmazhatók (6) (8) (15). E vizsgálati módszer esetében lehetőségként ismertetésre kerül a csökkentett LLNA (rLLNA) módszer is, 
amelyet akár 40 %-kal kevesebb állattal is el lehet végezni (16) (17) (18). 
Az rLLNA olyan esetekben alkalmazható, amikor a szabályozási el őírá­
soknak megfelel ően igazolni kell a feltételezett negatív b őrszenzibilizáló 
hatást, azzal a feltétellel, hogy a vizsgálati módszer e leírásában foglalt ­
aknak megfelel ően az LLNA protokolljában szerepl ő összes egyéb el őírást 
betartják. A negatív eredmény feltételezésének a 4. bekezdésben leírtak szerint az összes rendelkezésre álló adaton kell alapulnia. Az rLLNA módszer alkalmazása el őtt egyértelm űen meg kell indokolni a módszert 
alkalmazását, és ismertetni kell az alkalmazását alátámasztó tudományos 
magyarázatot. Amennyiben az rLLNA a várakozásokkal ellentétben pozitív vagy kétes eredményt ad, az eredmény értelmezéséhez és tisztázásához további vizsgálatokra lehet szükség. Az rLLNA nem használható b őrszen­
zibilizáló vizsgált anyagok veszélyességének meghatározását célzó vizsgála ­
tokhoz abban az esetben, ha dózis-válasz információra van szükség, mint például az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról szóló 1272/2008/EK rendelet és az ENSZ vegyi anyagok osztá ­
lyozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszere szerinti alka ­
tegóriákba sorolás esetében.
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
3. Az alkalmazott fogalmak meghatározása a 2. függelékben található.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
4. Az LLNA alternatív módszert jelent a lehetséges b őrszenzibilizáló vegyi 
anyagok meghatározására. Ez nem feltétlenül jelenti azt, hogy minden 
esetben az LLNA-t kell alkalmazni a tengerimalac-vizsgálat (lásd B.6. feje ­
zet, az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (14) helyett, inkább azt, hogy ez a vizsgálati módszer ugyanolyan hasznos, és olyan alternatív módszer ­
ként alkalmazható, amely esetében a pozitív és negatív eredmények álta ­
lában már nem igényelnek további meger ősítést. A vizsgálat elvégzése el őtt 
a vizsgáló laboratóriumnak a vizsgált anyagról rendelkezésre álló összes
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
adatot figyelembe kell vennie. Ezen információk közé tartozik a vizsgált 
anyag azonosítása, kémiai szerkezete, fizikai-kémiai tulajdonságai, valamint 
a vizsgált anyaggal korábban végzett  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizs ­
gálatok eredményei és a szerkezetileg rokon vegyi anyagok toxikológiai adatai is. Mindezen információk figyelembevételével dönthet ő el, hogy a 
LLNA alkalmazható-e az adott anyag esetében (tekintve, hogy bizonyos 
vegyianyag-típusoknál inkompatibilitás áll fenn az LLNA-val (lásd az (5) bekezdést), és milyen dózist célszer ű választani a vizsgálatokhoz.
 
5. Az LLNA  in vivo  módszer, következésképpen nem küszöbölhet ő ki vele az 
állatok felhasználása az allergiás kontakt szenzibilizáló hatás vizsgálata során. Ugyanakkor csökkenteni lehet vele az e célra felhasznált állatok 
számát. Az LLNA emellett az állatok kontakt szenzibilizációs vizsgálatok 
során történ ő felhasználásának módját tekintve jelent ősen kíméletesebb 
(kevesebb fájdalommal és szenvedéssel jár). Az LLNA azon immunológiai történések figyelmes vizsgálatán alapul, amelyeket a vegyi anyagok a szen ­
zibilizáció indukciós fázisában stimulálnak. A tengerimalac-vizsgálattól 
(B.6.; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (13) eltér ően az LLNA- 
hoz nincs szükség indukált b őr-hiperszenzitivitási reakciók el őidézésére. A 
tengerimalac-maximizációs vizsgálattal ellentétben nincs szükség adjuváns 
alkalmazására sem (13). Az LLNA alkalmazásával tehát csökkenthet ő az 
állatokat ér ő fájdalom és szenvedés mértéke. Az LLNA-nak a B.6. pont és 
az OECD 406. vizsgálati iránymutatása szerinti vizsgálatokkal szembeni előnyei ellenére el kell ismerni, hogy a módszernek vannak olyan korlátai 
(pl. az LLNA hamis negatív eredményei egyes fémek, vagy hamis pozitív 
eredményei bizonyos b őrirritáló anyagok, [például bizonyos felületaktív 
szerek] esetében (19) (20), illetve a vizsgált anyag oldhatósága), amelyek szükségessé teszik a B.6. pont és az OECD 406. vizsgálati iránymutatása 
szerinti vizsgálatok alkalmazását (21). Továbbá az olyan kémiai osztályok 
vagy funkcionális csoportot tartalmazó anyagok, amelyek lehetséges zavaró tényezőként szerepelnek (21) szükségessé tehetik a tengerimalac-vizsgálatok 
(vagyis a B.6. pont; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) használatát 
(13). Emellett a hitelesítési adatbázis hiányosságai miatt, amely els ősorban 
peszticid készítmények adataiból áll, az LLNA a tengerimalac-vizsgálatnál nagyobb valószín űséggel ad pozitív eredményt az ilyen típusú vizsgált 
anyagok esetében (22). A készítmények vizsgálatakor azonban, az LLNA 
megfelelő működésének bizonyításához meg lehet fontolni az ismert ered ­
ménnyel rendelkez ő, hasonló anyagok referenciaanyagként történ ő bevo­
nását is (lásd 16. bekezdés). E meghatározott hiányosságokon kívül, az 
LLNA bármilyen anyag vizsgálatára megfelel ő, kivéve, ha ezek az anyagok 
olyan tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek befolyásolják az LLNA pontosságát.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
6. Az LLNA módszer hátterében az az alapelv áll, hogy a szenzibilizáló 
anyagok els ődleges limfocitaproliferációt indukálnak a vizsgált anyag alkal ­
mazási területének nyirokelvezetésér ől gondoskodó nyirokcsomókban. Ez a 
proliferáció arányos az alkalmazott allergén dózisával és er ősségével, vala ­
mint egyszer ű módszert biztosít a szenzibilizáció kvantitatív méréséhez. A 
proliferációt úgy mérik, hogy a vizsgálati csoportokban mért átlagos proli ­
ferációt összehasonlítják a viv őanyaggal kezelt csoportban mért proliferáci ­
óval. Meghatározzák az egyes kezelt csoportokban és a párhuzamosan viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoportokban mért átlagos proliferáció arányát, amelyet stimulációs indexnek (SI) neveznek, és amelynek legalább ≥ 3- 
nak kell lennie ahhoz, hogy indokolt legyen a vizsgált anyag potenciális 
bőrszenzibilizáló anyagként történ ő besorolása. Az itt ismertetett eljárások  
in vivo  radioaktív anyaggal történ ő jelölésen alapulnak, amellyel mérhet ő az 
elvezető aurikuláris nyirokcsomókban lév ő proliferáló sejtek számának 
növekedése. A proliferációs sejtek számának vizsgálatára azonban más 
végpontok is alkalmazhatók, feltéve, hogy a PS követelmények maradékta ­
lanul teljesülnek (1. függelék).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
A VIZSGÁLAT LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
7. Ehhez a vizsgálathoz az egér a választandó faj. A CBA/Ca vagy CBA/J 
törzsbe tartozó, fiatal feln őtt nullipara és nem vemhes n őstény egereket kell 
használni. A vizsgálat elején az állatok korának 8–12 hétnek kell lennie, az állatok testtömege között az eltérésnek minimálisnak kell lennie, és a test ­
tömeg nem haladhatja meg az átlagos testtömeg 20 %-át. Ha elegend ő adat 
áll rendelkezésre arra nézve, hogy az LLNA módszerrel kapott válaszreak ­
cióban nincsenek jelent ős törzs- és/vagy ivarspecifikus különbségek, akkor 
más törzsek, illetve hím állatok is alkalmazhatók.
 
Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
8. Az egereket csoportosan kell tartani (23), kivéve, ha az egyedenkénti 
tartásra megfelel ő tudományos indok merül fel. A kísérleti állatok tartásául 
szolgáló helyiség h őmérsékletének 22 °C ± 3 °C-nak kell lennie. Noha a 
helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától eltekintve – lehet őség szerint nem haladhatja meg 
a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen 
mesterséges, 12 órás világos, 12 órás sötét periódusok váltakozásával. Az 
etetéshez a szokásos laboratóriumi takarmány alkalmazható korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 
Az állatok el őkészítése  
9. Az állatokat véletlenszer űen választják ki, majd egyedi azonosítóval látják 
el (viszont az állat fülén semmiféle azonosító nem alkalmazható), és a kezelés megkezdése el őtt legalább 5 napig a ketrecükben tartják őket, 
hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. A kezelés 
megkezdése el őtt minden állatot megvizsgálnak, hogy meggy őződjenek 
arról, nincs rajtuk látható b őrsérülés.
 
A dózisok el őkészítése  
10. A szilárd halmazállapotú vegyi anyagokat az egér fülén történ ő alkal­
mazás el őtt oldószerben/viv őanyagban kell feloldani vagy szuszpendálni, 
és szükség esetén hígítani kell. A folyadék halmazállapotú vegyi anya ­
gokat hígítatlanul vagy az adagolás el őtt hígított formában lehet alkal ­
mazni. A nem oldható vegyi anyagokat, például az orvosi eszközökben általánosan el őforduló anyagokat megfelel ő oldószerben történ ő agresszív 
extrakciónak kell kitenni, hogy a vizsgálat során az egér fülén való 
alkalmazás el őtt az összes kivonható összetev őt feltárjuk. A vizsgált anya ­
gokat naponta kell elkészíteni, kivéve, ha stabilitási adatok igazolják, hogy a tárolás elfogadható.
 
A megbízhatóság ellen őrzése  
11. A vizsgálat megfelel ő teljesítményének megfelel ő és reprodukálható szen ­
zitivitással adott válaszreakciókkal történ ő igazolására pozitív 
kontrollanyagokat (PK) alkalmaznak; ezek olyan szenzibilizáló tesztanya ­
gok, amelyek esetében a válaszreakció mértéke pontosan meghatározott. 
Pozitív kontroll párhuzamos vizsgálata ajánlott, mivel ez igazolja, hogy a laboratórium megfelel ő szakértelemmel végzi az egyes vizsgálatokat, és 
lehetővé teszi a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodu ­
kálhatóság és összehasonlíthatóság értékelését. Néhány szabályozó hatóság 
szintén el őírja a pozitív kontroll minden vizsgálat során történ ő alkalmazá ­
sát, ezért az LLNA módszer elvégzése el őtt ajánlott egyeztetni az illetékes 
hatóságokkal. Ennek megfelel ően javasolt a pozitív kontroll rutinszer ű 
párhuzamos vizsgálata, hogy elkerülhet őek legyenek az olyan további állat ­
kísérletek, amelyeket a pozitív kontrollt csak id őszakosan alkalmazó
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
laboratórium az el őírásoknak való megfelelés érdekében végezne (lásd a 12. 
bekezdést). A pozitív kontrollnak az LLNA módszerrel olyan expozíciós 
szint mellett kell pozitív válaszreakciót adnia, amely a negatív kontrollcsoporthoz (NK) képest várhatóan legalább 3-mal növeli a stimulá ­
ciós indexet (SI). A pozitív kontroll dózisát úgy kell megválasztani, hogy ne 
okozzon túlzott b őrirritációt vagy szisztémás toxicitást, és az indukció 
reprodukálható, de ne túl nagymérték ű legyen (tehát SI > 20 már túlzottnak 
tekinthető). Az előnyben részesítend ő pozitív kontrollanyagok a 25 %-os 
hexil-cinnemaldehid (Chemical Abstracts Service [CAS] szám: 101-86-0) 
aceton: olívaolaj (4:1, v/v) keverékében és 5 %-os merkaptobenzotiazol 
(CAS-szám: 149-30-4) N,N-dimetilformamidban (lásd 1. függelék, 1. táblá ­
zat). Adódhatnak olyan körülmények, amelyek fennállásakor, megfelel ő 
indoklás esetén a fenti kritériumoknak megfelel ő más pozitív kontroll ­
anyagok is alkalmazhatók.
 
12. Bár ajánlott a pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata, lehetnek azonban 
olyan helyzetek, amikor a pozitív kontroll id őszakos (például legalább 6 havonta 
végzett) vizsgálata elfogadható lehet az olyan, az LLNA vizsgálatot rendsze ­
resen (vagyis legalább havonta egyszeri gyakorisággal) végz ő laboratóriumok 
esetében, amelyek rendelkeznek a pozitív kontrollok igazolt, historikus adatbá ­
zisával, és ezzel bizonyítható, hogy a laboratórium a pozitív kontrollokkal képes reprodukálható és pontos eredményeket el őállítani. Az LLNA módszerben való 
jártasság alátámasztható a pozitív kontrollal megfelel ő időszakon belül (keve ­
sebb mint egy éve) végzett legalább 10 független vizsgálat során kapott követ ­
kezetesen pozitív eredményekkel.
 
13. Pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata minden alkalommal szük ­
séges, valahányszor az LLNA vizsgálat módszerében változtatást hajtanak 
végre (például a képzett személyzet, a vizsgálati eljárás során használt 
anyagok és/vagy reagensek, a vizsgálati eszközök, vagy a kísérleti állatok beszerzési forrásának megváltoztatása), és ezeket a változásokat dokumen ­
tálni kell a laboratóriumi jelentésekben. Figyelembe kell venni, hogy ezek a 
változtatások mennyiben befolyásolják a korábban létrehozott historikus 
adatbázis megfelel őségét, és el kell dönteni, hogy szükséges-e új historikus 
adatbázis felállítása a pozitív kontroll eredményei következetességének dokumentálása érdekében.
 
14. A vizsgálatot végz ő személyeknek tisztában kell lenniük azzal, hogy 
amennyiben a párhuzamos vizsgálat helyett a pozitív kontrollok id őszakos 
vizsgálata mellett döntenek, ez hatással lehet a pozitív kontrollok id őszakos 
vizsgálatai közötti id őszakokban, párhuzamos pozitív kontroll vizsgálata 
nélkül előállított negatív vizsgálati eredmények megfelel őségére és elfogad ­
hatóságára. Ha például a pozitív kontrollal végzett id őszakos vizsgálat álne ­
gatív eredményt adott, akkor megkérd őjelezhetők azok a negatív eredmé ­
nyek, amelyek az utolsó elfogadható eredmény ű és az elfogadhatatlan ered ­
ményű időszakos pozitív kontroll vizsgálat között eltelt id őszakban kelet ­
keztek. Az ilyen következmények jelent őségét körültekint ően mérlegelni 
kell annak eldöntésekor, hogy pozitív kontrollokat párhuzamosan vagy csak időszakosan vizsgáljanak-e. Szintén megfontolandó a kevesebb állat 
használata a párhuzamos pozitív kontrollcsoportban, amennyiben ez tudo ­
mányosan indokolt, és a laboratóriumra specifikus historikus adatok alapján a laboratórium igazolja, hogy megfelel ő a kevesebb egér használata (12).
 
15. Bár a pozitív kontrollt olyan viv őanyagban kell vizsgálni, amelyr ől ismert, 
hogy következetes válaszreakciót vált ki (például aceton:olívaolaj; 4:1, v/v 
arányú keveréke), lehetnek olyan szabályozási helyzetek, amikor nem szok ­
ványos viv őanyagokban (klinikailag/kémiailag releváns készítmény) történ ő 
vizsgálat elvégzésére is szükség van (24). Amennyiben a párhuzamos 
pozitív kontrollt a vizsgált anyagétól eltér ő vivőanyagban vizsgálják, 
akkor a párhuzamos pozitív kontrollal együtt egy külön viv őanyagos kont ­
rollt is vizsgálni kell.  
16. Azokban az estekben, amikor egy bizonyos vegyi csoportba tartozó vizsgált 
anyagokat vagy a válaszreakciók tartományát értékelik, szintén hasznos 
lehet a referenciaanyagok alkalmazása annak igazolására, hogy a vizsgálati 
módszer megfelel ően működik az ilyen típusú vizsgált anyagok b őrszenzi­
bilizáló hatásának kimutatására. A megfelel ő referenciaanyagoknak a követ ­
kező tulajdonságokkal kell rendelkezniük:  
— szerkezeti és funkcionális hasonlóság a vizsgált anyag csoportjával,  
— ismert fizikai/kémiai tulajdonságok,  
— az LLNA módszerrel kapott alátámasztó adatok,  
— egyéb állatmodellekb ől és/vagy emberb ől származó alátámasztó adatok.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
Az állatok száma és a dózisszintek  
17. Minden dóziscsoportban legalább négy állatot kell használni, és a vizsgált 
anyagból legalább három különböz ő koncentrációt, továbbá párhuzamos 
negatív kontrollcsoportot, amelyet csak a vizsgált anyaghoz használt viv ő­
anyaggal kezelnek, valamint egy pozitív kontroll csoportot kell alkalmazni (pozitív kontroll párhuzamos vagy a közelmúltban végzett vizsgálata a 
laboratórium szabályzatának megfelel ően, figyelembe véve a 11-14. bekez ­
désben foglaltakat). Megfontolandó a pozitív kontroll többféle dózisának vizsgálata, különösen, ha a pozitív kontroll vizsgálatát id őszakosan végzik. 
A kontrollcsoportban lév ő állatokkal ugyanúgy kell bánni és dolgozni, mint 
a kezelt csoportokban lév őkkel, azzal a kivétellel, hogy az állatokat nem 
kezelik a vizsgált anyaggal.
 
18. A dózist és a viv őanyagot a (3) és (5) számú hivatkozásokban megadott 
ajánlások alapján kell kiválasztani. Az egymás utáni dózisok kiválasztása 
általában megfelel ő koncentrációsorból, például 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 
5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % stb. történik. Az alkalmazott koncentrációsort megfelelő tudományos megfontolások alapján kell kiválasztani. A három 
egymás utáni koncentráció kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált 
anyagról esetlegesen rendelkezésre álló valamennyi toxikológiai információt 
(például akut toxicitás és b őrirritáció), valamint szerkezeti és fizikokémiai 
adatot, hogy a legmagasabb koncentrációval a lehet ő legnagyobb expozíciót 
idézzük el ő, amely még nem okoz szisztémás toxicitást és/vagy túlzott 
mértékű lokális b őrirritációt (3) (25). Ilyen jelleg ű információk hiányában 
szükséges lehet a megel őző előszűrő vizsgálat (lásd a 21-24. bekezdést).
 
19. A viv őanyagnak nem szabad megzavarnia vagy befolyásolnia a vizsgálat 
eredményét, és aszerint kell kiválasztani, hogy a vizsgált anyag oldható ­
sága a lehet ő legnagyobb koncentráció elérése érdekében maximális 
legyen, ugyanakkor a vizsgált anyag felvitelére alkalmas oldatot/szuszpen ­
ziót kapjunk. A javasolt viv őanyagok az aceton:olívaolaj (4:1, v/v) keve ­
réke, N,N-dimetilformamid, metil-etil-keton, propilén-glikol és 
dimetil-szulfoxid (19), de megfelel ő tudományos indoklás esetén más 
vivőanyagok is alkalmazhatók. Bizonyos esetekben további kontrollként 
szükséges lehet valamely klinikai szempontból releváns oldószer haszná ­
lata, vagy annak a kereskedelmi formulának az alkalmazása, amelyben a 
vizsgált anyagot forgalomba hozzák. Különösen vigyázni kell arra, hogy 
megfelelő szolubilizáló szerek (pl. 1 % Pluronic® L92) alkalmazásával a 
hidrofil vizsgált anyagokat olyan viv őanyagrendszerbe építsük be, amely 
benedvesíti a b őrt, de nem folyik le azonnal. A teljesen vizes alapú 
vivőanyagokat tehát kerülni kell.  
20. A nyirokcsomók egyedenként történ ő feldolgozása lehet ővé teszi az 
egyedek közötti variabilitás, valamint a vizsgált anyaggal és a viv őanyaggal 
kezelt csoport eredményeinek statisztikai összehasonlítását (lásd a 35. 
bekezdést). Emellett akkor lehet értékelni, hogy lehetséges-e csökkenteni 
a pozitív kontrollcsoportban lév ő egerek számát, ha az egyedi állatokra 
vonatkozóan gy űjtünk adatokat (12). Ezen túlmen ően, egyes szabályozó 
hatóságok is megkövetelik az egyedi állatokon alapuló adatgy űjtést. 
Egyes szabályozó hatóságok azonban esetleg elfogadhatónak tartják az állat ­
okra vonatkozó összesítve gy űjtött adatokat, és ezekben az esetekben, a 
felhasználók eldönthetik, hogy egyedenként vagy összesítve kívánják-e gyűjteni a kísérleti állatokra vonatkozó adatokat.
 
Előszűrő vizsgálat  
21. A legmagasabb vizsgálandó dózis meghatározását lehet ővé tevő információ 
hiányában (lásd a 18. bekezdést) az LLNA módszerhez alkalmazandó megfelelő dózisszint megállapítása érdekében el őszűrő vizsgálatot kell 
végezni. Az el őszűrő vizsgálat célja, hogy támpontot adjon az LLNA vizs ­
gálat során alkalmazandó maximális dózis kiválasztásához, amennyiben a 
szisztémás toxicitást (lásd a 24. bekezdést) és/vagy nagyfokú b őrirritációt 
(lásd 23. bekezdés) okozó koncentrációra vonatkozó információk nem állnak rendelkezésre. Folyadékok esetében a legmagasabb vizsgált dózisnak 
100 %-os koncentrációnak kell lennie, szilárd anyagok vagy szuszpenziók 
esetében pedig a lehetséges maximális koncentrációnak.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Az el őszűrő vizsgálatot a f ő LLNA vizsgálathoz hasonló körülmények 
között kell elvégezni, eltekintve attól, hogy a nyirokcsomó proliferációt 
nem kell értékelni, valamint dóziscsoportonként kevesebb állat használható. Dóziscsoportonként egy vagy két állat javasolt. Az egereket a szisztémás toxicitás, illetve az alkalmazás helyén fellép ő helyi irritáció jeleinek szem ­
pontjából naponta megfigyelik. A testtömeget a vizsgálat el őtt és az állat 
exterminálása el őtt is (6. nap) feljegyzik. A b őrpírt az egerek mindkét fülén 
vizsgálják és pontozzák az 1. táblázat (25) szerint. A fülvastagság értékeit egy vastagságmér ővel (például digitális mikrométer, vagy Peacock Dial 
vastagságmér ő) állapítják meg az 1. napon (az adagolás el őtt), a 3. napon 
(hozzávet őleg 48 órával az els ő dózis után), valamint a 6. napon. A 6. 
napon a fülvastagságot ezen kívül a fülb ől lyukasztással eltávolított szövet 
tömegének meghatározásával is meg lehet állapítani, amit az állat extermi ­
nálása után kell elvégezni. Nagyfokú helyi b őrirritációnak min ősül a 
legalább ≥ 3-as pontszámú b őrpír és/vagy legalább ≥ 25 %-os fülvastag ­
ság-növekedés a vizsgálat bármely napján (26) (27). A f ő LLNA vizs ­
gálathoz azt a dózist kell maximális dózisként választani, amely az 
előszűrés során alkalmazott koncentrációsorban (lásd a 18. bekezdést) a 
szisztémás toxicitást és/vagy nagyfokú helyi b őrirritációt okozó koncentrá ­
ciónál eggyel alacsonyabb.
 
1. táblázat  
Bőrpír (erythema) pontszámai  
Megfigyelés Pontszám  
Nincs erythema 0 
Nagyon enyhe erythema (alig észlelhet ő) 1 
Jól körülírt erythema 2 Közepes-súlyos erythema 3 Súlyos (céklavörös elszínez ődés), pörkképz ődéig terjed ő eryt­
hema, amely lehetetlenné teszi az erythema besorolását 4
 
23. A 25 %-os fülvastagság-növekedésen felül (26) (27), a b őrirritáló anyagok 
LLNA módszerrel végzett kimutatásához a kezelt állatok fülvastagságának kontrollcsoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns növekedését is 
használják (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Noha 25 % alatti fülvastagság 
esetén is el őfordulhat statisztikailag szignifikáns növekedés, a nagyfokú 
irritációval azonban ezt különösen nem hozták összefüggésbe (30) (32) (33) (34).
 
24. Az integrált értékelés részeként alkalmazva a következ ő klinikai tünetek 
jelezhetnek szisztémás toxicitást (35) (36), és ezáltal kijelölhetik a f ő 
LLNA vizsgálat során alkalmazandó maximális dózist: az idegrendszer 
működésében bekövetkez ő változások (például piloerekció, ataxia, tremorok 
és görcsrohamok); a viselkedésben bekövetkez ő változások (például agresz ­
szivitás, a tisztálkodási tevékenységekben bekövetkez ő változás, az aktivi ­
tási szint jelent ős változása); a légzési mintázat változása (például a légvé ­
telek gyakoriságában és az intenzitásában bekövetkez ő változás, úgymint 
dyspnoe, zihálás és szörtyzörejek), valamint változások az táplálék- és vízfogyasztásban. Az értékelés során emellett figyelembe kell venni a 
letargia és/vagy reakciókészség hiányának jeleit, valamint az enyhénél és 
pillanatnyinál fokozottabb fájdalom vagy szenvedés bármilyen klinikai tüne ­
tét, az > 5 %-nál nagyobb arányú testtömegcsökkenést az 1. naptól a 6. napig tartó id őszakban, valamint a mortalitást. Az elhullásközeli állapotban 
lévő, egyértelm űen fájdalmat érz ő vagy súlyos, tartós szenvedés jeleit 
mutató állatokat humánus módon exterminálni kell (37).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
A fő vizsgálat kísérleti ütemterve  
25. A vizsgálat kísérleti ütemterve a következ ő: 
— 1. nap:  Külön meg kell határozni, és fel kell jegyezni mindegyik állat 
testtömegét és az esetleges klinikai megfigyeléseket. Vigyünk fel 25 μl 
térfogatú, megfelel ő hígítású vizsgált anyagot, valamint a viv őanyagot 
önmagában vagy pozitív kontrollt (pozitív kontroll párhuzamos vagy a közelmúltban végzett vizsgálata a laboratórium szabályzatának megfele ­
lően, figyelembe véve a 11–15. bekezdésekben foglaltakat) a fülek 
dorzális oldalára.
 
— 2. és 3. nap:  Ismételjük meg az 1. napon elvégzett felviteli eljárást.  
— 4. és 5. nap:  Nincs kezelés.  
— 6. nap:  Jegyezzük fel az állatok testtömegét. Injekciózzunk 250 μl steril 
20 μCi (7,4 × 10  5 Bq)  3 H-metil-timidint tartalmazó sós 
foszfátpuffert (PBS) a kezelt és kontrollegerek farokvénájába. Használ ­
hatunk ehelyett 250 μl, steril 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jóddezoxiuridint 
és 10  –5 M fluordezoxiuridint tartalmazó PBS-t is, szintén az egerek 
farokvénájába injektálva. Öt órával kés őbb extermináljuk az állatokat. 
Mindegyik kísérleti csoportban az állatok füléb ől vágjuk ki a kezelt 
terület nyirokelvezetésér ől gondoskodó füli nyirokcsomókat, és minden 
egyes állat esetében egyenként helyezzük PBS-be (egyedi állatokon 
alapuló megközelítés); vagy tegyük a mintákat kísérleti csoportonként 
egy PBS-t tartalmazó edénybe (kezelési csoportokon alapuló összevont megközelítés). A nyirokcsomók azonosításának és preparálásának rész ­
letei és az ehhez kapcsolódó ábrákat a (12) hivatkozásban találhatók. A 
helyi bőrreakció f ő vizsgálatban történ ő további monitorozásához olyan 
további paramétereket lehet belevenni a vizsgálati protokollba, mint például a b őrpír pontozása vagy a fülvastagság mérése (akár vastagság ­
mérővel, akár elölés utáni füldarabsúly-meghatározással).
 
A sejtszuszpenziók elkészítése  
26. Az egyedi állatokon alapuló vagy kezelési csoporton alapuló összevont 
megközelítést alkalmazva, az egyes állatokból két oldalról vett 
nyirokcsomósejtekb ől (LNC) álló egysejtszuszpenziókat kell el őállítani a 
sejtek 200 mikrométeres lyukméret ű rozsdamentes acélból készült fémhálón 
keresztül vagy egyéb elfogadható módszerrel történ ő óvatos mechanikai 
szétválasztásával. A nyirokcsomósejteket nagy feleslegben lév ő PBS-sel 
kétszer át kell mosni, majd a DNS-t 4 °C-on 18 órán át, 5 %-os triklórecetsavval (TCA) precipitálni (3). A pelleteket vagy 1 ml TCA-ban 
újra kell szuszpendálni és 10 ml szcintillációs folyadékot tartalmazó szcin ­
tillációs fiolákba (
 3 H-számlálás) áttenni, vagy közvetlenül gammaszámláló 
csövekbe (  125 I-számlálás) kell átrakni.  
A sejtproliferáció meghatározása (beépült radioaktivitás)  
27. A  3 H-metil-timidin beépülését a β-szcintillációs beütésszámmal mérik, 
percenkénti bomlás (DPM) egységekben. A  125 I-jóddezoxiuridin beépülését 
a 125 I beütésszámával mérik, és ugyancsak DPM-ben fejezik ki. Az alkal ­
mazott megközelítést ől függően a beépülést DPM/egér (egyedi állatokon 
alapuló megközelítés) vagy DPM/kezelési csoport (kezelési csoporton 
alapuló összevont megközelítés) egységben fejezik ki.  
Csökkentett LLNA (rLLNA)  
28. Bizonyos esetekben, amikor a szabályozási el őírásoknak megfelel ően 
igazolni kell a b őrszenzibilizáló képesség feltételezett hiányát, opcionális 
rLLNA protokoll alkalmazható (16) (17) (18), amelyhez kevesebb állatot kell felhasználni, azzal a feltétellel, hogy a vizsgálati módszer e leírá ­
sában foglalt, az LLNA protokolljában szerepl ő összes egyéb el őírást 
betartják. Az rLLNA módszer alkalmazása el őtt egyértelm űen meg kell 
indokolni annak alkalmazását, és ismertetni kell az alkalmazást alátá ­
masztó tudományos magyarázatot. Amennyiben a módszer pozitív vagy 
kétes eredményt ad, további vizsgálatokra lehet szükség az eredmény 
értelmezéséhez és tisztázásához.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Az LLNA és az rLLNA vizsgálati módszerek protokolljai között az 
egyetlen különbség a dóziscsoportok kisebb száma az rLLNA esetében, 
ennélfogva az rLLNA módszer nem szolgáltat adatokat a dózis-válasz összefüggésre vonatkozóan. Az rLLNA módszer ezért nem alkalmazható olyan esetekben, amikor a dózis-válasz összefüggésre vonatkozó informáci ­
ókra van szükség. A több dózist alkalmazó LLNA módszerhez hasonlóan az 
rLLNA módszer során a vizsgált anyagból alkalmazott maximális koncent ­
rációt úgy kell megválasztani, hogy az ne idézzen el ő az egérnél kifejezett 
szisztémás toxicitást és/vagy túlzott mérték ű helyi bőrirritációt (lásd a 18. 
bekezdést).
 
MEGFIGYELÉSEK  
Klinikai megfigyelések  
30. Naponta legalább egyszer minden egérnél meg kell vizsgálni az alkalmazás 
helyén kialakuló lokális vagy szisztémás toxicitás esetleges tüneteit. Minden 
megfigyelést szisztematikusan fel kell jegyezni minden egyes egér esetében, 
egyedi adatsor felvételével. A monitoring tervnek tartalmaznia kell azon kritériumokat, amelyek alapján azonnal azonosíthatóak az eutanáziát igénylő, szisztémás toxicitást, kiterjedt helyi b őrirritációt vagy b őrkorróziót 
mutató egerek (37).
 
Testtömeg  
31. Ahogyan az a 25. bekezdésben szerepel, az egyes állatok testtömegét a 
vizsgálat kezdetén, valamint a humánusan történ ő exterminálás tervezett 
időpontjában kell megmérni.  
AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA  
32. Az egyes kezelési csoportokra vonatkozó eredményeket stimulációs 
indexben (SI) fejezzük ki. Az egyedi állatokon alapuló megközelítés alkal ­
mazása esetén, akkor az SI kiszámítása úgy történik, hogy a vizsgált 
anyaggal kezelt egyes csoportokban és a pozitív kontrollcsoportban kapott állatonkénti átlagos DPM-értéket el kell osztani az oldószerrel/viv őanyaggal 
kezelt kontrollcsoport átlagos állatonkénti DPM-értékével. A viv őanyaggal 
kezelt kontrollcsoportok átlagos SI-értéke tehát 1. A kezelési csoportokon 
alapuló összevont megközelítésének alkalmazása esetén az SI-t úgy kapják meg, hogy az egyes kezelési csoportokra es ő összevont radioaktív beépülést 
elosztják a viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportra jutó összevont beépüléssel, 
ami megadja az átlagos SI-t.
 
33. A válaszreakciót akkor lehet pozitívan értékelni, ha a stimulációs index 
legalább ≥ 3. Amikor azonban azt kell meghatározni, hogy egy határértéken 
lévő eredmény pozitívnak tekintend ő-e, akkor a dózis-válasz összefüggés 
erőssége, a statisztikai szignifikancia és az oldószerrel/viv őanyaggal, vala ­
mint a pozitív kontrollal kapott válaszreakciók következetessége is felhasz ­
nálható (4)(5)(6).  
34. Ha a kapott eredmények tisztázást igényelnek, figyelembe kell venni a 
vizsgált anyag különféle tulajdonságait, és ezen belül azt is, hogy mutat-e szerkezeti rokonságot ismert b őrszenzibilizáló anyagokkal, okoz-e er őteljes 
helyi bőrirritációt egereknél, illetve hogy milyen a megfigyelt dózis-válasz 
összefüggés. Ezek, illetve további megfontolások részletesebb tárgyalását lásd a (7) hivatkozásban.
 
35. A radioaktivitási adatok egyes egerekre vonatkozó gy űjtése lehet ővé teszi a 
dózis-válasz összefüggés adatokban tükröz ődő fennállásának és mértékének 
statisztikai elemzését. Bármely statisztikai elemzés tartalmazhatja a dózis- válasz összefüggés értékelését, valamint a vizsgálati csoportok megfelel ően 
korrigált összehasonlításait (például a dóziscsoportok páronkénti összeha ­
sonlítása a párhuzamos, viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportokkal). A 
statisztikai elemzésekben a dózis-válasz tendenciák értékelésénél szerepelhet például lineáris regresszió vagy Williams-féle próba, a páronkénti összeha ­
sonlításoknál pedig Dunnett-féle próba. A megfelel ő statisztikai elemzési 
módszer kiválasztásakor a vizsgálónak figyelemmel kell lennie a lehetséges 
varianciaegyenl őtlenségekre és más kapcsolódó problémákra, amelyek miatt 
az adatok transzformációjára vagy nem paraméteres statisztikai elemzésre lehet szükség. A vizsgálónak minden esetben el kell végeznie az SI-k 
kiszámítását és statisztikai elemzéseket bizonyos adatpontokkal (az úgyne ­
vezett „kiugró adatokkal”) és azok nélkül.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
ADATOK ÉS JELENTÉS  
Adatok  
36. Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni. Az egyedi állatokon 
alapuló megközelítés alkalmazása esetén, ki kell mutatni az egyedi 
DPM-értéket, a csoport átlagos DPM/állat értékeit, az ehhez tartozó hiba értékeket (pl. SD, SEM), valamint az egyes dóziscsoportokra vonatkozó átlagos SI értéket összevetve a megfelel ő, vivőanyaggal kezelt kontrollcso ­
port értékével. A kezelési csoportokon alapuló összevont megközelítésének 
alkalmazása esetén az egyes dóziscsoportoknál ki kell mutatni az átlagos/ medián DMP és átlagos stimulációs index értékét összehasonlítva a megfelelő vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport értékével.
 
Vizsgálati jelentés  
37. A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyagok és kontrollanyagok:  
— azonosító adatok (pl. adott esetben a CAS-szám és az EU-szám; eredet; 
tisztaság; ismert szennyez ők; tételszám),  
— fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. illékonyság, stabi ­
litás, oldhatóság),  
— elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek egymáshoz 
viszonyított aránya,  
Oldószer/viv őanyag:  
— azonosító adatok (adott esetben tisztaság; koncentráció; alkalmazott 
térfogat,  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— CBA egértörzs származása,  
— az állatok mikrobiológiai státusa, amennyiben ismert,  
— az állatok száma és életkora,  
— az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.,  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgált anyagból el őállított készítménnyel és annak alkalmazásával 
kapcsolatos adatok,  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása (ezen belül adott esetben az 
előszűrési vizsgálatok eredményei),  
— a vivőanyag és a vizsgált anyag alkalmazott koncentrációja, valamint a 
vizsgált anyagból alkalmazott teljes mennyiség,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takar ­
mány típusa/eredete, a víz eredete),  
— a kezelés adatai és a mintavételek ütemezése,  
— a toxicitás mérésére alkalmazott módszerek,  
— a pozitív és negatív vizsgálati eredmény kimondásának kritériumai,  
— a protokolltól való esetleges eltérések adatai, és annak kifejtése, hogy az 
eltérés hogyan érintheti vizsgálati tervet és az eredményeket,  
A megbízhatóság ellen őrzése:  
— a legutóbbi megbízhatósági ellen őrzés eredményeinek összefoglalása az 
alkalmazott anyag, koncentráció és viv őanyag adataival együtt,  
— a vizsgálólaboratórium párhuzamosan és/vagy korábban vizsgált pozitív 
és párhuzamosan vizsgált negatív kontrollokra vonatkozó adatai,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— ha nem vizsgáltak párhuzamosan pozitív kontrollt, a laboratóriumban 
legutóbb végzett id őszakos pozitív kontroll dátuma és laboratóriumi 
jelentése, valamint pozitív kontroll vizsgálatának korábbi adatait részle ­
tező jelentés, amely indokolja, hogy miért nem végzik a laboratóri ­
umban pozitív kontroll párhuzamos vizsgálatát,  
Eredmények:  
— az egyes állatok testtömege a kezelés kezdetén és az exterminálás terve ­
zett időpontjában, illetve az átlagos és vonatkozó hibamutatók (pl. SD, 
SEM) kezelési csoportonként,  
— a toxicitási tünetek, ezen belül az alkalmazás helyén esetleg kialakuló 
bőrirritáció megjelenésének id őpontja és id őbeli alakulása minden egyes 
állatra vonatkozóan,  
— az egy egérre vonatkozó (egyedi állatokon alapuló megközelítés) és az 
átlagos (kezelési csoportokon alapuló összevont megközelítés) 
DPM-értékek és SI-értékek kezelési csoportonkénti táblázata,  
— átlagos és kapcsolódó hibamutatók (pl. SD, SEM) az állatonkénti 
DPM-értékek esetében, az egyes kezelés csoportokban, és a kiugró értékek elemzése az egyes kezelési csoportokban, amennyiben az egyedi 
állatokon alapuló megközelítést alkalmazzuk,
 
— a kiszámított SI és a variabilitás megfelel ő mutatója, amely az egyedek 
közti variabilitást a vizsgált anyaggal kezelt csoportban és a kontroll ­
csoportokban egyaránt figyelembe veszi, amennyiben az egyedi állat ­
okon alapuló megközelítést alkalmazzuk,  
— dózis-válasz összefüggés,  
— adott esetben statisztikai elemzések,  
Az eredmények tárgyalása:  
— rövid kommentár az eredményekhez, a dózis-válasz elemzéshez és adott 
esetben a statisztikai elemzésekhez, és következtetés levonása arra vonatkozóan, hogy a vizsgált anyagot b őrszenzibilizáló hatásúnak 
kell-e tekinteni vagy sem.
 
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Elektronikus formá ­
tumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165-169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13- 
31. 
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985-997.
 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food 
Chem. Toxicol ., 36, 327-33.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., 
Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph 
node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scien ­
tific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273.  
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257.  
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektro ­
nikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Elektronikus formá ­
tumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281-284.
 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185.  
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), 
European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alter ­
native Methods, April 2007. Elektronikus formátumban: [http://ecvam.jrc.it/ 
ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Elektronikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi ­
nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektro ­
nikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/ 
llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90-96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment 
of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: [http://iccvam.ni ­
ehs.nih.gov/]
 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: Nati ­
onal Academies Press.  
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing 
of Chemicals No. 404, Paris, France. Elektronikus formátumban: http:// 
www.oecd.org/document/40/ 
0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]  
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: 
Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomple ­
te.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, 83-94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245-256.
 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Elektronikus formátumban: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In 
Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluati ­
ons. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, 
OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testgu ­
idelines]
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
1. függelék  
Teljesítményszabványok a b őrszenzibilizáció vizsgálatára javasolt hasonló 
vagy módosított LLNA vizsgálati módszerek értékeléséhez  
BEVEZETÉS  
1. A teljesítményszabványok (PS) célja annak ismertetése, hogy milyen 
alapon lehet egy vizsgálati módszerr ől – akár védett (például szerz ői joggal 
védett, védjeggyel ellátott, bejegyzett), akár nem védett módszerr ől – 
megállapítani, hogy adott vizsgálati célokra kell ő pontossággal és megbíz ­
hatósággal rendelkezik-e. Ezek a hitelesített és elfogadott vizsgálati 
módszereken alapuló teljesítményszabványok a hasonló tudományos 
elvekre és mérésre épül ő, illetve azonos biológiai vagy toxikus hatást 
előrevetítő módszerek (köznapi elnevezéssel „me-too” vizsgálatok) megbíz ­
hatóságának és pontosságának értékelésére alkalmazhatók (14).  
2. A módosított módszerek (például tervezett esetleges javítás egy jóváhagyott 
vizsgálati módszeren) alkalmazása el őtt értékelést kell végezni annak 
meghatározására, hogy a tervezett változtatások milyen hatást gyakorolnak 
a vizsgálat teljesítményére, és milyen mértékben befolyásolják a hitelesítési 
folyamat egyéb összetev őiről rendelkezésre álló információkat. A tervezett 
változtatások számától és jellegét ől, valamint a változtatásokra vonatkozóan 
keletkezett adatoktól és alátámasztó dokumentációtól függ ően, ezeket vagy 
az új vizsgálatokra el őírtakkal megegyez ő hitelesítési eljárásnak, vagy – 
amennyiben ez lehetséges – a megállapított teljesítményszabványban foglalt korlátozott megbízhatósági és relevanciaértékelésnek kell alávetni (14).
 
3. Az e vizsgálati módszer alapján alkalmazásra javasolt hasonló vagy módo ­
sított eljárásokat megbízhatóságuk és pontosságuk meghatározása érde ­
kében az LLNA-pontértékek teljes tartományát képvisel ő vegyi anyagok 
felhasználásával kell értékelni. Állatok indokolatlan felhasználásának elke ­
rülése érdekében kifejezetten ajánlott, hogy a modell kifejleszt ői, mielőtt a 
teljesítményszabványban és a vizsgálati módszer e leírásában adott útmu ­
tatásnak megfelel ően megkezdenék a hitelesítési vizsgálatokat, egyeztes ­
senek az illetékes hatóságokkal.  
4. Ezek a teljesítményszabványok az LLNA hasonló vagy módosított válto ­
zatainak értékelésére szolgáló US-ICCVAM, EC-ECVAM és Japanese-JaCVAM harmonizált teljesítményszabványokon alapulnak (12). 
A teljesítményszabvány tartalmazza a vizsgálati módszer alapvet ő összete­
vőit, az ajánlott referenciaanyagokat, valamint a pontosság és megbízha ­
tóság azon szabványos értékeit, amelyet a javasolt módszernek el kell érnie, 
vagy meg kell haladnia.
 
I. A vizsgálati módszer alapvet ő összetev ői 
5. Annak biztosítására, hogy a hasonló vagy módosított LLNA módszer funk ­
cionális és mechanikai szempontból megegyez ő legyen az LLNA-val, és 
ugyanazt a biológiai hatást mérje, a vizsgálati módszer protokolljában a 
következő összetev őknek kell szerepelniük:  
— a vizsgált anyagot helyileg kell felvinni az egér mindkét fülére,  
— a limfocitaproliferációt a vizsgált anyag alkalmazásának területér ől 
elvezető nyirokcsomókban kell mérni,  
— a limfocitaproliferációt a b őrszenzibilizáció indukciós fázisában kell 
mérni,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— a vizsgált anyagból alkalmazott maximális koncentrációt úgy kell 
megválasztani, hogy az ne idézzen el ő az egérnél szisztémás toxicitást 
és/vagy túlzott mérték ű helyi bőrirritációt. Pozitív referenciaanyagok 
esetében a legmagasabb dózisnak el kell érnie legalább az adott refe ­
renciaanyag LLNA EC3 értékét (lásd az 1. táblázatot), ami még nem 
idéz elő az egérnél szisztémás toxicitást és/vagy túlzott mérték ű helyi 
bőrirritációt,  
— minden vizsgálat során alkalmazni kell párhuzamos negatív kontrollt, és 
adott esetben párhuzamos pozitív kontrollt is,  
— dóziscsoportonként legalább négy állatot kell használni,  
— az állatok adatai egyénileg vagy összesítve is gy űjthetők. 
Amennyiben e feltételek bármelyike nem teljesül, akkor ezek a teljesít ­
ményszabványok a hasonló vagy módosított módszer hitelesítésére nem 
alkalmazhatók.  
II. A referenciaanyagok minimális listája  
6. Az US-ICCVAM, EC-ECVAM és a Japanese-JaCVAM harmonizált telje ­
sítményszabvány (12) az LLNA teljesítményszabványában 18 minimálisan alkalmazandó referenciaanyagot, valamint négy opcionális referencia ­
anyagot azonosít (ezek például olyan anyagok, amelyek az LLNA-vizs ­
gálatban álpozitív vagy álnegatív eredményt adtak a humán és a tengeri ­
malacokon végzett vizsgálatokkal összehasonlítva [B.6. fejezet vagy az OECD 406. vizsgálati iránymutatása] (13), ezért lehet őséget biztosítanak 
az LLNA vizsgálatéval egyenérték ű vagy jobb teljesítmény igazolására). E 
vegyi anyagok kiválasztása során a következ ő kritériumokat vették figye ­
lembe:
 
— a referenciaanyagok listája megfelelt a b őrszenzibilizáció hatás szem ­
pontjából általában vizsgált anyagok típusainak, valamint az LLNA-val mérhető vagy előre jelezhet ő válaszreakciók tartományának,
 
— az anyagok jól meghatározott kémiai szerkezettel rendelkeznek,  
— mindegyik anyagról rendelkezésre álltak tengerimalacokon végzett vizs ­
gálatokból (B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (13) és (lehetőség szerint) humán vizsgálatokból származó LLNA-adatok, vala ­
mint
 
— az anyagok kereskedelmi forrásból azonnal elérhet ők voltak.  
Az ajánlott referenciaanyagok felsorolása az 1. táblázatban található. Az 
ajánlott referenciaanyagok alkalmazásával végzett vizsgálatokat annál a vivőanyagnál kell értékelni, amellyel együtt az 1. táblázatban szerepelnek. 
Amennyiben a listában szerepl ő anyag esetleg nem áll rendelkezésre, akkor 
megfelelő indoklással az említett kiválasztási kritériumoknak megfelel ő 
egyéb anyagok is használhatók.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
1. táblázat  
Az LLNA teljesítményszabványhoz javasolt referenciaanyagok  
Sorszám Vegyi anyagok (  1 ) CAS-szám Halmazál ­
lapot Vivő ( 2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Tényleges 
EC3-tarto ­
mány LLNA vs. 
tengerimalac LLNA vs. 
humán  
1 5-klór-2-metil-4-izotiazolin-3-on (CMI)/2-metil-4- 
izotiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Foly. DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NSZ +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Szil. AOO 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-feniléndiamin 106-50-3 Szil. AOO 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 4 Kobalt-klorid 7646-79-9 Szil. DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 5 Izoeugenol 97-54-1 Foly. AOO 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 
6 2-merkaptobenzotiazol 149-30-4 Szil. DMF 1,7 1 0,85-3,4 NSZ +/+ +/+ 
7 Citrál 5392-40-5 Foly. AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Foly. AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Foly. AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Fenil-benzoát 93-99-2 Szil. AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Cinnamil-alkohol 104-54-1 Szil. AOO 21 1 10,5-42 NSZ +/+ +/+ 
12 Imidazolidinil-urea 39236-46-9 Szil. DMF 24 1 12-48 NSZ +/+ +/+ 
13 Metil-metakrilát 80-62-6 Foly. AOO 90 1 45-100 NSZ +/+ +/+ 14 Klórbenzol 108-90-7 Foly. AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Izopropanol 67-63-0 Foly. AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Sorszám Vegyi anyagok (  1 ) CAS-szám Halmazál ­
lapot Vivő ( 2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Tényleges 
EC3-tarto ­
mány LLNA vs. 
tengerimalac LLNA vs. 
humán  
16 Tejsav 50-21-5 Foly. DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Metil-szalicilát 119-36-8 Foly. AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Szalicilsav 69-72-7 Szil. AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Opcionális anyagok az LLNA-hoz viszonyított jobb teljesítmény igazolásához 
19 Nátrium-lauril-szulfát 151-21-3 Szil. DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Etilén-glikol-dimetakrilát 97-90-5 Foly. MEK 28 1 14-56 NSZ +/– +/+ 
21 Xilol 1330-20-7 Foly. AOO 95,8 1 47,9-100 NSZ +/ (**) +/– 
22 Nikkel-klorid 7718-54-9 Szil. DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Rövidítések: AOO = aceton: olívaolaj (4:1, v/v); CAS-szám = Chemical Abstracts Service szám; DMF =  N,N -dimetilformamid; DMSO = dimetil-szulfoxid; DNCB = 2,4-dinitroklórbenzol; EC3 = 3-as stimulációs index el őidézé- 
séhez szükséges becsült koncentráció; GP = tengerimalacon végzett vizsgálat eredménye ( lásd B. 6. vagy az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (13); HCA = hexil-cinnamaldehid; Foly. = folyadék; LLNA = murin lokális 
nyirokcsomó-vizsgálat eredménye ( lásd B.42. vagy az OECD 429. vizsgálati iránymutatása) (2); MEK = metil-etil-keton; NA = nem alkalmazható, mivel a stimulációs inde x < 3; NSZ = nem került kiszámításra, mert az adatok 
egyetlen vizsgálatból származnak; Szil. = szilárd; Viv ő, = a vizsgálathoz alkalmazott viv őanyag. 
(*) Embereknél feltételezhet ően nem okoz szenzibilizációt, mivel klinikai epikután (patch) teszt eredmények nem voltak fellelhet ők, nem szerepel az epikután vizsgálati készletekben allergénként, továbbá humán szenzibili ­
zációról szóló esettanulmány nem lelhet ő fel. 
(**) Tengerimalacokra vonatkozó adatok nem állnak rendelkezésre. 
( 1 ) A vegyi anyagokat aznap kell elkészíteni, kivéve, ha stabilitási adatok igazolják, hogy a tárolás elfogadható. 
( 2 ) A különböz ő vivőanyagok LLNA vizsgálat teljesítményére gyakorolt potenciális hatása miatt az egyes referenciaanyagokhoz ajánlott viv őanyagot kell használni (24) (32). 
( 3 ) Átlagérték, ahol több EC3-érték is rendelkezésre állt. Negatív anyagoknál (3-as alatti stimulációs index) a legmagasabb vizsg ált koncentráció van megadva. 
( 4 ) Az adatok forrásául szolgáló LLNA-vizsgálatok száma. 
( 5 ) Kereskedelemben kapható Kathon CG néven (CAS-szám: 55965-84-9), ami CMI és MI 3:1 arányú keveréke. Az egyes összetev ők relatív koncentrációja a 1,1-1,25 %-os (CMI) és 0,3–0,45 %-os (MI) tartományban mozog. 
Inaktív összetev ők a magnéziumsók (21,5–24 %) és a réz-nitrát (0,15–0,17 %), a fennmaradó rész pedig 74–77 % víz. A Kathon CG könnyen beszerezhe tő a Sigma-Aldrich and Rohm and Haas (jelenleg Dow Chemical 
Corporation) cégt ől.
 III. A megbízhatóságra és pontosságra vonatkozóan meghatározott szabvá ­
nyok  
7. A hasonló vagy módosított LLNA módszerek pontosságának a minimálisan 
alkalmazandó 18 referenciaanyaggal vizsgálva el kell érnie vagy meg kell haladnia az LLNA teljesítményszabványában meghatározott pontosságot. Az új vagy módosított módszernek „igen/nem” döntés alapján a vizsgált 
anyag helyes besorolását kell eredményeznie. Az új vagy módosított 
módszernek ugyanakkor nem feltétlenül kell az összes minimálisan alkal ­
mazandó referenciaanyagot helyesen besorolnia. Ha például a vizsgálat a gyengén szenzibilizáló anyagok egyikét esetleg nem megfelel ően sorolná 
be, akkor a hibás besorolás elméleti alapjait, valamint megfelel ő kiegészít ő 
adatokat (például olyan vizsgálati eredményeket, amelyek alapján a hibásan besorolt referenciaanyagéhoz hasonló fizikai, kémiai és szenzibilizáló jellemzőkkel rendelkez ő egyéb anyagok besorolása helyesen történt) figye ­
lembe lehetne venni az egyenérték ű teljesítmény bizonyítása érdekében. 
Ilyen körülmények között az új vagy módosított LLNA vizsgálati módszer hitelesítési státusának értékelése eseti alapon történne.
 
Laboratóriumon belüli reprodukálhatóság  
8. A laboratóriumon belül reprodukálhatóság meghatározásához az új vagy 
módosított LLNA módszert az LLNA-vizsgálatban jól jellemzett szenzibi ­
lizáló anyag használatával kell értékelni. Ezért az LLNA teljesítményszab ­
vány a hexil-cinnamaldehid (HCA) ismételt vizsgálataiból származó ered ­
mények variabilitásán alapul. A laboratóriumon belüli megbízhatóság érté ­
keléséhez négy külön alkalommal, a vizsgálatok között legalább egy hetes 
időszakot hagyva meg kell határozni a HCA-ra vonatkozó becsült koncent ­
rációküszöb (ECt) értékeit. Akkor elfogadható a laboratóriumon belüli reprodukálhatóság, ha a laboratórium a HCA mindegyik vizsgálata során 
5 % és 20 % közötti ECt-értékeket kap, amelyek a HCA-ra vonatkozóan 
az LLNA-vizsgálatban meghatározott átlagos EC3 (10 %) 0,5–2,0-szere ­
sének felelnek meg (lásd az 1. táblázatot).
 
Laboratóriumok közötti reprodukálhatóság  
9. Az új vagy módosított LLNA módszer laboratóriumok közötti reprodukál ­
hatóságát az LLNA-vizsgálatban jól jellemzett két szenzibilizáló anyag 
használatával kell értékelni. Ezért az LLNA teljesítményszabványa a HCA és a 2,4-dinitroklórbenzol (DNCB) különböz ő laboratóriumokban 
végzett vizsgálataiból származó eredmények variabilitásán alapul. Az 
ECt-értékeket függetlenül, legalább három külön laboratóriumban végzett 
azonos vizsgálat alapján kell kiszámítani. Akkor igazolható a laboratóri ­
umok közötti reprodukálhatóság, ha a HCA-ra mindegyik laboratórium 5 % és 20 % közötti, a DNCB-re pedig 0,025 % és 0,1 % közötti ECt-értékeket 
kap, amelyek az LLNA-vizsgálatban a HCA-ra (10 %), illetve a DNCB-re 
(0,05 %) vonatkozóan meghatározott átlagos EC3-koncentráció 0,5-2,0- szeresének felelnek meg (lásd az 1. táblázatot).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
2. függelék  
Fogalommeghatározások  
Pontosság:  A vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referen ­
ciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének muta ­
tója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést 
gyakran használják az „egyezés” megfelel őjeként, amely egy adott vizsgálati 
módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (14).  
Referenciaanyag:  A vizsgált anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként 
használt szenzibilizáló vagy nem szenzibilizáló anyag. A referenciaanyaggal szemben a következ ő elvárások fogalmazhatók meg: i. állandó és megbízható 
beszerzési forrásból vagy forrásokból kell származnia; ii. a vizsgált anyagok 
csoportjához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. 
ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell állniuk az anyag ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástar ­
tományban ismert hatásúnak kell lennie.
 
Becsült koncentrációküszöb (ECt):  Valamely vizsgált anyag ahhoz szükséges 
becsült koncentrációja, hogy az anyag pozitív válaszreakcióra utaló stimulációs 
indexet adjon.  
Becsült koncentráció 3 (EC3):  Valamely vizsgált anyag ahhoz szükséges becsült 
koncentrációja, hogy hármas stimulációs indexet adjon.  
Álnegatív:  Valamely vizsgálati módszerrel tévesen negatívnak vagy inaktívnak 
minősített vizsgált anyag, amely valójában pozitív vagy aktív.  
Álpozitív:  Valamely vizsgálattal tévesen pozitívnak vagy aktívnak min ősített vizs ­
gált anyag, amely valójában negatív vagy inaktív.  
Veszély:  Káros egészségügyi vagy ökológiai hatások el őidézésének lehet ősége. A 
káros hatás csak akkor jelenik meg, ha kell ő szintű az expozíció.  
Laboratóriumok közötti reprodukálhatóság:  Annak mértéke, hogy a különböz ő 
minősített laboratóriumok azonos protokoll és azonos vizsgált anyagok alkalma ­
zásával mennyire képesek min őségileg és mennyiségileg azonos eredményeket 
produkálni. A laboratóriumok közötti reprodukálhatóság az el őhitelesítési és hite ­
lesítési folyamat során kerül meghatározásra, és annak mértékét jelzi, hogy az adott vizsgálat mennyire sikeresen vihet ő át laboratóriumok között; más néven 
laboratóriumok közötti megismételhet őség (14).
 
Laboratóriumon belüli reprodukálhatóság:  Annak meghatározása, hogy az ugyan ­
azon laboratóriumban dolgozó képzett személyek meghatározott protokoll különböz ő 
időpontokban történ ő alkalmazásával mennyire sikeresen tudják reprodukálni az 
eredményeket. Más néven laboratóriumon belüli megismételhet őség (14).  
Me-too vizsgálat:  Olyan vizsgálati módszerek köznapi elnevezése, amelyek struk ­
turálisan és funkcionálisan hasonlóak egy hitelesített és elfogadott referenciaként szolgáló vizsgálati módszerhez. Az ilyen vizsgálati módszerek esetében 
megfelelő lehet az úgynevezett „catch-up” (rövidített) hitelesítési eljárás. A 
hasonló vizsgálati módszer szinonimája (14).
 
Kiugró érték:  A kiugró érték olyan megfigyelés, amely szembet űnően eltér az 
egy populációból vett véletlenszer ű minta egyéb értékeit ől. 
Teljesítményszabványok (PS):  Hitelesített vizsgálati módszeren alapuló szabvá ­
nyok, amelyek a javasolt, funkcionalitás és végrehajtás szempontjából hasonló vizsgálati módszer összehasonlíthatósági értékelésének alapjául szolgálnak. Ide 
tartoznak i. a vizsgálati módszer alapvet ő összetev ői; ii. a hitelesített vizsgálati 
módszer elfogadható teljesítményének igazolására alkalmazott vegyi anyagok közül kiválasztott referenciaanyagok minimális listája; valamint iii. a hitelesített vizsgálati módszerrel kapott eredmények alapján az a hasonló szint ű pontosság és 
megbízhatóság, amelyet a javasolt vizsgálati módszernek a referenciaanyagok 
minimális listájával történ ő értékeléskor mutatnia kell (14).
 
Védett vizsgálati módszer:  Olyan vizsgálati módszer, amelynek esetében az el őál­
lítást és a forgalmazást szabadalmak, szerz ői jogok, védjegyek stb. korlátozzák.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Minőségbiztosítás:  Irányítási folyamat, amelynek során a laboratóriumi vizsgálati 
szabványok és követelmények betartását, a jegyz őkönyvek vezetését, valamint az 
adattovábbítás pontosságát a vizsgálatot végz ő személyekt ől független személyek 
ellenőrzik. 
Referenciaanyagok:  A hitelesítési eljárás során történ ő alkalmazásra kiválasztott 
olyan vegyi anyagok, amelyek esetében már ismert az  in vitro  vagy  in vivo  
referencia-vizsgálatirendszerben vagy vizsgált fajnál adott válaszreakció. Ezeknek 
a vegyi anyagoknak reprezentatívaknak kell lenniük arra az anyagcsoportra nézve, amely esetében a vizsgálati módszert várhatóan alkalmazni fogják, és képviselniük kell azon vegyi anyagokra jellemz ő válaszreakciók teljes tartomá ­
nyát – az er őstől kezdve a gyengén át a negatívig –, amelyek esetében az adott 
referenciaanyag alkalmazható. A hitelesítési eljárás különböz ő szakaszaiban, 
illetve a különböz ő vizsgálati módszerekhez és vizsgálati alkalmazásokhoz a 
referenciaanyagok különböz ő csoportjaira lehet szükség (14).
 
Relevancia:  A vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, 
hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt 
tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi el őre a vizsgált 
biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontos ­
ságát (az eredmények egyezését) kell figyelembe venni (14).  
Megbízhatóság:  Azonos protokoll szerint végzett vizsgálati módszer laboratóri ­
umon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóságának mérésére szolgál. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámítá ­
sával állapítják meg (14).
 
Bőrszenzibilizáció:  Immunológiai folyamat, amely akkor jelentkezik, ha egy érzé ­
keny egyén lokálisan érintkezik valamely indukáló hatású allergén vegyi anyag ­
gal, amely esetlegesen kontakt szenzibilizáció kialakulásához vezet ő immunvá ­
laszt vált ki a b őrben.  
Stimulációs index (SI):  Adott vizsgált anyag b őrszenzibilizációt okozó képes ­
ségének meghatározására kiszámított érték, amely az anyaggal kezelt csoportban 
és a párhuzamosan viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportban tapasztalt proliferáció 
aránya.  
Vizsgált anyag (más néven vizsgált vegyi anyag):  Bármely anyag vagy keverék, 
amelyet ezzel a vizsgálati módszerrel vizsgálnak.  
Hitelesített vizsgálati módszer:  Olyan vizsgálati módszer, amely esetében az adott 
célra történ ő alkalmazás relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága 
hitelesítési vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a hitelesített vizsgálati módszerek nem feltétlenül nyújtanak megfelel ő teljesítményt 
a pontosság és megbízhatóság tekintetében ahhoz, hogy egy tervezett alkalmazási 
célra megfelel őnek minősüljenek (14).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKBAN  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer egyenérték ű az OECD TG 424 (1997) módszerrel.  
Ennek a vizsgálati módszernek az a célja, hogy megkapjuk egy 
vegyület feln őtt állatokra gyakorolt neurotoxicitási potenciáljának 
igazolásához vagy további jellemzéséhez szükséges információkat. A vizsgálat végezhet ő más, az ismételt dózisú toxicitási vizsgála ­
tokhoz alkalmazott ismert vizsgálati módszerekkel együtt vagy 
önálló vizsgálatként is. Az e módszeren alapuló vizsgálatok megter ­
vezésekor ajánlatos az OECD Neurotoxicitási Vizsgálati Stratégiák és Módszerek Útmutatóját (1) is igénybe venni. Ez különösen akkor fontos, ha fontolóra vesszük a megfigyelések és vizsgálati eljárások 
módosítását az e módszer rutinalkalmazásához ajánlottakhoz képest. 
Az útmutató azzal a céllal készült, hogy el ősegítse a konkrét felté ­
telek esetén alkalmazandó egyéb vizsgálati eljárások kiválasztását.
 
Ez a módszer nem terjed ki a fejl ődési neurotoxicitás tanulmányo ­
zására.  
1.1. BEVEZETÉS  
A vegyületek toxikus jellemz őinek vizsgálatakor és értékelésekor 
fontos figyelembe venni a neurotoxikus hatások lehet őségét. Már 
az ismételt dózisú szisztémás toxicitási vizsgálati módszer is magában foglal olyan megfigyeléseket, amellyel a neurotoxicitás 
lehetőségét szűrik. Ez a vizsgálati módszer felhasználható olyan vizs ­
gálatok tervezésére, amelyekkel további információk szerezhet ők az 
ismételt dózisú szisztémás toxicitási vizsgálatokban megfigyelt neurotoxikus hatásokkal kapcsolatban, vagy meger ősíthetik azokat. 
Azonban bizonyos vegyületcsoportok potenciális neurotoxicitásának 
mérlegelése azt sugallhatja, hogy e módszer alkalmasabb lehet ezek vizsgálatára anélkül, hogy ismételt dózisú szisztémás toxicitási vizs ­
gálatok az adott anyag potenciális neurotoxicitását el őre jeleznék. 
Ilyen megfontolások például a következ ők:
 
— neurológiai tünetek vagy neuropathológiai léziók észlelése az 
ismételt dózisú szisztémás toxicitási vizsgálatoktól eltér ő toxici­
tási vizsgálatokban, vagy  
— szerkezeti összefüggések vagy más információk, amelyek 
kapcsolatba hozzák az anyagot ismert neurotoxikus anyagokkal.  
Előfordulhatnak továbbá más olyan esetek is, amikor ezt a módszert 
érdemes alkalmazni. A további részleteket lásd az (1) hivatkozásban.  
E módszert úgy dolgozták ki, hogy annak megfelel ő kiigazításával 
egy vegyület egyedi kórszövettani és viselkedési neurotoxicitásának 
igazolására vonatkozó sajátos elvárásoknak is megfeleljen, és tegye 
lehetővé a neurotoxikus válaszok jellemzését és számszer űsítését.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
A neurotoxicitást korábban azonosnak tekintették az idegbántal ­
makkal (neuropátia), beleértve az idegkórtani bántalmakat vagy ideg ­
működési zavarokat, így például rohamokat, bénulást vagy remegést. 
Bár az idegbántalmak a neurotoxicitás fontos megnyilvánulási formáit jelentik, ma már világos, hogy az idegrendszeri toxicitásnak 
számos olyan jele van (pl. a mozgáskoordináció csökkenése, érzéke ­
lési zavarok, tanulási és memóriazavarok), amelyek neuropátiás vagy más típusú vizsgálatokban esetleg nem jelennek meg.
 
E neurotoxicitási vizsgálati módszert úgy alakították ki, hogy 
alkalmas legyen a jelent ősebb viselkedésneurológiai és idegkórtani 
hatások feln őtt rágcsálókban történ ő kimutatására. Bár a viselkedés ­
beli hatások még morfológiai változások hiányában is tükrözhetik az 
élő szervezetekre gyakorolt káros hatásokat, nem minden viselkedés ­
beli változás specifikus az idegrendszerre. Így tehát minden megfigyelt változást az ezzel összefügg ő kórszövettani, hematológiai 
vagy biokémiai adatokkal, valamint egyéb típusú szisztémás toxici ­
tásra vonatkozó adatokkal összefüggésben kell értékelni. Az e 
módszerrel végzett és a neurotoxikus válaszok jellemzését, valamint számszerűsítését célzó vizsgálat specifikus kórszövettani és viselke ­
désvizsgálati eljárásokat is magában foglal, amelyek további elektro ­
fiziológiai és/vagy biokémiai vizsgálatokkal is alátámaszthatók (1) 
(2) (3) (4).
 
A neurotoxikus anyagok egy sor célpontra hathatnak az idegrend ­
szeren belül, és hatásmechanizmusuk is igen sokféle lehet. Mivel 
nem létezik egyetlen olyan vizsgálatsorozat sem, amelynek segít ­
ségével az összes anyag esetében meghatározható lenne a neuroto ­
xikus potenciál, szükség lehet más, a megfigyelt vagy várt neuroto ­
xicitás típusára specifikus  in vivo  vagy  in vitro  vizsgálatokra is.  
Ez a vizsgálati módszer arra is felhasználható, hogy az OECD 
Neurotoxicitási Vizsgálati Stratégiák és Módszerek Útmutatójában 
(1) megfogalmazott iránymutatással összefüggésben olyan vizsgála ­
tokat is lehessen általa tervezni, amelyek célja, hogy általuk tovább lehessen jellemezni vagy növelni a dózis-válasz összefüggés szám ­
szerű meghatározásának érzékenységét annak érdekében, hogy 
jobban meg lehessen becsülni a nem észlelhet ő káros hatás szintjét, 
vagy igazolható legyen a vegyület ismert vagy feltételezett veszé ­
lyessége. Olyan vizsgálatok is tervezhet ők például, amelyek segít ­
ségével meghatározható(k) vagy értékelhet ő(k) a neurotoxicitási 
mechanizmus(ok), vagy kiegészíthet ők a rendelkezésre álló, alap 
viselkedésneurológiai és neuropathológiai megfigyelési eljárások alkalmazásával kapott adatok. Az ilyen vizsgálatok esetében nem szükséges olyan adatok gy űjtését megismételni, amelyeket az e 
módszernél ajánlott standard eljárások alkalmazásával kapnának 
meg, ha az ilyen adatok már rendelkezésre állnak, és azokat nem tartják szükségesnek a vizsgálat eredményeinek értelmezéséhez.
 
Ez a neurotoxicitási vizsgálat – akár önállóan, akár más vizsgála ­
tokhoz kapcsolódva végzik – olyan információkat szolgáltat, amelyek:
 
— meghatározhatják, hogy a vizsgálandó vegyület tartós vagy 
visszafordítható hatásokat gyakorolt-e az idegrendszerre,  
— hozzájárulhatnak a kémiai vegyülettel történ ő expozícióval járó 
idegrendszeri elváltozások jellemzéséhez, illetve az ezek hátte ­
rében álló mechanizmusok megismeréséhez,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— meghatározhatják a dózis- és id ő-válasz összefüggéseket a nem 
észlelhető káros hatás szint becsléséhez (amelyet a vegyület 
biztonsági kritériumainak megállapításához lehet felhasználni).  
Ennél a vizsgálati módszernél a vizsgálandó anyagot orálisan adagol ­
ják. Más (pl. a dermális vagy inhalálásos) beadási módok esetenként megfelelőbbek lehetnek, amelyek használata esetén szükség lehet a 
javasolt eljárások módosítására is. A beadási mód kiválasztásával 
kapcsolatos megfontolások a humán expozíciós profiltól és a rendel ­
kezésre álló toxikológiai és kinetikai adatoktól függenek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Káros hatás:  a normálhoz viszonyított bármilyen, a kezelés okozta 
elváltozás, amely csökkenti az él ő szervezet túlélésre, szaporodásra 
vagy környezethez való alkalmazkodásra való képességét.  
Dózis:  a vizsgálandó anyag beadott mennyisége. A dózist tömeg ­
egységben (g, mg), vagy a vizsgálandó anyag tömegének és a vizs ­
gált állat tömegegységének hányadosában (pl. mg/kg), vagy a táplá ­
lékban lév ő állandó koncentrációban (ppm) fejezik ki.  
Adagolás:  általános meghatározás, amely a dózist, valamint az 
adagolás gyakoriságát és id őtartamát foglalja magában.  
Neurotoxicitás:  az idegrendszer szerkezetét vagy m űködését érint ő 
káros elváltozás, amelyet egy kémiai, biológiai vagy fizikai ágens jelentette expozíció idéz el ő.
 
Neurotoxikus anyag:  bármilyen kémiai, biológiai vagy fizikai 
ágens, amely neurotoxicitást tud okozni.  
NOAEL:  a nem észlelhet ő káros hatás szintjének (no-observed- 
adverse effect level) rövidítése, amely azt a legmagasabb dózisszintet 
jelöli, amelynél nem figyelhet ők meg kezeléssel összefügg ő káros 
hatások.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálandó vegyületet egy dózistartományon belül több dózisban 
adagolják orálisan laboratóriumi rágcsálók több csoportjának. Álta ­
lában ismételt dózisokat kell alkalmazni, és az adagolási rend lehet 
28 napos, szubkrónikus (90 napos) vagy krónikus (1 éves vagy annál 
hosszabb). Az ebben a vizsgálati módszerben leírt eljárások akut neurotoxicitási vizsgálatokhoz is felhasználhatók. Az állatokat olyan módon vizsgálják, hogy lehet őség legyen a viselkedési és/vagy 
neurológiai rendellenességek észlelésére vagy jellemzésére. Minden 
megfigyelési id őszakban egy sor olyan viselkedést vizsgálnak meg, 
amelyre hatással lehetnek a neurotoxikus anyagok. A vizsgálat végén 
az összes csoportból és mindkét nemb ől kiválasztanak néhány állatot, 
amelyeknél  in situ  perfúziót végeznek, és amelyekb ől agyi, gerinc ­
velői és perifériás idegi metszeteket készítenek és vizsgálnak meg.
 
Ha a vizsgálatot a neurotoxikus hatások megállapítását vagy jellem ­
zését célzó önálló vizsgálatként végzik, a csoportokba tartozó, perfú ­
zióra és ezt követ ő kórszövettani vizsgálatokra (lásd 1. táblázat) fel 
nem használt állatokat olyan specifikus viselkedésneurológiai, neuro ­
pathológiai, neurokémiai vagy elektrofiziológiai eljárásokhoz lehet felhasználni, amelyek kiegészíthetik az e módszer szerint szükséges standard vizsgálatokkal kapott adatokat (1). E kiegészít ő eljárások 
különösen akkor lehetnek hasznosak, ha empirikus megfigyelések 
vagy várható hatások a vegyület specifikus típusú vagy specifikus célterületre irányuló neurotoxicitását jelzik. Más esetben a fenn ­
maradó állatok egyéb értékelések, így például a rágcsálókban végzett 
ismételt dózisú toxicitási vizsgálati módszerekben el őírtak céljára 
alkalmazhatók.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Ha e vizsgálati módszer eljárásait más vizsgálati módszerek eljárá ­
saival kombinálják, kell ő számú állatra van szükség ahhoz, hogy 
mindkét vizsgálat megfigyelési igényei kielégíthet ők legyenek.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.4.1.  Az állatfaj kiválasztása  
A preferált rágcsálófaj a patkány, bár megfelel ő indoklás esetén más 
rágcsálófajok is alkalmazhatók. Általánosan használt laboratóriumi 
törzsekből származó egészséges, fiatal feln őtt állatokat kell alkal ­
mazni. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer 
sem ellettek, és nem vemhesek. Az adagolást általában az elválasztás 
után a lehet ő leghamarabb meg kell kezdeni, lehet őleg még az 
állatok hathetes koráig, de mindenképpen azel őtt, hogy elérnék a 
kilenchetes kort. Azonban ha a vizsgálatot más vizsgálatokkal kombinálják, a korra vonatkozó követelményeket esetleg ennek 
megfelelőn módosítani kell. A vizsgálat kezdetén az alkalmazott 
állatok közötti testtömegeltérés nem haladhatja meg az egyes ivarok átlagának ± 20 %-át. Ha egy hosszú távú vizsgálat el őtt előzetes 
vizsgálatként rövid id őtartamú ismételt dózisú vizsgálatot végeznek, 
mindkét vizsgálatban azonos törzsb ől és forrásból származó állatokat 
kell használni.
 
1.4.2.  Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
A kísérleti helyiség h őmérsékletének 22  o C (± 3  o C)-nak kell lennie. 
Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, 
illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 
70 %-ot, a javasolt átlagértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges; 12 órás világos és 12 órás sötét peri ­
ódusok váltsák egymást. Minimálisra kell csökkenteni az id ősza­
kosan jelentkez ő erős zajokat. Az etetéshez standard laboratóriumi 
takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása 
mellett. A takarmány megválasztását az is befolyásolhatja, hogy ha 
a vizsgálandó anyagot táplálékkal adják be, akkor az megfelel ően 
keveredjen el az élelemmel. Az állatokat tarthatjuk egyedileg vagy azonos ivarú egyedekb ől álló kisebb csoportokban is.
 
1.4.3.  Az állatok el őkészítése  
Az egészséges fiatal állatokat véletlenszer űen kell beosztani a kezelt 
és kontrollcsoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy mini ­
málisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatá ­
sait. Az állatokat egyedi azonosítóval kell ellátni, és a vizsgálat megkezdése el őtt legalább öt (5) napig a ketrecükben kell őket 
tartani, hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez.
 
1.4.4.  A beadási mód és a dózisok el őkészítése  
Ez a vizsgálati módszer konkrétan el őírja a vizsgálandó anyag orális 
alkalmazását, amely történhet szondán keresztül, táplálék vagy ivóvíz útján vagy kapszulák beadásával. Más beadási módok (pl. dermális 
vagy inhalálásos) is használhatók, de emiatt esetleg módosítani kell 
az ajánlott eljárásokat. A beadási mód megválasztása függ a humán expozíciós profiltól és a rendelkezésre álló toxikológiai vagy kine ­
tikai információktól. A beadási mód megválasztását meg kell indo ­
kolni, továbbá meg kell jelölni az ebben a vizsgálati módszerben 
előírt eljárások emiatt szükségessé vált módosításait is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Ha szükséges, a vizsgálandó anyagot megfelel ő vivőanyagban fel 
lehet oldani vagy szuszpendálni. Els ősorban vizes oldatot/ ­
szuszpenziót ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (pl. kukorica ­
csíra-olajban elkészített) oldatot vagy szuszpenziót, és csak harmad ­
sorban más viv őanyagokban elkészített oldatot vagy szuszpenziót. 
Ismerni kell a viv őanyag toxikus jellemz őit. Emellett a viv őanyag 
következő jellemzőit kell figyelembe venni: a vizsgálandó anyag 
felszívódására, eloszlására, metabolizmusára és visszatartására gyakorolt hatások; a vizsgálandó anyag kémiai tulajdonságaira 
gyakorolt hatások, amelyek módosíthatják annak toxikus jellemz őit; 
valamint az állatok táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások.
 
1.5. ELJÁRÁSOK  
1.5.1.  Az állatok száma és ivara  
Ha a vizsgálatot önálló vizsgálatként végzik, legalább 20 állatot (10 
nőstényt és 10 hímet) kell alkalmazni minden egyes dózis- és kont ­
rollcsoportban a részletes klinikai és funkcionális megfigyelések érté ­
keléséhez. A 10 hím és 10 n őstény közül a vizsgálat végén legalább 
öt hímet és öt n őstényt kell kiválasztani az  in situ  perfúzióhoz és a 
részletes ideg-kórszövettani vizsgálatokhoz. Ha az adott dóziscso ­
portban csak korlátozott számú állatnál lehet megfigyelni neuroto ­
xikus hatásokat, fontolóra kell venni ezeknek az állatoknak is a 
perfúzióra kijelöltek közé való felvételét. Ha a vizsgálatot egy ismé ­
telt dózisú toxicitási vizsgálattal egybekötve végzik, kell ő számú 
állatot kell felhasználni ahhoz, hogy mindkét vizsgálat célkit űzéseit 
meg tudják valósítani. A vizsgálatok különböz ő kombinációi esetén 
szükséges minimális csoportméreteket az 1. táblázat tartalmazza. Ha 
időközi exterminációkat vagy a toxikus hatások visszafordíthatóságá ­
nak, tartósságának vagy kezelés utáni késleltetett megjelenésének megfigyelésére gyógyulási csoportokat vagy kiegészít ő megfigyelé ­
seket is terveznek, a kísérleti állatok számát úgy kell növelni, hogy 
elegendő számú állatot biztosíthassanak a megfigyelésekhez és 
kórszövettani vizsgálatokhoz.
 
1.5.2.  A kezelt és kontrollcsoportok  
Általában legalább három dóziscsoportot és egy kontrollcsoportot 
kell alkalmazni, de ha más adatok áttekintése alapján 1 000 mg/ ­
testtömeg-kg/nap ismételt dózis alkalmazásakor sem várhatók hatá ­
sok, akkor lehet határérték-vizsgálatot is végezni. Ha nincs megfelel ő 
adat erre nézve, akkor tartománybehatároló vizsgálat is végezhet ő az 
alkalmazandó dózisok meghatározásának el ősegítésére. Attól elte ­
kintve, hogy a vizsgálandó anyagot nem alkalmazzák, a kontrollcso ­
portokban lév ő állatokat ugyanúgy kell kezelni, mint a kezelt csopor ­
tokban lév őket. Ha a vizsgálandó anyag beadásához viv őanyagot 
alkalmaznak, a kontrollcsoportnak a legnagyobb alkalmazott térfo ­
gatban kell beadni a viv őanyagot.  
1.5.3.  A megbízhatóság ellen őrzése  
A vizsgálatot végz ő laboratóriumnak adatokkal kell igazolnia, hogy 
el tudja végezni a vizsgálatot, illetve hogy az alkalmazott eljárások 
megfelelő érzékenység űek. Az ilyen adatoknak bizonyítékkal kell 
szolgálniuk a megfigyelésre javasolt különféle végpontok, így például az autonóm tünetek, a szenzoros reaktivitás, a végtagok 
fogóereje, valamint a motoros aktivitás változásainak detektálására 
és adott esetben számszer űsítésére való képességet. A különböz ő 
típusú neurotoxicitási válaszokat kiváltó és pozitív kontrollként alkal ­
mazható vegyületekkel kapcsolatos információk a (2) és a (9) hivat ­
kozásban találhatók. Ha a kísérleti eljárások lényeges vonásai nem 
változnak, akkor korábbi adatok is felhasználhatók. Javasolt a korábbi adatok id őszakos felfrissítése. Az eljárások érzékenységének 
fennmaradását igazoló új adatokra akkor van szükség, ha a vizsgálat 
vagy az eljárások valamely lényegi elemét a vizsgálatot végz ő labo­
ratórium megváltoztatta.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  A dózisok kiválasztása  
A dózisszinteket a vizsgálandó vegyülettel vagy rokon anyagokkal 
kapcsolatban esetlegesen rendelkezésre álló korábbi toxicitási és kinetikai adatok figyelembevételével kell meghatározni. A legna ­
gyobb dózist azt a célt szem el őtt tartva kell megválasztani, hogy 
a neurotoxikus hatásokat vagy egyértelm ű szisztémás toxikus hatá ­
sokat váltson ki. Ezt követ ően úgy kell csökken ő sorrendben kivá ­
lasztani a kisebb dózisokat, hogy meg lehessen határozni a dózissal 
összefügg ő válaszokat, illetve a legkisebb dózisnál a nem észlelhet ő 
káros hatás szintjét (NOAEL). A dózisszinteket elvben úgy kell beállítani, hogy meg lehessen különböztetni az idegrendszerre gyako ­
rolt elsődleges toxikus hatásokat a szisztémás toxicitással összefügg ő 
hatásoktól. Gyakran optimális a két-három intervallum alkalmazása, és nagyon nagy intervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása esetén gyakran el őnyös a dózisok közé egy negyedik 
vizsgálati csoportot is beiktatni. Ha létezik a humán expozícióra 
vonatkozóan elfogadható becslés, akkor ezt is figyelembe kell venni.
 
1.5.5.  Határérték-vizsgálat  
Ha egy egyetlen, legalább 1 000 mg/testtömeg-kg/nap dózis alkalma ­
zásával történ ő, az itt ismertetett eljárások szerint elvégzett vizsgálat 
nem idéz el ő észlelhet ő neurotoxicitást, és ha a szerkezetileg és/vagy 
metabolizmus szempontjából rokon vegyületekkel kapcsolatos adatok 
alapján nem várható toxicitás, a három dózisszint alkalmazásával 
történő teljes vizsgálatot esetenként szükségtelen elvégezni. A 
várható humán expozíció nagyobb orális dózis alkalmazását teszi esetenként szükségessé a határérték-vizsgálatban. Más típusú beadási 
módok, így például inhalálás vagy dermális alkalmazás esetén a 
vizsgálandó anyag fizikaikémiai tulajdonságai gyakran el őre jelez­
hetik a lehetséges expozíciós szint maximumát. Akut orális vizsgálat elvégzéséhez a határérték-vizsgálat során alkalmazott dózisnak 
legalább 2 000 mg/kg-nak kell lennie.
 
1.5.6.  A dózisok beadása  
A vizsgálandó anyag dózisait legalább 28 napon át naponta, azaz 
heti hét napon át kell adagolni az állatoknak; ötnapos adagolási rend 
vagy rövidebb expozíciós id őszak alkalmazását megfelel ően indo­
kolni kell. Ha a vizsgálandó anyagot szondán át adagolják, a dózist lehetőleg egyszerre kell egy gyomorszondán vagy megfelel ő intubá­
ciós kanülön át beadni az állatnak. Az, hogy egyszerre maximálisan 
mekkora térfogatú folyadék adható be, a kísérleti állatok méretét ől 
függ. A térfogat nem lehet 1 ml/100 g testtömegaránynál nagyobb. Vizes oldatok esetében azonban 2 ml/100 g testtömegarány is alkal ­
mazható. Az irritáló vagy korróziós hatású anyagok kivételével, 
amelyek esetében a magasabb koncentrációk általában súlyosabb hatásokat okoznak, minimálisra kell csökkenteni a térfogatbeli elté ­
réseket, amihez a koncentrációt kell úgy beállítani, hogy minden 
dózisszinten állandó térfogatot lehessen biztosítani.
 
A táplálékkal vagy ivóvízzel bejuttatott anyagok esetében fontos, 
hogy a vizsgálandó anyag mennyisége ne zavarja a normál táplálko ­
zást vagy vízháztartást. Ha a vizsgálandó anyagot a táplálékkal juttatják be, vagy a táplálékbeli koncentrációt (ppm), vagy pedig 
az állat testtömegére számított dózist kell állandó értéken tartani, 
és meg kell adni, hogy melyik alternatívát alkalmazzák. A szondával bejuttatott anyagok esetében a dózist mindig a nap hasonló id ősza­
kában kell beadni, és szükség szerint újra és újra be kell állítani 
ahhoz, hogy az állat testtömegéhez viszonyítva állandó értéken 
lehessen tartani. Ha egy hosszú távú vizsgálat el őtt előzetes vizs ­
gálatként ismételt dózisú vizsgálatot végeznek, mindkét vizsgálatban hasonló takarmányt kell alkalmazni. Akut vizsgálatok esetén, ha a 
dózist nem lehet egyszerre bejuttatni, akkor egy legfeljebb 24 órás 
időtartam alatt részletekben is beadható.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. MEGFIGYELÉSEK  
1.6.1.  A megfigyelések és vizsgálatok gyakorisága  
Ismételt dózisú vizsgálatok esetében a megfigyelési id őszaknak az 
egész kezelési id őszakot le kell fednie. Akut vizsgálatok esetében a 
kezelés után 14 napig kell még megfigyeléseket végezni. A mellék ­
csoportokba tartozó és a kezelés utáni id őszakban expozíció nélkül 
tartott állatok esetében a megfigyeléseknek ezt az id őszakot is le kell 
fedniük.  
A megfigyeléseket kell ő gyakorisággal kell végezni, hogy az eset ­
leges viselkedési és/vagy neurológiai rendellenességek észlelésének valószínűsége a lehet ő legnagyobb legyen. A megfigyeléseket lehe ­
tőleg mindig a nap azonos szakában kell végezni, és ehhez figye ­
lembe kell venni azt is, hogy a várt hatások a dózis beadása után 
mikor érik el a maximumukat. A klinikai megfigyelések és funkci ­
onális vizsgálatok gyakoriságát a 2. táblázatban foglaltuk össze. Ha a kinetikai adatok vagy más, korábbi vizsgálatokban kapott adatok 
szerint más id őpontokat kellene alkalmazni a megfigyelésekhez, vizs ­
gálatokhoz vagy megfigyelések utáni id őszakokhoz, alternatív kísér ­
leti programot kell követni a kinyerhet ő információk maximalizálása 
érdekében. A kísérleti program ilyen jelleg ű módosításait meg is kell 
indokolni.
 
1.6.1.1.  Az általános egészségi állapot és a megbetegedések/elhullások 
megfigyelése  
Az állatok egészségi állapotát legalább naponta egyszer, a megbete ­
gedéseket és elhullásokat pedig naponta kétszer gondosan meg kell figyelni.
 
1.6.1.2.  Részletes klinikai megfigyelések  
Az első expozíciót megel őzően egy alkalommal (az egyeden belüli 
összehasonlításokhoz), majd ezt követ ően a vizsgálat teljes id őtarta­
mától függ ően különböz ő időközönként (lásd 2. táblázat) részletes 
klinikai megfigyeléseket kell végezni az erre a célra kiválasztott összes állaton (lásd 1. táblázat). A gyógyulási mellékcsoportok rész ­
letes klinikai megfigyeléseit a gyógyulási id őszak végén kell elvé ­
gezni. A részletes klinikai megfigyeléseket a ketrecen kívül, egy standard porondon kell végezni. Az észleléseket egy olyan pontozási rendszer segítségével kell gondosan felvenni, amely a megfigyelés 
során végzett minden egyes mérés esetében kritériumokat vagy 
pontozási skálákat is magában foglal. A vizsgálólaboratóriumnak világosan meg kell határoznia az alkalmazott kritériumokat vagy skálákat. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti 
körülmények közötti (a kezeléssel szisztematikusan nem összefügg ő) 
eltérések, és hogy a megfigyeléseket az aktuális kezelést nem ismer ő, 
képzett megfigyel ők végezzék.
 
A megfigyeléseket ajánlatos megtervezetten végezni, amelynek során 
minden állatra vonatkozóan és minden megfigyelési id őpontban vilá ­
gosan meghatározott (a „normál tartomány” meghatározását is 
magában foglaló) kritériumokat kell szisztematikusan alkalmazni. A „normál tartományt” megfelel ően dokumentálni kell. Minden 
megfigyelt tünetet fel kell jegyezni. Ha megoldható, a megfigyelt 
tünetek er ősségét is fel kell jegyezni. A klinikai megfigyelések 
többek között a b őr, a szőrzet, a szemek, a nyálkahártyák változása ­
ira, szekrétumok és exkrétumok, valamint az autonóm aktivitás megjelenésére (pl. könnyezés, sz őrmeredezés, pupillaméret, szokatlan 
légzési mintázat és/vagy szájon át történ ő légzés, szokatlan vizelés 
vagy székletürítés és elszínez ődött vizelet) irányulnak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Rögzíteni kell továbbá a testhelyzettel, aktivitási szinttel (pl. a stan ­
dard porond csökkent vagy fokozott felderítése) és a mozgáskoordi ­
nációval kapcsolatos összes szokatlan választ is. A járás (pl. kacsá ­
zás, ataxia), a testtartás (pl. púpos tartás) és a megfogás, elhelyezés vagy más környezeti ingerekkel szembeni reaktivitás megváltozását, 
valamint a rángásos vagy görcsös mozgásokat, görcsös vonaglásokat 
vagy remegéseket, sztereotípiákat (pl. túlzott tisztálkodást, szokatlan fejmozgásokat, ismétl ődő körbejárást) vagy bizarr viselkedést (pl. 
harapást vagy túlzott nyalogatást, öncsonkítást, hátrafelé menést, 
hangadást) vagy agressziót is fel kell jegyezni.
 
1.6.1.3.  Funkcionális vizsgálatok  
A részletes klinikai megfigyelésekhez hasonlóan az expozíció el őtt, 
majd azt követ ően rendszeres id őközönként funkcionális vizsgála ­
tokat is kell végezni az erre kiválasztott összes állaton (lásd 1. táblá ­
zat). A funkcionális vizsgálatok gyakorisága is a teljes vizsgálat 
időtartamától függ (lásd 2. táblázat). A 2. táblázatban megadott 
megfigyelési id őszakok mellett az extermináláshoz a lehet ő legköze­
lebbi időpontban a gyógyulási mellékcsoportokban is funkcionális 
vizsgálatokat kell végezni. A funkcionális vizsgálatok során meg 
kell figyelni a különféle [pl. hallási, látási és proprioceptív (5) (6) 
(7)] ingerekre adott szenzoros reaktivitást, és el kell végezni a végtagok fogóerejének (8), valamint a motoros aktivitásnak a vizs ­
gálatát (9). A motoros aktivitást olyan automata berendezéssel kell 
mérni, amely az aktivitás csökkenés és az aktivitásnövekedés kimu ­
tatására is képes. Ha egy másik meghatározott rendszert alkalmaz ­
nak, akkor annak kvantitatívnak kell lennie, és igazolni kell annak érzékenységét és megbízhatóságát is. Minden berendezés esetében 
ellenőrizni kell, hogy id őben megbízhatóan, illetve az egyes beren ­
dezések egymáshoz képest konzisztensen m űködnek-e. A követend ő 
eljárásokkal kapcsolatban a további részletek a vonatkozó hivatkozá ­
sokban találhatók. Ha nincsenek olyan adatok (pl. szerkezetaktivitási, 
epidemiológiai adatok vagy más toxikológiai vizsgálati adatok), 
amelyek potenciális neurotoxikus hatásokat jeleznének, fontolóra kell venni specializáltabb vizsgálatok végzését a szenzoros és motoros m űködés vagy a tanulás és a memória tanulmányozására, 
e lehetséges hatások részletesebb vizsgálata érdekében. A speciali ­
záltabb vizsgálatokkal és alkalmazásukkal kapcsolatban további információk az (1) hivatkozásban találhatók.
 
Kivételes esetben ki lehet hagyni a funkcionális vizsgálatból azokat 
az állatokat, amelyeknél a toxicitás jelei olyan mérv űek, hogy már 
zavarják az adott vizsgálatot. Meg kell indokolni, amennyiben az ilyen állatokat kizárják valamely funkcionális vizsgálatból.
 
1.6.2.  Testtömeg és táplálék/vízfogyasztás  
A legfeljebb 90 napig tartó vizsgálatok esetében minden állat testtö ­
megét legalább hetente egyszer meg kell mérni, továbbá legalább 
hetente a táplálékfogyasztást is ellen őrizni kell (illetve ha a vizs ­
gálandó anyagot az ivóvízzel adják be, akkor annak fogyasztását is). A hosszú távú vizsgálatok esetében az állatok testtömegét az első 13 hét során legalább hetente egyszer, majd azt követ ően 
legalább négyhetente meg kell mérni. Az els ő 13 hét során a táplá ­
lékfogyasztást (illetve ha a vizsgálandó anyagot az ivóvízzel adjuk be, akkor annak fogyasztását is) legalább hetente, majd azt követ ően 
körülbelül háromhavonta kell megmérni, kivéve ha az egészségi 
állapot változásai vagy testtömegváltozások azt másképp szabják 
meg.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Szemészeti vizsgálatok  
A 28 napnál hosszabb vizsgálatok esetében lehet őleg minden állaton, 
de legalább a nagy dózissal kezelt és a kontrollcsoportokba tartozó állatokon a vizsgálandó anyag adagolásának megkezdése el őtt, illetve 
a vizsgálat legvégén szemtükör vagy ezzel egyenérték ű és megfelel ő 
eszköz alkalmazásával szemészeti vizsgálatokat kell végezni. Ha szemelváltozást tapasztalnak, vagy ha a klinikai tünetek alapján ez szükségesnek látszik, minden állatot meg kell vizsgálni. A hosszú 
távú vizsgálatok esetében a 13. héten is szemészeti vizsgálatot kell 
végezni. Nem kell szemészeti vizsgálatot végezni, ha ilyen adatok más, hasonló id őtartamú és hasonló dózisszintek mellett történ ő vizs­
gálatokból már rendelkezésre állnak.
 
1.6.4.  Hematológiai és klinikai biokémiai vizsgálatok  
Ha a neurotoxicitási vizsgálatot ismételt dózisú szisztémás toxicitási 
vizsgálattal kombinálva végzik, a szisztémás toxicitási vizsgálat vonatkozó módszerében el őírtaknak megfelel ően hematológiai és 
klinikai biokémiai vizsgálatokat is végezni kell. A mintavételt úgy 
kell végrehajtani, hogy minimális legyen a potenciális viselkedésneu ­
rológiai hatások kockázata.
 
1.6.5.  Kórszövettani vizsgálatok  
A neuropathológiai (idegkórtani) vizsgálatot úgy kell megtervezni, 
hogy egészítse ki és b ővítse a vizsgálat  in vivo  fázisában tett 
megfigyeléseket. Ivaronként és csoportonként legalább 5 állatból (1ásd az 1. táblázatot és a következ ő bekezdést) szövetmintát kell 
venni, amelyet azután általánosan elfogadott perfúziós és fixálási 
technikák alkalmazásával  in situ  fixálni kell (lásd a (3) hivatkozás 
5. fejezetét és a (4) hivatkozás 50. fejezetét). Minden makroszkó ­
posan megfigyelhet ő változást fel kell jegyezni. Amennyiben a vizs ­
gálatot önálló vizsgálatként végzik el a neurotoxicitás sz űrése vagy a 
neurotoxikus hatások jellemzése céljából, a többi állat vagy speci ­
fikus viselkedésneurológiai (10) (11), neuropathológiai (10) (11) (12) (13), neurokémiai (10) (11) (14) (15) vagy elektrofiziológiai (10) 
(11) (16) (17) eljárásokhoz használható fel, amelyek kiegészíthetik 
az itt ismertetett eljárásokat és vizsgálatokat, vagy növelhetik a kórszövettani vizsgálatok alanyainak számát. E kiegészít ő eljárások 
különösen akkor lehetnek hasznosak, ha empirikus megfigyelések 
vagy a várható hatások specifikus típusú vagy specifikus célterületre 
irányuló neurotoxicitást jeleznek (2) (3). Más esetben a fennmaradó állatok az ismételt dózisú toxicitási vizsgálati módszerben leírt rutin patológiai értékelésekhez is felhasználhatók.
 
A paraffinba ágyazott mintákat megszokott festési eljárással, például 
hematoxilin-eozin festékkel (H&E) kell megfesteni, és mikroszkópos vizsgálatokat kell végezni. Perifériás neuropátiák megfigyelése vagy 
gyanúja esetén m űanyagba ágyazott perifériás idegszövetmintákat is 
vizsgálni kell. Egyes klinikai tünetek további helyek vizsgálatát vagy speciális festési eljárások alkalmazását tehetik szükségessé. A további vizsgálati helyekkel kapcsolatban útmutatás a (3) és (4) 
hivatkozásban található. Hasznos lehet továbbá, ha speciális festé ­
seket alkalmaznak konkrét patológiai változások kimutatásához (18).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
A központi és a perifériás idegrendszerb ől származó reprezentatív 
metszeteket szövettani vizsgálatoknak kell alávetni (lásd a (3) hivat ­
kozás 5. fejezetét és a (4) hivatkozás 50. fejezetét). A vizsgált terü ­
letek általában a következ ők: az előagy, a nagyagy központi része, 
ezen belül a hippokampuszt keresztmetszet, a középagy, a kisagy, a 
híd, a nyúltvel ő, a szem a látóideggel és a retinával együtt, a gerinc ­
velő a nyaki és ágyéki duzzanatnál, a dorzális ideggyökér-ganglio ­
nok, a dorzális és ventrális ideggyökérrostok, a proximális ül őideg, a 
proximális sípcsonti ideg (a térdnél) és a sípcsonti ideg lábikraizom- 
ágai. A gerincvel őből és a perifériás idegekb ől készített metszeteknek 
mind keresztirányú vagy haránt-, mind hosszanti metszeteket tartal ­
mazniuk kel. Figyelmet kell szentelni az idegrendszer érhálózatának is. Meg kell vizsgálni egy vázizommintát is, különösen a lábikra ­
izomét. Különös figyelmet kell fordítani a központi és perifériás 
idegrendszernek azokra a sejtes és rostos struktúrájú és mintázatú területeire, amelyekre különösen hatást gyakorolnak a neurotoxikus anyagok.
 
A toxikus anyag által tipikusan el őidézett neuropathológiai elválto ­
zásokkal kapcsolatban a (3) és a (4) hivatkozásban található útmu ­
tatás. Ajánlatos a szövetmintákat lépcs őzetesen megvizsgálni, ami azt 
jelenti, hogy el őször a nagy dózissal kezelt csoportokból származó 
metszeteket hasonlítjuk össze a kontrollcsoportból származókkal. Ha 
az ezekből a csoportokból származó mintákban nem láthatók neuro ­
pathológiai elváltozások, nincs szükség további vizsgálatra. Ha azonban neuropathológiai elváltozásokat észlelnek a nagy dózissal kezelt csoportokban, a köztes és kis dózisú csoportokból származó, 
potenciálisan érintett szövetekb ől készített mintákat is kóddal kell 
ellátni, majd egymás után meg kell vizsgálni őket.
 
Ha a kvalitatív vizsgálatok során bizonyítékot találnak valamilyen 
neuropathológiai elváltozásra, akkor az ilyen elváltozást mutató idegrendszeri területeken egy második vizsgálatot is el kell 
végezni. Az összes dóziscsoportban minden potenciálisan érintett 
területről metszeteket kell készíteni, amelyeket véletlenszer űen 
kódokkal kell ellátni, és a kód ismeretének hiányában ugyancsak véletlenszer űen kell őket megvizsgálni. Minden lézió esetében fel 
kell jegyezni azok gyakoriságát és súlyosságát. Miután minden 
dóziscsoportban kiértékelték az összes területet, vissza lehet fejteni a kódot, és a dózis-válasz összefüggések megállapítása érdekében statisztikai elemzést lehet végezni. Ismertetni kell az egyes léziók 
súlyosságának fokozatait.
 
A neuropathológiai leleteket a viselkedési megfigyelésekkel és 
mérésekkel, továbbá a korábbi és párhuzamosan végzett szisztémás toxicitási vizsgálatokból származó adatokkal összefüggésben kell értékelni.
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Az állatokra vonatkozóan egyedi adatsorokat kell felvenni. Emellett 
az összes adatot táblázatos formában is össze kell foglalni úgy, hogy 
minden kezelt és kontrollcsoport esetében mutassa az állatok számát a vizsgálat kezdetén, valamint azoknak a számát, amelyek a vizsgálat során elhullottak vagy humánus módon exterminálásra kerültek, 
illetve az elhullások és humánus okokból végzett exterminálás 
időpontját, a toxicitásra utaló tüneteket mutató állatok számát, a 
megfigyelt toxikus hatások leírását, ezen belül megjelenésük időpontját, valamint ezek id őbeli lefolyását, típusát és súlyosságát, 
és végül a léziókat mutató állatok számát és ezen belül a lézió(k) 
típusát és súlyosságát.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. ÉRTÉKELÉS ÉS AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A vizsgálat eredményeit a viselkedésneurológiai és neuropathológiai 
hatások (ha kiegészít ő vizsgálatok is történtek, akkor emellett a 
neurokémiai vagy elektrofiziológiás hatások) és bármely más 
megfigyelt káros hatás el őfordulása, súlyossága és viszonylagossága 
alapján kell értékelni. Ahol lehet, a számszer ű eredményeket 
megfelelő és általánosan elfogadott statisztikai módszer alkalmazá ­
sával kell kiértékelni. A statisztikai módszereket a vizsgálat tervezé ­
sekor kell megválasztani.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai megjelenés (ezen belül izomerizáció, tisztaság és fizikai- 
kémiai tulajdonságok),  
— azonosító adatok.  
Vivőanyag (ha szükséges):  
— a vivőanyag megválasztásának indoklása.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj/törzs,  
— az állatok száma, életkora és ivara,  
— származás, tartási körülmények, akklimatizálódás, takarmány stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetén.  
Kísérleti körülmények:  
— a vizsgálandó anyag formulázásával/a táplálék el őkészítésével, az 
elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitá ­
sával kapcsolatos adatok,  
— a beadott dózisok, ezen belül a viv őanyagra, valamint a beadott 
anyag térfogatára és fizikai formájára vonatkozó adatok részletes 
leírása,  
— a vizsgálandó anyag adagolására vonatkozó adatok,  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása,  
— az expozíciós út és id őtartam megválasztásának indoklása,  
— adott esetben a vizsgálandó anyag táplálékban/ivóvízben lév ő 
koncentrációjának (ppm) átszámítása a tényleges dózisra (mg/ ­
testtömeg-kg/nap),  
— a táplálék és az ivóvíz min őségével kapcsolatos adatok.  
Megfigyelések és vizsgálati eljárások:  
— az egyes csoportokba tartozó állatoknak a perfúziós alcsopor ­
tokba való besorolásával kapcsolatos adatok,  
— a pontozási rendszerrel kapcsolatos adatok, beleértve a részletes 
klinikai megfigyelések során alkalmazott kritériumokat és az 
egyes méréseknél használt pontozási skálát,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— a különféle (pl. hallási, látási és proprioceptív) ingerekre adott 
szenzoros reaktivitáshoz, a végtag-fogó er ő értékeléséhez, a 
motoros aktivitás értékeléséhez (ezen belül az aktivitás detektá ­
lására alkalmazott automatikus berendezésekkel kapcsolatos adatok) alkalmazott funkcionális vizsgálatokkal és más alkalma ­
zott eljárásokkal kapcsolatos adatok,
 
— a szemészeti vizsgálatokkal, valamint adott esetben a hematoló ­
giai vizsgálatokkal és klinikai biokémiai vizsgálatokkal kapcso ­
latos adatok, ideértve a vonatkozó alapértékeket is,  
— a különleges viselkedésneurológiai, neuropathológiai és neuroké ­
miai vagy elektrofiziológiai eljárásokra vonatkozó adatok.  
Eredmények:  
— testtömeg/testtömegváltozások, ezen belül az extermináláskor 
mért testtömeg,  
— adott esetben a táplálék- és vízfogyasztás,  
— toxikus reakciók adatai ivaronként és dózisonként, ezen belül a 
toxicitás tünetei vagy az elhullás,  
— a részletes klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és id őtar­
tama (megjelenése és id őbeli lefolyása) (valamint hogy visszafor ­
díthatók-e),  
— minden funkcionális vizsgálat eredményének részletes ismerte ­
tése, 
— boncolási eredmények,  
— adott esetben az összes viselkedésneurológiai, neuropathológiai 
és neurokémiai vagy elektrofiziológiai eredmény részletes 
ismertetése,  
— adott esetben a felszívódással és metabolizmussal kapcsolatos 
adatok,  
— adott esetben az eredmények statisztikai elemzése.  
Az eredmények diszkussziója;  
— dózis-válasz adatok,  
— bármely más toxikus hatás és a vizsgálandó vegyület neuroto ­
xicitási potenciáljával kapcsolatban levont következtetések kapcsolata,
 
— nem észlelt káros hatás szintje.  
Következtetések:  
— javasolt a vizsgálandó vegyület teljes neurotoxicitásának konkrét 
megállapítása.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to 
Chemicals.
 
(4) Spencer, P. S. and Schaumburg, H. H. (1980). Experimental 
and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaum ­
burg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurolo ­
gical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999–1003.  
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observati ­
onal Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283.  
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., 1, 233–236.  
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599–609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, CL. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343–352.  
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elect ­
rophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, CL. ed. Raven Press, New York, pp. 299–335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological 
Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill 
Livingstone.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
1. táblázat  
A csoportonként szükséges állatok minimális száma, ha a neurotoxicitási vizsgálatot külön, illetve más 
vizsgálatokkal együtt végzik  
A NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSÉNEK MÓDJA 
Külön vizsgálat A 28 napos vizsgálattal 
együtt végzett vizsgálat A 90 napos vizsgálattal 
együtt végzett vizsgálat A krónikus toxicitási 
vizsgálattal együtt 
végzett vizsgálat  
Az állatok összlétszáma az 
egyes csoportokban 10 hím és 10 
nőstény 10 hím és 10 
nőstény 15 hím és 15 
nőstény 25 hím és 25 
nőstény 
A funkcionális vizsgálatok ­
hoz, ezen belül részletes klinikai megfigyelésekhez kiválasztott állatok száma 10 hím és 10 
nőstény 10 hím és 10 
nőstény 10 hím és 10 
nőstény 10 hím és 10 
nőstény 
Az in situ  perfúzióhoz és az 
ideg-kórszövettani vizsgála ­
tokhoz kiválasztott állatok 
száma 5 hím és 5 n őstény 5 hím és 5 n őstény 5 hím és 5 n őstény 5 hím és 5 n őstény 
Az ismételt dózisú/szubkró ­
nikus/krónikus toxicitási megfigyelésekhez, hemato ­
lógiai vizsgálatokhoz, 
klinikai biokémiai vizsgála ­
tokhoz, kórszövettani vizs ­
gálatokhoz stb. (ahogyan az 
a megfelel ő útmutatókban 
szerepel) kiválasztott állatok száma 5 hím és 5 n őstény 10 hím † és 10 
nőstény † 20 hím † és 20 
nőstény † 
Adott esetben kiegészít ő 
megfigyelések 5 hím és 5 n őstény
 
† Magában foglalja a neurotoxicitási vizsgálat keretében végzend ő funkcionális vizsgálatokhoz és részletes klinikai megfigyelésekhez 
kiválasztott öt állatot is.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
2. táblázat  
A klinikai megfigyelések és funkcionális vizsgálatok gyakorisága  
A megfigyelések típusai A vizsgálat id őtartama 
Akut 28 napos 90 napos Krónikus  
Minden állatban Általános egész ­
ségi állapot naponta naponta naponta naponta 
Elhullás/meg ­
betegedés naponta kétszer naponta kétszer naponta kétszer naponta kétszer 
A funkcionális 
megfigyelésekhez kiválasztott állat ­
okban Részletes 
klinikai megfigyelések — az els ő 
expozíció előtt 
— az adagolást 
követően 8 
órán belül a hatás csúcsának 
becsült 
időpontjában 
— az adagolás 
után 7 és 14 
nappal — az els ő 
expozíció előtt 
— ezt követ ően 
hetente 
egyszer — az els ő 
expozíció előtt 
— egy alka ­
lommal az 
expozíció első vagy 
második 
hetében 
— ezt követ ően 
havonta — az els ő expo­
zíció előtt 
— egy alka ­
lommal az 
expozíció els ő 
hónapjának végén 
— ezt követ ően 
háromhavonta 
Funkcionális 
vizsgálatok — az els ő 
expozíció előtt 
— az adagolást 
követően 8 
órán belül a hatás csúcsának 
becsült 
időpontjában 
— az adagolás 
után 7 és 14 
nappal — az els
ő 
expozíció előtt 
— a kezelés 
negyedik 
hetében, a lehető 
legközelebb 
az expozíció 
végéhez — az els ő 
expozíció előtt 
— egy alka ­
lommal az 
expozíció első vagy 
második 
hetében 
— ezt követ ően 
havonta — az els ő expo­
zíció előtt 
— egy alka ­
lommal az 
expozíció els ő 
hónapjának végén 
— ezt követ ően 
háromhavonta
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  BŐRÖN ÁT TÖRTÉN Ő FELSZÍVÓDÁS:  IN VIVO  MÓDSZER  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 427 (2004) vizs ­
gálattal.  
1.1. BEVEZETÉS  
Számos vegyszer esetén az expozíció f őként a bőrön keresztül törté ­
nik, miközben a kísérleti állatokon végzett toxikológiai vizsgálatok nagy részét orális úton történ ő bevitellel végzik. Az ebben az útmu ­
tatóban leírt, a b őrön át történ ő felszívódást tanulmányozó  in vivo  
vizsgálat meghatározza azt a kapcsolatot, amely lehet ővé teszi, hogy 
az orális vizsgálatokból extrapoláljuk a b őr expozíciójához kapcso ­
lódó biztonsági szintet.
 
Az anyagnak nagyszámú sejtrétegen kell áthaladnia, miel őtt eléri a 
vérkeringést. A legtöbb anyag esetén a felszívódás sebességét a  
stratum corneum  határozza meg, amely elhalt sejtekb ől áll. A 
bőrön keresztüli átereszt őképesség függ a vegyszer lipofilicitásától 
és az epidermisz küls ő rétegének vastagságától, valamint olyan 
tényezőktől, mint az anyag molekulatömege és koncentrációja. Álta ­
lában a patkányok és a nyulak b őre nagyobb átereszt őképességgel 
rendelkezik, mint az emberé, míg a tengerimalac és a majom b őrének 
áteresztőképessége közelebb áll az emberéhez.  
A bőrön át történ ő felszívódás vizsgálati módszereit két csoportba 
lehet sorolni: az  in vivo  és az  in vitro  módszerek csoportjába. Az  in 
vivo módszer különféle kísérleti fajok esetében megbízható informá ­
ciót nyújt a b őrön át történ ő felszívódásra vonatkozóan. Az utóbbi 
időben dolgozták ki az  in vitro  módszereket. Ezek a teljes vagy 
részleges vastagságú állati vagy emberi b őrön át egy folyadéktartály 
felé történ ő anyagszállítás mérésén alapulnak. Az  in vitro  módszert 
egy külön vizsgálati módszer (1) ismerteti. Adott feltételek esetén a 
legmegfelel őbb módszer kiválasztásához ajánlatos tanulmányozni az 
OECD által a b őrön át történ ő felszívódási vizsgálatok lefolytatásáról 
kiadott útmutató dokumentumot (2), amely az  in vivo  és az  in vitro  
módszerek alkalmasságára vonatkozóan több részletettel szolgál.  
Az ebben a módszerben leírt  in vivo  módszer lehet ővé teszi, hogy 
meghatározzuk, hogyan jut be a kísérleti anyag a b őrön át a szervi 
rekeszbe. Az eljárást évek óta széles körben használják (3) (4) (5) (6) (7). Bár a b őrön át történ ő felszívódásra vonatkozó  in vitro  vizs­
gálatok számos esetben megfelel ők lehetnek, elképzelhet ők olyan 
helyzetek, amelyekben csak az  in vivo  vizsgálat nyújthatja a szük ­
séges adatokat.
 
Az in vivo  módszer el őnye, hogy fiziológiailag és az anyagcsere 
szempontjából sértetlen szervezetet használ, a vizsgálatot a toxikoló ­
giai vizsgálatokban rutinszer űen használt fajon végzik, ugyanakkor 
más fajok esetén módosítható. Hátránya, hogy él ő állatokat használ, 
a megbízhatóbb eredmények érdekében radioaktívan jelzett anya ­
gokra van szükség, nehézkes a korai felszívódási fázis meghatá ­
rozása, és az el őnyben részesített faj (patkány) b őrének átereszt őké­
pessége eltér az emberét ől. Az állati b őrnek általában nagyobb az 
áteresztőképessége, ezért az emberi b őrön át történ ő felszívódást a 
vizsgálat túlbecsülheti (6) (8) (9). Éget ő/maró anyagokat nem szabad 
élő állatokon kipróbálni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Fel nem szívott dózis:  az a dózis, amelyet az expozíció után a b őr 
felületéről lemosnak, továbbá amely a nem záró fed őrétegen talál ­
ható, beleértve azt a dózist is, amelyr ől kimutatható, hogy az expo ­
zíció alatt a b őrről elpárolgott.  
Felszívott dózis (in vivo):  az a dózis, amely a vizeletben, a ketrec 
mosóoldatában, az ürülékben, a kilélegzett leveg őben (ha mérik), a 
vérben, a szövetekben (ha gy űjtik) és a kísérleti preparátummal érin ­
tett bőrterület eltávolítása után fennmaradó tetemben jelen van.  
Felszívható dózis:  az a dózis, amely a lemosás után a b őrön vagy a 
bőrben található.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A lehetőleg radioaktívan jelzett kísérleti anyagot egy vagy több 
megfelelő dózisszinten, szokásosan használt preparátum formájában 
felviszik az állat lenyírt b őrére. A kísérleti preparátum egy meghatá ­
rozott időtartamig marad kapcsolatban a b őrrel, megfelel ő (nem záró, 
félig záró vagy záró) véd őtakaró alatt, amely megakadályozza a 
kísérleti preparátum lenyelését. Az expozíció id őtartamának lejártával 
a védőtakarót eltávolítják, a b őrt megfelel ő tisztítószerrel megtisztít ­
ják, a véd őtakarót és a tisztítóanyagokat elemzésre félreteszik, és új 
védőtakarót tesznek fel. Az állatokat az expozíciós id őszak előtt, alatt 
és után egyedi anyagcsereketrecekben tartják, és a salakanyagokat, 
valamint a kilélegzett leveg őt ezen id őszak alatt elemzés céljából 
összegyűjtik. A kilélegzett leveg ő összegy űjtése elhagyható, ha 
megfelelő információ áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy 
nem, vagy csak kis mennyiségben keletkezik illó radioaktív metabo ­
lit. A vizsgálatok során általában több állatcsoporton alkalmazzák a kísérleti preparátumot. Az egyik csoportot az expozíciós id őszak 
elteltével elpusztítják. Más csoportokat ezután bizonyos meghatá ­
rozott id őközönként pusztítanak el (2). A mintavételi id őszak 
végén elpusztítják a megmaradó állatokat, a vért elemzés céljából összegyűjtik, az alkalmazás helyét elemzés céljából eltávolítják, és 
a tetemet megvizsgálják az esetleges nem kiválasztott anyagok szem ­
pontjából. A mintákat megfelel ő eszközökkel elemzik, és meghatá ­
rozzák a b őrön át történ ő felszívódás mértékét (6) (8) (9).
 
1.4. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Az állatfaj kiválasztása  
Leggyakrabban patkányt alkalmaznak, de az emberéhez közelebb 
álló bőrön át történ ő felszívódási sebességgel rendelkez ő, szőr 
nélküli fajták és fajok is használhatók (3) (6) (7) (8) (9). A kísérleti 
állatok legyenek egynem űek (alapesetben hímnem űek), fiatalok, 
felnőttek és egészségesek. A vizsgálat elején a használt állatok 
súlya ± 20 %-nál nagyobb mértékben nem térhet el az átlagos súly ­
tól. Például a hímnem ű patkányoknál a 200–250 g testtömeg, de 
inkább ennek a tartománynak a fels ő része kívánatos.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Az állatok száma és neme  
Minden kísérleti preparátum esetében és minden ütemezett befejezési 
idő tekintetében egy-egy legalább négy egynem ű egyedből álló 
csoportot kell kialakítani. Minden egyes id őintervallum elteltével, 
például az expozíciós id őszak (jellemz ően 6 vagy 24 óra) végén és 
az ezt követ ő alkalmakkor (pl. 48 és 72 óra) elpusztítanak egy-egy 
állatcsoportot. Ha van olyan adat, amely a hímek és a n őstények 
között fennálló alapvet ő különbségekre utal a dermális toxicitás 
tekintetében, akkor az érzékenyebb nemet kell kiválasztani. Ha 
nincs ilyen adat, akkor bármelyik nem alkalmazható.  
1.4.3.  Tartási és etetési feltételek  
Az állatkísérleti teremben a h őmérséklet 22  o C (± 3  o C) legyen. Bár 
a relatív páratartalomnak legalább 30 %-nak kell lennie, és lehet őleg 
nem haladhatja meg a 70 %-ot, kivéve a terem takarításának idejét, 
50–60 %-os érték beállítására kell törekedni. A világítás legyen mesterséges, váltakozva 12 óra világosság és 12 óra sötétség. Az etetésnél a szokásos laboratóriumi étrend alkalmazható; az élelem 
és az ivóvíz mennyisége legyen korlátlan. A vizsgálat idején, és 
lehetőleg az akklimatizálódás idején is, az állatokat egyedi anyag ­
csereketrecekben kell tartani. Mivel a táplálék és a víz kiömlése befolyásolhatja az eredményeket, ennek lehet őségét a minimumra 
kell szorítani.
 
1.4.4.  Az állatok el őkészítése  
Az állatokat az egyedi azonosíthatóság céljából megjelölik, és a 
laboratóriumi feltételekhez való akklimatizálódás érdekében öt nappal a vizsgálat megkezdését megel őzően egyedi ketrecükben 
tartják őket.
 
Az akklimatizálódás id őszakát követ ően és körülbelül a kezelés 
megkezdését 24 órával megel őzően minden állatnak a váll- és hátré ­
szén egy b őrterületet megnyírnak. A sérült b őr felszívási jellemz ői 
eltérnek az ép b őrétől, ezért vigyázni kell, nehogy felhorzsolódjon a 
bőr. A nyírást követ ően és körülbelül 24 órával azel őtt, hogy a 
kísérleti anyag a b őrre kerül (lásd az 1.4.7. szakaszt), a faggyú 
eltávolításához a b őr felületét acetonnal le kell törölni. A szappannal 
és vízzel történ ő lemosás nem ajánlott, mivel az esetleges szappan ­
maradvány fokozhatja a kísérleti anyag felszívódását. A terület megfelelő nagyságú, lehet őleg legalább 10 cm
 2 legyen, hogy a kísér ­
leti vegyszer felszívódásának a b őr cm  2 -ére jutó mennyiségét 
megbízhatóan lehessen számítani. Ez a terület a 200–250 g testtö ­
megű patkányok esetén biztosított. Az el őkészítés után az állatok 
visszakerülnek az anyagcsereketrecekbe.  
1.4.5.  Kísérleti anyag  
A kísérleti anyag az az anyag, amelynek penetrációs jellemz őit vizs­
gáljuk. Ideális esetben a kísérleti anyag radioaktívan jelzett.  
1.4.6.  Kísérleti preparátum  
A kísérletianyag-preparátumnak (a kísérleti anyagot tartalmazó, 
tiszta, hígított vagy formulázott anyag, amelyet felvisznek a b őrre) 
meg kell egyeznie azzal az anyaggal (vagy reális helyettesít őjének 
kell lennie annak az anyagnak), amelynek az ember vagy más lehet ­
séges célfajok ki lehetnek téve. A „szokásosan használt” prepará ­
tumtól való bárminem ű eltérésre csak indokolt esetben van lehet őség. 
Ha szükséges, akkor a vizsgált anyagot fel kell oldani vagy szusz ­
pendálni kell valamilyen alkalmas viv őanyagban. A vízt ől eltérő 
vivőanyagok esetében ismerni kell a felszívódási jellemz őket és a 
kísérleti anyaggal történ ő esetleges kölcsönhatást.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  A b őrre történ ő felvitel  
A bőr felszínének egy bizonyos felületén kijelölik a felvitel helyét. 
Ezután erre a helyre egyenletesen elosztva ismert mennyiség ű kísér­
leti preparátumot visznek fel. Ez a mennyiség általában az emberi 
expozícióhoz hasonló, szokásos esetben szilárd anyag esetében 
1–5 mg/cm  2 , folyadék esetében pedig akár 10 μl/cm  2 lehet. Az 
ettől eltérő mennyiséget a várható használati feltételeknek, a vizs ­
gálat célkit űzéseinek vagy a kísérleti preparátum fizikai jellemz őinek 
kell indokolnia. Az alkalmazást követ ően a kezelt területet védeni 
kell a vakarás ellen. Az eszköz jellemz ő kialakítására mutat példát az 
1. ábra. A felvitel helyét általában nem záró véd őtakaróval (pl. 
áteresztő nejlon géztakaróval) védeni kell. Ugyanakkor végtelen 
dózis esetén a felvitel helyét le kell zárni. Ha a félig illékony kísérleti anyag párolgása következtében a kísérleti anyag visszanyerési aránya elfogadhatatlan mértékig csökken (lásd az 1.4.10. szakasz els ő 
bekezdését is), akkor az elpárolgó anyagot célszer ű az adagolóesz ­
közt takaró szénsz űrőben felfogni (lásd 1. ábra). Fontos, hogy 
semmilyen eszköz sem sértheti fel a b őrt, nem szívhatja fel a kísérleti 
anyagot és nem léphet azzal reakcióba. Az állatokat a salakanyagok 
gyűjtése érdekében vissza kell vinni az egyedi anyagcsereketrecekbe.
 
1.4.8.  Az expozíció id őtartama és a mintavétel  
Az expozíció id őtartama az az id őintervallum, amely a kísérleti 
anyag felvitele és a b őr lemosásával történ ő eltávolítása között 
telik el. A várható emberi expozíciós id őtartamnak megfelel ően 
kellő expozíciós id őtartamot (jellemz ően 6 vagy 24 órát) kell alkal ­
mazni. Az expozíciós id őszak elteltével az állatokat az ütemezett 
elpusztításig az anyagcsereketrecekben tartják. Az állatokat a vizs ­
gálat teljes ideje alatt, rendszeres id őközönként, a toxicitás/ ­
rendellenes reakciók jeleinek kimutatása végett meg kell figyelni. Az expozíciós id őszak elteltével az irritáció látható jeleinek kimuta ­
tása végett a kezelt b őrt szemrevételezni kell.
 
Az anyagcsereketrecek tegyék lehet ővé a vizsgálat teljes id őtartama 
alatt a vizelet és az ürülék külön gy űjtését. Tegyék lehet ővé továbbá 
a 14 C-szén-dioxid és az illó  14 C-szénvegyületek gy űjtését, amelyeket 
elemezni kell, ha nagyobb mennyiségben (> 5 %) termel ődnek. A 
vizeletet, az ürüléket és a csapdafolyadékokat (pl. a  14 C-szén- 
dioxidot és az illó  14 C-szénvegyületeket) csoportonként és mintavé ­
teli időpontonként egyedileg kell gy űjteni. Ha kell ő információ áll 
rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy nem képz ődik vagy csak kis 
mennyiségben képz ődik illó radioaktív metabolikum, akkor nyitott 
ketrecek is használhatók.  
A salakanyagok gy űjtésére az expozíciós id őszakban, a b őrrel történ ő 
első érintkezést követ ően 24 óráig, majd a kísérlet végéig naponta 
kerül sor. Bár általában három ürülékgy űjtési időszak elegend ő, a 
kísérleti preparátum el őirányzott célja vagy a rendelkezésre álló kine ­
tikai adatok függvényében alkalmasabb, vagy további vizsgálati 
időpontok kijelölésére is szükség lehet.  
Az expozíciós id őszak végén a véd őeszközt minden állatról leve ­
szik, és elemzésre külön félreteszik. Az állatok kezelt b őrét 
megfelelő törlőkendő használatával legalább háromszor tisztító ­
szerrel le kell mosni. Vigyázni kell, hogy a test más része ne 
szennyeződjön be. A tisztítószer feleljen meg a szokásos higiéniai 
gyakorlatnak, például lehet vizes szappanoldat. Végül a b őrt meg 
kell szárítani. A törl őkendőket és a lemosott oldatot elemzésre 
félre kell tenni. A kés őbbre ütemezett csoportba tartozó állatokon, 
mielőtt egyedi ketreceikbe visszatérnek, a kezelt terület védelmére 
friss védőtakarót kell alkalmazni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Befejez ő eljárások  
Minden csoport esetében az egyes állatokat az ütemezés szerint kell 
elpusztítani, és a vért elemzés céljából össze kell gy űjteni. A véd ő­
eszközt vagy a véd őtakarót az elemzés céljából el kell távolítani. A 
kezelt bőrfelületet és egy ahhoz hasonló, nem kezelt lenyírt b őrfelü­
letet minden állatról külön elemzés céljából el kell távolítani. Az alkalmazás területe a  stratum corneumnak  az alatta lév ő epider­
misztől történő leválasztásával felosztható annak érdekében, hogy a 
kísérleti vegyszer eloszlására vonatkozóan több információt lehessen 
összegyűjteni. Ennek az eloszlásnak az expozíciós id őszak után egy 
bizonyos id ő elteltével történ ő meghatározása utalhat arra, hogy 
milyen sorsra jutott a  stratum corneumban  maradó esetleges kísérleti 
vegyszer. A b őr felosztásának megkönnyítése érdekében (a végs ő 
bőrlemosást és az állat elpusztítását követ ően) el kell távolítani a 
védőtakarót. A kezelt b őrfelületet a körülötte lév ő bőrgyűrűvel együtt 
lenyúzzák a patkányról és egy táblára szegezik. Egy ragasztószalag ­
csíkot gyengéden a b őrfelületetre nyomnak, majd a  stratum corneum  
egy részével együtt eltávolítják. További ragasztószalagcsíkokat alkalmaznak mindaddig, amíg a szalag már nem ragad a b őrfelü­
lethez, azaz már a teljes  stratum corneumot  eltávolították. Minden 
egyes állat valamennyi ragasztószalagcsíkja egyetlen konténerbe gyűjthető össze, amelybe szövetoldószert adagolnak a  stratum 
corneum  feloldására. Miel őtt a tetemet a felszívott dózis szempont ­
jából elemzésnek vetnék alá, az esetleges külön vizsgálat céljára 
szolgáló célszövetek eltávolíthatók. Az egyes állatok tetemét elem ­
zésre félre kell tenni. Rendszerint elegend ő elemezni a teljes tartal ­
mat. Külön vizsgálat céljából a megfelel ő célszervek eltávolíthatók 
(ha ezt más vizsgálatok igénylik). Az ütemezett elpusztításkor a 
húgyhólyagban lév ő
 vizeletet hozzá kell adni a korábban összegy űj­
tött vizelethez. Az ütemezett elpusztításkor az ürülék kigy űjtése után 
az anyagcsereketreceket és a csapdáikat megfelel ő oldószerrel el kell 
mosni. Az egyéb, esetleg szennyezett eszközöket ugyancsak meg kell 
vizsgálni.  
1.4.10.  Elemzés  
Valamennyi vizsgálat során megfelel ő visszanyerést kell elérni (azaz 
a radioaktivitás átlagosan 100 ± 10 %-át). Az ezen a tartományon 
kívüli visszanyerést indokolni kell. Az alkalmazott dózis mennyi ­
ségét minden mintában megfelel ően hitelesített eljárással kell 
megvizsgálni.  
Statisztikai szempontból célszer ű lehet megállapítani az egyes dózi ­
sokhoz tartozó eredmények szórását.  
2. ADATOK  
A kísérleti vegyszer és a metabolikum tekintetében egyedenként és 
mintavételi id őpontonként a következ ő méréseket kell elvégezni. Az 
egyedi adatokon kívül a mintavételi id őpontokhoz tartozó adatok 
átlagát is meg kell adni.  
— A véd őeszközökhöz rendelt mennyiség,  
— a bőrről eltávolítható mennyiség,  
— a bőrben/bőrön található le nem mosható mennyiség,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— a vizsgált vérben lév ő mennyiség,  
— az ürülékben és (ha szükséges) a kilélegzett leveg őben lévő 
mennyiség,  
— a tetemben és a külön vizsgálatok céljából kiemelt szervekben 
maradó mennyiség.  
Az ürülékben, a kilélegzett leveg őben, a vérben és a tetemben lév ő 
kísérleti anyag és/vagy metabolikum mennyisége lehet ővé teszi a 
teljes felszívott mennyiség minden egyes id őpontban történ ő 
meghatározását. Ugyancsak meghatározható az expozíciós időszakban a kísérleti anyagnak a b őr cm
 2 -ére jutó felszívott 
mennyisége.  
3. JEGYZ ŐKÖNYV  
3.1. A KÍSÉRLETI JEGYZ ŐKÖNYV  
A kísérleti jegyz őkönyv tartalmazza a kísérlet leírásában meghatá ­
rozott követelményeket, beleértve a használt vizsgálati rendszer 
indoklását, valamint a következ őket: 
Kísérleti anyag:  
— azonosítási adatok (pl. CAS-szám, ha rendelkezésre áll; szárma ­
zás; tisztaság [radiokémiai tisztaság]; ismert szennyez ődések; 
tételszám),  
— fizikai természet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. pH, illékony ­
ság, oldhatóság, stabilitás, molekulatömeg és log P  ow ). 
Kísérleti preparátum:  
— formuláció és megválasztásának indoklása,  
— a preparátum részletes adatai, a felvitt mennyiség, az elért 
koncentráció, viv őanyag, stabilitás és homogenitás.  
Kísérleti állatok:  
— használt faj/fajta,  
— az egyedek száma, kora és neme,  
— az egyedek származása, tartási körülményei, étrendje stb.,  
— az egyedek súlya a kísérlet megkezdésekor.  
Kísérleti körülmények:  
— a kísérleti preparátum adagolásának részletei (a felvitel helye, a 
mennyiségi elemzés módszerei, elzárás/nem elzárás, térfogat, 
kinyerés, kimutathatóság),  
— a táplálék és az itatóvíz min őségére vonatkozó adatok.  
Eredmények:  
— a toxicitás bármilyen jele,  
— táblázatba foglalt felszívódási adatok (arányszámban, abszolút 
mennyiségben vagy százalékban kifejezve),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— a teljes visszanyerés a kísérlet során,  
— az eredmények értelmezése, hasonló, a kísérleti vegyület b őrön át 
történő felszívódására vonatkozó korábbi kísérletek hozzáférhet ő 
adataival való összehasonlítás.  
Az eredmények szöveges értékelése.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) ECETOC (1993). Percutaneous Absorption. European Centre 
for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20.  
(4) Zendzian RP (1989). Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829–835.  
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
(6) EPA (1992). Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
 
(7) EPA (1998). Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
 
(8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990).  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369–373.  
(9) Feldman RJ and Maibach HI (1970). Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399–404.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
1. ábra  
Példa a b őrön át történ ő felszívódásra vonatkozó  in vivo  kísérletek során a b őrre történ ő 
felvitel helyének meghatározására és védelmére szolgáló jellemz ő eszközre
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  BŐRÖN ÁT TÖRTÉN Ő FELSZÍVÓDÁS:  IN VITRO  MÓDSZER  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 428 (2004) vizs ­
gálattal.  
1.1. BEVEZETÉS  
A módszer célja, hogy adatokat szolgáltasson a kísérleti anyag 
bőrből kimetszett mintán keresztül történ ő felszívódására vonatko ­
zóan. A módszer összekapcsolható a b őrön át történ ő felszívódás  
in vivo  módszerével (1), de különállóan is lefolytatható. A 
módszeren alapuló vizsgálatok tervezéséhez ajánlatos az OECD 
által a bőrön át történ ő felszívódási vizsgálatok lefolytatásáról kiadott 
útmutató dokumentum (2) tanulmányozása. Az útmutató doku ­
mentum azért készült, hogy konkrét körülmények között történ ő 
használat esetén megkönnyítse a megfelel ő in vitro  eljárások kivá ­
lasztását annak érdekében, hogy az ezen módszerrel nyert eredmé ­
nyek kell ő megbízhatóságúak legyenek.  
A bőrön át történ ő felszívódásra és a b őr szállítóképességére vonat ­
kozó mérési módszereket két csoportba lehet sorolni: az  in vivo  és az  
in vitro  módszerek csoportjába. A b őrön át történ ő felszívódás  in 
vivo módszere gyakran alkalmazott eljárás, és számos állatfajra 
vonatkozóan nyújt farmakokinetikai információkat. Egy  in vivo  
módszert ismertet egy másik vizsgálati módszer (1). Az  in vitro  
módszereket is évek óta használják a b őrön át történ ő felszívódás 
mérésére. Bár az itt leírt  in vitro  módszer formális validálását még 
nem végezték el, az OECD szakért ői 1999-ben megállapították, hogy 
elegendő kiértékelt adat áll rendelkezésre az  in vitro  módszer alátá ­
masztására (3). Az útmutató dokumentum (2) további, e döntést 
igazoló részleteket tartalmaz, többek között nagyszámú példát az  in 
vitro  és az  in vivo  módszerek közvetlen összehasonlítására. A témát 
számos monográfia tekinti át, amelyek részletes háttéranyagot nyúj ­
tanak az  in vitro  módszerek használatára vonatkozóan (4) (5) (6) (7) 
(8) (9) (10) (11) (12). Az  in vitro  módszerek a vegyszereknek a 
bőrbe és a b őrön át, egy folyadéktartály felé történ ő diffúzióját vizs ­
gálják, és használhatnak élettelen b őrt is kizárólag a diffúzió vizs ­
gálatához, vagy friss, az anyagcsere szempontjából aktív b őrt annak 
érdekében, hogy egyszerre vizsgálják a diffúziót és a b őr anyagcse ­
réjét. Az ilyen módszereket különösen annak összehasonlítására használják, hogy hogyan zajlik le a különféle vegyszerkészítmé ­
nyeknek a b őrbe és a b őrön át történ ő bejutása, valamint hasznos 
modellként szolgálhatnak az emberi b őrön át történ ő felszívódás 
értékelésére is.
 
Az in vitro  módszer nem minden helyzetben és nem minden vegy ­
szerfajtával alkalmazható. Egyes esetekben az  in vitro  módszerek 
kiindulásképpen, a b őrbe való behatolás kvalitatív értékelésére hasz ­
nálhatók. Bizonyos esetekben szükség lehet arra, hogy az így nyert eredményeket  in vivo  adatokkal egészítsük ki. Az útmutató doku ­
mentum (2) részletesebben is ismerteti azokat a körülményeket, 
amikor érdemes az  in vitro  módszerekhez folyamodni. A döntés 
alátámasztására szolgáló további részletes információk a (3) hivatko ­
zásban találhatók.
 
Ez a módszer egy kísérleti anyagnak a b őrön át történ ő felszívódá ­
sára és továbbítására vonatkozó vizsgálatának általános elveit mutatja 
be bőrből kimetszett minta esetében. Számos eml ősfaj bőre használ ­
ható, beleértve az emberét is. A b őr átereszt őképességi jellemz ői a 
testből való kimetszés után is változatlanok maradnak, mivel a 
diffúzió f ő gátja az élettelen  stratum corneum;  vegyszereknek 
bőrön át történ ő aktív továbbítását nem állapították meg. Kimutatták, 
hogy a bőrön át történ ő felszívódás során a b őr képes metabolizálni 
bizonyos vegyszereket (6), de ez a folyamat nem korlátozza az adott 
dózis felszívódási sebességét, bár hatással lehet a véráramba bekerül ő 
anyag természetére.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Fel nem szívott dózis:  az a dózis, amelyet az expozíció után a b őr 
felületéről lemosnak, továbbá amely a nem záró fed őrétegen talál ­
ható, beleértve azt a dózist is, amelyr ől kimutatható, hogy az expo ­
zíció alatt a b őrről elpárolgott.  
Felszívott dózis  (in vitro):  a kísérleti anyagnak az a tömege, amely 
egy meghatározott id őtartam alatt elérte a receptorfolyadékot vagy a 
szisztémás keringést.  
Felszívható dózis  (in vitro):  az a  dózis, amely a lemosás után a 
bőrön vagy a b őrben található.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A kísérleti anyagot, amely radioaktívan jelzett is lehet, felviszik egy, 
a diffúziós cella két kamráját elválasztó b őrminta felületére. A vegy ­
szer meghatározott ideig, meghatározott feltételek között a b őrön 
marad, majd megfelel ő tisztító eljárással eltávolítják. A receptorfo ­
lyadékból a kísérlet során bizonyos id őközönként mintát vesznek, és 
elemzik a kísérleti vegyszer és/vagy a metabolikum tekintetében.  
Anyagcsere szempontjából aktív szervezet használata esetén 
megfelelő módszerrel elemezni lehet a kísérleti vegyszer metaboliká ­
ját. A kísérlet végén, ha szükséges, megmérik a kísérleti vegyszer 
eloszlását és metabolikumát.  
Az ebben a módszerben és az útmutató dokumentumban (2) leírt 
megfelelő feltételek megléte esetén az egy bizonyos id őtartam alatt 
felszívódott kísérleti anyag mennyiségét a receptorfolyadék és a 
kezelt bőr elemzésével vizsgálják. A b őrben maradó kísérleti anyagot 
felszívottnak kell tekinteni, kivéve akkor, ha kimutatható, hogy a felszívódás kizárólag a receptorfolyadék alapján is meghatározható. A többi összetev ő elemzése (a b őrről lemosott és a b őr rétegeiben 
megmaradt anyagok) lehet ővé teszi a további adatértékelést, bele ­
értve a kísérleti anyag teljes eloszlása és a visszanyerési arány elem ­
zését is.
 
A kísérletet végz ő laboratórium vizsgálati rendszere alkalmasságának 
és megbízhatóságának kimutatása érdekében rendelkezésre kell 
állniuk a vonatkozó referencia-vegyszerekre vonatkozó eredmények ­
nek, amelyeknek összhangban kell lenniük a használt módszerre vonatkozó publikált szakirodalommal. Ez a követelmény egy alkalmas (lehet őleg a kísérleti anyaghoz közeli lipofilicitású) referen ­
cia-vegyszerrel és párhuzamosan a kísérleti anyaggal végzett kísér ­
lettel, vagy pedig megfelel ő korábbi, több, különféle lipofilicitású 
referenciaanyagra (pl. koffein, benzoesav és tesztoszteron) vonatkozó adattal teljesíthet ő.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.4.1.  Diffúziós cella  
A diffúziós cella donorkamrából és receptorkamrából áll, amelyek 
közé elhelyezik a b őrt (egy tipikus elrendezés található az 1. ábrán). 
A cellának jól kell záródnia a b őr körül, biztosítania kell a b őr alsó 
felületével érintkez ő receptorfolyadék jó keveredését és a receptorfo ­
lyadékból való könny ű mintavételt, és alkalmasnak kell lennie a cella 
és tartalma h őmérsékletének szabályozására. A statikus és az átfo ­
lyásos diffúziós cellák egyaránt elfogadhatók. A kísérleti preparátum véges dózisú expozíciója esetén a donorkamrákat általában nem 
zárják le. Ugyanakkor végtelen dózis és bizonyos véges dózisok 
használata esetén a donorkamrák lezárhatók.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Receptorfolyadék  
Előnyben kell részesíteni a fiziológiailag vezet ő receptorfolyadéko ­
kat, bár indokolt esetben más folyadék is használható. Meg kell határozni a receptorfolyadék pontos összetételét. Ki kell mutatni, 
hogy a kísérleti anyag a receptorfolyadékban megfelel ő mértékben 
oldható, ami ahhoz szükséges, hogy ne gátolja a felszívódást. Továbbá, a receptorfolyadék nem károsíthatja a b őrpreparátum 
épségét. Az átfolyásos rendszerben az átfolyás sebessége nem gátol ­
hatja a kísérleti anyagnak a receptorfolyadékban történ ő diffúzióját. 
Statikus cellarendszer esetén a folyadékot folyamatosan keverni kell, és rendszeresen mintát kell bel őle venni. Ha az anyagcserét is vizs ­
gáljuk, akkor a receptorfolyadéknak a kísérlet folyamán támogatnia 
kell a bőr életképességét.
 
1.4.3.  Bőrpreparátumok  
Emberi és állati eredet ű bőr egyaránt felhasználható. Tudatában kell 
lenni annak, hogy az emberi b őr felhasználását nemzeti és nemzet ­
közi etikai szempontok és feltételek szabályozzák. Bár el őnyben 
részesítend ő az élő bőr, élettelen b őrt is szabad használni, feltéve 
hogy kimutatható a b őr épsége. Epidermiszmembrán (enzimmel, 
hővel vagy kémiailag leválasztva), illet őleg dermatomával készített, 
hasított vastagságú b őr (jellemz ően 200–400 μm vastagsággal) egya ­
ránt felhasználható. Teljes vastagságú b őr is használható, de kerülni 
kell a túl vastag b őr (kb. > 1 mm) használatát, kivéve akkor, ha a 
kísérleti vegyszernek a b őr rétegeiben történ ő kimutatásához erre 
kifejezetten szükség van. A faj, az anatómiai helyzet és a prepará ­
tumkészítési eljárás megválasztásának indokoltnak kell lennie. Kísér ­
leti preparátumonként minimum négy, elfogadható adatokat szolgál ­
tató vizsgálatot kell elvégezni.  
1.4.4.  A b őrpreparátum épsége  
Alapvető fontosságú, hogy a b őrt gondosan el őkészítsük. A nem 
megfelelő kezelés következtében sérülhet a  stratum corneum , ezért 
ellenőrizni kell az el őkészített b őr épségét. Ha a b őr anyagcseréjét 
vizsgáljuk, a frissen kimetszett b őrt a lehet ő leggyorsabban kell 
felhasználni olyan feltételek között, amelyekr ől ismert, hogy támo ­
gatják az anyagcsere-aktivitást. Általános útmutatásként azt mondhat ­
juk, hogy a frissen kimetszett b őrt 24 órán belül fel kell használni, de 
az elfogadható tárolási id őszak a metabolizációban használt enzim ­
rendszertől és a tárolási h őmérséklett ől függően változhat (13). Ha a 
bőrpreparátumot a használat el őtt tárolták, bizonyítani kell, hogy a 
gátfunkció fennmaradt.  
1.4.5.  Kísérleti anyag  
A kísérleti anyag az az anyag, amelynek penetrációs jellemz őit vizs­
gáljuk. Ideális esetben a kísérleti anyag radioaktívan jelzett.  
1.4.6.  Kísérleti preparátum  
A kísérletianyag-preparátumnak (a kísérleti anyagot tartalmazó, 
tiszta, hígított vagy formulázott anyag, amelyet felvisznek a b őrre) 
meg kell egyeznie azzal az anyaggal (vagy reális helyettesít őjének 
kell lennie annak az anyagnak), amelynek az ember vagy más lehet ­
séges célfajok ki lehetnek téve. A „szokásosan használt” prepará ­
tumtól való bárminem ű eltérésre csak indokolt esetben van lehet őség. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  A kísérleti anyagok koncentrációja és összetétele  
A vizsgálatot általában a kísérleti anyag több koncentrációjával is 
elvégzik oly módon, hogy az egyes koncentrációk átfogják a lehet ­
séges emberi expozíció fels ő határát. Ugyanígy meg kell fontolni a 
jellemzően előforduló formulációk mindegyikének vizsgálatát.  
1.4.8.  A b őrre történ ő felvitel  
A szokásos feltételek között az ember vegyszereknek való expozí ­
ciója során véges dózisokkal találkozunk. Ezért az emberi expozíciót 
modellező alkalmazás során szokásos esetben szilárd anyag esetében 
a bőrön 1–5 mg/cm  2 mennyiséget, folyadék esetében pedig 10 μl/­
cm 2 -ig terjedő mennyiséget kell használni. A mennyiséget a várható 
használati feltételek, a vizsgálat célkit űzései vagy a kísérleti prepa ­
rátum fizikai jellemz ői függvényében kell meghatározni. Például az 
egységnyi felületre m űködő nagy mennyiség modellezhet ő azáltal, ha 
a bőr felületén végtelen dózist alkalmazunk.  
1.4.9.  Hőmérséklet  
A vegyszerek passzív diffúzióját (és ezért a b őrön át történ ő felszí­
vódást is) befolyásolja a h őmérséklet. A diffúziós kamrát és a b őrt 
állandó, a normál b őr hőmérsékletéhez közeli, 32 ± 1  o C-os hőmér­
sékleten kell tartani. Különféle cellafelépítések különféle vízfürd őt 
vagy fűtöttblokk-h őmérsékletet kívánnak annak érdekében, hogy 
biztosítva legyen, hogy a receptor/b őr fiziológiai normaértékén 
legyen. A páratartalom lehet őleg 30 és 70 % között legyen.  
1.4.10.  Az expozíció id őtartama és a mintavétel  
A bőr kísérleti preparátumnak való expozíciója történhet a kísérlet 
teljes időtartama alatt vagy rövidebb id őtartamok során (az emberi 
expozíció valamely sajátos típusának modellezéseként). A b őrről 
megfelelő tisztítószerrel le kell mosni a felesleges kísérleti prepará ­
tumot, és a lemosott folyadékot elemzés céljából össze kell gy űjteni. 
A kísérleti preparátum eltávolítására vonatkozó eljárás a várható 
használati feltételekt ől függ, és indokoltnak kell lennie. A felszívó ­
dási jellemz ők megfelel ő megállapításához általában 24 órás minta ­
vételi időszak szükséges. Mivel a b őr épsége 24 óra elteltével 
romlásnak indulhat, a mintavételi id ő rendszerint nem haladhatja 
meg a 24 órát. Azoknak a kísérleti anyagoknak az esetében, amelyek 
gyorsan behatolnak a b őrbe, ez nem feltétlenül szükséges, de a 
lassan behatoló kísérleti anyagok esetében hosszabb id őre lehet szük ­
ség. A receptorfolyadékból történ ő mintavétel gyakoriságának 
olyannak kell lennie, amely lehet ővé teszi a kísérleti anyag felszívó ­
dási folyamatának grafikus megjelenítését.  
1.4.11.  Befejez ő eljárások  
A kísérleti rendszer minden összetev őjét elemezni kell, és meg kell 
határozni a visszanyerést. Ez magában foglalja a donorkamrát, a b őr 
felületéről lemosott folyadékot, a b őrpreparátumot és a 
receptorfolyadékot/kamrát. Bizonyos esetekben, külön elemzések 
céljából a b őrt részekre oszthatjuk: a b őr expozíciónak kitett részeire 
és a cella pereme alatti b őrterületre, illet őleg a  stratum corneum ra, az 
epidermiszre és a dermiszre.  
1.4.12.  Elemzés  
Valamennyi vizsgálat során megfelel ő visszanyerést kell elérni (a 
radioaktivitás átlagosan 100 ± 10 %-ára kell törekedni, az esetleges eltérést indokolni kell). A receptorfolyadékban, a b őrpreparátumban, 
valamint a b őrfelületről és a műszerekről lemosott öblít őfolyadékban 
lévő kísérleti anyag mennyiségét megfelel ő módszer alkalmazásával 
elemezni kell.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. ADATOK  
Be kell mutatni a receptorfolyadék elemzését, a vizsgálati rend ­
szerben a kísérleti vegyszer eloszlását és a felszívódás jellemz őinek 
időbeli alakulását. Ha az expozíció során véges dózist alkalmazunk, 
akkor meg kell határozni a b őrről lemosott mennyiséget, a b őrrel (és 
ha vizsgáljuk, a különböz ő bőrrétegekkel) összefüggésbe hozható 
mennyiséget és a receptorfolyadékban jelen lev ő mennyiséget (sebes ­
ségben, abszolút mennyiségben vagy százalékban kifejezve). A 
bőrön át történ ő felszívódás néha kizárólag a receptorfolyadékra 
vonatkozó adatok alapján is kifejezhet ő. Ugyanakkor ha a kísérleti 
anyag a vizsgálat végén a b őrben marad, szükség lehet a teljes 
felszívódott mennyiségbe való beszámítására (lásd a (3) hivatkozás 
66. bekezdését). Ha az expozíció során végtelen dózist alkalmazunk, akkor az adatok lehet ővé tehetik az átereszt őképességi állandó (Kp) 
kiszámítását. Ez utóbbi esetben a felszívódott anyag aránya nem 
lényeges.
 
3. JEGYZ ŐKÖNYV  
3.1. A KÍSÉRLETI JEGYZ ŐKÖNYV  
A kísérleti jegyz őkönyv tartalmazza a kísérlet leírásában meghatá ­
rozott követelményeket, beleértve a használt vizsgálati rendszer indoklását, valamint a következ őket:
 
Kísérleti anyag:  
— fizikai természete, fizikai-kémiai tulajdonságai (legalább a mole ­
kulatömeg és a log P  ow ), tisztasága (radiokémiai tisztaság),  
— azonosítási adatok (pl. tételszám),  
— oldhatóság a receptorfolyadékban.  
Kísérleti preparátum:  
— formuláció és megválasztásának indoklása,  
— homogenitás.  
Kísérleti körülmények:  
— a bőr eredete és helyzete, az el őkészítés módszere, a felhasználást 
megelőző tárolás körülményei, az esetleges el őkezelés (tisztítás, 
antibiotikumos kezelés stb.), a b őr épségére vonatkozó vizsgála ­
tok, anyagcsere-állapot, a megválasztás indoklása,  
— a cella felépítése, a receptorfolyadék összetétele, a receptorfo ­
lyadék áramlási sebessége vagy a mintavételi id őpontok és eljá ­
rások,  
— a kísérleti preparátum adagolása és az alkalmazott dózis mennyi ­
ségi meghatározása,  
— az expozíció id őtartama,  
— a kísérleti preparátum b őrről történő eltávolításának részletei, pl. 
a bőr öblítése,  
— a bőr elemzésére vonatkozó adatok és a b őrön belüli eloszlás 
leírása céljából végzett részekre osztás részletei,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— cella- és m űszermosási eljárások,  
— a mennyiségi elemzés módszerei, kinyerési eljárások, kimutatha ­
tósági határok és az értékelési módszer hitelesítése.  
Eredmények:  
— a teljes visszanyerés a kísérlet során (alkalmazott dózis ≡ 
bőrmosás + b őr + receptorfolyadék + cellamosás),  
— minden egyes rekeszben az egyes cellavisszanyerések táblázatos 
összefoglalása,  
— felszívódási profil,  
— táblázatba foglalt felszívódási adatok (sebességben, abszolút 
mennyiségben vagy százalékban kifejezve).  
Az eredmények szöveges értékelése.  
Következtetések.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
 
(4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
(5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s, RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237–241.
 
(6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Application s. CRC 
Press, Boca Raton.  
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels.  
(8) Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
 
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
(10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et a l. (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
(12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
(13) Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene  in vitro . Arch Toxicol 74: 356–365.  
1. ábra  
Példa a statikus diffúziós cella felépítésére a b őrön át történ ő felszívódás  in vitro  vizsgálatához
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO  BŐRIRRITÁCIÓ: REKONSTRUÁLT EMBERI 
FELHÁMON VÉGZETT VIZSGÁLATI MÓDSZER  
BEVEZETÉS  
1. A b őrirritáció a vizsgált vegyi anyag alkalmazását követ ően 4 órán belül 
megjelenő, visszafordítható b őrkárosodás (az Egyesült Nemzetek Szervezete 
[ENSZ] által kidolgozott, vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszerében [GHS], valamint az anyagok és keve ­
rékek osztályozásáról, címkézésér ől és csomagolásáról szóló, 2008. 
december 16-i 1272/2008/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletében 
[EU CLP] meghatározottak szerint (1)(3)). Ez a vizsgálati módszer olyan  
in vitro  eljárást biztosít, amely lehet ővé teszi az ENSZ által kidolgozott 
GHS és az EU CLP szerinti 2-es kategóriának megfelel ő, irritációt okozó 
anyagok (anyagok és keverékek) jelentette veszély meghatározását (1) (2) 
(3). Az EU-ban, valamint azokban a régiókban, ahol nem vették át az ENSZ GHS opcionális 3. kategóriáját (enyhén irritáló hatású anyagok), ez a vizs ­
gálati módszer a besorolással nem rendelkez ő vegyi anyagok, vagyis az 
ENSZ GHS és az EU CLP szerinti „kategória nélküli” anyagok meghatá ­
rozására is alkalmazható (1)(3). Ez a vizsgálati módszer a vegyi anyagok bőrirritációt okozó hatásának lépcs őzetes vizsgálati stratégiáján belül az  in 
vivo vizsgálatot önállóan helyettesít ő vizsgálatként (e melléklet 4. és B.4. 
fejezete) alkalmazható.
 
2. A bőrirritáció vizsgálata jellemz ően állatkísérletek végzésével jár (az OECD 
404. vizsgálati iránymutatása; e melléklet B.4. fejezete) (4). 2004-ben a B.4. fejezet állatjólléti szempontokat figyelembe véve átdolgozásra került, lehe ­
tővé téve a b őrkorrózió/b őrirritáció lépcs őzetes vizsgálati stratégia részét 
képező hitelesített  in vitro  és ex vivo  vizsgálati módszerek alkalmazásával 
történő meghatározását, megkímélve ezzel az állatokat a fájdalomtól és 
szenvedést ől. Három hitelesített  in vitro  vizsgálati módszert fogadtak el és 
foglaltak bele az OECD 430., 431. és 435. vizsgálati iránymutatásaiba (5) 
(6) (7), ezek közül két vizsgálati módszert – amelyek e melléklet B.40. és 
B.40 A. fejezetében szerepelnek – a B.4. fejezet, illetve az OECD 404. vizsgálati iránymutatása lépcs őzetes vizsgálati stratégiájának korrozív hatást 
vizsgáló részében kell alkalmazni (4).
 
3. Ez a vizsgálati módszer a b őrirritációval mint az emberi egészség károso ­
dásának egyik végpontjával foglalkozik. Rekonstruált emberi felhám-(epi ­
dermisz)modellen alapul, amely általános felépítését tekintve (sejtforrásként humán eredet ű, nem transzformált epidermális keratinsejtek alkalmazása, 
valamint reprezentatív szövet- és citoarchitektúra) életh űen utánozza az 
emberi bőr felső rétegének, vagyis a felhámnak (epidermisznek) a biokémiai 
és fiziológiai tulajdonságait. Ez a vizsgálati módszer több teljesítményszab ­
ványt (2. függelék) is magában foglal az EC-ECVAM (8) által kidolgozott hasonló és módosított rekonstruált emberi epidermiszalapú vizsgálati 
módszereknek az OECD 34. iránymutatásában szerepl ő elveknek megfelel ő 
értékeléséhez (9).
 
4. Három olyan módszer van, amelyet e vizsgálati módszer alapján hitelesítet ­
tek. Előhitelesítési, optimalizálási és hitelesítési vizsgálatokat végeztek egy 
emberi felhámmodellt alkalmazó  in vitro  módszerhez (10) (11) (12) (13) 
(14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), amely kereskedelmi forgalomban EpiS ­
kin TM (hitelesített referencia-módszer – VRM) néven kapható. A teljesít ­
ményszabvány szerinti hitelesítés alapján két másik, szintén kereskedelmi forgalomban kapható,  in vitro  rekonstruált emberi felhámmodellen végzett 
bőrirritáció-vizsgálati módszer adott a referencia-módszerhez hasonló ered ­
ményeket (21): az EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) és a SkinEthic  TM RHE 
módszerek (22).  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Ahhoz, hogy az  in vitro  rekonstruált emberi felhámmodellen végzett 
módszerhez hasonló vagy annak egyik változatát képez ő, de a hitelesített 
referencia-módszert ől, az EpiDerm  TM SIT (EPI-200) vagy a SkinEthic  TM 
RHE módszert ől eltérő javasolt vizsgálatot szabályozási célokra lehessen 
alkalmazni, a javasolt alkalmazás tekintetében meg kell határozni annak 
megbízhatóságát, relevanciáját (pontosságát) és korlátait, hogy a vizsgálatot 
az e vizsgálati módszerben el őírt teljesítményszabványban foglalt követel ­
ményeknek megfelel ően (2. függelék) az 1. referencia-módszerhez hason ­
lónak lehessen min ősíteni. Továbbá az  in vitro  rekonstruált emberi felhám ­
modellen alapuló hasonló vagy módosított módszer hatósági engedélyezés 
céljából történ ő kidolgozása és hitelesítése el őtt javasolt tanulmányozni az 
OECD által a b őrirritáció  in vitro  vizsgálatára vonatkozóan kiadott magya ­
rázó háttérdokumentumot (23).  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
6. Az alkalmazott fogalmak meghatározása az 1. függelékben található.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
7. Amint azt a hitelesítési vizsgálat kimutatta (16), a vizsgálati módszer egyik 
korlátja az, hogy nem teszi lehet ővé a vegyi anyagok ENSZ GHS szerinti 3. 
kategóriába történ ő besorolását (enyhe b őrirritáló hatású anyag) (1). Rész ­
leges helyettesít ő vizsgálatként alkalmazva  in vivo  kontrollteszt válhat szük ­
ségessé a b őrirritáló hatás teljes jellemzéséhez (e melléklet 4. és B.4. feje ­
zete). Elfogadott tény, hogy az emberi b őr használatára nemzeti és nemzet ­
közi etikai megfontolások és feltételek vonatkoznak.  
8. Ez a vizsgálati módszer a B.4. fejezetben szerepl ő (az OECD 404. vizsgálati 
iránymutatása), b őrkorrózióra/b őrirritációra irányuló lépcs őzetes vizsgálati 
stratégia  in vitro  bőrirritációs részével foglalkozik (4). Bár ez a vizsgálati 
módszer nem nyújt megfelel ő információt a b őrkorrózióról, megjegyzend ő, 
hogy a bőrkorrózió vizsgálatára irányuló B.40 A. módszer (az OECD 431. 
vizsgálati iránymutatása) ugyanezen a rekonstruált emberi felhámmodelles vizsgálati rendszeren alapul, noha más protokollt alkalmaz (B.40 A. fejezet). 
Ez a módszer az emberi keratinsejteket tartalmazó rekonstruált emberi 
felhámmodelleken alapul, tehát a vizsgált faj célszervének  in vitro  vizsgála­
táról van szó. Továbbá közvetlenül lefedi az irritáció során  in vivo  zajló 
gyulladásos kaszkád/hatásmechanizmus kezdeti lépését (körülírt sérülést 
eredményez ő sejt- és szövetkárosodás). E vizsgálati módszer hitelesítési 
eljárása során a vegyi anyagok széles körét vizsgálták, és a hitelesítési vizsgálat empirikus adatbázisa összesen 58 vegyi anyagra terjedt ki (16)(18)(23). Ezek között szilárd, folyékony és félszilárd anyagok, valamint 
viaszok is el őfordulhatnak. A folyadékok lehetnek vizes vagy nem vizes 
alapúak, a szilárd anyagok pedig vízben oldódóak vagy vízben nem oldha ­
tóak. Amennyiben lehetséges, a szilárd anyagokat alkalmazásuk el őtt finom 
porrá kell törni, a minta egyéb el őkezelése nem szükséges. Gázokat és 
aeroszolokat hitelesítési vizsgálat keretében még nem vizsgáltak (24). Bár 
elképzelhet ő, hogy ezek is vizsgálhatók a rekonstruált emberi felhámmo ­
delles technikával, a jelenlegi vizsgálatimódszer-leírás nem engedi meg gázok és aeroszolok vizsgálatát. Szintén megjegyzend ő, hogy az er ős 
színű vegyi anyagok befolyásolhatják a sejt életképességének méréseit, és 
a korrekció érdekében adaptált kontrollok alkalmazását teszik szükségessé (lásd a 24–26. bekezdéseket).
 
9. Ha a besorolás egyértelm ű, akkor három szövetpéldány vizsgálatából álló 
egyszeri vizsgálatmenetnek elegend őnek kell lennie az adott vizsgált vegyi 
anyag esetében. Határértéken lév ő eredmények esetében azonban, ha 
például az egyes szövetpéldányok eredményei nem egyeznek és/vagy az átlagos százalékos életképesség 50 ± 5 %, megfontolandó egy második 
vizsgálatmenet lefolytatása, és ha az els ő és a második vizsgálatmenet 
eredményei különböz őek, akkor egy harmadiké is.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
10. A vizsgált vegyi anyagot egy olyan nem transzformált emberi epidermális 
keratinsejteket tartalmazó, háromdimenziós emberi felhámmodellre viszik 
fel helyileg, amelyeket úgy tenyésztettek ki, hogy többréteg ű, erősen diffe­
renciált emberi felhámot ( epidermist ) alkossanak. Ez szervezett bazális, 
spinózus és granuláris sejtrétegekb ől, valamint intercelluláris lamelláris 
lipidrétegeket tartalmazó többréteg ű szarurétegb ől (stratum corneum ) áll, 
amely az  in vivo  megtalálható lipidcsoportokhoz hasonló f ő lipidcsoportokat 
tartalmazza.  
11. Az irritatív hatású anyagok okozta, b őrpír és ödéma formájában megnyil ­
vánuló b őrirritáció olyan eseménysorozat eredménye, amely az irritatív 
hatású anyagok  stratum corneum  történő penetrációjával és az alatta 
fekvő keratinsejtrétegek roncsolódásával kezd ődik. A pusztuló keratinsejtek 
mediátoranyagokat bocsátanak ki, amelyek a  dermisz  sejtjeire – f őként a 
strómális és endoteliális sejtekre – ható gyulladásos kaszkádot indítanak el. A megfigyelt b őrpírt és ödémát az endoteliális sejtek dilatációja és fokozott 
permeabilitása idézi el ő (24). A rekonstruált emberi felhámmodellen alapuló 
módszerek a kaszkád kezdeti eseményeit mérik.
 
12. A rekonstruált emberi felhámmodellben a sejtek életképességét a MTT 
[3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid, tiazolil kék; CAS-szám: 298–93–1)] vitális festék enzimatikus úton kék formazán sóvá 
történő átalakulása alapján mérik, amelyet a szövetekb ől történő kivonás 
után mennyiségileg meghatároznak (25). Az irritatív hatású anyagokat azon képességük alapján azonosítják, hogy a sejtek életképességét meghatá ­
rozott határérték alá (azaz az ENSZ GHS/EU CLP szerinti 2. kategóriájú 
anyagok esetében ≤ 50 % alá) csökkentik. Azoktól a jogszabályi keretekt ől 
függően, amelyekben a vizsgálati módszer eredményeit fel fogják használni, 
a határérték feletti sejtéletképességet eredményez ő anyagok irritáló hatással 
nem rendelkez őnek tekinthet ők (azaz 50 % felett nincsenek kategóriába 
sorolva).
 
A JÁRTASSÁG BIZONYÍTÁSA  
13. Az e vizsgálati módszer alapján hitelesített három módszer bármelyikének 
rutinszerű alkalmazását megel őzően a laboratóriumoknak igazolniuk kell 
technikai jártasságukat az 1. táblázatban felsorolt tíz referenciaanyag felhasználásával. Az e vizsgálati módszer alapján kifejlesztett hasonló módszerek vagy a három hitelesített módszer bármelyikének módosításai 
esetén, a módszer hatósági vizsgálatokra történ ő használata el őtt teljesíteni 
kell a vizsgálati módszer 2. függelékében ismertetett teljesítményszabvány előírásait.
 
14. A jártasság igazolásának részeként ajánlott, hogy a felhasználó a rekonst ­
ruált emberi felhámmodell gyártója által meghatározottak szerint, átvétel után ellen őrizze a szövetek barrierjellemz őit. Ez különösen fontos, ha a 
szöveteket nagy távolságra/hosszú ideig szállították. Ha egy módszert már 
sikeresen igazoltak, és az alkalmazásában való jártasságot bizonyították, 
akkor ilyen jelleg ű ellenőrzéseket nem szükséges rutinszer űen végezni. Ha 
azonban egy módszert rutinszer űen alkalmaznak, akkor a barrierjellemz őket 
javasolt továbbra is rendszeres id őközönként ellen őrizni.
 
1. táblázat  
Referenciaanyagok  ( 1 ) 
Vegyi anyag CAS-szám  In vivo  
eredmény (  2 ) Halmazállapot ENSZ GHS/EU CLP 
szerinti kategória  
naftalin-ecetsav 86-87-3 0 szilárd kategória nélküli 
izopropanol 67-63-0 0,3 folyadék kategória nélküli  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Vegyi anyag CAS-szám  In vivo  
eredmény (  2 ) Halmazállapot ENSZ GHS/EU CLP 
szerinti kategória  
metil-sztearát 112-61-8 1 szilárd kategória nélküli 
heptil-butirát 5870-93-9 1,7 folyadék kategória nélküli  
(opcionális 3. 
kategória)  ( 3 ), ( 4 ) 
hexil-szalicilát 6259-76-3 2 folyadék kategória nélküli  
(opcionális 3. 
kategória)  ( 3 ), ( 4 ) 
ciklámen-aldehid 103-95-7 2,3 folyadék 2. kat. 1-brómhexán 111-25-1 2,7 folyadék 2. kat. 
kálium-hidroxid (5 %-os vizes oldat) 1310-58-3 3 folyadék 2. kat. 
1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 3,3 szilárd 2. kat. Heptanal 111-71-7 3,4 folyadék 2. kat.
 
( 1 ) Ezek a referenciaanyagok a hitelesítési vizsgálat során alkalmazott referenciaanyagok alcsoportját képezik. 
( 2 ) In vivo  eredmény a B.4. fejezet és az OECD 404. vizsgálati iránymutatása szerint (4). 
( 3 ) E vizsgálati módszer alapján az ENSZ GHS szerinti opcionális 3. kategóriába tartozó anyagok (enyhe irritáló hatású anyagok) ( 1) 
„kategória nélküli” anyagoknak min ősülnek. 
( 4 ) Az ENSZ GHS szerinti opcionális 3. kategória az EU CLP rendszerben nem alkalmazható.  
ELJÁRÁS  
15. Az alábbiakban a rekonstruált emberi felhámmodellen végzett b őrirritációs 
vizsgálat összetev őinek és eljárásainak leírása található. Rekonstruált emberi 
felhámmodellt kell felépíteni; a modell elkészíthet ő házon belül vagy besze ­
rezhető kereskedelmi forgalomból. Az EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI- 
200) és SkinEthic  TM RHE módszerekhez szabványm űveleti előírások (SOP) 
állnak rendelkezésre (26)(27)(28). A vizsgálatot az alábbiak szerint kell végrehajtani:
 
A rekonstruált emberi felhámmodellel végzett módszer összetev ői 
Általános feltételek  
16. Az epitélium felépítéséhez nem transzformált emberi keratinsejteket kell 
használni. Él ő epitélsejtek több rétegének (bazális réteg,  stratum spinosum, 
stratum granulosum ) kell jelen lennie a funkcionális  stratum corneum  alatt. 
A stratum corneum nak többréteg űnek kell lennie, és tartalmaznia kell az 
elengedhetetlenül szükséges lipidprofilt, hogy nagy ellenálló képességgel 
rendelkez ő funkcionális barriert képezzen a citotoxikus markeranyagok, 
pl. a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) vagy a Triton X-100 gyors áthatolása ellen. A barrierfunkciót bizonyítani kell, ennek értékelése vagy a marker ­
anyag azon koncentrációjának meghatározásával történik, amely a szövetek 
életképességét meghatározott expozíciós id ő elteltével 50 %-kal csökkenti 
(IC
 50 ), vagy a markeranyag meghatározott, állandó koncentrációban történ ő 
alkalmazásakor a sejtek életképességének 50 %-kal való csökkentéséhez 
szükséges expozíciós id ő (ET  50 ) meghatározásával. A rekonstruált emberi 
felhámmodell folyadékzáró tulajdonságainak meg kell akadályozni, hogy az anyag áthatoljon a  stratum corneum  körül az él ő szövetbe, amely a b őr 
expozíciójának rossz modellezését eredményezné. A rekonstruált emberi 
felhámmodellnek baktérium-, vírus-, mikoplazma- és gombafert őzéstől 
mentesnek kell lennie.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funkcionális feltételek  
Életképesség  
17. Az életképesség nagyságrendjének meghatározásához az MTT-vizsgálatot 
alkalmazzák (25). A rekonstruált emberi felhámmodell (RhE) felhasználó ­
inak biztosítaniuk kell, hogy az alkalmazott RhE minden egyes tétele megfeleljen a negatív kontrollra (NC) vonatkozóan meghatározott kritériu ­
moknak. Az extraháló oldószer optikai s űrűségének (OD) eléggé alacsony ­
nak, azaz 0,1 alattinak kell lennie. A RhE modell gyártója/forgalmazója (a 
bőrirritáció meghatározására irányuló vizsgálati módszer feltételeiben) a 
negatív kontroll OD-értékeire vonatkozóan elfogadási tartományt (fels ő és 
alsó határérték) ad meg; a három hitelesített módszerre vonatkozó elfoga ­
dási tartományok a 2. táblázatban vannak feltüntetve. Dokumentálni kell, 
hogy a negatív kontrollal kezelt szövetek stabil tenyészetben vannak (hasonló életképességi értékeket adnak) a vizsgálat során alkalmazott expo ­
zíció időtartama alatt.
 
2. táblázat  
A negatív kontrollok OD-értékeinek elfogadási tartományai  
Alsó elfogadási határ Fels ő elfogadási határ  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Barrierfunkció  
18. A  stratum corneum nak és lipidprofiljának az IC  50 vagy ET  50 alapján 
végzett becslések szerint (3. táblázat) megfelel ő ellenálló képességgel kell 
rendelkeznie a citotoxikus markeranyagok, például a nátrium-dodecil- 
szulfát (SDS) vagy a Triton X-100 gyors áthatolásának megakadályozására.  
Morfológia  
19. A rekonstruált emberi felhámmodellen szövettani vizsgálatot kell végezni, 
amely igazolja a humán  epidermisz szerű szerkezetet (beleértve a többréteg ű 
stratum corneum ot is).  
Reprodukálhatóság  
20. A módszer során vizsgált pozitív kontrollanyagok (PC) és negatív 
kontrollanyagok (NC) eredményeinek a kés őbbiekben reprodukálhatóknak 
kell lenniük.  
Minőség-ellenőrzés (QC)  
21. A rekonstruált emberi felhámmodell el őállítójának/forgalmazójának gondos ­
kodnia kell arról, és igazolnia kell azt, hogy az alkalmazott RhE modell 
minden egyes tétele megfelel a gyártás utáni felszabadításra vonatkozóan meghatározott feltételeknek, amelyek közül az  életképességre  (17. bekez ­
dés), a  barrierfunkcióra  (18. bekezdés) és a  morfológiára  (19. bekezdés) 
vonatkozó kritériumok a leglényegesebbek. Ezeket az adatokat a módszer 
felhasználóinak rendelkezésére kell bocsátani, hogy ezeket az információkat fel tudják tüntetni a vizsgálati jelentésben. Az RhE-modell kifejleszt őjének/ 
forgalmazójának (illetve házon belüli modell használata estén a vizsgálatot 
végző személynek) az IC
 50 és az ET  50 -értékekre vonatkozóan elfogadási 
tartományt (fels ő és alsó határértéket) kell megállapítania. Az irritáló 
hatás besorolásának megbízható el őrejelzéseként kizárólag min ősített szöve ­
teken végzett vizsgálatok eredményei fogadhatók el. A 3. táblázatban 
például a három hitelesített módszerhez alkalmazott elfogadási tartományok 
láthatók.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
3. táblázat  
Példák a min őség-ellenőrzésre szolgáló tételeknél alkalmazott felszabadítási kritériumokra  
Alsó elfogadási határ Fels ő elfogadási határ  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 órás kezelés nátrium-dodecil- 
szulfáttal (SDS) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100)(27) ET 50 = 4,8 óra ET  50 = 8,7 óra 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100)(28) ET 50 = 4,0 óra ET  50 = 9,0 óra  
A vizsgált anyagok és kontrollanyagok alkalmazása  
22. Minden vizsgálatmenetben valamennyi vizsgált vegyi anyaghoz és kont ­
rollhoz legalább három szövetpéldányt kell használni. Folyékony és szilárd anyagok esetében egyaránt megfelel ő mennyiség ű vizsgált vegyi anyagot 
kell alkalmazni, hogy az egyenletesen fedje az  epidermisz  felszínét, azaz 
minimum 25 μl/cm
 2 vagy 25 mg/cm  2 -ot, ugyanakkor el kell kerülni 
végtelen dózis alkalmazását. Szilárd anyagok alkalmazása el őtt az  epider­
misz felületét ionmentesített vagy desztillált vízzel be kell nedvesíteni, hogy 
jobb legyen az érintkezés a vizsgált vegyi anyag és az  epidermisz  felszíne 
között. Amennyiben lehetséges, a szilárd anyagokat finom por formájában kell vizsgálni Az expozíciós id ő lejárával a vizsgált vegyi anyagot vizes 
alapú pufferrel vagy 0,9 %-os NaCl-dal óvatosan le kell mosni az  epider­
misz felületér ől. Attól függ ően, hogy a három hitelesített RhE-módszer 
közül melyiket alkalmazzák, az expozíciós id ő 15–60 perc között, az inku ­
bációs hőmérséklet pedig 20–37 °C között változhat. Ezeket az expozíciós 
időket és h őmérsékleteket a módszerek természetéb ől adódó jellemz ők 
figyelembevételével mindegyik RhE-módszerre optimalizálták; ennek rész ­
leteit lásd a módszerek szabványm űveleti előírásaiban (SOP) (26)(27)(28).
 
23. Minden vizsgálatmenet során párhuzamos negatív (NC) és pozitív (PC) 
kontrollt is alkalmazni kell annak bizonyítására, hogy a szövetek (negatív 
kontrollal bizonyított) életképessége, barrierfunkciója és a (pozitív kontrollal 
bizonyított) kapott szövetérzékenység a korábbi adatok alapján meghatá ­
rozott elfogadási tartományon belül van. A javasolt pozitív kontrollanyag nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 5 %-os vizes oldata. A javasolt negatív kont ­
rollanyag a víz vagy a foszfátpuffert tartalmazó sóoldat (PBS).
 
A sejtek életképességének mérése  
24. A vizsgálati eljárás legfontosabb eleme, hogy az életképesség mérését ne 
közvetlenül a vizsgált vegyi anyaggal végzett expozíció után végezzük, hanem friss tápközeggel történt átöblítés után, megfelel ő hosszúságú kezelés 
utáni inkubációs id őszakot követ ően. Ez az id őszak egyaránt lehet ővé teszi 
az enyhe irritatív hatás utáni felépülést, valamint az egyértelm ű citotoxikus 
hatások megjelenését. A vizsgálat optimalizálási szakasza (11) (12) (13) 
(14) (15) azt mutatta, hogy 42 órás kezelés utáni inkubációs id őszak az 
optimális.
 
25. Az MTT vizsgálat egy olyan kvantitatív hitelesített módszer, amelyet e 
vizsgálati módszer során a sejtek életképességének méréséhez kell alkal ­
mazni. A vizsgálat kompatibilis a háromdimenziós szövetkonstrukcióban 
történő használattal. A szövetmintát 3 órára megfelel ő koncentrációjú (pél ­
dául 0,3–1 mg/ml) MTT-oldatba kell helyezni. A kicsapódott kék formazán terméket ezután oldószer (például izopropanol, savas izopropanol) haszná ­
latával ki kell vonni a szövetb ől, és a formazán koncentrációját az OD 570 
nm-en történ ő mérésével, egy maximum ± 30 nm sávsz űrő alkalmazásával 
meg kell határozni.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. A vizsgált vegyi anyag optikai tulajdonságai vagy az MTT-re gyakorolt 
kémiai hatása megzavarhatja a vizsgálatot, ami az életképesség téves 
megállapításához vezet (mivel a vizsgált anyag akadályozhatja, visszafordít ­
hatja vagy akár el ő is idézheti az elszínez ődést). Ez akkor következhet be, 
amikor egy adott vizsgált vegyi anyagot öblítéssel nem távolítottak el 
teljesen a szövetb ől, vagy amikor az anyag áthatol az  epidermisz en. Ha a 
vizsgált vegyi anyag közvetlen hatást gyakorol az MTT-re (MTT-redukáló), természetes állapotában is színes, vagy a szövetkezelés során elszínez ődik, 
akkor további kontrollokat kell alkalmazni annak kimutatására és korrigá ­
lására, hogy a vizsgált vegyi anyag befolyásolja az életképesség mérésének 
módját. A három hitelesített módszer szabványm űveleti el őírásaiban 
megtalálható annak részletes leírása, hogyan kell korrigálni a közvetlen MTT-redukáló hatást és a színez őanyagok okozta zavaró hatást 
(26)(27)(28).
 
Elfogadhatósági kritériumok  
27. Minden olyan módszer esetében, melynek során érvényes RhE-modell 
tételeket alkalmaznak (lásd a 21. bekezdést), a negatív kontrollal kezelt 
szöveteknek olyan OD-t kell mutatniuk, amely tükrözi a szöveteknek a szállítást és az átvételi lépéseket, valamint az összes protokollfolyamatot követő minőségét. A kontrollok OD-értékei nem lehetnek alacsonyabbak 
a korábbi adatok alapján megállapított határértékeknél. Hasonlóképpen a 
pozitív kontrollal, vagyis nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 5 %-os vizes oldatával kezelt szöveteknek tükrözniük kell, hogy azok a vizsgálati módszer körülményei között képesek válaszreakciót adni az irritáló hatású 
anyagokra (26) (27) (28). A szövetpéldányok közötti variabilitás kapcso ­
lódó, megfelel ő mutatóit meg kell határozni (ha például a szórást (SD) 
alkalmazzák, ennek a régebbi adatok alapján számolt egyoldalú 95 %-os toleranciaintervallumon belül kell lennie; a hitelesített referencia-módszer 
esetében a szórásnak 18 % alatt kell lennie).
 
Az eredmények értelmezése és az el őrejelzési modell  
28. Az egyes vizsgált vegyi anyagokra vonatkozóan kapott OD-értékek felhasz ­
nálhatók a negatív kontrollra normalizált életképesség százalékos arányának kiszámításához, amely 100 %-ra van beállítva. Az irritáló anyagokat a kategória nélküli vizsgált vegyi anyagoktól megkülönböztet ő százalékos 
sejtéletképesség határértékét, valamint az eredmények értékeléséhez és az 
irritáló hatású vegyi anyagok meghatározásához alkalmazott statisztikai eljá ­
rás(oka)t egyértelm űen meg kell határozni, dokumentálni kell, és megfele ­
lőségüket igazolni kell. Az irritáló hatás el őrejelzésére alkalmazott határ ­
értékek az alábbiak:
 
— A vizsgált vegyi anyag az ENSZ GHS/EU CLP 2. kategóriájába tartozó 
bőrirritáló hatásúnak anyagnak tekintend ő, amennyiben az expozíció és 
a kezelést követ ő inkubáció után a szövet életképessége ( ≤) 50 % vagy 
ennél kevesebb.  
— Azoktól a jogszabályi keretekt ől függően, amelyekben a vizsgálati 
módszer eredményeit fel fogják használni, a vizsgált vegyi anyag az ENSZ GHS/EU CLP szerint kategóriába nem sorolt, b őrirritáló hatással 
nem rendelkez ő anyagnak tekintend ő, amennyiben az expozíció és a 
kezelést követ ő inkubáció után a szövet életképessége (>) 50 %-nál 
nagyobb.
 
ADATOK ÉS JELENTÉS  
Adatok  
29. Mindegyik vizsgálatmenetre vonatkozóan táblázatos jelentést kell készíteni 
az egyes szövetpéldányok adatairól (például OD-értékek és számított száza ­
lékos sejt-életképességi adatok az egyes vizsgált vegyi anyagok esetében, a 
besorolást is beleértve), amelyben szerepelnie kell a megismételt kísérletek adatainak is, ha voltak ilyenek. Továbbá mindegyik vizsgálatmenet esetében meg kell adni az átlagot ± szórást. Az MTT reagenssel és a színes vizsgált 
vegyi anyagokkal megfigyelt kölcsönhatásokat a jelentésben minden vizs ­
gált vegyi anyag esetében fel kell tüntetni.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Vizsgálati jelentés  
30. A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyagok és kontrollanyagok:  
— a vegyi anyag(ok) neve, például a CAS-név és -szám, EU-név és -szám, 
ha ismert,  
— a vegyi anyag tisztasága és összetétele (tömegszázalékban),  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából lényeges fizikai/kémiai tulajdon ­
ságok (pl. halmazállapot, stabilitás, illékonyság, pH és vízoldékonyság, 
ha ismert,  
— a vizsgált vegyi anyagok/kontrollanyagok vizsgálatot megel őző keze­
lése, ha történt ilyen (például melegítés, porítás),  
— tárolási feltételek.  
Az alkalmazott rekonstruált emberi felhámmodell és protokoll indoklása  
Vizsgálati körülmények:  
— a felhasznált sejtrendszer,  
— az alkalmazott specifikus RhE-modellre vonatkozó teljes kör ű alátá­
masztó adatok, köztük a modell teljesítménye. Ennek többek között az alábbiakat kell magában foglalnia:
 
i. életképesség;  
ii. barrierfunkció;  
iii. morfológia;  
iv. reprodukálhatóság és prediktív érték;  
v. a modell min őség-ellenőrzése (QC),  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás részletei,  
— az alkalmazott vizsgálati dózisok, az expozíció id őtartama és a kezelés 
utáni inkubációs id őszak hossza,  
— a vizsgálati eljáráson végzett bármilyen változtatás leírása,  
— hivatkozás a modellel kapott korábbi adatokra. Ennek többek között az 
alábbiakat kell magában foglalnia:  
i. a minőség-ellenőrzési adatok elfogadhatósága tekintettel a tételre 
vonatkozó korábbi adatokra;  
ii. a pozitív és negatív kontrollértékek elfogadhatósága tekintettel a 
pozitív és negatív kontrollok átlagértékeire és tartományaira;  
— az alkalmazott értékelési kritériumok leírása, beleértve az el őrejelző 
modellhez választott határérték(ek) indoklását,  
— hivatkozás a régebbi kontrolladatokra,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Eredmények:  
— az egyes vizsgált vegyi anyagok adatainak táblázatos bemutatása mind ­
egyik vizsgálatmenet és mindegyik szövetpéldány esetében,  
— a közvetlen MTT-redukáló hatással rendelkez ő és/vagy színváltozást 
okozó vegyi anyagokhoz alkalmazott kontrollok feltüntetése,  
— a megfigyelt egyéb jelenségek leírása.  
Az eredmények tárgyalása  
Következtetés  
SZAKIRODALOM  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York 
and Geneva. Elektronikus formátumban: [http://www.unece.org/trans/dan ­
ger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]  
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the Performance under UN GHS of three  
in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference 
Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation 
Performance Standards” ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 2009. április 9. Elektronikus formátumban: [http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]
 
(3) Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. 
december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és 
csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és 
hatályon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosítá ­
sáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 
430, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Elektronikus 
formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. 
Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Elektronikus 
formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Elektro ­
nikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in 
Vitro 16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329-349.  
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to 
the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.  
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Elektronikus formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. 
and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 
603-619.  
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – 
Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 
351-358.  
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Elektronikus formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Elektronikus formátumban: [http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Elektronikus formátumban: [http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]  
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http:// www.oecd.org/document/24/ 0,3746,en_2649_34377_47858904_ 1_1_1_1,00.html]
 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231-243.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Elektronikus 
formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Elekt ­
ronikus formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Elektronikus formátumban: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) A Bizottság 2001/59/EK irányelve (2001. augusztus 6.) a veszélyes anyagok 
osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti 
és közigazgatási rendelkezések közelítésér ől szóló 67/548/EGK tanácsi 
irányelvnek a m űszaki fejl ődéshez történ ő huszonnyolcadik hozzáigazításá ­
ról, HL L 225., 2001.8.21., 1. o.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, 1-4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
1. függelék  
Fogalommeghatározások  
Pontosság:  A vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referen ­
ciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének muta ­
tója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést 
gyakran használják az „egyezés” megfelel őjeként, amely egy adott vizsgálati 
módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (9).  
Sejtek életképessége:  A sejtpopulációk teljes aktivitását mér ő paraméter (például 
a celluláris mitokondriális dehidrogenázoknak az MTT ([3–(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólium-bromid, tiazolil kék] vitális festéket redukáló képessé ­
ge), amely – a mért végponttól és az alkalmazott vizsgálati tervt ől függően – 
korrelációt mutat az él ő sejtek teljes számával és/vagy életképességével.
 
Egyezés:  A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek teljesítményének 
mutatója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. A kifejezést a pontosság szinonimájaként használják, és a vizsgált vegyi anyagok közül az 
adott módszerrel helyesen a pozitív vagy negatív eredményt adók közé beso ­
rolható vegyi anyagok arányát fejezi ki (9).
 
ET 50 : A marker vegyi anyag meghatározott, állandó koncentrációban történ ő 
alkalmazása esetén a sejt életképességének 50 %-kal való csökkentéséhez szük ­
séges expozíciós id ő meghatározásával becsülhet ő meg, lásd még az IC  50 -et. 
EU CLP (Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. 
december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról):  Az ENSZ által kidolgozott, vegyi anyagok (anyagok és keverékek) 
osztályozásának és címkézésének globálisan harmonizált rendszerét (GHS) az 
Európai Unióban (EU) végrehajtó rendelet (3).  
GHS (az ENSZ által kidolgozott, vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének 
globálisan harmonizált rendszere):  Anyagoknak és keverékeknek a fizikai, 
egészségi és környezeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelel ő kommunikációs elemekkel (például piktog ­
ramokkal, figyelmeztetésekkel, figyelmeztet ő mondatokkal, óvintézkedésekre 
vonatkozó mondatokkal és biztonsági adatlapokkal) történ ő jelölésére javaslatokat 
megfogalmazó rendszer, amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkaadók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürg ősségi segélyszolgálatok) és 
a környezet megóvása érdekében egységesítse az anyagok káros hatásaira vonat ­
kozó információk továbbítását (1).
 
IC 50 : Annak a koncentrációnak a meghatározásával becsülhet ő meg, amelynél 
egy adott markeranyag egy meghatározott expozíciós id ő elteltével 50 %-kal 
(IC 50 ) csökkenti a szövetek életképességét; lásd még az ET  50 -et. 
Végtelen dózis:  Az epidermiszen  alkalmazott vizsgált vegyi anyag azon mennyi ­
sége, amely meghaladja az  epidermisz  felszínének teljes és egyenletes befedé ­
séhez szükséges mennyiséget.  
Me-too vizsgálat:  Olyan vizsgálati módszerek köznapi elnevezése, amelyek struk ­
turálisan és funkcionálisan hasonlóak egy hitelesített és elfogadott referenciaként szolgáló vizsgálati módszerhez. Az ilyen vizsgálati módszerek esetében 
megfelelő lehet az úgynevezett „catch-up” (rövidített) hitelesítési eljárás. A 
hasonló vizsgálati módszer szinonimája (9).
 
Teljesítményszabványok:  Hitelesített referencia-módszeren alapuló szabványok, 
amelyek a javasolt, végrehajtás és funkcionalitás szempontjából hasonló vizs ­
gálati módszer összehasonlíthatósági értékelésének alapjául szolgálnak. Ide 
tartoznak: i. a vizsgálati módszer alapvet ő összetev ői; ii. a hitelesített vizsgálati 
módszer elfogadható teljesítményének igazolására alkalmazott vegyi anyagok közül kiválasztott referenciaanyagok minimális listája; valamint iii. a hitelesített vizsgálati módszerrel kapott eredmények alapján az az összehasonlítható szint ű 
pontosság és megbízhatóság, amelyet a javasolt vizsgálati módszernek a referen ­
ciaanyagok minimális listájával történ ő értékeléskor mutatnia kell (9).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referenciaanyagok:  A hitelesítési eljárás során történ ő alkalmazásra kiválasztott 
olyan vegyi anyagok, amelyek esetében már ismert az  in vitro  vagy  in vivo  
referencia-vizsgálatirendszerben vagy vizsgált fajnál adott válaszreakció. Ezeknek a vegyi anyagoknak reprezentatívaknak kell lenniük arra az anyagcsoportra nézve, amely esetében a vizsgálati módszert várhatóan alkalmazni fogják, és 
képviselniük kell azon vegyi anyagokra jellemz ő válaszreakciók teljes tartomá ­
nyát – az er őstől kezdve a gyengén át a negatívig –, amelyek esetében az adott 
referenciaanyag alkalmazható. A hitelesítési eljárás különböz ő szakaszaiban, 
illetve a különböz ő vizsgálati módszerekhez és vizsgálati alkalmazásokhoz a 
referenciaanyagok különböz ő csoportjaira lehet szükség (9).
 
Relevancia:  A vizsgálat és a vizsgált hatás kapcsolatát adja meg, valamint azt, 
hogy van-e a vizsgálatnak az adott cél szempontjából értelme és haszna. Azt tükrözi, hogy a vizsgálat mennyire pontosan méri vagy jelzi el őre a vizsgált 
biológiai hatást. A relevancia meghatározása során a vizsgálati módszer pontos ­
ságát (az eredmények egyezését) kell figyelembe venni (9).
 
Megbízhatóság:  Azonos protokoll szerint végzett vizsgálati módszer laboratóri ­
umon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóságának mérésére szolgál. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámítá ­
sával állapítják meg (9).
 
Helyettesít ő vizsgálat:  Olyan vizsgálat, amelynek célja, hogy a veszélyek 
azonosítására és/vagy kockázatértékelésre rutinszer űen alkalmazott és elfogadott 
vizsgálatot helyettesítse, és amelyr ől megállapították, hogy az elfogadott vizs ­
gálattal összehasonlítva, az összes lehetséges vizsgálati helyzetben és vegyi 
anyag esetében a humán vagy állati egészség egyenérték ű vagy jobb védelmét 
biztosítja (9).  
Érzékenység:  A vizsgálat elvégzésével helyesen besorolt összes pozitív/aktív 
vizsgált vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek rele ­
vanciájának megítélésében (9).
 
Bőrirritáció:  A vizsgált vegyi anyag alkalmazását követ ően 4 órán belül 
megjelenő, visszafordítható b őrkárosodás. A b őrirritáció helyileg jelentkez ő, 
nem immunogén reakció, amely röviddel a stimuláció után megjelenik (29). F ő 
jellemzője, hogy gyulladásos reakciókkal és gyulladásos folyamat által okozott 
irritáció klinikailag jellemz ő jeleinek többségével (b őrpír, ödéma, viszketés és 
fájdalom) kísért, visszafordítható folyamat.  
Specificitás:  A vizsgálat elvégzésével helyesen besorolt összes negatív/inaktív 
vizsgált vegyi anyag aránya. A kategorikus eredményt adó vizsgálati módszerek 
pontosságának mutatója, valamint fontos szempont a vizsgálati módszerek rele ­
vanciájának megítélésében (9).  
Többszint ű vizsgálati stratégia:  Egymás után következ ő vizsgálati módszereket 
alkalmazó vizsgálat; az egyes egymást követ ő szinteken választandó vizsgálati 
módszerekr ől a vizsgálat el őző szintjén kapott eredmények alapján kell dönteni (9).  
Vizsgált vegyi anyag (más néven vizsgált anyag):  Bármely anyag vagy keverék, 
amelyet ezzel a vizsgálati módszerrel vizsgálnak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
2. függelék  
Teljesítményszabványok a javasolt hasonló vagy módosított,  IN VITRO  
rekonstruált emberi felhámmodellen végzett b őrirritációs vizsgálatok 
értékeléséhez  
BEVEZETÉS  
1. A teljesítményszabványok (PS) célja annak ismertetése, hogy milyen alapon 
lehet egy új vizsgálati módszerr ől – akár védett (például szerz ői joggal 
védett, védjeggyel ellátott, bejegyzett), akár nem védett módszerr ől – 
megállapítani, hogy adott vizsgálati célokra kell ő pontossággal és megbíz ­
hatósággal rendelkezik. Ezek a hitelesített és elfogadott vizsgálati módsze ­
reken alapuló teljesítményszabványok a hasonló tudományos elvekre és 
mérésre épül ő, illetve azonos biológiai vagy toxikus hatást el őrevetítő 
módszerek (köznapi elnevezéssel „mee-too” vizsgálatok) megbízhatósá ­
gának és pontosságának értékelésére alkalmazhatók (9).  
2. A módosított módszerek (például tervezett esetleges javítás egy jóváhagyott 
módszeren) alkalmazása el őtt értékelést kell végezni annak meghatározá ­
sára, hogy a tervezett változtatások milyen hatást gyakorolnak a vizsgálat teljesítményére, és milyen mértékben befolyásolják a hitelesítési folyamat egyéb összetev őiről rendelkezésre álló információkat. A tervezett változta ­
tások számától és jellegét ől, valamint a változtatásokra vonatkozóan kelet ­
kezett adatoktól és alátámasztó dokumentációtól függ ően ezeket vagy az új 
vizsgálatokra el őírtakkal megegyez ő hitelesítési eljárásnak, vagy – ameny ­
nyiben ez lehetséges – a megállapított teljesítményszabványban foglalt 
korlátozott megbízhatósági és relevanciaértékelésnek kell alávetni (9).
 
3. A három hitelesített módszer (EpiSkin  TM [hitelesített referencia-módszer – 
VRM], EpiDerm  TM SIT [EPI-200] és SkinEthic  TM RHE) bármelyikének 
hasonló („me-too”) vagy módosított, e vizsgálati módszerben alkalmazásra javasolt változatát a megbízhatóság és pontosság meghatározása érdekében 
a Draize-féle irritációs pontértékek teljes tartományát képvisel ő anyagok 
felhasználásával kell értékelni. A teljesítményszabvány húsz javasolt refe ­
renciaanyagának (1. táblázat) felhasználásával történ ő értékelés során a java ­
solt hasonló vagy módosított eljárás által elért megbízhatósági és pontossági 
értékeknek hasonlónak kell vagy jobbnak kell lenniük a hitelesített 
referencia-módszer (VRM) ugyanezen értékeinél (2. táblázat) (2) (16). Az elérendő pontossági és megbízhatósági értékek a függelék 8–12. bekezdé ­
sében találhatók. A függelékben különféle kémiai osztályokat képvisel ő 
besorolás nélküli (az ENSZ GHS/EU CLP szerint kategória nélküli) és 
besorolással rendelkez ő (az ENSZ GHS/EU CLP szerinti 2. kategóriába 
tartozó) (1) kémiai anyagokat tüntettek fel, hogy a javasolt vizsgálati módszer és a hitelesített referencia-módszer megbízhatóságát és pontosságát 
(érzékenység, specificitás és összesített pontosság) össze lehessen hasonlí ­
tani. Új vegyi anyagok vizsgálatára történ ő alkalmazását megel őzően a vizs­
gálati módszer megbízhatóságát, valamint az ENSZ GHS/EU CLP szerinti 2. kategóriába tartozó irritatív hatású anyagok, illetve – az adatszolgáltatást 
igénylő szabályozási kerett ől függően – az ENSZ GHS/EU CLP szerinti 
kategória nélküli anyagok helyes azonosítására való képességét is bizonyí ­
tani kell.
 
4. Ezek a teljesítményszabványok az EC-ECVAM teljesítményszabványon 
alapulnak (8), és ezeket az osztályozásra és címkézésre vonatkozó ENSZ 
GHS és EU CLP rendszer szerint aktualizálták (1) (3). Az eredeti teljesít ­
ményszabványt a hitelesítési vizsgálat (21) elvégzése után határozták meg, a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó 
törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítésér ől szóló 
67/548/EGK tanácsi irányelvnek a m űszaki fejlődéshez történ ő huszonnyol ­
cadik hozzáigazításáról szóló, 2001. augusztus 6-i 2001/59/EK bizottsági irányelvben (
 1 ) rögzített uniós osztályozási rendszer alapján. Mivel a hite ­
lesítési vizsgálat befejezése és az e vizsgálati módszer elkészítése közötti  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) HL L 225., 2001.8.21., 1. o.
 időszakban az EU átvette (EU CLP) az ENSZ osztályozásra és címkézésre 
vonatkozó GHS rendszerét (3), a teljesítményszabványt aktualizálták (8). Ez 
az aktualizálás f őként i. a teljesítményszabványban foglalt referencia ­
anyagok körét, valamint ii.a meghatározott megbízhatósági és pontossági értékeket érint ő változásokat jelent (2) (23).
 
REKONSTRUÁLT EMBERI FELHÁMMODELLEN VÉGZETT IN VITRO 
BŐRIRRITÁCIÓS VIZSGÁLATOK TELJESÍTMÉNYSZABVÁNYA  
5. A teljesítményszabvány a következ ő három elemet foglalja magában (9):  
I. A vizsgálati módszer alapvet ő összetev ői 
II. A referenciaanyagok minimális listája  
III. A megbízhatóság és a pontosság meghatározott értékei  
I. A vizsgálati módszer alapvet ő összetev ői 
6. Ezek egy adott hitelesített módszer azon elengedhetetlen szerkezeti, funkci ­
onális és procedurális elemeit jelentik, amelyeket a javasolt, technikailag és 
funkcionálisan hasonló vagy módosított módszer protokolljának tartal ­
maznia kell. Ezen összetev ők közé tartoznak a módszer egyedi jellemz ői, 
döntő fontosságú procedurális részletei, valamint a min őség-ellenőrzési 
lépések. A vizsgálati módszer alapvet ő elemeinek betartása el ősegíti 
annak biztosítását, hogy a javasolt hasonló vagy módosított módszer ugyan ­
azokon az elveken alapuljon, mint a vonatkozó hitelesített referencia-módszer (9). A vizsgálati módszer alapvet ő összetev őinek rész ­
letes ismertetése a vizsgálati módszer leírásának 16–21. bekezdésében talál ­
ható, és a vizsgálatot a következ ők szerint kell végezni:
 
— Általános feltételek (16. bekezdés)  
— Funkcionális feltételek, többek között:  
— életképesség (17. bekezdés),  
— barrierfunkció (18. bekezdés),  
— morfológia (19. bekezdés),  
— reprodukálhatóság (20. bekezdés), valamint  
— minőség-ellenőrzés (21. bekezdés).  
II. A referenciaanyagok minimális listája  
7. Referenciaanyagokat kell alkalmazni annak megállapítására, hogy a hite ­
lesített referencia-módszerekhez szerkezetileg és funkcionálisan igazoltan hasonló, vagy a három hitelesített módszer egyikének kisebb módosítását képviselő javasolt módszer megbízhatósága és pontossága hasonló vagy 
jobb eredményeket mutat, mint a hitelesített referencia-módszeré (2) (8) 
(16) (23). Az 1. táblázatban felsorolt 20 ajánlott referenciaanyag között különböző kémiai osztályokat képvisel ő anyagok (vagyis a funkcionális 
csoportok alapján meghatározott kémiai osztályok) találhatók, amelyek 
a Draize-féle irritációs pontértékek teljes tartományát lefedik (a nem irritá ­
lótól az er ősen irritálóig). A listán szerepl ő vegyi anyagok közül 10 tartozik 
az ENSZ GHS/EU CLP szerinti 2. kategóriába, 10 anyag pedig nincs kate ­
góriába sorolva, amelyek közül 3 az ENSZ GHS szerinti opcionális 3. 
kategóriába tartozik. E vizsgálati módszer szerint az opcionális 
3. kategóriába tartozó anyagok „kategória nélkülinek” min ősülnek.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
Az 1. táblázatban felsorolt vegyi anyagokat a hitelesített referencia-módszer 
előhitelesítést követ ő optimalizációs fázisában és hitelesítési vizsgálata során 
alkalmazott anyagok közül választott ák ki, figyelembe véve a kémiai funk ­
ciót és a halmazállapotot (14) (18). Ezek a referenciaanyagok képezik azon anyagok minimális számát, amelyeket egy javasolt hasonló vagy módosított 
módszer pontosságának és megbízhatóságának értékeléséhez fel kell hasz ­
nálni, új módszerek kifejlesztéséhez azonban nem szabad alkalmazni. Olyan esetekben, amikor a listában szerepl ő anyagok egyike nem hozzáférhet ő, 
alkalmazható más olyan anyag, amelyre vonatkozóan megfelel ő in vivo  
referenciaadatok állnak rendelkezésre, és amelyet els ősorban a hitelesített 
referencia-módszer el őhitelesítését követ ő optimalizációs szakaszban vagy a 
hitelesítési vizsgálat során alkalmazott anyagok közül kell kiválasztani. Szükség esetén a javasolt vizsgálati módszer pontosságának további értéke ­
léséhez a referenciaanyagok minimális listája kiegészíthet ő más kémiai 
osztályba tartozó és megfelel ő in vivo  referenciaadatokkal rendelkez ő 
további anyagokkal.
 
1. táblázat  
A hasonló vagy módosított, rekonstruált emberi felhámon (epidermisz) végzett b őrirritációs vizsgálati módszerek 
pontossági és megbízhatósági értékeinek meghatározásához alkalmazandó referenciaanyagok minimális listája  ( 1 ) 
Vegyi anyag CAS-szám Halmazállapot  In vivo  eredmény VRM  in vitro  
kategória ENSZ GHS/EU CLP  
in vivo  kategória  
1-bróm-4-klórbután 6940-78-9 folyadék 0 2. kat. kategória nélküli 
dietilftalát 84-66-2 folyadék 0 kategória 
nélküli kategória nélküli 
naftalin-ecetsav 86-87-3 szilárd 0 kategória 
nélküli kategória nélküli 
allil-fenoxi-acetát 7493-74-5 folyadék 0,3 kategória 
nélküli kategória nélküli 
izopropanol 67-63-0 folyadék 0,3 kategória 
nélküli kategória nélküli 
4-metil-tio-benzaldehid 3446-89-7 folyadék 1 2. kat. kategória nélküli 
metil-sztearát 112-61-8 szilárd 1 kategória 
nélküli kategória nélküli 
heptil-butirát 5870-93-9 folyadék 1,7 kategória 
nélküli kategória nélküli 
hexil-szalicilát 6259-76-3 folyadék 2 kategória 
nélküli kategória nélküli 
Cinnamaldehid 104-55-2 folyadék 2 2. kat. 2 kategória nélküli  
(opcionális 3. 
kategória)  ( 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1 folyadék 2,3 2. kat. 2. kat.  
ciklámen-aldehid 103-95-7 folyadék 2,3 2. kat. 2. kat. 
1-brómhexán 111-25-1 folyadék 2,7 2. kat. 2. kat. 
2-klórmetil-3,5-dimetil-4- 
metoxipiridin-hidroklorid 86604-75-3 szilárd 2,7 2. kat. 2 2. kat.2  
di-n-propil-diszulfid  ( 2 ) 629-19-6 folyadék 3 kategória 
nélküli 2. kat.  
kálium-hidroxid (5 %-os 
vizes oldat) 1310-58-3 folyadék 3 2. kat. 2. kat. 
benzoltiol, 5-(1,1-dimetil- 
etil)-2-metil 7340-90-1 folyadék 3,3 2. kat. 2. kat. 
1-metil-3-fenil-1-piperazin 5271-27-2 szilárd 3,3 2. kat. 2. kat.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Vegyi anyag CAS-szám Halmazállapot  In vivo  eredmény VRM  in vitro  
kategória ENSZ GHS/EU CLP  
in vivo  kategória  
Heptanal 111-71-7 folyadék 3,4 2. kat. 2. kat. 
Tetraklóretilén 127-18-4 folyadék 4 2. kat. 2. kat.  
( 1 ) A vegyi anyagok kiválasztása a következ ő kritériumokon alapul: i. az anyag kereskedelmi forgalomban kapható; ii. képviseli 
a Draize-féle b őrirritációs pontértékek teljes tartományát (a nem irritálótól az er ősen irritálóig); iii. jól meghatározott kémiai 
szerkezettel rendelkezik; iv. reprezentatív a hitelesítési folyamat során alkalmazott kémiai funkcionalitás tekintetében; és v.  nem 
rendelkezik rendkívül toxikus profillal (például karcinogén hatással vagy reproduktív toxicitással), valamint ártalmatlanítása nem jár 
problémát jelent ő költségekkel. 
( 2 ) Nyulaknál irritáló hatású vegyi anyagoknak számítanak, emberekre azonban megbízható bizonyítékok alapján nincs irritáló hatás uk 
(31) (32) (33). 
( 3 ) Az ENSZ GHS szerint, az EU CLP szabványban nem szerepel.  
III. A megbízhatóság és a pontosság meghatározott értékei  
8. A laboratóriumok között átadni kívánt javasolt hasonló vagy módosított 
módszerek megbízhatóságának és relevanciájának megállapításához az 1. 
táblázatban szerepl ő mind a 20 referenciaanyagot legalább három laborató ­
riumban kell vizsgálni. Ha azonban a javasolt módszert csak egy laborató ­
riumban kívánják alkalmazni, akkor a hitelesítéshez nem szükséges a több laboratóriumban végzett tesztelés. Elengedhetetlenül fontos azonban, hogy 
ezeket a hitelesítési vizsgálatokat nemzetközileg elismert, hitelesítéssel 
foglalkozó testületek a nemzetközi irányelvekkel összhangban függetlenül értékeljék (9). Mindegyik laboratóriumban 20 referenciaanyagot kell vizs ­
gálni különböz ő szövettételekkel végzett három független menetben, 
megfelelő időt hagyva az egyes menetek között. Mindegyik menetnek 
legalább három, párhuzamos szövetmintapéldány vizsgálatát kell magában foglalnia a listában szerepl ő egyes vegyi anyagok, negatív kontroll és 
pozitív kontroll alkalmazásával.
 
9. A javasolt módszer megbízhatósági és pontossági értékeinek kiszámítását az 
alábbi négy kritérium együttes figyelembevételével kell végezni, biztosítva, hogy a megbízhatóságot és a relevanciát jellemz ő értékek el őre meghatá ­
rozott és következetes módon kerüljenek kiszámításra:
 
1. Csak olyan vizsgálatmenetek adatai vonhatók be a módszer laboratóri ­
umon belüli és laboratóriumok közötti variabilitásának és prediktív érté ­
kének (pontosságának) kiszámításába, amelyek esetében a teljes vizs ­
gálatsor lezajlott.  
2. Az egyes referenciaanyagok végleges besorolását mindegyik laboratóri ­
umban egy teljes vizsgálatsor különböz ő vizsgálataiban megfigyelt élet ­
képesség átlagértékének felhasználásával kell meghatározni.  
3. A laboratóriumok közötti variabilitás kiszámítása során csak azokra a 
vegyi anyagokra vonatkozó adatokat szabad figyelembe venni, amelyek 
esetében minden résztvev ő laboratóriumban végrehajtották a teljes vizs ­
gálatsort.  
4. A pontossági értékek kiszámítását a 20 referenciaanyagra vonatkozóan a 
különböző résztvevő laboratóriumokban kapott egyes laboratóriumi beso ­
rolások alapján kell végezni.  
Ebben a szövegösszefüggésben a  vizsgálatsor  adott vizsgált vegyi anyaggal 
egy laboratórium által elvégzett három független vizsgálatmenetet jelent. A  
teljes vizsgálatsor  egy adott vizsgált vegyi anyaggal egyetlen laboratórium 
által végzett olyan vizsgálatsort jelent, amelyben mindhárom vizsgálat érvé ­
nyes. Ez azt jelenti, hogy egyetlen érvénytelen vizsgálatmenet érvénytelenné 
teszi a három vizsgálatmenetb ől álló sorozat egészét.  
Laboratóriumon belüli reprodukálhatóság  
10. A laboratóriumon belüli reprodukálhatóság vizsgálata során a húsz referen ­
ciaanyag egyetlen laboratóriumban történ ő, egymástól független, különböz ő 
vizsgálatmenetei során kapott besorolási eredményeknek (ENSZ GHS/EU 
CLP szerinti 2. kategória vagy kategória nélküli) legalább ( ≥) 90 %-os 
egyezést kell mutatniuk.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Laboratóriumok közötti reprodukálhatóság  
11. A laboratóriumok közötti reprodukálhatóság vizsgálata nem feltétlenül szük ­
séges, amennyiben a javasolt vizsgálati módszer csak egy laboratóriumban 
kerül alkalmazásra. A laboratóriumok között átadásra kerül ő módszerek 
esetében a húsz referenciaanyag lehet őleg legalább három laboratóriumban 
történő, egymástól független, különböz ő vizsgálatmenetei során kapott beso ­
rolási eredményeknek (ENSZ GHS/EU CLP szerinti 2. kategória vagy kate ­
gória nélküli) legalább ( ≥) 80 %-os egyezést kell mutatniuk.  
Prediktív érték (pontosság)  
12. A javasolt hasonló vagy módosított módszer pontosságának (érzékenységének, 
specificitásának és összesített pontosságának) a hitelesített referencia-módszer 
pontosságához hasonlónak, vagy annál jobbnak kell lennie, figyelembe véve a 
vizsgált faj esetében a relevanciára vonatkozó kiegészít ő információkat is (2. 
táblázat). Az érzékenységnek legalább ( ≥) 80 %-osnak kell lennie (2) (8) (23). 
Van azonban egy további specifikus el őírás az  in vitro  módszer érzékenységére 
vonatkozóan, amely szerint az  in vivo  2. kategóriába tartozó kémiai anyagok 
közül csak az  1-dekanol t és a  di-n-propil-diszulfid ot sorolhatja be egynél több 
laboratórium tévesen a kategória nélküli csoportba. A specificitásnak legalább (≥) 70 %-osnak kell lennie (2) (8) (23). A javasolt  in vitro  módszer specificitá ­
sára vonatkozóan nincs további el őírás, vagyis bármely résztvev ő laboratórium 
bármelyik  in vivo  kategória nélküli kémiai anyagot besorolhatja tévesen, feltéve, 
hogy a vizsgálati módszer végleges specificitása az elfogadható tartományon 
belül marad. Az összesített pontosságnak legalább ( ≥) 75 %-osnak kell lennie 
(2) (8) (23). Bár a hitelesített referencia-módszer 1. táblázatban szerepl ő 20 
referenciaanyagra vonatkozóan számított érzékenysége 90 %-os, a hasonló vagy módosított módszerek esetében az érvényesnek min ősülő előírt minimális 
érzékenységi érték 80 %, mivel az  1-dekanolról  (határértéken lév ő anyag) és a  
di-n-propil-diszulfidról  (a hitelesített referencia-módszerrel álnegatív eredményt 
adó anyag) egyaránt ismert, hogy embernél nincs irritáló hatásuk (31) (32) (33), ugyanakkor nyúlon végzett vizsgálatok során irritáló hatásúnak bizonyulnak. 
Mivel az RhE-modelleket humán eredet ű sejtekből építik fel, el őfordulhat, hogy 
azok e vegyi anyagok esetében nem jelezik el őre az irritáló hatást (ENSZ 
GHS/EU CLP szerinti, kategória nélküli besorolás).
 
2. táblázat  
A hasonló vagy módosított módszerek hitelesítéséhez el őírt prediktív szenzitivitásra, 
specificitásra és összesített pontosságra vonatkozó értékek  
Szenzitivitás Specificitás Összesített pontosság  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
A vizsgálat elfogadási kritériumai  
13. Lehetséges, hogy egy vagy több vizsgált vegyi anyaggal végzett egy vagy 
több vizsgálat az adott vizsgált anyag, illetve a kontrollanyagok tekintetében 
nem felel meg az elfogadási kritériumoknak, vagy a vizsgálat más okból nem fogadható el. A hiányzó adatok pótlása érdekében mindegyik vizsgált vegyi anyag esetében legfeljebb két további vizsgálat („ismétlés”) fogadható 
el. Pontosabban, mivel a vizsgálat ismétlésekor is kell párhuzamos pozitív 
és negatív kontrollt vizsgálni, minden vizsgált vegyi anyagesetében legfel ­
jebb két további vizsgálatmenet végezhet ő.
 
14. Elképzelhet ő, hogy a vizsgálat megismétlése után sem sikerül minden részt ­
vevő laboratóriumban elvégezni minden referenciaanyag esetében a legalább 
három érvényes vizsgálatmenetet, ami hiányos adatmátrixot eredményez. Ilyen esetekben a következ ő három kritériumnak kell eleget tenni ahhoz, 
hogy az adatkészleteket elfogadhatónak lehessen tekinteni:
 
1. Mind a 20 referenciaanyagnál lennie kell legalább egy teljes vizsgálat ­
sornak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. Az egyes résztvev ő laboratóriumokban a vizsgálatmenetek legalább 
85 %-ának hiánytalannak kell lennie (a 20 anyag esetében ez azt jelenti, 
hogy egyetlen laboratóriumban 3 érvénytelen vizsgálatsor megengedett).  
3. Legalább három laboratóriumban az összes lehetséges vizsgálatmenet 
legalább 90 %-ának hiánytalannak kell lennie (ez 3 laboratóriumban vizsgált 20 anyag esetében azt jelenti, hogy összesen 6 érvénytelen vizs ­
gálatsor megengedett).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B.47.  SZARVASMARHA-SZARUHÁRTYA OPACITÁSÁNAK ÉS 
PERMEABILITÁSÁNAK MÉRÉSÉN ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZER A SZEMKORRÓZIÓT ÉS A SÚLYOS SZEMIRRITÁ ­
CIÓT OKOZÓ ANYAGOK AZONOSÍTÁSÁRA
 
BEVEZETÉS  
1. A szarvasmarha-szaruhártya opacitásának és permeabilitásának mérésén 
alapuló vizsgálati módszer (a továbbiakban: BCOP vizsgálat) olyan  in 
vitro vizsgálati módszer, amely bizonyos körülmények között és bizonyos 
korlátok mellett felhasználható anyagok és vegyületek „szemkorróziót és 
súlyos szemirritációt okozóként” történ ő besorolására (1) (2) (3). E vizs ­
gálati módszer alkalmazásában súlyos szemirritációt okozó anyagok azok az anyagok, amelyek a nyulak esetében a felvitelt követ ően legalább 21 
napon át tartó szemléziókat okoznak. Noha a vizsgálat nem váltja ki teljes 
mértékben a nyulakon végzett  in vivo  szemvizsgálatot, a BCOP vizsgálat 
alkalmazása a szabályozói követelmények szerinti besorolás és címkézés egy adott alkalmazási területen történ ő meghatározására szolgáló, több ­
szintű vizsgálati stratégia részeként ajánlott (4) (5). A vizsgált anyagok 
és keverékek (6) nyulakon végzett további vizsgálatok nélkül „szemkorró ­
ziót vagy súlyos szemirritációt okozó” besorolást kaphatnak. Azokat az anyagokat, amelyek vizsgálata negatív eredményt adott, az OECD 405. 
vizsgálati iránymutatásában (e melléklet B.5. fejezete) (7) leírtak szerint 
lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával nyulakon végzett további 
vizsgálatoknak kell alávetni.
 
2. E vizsgálati módszer célja a vizsgált anyag szemkorróziót vagy súlyos 
szemirritációt okozó esetleges hatásának kimutatása annak alapján, hogy 
izolált szarvasmarha-szaruhártyában milyen mértékben vált ki opacitást és fokozott permeabilitást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellem ­
zése (i) a csökkent fényátbocsátás (opacitás) és (ii) a fluoreszcein-nátrium 
festékanyag fokozott áthatolása (permeabilitás) mérésével történik. A 
szaruhártya vizsgált anyagnak való expozícióját követ ően megállapítható 
opacitásból és permeabilitásból együttesen származtatjuk az ún. in  vitro  
irritációs pontszámot (In Vitro Irritancy Score, a továbbiakban: IVIS), 
amely a vizsgált anyag irritáció szempontjából való osztályba sorolására 
szolgál.
 
3. A BCOP vizsgálattal 21 napnál rövidebb id ő alatt gyógyuló szemléziókat 
kiváltó szemirritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagokat is vizs ­
gáltak. Az ezekbe a kategóriákba tartozó anyagok tekintetében azonban 
nem történt meg a BCOP vizsgálat pontosságának és megbízhatóságának formális értékelése.
 
4. A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
5. E vizsgálati módszer alapja az alternatív módszerek validálásával foglal ­
kozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) BCOP vizsgálati 
protokollja (8), amelynek kidolgozása az alternatív módszerek validálá ­
sával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM) rész ­
vételével végrehajtott nemzetközi validációs vizsgálat (4) (5) (9) alapján 
történt. A protokoll alapját az In Vitro Tudományok Intézetét ől (IIVS) 
kapott adatok, illetve az INVITTOX 124. protokoll (10) képezi; ez a protokoll szolgált a BCOP vizsgálat Európai Közösség által finanszírozott, 1997–1998-ban elvégzett el ővalidációjának protokolljaként. Mindkét 
protokoll alapja az a BCOP vizsgálati módszer, amelyr ől elsőként Gaut ­
heron et al. (11) számolt be.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. A vizsgálati módszer azonosított korlátai a validációs adatbázisban az 
alkoholok és a ketonok esetében tapasztalt nagy hamis pozitív arányokon 
és a szilárd anyagok esetében tapasztalt nagy hamis negatív arányon alapulnak (lásd a 44. pontot) (5). Ha az említett kémiai és fizikai osztá ­
lyokba tartozó anyagokat kizárjuk az adatbázisból, akkor a BCOP vizs ­
gálat pontossága az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerében egya ­
ránt jelent ősen javul (5). A vizsgálat célját (azaz kizárólag a szemkorró ­
ziót, illetve súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása) is figyelembe véve a hamis negatív arányok jelent ősége nem kritikus, hiszen az érintett 
anyagokat a szabályozói követelményekt ől függően – az adatok bizonyító 
erejének mérlegelésével, lépcs őzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával – 
később nyulakon vagy más, megfelel ően validált  in vitro  vizsgálatokkal is 
megvizsgálják. Emellett a jelenleg rendelkezésre álló validációs adatbázis 
nem teszi lehet ővé egyes kémiai osztályok vagy termékcsoportok (például 
a keverékek) megfelel ő értékelését. A vizsgálat végrehajtója azonban a 
vizsgálati módszer alkalmazását valamennyi típusú vizsgálandó anyag esetében (beleértve a keverékeket is) fontolóra veheti, a pozitív eredmény 
ugyanis ilyenkor is elfogadható lehet a szemkorrózió, illetve a súlyosan 
irritatív hatás jelzésére. Az alkoholok és a ketonok esetében azonban a kapott pozitív eredményeket a túlzó el őrejelzés kockázata miatt óvatosan 
kell értelmezni.
 
7. A szarvasmarhaszemmel és a szarvasmarha-szaruhártyával végzett vala ­
mennyi eljárás során be kell tartani a vizsgáló intézménynek az állati eredetű anyagok – ideértve többek között a szöveteket és a szöveti folya ­
dékokat – kezelésére vonatkozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott 
továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (12).
 
8. A vizsgálati módszernek korlátja, hogy noha figyelembe vesz egyes 
szemre gyakorolt, a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban elemzett hatásokat, illetve bizonyos fokig azok súlyosságát is, nem veszi figye ­
lembe a köt őhártya- és az íriszsérüléseket. Másrészr ől, noha maga a 
BCOP vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatósá ­
gának értékelésére, a nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban javasolták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan és a visszafordítható hatások 
megkülönböztetésére (13). Végezetül a BCOP vizsgálat nem alkalmas a 
szembe kerülés következtében fellép ő szisztémás toxicitási potenciál 
megítélésére.
 
9. Továbbra is folyik a munka a BCOP vizsgálat nem súlyos irritációt okozó, 
illetve irritációt nem okozó anyagok azonosítására való használhatósága, valamint korlátai részletesebb leírása érdekében (lásd még a 45. pontot is). 
A felhasználókat bátorítjuk arra, hogy mintáikat és/vagy adataikat küldjék 
meg a validáló szervezeteknek, ezzel ugyanis segíthetik a BCOP vizsgálat jövőbeli felhasználásainak (ideértve a nem súlyos irritációt okozó, illetve 
az irritációt nem okozó anyagok azonosítását is) formális értékelését.
 
10. Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot el őször alkalmazza, a 
2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségér ől. Mielőtt a laboratórium a BCOP vizsgálat 
adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi besorolás 
céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonst ­
rálhatja a BCOP vizsgálat elvégzésében való jártasságát.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
11. A BCOP vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon  in 
vitro  fenntartja a szarvasmarhák izolált szaruhártyájának normál fiziológiai 
és biokémiai m űködését. A módszerrel a vizsgált anyag által okozott 
károsodás jellemzése a szaruhártya opacitásváltozásának opaciméterrel, 
illetőleg permeabilitásváltozásának látható fényes fényspektroszkópiával 
való kvantitatív mérése útján történik. A két mérés alapján számítjuk az IVIS értékét, amely a vizsgált anyag  in vivo  szemirritációs hatásának 
előrejelzését megalapozó  in vitro  veszélyességi besorolási kategória 
megállapítására szolgál (lásd a döntési kritériumokat).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. A BCOP vizsgálat frissen levágott szarvasmarhából izolált szaruhártyákat 
használ fel. A szaruhártya opacitásának mérése kvantitatív módon, a szaru ­
hártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével történik. A permeabi ­
litás mérése ugyancsak kvantitatív módon, a szaruhártya teljes vastagságán áthatoló és a hátsó kamrában található közegben kimutatható 
fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérésével történik. A 
vizsgált anyagoknak a szaruhártya felhámjának felületére történ ő felvitele 
a szaruhártyatartó elüls ő kamrájába történ ő bevitellel történik. A 3. 
függelék tartalmazza a BCOP vizsgálatban felhasznált szaruhártyatartó 
leírását és ábráját. A szaruhártyatartó a kereskedelmi forgalomban külön ­
féle forrásokból beszerezhet ő, vagy saját használatra megépíthet ő.
 
A szarvasmarhaszemek származása és életkora, az állatfaj kiválasz ­
tása 
13. A vágóhídon a szarvasmarhákat rendszerint emberi fogyasztás céljából 
vagy más kereskedelmi célokból ölik le. A BCOP vizsgálat céljára felhasz ­
nálandó szaruhártyák csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre 
alkalmas, egészséges állatokból vehet ők. Mivel a szarvasmarhák tömege 
fajtától, életkortól és nemt ől függőn jelentős mértékben eltérhet, a vágásra 
kerülő állatok tekintetében nincs ajánlott tömeg.  
14. Különböz ő életkorú állatokból származó szemek esetén a szaruhártya 
mérete változó lehet. A 30,5 mm vízszintes átmér őt meghaladó és legalább 
1 100 μm középponti vastagságú szaruhártyák általában nyolcévesnél 
idősebb, a 28,5 mm átmér ő és 900 μm középponti vastagság alatti szaru ­
hártyák általában ötévesnél fiatalabb szarvasmarhából származnak (14). 
Emiatt nem szokás 60 hónaposnál id ősebb szarvasmarhákból származó 
szaruhártyákat felhasználni. Hagyományosan nem szokás 12 hónaposnál fiatalabb szarvasmarhákból származó szemeket sem felhasználni, mivel 
ebben az életkorban a szemek még fejl ődésben vannak, és a szaruhártya 
vastagsága és átmér ője lényegesen kisebb a kifejlett szarvasmarhából szár ­
mazó szaruhártyákon mért értékeknél. El őnyeikre való tekintettel ugyan ­
akkor megengedhet ő a fiatal (6 és 12 hónap közötti életkorú) állatokból 
származó szaruhártyák használata is, mivel ezek nagyobb mennyiségben állnak rendelkezésre, sz űkebb az életkori tartományuk, és ez esetben 
kisebb a munkavállalóknak a szarvasmarhák szivacsos agyvel őbántalmával 
szembeni kitettsége is (15). Mivel a szaruhártya méretének és vastagsá ­
gának a korróziót és az irritációt okozó anyagokkal szembeni reagálási képességre gyakorolt hatásával kapcsolatban hasznos volna további érté ­
kelést végezni, a felhasználókat bátorítjuk arra, hogy számoljanak be a 
vizsgálataikban felhasznált szaruhártyákat adó állatok becsült életkoráról 
és/vagy tömegér ől.
 
A szemek begy űjtése és beszállítása a laboratóriumba  
15. A szemeket a vágóhíd alkalmazottai gy űjtik be. A mechanikai és egyéb 
károsodásnak a lehet ő legkisebb mérték űre való csökkentése érdekében a 
szemeket a halál bekövetkezése után mihamarabb ki kell venni. A szemek potenciálisan irritatív anyagokkal szembeni expozíciójának megel őzése 
érdekében a vágóhíd alkalmazottai az állat fejének leöblítésekor mosószert 
nem használhatnak.
 
16. A szemeket megfelel ő méretű edénybe öntött Hank-féle sóoldatba (HBBS- 
oldat) kell helyezni oly módon, hogy az oldat a szemeket teljesen befedje, 
és a laboratóriumba oly módon kell beszállítani, hogy a lehet ő legkisebb 
legyen a károsodás és/vagy a bakteriális fert őzés esélye. Mivel a begy űjtés 
a vágás során történik, a szemek vérrel és más biológiai anyagokkal – 
ideértve a baktériumokat és más mikroorganizmusokat is – érintkezhetnek. 
Ezért fontos annak biztosítása, hogy a kontamináció veszélye a lehet ő 
legkisebb legyen (például a szemeket tartalmazó edény jégen tárolásával, a szemek szállítás közbeni tárolására használt HBSS-oldathoz antibioti ­
kumok [például penicillin 100 IU/ml és streptomicin 100 mg/ml koncent ­
rációban] hozzáadásával).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. A szemek begy űjtése és a szaruhártyának a BCOP vizsgálatban való 
felhasználása között eltelt id őnek a lehet ő legrövidebbnek kell lennie (a 
begyűjtésnek és a felhasználásnak rendszerint ugyanazon a napon meg kell 
történnie), és igazolni kell, hogy ez az id ő nem befolyásolja a vizsgálat 
eredményeit, azaz a szemek kiválasztási kritériumait, valamint a pozitív és 
a negatív kontrollminták eredményeit. A vizsgálatban felhasznált vala ­
mennyi szemnek egy meghatározott napon begy űjtött szemállományból 
kell származnia.  
A BCOP vizsgálatban felhasznált szemek kiválasztási kritériumai  
18. A szemek épségét a laboratóriumba való beérkezést követ ően gondosan 
meg kell vizsgálni; ennek keretében ellen őrizni kell különösen a fokozott 
opacitást, valamint a karcolások és a rendellenes érburjánzás (neovaszku ­
larizáció) jelenlétét. A vizsgálat céljára csak ép szemekb ől származó szaru ­
hártyák használhatók fel.  
19. Az egyes szaruhártyák min őségét a vizsgálat során kés őbb is kell értékelni. 
A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szaruhártyákat, amelyek opacitása a kezdeti egyórás ekvilibrációs id őszak elteltével hét opacitásegységnél 
nagyobb (MEGJEGYZÉS: az opacimétert az opacitási egységek meghatá ­
rozásához használt opacitásetalonnal kell kalibrálni, lásd a 3. függeléket).
 
20. Minden kezelt csoportnak (a vizsgált anyaggal és a negatív és a pozitív 
kontrollanyaggal kezelt csoportnak egyaránt) legalább három szemb ől kell 
állnia. A BCOP vizsgálatban a negatív kontroll céljára három szaruhártyát kell felhasználni. Mivel a szaruhártyák a teljes szemgolyóból kivágással kerülnek eltávolításra, majd pedig rögzítésre kerülnek a szaruhártyakamrá ­
ban, fennáll annak a veszélye, hogy a különböz ő műveletek befolyásolják 
az egyes szaruhártyák (a negatív kontrollt is ideértve) opacitás- és perme ­
abilitásértékét. Figyelembe veend ő még az is, hogy az IVIS számítása 
során a vizsgált anyaggal és a pozitív kontrollanyaggal kezelt szaruhártyák 
opacitás- és permeabilitásértékeinek korrekciója a negatív kontrollanyaggal 
kezelt szaruhártyák opacitás- és permeabilitásértékeinek felhasználásával történik.
 
ELJÁRÁS  
A szemek el őkészítése  
21. Az ép szaruhártyákat a kés őbbi kezelés el ősegítése érdekében preparáljuk 
úgy, hogy a szaruhártya körül 2–3 mm-es perem maradjon, ügyelve arra, 
hogy a szaruhártya fel- és belhámja ne sérüljön. A preparált szaruhártyákat 
felerősítjük az erre a célra kialakított, a szaruhártya felhámja elé kerül ő 
elülső, illetve belhámja elé kerül ő hátsó kamrából álló szaruhártyatartókra. 
Mindkét kamrát (a hátsó kamrával kezdve) teljesen feltöltjük el őmelegített 
Eagle-féle tápfolyadékkal (Eagle’s Minimum Essential Medium, a továb ­
biakban: EMEM oldat), ügyelve a buborékképz ődés megel őzésére. A 
berendezést ezt követ ően 32 ± 1 °C-on legalább egy órán át ekvilibráljuk 
annak érdekében, hogy a szaruhártyák a közeggel kiegyenlít ődjenek, és 
lehetőség szerint elérjék normális metabolikus aktivitásukat (a szaruhártya 
felületének h őmérséklete  in vivo  32 °C).  
22. Az ekvilibrációs id ő eltelte után mindét kamrát új EMEM oldattal feltölt ­
jük, és minden egyes szaruhártyán leolvassuk a kiindulási opacitásértéket. A vizsgálatból ki kell zárni a makroszkopikus szöveti károsodást (például karcolásokat, elszínez ődést, rendellenes érburjánzást) mutató és a 7-nél 
nagyobb opacitású szaruhártyákat. Kiszámítjuk valamennyi ekvilibrált 
szaruhártya opacitásának számtani közepét. A negatív kontroll céljára legalább három olyan szaruhártyát kell kiválasztani, amelynek opacitása az összes szaruhártyán mért opacitásértékek mediánjának közelében van. A 
megmaradó szaruhártyákat ezt követ ően kezelt csoportra és pozitív kont ­
rollcsoportra osztjuk.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Mivel a víz fajh ője nagyobb, mint a leveg őé, a víz stabilabb h őmérsékleti 
viszonyokat biztosít az inkubáláshoz. Ezért a szaruhártyatartó és tartal ­
mának 32 ± 1 °C h őmérsékleten való tartására vízfürd ő használata ajánlott. 
A hőmérséklet állandóságának biztosítását szolgáló óvintézkedések (pél ­
dául a tartók és a közeg el őmelegítése) mellett azonban használható 
levegős inkubátor is.  
A vizsgált anyag felvitele  
24. Két eltér ő kezelési protokoll használatos, az egyik a folyadékok és a 
szilárd és a folyékony felületaktív anyagok, a másik pedig a nem felület ­
aktív szilárd anyagok esetében.  
25. A folyadékok vizsgálata hígítatlan állapotban, a felületaktív anyagoké 10 
vegyes százalék (m/V) koncentrációban, 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal, 
desztillált vízzel vagy más olyan oldószerrel készített oldatban történik, 
amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra. A félszilárd anyagok, krémek és gyanták vizsgálata rendszerint a folyadékokra vonat ­
kozó protokoll szerint történik. Ha a hígítás koncentrációja ett ől eltérő, 
akkor azt megfelel ően meg kell indokolni. A szaruhártyákat a folyadéknak 
vagy felületaktív anyagnak 10 percig kell kitenni. Ett ől eltérő behatási id ő 
alkalmazását tudományos szempontból megfelel ően meg kell indokolni.
 
26. A nem felületaktív szilárd anyagok vizsgálata 20 % koncentrációban, 
0,9 %-os nátrium-klorid-oldattal, desztillált vízzel vagy más olyan oldó ­
szerrel készült oldat vagy szuszpenzió formájában történik, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra. A szilárd anyagok 
bizonyos körülmények között és megfelel ő tudományos indokolással hígí ­
tatlanul, a szaruhártya felületére a nyitott kamrás módszerrel (lásd a 29. pontot) való közvetlen felvitellel is vizsgálhatók. A szaruhártyát a szilárd anyagnak négy órán át kell kitenni, de a folyadékok és a felületaktív 
anyagok esetéhez hasonlóan – tudományos szempontú megfelel ő indoko­
lással – más behatási id ő is alkalmazható.
 
27. A vizsgált anyag fizikai jellegét ől és kémiai jellemz őitől (pl. szilárd anyag 
vagy folyadék, viszkózus vagy nem viszkózus folyadék) függ ően más 
felviteli módok is alkalmazhatók. A legfontosabb annak biztosítása, hogy 
a vizsgált anyag megfelel ően beborítsa a felhám felületét, valamint hogy 
azt az öblítési lépések során megfelel ően eltávolítsuk. A nem és a kissé 
viszkózus folyadékok esetében rendszerint a zárt kamrás, míg a közepes és 
a nagy viszkozitású folyadékok, illetve a szilárd anyagok esetében rend ­
szerint a nyitott kamrás módszer használatos.  
28. A zárt kamrás módszer esetében az elüls ő kamrába a szaruhártya felhám ­
jának befedéséhez elegend ő mennyiség ű (750 μl) vizsgált anyagot kell a 
kamra tetején található adagolónyílásokon keresztül bevinni, majd az expo ­
zíció idejére a nyílásokat a kamradugaszokkal le kell zárni. Fontos annak biztosítása, hogy valamennyi szaruhártya megfelel ő ideig legyen kitéve a 
vizsgált anyagnak.
 
29. A nyitott kamrás módszer esetében a kezelés el őtt levesszük az elüls ő 
kamra ablakzáró gy űrűjét és az ablaknyílás üvegét. A kontrollanyagot 
vagy a vizsgált anyagot (750 μl vagy a szaruhártya teljes befedéséhez 
szükséges mennyiségben) mikropipettával közvetlenül a szaruhártya felhámjának felületére visszük fel. Ha a vizsgált anyagot nehezen lehet pipettába felszívni, akkor az adagolás megkönnyítésére finnpipettába 
pumpálható. A finnpipetta hegyét behelyezzük a fecskend ő adagolójába, 
hogy az anyagot nyomás alatt lehessen befecskendezni a hegybe. A fecs ­
kendő dugattyúját a pipetta szelepének felfelé húzásával egyidej űleg 
benyomjuk. Ha a pipetta hegyében légbuborékok jelennek meg, a vizs ­
gálati anyagot el kell távolítani (ki kell nyomni) és a m űveletet mindaddig 
ismételni kell, amíg a pipetta hegye légbuborékok nélkül feltelik. Szükség esetén normál fecskend ő is használható (t ű nélkül), mivel ez lehet ővé teszi 
a vizsgált anyag pontos mérését és a szaruhártya felhámjának felületére 
való egyszer ű felvitelét. Az adagolást követ ően a zárt rendszer visszaállí ­
tása érdekében az ablaknyílás üvegét vissza kell szerelni az elüls ő kamrára.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubáció a behatást követ ően 
30. A behatási id ő elteltével a vizsgált anyagot vagy negatív vagy pozitív 
kontrollanyagot kivesszük az elüls ő kamrából, és a felhámot legalább 
háromszor (de legalább a vizsgált anyag látható nyomainak teljes eltávo ­
lításáig) fenolvörös indikátort tartalmazó EMEM oldattal lemossuk. Az öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort tartalmazó közeget használni, 
mert a fenolvörös indikátor színváltozásának megfigyelésével ellen őrizhető 
a savas és a lúgos anyagok leöblítésének eredményessége. A szaruhártyát háromnál többször is le kell mosni, ha a fenolvörös indikátor még mindig elszíneződik (sárgára vagy lilára) vagy ha a vizsgált anyag még mindig 
látható. A közeg vizsgált anyagtól való megtisztítását követ ően a szaruhár ­
tyákat még egyszer le kell mosni EMEM oldattal (mely ekkor fenolvörös indikátort már nem tartalmaz). Az utolsó öblítéshez azért kell fenolvörös indikátort nem tartalmazó EMEM oldatot használni, mert így biztosítható 
az opacitásmérés el őtt a fenolvörös indikátornak az elüls ő kamrából való 
eltávolítása. Ezt követ ően az elüls ő kamrát – fenolvörös indikátor bekeve ­
rése nélkül – ismételten feltöltjük új EMEM oldattal.
 
31. Folyadékok és felületaktív anyagok esetében a szaruhártyákat az öblítést 
követően legalább további két órán át 32 ± 1 °C h őmérsékleten inkubálni 
kell. Bizonyos körülmények között hasznos lehet hosszabb utóinkubációs 
időt alkalmazni, amir ől eseti alapon kell dönteni. A szilárd anyagokkal 
kezelt szaruhártyákat a négyórás behatási id ő végén alaposan le kell öblí ­
teni, utóinkubáció azonban nem szükséges.  
32. Folyadékok és felületaktív anyagok esetében az utóinkubáció végén, nem 
felületaktív szilárd anyagok esetében a négyórás behatási id ő elteltével 
minden egyes szaruhártya opacitását és permeabilitását feljegyezzük. Egyben minden szaruhártyát szemrevételezéssel is megvizsgálunk, és az esetleges észrevételeket (pl. szövetleválás, vizsgált anyag maradéka, egye ­
netlen fényáteresztési minták) feljegyezzük. Ezek a megfigyelések fontosak 
lehetnek, mert befolyásolhatják az opaciméteren leolvasott értékeket.
 
Kontrollanyagok  
33. Minden vizsgálatban párhuzamosan negatív vagy oldószeres/viv őanyagos 
kontrollt és pozitív kontrollt is kell végezni.  
34. Hígítatlan folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem 
jellemző változásainak észlelése és a vizsgálat végpontjaiban figyelembe 
veendő kiindulási értékek meghatározása céljából a BCOP vizsgálatban 
párhuzamos negatív kontrollanyagot (például 0,9 %-os nátrium-klorid oldatot vagy desztillált vizet) kell alkalmazni. A negatív kontrollanyag alkalmazása egyben azt is biztosítja, hogy a vizsgálat körülményei ne 
eredményezzenek tévesen irritatív hatást.
 
35. Hígított folyadékok, felületaktív anyagok és szilárd anyagok vizsgálatakor 
a vizsgálati elrendezés esetleges nem jellemz ő változásainak észlelése és a 
vizsgálat végpontjaiban figyelembe veend ő kiindulási értékek meghatá ­
rozása céljából a BCOP vizsgálatban párhuzamos oldószeres/viv őanyagos 
kontrollt kell alkalmazni. Csak olyan oldószer, illet őleg vivőanyag alkal ­
mazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizsgálatra.  
36. Annak ellen őrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás valóban megfelel ő-e, 
a vizsgálatnak mindig tartalmaznia kell egy ismerten szemirritációt okozó anyaggal végzett párhuzamos pozitív kontrollvizsgálatot is. Mivel a BCOP 
vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok 
azonosítása, a pozitív kontrollanyagnak ideális esetben olyan referencia ­
anyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálatban súlyos hatást vált ki. Annak érdekében azonban, hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkez ő 
hatás időbeli változása is megfigyelhet ő legyen, az irritatív hatás nem lehet 
túlságosan er őteljes.
 
37. Folyékony vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például 
dimetil-formamid vagy 1 %-os nátrium-hidroxid alkalmazható. Szilárd vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például 0,9 %-os 
nátrium-klorid-oldathoz 20 vegyes százalék (m/V) koncentrációban adagolt 
imidazol alkalmazható.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. A referenciaanyagok jól használhatók egy adott vegyianyag- vagy termék ­
osztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának érté ­
kelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.
 
Mért végpontok  
39. Az opacitást a szaruhártyán átbocsátott fény mennyiségének mérésével 
határozzuk meg. A szaruhártya opacitásának kvantitatív mérése opacimé ­
terrel történik, amely a mért opacitásértéket folyamatos skálán mutatja.  
40. A permeabilitás meghatározása a szaruhártya összes sejtrétegén (azaz a 
szaruhártya küls ő felületén a felhámtól a szaruhártya bels ő felületén a 
belhámig) áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének méré ­
sével történik. A szaruhártyatartónak a felhám elé kerül ő elülső kamráját 
1 ml (folyadék vagy felületaktív anyag vizsgálata esetében 4 mg/ml, nem 
felületaktív szilárd anyag vizsgálata esetében 5 mg/ml) fluoreszcein-nátrium-oldattal, a belhám elé kerül ő hátsó kamrát pedig új 
EMEM oldattal feltöltjük. A tartót ezt követ ően vízszintes helyzetben 90 ± 
5 percig 32 ± 1 °C h őmérsékleten inkubáljuk. A hátsó kamrába áthatoló 
fluoreszcein-nátrium mennyiségének mérése ultraibolya- és látható fényes fényspektroszkópiás eljárással történik. Az eljárás keretében folyamatos skálán meg kell határozni és fel kell jegyezni a 490 nm-hez tartozó optikai 
sűrűségek (OD
 490 ) vagy abszorbanciák értékét. A fluoreszceines mérés 
keretében a permeabilitásértékeket a szabványos 1 cm-es fényút alkalma ­
zásával, a látható fényes fényspektroszkópiával mért OD  490 értékek alapján 
kell meghatározni.  
41. Az el őzőekben leírt módszer alternatívájaképpen 96 lyukú 
mikrotiterlemez-olvasó is alkalmazható azzal a feltétellel, hogy (i) a fluo ­
reszceines OD  490 értékek meghatározásához megállapítható a lemezolvasó 
lineáris tartománya, és (ii) a 96 lyukú lemezbe annyi fluoreszceinmintát 
teszünk, amennyi ahhoz szükséges, hogy az így meghatározott OD  490 
értékek megegyezzenek a szabványos 1 cm-es fényúttal mért értékekkel 
(ehhez gyakran teljesen [általában 360 ml-rel] feltöltött lyukak szüksége ­
sek).  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Az adatok kiértékelése  
42. Azt követ ően, hogy az opacitás- és az átlagos permeabilitásértékeket 
(OD  490 ) a háttéropacitás, illetve a negatív kontroll OD  490 permeabilitás ­
értékeinek figyelembevételével korrigáltuk, az egyes kezelt csoportok átlagos opacitás- és átlagos OD
 490 permabilitásértékeit egy kísérleti úton 
származtatott összefüggés segítségével kezelt csoportonként egyetlen jelz ő­
számmá, az  in vitro  irritációs pontszámmá (IVIS) alakítjuk:  
IVIS = átlagopacitás + (15 × OD  490 átlagpermeabilitás).  
Sina et al. (16) szerint ezt az összefüggést bels ő és laboratóriumközi vizs ­
gálatok keretében dolgozták ki. Egy több laboratóriumban 36 anyagon 
elvégzett vizsgálatsorozat adatain többváltozós analízist hajtottak végre azon összefüggés meghatározása végett, amely az  in vivo  és az  in vitro  
adatok között a legjobb illeszkedést biztosítja. Ezt az analízist két külön ­
böző cég kutatói is elvégezték, és csaknem azonos összefüggésre jutottak.
 
43. Az opacitás- és a permeabilitásértékeket egymástól függetlenül is ki kell 
értékelni annak meghatározására, hogy a vizsgált anyag a korróziót vagy a 
súlyos irritációt nem csak a két végpont egyikében váltotta-e ki (lásd a 
döntési kritériumokat).  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Döntési kritériumok  
44. Korróziót vagy súlyos irritációt okozónak kell tekinteni azt az anyagot, 
amelyre IVIS ≥ 55,1 adódik. Mint az 1. pontban láttuk, ha a vizsgált 
anyagot a vizsgálat nem mutatja szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, akkor a besorolás és a címkézés céljára további vizsgálatokat kell végezni. A nyulakon végzett  in vivo  szemvizsgálatból származó, az 
EPA (1), az EU (2) vagy a GHS (3) besorolási rendszer szerint osztályo ­
zott adatokkal összehasonlítva a BCOP vizsgálat általános pontossága 79 % (113/143) és 81 % (119/147) között, hamis pozitív aránya 19 % (20/103) és 21 % (22/103) között, hamis negatív aránya pedig 16 % (7/43) 
és 25 % (10/40) között van. Ha az adatbázisból egyes meghatározott 
kémiai (alkoholok, ketonok) vagy fizikai (szilárd anyagok) osztályokat kizárunk, akkor az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerben a BCOP vizsgálat pontossága 87 % (72/83) és 92 % (78/85), hamis pozitív 
aránya 12 % (7/58) és 16 % (9/56), hamis negatív aránya pedig 0 % (0/27) 
és 12 % (3/26) közé kerül.
 
45. Ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja is szemkorróziót vagy 
súlyos szemirritációt okozónak, a BCOP vizsgálat adatai – a nyulakon 
végzett  in vivo  szemvizsgálatból vagy megfelel ően validált más  in vitro  
vizsgálatból származó adatokkal együtt – jól használhatók annak további meghatározásában, hogy a BCOP vizsgálat mennyire és milyen korlátokkal 
alkalmas a nem súlyos irritációt okozó, illetve az irritációt nem okozó 
anyagok azonosítására (jelenleg folyik egy útmutató elkészítése az in vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekre vonatkozóan).
 
A vizsgálat elfogadási kritériumai  
46. A vizsgálat akkor elfogadható, ha a pozitív kontrollanyaghoz tartozó IVIS 
érték az aktuális (legalább háromhavonta, illet őleg az ilyen vizsgálatot havi 
egy alkalomnál ritkábban végz ő laboratóriumok esetében minden elfogad ­
ható vizsgálat után aktualizált) történeti átlagtól legfeljebb a szórás kétsze ­
resének megfelel ő mértékben tér el. A negatív kontrollanyagon és az 
oldószeren/viv őanyagon megfigyelt hatásokhoz tartozó opacitás- és perme ­
abilitásértékeknek kisebbnek kell lenniük az adott negatív kontrollanyaggal 
vagy oldószerrel/viv őanyaggal kezelt szarvasmarha-szaruhártyára megálla ­
pított fels ő háttéropacitás- és háttérpermeabilitás-korlátnál.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
47. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia, 
amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:  
Vizsgált anyag és kontrollanyagok  
Kémiai név (nevek): a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti szerke ­
zeti név, ezt követ ően az egyéb ismert nevek, ha vannak  
A CAS szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám), ha ismert  
Az anyag vagy keverék tisztasága és összetétele (tömegszázalékban), a 
rendelkezésre álló információknak megfelel ően 
Fizikai-kémiai tulajdonságok: halmazállapot, illékonyság, pH, stabilitás, 
kémiai osztály, vízben való oldhatóság, ha a vizsgálat szempontjából rele ­
vánsak  
A vizsgált anyag és a kontrollanyagok kezelése a vizsgálatot megel őzően, 
ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés) 
Stabilitás, ha ismert  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
A megbízó és a vizsgálatot végz ő laboratórium adatai  
A megbízó, a vizsgálatot végz ő laboratórium és a vizsgálatvezet ő neve és 
címe  
A szemek beszerzési helyének (a létesítmény, ahonnan származnak) 
megjelölése  
A szemek tárolásának és szállításának körülményei (pl. a szemek begy űj­
tésének napja és id őpontja, a vizsgálat megkezdéséig eltelt id ő, a szállító ­
eszköz és a h őmérsékleti viszonyok, az alkalmazott antibiotikumok)  
Azon egyedek jellemz ői, amelyekb ől a szemek származnak (pl. a dono ­
rállat életkora, neme, tömege), ha rendelkezésre állnak  
Az alkalmazott vizsgálati módszer és protokoll indokolása  
A vizsgálati módszer integritása  
A vizsgálati módszer id őbeli integritásának (például pontosságának, 
megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például jártassági tesztanyagokon végzett id őszakos vizsgálatok, negatív és pozitív történeti 
kontrolladatok felhasználása)
 
A vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai  
Az elfogadható párhuzamos pozitív és negatív kontrolladatok tartománya a 
történeti adatok alapján  
Az elfogadható párhuzamos referencia-kontrolltartományok a történeti 
adatok alapján, szükség szerint  
Vizsgálati körülmények  
Az alkalmazott vizsgálati elrendezés leírása  
Az alkalmazott szaruhártyatartó típusa  
Az opacitás és a permeabilitás mérésére használt m űszerek (pl. opaciméter 
és spektroszkóp) kalibrálási adatai  
A felhasznált szarvasmarha-szaruhártya adatai, megállapítások a min ősé­
gükre vonatkozóan  
Az alkalmazott vizsgálati eljárás részletei  
A vizsgált anyagok alkalmazott koncentrációja (koncentrációi)  
A vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása  
Utalás a modellel kapcsolatos történeti adatokra (pl. negatív és pozitív 
kontrollanyagok, jártassági tesztanyagok, referenciaanyagok)  
Az alkalmazott értékelési kritériumok leírása  
Eredmények  
A megvizsgált minták adatai egyenként, táblázatos formában (pl. a vizsgált 
anyag, a pozitív, a negatív és a referencia-kontrollanyag [ha volt] opacitás- és OD
 490 értékei táblázatos formában, ideértve az esetleg megismételt 
azonos mérések adatait, valamint az egyes mérések középértékeit és szórá ­
sait is)  
A megfigyelt egyéb jelenségek leírása  
Az eredmények szöveges elemzése  
Következtetések  
IRODALOM  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
96-001. Washington, DC: US Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. 
december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézé ­
séről és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv 
módosításáról és hatályon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/ ­
2006/EK rendelet módosításáról, HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York 
& Geneva: United Nations Publications, 2007. Elektronikus formá ­
tumban:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ ­
02files_e.html]  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Elektro ­
nikus formátumban:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) Az Európai Parlament és a Tanács 1907/2006/EK rendelete (2006. 
december 18.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, enge­
délyezésér ől és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag- 
ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, 
valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági 
rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/ ­
EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatályon kívül helyezésér ől, HL L 396., 2006.12.30., 1. o.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for the Testing 
of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Elektronikus formátum ­
ban: 
[http://www.oecd.org/document/40/ ­
0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.htm l]  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants 
and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06- 
4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Elekt ­
ronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italy: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healt ­
hcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of 
Infectious Agents in Healthcare Settings. Elektronikus formátumban:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Pontosság:  A vizsgálati eredmény és az elfogadott referenciaérték közötti 
egyezés mértéke. A vizsgálati módszer hatékonyságát mutatja, és alkalmazható ­
ságának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az „egyezés” szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szol ­
gáltat helyes eredményeket.
 
Referenciaanyag:  A vizsgált anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként 
használt anyag. A referenciaanyaggal szemben a következ ő elvárások fogalmaz ­
hatók meg: (i) állandó és megbízható beszerzési forrással vagy forrásokkal kell 
rendelkeznie; (ii) a vizsgált anyagosztályhoz hasonló szerkezettel és funkcionali ­
tással kell rendelkeznie; (iii) ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendel ­
keznie; (iv) rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és (v) a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.
 
Szaruhártya:  A szemgolyó elüls ő részén az íriszt és a pupillát fed ő és a szem 
belsejébe a fényt bevezet ő, áttetsző rész.  
Szaruhártya opacitása:  A szaruhártyának a vizsgált anyaggal való behatást 
követő átlátszatlanságát leíró jellemz ő. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya 
károsodását jelzi. Az opacitás értékelése történhet szubjektív módon (mint 
például a nyulakon végzett Draize-féle szemvizsgálatban) vagy objektív módszerrel (m űszerrel, például opaciméterrel).
 
Szaruhártya permeabilitása:  A szaruhártya felhámjának károsodását leíró szám ­
adat; meghatározása a szaruhártya összes sejtrétegén áthatoló fluoreszcein-nátrium festékanyag mennyiségének mérése alapján történik.
 
EPA szerinti 1. kategória:  Szemkorrózió (visszafordíthatatlan pusztulás a szem 
szöveteiben) vagy 21 napnál hosszabb ideig fennálló szaruhártya-elváltozás vagy 
-irritáció (1).  
EU szerinti R41. kategória:  A vizsgált anyagnak a szem küls ő felületére való 
juttatását követ ően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos 
fizikai romlása, amely a behatást követ ően 21 napon belül nem fordítható vissza 
teljes mértékben (2).  
Hamis negatív arány:  A vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen nega ­
tívnak min ősített pozitív anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati 
módszer hatékonyságának egyik mutatója.  
Hamis pozitív arány:  A vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozi ­
tívnak min ősített negatív anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati 
módszer hatékonyságának egyik mutatója.  
GHS (a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmo ­
nizált rendszere):  Anyagoknak és keverékeknek a fizikai, egészségi és környe ­
zeti veszélyek szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelelő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmeztetések ­
kel, figyelmeztet ő mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és 
biztonsági adatlapokkal) történ ő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, 
amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkaadók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürg ősségi segélyszolgálatok) és a környezet 
megóvása érdekében egységesítse az anyagok káros hatásaira vonatkozó infor ­
mációk továbbítását (3).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS szerinti 1. kategória:  A vizsgált anyagnak a szem küls ő felületére való 
juttatását követ ően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos 
fizikai romlása, amely a behatást követ ően 21 napon belül nem fordítható vissza 
teljes mértékben (3).  
Veszély:  Anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy él ő szervezettel, rendszerrel 
vagy (al)populációval való találkozásakor káros hatásokat képes el őidézni.  
In vitro  irritációs pontszám (IVIS):  A BCOP vizsgálatban alkalmazott, kísérleti 
úton származtatott összefüggés, amely az egyes kezelt csoportok opacitásának és 
permeabilitásának középértékeit minden egyes kezelt csoportra egyetlen  in vitro  
pontszám formájában fejezi ki. IVIS = átlagopacitás + (15 x átlagpermeabilitás).  
Negatív kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóelemét tartalmazó 
kezeletlen rendszer. Ez a minta összevethet ő a vizsgált anyaggal kezelt mintákkal 
és más kontrollmintákkal, és ennek alapján megállapítható, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati elrendezéssel.
 
Szemirritációt nem okozó anyag:  Az EPA szerinti I., II. vagy III., az EU 
szerinti R41. vagy R36., illetve a GHS szerinti 1., 2.A. vagy 2.B. kategóriába nem tartozó anyag.
 
Szemkorróziót okozó anyag:  (a) A szemben visszafordíthatatlan szövetkároso ­
dást okozó anyag; (b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti R41. kategóriába tartozó, szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).
 
Szemirritációt okozó anyag:  (a) Olyan anyag, amelynek a szem küls ő felületére 
való behatása visszafordítható elváltozást okoz; (b) az EPA szerinti II. vagy III., az EU szerinti R36., illetve a GHS szerinti 2.A. vagy 2.B. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).
 
Súlyos szemirritációt okozó anyag:  (a) Olyan anyag, amelynek a szem küls ő 
felületére való behatása a behatást követ ően 21 napon belül nem gyógyuló 
szövetkárosodást okoz vagy a látás súlyos fizikai romlását okozza; (b) a GHS 
szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti R41. kategóriába besorolt, 
szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).  
Opaciméter:  A szaruhártya fényátbocsátását kvantitatív módon értékel ő, a szaru­
hártya opacitásának mérésére alkalmazott m űszer. Rendszerint két kamrából áll, 
amelyek mindegyike saját fényforrással és fotocellával van ellátva. Az egyik kamrában helyezkedik el a kezelt szaruhártya, míg a másik a m űszer kalibrálására 
és alaphelyzetbe állítására szolgál. Egy kontrollrekeszt (folyadékkal nem töltött 
üres kamra ablakok nélkül) halogénlámpa fényével átvilágítanak, a fényt fotocel ­
lával érzékelik, és ezt összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átvezetett, a fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényer ősségek összehasonlításából adódó számszer ű opacitás­
érték digitális kijelz őn jelenik meg.
 
Pozitív kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóelemét tartalmazó, 
ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt rendszer. Annak érdekében azonban, 
hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkez ő hatás id őbeli változása is 
megfigyelhet ő legyen, a hatás nem lehet túlságosan er őteljes.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Megbízhatóság:  Vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok 
közötti reprodukálhatósága ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megálla ­
pítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumok közötti megismételhet őség kiszámításával történik.
 
Oldószeres/viv őanyagos kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóe ­
lemét az oldószerrel vagy viv őanyaggal együtt tartalmazó kezeletlen rendszer, 
amely összevethet ő a vizsgált anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollminták ­
kal, és ennek alapján megállapíthatók az ugyanazon oldószerben oldott vagy vivőanyaggal felvitt vizsgált anyag kiindulási értékei. E kontroll negatív kont ­
rollal elvégzett párhuzamos vizsgálatával az is megállapítható, hogy az oldószer 
vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati elrendezéssel.
 
Többszint ű vizsgálat:  Olyan lépcs őzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében 
a vizsgált anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben áttekintjük, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének mérlegelésével meghatározzuk, hogy a következ ő szintre való továbblépés el őtt a veszélyességi 
besorolásra vonatkozó döntéshez elegend ő információ áll-e rendelkezésre. Ha a 
vizsgált anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megálla ­
pítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgált anyag irritatív hatása a 
rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcs őben 
egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelm ű beso­
rolás meg nem állapítható.
 
Validált vizsgálati módszer:  Olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal 
kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága ellen őrző 
vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált 
vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelel ő 
pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.  
Az adatok bizonyító erejének mérlegelése:  Az a folyamat, amelynek során az 
adott anyag veszélyességével kapcsolatban rendelkezésre álló érveket és ellen ­
érveket a megfelel ő következtetés levonása és alátámasztása céljából részletesen 
áttekintjük.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
2. függelék  
Jártassági tesztanyagok a BCOP vizsgálathoz  
Az e vizsgálati módszerre támaszkodó vizsgálati módszerek rutinszer ű alkalma­
zásának megkezdése el őtt célszerű lehet, ha a laboratórium az 1. táblázat szerinti 
tíz anyagon ellen őrzi a szemkorróziót okozó anyagok azonosításában való tech ­
nikai jártasságát. Ezen anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatok (TG 405.) alapján a lokális szemirritáció/szemkorrózió 
(ENSZ GHS szerinti 1., 2.A. és 2.B. kategória, valamint a „nem besorolt és 
címkézett” kategória) szempontjából reprezentatívak legyenek (3) (7). Azonban e vizsgálatok validált alkalmazási körét (kizárólag a szemkorróziót, illet őleg 
súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása) figyelembe véve besorolási 
célból a jártasság igazolása csak két vizsgálati kimenetelre (szemkorróziót vagy 
súlyos szemirritációt okozó, illetve szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt nem okozó) értelmezhet ő. A kiválasztás másik kritériuma az volt, hogy az 
anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhet ők legyenek, kiváló min őségű 
in vivo referenciaadatok álljanak rájuk vonatkozóan rendelkezésre, és kiváló 
minőségű referenciaadatok álljanak rendelkezésre abból a két in vitro vizsgálati 
módszerb ől is, amelyek tekintetében folyik a vizsgálati útmutató kidolgozása. 
Ennek megfelel ően az anyagok az ICCVAM által az in vitro szemtoxicitási 
vizsgálati módszer validálásához ajánlott 122 irritatív referenciaanyagból kerültek kiválasztásra (lásd Appendix H: ICCVAM Recommended Reference Substances) (5). A referenciaadatok megtalálhatók a BCOP vizsgálatra és az izolált csirke ­
szem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszerre (ICE vizsgálat) vonatkozó 
ICCVAM-háttérdokumentumokban (17) (18).
 
1. táblázat  
Ajánlott tesztanyagok a BCOP vizsgálatban való technikai jártasság ellen őrzéséhez  
Anyag CASRN Kémiai osztály (  1 ) Halmazállapot  In vivo  
besorolás (  2 ) In vitro  besorolás (  3 ) 
Benzalkonium- 
klorid (5 %) 8001-54-5 Óniumvegyület Folyadék 1. kategória Szemkorróziót /súlyos irritá ­
ciót okozó 
Klórhexidin 55-56-1 Amin, amidin Szilárd 1. kategória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt okozó 
Dibenzoil-L- 
borkősav 2743-38-6 Karbonsav, 
észter Szilárd 1. kategória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt okozó 
Imidazol 288-32-4 Heterociklikus Szilárd 1. kategória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt okozó 
Triklórecetsav (30 
%) 76-03-9 Karbonsav Folyadék 1. kategória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt okozó 
2,6-Diklórbenzoil- 
klorid 4659-45-4 Savhalogenid Folyadék 2.A. kate ­
gória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt nem okozó 
Etil-2-metilaceto- 
acetát 609-14-3 Keton, észter Folyadék 2.B. kate ­
gória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt nem okozó 
Ammónium-nitrát 6484-52-2 Szervetlen só Szilárd 2.A. kate ­
gória Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt nem okozó  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Anyag CASRN Kémiai osztály (  1 ) Halmazállapot  In vivo  
besorolás (  2 ) In vitro  besorolás (  3 ) 
Glicerin 56-81-5 Alkohol Folyadék Nem címké ­
zett Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt nem okozó 
n-Hexán 110-54-3 Szénhidrogén 
(aciklikus) Folyadék Nem címké ­
zett Szemkorróziót /súlyos 
szemirritációt nem okozó  
Rövidítések: CASRN = a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám). 
( 1 ) A kémiai osztály meghatározása standard besorolási rendszer alkalmazásával, a National Library of Medicine „Medical Subject 
Headings” (MeSH) elnevezés ű besorolási rendszere alapján (elektronikus formátumban: http//www.nlm.nih.gov/mesh címen) történt. 
( 2 ) A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálat (OECD TG 405) eredményei alapján és az ENSZ GHS felhasználásával (3) (7). 
( 3 ) BCOP- és ICE-eredmények alapján.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
3. függelék  
SZARUHÁRTYATARTÓ A BCOP VIZSGÁLATHOZ  
1. A BCOP vizsgálathoz alkalmazott szaruhártyatartó inert anyagból (például 
polipropilénb ől) készül. A tartók két részb ől (elülső és hátsó kamrából) 
állnak, és két, egymáshoz hasonló hengeres bels ő kamrával rendelkeznek. 
Mindkét kamra 5 ml térfogatú és üvegablakban végz ődik, amelyen keresztül 
az opacitást mérik. Mindkét bels ő kamra átmér ője 1,7 cm, mélysége 
2,2 cm. (  1 ) A szivárgás megel őzésére a hátsó kamrában egy tömít őgyűrű 
található. A szaruhártyákat a belhámi oldalukkal lefelé kell a hátsó kamra tömítőgyűrűjére fektetni, majd az elüls ő kamrákat a szaruhártyák felhámi 
oldalára kell elhelyezni. A kamrákat a kamrák küls ő peremén található 
három, korrózióálló acélból készült csavar rögzíti. Az egyes kamraházak végén üvegablak található, amely a szaruhártyához való könnyebb hozzá ­
férés érdekében eltávolítható. A szivárgás megel őzésére az üvegablak és a 
kamra között is van egy tömít őgyűrű. Mindegyik kamra tetején két nyílás 
található, amelyen keresztül betölthet ő és üríthet ő a közeg és a vizsgált 
anyag. A kezelési és az inkubációs id őszak alatt ezeket a nyílásokat gumi ­
kupak zárja le.
 
Szószedet  
Glass disc: Üveglemez  
PTFE-O-ring: PTFE tömít őgyűrű 
Refill: Tölt őnyílás  
Hanger: Rögzít őelem  
Cap: Kupak  
Nut: Csavaranya  
O-ring: Tömít őgyűrű 
Posterior compartment: Hátsó kamra  
Anterior compartment: Elüls ő kamra  
Fixing screws: Rögzít őcsavarok  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) A megadott méretek 12–60 hónapos tehenekhez használt szaruhártyatartókon alapulnak. 
6–12 hónapos egyedek esetében a tartót úgy kell kialakítani, hogy mindkét kamra térfo ­
gata 4 ml, a bels ő kamrák átmér ője 1,5 cm, mélysége pedig 2,2 cm legyen. Új típusú 
szaruhártyatartók esetében nagyon fontos, hogy a vizsgált anyagnak kitett szaruhártya- 
felület és a hátsó karma térfogatának hányadosa megegyezzen a hagyományos szaruhár ­
tyatartó hasonló adatával. Ez azért szükséges, hogy az IVIS javasolt képletébe beírandó 
permeabilitásértékek helyesen legyenek meghatározva.
 AZ OPACIMÉTER  
2. Az opaciméter a fényátbocsátás mérésére szolgáló m űszer. Egy kontroll ­
rekeszt (folyadékkal nem töltött üres kamra ablakok nélkül) halogénlámpa 
fényével átvilágítanak, a fényt fotocellával érzékelik, és ezt összevetik a szaruhártyát tartalmazó kamrát magában foglaló vizsgálati rekeszen átveze ­
tett, a fotocellával érzékelt fénnyel. A fotocellák segítségével mért fényer ős­
ségek összehasonlításából adódó számszer ű opacitásérték digitális kijelz őn 
jelenik meg. Ennek alapján történik az opacitásegységek megállapítása.
 
3. Az opaciméternek az el őrejelző modellben leírt különféle besorolásokhoz 
tartozó határértékek által kijelölt tartományokban (vagyis a szemkorróziót, illetve a súlyos irritatív hatást meghatározó határértékig) lineáris viselkedést 
kell tanúsítania. Annak érdekében, hogy a leolvasások 75–80 opacitásegy ­
ségig lineárisak és pontosak legyenek, az opacimétert több kalibrátorral kell kalibrálni. A kalibrátorokat (opálos poliészter lapokat) a kalibrációs kamrába (a kalibrátorok tartására átalakított szaruhártyakamrába) kell helyezni, és 
leolvasást kell végezni az opaciméteren. A kalibrációs kamrákat úgy kell 
kialakítani, hogy a kalibrátorok a fényforrástól és a fotocellától ugyanolyan távolságra helyezkedjenek el, mint a szaruhártyák az opacitásmérés során. 
Az opacimétert el őször üres kalibrációs kamrával a zérus opacitásegységre 
kell kalibrálni. A három különböz ő kalibrátort ezután egyenként be kell 
helyezni a kalibrációs kamrába, és mérni kell az opacitást. Az els ő, a 
második és a harmadik kalibrátor behelyezésekor rendre az el őre beállított 
75, 150 és 225 (± 5 % t űrés) opacitásegységet kell tudni leolvasni.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48.  IZOLÁLT CSIRKESZEM VIZSGÁLATÁN ALAPULÓ 
VIZSGÁLATI MÓDSZER A SZEMKORRÓZIÓT ÉS A SÚLYOS 
SZEMIRRITÁCIÓT OKOZÓ ANYAGOK AZONOSÍTÁSÁRA  
BEVEZETÉS  
1. Az izolált csirkeszem vizsgálatán alapuló vizsgálati módszer (a továbbiak ­
ban: ICE vizsgálat) olyan in vitro vizsgálati módszer, amely bizonyos körülmények között és bizonyos korlátok mellett felhasználható anyagok 
és vegyületek „szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozóként” történ ő 
besorolására (1) (2) (3). E vizsgálati módszer alkalmazásában súlyos szemirritációt okozó anyagok azok az anyagok, amelyek a nyulak esetében a felvitelt követ ően legalább 21 napon át tartó szemléziókat okoznak. 
Noha a vizsgálat nem váltja ki teljes mértékben a nyulakon végzett in 
vivo szemvizsgálatot, az ICE vizsgálat alkalmazása a szabályozói követel ­
mények szerinti besorolás és címkézés egy adott alkalmazási területen történő meghatározására szolgáló, többszint ű vizsgálati stratégia részeként 
ajánlott (4) (5). A vizsgálatban pozitív eredményt adó vizsgált anyagok és 
keverékek (6) nyulakon végzett további vizsgálatok nélkül „szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó” besorolást kaphatnak. Azokat az anya ­
gokat, amelyek vizsgálata negatív eredményt adott, az OECD 405. vizs ­
gálati iránymutatásában (e melléklet B.5. fejezete) (7) leírtak szerint lépcsőzetes vizsgálati stratégia alkalmazásával nyulakon végzett további 
vizsgálatoknak kell alávetni.
 
2. E vizsgálati módszer célja a vizsgált anyag szemkorróziót vagy súlyos 
szemirritációt okozó esetleges hatásának kimutatása annak alapján, hogy a csirkéb ől eltávolított csirkeszemben milyen mértékben vált ki toxikus 
hatást. A szaruhártyára gyakorolt toxikus hatások jellemzése (i) az opacitás 
kvalitatív értékelésével, (ii) a szembe juttatott fluoreszcein következtében bekövetkez ő felhámkárosodás (fluoreszcein-visszatartás) kvalitatív értéke ­
lésével, (iii) a megvastagodás (felduzzadás) kvantitatív mérésével és (iv) a 
felület makroszkopikus morfológiai károsodásának kvalitatív értékelésével 
történik. A szaruhártya vizsgált anyagnak való expozícióját követ ően 
megállapítható szaruhártya-opacitást, felduzzadást és károsodást külön- külön jellemezzük, majd ezekb ől a jellemz őkből együttesen származtatjuk 
az ún. szemirritációs osztályt.
 
3. Az ICE vizsgálattal 21 napnál rövidebb id ő alatt gyógyuló szemléziókat 
kiváltó szemirritációt okozó, illetve irritációt nem okozó anyagokat is vizs ­
gáltak. Az ezekbe a kategóriákba tartozó anyagok tekintetében azonban nem történt meg az ICE vizsgálat pontosságának és megbízhatóságának formális értékelése.
 
4. A fogalommeghatározások az 1. függelékben találhatók.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
5. E vizsgálati módszer alapja az alternatív módszerek validálásával foglal ­
kozó ügynökségközi koordinációs bizottság (ICCVAM) ICE vizsgálati protokollja (8), amelynek kidolgozása az alternatív módszerek validálá ­
sával foglalkozó európai, illetve japán központ (ECVAM, JaCVAM), vala ­
mint a hollandiai TNO Quality of Life Department of Toxicology and 
Applied Pharmacology kutatószervezet részvételével végrehajtott nemzet ­
közi validációs vizsgálat (4) (5) (9) alapján történt. A protokoll alapját publikált protokollokból származó információk, valamint a protokoll alkal ­
mazása kapcsán a TNO-nál szerzett tapasztalatok képezik (10) (11) (12) 
(13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. A módszer azonosított korlátai az alkoholok esetében tapasztalt hamis 
pozitív arányokon és a szilárd és a felületaktív anyagok esetében tapasztalt 
hamis negatív arányon alapulnak (lásd a 47. pontot) (4). Ha az említett kémiai és fizikai osztályokba tartozó anyagokat kizárjuk az adatbázisból, akkor az ICE vizsgálat pontossága az EU, az EPA és a GHS besorolási 
rendszerében egyaránt jelent ősen javul (4). A vizsgálat célját (azaz kizá ­
rólag a szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt okozó anyagok azono ­
sítása) is figyelembe véve a hamis negatív arányok jelent ősége nem kriti ­
kus, hiszen az érintett anyagokat a szabályozói követelményekt ől függően 
– az adatok bizonyító erejének mérlegelésével, lépcs őzetes vizsgálati stra ­
tégia alkalmazásával – kés őbb nyulakon vagy más, megfelel ően validált in 
vitro vizsgálatokkal is megvizsgálják. Emellett a jelenleg rendelkezésre álló validációs adatbázis nem teszi lehet ővé egyes kémiai osztályok vagy 
termékcsoportok (például a keverékek) megfelel ő értékelését. A vizsgálat 
végrehajtója azonban a vizsgálati módszer alkalmazását valamennyi típusú anyag vizsgálata esetében (beleértve a keverékeket is) fontolóra veheti, a pozitív eredmény ugyanis ilyenkor is elfogadható lehet a szemkorrózió, 
illetve a súlyosan irritatív hatás jelzésére. Az alkoholok esetében azonban a 
kapott pozitív eredményeket a túlzó el őrejelzés kockázata miatt óvatosan 
kell értelmezni.
 
7. A csirkeszemmel végzett valamennyi eljárás során be kell tartani a vizs ­
gáló intézménynek az emberi és az állati eredet ű anyagok – ideértve 
többek között a szöveteket és a szöveti folyadékokat – kezelésére vonat ­
kozó rendelkezéseit és eljárásait. Ajánlott továbbá követni az általános laboratóriumi óvintézkedéseket is (15).
 
8. A vizsgálati módszernek korlátja, hogy noha figyelembe vesz egyes 
szemre gyakorolt, a nyulakon végzett szemirritációs vizsgálatban elemzett 
hatásokat, illetve bizonyos fokig azok súlyosságát is, nem veszi figye ­
lembe a köt őhártya- és az íriszsérüléseket. Másrészr ől, noha maga az 
ICE vizsgálat nem alkalmas a szaruhártya-léziók visszafordíthatóságának 
értékelésére, a nyulakon végzett szemvizsgálatok alapján korábban java ­
solták, hogy a szaruhártya-sérülés kezdeti mélységének értékelése alkalmas lehet a visszafordíthatatlan és a visszafordítható hatások megkülönbözteté ­
sére (16). Végezetül az ICE vizsgálat nem alkalmas a szembe kerülés 
következtében fellép ő szisztémás toxicitási potenciál megítélésére.
 
9. Továbbra is folyik a munka az ICE vizsgálat nem súlyos irritációt okozó, 
illetve irritációt nem okozó anyagok azonosítására való használhatósága, valamint korlátai részletesebb leírása érdekében (lásd még a 48. pontot is). A felhasználókat bátorítjuk arra, hogy mintáikat és/vagy adataikat küldjék 
meg a validáló szervezeteknek, ezzel ugyanis segíthetik az ICE vizsgálat 
jövőbeli felhasználásainak (ideértve a nem súlyos szemirritációt okozó, 
illetve a szemirritációt nem okozó anyagok azonosítását is) formális érté ­
kelését.
 
10. Minden olyan laboratóriumnak, amely a vizsgálatot el őször alkalmazza, a 
2. függelékben felsorolt jártassági tesztanyagok felhasználásával ajánlatos meggyőződnie felkészültségér ől. Mielőtt a laboratórium az ICE vizsgálat 
adatait a szabályozói követelmények szerinti veszélyességi besorolás 
céljaira rendelkezésre bocsátaná, e vegyi anyagok vizsgálatával demonst ­
rálhatja a BCOP vizsgálat elvégzésében való jártasságát.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
11. Az ICE vizsgálat olyan organotipikus módszer, amely rövid távon in vitro 
fenntartja a csirkeszem m űködését. A módszerrel a vizsgált anyag által 
okozott károsodás jellemzése a szaruhártya felduzzadásának, opacitásának 
és károsodásának értékelése útján történik. Míg e két utóbbi paraméter 
kvalitatív értékelést igényel, a szaruhártya felduzzadásának jellemzése kvantitatív módszerrel történik. A mérési eredményeket vagy kvantitatív pontszámmá transzformáljuk, amely az átfogó jellemzést adó irritációs 
index kiszámításához szükséges, vagy kvalitatív jellemzés formájában 
fejezzük ki, amely a vizsgált anyag in vitro szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozó hatású anyagként történ ő besorolására szolgál. Ezt 
követően e két eredmény bármelyike felhasználható a vizsgált anyag in 
vivo szemkorróziót és súlyos szemirritációt okozó hatásának el őrejelzésére 
(lásd a döntési kritériumokat).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
A csirkeszemek származása és életkora  
12. A múltban a vizsgálathoz vágóhídról beszerzett, emberi fogyasztás céljából 
leölt csirkékb ől nyert szemeket használtak, ami biztosította, hogy nem 
kellett laboratóriumi állatokat tartani. Csak az emberi élelmiszerláncba való bekerülésre alkalmas, egészséges állatokból nyert szemek használha ­
tóak fel.
 
13. Bár a csirkék optimális életkorának meghatározása céljából nem végeztek 
átfogó ellen őrzött vizsgálatot, a vizsgálat céljára igénybe vett csirkék élet ­
kora és tömege a hagyományosan vágóhídra kerül ő vágócsirkék életko ­
rának és tömegének felel meg (kb. 7 hetes, 1,5–2,5 kg tömeg ű csirkék).  
A szemek begy űjtése és beszállítása a laboratóriumba  
14. A csirke elkábítását (mely rendszerint elektromos sokkal történik) és a 
nyak kivéreztetési célú bemetszését követ ően a fejet azonnal el kell távo ­
lítani. Annak érdekében, hogy a csirkefejeket a vágóhídról a károsodás 
és/vagy bakteriális fert őzés megel őzéséhez szükséges gyorsasággal a labo ­
ratóriumba lehessen szállítani, a laboratórium közelében helyi beszerzési forrást célszer ű találni. A fejek begy űjtése és a szemeknek az ICE vizs ­
gálatban való felhasználása között eltelt id őnek a lehet ő legrövidebbnek 
kell lennie (mindennek rendszerint két órán belül meg kell történnie), és 
igazolni kell, hogy ez az id ő nem befolyásolja a vizsgálat eredményeit, 
azaz a szemek kiválasztási kritériumait, valamint a pozitív és negatív kont ­
rollminták eredményeit. A vizsgálatban felhasznált valamennyi szemnek 
egy meghatározott napon begy űjtött szemállományból kell származnia.
 
15. Mivel a szemeknek a fejb ől való kimetszése a laboratóriumban történik, az 
egész fejeket szobah őmérsékleten, izotóniás sóoldattal nedvesített törülkö ­
zőkkel párásított m űanyag dobozokban kell a vágóhídról a laboratóriumba 
szállítani.  
Az ICE vizsgálatban felhasznált szemek kiválasztási kritériumai  
16. A vizsgálatból ki kell zárni azokat a szemeket, amelyek esetében a kivételt 
követően nagy (0,5-nél nagyobb) a fluoreszceines foltosodás kiindulási 
értéke vagy a szaruhártya-opacitási pontszám.  
17. Minden kezelt csoportnak és pozitív kontrollcsoportnak legalább három 
szemből kell állnia. A negatív, illetve – ha az oldószer nem sóoldat – 
az oldószeres kontrollcsoportnak legalább egy szemb ől kell állnia.  
ELJÁRÁS  
A szemek el őkészítése  
18. A szemhéjat óvatosan bemetsszük, ügyelve arra, hogy elkerüljük a szaru ­
hártya sérülését. Ezután a szaruhártya épségét a szaruhártya felületére néhány másodpercre felvitt, majd izotóniás sóoldattal leöblített, egy cseppnyi 2 vegyes százalékos (m/V) fluoreszcein-nátrium alkalmazásával 
gyorsan értékeljük. A fluoreszceinnel kezelt szemeket ezután réslámpás 
mikroszkóppal megvizsgáljuk, és ellen őrizzük, hogy a szaruhártya nem 
sérült-e meg (a fluoreszcein-visszatartási és a szaruhártya-opacitási pont ­
szám legfeljebb 0,5 lehet).
 
19. Ha a szem sérülést ől mentes, akkor eltávolítjuk a koponyából, ügyelve 
arra, hogy elkerüljük a szaruhártya sérülését. A szemgolyót – a pislogóhár ­
tyát sebészeti csipesszel feszesen tartva – kihúzzuk a szemüregb ől, és a 
szemizmokat tompa hegy ű hajlított ollóval átvágjuk. Fontos, hogy ne fejt ­
sünk ki olyan er ős nyomást, amely károsíthatja a szaruhártyát (nyomásos 
szövetelváltozás következhet be).  
20. Amikor a szemet a szemüregb ől eltávolítjuk, a szemidegb ől egy szabad 
szemmel is jól látható részt rajta hagyunk. A szemet a szemüregb ől való 
eltávolítást követ ően nedvszívó párnára helyezzük, majd levágjuk róla a 
pislogóhártyát és az egyéb köt őszöveteket.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. A kivett szemet korrózióálló acél csíptet őre erősítjük úgy, hogy a szaru ­
hártya függ őleges helyzetben legyen. A csíptet őt ezt követ ően behelyezzük 
a szuperfúziós készülék egyik kamrájába (16). A csíptet őt a szuperfúziós 
készülékben úgy kell elhelyezni, hogy az izotóniás sóoldat cseppjei a teljes szaruhártyát érjék. A szuperfúziós készülék kamráinak h őmérsékletét 32 ± 
1,5 °C-on kell tartani. A 3. függelék bemutatja a szuperfúziós készülék 
jellemző kialakítását és a szemcsíptet őket; ezek az eszközök kereskedelmi 
forgalomban is kaphatók, de saját használatra is megépíthet ők. A készülék 
az egyes laboratóriumok igényeinek (például a vizsgálandó szemek számá ­
nak) megfelel ően módosítható.
 
22. A szemeket a szuperfúziós készülékbe való behelyezés után ismét 
megvizsgáljuk réslámpás mikroszkóppal annak ellen őrzésére, hogy az 
előkészítés során nem sérültek-e meg. A réslámpás mikroszkóp mélység ­
mérőjével ekkor a szaruhártya legmagasabb pontján megmérjük a szaru ­
hártya vastagságát is. Nem vizsgálhatók tovább azok a szemek, (i) amelyeknek fluoreszcein-visszatartási pontszáma 0,5-nél nagyobb, (ii) amelyeknek szaruhártya-opacitása 0,5-nél nagyobb, valamint (iii) amelyek 
a károsodás bármely további jelét mutatják. Az e szempontok alapján ki 
nem zárt szemek közül ki kell zárni mindazokat, amelyek szaruhártya- vastagsága az összes szem középértékét ől 10 %-kal nagyobb mértékben 
eltér. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás 
mikroszkópok különböz ő résbeállítások esetén eltér ő szaruhártya-vastag ­
ságot adhatnak. A résszélességet 0,095 mm-re kell állítani.
 
23. Valamennyi szem megvizsgálása és jóváhagyása után a szemeket körül ­
belül 45–60 percig inkubálni kell annak érdekében, hogy a vizsgálandó 
anyag felvitele el őtt a rendszerrel ekvilibrálódjanak. Az ekvilibrációs id ő 
eltelte után fel kell jegyezni a kiindulási (azaz a zérus id őpillanatban 
érvényes) szaruhártya-vastagságot és opacitást. A fluoreszcein-visszatartás végpontban kiindulási értékként az el őkészítéskor meghatározott 
fluoreszcein-pontszámot kell figyelembe venni.
 
A vizsgált anyag felvitele  
24. A kiindulási referenciamérések után a szemeket (tartójukkal együtt) 
azonnal ki kell venni a szuperfúziós készülékb ől, vízszintes helyzetbe 
kell hozni, majd fel kell vinni a vizsgált anyagot a szaruhártyára.  
25. A folyadékokat általában hígítatlan állapotban vizsgáljuk, de szükség 
esetén (például ha a vizsgálat leírása így rendelkezik) hígítás is alkalmaz ­
ható. Hígítás esetén lehet őleg fiziológiás sóoldatot alkalmazunk. Ellen ­ 
őrzött körülmények között másféle oldószer is használható, a fiziológiás 
sóoldattól eltér ő oldószerek megfelel őségét azonban külön igazolni kell.  
26. A folyékony vizsgált anyagot úgy visszük fel a szaruhártya felületére , 
hogy a szaruhártya teljes felületét egyenletesen beborítsa. A szabványos térfogat 0,03 ml.
 
27. A szilárd anyagokat lehet őleg dörzscsészében, mozsárban vagy hasonló 
őrlőeszközben a lehet ő legfinomabbra őröljük. A port úgy visszük fel a 
szaruhártya felületére, hogy a vizsgált anyag egyenletesen fedje azt be. A szabványos mennyiség 0,03 g.
 
28. A vizsgált anyagot (akár folyékony, akár szilárd) 10 másodpercig hagyjuk 
hatni, majd szobah őmérsékleten leöblítjük kb. 20 ml izotóniás sóoldattal. 
Ezt követ ően a szemet (tartójával együtt) az eredeti függ őleges helyzetben 
visszahelyezzük a szuperfúziós készülékbe.  
Kontrollanyagok  
29. Minden vizsgálatban párhuzamosan negatív vagy oldószeres/viv őanyagos 
kontrollt és pozitív kontrollt is kell végezni.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Hígítatlan folyadékok és szilárd anyagok vizsgálatakor a vizsgálati elren ­
dezés esetleges nem jellemz ő változásainak észlelése céljából és annak 
biztosítására, hogy a vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az ICE vizsgálatban párhuzamos negatív kontrollanyagként fiziológiás sóoldatot kell alkalmazni.
 
31. Hígított folyadékok vizsgálatakor a vizsgálati elrendezés esetleges nem 
jellemző változásainak észlelése céljából és annak biztosítására, hogy a 
vizsgálat körülményei ne eredményezzenek tévesen irritatív hatást, az 
ICE vizsgálatban párhuzamos oldószeres/viv őanyagos kontrollt kell alkal ­
mazni. A 25. pontnak megfelel ően csak olyan oldószer, illet őleg vivő­
anyag alkalmazható, amely igazoltan nem gyakorol káros hatást a vizs ­
gálatra.  
32. Annak ellen őrzése érdekében, hogy a kiváltott hatás valóban megfelel ő-e, 
a vizsgálatnak mindig tartalmaznia kell egy ismerten szemirritációt okozó 
anyaggal végzett párhuzamos pozitív kontrollvizsgálatot is. Mivel az ICE 
vizsgálat célja a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása, a pozitív kontrollanyagnak olyan referenciaanyagnak kell lennie, amely ebben a vizsgálatban súlyos hatást vált ki. Annak érdekében 
azonban, hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkez ő hatás id őbeli 
változása is megfigyelhet ő legyen, az irritatív hatás nem lehet túlságosan 
erőteljes. A pozitív kontrollanyagra vonatkozóan megfelel ő mennyiség ű in 
vitro adatot kell létrehozni úgy, hogy meghatározható legyen a pozitív 
kontrollanyag statisztikailag meghatározott elfogadható tartománya. Ha 
egy adott pozitív kontrollanyagra vonatkozóan nincs elegend ő korábbi 
adat az ICE vizsgálat alkalmazásából, akkor ezen adatok el őállításához 
külön vizsgálatok lehetnek szükségesek.
 
33. Folyékony vizsgált anyagok esetében pozitív kontrollanyagként például 
10 %-os ecetsav vagy 5 %-os benzalkónium-klorid, szilárd vizsgált 
anyagok esetében például nátrium-hidroxid vagy imidazol alkalmazható.  
34. A referenciaanyagok jól használhatók egy adott vegyianyag- vagy termék ­
osztályba tartozó ismeretlen vegyi anyagok szemirritációs hatásának érté ­
kelésére vagy valamely szemirritációs anyag relatív irritatív hatásának az 
irritatív hatás egy adott tartományán belüli értékelésére.  
Mért végpontok  
35. A kezelt szaruhártyákat a kezelés el őtt, majd a kezelést követ ő leöblítés 
után 30, 75, 120, 180 és 240 perc (± 5 perc) elteltével értékeljük. Ezek az időpontok a négyórás behatási id őn belül megfelel ő mennyiség ű mérést 
adnak, miközben a mérések között elegend ő idő áll rendelkezésre vala ­
mennyi szem szükséges vizsgálatának elvégzéséhez.
 
36. Az értékelt végpontok: a szaruhártya opacitása, felduzzadása, 
fluoreszcein-visszatartása és morfológiai elváltozásai (például a felhám 
benyomódása vagy fellazulása). A fluoreszcein-visszatartás kivételével (amelyet csak a kezelés el őtt és a vizsgált anyagnak való expozíció után 
30 perccel határozunk meg) minden végpontot valamennyi fenti 
időpontban meg kell határozni.
 
37. A szaruhártya opacitásának, fluoreszcein-visszatartásának, morfológiai 
elváltozásainak és – ha vizsgáljuk – hisztopatológiájának dokumentálására 
ajánlott fényképeket készíteni.  
38. A négy óra elteltével végrehajtott utolsó vizsgálatot követ ően ajánlatos a 
szemeket az esetleges hisztopatológiai vizsgálathoz megfelel ő fixálóban 
(például semleges pufferolt formalinban) tartani.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. A szaruhártya felduzzadását a réslámpás mikroszkóp optikai pachométe ­
rével végzett szaruhártyavastagság-mérésekb ől határozzuk meg. A felduz ­
zadást százalékban fejezzük ki, és a következ ő képletből, a mért szaruhár ­
tya-vastagságok felhasználásával számítjuk (a képletben  t c a vizsgált 
időpillanathoz,  t c0 pedig a  t = 0 időpillanathoz tartozó szaruhártya-vastag ­
ságot jelenti): 
" 
szaruhártya Ä vastagság a vizsgált id őpillanatban Ä szaruhártya Ä vastagság a zérus id őpillanatban 
szaruhártya Ä vastagság a zérus id őpillanatban # 
Ü 100 
40. Minden megfigyelési id őpontban meghatározzuk az összes vizsgált szem 
szaruhártya-felduzzadásának középértékét. Az összes id őpontban 
megfigyelt szaruhártyafelduzzadás-középértékek maximuma alapján 
minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot rendelünk.  
41. A szaruhártya-opacitási pontszámot a szaruhártya legs űrűbben opálos terü ­
lete alapján kell megállapítani. Minden megfigyelési id őpontban meghatá ­
rozzuk az összes vizsgált szem szaruhártya-opacitásának középértékét. Az 
összes időpontban megfigyelt szaruhártyaopacitás-középértékek maximuma 
alapján minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot rende ­
lünk (1. táblázat).  
1. táblázat  
Szaruhártya-opacitási pontszámok  
Pontszám Megfigyelés  
0 Nincs opálosodás 
0,5 Nagyon halvány opálosodás 1 Szórt vagy zavaros területek; az írisz részletei tisztán kivehet őek 
2 Könnyen észrevehet ő áttetsző terület; az írisz részletei kissé elmosódottak 
3 Súlyos szaruhártya-opálosodás; az írisznek egyetlen részlete sem vehet ő ki, a 
pupilla mérete alig érzékelhet ő 
4 A szaruhártya teljes opálosodása; az írisz nem látható
 
42. Kizárólag a 30 perc elteltével végzett megfigyelés alkalmával meghatá ­
rozzuk az összes szem fluoreszcein-visszatartásának középértékét, és 
ennek alapján minden vizsgált anyaghoz átfogó jellemzést adó pontszámot 
rendelünk (2. táblázat).  
2. táblázat  
Fluoreszcein-visszatartási pontszámok  
Pontszám Megfigyelés  
0 Nincs fluoreszcein-visszatartás 
0,5 Igen csekély mérték ű, egysejtes foltosodás 
1 Egysejtes foltosodás elszórtan a szaruhártya kezelt felületén 
2 Fokális vagy egybefügg ő, sűrű egysejtes foltosodás 
3 A szaruhártya nagy egybefügg ő területei tartanak vissza fluoreszceint  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. A morfológiai elváltozások között megemlítend ő a szaruhártya felhámsejt ­
jeinek „benyomódása”, a felhám „fellazulása”, a szaruhártya felületének 
„érdesedése” és a vizsgált anyag „feltapadása” a szaruhártya felületére. Ezek a megfigyelések különböz ő súlyosságúak lehetnek, és egyidej űleg 
is előfordulhatnak. A megfigyelések besorolása a vizsgálatot végz ő 
személy szubjektív megítélését ől függ.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Az adatok értékelése  
44. A szaruhártya opacitását, felduzzadását és fluoreszcein-visszatartását 
külön-külön értékeljük, és az egyes végpontokhoz külön-külön 
ICE-osztályt állapítunk meg. Ezt követ ően az egyes végpontokhoz tartozó 
ICE-osztályok együttes figyelembevételével meghatározzuk az egyes vizs ­
gált anyagok irritációs besorolását.  
Döntési kritériumok  
45. Az egyes végpontok értékelését követ ően az ICE-osztályok megállapítását 
előre meghatározott tartományok alapján végezzük. A szaruhártya- 
vastagság (3. táblázat), az opacitás (4. táblázat) és a fluoreszcein-visszatartás (5. táblázat) jellemzése a következ ő skálákon, négy ICE-osztály figyelembe ­
vételével történik:
 
3. táblázat  
A szaruhártya-vastagság besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban  
Szaruhártya-felduzzadás középértéke (%) (*) ICE-osztály  
0-tól 5-ig I. 
5-nél nagyobb, 12-ig II. 12-nél nagyobb, 18-ig (a kezelés után több 
mint 75 perccel) II. 
12-nél nagyobb, 18-ig (a kezelés után legfel ­
jebb 75 perccel) III. 
18-nál nagyobb, 26-ig III. 
26-nál nagyobb, 32-ig (a kezelés után több 
mint 75 perccel) III. 
26-nál nagyobb, 32-ig (a kezelés után legfel ­
jebb 75 perccel) IV. 
32 felett IV.
 
(*) A szaruhártya-felduzzadás pontszámai csak akkor érvényesek, ha a vastagság mérése I. sz. mélység ­
mérővel felszerelt Haag-Streit BP900 réslámpás mikroszkóppal és 9½-re (0,095 mm) állított résszéles ­
séggel történt. A felhasználóknak tisztában kell lenniük azzal, hogy a réslámpás mikroszkópok különböz ő 
résbeállítás esetén eltér ő szaruhártya-vastagságot adhatnak.  
4. táblázat  
Az opacitás besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban  
A maximális opacitáspontszámok középértéke (*) ICE-osztály  
0,0–0,5 I. 
0,6–1,5 II. 1,6–2,5 III. 2,6–4,0 IV.
 
(*) Lásd az 1. táblázatot.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
5. táblázat  
A fluoreszcein-visszatartás középértékének besorolási kritériumai az ICE vizsgálatban  
Fluoreszcein-visszatartás középértéke a kezelés után 
30 perccel (*) ICE-osztály  
0,0–0,5 I. 
0,6–1,5 II. 1,6–2,5 III. 2,6–3,0 IV.
 
(*) Lásd a 2. táblázatot.  
46. A vizsgált anyag általános in vitro irritációs besorolását a szaruhártya 
opacitása, felduzzadása és fluoreszcein-visszatartása alapján meghatározott 
kategóriák alapján, a 6. táblázatban bemutatott séma szerint állapítjuk meg.  
6. táblázat  
Összesített in vitro irritációs besorolás  
Besorolás A három végpont kombinációi  
Szemkorróziót / súlyos szemirritációt okozó 
anyag 3 × IV. 
2 × IV., 1 × III. 2 × IV., 1 × II. (*) 
2 × IV., 1 × I. (*) 
30 percnél a szaruhártya opacitása legalább 3 (legalább két szem esetében) 
Bármely id őpontban a szaruhártya opacitása 4 
(legalább két szem esetében) A felhám súlyos fellazulása (legalább egy szem esetében)
 
(*) Kevésbé valószín ű kombinációk.  
47. Mint az 1. pontban láttuk, ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja 
szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozónak, akkor a besorolás és a címkézés céljára további vizsgálatokat kell végezni. A nyulakon végzett in vivo szemvizsgálatból származó, az EPA (1), az EU (2) vagy a GHS (3) 
besorolási rendszer szerint osztályozott adatokkal összehasonlítva az ICE 
vizsgálat általános pontossága a szemkorróziót és a súlyos szemirritációt okozó anyagok azonosítása tekintetében 83 % (120/144) és 87 % (134/154) között, hamis pozitív aránya 6 % (7/122) és 8 % (9/116) között, hamis 
negatív aránya pedig 41 % (13/32) és 50 % (15/30) között van. Ha az 
adatbázisból egyes meghatározott kémiai (alkoholok, felületaktív anyagok) és fizikai (szilárd anyagok) osztályokat kizárunk, akkor az EU, az EPA és a GHS besorolási rendszerben az ICE vizsgálat pontossága 91 % (75/82) és 
92 % (69/75), hamis pozitív aránya 5 % (4/73) és 6 % (4/70), hamis negatív 
aránya pedig 29 % (2/7) és 33 % (3/9) közé kerül (4).
 
48. Ha a vizsgált anyagot a vizsgálat nem mutatja is szemkorróziót vagy 
súlyos szemirritációt okozónak, az ICE vizsgálat adatai – a nyulakon 
végzett in vivo szemvizsgálatból vagy megfelel ően validált más in vitro 
vizsgálatból származó adatokkal együtt – jól használhatók annak további meghatározásában, hogy az ICE vizsgálat mennyire és milyen korlátokkal alkalmas a nem súlyos irritációt okozó, illetve az irritációt nem okozó 
anyagok azonosítására (jelenleg folyik egy útmutató elkészítése az in 
vitro szemtoxicitás-vizsgálati módszerekre vonatkozóan).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
A vizsgálat elfogadási kritériumai  
49. A vizsgálat akkor elfogadható, ha a szemirritáció szempontjából az egyi ­
dejű negatív vagy viv őanyagos/oldószeres kontroll irritációt nem okozó ­
nak, az egyidej ű pozitív kontroll súlyos irritációt /korróziót okozónak 
bizonyul.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
50. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia, 
amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:  
Vizsgált anyag és kontrollanyagok  
Kémiai név (nevek): a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti szerke ­
zeti név, ezt követ ően az egyéb ismert nevek, ha vannak  
A CAS szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám), ha ismert  
Az anyag vagy keverék tisztasága és összetétele (tömegszázalékban), a 
rendelkezésre álló információknak megfelel ően 
Fizikai-kémiai tulajdonságok: halmazállapot, illékonyság, pH, stabilitás, 
kémiai osztály, vízben való oldhatóság, ha a vizsgálat szempontjából rele ­
vánsak  
A vizsgált anyag és a kontrollanyagok kezelése a vizsgálatot megel őzően, 
ha történt ilyen (pl. melegítés, őrlés) 
Stabilitás, ha ismert  
A megbízó és a vizsgálatot végz ő laboratórium adatai  
A megbízó, a vizsgálatot végz ő laboratórium és a vizsgálatvezet ő neve és 
címe  
A szemek beszerzési helyének (pl. a létesítmény, ahonnan származnak) 
megjelölése  
A szemek tárolásának és szállításának körülményei (pl. a szemek begy űj­
tésének napja és id őpontja, a vizsgálat megkezdéséig eltelt id ő) 
Azon egyedek jellemz ői, amelyekb ől a szemek származnak (pl. a dono ­
rállat életkora, neme, tömege), ha rendelkezésre állnak  
Az alkalmazott vizsgálati módszer és protokoll indokolása  
A vizsgálati módszer integritása  
A vizsgálati módszer id őbeli integritásának (például pontosságának, 
megbízhatóságának) biztosítására alkalmazott módszer (például jártassági tesztanyagokon végzett id őszakos vizsgálatok, negatív és pozitív történeti 
kontrolladatok felhasználása)
 
A vizsgálat elfogadhatóságának kritériumai  
Az elfogadható párhuzamos referencia-kontrolltartományok a történeti 
adatok alapján, szükség szerint  
Vizsgálati körülmények  
Az alkalmazott vizsgálati elrendezés leírása  
Az alkalmazott réslámpás mikroszkóp (pl. modellszám)  
Az alkalmazott réslámpás mikroszkóp beállításai  
A felhasznált csirkeszemek adatai, megállapítások a min őségükre vonatko ­
zóan ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Az alkalmazott vizsgálati eljárás részletei  
A vizsgált anyagok alkalmazott koncentrációja (koncentrációi)  
A vizsgálati eljárás bármilyen változtatásának leírása  
Utalás a modellel kapcsolatos történeti adatokra (pl. negatív és pozitív 
kontrollanyagok, jártassági tesztanyagok, referenciaanyagok)  
Az alkalmazott értékelési kritériumok leírása  
Eredmények  
A megfigyelt egyéb jelenségek leírása  
A szemekr ől készült fényképek (ha vannak)  
Az eredmények szöveges elemzése  
Következtetések  
IRODALOM  
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: US Environmental Protection Agency.  
(2) Az Európai Parlament és a Tanács 1272/2008/EK rendelete (2008. 
december 16.) az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől 
és csomagolásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módo ­
sításáról és hatályon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK 
rendelet módosításáról, HL L 353, 2008.12.31., 1. o.  
(3) United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Elektronikus formátumban:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ ­
02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Elektro ­
nikus formátumban:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(6) Az Európai Parlament és a Tanács 1907/2006/EK rendelete (2006. 
december 18.) a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, enge­
délyezésér ől és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag- 
ügynökség létrehozásáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 
93/67/EGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK bizottsági irányelv hatá ­
lyon kívül helyezésér ől, HL L 396, 2006.12.30., 1. o.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for the Testing 
of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Elektronikus formátum ­
ban: 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Elektronikus formátumban:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ ­
prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol . 35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healt ­
hcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Elektronikus formátumban:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_ice.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Elektronikus formá ­
tumban:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Pontosság:  A vizsgálati eredmény és az elfogadott referenciaérték közötti 
egyezés mértéke. A vizsgálati módszer hatékonyságát mutatja, és alkalmazható ­
ságának egyik szempontja. A kifejezés gyakran használatos az „egyezés” szó megfelelőjeként, amely arra utal, hogy egy adott vizsgálat milyen arányban szol ­
gáltat helyes eredményeket.
 
Referenciaanyag:  A vizsgált anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként 
használt anyag. A referenciaanyaggal szemben a következ ő elvárások fogalmaz ­
hatók meg: (i) állandó és megbízható beszerzési forrással vagy forrásokkal kell 
rendelkeznie; (ii) a vizsgált anyagosztályhoz hasonló szerkezettel és funkcionali ­
tással kell rendelkeznie; (iii) ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendel ­
keznie; (iv) rendelkezésre kell állnia az ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és 
(v) a kívánt hatástartományban ismert hatásúnak kell lennie.  
Szaruhártya:  A szemgolyó elüls ő részén az íriszt és a pupillát fed ő és a szem 
belsejébe a fényt bevezet ő, áttetsző rész.  
Szaruhártya opacitása:  A szaruhártyának a vizsgált anyaggal való behatást 
követő átlátszatlanságát leíró jellemz ő. Az opacitás megnövekedése a szaruhártya 
károsodását jelzi.  
Szaruhártya felduzzadása:  Az ICE vizsgálatban a szaruhártyának a vizsgált 
anyaggal való érintkezését követ ő felpuffadása mértékét objektív módon jellemz ő 
érték. Százalékban fejezzük ki, és a szaruhártya-vastagság kiindulási (a vizsgált 
anyag felvitele el őtti) értékéb ől és az ICE vizsgálat során a vizsgált anyagnak 
való expozíciót követ ően rendszeres id őközönként végzett mérésekb ől számítjuk. 
A szaruhártya felduzzadásának foka jelzi a szaruhártya károsodásának mértékét.  
EPA szerinti 1. kategória:  Szemkorrózió (a szem szöveteiben visszafordítha ­
tatlan pusztulást okoz) vagy 21 napnál hosszabb ideig fennálló szaruhártya-elvál ­
tozás vagy -irritáció (1).  
EU szerinti R41. kategória:  A vizsgált anyagnak a szem küls ő felületére való 
juttatását követ ően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos 
fizikai romlása, amely a behatást követ ően 21 napon belül nem fordítható vissza 
teljes mértékben (2).  
Hamis negatív arány:  A vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen nega ­
tívnak min ősített pozitív anyagok részaránya. A hamis negatív arány a vizsgálati 
módszer hatékonyságának egyik mutatója.  
Hamis pozitív arány:  A vizsgálati módszer alkalmazása során tévesen pozi ­
tívnak min ősített negatív anyagok részaránya. A hamis pozitív arány a vizsgálati 
módszer hatékonyságának egyik mutatója.  
Fluoreszcein-visszatartás:  Az ICE vizsgálatban a szaruhártya felhámsejtjeiben a 
vizsgált anyagnak való expozíciót követ ően visszatartott fluoreszcein-nátrium 
mennyiségét szubjektív módon jellemz ő adat. A fluoreszcein-visszatartás foka 
utal a szaruhártyafelhám károsodásának mértékére.  
GHS (a vegyi anyagok osztályozásának és címkézésének globálisan harmo ­
nizált rendszere):  Anyagoknak és keverékeknek a fizikai, egészségi és környe ­
zeti kockázatok szabványosított típusai és szintjei szerinti osztályokba sorolására és megfelel ő kommunikációs elemekkel (például piktogramokkal, figyelmezteté ­
sekkel, figyelmeztet ő mondatokkal, óvintézkedésekre vonatkozó mondatokkal és 
biztonsági adatlapokkal) történ ő jelölésére javaslatokat megfogalmazó rendszer, 
amelynek célja, hogy az emberek (köztük a munkaadók, a munkavállalók, a fuvarozók, a fogyasztók és a sürg ősségi segélyszolgálatok) és a környezet 
megóvása érdekében egységesítse az anyagok káros hatásaira vonatkozó infor ­
mációk továbbítását (3).
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS szerinti 1. kategória:  A vizsgált anyagnak a szem küls ő felületére való 
juttatását követ ően olyan szövetkárosodás kialakulása vagy a látás olyan súlyos 
fizikai romlása, amely a behatást követ ően 21 napon belül nem fordítható vissza 
teljes mértékben (3).  
Veszély:  Anyag vagy helyzet azon sajátossága, hogy él ő szervezettel, rendszerrel 
vagy (al)populációval való találkozásakor káros hatásokat képes el őidézni.  
Negatív kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóelemét tartalmazó 
kezeletlen rendszer. Ez a minta összevethet ő a vizsgált anyaggal kezelt mintákkal 
és más kontrollmintákkal, és ennek alapján megállapítható, hogy az oldószer kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati elrendezéssel.
 
Szemirritációt nem okozó anyag:  Az EPA szerinti I., II. vagy III., az EU 
szerinti R41. vagy R36., illetve a GHS szerinti 1., 2.A. vagy 2.B. kategóriába nem tartozó anyag (1) (2) (3).
 
Szemkorróziót okozó anyag:  (a) A szemben visszafordíthatatlan szövetkároso ­
dást okozó anyag; (b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti R41. kategóriába tartozó, szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).
 
Szemirritációt okozó anyag:  (a) Olyan anyag, amelynek a szem küls ő felületére 
való behatása visszafordítható elváltozást okoz; (b) az EPA szerinti II. vagy III., 
az EU szerinti R36., illetve a GHS szerinti 2.A. vagy 2.B. kategóriába besorolt, 
szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).  
Súlyos szemirritációt okozó anyag:  (a) Olyan anyag, amelynek a szem küls ő 
felületére való behatása a behatást követ ően 21 napon belül nem visszafordítható 
szövetkárosodást okoz vagy a látás súlyos fizikai romlását okozza; (b) a GHS szerinti 1., az EPA szerinti I. vagy az EU szerinti R41. kategóriába besorolt, szemirritációt okozó anyag (1) (2) (3).
 
Pozitív kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóelemét tartalmazó, 
ismert pozitív hatást kiváltó anyaggal kezelt rendszer. Annak érdekében azonban, 
hogy a pozitív kontrollvizsgálatban jelentkez ő hatás id őbeli változása is 
megfigyelhet ő legyen, a hatás nem lehet túlságosan er őteljes.  
Megbízhatóság:  Vizsgálati módszer laboratóriumon belüli és laboratóriumok 
közötti reprodukálhatósága ugyanazon protokoll alkalmazása mellett. Megálla ­
pítása a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság, valamint a laboratóriumok közötti megismételhet őség kiszámításával történik.
 
Réslámpás mikroszkóp:  A szem binokuláris mikroszkóp nagyítása alatti, álló 
sztereoszkópiás kép alkotásával történ ő közvetlen vizsgálatára alkalmazott 
műszer. Az ICE vizsgálatban a m űszert a csirkeszem elüls ő szerkezeteinek, 
illetve a mélységmér ő tartozékkal a szaruhártya vastagságának objektív mérésére 
használjuk.  
Oldószeres/viv őanyagos kontroll:  A vizsgálati elrendezés valamennyi alkotóe ­
lemét az oldószerrel vagy viv őanyaggal együtt tartalmazó kezeletlen rendszer, 
amely összevethet ő a vizsgált anyaggal kezelt mintákkal és más kontrollminták ­
kal, és ennek alapján megállapíthatók az ugyanazon oldószerben oldott vagy vivőanyaggal felvitt vizsgált anyag kiindulási értékei. E kontroll negatív kont ­
rollal elvégzett párhuzamos vizsgálatával az is megállapítható, hogy az oldószer 
vagy vivőanyag kölcsönhatásba lép-e a vizsgálati elrendezéssel.
 ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Többszint ű vizsgálat:  Olyan lépcs őzetes vizsgálati stratégia, amelynek keretében 
a vizsgált anyagra vonatkozó valamennyi információt meghatározott sorrendben 
áttekintjük, és az egyes szinteken az adatok bizonyító erejének mérlegelésével meghatározzuk, hogy a következ ő szintre való továbblépés el őtt a veszélyességi 
besorolásra vonatkozó döntéshez elegend ő információ áll-e rendelkezésre. Ha a 
vizsgált anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján megálla ­
pítható, további vizsgálatra nincs szükség. Ha a vizsgált anyag irritatív hatása a rendelkezésre álló információk alapján nem állapítható meg, több lépcs őben 
egymás után állatkísérleteket kell végezni mindaddig, amíg az egyértelm ű beso­
rolás meg nem állapítható.
 
Validált vizsgálati módszer:  Olyan vizsgálati módszer, amelynek az adott céllal 
kapcsolatos relevanciája (pontosságát is ideértve) és megbízhatósága ellen őrző 
vizsgálatok alapján megállapítást nyert. Fontos megjegyezni, hogy a validált vizsgálati módszer a javasolt felhasználási célra nem feltétlenül kínál megfelel ő 
pontosságú és megbízhatóságú elfogadható eljárást.
 
Az adatok bizonyító erejének mérlegelése:  Az a folyamat, amelynek során az 
adott anyag veszélyességével kapcsolatban rendelkezésre álló érveket és ellen ­
érveket a megfelel ő következtetés levonása és alátámasztása céljából részletesen 
áttekintjük.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
2. függelék  
JÁRTASSÁGI TESZTANYAGOK AZ ICE VIZSGÁLATHOZ  
Az e vizsgálati módszerre támaszkodó vizsgálati módszerek rutinszer ű alkalmazá ­
sának megkezdése el őtt célszerű lehet, ha a laboratórium az 1. táblázat szerinti tíz 
anyagon ellen őrzi a szemkorróziót okozó anyagok azonosításában való technikai 
jártasságát. Ezen anyagok kiválasztása úgy történt, hogy a nyulakon végzett  in vivo  
szemvizsgálatok (TG 405.) alapján a lokális szemirritáció/szemkorrózió (ENSZ GHS 
szerinti 1., 2.A. és 2.B. kategória, valamint a „nem besorolt és címkézett” kategória) szempontjából reprezentatívak legyenek (3) (7). Azonban e vizsgálatok validált alkal ­
mazási körét (kizárólag a szemkorróziót, illet őleg súlyos szemirritációt okozó 
anyagok azonosítása) figyelembe véve besorolási célból a jártasság igazolása csak 
két vizsgálati kimenetelre (szemkorróziót vagy súlyos szemirritációt okozó, illetve szemkorróziót, illetve súlyos szemirritációt nem okozó) értelmezhet ő. A kiválasztás 
másik kritériuma az volt, hogy az anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhet ők 
legyenek, kiváló min őségű in vivo  referenciaadatok álljanak rájuk vonatkozóan 
rendelkezésre, és kiváló min őségű referenciaadatok álljanak rendelkezésre abból a 
két in vitro vizsgálati módszerb ől is, amelyek tekintetében folyik a vizsgálati útmutató 
kidolgozása. Ennek megfelel ően az anyagok az ICCVAM által az in vitro szemtoxi ­
citási vizsgálati módszer validálásához ajánlott 122 irritatív referenciaanyagból 
kerültek kiválasztásra (lásd Appendix H: ICCVAM Recommended Reference Subs ­
tances List) (4). A referenciaadatok megtalálhatók a szarvasmarha-szaruhártya opaci ­
tásának és permeabilitásának mérésén alapuló vizsgálati módszerre (BCOP vizsgálat) 
és az ICE vizsgálatra vonatkozó ICCVAM-háttérdokumentumokban (18) (19).
 
1. táblázat  
Ajánlott tesztanyagok az ICE vizsgálatban való technikai jártasság ellen őrzéséhez  
Vegyi anyag CASRN Kémiai osztály (  1 ) Halmazállapot  In vivo  
besorolás (  2 ) In vitro  besorolás (  3 ) 
Benzalkonium-klorid 
(5 %) 8001-54-5 Óniumvegyület Folyadék 1. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt okozó 
Klórhexidin 55-56-1 Amin, amidin Szilárd 1. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt okozó 
Dibenzoil-L- 
borkősav 2743-38-6 Karbonsav, 
észter Szilárd 1. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt okozó 
Imidazol 288-32-4 Heterociklikus Szilárd 1. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt okozó 
Triklórecetsav 
(30 %) 76-03-9 Karbonsav Folyadék 1. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt okozó 
2,6-Diklórbenzoil- 
klorid 4659-45-4 Savhalogenid Folyadék 2.A. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt nem 
okozó 
Etil-2-metilaceto- 
acetát 609-14-3 Keton, észter Folyadék 2.B. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt nem 
okozó 
Ammónium-nitrát 6484-52-2 Szervetlen só Szilárd 2.A. kategória Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt nem 
okozó  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Vegyi anyag CASRN Kémiai osztály (  1 ) Halmazállapot  In vivo  
besorolás (  2 ) In vitro  besorolás (  3 ) 
Glicerin 56-81-5 Alkohol Folyadék Nem címkézett Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt nem 
okozó 
n-Hexán 110-54-3 Szénhidrogén 
(aciklikus) Folyadék Nem címkézett Szemkorróziót/súlyos 
szemirritációt nem 
okozó  
Rövidítések: CASRN\; =\; a Chemical Abstracts Service (CAS) szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám). 
( 1 ) A kémiai osztály meghatározása standard besorolási rendszer alkalmazásával, a National Library of Medicine „Medical Subject 
Headings” (MeSH) elnevezés ű besorolási rendszere alapján (elektronikus formátumban: http//www.nlm.nih.gov/mesh címen) 
történt. 
( 2 ) A nyulakon végzett  in vivo  szemvizsgálat (OECD TG 405) eredményei alapján és az ENSZ GHS felhasználásával (3) (7). 
( 3 ) BCOP- és ICE-eredmények alapján.  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
3. Függelék  
Szuperfúziós készülék és szemcsíptet ő az ICE vizsgálathoz  
(A szuperfúziós készülék és a szemcsíptet ő további általános leírását 
lásd: Burton et al. (17))
  ▼M2 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49  IN VITRO  CELLULÁRIS MIKRONUKLEUSZ-VIZSGÁLAT 
EMLŐSÖKÖN  
BEVEZETÉS  
1. Az  in vitro  mikronukleusz-vizsgálat (MNvit vizsgálat) interfázisban lév ő 
sejtek citoplazmájában mikronukleuszok (MN) kimutatására szolgáló geno ­
toxicitási vizsgálat. A mikronukleuszok acentrikus (vagyis centromérával nem rendelkez ő) kromoszómafragmentumokból származhatnak, vagy 
olyan ép kromoszómákból, amelyek a sejtosztódás anafázisa során nem 
képesek a sejtpólusokra vándorolni. A vizsgálattal klasztogén és aneugén 
kémiai anyagok (anyagok és keverékek) (1) (2) aktivitása mutatható ki osztódó sejteken, a vizsgált anyaggal történ ő expozíció során vagy azt 
követően. Ez a vizsgálati módszer egyaránt lehet ővé teszi az aktin-polime ­
rizációt gátló citokalazin-B-t (citoB) tartalmazó és nélkülöz ő protokollok 
használatát. A citoB célzott mitózist megel őző hozzáadása az egy mitotikus 
cikluson átesett sejtek esetében lehet ővé teszi a mikronukleuszok gyakori ­
ságának azonosítását és szelektív analízisét, mivel ezek a sejtek kétmagvúak 
(3) (4). Ez a vizsgálati módszer a citokinézis-gátlást nem alkalmazó protok ­
ollok használatát is lehet ővé teszi, feltéve, hogy a vizsgált sejtpopuláció 
mitózisa bizonyítható.
 
2. Amellett, hogy MNvit vizsgálat alkalmazható a mikronukleuszokat indukáló 
vegyi anyagok (anyagok vagy keverékek) azonosítására, a citokinézis-gátlás 
alkalmazása, a kinetochorok immunkémiai jelölése, illetve a centroméra/te ­
loméra próbák hibridizációja (fluoreszcens  in situ  hibridizáció (FISH)) arról 
is információkat nyújthat, hogy milyen mechanizmussal történt a kromoszó ­
masérülés és a mikronukleusz-képz ődés (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 
(13) (14) (15) (16). A jelölést és a hibridizációs technikákat akkor lehet 
használni, ha fokozódik a mikronukleusz-képz ődés, és a vizsgáló személy 
szeretné megállapítani, hogy ez a fokozódás klasztogén és/vagy aneugén hatásra jött-e létre.
 
3. A mikronukleuszok olyan károsodást jeleznek, amely átkerült az utódsej ­
tekbe, míg a metafázisban lév ő sejtekben talált kromoszómaaberrációk nem 
feltétlenül örökl ődnek. Mivel az interfázisos sejtben lév ő mikronukleuszok 
viszonylag objektívan vizsgálhatók, a laboratóriumi személyzetnek csupán azt kell meghatároznia, hogy a sejtek átestek-e osztódáson, és hogy hány sejt tartalmaz mikronukleuszt. Ennek következtében a preparátumok 
viszonylag gyorsan értékelhet ők, és a vizsgálat automatizálható. Ez a 
gyakorlatban kezelésenként több száz helyett több ezer sejt értékelését teszi lehet ővé, növelve a vizsgálat erejét. Végül megállapítható, hogy 
mivel a mikronukleuszok lemaradó kromoszómákból keletkezhetnek, lehet ­
séges olyan aneuploidiát indukáló anyagok azonosítása, amelyeket a hagyo ­
mányos kromoszómaaberrációs vizsgálatokkal, például az OECD 473. vizs ­
gálati iránymutatása (e melléklet B.10. fejezete) szerint nehéz vizsgálni (17). Az MNvit vizsgálat ugyanakkor speciális technikák, például a 2. bekez ­
désben leírt FISH alkalmazása nélkül nem teszi lehet ővé a poliploidiát 
okozó és a klasztogén hatású vegyi anyagok elkülönítését.
 
4. Az MNvit vizsgálat  in vitro  módszer, amelyet jellemz ően humán és rágcsáló 
eredetű tenyésztett sejteken alkalmaznak.  Mivel aneugén és klasztogén 
hatású anyagok egyaránt kimutathatóak , széleskör ű alapot biztosít a kromo ­
szómakárosító hatás  in vitro  vizsgálatához.  
5. Az MNvit vizsgálat számos különféle sejttípus esetében, valamint citoB 
jelenlétében és hiányában is megbízható és hatékony. Az MNvit vizsgálat 
hitelességét különböz ő rágcsálósejtvonalak (CHO, V79, CHL/IU és 
L5178Y) és humán limfociták alkalmazásával nyert nagy mennyiség ű 
adat támasztja alá (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Ezek közé tartoznak különösen a Société Française de Toxi ­
cologie Génétique (SFTG) által koordinált nemzetközi hitelesítési tanulmá ­
nyok (18) (19) (20) (21) (22) és a genotoxicitás vizsgálatával foglalkozó
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
nemzetközi m űhely (International Workshop on Genotoxicity Testing) 
jelentései (4) (16). A rendelkezésre álló adatokat az Európai Bizottság 
Alternatív Módszerek Validálásával Foglalkozó Európai Központja (ECVAM) is újraértékelte egy, a bizonyítékok súlyát mérlegel ő 
retrospektív hitelesítési vizsgálatban, és a vizsgálati módszert az ECVAM 
tudományos tanácsadó bizottsága (ESAC) tudományosan hitelesített 
módszerként jóváhagyta (32) (33) (34). A humán TK6 limfoblasztoid sejt ­
vonal (35), HepG2 sejtek (36) (37) és szíriai aranyhörcsög-embrió els őd­
leges sejtjeinek (38) felhasználását is leírták, bár ezeket hitelesítési vizs ­
gálatok során nem használják.
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
6. Az alkalmazott fogalmak meghatározása az 1. függelékben található.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
7. Az  in vitro  végrehajtott vizsgálatok rendszerint szükségessé teszik a meta ­
bolikus aktiválás valamilyen exogén forrásának használatát, kivéve, ha a sejtek metabolizálják a vizsgált anyagokat. A küls ő metabolikus aktivációs 
rendszer nem utánozza teljesen az  in vivo  körülményeket. Ügyelni kell az 
olyan körülmények elkerülésére, amelyek m űhibaként a bels ő mutagenitást 
nem tükröz ő pozitív eredményekhez vezetnének, és amelyek olyan ténye ­
zőkből adódhatnak, mint például a pH vagy az ozmolalitás jelent ős válto­
zásai vagy a citotoxicitás magas szintje (39) (40) (41). Amennyiben a vizs ­
gált vegyi anyag a hozzáadásakor változást idéz el ő a közeg pH-jában, 
akkor a pH-t – lehet őleg a törzsoldat pufferolásával – úgy kell beállítani, 
hogy a térfogatok minden vizsgált koncentráció és minden kontroll esetében 
azonosak maradjanak.
 
8. A mikronukleuszok indukálásának vizsgálatához elengedhetetlen, hogy a 
kezelt és a nem kezelt tenyészetekben egyaránt mitózis menjen végbe. A 
mikronukleuszok számolásához az a leginformatívabb szakasz, amikor a sejt 
a vizsgált anyaggal végzett kezelés során vagy után egy mitózison esett át.  
A VIZSGÁLAT ELVE  
9. A humán vagy eml ős eredetű sejttenyészeteket metabolikus aktiváció 
exogén forrásának jelenlétében és anélkül egyaránt kiteszik a vizsgált 
anyag hatásának, kivéve, ha megfelel ő metabolizáló képességgel rendelkez ő 
sejteket használnak. A párhuzamos oldószeres/viv őanyagos (VC) és pozitív 
kontrollanyagok (PC) minden vizsgálathoz hozzátartoznak.  
10. A vizsgált anyaggal végzett expozíció során vagy után a sejteket elegend ő 
ideig kell tenyészteni ahhoz, hogy kromoszóma- vagy orsókárosodás jöhessen létre, és ez az interfázisban lév ő sejtekben mikronukleuszok képz ő­
déséhez vezessen. Az aneuploidia indukálásához a vizsgált anyagnak a 
mitózis során a szokott módon jelen kell lennie. A mikronukleuszok jelen ­
létét a begy űjtött és megfestett, interfázisban lév ő sejtekben vizsgálják. 
Ideális esetben a mikronukleuszokat csak azokban a sejtekben kell megszá ­
molni, amelyek a vizsgált anyaggal történt expozíció során vagy – ha van 
ilyen – az expozíció utáni id őszakban estek át mitózison. A 
citokinezis-gátlóval kezelt tenyészetekben ezt úgy érjük el, hogy csak a kétmagvú sejteket értékeljük. Citokinezis-gátló hiányában fontos annak 
bizonyítása, hogy a vizsgált sejtek valószín űleg sejtosztódáson estek át a 
vizsgált anyaggal végzett expozíció során vagy után. Minden protokoll esetében fontos bizonyítani, hogy a sejtproliferáció a kontroll és a kezelt tenyészetekben egyaránt végbement, és a mikronukleuszok számolásához 
használt tenyészetekben (vagy a párhuzamos tenyészetekben) meg kell álla ­
pítani a vizsgált anyag által kiváltott citotoxicitás vagy citosztázis mértékét.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
A VIZSGÁLAT LEÍRÁSA  
Előkészületek  
11. Humán perifériás vérb ől származó tenyésztett primer limfociták (5) (19) 
(42) (43) és bizonyos rágcsáló sejtvonalak, például a CHO, V79, CHL/IU 
és L5178Y sejtek alkalmazhatók (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Egyéb sejtvonalak és sejttípusok alkalmazását a vizsgálat során muta ­
tott teljesítményük alapján, az Elfogadhatósági kritériumok cím ű részben 
leírtak szerint kell indokolni. Mivel a mikronukleusz-képz ődés alapgyako ­
risága befolyásolja a vizsgálat érzékenységét, ezért alacsony, stabil mikronukleusz-képz ődési gyakorisággal rendelkez ő sejttípusok alkalmazása 
javasolt.
 
12. A limfociták kinyeréséhez a humán perifériás vért fiatal (körülbelül 18-35 
éves), egészséges, nem dohányzó személyt ől kell venni, akir ől nem ismert, 
hogy az utóbbi id őben genotoxikus vegyi anyagoknak vagy sugárhatásnak 
lett volna kitéve. Amennyiben több donortól származó sejteket együtt hasz ­
nálnak fel, akkor a donorok számát meg kell adni. A 
mikronukleusz-képz ődés gyakorisága az életkor el őrehaladtával fokozódik, 
és ez a tendencia a n őknél erősebb, mint a férfiaknál (44), így ezt a donor ­
sejtek gyűjtésre történ ő kiválasztása során figyelembe kell venni.  
Tenyésztőközegek és tenyésztési körülmények  
13. A tenyészetek fenntartásához megfelel ő tenyészt őközeget és inkubálási 
körülményeket (tenyészt őedényeket, CO  2 -koncentrációt, h őmérsékletet és 
páratartalmat) kell biztosítani. Az igazolt sejtvonalaknál és törzseknél rutin ­
szerűen ellen őrizni kell a modális kromoszómaszám stabilitását és 
a mikoplazma-fert őzés hiányát, és amennyiben a modális kromoszómaszám 
megváltozott, nem szabad felhasználni a tenyészetet. A vizsgálólaboratóri ­
umban a tenyésztéshez alkalmazott normál sejtciklus idejének ismertnek kell 
lennie. Amennyiben citokinezis-gátlási módszert alkalmaznak, akkor a citokinezis-gátló anyag koncentrációját az adott sejttípusnak megfelel ően 
optimalizálni kell, és bizonyítottnak kell lennie, hogy az adott koncentráció 
az értékeléshez megfelel ő számú kétmagvú sejtet eredményez.
 
Tenyészetek készítése  
14. Igazolt sejtvonalak és törzsek: a törzstenyészetb ől származó sejteket szélesz ­
teni kell, majd tápközegben, olyan denzitásban kell tenyészteni, hogy az egy rétegben növ ő tenyészetek (monolayerek) ne váljanak egybefügg ővé, és a 
szuszpenziós tenyészetek ne érjenek el túlzott denzitást a begy űjtés előtt, 
majd 37 °C h őmérsékleten inkubálni kell.
 
15. Limfociták: a vizsgált anyaggal és a citoB-vel való expozíció el őtt véralva ­
dásgátlóval (például heparinnal) kezelt teljes vért vagy izolált limfocitákat tenyésztünk valamilyen mitogén anyag, például fitohemagglutinin (PHA) jelenlétében.
 
Metabolikus aktiváció  
16. Megfelel ő endogén metabolikus kapacitással nem rendelkez ő sejtek haszná ­
lata esetén exogén metabolizáló rendszereket kell alkalmazni. A leggyak ­
rabban használt rendszer egy kofaktorral kiegészített posztmitokondriális frakció (S9), amelyet enziminduktor szerekkel, például Aroclor 1254-gyel (45) (46) vagy fenobarbiton és β-naftoflavon kombinációjával (46) (47) (48) 
(49) kezelt rágcsálók májából állítanak el ő. Ez utóbbi kombináció nem sérti 
a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyez ő anyagokra vonat ­
kozó Stockholmi Egyezményt (50) és a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyez ő anyagokról szóló 850/2004/EK rendeletet (66), és a 
vegyes funkciójú oxidázok indukciója terén ugyanolyan hatékonynak bizo ­
nyult, mint az Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). Az S9 frakciót a végleges vizsgálati tenyészt őközegben általában az 1–10 % (v/v) közötti koncentrá ­
ciótartományban alkalmazzák. A metabolikus aktivációs rendszer jellemz ői 
függhetnek a vizsgált kémiai anyag csoportjától, és bizonyos esetekben 
megfelelő lehet több S9 koncentráció alkalmazása.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. A humán vagy rágcsáló eredet ű aktiváló enzimeket termel ő, géntechnológi ­
ával előállított sejtvonalak kiküszöbölhetik az exogén metabolikus aktivá ­
ciós rendszer alkalmazásának szükségességét, és alkalmazhatók vizsgálat ­
hoz. Ilyen esetekben az alkalmazott sejtvonalra vonatkozó döntésnek – például a vegyes funkciójú oxidázoknak a vizsgált anyag metabolizmusában 
betöltött szerepe (51), valamint az ismert klasztogén és aneugén hatású 
anyagokra adott válaszreakciójuk alapján – tudományosan megalapozottnak kell lennie (lásd az Elfogadhatósági kritériumokra vonatkozó külön részt). Szem előtt kell tartani, hogy a vizsgált anyagot a termelt vegyes funkciójú 
oxidáz(ok) nem metabolizálhatják, ellenkez ő esetben ugyanis a negatív 
eredmények nem jelentenék azt, hogy a vizsgált anyag nem indukálja mikronukleuszok képz ődését.
 
A vizsgált anyag el őkészítése  
18. A szilárd halmazállapotú vegyi anyagokat a sejtek kezelése el őtt oldó­
szerben vagy viv őanyagban kell feloldani, és szükség esetén hígítani kell. 
A folyékony anyagokat közvetlenül is lehet a vizsgálati rendszerhez adagolni és/vagy a kezelés el őtt hígíthatók. Gáznem ű vagy illékony vegyi 
anyagok a szabványos protokoll megfelel ő módosításával vizsgálhatók, 
ilyen lehet például, hogy az anyagok kezelését légmentesen lezárt 
edényekben kell végezni (52) (53). A vizsgált anyagból friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve, ha a stabilitási adatok a tárolás elfogadhatóságát bizonyítják.
 
Vizsgálati körülmények  
Oldószerek/viv őanyagok  
19. Az oldószer/viv őanyag nem léphet reakcióba a vizsgált anyaggal, és nem 
befolyásolhatja a sejtek túlél őképességét vagy az S9 aktivitásának fenn ­
maradását az alkalmazott koncentrációban. Ha nem jól bevált oldószert/vi ­
vőanyagot (például víz, sejttenyészt őközeg, dimetil-szulfoxid) alkalmaznak, 
akkor a választott szer alkalmazását a vizsgált anyaggal való kompatibilitást 
és a genotoxicitás hiányát mutató adatokkal kell alátámasztani. Amennyiben lehetséges, el őször valamilyen vizes oldószer/viv őanyag használatát kell 
megfontolni.
 
CitoB alkalmazása citokinezis-gátlóként  
20. Az MNvit vizsgálat teljesítményét illet ően az egyik legf őbb szempont annak 
biztosítása, hogy az értékelt sejtek a kezelés során vagy – ha volt ilyen – a kezelés utáni inkubációs periódusban mitózison essenek át. A citokinezis gátlására a legelterjedtebben alkalmazott szer a citoB, mivel gátolja az aktin 
kapcsolódását, ezzel megakadályozza az utódsejtek mitózis utáni szétválá ­
sát, ami kétmagvú sejtek képz ődéséhez vezet (5) (54) (55). A mikronukle ­
uszok számolása ezért azokra a sejtekre korlátozható, amelyek a kezelés során vagy utána átestek a mitózison. A vizsgált anyag által a sejtprolife ­
ráció kinetikájára gyakorolt hatás párhuzamosan mérhet ő. A citoB akkor 
alkalmazandó citokinezis-gátlóként, ha humán limfocitákat alkalmazunk, mivel a sejtciklusid ők adott tenyészeten belül és donorok között változóak 
lesznek, és nem az összes limfocita fog reagálni a PHA-ra. Egyéb módsze ­
reket alkalmazunk, ha azért vizsgáljuk a sejtvonalakat, hogy meghatározzuk, 
osztódtak-e az értékelt sejtek; ezek alább szerepelnek (lásd a 26. bekezdést).
 
21. A citoB megfelel ő koncentrációját az egyes sejttípusokra vonatkozóan a 
laboratóriumnak kell meghatározni annak érdekében, hogy az oldószerrel/ vivőanyaggal kezelt kontroll tenyészetekben megfelel ő gyakorisággal 
alakuljanak ki kétmagvú sejtek. A citoB megfelel ő koncentrációja általában 
3–6 μg/ml.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
A sejtproliferáció és a citotoxicitás mérése, valamint az expozíciós koncent ­
ráció kiválasztása  
22. A vizsgált anyag legmagasabb vizsgálandó koncentrációjának meghatározá ­
sakor kerülni kell azokat a koncentrációkat, amelyek mellett álpozitív válaszreakciók alakulhatnak ki, ilyenek például a rendkívüli citotoxicitást kiváltó, a tenyészt őközegben kicsapódást okozó vagy a pH-ban, illetve az 
ozmolalitásban jelent ős változásokat okozó koncentrációk (39) (40) (41).
 
23. Mérni kell a sejtproliferációt, és ezáltal meg kell gy őződni arról, hogy a 
kezelt sejtek a vizsgálat során átestek a mitózison, és hogy a kezeléseket 
megfelelő szintű citotoxicitás mellett végezzük (lásd a 29. bekezdést). A 
citotoxicitást a metabolikus aktivációt igényl ő sejtekben meg kell határozni 
metabolikus aktiváció mellett és anélkül is, a sejtszám relatív 
növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) alapján 
(lásd a 2. függelék képleteit), kivéve, ha citoB-t alkalmazunk. CitoB alkal ­
mazása esetén a citotoxicitás meghatározható a replikációs index (RI) segít ­
ségével (a képletet lásd a 2. függelékben).  
24. A tenyészetek citoB-vel történ ő kezelése, valamint a tenyészetben található 
egymagvú, kétmagvú és többmagvú sejtek relatív gyakoriságainak mérése pontos módszer a kezelés sejtproliferációt el őidéző és citotoxikus vagy 
citosztatikus hatásának mennyiségi meghatározására (5), valamint biztosítja, 
hogy csak a kezelés során vagy után osztódott sejtek kerüljenek értékelésre.
 
25. A citoB-vel végzett vizsgálatokban a citosztázis/citotoxicitás mennyiségi 
meghatározása a citokinezis-gátlási proliferációs indexb ől (CBPI) (5) (26) 
(56) végezhet ő, vagy tenyészetenként legalább 500 sejt RI-jéb ől (a képle ­
teket lásd a 2. függelékben) vezethet ő le. Amennyiben a sejtproliferáció 
értékeléséhez citoB-t alkalmazunk, a CBPI-t vagy az RI-t tenyészetenként 
legalább 500 sejtb ől kell meghatározni. Többek között ezek a mérések 
alkalmazhatók a citotoxicitásnak a kezelt tenyészetekben és a kontrolltenyé ­
szetekben kapott értékek összehasonlításával történ ő becslésére. A citotoxi ­
citás egyéb markereinek (például egybefügg őség, sejtszám, apoptózis, 
nekrózis, metafázis számolása) értékelése szintén hasznos információkat szolgáltathat.
 
26. A citoB nélkül végzett vizsgálatokban igazolni kell azt, hogy a tenyészetben 
értékelt sejtek a vizsgált anyaggal végzett kezelés alatt vagy az után átestek az osztódáson, ellenkez ő esetében álnegatív lehet a válaszreakció. Annak 
biztosítására, hogy az osztódott sejtek kerüljenek értékelésre, alkalmazható 
például a bromodezoxiuridin (BrdU) beépítése és azt követ ő kimutatása az 
osztódott sejtek azonosítása érdekében (57), a klónképz ődés, amikor immor ­
talizált sejtvonalat kezelnek és értékelnek in situ tárgylemezen, mikroszkóp 
használatával (proliferációs index, [PI]) (25) (26) (27) (28), illetve a relatív 
populációduplázódás (RPD), a sejtszám relatív növekedése (RICC) vagy egyéb bizonyított igazolt módszerek (16) (56) (58) (59) (a képleteket lásd a 2. függelékben). A citotoxicitás vagy citosztázis egyéb markereinek (pél ­
dául egybefügg őség, sejtszám, apoptózis, nekrózis, metafázis számolása) 
értékelése szintén hasznos információkat szolgáltathat.
 
27. Legalább három elemezhet ő vizsgálati koncentrációt kell értékelni. Ennek 
érdekében szükséges lehet nagyobb számú, egymáshoz közeli koncentrá ­
ciókkal végezni a kísérletet, és a mikronukleusz-képz ődést a megfelel ő 
tartományba es ő citotoxicitást eredményez ő koncentrációk alkalmazásával 
elemezni. Egy másik lehetséges stratégia szerint el őzetes citotoxicitási 
vizsgálatot kell végezni és ezzel lesz űkíteni a tartományt a végleges vizs ­
gálathoz.  
28. A legmagasabb koncentrációval 55 ± 5 %-os citotoxicitás el őidézését kell 
megcélozni. Nagyobb koncentrációk a citotoxicitás másodlagos hatásaként kromoszómakárosodást idézhetnek el ő (60). Amennyiben citotoxicitás lép 
fel, a kiválasztott koncentrációknak le kell fedni az 55 ± 5 %-os citotoxi ­
citástól kezdve a kisfokú citotoxicitáson át a citotoxicitást nem okozó 
koncentrációk tartományát.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Amennyiben citotoxicitás vagy kicsapódás nem figyelhet ő meg, akkor a 
legmagasabb vizsgált koncentrációnak 0,01 M-nak, 5 mg/ml-nek vagy 5 
μl/ml-nek kell megfelelnie, attól függ ően, hogy melyik a legalacsonyabb 
érték. A vizsgálathoz kiválasztott koncentrációk között általában nem lehet 10-nél nagyobb távolság. Olyan vizsgált anyagok esetében, amelyek 
meredek koncentráció-válasz görbével rendelkeznek, szükséges lehet 
kisebb különbségeket hagyni a vizsgált anyag koncentrációi között, hogy a közepes és alacsony toxicitási tartományban lév ő tenyészetek is 
értékelésre kerüljenek.
 
30. Amennyiben az oldhatóság korlátozó tényez ő, akkor a maximális koncent ­
rációnak – ha nem korlátozza citotoxicitás – azt a legalacsonyabb koncent ­
rációt kell választani, amely mellett csak minimális precipitátumok láthatók a tenyészetekben, feltéve, hogy nem zavarják az értékelést. A precipitáció értékelését például fénymikroszkópos módszerrel kell végezni, figyelembe 
véve azokat a precipitátumokat, amelyek a tenyésztés során tartósan 
megmaradtak vagy ekkor (a kezelés végéig) jelentek meg.
 
Kontrollok  
31. Minden kísérletben egyidej űleg pozitív és oldószeres/viv őanyagos kontr ­
ollokat is vizsgálni kell, metabolikus aktiválással és anélkül is.  
32. A pozitív kontrollok azért szükségesek, hogy igazoljuk az alkalmazott 
sejtek és a vizsgálati protokoll alkalmasságát a klasztogén és aneugén 
hatású anyagok azonosítására, valamint az S9 készítmény metabolikus képességének meger ősítésére. A pozitív kontrollnak a mikronukleusz- 
képződés ismert induktorát olyan koncentrációban kell tartalmaznia, 
amely a háttérértékekben várhatóan kismérték ű, de reprodukálható növe ­
kedést okoz, és bizonyítja a vizsgálati rendszer érzékenységét. A pozitív kontrollok koncentrációját úgy kell kiválasztani, hogy a hatások egyértel ­
műek legyenek, de a kiértékel ő számára ne árulkodjanak azonnal a kódolt 
tárgylemezek tartalmáról.
 
33. A metabolikus kompetencia és a vizsgálati rendszer klasztogén anyagok 
kimutatására való képességének igazolására egyaránt metabolikus aktivációt igénylő klasztogén anyagokat (például ciklofoszfamid; benzo[a]pirén) kell 
alkalmazni. Indokolt esetben más pozitív kontroll is alkalmazható. Mivel a 
metabolikus aktivációt igényl ő egyes pozitív kontrollok bizonyos kezelési 
körülmények mellett, illetve bizonyos sejtvonalakban exogén metabolikus aktiváció nélkül is aktívak lehetnek, ezért a metabolikus aktiváció szük ­
ségességét, valamint az S9 preparátum aktivitását a kiválasztott sejtvonalban 
és a kiválasztott koncentrációk mellett kell vizsgálni.
 
34. Jelenleg nem ismert olyan aneugén hatású anyag, amely genotoxikus akti ­
vitásához metabolikus aktivációt igényelne (16). Az aneugén aktivitás vizs ­
gálata során alkalmazandó jelenleg elfogadott pozitív kontroll például a 
kolhicin és a vinblasztin. Más vegyi anyagok is alkalmazhatók, amennyiben 
a mikronukleuszok képz ődését kizárólag, vagy els ődlegesen aneugén 
hatásuk révén indukálják. Annak elkerülésére, hogy metabolikus aktiváció nélkül két pozitív kontrollt (a klasztogén és az aneugén hatás vizsgálatára) 
kelljen alkalmazni, az aneugenitás vizsgálata során alkalmazott kontroll S9 
nélkül szolgálhat pozitív kontrollként, a klasztogén hatás vizsgálatához alkalmazott kontroll pedig használható az alkalmazott metabolikus aktiváló rendszer megfelel őségének vizsgálatára. Az S9 preparátumot nem igényl ő 
sejtekben a klasztogén és az aneugén hatás vizsgálatához egyaránt szük ­
séges pozitív kontrollt alkalmazni. A javasolt pozitív kontrollokat a 3. függelék tartalmazza.
 
35. Megfontolható a vegyi anyag csoportjához tartozó pozitív kontroll haszná ­
lata, amennyiben a megfelel ő vegyi anyagok rendelkezésre állnak. Az alkal ­
mazott pozitív kontrolloknak meg kell felelniük a sejttípusnak és az akti ­
válás körülményeinek.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Minden begy űjtési időpontban oldószeres/viv őanyagos kontrollokat kell 
alkalmazni. Ezenfelül kezeletlen negatív kontrollt (amelyben nincs oldószer/ 
vivőanyag) szintén alkalmazni kell, kivéve, ha rendelkezésre állnak olyan 
publikált vagy a laboratóriumban nyert régebbi kontrolladatok, amelyek igazolják, hogy a választott oldószer az alkalmazott koncentrációban nem 
idéz elő genotoxikus vagy egyéb ártalmas hatásokat.
 
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
A kezelés ütemterve  
37. A sejtciklus meghatározott fázisában ható aneugén, illetve klasztogén 
anyagok azonosítási valószín űségének maximalizálása érdekében fontos, 
hogy a sejtciklusok valamennyi fázisa során megfelel ő számú sejtet kezel ­
jünk a vizsgált anyaggal. A kezelés ütemterve a sejtvonalak és primer sejt ­
tenyészetek esetében ezért valamelyest elérthet a limfocitákétól, amelyek mitogén stimulációt igényelnek ahhoz, hogy megkezd ődjön a sejtciklus; 
ennek tárgyalása a 41–43. bekezdésekben szerepel (16).
 
38. Az elméleti megfontolások a publikált adatokkal együtt (18) azt mutatják, 
hogy a legtöbb aneugén és klasztogén anyagot rövid, 3–6 órás kezelési 
időszak alkalmazásával – S9 jelenlétében vagy hiányában – lehet kimutatni, 
amelyet a vizsgált anyag eltávolítása és 1,5–2,0 sejtciklusnyi szaporodási időszak követ (6). A sejteket a kezelés kezdetét ől vagy végét ől számítva a 
normál sejtciklus (vagyis a kezeletlen sejtek sejtciklusa) körülbelül 1,5–2,0- 
szeresének megfelel ő idő elteltével kell begy űjteni (lásd az 1. táblázatot). A 
begyűjtési vagy visszanyerési id ők meghosszabbíthatók, amennyiben ismert 
vagy feltételezhet ő, hogy a vizsgált anyag befolyásolja a sejtciklus idejét 
(például nukleozidanalógok vizsgálata során).
 
39. Az S9 preparátumok tenyésztett eml őssejtek esetében tapasztalható potenci ­
ális citotoxicitása miatt a normál sejtciklus-id ő 1,5–2,0-szeresének 
megfelelő meghosszabbított expozíciós kezelést kizárólag S9 hiányában 
végeznek. Meghosszabbított kezelés esetén lehet őség kínálkozik a sejtek 
vizsgált vegyi anyaggal történ ő kezelésének citoB hiányában vagy jelenlé ­
tében történ ő végzésére. Ezeknek a választási lehet őségeknek azokban a 
helyzetekben van jelent őségük, amikor problémát jelenthet a vizsgált 
anyag és a citoB közötti lehetséges kölcsönhatás.  
40. A sejtek kezelésének javasolt ütemtervét az 1. táblázat mutatja be. Ezek az 
általános kezelési ütemtervek a vizsgált anyag stabilitásától és reaktivitásá ­
tól, illetve az alkalmazott sejtek konkrét szaporodási jellemz őitől függően 
módosíthatóak. Minden kezelésnek az exponenciális szaporodás id ősza­
kában kell kezd ődnie és véget érnie. Ezeket az ütemterveket a következ ő, 
41–47. bekezdések mutatják be részletesebben.  
1. táblázat  
A sejtek kezelésének és begy űjtésének ideje az MNvit vizsgálat esetében  
CitoB-vel kezelt limfociták, primer sejtek és 
sejtvonalak + S9 A sejteket 3–6 órán át S9 jelenlétében kezel ­
jük; 
eltávolítjuk az S9-et és a kezelési közeget; friss közeget és citoB-t adunk hozzá; 
a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének eltel ­
tével begy űjtjük a sejteket. 
– S9 
Rövid expozíció A sejteket 3–6 órán át kezeljük; 
eltávolítjuk a kezelési közeget; 
friss közeget és citoB-t adunk hozzá; 
a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének eltel ­
tével begy űjtjük a sejteket.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Meghoszszabbított 
expozíció „A”lehetőség: A sejteket a normál sejtciklus 
1,5–2-szeresének megfelel ő ideig citoB jelenlé ­
tében kezeljük; 
az expozíciós id ő végén begy űjtjük a sejteket. 
„B”lehetőség: A sejteket a normál sejtciklus 
1,5–2-szeresének megfelel ő ideig kezeljük; 
eltávolítjuk a vizsgált anyagot; friss közeget és citoB-t adunk hozzá; a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének eltel ­
tével begy űjtjük a sejteket. 
CitoB nélkül kezelt sejtvonalak 
(Megegyezik a fentebb ismertetett kezelési ütemtervvel, azzal a kivétellel, hogy citoB hozzáadására nem kerül sor)
 
CitoB-vel kezelt limfociták, primer sejtek és sejtvonalak  
41. Limfociták esetében a leghatékonyabb módszer, ha a vizsgált anyaggal 
történő expozíciót a PHA-stimuláció után 44–48 órával kezdjük, amikorra 
a ciklusszinkronizáció már elt űnik (5). Az els ő vizsgálat során a sejteket 
3–6 órán át, S9 hiányában és jelenlétében kezeljük a vizsgált anyaggal. Eltávolítjuk a kezelési közeget, citoB-t tartalmazó friss közeggel pótoljuk, 
majd a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének megfelel ő idő elteltével 
begyűjtjük a sejteket.
 
42. Amennyiben a rövid (3–6 órás) kezeléssel végzett mindkét els ő vizsgálat 
negatív vagy kétes eredmény ű, akkor meghosszabbított expozíciós id ővel, 
S9 nélkül újabb kezelést végzünk. Kétféle kezelési lehet őség áll rendelke ­
zésre, amelyek mindegyike egyformán elfogadott. Stimulált limfociták 
esetében, amelyeknél az exponenciális szaporodási fázis a stimulációt 
követő 96. órától csökkenhet, megfelel őbb lehet az „A” lehet őség szerint 
eljárni. Ezenfelül a „B” lehet őség esetében a sejttenyészeteknek a végleges 
mintavétel id őpontjáig nem szabad egybefügg ővé válniuk.  
— „A” lehet őség: A sejteket a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének 
megfelelő ideig kezeljük a vizsgált anyaggal, majd a kezelési id ő 
végén begy űjtjük.  
— „B” lehet őség: A sejteket a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének 
megfelelő ideig kezeljük a vizsgált anyaggal. Eltávolítjuk a kezelési 
közeget és friss közeggel pótoljuk, majd a normál sejtciklus 1,5–2,0- 
szeresének megfelel ő további id őszak elteltével begy űjtjük a sejteket.  
43. A primer sejteket és sejtvonalakat a limfocitákhoz hasonló módon kell 
kezelni, azzal a kivétellel, hogy a PHA-val 44–48 órán át végzett stimuláció nem szükséges. A limfocitáktól eltér ő egyéb sejtek esetében az expozíciót 
úgy kell végezni, hogy a vizsgálat befejezésének id őpontjában a sejtek még 
a szaporodás logaritmikus fázisában legyenek.
 
CitoB nélkül kezelt sejtvonalak  
44. A sejteket 3–6 órán át, S9 jelenlétében és hiányában kell kezelni. Eltávo ­
lítjuk a kezelési közeget és friss közeggel pótoljuk, majd a normál sejtciklus 
1,5–2,0-szeresének megfelel ő idő elteltével begy űjtjük a sejteket.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Amennyiben a rövid (3–6 órás) kezeléssel végzett mindkét els ő vizsgálat 
negatív vagy kétes eredmény ű, akkor meghosszabbított expozíciós id ővel 
újabb kezelést végzünk (S9 nélkül). Kétféle kezelési lehet őség áll rendel ­
kezésre, amelyek mindegyike egyformán elfogadott:  
— „A” lehet őség: A sejteket a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének 
megfelelő ideig kezeljük a vizsgált anyaggal, majd a kezelési id ő 
végén begy űjtjük.  
— „B” lehet őség: A sejteket a normál sejtciklus 1,5–2,0-szeresének 
megfelelő ideig kezeljük a vizsgált anyaggal. Eltávolítjuk a kezelési 
közeget és friss közeggel pótoljuk, majd a normál sejtciklus 1,5–2,0- szeresének megfelel ő további id őszak elteltével begy űjtjük a sejteket.
 
46. Az egy rétegben növ ő tenyészetekben (monolayerek) a 3-6 órás kezelés 
végén mitotikus sejtek (ismertet őjegyük, hogy alakjuk kerek, és leválnak 
a felszínről) lehetnek jelen. Mivel ezek a mitotikus sejtek könnyen leválnak, 
a vizsgált anyagot tartalmazó közeg eltávolításakor elveszhetnek. Ügyelni 
kell arra, hogy a tenyészetek átmosásakor összegy űjtsük ezeket a sejteket, 
és visszahelyezzük a tenyészetbe, ezáltal a begy űjtéskor ne veszítsünk el 
mitózisban lév ő és a mikronuleusz-képz ődés kockázatának kitett sejteket.  
A tenyészetek száma  
47. A vizsgált anyag minden koncentrációjához, valamint a viv őanyagos/oldó ­
szeres és negatív kontroll tenyészetekhez két párhuzamos tenyészetet kell 
alkalmazni. Amennyiben a párhuzamos tenyészetek között a korábbi labo ­
ratóriumi adatok alapján csak minimális eltérések igazolhatók, elfogadható lehet egy tenyészet alkalmazása. Egy tenyészet alkalmazása esetén javasolt 
nagyobb számú koncentrációkat vizsgálni.
 
A sejtek begy űjtése és a metszet elkészítése  
48. A begy űjtést és a feldolgozást minden tenyészetnél külön kell végezni. A 
sejtek előkészítéséhez hozzátartozhat a hipotóniás kezelés, ez a lépés 
azonban nem szükséges, ha a sejtek megfelel ő szétterítése egyéb módon 
is elérhet ő. A metszetkészítés során különböz ő technikák alkalmazhatók, 
amennyiben ezek az értékeléshez jó min őségű sejtpreparátumokat eredmé ­
nyeznek. A sejt citoplazmáját meg kell tartani, hogy ki lehessen mutatni a mikronukleuszokat és (a citokinezis-gátlási módszer esetén) megbízhatóan 
azonosítani lehessen a kétmagvú sejteket.
 
49. A metszetek különböz ő módszerekkel festhet ők meg, például Giemsa vagy 
fluoreszkáló DNS-specifikus festékekkel (59). DNS-specifikus festék (pél ­
dául akridin narancs (61) vagy Hoechst 33258 plusz pironin-Y (62)) hasz ­
nálatával kiküszöbölhet ők a nem DNS-specifikus festékkel járó bizonyos 
műhibák. A mikronukleuszok tartalmának (kromoszóma/kromoszómafrag ­
mentum) azonosítására antikinetokor antitestek, pancentromérás 
DNS-próbákkal végzett FISH vagy pancentroméra-specifikus primerekkel végzett  in situ  jelölés, illetve megfelel ő DNS-kontrasztfestés alkalmazható, 
amennyiben a mikronukleuszok keletkezésének mechanizmusára vonatkozó 
információkra van szükség (15)(16). A klasztogén és aneugén hatású 
anyagok megkülönböztetésére egyéb, korábban hatékonynak bizonyult módszerek is alkalmazhatók.
 
Elemzés  
50. A mikroszkópos elemzés el őtt az összes metszetet, köztük az oldószeres/ 
vivőanyagos metszeteket és a kontrollokat is egymástól függetlenül kell 
kódolni. A kódolt minták hitelesített, automatikus flow citometriával vagy 
képelemzési rendszerrel is elemezhet ők. ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. A citoB-vel kezelt tenyészetekben a mikronukleusz-képz ődés gyakoriságát 
koncentrációnként legalább 2 000 kétmagvú sejt értékelésével (tenyészete ­
ként legalább 1 000 kétmagvú sejt; két tenyészet koncentrációként) kell vizsgálni. Ha csak egy tenyészetet alkalmazunk, akkor az adott tenyészetb ől 
koncentrációként legalább 2 000 kétmagvú sejtet kell értékelni. Ha az egyes 
koncentrációkban tenyészetenként 1 000-nél vagy – egy tenyészet alkalma ­
zása esetén – 2 000-nél jelent ősen kevesebb kétmagvú sejt áll rendelkezésre, 
és nem mutatható ki a mikronukleuszok számának jelent ős növekedése, 
akkor vizsgálatot szükség szerint több sejt vagy kevésbé toxikus koncent ­
rációk alkalmazásával meg kell ismételni. Ügyelni kell arra, hogy nem 
szabad olyan kétmagvú sejteket értékelni, amelyek szabálytalan alakúak vagy amelyeknél nagyobb méret ű a két mag, továbbá nem szabad összeté ­
veszteni a rosszul szétterített sejteket a többmagvú sejtekkel. A kett őnél 
több fő magot tartalmazó sejteknél nem szabad vizsgálni a mikronukleuszo ­
kat, mivel a ezekben a sejtekben magasabb lehet a mikronukleusz-képz ődés 
háttérgyakorisága (63) (64). Egymagvú sejtek értékelése elfogadható, amennyiben a vizsgált anyagról bebizonyosodott, hogy interferál a citoB 
aktivitásával.
 
52. A citoB nélkül vizsgált sejtvonalakban a mikronukleusz-képz ődés gyakori ­
ságát koncentrációnként legalább 2 000 sejt értékelésével (tenyészetenként legalább 1 000 sejt; két tenyészet koncentrációként) kell vizsgálni. Ha 
koncentrációnként csak egy tenyészetet alkalmazunk, akkor az adott tenyé ­
szetből legalább 2 000 sejtet kell értékelni.
 
53. Amennyiben citoB-t alkalmazunk, a sejtproliferáció értékelése érdekében 
tenyészetenként legalább 500 sejtb ől meg kell határozni a CBPI-t vagy 
az RI-t (lásd 2. függelék). Amennyiben a kezeléseket citoB hiányában 
végzik, elengedhetetlen annak bizonyítása, hogy az értékelt sejtek osztódtak, amint ezt a 24–27. bekezdések is tárgyalták.
 
Elfogadhatósági kritériumok  
54. A vizsgálati módszerben leírt MNvit tesztet alkalmazni kívánó laboratóri ­
umnak igazolnia kell, hogy metabolikus aktivációval és anélkül, megbíza ­
tóan és pontosan ki tudja mutatni az ismert aneugén és klasztogén hatású anyagokat, valamint az ismert negatív vegyi anyagokat a 3. függelékben 
felsorolt referenciaanyagok alkalmazásával. Amennyiben a vizsgálatot citoB 
használata nélkül végzik, akkor a vizsgálati módszer helyes elvégzésének alátámasztására a laboratóriumnak igazolnia kell, hogy a mikronukleusz- képződés vizsgálatához értékelt sejtek egy magosztódáson átestek.
 
55. Referenciaanyagként történ ő alkalmazásra a 3. függelékben szerepl ő vegyi 
anyagok javasoltak. Helyettesít ő vagy további vegyi anyagok is alkalmaz ­
hatók, ha ezek ismert hatásúak, és ugyanolyan hatásmechanizmussal indu ­
kálják a mikronukleusz-képz ődést, továbbá igazoltan relevánsak az MNvit 
eljárással vizsgálandó vegyi anyagok szempontjából. Ezt olyan hitelesítési 
vizsgálat elvégzésével lehet indokolni, amelyhez az anyagok széles körét alkalmazzák vagy a vizsgált vegyi anyag kémiai csoportja vagy a vizsgált károsodás mechanizmusa alapján egy sz űkebb körre összpontosítanak.
 
56. Az oldószeres/viv őanyagos kontrollnak és a kezeletlen tenyészeteknek 
reprodukálhatóan alacsony és következetes mikronukleusz-képz ődési gyako ­
riságot kell produkálniuk (a 11. bekezdésben azonosított sejttípusok esetében általában 5–25 mikronukleusz/1 000 sejt). Az egyéb sejttípusok 
esetében a válaszreakciók eltér ő tartományokba eshetnek, amelyeket a sejtek 
MNvit vizsgálathoz történ ő alkalmazásának hitelesítésekor meg kell hatá ­
rozni. A historikus kontrolltartományok megállapításához a negatív kontroll, az oldószer és a pozitív kontroll adatait kell felhasználni. A vizsgálat során 
párhuzamosan értékelt negatív kontrollok/pozitív kontrollok megfelel ő­
ségének megítéléséhez ezeket az értékeket kell felhasználni.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Amennyiben a vizsgálati protokollon kisebb változtatásokat terveznek (pél ­
dául manuális értékelés helyett automatikus; új sejttípus használata), akkor 
ahhoz, hogy a módosított protokollt használatra elfogadhatónak lehessen tekinteni, a változtatás után igazolni kell a vizsgálat hatékonyságát. A haté ­
konyság igazolása magába foglalja annak bizonyítását, hogy a kromoszó ­
matörés, valamint a szám feletti vagy hiányzó kromoszómák kimutathatók, 
és a vizsgálandó kémiai anyagok adott csoportjával vagy anyagok széles körével a vizsgálat megfelel ő pozitív vagy negatív eredményeket ad.
 
ADATOK ÉS JELENTÉS  
Eredmények kezelése  
58. Amennyiben a citokinezis-gátlási technikát alkalmazzuk, a mikronuleusz- 
képződés indukciójának értékelése során (a mikronukleuszok sejtenkénti 
számától függetlenül) csak a mikronukleuszokkal rendelkez ő kétmagvú 
sejtek gyakoriságát használjuk fel. Az egy, két vagy több mikronukleusz ­
szal rendelkez ő sejtek pontozása hasznos információval szolgálhat, de 
nem kötelez ő. 
59. Egyidej űleg az összes kezelt, illetve oldószeres/viv őanyagos kontroll tenyé ­
szet esetében meg kell határozni a citotoxicitás és/vagy a citosztázis para ­
métereit is (58). Amennyiben a citokinezis-gátlási módszert alkalmazzuk, a kezelt és kontrolltenyészetek esetében a sejtcikus késésének mutatójaként ki kell számolni a CBPI-t vagy az RI-t. CitoB nélkül végzett vizsgálatoknál 
az RPD-t, az RICC-t vagy a PI-t kell alkalmazni (lásd a 2. függeléket).
 
60. Meg kell adni a tenyészetre vonatkozó egyedi adatokat. Ezenkívül táblá ­
zatos formában az összes adatot össze kell foglalni.  
61. Az MNvit vizsgálatban a mikronukleusz-képz ődést indukáló vegyi 
anyagok azért válthatnak ki ilyen hatást, mert kromoszómatörést, kromo ­
szómavesztést vagy a kett ő együttesét idézik el ő. Annak vizsgálatára, 
hogy a mikronukleusz-képz ődés indukciója klasztogén és/vagy aneugén 
hatás eredménye-e, antikinetokor antitestekkel, centroméraspecifikus in situ próbákkal vagy egyéb módszerekkel végzett további elemzések alkal ­
mazhatók.
 
Az eredmények értékelése és értelmezése  
62. Egyértelm űen pozitív vagy negatív eredmény esetén nincs el őírva további 
vizsgálattal végzend ő igazolás. A kétes eredmények tisztázhatók – a vizs ­
gálat vak jellegének fenntartása érdekében – az összes tenyészetb ől vett 
újabb 1 000 sejt vizsgálatával. Ha ezzel a módszerrel nem lehet egyértelm ű 
eredményre jutni, akkor további vizsgálatokat kell végezni. A nyomonkö ­
vetési kísérletek során mérlegelend ő a vizsgálati paraméterek módosítása a 
vizsgálati paraméterek tartományának szükség szerinti növelésével vagy csökkentésével. A módosítható vizsgálati paraméterek közé tartozik a vizs ­
gált koncentrációk különbsége, a sejtek begy űjtésének id őzítése és/vagy a 
metabolikus aktiváció körülményei.
 
63. A pozitív eredmény kimondásának számos feltétele van, például a mikro ­
nukleuszokat tartalmazó sejtek számában bekövetkezett koncentrációfügg ő 
vagy statisztikailag szignifikáns növekedés. Els őként mérlegelend ő az ered­
mények biológiai relevanciája. A válaszreakció biológiai jelent őségének 
értékelésekor támpontot adhat annak mérlegelése, hogy a megfigyelt értékek 
a kontrollokkal kapott régebbi eredmények tartományába esnek-e. A vizs ­
gálati eredmények értékelése során segítségként megfelel ő statisztikai 
módszerek alkalmazhatók (65). A statisztikai próbák eredményeit azonban 
a dózis-válasz összefüggés figyelembevételével kell értékelni. A reprodu ­
kálhatóságot és a régebbi adatokat szintén figyelembe kell venni.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Bár a legtöbb kísérlet egyértelm ű pozitív vagy negatív eredményeket fog 
hozni, bizonyos esetekben el őfordul, hogy a rendelkezésre álló adatok 
alapján nem lehet a vizsgált anyag aktivitásával kapcsolatban egyértelm űen 
állást foglalni. El őfordul, hogy az eredmények továbbra is többféleképpen 
magyarázhatók vagy megkérd őjelezhetők maradnak függetlenül attól, hogy 
hány alkalommal ismételik meg a kísérletet.  
65. Az MNvit vizsgálattal kapott pozitív eredmény azt jelzi, hogy a vizsgált 
anyag tenyésztett eml őssejtekben kromoszómatörést vagy kromoszómavesz ­
tést indukál. A negatív eredmények azt jelzik, hogy az alkalmazott vizs ­
gálati körülmények között a vizsgált anyag tenyésztett eml őssejtekben nem 
idéz elő kromoszómatöréseket és/vagy szám feletti kromoszómákat vagy 
kromoszómahiányt.  
Vizsgálati jelentés  
66. A vizsgálati jegyz őkönyvnek legalább a következ ő információkat kell tartal ­
maznia, amennyiben azok a vizsgálat lefolytatása szempontjából relevánsak:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— azonosítási adatok, valamint a CAS nyilvántartási szám és EU-szám,  
— fizikai jelleg és tisztaság,  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából releváns fizikai-kémiai tulajdon ­
ságok,  
— a vizsgált vegyi anyag reaktivitása az oldószerrel/viv őanyaggal vagy a 
sejttenyészethez alkalmazott tápközeggel,  
Oldószer/viv őanyag:  
— az oldószer/viv őanyag kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/viv őanyagban,  
Sejtek:  
— az alkalmazott sejtek típusa és eredete,  
— az alkalmazott sejtek alkalmassága,  
— adott esetben a mikoplazma-fert őzöttség hiánya,  
— a sejtciklus hosszára, a duplázódási id őre, illetve a proliferációs indexre 
vonatkozó információk,  
— limfociták alkalmazása esetén adott esetben a véradók neme, életkora és 
száma,  
— limfociták alkalmazása esetén meg kell adni, hogy teljes vér vagy szepa ­
rált limfociták expozíciója történt-e,  
— adott esetben az átoltások száma,  
— adott esetben a sejttenyészetek fenntartására alkalmazott módszerek,  
— modális kromoszómaszám,  
— a normál (negatív kontroll) sejtciklusid ő, 
Vizsgálati körülmények:  
— amennyiben alkalmaznak citokinezis-gátló anyagot, annak megnevezése 
(például citoB), illetve koncentrációja és a sejtek expozíciójának id őtar­
tama,  
— a koncentrációk kiválasztásának és a tenyészetek számának indoklása, 
beleértve a citotoxicitási adatokat és az oldhatóságra vonatkozó korlá ­
tokat, ha rendelkezésre állnak,  
— közegek összetétele, adott esetben a CO  2 –koncentráció,  
— a vizsgált anyag koncentrációi,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— a hozzáadott viv őanyag és vizsgált anyag koncentrációja (és/vagy 
térfogata),  
— inkubációs h őmérséklet és id ő, 
— a kezelés id őtartama,  
— a kezelés utáni begy űjtés időpontja,  
— adott esetben sejts űrűség a leoltáskor,  
— a metabolikus aktiváló rendszer típusa és összetétele, ideértve az elfo ­
gadhatósági kritériumokat,  
— pozitív kontrollanyagok és negatív kontrollok,  
— az alkalmazott metszetkészítési módszer és festési technika,  
— a mikronukleusz azonosításának kritériumai,  
— a vizsgált sejtek száma,  
— a citotoxicitás mérésére alkalmazott módszerek,  
— a citotoxicitás szempontjából lényeges kiegészít ő információk,  
— a pozitív, negatív és kétes vizsgálati eredmény kritériumai,  
— az alkalmazott statisztikai elemzési módszer(ek),  
— szükség esetén annak meghatározására alkalmazott módszerek, hogy a 
mikronukleuszok teljes kromoszómákat vagy csak kromoszómatöredé ­
keket tartalmaznak,  
Eredmények:  
— a citokinezis-gátlási módszer esetében az alkalmazott citotoxicitás 
mérése, például CBPI vagy RI meghatározásával; citokinezis-gátlási módszerek alkalmazása nélkül az RICC, RPD vagy PI meghatározása; szükség esetén egyéb megfigyelések, például a sejtek egybefügg ősége, 
apoptózis, nekrózis, metafázis számolás, kétmagvú sejtek el őfordulási 
gyakorisága,
 
— a precipitáció jelei,  
— a kezelési közeg pH-jára és ozmolalitására vonatkozó adatok, ameny ­
nyiben meghatározásra kerültek,  
— az elemzéshez elfogadható sejtek meghatározása,  
— az egymagvú, kétmagvú és többmagvú sejtek megoszlása, amennyiben 
citokinezis-gátlási módszert alkalmazunk,  
— a mikronukleuszokkal rendelkez ő sejtek száma minden kezelt és kont ­
rolltenyészetre megadva, valamint adott esetben annak meghatározása, 
hogy kétmagvú vagy egymagvú sejtben találhatók-e,  
— amennyiben lehetséges, a koncentráció-válasz összefüggés,  
— a párhuzamos negatív (oldószeres/viv őanyagos) kontroll és pozitív kont ­
roll kémiai adatai,  
— a negatív (oldószeres/viv őanyagos) kontroll és pozitív kontroll historikus 
kémiai adatai a tartományokkal, átlagokkal, szórással és konfidencia ­
intervallummal (például 95 %) együtt,  
— statisztikai elemzés; p-értékek, ha meghatározásra kerültek.  
Az eredmények tárgyalása  
Következtetések  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
SZAKIRODALOM  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167-172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of 
hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human 
lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone 
using multicolor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  
Mutation Res. , 322, 9-20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific cent ­
romeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 
372, 233-245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211-219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Elektronikus formátumban: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study 
on the  in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 
607, 88-124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. 
(1997), Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and 
the in vitro  chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation 
Res., 392, 45-59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells – results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137-163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123-134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 November, 2006. Elektronikus formátumban: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Elektronikus formá ­
tumban: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61-70.
 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogeni ­
city of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 
297-305.  
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789-886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in 
lymphocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. 
Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the 
frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, 85-88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Elektronikus formátum ­
ban: [http://www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An inves ­
tigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247-274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New 
York, Plenum, pp. 91-103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a deta ­
iled description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103-112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97-100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human 
lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 463-467.  
(66) Az Európai Parlament és a Tanács 850/2004/EK rendelete (2004. április 
29.) a környezetben tartósan megmaradó szerves szennyez ő anyagokról és 
a 79/117/EGK irányelv módosításáról, HL L 229., 2004.4.30., 5. o.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
1. függelék  
Fogalommeghatározások  
Aneugén:  olyan anyag vagy folyamat, amely a mitózissal vagy meiózissal történ ő 
sejtosztódási ciklus elemeivel kölcsönhatásba lépve a sejtek vagy organizmusok aneuploidiáját eredményezi.
 
Aneuploidia:  bármilyen eltérés a normális diploid (vagy haploid) kromoszóma ­
számtól, amely lehet egy vagy több szám feletti vagy hiányzó kromoszóma, nem 
tartozik viszont ide a teljes kromoszómakészlet többszöröz ődése (poliploidia).  
Apoptózis:  programozott sejthalál olyan lépések során keresztül, amelyek a sejt 
membránhoz kötött részecskékre történ ő szétesését eredményezik; a részecskék 
ezután fagocitózissal és endocitózissal kerülnek eltávolításra.  
Sejtproliferáció:  a sejtek számának növekedése mitotikus sejtosztódással.  
Centroméra:  A kromoszóma DNS-ének azon része, ahol a két kromatida összeér, 
és amelyhez a két kinetokor oldalirányban kapcsolódik.  
Klasztogén:  bármilyen anyag vagy folyamat, amely a sejtek vagy organizmusok 
populációjában szerkezeti kromoszómakárosodásokat okoz.  
Citokinezis:  a mitózist közvetlenül követ ő sejtosztódási folyamat, amelynek ered ­
ményeként két utódsejt képz ődik egy-egy sejtmaggal.  
Citokinezis-gátlási proliferációs index (CBPI):  a kezelt populációban tapasztal ­
ható másodszor osztódó sejtek aránya a kezeletlen kontrollhoz képest (a képletet 
lásd a 2. függelékben).  
Citosztázis:  a sejtszaporodás gátlása (a képletet lásd a 2. függelékben).  
Citotoxicitás:  a sejt szerkezetét vagy m űködését károsító hatások, amelyek végs ő 
soron sejthalált idéznek el ő. 
Genotoxikus:  általános kifejezés, amely magába foglalja a DNS- vagy kromoszó ­
makárosodás valamennyi típusát, köztük a töréseket, adduktok képz ődését, átren ­
deződéseket, mutációkat, kromoszómaaberrációkat és aneuploidiát. A genoto ­
xikus hatás nem minden típusa eredményez mutációkat vagy stabil kromoszóma ­
károsodást.  
Interfázisban lév ő sejtek:  azok a sejtek, amelyek nincsenek a mitózis fázisában.  
Kinetokor:  protein tartalmú struktúra, amely a kromoszóma centroméra részén 
épül fel, és amelyhez az orsórostok a sejtosztódás során köt ődnek, lehet ővé téve 
a leánykromoszómák szabályos mozgását az utódsejtek pólusaihoz.  
Mikronukleuszok:  kis magvak, amelyek a sejtmagtól külön, azon felül találhatók 
a sejtekben, és a mitózis vagy meiózis telofázisa során, lemaradó kromoszóma ­
töredékek vagy teljes kromoszómák révén képz ődnek.  
Mitózis:  a sejtmag osztódása, amely általában profázisra, prometafázisra, metafá ­
zisra, anafázisra és telofázisra osztható fel.  
Mitotikus index:  a metafázisban lév ő sejtek aránya osztva a sejtpopulációban 
megfigyelt sejtek összes számával; az adott populációban a sejtproliferáció fokát jelzi.
 
Mutagén:  örökletes elváltozást idéz el ő a génekben lév ő DNS-bázispár szekven ­
ciában vagy szekvenciákban vagy a kromoszómák szerkezetében (kromoszóma ­
aberrációk).  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondiszjunkció:  a kromatidpárok nem válnak szét, és különülnek el a kifejl ődő 
utódsejtekbe, rendellenes kromoszómaszámmal rendelkez ő utódsejteket eredmé ­
nyezve.  
Poliploidia:  ellentétben a csak egyetlen kromoszómát vagy bizonyos kromoszó ­
mákat érint ő számbeli rendellenességekkel (aneuploidia), poliploidia esetében a 
teljes kromoszómakészlet(ek) számbeli rendellenessége áll fenn.  
Proliferációs index (PI):  a citotoxicitás mérésére használható módszer olyan 
esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).  
A sejtszám relatív növekedése (RICC):  a citotoxicitás mérésére használható 
módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 2. függelékben).
 
Relatív populációduplázódás (RPD):  a citotoxicitás mérésére használható 
módszer olyan esetekben, amikor nem alkalmaznak citoB-t (a képletet lásd a 
2. függelékben).  
Replikációs index (RI):  a kezelt tenyészetben tapasztalható sejtciklusok aránya a 
kezeletlen kontrollhoz képest, az expozíciós id őszakban és a helyreállás id ősza­
kában (a képletet lásd a 2. függelékben).  
Vizsgált vegyi anyag (más néven vizsgált anyag):  Bármely anyag vagy keverék, 
amelyet ezzel a vizsgálati módszerrel vizsgálnak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
2. függelék  
A citotoxicitás értékelésére szolgáló képletek  
1. CitoB alkalmazása esetén  a citotoxicitás értékelését a citokinezis-gátlási 
proliferációs index (CBPI) vagy replikációs index (RI) alapján kell végezni 
(16) (58). A CBPI a citoB-expozíció id őszaka alatt megmutatja a sejtenkénti 
sejtciklusok átlagos számát, így alkalmazható a sejtproliferáció kiszámítására. Az RI a kezelt tenyészetekben a sejtmagok viszonylagos számát mutatja meg a kontroll tenyészetekhez képest, így alkalmazható a %-os citosztázis kiszámítá ­
sára:
 
%-os citosztázis = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
valamint:  
T = a vizsgált vegyi anyaggal kezelt tenyészet  
C = viv őanyagos kontrolltenyészet  
ahol:  
CBPI ¼ ððegymagvú sejtek száma Þ þ ð2 Ü kéétmagvú sejtek száma Þ þ ð3 Ü többmagvú sejtek száma ÞÞ 
ðsejtek száma összesen Þ 
Tehát az 1-es CBPI (az összes sejt egymagvú) 100 %-os citosztázisnak felel meg.  
Citosztázis = 100 – RI  
RI ¼ ððkétmagvú sejtek száma Þ þ ð2 Ü többmagvú sejtek száma ÞÞ ö ðsejtek összes száma Þ T 
ððkétmagvú sejtek száma Þ þ ð2 Ü többmagvú sejtek száma ÞÞ ö ðsejtek összes száma Þ C Ü 100  
T = kezelt tenyészetek  
C = kontrolltenyészetek  
2. Tehát az 53 %-os RI azt jelenti, hogy a kontroll tenyészetben kétmagvú és 
többmagvú sejtekké osztódott sejtek számához képest a kezelt tenyészetben ennek csak 53 %-a osztódott, vagyis a citosztázis 47 %-os.
 
3. Amennyiben citoB-t nem alkalmaznak , a citotoxicitás értékelésére a sejtszám 
relatív növekedése (RICC) vagy a relatív populációduplázódás (RPD) ajánlott (58), mivel mindkét módszer figyelembe veszi az osztódott sejtpopuláció arányát.
 
RICC ¼ ða sejtszám növekedése a kezelt tenyészetekben  ðvégsö – kiindulásiÞÞ 
ða sejtszám növekedése a kontrolltenyészetekben  ðvégsö – kiindulásiÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ða populáció duplázódásának száma a kezelt tenyészetekben Þ 
ða populáció duplázódásának száma a kontrolltenyészetekben Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
ahol:  
Populációduplázódás = [log (kezelés utáni sejtszám ÷ kiindulási 
sejtszám)] ÷ log 2  
4. Tehát az 53 %-os RICC vagy RPD 47 %-os citotoxicitást/citosztázist jelez.  
5. Proliferációs index (PI) alkalmazásával a citotoxicitás az 1 sejtb ől (cl1), 2 
sejtből (cl2), 3-4 sejtb ől (cl4) és 5-8 sejtb ől (cl8) álló telepek megszámlálásával 
határozható meg.  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. A PI-t a citotoxicitás értékes és megbízható paramétereként alkalmazzák a 
citoB nélkül  in situ  tenyésztett sejtvonalak esetében is (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
3. függelék  
A teljesítmény értékeléséhez ajánlott referenciaanyagok  ( 1 ) 
Kategória Vegyi anyag CAS-szám EU-szám  
1. Metabolikus aktiváció nélkül is aktív klasztogének 
Citozin-arabinozid 147-94-4 205-705-9 Mitomicin C 50-07-7 200-008-6 
2. Metabolikus aktivációt igényl ő klasztogének 
Benzo(a)pirén 50-32-8 200-028-5 
Ciklofoszfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugén anyagok 
Kolhicin 64-86-8 200-598-5 Vinblasztin 143-67-9 205-606-0 
4. Negatív anyagok 
Di-(2-etilhexil)-ftalát 117-81-7 204-211-0 
Nalidixsav 389-08-2 206-864-7 Pirén 129-00-0 204-927-3 Nátrium-klorid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) A referenciaanyagok a használatra ajánlott vegyi anyagokat képviselik. A referenciaanyagok listájában szerepl ő vegyi anyagok akkor 
helyettesíthet ők vagy egészíthet ők ki, ha azok hatása ismert, ugyanolyan hatásmechanizmussal indukálják a mikronukleusz-képz ő­
dést, és igazoltan relevánsak az MNvit eljárással vizsgálandó vegyi anyagok szempontjából. A céltól függ ően olyan hitelesítési 
vizsgálat végzése is indokolhatja ezt, amelyhez az anyagok széles körét alkalmazzák vagy a vizsgált anyag kémiai csoportja vagy  a 
vizsgált károsodás mechanizmusa alapján egy sz űkebb körre összpontosítanak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  BŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZSGÁLATI 
MÓDSZER (LLNA): DA  
BEVEZETÉS  
1. Az OECD vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó iránymutatásait és az uniós 
vizsgálati módszereket id őnként felülvizsgálják a tudományos fejl ődés, a 
változó szabályozási igények és állatjóléti megfontolások fényében. A 
bőrszenzitizáció egereknél történ ő meghatározására szolgáló els ő vizsgálati 
módszer (B.42.), a lokális nyirokcsomó-vizsgálat (LLNA; az OECD 429. vizsgálati iránymutatása) átdolgozásra került (1). Az LLNA hitelesítésének részleteit és az ezzel kapcsolatos munka áttekintését publikálták 
(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Az LLNA során a limfociták proliferációjának 
mérése radioizotópos timidin vagy jód alkalmazásával történik, ezért ameny ­
nyiben a radioaktív anyagok beszerzése, használata vagy ártalmatlanítása problémát jelent, a vizsgálat csak korlátozottan alkalmazható. Az LLNA: 
DA (a Daicel Chemical Industries, Ltd. fejlesztése) az LLNA nem radioaktív 
változata, amely az adenozin-trifoszfát (ATP) tartalom mennyiségi meghatá ­
rozását biolumineszcencia útján végzi, amely alkalmazható a limfocitaproli ­
feráció indikátoraként. Az LLNA: DA vizsgálati módszert egy szakért őkből 
álló nemzetközi értékel ő testület hitelesítette, vizsgálta felül és ajánlotta olyan 
módszerként, amely a b őrszenzitizációt okozó, illetve nem okozó vegyi 
anyagok meghatározására bizonyos megkötésekkel hasznosnak tekinthet ő (10) 
(11) (12) (13). A vizsgálati módszer célja a vegyi anyagok (anyagok és keveré ­
kek) bőrszenzibilizáló hatásának állatoknál történ ő felmérése. E melléklet B.6. 
fejezete és az OECD 406. vizsgálati iránymutatása tengerimalac-vizsgálatokat alkalmaz, nevezetesen a tengerimalac-maximizációs módszert és Bühler-vizs ­
gálatot (14). Az LLNA (e melléklet B.42. fejezete; az OECD 429. vizsgálati 
iránymutatása) és a két nem radioaktív módosított eljárás, az LLNA: DA (e melléklet B.50. fejezete; az OECD 442. A. vizsgálati iránymutatása) és az LLNA: BrdU-ELISA (e melléklet B.51. fejezete; az OECD 442. B. vizsgálati 
iránymutatása) egyaránt el őnyösebb a B.6. fejezetben és az OECD 406. vizsgálati 
iránymutatásában (14) szerepl ő tengerimalac-vizsgálatnál abból a szempontból, 
hogy kevesebb állat használatát igényli és kíméletesebb.
 
2. Az LLNA-hoz hasonlóan az LLNA: DA is a b őrszenzibilizáció indukciós 
fázisát vizsgálja, és a dózis-válasz értékelésére alkalmas mennyiségi adatokat szolgáltat. Emellett azáltal, hogy a b őrszenzibilizáló anyagokat a DNS radio ­
aktív jelölése nélkül lehet kimutatni, a munka során kiküszöbölhet ő a radio­
aktivitásnak való kitettség, valamint a hulladék ártalmatlanításának problé ­
mája. Ez viszont az egerek nagyobb arányú használatát jelentheti a b őrszen­
zibilizáló anyagok kimutatására, ami a b őrszenzibilizáló képesség vizsgálata 
során tovább csökkenthetné a tengerimalacok használatát (pl. B.6. fejezet; az 
OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (14).
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
3. Az alkalmazott fogalmak meghatározása az 1. függelékben található.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
4. Az LLNA: DA egy módosított LLNA módszer, amely bizonyos korlátozások 
mellett a potenciális b őrszenzibilizáló vegyi anyagok azonosítására szolgál. 
Ez nem feltétlenül jelenti azt, hogy az LLNA vagy a tengerimalac-vizsgálat 
(lásd B.6. fejezet, az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (14) helyett 
minden esetben az LLNA: DA-t kell alkalmazni, inkább azt, hogy ez a vizsgálati módszer ugyanolyan hasznos, és olyan alternatív módszerként alkalmazható, amely esetében a pozitív és negatív eredmények általában 
már nem igényelnek további meger ősítést (10) (11). A vizsgálat elvégzése 
előtt a vizsgáló laboratóriumnak a vizsgált anyagról rendelkezésre álló
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
összes adatot figyelembe kell vennie. Ezen információk közé tartozik a vizs ­
gált anyag azonosítása, kémiai szerkezete, fizikai-kémiai tulajdonságai, vala ­
mint a vizsgált anyaggal korábban végzett  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizs ­
gálatok eredményei és a szerkezetileg rokon vegyi anyagok toxikológiai adatai is. Mindezen információk figyelembevételével dönthet ő el, hogy az LLNA: DA 
módszer alkalmazható-e a vizsgált anyag esetében (tekintve, hogy bizonyos 
vegyianyag-típusoknál inkompatibilitás áll fenn [lásd az 5. bekezdést]), és milyen dózist célszer ű választani a vizsgálatokhoz.
 
5. Az LLNA: DA  in vivo  módszer, következésképpen nem küszöbölhet ő ki vele 
az állatok felhasználása az allergiás kontakt szenzibilizáló hatás vizsgálata 
során. Ugyanakkor a tengerimalac-vizsgálatokhoz képest (B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) lehet ővé teszi az állatok ilyen célú 
felhasználásának csökkentését (14). Továbbá az állatok kontakt szenzibilizá ­
ciós vizsgálatok során történ ő felhasználásának módját tekintve az LLNA: 
DA jelent ősen kíméletesebb (kevesebb fájdalmat és szenvedést okoz), mivel 
a B.6. fejezet és az OECD 406. vizsgálati iránymutatásával ellentétben az LLNA: DA esetében nincs szükség indukált b őr-hiperszenzitivitási reakciók 
előidézésére. A B.6. fejezetben és az OECD 406. vizsgálati iránymutatásában 
foglalt módszerrel (14) szembeni el őnyei ellenére az LLNA: DA módszernek 
vannak bizonyos korlátai, amelyek szükségessé tehetik a B.6. fejezetben és 
az OECD 406. vizsgálati iránymutatásában foglaltak alkalmazását (pl. bizo ­
nyos fémek vizsgálata, álpozitív eredmények bizonyos b őrirritáló anyagokkal 
[például bizonyos felületaktív anyagokkal] (6) [1, illetve e melléklet B.42. fejezete], vagy a vizsgált anyag oldhatósága). Továbbá az olyan funkcionális 
csoportokat tartalmazó anyagcsoportok, illetve anyagok, amelyek potenciális 
zavaró tényez őként szerepelnek (16) szükségessé tehetik a tengerimalac-vizs ­
gálatok (vagyis a B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása (14)) használatát. Az LLNA esetében megállapított korlátozásokat (1, illetve e 
melléklet B.42. fejezete) az LLNA: DA módszerre is ajánlott alkalmazni 
(10). Ezenkívül az LLNA: DA módszer nem feltétlenül alkalmas olyan anyagok vizsgálatára, amelyek befolyásolják az ATP szintjét (például ATP-gátlóként ható anyagok) vagy az intracelluláris ATP pontos mérését 
(például az ATP-t bontó enzimek jelenléte vagy extracelluláris ATP jelenléte 
a nyirokcsomóban). E meghatározott hiányosságokon kívül, az LLNA: DA bármilyen anyag vizsgálatára megfelel ő, kivéve, ha ezek az anyagok olyan 
tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek befolyásolják az LLNA: DA 
pontosságát. Emellett abban az esetben, ha a stimulációs indexre (SI) kapott 
érték 1,8 és 2,5 közé esik figyelembe kell venni a határértéken lév ő pozitív 
eredmények lehet őségét is (lásd a 31–32. bekezdést). Ez egy legalább 1,8 
értékű stimulációs indexszel rendelkez ő, 44 anyagot magában foglaló hite ­
lesítési adatbázison alapul (lásd a 6. bekezdést), amely esetében az LLNA: 
DA módszer helyesen azonosította mind a 32, az LLNA módszer szerint szenzibilizáló anyagot, de hibásan azonosított három anyagot az LLNA módszerrel nem szenzibilizálóként meghatározott, 1,8 és 2,5 közötti 
SI-értékkel (vagyis határértéken lév ő pozitív) rendelkez ő 12 anyagok közül 
(10). Mivel azonban az SI-értékek beállításához és a vizsgálat prediktív jellemzőinek kiszámításához ugyanazt az adatállományt alkalmazták, a 
megadott eredmények túlbecsülhetik a valós prediktív jellemz őket.
 
A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
6. Az LLNA: DA módszer hátterében az az alapelv áll, hogy a szenzibilizáló 
anyagok els ődleges limfocitaproliferációt indukálnak a vizsgált anyag alkal ­
mazási területének nyirokelvezetésér ől gondoskodó nyirokcsomókban. Ez a 
proliferáció arányos az alkalmazott allergén dózisával és er ősségével, vala ­
mint egyszer ű módszert biztosít a szenzibilizáció kvantitatív méréséhez. A 
proliferációt úgy mérik, hogy a vizsgálati csoportokban mért átlagos prolife ­
rációt összehasonlítják a viv őanyaggal kezelt csoportban mért proliferációval. 
Meghatározzák az egyes kezelt csoportokban és a párhuzamosan viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoportokban mért átlagos proliferáció arányát,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
amelyet stimulációs indexnek (SI) neveznek, és amelynek legalább ≥ 1,8-nek 
kell lennie ahhoz, hogy indokolt legyen a vizsgált anyag potenciális b őrszen­
zibilizáló anyagként történ ő további vizsgálata. Az itt leírt eljárások az ATP 
tartalom biolumineszcenciával történ ő mérésén alapulnak (az ATP-r ől ismert, 
hogy korrelál az él ő sejtek számával) (17), amely az elvezet ő aurikuláris 
nyirokcsomókban lév ő proliferáló sejtek számának növekedését jelzi (18) 
(19). A biolumineszcens módszer során alkalmazott luciferáz enzim ATP-ből és luciferinb ől fény képz ődését katalizálja a következ ő reakció 
lezajlásával:
 
ATP + luciferin  + O 2
 Oxiluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + fény  
A kibocsátott fény intenzitása lineáris összefüggést mutat az ATP koncent ­
rációjával, és luminométerrel mérhet ő. A luciferin-luciferáz vizsgálat széles 
körében alkalmazott, érzékeny módszer az ATP mennyiségi meghatározására 
(20).  
A VIZSGÁLAT LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
7. Ehhez a vizsgálathoz az egér a választandó faj. A LLNA: DA módszerhez a 
hitelesítési vizsgálatokat kizárólag a CBA/J törzzsel végezték, amely ezért 
preferált törzsnek tekintend ő (12) (13). Fiatal feln őtt nullipara és nem 
vemhes n őstény egereket kell használni. A vizsgálat elején az állatok korának 
8-12 hétnek kell lennie, az állatok testtömege között az eltérésnek minimá ­
lisnak kell lennie, és a testtömeg nem haladhatja meg az átlagos testtömeg 
20 %-át. Ha elegend ő adat áll rendelkezésre arra nézve, hogy az LLNA: DA 
módszerrel kapott válaszreakcióban nincsenek jelent ős törzs- és/vagy ivars ­
pecifikus különbségek, akkor más törzsek, illetve hím állatok is alkalmazha ­
tók. 
Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
8. Az egereket csoportosan kell tartani (21), kivéve, ha az egyedenkénti tartásra 
megfelelő tudományos indok merül fel. A kísérleti állatok tartásául szolgáló 
helyiség h őmérsékletének 22 °C ± 3 °C-nak kell lennie. Noha a helyiség 
relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtar­
tamától eltekintve – lehet őség szerint nem haladhatja meg a 70 %-ot, a 
célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 
órás világos, 12 órás sötét periódusok váltakozásával. Az etetéshez a szokásos laboratóriumi takarmány alkalmazható korlátlan mennyiség ű ivóvíz 
biztosítása mellett.
 
Az állatok el őkészítése  
9. Az állatokat véletlenszer űen választják ki, majd egyedi azonosítóval látják el 
(viszont az állat fülén semmiféle azonosító nem alkalmazható), és a kezelés 
megkezdése el őtt legalább 5 napig a ketrecükben tartják őket, hogy hozzá ­
szokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. A kezelés megkezdése el őtt 
minden állatot megvizsgálnak, hogy meggy őződjenek arról, nincs rajtuk 
látható bőrsérülés.  
A dózisok el őkészítése  
10. A szilárd halmazállapotú vegyi anyagokat az egér fülén történ ő alkalmazás 
előtt oldószerben/viv őanyagban kell feloldani vagy szuszpendálni, és 
szükség esetén hígítani kell. A folyadék halmazállapotú vegyi anyagokat hígítatlanul vagy az adagolás el őtt hígított formában lehet alkalmazni. A 
nem oldható vegyi anyagokat, például az orvosi eszközökben általánosan 
előforduló anyagokat megfelel ő oldószerben történ ő agresszív extrakciónak 
kell kitenni, hogy a vizsgálat során az egér fülén való alkalmazás el őtt az 
összes kivonható összetev őt feltárjuk. A vizsgált anyagokat naponta kell 
elkészíteni, kivéve, ha stabilitási adatok igazolják, hogy a tárolás elfogad ­
ható.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
A megbízhatóság ellen őrzése  
11. A vizsgálat megfelel ő teljesítményének megfelel ő és reprodukálható szenzi ­
tivitással adott válaszreakciókkal történ ő igazolására pozitív 
kontrollanyagokat (PK) alkalmaznak olyan szenzibilizáló tesztanyagként, amelynél a válaszreakció mértéke pontosan meghatározott. Pozitív kontroll párhuzamos vizsgálata ajánlott, mert ez igazolja, hogy a laboratórium 
megfelelő szakértelemmel végzi az egyes vizsgálatokat, és lehet ővé teszi a 
laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodukálhatóság és összehasonlíthatóság értékelését. Néhány szabályozó hatóság szintén el őírja 
a pozitív kontroll minden vizsgálat során történ ő alkalmazását, ezért az 
LLNA: DA módszer elvégzése el őtt ajánlott egyeztetni az illetékes hatósá ­
gokkal. Ennek megfelel ően javasolt a pozitív kontroll rutinszer ű párhuzamos 
vizsgálata, hogy elkerülhet őek legyenek az olyan további állatkísérletek, 
amelyeket a pozitív kontrollt csak id őszakosan alkalmazó laboratórium az 
előírásoknak való megfelelés érdekében végezne (lásd a 12. bekezdést). A 
pozitív kontrollnak az LLNA: DA módszerrel olyan expozíciós szint mellett kell pozitív válaszreakciót adnia, amely a negatív kontrollcsoporthoz (NK) képest várhatóan legalább 1,8-del növeli a stimulációs indexet (SI). A pozitív 
kontroll dózisát úgy kell megválasztani, hogy ne okozzon túlzott b őrirritációt 
vagy szisztémás toxicitást, és az indukció reprodukálható, de ne túl nagy ­
mértékű legyen (például SI > 10 már túlzottnak tekinthet ő). Az előnyben 
részesítend ő pozitív kontrollanyagok a 25 %-os hexil-cinnemaldehid (Che ­
mical Abstracts Service [CAS] szám: 101-86-0) és a 25 %-os eugenol (CAS- 
szám: 97-53-0) aceton:olívaolaj (4:1, v/v) arányú keverékében. Adódhatnak olyan körülmények, amelyek fennállásakor, megfelel ő indoklás esetén a fenti 
kritériumoknak megfelel ő más pozitív kontrollanyagok is alkalmazhatók.
 
12. Bár ajánlott a pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata, lehetnek 
azonban olyan helyzetek, amikor a pozitív kontroll id őszakos (például 
legalább 6 havonta végzett) vizsgálata elfogadható lehet az LLNA: DA vizs ­
gálatot rendszeresen (vagyis legalább havonta egyszeri gyakorisággal) végz ő 
laboratóriumok esetében, amelyek rendelkeznek pozitív kontrollok igazolt, 
historikus adatbázisával, és ezzel bizonyítható, hogy a laboratórium a pozitív 
kontrollokkal képes reprodukálható és pontos eredményeket el őállítani. Az 
LLNA: DA módszerben való jártasság alátámasztható a pozitív kontrollal megfelelő időszakon belül (kevesebb mint egy éve) végzett legalább 10 
független vizsgálat során kapott következetesen pozitív eredményekkel.
 
13. Pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata minden alkalommal szükséges, 
valahányszor az LLNA: DA vizsgálati módszerében változtatást hajtanak 
végre (például a képzett személyzet, a vizsgálati eljárás során használt anyagok és/vagy reagensek, a vizsgálati eszközök, a kísérleti állatok beszer ­
zési forrásának megváltoztatása), és ezeket a változásokat dokumentálni kell 
a laboratóriumi jelentésekben. Figyelembe kell venni, hogy ezek a változta ­
tások mennyiben befolyásolják a korábban létrehozott historikus adatbázis megfelelőségét, és el kell dönteni, hogy szükséges-e új historikus adatbázis 
felállítása a pozitív kontroll eredményei következetességének dokumentálása 
érdekében.
 
14. A vizsgálatot végz ő személyeknek tisztában kell lenniük azzal, hogy ameny ­
nyiben a párhuzamos vizsgálat helyett a pozitív kontrollok id őszakos vizs ­
gálata mellett döntenek, ez hatással lehet a pozitív kontrollok id őszakos 
vizsgálatai közötti id őszakokban, párhuzamos pozitív kontroll vizsgálata 
nélkül előállított negatív vizsgálati eredmények megfelel őségére és elfogad ­
hatóságára. Ha például a pozitív kontrollal végzett id őszakos vizsgálat álne ­
gatív eredményt adott, akkor megkérd őjelezhetők azok a negatív eredmé ­
nyek, amelyek az utolsó elfogadható eredmény ű és az elfogadhatatlan ered ­
ményű időszakos pozitív kontroll vizsgálat között eltelt id őszakban keletkez ­
tek. Az ilyen következmények jelent őségét körültekint ően mérlegelni kell 
annak eldöntésekor, hogy pozitív kontrollokat párhuzamosan vagy csak időszakosan vizsgáljanak-e. Szintén megfontolandó a kevesebb állat haszná ­
lata a párhuzamos pozitív kontrollcsoportban, amennyiben ez tudományosan 
indokolt, és a laboratóriumra specifikus historikus adatok alapján a labora ­
tórium igazolja, hogy megfelel ő a kevesebb egér használata (22).
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Bár a pozitív kontrollt olyan viv őanyagban kell vizsgálni, amelyr ől ismert, 
hogy következetes válaszreakciót vált ki (például aceton:olívaolaj; 4:1, v/v 
arányú keveréke), lehetnek olyan szabályozási helyzetek, amikor nem szok ­
ványos viv őanyagokban (klinikailag/kémiailag releváns készítmény) történ ő 
vizsgálat elvégzésére is szükség van (23). Amennyiben a párhuzamos pozitív 
kontrollt a vizsgált anyagétól eltér ő vivőanyagban vizsgálják, akkor a párhu ­
zamos pozitív kontrollal együtt egy külön viv őanyagos kontrollt is vizsgálni 
kell. 
16. Azokban az estekben, amikor egy bizonyos vegyi csoportba tartozó anya ­
gokat vagy a válaszreakciók tartományát értékelik, szintén hasznos lehet a 
referenciaanyagok alkalmazása annak igazolására, hogy a vizsgálati módszer 
megfelelően működik az ilyen típusú anyagok b őrszenzibilizáló hatásának 
kimutatására. A megfelel ő referenciaanyagoknak a következ ő tulajdonsá ­
gokkal kell rendelkezniük:  
— szerkezeti és funkcionális hasonlóság a vizsgált anyag csoportjával,  
— ismert fizikai/kémiai tulajdonságok,  
— az LLNA: DA módszerrel kapott alátámasztó adatok,  
— egyéb állatmodellekb ől és/vagy emberb ől származó alátámasztó adatok.  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
Az állatok száma és a dózisszintek  
17. Minden dóziscsoportban legalább négy állatot kell használni, és a vizsgált 
anyagból legalább három különböz ő koncentrációt, továbbá párhuzamos 
negatív kontrollcsoportot, amelyet csak a vizsgált anyaghoz használt viv ő­
anyaggal kezelnek, valamint egy pozitív kontroll csoportot kell alkalmazni (pozitív kontroll párhuzamos vagy a közelmúltban végzett vizsgálata a labo ­
ratórium szabályzatának megfelel ően, figyelembe véve a 11–15. bekezdésben 
foglaltakat). Megfontolandó a pozitív kontroll többféle dózisának vizsgálata, 
különösen, ha a pozitív kontroll vizsgálatát id őszakosan végzik. A kontroll ­
csoportban lév ő állatokkal ugyanúgy kell bánni és dolgozni, mint a kezelt 
csoportokban lév őkkel, azzal a kivétellel, hogy az állatokat nem kezelik a 
vizsgált anyaggal.
 
18. A dózist és a viv őanyagot a (2) és (24) számú hivatkozásokban megadott 
ajánlások alapján kell kiválasztani. Az egymás utáni dózisok kiválasztása általában megfelel ő koncentrációsorból, például 100 %, 50 %, 25 %, 
10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % stb. történik. Az alkalmazott koncentrációsort 
megfelelő tudományos megfontolások alapján kell kiválasztani. A három 
egymás utáni koncentráció kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált anyagról esetlegesen rendelkezésre álló valamennyi toxikológiai információt 
(például akut toxicitás és b őrirritáció), valamint szerkezeti és fizikai-kémiai 
adatot, hogy a legmagasabb koncentrációval a lehet ő legnagyobb expozíciót 
idézzük el ő, amely még nem okoz szisztémás toxicitást és/vagy túlzott 
mértékű lokális b őrirritációt (24) (25). Ilyen jelleg ű információk hiányában 
szükséges lehet a megel őző előszűrő vizsgálat (lásd 21–24. bekezdés).
 
19. A viv őanyagnak nem szabad megzavarnia vagy befolyásolnia a vizsgálat 
eredményét, és aszerint kell kiválasztani, hogy a vizsgált anyag oldhatósága a lehető legnagyobb koncentráció elérése érdekében maximális legyen, 
ugyanakkor a vizsgált anyag felvitelére alkalmas oldatot/szuszpenziót 
kapjunk. A javasolt viv őanyagok az aceton:olívaolaj (4:1 v/v) keveréke, 
N,N-dimetilformamid, metil-etil-keton, propilén-glikol és dimetil-szulfoxid (6), de megfelel ő tudományos indoklás esetén más viv őanyagok is alkalmaz ­
hatók. Bizonyos esetekben további kontrollként szükséges lehet valamely 
klinikai szempontból releváns oldószer használata, vagy annak a kereske ­
delmi formulának az alkalmazása, amelyben a vizsgált anyagot forgalomba hozzák. Különösen vigyázni kell arra, hogy megfelel ő szolubilizáló szerek 
(pl. 1 % Pluronic® L92) alkalmazásával a hidrofil anyagokat olyan viv ő­
anyag-rendszerbe építsük be, amely benedvesíti a b őrt, de nem folyik le 
azonnal. A teljesen vizes alapú viv őanyagokat tehát kerülni kell.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. A nyirokcsomók egyedenként történ ő feldolgozása lehet ővé teszi az egyedek 
közötti variabilitás, valamint a vizsgált anyaggal és a viv őanyaggal kezelt 
csoport eredményeinek statisztikai összehasonlítását (lásd a 33. bekezdést). Emellett csak akkor lehet értékelni, hogy lehetséges-e csökkenteni a pozitív kontrollcsoportban lév ő egerek számát, ha az egyedi állatokra vonatkozóan 
gyűjtünk adatokat (22). Ezen túlmen ően, egyes szabályozó hatóságok is 
megkövetelik az egyedi állatokon alapuló adatgy űjtést. Az egyedi állatokon 
alapuló adatgy űjtés rendszeresítése állatjóléti el őnyökkel jár azáltal, hogy 
elkerülhet ő a vizsgálatok megismétlése abban az esetben, amikor a vizsgált 
anyagról eredetileg csak egyféleképpen gy űjtötték az adatokat (pl. összevont 
állatkísérletes adatok), míg a szabályozó hatóság kés őbb eltérő követelmé ­
nyeket állít fel (pl. egyedi állatokon alapuló adatok).
 
Előszűrő vizsgálat  
21. A legmagasabb vizsgálandó dózis meghatározását lehet ővé tevő információ 
hiányában (lásd a 18. bekezdést) az LLNA: DA módszerhez alkalmazandó megfelelő dózisszint megállapítása érdekében el őszűrő vizsgálatot kell 
végezni. Az el őszűrő vizsgálat célja, hogy támpontot adjon az LLNA: DA 
vizsgálat során alkalmazandó maximális dózis kiválasztásához, amennyiben a szisztémás toxicitást (lásd a 24. bekezdést) és/vagy nagyfokú b őrirritációt 
(lásd a 23. bekezdést) okozó koncentrációra vonatkozó információk nem 
állnak rendelkezésre. Folyadékok esetében a legmagasabb vizsgált dózisnak 100 %-os koncentrációnak kell lennie, szilárd anyagok vagy szuszpenziók esetében pedig a lehetséges maximális koncentrációnak.
 
22. Az el őszűrő vizsgálatot a f ő LLNA: DA vizsgálathoz hasonló körülmények 
között kell végezni, eltekintve attól, hogy nem kell a nyirokcsomó prolife ­
rációt értékelni, valamint dóziscsoportonként kevesebb állat használható. 
Dóziscsoportonként egy vagy két állat javasolt. Az egereket a szisztémás toxicitás, illetve az alkalmazás helyén fellép ő helyi irritáció jeleinek szem ­
pontjából naponta megfigyelik. A testtömeget a vizsgálat el őtt és az állat 
exterminálása el őtt is (8. nap) feljegyzik. A b őrpírt az egerek mindkét 
fülén vizsgálják és pontozzák az 1. táblázat (25) szerint. A fülvastagság értékeit egy vastagságmér ővel (például digitális mikrométer, vagy Peacock 
Dial vastagságmér ő) állapítják meg az 1. napon (az adagolás el őtt), a 3. 
napon (hozzávet őleg 48 órával az els ő dózis után), valamint a 7. napon 
(az exterminálás el őtt 24 órával) és a 8. napon. A 8. napon a fülvastagságot 
ezen kívül a fülb ől lyukasztással eltávolított szövet tömegének meghatározá ­
sával is meg lehet állapítani, amit az állat exterminálása után kell elvégezni. 
Nagyfokú helyi irritációnak min ősül a legalább ≥ 3-as pontszámú b őrpír 
és/vagy legalább ≥ 25 %-os fülvastagság a vizsgálat bármely napján (26) 
(27). A f ő LLNA: DA vizsgálathoz azt a dózist kell maximális dózisként 
választani, amely az el őszűrés során alkalmazott koncentrációsorban (lásd a 
18. bekezdést) a szisztémás toxicitást és/vagy nagyfokú helyi b őrirritációt 
okozó koncentrációnál eggyel alacsonyabb.
 
1. táblázat  
Bőrpír (erythema) pontszámai  
Megfigyelés Pontszám  
Nincs erythema 0 
Nagyon enyhe erythema (alig észlelhet ő) 1 
Jól körülírt erythema 2  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Megfigyelés Pontszám  
Közepes-súlyos erythema 3 
Súlyos (céklavörös elszínez ődés), pörkképz ődéig terjed ő erythema, amely 
lehetetlenné teszi az erythema besorolását 4 
23. A 25 %-os fülvastagság-növekedésen felül (26) (27), a b őrirritáló anyagok 
LLNA módszerrel végzett kimutatásához a kezelt állatok fülvastagságának kontrollcsoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns növekedését is használják (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Noha 25 % alatti fülvas ­
tagság esetén el őfordulhat statisztikailag szignifikáns növekedés, a nagy ­
fokú irritációval azonban ezt különösen nem hozták összefüggésbe (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Az integrált értékelés részeként alkalmazva a következ ő klinikai tünetek 
jelezhetnek szisztémás toxicitást (35), és ezáltal kijelölhetik a f ő LLNA: 
DA vizsgálat során alkalmazandó maximális dózist: az idegrendszer m űkö­
désében bekövetkez ő változások (például piloerekció, ataxia, tremorok és 
görcsrohamok); a viselkedésben bekövetkez ő változások (például agresszivi ­
tás, a tisztálkodási tevékenységekben bekövetkez ő változás, az aktivitási szint 
jelentős változása); a légzési mintázat változása (például a légvételek gyako ­
riságában és az intenzitásában bekövetkez ő változás, úgymint dyspnoe, 
zihálás és szörtyzörejek), valamint változások az táplálék- és vízfogyasztás ­
ban. Továbbá az értékelés során figyelembe kell venni a letargia és/vagy 
reakciókészség hiányának jeleit, valamint az enyhénél és pillanatnyinál foko ­
zottabb fájdalom vagy szenvedés bármilyen klinikai tünetét, az > 5 %-nál 
nagyobb arányú testtömeg-csökkenést az 1. naptól a 8. napig tartó id őszak­
ban, valamint a mortalitást. Az elhullásközeli állapotban lévõ vagy súlyos fájdalmak és szenvedés jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell (36).
 
A fő vizsgálat kísérleti ütemterve  
25. A vizsgálat kísérleti ütemterve a következ ő: 
— 1. nap:  Külön meg kell határozni, és fel kell jegyezni mindegyik állat 
testtömegét és az esetleges klinikai megfigyeléseket. Vigyük fel 1 % 
nátrium-lauril-szulfát (SLS) vizes oldatát mindkét fül dorzális oldalára 
egy SLS-oldatba mártott kefével, és négy-öt húzással be kell fedni a fülek teljes dorzális felszínét. Az SLS-tal végzett kezelés után egy órával vigyünk fel a vizsgált anyag megfelel ő hígításából 25 μl-t, valamint a 
vivőanyagot önmagában, illetve pozitív kontrollt (pozitív kontroll párhu ­
zamos vagy a közelmúltban végzett vizsgálata a laboratórium szabályza ­
tának megfelel ően, figyelembe véve a 11–15. bekezdésekben foglaltakat) 
a fülek dorzális oldalára.
 
— 2., 3. és 7. nap:  Az 1. napnak megfelel ően ismételjük meg az SLS 1 %- 
os vizes oldatával végzett el őkezelést, valamint a vizsgált anyag felviteli 
eljárását.  
— 4., 5. és 6. nap:  Nincs kezelés.  
— 8. nap:  Fel kell jegyezni minden állat testtömegét és minden klinikai 
megfigyelést. Az állatokat az alkalmazás megkezdése után körülbelül 
24–30 órával a 7. napon humánus módon extermináljuk. Mindegyik 
egér füléb ől vágjuk ki a kezelt terület nyirokelvezetésér ől gondoskodó 
füli nyirokcsomókat, és tegyük be azokat állatonként külön-külön fosz ­
fáttal pufferelt sóoldatba (PBS). A nyirokcsomók azonosításának és 
preparálásának részletei és az ehhez kapcsolódó ábrák az (22) hivatko ­
zásban találhatók. A helyi b őrreakció f ő vizsgálatban történ ő további 
monitorozásához olyan további paramétereket lehet belevenni a vizs ­
gálati protokollba, mint például a b őrpír pontozása vagy a fülvastagság 
mérése (akár vastagságmér ővel, akár elölés utáni füldarabsúly-meghatá ­
rozással).  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
A sejtszuszpenziók elkészítése  
26. Mindegyik egér esetében el kell készíteni a két oldalról kimetszett nyirok ­
csomó-sejtek (LNC) különálló sejtekb ől álló szuszpenzióját; ehhez a nyirok ­
csomót két üveg tárgylemez közé kell helyezni, és a nyirokcsomók összetö ­
réséhez enyhe nyomást kell rá gyakorolni. Miután meggy őződtünk róla, hogy 
a szövet vékony rétegben szétterjedt, válasszuk szét a két tárgylemezt. Szusz ­
pendáljuk a két tárgylemezen található szövetet PBS-ben; ehhez a tárgyleme ­
zeket Petri-csésze fölött ferdén tartva öblítsük le PBS-oldattal, eközben sejt ­
kaparóval kaparjuk le a szövetet a tárgylemezr ől. A negatív kontrollként 
szolgáló állatok nyirokcsomói kisméret űek, ezért az SI-értékre gyakorolt 
mesterséges hatások elkerülése érdekében fontos az el ővigyázatos kezelés. 
A két tárgylemez leöblítéséhez összesen 1 ml térfogatú PBS-oldatot kell használni. A Petri-csészében lév ő LNC-szuszpenziót a sejtkaparóval enyhén 
homogenizálni kell. Ezután az LNC-szuszpenzióból mikropipettával 20 μl- 
nyi adagot fel kell szívni, ügyelve arra, hogy szemmel látható membránt ne 
szívjunk fel, majd el kell keverni 1,98 ml PBS-oldattal, hogy 2 ml-nyi mintát kapjunk. Ezután ugyanilyen eljárással újabb 2 ml-es mintát kell készíteni, hogy minden állat esetében két minta álljon rendelkezésre.
 
A sejtproliferáció meghatározása (a limfociták ATP-tartalmának mérése)  
27. A nyirokcsomók ATP-tartalmában bekövetkezett növekedést a luciferin/luci ­
feráz módszerrel ATP-mérési készlet segítségével határozzuk meg, amely a 
biolumineszcenciát relatív lumineszcencia egységekben (RLU) méri. A vizs ­
gálat idejének az állat exterminálásától az ATP-tartalom méréséig mindegyik állat esetében azonosnak, körülbelül 30 percesnek kell lennie, ugyanis az ATP tartalom az állat exterminálása után id ővel feltételezhet ően fokozatosan 
csökken (12). Tehát az eljárások sorát az aurikuláris nyirokcsomók kimet ­
szésétől az ATP méréséig, az el őre meghatározott, mindegyik állat esetében 
azonos ütemterv szerint 20 percen belül el kell végezni. Az ATP-lumineszcenciát mindegyik 2 ml-es mintában mérni kell, hogy minden 
állat esetében összesen két ATP mérési eredmény álljon rendelkezésre. 
Ezután meghatározzuk az átlagos ATP-lumeneszcenciát, és a további számí ­
tásokhoz ezt alkalmazzuk (lásd a 30. bekezdést).
 
MEGFIGYELÉSEK  
Klinikai megfigyelések  
28. Naponta legalább egyszer minden egérnél meg kell vizsgálni az alkalmazás 
helyén kialakuló lokális vagy szisztémás toxicitás esetleges tüneteit. Minden 
megfigyelést szisztematikusan fel kell jegyezni minden egyes egér esetében, 
egyedi adatsor felvételével. A monitoring tervnek tartalmaznia kell azon kritériumokat, amelyek alapján azonnal azonosíthatóak az eutanáziát igényl ő, 
szisztémás toxicitást, kiterjedt helyi b őrirritációt vagy b őrkorróziót mutató 
egerek (36).
 
Testtömeg  
29. Ahogyan az a 25. bekezdésben szerepel, az egyes állatok testtömegét a vizs ­
gálat kezdetén, valamint a humánusan történ ő exterminálás tervezett id őpont­
jában kell megmérni.  
AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA  
30. Az egyes kezelési csoportokra vonatkozó eredményeket átlagos stimulációs 
indexben (SI) fejezzük ki. Az SI kiszámítása úgy történik, hogy a vizsgált anyaggal kezelt egyes csoportokban és a pozitív kontrollcsoportban kapott állatonkénti átlagos RLU-értéket el kell osztani az oldószerrel/viv őanyaggal 
kezelt kontrollcsoport átlagos állatonkénti RLU-értékével. A viv őanyaggal 
kezelt kontrollcsoportok átlagos SI-értéke tehát 1.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. A válaszreakciót akkor lehet pozitívan értékelni, ha a stimulációs index ≥ 1,8 
(10). Amikor azonban azt kell meghatározni, hogy egy határértéken lév ő 
eredmény (vagyis amikor az SI-érték 1,8 és 2,5 között van) pozitívnak tekintendő-e, akkor a dózis-válasz összefüggés er őssége, a statisztikai szig ­
nifikancia és az oldószerrel/viv őanyaggal, valamint a pozitív kontrollal kapott 
válaszreakciók következetessége is felhasználható (2) (3) (37).
 
32. Az 1,8 és 2,5 közötti SI-vel járó, határértéken lév ő pozitív válaszreakciók 
esetében a felhasználók dönthetnek úgy, hogy az eredmények pozitivitásának megerősítéséhez további információkat – például a dózis-válasz összefüggést, 
szisztémás toxicitás vagy nagyfokú irritáció jelét, illetve adott esetben a 
statisztikai szignifikanciát az SI értékekkel együtt – kívánnak figyelembe 
venni (10). Figyelembe kell venni a vizsgált anyag különféle tulajdonságait is, köztük azt, hogy mutat-e szerkezeti rokonságot ismert b őrszenzibilizáló 
anyagokkal, okoz-e nagyfokú b őrirritációt egereknél, illetve a megfigyelt 
dózis-válasz összefüggés jellegét. Ezek, illetve további megfontolások rész ­
letesebb tárgyalását lásd a (4) hivatkozásban.
 
33. Az egyedi állatokon alapuló adatgy űjtés lehetővé teszi a dózis-válasz össze ­
függés adatokban tükröz ődő fennállásának és mértékének statisztikai elem ­
zését. Bármely statisztikai elemzés tartalmazhatja a dózis-válasz összefüggés 
értékelését, valamint a vizsgálati csoportok megfelel ően korrigált összehason ­
lításait (például a dóziscsoportok páronkénti összehasonlítása a párhuzamos oldószeres/viv őanyagos kontrollcsoportokkal). A statisztikai elemzésekben a 
dózis-válasz tendenciák értékelésénél szerepelhet például lineáris regresszió 
vagy William-féle próba, a páronkénti összehasonlításoknál pedig 
Dunnett-féle próba. A megfelel ő statisztikai elemzési módszer kiválasztá ­
sakor a vizsgálónak figyelemmel kell lennie a lehetséges varianciaegyenl őt­
lenségekre és más kapcsolódó problémákra, amelyek miatt az adatok transz ­
formációjára vagy nem paraméteres statisztikai elemzésre lehet szükség. A 
vizsgálónak minden esetben el kell végeznie az SI-k kiszámítását és statisz ­
tikai elemzéseket bizonyos adatpontokkal (az úgynevezett „kiugró adatok ­
kal”) és azok nélkül.
 
ADATOK ÉS JELENTÉS  
Adatok  
34. Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, feltüntetve az egyedi 
állatok RLU-értékeit, a csoport átlagos RLU/állat értékét, a hozzá tartozó hibamutatóval (például SD, SEM), valamint az egyes dóziscsoportokban kapott átlagos stimulációs indexeket (SI) összehasonlítva a párhuzamos oldó ­
szeres/viv őanyagos kontrollcsoport értékeivel.
 
Vizsgálati jelentés  
35. A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyagok és kontrollanyagok:  
— azonosító adatok (pl. adott esetben a CAS-szám és az EU-szám; eredet; 
tisztaság; ismert szennyez ők; tételszám),  
— fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. illékonyság, stabi ­
litás, oldhatóság),  
— elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek egymáshoz 
viszonyított aránya,  
Oldószer/viv őanyag:  
— azonosító adatok (adott esetben tisztaság; koncentráció; alkalmazott térfo ­
gat), 
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Kísérleti állatok:  
— CBA egértörzs származása,  
— az állatok mikrobiológiai státusa, amennyiben ismert,  
— az állatok száma és életkora,  
— az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.,  
Vizsgálati körülmények:  
— az ATP készlet származása, tételszáma, a gyártó min őségbiztosítási/mi ­
nőség-ellenőrzési adatai,  
— a vizsgált anyagból el őállított készítménnyel és annak alkalmazásával 
kapcsolatos adatok,  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása (ezen belül adott esetben az 
előszűrési vizsgálatok eredményei),  
— a vivőanyag és a vizsgált anyag alkalmazott koncentrációja, valamint a 
vizsgált anyagból alkalmazott teljes mennyiség,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány 
típusa/eredete, a víz eredete),  
— a kezelés adatai és a mintavételek ütemezése,  
— a toxicitás mérésére alkalmazott módszerek,  
— a pozitív és negatív vizsgálati eredmény kimondásának kritériumai,  
— a protokolltól való esetleges eltérések adatai, és annak kifejtése, hogy az 
eltérés hogyan érintheti vizsgálati tervet és az eredményeket,  
A megbízhatóság ellen őrzése:  
— a legutóbbi megbízhatósági ellen őrzés eredményeinek összefoglalása az 
alkalmazott anyag, koncentráció és viv őanyag adataival együtt,  
— a vizsgálólaboratórium párhuzamosan és/vagy korábban vizsgált pozitív 
és párhuzamosan vizsgált negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollokra 
vonatkozó adatai,  
— ha nem vizsgáltak párhuzamosan pozitív kontrollt, a laboratóriumban 
legutóbb végzett id őszakos pozitív kontroll dátuma és laboratóriumi 
jelentése, valamint pozitív kontroll vizsgálatának korábbi adatait részle ­
tező jelentés, amely indokolja, hogy miért nem végzik a laboratóriumban 
pozitív kontroll párhuzamos vizsgálatát,  
Eredmények:  
— az egyes állatok testtömege a kezelés kezdetén és az exterminálás terve ­
zett időpontjában, illetve az átlagos és vonatkozó hibamutatók (pl. SD, 
SEM) kezelési csoportonként,  
— a toxicitási tünetek, ezen belül az alkalmazás helyén esetleg kialakuló 
bőrirritáció megjelenésének id őpontja és id őbeli alakulása minden egyes 
állatra vonatkozóan,  
— az állat exterminálásának id őpontja és az ATP mérésének id őpontja az 
egyes állatok esetében,  
— az állatonkénti RLU-értékek és dóziscsoportonkénti SI-értékek táblázata,  
— átlagos és kapcsolódó hibamutatók (pl. SD, SEM) az állatonkénti 
RLU-értékek esetében, az egyes kezelés csoportokban, és a kiugró 
értékek elemzése az egyes kezelési csoportokban,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— a kiszámított SI és a variabilitás megfelel ő mutatója, amely az egyedek 
közti variabilitást a vizsgált anyaggal kezelt csoportban és a kontroll ­
csoportokban egyaránt figyelembe veszi,  
— dózis-válasz összefüggés,  
— adott esetben statisztikai elemzések,  
Az eredmények tárgyalása:  
— rövid kommentár az eredményekhez, a dózis-válasz elemzéshez és adott 
esetben a statisztikai elemzésekhez, és következtetés levonása arra vonat ­
kozóan, hogy a vizsgált anyagot b őrszenzibilizáló hatásúnak kell-e tekin ­
teni vagy sem.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elektro ­
nikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985-997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins.  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Elektronikus formátum ­
ban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA:DA). NIH Publi ­
cation No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formá ­
tumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRP ­
Rept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Charac ­
terization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.  J. Pharmacol. Toxicol. 
Meth. , 58, 1-10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. 
(2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90-96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127-132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346-370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Elektronikus 
formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna- 
ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71-89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13-31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elektronikus formátum ­
ban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Backg ­
round Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].  
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195-206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Elektronikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
acutetox/Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 563-79.  
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Elektronikus formátum ­
ban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Pontosság:  A vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referen ­
ciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének muta ­
tója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést 
gyakran használják az „egyezés” megfelel őjeként, amely egy adott vizsgálati 
módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (38).  
Referenciaanyag:  A vizsgált anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként 
használt szenzibilizáló vagy nem szenzibilizáló anyag. A referenciaanyaggal 
szemben a következ ő elvárások fogalmazhatók meg: i. állandó és megbízható 
beszerzési forrásból vagy forrásokból kell származnia; ii. a vizsgált anyagok csoportjához hasonló szerkezettel és funkcionalitással kell rendelkeznie; iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell 
állniuk az anyag ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt hatástar ­
tományban ismert hatásúnak kell lennie.
 
Álnegatív eredmény:  Valamely vizsgálati módszerrel tévesen negatívnak vagy 
inaktívnak min ősített anyag, amely valójában pozitív vagy aktív.  
Álpozitív:  Valamely vizsgálattal tévesen pozitívnak vagy aktívnak min ősített 
anyag, amely valójában negatív vagy inaktív.  
Veszély:  Káros egészségügyi vagy ökológiai hatások el őidézésének lehet ősége. A 
káros hatás csak akkor jelenik meg, ha kell ő szintű az expozíció.  
Laboratóriumok közötti reprodukálhatóság:  Annak mértéke, hogy a különböz ő 
minősített laboratóriumok azonos protokoll és azonos vizsgált anyagok alkalma ­
zásával mennyire képesek min őségileg és mennyiségileg azonos eredményeket 
produkálni. A laboratóriumok közötti reprodukálhatóság az el őhitelesítési és hite ­
lesítési folyamat során kerül meghatározásra, és annak mértékét jelzi, hogy az adott vizsgálat mennyire sikeresen vihet ő át laboratóriumok között; más néven 
laboratóriumok közötti megismételhet őség (38).
 
Laboratóriumon belüli reprodukálhatóság:  Annak meghatározása, hogy az ugyan ­
azon laboratóriumban dolgozó képzett személyek meghatározott protokoll különböz ő 
időpontokban történ ő alkalmazásával mennyire sikeresen tudják reprodukálni az 
eredményeket. Más néven laboratóriumon belüli megismételhet őség (38).  
Kiugró érték:  A kiugró érték olyan megfigyelés, amely szembet űnően eltér az 
egy populációból vett véletlenszer ű minta egyéb értékeit ől. 
Minőségbiztosítás:  Irányítási folyamat, amelynek során a laboratóriumi vizsgálati 
szabványok és követelmények betartását, a jegyz őkönyvek vezetését, valamint az 
adattovábbítás pontosságát a vizsgálatot végz ő személyekt ől független személyek 
ellenőrzik. 
Megbízhatóság:  Azonos protokoll szerint végzett vizsgálati módszer laboratóri ­
umon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóságának mérésére szolgál. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámítá ­
sával állapítják meg (38).
 
Bőrszenzibilizáció:  Immunológiai folyamat, amely akkor jelentkezik, ha egy érzé ­
keny egyén lokálisan érintkezik valamely indukáló hatású allergén vegyi anyag ­
gal, amely esetlegesen kontakt szenzibilizáció kialakulásához vezet ő immunvá ­
laszt vált ki a b őrben.  
Stimulációs index (SI):  Adott vizsgált anyag b őrszenzibilizációt okozó képes ­
ségének meghatározására kiszámított érték, amely az anyaggal kezelt csoportban és a párhuzamosan viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportban tapasztalt proliferáció 
aránya.
 
Vizsgált anyag (más néven vizsgált vegyi anyag):  Bármely anyag vagy keverék, 
amelyet ezzel a vizsgálati módszerrel vizsgálnak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  BŐRSZENZIBILIZÁCIÓ: LOKÁLIS NYIROKCSOMÓ-VIZS ­
GÁLATI MÓDSZER (LLNA): BRDU-ELISA  
BEVEZETÉS  
1. Az OECD vegyi anyagok vizsgálatára vonatkozó iránymutatásait és az 
uniós vizsgálati módszereket id őnként felülvizsgálják a tudományos fejl ő­
dés, a változó szabályozási igények és állatjóléti megfontolások fényében. 
A bőrszenzibilizáció egereknél történ ő meghatározására szolgáló els ő vizs­
gálati módszer (B.42.), a lokális nyirokcsomó-vizsgálat (LLNA; az OECD 429. vizsgálati iránymutatása) átdolgozásra került (e melléklet 1. és B.42. fejezete). Az LLNA hitelesítésének részleteit és az ezzel kapcsolatos 
munka áttekintését publikálták (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Az 
LLNA során a limfociták proliferációjának mérése radioizotópos timidin vagy jód alkalmazásával történik, ezért amennyiben a radioaktív anyagok beszerzése, használata vagy ártalmatlanítása problémát jelent, a vizsgálat 
csak korlátozottan alkalmazható. Az LLNA: BrdU-ELISA (enzimhez 
kapcsolt immunszorbens vizsgálat) az LLNA vizsgálati módszer nem radioaktív változata, amely radioaktívan nem jelölt 5-bromo-2-dezoxiu ­
ridin (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS] szám: 59-14-3) felhasz ­
nálásával, ELISA alapú vizsgálati rendszerben méri a limfocitaproliferá ­
ciót. Az LLNA: BrdU-ELISA-t vizsgálati módszert egy szakért őkből álló 
független nemzetközi értékel ő testület hitelesítette, vizsgálta felül és aján ­
lotta olyan módszerként, amely a b őrszenzibilizációt okozó, illetve nem 
okozó vegyi anyagok meghatározására bizonyos megkötésekkel hasz ­
nosnak tekinthet ő (10) (11) (12). A vizsgálati módszer célja a vegyi 
anyagok (anyagok és keverékek) b őrszenzibilizáló hatásának állatoknál 
történő felmérése. E melléklet B.6. fejezete és az OECD 406. vizsgálati 
iránymutatása tengerimalac-vizsgálatokat alkalmaz, nevezetesen 
a tengerimalac-maximizációs módszert és Bühler-vizsgálatot (13). Az LLNA (e melléklet B.42. fejezete; az OECD 429. vizsgálati iránymuta ­
tása) és a két nem radioaktív módosított eljárás, az LLNA: BrdU-ELISA 
(e melléklet B.51. fejezete; az OECD 442. B. vizsgálati iránymutatása) és 
az LLNA: DA (e melléklet B.50. fejezete; az OECD 442. A. vizsgálati iránymutatása) egyaránt el őnyösebb a B.6. fejezetben és az OECD 406. 
vizsgálati iránymutatásában (13) szerepl ő tengerimalac-vizsgálatnál abból 
a szempontból, hogy kevesebb állat használatát igényli és kíméletesebben.
 
2. Az LLNA-hoz hasonlóan az LLNA: BrdU-ELISA vizsgálat is a b őrszenzi­
bilizáció indukciós fázisát vizsgálja, és a dózis-válasz értékelésére alkalmas mennyiségi adatokat szolgáltat. Emellett azáltal, hogy a b őrszenzibilizáló 
anyagokat a DNS radioaktív jelölése nélkül lehet kimutatni, a munka 
során kiküszöbölhet ő a radioaktivitásnak való kitettség, valamint a hulladék 
ártalmatlanításának problémája. Ez viszont az egerek nagyobb arányú hasz ­
nálatát jelentheti a b őrszenzibilizáló anyagok kimutatására, ami a b őrszen­
zibilizáló képesség vizsgálata során tovább csökkenthetné a tengerimalacok 
használatát (pl. B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati irányelve) (13).
 
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
3. Az alkalmazott fogalmak meghatározása az 1. függelékben található.  
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
4. Az LLNA: BrdU-ELISA egy módosított LLNA (helyi nyirokcsomó-vizs ­
gálati) módszer, amely bizonyos korlátozások mellett a b őrön túlérzékeny ­
ségi reakciót kiváltó vegyi anyagok azonosítására szolgál. Ez nem feltét ­
lenül jelenti azt, hogy az LLNA vagy a tengerimalac-vizsgálat (lásd B.6. 
fejezet, az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) (13) helyett minden esetben az LLNA: BrdU-ELISA-t kell alkalmazni, inkább azt, hogy ez a vizsgálati módszer ugyanolyan hasznos, és olyan alternatív módszerként alkalmazható, 
amely esetében a pozitív és negatív eredmények általában már nem 
igényelnek további meger ősítést (10) (11). A vizsgálat elvégzése el őtt
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
a vizsgáló laboratóriumnak a vizsgált anyagról rendelkezésre álló összes 
adatot figyelembe kell vennie. Ezen információk közé tartozik a vizsgált 
anyag azonosítása, kémiai szerkezete, fizikai-kémiai tulajdonságai, valamint a vizsgált anyaggal korábban végzett  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizs ­
gálatok eredményei és a szerkezetileg rokon vegyi anyagok toxikológiai adatai 
is. Mindezen információk figyelembevételével dönthet ő el, hogy az LLNA: 
BrdU-ELISA módszer alkalmazható-e a vizsgált anyag esetében (tekintve, hogy bizonyos vegyianyag-típusoknál inkompatibilitás áll fenn [lásd az 5. bekezdést]), és milyen dózist célszer ű választani a vizsgálatokhoz.
 
5. Az LLNA: BrdU-ELISA  in vivo  módszer, következésképpen nem küszö ­
bölhető ki vele az állatok felhasználása az allergiás kontakt szenzibilizáló 
hatás vizsgálata során. Ugyanakkor a tengerimalac-vizsgálatokhoz képest 
(B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása) lehet ővé teszi az 
állatok ilyen célú felhasználásának csökkentését (13). Továbbá az állatok kontakt szenzibilizációs vizsgálatok során történ ő felhasználásának módját 
tekintve az LLNA: BrdU-ELISA jelent ősen kíméletesebb, mivel a B.6. 
fejezetben és a 406-os OECD vizsgálati irányelvben foglaltakkal ellentétben az LLNA: BrdU-ELISA esetében nincs szükség indukált b őr-hiperszenziti ­
vitási reakciók el őidézésére. Továbbá az LLNA: BrdU-ELISA során 
a tengerimalac-maximizációs vizsgálattal ellentétben nincs szükség adjuváns 
alkalmazására sem (e melléklet B.6. fejezete, 13). Az LLNA: BrdU-ELISA alkalmazásával tehát csökkenthet ő az állatok szenvedése. A B.6. fejezetben 
és az OECD 406. vizsgálati iránymutatásában (13) foglalt módszerrel szem ­
beni előnyei ellenére az LLNA: BrdU-ELISA módszernek vannak bizonyos 
korlátai, amelyek szükségessé tehetik a B.6. fejezetben és az OECD 406. vizsgálati iránymutatásában foglaltak alkalmazását (pl. bizonyos fémek vizs ­
gálata, álpozitív eredmények bizonyos b őrirritáló anyagokkal [például bizo ­
nyos felületaktív anyagokkal] (6) [1, illetve e melléklet B.42. fejezete], vagy a vizsgált anyag oldhatósága). Továbbá az olyan funkcionális csoportokat tartalmazó anyagcsoportok, illetve anyagok, amelyek potenciális zavaró 
tényezőként szerepelnek (15) szükségessé tehetik a tengerimalac-vizsgálatok 
(vagyis a B.6. fejezet; az OECD 406. vizsgálati iránymutatása (13)) hasz ­
nálatát. Az LLNA esetében megállapított korlátozásokat (1, illetve e melléklet B.42. fejezete) az LLNA: BrdU-ELISA módszerre is javasolt 
alkalmazni (10). E meghatározott hiányosságokon kívül, az LLNA: 
BrdU-ELISA bármilyen vegyi anyag vizsgálatára megfelel ő, kivéve, ha 
ezek a vegyi anyagok olyan tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek befo ­
lyásolják az LLNA: BrdU-ELISA pontosságát. Emellett abban az esetben, 
ha a stimulációs indexre (SI) kapott érték 1,6 és 1,9 közé esik (lásd a 
31–32. bekezdést) figyelembe kell venni a határértéken lév ő pozitív ered ­
mények lehet őségét. Ez egy legalább 1,6 érték ű stimulációs indexszel 
rendelkez ő, 43 anyagot magában foglaló hitelesítési adatbázison alapul 
(lásd a 6. bekezdést), a mely esetében az LLNA: BrdU-ELISA módszer 
helyesen azonosította mind a 32, az LLNA módszer szerint szenzibilizáló anyagot, de hibásan azonosított két anyagot az LLNA módszerrel nem szenzibilizálóként meghatározott, 1,6 és 1,9 közötti SI-értékkel (vagyis 
határértéken lév ő pozitív értékkel) rendelkez ő 11 anyag közül (10). Mivel 
azonban az SI-értékek beállításához és a vizsgálat prediktív jellemz őinek 
kiszámításához ugyanazt az adatállományt alkalmazták, a megadott eredmé ­
nyek túlbecsülhetik a valós prediktív jellemz őket.
 
A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
6. Az LLNA: BrdU-ELISA módszer hátterében az az alapelv áll, hogy a 
szenzibilizáló anyagok els ődleges limfocitaproliferációt indukálnak a vizs ­
gált anyag alkalmazási területének nyirokelvezetésér ől gondoskodó nyirok ­
csomókban. Ez a proliferáció arányos az alkalmazott allergén dózisával és erősségével, valamint egyszer ű módszert biztosít a szenzibilizáció kvanti ­
tatív méréséhez. A proliferációt úgy mérik, hogy az egyes vizsgálati csopor ­
tokban mért átlagos proliferációt összehasonlítják a viv őanyaggal kezelt 
kontrollcsoportban (VK) mért átlagos proliferációval. Meghatározzák az egyes kezelt csoportokban és a párhuzamosan viv őanyaggal kezelt kontroll ­
csoportokban mért átlagos proliferáció arányát, amelyet stimulációs 
indexnek (SI) neveznek, és amelynek legalább ≥ 1,6-nek kell lennie ahhoz,
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
hogy indokolt legyen a vizsgált anyag potenciális b őrszenzibilizáló anyag ­
ként történ ő további vizsgálata. Az itt leírt eljárások a BrdU tartalom 
mérésén alapulnak, amely jelzi az elvezet ő aurikuláris nyirokcsomókban 
lévő proliferáló sejtek számának növekedését. A BrdU egy timidinanalóg, 
amely hasonlóan beépül a proliferáló sejtek DNS-ébe. A BrdU beépülését 
ELISA-val mérjük, amely peroxidázzal is jelölt BrdU-specifikus antitestet 
alkalmaz. A szubsztrát hozzáadáskor a peroxidáz reakcióba lép a szubszt ­
ráttal, és színes termék képz ődik, amelynek mennyisége meghatározott 
abszorbancia mellett mikrotiterlemez-leolvasó segítségével mérhet ő. 
A VIZSGÁLAT LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
7. Ehhez a vizsgálathoz az egér a választandó faj. A LLNA: BrdU-ELISA 
módszerhez a hitelesítési vizsgálatokat kizárólag a CBA/JN törzzsel végez ­
ték, amely ezért preferált törzsnek tekintend ő (10) (12). Fiatal feln őtt nulli­
para és nem vemhes n őstény egereket kell használni. A vizsgálat elején az 
állatok korának 8-12 hétnek kell lennie, az állatok testtömege között az 
eltérésnek minimálisnak kell lennie, és a testtömeg nem haladhatja meg az átlagos testtömeg 20 %-át. Ha elegend ő adat áll rendelkezésre arra nézve, 
hogy az LLNA:BrdU-ELISA módszerrel kapott válaszreakcióban nincsenek 
jelentős törzs- és/vagy ivarspecifikus különbségek, akkor más törzsek, 
illetve hím állatok is alkalmazhatók.
 
Az állatok tartásának és etetésének körülményei  
8. Az egereket csoportosan kell tartani (16), kivéve, ha az egyedenkénti 
tartásra megfelel ő tudományos indok merül fel. A kísérleti állatok tartásául 
szolgáló helyiség h őmérsékletének 22 °C ± 3 °C-nak kell lennie. Noha a 
helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és – a takarítás id őtartamától eltekintve – lehet őség szerint nem haladhatja meg 
a 70 %-ot, a célértéknek 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen 
mesterséges, 12 órás világos, 12 órás sötét periódusok váltakozásával. Az etetéshez a szokásos laboratóriumi takarmány alkalmazható korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett.
 
Az állatok el őkészítése  
9. Az állatokat véletlenszer űen választják ki, majd egyedi azonosítóval látják 
el (viszont az állat fülén semmiféle azonosító nem alkalmazható), és a kezelés megkezdése el őtt legalább 5 napig a ketrecükben tartják őket, 
hogy hozzászokhassanak a laboratóriumi körülményekhez. A kezelés 
megkezdése el őtt minden állatot megvizsgálnak, hogy meggy őződjenek 
arról, nincs rajtuk látható b őrsérülés.
 
A dózisok el őkészítése  
10. A szilárd halmazállapotú vegyi anyagokat az egér fülén történ ő alkalmazás 
előtt oldószerben/viv őanyagban kell feloldani vagy szuszpendálni, és 
szükség esetén hígítani kell. A folyadék halmazállapotú vegyi anyagokat 
hígítatlanul vagy az adagolás el őtt hígított formában lehet alkalmazni. A 
nem oldható vegyi anyagokat, például az orvosi eszközökben általánosan előforduló anyagokat megfelel ő oldószerben történ ő agresszív extrakciónak 
kell kitenni, hogy a vizsgálat során az egér fülén való alkalmazás el őtt az 
összes kivonható összetev őt feltárjuk. A vizsgált anyagokat naponta kell 
elkészíteni, kivéve, ha stabilitási adatok igazolják, hogy a tárolás elfogad ­
ható.
 
A megbízhatóság ellen őrzése  
11. A vizsgálat megfelel ő teljesítményének megfelel ő és reprodukálható szen ­
zitivitással adott válaszreakciókkal történ ő igazolására pozitív 
kontrollanyagokat (PK) alkalmaznak; ezek olyan szenzibilizáló tesztanya ­
gok, amelyek esetében a válaszreakció mértéke pontosan meghatározott. 
Pozitív kontroll párhuzamos vizsgálata ajánlott, mivel ez igazolja, hogy a 
laboratórium megfelel ő szakértelemmel végzi az egyes vizsgálatokat, és 
lehetővé teszi a laboratóriumon belüli és a laboratóriumok közötti reprodu ­
kálhatóság és összehasonlíthatóság értékelését. Néhány szabályozó hatóság 
szintén el őírja a pozitív kontroll minden vizsgálat során történ ő alkalmazá ­
sát, ezért az LLNA: BrdU-ELISA módszer elvégzése el őtt ajánlott  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
egyeztetni az illetékes hatóságokkal. Ennek megfelel ően javasolt a pozitív 
kontroll rutinszer ű párhuzamos vizsgálata, hogy elkerülhet őek legyenek az 
olyan további állatkísérletek, amelyeket a pozitív kontrollt csak id őszakosan 
alkalmazó laboratórium az el őírásoknak való megfelelés érdekében végezne 
(lásd 12. bekezdés). A pozitív kontrollnak az LLNA: BrdU-ELISA 
módszerrel olyan expozíciós szint mellett kell pozitív válaszreakciót adnia, 
amely a negatív kontrollcsoporthoz (NK) képest várhatóan legalább 1,6-del növeli a stimulációs indexet (SI). A pozitív kontroll dózisát úgy kell megválasztani, hogy ne okozzon túlzott b őrirritációt vagy szisztémás toxi ­
citást, és az indukció reprodukálható, de ne túl nagymérték ű legyen (például 
SI > 14 már túlzottnak tekinthet ő). Az előnyben részesítend ő pozitív kont ­
rollanyagok a 25 %-os hexil-cinnemaldehid (CAS-szám: 101-86-0) és a 25 %-os eugenol (CAS-szám: 97-53-0) aceton:olívaolaj (4:1, v/v) arányú 
keverékében. Adódhatnak olyan körülmények, amelyek fennállásakor, 
megfelelő indoklás esetén a fenti kritériumoknak megfelel ő más pozitív 
kontrollanyagok is alkalmazhatók.
 
12. Bár ajánlott a pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata, lehetnek 
azonban olyan helyzetek, amikor a pozitív kontroll id őszakos (például 
legalább 6 havonta végzett) vizsgálata elfogadható lehet az olyan, az LLNA: BrdU-ELISA vizsgálatot rendszeresen (vagyis legalább havonta 
egyszeri gyakorisággal) végz ő laboratóriumok esetében, amelyek rendel ­
keznek a pozitív kontrollok igazolt, historikus adatbázisával, és ezzel bizo ­
nyítható, hogy a laboratórium a pozitív kontrollokkal képes reprodukálható és pontos eredményeket el őállítani. Az LLNA: BrdU-ELISA módszerben 
való jártasság alátámasztható a pozitív kontrollal megfelel ő időszakon belül 
(kevesebb mint egy éve) végzett legalább 10 független vizsgálat során kapott következetesen pozitív eredményekkel.
 
13. Pozitív kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata minden alkalommal szük ­
séges, valahányszor az LLNA: BrdU-ELISA vizsgálati módszerében változ ­
tatást hajtanak végre (például a képzett személyzet, a vizsgálati eljárás során használt anyagok és/vagy reagensek, a vizsgálati eszközök, a kísérleti 
állatok beszerzési forrásának megváltoztatása), és ezeket a változásokat 
dokumentálni kell a laboratóriumi jelentésekben. Figyelembe kell venni, hogy ezek a változtatások mennyiben befolyásolják a korábban létrehozott historikus adatbázis megfelel őségét, és el kell dönteni, hogy szükséges-e új 
historikus adatbázis felállítása a pozitív kontroll eredményei következetes ­
ségének dokumentálása érdekében.
 
14. A vizsgálatot végz ő személyeknek tisztában kell lenniük azzal, hogy 
amennyiben a párhuzamos vizsgálat helyett a pozitív kontrollok id őszakos 
vizsgálata mellett döntenek, ez hatással lehet a pozitív kontrollok id őszakos 
vizsgálatai közötti id őszakokban, párhuzamos pozitív kontroll vizsgálata 
nélkül előállított negatív vizsgálati eredmények megfelel őségére és elfogad ­
hatóságára. Ha például a pozitív kontrollal végzett id őszakos vizsgálat álne ­
gatív eredményt adott, akkor megkérd őjelezhetők azok a negatív eredmé ­
nyek, amelyek az utolsó elfogadható eredmény ű és az elfogadhatatlan ered ­
ményű időszakos pozitív kontroll vizsgálat között eltelt id őszakban kelet ­
keztek. Az ilyen következmények jelent őségét körültekint ően mérlegelni 
kell annak eldöntésekor, hogy pozitív kontrollokat párhuzamosan vagy csak időszakosan vizsgáljanak-e. Szintén megfontolandó a kevesebb állat 
használata a párhuzamos pozitív kontrollcsoportban, amennyiben ez tudo ­
mányosan indokolt, és a laboratóriumra specifikus historikus adatok alapján 
a laboratórium igazolja, hogy megfelel ő a kevesebb egér használata (17).
 
15. Bár a pozitív kontrollt olyan viv őanyagban kell vizsgálni, amelyr ől ismert, 
hogy következetes válaszreakciót vált ki (például aceton:olívaolaj; 4:1, v/v 
arányú keveréke), lehetnek olyan szabályozási helyzetek, amikor nem szok ­
ványos viv őanyagokban (klinikailag/kémiailag releváns készítmény) történ ő 
vizsgálat elvégzésére is szükség van (18). Amennyiben a párhuzamos pozitív kontrollt a vizsgált anyagétól eltér ő vivőanyagban vizsgálják, 
akkor a párhuzamos pozitív kontrollal együtt egy külön viv őanyagos kont ­
rollt is vizsgálni kell.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. Azokban az estekben, amikor egy bizonyos vegyi csoportba tartozó vizsgált 
anyagokat vagy a válaszreakciók tartományát értékelik, szintén hasznos 
lehet a referenciaanyagok alkalmazása annak igazolására, hogy a vizsgálati módszer megfelel ően működik az ilyen típusú vizsgált anyagok b őrszenzi­
bilizáló hatásának kimutatására. A megfelel ő referenciaanyagoknak a követ ­
kező tulajdonságokkal kell rendelkezniük:
 
— szerkezeti és funkcionális hasonlóság a vizsgált anyag csoportjával,  
— ismert fizikai/kémiai tulajdonságok,  
— az LLNA: BrdU-ELISA módszerrel kapott alátámasztó adatok,  
— egyéb állatmodellekb ől és/vagy emberb ől származó alátámasztó adatok.  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
Az állatok száma és a dózisszintek  
17. Minden dóziscsoportban legalább négy állatot kell használni, és a vizsgált 
anyagból legalább három különböz ő koncentrációt, továbbá párhuzamos 
negatív kontrollcsoportot, amelyet csak a vizsgált anyaghoz használt viv ő­
anyaggal kezelnek, valamint egy pozitív kontroll csoportot kell alkalmazni (pozitív kontroll párhuzamos vagy a közelmúltban végzett vizsgálata a 
laboratórium szabályzatának megfelel ően, figyelembe véve a 11–15. bekez ­
désben foglaltakat). Megfontolandó a pozitív kontroll többféle dózisának vizsgálata, különösen, ha a pozitív kontroll vizsgálatát id őszakosan végzik. 
A kontrollcsoportban lév ő állatokkal ugyanúgy kell bánni és dolgozni, mint 
a kezelt csoportokban lév őkkel, azzal a kivétellel, hogy az állatokat nem 
kezelik a vizsgált anyaggal.
 
18. A dózist és a viv őanyagot a 2. és 19. számú hivatkozásokban megadott 
ajánlások alapján kell kiválasztani. Az egymás utáni dózisok kiválasztása általában megfelel ő koncentrációsorból, például 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 
5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % stb. történik. Az alkalmazott koncentrációsort 
megfelelő tudományos megfontolások alapján kell kiválasztani. A három 
egymás utáni koncentráció kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált anyagról esetlegesen rendelkezésre álló valamennyi toxikológiai információt 
(például akut toxicitás és b őrirritáció), valamint szerkezeti és fizikokémiai 
adatot, hogy a legmagasabb koncentrációval a lehet ő legnagyobb expozíciót 
idézzük el ő, amely még nem okoz szisztémás toxicitást és/vagy túlzott 
mértékű lokális b őrirritációt (19) (20, illetve e melléklet B.4. fejezete). 
Ilyen jelleg ű információk hiányában szükséges lehet a megel őző előszűrő 
vizsgálat (lásd a 21–24. bekezdést).
 
19. A viv őanyagnak nem szabad megzavarnia vagy befolyásolnia a vizsgálat ered ­
ményét, és aszerint kell kiválasztani, hogy a vizsgált anyag oldhatósága a lehet ő 
legnagyobb koncentráció elérése érdekében maximális legyen, ugyanakkor a vizsgált anyag felvitelére alkalmas oldatot/szuszpenziót kapjunk. A javasolt 
vivőanyagok az aceton:olívaolaj (4:1 v/v) keveréke, N,N-dimetilformamid, 
metil-etil-keton, propilén-glikol és dimetil-szulfoxid (6), de megfelel ő tudomá­
nyos indoklás esetén más viv őanyagok is alkalmazhatók. Bizonyos esetekben 
további kontrollként szükséges lehet valamely klinikai szempontból releváns 
oldószer használata, vagy annak a kereskedelmi formulának az alkalmazása, 
amelyben a vizsgált anyagot forgalomba hozzák. Különösen vigyázni kell arra, hogy megfelel ő szolubilizáló szerek (pl. 1 % Pluronic® L92) alkalmazá ­
sával a hidrofil vizsgált anyagokat olyan viv őanyagrendszerbe építsük be, amely 
benedvesíti a b őrt, de nem folyik le azonnal. A teljesen vizes alapú viv őanya­
gokat tehát kerülni kell.
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. A nyirokcsomók egyedenként történ ő feldolgozása lehet ővé teszi az 
egyedek közötti variabilitás, valamint a vizsgált anyaggal és a viv őanyaggal 
kezelt csoport eredményeinek statisztikai összehasonlítását (lásd a 33. bekezdést). Emellett csak akkor lehet értékelni, hogy lehetséges-e csökken ­
teni a pozitív kontrollcsoportban lév ő egerek számát, ha az egyedi állatokra 
vonatkozóan gy űjtünk adatokat (17). Ezen túlmen ően, egyes szabályozó 
hatóságok is megkövetelik az egyedi állatokon alapuló adatgy űjtést. Az 
egyedi állatokon alapuló adatgy űjtés rendszeresítése állatjóléti el őnyökkel 
jár azáltal, hogy elkerülhet ő a vizsgálatok megismétlése abban az esetben, 
amikor a vizsgált anyagról eredetileg csak egyféleképpen gy űjtötték az 
adatokat (pl. összevont állatkísérletes adatok), míg a szabályozó hatóság később eltérő követelményeket állít fel (pl. egyedi állatokon alapuló 
adatok).
 
Előszűrő vizsgálat  
21. A legmagasabb vizsgálandó dózis meghatározását lehet ővé tevő információ 
hiányában (lásd a 18. bekezdést) az LLNA: BrdU-ELISA módszerhez alkal ­
mazandó megfelel ő dózisszint megállapítása érdekében el őszűrő vizsgálatot 
kell végezni. Az el őszűrő vizsgálat célja, hogy támpontot adjon az LLNA: 
BrdU-ELISA vizsgálat során alkalmazandó maximális dózis kiválasztásá ­
hoz, amennyiben a szisztémás toxicitást (lásd a 24. bekezdést) és/vagy 
nagyfokú b őrirritációt (lásd a 23. bekezdést) okozó koncentrációra vonat ­
kozó információk nem állnak rendelkezésre. Folyadékok esetében a legma ­
gasabb vizsgált dózisnak 100 %-os koncentrációnak kell lennie, szilárd 
anyagok vagy szuszpenziók esetében pedig a lehetséges maximális koncent ­
rációnak.  
22. Az el őszűrő vizsgálatot a f ő LLNA: BrdU-ELISA vizsgálathoz hasonló 
körülmények között kell végezni, eltekintve attól, hogy nem kell a nyirok ­
csomó-proliferációt értékelni, valamint dóziscsoportonként kevesebb állat 
használható. Dóziscsoportonként egy vagy két állat javasolt. Az egereket 
a szisztémás toxicitás, illetve az alkalmazás helyén fellép ő helyi irritáció 
jeleinek szempontjából naponta megfigyelik. A testtömeget a vizsgálat el őtt 
és az állat exterminálása el őtt is (6. nap) feljegyzik. A b őrpírt az egerek 
mindkét fülén vizsgálják és pontozzák az 1. táblázat (20, illetve e melléklet 
B.4. fejezete) szerint. A fülvastagság értékeit egy vastagságmér ővel (például 
digitális mikrométer, vagy Peacock Dial vastagságmér ő) állapítják meg az 
1. napon (az adagolás el őtt), a 3. napon (hozzávet őleg 48 órával az els ő 
dózis után), valamint a 6. napon. A 6. napon a fülvastagságot ezen kívül a 
fülből lyukasztással eltávolított szövet tömegének meghatározásával is meg 
lehet állapítani, amit az állat exterminálása után kell elvégezni. Nagyfokú 
helyi irritációnak min ősül a legalább ≥ 3-as pontszámú b őrpír és/vagy 
legalább ≥ 25 %-os fülvastagság a vizsgálat bármely napján (21) (22). A 
fő LLNA: BrdU-ELISA vizsgálathoz azt a dózist kell maximális dózisként 
választani, amely az el őszűrés során alkalmazott koncentrációsorban (lásd a 
18. bekezdést) a szisztémás toxicitást és/vagy nagyfokú helyi b őrirritációt 
okozó koncentrációnál eggyel alacsonyabb.  
1. táblázat  
Bőrpír (erythema) pontszámai  
Megfigyelés Pontszám  
Nincs erythema 0 
Nagyon enyhe erythema (alig észlelhet ő) 1 
Jól körülírt erythema 2  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Megfigyelés Pontszám  
Közepes-súlyos erythema 3 
Súlyos (céklavörös elszínez ődés), pörkképz ődéig terjed ő eryt­
hema, amely lehetetlenné teszi az erythema besorolását 4 
23. A 25 %-os fülvastagság-növekedésen felül (21) (22), a b őrirritáló 
anyagok LLNA módszerrel végzett kimutatásához a kezelt állatok fülvas ­
tagságának kontrollcsoporthoz viszonyított statisztikailag szignifikáns növekedését is használják (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Noha 
25 % alatti fülvastagság esetén el őfordulhat statisztikailag szignifikáns 
növekedés, a nagyfokú irritációval azonban ezt különösen nem hozták összefüggésbe (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Az integrált értékelés részeként alkalmazva a következ ő klinikai tünetek 
jelezhetnek szisztémás toxicitást (30), és ezáltal kijelölhetik a f ő 
LLNA:BrdU-ELISA vizsgálat során alkalmazandó maximális dózist: az idegrendszer m űködésében bekövetkez ő változások (például piloerekció, 
ataxia, tremorok és görcsrohamok); a viselkedésben bekövetkez ő változások 
(például agresszivitás, a tisztálkodási tevékenységekben bekövetkez ő válto­
zás, az aktivitási szint jelent ős változása); a légzési mintázat változása (pél ­
dául a légvételek gyakoriságában és az intenzitásában bekövetkez ő változás, 
úgymint dyspnoe, zihálás és szörtyzörejek), valamint változások az táplálék- 
és vízfogyasztásban. Az értékelés során emellett figyelembe kell venni a 
letargia és/vagy reakciókészség hiányának jeleit, valamint az enyhénél és pillanatnyinál fokozottabb fájdalom vagy szenvedés bármilyen klinikai tüne ­
tét, az > 5 %-nál nagyobb arányú testtömegcsökkenést az 1. naptól a 6. 
napig tartó id őszakban, valamint a mortalitást. Az elhullásközeli állapotban 
lévõ vagy súlyos fájdalmak és szenvedés jeleit mutató állatokat humánus módon exterminálni kell (31).
 
A fő vizsgálat kísérleti ütemterve  
25. A vizsgálat kísérleti ütemterve a következ ő: 
— 1. nap:  Külön meg kell határozni, és fel kell jegyezni mindegyik állat 
testtömegét és az esetleges klinikai megfigyeléseket. Vigyünk fel 25 μl 
térfogatú, megfelel ő hígítású vizsgált anyagot, valamint a viv őanyagot 
önmagában vagy pozitív kontrollt (pozitív kontroll párhuzamos vagy a 
közelmúltban végzett vizsgálata a laboratórium szabályzatának megfele ­
lően, figyelembe véve a 11–15. bekezdésekben foglaltakat) a fülek 
dorzális oldalára.  
— 2. és 3. nap:  Ismételjük meg az 1. napon elvégzett felviteli eljárást.  
— 4. nap:  Nincs kezelés.  
— 5. nap:  Fecskendezzünk be 0,5 mL (5 mg/egér) BrdU (10 mg/ml) 
oldatot intraperitoneálisan.  
— 6. nap:  Fel kell jegyezni minden állat testtömegét és minden klinikai 
megfigyelést. A BrdU befecskendezése után körülbelül 24 órával (24 h) 
extermináljuk az állatokat. Mindegyik egér füléb ől vágjuk ki a kezelt 
terület nyirokelvezetésér ől gondoskodó füli nyirokcsomókat, és tegyük 
be azokat állatonként külön-külön foszfáttal pufferelt sóoldatba (PBS). 
A nyirokcsomók azonosításának és preparálásának részletei és az ehhez 
kapcsolódó ábrák a (17) hivatkozásban találhatók. A helyi b őrreakció f ő 
vizsgálatban történ ő további monitorozásához olyan további paraméte ­
reket lehet belevenni a vizsgálati protokollba, mint például a b őrpír 
pontozása vagy a fülvastagság mérése (akár vastagságmér ővel, akár 
elölés utáni füldarabsúly-meghatározással).  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
A sejtszuszpenziók elkészítése  
26. Az egyes állatokból két oldalról vett nyirokcsomósejtekb ől (LNC) egysejt ­
szuszpenziót kell készíteni a sejtek mechanikus úton történ ő óvatos szét ­
választásával, amely végezhet ő 200 mikrométeres lyukméret ű rozsdamentes 
acélból készült fémhálóval vagy egyéb elfogadható módszerrel (pl. a nyirokcsomók egyszer használatos m űanyag mozsárban történ ő összetörése, 
majd 70-es nejlonhálón való átpréselése). Az LNC szuszpenzió elkészítése a 
vizsgálat szempontjából dönt ő fontosságú, ezért a módszert a vizsgálatot 
végző valamennyi munkatársnak el őre el kell sajátítani. A negatív kontroll ­
ként szolgáló állatok nyirokcsomói kisméret űek, ezért az SI-értékre gyako ­
rolt mesterséges hatások elkerülése érdekében fontos az el ővigyázatos keze ­
lés. Az LNC szuszpenzió céltérfogatát minden esetben a meghatározott optimalizált térfogathoz kell igazítani (körülbelül 15 ml). Az optimális térfogat meghatározása a negatív kontrollcsoport 0,1–0,2 közötti átlagos 
abszorbanciájának elérésén alapul.
 
A sejtproliferáció meghatározása (a BrdU limfociták DNS-ébe való beépülé ­
sének mérése)  
27. A BrdU mérése a kereskedelemben kapható ELISA készlet (például Roche 
Applied Science, Mannheim, Németország, katalógusszám: 11 647 229 
001) használatával történik. A mérés lényege, hogy az LNC-szuszpenzióból három adagban 100 μl-t kell egy lapos aljú mikrotiterlemez mélyedéseibe 
adagolni. Az LNC fixálása és denaturálása után mindegyik mélyedésbe 
anti-BrdU-antitestet kell adni, majd várni kell, hogy a reakció kialakuljon. 
Ezután az anti-BrdU antitestet mosással el kell távolítani, majd hozzá kell adni a szubsztrátoldatot, és várni kell, hogy kialakuljon a kromogén termék. Ekkor 370 nm-en 492 nm-es referencia-hullámhossz mellett mérni kell az 
abszorbanciát. A vizsgálati körülményeket minden esetben optimalizálni 
kell (lásd a 26. bekezdést).
 
MEGFIGYELÉSEK  
Klinikai megfigyelések  
28. Naponta legalább egyszer minden egérnél meg kell vizsgálni az alkalmazás 
helyén kialakuló lokális vagy szisztémás toxicitás esetleges tüneteit. Minden megfigyelést szisztematikusan fel kell jegyezni minden egyes egér esetében, egyedi adatsor felvételével. A monitoring tervnek tartalmaznia kell azon 
kritériumokat, amelyek alapján azonnal azonosíthatóak az eutanáziát 
igénylő, szisztémás toxicitást, kiterjedt helyi b őrirritációt vagy b őrkorróziót 
mutató egerek (31).
 
Testtömeg  
29. Ahogyan az a 25. bekezdésben szerepel, az egyes állatok testtömegét a 
vizsgálat kezdetén, valamint a humánusan történ ő exterminálás tervezett 
időpontjában kell megmérni.  
AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA  
30. Az egyes kezelési csoportokra vonatkozó eredményeket átlagos stimulációs 
indexben (SI) fejezzük ki. Az SI kiszámítása úgy történik, hogy a vizsgált anyaggal kezelt egyes csoportokban és a pozitív kontrollcsoportban kapott állatonkénti átlagos BrdU jelölési indexet el kell osztani az oldószerrel/viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoport átlagos BrdU jelölési indexével. A viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoportok átlagos SI-értéke tehát 1.
 
A BrdU jelölési index meghatározása:  
BrdU jelölési index = (ABS  em – ABS vak  em ) – (ABS  ref – ABS vak  ref ) 
em = kibocsátott hullámhossz; ref = referencia hullámhossz.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. A válaszreakciót akkor lehet pozitívan értékelni, ha a stimulációs index 
≥ 1,6 (10). Amikor azonban azt kell meghatározni, hogy egy határértéken 
lévő eredmény (vagyis amikor az SI-érték 1,6 és 1,9 között van) pozitívnak 
tekintendő-e, akkor a dózis-válasz összefüggés er őssége, a statisztikai szig ­
nifikancia és az oldószerrel/viv őanyaggal, valamint a pozitív kontrollal 
kapott válaszreakciók következetessége is felhasználható (3) (6) (32).  
32. Az 1,6 és 1,9 közötti SI-vel járó, határértéken lév ő pozitív válaszreakciók 
esetében a felhasználók dönthetnek úgy, hogy az eredmények pozitivitá ­
sának meger ősítéséhez további információkat – például a dózis-válasz 
összefüggést, szisztémás toxicitás vagy nagyfokú irritáció jelét, illetve 
adott esetben a statisztikai szignifikanciát az SI értékekkel együtt – 
kívánnak figyelembe venni (10). Figyelembe kell venni a vizsgált anyag különféle tulajdonságait is, köztük azt, hogy mutat-e szerkezeti rokonságot ismert bőrszenzibilizáló anyagokkal, okoz-e nagyfokú b őrirritációt egerek ­
nél, illetve a megfigyelt dózis-válasz összefüggés jellegét. Ezek, illetve 
további megfontolások részletesebb tárgyalását lásd a (4) hivatkozásban.
 
33. Az egyedi állatokon alapuló adatgy űjtés lehetővé teszi a dózis-válasz össze ­
függés adatokban tükröz ődő fennállásának és mértékének statisztikai elem ­
zését. Bármely statisztikai elemzés tartalmazhatja a dózis-válasz összefüggés 
értékelését, valamint a vizsgálati csoportok megfelel ően korrigált összeha ­
sonlításait (például a dóziscsoportok páronkénti összehasonlítása a párhu ­
zamos oldószeres/viv őanyagos kontrollcsoportokkal). A statisztikai elemzé ­
sekben a dózis-válasz tendenciák értékelésénél szerepelhet például lineáris 
regresszió vagy William-féle próba, a páronkénti összehasonlításoknál pedig 
Dunnett-féle próba. A megfelel ő statisztikai elemzési módszer kiválasztá ­
sakor a vizsgálónak figyelemmel kell lennie a lehetséges varianciaegyenl őt­
lenségekre és más kapcsolódó problémákra, amelyek miatt az adatok transz ­
formációjára vagy nem paraméteres statisztikai elemzésre lehet szükség. A 
vizsgálónak minden esetben el kell végeznie az SI-k kiszámítását és statisz ­
tikai elemzéseket bizonyos adatpontokkal (az úgynevezett „kiugró adatok ­
kal”) és azok nélkül.  
ADATOK ÉS JELENTÉS  
Adatok  
34. Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, feltüntetve az egyedi 
állatok BrdU jelölési indexének értékeit, a csoport átlagos BrdU jelölés/állat értékét, a hozzá tartozó hibamutatóval (például SD, SEM), valamint az egyes dóziscsoportokban kapott átlagos stimulációs indexeket (SI) összeha ­
sonlítva a párhuzamos oldószeres/viv őanyagos kontrollcsoportéval.
 
Vizsgálati jelentés  
35. A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyagok és kontrollanyagok:  
— azonosító adatok (pl. adott esetben a CAS-szám és az EU-szám; eredet; 
tisztaság; ismert szennyez ők; tételszám),  
— fizikai megjelenés és fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. illékonyság, stabi ­
litás, oldhatóság),  
— elegy esetén annak összetétele és az egyes komponensek egymáshoz 
viszonyított aránya,  
Oldószer/viv őanyag:  
— azonosító adatok (adott esetben tisztaság; koncentráció; alkalmazott 
térfogat),  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Kísérleti állatok:  
— CBA egértörzs származása,  
— az állatok mikrobiológiai státusa, amennyiben ismert,  
— az állatok száma és életkora,  
— az állatok származása, tartásának körülményei, takarmánya stb.,  
Vizsgálati körülmények:  
— az ELISA készlet esetében a származás, a tételszám, a gyártó min őség­
biztosítási/min őség-ellenőrzési adatai (antitest szenzitivitása és specifici ­
tása, illetve a kimutatási határ),  
— a vizsgált anyagból el őállított készítménnyel és annak alkalmazásával 
kapcsolatos adatok,  
— a dózisszintek megválasztásának indoklása (ezen belül adott esetben az 
előszűrési vizsgálatok eredményei),  
— a vivőanyag és a vizsgált anyag alkalmazott koncentrációja, valamint a 
vizsgált anyagból alkalmazott teljes mennyiség,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takar ­
mány típusa/eredete, a víz eredete),  
— a kezelés adatai és a mintavételek ütemezése,  
— a toxicitás mérésére alkalmazott módszerek,  
— a pozitív és negatív vizsgálati eredmény kimondásának kritériumai,  
— a protokolltól való esetleges eltérések adatai, és annak kifejtése, hogy az 
eltérés hogyan érintheti vizsgálati tervet és az eredményeket,  
A megbízhatóság ellen őrzése:  
— a legutóbbi megbízhatósági ellen őrzés eredményeinek összefoglalása az 
alkalmazott anyag, koncentráció és viv őanyag adataival együtt,  
— a vizsgálólaboratórium párhuzamosan és/vagy korábban vizsgált pozitív 
és párhuzamosan vizsgált negatív (oldószer/viv őanyag) kontrollokra 
vonatkozó adatai,  
— ha nem vizsgáltak párhuzamosan pozitív kontrollt, a laboratóriumban 
legutóbb végzett id őszakos pozitív kontroll dátuma és laboratóriumi 
jelentése, valamint pozitív kontroll vizsgálatának korábbi adatait részle ­
tező jelentés, amely indokolja, hogy miért nem végzik a laboratóri ­
umban pozitív kontroll párhuzamos vizsgálatát,  
Eredmények:  
— az egyes állatok testtömege a kezelés kezdetén és a humánusan történ ő 
exterminálás tervezett id őpontjában, illetve az átlagos és vonatkozó 
hibamutatók (pl. SD, SEM) kezelési csoportonként,  
— a toxicitási tünetek, ezen belül az alkalmazás helyén esetleg kialakuló 
bőrirritáció megjelenésének id őpontja és id őbeli alakulása minden egyes 
állatra vonatkozóan, amennyiben volt ilyen,  
— az állatonkénti BrdU jelölési indexek és kezelési csoportonkénti SI 
értékek táblázata,  
— átlagos és kapcsolódó hibamutatók (pl. SD, SEM) az állatonkénti BrdU 
jelölési index esetében, az egyes kezelés csoportokban, és a kiugró 
értékek elemzése az egyes kezelési csoportokban,  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— a kiszámított SI és a variabilitás megfelel ő mutatója, amely az egyedek 
közti variabilitást a vizsgált anyaggal kezelt csoportban és a kontroll ­
csoportokban egyaránt figyelembe veszi,  
— dózis-válasz összefüggés,  
— adott esetben statisztikai elemzések,  
Az eredmények tárgyalása:  
— rövid kommentár az eredményekhez, a dózis-válasz elemzéshez és adott 
esetben a statisztikai elemzésekhez, és következtetés levonása arra 
vonatkozóan, hogy a vizsgált anyagot b őrszenzibilizáló hatásúnak 
kell-e tekinteni vagy sem.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elekt ­
ronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins. Toxicol., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Elektronikus formátum ­
ban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA:BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. 
Elektronikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immuno ­
tox/llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formá ­
tumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRP ­
Rept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90-96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]  
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), 
The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.
 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Elektronikus formátum ­
ban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.  
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Backg ­
round Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Elektronikus formátumban: [http://icc ­
vam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60-68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023-1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Elektronikus formátumban: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ acutetox/Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Elektronikus formátumban: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Pontosság:  A vizsgálati módszerrel kapott eredmények és az elfogadott referen ­
ciaértékek közötti egyezés mértéke. A vizsgálati módszer teljesítményének muta ­
tója, valamint a relevanciájának egyik megítélési szempontja. E kifejezést 
gyakran használják az „egyezés” megfelel őjeként, amely egy adott vizsgálati 
módszer alkalmazásakor az azonos eredmények arányát fejezi ki (33).  
Referenciaanyag:  A vizsgált anyaggal való összehasonlítás céljából etalonként 
használt szenzibilizáló vagy nem szenzibilizáló anyag. A referenciaanyaggal 
szemben a következ ő elvárások fogalmazhatók meg: i. állandó és megbízható 
beszerzési forrásból vagy forrásokból kell származnia; ii. a vizsgált anyagok csoportjához hasonló szerkezettel és funkcionális jellemz őkkel kell rendelkeznie; 
iii. ismert fizikai-kémiai tulajdonságokkal kell rendelkeznie; iv. rendelkezésre kell 
állniuk az anyag ismert hatásait alátámasztó adatoknak; és v. a kívánt válaszre ­
akciók tartományában ismert hatásúnak kell lennie.
 
Álnegatív eredmény:  Valamely vizsgálati módszerrel tévesen negatívnak vagy 
inaktívnak min ősített vizsgált anyag, amely valójában pozitív vagy aktív (33).  
Álpozitív:  Valamely vizsgálattal tévesen pozitívnak vagy aktívnak min ősített vizs ­
gált anyag, amely valójában negatív vagy inaktív (33).  
Veszély:  Káros egészségügyi vagy ökológiai hatások el őidézésének lehet ősége. A 
káros hatás csak akkor jelenik meg, ha kell ő szintű az expozíció.  
Laboratóriumok közötti reprodukálhatóság:  Annak mértéke, hogy a különböz ő 
minősített laboratóriumok azonos protokoll és azonos vizsgált anyag alkalmazá ­
sával mennyire képesek min őségileg és mennyiségileg azonos eredményeket 
produkálni. A laboratóriumok közötti reprodukálhatóság az el őhitelesítési és hite ­
lesítési folyamat során kerül meghatározásra, és annak mértékét jelzi, hogy az adott vizsgálat mennyire sikeresen vihet ő át laboratóriumok között; más néven 
laboratóriumok közötti megismételhet őség (33).
 
Laboratóriumon belüli reprodukálhatóság:  Annak meghatározása, hogy az ugyan ­
azon laboratóriumban dolgozó képzett személyek meghatározott protokoll különböz ő 
időpontokban történ ő alkalmazásával mennyire sikeresen tudják reprodukálni az 
eredményeket. Más néven laboratóriumon belüli megismételhet őség (33).  
Kiugró érték:  A kiugró érték olyan megfigyelés, amely szembet űnően eltér az 
egy populációból vett véletlenszer ű minta egyéb értékeit ől. 
Minőségbiztosítás:  Irányítási folyamat, amelynek során a laboratóriumi vizsgálati 
szabványok és követelmények betartását, a jegyz őkönyvek vezetését, valamint az 
adattovábbítás pontosságát a vizsgálatot végz ő személyekt ől független személyek 
ellenőrzik. 
Megbízhatóság:  Azonos protokoll szerint végzett vizsgálati módszer laboratóri ­
umon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóságának mérésére szolgál. A laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti reprodukálhatóság kiszámítá ­
sával állapítják meg (33).
 
Bőrszenzibilizáció:  Immunológiai folyamat, amely akkor jelentkezik, ha egy érzé ­
keny egyén lokálisan érintkezik valamely indukáló hatású allergén vegyi anyag ­
gal, amely esetlegesen kontakt szenzibilizáció kialakulásához vezet ő immunvá ­
laszt vált ki a b őrben.  
Stimulációs index (SI):  Adott vizsgált anyag b őrszenzibilizációt okozó képes ­
ségének meghatározására kiszámított érték, amely az anyaggal kezelt csoportban és a párhuzamosan viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportban tapasztalt proliferáció 
aránya.
 
Vizsgált anyag (más néven vizsgált vegyi anyag):  Bármilyen anyag vagy keverék, 
amelyet ezzel a vizsgálati módszerrel vizsgálnak.  ▼M3 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  AKUT INHALÁCIÓS TOXICITÁS – AKUT TOXIKUS OSZTÁLY 
MÓDSZER  
BEVEZETÉS  
1. A jelen vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 436. vizsgálati iránymuta ­
tásban (2009) leírt módszerrel. Az akut inhalációs toxicitásra vonatkozó els ő 
403. vizsgálati iránymutatást 1981-ben fogadták el, és azóta felülvizsgálták 
(lásd e melléklet B.2. fejezetét (1)). Az inhalációs akut toxikus osztály (ATC) módszer (2) (3) (4) kidolgozását helyénvalónak ítélték a felülvizsgált orális ATC módszer elfogadását követ ően (a e B.1b. fejezete) 
(5). Az ATC vizsgálati módszer akut inhalációs toxicitásra vonatkozó 
visszamen őleges teljesítmény-értékelésének eredménye azt mutatta, hogy a 
módszer megfelel ő az osztályozási és címkézési célból történ ő használatra 
(6). Az inhalációs ATC vizsgálati módszer rögzített célkoncentrációk 
melletti sorozatos, lépésenkénti vizsgálatot tesz lehet ővé a vizsgált vegyi 
anyag toxicitásának besorolása céljából. A letalitás kulcsfontosságú végpont, azonban a súlyos fájdalom vagy szorongás jeleit mutató, szenved ő vagy 
elhullásközeli állapotban lév ő állatokat humánus módon el kell pusztítani 
a szenvedés minimalizálása érdekében. A humánus végpontokra vonatko ­
zóan az OECD 19. iránymutatásában (7) található útmutatás.
 
2. A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálatok végrehajtásához és értelme ­
zéséhez az akut inhalációs toxicitási vizsgálatokra vonatkozó (39. számú) iránymutatás (8) nyújt útmutatást.
 
3. Az e vizsgálati módszer összefüggésében alkalmazott fogalmak meghatá ­
rozása az 1. függelékben, valamint a 39. iránymutatásban (8) található.  
4. A jelen vizsgálati módszer információkat szolgáltat a veszélyes tulajdonsá ­
gokról, és lehet ővé teszi a vizsgált vegyi anyagnak az akut toxicitást okozó 
vegyi anyagok osztályozására vonatkozó 1272/2008/EK rendelet (9) szerinti besorolását és osztályozását. Abban az esetben, ha az LC
 50 értékek pont ­
becslése vagy a koncentráció-válasz összefüggés elemzése szükséges, az e 
melléklet B.2. fejezetében leírt vizsgálati módszert kell alkalmazni (1). A vizsgálati módszer kiválasztására vonatkozó további útmutatás a 39. irány ­
mutatásban (8) található. A jelen vizsgálati módszer nem kifejezetten külön ­
leges anyagok – például alacsony oldhatóságú izometrikus vagy rostos anya ­
gok, vagy mesterséges nanoanyagok – vizsgálatára szolgál.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
5. A jelen vizsgálati módszer szerinti vizsgálat alkalmazásának mérlegelése 
előtt a vizsgálati laboratóriumnak az állatkísérletek minimalizálása érde ­
kében figyelembe kell vennie minden, a vizsgált vegyi anyagról rendelke ­
zésre álló információt, beleértve az olyan, meglév ő tanulmányokat, amelyek 
adatai a további vizsgálatok elvégzésének mell őzését támasztják alá. A 
legalkalmasabb faj, törzs, nem, expozíciós mód és a megfelel ő vizsgálati 
koncentráció kiválasztását esetlegesen segít ő információk közé tartozik a 
vizsgált vegyi anyag azonossága, kémiai szerkezete, valamint fizikai és kémiai tulajdonságai, az esetleges  in vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálatok 
eredményei, a várható felhasználási terület(ek) és a humán expozíció lehe ­
tősége, a szerkezetileg rokon vegyi anyagokról rendelkezésre álló (Q)SAR- 
és toxikológiai adatok. A maró (
 1 ) vagy súlyosan irritáló hatásuk miatt 
várhatóan súlyos fájdalmat vagy szorongást okozó koncentrációk jelen vizs ­
gálati módszerrel való vizsgálata nem javasolt (lásd a 39. iránymutatást (8)).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) A maró hatás értékelése egyebek között az alábbi bizonyítékokat felhasználó szakért ői 
véleményen alapulhat: emberekkel és állatokkal kapcsolatos tapasztalatok, rendelkezésre 
álló ( in vitro)  adatok, például a jelen melléklet B.40. (10), B.40a. fejezete (11), vagy az 
OECD 435. iránymutatása (12), pH-értékek, hasonló vegyszerekkel kapcsolatos informá ­
ciók vagy bármely más vonatkozó adat.
 A VIZSGÁLAT ELVE  
6. A progresszív eljáráson alapuló vizsgálat elve, hogy a 4 órás expozíciós 
időszak alatt elegend ő információt szerezzünk a vizsgált vegyi anyag akut 
inhalációs toxicitására vonatkozóan a vizsgált vegyi anyag osztályozásának 
lehetővé tétele érdekében. Meghatározott szabályozási célok elérése érde ­
kében más expozíciós id őtartamok is alkalmazhatók. A lépésenként változó 
koncentráció bejuttatásának minden meghatározott szakaszában nemenként 3 állatot kell vizsgálni. Az elhullási aránytól és/vagy az állatok elhullásközeli 
állapotától függ ően 2 lépés elegend ő lehet a vizsgált vegyi anyag akut 
toxicitásának megítéléséhez. Ha bizonyítható, hogy az egyik nem érzéke ­
nyebb a vizsgált anyagra, mint a másik, a vizsgálat folytatható csak az 
érzékenyebb nemmel. Az el őző lépés eredménye meghatározza a következ ő 
lépést, az alábbiak szerint:
 
a) nincs szükség további vizsgálatra;  
b) nemenként 3 állat vizsgálata szükséges; vagy  
c) 6 állat vizsgálata szükséges csak az érzékenyebb nemb ől, azaz a toxikus 
osztály becsült alsó határainak vizsgált koncentrációs csoportonként nemtől függetlenül 6 állaton kell alapulniuk.
 
7. Az elhullásközeli állapotban lév ő, nyilvánvalóan fájdalmakkal küszköd ő 
vagy súlyos és tartós szorongás jeleit mutató állatokat humánus módon el kell pusztítani, és a vizsgálat eredményeinek értelmezésekor a vizsgálat 
során elhullott állatokkal azonos módon kell figyelembe venni. A megjósol ­
ható vagy közeli elhullás felismerését segít ő iránymutatás, valamint az 
elhullás közelében lév ő vagy súlyosan szenved ő állatok elpusztítására vonat ­
kozó döntési kritériumok a humánus végpontokról szóló 19. iránymuta ­
tásban (7) találhatók.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Az állatfaj kiválasztása  
8. Általánosan használt laboratóriumi törzsekb ől származó egészséges, fiatal, 
ivarérett állatokat kell alkalmazni. A javasolt állatfaj a patkány, más faj használata esetén a döntést indokolni kell.
 
Az állatok el őkészítése  
9. Olyan n őstényeket kell választani, amelyek még egyszer sem ellettek, és 
nem vemhesek. Az expozíció napján az állatoknak 8–12 hetes fiatal, ivaré ­
rett egyedeknek kell lenniük, a testsúlyuk pedig a korábbi expozíciókkal érintett, azonos életkorú állatok nemenkénti átlagos testsúlyától legfeljebb 
± 20 %-kal térhet el. Az állatokat véletlenszer űen kell kiválasztani, egyedi 
azonosítás céljából meg kell jelölni azokat. Az állatokat a laboratóriumi körülményekhez való szoktatás céljából a vizsgálat megkezdése el őtt 
legalább 5 napig a ketrecükben tartjuk. Az állatokat a vizsgálatot megel ő­
zően rövid ideig szoktatni kell a vizsgálati eszközökhöz, mivel ezzel csök ­
kenthető az új környezet okozta stressz.
 
Az állatok tartása  
10. A kísérleti állatok tartására használt helyiség h őmérséklete 22 ± 3 °C kell, 
hogy legyen. A relatív páratartalmat ideális esetben 30–70 %-os tarto ­
mányban kell tartani, ugyanakkor ez nem feltétlenül lehetséges, ha viv ő­
anyagként vizet használnak. Az expozíció el őtt és után az állatokat általában 
nemek és koncentrációk szerinti csoportokban kell a ketreceikben elhelyezni, azonban az állatok ketrecenkénti számának nem szabad akadályoznia az 
egyes állatok megfigyelését, és minimalizálnia kell a kannibalizmus és a 
marakodás okozta veszteségeket. Ha az állatok expozíciója csak orron át történik, szükséges lehet szoktatni azokat a lefogásukra szolgáló csövekhez. Az állatok lefogására szolgáló csövek nem okozhatnak az állatoknak indo ­
kolatlan fizikai, termális vagy a mozgásképtelenség okozta stresszt. A 
lefogás hatással lehet olyan fiziológiai végpontokra, mint a testh őmérséklet
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
(hipertermia) és/vagy a percenkénti légzésvolumen. Amennyiben a rendel ­
kezésre álló általános adatok azt igazolják, hogy ilyen változások nem 
lépnek fel számottev ő mértékben, az állatok lefogására szolgáló csövekhez 
való előzetes szoktatás mell őzhető. Az aeroszoloknak egész testfelületükön 
kitett állatokat az expozíció során külön ketrecben kell elhelyezni, hogy a 
vizsgált aeroszol ne sz űrődhessen át a többi állat sz őrzetén. Hagyományos és 
minősített laboratóriumi takarmány alkalmazható – kivéve az expozíció 
időtartama alatt –, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A vilá ­
gítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák 
egymást.  
Inhalációs kamrák  
11. Az inhalációs kamra kiválasztásakor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi 
anyag jellegét és a vizsgálat célját. Az el őnyben részesítend ő expozíciós 
mód a csak orron keresztüli expozíció (ez magában foglalja a csak a fejet, 
orrot vagy szájat érint ő expozíciót). A csak orron keresztüli expozíció álta ­
lában előnyben részesítend ő a folyékony vagy szilárd aeroszolok, valamint a 
lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök vizsgálata esetén. El őfordul­
hat, hogy a vizsgálat különleges céljai egész testfelületen keresztüli expo ­
zíció alkalmazásával hatékonyabban elérhet ők, ezt azonban indokolni kell a 
vizsgálati jegyz őkönyvben. Egész testfelületen keresztüli expozícióra szol ­
gáló kamra használata esetén a légköri stabilitás biztosítása érdekében a 
vizsgált állatok össztérfogata nem haladhatja meg a kamra térfogatának 
5 %-át. A csak orron át történ ő és az egész testfelületen keresztüli expozí ­
ciós technikák elveit, valamint azok különös el őnyeit és hátrányait a 39. 
iránymutatás (8) ismerteti.  
EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK  
A koncentrációk beadása  
12. Az expozíció javasolt id őtartama négy óra, amelybe nem tartozik bele az 
egyensúlyi állapot eléréséhez szükséges id őtartam. Meghatározott követel ­
mények teljesítése érdekében ett ől eltérő időtartamok alkalmazása lehet 
szükséges, ezt azonban a vizsgálati jegyz őkönyvben indokolni kell (lásd a 
39. iránymutatást (8)). Az anyagnak egész testfelületen keresztüli expozí ­
cióra szolgáló kamrában kitett állatokat külön ketrecben kell tartani, hogy az állatok egymás tisztogatása során ne nyelhessék le a vizsgált vegyi anyagot. 
Az expozíció id őtartama alatt az állatok nem kaphatnak takarmányt. Az 
állatoknak víz az egész testfelületen keresztüli expozíció teljes id őtartama 
alatt adható.
 
13. Az állatokat gáz, g őz, aeroszol vagy ezek keveréke formájában tesszük ki a 
vizsgált vegyi anyagnak. A vizsgálandó halmazállapot a vizsgált vegyi 
anyag fizikai és kémiai tulajdonságaitól, a kiválasztott koncentrációtól 
és/vagy a vizsgált vegyi anyag kezelése és használata során legnagyobb valószínűséggel el őforduló halmazállapottól függ. A higroszkopikus és 
kémiailag reakcióképes vizsgált vegyi anyagokat száraz leveg ős körülmé ­
nyek között kell vizsgálni. Ügyelni kell a robbanékony koncentrációk kelet ­
kezésének elkerülésére.
 
Részecskeméret-eloszlás  
14. Minden aeroszol, valamint a lecsapódva esetlegesen aeroszolt alkotó g őzök 
esetén részecskeméretezést kell végezni. A légz őrendszer összes lényeges 
részének expozíciója érdekében 1 és 4 μm közötti tömegfelez ő aerodina ­
mikai átmér ővel (MMAD) rendelkez ő, az 1,5 és 3,0 közötti tartományba 
eső geometriai szórású ( σ g ) aeroszolok használata javasolt (8) (13) (14). 
Habár ésszer ű keretek között törekedni kell az e szabványnak való megfele ­
lésre, szakért ői megítélésre kell hagyatkozni, ha erre nincs lehet őség. A 
fémgőzök részecskéi például kisebbek lehetnek e szabványos méretnél, 
míg a töltéssel rendelkez ő részecskék, a rostok és a higroszkopikus anyagok 
(amelyek részecskemérete a légz őrendszer nedves környezetében n ő) 
meghaladhatják azt.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
A vizsgált vegyi anyag el őkészítése viv őanyagban  
15. A vizsgált vegyi anyag megfelel ő légköri koncentrációjának és részecskemé ­
retének eléréséhez viv őanyag alkalmazható. F őszabályként a víz részesí ­
tendő előnyben. A részecskéket képz ő anyagok mechanikai eljárásoknak 
vethetők alá a szükséges részecskeméret-eloszlás elérése érdekében, ugyan ­
akkor ügyelni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag ne induljon bomlásnak és ne módosuljon. Amennyiben úgy véljük, hogy a mechanikai folyamatok (például a túlzott őrlésből adódó súrlódás miatt kialakult széls őséges hőmér­
séklet) megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi 
anyag összetételét analitikai úton ellen őrizni kell. Kell ő figyelmet kell fordí ­
tani a vizsgált vegyi anyag szennyez ődésének elkerülésére. A nem morzsá ­
lódó, szándékosan belélegezhetetlen összetétellel készült szemcsés anya ­
gokat nem szükséges vizsgálni. Kopásvizsgálattal kell igazolni, hogy a szemcsés anyag kezelése során nem keletkeznek belélegezhet ő részecskék. 
Ha a kopásvizsgálat során belélegezhet ő részecskék keletkezését észlelik, 
inhalációs toxicitási vizsgálatot kell végezni.
 
Kontrollállatok  
16. Negatív (leveg ővel kezelt) kontrollcsoport párhuzamos vizsgálata nem szük ­
séges. Amennyiben a vizsgálati légkör létrehozása során vízt ől eltérő vivő­
anyagot alkalmazunk, viv őanyaggal kezelt kontrollcsoportra csak akkor van 
szükség, ha nem állnak rendelkezésre múltbeli inhalációs toxicitási adatok. Ha a vivőanyaggal kevert vizsgált vegyi anyag a toxicitási vizsgálat alapján 
nem bizonyul toxikusnak, a vizsgált koncentráció mellett a viv őanyag sem 
tekintendő toxikusnak, tehát nincs szükség viv őanyaggal kezelt kontrollra.
 
AZ EXPOZÍCIÓS KÖRÜLMÉNYEK NYOMON KÖVETÉSE  
Kamrabeli légáramlás  
17. A kamrán keresztüli légáramlást gondosan szabályozni kell, folyamatosan 
nyomon kell követni, és minden expozíció során legalább óránként fel kell jegyezni. A vizsgálati légköri koncentráció (vagy stabilitás) nyomon köve ­
tése valamennyi dinamikus paraméter globális mérését jelenti, és közvetett 
lehetőséget nyújt a légkör el őállítása szempontjából lényeges összes dina ­
mikus paraméter szabályozására. Különös figyelmet kell fordítani a csak orron át történ ő expozícióra szolgáló kamrában az újbóli belélegzés elkerü ­
lésére, amennyiben az expozíciós rendszeren keresztüli légáramlás nem 
elegendő a vizsgált vegyi anyagot tartalmazó légkör dinamikus áramlásának 
biztosítására. El őírt módszerek állnak rendelkezésre annak igazolására, hogy 
a választott m űködési körülmények között nem történik újbóli belélegzés (8) 
(15). Az oxigénkoncentrációnak legalább 19 %-nak kell lennie, a szén- 
dioxid-koncentráció pedig legfeljebb 1 % lehet. Amennyiben bármilyen okból feltételezhet ő, hogy ezek a szabványok nem teljesíthet ők, az oxigén- 
és szén-dioxid-koncentrációt mérni kell.
 
A kamra h őmérséklete és relatív páratartalma  
18. A kamra h őmérsékletét 22 ± 3 °C-on kell tartani. Az állatok belégzési 
zónájában fennálló relatív páratartalmat a csak orron át történ ő és az 
egész testfelületen keresztüli expozíció esetén egyaránt nyomon kell követni, 
és legfeljebb 4 órás id őtartamú expozíciók esetén legalább háromszor, rövi ­
debb időtartamok esetén pedig óránként fel kell jegyezni. A relatív páratar ­
talmat ideális esetben 30–70 %-os tartományban kell tartani, ugyanakkor előfordulhat, hogy ez vagy nem érhet ő el (például vízalapú keverékek vizs ­
gálata esetén), vagy nem mérhet ő a vizsgált vegyi anyag vizsgálati 
módszerrel való interferenciája miatt.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Vizsgált vegyi anyag: névleges koncentráció  
19. Az expozíciós kamrában fennálló névleges koncentrációt lehet őség szerint ki 
kell számítani és fel kell jegyezni. A névleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy az el őállított vizsgált vegyi anyag tömegét elosztjuk a kamrarend ­
szeren áthaladt leveg ő össztérfogatával. A névleges koncentráció nem az 
állatok expozíciójának jellemzésére szolgál, ugyanakkor a névleges és a tényleges koncentráció összehasonlításával megismerhet ő a vizsgálati rend ­
szer előállítási hatásfoka, és így feltárhatók az el őállítással összefügg ő prob­
lémák.
 
Vizsgált vegyi anyag: tényleges koncentráció  
20. A tényleges koncentráció a vizsgált vegyi anyagnak az inhalációs kamrán 
belül, az állatok belégzési zónájában fennálló koncentrációját jelenti. A tényleges koncentráció vagy specifikus módszerekkel (például közvetlen 
mintavétellel, adszorpciós vagy kémiai reakcióképességet vizsgáló módsze ­
rekkel, valamint utólagos analitikai jellemzéssel), vagy nem specifikus módszerekkel, például gravimetriai sz űrőelemzéssel határozható meg. A 
gravimetriai elemzés csak egykomponens ű, por alakú aeroszolok, illetve 
alacsony illékonyságú folyadékok aeroszoljai esetén elfogadható, és alkal ­
mazását a vizsgált vegyi anyag megfelel ő, a vizsgálat el őtt végzett jellem ­
zésével kell alátámasztani. A gravimetriai elemzés a többkomponens ű, por 
alakú aeroszolok koncentrációjának meghatározására szintén alkalmazható. 
Ebben az esetben azonban analitikai adatokkal kell alátámasztani, hogy a levegőben lévő anyag összetétele hasonló a kiindulási anyagéhoz. Ameny ­
nyiben ilyen információ nem áll rendelkezésre, a (lehet őleg leveg őben 
lebegő) vizsgált vegyi anyag rendszeres id őközönként végzett újbóli elem ­
zésére lehet szükség a vizsgálat során. Olyan aeroszolizálódott ágensek esetén, amelyek elpárologhatnak vagy szublimálhatnak, igazolni kell, hogy mindegyik fázisból a választott módszerrel vettünk mintát. A cél-, névleges 
és tényleges koncentrációt fel kell tüntetni a vizsgálati jegyz őkönyvben, 
azonban a letális koncentráció értékének kiszámításához csak a tényleges koncentrációkat kell felhasználni.
 
21. Lehet őség szerint a vizsgált vegyi anyag egyetlen tételét kell használni, és a 
vizsgált mintát olyan körülmények között kell tárolni, hogy meg őrződjön 
annak tisztasága, homogenitása és stabilitása. A vizsgálat megkezdését megelőzően el kell végezni a vizsgált vegyi anyag jellemzését, meghatá ­
rozva többek között annak tisztaságát, valamint amennyiben technikailag 
lehetséges, az észlelt szennyez ő anyagok és szennyez ődések azonosságát 
és mennyiségét. Ez többek között – de nem kizárólag – a következ ő 
adatokkal mutatható ki: retenciós id ő és relatív csúcsterület, tömegspektrosz ­
kópiai vagy gázkromatográfiás elemzéssel, illetve más becslésekkel 
meghatározott molekulatömeg. Bár a vizsgált minta azonosságának meghatá ­
rozása nem tartozik a vizsgálati laboratórium feladatai közé, óvatosságból érdemes lehet a vizsgálati laboratóriumban legalábbis korlátozott módon 
(például szín, fizikai jelleg stb. alapján) meger ősíteni a megbízó által adott 
jellemzést.
 
22. Az expozíciós légkört amennyire csak lehet, állandó állapotban kell tartani, 
továbbá az analitikai módszert ől függően folyamatosan és/vagy id őszakosan 
nyomon kell követni. Id őszakos mintavétel esetén a kamrából a négyórás 
vizsgálat során legalább kétszer kell légköri mintát venni. Ha az alacsony légáramlási sebesség vagy koncentráció miatt ez nem megoldható, a teljes 
expozíciós id őszak alatt egy mintavétel végezhet ő. Ha jelent ős ingadozás 
figyelhető meg az egyes minták között, a következ őnek vizsgált koncentrá ­
ciókat expozíciónként négy minta alapján kell vizsgálni. Az egyes kamra ­
koncentráció-minták gázok és g őzök esetén legfeljebb ± 10 %-kal, folyé ­
kony vagy szilárd aeroszolok esetén pedig legfeljebb ± 20 %-kal térhetnek 
el a kamrabeli átlagkoncentrációtól. A kamra egyensúlyi állapotának kiala ­
kulásához szükséges id őt (t
 95 ) ki kell számítani és fel kell jegyezni. Egy 
adott expozíció id őtartama magában foglalja a vizsgált vegyi anyag el őállí­
tásának idejét, utóbbihoz pedig figyelembe kell venni a t  95 eléréséhez szük ­
séges időt. A t  95 becsléséhez a 39. iránymutatásban (8) található útmutatás.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. A nagyon összetett, g őzökből/gázokból és aeroszolokból álló keverékek 
(például égési légkörök, valamint meghatározott célra szolgáló végfelhasz ­
nálói termékekb ől/készülékekb ől kibocsátott vizsgált vegyi anyagok) esetén 
az egyes fázisok eltér ően viselkedhetnek az inhalációs kamrában, ezért 
mindegyik fázishoz (g őz/gáz és aeroszol) legalább egy indikátoranyagot 
(analitot) – általában a keverék els ődleges hatóanyagát – kell kiválasztani. 
Amennyiben a vizsgált vegyi anyag keverék, az analitikai koncentrációt a teljes keverék, nem pedig csak az aktív összetev ő vagy a komponens (analit) 
vonatkozásában kell a jegyz őkönyvben feltüntetni. A tényleges koncentrá ­
cióról további információ a 39. iránymutatásban található (8).
 
Vizsgált vegyi anyag: részecskeméret-eloszlás  
24. Az aeroszolok részecskeméret-eloszlását mindegyik 4 órás expozíció során 
legalább kétszer meg kell határozni sorozatos ütközésmér ő vagy alternatív 
műszer, például aerodinamikai részecskeméret-meghatározó segítségével. Ha 
bizonyítható, hogy a sorozatos ütközésmér ővel és az alternatív m űszerrel 
kapott eredmények egyeznek, az alternatív m űszer a teljes vizsgálat 
folyamán használható. Az els ődleges műszerrel párhuzamosan egy második 
eszközt, például gravimetriai sz űrőt vagy impingert/gázbuborékoltatót kell 
használni az els ődleges m űszer mintavételi hatékonyságának meger ősítése 
érdekében. A részecskeméret-elemzés útján kapott tömegkoncentrációnak a szűrőelemzéssel kapott tömegkoncentrációt ésszer ű mértékben meg kell 
közelítenie (lásd a 39. iránymutatást (8)). Ha a vizsgálat kezdeti szakaszában 
egyezés mutatható ki, a további meger ősítő mérések mell őzhetők. Az állatok 
jóléte érdekében intézkedéseket kell tenni az expozíció eseteges megismét ­
lését szükségessé tev ő kétes adatok el őfordulásának minimalizálása érdeké ­
ben. Gőzök esetén részecskeméretezést kell végezni, ha fennáll annak a 
lehetősége, hogy a g őz lecsapódásával aeroszol keletkezhet, vagy ha vegyes 
fázisok alkotására képes részecskéket észlelünk a g őzatmoszférában (lásd a 
14. bekezdést).
 
ELJÁRÁS  
Fő vizsgálat  
25. Minden szakaszhoz nemenként három állatot, vagy az anyagra érzékenyebb 
nemből hat állatot kell használni. Patkányoktól eltér ő rágcsálófajok csak 
orron át történ ő expozíciója esetén az expozíció maximális id őtartama kiiga ­
zítható a fajspecifikus szorongás minimalizálása érdekében. A kiindulási dózisként alkalmazandó koncentrációszintet négy meghatározott szint 
közül kell kiválasztani, és kiindulási koncentrációszintként azt a szintet 
kell választani, amely a legnagyobb valószín űséggel eredményez toxicitást 
a kezelt állatok némelyikénél. A gázokra, g őzökre és aeroszolokra vonat ­
kozó (a 2–4. függelékben bemutatott) vizsgálati rendszerek az 1–4. 
CLP-kategória (9) határértékeivel történ ő vizsgálatokra vonatkoznak gázok 
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (2. függelék), g őzök (0,5, 2, 10, 20 
mg/l/4 h) (3. függelék) és aeroszolok (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (4. függelék) esetében. Az 1272/2008/EK rendeletben (9) nem szerepl ő 5. kategória a 
vonatkozó határkoncentrációkat meghaladó koncentrációkra vonatkozik. 
Minden egyes kiindulási koncentrációra a vonatkozó vizsgálati rendszert kell alkalmazni. A humánus módon elpusztított vagy elhullott állatok számától függ ően a vizsgálati eljárás a jelzett nyilakat követi mindaddig, 
amíg az osztályozás el nem végezhet ő.
 
26. Az egyes expozíciós csoportok vizsgálata közötti id őtartamot a mérgezési 
tünetek megjelenésének id őpontja, id őtartama és súlyossága határozza meg. 
Az állatok következ ő koncentrációszintnek való expozícióját addig kell 
halasztani, amíg ésszer ű biztonsággal nem várható az el őzőleg vizsgált 
állatok túlélése. Minden egyes koncentrációszint esetében az expozíciók között három- vagy négynapos id őszak biztosítása javasolt a késleltetett 
toxicitás megfigyelésének lehet ővé tétele érdekében. Ez az id őtartam 
szükség szerint – például nem egyértelm ű válaszok esetén – kiigazítható.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Határérték-vizsgálat  
27. Határérték-vizsgálatot akkor kell végezni, ha a vizsgált vegyi anyagról 
ismert vagy várható, hogy gyakorlatilag nem mérgez ő, azaz csak a hatósá ­
gilag előírt határkoncentráció felett idéz el ő toxikus reakciót. A vizsgált 
vegyi anyag toxicitásával kapcsolatban hasonló vizsgált anyagokra vagy 
hasonló keverékekre vonatkozó adatokból nyerhet ők információk, figye ­
lembe véve a toxikológiai szempontból fontos komponenseket, valamint azok százalékos arányát. Olyan esetekben, ha kevés az anyag toxicitásával 
kapcsolatos információ, vagy egyáltalán nem áll rendelkezésre, vagy ha a 
vizsgálandó vegyi anyag várhatóan toxikus, a f ő vizsgálatot kell elvégezni 
(további útmutatás a 39. iránymutatásban (8) található).
 
28. A jelen vizsgálati módszer határérték-vizsgálataként szolgáló szokásos 
eljárás alkalmazása során nemenként három állatot, vagy az anyagra érzé ­
kenyebb nemb ől hat állatot teszünk ki gázok esetén 20 000 ppm, g őzök 
esetén 20 mg/l, porok/párák esetén pedig 5 mg/l koncentrációnak (ha ez 
megvalósítható). Aeroszolok vizsgálata esetén az els ődleges cél a belélegez ­
hető részecskeméret (azaz 1–4 μm-es MMAD) elérése. Ez a legtöbb vizsgált 
vegyi anyag esetén 2 mg/l koncentrációnál érhet ő el. Aeroszolok 2 mg/l 
feletti koncentráció mellett történ ő vizsgálatát csak akkor szabad megkísé ­
relni, ha ezzel elérhet ő a belélegezhet ő részecskeméret (lásd a 39. irány ­
mutatást (8)). A GHS-nek (16) megfelel ően a határkoncentrációt meghaladó 
koncentrációnál végzett vizsgálat állatjóléti okokból nem javasolt. Az 
1272/2008/EK rendeletben (9) nem szerepl ő 5. GHS-kategóriában (16) 
végzett vizsgálatot csak abban az esetben szabad kilátásba helyezni, ha egy ilyen vizsgálat eredménye nagy valószín űséggel közvetlen jelent őséggel 
bírna az emberi egészség védelme szempontjából, továbbá ha mindezt a 
vizsgálati jegyz őkönyvben indokoljuk. Robbanásveszélyes vizsgált vegyi 
anyagok esetén ügyelni kell a robbanást el ősegítő körülmények elkerülésére. 
A szükségtelen állatkísérletek elkerülése végett a határérték-vizsgálatot megelőzően állatok nélküli próbavizsgálatot kell végezni annak érdekében, 
hogy a kamrában elérhet ők legyenek a határérték-vizsgálathoz szükséges 
körülményeket.
 
MEGFIGYELÉSEK  
29. Az expozíció id őtartama alatt az állatokat gyakori klinikai megfigyeléseknek 
kell alávetni. Az expozíciót követ ően az expozíció napján legalább kétszer, 
vagy – amennyiben az állatok kezelésre adott reakciója ezt indokolja – annál 
gyakrabban, az azt követ ő 14 nap során pedig naponta legalább egyszer 
klinikai megfigyeléseket kell végezni. A megfigyelés id őtartama nem rögzí ­
tett, hanem a klinikai tünetek jellege és jelentkezésének ideje, valamint a 
felépülés id őtartama alapján határozandó meg. Fontos a toxicitási tünetek 
megjelenésének és megsz űnésének id őpontja, különösen, ha fennáll a toxi ­
citási tünetek késleltetett megjelenésének tendenciája. Minden megfigyelést szisztematikusan rögzíteni kell olyan módon, hogy minden állat esetében 
önálló adatsort veszünk fel. Állatjóléti okokból humánus módon el kell 
pusztítani az elhullásközeli állapotban lév ő, valamint súlyos fájdalom 
és/vagy tartós és súlyos szorongás jeleit mutató állatokat. A toxicitás klinikai tünetei el őfordulásának vizsgálata során ügyelni kell arra, hogy az expozí ­
ciós eljárás okozta kezdeti beteges megjelenést és átmeneti légúti változá ­
sokat ne azonosítsuk tévesen a kezeléssel összefügg ő hatásokként. A 
humánus végpontokra vonatkozó iránymutatásban összegzett elveket és feltételeket figyelembe kell venni (7). Ha az állatokat humánus okok miatt 
el kell pusztítani, vagy ha azok elhullnak, a lehet ő legpontosabban fel kell 
jegyezni az elhullás id őpontját.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. A ketrecben tartott állatok megfigyelésének ki kell terjednie a b őr és a 
szőrzet, a szem és a nyálkahártya, valamint a légz őrendszer, a keringési 
rendszer, a vegetatív és a központi idegrendszer, továbbá a szomatomotoros aktivitás és a viselkedési minták változásaira. Lehet őség szerint fel kell 
jegyezni, ha különbséget lehet tenni a helyi és szisztémás hatások között. 
Figyelmet kell szentelni a remegés, görcsök, nyáladzás, hasmenés, letargia, 
alvás és kóma megfigyelésére. A végbélben mért h őmérséklet bizonyítékot 
szolgáltathat a kezelés vagy a fogság okozta bradipnoés reflexre vagy hipo-/hipertermiára.
 
Testsúly  
31. Az egyes állatok súlyát az szoktatási id őszak során egy alkalommal, az 
expozíció napján (0. nap) az expozíció el őtt, valamint legalább az 1., 3. 
és 7. napon (azt követ ően pedig hetente) egy-egy alkalommal, továbbá az 
1. napon túli elhullás vagy elpusztítás id őpontjában fel kell jegyezni. A 
testsúly a toxicitás kulcsfontosságú indikátorának számít, és a vizsgálat el őtti 
értékekhez képest legalább 20 %-os tartós súlycsökkenést mutató állatokat 
szorosan figyelemmel kell kísérni. Az expozíciót követ ő időszak végén az 
életben maradt állatokat újra megmérjük, majd humánus módon elpusztítjuk.  
Patológia  
32. Minden kísérleti állatot makroszkópos boncolásnak kell alávetni, azokat is, 
amelyek a vizsgálat során elpusztultak, vagy amelyeket állatjóléti okok miatt el kellett pusztítani és ki kellett vonni a vizsgálatból. Ha a boncolás nem végezhető el rögtön azután, hogy az elpusztult állatot észrevették, az állatot 
hűtve (nem fagyasztva) kell tárolni az autolízis minimalizálásához kell ően 
alacsony h őmérsékleten. A boncolást a lehet ő leghamarabb, általában egy 
vagy két napon belül el kell végezni. Minden állat esetén fel kell jegyezni minden makroszkopikus patológiai elváltozást, különös tekintettel a légz ő­
rendszert érint ő változásokra.
 
33. A vizsgálat értelmez ő értékének fokozása érdekében el őzetesen, terv szerint 
kilátásba helyezhet ők olyan további vizsgálatok, mint az életben maradt 
patkányok tüdeje súlyának megmérése és/vagy az irritációnak a légz őrend­
szer mikroszkópos vizsgálatával való igazolása. Megvizsgálhatók azok a 
szervek is, amelyek makroszkopikus patológia jeleit mutatják 24 óráig 
vagy annál tovább életben maradt állatoknál, valamint olyan szervek, amelyekről ismert vagy várható, hogy a vizsgált anyag hatást gyakorolt 
azokra. A teljes légz őrendszer mikroszkópos vizsgálata hasznos informáci ­
ókkal szolgálhat a vízzel könnyen reagáló vizsgált vegyi anyagokról, például 
a savakról és higroszkópos vegyi anyagokról.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
34. Meg kell adni az egyes állatok testsúlyával és boncolási eredményeivel 
kapcsolatos adatokat. A klinikai megfigyelések adatait táblázatos formában 
össze kell foglalni, minden egyes vizsgált csoporthoz megadva a csoportban lévő állatok számát, a specifikus mérgezési tüneteket mutató, valamint a 
vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok számát, 
az egyes állatok elhullásának id őpontját, a toxikus hatások leírását, id őbeli 
lefolyását és visszafordíthatóságát, valamint a boncolások eredményeit.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
35. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell értelemszer űen 
tartalmaznia:  
Kísérleti állatok és azok tartása  
— a ketrecben való tartás körülményei, beleértve a következ őket: az állatok 
ketrecenkénti száma (vagy számának változása), az alom anyaga, 
környezeti h őmérséklet és relatív páratartalom, a megvilágítás id őtar­
tama, valamint a takarmány meghatározása,  
— a vizsgált faj/törzs, valamint a patkánytól eltér ő faj alkalmazásának indo ­
kolása,  
— az állatok száma, kora és neme,  
— a véletlen kiválasztás módszere,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takarmány 
típusa/eredete, a víz eredete),  
— a vizsgálat el őtti esetleges kondicionálás leírása, beleértve a takarmányt, 
a karantént és a betegség kezelését,  
Vizsgált vegyi anyag  
— fizikai jelleg, tisztaság, valamint – ha lényeges – fizikai és kémiai tulaj ­
donságok (beleértve az izomerizációt),  
— azonosító adatok és – amennyiben ismert – a Vegyianyag Nyilvántartási 
Szolgálat szerinti nyilvántartási szám (CAS-szám),  
Vivőanyag  
— a vivőanyag használatának, valamint kiválasztásának indokolása (ha a 
vivőanyag nem víz),  
— múltbeli vagy párhuzamosan kapott adatok, amelyek igazolják, hogy a 
vivőanyag nem befolyásolja a vizsgálat eredményét,  
Inhalációs kamra  
— az inhalációs kamra leírása, beleértve annak méreteit és térfogatát,  
— az állatok expozíciójához és a légkör el őállításához használt berende ­
zések eredete és leírása,  
— a hőmérséklet, páratartalom, részecskeméret és tényleges koncentráció 
mérésére szolgáló berendezések,  
— a leveg ő forrása, a bevitt/elszívott leveg ő kezelése, valamint a kondici ­
onáló rendszer,  
— az eszközök homogén vizsgálati légkör biztosítása érdekében történ ő 
kalibrálására alkalmazott módszerek,  
— nyomáskülönbség (pozitív vagy negatív),  
— expozíciós nyílások száma kamránként (csak orron keresztüli expozíció), 
az állatok helye a rendszerben (egész testfelületen keresztüli expozíció),  
— a vizsgálati légkör id őbeli homogenitása/stabilitása,  
— a hőmérséklet- és páratartalom-érzékel ők, valamint a vizsgálati légkör 
mintavételének helye a kamrában,  
— légáramlási sebességek, légáramlási sebesség expozíciós nyílásonként 
(csak orron keresztüli expozíció), vagy az állatok terhelése kamránként (egész testfelületen keresztüli expozíció),
 
— adott esetben az oxigén és a szén-dioxid mérésére használt eszközökre 
vonatkozó információk,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— az inhalációs kamra egyensúlyi állapotának eléréséhez szükséges id ő 
(t 95 ), 
— a térfogatváltozások óránkénti száma,  
— mérőberendezések (ha vannak),  
Expozíciós adatok  
— a fő vizsgálathoz kiválasztott célkoncentráció indokolása,  
— névleges koncentrációk (az inhalációs kamrába való bejuttatásra el őállí­
tott vizsgált vegyi anyag össztömege osztva a kamrán áthaladt leveg ő 
térfogatával),  
— a vizsgált vegyi anyagnak az állatok belégzési zónájából gy űjtött tény­
leges koncentrációi; a heterogén halmazállapotokat (gáz, g őz, aeroszol) 
felvevő vizsgált keverékek esetén mindegyik külön elemezhet ő, 
— minden leveg őbeli koncentrációt tömegegységekben (például mg/l, 
mg/m  3 stb.) kell megadni; zárójelben a térfogategységekben (például 
ppm, ppb) kifejezett értékek is feltüntethet ők, 
— részecskeméret-eloszlás, tömegfelez ő aerodinamikai átmér ő (MMAD), 
valamint geometriai szórás ( σ g ), beleértve azok kiszámításának módját. 
Jegyzőkönyvezni kell az egyes részecskeméret-elemzéseket,  
Vizsgálati körülmények  
— A vizsgált vegyi anyag el őkészítésének részletei, beleértve a szilárd 
anyagok részecskeméretének csökkentésére vagy a vizsgált vegyi 
anyag oldatainak elkészítésére esetlegesen alkalmazott eljárások részle ­
teit. mennyiben a mechanikai folyamatok megváltoztatták a vizsgált vegyi anyag összetételét, a vizsgált vegyi anyag összetételének ellen ­ 
őrzése érdekében végzett elemzések eredményeit is fel kell tüntetni,
 
— a vizsgálati légkör el őállítására és az állatok vizsgálati légkörnek való 
kitételére alkalmazott berendezések leírása (lehet őség szerint vázlatrajz ­
zal), 
— az alkalmazott kémiai analitikai módszer és a módszer validációjának 
részletei (beleértve a vizsgált vegyi anyag mintavételi közegb ől való 
visszanyerésének hatásfokát),  
— a vizsgált koncentrációk kiválasztásának indokolása,  
Eredmények  
— a kamrabeli h őmérséklet, páratartalom és légáramlás táblázatos összefog ­
lalása,  
— a kamra névleges és tényleges koncentrációs adatainak táblázatos össze ­
foglalása,  
— részecskeméret-adatok táblázatos összefoglalása, beleértve az analitikai 
mintavételi adatokat, a részecskeméret-eloszlást, valamint az MMAD és 
a σ g számításait,  
— a válaszadatok és a koncentrációszintek táblázatos összefoglalása minden 
egyes állatra vonatkozóan (azaz a mérgezési tüneteket mutató és elhullt 
állatok, a hatások jellege, súlyossága és id őtartama),  
— az egyes állatok vizsgálati napokon mért testsúlya, az elhullás dátuma és 
időpontja, amennyiben az a tervszer ű elpusztítást megel őzően történt, a 
toxicitási tünetek megjelenésének id őbeli alakulása, valamint annak 
megjelölése, hogy azok visszafordíthatók voltak-e az egyes állatoknál,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— a boncolások és adott esetben a kórszövettani vizsgálatok eredményei 
minden egyes állatra vonatkozóan,  
— CLP-kategóriák szerinti besorolás és az LC  50 -határérték,  
Az eredmények szöveges értékelése és értelmezése  
— különös hangsúlyt kell fektetni az e vizsgálati módszer feltételeinek – 
például a határkoncentrációnak vagy a részecskeméretnek – való 
megfelelés érdekében alkalmazott módszerek leírására,  
— ki kell térni a részecskék belélegezhet őségére az általános megállapítások 
tükrében, különösen ha a részecskeméretre vonatkozó feltétel nem telje ­
sült, 
— a vizsgálat általános értékelésének ismertetnie kell a névleges és a tény ­
leges koncentrációk meghatározására használt módszerek konzisztenciá ­
ját, valamint a tényleges és a névleges koncentráció közötti összefüggést,  
— ki kell térni az elhullás valószín ű okára, valamint az els ődleges hatás ­
mechanizmusra (szisztémás vagy helyi),  
— magyarázatot kell szolgáltatni, amennyiben a humánus végpontokról 
szóló OECD-iránymutatás (7) szerinti kritériumok alapján humánus 
módon el kellett pusztítani a fájdalommal küszköd ő vagy súlyos és 
tartós szorongás jeleit mutató állatokat.  
SZAKIRODALOM  
(1) E melléklet B.2., Akut toxicitás (inhaláció) cím ű fejezete.  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and 
Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  
Arch. Toxicol.  77: 243-254.  
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
(5) E melléklet B.1b., Akut orális toxicitás – Akut toxikus osztály módszer 
című fejezete.  
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/ env/testguidelines]
 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]
 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testgu ­
idelines]  
(9) Az Európai Parlament és a Tanács 2008. december 16-i 1272/2008/EK 
rendelete az anyagok és keverékek osztályozásáról, címkézésér ől és csoma ­
golásáról, a 67/548/EGK és az 1999/45/EK irányelv módosításáról és hatá ­
lyon kívül helyezésér ől, valamint az 1907/2006/EK rendelet módosításáról, 
HL L 353., 2008.12.31., 1. o.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) E melléklet B.40., In vitro b őrkorrózió: transzkután elektromos rezisztencia 
vizsgálat (TER) cím ű fejezete.  
(11) E melléklet B.40a., In vitro b őrkorrózió: emberi b őrmodellen végzett vizs ­
gálat cím ű fejezete.  
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appéldául Toxicol.  18: 321-327.
 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appéldául Toxicol. 27: 
160-167  
(16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_wel ­
come_e.html]  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁS  
Vizsgált vegyi anyag:  A jelen vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
bármely anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
2. függelék  
Az egyes kiindulási gázkoncentrációk esetében követend ő eljárás (ppm/4 
óra) 
Általános megjegyzések (  1 ) 
Az egyes kiindulási koncentrációk esetében a jelen függelékben leírt vonatkozó 
vizsgálati rendszer vázolja a követend ő eljárást.  
2.a. függelék: a kiindulási koncentráció 100 ppm  
2.b. függelék: a kiindulási koncentráció 500 ppm  
2.c. függelék: a kiindulási koncentráció 2 500 ppm  
2.d. függelék: a kiindulási koncentráció 20 000 ppm  
A humánus módon elpusztított vagy elhullott állatok számától függ ően a vizs ­
gálati eljárás a megjelölt nyilakat követi.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfele ­
lője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK 
rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
 2.a. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
2.b. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
2.c. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
2.d. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
3. függelék  
Az egyes kiindulási g őzkoncentrációk esetében követend ő eljárás (mg/l/4 
óra) 
Általános megjegyzések (  1 ) 
Az egyes kiindulási koncentrációk esetében a jelen függelékben leírt vonatkozó 
vizsgálati rendszer vázolja a követend ő eljárást.  
3.a. függelék: a kiindulási koncentráció 0,5 mg/l  
3.b. függelék: a kiindulási koncentráció 2,0 mg/l  
3.c. függelék: a kiindulási koncentráció 10 mg/l  
3.d. függelék: a kiindulási koncentráció 20 mg/l  
A humánus módon elpusztított vagy elhullott állatok számától függ ően a vizs ­
gálati eljárás a megjelölt nyilakat követi.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfele ­
lője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK 
rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
 3.a. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
3.b. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
3.c. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
3.d. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
4. függelék  
Az egyes kiindulási aeroszolkoncentrációk esetében követend ő eljárás 
(mg/l/4 óra)  
Általános megjegyzések (  1 ) 
Az egyes kiindulási koncentrációk esetében a jelen függelékben leírt vonatkozó 
vizsgálati rendszer vázolja a követend ő eljárást.  
4.a. függelék: a kiindulási koncentráció 0,05 mg/l  
4.b. függelék: a kiindulási koncentráció 0,5 mg/l  
4.c. függelék: a kiindulási koncentráció 1 mg/l  
4.d. függelék: a kiindulási koncentráció 5 mg/l  
A humánus módon elpusztított vagy elhullott állatok számától függ ően a vizs ­
gálati eljárás a megjelölt nyilakat követi.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Az alábbi táblázatokban a GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals) rendszerre találhatók hivatkozások. A rendszer uniós megfele ­
lője az 1272/2008/EK rendelet. Az akut inhalációs toxicitás esetében az 1272/2008/EK 
rendeletben (9) nem szerepel az 5. kategória.
 4.a. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.05 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
4.b. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
4.c. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
4.d. függelék  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  FEJLŐDÉSI NEUROTOXICITÁSI VIZSGÁLAT  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 426. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2007) leírt módszerrel. Az OECD szaporodási és fejl ődési toxici ­
tási munkacsoportja 1995 júniusában, Koppenhágában megvitatta, hogy 
frissíteni kell a reprodukciós és fejl ődési toxicitásra vonatkozó, meglév ő 
OECD vizsgálati iránymutatásokat, és új iránymutatásokat kell kidolgozni a még le nem fedett végpontokra (1). A munkacsoport azt javasolta, hogy a 
fejlődési neurotoxicitásra vonatkozó vizsgálati iránymutatást az amerikai 
EPA útmutató alapján kell összeállítani, amelyet azóta módosítottak (2). 1996 júniusában egy második konzultációs találkozót tartottak Koppenhá ­
gában, hogy útmutatót adjanak a Titkárság számára a fejl ődési neurotoxici ­
tásra vonatkozó új vizsgálati iránymutatás vázlatának összeállításához, bele ­
értve a f őbb elemekre, például az állatfaj kiválasztására, az adagolási 
időszakra, a tesztelési id őszakra, a megvizsgálandó végpontokra, és az ered ­
mények értékelésének kritériumaira vonatkozó részleteket. Az amerikai 
neurotoxicitási kockázatértékelési irányelv 1998-ban jelent meg (3). 2000 
októberében egymás után egy OECD szakért ői konzultációs értekezletet és 
egy ILSI Risk Science Institute workshopot, valamint 2005-ben Tokióban egy szakért ői konzultációs találkozót tartottak. Ezeket a találkozókat abból a 
célból tartották, hogy megvitassák a jelenlegi vizsgálati iránymutatással 
kapcsolatos tudományos és technikai kérdéseket, és az üléseken (4) (5) (6) (7) hozott javaslatokat figyelembe vették a vizsgálati módszer kifejlesz ­
tése során. A vizsgálati módszer végrehajtására, értelmezésére és a használt 
terminológiára vonatkozó további információk megtalálhatók a reproduktív 
toxicitási vizsgálatokról és értékelésükr ől szóló 43. számú (8) és a neuro ­
toxicitási vizsgálatokról szóló 20. számú (9) OECD irányelvben.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
2. Számos vegyi anyagról ismert, hogy fejl ődési neurotoxikus hatást fejt ki 
emberben és más fajokban (10) (11) (12) (13). A vegyi anyag toxikus tulajdonságainak felmérése és értékelése céljából a potenciális fejl ődési 
neurotoxicitás meghatározására lehet szükség. A fejl ődési neurotoxicitási 
vizsgálatok célja, hogy adatokat – beleértve a dózis-válasz jellemzést – szolgáltassanak az utódok fejl ődő idegrendszerére gyakorolt potenciális 
funkcionális és morfológiai hatásokról, amelyek a méhen belüli és a korai 
életszakaszban történt expozíció következtében esetlegesen felmerülhetnek.
 
3. A fejl ődési neurotoxicitási vizsgálatot el lehet elvégezni külön vizsgálatként, 
be lehet építeni a reprodukciós toxicitási és/vagy feln őtt neurotoxicitási 
vizsgálatba (pl. B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16) vizsgálati módszerek), 
vagy ki lehet vele egészíteni a prenatális fejl ődési toxicitási vizsgálatot (pl. 
B.31 (17) vizsgálati módszer). Amikor a fejl ődési neurotoxicitási vizsgálat 
be van építve vagy hozzá van kapcsolva egy másik vizsgálathoz, elenged ­
hetetlen mindkét vizsgálati típus integritásának meg őrzése. A vizsgálatok 
során meg kell felelni a laboratóriumi állatok kutatásokban történ ő haszná­
latára vonatkozó jogszabályoknak, illetve kormányzati és intézményi irány ­
mutatásoknak (pl . 18).  
4. A vizsgáló laboratóriumnak a vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgált vegyi 
anyaggal kapcsolatos minden rendelkezésre álló információt figyelembe kell vennie. Ilyen információk a vegyi anyag megjelölése és szerkezete; 
fizikai-kémiai tulajdonságai; bármely más, a vegyi anyaggal elvégzett  in 
vitro  vagy  in vivo  toxicitási vizsgálatok eredményei; szerkezetileg rokon 
vegyi anyagok toxikológiai adatai és a vegyi anyag várható alkalmazása(i). Ezekre az információkra azért van szükség, hogy minden érintett meggy ő­
ződjön arról, hogy a vizsgálat releváns az emberi egészség védelme szem ­
pontjából, és el ősegíti majd a megfelel ő kezdődózis kiválasztását.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
5. A vizsgált vegyi anyagot vemhesség és szoptatás alatt adjuk be az állat ­
oknak. Az anyaállatokat a vemhes és szoptató n őstényekre gyakorolt 
hatások értékelése céljából teszteljük, illetve az anyaállatok összehasonlító információval is szolgálhatnak (az anyaállatok összehasonlítása az utódok ­
kal). Az utódokat a neurotoxicitási értékeléshez véletlenszer űen választjuk 
ki az almokból. Az értékelés egyrészt a súlyos neurológiai és viselkedési 
rendellenességek észlelését célzó megfigyelésekb ől áll, beleértve a fizikai 
fejlődés, a viselkedési egyedfejl ődés, a motoros aktivitás, a motoros és 
szenzoros funkció, másrészt a tanulás és a memória értékelését, valamint 
az agytömeg és a neuropatológia posztnatális fejl ődés és feln őttkor során 
történő értékeléséb ől.
 
6. Amikor a vizsgálati módszert külön vizsgálatként hajtjuk végre, a csopor ­
tokban rendelkezésre álló további állatokat fel lehet használni meghatározott 
idegrendszeri, neuropatológiai, neurokémiai vagy elektrofiziológiai eljárá ­
sokhoz, amelyek kiegészíthetik a vizsgálati módszer által ajánlott vizsgála ­
tokból kapott adatokat (16) (19) (20) (21). A kiegészít ő eljárások különösen 
akkor lehetnek hasznosak, ha az empirikus megfigyelés, a várható hatások, 
illetve a hatásmechanizmus egy bizonyos típusú neurotoxicitásra utalnak. Ezeket a kiegészít ő eljárásokat az anyaállatokban és az utódokban egyaránt 
használni lehet. Ezen kívül  ex vivo  vagy  in vitro  eljárások is használhatók, 
mindaddig, amíg ezek az eljárások nem változtatják meg az  in vivo  eljá­
rások integritását.
 
ELŐKÉSZÜLET A VIZSGÁLATHOZ  
Az állatfaj kiválasztása  
7. Az els ődleges vizsgálandó faj a patkány, de más faj is használható, ha 
megfelelő. Megjegyzend ő azonban, hogy a vizsgálati módszerben meghatá ­
rozott vemhességi és posztnatális napok az általánosan használt patkánytör ­
zsekre vonatkoznak, és összehasonlítható id őtartamokat kell választani, ha 
másik állatfajt vagy szokatlan törzset használunk. Más állatfaj használatát 
toxikológiai, farmakokinetikai és/vagy más adatokkal kell megindokolni. Az indoklásnak tartalmaznia kell a rendelkezésre álló fajspecifikus posztnatális idegrendszeri és neuropatológiai értékeléseket. Ha volt olyan korábbi vizs ­
gálat, amely aggodalomra adott okot, meg kell fontolni az abban alkalma ­
zott faj/törzs használatát. Mivel a különböz ő patkánytörzsek teljesít őképes­
sége eltér ő, bizonyítani kell, hogy a használatra kiválasztott törzs megfelel ő 
termékenységgel és válaszképességgel rendelkezik. Az egyéb fajoknak a 
fejlődési neurotoxicitás kimutatásával kapcsolatos megbízhatóságát és érzé ­
kenységét dokumentumokkal kell alátámasztani.
 
Tartási és etetési körülmények  
8. A kísérleti állatokat 22 ± 3 °C h őmérséklet ű helyiségben kell tartani. Bár a 
helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a 
takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 70 %-ot, a 
célértéknek 50 és 60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges, 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. A párzás el őtt 
és a vizsgálat id őtartama alatt meg lehet fordítani a fényciklust annak érde ­
kében, hogy a funkcionális és viselkedési végpontok értékelését a sötét periódus alatt lehessen elvégezni (piros fény alatt),  vagyis  abban az id őszak­
ban, amikor az állatok rendszerint aktívak (22). A világos-sötét ciklus 
bármilyen megváltoztatásának magában kell foglalnia egy megfelel ő 
akklimatizációs id őt ahhoz, hogy az állatok alkalmazkodjanak az új ciklus ­
hoz. Az etetéshez hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány és a víz 
típusát fel kell jegyezni, és mindkett őt meg kell vizsgálni szennyez ő 
anyagokra.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Az állatok egyedileg vagy azonos ivarú egyedekb ől álló kisebb csopor ­
tokban is tarthatók. A pároztatást erre a célra alkalmas ketrecekben kell 
végezni. Miután meggy őződtek a párzás megtörténtér ől, vagy a vemhesség 
15. napjánál nem kés őbb a pároztatott n őstényeket egyedileg kell elhelyezni 
ellető vagy fialtató ketrecekben. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy 
minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatá ­
sait. Az ellés közeledtével a pároztatott n őstények számára megfelel ő és 
meghatározott fészekrakó anyagot kell biztosítani. Jól ismert, hogy a vemhesség során a nem megfelel ő bánásmód vagy a stressz nem kívánatos 
kimenetelekhez vezethet, ideértve a prenatális veszteségeket és a megválto ­
zott magzati és posztnatális fejl ődést. A kezeléssel nem összefügg ő 
tényezők miatti magzati veszteség kivédése érdekében az állatokkal 
óvatosan kell bánni a vemhesség alatt, valamint kerülni kell a küls ő ténye­
zők, így például a túlzott küls ő zaj miatti stresszt.
 
Az állatok el őkészítése  
10. A laboratóriumi körülményekhez hozzászoktatott, korábban vizsgálatban 
még részt nem vett, egészséges állatokat kell használni, kivéve, ha a vizs ­
gálatot beépítjük egy másik vizsgálatba (lásd a 3. bekezdést). A kísérleti állatokat faj, törzs, eredet, nem, testtömeg és életkor szerint kell jellemezni. 
Minden állatot egyedi azonosító számmal kell ellátni. Amennyire csak 
megoldható, az állatok az összes vizsgálati csoportban legyenek azonos testtömeg űek és korúak, illetve a vizsgálatban részt vev ő fajra és törzsre 
jellemző normál tartományba essenek. Minden dózishoz még egyszer sem 
ellett, fiatal feln őtt nőstényeket kell használni. Gondosan ügyelni kell arra, 
hogy testvéreket nem szabad pároztatni. A vemhesség 0. napja az, amikor hüvelydugó és/vagy sperma észlelhet ő. Megfelel ő akklimatizációs id őt (pl. 
2–3 nap) kell biztosítani, ha meghatározott ideje vemhes állatokat vásá ­
rolnak a szállítótól. A pároztatott n őstényeket megkülönböztetés nélkül 
kell a kontroll- és a kezelési csoportokba beosztani, és a lehet őségekhez 
mérten egyenletesen kell elosztani a csoportok között (pl. ajánlott a rétegzett random eljárás, amely egyenletes eloszlást biztosít a csoportok között, 
például a testtömeg alapján). Az azonos hímmel pároztatott n őstényeket 
egyenletesen kell szétosztani a különböz ő csoportokban.
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
11. Minden kísérleti és kontrollcsoportnak elegend ő számú vemhes, a vizsgált 
vegyi anyaggal kezelend ő nőstényt kell tartalmaznia, hogy megfelel ő számú 
utódot termeljenek a neurotoxicitási értékeléshez. Összesen 20 alom hasz ­
nálata ajánlott minden dózisszinthez. A párhuzamos és lépcs őzetes csoport 
adagolási tervek akkor használhatók, ha a csoportonkénti teljes alomszámot elértük, és megfelel ő statisztikai modelleket alkalmazunk az ismétlések 
elszámolására.
 
12. A 4. posztnatális napon (PND) vagy azt megel őzően (az ellés napja a PND 
0) minden alom méretét ki kell igazítani az extra kölykök véletlenszer ű 
kiválasztás útján történ ő kiküszöbölésével, és egységes alomméretet kell 
kialakítani minden alomban (23). Az alom mérete nem haladhatja meg a használt rágcsálótörzsre jellemz ő átlagos alomméretet (8–12). Az almoknak 
a lehetőségekhez mérten azonos számú hím és n őstény kölyökb ől kell 
állniuk. A kölykök szelektív eltávolítása, pl . a testtömeg alapján, nem elfo ­
gadható. Az almok standardizálása (selejtezés) után és a funkcionális végpontok vizsgálatát megel őzően az elválasztás el őtti vagy elválasztás 
utáni vizsgálatra szánt kölyköket egyedi azonosítóval kell ellátni a kölykök 
azonosítására alkalmas bármely humánus módszer használatával (pl. 24).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Az állatok besorolása a funkcionális és viselkedési tesztekbe, az 
agytömeg mérésébe és a neuropatológiai értékelésekbe  
13. A vizsgálati módszer különböz ő megközelítéseket tesz lehet ővé az  in utero  
és a szoptatás útján kezelt állatoknak a funkcionális és viselkedési tesztek ­
hez, a szexuális éréshez, az agytömeg meghatározásához és a neuropatoló ­
giai értékeléshez való hozzárendelése tekintetében (25). Egyéb, az idegrend ­
szeri funkciót (pl . szociális viselkedés) értékel ő, illetve neurokémiai vagy 
neuropatológiai vizsgálatokat lehet hozzáadni eseti elbírálás alapján, amíg ezek az eredetileg el őírt vizsgálatok integritását nem veszélyeztetik.
 
14. Minden egyes dóziscsoportból kölyköket kell kiválasztani és hozzárendelni 
a 4. posztnatális napon (PND 4) vagy azt követ ően elvégzend ő végpont- 
értékelésekhez. A kölykök kiválasztását úgy kell elvégezni, hogy minden alomból mindkét nem minden adagolási csoportban lehet őleg egyenl ő 
arányban képviselve legyen az összes tesztben. A motoros aktivitás vizs ­
gálata során ugyanazokat a hím és n őstény kölyökpárokat kell megvizsgálni 
az elválasztást megel őző minden életkorban (lásd a 35. bekezdést). Az 
egyéb vizsgálatok során azonos vagy különböz ő hím és n őstény párokat 
lehet hozzárendelni a különböz ő viselkedési tesztekhez. Különböz ő kölykök 
hozzárendelése lehet szükséges az elválasztott kölykök és a feln őtt egyedek 
kognitív funkciójának vizsgálataihoz annak érdekében, hogy kiküszöbölhet ő 
legyen az életkor és a korábbi képzés zavaró hatása ezekre a mérésekre (26) (27). Az elválasztáskor (PND 21) a vizsgálatra ki nem választott kölykök 
humánus módon eltávolíthatók. A kölykök elosztásának minden módosítását 
fel kell jegyezni. A statisztikai mértékegység az alom (vagy az anyaállat) és nem a kölyök.
 
15. A kölykök különböz ő módokon sorolhatók be az elválasztás el őtti és elvá ­
lasztás utáni vizsgálatokba, a kognitív tesztekbe, a patológiai vizsgálatokba, 
stb. (lásd az 1. ábrát az általános elrendezéssel és az 1. függeléket a beso ­
rolási példákkal). Az állatok javasolt minimális száma az elválasztás el őtti 
és elválasztás utáni vizsgálatok egyes dóziscsoportjaiban a következ ő: 
Klinikai megfigyelések és testtömeg Minden állat 
Részletes klinikai megfigyelések 20/nem (1/nem/alom) Agytömeg (fixálás után) PND 11-22 10/nem (1/alom) 
Agytömeg (fixálatlan) ~ PND 70 10/nem (1/alom) 
Neuropatológia (immerziós vagy perfúziós 
fixálás) PND 11-22. 10/nem (1/alom) 
Neuropatológia (perfúziós fixálás) PND 
~70. 10/nem (1/alom) 
Nemi érés 20/nem (1/nem/alom) 
Egyéb fejl ődési tájékozódási pontok 
(választható) Minden állat 
Viselkedési egyedfejl ődés 20/nem (1/nem/alom) 
Motoros aktivitás 20/nem (1/nem/alom) Motoros és szenzoros funkció 20/nem (1/nem/alom) Tanulás és memória 10/nem (
 a ) (1/alom)  
( a ) A kognitív funkció vizsgálatok érzékenységét ől függően meg kell fontolni 
nagyobb számú állat vizsgálatát, pl. 1 hím és 1 n őstény állat vizsgálatát almon ­
ként (az állatok hozzárendelésével kapcsolatban lásd az 1. függeléket) (a minta 
méretével kapcsolatos további útmutatás az OECD 43. iránymutatásában találha ­
tó). ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Adagolás  
16. Legalább három dózisszintet és egy párhuzamos kontrollt kell alkalmazni. A 
dózisszinteket úgy kell megválasztani, hogy biztosítsák a kiváltott toxikus 
hatások fokozatosságát. Hacsak a vegyi anyag fizikai-kémiai jellege vagy biológiai tulajdonságai nem szabnak ennek határt, a legmagasabb adagolási szintet úgy kell megválasztani, hogy némi anyai toxicitást is kiváltson (pl. 
klinikai tünetek, csökkent testtömegnövekedés (legfeljebb 10 %) és/vagy 
dózis-korlátozó toxicitásra utaló bizonyíték a célszervben). A magas dózist 1 000 mg/ttkg/nap értékre lehet korlátozni, néhány kivételt ől eltekintve. 
Például a várható humán expozíció magasabb dózis alkalmazását teheti 
szükségessé. Alternatívaként el őzetes vizsgálatokat vagy el őzetes dózisbe ­
határoló vizsgálatokat kell végezni, hogy meghatározzuk az alkalmazandó legmagasabb dózist, amelynek minimális fokú anyai toxicitást is ki kell váltania. Ha a vizsgált vegyi anyagról standard fejl ődési toxicitási vizs ­
gálatban vagy el őzetes vizsgálatban kimutatták, hogy fejl ődési toxicitást 
okoz, legmagasabb dózisként azt a maximális dózist kell választani, amely az utódokban nem vált ki túlzott toxicitást,  in utero  vagy neonatális 
elhullást, illetve fejl ődési rendellenességeket, mivel ezek kizárják a neuro ­
toxicitás értelmezhet ő értékelését. A legalacsonyabb dózist úgy kell 
megválasztani, hogy semmilyen anyai vagy fejl ődési toxicitásra utaló 
tünetet ne okozzon, ideértve a neurotoxicitást is. Fokozatosan csökken ő 
dózisszinteket kell választani azzal a céllal, hogy demonstrálni lehessen a 
dózisfügg ő hatásokat és a megfigyelhet ő káros hatást nem okozó 
szintet (NOAEL), illetve a kimutatási határ közelében lév ő dózisokat, 
amelyek lehet ővé teszik a benchmark dózis meghatározását. A csökken ő 
dózisszintek meghatározásához gyakran optimális a 2–4-szeres interval ­
lumok alkalmazása, a dózisok közötti nagyon nagy intervallumok (pl. 10- 
nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása esetén pedig gyakran el őnyös egy 
negyedik dóziscsoport beiktatása is.
 
17. A dózisszintek megválasztásakor figyelembe kell venni mind a rendelke ­
zésre álló összes toxicitási adatot, mind a vizsgált vegyi anyag vagy a rokon anyagok metabolizmusával vagy toxikokinetikájával kapcsolatos további 
információkat. Ezek az információk segíthetik az adagolási rend megfelel ő­
ségének igazolását is. A kölyköknek történ ő közvetlen adagolást az expo ­
zíció és farmakokinetikai információk alapján kell mérlegelni (28) (29). A közvetlen adagolásos vizsgálatok el őtt gondosan mérlegelni kell az 
előnyöket és a hátrányokat (30).
 
18. A kísér ő kontrollcsoport egy placebóval kezelt kontrollcsoport, vagy ha a 
vizsgált vegyi anyag beadásához viv őanyagot használnak, akkor egy viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoport. Minden állatnak ugyanolyan térfogatú vizs ­
gált vegyi anyagot vagy viv őanyagot kell beadni a testtömeg alapján. Ha a 
beadás megkönnyítése érdekében viv őanyagot vagy más adalékot alkalma ­
zunk, a következ ő jellemzőket kell figyelembe venni: a vizsgált vegyi anyag 
felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy visszatartására gyakorolt 
hatások; a vizsgált vegyi anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt hatások, amelyek megváltoztathatják annak toxikus jellemz őit; valamint az állatok 
táplálék- és vízfogyasztására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások. 
A vivőanyag nem okozhat olyan hatásokat, amelyek zavarhatják a vizsgálat 
értelmezését, nem okozhat idegrendszeri toxicitást, és nem lehet hatással a reprodukcióra vagy a fejl ődésre. Újfajta viv őanyagok esetében a viv ő­
anyaggal kezelt kontrollcsoporton felül egy placebóval kezelt kontrollcso ­
portot is be kell iktatni. A kontrollcsoport(ok)ba tartozó állatokat ugyan ­
olyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lév őket.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
A dózisok beadása  
19. A vizsgált vegyi anyagot és a viv őanyagot olyan úton kell beadni, amely a 
leginkább megközelíti a lehetséges emberi expozíciót, valamint amely a 
kísérleti állatok vonatkozásában rendelkezésre álló anyagcsere és eloszlási információkon alapul. A beadás általában szájon át történik (pl. gyomor ­
szonda, táplálék, ivóvíz), de egyéb módok (pl. b őr, inhaláció) is használ ­
hatók az anyag jellegét ől és a várható vagy ismert emberi expozíciós utaktól 
függően (további útmutatás a 43. iránymutatásban található (8)). A válasz ­
tott beadási módra vonatkozó döntést indokolni kell. A vizsgált vegyi anyagot minden nap körülbelül ugyanabban az id őpontban kell beadni.
 
20. Az egyes állatoknak beadandó dózist általában a legutóbbi testtömegmérés 
eredménye alapján kell meghatározni. A vemhesség utolsó harmadában azonban óvatosan kell eljárni a dózis beállításakor. Ha túlzott toxicitást észlelünk a kezelt anyaállatokban, akkor azokat humánus módon extermi ­
nálni kell.
 
21. A vizsgált vegyi anyagot vagy viv őanyagot minimálisan naponta kell 
beadni a pároztatott n őstényeknek az implantáció id őpontjától (GD 6) 
kezdve a szoptatás egész id őtartama alatt (PND 21) annak érdekében, 
hogy a kölyköket kitegyék a vizsgált vegyi anyagnak a pre- és posztnatális 
idegrendszeri fejl ődés időszaka alatt. Azt az életkort, amikor az adagolás 
megkezdődik, illetve az adagolás id őtartamát és gyakoriságát módosítani 
lehet, ha a bizonyítékok egy olyan kísérleti elrendezést támasztanak alá, amely relevánsabb az emberi expozíció szempontjából. Az adagolási id őtar­
tamokat hozzá kell igazítani az egyéb állatfajokhoz, hogy biztosítani 
lehessen az expozíciót az agy fejl ődésének minden korai id őszakában 
(ami egyenérték ű az emberi agy prenatális és korai posztnatális növekedé ­
sével). Az adagolás indulhat a vemhesség kezdetét ől (GD 0), habár figye ­
lembe kell venni, hogy a vizsgált vegyi anyag preimplantációs veszteséget 
okozhat. Az adagolásnak a vemhesség 6. napján (GD 6) történ ő megkez­
désével elkerülhet ő ez a kockázat, ebben az esetben azonban a 0. és 6. GD 
közötti fejl ődési szakaszok kezelése elmarad. Ha a laboratórium küls ő 
forrásból adott id őben pároztatott állatokat vásárol, akkor az adagolás 
megkezdése nem kivitelezhet ő a pároztatás napján (GD 0), és így a GD 6 
jó kezdőnap lehet. A vizsgáló laboratóriumnak az adagolási rendet a vizs ­
gált vegyi anyag hatásaira vonatkozó lényeges információk, a korábbi 
tapasztalatok és a logisztikai szempontok alapján kell megállapítania; ez 
magában foglalhatja az adagolásnak az elválasztás utáni id őszakra történ ő 
kiterjesztését is. Nem kezelhet ők az ellés napján azok az állatok, amelyek 
még nem teljesen ellették meg az utódaikat. Általában azt feltételezzük, 
hogy a kölykök expozíciója az anyatej útján fog megtörténni; meg kell azonban fontolni a kölykök közvetlen kezelését is azokban az esetekben, ahol hiányoznak az utódok folyamatos expozícióját alátámasztó bizonyíté ­
kok. Folyamatos expozícióra utaló bizonyítékok nyerhet ők pl. a farmakoki ­
netikai információkból, az utódokban jelentkez ő toxicitásból vagy a biomar ­
kerek változásaiból (28).
 
MEGFIGYELÉSEK  
Az anyaállatok megfigyelése  
22. Az anyaállatok egészségi állapotát legalább naponta egyszer gondosan meg 
kell figyelni, ideértve a megbetegedéseket és elhullásokat.  
23. A kezelési és megfigyelési id őszak során rendszeresen részletesebb klinikai 
megfigyeléseket is végezni kell (legalább kétszer a vemhességi adagolási időszak alatt és kétszer a laktációs adagolási periódus alatt), dózisszinten ­
ként legalább tíz anyaállatban. Az állatokat az otthonul szolgáló ketrecen 
kívül olyan képzett technikusnak kell megfigyelnie, aki nincs tisztában az 
állatok kezelésének részleteivel és standardizált eljárásokat alkalmaz annak érdekében, hogy az állatokat ér ő stresszt és a megfigyel ő elfogultságát 
minimalizálni, a megfigyel ők közti megbízhatóságot pedig maximalizálni 
lehessen. Ahol lehetséges, célszer ű, hogy egy adott vizsgálat megfigyeléseit 
ugyanaz a technikus végezze.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. A megfigyelt tüneteket fel kell jegyezni. Ha megoldható, a megfigyelt 
tünetek er ősségét is fel kell jegyezni. A klinikai megfigyelések többek 
között a b őr, a szőrzet, a szemek, a nyálkahártyák változásaira, szekrétumok 
és autonóm aktivitás megjelenésére ( pl. könnyezés, sz őrmeredezés, pupilla ­
méret, szokatlan légzési mintázat és/vagy szájon át történ ő légzés, szokatlan 
vizelés vagy székletürítés) irányuljanak.  
25. Rögzíteni kell továbbá a testhelyzettel, aktivitási szinttel (pl. a standard 
terület csökkent vagy fokozott felderítése) és a mozgáskoordinációval 
kapcsolatos összes szokatlan választ is. A járás (pl. kacsázás, ataxia), a testtartás (pl. púpos tartás) és a megfogásra, elhelyezésre vagy más környe ­
zeti ingerekre adott reakció megváltozását, valamint a rángásos vagy 
görcsös mozgásokat, görcsös vonaglásokat, remegéseket, sztereotípiákat 
(pl. túlzott tisztálkodást, szokatlan fejmozgásokat, ismétl ődő körbejárást), 
bizarr viselkedést (pl. harapást vagy túlzott nyalogatást, öncsonkítást, hátra ­
felé menést, hangadást) vagy agressziót is fel kell jegyezni.
 
26. A toxicitás tüneteit gondosan fel kell jegyezni, beleértve kialakulásuk napját 
és időpontját, a súlyosságot és az id őtartamot.  
27. Az állatokat a vizsgálat id őtartama alatt legalább hetente egyszer meg kell 
mérni az adagoláskor, illetve az ellés napján vagy annak környékén, vala ­
mint a 21. posztnatális napon (PND 21) is (elválasztás). A gyomorszondával végzett vizsgálatok esetében az anyaállatokat legalább hetente kétszer kell 
megmérni. A dózist szükség esetén minden egyes testtömeg-meghatározás 
alkalmával be kell állítani. A táplálékfogyasztást legalább hetente kell mérni a vemhesség és a szoptatás alatt. A vízfogyasztást is legalább hetente kell mérni, ha az expozíció a vízellátáson keresztül történik.
 
Az utódok megfigyelése  
28. Minden utódot legalább naponta gondosan meg kell figyelni a toxikus 
hatások, valamint a morbiditás és mortalitás észlelése céljából.  
29. A kezelési és megfigyelési id őszak során részletesebb klinikai megfigyelé ­
seket is végezni kell az utódokon. Az utódokat (nemenként és almonként legalább 1 kölyköt) képzett technikusnak kell megvizsgálnia, aki nincs tisztában az állatok kezelésével és standardizált eljárásokat alkalmaz 
annak érdekében, hogy a megfigyel ő elfogultságát minimalizálni, a 
megfigyel ők közti megbízhatóságot pedig maximalizálni lehessen. Ahol 
lehetséges, célszer ű, hogy a megfigyeléseket ugyanaz a technikus végezze. 
A megfigyelt fejl ődési fázisnak megfelel ően legalább a 24. és 25. bekez ­
désben leírt végpontokat ellen őrizni kell.
 
30. A toxicitás utódokban jelentkez ő minden tünetét gondosan fel kell jegyezni, 
beleértve a kialakulás napját és id őpontját, a súlyosságot és az id őtartamot.  
Testi és fejl ődési tájékozódási pontok  
31. Az elválasztás el őtti fejlődési tájékozódási pontok (pl. fülkagyló kitárulása, 
szem kinyílása, metsz őfog előtörése) er ősen korrelálnak a testtömeggel (30) 
(31). A testi fejl ődés legjobb mutatója a testtömeg lehet. A fejl ődési tájé­
kozódási pontok mérése ezért csak akkor ajánlott, ha van korábbi bizonyíték 
arra, hogy ezek a végpontok további információkat nyújtanak. A fenti paraméterek értékelésének id őzítése az 1. táblázatban látható. A várható 
hatásoktól és a kezdeti mérések eredményeit ől függően tanácsos lehet 
további id őpontokat hozzáadni, vagy a méréseket más fejl ődési szaka ­
szokban elvégezni.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. A testi fejl ődés értékelésekor célszer ű a posztnatális életkor helyett a poszt ­
koitális életkort használni (33). Ha a kölyköket az elválasztás napján vizs ­
gáljuk, akkor ajánlott ezt a vizsgálatot a tényleges elválasztás el őtt elvé­
gezni, hogy kiküszöbölhet ő legyen az elválasztással járó stressz zavaró 
hatása. Ezenkívül a kölykök elválasztás utáni vizsgálatára nem kerülhet 
sor az elválasztást követ ő két napban.  
1. táblázat  
A testi és fejl ődési tájékozódási pontok és a funkcionális/viselkedési végpontok 
értékelésének ütemezése  ( a ) 
Életkori szaka ­
szok 
Végpontok Elválasztás el őtt ( b ) Serdül őkor (  b ) Fiatal ivarérett 
egyedek (  b ) 
Testi és fejl ődési tájékozódási pontok  
Testtömeg és klinikai 
megfigyelések hetente (  c ) legalább minden két 
hétben legalább minden két 
hétben 
Agytömeg PND 22 (  d ) befejezéskor 
Neuropatológia PND 22 (  d ) befejezéskor 
Nemi érés — szükség szerint — 
Egyéb fejl ődési tájéko ­
zódási pontok (  e ) szükség szerint — —  
Funkcionális/viselkedési végpontok  
Viselkedési egyedfej ­
lődés legalább két mérés 
Motoros aktivitás 
(beleértve a habituá ­
ciót) 1-3 alkalommal (  f ) — egyszer 
Motoros és szenzoros 
funkció — egyszer egyszer 
Tanulás és memória — egyszer egyszer  
( a ) Ez a táblázat azt a minimális számú alkalmat adja meg, amikor méréseket kell végezni. A várható 
hatásoktól és a kezdeti mérések eredményeit ől függően tanácsos lehet további id őpontokat hozzáadni 
(pl. idős állatok), vagy a méréseket más fejl ődési szakaszokban elvégezni. 
( b ) A kölykök vizsgálata az elválasztás utáni két napban nem javasolt (lásd a 32. bekezdést). A serdül ő 
állatok tesztelésére ajánlott életkorok: tanulás és memória = PND 25 ± 2; motoros és szenzoros funkció 
= PND 25 ± 2. A fiatal ivarérett egyedek tesztelésére ajánlott életkor PND 60-70. 
( c ) A testtömegeket legalább hetente kétszer kell mérni, amikor a gyors testtömeg-gyarapodás id őszakában a 
kölykök közvetlen adagolást kapnak a dózis beállítása céljából. 
( d ) Az agytömegeket és a neuropatológiai elváltozásokat adott esetben egy korábbi id őpontban is lehet 
értékelni (pl. PND 11) (lásd a 39. bekezdést). 
( e ) A testtömeg mellett egyéb fejl ődési tájékozódási pontokat is rögzíteni kell (pl. szem kinyílása), ha 
szükséges (lásd a 31. bekezdést). 
( f ) Lásd a 35. bekezdést.  
33. Az él ő kölyköket meg kell számolni és a nemüket meg kell állapítani pl. 
vizuális vizsgálattal vagy az anogenitális távolság mérésével (34) (35), 
illetve az alomban lév ő valamennyi kölyköt egyenként meg kell mérni a 
születéskor vagy nem sokkal azt követ ően, valamint legalább hetente 
egyszer a szoptatási id őszak alatt, és azt követ ően legalább kéthetente 
egyszer. A szexuális érés értékelése céljából a hüvelykinyílás (36) vagy 
fitymaelválás (37) jelentkezésekor almonként legalább egy hím és egy 
nőstény korát és testtömegét meg kell határozni.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Viselkedési egyedfejl ődés 
34. A kiválasztott viselkedések egyedfejl ődését a megfelel ő életkorban, almon ­
ként és ivaronként legalább egy kölykön kell mérni, ugyanazokat a köly ­
köket használva valamennyi vizsgálati napon az összes értékelt viselkedés vizsgálatára. A mérési napokat egyenletesen kell elosztani ebben az időszakban, hogy meghatározható legyen az adott magatartás egyedfejl ődé­
sének normál vagy a kezeléssel összefügg ő változása (38). Néhány példa 
azokra a viselkedésekre, amelyek egyedfejl ődését értékelni lehet: felegye ­
nesedési reflex, negatív geotaxis és motoros aktivitás (38) (39) (40).
 
Motoros aktivitás  
35. A motoros aktivitást (41) (42) (43) (44) (45) az elválasztás el őtti időszakban 
és felnőtt korban egyaránt monitorozni kell. Az elválasztás idején történ ő 
vizsgálat tekintetében lásd a 32. bekezdést. A vizsgálatnak elegend ő ideig 
kell tartania ahhoz, hogy demonstrálni lehessen a tesztmenet alatti habitu ­
ációt a nem kezelt kontrollok esetében. Er ősen ajánlott a motoros aktivitás 
használata a viselkedési egyedfejl ődés értékelésére. Ha a viselkedési egyed ­
fejlődés vizsgálatára használjuk, akkor a vizsgálathoz ugyanazokat az állat ­
okat kell használni minden elválasztás el őtti tesztmenet esetén. A vizs ­
gálatnak elég gyakorinak kell lennie ahhoz, hogy értékelni lehessen a teszt ­
menet alatti habituáció egyedfejl ődését (44). Ehhez három vagy több 
időpontra lehet szükség az elválasztást megel őzően, az elválasztás napját 
is beleértve (pl. PND 13, 17, 21). Ugyanezen állatok vagy alomtársaik vizsgálatára feln őtt korban is sort kell keríteni, a vizsgálat befejezésének 
időpontja környékén (pl. PND 60-70). Vizsgálatot további napokon is lehet 
végezni, amennyiben szükséges. A motoros aktivitást olyan automatizált 
aktivitásrögzít ő készülékkel kell monitorozni, amely egyaránt képes észlelni 
az aktivitás növekedését és csökkenését ( vagyis  a kiindulási aktivitás az 
eszközzel mérve ne legyen olyan alacsony, hogy kizárja az aktivitás csök ­
kenésének kimutatását, és ne legyen olyan magas, hogy kizárja az aktivitás 
növekedésének kimutatását). Minden eszközt olyan standard eljárásokkal kell bevizsgálni, amelyek a lehet ő legnagyobb mértékben garantálják a 
különböző eszközök folyamatos és megbízható m űködését. A kezelési 
csoportokat a lehetséges mértékben kiegyensúlyozottan kell szétosztani a 
készülékek között. Minden állatot egyedileg kell megvizsgálni. A kezelési csoportokat ellensúlyozni kell a vizsgálati id őpontok között, hogy kiküszö ­
bölhető legyen az aktivitás cirkadián ritmusának zavaró hatása. Törekedni 
kell arra, hogy minimálisak legyenek a kísérleti körülmények közötti elté ­
rések és ne legyenek szisztematikus összefüggésben a kezeléssel. Változók, amelyek hatással lehetnek a viselkedés számos mutatójára, beleértve a motoros aktivitást is: zajszint, a vizsgálati ketrec mérete és alakja, h őmér­
séklet, relatív páratartalom, fényviszonyok, szagok, az otthoni ketrec vagy 
új vizsgálati ketrec használata és zavaró környezeti tényez ők.
 
Motoros és szenzoros funkció  
36. A motoros és szenzoros funkciót legalább egyszer részletesen meg kell 
vizsgálni a serdül ő időszakban és egyszer a fiatal feln őtt időszakban is 
(pl. PND 60-70). Az elválasztás idején történ ő vizsgálatra vonatkozóan 
lásd a 32. bekezdést. Elegend ő vizsgálatot kell végezni annak érdekében, 
hogy megfelel ő kvantitatív mintavételre kerüljön sor a szenzoros módozatok 
(pl. szomato-szenzoros, vesztibuláris) és a motoros funkciók (pl. er ő, koor­
dináció) értékeléséhez. Néhány példa a motoros és szenzoros funkció vizs ­
gálataira: extenzor tolóer ő válasz (46), felegyenesedési reflex (47) (48), 
riasztó hanghatásokhoz való hozzászokás (40) (49) (50) (51) (52) (53) 
(54), kiváltott potenciálok (55).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Tanulási és memóriatesztek  
37. Az asszociatív tanulási és memóriatesztet az elválasztás után (pl. 25 ± 2 
nap) és fiatal feln őttkorban (PND 60 és id ősebb) kell elvégezni. Az elvá ­
lasztás idején történ ő vizsgálat tekintetében lásd a 32. bekezdést. Ebben a 
két fejlődési szakaszban ugyanazt a vizsgálatot vagy különböz ő vizsgála ­
tokat is lehet végezni. Az elválasztott és feln őtt patkányok esetében a tanu ­
lási és memóriavizsgálatok kiválasztásakor bizonyos fokú rugalmasság 
megengedett. A vizsgálatokat azonban úgy kell kialakítani, hogy azok megfeleljenek két kritériumnak. Egyrészt a tanulást egy több ismételt tanu ­
lási próba vagy szakasz során kialakuló változásként, vagy – az egyetlen 
próbát tartalmazó vizsgálatokban – egy olyan feltételre hivatkozva kell 
értékelni, amely a tanulási tapasztalat nem asszociatív hatását szabályozza. Másrészt a vizsgálatoknak az eredeti tanulás (akvizíció) mellett tartalmaz ­
niuk kell némi memóriamérést is (rövidtávú vagy hosszú távú), de ezt a 
memóriamérést az ugyanebb ől a vizsgálatból nyert akvizíció hiányában nem 
kell jelenteni. Amennyiben a tanulási és memóriatesztek kimutatják a vizs ­
gált vegyi anyag hatását, mérlegelni kell további vizsgálatok elvégzését az érzékszervi, motivációs és/vagy a motoros képességek változásain alapuló 
alternatív értelmezések kizárása érdekében. A fenti két kritérium mellett 
ajánlott a tanulási és memóriatesztet a vizsgálat alatt álló vegyi anyag osztályával szemben igazolt érzékenység alapján kiválasztani, amennyiben ilyen információ rendelkezésre áll a szakirodalomban. Ilyen információ 
hiányában néhány példa azokra a vizsgálatokra, amelyeket átalakíthatók 
úgy, hogy megfeleljenek a fenti szempontoknak: passzív elkerülés (43) (56) (57), ‘delayed-matching-to-position’ vizsgálat feln őtt patkányok (58) 
és napos patkányok esetén (59), olfaktorikus kondicionálás (43) (60), 
Morris-féle vízi labirintus (61) (62) (63), Biel- vagy Cincinnati-labirintus 
(64) (65), radiális kar labirintus (66), T-labirintus (43), menetrend-vezérelt viselkedés megszerzése és megtartása (26) (67) (68). Az elválasztott (26) (27) és a feln őtt patkányok esetében (19) (20) az irodalom további vizs ­
gálatokat ír le.
 
Post mortem vizsgálat  
38. Az anyaállatokat az utódok leválasztása után lehet elaltatni.  
39. Az utódok neuropatológiai értékelését a 22. posztnatális napon (PND 22) 
vagy egy korábbi, a 11. és 22. posztnatális nap (PND 11 és PND 22) közötti id őpontban, valamint a vizsgálat befejezésekor humánusan extermi ­
nált állatokból származó szöveteken kell elvégezni. A 22. posztnatális 
napon (PND 22) elpusztított utódok esetében az agyi szöveteket kell érté ­
kelni; a vizsgálat befejezésekor elpusztított állatok esetében a központi 
idegrendszeri (CNS) és a perifériás idegrendszeri (PNS) szövetmintákat is 
ki kell értékelni. A 22. posztnatális napon (PND 22) vagy korábban elpusz ­
tított állatokat immerzióval vagy perfúzióval lehet fixálni. A vizsgálat befe ­
jezésekor elpusztított állatokat perfúzióval kell fixálni. A szövetminták 
előkészítésének valamennyi lépése során, az állatok perfúziójától kezdve a 
szövetminták kimetszésén és a szövetek feldolgozásán át a metszetek festé ­
séig, kiegyensúlyozott elrendezést kell alkalmazni úgy, hogy minden tételnek minden dóziscsoportból tartalmaznia kell reprezentatív mintákat. 
A neuropatológiára vonatkozó további útmutatás az OECD 20. iránymuta ­
tásában található (9), lásd még (103).
 
A szövetminták feldolgozása  
40. A már a boncolás során nyilvánvaló súlyos rendellenességeket fel kell jegy ­
ezni. A szövetmintáknak az idegrendszer összes f őbb régióját reprezentál ­
niuk kell. A szövetmintákat megfelel ő fixálóban kell tartani és a publikált 
standard szövettani protokolloknak megfelel ően kell feldolgozni (69) (70) 
(71) (103). A paraffin-beágyazás elfogadható a központi idegrendszerb ől és ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
a perifériás idegrendszerb ől származó szövetek esetében, de fixálás után 
ajánlott lehet az ozmium használata epoxi-beágyazással kombinálva, ameny ­
nyiben magasabb felbontásra van szükség (pl. perifériás idegek esetében, ha perifériás neuropátia gyanúja merül fel és/vagy a perifériás idegek morfo ­
metriai analízise céljából). A morfometriai analízis céljára gy űjtött agyszö ­
veteket minden dózisszinten egyidej űleg kell a megfelel ő közegbe ágyazni 
annak érdekében, hogy elkerüljék a zsugorodási m űtermékek kialakulását, 
amelyek a fixálószerben való hosszabb tároláshoz társulhatnak (6).
 
Neuropatológiai vizsgálatok  
41. A kvalitatív vizsgálat céljai:  
i. a neuropatológiai változásokat mutató régiók beazonosítása az idegrend ­
szeren belül;  
ii. a vizsgált vegyi anyaggal történt expozícióból ered ő neuropatológiai 
elváltozások típusainak meghatározása; és  
iii. a neuropatológiai változások súlyossági tartományának meghatározása.  
A neuropatológiai elváltozások kimutatása céljából a szövetminták repre ­
zentatív szövettani metszeteinek mikroszkópos vizsgálatát megfelel ően 
képzett patológusnak kell elvégeznie. Minden neuropatológiai elváltozáshoz 
hozzá kell rendelni egy szubjektív fokot, amely az elváltozás súlyosságát 
jelzi. A hematoxilin-eozin festés elegend ő lehet a 22. posztnatális napon 
(PND 22) vagy korábban humánusan exterminált állatok agyi metszeteinek kiértékelésére. A vizsgálat befejezésekor elpusztított állatokból származó 
központi és perifériás idegrendszeri metszetek esetében azonban a myelin 
festés (pl. Luxol Fast Blue/krezilibolya) vagy az ezüst festés (pl. Bielschowsky- vagy Bodians-festés) ajánlott. Figyelembe véve a patológus szakmai értékelését és a megfigyelt elváltoztatások jellegét, egyéb festési 
módszerek alkalmazása is megfelel őnek tekinthet ő bizonyos típusú elválto ­
zások azonosítása és jellemzése céljából (pl. gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) vagy lektin hisztokémia a gliális és mikrogliális elválto ­
zások értékelésére (72), fluoro-jade festés a nekrózis kimutatására (73) 
(74), vagy ezüst festés a specifikus idegi degeneráció kimutatására (75)).
 
42. Morfometriai (mennyiségi) értékelést kell végezni, mivel ezek az adatok 
segíthetnek a kezeléssel összefügg ő hatások kimutatásában és értékes segít ­
séget nyújtanak az agy tömegében vagy morfológiájában a kezeléssel össze ­
függésben kialakuló különbségek értelmezése során (76) (77). Az idegszö ­
veti mintát úgy kell levenni és el őkészíteni, hogy az lehet ővé tegye a 
morfológiai értékelést. A morfometriai értékelések közé tartozik például a 
specifikus agyi régiók lineáris vagy területi mérése (78). A lineáris vagy 
területi mérések megbízható mikroszkopikus tájékozódási pontok alapján gondosan kiválasztott homológ metszetek használatát követelik meg (6). Sztereológiát lehet használni a kezelések egyes paraméterekre, mint például 
bizonyos neuroanatómiai régiók térfogatára vagy sejtjeinek számára gyako ­
rolt hatásainak azonosítására (79) (80) (81) (82) (83) (84).
 
43. Az agyakat meg kell vizsgálni a kezeléssel összefügg ő neuropatológiai 
elváltozásokra és megfelel ő mintákat kell venni minden nagyobb agyi régi ­
óból (pl. szaglóhagymák, cerebrális cortex, hippocampus, bazális ganglio ­
nok, thalamus, hypothalamus, középagy (tectum, tegmentum, és agyi pedunculusok), híd, nyúltvel ő, kisagy) az alapos vizsgálat érdekében. 
Fontos, hogy a metszeteket az összes állat esetében ugyanabban a síkban 
kell készíteni. A vizsgálat befejezésekor humánusan elpusztított feln őtt 
egyedek esetében a gerincvel ő és a perifériás idegrendszer reprezentatív 
részeiből kell mintát venni. A vizsgált területeknek magukban kell foglal ­
niuk a szemet a látóideggel és a retinával, a gerincvel őt a nyaki és ágyéki 
megvastagodásnál, a dorzális és ventrális ideggyökérrostokat, a proximális ülőideget, a proximális sípcsonti ideget (a térdnél) és a sípcsonti ideg lábik ­
raizom-ágait. A gerincvel őből és a perifériás idegekb ől készített metsze ­
teknek mind keresztirányú vagy haránt irányú, mind hosszanti metszeteket 
tartalmazniuk kell.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. A neuropatológiai értékelésnek a celluláris elváltozások (pl. neuronális 
vakuolizáció, degeneráció, nekrózis) és a szöveti elváltozások (pl. gliózis, 
leukocita infiltráció, cisztaképz ődés) vizsgálata mellett magában kell 
foglalnia az idegrendszert ért fejl ődési károsodások vizsgálatát is (6) (85) 
(86) (87) (88) (89). Ebben a tekintetben fontos, hogy a kezeléssel össze ­
függő hatásokat meg kell különböztetni a normális fejl ődési eseményekt ől, 
amelyek az állat elpusztításának id őpontjában zajló fejl ődési szakaszban 
előfordulhatnak (90). A fejl ődési károsodásokat jelz ő jelentős elváltozások 
közé tartoznak egyebek között:  
— a szaglóhagymák, a nagyagy és a kisagy bruttó méretének és alakjának 
megváltozása,  
— a különböz ő agyi régiók relatív méretének változásai, beleértve a régiók 
méretének a normális körülmények között átmeneti sejtpopulációk vagy 
axonális projekciók elvesztése vagy fennmaradása miatti csökkenését vagy növekedését (pl. a kisagy küls ő germinális rétege, corpus callo ­
sum),
 
— a proliferáció, migráció és differenciálódás elváltozásai, amelyet a 
túlzott mérték ű apoptózist vagy nekrózist mutató területek, az ektópiás, 
dezorientált vagy hibás alakulású neuronok klaszterei vagy szétszórt 
populációi, illetve az agykérgi struktúrák különböz ő rétegeinek relatív 
méretében kialakult módosulások jeleznek,  
— a myelinizációs minták elváltozásai, beleértve a myelinhüvelyes struk ­
túrák méretének csökkenését vagy megváltozott fest ődését,  
— hydrocephalusra utaló bizonyíték, különösen a kamrák megnagyobbo ­
dása, az agyi vízvezeték sz űkülete és az agyféltekék elvékonyodása.  
A neuropatológiai elváltozások dózis-válasz összefüggéseinek elemzése  
45. A kvalitatív és kvantitatív neuropatológiai analízisek céljára az alábbi több ­
lépcsős eljárás ajánlott. El őször a magas dózissal kezelt csoport metszeteit 
összehasonlítjuk a kontrollcsoport metszeteivel. Ha a magas dózissal kezelt csoportból származó állatokban nem található bizonyíték neuropatológiai 
elváltozásokra, nincs szükség további analízisre. Ha neuropatológiai elvál ­
tozások találhatók a magas dózissal kezelt csoportban, meg kell vizsgálni a közepes és az alacsony dózissal kezelt csoportokból származó állatokat. Ha a magas dózissal kezelt csoportot elhullás vagy más zavaró toxicitás miatt 
fel kell számolni, a magas és a közepes dózissal kezelt csoportokat meg kell 
vizsgálni neuropatológiai elváltozásokra. Ha a neurotoxicitás bármilyen jele mutatkozik a kisebb dózissal kezelt csoportokban, neuropatológiai analízist kell végezni. Ha a kvalitatív vagy kvantitatív vizsgálat során a kezeléssel 
összefügg ő neuropatológiai elváltozások mutatkoznak, valamennyi dózis ­
csoport valamennyi állatának értékelése alapján meg kell határozni az előfordulás dózisfüggését, a léziók vagy morfológiai elváltozások gyakori ­
ságát és súlyossági fokát. Az agy neuropatológiai elváltoztatást mutató 
valamennyi régióját be kell vonni ebbe az értékelésbe. A léziók minden 
típusa esetében be kell mutatni az egyes súlyossági fokok meghatározására használt jellemz őket, megjelölve azokat a jellemz őket, amelyek alapján 
különbséget tettünk az egyes fokozatok között. Az egyes léziók gyakori ­
ságát és súlyosságát fel kell jegyezni, és statisztikai elemzést kell végezni a 
dózis-hatás összefüggés értékelése céljából. Kóddal ellátott metszetek hasz ­
nálata ajánlott (91).
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
46. Az adatokat külön-külön és táblázatos formában összesítve is jegyz őköny­
vezni kell, minden egyes vizsgált csoport esetében megjelenítve az elválto ­
zások típusát és az egyes elváltozásokat mutató anyaállatok, utódok (nem szerint) és almok számát. Ha az utódoknál közvetlen posztnatális expozíciót 
végeztünk, az útvonalat, valamint az expozíció id őtartamát és id őszakát is 
jegyzőkönyvezni kell.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Az eredmények értékelése és értelmezése  
47. A fejl ődési neurotoxicitási vizsgálat tájékoztatást nyújt egy vegyi anyaggal 
az in utero  és a korai posztnatális fejl ődés során történt ismételt expozíció 
hatásairól. Mivel mind az általános toxicitási, mind pedig a fejl ődési neuro ­
toxicitási végpontokra hangsúlyt fektetnek, a vizsgálat eredményei lehet ővé 
teszik az általános anyai toxicitás hiányában is fellép ő idegfejlődési hatások 
megkülönböztetését azoktól, amelyek az anyaállatra is csak toxikus szintek 
mellett fejez ődnek ki. A vizsgálati elrendezésen belüli bonyolult összefüg ­
gések, a statisztikai elemzés, illetve az adatok biológiai jelent ősége miatt a 
fejlődési neurotoxicitási adatok megfelel ő értelmezéséhez szakért ői értéke­
lésre van szükség (107) (109). A vizsgálati eredmények értelmezéséhez a 
bizonyítékok súlyán alapuló megközelítést kell alkalmazni (20) (92) (93) (94). A viselkedési vagy morfológiai eredmények mintázatait, ha vannak ilyenek, valamint a dózis-válaszra utaló bizonyítékokat meg kell vitatni. A 
fejlődési neurotoxicitás értékelése szempontjából lényeges valamennyi vizs ­
gálatból származó adatokat bele kell foglalni kell ebbe a jellemzésbe, bele ­
értve az emberi epidemiológiai vizsgálatokat vagy esettanulmányokat, illetve az állatkísérleteket (pl. toxikokinetikai adatok, szerkezet-hatás infor ­
mációk és egyéb toxicitási vizsgálatok adatai). Ez magában foglalja a vizs ­
gált vegyi anyag dózisai és a neurotoxikus hatás jelenléte vagy hiánya, gyakorisága és mértéke (nemenként) közötti kapcsolatot (20) (95).
 
48. Az adatok értékelésének tartalmaznia kell a biológiai és a statisztikai szig ­
nifikancia diszkusszióját. A statisztikai elemzést olyan eszköznek kell tekin ­
teni, amely inkább segíti, mintsem meghatározza az adatok értelmezését. 
Egyedül a statisztikai szignifikancia hiánya alapján nem lehet a kezeléssel 
összefügg ő hatás hiányára vonatkozó következtetést levonni, és egyedül a 
statisztikai szignifikancia alapján nem lehet a kezeléssel összefügg ő hatásra 
sem következtetni. Az esetleges hamis negatív eredmények és a „negatív 
tények bizonyításának” nehézségei elleni védekezés érdekében tárgyalni kell 
a rendelkezésre álló pozitív és történeti kontroll adatokat, különösen akkor, ha nem mutatkoztak kezeléssel összefügg ő hatások (102) (106). A hamis 
pozitív eredmények valószín űségét az adatok teljes statisztikai értékelésének 
fényében kell tárgyalni (96). Az értékelésnek tartalmaznia kell a megfigyelt 
neuropatológiai és viselkedési változások közötti kapcsolatot, ha van ilyen.
 
49. Minden eredményt elemezni kell a kísérleti elrendezésnek megfelel ő statisz­
tikai modellekkel (108). A paraméteres és nem paraméteres elemzés közötti választást meg kell indokolni, figyelembe véve olyan tényez őket, mint 
például az adatok jellege (transzformált vagy nem), eloszlása, valamint a 
kiválasztott statisztikai elemzési módszer relatív robusztussága. A vizsgálat céljának és elrendezésének útmutatóul kell szolgálnia a statisztikai elemzési módszer kiválasztásakor, hogy minimalizálni lehessen az I-es típusú (hamis 
pozitív) és a II-es típusú (hamis negatív) hibákat (96) (97) (104) (105). Az 
egyszerre többet ell ő fajokat használó fejl ődési vizsgálatok esetében, ahol 
almonként több kölyköt vizsgálunk, a statisztikai modellnek az almot is tartalmaznia kell, hogy csökkenteni lehessen az I-es típusú hibák arányát 
(98) (99) (100) (101). Statisztikai mértékegységül az almot kell választani, 
nem a kölyköt. A kísérleteket úgy kell megtervezni, hogy az alomtársakat ne tekintsük önálló megfigyelésnek. Az ugyanabban az alanyban többször mért végpontot olyan statisztikai modellel kell elemezni, amely figyelembe 
veszi, hogy ezek nem független mérések.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
50. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— fizikai jelleg és szükség szerint a fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— azonosító adatok, beleértve a forrást is,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— a készítmény tisztasága, az ismert és/vagy várható szennyez ődések.  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag kiválasztásának indokolása, ha az nem víz vagy fiziológiás 
sóoldat.  
Kísérleti állatok:  
— az alkalmazott faj és törzs, és a patkánytól eltér ő faj választásának 
indokolása,  
— a kísérleti állatok szállítója,  
— az állatok száma, kora a vizsgálat kezdetekor, neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány, víz stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor.  
Vizsgálati körülmények:  
— az adagolási szintek megválasztásának indokolása,  
— az adagolási útvonal és id őszak megválasztásának indokolása,  
— a beadott dózisok, ezen belül a viv őanyagra, valamint a beadott anyag 
térfogatára és fizikai formájára vonatkozó adatok részletes leírása,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázásával/a takarmány el őkészítésével, az 
elért koncentrációval, a készítmény stabilitásával és homogenitásával 
kapcsolatos adatok,  
— az anyaállatok és az utódok egyedi azonosítására használt módszer,  
— azon randomizálási eljárás(ok) részletes leírása, amelye(ke)t az anyaál ­
latok kezelési csoportokhoz való hozzárendelésére, a kölykök selejte ­
zésre történ ő kiválasztására, valamint a kölykök tesztcsoportokhoz 
való hozzárendelésére felhasználtunk,  
— a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,  
— ha alkalmazandó, a vizsgált vegyi anyag takarmányban/ivóvízben lév ő 
koncentrációjának (ppm) átszámítása a tényleges dózisra (mg/testtömeg kg/nap),
 
— környezeti feltételek,  
— a táplálék és a víz min ősége (pl. csapvíz, desztillált víz),  
— a vizsgálat kezdetének és végének napja.  
Megfigyelések és vizsgálati eljárások:  
— a megfigyelések és az eljárások szabványosítására használt eljárások, 
valamint a megfigyelések pontozására szolgáló operatív definíciók rész ­
letes leírása,  
— az alkalmazott vizsgálati eljárások listája az alkalmazásuk indokolásával,  
— az alkalmazott viselkedési/funkcionális, patológiai, neurokémiai és elekt ­
rofiziológiai eljárások részletei, beleértve az automatizált eszközökre vonatkozó információkat és adatokat is,
 
— az eszközök kalibrálását szolgáló és egyenérték űségüket biztosító, illetve 
a kezelési csoportoknak a vizsgálati eljárásokban való kiegyensúlyozását 
biztosító eljárások,  
— minden, szakmai megítélést igényl ő döntés rövid indokolása.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Eredmények (egyenként és összefoglalóan, szükség szerint középértékek és 
szórásnégyzetek megadásával):  
— az állatok száma a vizsgálat kezdetén és végén,  
— az egyes vizsgálati módszerekhez felhasznált állatok és almok száma,  
— az egyes állatok és származási almuk azonosító száma,  
— az alomméret és az átlagos születéskori testtömeg nemenként,  
— a testtömegre és a testtömeg változására vonatkozó adatok, beleértve az 
anyaállatoknak és az utódoknak a vizsgálat befejezésekor mért testtö ­
megét is,  
— takarmányfogyasztási és indokolt esetben vízfogyasztási adatok (például 
ha a vizsgált vegyi anyagot vízzel adtuk be),  
— a toxikus reakciókra vonatkozó adatok nemek és adagolási szint szerint, 
beleértve a toxicitás jeleit vagy az elhullást, beleértve adott esetben az elhullás okát és id őpontját is,
 
— a részletes klinikai megfigyelések jellege, súlyossága, id őtartama, a 
fellépés napja, id őpontja és lefolyása,  
— a fejlődési tájékozódási pontok (testtömeg, szexuális érés és viselkedési 
egyedfejlődés) pontszámai az egyes megfigyelési id őpontokban,  
— a viselkedési, funkcionális, neuropatológiai, neurokémiai, elektrofizioló ­
giai eredmények részletes leírása nemek szerint, beleértve a kontr ­
ollokhoz viszonyított növekedéseket és csökkenéseket is,  
— boncolási eredmények,  
— agytömegek,  
— a neurológiai tünetekb ől és léziókból levezetett diagnózisok, beleértve a 
természetesen el őforduló betegségeket vagy állapotokat is,  
— a jellemz őnek tekintett leletekr ől készült képek,  
— a morfometriára használt metszetek homológ voltának értékelésére szol ­
gáló kis nagyítású képek,  
— felszívódási és anyagcsereadatok, beleértve a külön toxikokinetikai vizs ­
gálatból származó kiegészít ő adatokat is, ha volt ilyen,  
— az eredmények statisztikai feldolgozása, beleértve az adatok és az ered ­
mények elemzésére használt statisztikai modelleket is, függetlenül attól, 
hogy szignifikánsak voltak-e vagy sem,  
— a vizsgáló személyzet névjegyzéke, beleértve a szakmai képzéseket is.  
Az eredmények diszkussziója:  
— dózis-hatás információk nemenként és csoportonként,  
— bármely más toxikus hatás és a vizsgált vegyi anyag neurotoxicitási 
potenciáljával kapcsolatban levont következtetések kapcsolata nemen ­
ként és csoportonként,  
— a toxikokinetikai információk (ha vannak ilyenek) hatása a következte ­
tésekre,  
— hasonlóságok bármely ismert neurotoxikus anyag hatásaival,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— a vizsgálati módszer megbízhatóságát és érzékenységét alátámasztó 
adatok (pozitív és történeti kontrolladatok),  
— a neuropatológiai és a funkcionális hatások közötti kapcsolatok, ha 
vannak ilyenek,  
— NOAEL- vagy benchmarkdózis az anyaállatok és az utódok esetében, 
nemenként és csoportonként.  
Következtetések:  
— az adatok értelmezésének átfogó diszkussziója az eredmények alapján, 
beleértve az arra vonatkozó következtetést, hogy a vizsgált vegyi anyag 
okozott-e fejl ődési neurotoxicitást vagy sem, valamint a NOAEL-t is.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13- 14 June 1995.
 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Elektronikus formátumban: [http://www.epa.gov/ opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Seri ­
es/].
 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Elektronikus formátumban: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/ recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].
 
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral 
effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.  
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., 
Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental 
neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.
 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93-100.  
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23- 25 October 2000.
 
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian 
Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Elektronikus formátumban: [http://se ­
arch.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono 
(2008)16&doclanguage = en].
 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Elektro ­
nikus formátumban: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_ 
34377_1916054_1_1_1_1,00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
(14) E melléklet B.34. fejezete: Egygenerációs reprodukciós toxicitásvizsgálat.  
(15) E melléklet B.35. fejezete: Kétgenerációs reprodukciós toxicitásvizsgálat.  
(16) E melléklet B.43. fejezete: Neurotoxicitási vizsgálat rágcsálókban.  
(17) E melléklet B.31. fejezete: Prenatális fejl ődési toxicitásvizsgálat.  
(18) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU 
irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől, HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.  
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Elektronikus formátumban: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ 
ehc/ehc060.htm].
 
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Elektronikus formátumban: [http://www.in ­
tox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxi ­
col. Teratol., 19:499-509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110-112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 
13:118-136.  
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Peri­
natal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando.  
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, 
Washington, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.
 
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.  
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.
 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.
 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.
 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.  
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 67-100.  
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.  
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 37-82.  
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assess ­
ments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.  
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405-411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory 
animals.Physiol. Behav., 64:661-669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589-591.  
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287- 
351 
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107- 
128. 
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199-211.  
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxi ­
city in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.
 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445.  
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New 
York. pp. 125-145.  
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.
 
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev. 6:247-296.
 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237-244.  
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465-479.  
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.
 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.  
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342-352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol ., 36:338–341.  
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122-131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, pp. 84-107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalu ­
ation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.  
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365-372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and 
semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16:545-561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129–135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New 
York.  
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305- 
310. 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.  
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.  
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 
22:51-61.  
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.  
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294-298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slik­
ker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. Science, 283:70-74.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.
 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.  
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113-126.  
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21-27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165-172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221-228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.
 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.
 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296- 
313.
 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.
 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.
 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266-287.
 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288-325.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326-348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349-381.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
1. ábra  
Általános vizsgálati elrendezés a funkcionális/viselkedési tesztekhez, a neuropatológiai 
értékeléshez és az agytömegek vizsgálatához. Ez a vázlatrajz a 13–15. bekezdésben foglalt 
leíráson alapul (PND = posztnatális nap). Az állatok besorolására vonatkozó példák az 1. 
függelékben találhatók.
  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
1. függelék  
1. A lehetséges besorolásokra vonatkozó példák bemutatása szöveges és táblá ­
zatos formában az alábbiakban található. Ezek a példák annak illusztrálására 
szolgálnak, hogy a vizsgálati állatok különböz ő tesztelési paradigmákba 
való besorolása több különböz ő módon is elvégezhet ő. 
1. példa  
2. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 
nőstény kölyköt) használunk a viselkedési egyedfejl ődés elválasztás el őtti 
tesztelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 n őstény kölyköt) a 22. posztnatális 
napon (PND 22) humánusan elpusztítunk. Az agyakat eltávolítjuk, lemérjük, 
és feldolgozzuk a szövettani értékeléshez. Ezen túlmen ően agytömeg- 
adatokat gy űjtünk a dózisszintenként fennmaradó 10 hím és 10 n őstény 
állat fixálatlan agyának felhasználásával.
 
3. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 
1 nőstény kölyköt) használunk az elválasztás utáni funkcionális/viselkedési 
tesztek céljára (részletes klinikai vizsgálatok, motoros aktivitás, riasztó hanghatások és kognitív funkciók tesztelése serdül ő állatokban) és a szexu ­
ális éréskori életkor értékelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és 
dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 n őstény kölyköt) 
a vizsgálat befejezésekor (kb. PND 70) elaltatunk és perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást követ ően az agyat eltávolítjuk, és feldolgozzuk a 
neuropatológiai értékeléshez.
 
4. A kognitív funkciók fiatal feln őtt egyedekben (pl. PND 60-70) történ ő vizs­
gálatához egy harmadik adag, nemenként és dózisszintenként 20 db (azaz almonként 1 hím és 1 n őstény) kölyköt kell használni. Ezek közül az állatok 
közül nemenként és csoportonként 10 állatot (almonként 1 hím vagy 1 
nőstény egyedet) a vizsgálat befejezésekor el kell pusztítani, az agyakat el 
kell távolítani, majd megmérni.
 
5. A maradék 20 állat/nem/csoport esetleges további vizsgálatok számára van 
fenntartva.  
1. táblázat  
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
1 5 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejl ődés 
10 h + 10 n PND 22 agytömeg/neuropatoló ­
gia/morfometria 
10 h + 10 n PND 22 agytömeg 
2 6 20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 
20 h + 20 n Motoros aktivitás 
20 h + 20 n Nemi érés 
20 h + 20 n Motoros és szenzoros funkció 20 h + 20 n Tanulás és memória (PND 25) 
10 h + 10 n Fiatal feln őtt agytömeg/neuropa ­
tológia/morfometria ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
3 7 20 h + 20 n Tanulás és memória (fiatal 
felnőtt egyedek) 
10 h + 10 n Fiatal feln őtt agytömeg ~PND 
70 
4 8 — Tartalék állatok pótlás vagy 
további tesztek céljára  
( a ) Ebben a példában az almokat leredukáljuk 4 hím + 4 n őstény egyedre; a hím 
kölyköket 1-t ől 4-ig, nőstény kölyköket 5-t ől 8-ig számozzuk.  
2. példa  
6. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 
nőstény) használunk a viselkedési egyedfejl ődés elválasztás el őtti tesztelé ­
sére. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt 
(almonként 1 hím vagy 1 n őstény kölyköt) humánusan elpusztítunk a 11. 
posztnatális napon (PND 11). Az agyakat eltávolítjuk, lemérjük, és feldol ­
gozzuk a szövettani értékeléshez.  
7. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 
1 nőstény kölyköt) használunk az elválasztás utáni vizsgálatok céljára (rész ­
letes klinikai megfigyelések, motoros aktivitás, a szexuális éréskori életkor 
értékelése, motoros és szenzoros funkció). Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 
nőstény kölyköt) a vizsgálat befejezésekor (kb. PND 70) elaltatunk és 
perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást követ ően az agyat eltávolít ­
juk, megmérjük, és feldolgozzuk a neuropatológiai értékeléshez.
 
8. A kognitív funkciók serdül ő és fiatal feln őtt egyedekben történ ő vizsgála­
tához nemenként és dózisszintenként 10 db kölyköt használunk (azaz 
almonként 1 hím és 1 n őstény kölyköt). Különböz ő állatokat használunk 
a kognitív funkció vizsgálatához a 23. posztnatális napon (PND 23) és fiatal felnőttekben. A vizsgálat befejezésekor a feln őttkorban vizsgálandó nemen ­
kénti és csoportonkénti 10 állatot elpusztítjuk, majd az agyakat eltávolítjuk 
és megmérjük.
 
9. A vizsgálatra ki nem választott maradék 20 db/nem/csoport állatot az elvá ­
lasztáskor elpusztítjuk és eltávolítjuk.  
2. táblázat  
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
1 5 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejl ődés 
10 h + 10 n PND 11 agytömeg/neuropatoló ­
gia/morfometria 
2 6 20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 
20 h + 20 n Motoros aktivitás 20 h + 20 n Nemi érés 20 h + 20 n Motoros és szenzoros funkció 10 h + 10 n Fiatal feln őtt agytömeg/neuropa ­
tológia/morfometria ~PND 70
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
3 7 10 h + 10 n (  b ) Tanulás és memória (PND 23) 
3 7 10 h + 10 n (  b ) Tanulás és memória (fiatal 
felnőtt egyedek) 
Fiatal feln őtt agytömeg 
4 8 — Az állatokat a 21. posztnatális 
napon (PND 21) elpusztítjuk és eltávolítjuk.
 
( a ) Ebben a példában az almokat leredukáljuk 4 hím + 4 n őstény egyedre; a hím 
kölyköket 1-t ől 4-ig, nőstény kölyköket 5-t ől 8-ig számozzuk meg. 
( b ) Különböz ő kölyköket használunk a kognitív funkció vizsgálatához a 23. poszt ­
natális napon (PND 23) és fiatal feln őttekben (pl. páros/páratlan alom az 
összesen 20 alomból).  
3. példa  
10. Nemenként és dózisszintenként 20 kölyköt (azaz almonként 1 hím és 1 
nőstény kölyköt) használunk a 11. posztnatális napon (PND 11) az 
agytömeg mérésére és a neuropatológiai értékelésre. Ezek közül az állatok 
közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 n őstény kölyköt) a 11. posztnatális napon (PND 11) humánusan 
elpusztítunk, majd az agyakat eltávolítjuk, lemérjük és feldolgozzuk a 
kórszövettani értékeléshez. Ezen túlmen ően agytömeg-adatokat gy űjtünk a 
dózisszintenként fennmaradó 10 hím és 10 n őstény állat fixálatlan agyának 
felhasználásával.
 
11. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 
1 nőstény kölyköt) használunk a viselkedési egyedfejl ődés (motoros aktivi ­
tás) értékelésére, illetve az elválasztás utáni vizsgálatok céljára (motoros aktivitás, a szexuális éréskori életkor értékelése), valamint a serdül őkori 
kognitív funkció tesztelésére.
 
12. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 
1 nőstény kölyköt) használunk a motoros és szenzoros funkciós tesztek 
(riasztó hanghatások) és a részletes klinikai megfigyelések céljára. Ezek közül az állatok közül nemenként és dózisszintenként 10 kölyköt (azaz almonként 1 hím vagy 1 n őstény kölyköt) a vizsgálat befejezésekor (kb. 
PND 70) elaltatunk és perfúzióval rögzítünk. További in situ fixálást köve ­
tően az agyat eltávolítjuk, megmérjük, és feldolgozzuk a neuropatológiai 
értékeléshez.
 
13. Nemenként és dózisszintenként további 20 állatot (azaz almonként 1 hím és 
1 nőstény kölyköt) használunk a fiatal feln őtt egyedek kognitív funkció ­
jának tesztelésére. Ezek közül az állatok közül nemenként és csoportonként 10 állatot (azaz almonként 1 hím vagy 1 n őstény egyedet) a vizsgálat 
befejezésekor elpusztítunk, az agyakat eltávolítjuk, majd megmérjük.
 
3. táblázat  
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
1 5 10 h + 10 n PND 11 agytömeg/neuropatoló ­
gia/morfometria 
10 h + 10 n PND 11 agytömeg 
2 6 20 h + 20 n Viselkedési egyedfejl ődés 
(motoros aktivitás) 
20 h + 20 n Motoros aktivitás 20 h + 20 n Nemi érés 20 h + 20 n Tanulás és memória (PND 27)
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Kölyök 
sorszáma (  a ) A vizsgálatba besorolt 
kölykök száma Vizsgálat/Teszt 
h n  
3 7 20 h + 20 n Riasztó hanghatások (serdül ők 
és fiatal feln őtt egyedek) 
20 h + 20 n Részletes klinikai megfigyelések 
10 h + 10 n Fiatal feln őtt agytömeg/neuropa ­
tológia/morfometria ~PND 70 
4 8 20 h + 20 n Tanulás és memória (fiatal 
felnőtt egyedek) 
10 h + 10 n Fiatal feln őtt agytömeg  
( a ) Ebben a példában az almokat leredukáljuk 4 hím + 4 n őstény egyedre; a hím 
kölyköket 1-t ől 4-ig, nőstény kölyköket 5-t ől 8-ig számozzuk.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
2. függelék  
Fogalommeghatározások  
Vegyi anyag: egy anyag vagy keverék  
Vizsgált vegyi anyag: bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  UTEROTROFIKUS BIOLÓGIAI VIZSGÁLAT RÁGCSÁLÓKBAN: 
GYORS SZ ŰRŐVIZSGÁLAT AZ ÖSZTROGÉNSZER Ű 
TULAJDONSÁGOK KIMUTATÁSÁRA  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 440. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2007) leírt módszerrel. Az OECD 1998-ban a meglév ő vizsgálati 
iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen 
károsító anyagok kisz űrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati irány ­
mutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított (1). A tevékenység egyik eleme a rágcsáló uterotrofikus biológiai vizsgálati iránymutatásának kidolgozása volt. A rágcsáló uterotrofikus biológiai vizs ­
gálatát ezután egy alapos validálási programnak vetették alá, beleértve a 
részletes háttér-dokumentáció összeállítását (2) (3), valamint a kiterjedt laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti vizsgálatokat, amelyek a biológiai vizsgálat relevanciáját és reprodukálhatóságát vizsgálták er ős 
referencia-ösztrogénnel, gyenge ösztrogén-receptor agonistákkal, er ős öszt­
rogén-receptor antagonistával, illetve negatív referencia vegyi anyaggal (4) (5) (6) (7) (8) (9). A B.54 vizsgálati módszer a validálási tesztprogram 
során szerzett tapasztalatokon és az ösztrogén agonistákkal kapcsolatban 
ennek keretében gy űjtött eredményeken alapul.
 
2. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat egy gyors sz űrővizsgálat, amelyet erede ­
tileg az 1930-as években fejlesztettek ki (27) (28), és els őként egy szakért ői 
bizottság szabványosította sz űrés céljára 1962-ben (32) (35). A vizsgálat a 
méh tömegének növekedésén vagy az uterotrofikus válasz fokozódásán alapul (összefoglalásért lásd: 29). Abból a szempontból értékeli a vegyi 
anyagokat, hogy képesek-e a természetes ösztrogének (például 17ß-öszt ­
radiol) agonistáiéhoz vagy antagonistáiéhoz hasonló biológiai aktivitást kiváltani, habár sokkal ritkábban használják antagonisták, mint agonisták kimutatására. A méh kétféle módon reagál az ösztrogénre. A kezdeti válasz 
részben a megnövekedett vízfelvétel miatti tömeggyarapodás. Ezt a választ a 
szöveti osztódás miatti tömeggyarapodás követi (30). A méh által adott válaszok a patkányokban és az egerekben min őségileg hasonlóak.
 
3. Ez a biológiai vizsgálat in vivo sz űrővizsgálati célokat szolgál, és alkalma ­
zását az „OECD fogalmi kerete az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére” (2. függelék) összefüggésében kell 
szemlélni. Ebben a fogalmi keretben a uterotrofikus biológiai vizsgálatot 
a 3. szint tartalmazza olyan  in vivo  vizsgálatként, amely egyetlen endokrin 
mechanizmusról, az ösztrogénszer ű hatásról szolgáltat adatokat.
 
4. A uterotrofikus biológiai vizsgálatot arra használják, hogy beépítik az 
endokrin rendszerrel potenciálisan kölcsönhatásba lép ő vegyi anyagok 
azonosítására szolgáló  in vitro  és in vivo  vizsgálatsorozatba, amely végs ő 
soron az emberi egészségre vagy a környezetre gyakorolt kockázatok érté ­
kelését célozza. Az OECD validálási program er ős és gyenge ösztrogén 
agonistákat egyaránt használt a vizsgálat ösztrogénszer ű aktivitással rendel ­
kező vegyszerek azonosítása terén nyújtott teljesítményének értékelésére (4) 
(5) (6) (7) (8). Ezáltal a vizsgálati eljárás érzékenysége az ösztrogén 
agonisták tekintetében jól bizonyított, jó laboratóriumon belüli és laborató ­
riumok közötti reprodukálhatóság mellett.  
5. Ami a negatív vegyi anyagokat illeti, csak egyetlen „negatív” referencia 
vegyi anyag szerepelt a validálási programban, amelyet már negatívnak 
talált úgy az uterotrofikus vizsgálat, mint az  in vitro  receptorkötési és 
receptorvizsgálatok, de további, az OECD validálási programmal összefüg ­
gésben nem álló vizsgálati adatokat is kiértékeltek, hogy még jobban alátá ­
masszák az uterotrofikus biológiai vizsgálat ösztrogén agonisták sz űrése 
terén mutatott specificitását (16).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
6. Az ösztrogén agonisták és antagonisták ligandumként hatnak az a és b 
ösztrogén receptorokra és aktiválhatják vagy gátolhatják a receptorok 
transzkripciós m űködését. Ez káros egészségügyi kockázatokat eredményez ­
het, beleértve a reproduktív és a fejl ődési hatásokat. Ezért fennáll az igény a 
vegyi anyagok lehetséges ösztrogén agonista vagy antagonista hatásának 
gyors felmérésére és értékelésére. Bár informatív, a ligandum affinitása 
egy ösztrogén receptorhoz vagy a riporter gének  in vitro  transzkripciós 
aktiválása csak egy a lehetséges veszélyt meghatározó számos tényez ő 
közül. További tényez ők lehetnek a szervezetbe történ ő belépéskor bekö ­
vetkező metabolikus aktiválódás és deaktiválódás, a célszövetekbe történ ő 
disztribúció, illetve a szervezetb ől történő kiürülés, amelyek legalább 
részben a beadás módjától és a vizsgált vegyi anyagtól függenek. Ennek következtében szükség van arra, hogy  in vivo , azaz aktuális körülmények 
között sz űrjék a vegyi anyagok lehetséges aktivitását, kivéve, ha a vegyi 
anyag jellemz ői a felszívódás-eloszlás-metabolizmus-kiürülés (absorption- 
distribution-metabolism-elimination, ADME) tekintetében már jelenleg is megfelelő információkat szolgáltatnak. A méh szövetei gyors és er őteljes 
növekedéssel reagálnak az ösztrogének általi stimulációra, különösen labo ­
ratóriumi rágcsálókban, ahol az ösztrogénciklus körülbelül 4 napig tart. A rágcsálófajokat, különösen a patkányokat, széles körben használják a kocká ­
zatok jellemzését célzó toxicitási vizsgálatokra is. Ezért a rágcsálók méhe 
megfelelő célszerv az ösztrogén agonisták és antagonisták  in vivo  szűrésére.
 
7. A vizsgálati módszer az OECD validálási vizsgálatban alkalmazott azon 
protokollokon alapul, amelyeket a laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti vizsgálatokban megbízhatónak és megismételhet őnek találtak (5) (7). 
Jelenleg két módszer, nevezetesen az ovariektomizált kifejlett n őstény 
módszer (ovx-feln őtt módszer), és az éretlen, nem ovariektomizált módszer 
(éretlen módszer) áll rendelkezésre. Az OECD validálási tesztprogramban bebizonyosodott, hogy a két módszer összehasonlítható érzékenységgel és 
reprodukálhatósággal rendelkezik. Az éretlen módszer azonban, mivel az 
állatok érintetlen hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengellyel rendelkez ­
nek, valamivel kevésbé specifikus, viszont a benne foglalt vizsgálatok köre nagyobb, mint az ovariektomizált módszer esetében, mert reagálni képes 
azokra a vegyi anyagokra is, amelyek nemcsak az ösztrogén receptorral, 
hanem a HPG-tengellyel is kölcsönhatásba lépnek. A patkány HPG-tengelye körülbelül 15 napos korban kezd m űködni. Ezt megel őzően a pubertást nem 
lehet olyan kezelésekkel felgyorsítani, mint pl. a GnRH. Amikor a n ősté­
nyek kezdik elérni a pubertáskort, a n őstényeknek a hüvelykinyílás el őtt 
több csendes ciklusuk van, amelyek nem eredményeznek hüvelykinyílást vagy ovulációt, de hormonális ingadozások megfigyelhet ők. Ha egy vegyi 
anyag közvetlenül vagy közvetve serkenti a HPG-tengelyt, az korai puber ­
tást, korai ovulációt és gyorsított hüvelykinyílást eredményez. Nemcsak a 
HPG tengelyre ható vegyi anyagok képesek erre, hanem néhány magasabb metabolizálható energiaszintet tartalmazó étrend is, amelyek serkentik a 
növekedést és felgyorsítják a hüvelykinyílást, anélkül, hogy ösztrogénszer ű 
hatásuk lenne. Az ilyen vegyi anyagok nem váltanak ki uterotrofikus választ az OVX feln őtt állatokban, mivel a HPG-tengelyük nem m űködik.
 
8. Állatjóléti okok miatt az éretlen patkányokat használó módszert kell 
előnyben részesíteni, elkerülve az állatok m űtéti előkezelését és elkerülve 
azoknak az állatoknak a kihagyását, amelyek kezd ődő ivarzásra utaló bármi ­
lyen jelet mutatnak (lásd 30. bekezdés).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Az uterotrofikus válasz nem teljesen ösztrogén eredet ű, azaz az ösztrogén 
agonistákon vagy antagonistákon kívül egyéb vegyi anyagok is választ 
válthatnak ki. Például a progeszteron, a tesztoszteron, vagy a különféle szintetikus progesztinek viszonylag nagy dózisai mind stimulációhoz vezet ­
hetnek (30). Bármilyen választ szövettanilag lehet elemezni a keratinizáció 
és a hüvely-elszarusodás jelenlétére (30). A válasz lehetséges eredetét ől 
függetlenül az uterotrofikus biológiai vizsgálat pozitív eredménye alapján további tisztázást célzó intézkedéseket kell kezdeményezni. Az ösztrogén ­
szerű hatásra vonatkozó további bizonyítékokat lehet gy űjteni az  in vitro  
vizsgálatokból, úgymint az ER köt ődési vizsgálatokból és transzkripciós 
aktiválási vizsgálatokból, illetve más  in vivo  vizsgálatokból, úgymint a 
nőstény pubertás vizsgálatból.
 
10. Figyelembe véve, hogy az uterotrofikus biológiai vizsgálat  in vivo  szűrő­
vizsgálatként szolgál, a kiválasztott validálási megközelítés egyaránt 
megfelelt az állatjólléti megfontolásoknak és a lépcs őzetes vizsgálati straté ­
giának. Ezért az er őfeszítések arra összpontosultak, hogy alaposan vali ­
dálják az ösztrogénszer ű hatás – amely a f ő aggály számos vegyi anyaggal 
szemben – reprodukálhatóságát és érzékenységét, míg a vizsgálat antiöszt ­
rogén elemére kevesebb figyelem irányult. Csak egyetlen er ős aktivitású 
antiösztrogént vizsgáltak, mivel az egyértelm ű antiösztrogén-profillal (ame ­
lyet nem fed el valamilyen ösztrogénszer ű aktivitás) rendelkez ő vegyi 
anyagok száma nagyon korlátozott. Így ez a vizsgálati módszer az ösztrogén 
protokollhoz tartozik, míg a vizsgálat antagonista módozatát leíró protokollt az iránymutatás tartalmazza (37). A tisztán antiösztrogén aktivitású vegyi anyagok esetében a vizsgálat reprodukálhatóságát és érzékenységét kés őbb 
fogják pontosabban meghatározni, miután a vizsgálati eljárást már egy ideig 
rutinszerűen használták, és több ilyen aktivitással rendelkez ő vegyi anyagot 
beazonosítottak.
 
11. Minden állatkísérleteken alapuló eljárást az állatgondozásra vonatkozó helyi 
szabványoknak megfelel ően kell végrehajtani; az alábbiakban foglalt, 
gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális teljesítményszabvá ­
nyok, amelyeket a helyi szabályozások – mint például a tudományos 
célokra felhasznált állatok védelmér ől szóló 2010/63/EU európai parlamenti 
és tanácsi irányelv (2010. szeptember 22.) (38) – felülírnak (38). Az állat ­
okkal való humánus bánásmódról további iránymutatás a megfelel ő 
OECD-kiadványban található (25).  
12. Mint minden, él ő állatok felhasználásával végzett vizsgálat esetében, már a 
vizsgálat megkezdése el őtt alapvet ő fontosságú ellen őrizni, hogy az adatok 
valóban szükségesek-e. Két olyan körülmény, amikor például az adatokra szükség lehet:
 
— magas expozíciós potenciál (az elvi keretrendszer 1-es szintje, 2. függe ­
lék) vagy ösztrogénszer ű hatásra utaló jelek (2. szint) esetén annak 
vizsgálata, hogy az ilyen hatások  in vivo  is előfordulhatnak-e,  
— a 4. vagy 5. szint ű in vivo  tesztekben mutatott ösztrogénszer ű hatásra 
utaló jelek esetén annak alátámasztása, hogy a hatás kapcsolatban áll egy olyan ösztrogén-mechanizmussal, amelyet nem lehet  in vitro  vizs­
gálattal tisztázni.
 
13. Az ebben a vizsgálati módszerben használt fogalmak meghatározását az 1. 
függelék tartalmazza.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
14. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat az érzékenység tekintetében egy állat ­
kísérletekb ől álló rendszerre támaszkodik, amelyben a hipotalamusz-hipofí ­
zis-petefészek tengely nem m űködik, ami a kering ő ösztrogén alacsony 
endogén szintjét eredményezi. Ez alacsony kiindulási méhtömeget és maxi ­
mális választartományt biztosít a beadott ösztrogénre. Két ösztrogénre érzé ­
keny állapot felel meg ennek a követelménynek n őstény rágcsálókban:  
i. éretlen n őstények az elválasztás után és a pubertás el őtt; és  
ii. fiatal kifejlett n őstények a petefészek eltávolítása után, megfelel ő időt 
adva a méhszövetek visszafejl ődésére.  
15. A vizsgált anyagot orális szondán keresztül vagy szubkután injekció formá ­
jában naponta adagoljuk. A vizsgált vegyi anyag fokozatos dózisait adjuk 
be a kísérleti állatok legalább két kezelési csoportjának (iránymutatásért lásd 
a 33. bekezdést), csoportonként egy dózisszintet használva, az anyagot az éretlen módszer esetében három egymást követ ő napon, az ovx feln őtt 
módszer esetében pedig minimálisan három egymást követ ő napon beadva. 
Az állatokat körülbelül 24 órával az utolsó dózis után felboncoljuk. Öszt ­
rogén agonisták esetében a kezelt állatcsoport átlagos méhtömegét a viv ő­
anyag-csoporthoz viszonyítva értékeljük a statisztikailag szignifikáns növe ­
kedés kimutatása érdekében. A vizsgálati csoport átlagos méhtömegének 
statisztikailag szignifikáns növekedése pozitív választ jelent a biológiai vizs ­
gálatban.
 
A MÓDSZER ISMERTETÉSE  
Az állatfaj kiválasztása  
16. Általánosan használt laboratóriumi rágcsálótörzseket lehet alkalmazni. A 
validálás során például Sprague-Dawley- és Wistar-patkánytörzseket hasz ­
náltak. Az ismert vagy feltételezett alacsonyabb érzékenység ű méhvel 
rendelkez ő törzseket nem szabad használni. A laboratóriumnak a 26. és 
27. bekezdésben leírtak szerint bizonyítania kell a felhasznált törzs érzé ­
kenységét.  
17. A patkányt és az egeret már az 1930-as évek óta használják rutinszer űen az 
uterotrofikus biológiai vizsgálatban. Az OECD validálási vizsgálatokat csak 
patkányokon végezték el azon az alapon, hogy a két fajt egyenérték űnek 
tekintették, ezért egy fajnak elegend őnek kell lennie a világméret ű validálás 
céljára, hogy er őforrásokat és állatokat lehessen megtakarítani. A patkány a 
választott faj a legtöbb reprodukciós és fejl ődési toxicitási vizsgálat eseté ­
ben. Figyelembe véve, hogy hatalmas történelmi adatbázis létezik egerekre, egy korlátozott nyomonkövetés ű validálási vizsgálatot végeztek egereken is 
annak érdekében, hogy az uterotrofikus biológiai vizsgálati módszert kiter ­
jesszék az egerek kísérleti fajként való használatára (16). Egy áthidaló 
megközelítést választottak korlátozott számú vizsgált vegyi anyaggal, részt vevő laboratóriummal és nem kódolt minták vizsgálatával, összhangban az 
erőforrások és állatok megtakarítását célzó eredeti szándékkal. Az uterotro ­
fikus biológiai vizsgálat fiatal feln őtt ovariektomizált egerekben végzett 
áthidaló validálási vizsgálata azt mutatja, hogy a patkányokban és egerekben kapott adatok min őségi és mennyiségi szempontból jól 
megfelelnek egymásnak. Ha az uterotrofikus biológiai vizsgálat eredménye 
egy hosszú távú vizsgálat el őzménye, akkor mindkét kísérlethez ugyanabból 
a törzsből való, azonos eredet ű állatokat használhatnak. Az áthidaló 
megközelítés az OVX egerekre korlátozódott és a jelentés nem nyújt megbízható adatsort az éretlen modell validálásához, ezért az egerek éretlen 
modelljét nem veszik figyelembe a jelenlegi vizsgálati módszer alkalmazási 
területén.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Így bizonyos esetekben patkányok helyett egereket is lehet használni. Ennek 
fajnak a használatát toxikológiai, farmakokinetikai és/vagy egyéb kritériu ­
mokkal meg kell indokolni. Egerekben szükség lehet a protokoll módosítá ­
sára. Például az egerek testtömeghez viszonyított takarmányfogyasztása nagyobb, mint a patkányoké, ezért a takarmány fitoösztrogén-tartalmának 
alacsonyabbnak kell lennie egerek, mint patkányok esetében (9) (20) (22).
 
Tartási és etetési körülmények  
19. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonat ­
kozó helyi szabványoknak. Ezek a gondozásra és kezelésre vonatkozó 
leírások minimális teljesítményszabványok, amelyeket a helyi szabályozások – mint például a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől szóló 
2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv (2010. szeptember 22.) 
(38) – felülírnak (38). A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmér­
séklete 22 °C (kb. ±3 °C eltérési tartománnyal) kell, hogy legyen. A helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie és a takarítás időtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 70 %-ot. A relatív 
páratartalom célértékének 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen 
mesterséges. Naponta 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
 
20. A laboratóriumi takarmányt és az ivóvizet korlátozás nélkül kell biztosítani. 
A fiatal feln őtt állatok egyedileg vagy legfeljebb három egyedb ől álló 
csoportokban is tarthatók. Az éretlen állatok fiatal kora miatt társas, 
csoportos tartás ajánlott.  
21. A laboratóriumi takarmányok magas fitoösztrogén-tartalmáról már ismert, 
hogy olyan mértékben növeli meg a rágcsálók méhének tömegét, amely már 
zavarja az uterotrofikus biológiai vizsgálatot (13) (14) (15). A laboratóriumi takarmányok magas fitoösztrogén- és metabolizálható energia tartalma korai pubertáshoz is vezethet, ha éretlen állatokat használnak. A fitoösztrogének 
jelenléte els ősorban a szója és lucerna laboratóriumi takarmányba való 
beépítésének eredménye és a fitoösztrogének koncentrációja a standard laboratóriumi takarmány egyes gyártási tételei között is változik (23). A testtömeg egy fontos változó, mivel az elfogyasztott takarmány mennyisége 
összefügg a testtömeggel. Ezért az ugyanabból a takarmányból ténylegesen 
felvett fitoösztrogén-dózis állatfaj és életkor szerint különbözhet (9). Az éretlen nőstény patkányok testtömeg alapján számított takarmányfogyasztása 
mintegy kétszerese lehet az ovariektomizált fiatal feln őtt nőstényekének. A 
fiatal feln őtt egerek testtömeg alapján számított takarmányfogyasztása 
mintegy négyszerese lehet az ovariektomizált fiatal feln őtt nőstény patká ­
nyokénak.
 
22. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat eredményei (9) (17) (18) (19) azonban 
azt mutatják, hogy korlátozott mennyiség ű étrendi fitoösztrogén elfogadható 
és nem csökkenti a biológiai vizsgálat érzékenységét. Iránymutatásként, a 
fitoösztrogének étrendi szintje nem haladhatja meg a 350 μg genistein 
ekvivalens/gramm laboratóriumi takarmány értéket éretlen n őstény 
Sprague-Dawley- és Wistar-patkányok esetében (6) (9). Az ilyen étrend is megfelelő a fiatal feln őtt ovariektomizált patkányok vizsgálatkor, mivel a 
testtömegre vetített takarmányfogyasztás kisebb a fiatal feln őtt, mint a kifej ­
lett állatokban. Amennyiben kifejlett ovariektomizált egereket vagy fitoöszt ­
rogénekre érzékenyebb patkányokat kell használni, oda kell figyelni az étrendi fitoösztrogénszint arányos csökkentésére (20). Ezen túlmen ően, a 
különféle étrendek elérhet ő metabolikus energiájában mutatkozó különb ­
ségek a pubertás id őpontjának eltolódásához vezethetnek (21) (22).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. A vizsgálat el őtt gondosan ki kell választani egy olyan étrendet, amelynek 
nem magas a fitoösztrogén- vagy metabolizálható energiaszintje (útmutatá ­
sért lásd (6) (9)), amelyek zavarhatnák az eredményeket (15) (17) (19) (22) (36). A laboratórium által használt vizsgálati rendszer 26. és 27. bekezdé ­
sekben meghatározott megfelel ő teljesítményének biztosítása érdekében 
mindkét tényez őt ellen őrizni kell. A helyes laboratóriumi 
gyakorlattal (GLP) összhangban lév ő biztonsági intézkedésként reprezen ­
tatív mintavételt kell végezni a vizsgálat során alkalmazott takarmány minden egyes tételéb ől a takarmány fitoösztrogén-tartalmának esetleges 
analízise céljából (pl. ha a kontroll méhtömeg magas a történelmi kontr ­
ollokhoz viszonyítva, vagy ha a referencia ösztrogén, a 17-alfa-etinil-öszt ­
radiol nem eredményez megfelel ő választ). Az aliquotokat a vizsgálat része ­
ként, vagy – 20°C-on fagyasztva, vagy olyan módon kell analizálni, amely 
megakadályozza a minták analízis el őtti lebomlását.
 
24. Egyes alomanyagok természetes ösztrogén vagy antiösztrogén hatású vegyi 
anyagokat tartalmazhatnak (pl. a kukoricacsutkáról közismert, hogy befo ­
lyásolja a patkányok ciklusát és antiösztrogén hatású). A kiválasztott alom ­
anyagnak minimális mennyiség ű fitoösztrogént szabad tartalmaznia.  
Az állatok el őkészítése  
25. A betegségekre vagy fizikai rendellenességekre utaló jeleket nem mutató 
kísérleti állatokat véletlenszer űen kell besorolni a kontroll- és a kezelési 
csoportokba. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy minimálisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Az állatokat egyedi azonosítóval kell ellátni. El őnyös, ha az éretlen állatokat az akklimatizáció 
alatt az elválasztásig az anyaállatokkal vagy nevel őanyákkal közös ketre ­
cekben helyezik el. Az akklimatizációs id őszak a vizsgálat kezdete el őtt 
fiatal feln őtt állatok és anyaállatokkal vagy nevel őanyákkal együtt szállított 
éretlen állatok esetében körülbelül 5 nap. Ha az éretlen állatokat választott 
állatokként, anyaállatok nélkül kapja meg a laboratórium, rövidebb id őtar­
tamú akklimatizációs id őszak válhat szükségessé, mivel az adagolást az 
elválasztás után azonnal meg kell kezdeni (lásd a 29. bekezdést).
 
ELJÁRÁS  
A laboratórium jártasságának igazolása  
26. A laboratórium jártasságának ellen őrzésére két különböz ő módszert lehet 
alkalmazni:  
— időszakos ellen őrzés, a kiindulási pozitív kontrollvizsgálatra támasz ­
kodva (lásd a 27. bekezdést). Legalább hathavonta és minden alkalom ­
mal, amikor olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat teljesítményét (pl. új összetétel ű takarmány, változás a boncolást végz ő 
személyzetben, változás az állattörzsben vagy a szállítóban, stb.), ellen ­ 
őrizni kell a tesztrendszer (állatmodell) érzékenységét a referencia öszt ­
rogén megfelel ő dózisának (a 27. bekezdésben leírt kiindulási pozitív 
kontrollvizsgálat alapján) használatával: 17a-etinil-ösztradiol (CAS- 
szám: 57-63-6) (EE),
 
— egyidej ű ellenőrzések használata, melynek keretében minden vizsgálatba 
bevonnak egy csoportot, amelyet a referencia ösztrogén megfelel ő adag­
jával kezelnek.  
Ha a rendszer nem a várt választ adja, meg kell vizsgálni és megfelel ően 
módosítani kell a kísérleti körülményeket. Ajánlatos, hogy a referencia öszt ­
rogén alkalmazott dózisa mindkét megközelítés esetében megközelít őleg az 
ED70 és 80 között legyen.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Kiindulási pozitív kontrollvizsgálat  – Mielőtt a laboratórium els ő alka­
lommal végezne vizsgálatot eszerint a vizsgálati módszer szerint, a labora ­
tóriumi jártasságát az állatmodell érzékenységének tesztelése útján igazolni kell a referencia ösztrogén dózis-válasz összefüggésének meghatározásával: 17a-etinil-ösztradiol (CAS-szám: 57-63-6) (EE), minimum négy dózisban. A 
méhtömeg-választ össze kell hasonlítani a megalapozott történeti adatokkal 
(lásd az (5) referenciát). Ha ez a kiindulási pozitív kontrollvizsgálat nem adja a várt eredményeket, a kísérleti körülményeket meg kell vizsgálni és módosítani kell.
 
Az állatok száma és állapota  
28. Minden egyes kezelési és kontrollcsoportnak legalább 6 állatot kell tartal ­
maznia (mind az éretlen, mind az ovx feln őtt módszer protokollja esetében).  
Az éretlen állatok életkora  
29. Az éretlen állatokkal végzett uterotrofikus biológiai vizsgálat esetében meg 
kell adni a születés napját. Az adagolást elég korán kell kezdeni ahhoz, hogy a vizsgált vegyi anyag adagolásának végéig az endogén ösztrogének szintjének a pubertáshoz kapcsolódó fiziológiás megemelkedésére még ne 
kerüljön sor. Másrészt, bizonyíték van arra, hogy a nagyon fiatal állatok 
kevésbé érzékenyek lehetnek. Az optimális életkor meghatározása során minden laboratóriumnak a nemi éréssel kapcsolatos saját háttéradatait kell figyelembe vennie.
 
Általános szabályként alkalmazható, hogy patkányokban az adagolás a 18. 
posztnatális napon végrehajtott korai elválasztás után azonnal megkezd ődhet 
(a születés napja a 0. posztnatális nap). Az adagolást patkányokban lehet őség 
szerint a 21. posztnatális napon be kell fejezni, de a 25. posztnatális napot megelőzően mindenféleképpen, mert ez után az életkor után a hipotalamusz- 
hipofízis-petefészek tengely m űködni kezd, és az endogén ösztrogén szintek 
emelkedni kezdhetnek, amivel együtt a kiindulási átlagos méhtömeg és a 
csoporton belüli szórás is megemelkedik (2) (3) (10) (11) (12).
 
Az ovariektómiára vonatkozó eljárás  
30. Az ovariektomizált n őstény patkányok és egerek esetében (kezelési és kont ­
rollcsoportok) a petefészek eltávolítására 6 és 8 hetes kor között kell sort keríteni. Patkányok esetében legalább 14 napnak kell eltelnie a petefészek 
eltávolítása és az adagolás els ő napja között, hogy a méh visszafejl ődhessen 
egy minimális, stabil kiindulási állapotra. Egerek esetében legalább 7 napnak kell eltelnie a petefészkek eltávolítása és az adagolás els ő napja 
között. Mivel kis mennyiség ű petefészek-szövet is elegend ő egy szignifi ­
káns kering ő ösztrogénszint el őállításához (3), az állatokat a felhasználás 
előtt meg kell vizsgálni a hüvelyb ől legalább öt egymást követ ő napon 
tamponált hámsejtek megfigyelésével (pl. patkányok esetében 10–14 nappal 
a petefészek eltávolítása után). Ha az állatok az oestrus bármilyen jelét 
mutatják, azokat az állatokat nem szabad használni. Továbbá, a petefé ­
szek-csonkokat boncoláskor meg kell vizsgálni a petefészek-szövet jelenlé ­
tére utaló bizonyítékokra. Amennyiben van ilyen, akkor az állatot nem kell 
használni a számításokban (3).
 
31. Az ovariektómia eljárása azzal kezd ődik, hogy az állat a megfelel ő altatást 
követően ventrális helyzetben fekszik. A dorzolaterális hasfalat megnyitó 
kb. 1 cm-es hosszanti bemetszést az alsó bordaszél és a csíp őlapát közötti 
felezőpontban, az ágyéki izom laterális szélét ől néhány milliméterre laterá ­
lisan kell megtenni. A petefészket ki kell emelni a hasüregb ől és aszeptikus 
területre helyezni. A petefészket a petevezeték és a méhtest találkozásánál le 
kell választani. Miután meggy őződtünk arról, hogy nem lépett fel súlyos 
vérzés, a hasfalat varrattal, a b őrt pedig kapcsokkal vagy megfelel ő varrattal 
kell zárni. A ligációs pontokat sematikusan az 1. ábra mutatja be. Megfelel ő 
posztoperatív fájdalomcsillapítást kell alkalmazni a rágcsálóellátásban jártas 
állatorvos ajánlása szerint.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Testtömeg  
32. Az ovx-feln őtt módszernél a testtömeg és a méh tömege nincs korreláció ­
ban, mert a méh tömegét a hormonok – mint az ösztrogének – befolyásolják 
ugyan, de a testméretet szabályozó növekedési faktorok nem. Ezzel ellen ­
tétben, az éretlen modellben az érés során a testtömeg összefüggésben áll a méh tömegével (34). Ezért a vizsgálat kezdetén az éretlen modellben hasz ­
nált állatok testtömege lehet őleg csak minimálisan térjen el egymástól és az 
átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal különbözzön. Ez azt jelenti, hogy a 
tenyésztőnek szabványosítania kell az alomszámot annak érdekében, hogy a 
különböző anyaállatok utódai közel azonos mennyiség ű táplálékhoz jussa ­
nak. Az állatokat a randomizált súlyeloszlás módszerével kell besorolni a 
csoportokba (mind a kontroll-, mind a kezelési csoportokba), hogy az egyes csoportok átlagos testtömege statisztikailag ne különbözzön a többi csopor ­
tétól. Figyelembe kell venni, hogy amennyire csak lehetséges, kerülend ő az 
alomtestvérek ugyanabba a kezelési csoportba való besorolása, de a vizs ­
gálathoz használt almok számának növelése nélkül.
 
Adagolási szintek  
33. Annak megállapítása érdekében, hogy a vizsgált vegyi anyag rendelkezik-e  
in vivo  ösztrogénszer ű hatással, két dóziscsoport és egy kontrollcsoport 
általában elegend ő, és ezt az elrendezést ezért állatjólléti okok miatt 
előnyben kell részesíteni. Ha a cél a dózis-válasz görbe felállítása vagy 
az alacsonyabb dózisokra történ ő extrapoláció, akkor legalább 3 dóziscso ­
portra van szükség. Ha az ösztrogénaktivitás azonosításán túlmen ő informá­
cióra van szükség (például a hatóérték becslésére), fontolóra kell venni eltérő adagolási rend alkalmazását. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a 
vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, 
mint a vizsgálati csoportokban lév őket. Ha viv őanyagot használunk a vizs ­
gált anyag beadása során, a kontrollcsoport ugyanakkora mennyiség ű vivő­
anyagot kapjon, mint a kezelési csoportok (vagy a vizsgálati csoportokban alkalmazott legnagyobb mennyiséget, ha eltérés van a különböz ő csoportok 
között).
 
34. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat esetében a cél olyan dózisok kiválasz ­
tása, amelyek biztosítják az állatok túlélését és amelyek nem okoznak jelentős toxicitást vagy szorongást az állatoknak a vegyi anyag három 
egymást követ ő napon maximum 1 000 mg/kg/nap dózisban történ ő adago­
lása alatt. Valamennyi adagolási szint ajánlásánál és kiválasztásánál figye ­
lembe kell venni a vizsgált, vagy azzal rokon vegyi anyagok toxicitására és (toxiko)kinetikájára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. A legnagyobb 
dózisnál el őször az LD50 és/vagy akut toxicitási információkat kell figye ­
lembe venni annak érdekében, hogy elkerüljék az állatok elhullását, súlyos szenvedését vagy szorongását (24) (25) (26). A legmagasabb dózisnak a maximális tolerált dózist (MTD) kell képviselnie; az olyan vizsgálatot, 
amelyet a pozitív uterotrofikus választ indukáló dózisszinten végeznek, 
szintén el lehet fogadni. Sz űrésként a dózisok közötti nagy intervallumok 
(pl. fél log egység, amely 3,2 dózisprogressziónak felel meg, vagy akár egy log egység) általában elfogadhatók. Ha nem állnak rendelkezésre megfelel ő 
adatok, akkor dózisbehatároló vizsgálat végezhet ő az alkalmazandó dózisok 
meghatározása céljából.
 
35. Alternatívaként, ha az ösztrogén agonista potenciáját az  in vitro  (vagy  in 
silico ) adatok alapján meg lehet becsülni, ezek is figyelembe vehet ők a 
dózis kiválasztásakor. Például, a vizsgált vegyi anyagnak azt a mennyiségét, 
amely a referencia agonistával (etinil-ösztradiol) egyenérték ű uterotrofikus 
válaszokat eredményezne, az etinil-ösztradiolhoz viszonyított relatív  in vitro  
potenciája alapján kell megbecsülni. A legnagyobb vizsgálati dózist úgy 
kapjuk meg, hogy ezt az ekvivalens dózist megszorozzuk egy megfelel ő 
faktorral pl. 10-zel vagy 100-zal.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
A dózisbehatárolás szempontjai  
36. Ha szükséges, néhány állattal el őzetes dózisbehatároló vizsgálat végezhet ő. 
Ebben a tekintetben az OECD 19. iránymutatását (25) lehet használni, 
amely meghatározza az állatokban jelentkez ő toxicitásra vagy szorongásra 
utaló klinikai tüneteket. Ha a háromnapos adagolással járó dózisbehatároló vizsgálatban megvalósítható, a méheket körülbelül 24 órával az utolsó dózis 
után lehet kimetszeni és megmérni. Ezek az adatokat azután felhasználhatók 
a fő vizsgálat elrendezésének megtervezésében (az elfogadható maximális és 
alacsonyabb dózisok kiválasztása, javaslattétel a dóziscsoportok számára).
 
A dózisok beadása  
37. A vizsgált vegyi anyagot orális szondán keresztül vagy szubkután injekció 
formájában adagolják. Az állatjóléti és toxikológiai szempontokat, mint 
például a vegyi anyaggal való emberi expozíciós útvonallal kapcsolatos relevanciát (pl. gyomorszonda a lenyelés modellezésére, b őr alá adott 
injekció a belégzés vagy b őrön át történ ő adszorpció modellezésére), a 
vizsgálati vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságait és különösen az anyag ­
cserével és a kinetikával kapcsolatban rendelkezésre álló toxikológiai infor ­
mációkat és adatokat (pl. first pass metabolizmus elkerülése, jobb hatásfok adott útvonalon keresztül) egyaránt figyelembe kell venni a beadás útvona ­
lának kiválasztásakor.
 
38. Ahol csak lehetséges, el őször valamilyen vizes oldat/szuszpenzió haszná ­
latát kell megfontolni. De mivel a legtöbb ösztrogén ligandum vagy azok metabolikus prekurzorai általában hidrofóbok, a leggyakoribb megközelítés 
az, hogy olajos oldatot/szuszpenziót használnak (pl. kukorica-, mogyoró-, 
szezám- vagy olívaolaj). Ezek az olajok azonban különböz ő kalória- és 
zsírtartalommal rendelkeznek, így a viv őanyag befolyásolhatja a teljes meta ­
bolizálható energiabevitelt (ME), megváltoztatva ezáltal a potenciálisan mért 
végpontokat, mint például a méh tömegét, különösen az éretlen módszer 
esetében (33). Ezért a vizsgálat el őtt a használni tervezett valamennyi viv ő­
anyagot le kell tesztelni viv őanyag nélküli kontrollokkal szemben. A vizs ­
gált vegyi anyagokat fel lehet oldani minimális mennyiség ű 95 %-os 
etanolban vagy más megfelel ő oldószerben, majd a vizsgálati viv őanyaggal 
felhígítani a végs ő munkakoncentrációra. Az oldószer toxikus jellemz őit 
ismerni kell, és le is kell tesztelni egy külön csak oldószert tartalmazó kontrollcsoportban. Ha a vizsgált anyag stabilnak tekinthet ő, enyhe mele ­
gítést és er őteljes mechanikai hatást is lehet használni a vizsgált vegyi 
anyag feloldása során. Meg kell határozni azt is, hogy a vizsgált vegyi anyag mennyire stabil az adott viv őanyagban. Ha a vizsgált vegyi anyag 
a vizsgálat id őtartama alatt stabil marad, akkor el őállítható a vizsgált vegyi 
anyag kiindulási aliquotja, és a meghatározott adagolási hígítások naponta 
elkészíthet ők.
 
39. Az adagolás id őzítése függ az alkalmazott modellt ől (az éretlen modellt lásd 
a 29. bekezdésben, az ovx-feln őtt modellt pedig a 30. bekezdésben). Az 
éretlen n őstény patkányoknak a vizsgált vegyi anyagot naponta kell 
adagolni három egymást követ ő napon át. Háromnapos kezelés ajánlott 
ovariektomizált n őstény patkányok esetében is, de hosszabb expozíciók is 
elfogadhatók, mert javíthatják a gyenge aktivitású vegyi anyagok kimutatá ­
sát. Ovariektomizált n őstény egerek esetében a háromnapos adagolási 
időtartamnak elegend őnek kell lennie anélkül, hogy er ős ösztrogén 
agonisták esetében jelent ős előny származna az akár hétnaposra való kiter ­
jesztésből; gyenge ösztrogének esetében azonban ez az összefüggés nem 
volt kimutatható a validálási vizsgálatban (16), így ovx-feln őtt egerekben 
az adagolást ki kell terjeszteni akár 7 egymást követ ő napra.A dózist 
minden nap hasonló id őpontban kell beadni. A dózisokat szükség esetén 
ki kell igazítani, hogy az állat testtömegére vetítve állandó dózisszintet 
lehessen fenntartani (pl. mg vizsgált vegyi anyag per testtömeg kg per 
nap). Ami a beadott anyag volumenét illeti, a testtömegre vetített variabi ­
litást az adagolt oldat koncentrációjának beállításával minimálisra kell csök ­
kenteni annak érdekében, hogy a testtömegre vetítve állandó térfogatú 
anyagot lehessen beadni az állatoknak valamennyi dózisszinten és bármely 
beadási mód esetén.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán át adagoljuk, lehet őleg egyetlen napi 
adagban kell azt gyomorszondán vagy megfelel ő intubációs kanülön át 
beadni. Az egy alkalommal beadható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretét ől függ. A állatgondozásra vonatkozó helyi iránymuta ­
tásokat be kell tartani, de a volumen nem haladhatja meg az 5 ml/testtömeg 
kg értéket, kivéve a vizes oldatok esetében, ahol 10 ml/testtömeg kg volu ­
ment lehet használni.
 
41. Amikor a vizsgált anyag beadása szubkután injekció formájában történik, 
ezt napi egyszeri adaggal kell végrehajtani. A dózisokat a dorsoscapuláris 
vagy a lumbális régióba kell beadni steril (pl. 23-as vagy 25-ös méret ű) 
tűvel és tuberkulin fecskend ővel. Az injekció beadásának helyén a borot ­
válás nem kötelez ő. Minden veszteséget, a beadás helyén történt szivárgást 
vagy nem teljes adagolást fel kell jegyezni. A patkányonként naponta injek ­
tált teljes térfogat nem haladhatja meg az 5 ml/testtömeg kg értéket, szét ­
osztva 2 injektálási helyre, kivéve a vizes oldatokat, ahol 10 ml/testtömeg kg mennyiséget lehet használni.
 
Megfigyelések  
Általános és klinikai megfigyelések  
42. Általános klinikai megfigyeléseket legalább naponta kell végezni, vagy 
gyakrabban, ha toxicitás jelei figyelhet ők meg. A megfigyeléseket lehet őleg 
minden nap ugyanabban az id őpontban vagy id őpontokban kell végezni, 
figyelembe véve az adagolást követ ően várható hatások csúcsid őszakait. 
Valamennyi állatot meg kell figyelni a mortalitás és morbiditás el őfordulá­
sára, valamint az általános klinikai tünetekre, mint például a b őr, a szőrzet, 
a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében 
megfigyelhet ő változásokra.
 
Testtömeg és táplálékfogyasztás  
43. Minden állatot naponta, 0,1 grammos pontossággal kell megmérni, közvet ­
lenül a kezelés megkezdése el őtt, azaz amikor az állatokat beosztják a 
csoportokba. Opcionális mérésként a kezelési id őszak alatt elfogyasztott 
takarmány mennyiségét is meg lehet mérni a takarmányadagolók súlyának 
ketrecenkénti megmérésével. A takarmányfogyasztási eredményeket gramm/ 
patkány/nap értékben kell megadni.  
Boncolás és a méh tömegének mérése  
44. Huszonnégy órával az utolsó kezelés után a patkányokat humánusan el kell 
pusztítani. Ideális esetben a csoportok közötti boncolási sorrend véletlen ­
szerűen kerül meghatározásra, hogy el lehessen kerülni a kezelési csoportok 
közvetlenül felfelé vagy lefelé irányuló progresszióját, ami kismértékben 
befolyásolná az adatokat. A biológiai vizsgálat célja az, hogy megmérje mind a nedves, mind a leitatott méh tömegét. A nedves tömeg magában foglalja a méh és a luminális folyadék tömegét. A leitatott tömeget azután 
kell mérni, hogy a méh luminális tartalmát kipréseltük és eltávolítottuk.
 
45. A boncolás el őtt az éretlen állatokat meg kell vizsgálni, hogy kinyílt-e a 
hüvelyük. A boncolás azzal kezd ődik, hogy a hasfalat az ágyéki 
symphysisnél kezdve megnyitjuk. Ezután a méhszarvat és a petefészkeket, 
ha vannak, elválasztjuk a dorzális hasfaltól. A húgyhólyagot és húgyveze ­
tékeket eltávolítjuk a méh és a hüvely ventrális és laterális oldaláról. A végbél és a hüvely közötti fibrózus tapadást szétválasztjuk, amíg a vagina nyílásának és a gát b őrének találkozását be nem lehet azonosítani. A hüvely 
falát a vagina és a perineum b őre közötti találkozás fölött átvágva a méhet 
és a hüvelyt leválasztjuk a testr ől, amint az a 2. ábrán látható. A méhet a
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
test faláról a méhszarvak dorzolaterális aspektusához teljes hosszuk mentén 
csatlakozó mesenterium finom átvágásával kell lefejteni. A testb ől történő 
eltávolítás után a méhet gyorsan kell kezelni a szövetek kiszáradásának elkerülése érdekében. A kiszáradás miatti tömegcsökkenés nagyobb jelen ­
tőségű a kis szövetek, például a méh esetében (23). Ha jelen vannak a 
petefészkek, el kell távolítani azokat a petevezetékr ől, elkerülve a 
méhszarvon keresztüli luminális folyadékveszteséget. Ha az állat már ovari ­
ektomizált, a csonkokat meg kell vizsgálni petefészekszövet jelenlétére. A felesleges zsír- és köt őszövetet le kell metszeni. A hüvelyt közvetlenül a 
méhnyak alatt távolítjuk el a méhr ől úgy, hogy a méhnyak a méhtesttel 
együtt maradjon, amint az a 2. ábrán látható.
 
46. Minden méhet egyedileg megjelölt és lemért tartályba kell helyezni (pl. 
Petri-csészébe vagy m űanyag mér őtálkába), folyamatosan gondoskodva 
arról, hogy a méhek ne száradjanak ki mérés el őtt (pl. sóoldattal kissé 
megnedvesített sz űrőpapírt lehet elhelyezni a tartályban). A méhet a lumi ­
nális folyadékkal együtt kell megmérni, 0,1 mg pontossággal (nedves 
méhtömeg).  
47. A méhekb ől ezután egyenként el kell távolítani a luminális folyadékot. 
Ehhez mindkét méhszarvat kiszúrjuk vagy hosszában felvágjuk. A méhet 
enyhén megnedvesített sz űrőpapírra helyezzük (pl. Whatman No. 3), majd 
egy második darab enyhén megnedvesített sz űrőpapírral enyhén 
megnyomjuk a luminális folyadék teljes eltávolítása céljából. A méhet a luminális folyadék nélkül is megmérjük, 0,1 mg pontossággal (leitatott 
méhtömeg).
 
48. A vizsgálat befejezésekor mért méhtömeget annak igazolására lehet felhasz ­
nálni, hogy az éretlen intakt patkányok megfelel ő életkorát nem haladták 
meg, ebben a tekintetben azonban a laboratóriumban használt patkány ­
törzsre vonatkozó történeti adatok a mérvadóak (az eredmények értelmezé ­
séért lásd az 56. bekezdést).  
Választható vizsgálatok  
49. A méhet a mérlegelés után 10 %-os semleges pufferelt formalinban lehet 
rögzíteni, hogy hematoxilin-eozin (HE) festés után szövettanilag is meg 
lehessen vizsgálni. A hüvelyt is ennek megfelel ően lehet megvizsgálni 
(lásd a 9. bekezdést). Ezen túlmen ően, a mennyiségi összehasonlítás érde ­
kében az endometriális epithelium morfometriai mérése is elvégezhet ő. 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
50. A vizsgálati adatoknak a következ őket kell tartalmazniuk:  
— az állatok száma a vizsgálat kezdetekor,  
— a vizsgálat során elhullott vagy humánus okokból elpusztított állatok 
száma és azonosítója, valamint az elhullás vagy humánus elpusztítás dátuma és id őpontja,
 
— a toxicitás jeleit mutató állatok száma és azonosítója, valamint a 
megfigyelt toxicitási tünetek leírása, beleértve a toxikus hatások kezde ­
tének időpontját, azok id őtartamát és súlyosságát, és  
— a léziókat mutató állatok száma és azonosítója, valamint a léziók típu ­
sának leírása.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Az állatok egyedi adatai között rögzíteni kell a testtömeget, a nedves méh 
tömegét, és a leitatott méh tömegét. Az agonisták esetében egyoldalú 
statisztikai elemzéseket kell használni annak meghatározására, hogy a vizs ­
gált vegyi anyag adagolása eredményezett-e statisztikailag szignifikáns (p < 0,05) növekedést a méh tömegében. Megfelel ő statisztikai elemzést kell 
végezni, hogy teszteljék a leitatott és nedves méhtömeg kezeléssel kapcso ­
latos változásait. Az adatokat például a kovariancia elemzésével (ANCOVA) is ki lehet értékelni, kovariánsként a boncoláskor mért testtö ­
meget használva. Variancia-stabilizáló logaritmikus transzformációt lehet 
végezni a méhadatokon az adatok elemzését megel őzően. Az egyes dózis ­
csoportok viv őanyag kontrollcsoportokkal való páros összehasonlításához és 
a konfidencia intervallumok kiszámításához a Dunnett-Hsu teszt alkalmaz ­
ható. Az esetleges kirívó esetek detektálására és a varianciák homogenitá ­
sának értékelésére a studentizált reziduális pontok használhatók. Ezeket az 
eljárásokat alkalmazták az OECD validálási program során, a Statistical Analysis System (SAS Institute, Cary, NC), 8-as verzió PROC GLM funk ­
ciójának használatával (6) (7).
 
52. A záró jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell:  
Vizsgáló intézmény:  
— a felel ős személyzet és a vizsgálattal kapcsolatos felel ősségi körök,  
— a kiindulási pozitív kontrollvizsgálat adatai és az id őszakos pozitív kont ­
rolladatok (lásd a 26. és a 27. bekezdést).  
Vizsgált vegyi anyag:  
— a vizsgált vegyi anyag jellemz ői, 
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— a hígítások készítésének módja és gyakorisága,  
— a stabilitással kapcsolatban kapott adatok,  
— az adagoló oldatok analízisei.  
Vivőanyag:  
— a vizsgálati viv őanyag jellemz ői (jellege, szállítója és tételszáma),  
— a választott viv őanyag indokolása (ha az nem víz).  
Kísérleti állatok:  
— faj és törzs, illetve megválasztásuk indokolása,  
— szállító és konkrét szállítóeszköz,  
— szállításkori életkor a születési dátummal,  
— éretlen állatok esetében annak megadása, hogy anyaállattal vagy nevelt 
állattal együtt szállították-e őket, illetve az elválasztás dátuma,  
— az állatok akklimatizációs eljárásának részletei,  
— az állatok ketrecenkénti száma,  
— az egyes állatok és a csoportok azonosításának részletei és módja.  
A vizsgálat körülményei:  
— a randomizálási folyamat részletei (az alkalmazott módszer),  
— a dózis kiválasztásának indoklása,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— a vizsgált vegyi anyag formulázásával, az elért koncentrációval, a készít ­
mény stabilitásával és homogenitásával kapcsolatos adatok,  
— a vizsgált vegyi anyag adagolásának részletei és az expozíciós útvonal 
kiválasztásának indoklása,  
— takarmány (név, típus, szállító, beltartalom, és ha ismert, a fitoöszt ­
rogének szintje),  
— vízforrás (pl. csapvíz vagy sz űrt víz) és a vízellátás módja (nagy 
tartályból csövön keresztül, palackban stb.),  
— alom (név, típus, szállító, beltartalom),  
— a ketreces tartás feltételeinek leírása, világítási intervallum, a helyiség 
hőmérséklete és páratartalma, takarítás,  
— a boncolás és a méh mérlegelésére szolgáló eljárások részletes leírása,  
— a statisztikai eljárások leírása.  
Eredmények  
Minden egyes állat esetében:  
— egyéni testtömegek naponta (a csoportokba történ ő besorolástól a 
boncolásig) (0,1 gramm pontossággal),  
— az egyes állatok életkora a vizsgált vegyi anyag adagolásának megkez ­
désekor (napokban számolva, a születés napját a 0. napnak tekintve),  
— az egyes dózisok beadásának dátuma és id őpontja,  
— a beadott adagok számított térfogat és dózisa, valamint a beadás alatti 
vagy utáni veszteségekre vonatkozó megfigyelések,  
— az állat állapotára vonatkozó napi feljegyzések, beleértve a lényeges 
tüneteket és megfigyeléseket,  
— az elhullás feltételezhet ő oka (ha vizsgálat alatt haldokló vagy halott 
állapotban találták az állatot),  
— a humánus elpusztítás dátuma és id őpontja az utolsó adagolástól számí ­
tott időintervallummal,  
— a nedves méh tömege (0,1 mg pontossággal), valamint a boncolás és 
mérésére történ ő előkészítés alatti luminális folyadékvesztéssel kapcso ­
latos megfigyelések,  
— a leitatott méh tömege (0,1 mg pontossággal).  
Minden állatcsoport esetében:  
— átlagos napi testtömeg (0,1 mg pontossággal) és szórás (a csoportokba 
sorolástól a boncolásig),  
— átlagos nedves méhtömeg és átlagos leitatott méhtömeg (0,1 mg pontos ­
sággal), szórások,  
— ha mértük, a napi takarmányfogyasztás (elfogyasztott takarmány gramm/ 
állat),  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— a kezelési csoportok nedves és leitatott méhtömegeit a viv őanyag kont ­
rollcsoportok megegyez ő adataival összehasonlító statisztikai elemzések 
eredményei,  
— a kezelési csoportok teljes testtömegét és testtömeg-gyarapodását a viv ő­
anyag kontrollcsoportok megegyez ő adataival összehasonlító statisztikai 
elemzések eredményei.  
53. A vizsgálati módszer legfontosabb tényez őinek összefoglalása  
Patkány Egér  
Állatok  
Törzs Általánosan használt laboratóriumi rágcsálótörzs Az állatok száma Dóziscsoportonként legalább hat állat A csoportok száma Legalább két tesztcsoport (útmutatásért lásd a 33. bekezdést) és 
egy negatív kontrollcsoport 
A pozitív kontrollcsoportra vonatkozó útmutatásért lásd a 26. és 
27. bekezdést  
Tartási és etetési körülmények  
T° az állatok tartására 
szolgáló helyiségben 22 °C ± 3 °C 
Relatív páratartalom 50-60 %, de nem kevesebb, mint 30 % és nem több, mint 70 % 
Napi világítási elrendezés 12 óra világos, 12 óra sötét Étrend és ivóvíz Ad libitum Tartás Egyedileg vagy legfeljebb három egyedb ől álló csoportokban 
(éretlen állatok esetében társas csoportos tartás ajánlott) 
Étrend és alom Az étrendben és az alomban alacsony fitoösztrogénszint ajánlott  
Protokoll  
Módszer Éretlen nem ovariektomizált 
módszer (el őnyben részesített 
módszer). 
Ovariektomizált feln őtt nőstény 
módszer Ovariektomizált feln őtt nőstény 
módszer 
Az éretlen állatok életkora 
az adagoláskor Legkorábban PND 18. Az 
adagolást a PND 25 el őtt be 
kell fejezni. A jelenlegi vizsgálati módszer 
szempontjából nem releváns. 
Életkor az ovariektómia 
időpontjában 6 és 8 hetes kor között. 
Az ovariektomizált állatok 
életkora az adagoláskor A petefészkek eltávolítása és 
az adagolás els ő napja között 
legalább 14 napnak kell 
eltelnie. A petefészkek eltávolítása és az 
adagolás els ő napja között 
legalább 7 napnak kell eltelnie. 
Testtömeg Az állatok testtömege lehet őleg csak minimálisan térjen el 
egymástól, és az átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal külön ­
bözhet.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Patkány Egér  
Adagolás  
Az adagolás módja Gyomorszonda vagy szubkután injekció 
Az adagolás gyakorisága Napi egyszeri dózis Adagolandó térfogat 
gyomorszondához vagy 
szubkután injekcióhoz ≤ 5 ml/testtömeg kg (vagy max. 10 ml/testtömeg kg vizes oldat 
esetében) (2 injektálási helyre szétosztva a szubkután módszer 
esetében) 
Az adagolás id őtartama Három egymást követ ő nap az 
éretlen modell esetében 
Legalább három egymást 
követő nap az OVX-modell 
esetében Hét egymást követ ő nap 
az OVX-modell esetében 
Boncolás id őpontja Körülbelül 24 órával az utolsó dózis után  
Eredmények  
Pozitív válasz Az átlagos méhtömeg statisztikailag szignifikáns növekedése 
(nedves és/vagy leitatott) 
Referencia ösztrogén 17 α-etinil-ösztradiol
 
ÚTMUTATÁS AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSÉHEZ ÉS ELFOGA ­
DÁSÁHOZ  
54. Általánosságban, az ösztrogénszer ű hatás kimutatását szolgáló tesztet pozi ­
tívnak kell tekinteni, ha a méh tömege legalább a magas dózis esetében 
statisztikailag szignifikáns növekedést mutat (p< 0,05), az oldószer kont ­
rollcsoporttal összehasonlítva. A pozitív eredményt ezenkívül alátámaszt ­
hatja, ha biológiailag elfogadható kapcsolatot lehet kimutatni a dózis és a 
válasz nagysága között, szem el őtt tartva, hogy a vizsgált vegyi anyag 
egymást átfed ő ösztrogén és antiösztrogén aktivitása hatással lehet a 
dózis-válasz görbére.  
55. Ügyelni kell arra, hogy az adatok értelmezhet ősége érdekében ne lépjük túl 
a maximális tolerált dózist. Ebb ől a szempontból a testtömeg csökkenését, a 
klinikai tüneteket és az egyéb megfigyeléseket alaposan meg kell vizsgálni.  
56. Az uterotrofikus biológiai vizsgálat adatainak elfogadhatósága szempont ­
jából fontos adat a méh tömege a viv őanyag kontrollcsoportban. A magas 
kontrollértékek megkérd őjelezhetik a biológiai vizsgálat érzékenységét és a 
nagyon gyenge ösztrogén agonisták kimutatására való képességét. A szak ­
irodalom és az uterotrofikus biológiai vizsgálat validálása során kapott adatok azt mutatják, hogy magas kontrollátlagok spontán módon is el őfor­
dulhatnak, különösen éretlen állatokban (2) (3) (6) (9). Mivel a méh tömege 
éretlen patkányok esetében sok változótól függ, mint például a törzs vagy a testtömeg, nem adható meg konkrét fels ő érték a méh tömegére. Iránymuta ­
tásként, ha a leitatott méh tömege éretlen kontrollpatkányokban 40 és 45 mg 
között van, az eredményeket gyanúsnak kell tekinteni, a 45 mg feletti 
méhtömegek pedig a vizsgálat megismétlését tehetik szükségessé. Ezt azonban eseti elbírálás alapján kell mérlegelni (3) (6) (8). Feln őtt patkányok 
vizsgálatakor a nem teljes ovariektómia után petefészekszövet maradhat 
vissza, amely endogén ösztrogént termelhet és késleltetheti a méh töme ­
gének regresszióját.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. A leitatott viv őanyagos kontrollcsoportban az éretlen n őstény patkányok 
esetében a testtömeg 0,09 %-ánál, az ovariektomizált fiatal feln őtt nősté­
nyek esetében pedig a testtömeg 0,04 %-ánál alacsonyabb méhtömeg elfo ­
gadható eredményeket ad [lásd a 31. táblázatot (2)]. Ha a kontroll méhtö ­
megek magasabbak ezeknél az értékeknél, akkor több tényez őt is alaposan 
meg kell vizsgálni, beleértve az állatok korát, az ovariektómia megfelel ő 
kivitelezését, az étrendi fitoösztrogéneket, és így tovább, és a vizsgálat negatív eredményét (ösztrogén-aktivitásra utaló jelek nincsenek) óvatosan kell kezelni.
 
58. A viv őanyag kontrollcsoportra vonatkozó történeti adatokat meg kell őrizni 
a laboratóriumban. A pozitív referencia ösztrogénre (mint például a 17a- 
etinil-ösztradiol) adott válaszokkal kapcsolatos történeti adatokat is meg kell 
őrizni a laboratóriumban. A laboratóriumok az ismert gyenge ösztrogén 
agonistákra adott válaszokat is tesztelhetik. Mindezen adatok összehasonlít ­
hatók a rendelkezésre álló adatokkal (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) annak igazo ­
lására, hogy a laboratóriumi módszerek érzékenysége megfelel ő. 
59. A leitatott méhtömegek kisebb variabilitást mutattak az OECD validálási 
vizsgálat során, mint a nedves méhtömegek (6) (7). A bármelyik mérésben adott szignifikáns válasz azonban azt jelzi, hogy a vizsgált vegyi anyag pozitív az ösztrogénaktivitás szempontjából.
 
60. Az uterotrofikus válasz azonban nem teljesen ösztrogén eredet ű, de az 
uterotrofikus biológiai vizsgálat pozitív eredményét általában úgy kell értel ­
mezni, mint az in vivo ösztrogénpotenciál bizonyítékát, és további tisztázást 
kell kezdeményezni (lásd a 9. bekezdést és az „OECD Fogalmi keret az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére” c. anyagot, 2. melléklet).
 
1. ábra  
A petefészkek m űtéti eltávolításának sematikus ábrája
  
Az eljárás a dorzolaterális hasfalat az alsó bordaszél és a csíp őlapát közötti 
felezőpontban megnyitó kb. 1 cm-es hosszanti bemetszéssel kezd ődik, az 
ágyéki izom laterális szélét ől néhány milliméterre laterálisan. A petefész ­
keket megkeressük a hasüregben. A petefészkeket kiemeljük a hasüregb ől 
egy aszeptikus területre, érlekötést helyezünk fel a petefészkek és a méh 
között a vérzés kontrollálása céljából, majd a petefészkeket a petevezetékek 
és a méhkürtök találkozásánál az érlekötés feletti átmetszéssel leválasztjuk. Miután meggy őződtünk arról, hogy nem áll fenn jelent ősebb mérték ű 
vérzés, a hasfalat varrattal, a b őrt pedig pl. kapcsokkal vagy megfelel ő 
varrattal zárjuk. Az állatoknak a felhasználás el őtt legalább 14 napot bizto ­
sítunk arra, hogy felépüljenek és a méh tömege minimálisra csökkenjen.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
2. ábra  
A méhszövetek eltávolítása és el őkészítése a tömeg mérésére.
  
Az eljárás azzal kezd ődik, hogy a hasfalat az ágyéki symphysisnél megnyitjuk. 
Ezután mindkét petefészket, ha megvannak, és a méhkürtöket leválasztjuk a dorzális hasfalról. A húgyhólyagot és húgyvezetékeket eltávolítjuk a méh és a 
hüvely ventrális és laterális oldaláról. A végbél és a hüvely közötti fibrózus 
tapadást szétválasztjuk, amíg a vagina nyílásának és a gát b őrének találkozását 
be nem lehet azonosítani. A hüvely falát a vagina és a perineum b őre közötti 
találkozás fölött átvágva a méhet és a hüvelyt leválasztjuk a testr ől, amint az 
ábrán látható. A méhet a test faláról a méhszarvak dorzolaterális aspektusához 
teljes hosszuk mentén csatlakozó mesenterium finom átvágásával kell lefejteni. A testből való eltávolítást követ ően a felesleges zsír- és köt őszövetet lemetsszük. Ha 
megvannak a petefészkek, eltávolítjuk őket a petevezetékr ől, elkerülve a 
méhszarvon keresztüli luminális folyadékveszteséget. Ha az állat már ovariekto ­
mizált, a csonkokat megvizsgáljuk petefészekszövet jelenlétére. A hüvelyt közvetlenül a méhnyak alatt távolítjuk el a méhr ől úgy, hogy a méhnyak a 
méhtesttel együtt maradjon, amint az ábrán látható. A méhet ezután meg lehet 
mérni.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Antiösztrogenitás : egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerve ­
zetében a 17ß-ösztradiol hatását gátolja.  
Vegyi anyag : egy anyag vagy keverék.  
Születés napja : a 0. posztnatális nap.  
Adagolás : általános fogalom, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát 
és időtartamát foglalja magában.  
Dózis : a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége. Az uterotrofikus biológiai 
vizsgálat esetében a dózist a vizsgált vegyi anyag tömegének és a kísérleti 
állat egységnyi testtömegének napi hányadosaként (például mg/testtömeg kilo ­
gramm/nap) fejezzük ki.  
Maximális tolerálható dózis (MTD) : a vegyi anyag azon legnagyobb mennyi ­
sége, amely a szervezetbe beadva még nem pusztítja el a vizsgált állatokat 
(jelölése: LD  0 ) (IUPAC, 1993)  
Ösztrogenitás : egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerveze ­
tében a 17ß-ösztradiolhoz hasonló hatást fejtsen ki.  
X. posztnatális nap : az élet X. napja a születés napját követ ően. 
Érzékenység : az összes olyan pozitív/aktív vegyi anyag aránya, amelyet a vizs ­
gálat helyesen sorolt be. A vizsgálati módszer pontosságának olyan mér őszáma, 
amely kategorikus eredményre vezet, és amely fontos eszköz a vizsgálati 
módszer alkalmazhatóságának megítélésében.  
Specificitás : a vizsgálat elvégzésével helyesen besorolt összes negatív/inaktív 
vizsgált vegyi anyag aránya. A vizsgálati módszer pontosságának olyan 
mérőszáma, amely kategorikus eredményre vezet, és amely fontos eszköz a vizs ­
gálati módszer alkalmazhatóságának megítélésében.  
Vizsgált vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  
Uterotrofikus : a méh szöveteire gyakorolt pozitív hatás leírására használt 
fogalom.  
Validáció : tudományos folyamat, amelynek célja egy adott vizsgálati módszer 
működési követelményeinek és korlátainak jellemzése, valamint megbízhatósá ­
gának és egy adott célhoz kapcsolódó relevanciájának igazolása.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
2. függelék
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 MEGJEGYZÉSEK A KERETRENDSZERHEZ  
1. megjegyzés:  A belépés és kilépés minden szinten lehetséges és a veszély- és 
kockázatértékelésre szolgáló információs igények jellegét ől függ  
2. megjegyzés:  Az 5-ös szinten az ökotoxikológiának olyan végpontokat is 
tartalmaznia kell, amelyek jelzik a káros hatások és a potenciális populációs károk mechanizmusait
 
3. megjegyzés:  Amikor egy multimodális modell több egyetlen végpontú vizs ­
gálatot lefed, ez a modell az egyetlen végpontú vizsgálatok 
helyébe lép  
4. megjegyzés:  Az egyes vegyi anyagokat eseti alapon kell értékelni, figye ­
lembe véve az összes rendelkezésre álló információt és szem előtt tartva a keretrendszer különböz ő szintjeinek funkcióját.
 
5. megjegyzés:  A keretrendszert jelenleg nem lehet mindenre kiterjed őnek 
tekinteni. A 3., 4. és 5. szinten olyan vizsgálatokat foglal magá ­
ban, amelyek már rendelkezésre állnak vagy amelyek validálása még folyamatban van. Ami az utóbbiakat illeti, ezeket a keret ­
rendszer ideiglenes jelleggel tartalmazza. Miután kifejlesztették 
és validálták ezeket, hivatalosan is bekerülnek a keretrendszerbe.
 
6. megjegyzés:  Az 5. szintet nem lehet úgy tekinteni, hogy csak végleges tesz ­
teket tartalmaz. Az ezen a szinten szerepel ő teszteket úgy tekin ­
tik, hogy azok hozzájáruljanak az általános veszély- és kocká ­
zatértékeléshez  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterot ­
rophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.
 
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health 
and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33.
 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785-94.  
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549.
 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.
 
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.  
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.  
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.
 
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleisch ­
mann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens. SÖFW-J. 127:10-15.  
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science, 118:650-651.  
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxi ­
col. 13:425-427.  
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Pers ­
pec.106:369-373.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the 
Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.  
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.
 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.
 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.  
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347.  
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381- 
393.
 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601.
 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320 – 333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33 – 41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288 – 305.
 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284 – 291.  
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401-416.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159-184.  
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science, 131:1807-1808.  
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalu ­
ation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro 
assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.  
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
 
(38) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU 
irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől (HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  HERSHBERGER BIOASSAY PATKÁNYOKBAN: GYORS 
SZŰRŐVIZSGÁLAT AZ (ANTI)ANDROGÉN TULAJDONSÁGOK 
KIMUTATÁSÁRA  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 441. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2009) leírt módszerrel. 1998-ban az OECD a meglév ő vizsgálati 
iránymutatások felülvizsgálatára, valamint az endokrin rendszert esetlegesen 
károsító anyagok kisz űrésére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati irány ­
mutatások kidolgozására irányuló, kiemelt fontosságú tevékenységet indított (1). A tevékenység egyik eleme a patkányok Hershberger bioassay vizs ­
gálati iránymutatásának kidolgozása volt. A gyógyszeriparban történt több 
évtizedes használat után ezt a vizsgálatot el őször egy hivatalos szakért ői 
bizottság szabványosította az androgén vegyszerek kimutatására szolgáló szűrővizsgálatként 1962-ben (2). A patkány Hershberger bioassay-t 2001 
és 2007 között egy alapos validálási programnak vetették alá, beleértve a 
háttérdokumentum elkészítését (23), a részletes módszerdokumentáció 
összeállítását (3), a boncolási iránymutatás kifejlesztését (21) és a bioassay megbízhatóságának és reprodukálhatóságának igazolása céljából végzett 
kiterjedt, laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti vizsgálatokat. 
Ezeket a validálási vizsgálatokat egy er ős referencia androgénnel (tesztosz ­
teron-propionát (TP)), két er ős szintetikus androgénnel (trenbolon-acetát és 
metil-tesztoszteron), egy er ős antiandrogén gyógyszerkészítménnyel (fluta ­
mid), a természetes androgén (dihidro-tesztoszteron, DHT) szintézisének 
egy erős inhibitorával (finaszterid), több gyenge antiandrogén peszticiddel 
(linuron, vinklozolin, procimidon, p,p'-DDE), egy er ős 5-α-reduktáz inhibi ­
torral (finaszterid) és két ismert negatív vegyi anyaggal (dinitro-fenol és 
nonilfenol) végezték el (4) (5) (6) (7) (8). Ez a vizsgálati módszer 
a bioassay-vel gy űjtött hosszú történeti tapasztalatokon, a validálási teszt ­
program során szerzett tapasztalatokon, valamint az ezek keretében kapott eredményeken alapul.
 
2. A Hershberger bioassay egy rövid távú  in vivo  szűrővizsgálat, amely a hím 
nemi szervek kiegészít ő szöveteit használja. A vizsgálat az 1930-as évekb ől 
származik és az 1940-es években módosították, hogy beleépítsék a hím nemi szervek androgénre érzékeny izmait (2) (9-15). Az 1960-as években több mint 700 lehetséges androgént értékeltek a protokoll szabványosított 
változatával (2) (14), és az 1960-as években ezt a vizsgálatot tartották az 
androgének és az antiandrogének kimutatására szolgáló standard módszernek (2) (15). A jelenlegi biológiai vizsgálat öt androgénfügg ő 
szövet tömegének változásán alapul kasztrált peripubertális hím patkányok ­
ban. A vegyi anyagoknak az androgén agonistákéval, antagonistákéval vagy 
5α-reduktáz inhibitorokéval megegyez ő biológiai aktivitás kiváltására való 
képességét értékeli. A vizsgálati módszerbe bevont öt androgénfügg ő 
célszövet: ventrális prosztata (VP), ondóhólyag (SV) (plusz a folyadékok 
és a koaguláló mirigyek), levator ani-bulbocavernosus (LABC) izom, páros 
Cowper-mirigyek (COW), glans penis (GP). A kasztrált peripubertális hím patkányokban ezek a szövetek abszolút tömegük növekedésével reagálnak az androgénekre. Amikor ugyanezeket a szöveteket er ős referencia androgén 
beadásával arra ösztönzik, hogy növeljék a tömegüket, mind az öt szövet 
abszolút tömegének csökkenésével reagál az antiandrogénekre. A Hersh ­
berger bioassay els ődleges modellje a m űtétileg ivartalanított peripubertális 
hím állat, amelyet a Hershberger validálási program 1., 2. és 3. fázisában 
validáltak.
 
3. A Hershberger bioassay az androgén agonisták, androgén antagonisták és 
5a-reduktáz inhibitorok mechanisztikus  in vivo  szűrővizsgálatának céljára 
szolgál, és alkalmazását az „OECD Fogalmi keret az endokrin rendszert károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére” c. (2. függelék) össze ­
függésében kell szemlélni. Ebben a fogalmi keretben a Hershberger 
bioassay-t a 3. szint tartalmazza olyan  in vivo  vizsgálatként, amely egyetlen
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
endokrin mechanizmusról, az (anti)adrogénszer ű hatásról szolgáltat adato ­
kat. A Hershberger bioassay-t úgy használják, hogy beépítik az endokrin 
rendszerrel potenciálisan kölcsönhatásba lép ő vegyi anyagok azonosítására 
szolgáló  in vitro  és in vivo  vizsgálatsorozatba, amely végs ő soron az emberi 
egészségre vagy a környezetre gyakorolt veszélyek és kockázatok értéke ­
lését célozza.  
4. Az ivartalanítással kapcsolatos állatjóléti megfontolások miatt az ép (nem 
ivartalanított) stimulált elválasztott hím egyedeket választott ák ki alternatív 
modellként a Hershberger bioassay-hez, hogy a kasztrálási lépés elkerülhet ő 
legyen. A stimulált elválasztott vizsgálati módszert validálták (24); a vali ­
dálási vizsgálatok során azonban a Hershberger bioassay elválasztott válto ­
zata a tesztelt dózisokban nem bizonyult alkalmasnak a gyenge antiandro ­
gének androgénfügg ő szervek tömegére gyakorolt hatásainak következetes 
érzékelésére. Ezért ezt a vizsgálati módszer nem tartalmazza. Ugyanakkor figyelembe véve, hogy alkalmazása nemcsak állatjóléti el őnyökkel jár, de az 
egyéb hatásmechanizmusokra vonatkozó információkat is nyújthat, a teszt 
rendelkezésre áll az OECD 115. iránymutatásában (25).
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
5. Az androgén agonisták és antagonisták ligandumként hatnak az androgén 
receptorokra és aktiválhatják vagy gátolhatják a receptor által kontrollált géntranszkripciót. Ezenkívül egyes vegyi anyagok néhány androgén célszö ­
vetben gátolják a tesztoszteronnak egy hatásosabb természetes androgénre, a 
dihidrotesztoszteronra való átalakítását (5a-reduktáz inhibitorok). Az ilyen vegyi anyagok egészségügyi veszélyt jelenthetnek, beleértve a reproduktív és a fejlődési hatásokat. Ezért fennáll a szabályozói igény a vegyi anyagok 
lehetséges androgén agonista, antagonista vagy 5a-reduktáz inhibitor hatá ­
sának gyors felmérésére és értékelésére. Bár informatívak, a ligandum receptorköt ődésben mért affinitása egy androgén receptorhoz vagy a riporter 
gének  in vitro  transzkripciós aktiválása nem az egyetlen meghatározói a 
lehetséges veszélynek. További tényez ők lehetnek a szervezetbe történ ő 
belépéskor bekövetkez ő metabolikus aktiválódás és deaktiválódás, a vegyi 
anyag célszövetekbe történ ő disztribúciója, illetve a szervezetb ől történő 
kiürülése. Ennek következtében szükség van arra, hogy  in vivo , azaz aktu ­
ális körülmények között és expozíció mellett sz űrjék a vegyi anyagok lehet ­
séges aktivitását. Az  in vivo  értékelés kevésbé fontos, ha a vegyi anyag 
jellemzői a felszívódás-eloszlás-metabolizmus-kiürülés (absorption-distribu ­
tion-metabolism-elimination, ADME) tekintetében ismertek. Az androgén ­
függő szövetek gyors és er őteljes növekedéssel reagálnak az androgének 
általi stimulációra, különösen a kasztrált peripubertális hím patkányokban. A rágcsálófajokat, különösen a patkányokat, széles körben használják a kockázatok jellemzését célzó toxicitási vizsgálatokra is. Ezért az vizs ­
gálatnak a kasztrált peripubertális patkányokat és az öt célszövetet felhasz ­
náló változata alkalmas az androgén agonisták, antagonisták és 5a-reduktáz inhibitorok  in vivo  szűrésére.
 
6. A vizsgálati módszer az OECD validálási vizsgálatban alkalmazott azon 
protokollokon alapul, amelyeket a laboratóriumon belüli és laboratóriumok 
közötti vizsgálatokban megbízhatónak és reprodukálhatónak találtak (4) (5) 
(6) (7) (8). Ez a vizsgálati módszer mind az androgén, mind az antiand ­
rogén eljárást bemutatja.  
7. Bár az OECD Hershberger bioassay validálási program során volt némi 
eltérés az egyes laboratóriumok között az antiandrogének kimutatására hasz ­
nált TP dózisában (0,2 vagy 0,4 mg/kg/nap, szubkután injekció), alig volt 
különbség a két protokollváltozat között a gyenge vagy er ős antiandrogén 
aktivitás detektálására vonatkozó képességben. Ugyanakkor egyértelm ű, 
hogy a TP dózisa nem lehet annyira magas, hogy blokkolja a gyenge androgén receptor (AR) antagonisták hatását, vagy olyan alacsony, hogy 
az androgén szövetek antiandrogén egyidej ű alkalmazása nélkül is csak 
kis növekedési választ mutassanak.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Az egyes androgénfügg ő szövetek által adott növekedési válasz nem 
teljesen androgén eredet ű, az androgén agonistákon kívül más vegyi 
anyagok is megváltoztathatják egyes szövetek tömegét. Ugyanakkor több szövet egyidej ű növekedési válasza inkább androgén-specifikus mechaniz ­
must támaszt alá. Például az er ős ösztrogének magas dózisai növelhetik az 
ondóhólyag tömegét, az vizsgálatba bevont többi androgénfügg ő szövet 
azonban nem ad hasonló választ. Az antiandrogén vegyi anyagok andro ­
génreceptor antagonistaként vagy 5a-reduktáz inhibitorként m űködhetnek. 
Az 5a-reduktáz inhibitoroknak változó hatásuk van, mert a hatásosabb dihi ­
drotesztoszteronra történ ő konverzió szövetenként eltér ő mértékű. Az 5α – 
reduktázt gátló antiandrogének, mint a finaszterid, kifejezettebb hatással bírnak a ventrális prosztatában, mint más szövetekben, összehasonlítva egy potens AR antagonistával, például a flutamiddal. Ezt a szöveti 
válaszban megmutatkozó különbséget arra lehet használni, hogy különb ­
séget tegyenek az AR által mediált és az 5 α – reduktáz által mediált hatás ­
módok között. Ezen túlmen ően, az androgén receptor evolúciósan rokon az 
egyéb szteroid hormonok receptoraival, és ezért néhány más hormon, ha 
magas, szuprafiziológiás dózisszinteken adagolják, képes megköt ődni és 
antagonizálni a TP növekedést serkent ő hatásait (13). Továbbá az is való ­
színűnek tűnik, hogy a fokozott szteroid metabolizmus és a szérum tesz ­
toszteronszintjének ennek következtében el őálló csökkenése csökkentheti az 
androgénfügg ő szövetek növekedését. Ezért a Hershberger bioassay pozitív 
eredményét az adatok bizonyító erejének mérlegelésével kell értékelni, bele ­
értve az  in vitro  vizsgálatokat, mint például az AR és az ösztrogén 
receptor (ER) köt ődési vizsgálatokat és a megfelel ő transzkripciós aktiválási 
vizsgálatokat, vagy más  in vivo  vizsgálatokat, amelyek hasonló androgén 
célszöveteket vizsgálnak, mint például a hím pubertális vizsgálat, a 15 napos ép feln őtt hím vizsgálat, vagy a 28 vagy 90 napos ismételt adagolású 
vizsgálatok.
 
9. A tapasztalat azt mutatja, hogy a xenobiotikum androgének ritkábbak, mint 
a xenobiotikum antiandrogének. A várakozások szerint ezért a Hershberger 
bioassay-t a leggyakrabban antiandrogének sz űrésére fogják használni. 
Azonban az androgének tesztelésére szolgáló eljárás is ajánlható szteroid vagy szteroidszer ű vegyi anyagok, illetve olyan vegyi anyagok esetében, 
amelyeknél a lehetséges androgén hatásra vonatkozó jelzés a fogalmi keret 
1. vagy 2. szintjében foglalt módszerekb ől származik (2. számú melléklet). 
Hasonlóképpen, ha esetleg az 5. szint ű vizsgálatokban (anti)androgén profi ­
lokkal összefügg ő káros hatásokat lehet megfigyelni, akkor fel kell mérni, 
hogy a vegyi anyag endokrin hatásmechanizmus alapján m űködik-e.
 
10. Minden állatkísérleteken alapuló eljárást az állatgondozásra vonatkozó helyi 
szabványoknak megfelel ően kell végrehajtani; az alábbiakban foglalt, 
gondozásra és kezelésre vonatkozó leírások minimális teljesítményszabvá ­
nyok, amelyeket a helyi szabályozások – mint például a tudományos 
célokra felhasznált állatok védelmér ől szóló 2010/63/EU európai parlamenti 
és tanácsi irányelv (2010. szeptember 22.) (26) – felülírnak (38). Az állat ­
okkal való humánus bánásmódról szóló további iránymutatás a megfelel ő 
OECD-kiadványban található (17).  
11. Mint minden, kísérleti állatokat felhasználó biológiai vizsgálatnál, itt is 
alaposan meg kell fontolni, hogy el kell-e egyáltalán végezni ezt a vizs ­
gálatot. Alapvet ően két okból lehet egy ilyen döntést hozni:  
— magas expozíciós potenciál (a fogalmi keret 1-es szintje) vagy az  in 
vitro  vizsgálatokban megfigyelt (anti)androgénszer ű hatásra utaló jelek 
(2. szint) esetén annak alátámasztását célzó vizsgálatok, hogy az ilyen hatások  in vivo  is előfordulhatnak-e,
 
— a 4. vagy 5. szint ű in vivo  vizsgálatokban az (anti)androgenitással össz ­
hangban álló hatások esetén a konkrét hatásmechanizmust alátámasztó 
vizsgálatok, pl. annak meghatározására, hogy a hatások (anti)androgén 
mechanizmus miatt léptek-e fel.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Az ebben a vizsgálati módszerben használt fogalmak meghatározását az 1. 
függelék tartalmazza.  
A VIZSGÁLAT ELVE  
13. A Hershberger bioassay érzékenységéhez minimális mennyiség ű endogén 
androgént termel ő hím állatokra van szükség. Ez ivartalanított hím állatok 
használatával érhet ő el, feltéve, hogy a kasztrálás után elegend ő időt bizto­
sítottak a célszövetek minimumra való visszafejl ődéséhez és az egységes 
kiindulási tömeg eléréséhez. Így a potenciális androgén aktivitás sz űrésekor 
a keringő endogén androgének szintje alacsony, a hipotalamusz-agyalapi 
mirigy-gonád tengely nem képes a visszacsatolási mechanizmusok révén a 
kompenzációra, a szövetek reagálóképessége maximális, a szövet kiindulási tömegének variabilitása pedig minimális. A potenciális antiandrogén akti ­
vitás szűrésekor következetesebb szöveti tömeggyarapodás érhet ő el, ha a 
szöveteket referencia androgénnel stimuláljuk. Ennek eredményeként a 
Hershberger bioassay-hez csak 6 állatra van szükség dóziscsoportonként, míg az ép pubertáskorú vagy feln őtt hím egyedekkel végzett más vizsgála ­
tokban dóziscsoportonként 15 hím állat vizsgálata javasolt.
 
14. A peripubertális hím patkányok ivartalanítását a megfelel ő módon kell 
elvégezni az elfogadott érzéstelenítési és aszeptikus technikák alkalmazásá ­
val. A m űtét utáni els ő néhány napban fájdalomcsillapítót kell adni m űtét 
utáni kellemetlen érzés megszüntetéséhez. A kasztráció annak révén növeli 
a vizsgálat pontosságát a gyenge androgének és az antiandrogének felisme ­
rése terén, hogy megszünteti az intakt állatokban jelen lév ő kompenzációs 
endokrin feed-back mechanizmusokat, amelyek csökkenthetik a beadott 
androgének és antiandrogének hatását, valamint hogy kizárja a szérum 
tesztoszteron-szintjének egyedek közötti nagymérték ű variabilitását. Ezért 
a kasztráció csökkenti az ezen endokrin aktivitások sz űréséhez szükséges 
állatok számát.  
15. Amikor a sz űrés potenciális androgén aktivitás detektálása céljából történik, 
a vizsgált vegyi anyagot tíz egymást követ ő napon át naponta adjuk be az 
állatoknak gyomorszondán át orálisan vagy szubkután (sc.) injekció formá ­
jában. A vizsgált vegyi anyagokat a kísérleti állatok legalább két kezelési 
csoportjának adjuk be, csoportonként egy dózisszintet használva. Az állat ­
okat körülbelül 24 órával az utolsó dózis után felboncoljuk. Két vagy több célszerv tömegének a viv őanyag kontrollcsoporthoz viszonyított statisztika ­
ilag szignifikáns növekedése a vizsgált vegyi anyag csoportokban azt jelzi, 
hogy a vizsgált vegyi anyag pozitív a potenciális androgén aktivitás szem ­
pontjából (lásd a 60. bekezdést). Az olyan androgének, mint a trenbolon, amelyeket az 5 α – reduktáz nem alakít át, kifejezettebb hatást gyakorolnak 
az LABC-re és a GP-re, mint a TP, de minden szövetnek nagyobb növe ­
kedést kell mutatnia.
 
16. Amikor a sz űrés potenciális antiandrogén aktivitás detektálása céljából törté ­
nik, a vizsgált vegyi anyagot tíz egymást követ ő napon át naponta adjuk be 
az állatoknak gyomorszondán át orálisan vagy szubkután injekció formájá ­
ban, és az állatok naponta sc injekció formájában TP dózisokat is kapnak (0,2 vagy 0,4 mg/kg/nap). A validálási programban azt állapították meg, 
hogy 0,2 vagy 0,4 mg/kg/nap TP-dózist is lehet használni, mivel mindkét 
dózis alkalmas volt az antiandrogének kimutatására, ezért az egyik dózist ki kell választani a vizsgálatban történ ő használat céljára. A vizsgált vegyi 
anyag fokozatos dózisait adjuk be a kísérleti állatok legalább három kezelési 
csoportjának, csoportonként egy dózisszintet használva. Az állatokat körül ­
belül 24 órával az utolsó dózis után felboncoljuk. Két vagy több célszerv tömegének statisztikailag szignifikáns csökkenése a vizsgált vegyi anyag plusz TP csoportban csak a TP kontrollcsoporttal összehasonlítva azt jelzi, 
hogy a vizsgált vegyi anyag pozitív potenciális antiandrogén aktivitásra 
(lásd a 61. bekezdést).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
A MÓDSZER ISMERTETÉSE  
A faj és a törzs kiválasztása  
17. A patkányt már az 1930-as évek óta rutinszer űen használják a Hershberger 
bioassay-ben. Bár biológiailag valószín ű, hogy a patkány és az egér hasonló 
válaszokat adna, a patkánymodellel szerzett 70 éves tapasztalat alapján a patkány a kiválasztott faj a Hershberger bioassay-hez. Ezenkívül, mivel a Hershberger bioassay eredménye egy hosszú távú multigenerációs vizsgálat 
előzménye lehet, mindkét kísérlethez csak ugyanabból a fajból és törzsb ől 
származó, azonos eredet ű állatokat használhatunk.
 
18. Ez a protokoll lehet ővé teszi a laboratóriumoknak, hogy kiválasszák a vizs ­
gálati eljárásban alkalmazandó patkánytörzset, amelynek általánosságban ugyanannak kell lennie, mint a részt vev ő laboratórium által történetileg 
használt törzs. Az általánosan használt laboratóriumi patkánytörzsek is hasz ­
nálhatók; 42 napos kornál lényegesen kés őbb érő törzseket azonban nem 
szabad használni, mivel ezeknek a hímeknek a 42 napos korban történ ő 
kasztrációja megel őzheti a glans penis tömegének mérését, amelyet csak 
akkor lehet elvégezni, miután a fityma elkülönült a pénisztestt ől. Így a 
Fisher 344 patkánytól származó törzseket nem szabad használni, ritka esetektől eltekintve. A Fisher 344 patkány szexuális fejl ődésének más, álta ­
lánosabban használt törzsekkel, például a Sprague-Dawley- vagy a Wistar- 
törzzsel (16) összehasonlítva eltér ő az időzítése. Ha ilyen törzset kívánnak 
használni, akkor a laboratóriumnak egy kicsit id ősebb korban kell ivartala ­
nítania az állatokat, és demonstrálnia kell az alkalmazott törzs érzékenységét 
is. A patkánytörzs kiválasztását a laboratóriumnak egyértelm űen meg kell 
indokolnia. Ha a sz űrővizsgálat egy ismételt adagolású orális vizsgálat, 
reproduktív és fejl ődési vizsgálat, vagy hosszú távú vizsgálat bevezet ője 
lehet, akkor lehet őleg minden vizsgálathoz ugyanabból a törzsb ől való, 
azonos eredet ű állatokat kell használni.
 
Tartási és etetési körülmények  
19. Minden eljárásnak meg kell felelnie a laboratóriumi állatgondozásra vonat ­
kozó valamennyi helyi szabványnak. Ezek a gondozásra és kezelésre vonat ­
kozó leírások minimális teljesítményszabványok, amelyeket a szigorúbb helyi szabályozások – mint például a tudományos célokra felhasznált állatok 
védelméről szóló 2010/63/EU európai parlamenti és tanácsi irányelv (2010. 
szeptember 22.) (26) – felülírnak (38). A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmérsékletének 22
 o C-nak (kb. ±3  o C eltérési tartománnyal) kell 
lennie. A helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, és 
a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg ne haladja meg a 70 %-ot. A 
relatív páratartalom célértékének 50–60 % között kell lennie. A világítás legyen mesterséges. Naponta 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást.
 
20. Az állatok fiatal kora miatt és mert a patkányok társas lények, a csoportos 
tartás előnyösebb az elszigeteltséggel szemben. Ketrecenként két-három 
állat elhelyezése révén elkerülhet ő a zsúfoltság és a hozzá kapcsolódó 
stressz, amely zavarhatja a járulékos ivarszervi szövetek fejl ődésének 
hormonális szabályozását. A szennyez ő anyagok eltávolítása érdekében a 
ketreceket alaposan meg kell tisztítani és úgy kell elrendezni, hogy mini ­
málisra lehessen csökkenteni a ketrec elhelyezésének lehetséges hatásait. Megfelelő méretű (~2 000 négyzetcentiméter) ketrecek alkalmazásával 
megakadályozható a túlzsúfoltság.
 
21. Valamennyi állatot humánus módszerrel egyedileg kell azonosítani (pl. 
füljelölés vagy krotália). Az azonosításra használt módszert fel kell 
jegyezni.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. A laboratóriumi takarmányt és az ivóvizet korlátozás nélkül kell biztosítani. 
A Hershberger bioassay-t végz ő laboratóriumoknak azt a laboratóriumi 
takarmányt kell használniuk, amelyet a vegyi anyagok tesztelése során álta ­
lánosan használnak. A bioassay validálási vizsgálataiban az étrendre vissza ­
vezethető hatás vagy variabilitás nem volt megfigyelhet ő. Az alkalmazott 
étrendet fel kell jegyezni és a laboratóriumi takarmány mintáját az esetleges 
későbbi analízishez meg kell őrizni.  
Alkalmassági kritériumok az androgénfügg ő szervek tömegének méré ­
séhez  
23. A validációs vizsgálat során nem találtak bizonyítékot arra, hogy a test ­
tömeg csökkenése befolyásolta volna a célszövetek tömegének növekedését 
vagy csökkenését (amelyet súlyozni kellene a vizsgálatban).  
24. A validálási programban sikeresen alkalmazott patkánytörzseknél az andro ­
génfüggő szervek tömege nagyobb a nehezebb patkánytörzsekben, mint a 
könnyebb törzsekben. Ezért a Hershberger bioassay teljesítménykritériumai 
nem tartalmazzák az abszolút várt szervi tömegeket a pozitív és negatív kontrollok esetében.
 
25. Mivel egy szövet relatív szórása inverz kapcsolatban áll a statisztikai er ővel, 
a Hershberger bioassay teljesítménykritériumai az egyes szövetek maximális relatív szórásán alapulnak (1. táblázat). A relatív szórások az OECD vali ­
dálási vizsgálatokból származnak. Negatív kimenetelek esetében a laborató ­
riumnak meg kell vizsgálnia a kontrollcsoport és a nagy dózisú kezelési 
csoport relatív szórását annak meghatározására, hogy a maximális relatív szórásra vonatkozó követelményt túllépték-e.
 
26. A tanulmányt meg kell ismételni, ha: 1) a kontrollcsoportban és a nagy 
dózisú kezelési csoportokban a tíz lehetséges egyedi relatív szórás közül 
három vagy több meghaladja az agonista és antagonista vizsgálatokhoz az 1. táblázatban megadott maximumokat, és 2) legalább két célszövet margi ­
nálisan inszignifikáns volt, azaz a r értékek 0,05 és 0,10 között voltak.
 
1. táblázat  
Az OECD validálási vizsgálatokban a kasztrációs modell járulékos 
ivarszervi célszövetei részére meghatározott legnagyobb megengedett 
relatív szórások  ( 1 ) 
Szövet Antiandrogén hatás Androgén hatás  
Ondóhólyagok 40 % 40 % 
Ventrális prosztata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowper-mirigyek 35 % 55 % 
Glans penis 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Adott szövet relatív szórásának küszöbértékét a validálási program adott (agonista vagy 
antagonista) modellt használó összes kísérletének átlagértékeihez kapcsolódó – a legki ­
sebbtől a legnagyobbig sorba rendezett – relatív szórások grafikonjából határozták meg. 
A relatív szórás küszöbértéket annál a pontnál olvasták le, ahol a sorozat következ ő 
legmagasabb relatív szórásához szükséges emelkedés drámaian nagyobb volt, mint az 
előző néhány relatív szórásnál – a „töréspont”. Meg kell jegyezni, hogy bár ez az 
elemzés viszonylag megbízható „töréspontokat” azonosított a vizsgálat antagonista 
modelljéhez, az agonista vizsgálat során nyert relatív szórások görbéi sokkal egyenlete ­
sebb növekedést mutattak, ami a relatív szórás küszöbértékének e módszerrel történ ő 
azonosítását némileg önkényessé teszi.
 ELJÁRÁS  
Jogszabályi megfelel őség és a laboratórium vizsgálata  
27. Az uterotrofikus vizsgálattal ellentétben (e melléklet B.54. fejezete) a 
Hershberger vizsgálat esetében a laboratórium jártasságát a vizsgálat 
megkezdése el őtt nem kell igazolni, mert a vizsgálat szerves részeként 
egyidejűleg pozitív (tesztoszteron-propionát és flutamid) és negatív kontr ­
ollok is futnak.  
Az állatok száma és állapota  
28. Minden kezelési és kontrollcsoportnak minimum 6 állatot kell tartalmaznia. 
Ez az androgén és az antiandrogén protokollokra is vonatkozik.  
Ivartalanítás  
29. Az állatok érkezésekor el őször több napos akklimatizációs id őszakot kell 
biztosítani, hogy az állatok egészségesek és életer ősek legyenek. Mivel a 42 
napos kor vagy a 42. posztnatális nap (PND) el őtt kasztrált állatoknál még 
nem szükségszer űen mutatkozik a fitymaelválás, az állatokat a 42. poszt ­
natális napon vagy azután kell ivartalanítani, nem el őtte. Az állatokat alta ­
tásban ivartalanítjuk oly módon, hogy egy metszést ejtünk a herezacskón, majd mindkét herét és mellékherét eltávolítjuk az erek és a spermavezetékek 
lekötésével. Miután meggy őződtünk arról, hogy vérzés nem lépett fel, a 
herezacskót varrattal vagy kapcsokkal kell zárni. A m űtét utáni els ő néhány 
napban az állatokat fájdalomcsillapítóval kell kezelni a m űtét utáni kelle ­
metlen érzést enyhítése érdekében. Ha a szállítótól ivartalanított állatokat 
vásároltunk, az állatok életkorát és a szexuális érettség fázisát a szállítónak 
kell garantálnia.
 
Ivartalanítás utáni akklimatizáció  
30. Az állatoknak a kasztrálás után legalább 7 napig folytatniuk kell a labora ­
tóriumi körülményekhez való akklimatizációt, hogy lehet ővé váljon a 
célszövetek tömegének regressziója. Az állatokat naponta meg kell vizsgálni és a betegség vagy fizikai rendellenesség tüneteit mutató állatokat el kell távolítani. Így a kezelést az adagolás (vizsgált anyag) megkezdésével már 
PND 49 napos korban el lehet kezdeni, de nem kés őbb, mint PND 60. A 
boncoláskori életkor nem lehet nagyobb, mint PND 70. Ez a rugalmasság lehetővé teszi a laboratórium számára, hogy hatékony menetrendet alakítson 
ki a kísérleti feladatok elvégzéséhez.
 
A testtömeg és a csoportokba randomizálás  
31. Az egyedi testtömegek közötti különbségek az állatcsoportokon belül és a 
csoportok között is eltéréseket eredményeznek a szövetek tömegében. A szöveti tömeg variabilitásának növekedése megnövekedett relatív szórást 
eredményez és csökkenti a vizsgálat statisztikai erejét (ezt nevezik néha 
vizsgálati érzékenységnek). Ezért a testtömeg eltéréseit kísérletileg és statisztikailag is kontrollálni kell.
 
32. A kísérleti szabályozás kis testtömeg-eltérések el őállítását jelenti a vizsgálati 
csoporton belül és a csoportok között. El őször is, a szokatlanul kicsi vagy 
nagy állatokat kerülni kell, az ilyenek nem kerülhetnek be a vizsgálati állományba. A vizsgálat megkezdésekor a felhasznált állatok tömegének 
variabilitása nem haladhatja meg az átlagos testtömeg ± 20 %-át (pl. 
175 g ± 35 g peripubertális kasztrált patkányok esetében). Másodszor, az állatokat a randomizált súlyeloszlás módszerével kell besorolni a csopor ­
tokba (mind a kontroll-, mind a kezelési csoportokba), hogy az egyes 
csoportok átlagos testtömege statisztikailag ne különbözzön a többi csopor ­
tétól. Az alkalmazott blokkrandomizálási eljárást fel kell jegyezni.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Mivel a toxicitás csökkentheti a kezelési csoportok testtömegét a kontroll ­
csoporthoz viszonyítva, a vizsgált vegyi anyag adagolásának els ő napján 
mért testtömeget lehet statisztikai kovariánsként használni a boncoláskor mért testtömeg helyett.
 
Adagolás  
34. Annak megállapítása érdekében, hogy a vizsgált vegyi anyag rendelkezik-e  
in vivo  androgénszer ű hatással, két dóziscsoport plusz egy pozitív és egy 
vivőanyag (negatív) kontrollcsoport (lásd a 43. bekezdést) általában 
elegendő, ezért állatjólléti okok miatt ezt az elrendezést el őnyben részesítik. 
Amennyiben a cél a dózis-válasz görbe felállítása vagy az alacsonyabb dózisokra történ ő extrapoláció, akkor legalább 3 dóziscsoportra van szük ­
ség. Ha az androgénaktivitás azonosításán túlmen ő információra van 
szükség (például a hatóérték becslésére), eltér ő adagolási rend alkalmazását 
kell megfontolni. Antiandrogének tesztelése esetén a vizsgált vegyi anyagot referencia androgén agonistával együtt adjuk be. Legalább 3, a vizsgált vegyi anyag különböz ő dózisaival kezelt vizsgálati csoportot, valamint 
egy pozitív és egy negatív kontrollcsoportot (lásd a 44. bekezdést) kell 
használni. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától eltekintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lév őket. Ha a vizsgált vegyi anyag beadásához viv őanyagot 
alkalmazunk, a kontrollcsoportnak a viv őanyagból a kezelési csoportokban 
használt legnagyobb mennyiséget kell kapnia.
 
35. Valamennyi adagolási szint ajánlásánál és kiválasztásánál figyelembe kell 
venni a vizsgált, vagy az azzal rokon vegyi anyagok toxicitására és (toxi ­
ko)kinetikájára vonatkozóan rendelkezésre álló adatokat. A legnagyobb adag esetében el őször az LD50 és/vagy az akut toxicitási információkat 
kell figyelembe venni az állatok elhullásának, illetve súlyos szenvedésének 
vagy szorongásának elkerülése érdekében (17) (18) (19) (20), másrészt figyelembe kell venni a szubkrónikus és krónikus vizsgálatokban használt dózisokra vonatkozó információkat. Általánosságban, a legmagasabb dózis 
nem idézheti el ő az állatok testtömegének a kontroll testtömeg 10 %-ánál 
nagyobb mérték ű csökkentését. A legmagasabb dózis vagy 1) az a legma ­
gasabb dózis, amely biztosítja az állatok túlélését és amely 10 egymást követő napon maximum 1 000 mg/kg/nap dózisban beadva nem okoz 
jelentős toxicitást vagy szorongást az állatoknak (lásd a 36. bekezdést) 
vagy – ha ez az alacsonyabb – 2) az (anti)androgén hatást kiváltó dózis. Szűrésként a dózisok közötti nagy intervallumok is elfogadhatók, pl. fél log 
egység, amely 3,2 dózisprogressziónak felel meg, vagy akár egy log egység 
is. Ha nem állnak rendelkezésre megfelel ő adatok, akkor dózisbehatároló- 
vizsgálatot (lásd a 37. bekezdést) lehet végezni az alkalmazandó dózisok meghatározása céljából.
 
Határdózis  
36. Ha az 1 000 mg/testtömeg kg/nap határdózis és egy alacsonyabb dózis az 
ebben a vizsgálatban leírt eljárások alkalmazása mellett nem idéz el ő statisz­
tikailag szignifikáns változást a reproduktív szervek tömegében, akkor a 
további dózisszintek feleslegesnek tekinthet ők. A határdózis alkalmazandó, 
kivéve, ha az emberi expozícióra vonatkozó adatok ennél nagyobb adago ­
lási szint használatát indokolják.  
A dózisbehatárolás szempontjai  
37. Ha szükséges, néhány állattal el őzetes dózisbehatároló vizsgálatot lehet 
végezni a megfelel ő dóziscsoportok kiválasztásához [az akut toxicitási vizs ­
gálat módszereit használva (e melléklet B.1.a. és B.1.b. fejezete (27), OECD 
TG 425 (19))]. A Hershberger bioassay esetében a cél olyan dózisok kivá ­
lasztása, amelyek biztosítják az állatok túlélését és amelyek nem okoznak jelentős toxicitást vagy szorongást az állatoknak a vegyi anyag tíz egymást 
követő napon legfeljebb 1000 mg/kg/nap határdózisban történ ő adagolása 
alatt, a 35. és 36. bekezdésben megadottak szerint. Ebben a tekintetben az
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
OECD iránymutatását (25) lehet használni, amely meghatározza az állat ­
okban jelentkez ő toxicitásra vagy szorongásra utaló klinikai tüneteket. Ha a 
tíznapos adagolással járó dózisbehatároló vizsgálatban megvalósítható, a célszöveteket körülbelül 24 órával az utolsó dózis adagolása után lehet kimetszeni és megmérni. Ezeket az adatokat azután arra lehet használni, 
hogy segítsék a dózisok kiválasztását a f ő vizsgálatban.
 
Referencia vegyi anyagok és viv őanyag  
38. A referencia androgén agonista a tesztoszteron-propionát (TP) kell legyen, 
CAS-szám: 57-82-5. A referencia TP-dózis 0,2 mg/testtömeg kg/nap vagy 0,4 mg/testtömeg kg/nap lehet. A referencia androgén antagonista a 
flutamid (FT) kell legyen, CAS-szám: 1311-84-7. A referencia FT-adag 3 
mg/testtömeg kg/nap kell legyen és az FT-t a referencia TP adagolásával együtt kell alkalmazni.
 
39. Ahol csak lehetséges, el őször valamilyen vizes oldat/szuszpenzió haszná ­
latát kell megfontolni. De mivel számos androgén ligandum vagy azok 
metabolikus prekurzorai hidrofóbok, a leggyakoribb megközelítés az, 
hogy olajos oldatot/szuszpenziót használnak (pl. kukorica-, mogyoró-, szezám- vagy olívaolaj). A vizsgált vegyi anyagokat fel lehet oldani mini ­
mális mennyiség ű 95 %-os etanolban vagy más megfelel ő oldószerben, 
majd a vizsgálati viv őanyaggal felhígítani a végs ő munkakoncentrációra. 
Az oldószer toxikus jellemz őit ismerni kell, és le is kell tesztelni egy 
külön csak oldószert tartalmazó kontrollcsoportban. Ha a vizsgált anyag 
stabilnak tekinthet ő, enyhe melegítést és er őteljes mechanikai hatást is 
lehet használni a vizsgált vegyi anyag feloldása során. Meg kell határozni azt is, hogy a vizsgált vegyi anyag mennyire stabil az adott viv őanyagban. 
Ha a vizsgált vegyi anyag stabil marad a vizsgálat id őtartama alatt, akkor 
elő lehet állítani a vizsgált vegyi anyag kiindulási aliquotját, és a meghatá ­
rozott adagolási hígításokat naponta el lehet készíteni, gondosan ügyelve arra, hogy elkerüljük a minták szennyez ődését és állagromlását.
 
A dózisok beadása  
40. A TP-t szubkután injekció formájában, az FT-t gyomorszondán át kell 
beadni.  
41. A vizsgált vegyi anyagot orális szondán keresztül vagy szubkután injekció 
formájában adagoljuk. Az állatjóléti szempontokat és a vizsgálati vegyi anyag fizikai/kémiai tulajdonságait figyelembe kell venni a beadás módjának kiválasztásakor. Ezenkívül a toxikológiai szempontokat, mint 
például a vegyi anyaggal való emberi expozíciós úttal kapcsolatos relevan ­
ciát (pl. gyomorszonda a lenyelés modellezésére, b őr alá adott injekció a 
belégzés vagy b őrön át történ ő adszorpció modellezésére) és az anyagcse ­
rével és a kinetikával kapcsolatban rendelkezésre álló toxikológiai informá ­
ciókat és adatokat (pl. first pass metabolizmus elkerülése, jobb hatásfok adott útvonalon keresztül) egyaránt figyelembe kell venni, miel őtt kiterjedt, 
hosszú távú tesztelést kezdeményeznénk, ha az injekciós adagolás pozitív 
eredményt adott.
 
42. Az állatokat azonos módon és tíz egymást követ ő napon át körülbelül 24 
órás időközönként kell kezelni. Az adagolási szintet naponta be kell állítani 
az egyidőben történ ő napi testtömeg-mérések alapján. Az adag térfogatát és 
az adagolás id őpontját az expozíció minden napján fel kell jegyezni. 
Ügyelni kell arra, hogy az adatok értelmezhet ősége érdekében ne lépjük 
túl a 35. bekezdésben megadott maximális dózist. A testtömeg csökkenését, a klinikai tüneteket és az egyéb megfigyeléseket alaposan meg kell vizs ­
gálni ebb ől a szempontból. Az orális gyomorszondázáshoz gyomorszondát 
vagy megfelel ő intubációs kanült kell használni. Az egy alkalommal bead ­
ható folyadék maximális mennyisége a kísérleti állat méretét ől függ. A
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
állatgondozásra vonatkozó helyi iránymutatásokat be kell tartani, de a 
volumen nem haladhatja meg az 5 ml/testtömeg kg értéket, kivéve a 
vizes oldatok esetében, ahol 10 ml/testtömeg kg volument lehet használni. A szubkután injekció esetében a dózisokat a dorsoscapuláris és/vagy a lumbális régióba kell beadni steril (pl. 23-as vagy 25-ös méret ű) tűvel és 
tuberkulin fecskend ővel. Az injekció beadásának helyén a borotválás nem 
kötelező. Minden veszteséget, a beadás helyén történt szivárgást vagy nem 
teljes adagolást fel kell jegyezni. A patkányonként naponta injektált anyag teljes térfogata nem haladhatja meg a 0,5 ml/testtömeg kg mennyiséget.
 
Az androgén agonistákra vonatkozó különleges eljárások  
43. Az androgén agonisták tesztelése esetében a viv őanyag a negatív kontroll, 
a TP-vel kezelt csoport pedig a pozitív kontroll. Az androgén agonistáknak 
megfelelő biológiai aktivitást egy vegyi anyag beadásával teszteljük, 
amelyet 10 egymást követ ő napon át kell adni a kezelési csoportoknak a 
kiválasztott dózisokban. A vizsgált vegyi anyag csoportokban lév ő állatok 
öt járulékos ivarszervi szövetének tömegét összehasonlítjuk a viv őanyag 
csoportéval a statisztikailag szignifikáns tömegnövekedés kimutatása céljá ­
ból. 
Az androgén antagonistákra és 5 α-reduktáz inhibitorokra vonatkozó 
különleges eljárások  
44. Az androgén antagonisták és az 5 α-reduktáz inhibitorok tesztelése esetében 
a TP-kezelt csoport a negatív kontroll, az FT és TP referencia dózisaival 
együttesen kezelt csoport pedig a pozitív kontroll. Az androgén antagonist ­
áknak és 5 α-reduktáz inhibitoroknak megfelel ő biológiai aktivitást a TP 
referencia dózisának és a vizsgált anyagnak 10 egymást követ ő napon át 
történő beadásával tesztelik. A TP plusz vizsgált vegyi anyag csoportokban 
lévő állatok öt járulékos ivarszervi szövetének tömegét összehasonlítják a 
csak referencia TP-t kapó csoportéval a statisztikailag szignifikáns tömeg ­
csökkenés kimutatása céljából.  
MEGFIGYELÉSEK  
Klinikai megfigyelések  
45. Általános klinikai megfigyeléseket legalább naponta kell végezni, vagy 
gyakrabban, ha toxicitás jelei figyelhet ők meg. A megfigyeléseket lehet őleg 
minden nap ugyanabban az id őpontban vagy id őpontokban kell végezni, 
figyelembe véve az adagolást követ ően várható hatások csúcsid őszakait. 
Valamennyi állatot meg kell figyelni a mortalitás és morbiditás el őfordulá­
sára, valamint az általános klinikai tünetekre, mint például a b őr, a szőrzet, 
a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében 
megfigyelhet ő változásokra.
 
46. Az elhullott állatokat adatelemzés nélkül kell eltávolítani és ártalmatlanítani. 
Az állatok boncolás el őtti bármilyen mortalitását fel kell jegyezni, együtt a 
mortalitás nyilvánvaló okával. A moribund állatokat humánus módon el kell 
pusztítani. A moribund állapotú, majd elpusztított állatokat bele kell venni a 
vizsgálati jegyz őkönyvbe a morbiditás nyilvánvaló okával együtt.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Testtömeg és takarmányfogyasztás  
47. Minden állatot naponta meg kell mérni 0,1 gramm pontossággal, közvet ­
lenül a kezelés megkezdése el őtt, azaz amikor az állatokat beosztják a 
csoportokba. Opcionális mérésként a kezelési id őszak alatt elfogyasztott 
takarmány mennyiségét is meg lehet mérni a takarmányadagolók súlyának ketrecenkénti megmérésével. A takarmányfogyasztási eredményeket gramm/ 
patkány/nap értékben kell megadni.
 
A szövetek és szervek boncolása és tömegének mérése  
48. Körülbelül 24 órával a vizsgált anyag utolsó beadását követ ően a patká ­
nyokat el kell altatni és ki kell véreztetni a vizsgálatot végz ő laboratórium 
normál eljárása szerint, majd boncolást kell végezni. A humánus elpusztí ­
tásra használt módszert fel kell jegyezni a laboratóriumi jegyz őkönyvben.  
49. Ideális esetben a csoportok közötti boncolási sorrend véletlenszer űen kerül 
meghatározásra, hogy el lehessen kerülni a kezelési csoportok közvetlenül felfelé vagy lefelé irányuló progresszióját, ami befolyásolhatná az adatokat. 
A boncoláskor tett megállapításokat, azaz a kóros elváltozásokat/látható 
léziókat fel kell jegyezni és jegyz őkönyvezni kell.
 
50. Az öt androgénfügg ő szövet (VP, SV, LABC, COW, GP) tömegét meg kell 
mérni. Ezeket a szövetmintákat ki kell metszeni, gondosan el kell távolítani róluk a felesleges tapadó szöveteket és a zsírt, majd meg kell határozni azok friss (fixálatlan) tömegét. Minden szövetet különös gondossággal kell 
kezelni, hogy elkerüljük a folyadékveszteséget és a kiszáradást, amelyek 
jelentős hibákat és variabilitást okozhatnak a feljegyzett tömegek csökken ­
tése révén. A szövetek közül több nagyon kicsi vagy nehezen boncolható lehet, és ez variabilitást eredményezhet. Ezért fontos, hogy a járulékos 
ivarszervi szövetek boncolását végz ő személyek ismerjék ezeknek a szöve ­
teknek a standard boncolási eljárásait. A boncolás szabványos m űveleti 
eljárásainak (standard operating procedure, SOP) kézikönyve beszerezhet ő 
az OECD-t ől (21). A SOP útmutató szerinti körültekint ő képzés minimali ­
zálja a variabilitás potenciális forrásait a vizsgálatban. Ideális esetben 
ugyanaz a kórboncnok legyen felel ős egy adott szövet boncolásáért, hogy 
kiküszöbölhet ő legyen a személyek közötti különbség a szövetek feldolgo ­
zása során. Ha ez nem lehetséges, a boncolást úgy kell megtervezni, hogy 
az egyes kórboncnokok egy adott szövetet boncoljanak az összes kezelési 
csoportban, és ne egy kórboncnok boncoljon minden szövetet a kontroll ­
csoportban, miközben valaki más a felel ős a kezelési csoportokért. Mind ­
egyik járulékos ivarszervi szövetet leitatás nélkül kell megmérni 0,1 gramm 
pontossággal, majd a kapott értékeket minden állatnál fel kell jegyezni.
 
51. A szövetek közül több nagyon kicsi vagy nehezen boncolható lehet, és ez 
variabilitást eredményezhet. A korábbi vizsgálatok eltér ő relatív szórásokat 
jeleztek, amelyek különböz őek lehetnek a laboratórium jártasságától 
függően. Néhány esetben nagy különbségeket figyeltek meg a szövetek, 
például a VP és COW abszolút tömegében, egy adott laboratóriumon 
belül is.  
52. A máj, a páros vese és a páros mellékvese tömegének mérése választható. A 
szövetekr ől itt is el kell távolítani a rátapadó fasciát és zsírt. A májat meg 
kell mérni 0,1 gramm pontossággal és az eredményt fel kell jegyezni, a páros vesét és a páros mellékvesét meg kell mérni a 0,1 gramm pontos ­
sággal és az eredményt fel kell jegyezni. Amellett, hogy a májat, a vesét és 
a mellékveséket befolyásolják az androgének, ezek a szervek a szisztémás 
toxicitásnak is hasznos jelz ői.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. A szérumluteinizáló hormon (LH), tüsz őstimuláló hormon (FSH) és a 
tesztoszteron (T) szintjének mérése választható. A szérum T-szintek segí ­
tenek annak meghatározásában, hogy a vizsgált vegyi anyag kiváltja-e a tesztoszteron metabolizmusát a májban, csökkentve ezáltal a szérumban mérhető szintet. A T-adatok nélkül az ilyen hatás egy antiandrogén mecha ­
nizmuson keresztül megvalósuló hatásnak t űnhet. Az LH-szint információt 
szolgáltat egy antiandrogén azon képességér ől, hogy a szervek tömegének 
csökkentése mellett befolyásolja a hipotalamusz-hipofízis funkciót is, ami a hosszú távú vizsgálatokban heredaganatot válthat ki. Az FSH hormon 
fontos szerepet játszik a spermatogenezisben. A szérum T4 és T3 szintén 
választható mérések, amelyek hasznos kiegészít ő információt szolgáltat ­
hatnak a vegyi anyagok azon képességér ől, hogy megzavarják a pajzs ­
mirigyhormonok homeosztázisát. Ha hormonméréseket kell végezni, a 
patkányokat boncolás el őtt anesztetizálni kell és vért kell venni szívpunk ­
cióval, az érzéstelenítési módszert óvatosan megválasztva, hogy ne befolyá ­
solja a hormonmérést. A szérum el őkészítésének módszerét, a radioimmu ­
noassay vagy egyéb mérési készletek forrását, az analitikai eljárásokat és az 
eredményeket fel kell jegyezni. Az LH-szinteket ng/szérum ml mértékegy ­
ségben kell jegyz őkönyvezni, a T-szinteket szintén.
 
54. A szövetek boncolását fotókkal kiegészített részletes boncolási útmutató 
formájában kiegészít ő anyagként tették közzé a validálási program részeként 
(21). A boncolást bemutató videó is megtalálható a Korea Food and Drug 
Administration weblapján (22).  
— Az állatot ventrális felületével felfelé fektetve határozzuk meg, hogy a 
pénisz fitymája elvált-e már a pénisz makkjától. Ha igen, akkor húzzuk vissza a fitymát és távolítsuk el a pénisz makkját, majd mérjük meg (0,1 mg pontossággal) és jegyezzük fel a tömegét.
 
— Nyissuk fel a hasi b őrt és a hasfalat, és tárjuk fel a zsigereket. Ha 
választható szerveket kell mérni, vegyük ki és mérjük meg a májat 
0,1 g pontossággal, ezután távolítsuk el a gyomrot és a beleket, majd távolítsuk el és mérjük meg a páros veséket és a páros mellékveséket is 0,1 mg pontossággal. Ez a boncolási technika felfedi a húgyhólyagot és 
megkezdi a járulékos ivarszervi célszövetek boncolását.
 
— A VP boncolásához különítsük el a húgyhólyagot a ventrális izomré ­
tegtől a kötőszövetnek a középvonal mentén történ ő átvágásával. 
Mozdítsuk el a húgyhólyagot anterior irányba az ondóhólyagok (SV) felé, felfedve a ventrális prosztata bal és jobb lebenyét (amelyeket zsír ­
réteg fed). Óvatosan fejtsük fel a zsírt a VP jobb és bal lebenyér ől. 
Óvatosan mozdítsuk el a VP jobb lebenyét a húgycs őről és metsszük 
le a lebenyt a húgycs őről. Miközben még mindig kézben tartjuk a VP 
jobb lebenyét, óvatosan mozdítsuk el a VP bal lebenyét a húgycs őről, 
majd metsszük le, ezután pedig mérjük le 0,1 mg pontossággal és jegy ­
ezzük fel a tömeget.
 
— Az ondóhólyagok és a koaguláló mirigyek (seminal vesicles plus coagu ­
lating glands, SVCG) boncolásakor mozdítsuk el a húgyhólyagot kaudális irányba, felfedve az ondóvezetéket és az ondóhólyag és a 
koaguláló mirigyek (SVCG) jobb és bal lebenyeit. A folyadék szivár ­
gását érfogóval akadályozzuk meg az SVCG tövénél, ahol az ondóve ­
zeték a húgycs őhöz csatlakozik. Óvatosan metsszük le az SVCG-t, majd 
az érfogót a helyén tartva távolítsuk el a zsírt és a kapcsolódó anatómiai 
képleteket, ezután pedig helyezzük lemért mér őtálkába, távolítsuk el az 
érfogót, mérjük le 0,1 mg pontossággal és jegyezzük fel a tömeget.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— A levator ani plusz bulbocavernosus izmok (levator ani plus bulboca ­
vernosus muscles, LABC) boncolásakor fel kell tárni az izmokat és a 
pénisz bázisát. Az LA izmok körbeveszik a vastagbelet, míg az elüls ő 
LA és BC izmok a bulbus penishez kapcsolódnak. A b őrt, illetve a 
pénisz bázisa és a végbélnyílás anterior vége közötti perianális adne ­
xumot távolítsuk el. A BC izmokat fokozatosan metsszük le a bulbus 
penisről és a szövetekr ől. A vastagbelet kettévágjuk és a teljes LABC-t 
kiboncoljuk és eltávolítjuk. Az LABC-t megtisztítjuk a zsírtól és adne ­
xumtól, majd megmérjük 0,1 mg pontossággal és a tömeget feljegyez ­
zük. 
— Az LABC eltávolítása után a kerek Cowper- vagy bulbourethrális 
mirigyek (COW) láthatóvá válnak a bulbus penis alapjánál, attól kissé 
dorzálisan. Gondos boncolásra van szükség, hogy a folyadékszivárgás 
megelőzése érdekében elkerülhet ő legyen a vékony kapszula bemet ­
szése. Mérjük meg a páros COW-t 0,1 mg pontossággal és jegyezzük fel a tömeget.
 
— Ezenkívül, ha bármely mirigyb ől folyadékvesztés történik a boncolás és 
kimetszés során, azt fel kell jegyezni.  
55. Ha a vegyi anyag értékelése az ésszer űnél több állat felboncolását igényli 
egyetlen napon belül, a vizsgálat kezdetét szét lehet osztani két egymást 
követő napra, ami a boncolás és a kapcsolódó munkák két napra történ ő 
szétosztását is eredményezi. A vizsgálat ilyen módon való elosztása esetén kezelési csoportonként csak az állatok egyik felét kell használni naponta.
 
56. A tetemeket a boncolást követ ően megfelel ő módon meg kell semmisíteni.  
JEGYZŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
57. Az adatokat egyedenként (pl. testtömeg, járulékos ivarszervi szövetek 
tömege, választható mérések, egyéb válaszok és megfigyeléseik) vagy állat ­
csoportonként (az összes mérési átlagai és szórása) kell jegyz őkönyvezni. 
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni. Az adatoknak tartalmaz ­
niuk kell az állatok számát a vizsgálat kezdetén, a vizsgálat alatt elhullott 
vagy toxicitás jeleit mutató állatok számát, a megfigyelt toxicitási tünetek leírását, beleértve a fellépés id őpontját, id őtartamát és súlyosságát.
 
58. A záró jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell:  
Vizsgáló intézmény  
— létesítmény neve, helye,  
— vizsgálatvezet ő és egyéb személyzet, valamint a vizsgálattal kapcsolatos 
felelősségi körök,  
— a vizsgálat kezdetének és végének id őpontja, vagyis a vizsgált vegyi 
anyag adagolásának els ő napja és a boncolás utolsó napja.  
Vizsgált vegyi anyag  
— beszerzési forrás, tételszám, azonosítás, tisztaság, szállító teljes címe, 
vizsgált vegyi anyag(ok) jellemzése,  
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— tárolási körülmények és a hígítás készítésének módja és gyakorisága,  
— a stabilitással kapcsolatban kapott adatok,  
— az adagoló oldatok/szuszpenziók analízisei.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vivőanyag  
— a vivőanyag jellemz ői (azonosítás, szállító és tételszám),  
— a választott viv őanyag indokolása (ha az nem víz).  
Kísérleti állatok és állattenyésztési eljárások  
— az alkalmazott faj/törzs és megválasztásuk indoklása,  
— az állatok forrása vagy szállítója teljes címmel,  
— a szállított állatok száma és életkora,  
— tartási körülmények (h őmérséklet, megvilágítás stb.),  
— takarmány (név, típus, szállító, tételszám, beltartalom, és ha ismert, a 
fitoösztrogének szintje),  
— alom (név, típus, szállító, beltartalom),  
— körülmények és az állatok száma a ketrecben.  
A vizsgálat körülményei  
— életkor a kasztráció id őpontjában és az akklimatizáció id őtartama a 
kasztrálás után,  
— az egyes állatok testsúlya a vizsgálat kezdetekor (0,1 g pontossággal),  
— a randomizáció folyamata és a viv őanyag, referencia, valamint a vizsgált 
vegyi anyag csoportokba és ketrecekbe való besorolás jegyz őkönyve,  
— a testtömegek átlaga és szórása az egyes csoportban a vizsgálat vala ­
mennyi mérési napján,  
— a dózis kiválasztásának indoka,  
— a vizsgált vegyi anyag beadási módja és az expozíciós útvonal kiválasz ­
tásának indoklása,  
— ha a vizsgálat antiandrogén hatás kimutatását célozza, a TP-kezelés 
(dózis és térfogat),  
— a vizsgált vegyi anyaggal történt kezelés (dózis és térfogat),  
— az adagolás id őpontja,  
— boncolási eljárások, ideértve a kivéreztetés és az érzéstelenítés eszközeit,  
— ha szérumanalízist végeznek, a módszer részleteit meg kell adni. 
Például, ha RIA-t használnak, jegyz őkönyvezni kell a RIA eljárást, 
a RIA-készlet forrását, a készlet lejárati dátumait, a szcintillációs szám ­
lálási és a standardizálási eljárást.  
Eredmények  
— minden állat napi megfigyelése az adagolás során, egyebek mellett az 
alábbi szempontokból:  
— testtömeg (0,1 g pontossággal),  
— klinikai tünetek (ha vannak),  
— a takarmányfogyasztásra vonatkozó bármely mérés vagy feljegyzés,  
— boncolási megfigyelések állatonként, egyebek mellett:  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— a boncolás dátuma,  
— a kezelési állatcsoport,  
— az állat azonosítója,  
— a kórbocnok,  
— a boncolás és kimetszés id őpontja,  
— az állat kora,  
— végső testtömeg a boncoláskor, bármilyen statisztikailag szignifikáns 
növekedés vagy csökkenés megadásával,  
— az állat kivéreztetésének rendje és a boncolás során történ ő kimetszés 
rendje,  
— az öt androgén-dependens célszövet tömege:  
— ventrális prosztata (0,1 mg pontossággal),  
— ondóhólyag és koaguláló mirigyek, beleértve a folyadékot (páros szer ­
vek, 0,1 mg pontossággal),  
— levator ani plusz bulbocavernosus izom komplex (0,1 mg pontossággal),  
— Cowper-mirigyek (friss tömeg – páros szerv, 0,1 mg pontossággal),  
— glans penis (friss tömeg 0,1 mg pontossággal),  
— választható szövetek tömege, ha ilyen is történt:  
— máj (0,1 mg pontossággal),  
— vese (páros szerv, 0,1 mg pontossággal),  
— mellékvese (páros, 0,1 mg pontossággal),  
— általános megjegyzések és észrevételek,  
— szérum hormonok analízise, ha ilyen is történt,  
— szérum LH (választható – ng/szérum ml),  
— szérum T (választható – ng/szérum ml),  
— általános megjegyzések és észrevételek.  
Az adatok összegzése  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely tartalmazza a 
minta méretét az egyes csoportok esetén, az átlagos értéket és az átlag vagy a szórás standard hibáját. A táblázatoknak tartalmazniuk kell a bonco ­
láskor mért testtömegeket, a testtömeg változását az adagolás kezdetét ől a 
boncolásig, a cél járulékos ivarszervi szövetek tömegét és a választható szervek tömegét.
 
Az eredmények tárgyalása  
Az eredmények elemzése  
59. A test és a szervek boncoláskor mért tömegén – szükség esetén megfelel ő 
adatátalakítással – statisztikai elemzést kell végezni különféle jellemz őkre, 
mint például a variancia homogenitására. A kezelési csoportokat össze kell 
hasonlítani a kontrollcsoporttal olyan technikák használatával, mint például 
az ANOVA, amelyet páros összehasonlításnak (pl. egyoldalú Dunnett-teszt) és a statisztikai különbség kritériumának kell követnie, például p ≤ 0,05. 
Azonosítani kell a statisztikai szignifikanciát elér ő csoportokat. A „relatív 
szerv” tömegeket azonban kerülni kell az ilyen adatmanipuláció alapjául 
szolgáló érvénytelen statisztikai feltételezések miatt.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Androgén agonizmus esetén a kontrollnak a csak viv őanyagot kapó teszt ­
csoportnak kell lennie. A vizsgált vegyi anyag hatásmechanizmusának 
jellemzői eltérő relatív válaszokhoz vezethetnek a szövetek között, például 
a trenbolonnak, amelyet az 5-alfa-reduktáz nem alakít át, kifejezettebb hatása van a LABC-re és a GP-re, mint a TP-nek. Az öt androgénfügg ő 
célszövet (VP, LABC, GP, CG és SVCG) közül bármelyik kett ő vagy több 
tömegének statisztikailag szignifikáns növekedését (p ≤ 0,05) pozitív 
androgén agonista eredménynek kell tekinteni, és valamennyi célszövetnek bizonyos mérték ű fokozott növekedést kell mutatnia. A járulékos ivar ­
szervek (accessory sex organs, ASO) szöveti válaszainak kombinált értéke ­
lését megfelel ő sokváltozós adatelemzéssel lehet elvégezni. Ez javíthatja az 
elemzést, különösen azokban az esetekben, ahol csak egyetlen szövet ad statisztikailag szignifikáns választ.
 
61. Androgén antagonizmus esetében a kontrollnak a referencia androgénnel 
(csak tesztoszteron-propionát) kezelt csoportnak kell lennie. A vizsgált vegyi anyag hatásmechanizmusának jellemz ői eltérő relatív válaszokhoz 
vezethetnek a szövetek között, például az 5-alfa-reduktáz inhibitoroknak, 
mint a finaszterid, kifejezettebb hatása van a ventrális prosztatára, mint egyéb szövetekre, összehasonlítva az er ős AR antagonistákkal, mint amilyen 
például a flutamid. Az öt androgénfügg ő célszövet (VP, LABC, GP, CG és 
SVCG) közül bármelyik kett ő vagy több tömegének statisztikailag szigni ­
fikáns csökkenését (p ≤ 0,05) a csak TP-kezeléssel összehasonlítva pozitív 
androgén antagonista eredménynek kell tekinteni, és valamennyi célszö ­
vetnek bizonyos mérték ű csökkent növekedést kell mutatnia. Az ASO 
szöveti válaszok kombinált értékelését megfelel ő sokváltozós adatelemzéssel 
lehet elvégezni. Ez javíthatja az elemzést, különösen azokban az esetekben, ahol csak egyetlen szövet ad statisztikailag szignifikáns választ.
 
62. Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, amely tartalmazza az 
átlagot, az átlag standard hibáját (a szórás is elfogadható) és az egyes csoportok mintaméretét. Az egyedi adattáblákat is bele kell foglalni a jegy ­
zőkönyvbe. A kontrolladatok egyedi értékeit, átlagait, valamint az SE (szó ­
rás) értékeket és a relatív szórásokat meg kell vizsgálni annak eldöntése 
érdekében, hogy megfelelnek-e a várt történeti értékekkel való konzisztencia elfogadható kritériumainak. Az egyes szervek tömegének az 1. táblázatban (lásd a 25. és 26. bekezdést) szerepl ő relatív szórásait meghaladó relatív 
szórások meghatározzák, hogy vannak-e hibák az adatrögzítésben vagy 
-bevitelben, vagy hogy a laboratórium elsajátította-e az androgénfügg ő 
szövetek pontos boncolási technikáját vagy indokolt a továbbképzés/gya ­
korlás. Általánosságban, a relatív szórások (szórás osztva az átlagos szerv ­
tömeggel) laborról laborra és vizsgálatról vizsgálatra reprodukálhatók. A 
bemutatott adatoknak tartalmazniuk kell legalább a ventrális prosztata, az ondóhólyag, a levator ani plusz bulbocavernosus izom, a Cowper-mirigyek, a glans penis és a máj tömegét és a testtömeget, valamint a testtömeg 
változását az adagolás megkezdését ől a boncolásig. Az adatokat a kovari ­
ancia testtömeggel való módosítása után is be lehet mutatni, de ez nem helyettesíti a kiigazítatlan adatok bemutatását. Ezenfelül, ha fitymaelválás (preputial separation, PPS) nem fordul el ő egyik csoportban sem, a PPS 
előfordulási gyakoriságát fel kell jegyezni és statisztikailag össze kell 
hasonlítani a kontrollcsoporttal a Fisher Exact teszt alkalmazásával.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Amikor a számítógépes adatok bevitelének pontosságát az eredeti adatla ­
pokkal való összevetés alapján ellen őrzik, a biológiailag nem hihet ő vagy a 
kezelési csoport átlagától több mint három szórással eltér ő szervtömeg-érté ­
keket gondosan meg kell vizsgálni és el lehet vetni, mivel valószín űleg 
adatrögzítési hibák.  
64. A vizsgálati eredmények összehasonlítása az OECD relatív szórásaival (1. 
táblázat) gyakran fontos értelmezési lépés a vizsgálati eredmények érvé ­
nyessége tekintetében. A viv őanyag kontrollcsoportra vonatkozó történeti 
adatokat meg kell őrizni a laboratóriumban. A pozitív referencia vegyi 
anyagokra (mint például a TP és az FT) adott válaszokkal kapcsolatos 
történeti adatokat is meg kell őrizni a laboratóriumban. A laboratóriumok 
is rendszeresen ellen őrizhetik az ismert gyenge androgén agonistákra és 
antagonistákra adott választ és meg őrizhetik ezeket az adatokat. Ezeket az 
adatokat össze lehet hasonlítani a rendelkezésre álló OECD-adatokkal annak 
biztosítása érdekében, hogy a laboratórium módszerei megfelel ő statisztikai 
pontosságot és teljesítményt eredményezzenek.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Androgén : fogalom, amelyet az androgén-dependens szövetekre gyakorolt 
pozitív hatás leírására használnak.  
Antiandrogén : egy vegyi anyag azon képessége, hogy eml ősállatok szerveze ­
tében a TP hatását gátolja.  
Vegyi anyag : egy anyag vagy keverék.  
Születés napja : a 0. posztnatális nap.  
Dózis : a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége. A Hershberger bioassay 
esetében a dózist a vizsgált vegyi anyag tömegének és a kísérleti állat egységnyi 
testtömegének napi hányadosaként (például mg/testtömeg kilogramm/nap) fejezzük ki.
 
Adagolás : általános fogalom, amely a dózist, valamint az adagolás gyakoriságát 
és időtartamát foglalja magában.  
Moribund : kifejezés, amelyet a haldokló, elhullás-közeli állapotban lév ő állatok 
leírására használunk.  
X. posztnatális nap : az élet X. napja a születés napját követ ően. 
Érzékenység : a vizsgálati módszer azon képessége, hogy helyesen azonosítja be 
azokat a vegyi anyagokat, amelyek rendelkeznek a vizsgált tulajdonsággal.  
Specificitás : a vizsgálati módszer azon képessége, hogy pontosan azonosítja be 
azokat a vegyi anyagokat, amelyek nem rendelkeznek a vizsgált tulajdonsággal.  
Vizsgált vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  
Validáció : tudományos folyamat, melynek célja egy adott vizsgálati módszer 
működési követelményeinek és korlátjainak jellemzése, valamint megbízhatósá ­
gának és egy adott célhoz kapcsolódó relevanciájának igazolása.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
2. függelék
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 Megjegyzések a keretrendszerhez  
1. megjegyzés:  A belépés és kilépés minden szinten lehetséges és a veszély- és 
kockázatértékelésre szolgáló információs igények jellegét ől függ  
2. megjegyzés:  Az 5-ös szinten az ökotoxikológiának olyan végpontokat is 
tartalmaznia kell, amelyek jelzik a káros hatások és a potenciális 
populációs károk mechanizmusait  
3. megjegyzés:  Amikor egy multimodális modell több egyetlen végpontú vizs ­
gálatot lefed, ez a modell az egyetlen végpontú vizsgálatok 
helyébe lép  
4. megjegyzés:  Az egyes vegyi anyagokat eseti alapon kell értékelni, figyelembe 
véve az összes rendelkezésre álló információt és szem el őtt tartva 
a keretrendszer különböz ő szintjeinek funkcióját.  
5. megjegyzés:  A keretrendszert jelenleg nem lehet mindenre kiterjed őnek tekin ­
teni. A 3., 4. és 5. szinten olyan vizsgálatokat foglal magában, amelyek már rendelkezésre állnak vagy amelyek validálása még 
folyamatban van. Ami az utóbbiakat illeti, ezeket a keretrendszer 
ideiglenes jelleggel tartalmazza. Miután kifejlesztették és vali ­
dálták ezeket, hivatalosan is bekerülnek a keretrendszerbe.
 
6. megjegyzés:  Az 5. szintet nem lehet úgy tekinteni, hogy csak végleges tesz ­
teket tartalmaz. Az ezen a szinten szerepel ő teszteket úgy tekin ­
tik, hogy hozzájáruljanak az általános veszély- és kockázatérté ­
keléshez.  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols 
in Toxicology  16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental 
Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N  o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized proto ­
col. Env. Health Persp. 114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.
 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413-422.  
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306- 
1314.  
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38-44.  
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue resp ­
iration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.
 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.  
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.
 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p 38.  
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http:// rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.
 
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Az Európai Parlament és a Tanács 2010. szeptember 22-i 2010/63/EU 
irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelmér ől (HL 
L 276., 2010.10.20., 33. o.).  
(27) E melléklet következ ő fejezetei:  
B.1.a: Akut orális toxicitás – rögzített dózisú eljárás  
B.1.b: Akut orális toxicitás – akut toxikus osztály módszer  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  KIBŐVÍTETT EGYGENERÁCIÓS REPRODUKCIÓS TOXICITÁSI 
VIZSGÁLAT  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 443. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2012) leírt módszerrel. A vizsgálati módszer a Nemzetközi Élettu ­
dományi Intézet (ILSI) Egészség- és Környezettudományi Intézete (HESI) mezőgazdasági vegybiztonsági technikai ellen őrző bizottságának (ACSA 
Technical Commitee) az F
 1 életszakasz kib ővített egygenerációs reproduk ­
ciós vizsgálatra vonatkozó javaslatán alapul, amely megjelent Cooper et al., 2006 közlésében (1). A vizsgálati tervben számos fejlesztést és pontosítást hajtottak végre a vizsgálat rugalmasabbá tétele és annak kihangsúlyozása 
érdekében, hogy a meglév ő ismeretekb ől kell kiindulni, az életben tett 
megfigyeléseket pedig a vizsgálat irányítására és személyre szabására kell használni. Ez a vizsgálati módszer részletes leírást ad a kib ővített egygene ­
rációs reprodukciós toxicitási vizsgálat elvégzéséhez. A vizsgálati módszer 
az F
 1 -állatok három kohortját írja le:  
1. kohort: a reprodukciós/fejl ődési végpontokat értékeli; ezt a kohortot ki 
lehet bővíteni az F  2 -generációval is,  
2. kohort: a vegyianyag-expozíciónak a fejl ődő idegrendszerre gyakorolt 
lehetséges hatását értékeli,  
3. kohort: a vegyianyag-expozíciónak a fejl ődő immunrendszerre gyakorolt 
lehetséges hatását értékeli.  
2. A második generáció értékelésér ől, és a fejl ődési neurotoxicitási kohort 
és/vagy a fejl ődési immunotoxicitási kohort kihagyásáról szóló döntésnek 
tükröznie kell az értékelt vegyi anyagról meglév ő ismereteket, valamint a 
különböző szabályozó hatóságok igényeit. A vizsgálati módszer célja, hogy 
részletesen bemutassa, hogyan végezhet ő el a vizsgálat, és felvázolja, 
hogyan kell az egyes kohortokat értékelni.  
3. A 2. generáció el őállítására vonatkozó bels ő kiváltó tényez őkkel kapcso ­
latos döntési eljárást az OECD 117. iránymutatása (39) írja le a bels ő 
kiváltó tényez őket használó szabályozó hatóságok számára.  
Kiindulási megfontolások és célkit űzések  
4. A kib ővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat f ő célja, hogy 
értékelje azokat a speciális életszakaszokat, amelyekre nem terjednek ki az 
egyéb típusú toxicitási vizsgálatok, és tesztelje a pre- és posztnatális 
vegyianyag-expozíció eredményeként esetleg el őforduló hatásokat. A repro ­
dukciós végpontok esetében a tervek szerint – els ő lépésként és ha rendel ­
kezésre áll – az ismételt dózisú vizsgálatokból (beleértve a reprodukciós 
toxicitási sz űrővizsgálatokat, például OECD TG 422 (32)), vagy az 
endokrin rendszert károsító anyagok kimutatását célzó rövid távú sz űrővizs­
gálatokból (például uterotrofikus vizsgálat – B.54. vizsgálati módszer (36); Hershberger assay – B.55. vizsgálati módszer (37)) származó információt 
használjuk fel arra, hogy kimutassuk a hímek és n őstények szaporítószer ­
veire gyakorolt hatásokat. Ez hímek esetében magában foglalja a sperma ­
togenezist (herék kórszövettani vizsgálata), n őstények esetében pedig az 
ivari ciklust, a follikulusok számát/a petesejtek érését, valamint a petefészek 
integritását (kórszövettan). A kib ővített egygenerációs reprodukciós toxici ­
tási vizsgálat olyan reprodukciós végpontok tesztelésére használható, amelyhez a hímek és n őstények interakciójára, konceptussal rendelkez ő 
nőstényekre és utódokkal rendelkez ő nőstényekre van szükség, valamint 
az F
 1 -nemzedékre a szexuális érettségig (lásd az OECD 151. iránymutatását, 
amely támogatja ezt a vizsgálati módszert (40)).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. A vizsgálati módszer célja, hogy értékelje a vegyi anyagok pre- és poszt ­
natális fejl ődésre gyakorolt hatásait, valamint hogy részletesen értékelje a 
szisztémás toxicitást vemhes és szoptató n őstényekben, illetve a fiatal és 
felnőtt utódokban. A kulcsfontosságú fejl ődési végpontoknak, mint például 
az utódok életképességének, az újszülöttek egészségi állapotának, a szüle ­
téskori fejlettségi állapotnak, valamint a feln őttkorig tartó fizikai és funkci ­
onális fejl ődésnek a részletes vizsgálata várhatóan beazonosítja az 
utódokban a speciális célszerveket. A vizsgálat ezenkívül információkat nyújt a vizsgált vegyi anyagnak a feln őtt hím és n őstény szaporítórendszer 
integritására és teljesítményére gyakorolt hatásaival kapcsolatban és/vagy 
megerősíti ezeket az információkat. Különösen, de nem kizárólag, a követ ­
kező paramétereket kell figyelembe venni: az ivarmirigyek funkciója, az 
ivari ciklus, a spermiumok érése a mellékherében, a párzási viselkedés, a 
fogamzás, a vemhesség, az ellés és a szoptatás. Továbbá, az ezekre a rend ­
szerekre gyakorolt lehetséges hatásokat a fejl ődési neurotoxicitási és fejl ő­
dési immunotoxicitási értékelésekb ől kapott információk jellemzik. Az 
ezekből a vizsgálatokból származó adatoknak lehet ővé kell tennie a káros 
hatást nem okozó szintek (NOAEL-ek), a legkisebb megfigyelhet ő ártalmas 
hatást okozó szintek (LOAEL-ek) és/vagy a benchmark dózisok meghatá ­
rozását a különböz ő végpontok esetében, és/vagy a korábbi ismételt dózisú 
vizsgálatokban kimutatott hatások jellemzésére kell használni ezeket az 
adatokat és/vagy támpontul kell szolgálniuk a kés őbbi vizsgálatokhoz.
 
6. A 1. ábrán látható a protokoll sémája. A vizsgálandó vegyi anyagot folya ­
matosan kell adagolni fokozatosan növekv ő dózisokban hím és n őstény 
állatok több csoportjának. Ezt a szül ői (P) generációt egy el őre meghatá ­
rozott párzás el őtti időtartományban (a vizsgált vegyi anyagról rendelke ­
zésre álló információ alapján kiválasztott id őtartam, de legalább két hét) 
és a két hetes párzási id őszakban kell kezelni. A P-hímeket tovább, legalább 
az F  1 elválasztásáig kezeljük. Ezeket a hímeket legalább 10 héten át kell 
kezelni. Hosszabb ideig is lehet, ha a reprodukciós hatások tisztázására van szükség. A P-n őstények kezelése folytatódik a vemhesség és a szoptatás 
alatt, egészen a vizsgálatnak az almok elválasztása után történ ő befejezéséig 
(azaz 8-10 hetes kezelés). Az F
 1 -utódok további kezelést kapnak a vizsgált 
vegyi anyaggal az elválasztástól a feln őtté válásig. Amennyiben a második 
generációt is értékelik (lásd OECD 117. iránymutatás (39)), az F  1 -utódok 
kezelése az F  2 elválasztásáig, vagy a vizsgálat befejezéséig tovább folyta ­
tódik.  
7. Minden állaton klinikai megfigyeléseket és kórbonctani vizsgálatokat kell 
végezni a toxicitás jeleinek kimutatása érdekében, és külön hangsúlyt kell 
fektetni a hím és n ői szaporítórendszer épségére és teljesít őképességére, 
valamint az utódok egészségére, növekedésére, fejl ődésére és m űködésére. 
Elválasztáskor a kiválasztott utódokat besoroljuk az egyes alcsoportokba (1–3. kohort, lásd a 33. és 34. bekezdést és az 1. ábrát) a további vizs ­
gálatok céljára, ideértve a nemi érést, a reproduktív szervek integritását és 
funkcióját, a neurológiai és viselkedési végpontokat és az immunfunkciót.
 
8. A vizsgálatok elvégzése során a klinikai tüneteknek, mint a biztonsági 
értékeléshez használt kísérleti állatok humánus végpontjainak felismerésér ől, 
értékelésér ől és használatáról szóló 19. OECD-iránymutatásban (34) ismer ­
tetett vezérelveket és szempontokat kell követni.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Amikor elegend ő számú vizsgálat áll rendelkezésre, hogy meggy őződjenek 
ennek az új vizsgálati elrendezésnek a hatásáról, a vizsgálati módszert 
felülvizsgálják, és ha szükséges, a szerzett tapasztalatok fényében módosít ­
ják. 
1. ábra  
A kibővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat sémája
  
A MÓDSZER LEÍRÁSA/A VIZSGÁLAT EL ŐKÉSZÜLETEI  
Állatok  
Az állatfaj és a törzs kiválasztása  
10. A reprodukciós toxicitási vizsgálathoz használandó faj kiválasztását 
gondosan mérlegelni kell a rendelkezésre álló valamennyi információ fényé ­
ben. A háttéradatok mennyisége és az általános toxicitási vizsgálatokkal való összehasonlíthatóság miatt azonban rendszerint a patkány az el őnyben 
részesített állatfaj, és az ebben a vizsgálati módszerben megadott kritéri ­
umok és ajánlások is erre a fajra vonatkoznak. Ett ől eltérő fajok alkalma ­
zását megfelel ően indokolni kell, és a protokoll megfelel ő módosítására is 
szükség lesz. Nem szabad olyan törzseket alkalmazni, amelyek kevéssé 
termékenyek, vagy amelyekben magas a spontán fejl ődési defektusok 
előfordulási gyakorisága.
 
Életkor, testtömeg és beválogatási kritériumok  
11. Korábban vizsgálatban még részt nem vett, egészséges szül őállatokat kell 
használni. A hímeket és a n őstényeket egyaránt tanulmányozni kell, és a 
nőstényeknek nulliparának és nem vemhesnek kell lennie. A P-állatoknak 
szexuálisan érettnek, az adagolás kezdetén hasonló tömeg űnek (azonos 
nemen belül), a párzáskor hasonló korúnak (kb. 90 nap) és a vizsgált faj 
és törzs reprezentatív példányainak kell lennie. Az állatoknak az érkezés után legalább 5 napig akklimatizálódniuk kell. Az állatokat véletlenszer űen 
soroljuk be a kontroll- és kezelt csoportokba, oly módon, ami hasonló 
átlagos testtömeg-értékeket eredményez a csoportok között (azaz a közép ­
érték ± 20 %-a).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Tartási és etetési körülmények  
12. A kísérleti állatok tartására szolgáló helyiség h őmérséklete 22 °C (± 3 °C) 
kell, hogy legyen. A relatív páratartalomnak 30–70 % között kell lennie, az ideális érték 50–60 % között van. A mesterséges világítást úgy kell beállí ­
tani, hogy 12 órás világos és 12 órás sötét periódusok váltsák egymást. 
Hagyományos laboratóriumi táplálás alkalmazható korlátozás nélküli ivóvíz ­
ellátással. Különös figyelmet kell fordítani a takarmány fitoösztrogén-tartal ­
mára, mivel a takarmány magas fitoösztrogén-szintje befolyásolhat egyes 
reprodukciós végpontokat. Szabványosított, nyitott receptúrájú takarmány 
használata ajánlott, amelyben csökkentették ösztrogénszer ű vegyi anyagok 
mennyiségét (2) (30). A takarmány megválasztását a vizsgált vegyi 
anyaggal való megfelel ő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgált 
vegyi anyagot a takarmánnyal adjuk be. Igazolni kell a vizsgált vegyi anyag arányát, homogenitását és stabilitását a takarmányban. Rendszeresen ellen ­ 
őrizni kell, hogy a takarmány és az ivóvíz nem tartalmaz-e szennyez ő 
anyagokat. A vizsgálat során használt takarmány tételeib ől vett mintákat 
megfelelő körülmények között (pl. – 20 °C-on fagyasztva) meg kell őrizni 
a jelentés véglegesítéséig arra az esetre, ha az eredmények takarmányösz ­
szetevők további elemzését teszik szükségessé.
 
13. Az állatokat ketrecben, azonos nem ű és kezelési csoportba tartozó állat ­
okból álló kis csoportokban kell tartani. Egyedileg is elhelyezhet ők a sérü­
lések elkerülése érdekében (pl. hímek a párzási id őszak után). A pároztatá ­
sokat erre a célra alkalmas ketrecekben kell végezni. Miután a párzás bizo ­
nyíthatóan megtörtént, a feltételezhet ően vemhes n őstényeket külön-külön 
kell elhelyezni fiaztató ketrecekben, ahol megfelel ő és meghatározott 
fészekrakó anyagot kell biztosítani számukra. Az almoknak az anyaállattal 
kell maradniuk az elválasztásig. Az F  1 -állatokat ketrecben, azonos nem ű és 
kezelési csoportba tartozó állatokból álló kis csoportokban kell tartani az elválasztástól a vizsgálat befejezéséig. Ha tudományos szempontból indo ­
kolt, az állatokat egyedileg is el lehet helyezni. A kiválasztott alomanyag 
fitoösztrogének-szintjének minimálisnak kell lennie.
 
Az állatok száma és azonosítása  
14. Normális esetben minden teszt- és kontrollcsoportnak elegend ő számú 
pároztatandó állatpárt kell tartalmaznia, hogy az dóziscsoportonként legalább 20 vemhes n őstényt eredményezzen. A cél az, hogy megfelel ő 
mennyiség ű vemhességet hozzunk létre ahhoz, hogy felmérhessük a vegyi 
anyag hatását a termékenységre, a vemhességre és az anyai viselkedésre 
a P-nemzedékben, valamint a növekedésre és a fejl ődésre az F
 1 -utódokban 
a fogamzástól az érettségig. Ha nem sikerül elérni a kívánt számú vemhes állatot, az nem feltétlenül érvényteleníti a vizsgálatot, hanem eseti elbírálás 
alapján kell kiértékelni, figyelembe véve a lehetséges ok-okozati összefüg ­
gést a vizsgált vegyi anyaggal.
 
15. Minden P-állatot egyedi azonosító számmal kell ellátni az adagolás megkez ­
dése előtt. Ha a laboratóriumi történeti adatok azt mutatják, hogy a n ősté­
nyek jelent ős része esetleg nem fog szabályos (4 vagy 5 napos) ivari ciklust 
mutatni, akkor az ivari ciklusokat a kezelés megkezdése el őtt javasolt 
kiértékelni. Alternatív megoldásként a csoport mérete is megnövelhet ő 
annak érdekében, hogy mindegyik csoportban legalább 20 n ősténynek 
legyen szabályos (4 vagy 5 napos) ivari ciklusa a kezelés kezdetén. A születés utáni (PND) 0. vagy 1. napon, az újszülöttek els ő vizsgálata 
során minden F
 1 -utódot egyedi azonosítóval kell ellátni. A származási 
almot beazonosító feljegyzéseket minden F  1 -állat esetében meg kell őrizni 
a vizsgálat egész id őtartama alatt, adott esetben az F  2 -állatok esetében is.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Vizsgált vegyi anyag  
A vizsgált vegyi anyagról rendelkezésre álló információk  
16. A rendelkezésre álló információkat a beadási módra, a viv őanyag kiválasz ­
tására, az állatfaj kiválasztására, a dózisok kiválasztására és az adagolási 
ütemterv lehetséges módosítására vonatkozó döntések céljából felül kell 
vizsgálni. Ezért a vizsgált vegyi anyagról rendelkezésre álló valamennyi releváns információt, azaz a fizikai-kémiai, toxikokinetikai (beleértve a fajs ­
pecifikus anyagcserét) és toxikodinamikai tulajdonságokat, a szerkezet-hatás 
összefüggéseket (SAR), az  in vitro  anyagcsere folyamatokat, a korábbi 
toxicitási vizsgálatok eredményeit és a szerkezeti analógokra vonatkozó releváns információkat figyelembe kell venni a kib ővített egygenerációs 
reprodukciós toxicitási vizsgálat tervezése során. A felszívódásra, eloszlásra, 
metabolizmusra és eliminációra (ADME) és a bioakkumulációra vonatkozó 
előzetes információk a kémiai szerkezetb ől, a fizikai-kémiai adatokból, a 
plazmafehérjékhez való köt ődés mértékéb ől vagy a toxikokinetikai (TK) 
vizsgálatokból származhatnak, míg a toxicitási vizsgálatok eredményei 
kiegészítő információkat közölnek, például a NOAEL, az anyagcsere vagy 
a metabolizmus indukciója tekintetében.
 
A toxikokinetikai adatok figyelembevétele  
17. Bár használatuk nem kötelez ő, a korábban elvégzett dózisbehatároló és 
egyéb vizsgálatok TK-adatai rendkívül hasznosak a vizsgálati elrendezés megtervezésében, az alkalmazott dózisok szintjének kiválasztásában és az 
eredmények kiértékelésében. Különösen hasznosak azok az adatok, 
amelyek: 1) igazolják a fejl ődő magzatok és kölykök vizsgált anyaggal 
(vagy a metabolitjaival) történt expozícióját, 2) becslést adnak a bels ő 
dozimetriáról és 3) értékelik a kinetikai folyamatok potenciális dózisfügg ő 
telítettségét. Amennyiben rendelkezésre állnak, további TK-adatokat is 
figyelembe kell venni, mint például a metabolit profilokat, koncentráció- idő görbét, stb. Kiegészít ő TK-adatokat is lehet gy űjteni a fő vizsgálat 
során, feltéve, hogy az nem zavarja a f ő vizsgálati végpontok gy űjtését és 
értelmezését.
 
Általános útmutatásként az alábbi TK-adathalmaz lehet hasznos a kib ővített 
egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat tervezése során:  
— terhesség kés ői szakasza (pl. vemhesség 20. napja) – anyai vér és 
magzati vér,  
— szoptatás középs ő szakasza (PND 10) – anyai vér, kölyök vér és/vagy 
tej, 
— korai elválasztás utáni szakasz (pl. PND 28) – elválasztott kölykök 
vérmintái.  
Az egyes analitok (pl. szül ő vegyi anyag és/vagy metabolitok) és a minta ­
vételi rendszer meghatározása során rugalmasan kell eljárni. Például a 
mintavételek száma és id őzítése egy adott mintavételi napon a beadási 
módtól, valamint a nem terhes állatokban mutatott TK-tulajdonságok előzetes ismeretét ől fog függeni. Az étrendi vizsgálatok esetében elegend ő 
a minden nap egyetlen konzisztens id őpontban történ ő mintavétel, míg a 
gyomorszondán át történ ő adagolás további mintavételi id őpontokat tehet 
szükségessé a különböz ő belső dózisok pontosabb becslése érdekében. 
Azonban egyik mintavételi napon sincs szükség a teljes koncentráció- 
időgörbe elkészítésére. Szükség esetén a vért az almon belül nemenként 
egyesíteni lehet a magzati és újszülöttkori analízisekhez.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Az adagolás módja  
18. Az adagolási mód kiválasztásánál az emberi expozíció szempontjából legin ­
kább releváns útvonal(ak)at kell figyelembe venni. Bár a protokollt a vizs ­
gált vegyi anyag takarmányon keresztül történ ő beadására tervezték, a vegyi 
anyag jellemz őitől és a szükséges információktól függ ően módosítható más 
beadási módra is (ivóvíz, gyomorszonda, belégzés, b őr). 
A vivőanyag kiválasztása  
19. A vizsgált vegyi anyagot szükség esetén alkalmas viv őanyagban feloldjuk 
vagy szuszpendáljuk. Lehet őség szerint els ősorban vizes oldatot/emulziót 
ajánlatos alkalmazni, másodsorban olajos (például kukoricacsíra-olajban 
elkészített) oldatot vagy emulziót. A vízt ől eltérő vivőanyagok esetében 
ismerni kell a viv őanyag toxikológiai tulajdonságait. A potenciális bels ő 
toxicitással rendelkez ő vivőanyagok használatát kerülni kell (pl. aceton, 
DMSO). Meg kell határozni azt is, hogy a vizsgált vegyi anyag mennyire 
stabil az adott viv őanyagban. Ha viv őanyagot vagy más adalékanyagot 
használunk az adagolás megkönnyítésére, a következ ő tulajdonságokat 
kell figyelembe venni: a vizsgált vegyi anyag felszívódására, eloszlására, metabolizmusára vagy retenciójára gyakorolt hatások, a vizsgált vegyi 
anyag kémiai tulajdonságaira gyakorolt azon hatások, amelyek módosít ­
hatják annak toxikus jellemz őit, valamint az állatok táplálék- és vízfogyasz ­
tására vagy tápláltsági állapotára gyakorolt hatások.
 
A dózis megválasztása  
20. A vizsgálatnak alapesetben legalább három dózisszintet és egy párhuzamos 
kontrollt kell tartalmaznia. A megfelel ő dózisok megválasztásakor a vizs ­
gálatvezet őnek figyelembe kell vennie az összes rendelkezésre álló infor ­
mációt, beleértve a korábbi vizsgálatokból származó dózisinformációkat, a vemhes vagy nem vemhes állatok TK-adatait, a laktációs transzfer mértékét, valamint az emberi expozícióra vonatkozó becsléseket. Ha olyan TK-adatok 
állnak rendelkezésre, amelyek a TK-folyamatok dózisfügg ő telítődését 
jelzik, ügyelni kell arra, hogy elkerüljék az olyan magas adagokat, amelyek egyértelm űen telítődést mutatnak, feltéve természetesen, hogy az emberi 
expozíció várhatóan jóval a telítettségi pont alatt lesz. Ilyen esetekben a 
legmagasabb dózisszintnek a nemlineáris TK-viselkedésbe való átmenet 
inflexiós pontján vagy kicsivel felette kell lennie.
 
21. Az erre vonatkozó TK-adatok hiányában a dózisszinteknek a toxikus hatá ­
sokon kell alapulnia, kivéve, ha ezt a vizsgált vegyi anyag fizikai/kémiai 
jellege korlátozza. Ha a dózisok a toxicitáson alapulnak, a legmagasabb 
dózist úgy kell megválasztani, hogy valamilyen szisztémás toxicitást váltson ki, de ne okozza az állat halálát vagy súlyos szenvedését.
 
22. Fokozatosan csökken ő dózisszinteket kell választani annak érdekében, hogy 
demonstrálni lehessen a dózisfügg ő hatásokat és a megfigyelhet ő káros 
hatást nem okozó szintet (NOAEL), illetve a kimutatási határ közelében lévő dózisokat, amelyek lehet ővé teszik benchmark dózis meghatározását 
a legérzékenyebb végpontokra. A NOAEL-ek és LOAEL-ek közötti nagy 
dózistávolság elkerülése érdekében gyakran a két- vagy négyszeres inter ­
vallumok az optimálisak. Nagyon nagy dózisintervallumok (pl. 10-nél magasabb szorzófaktor) alkalmazása helyett gyakran el őnyösebb egy 
negyedik vizsgálati csoport beiktatása.
 
23. A kontrollcsoportba tartozó állatokat a vizsgált vegyi anyag beadásától elte ­
kintve ugyanolyan módon kell kezelni, mint a vizsgálati csoportokban lév ő­
ket. Ez a csoport egy kezeletlen vagy placebóval kezelt kontrollcsoport, vagy ha a vizsgálandó anyag beadásához viv őanyagot használnak, akkor 
egy vivőanyaggal kezelt kontrollcsoport. Viv őanyag alkalmazása esetén a 
kontrollcsoportban a legnagyobb alkalmazott mennyiségben kell beadni a 
vivőanyagot.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Határdózis-vizsgálat  
24. Amennyiben az ismételt dózisú vizsgálatokban nincs bizonyíték a toxici ­
tásra legalább 1 000 mg/testtömeg kg/nap dózisban, vagy ha toxicitás nem várható a szerkezetileg és/vagy metabolikusan rokon vegyi anyagokra 
vonatkozó adatok alapján, amelyek az  in vivo/in vitro  metabolikus tulajdon ­
ságok hasonlóságát jelzik, a több dózisszintet használó vizsgálatra nem feltétlenül van szükség. Ilyen esetekben kib ővített egygenerációs reproduk ­
ciós toxicitási vizsgálatot lehet végezni kontrollcsoporttal és egyetlen, 
legalább 1 000 mg/testtömeg kg/nap dózissal. Ha azonban ezen a határdó ­
zison reprodukciós vagy fejl ődési toxicitásra utaló bizonyíték található, 
további vizsgálatokra lesz szükség alacsonyabb dózisokkal a NOAEL 
beazonosítása céljából. Ezek a határdózis-vizsgálati szempontok csak 
akkor érvényesek, ha az emberi expozíció nem indikál magasabb dózist.
 
A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
Az utódok expozíciója  
25. Az adagolás preferált módja a takarmányban történ ő expozíció. Mesterséges 
táplálást alkalmazó vizsgálat végzése esetén figyelembe kell venni, hogy a 
kölykök általában mindaddig csak közvetve, az anyatejen keresztül kapják a vizsgált vegyi anyagot, amíg az elválasztáskor meg nem kezd ődik a 
közvetlen adagolás. A táplálékkal vagy ivóvízzel történ ő adagolást alkal ­
mazó vizsgálatok esetében a kölykök közvetlenül is megkapják a vizsgált 
vegyi anyagot, amikor a szoptatási id őszak utolsó hetében önállóan is elkez ­
denek táplálkozni. Meg kell fontolni a vizsgálati terv módosítását, ha a vizsgált vegyi anyag gyengén választódik ki a tejben, valamint akkor, ha 
hiányzik a bizonyíték az utódok folyamatos expozíciójára. Ezekben az 
esetekben a rendelkezésre álló toxikokinetikai információk, az utódokban jelentkező toxicitás vagy a biológiai markerek változásai alapján meg kell 
fontolni az utódoknak a szoptatás alatti közvetlen adagolását (3) (4). A 
szoptatott kölykökön végzett közvetlen adagolásos vizsgálatok el őtt 
gondosan mérlegelni kell az el őnyöket és a hátrányokat (5).
 
Adagolási ütemterv és a dózisok beadása  
26. Az ivari ciklusra, a férfi és a n ői ivarszervek kórszövettanára és a here/ 
mellékhere spermaanalízisére vonatkozó egyes információk elérhet ők a 
korábbi megfelel ő időtartamú ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból. A 
kibővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálatban a párzás el őtti 
kezelés id őtartama ezért a funkcionális változásokra gyakorolt olyan hatások 
észlelését célozza, amelyek zavarhatják a párzási viselkedést és a megter ­
mékenyítést. A párzás el őtti kezelés legyen elég hosszú, hogy a P-hímeknél 
és -nőstényeknél elérjék az állandósult állapotú expozíciós körülményeket. 
A párosodás el őtti 2 hetes kezelés a legtöbb esetben mindkét nemnél 
megfelelőnek tekinthet ő. A nőstények esetében ez 3–4 teljes ivari ciklust 
is magában foglal és elegend őnek kell lennie a ciklusra gyakorolt bármilyen 
káros hatás észleléséhez. Hímeknél ez megfelel az érlel ődő spermiumok 
mellékhere-tranzitjához szükséges id őnek, és lehet ővé teszi a spermiumokra 
a here után (a spermiumképz ődés utolsó szakaszaiban és a spermiumok 
mellékherében zajló érése során) gyakorolt hatások észlelését. A vizsgálat befejezéséig, amikor a here és a mellékhere kórszövettani vizsgálata és a spermaparaméterek analízise tervezett, a P- és F
 1 -hímek legalább egy teljes 
spermiumképz ődési folyamaton át ki voltak téve a vizsgálat anyagnak ((6) 
(7) (8) (9) és OECD 151. iránymutatás (40)).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. A hímek párzás el őtti expozíciós forgatókönyvét módosítani lehet, ha a 
heretoxicitást (a spermatogenesis károsodása) vagy a spermiumok integritá ­
sára és funkciójára gyakorolt hatásokat a korábbi vizsgálatok már egyértel ­
műen beazonosították. Hasonlóképpen, a n őstények esetében a vizsgált 
vegyi anyagnak az ivari ciklusra és így a szexuális fogékonyságra gyakorolt 
ismert hatásai eltér ő párzás el őtti expozíciós forgatókönyveket támaszt ­
hatnak alá. Különleges esetekben elfogadható lehet, hogy a P-n őstények 
kezelése csak azután indul, hogy spermium-pozitív kenetet sikerült venni (lásd a 151. OECD iránymutatást (40)).
 
28. Ha a párzás el őtti adagolási id őszakot meghatároztuk, az állatokat heti hét 
napon át folyamatosan kell a vizsgált vegyi anyaggal kezelni, egészen a 
boncolásig. Valamennyi állatot ugyanazon a módon kell kezelni. Az adago ­
lást a kéthetes párzási id őszak alatt is folytatni kell, P-n őstények esetében a 
vemhesség és a szoptatás alatt is, egészen az elválasztás utáni elaltatásig. A 
hímeket azonos módon kell kezelni az elaltatásig, amelyre az F  1 -állatok 
elválasztásakor kerül sor. A boncolás tekintetében els őbbséget kell adni 
azoknak a n őstényeknek, amelyeket a szoptatás ugyanazon/hasonló napján 
kell felboncolni. A hímek boncolása több napra is áthúzódhat a laborató ­
rium lehet őségeitől függően. A kiválasztott F  1 -hímek és n őstények 
közvetlen adagolását az elválasztáskor kell megkezdeni – kivéve abban az esetben, ha azt már a szoptatás alatt megkezdték – és a tervezett boncolásig folytatni, a kohort feladatától függ ően.
 
29. A takarmánnyal vagy ivóvízzel adagolt vegyi anyagok esetében fontos 
annak biztosítása, hogy a vizsgált vegyi anyag beadott mennyisége nem 
zavarja meg a szokásos táplálékfelvételt vagy a vízháztartás egyensúlyát. Amennyiben a vizsgált vegyi anyagot a táplálékkal juttatják be, a táplálék ­
beli koncentrációt (ppm) vagy az állat testtömegére számított dózist kell 
állandó értéken tartani, és meg kell adni, hogy melyik alternatívát válasz ­
tottuk ki.
 
30. Ha a vizsgált vegyi anyagot szondán keresztül juttatják be, az egy 
időpontban beadott folyadék térfogata általában nem haladhatja meg az 1 
ml/100 g testtömeg értéket (0,4 ml/100 g testtömeg a maximum az olajok, 
pl. a kukoricaolaj esetében). Az irritáló vagy korróziót okozó vegyi anyagok 
kivételével, amelyek esetében a magasabb koncentrációk súlyosabb hatá ­
sokat okoznak, minimálisra kell csökkenteni a térfogatbeli eltéréseket, amihez a koncentrációt kell úgy beállítani, hogy minden dózisszinten 
állandó térfogatot lehessen biztosítani. A kezelésnek minden nap hasonló 
időpontban kell történnie. Az egyes állatoknak adott adagnak általában a 
legfrissebb egyedi testtömeg-mérésen kell alapulnia, és legalább hetente korrigálni kell a feln őtt hímek és a feln őtt, nem vemhes n őstények esetében, 
illetve minden második napon a vemhes n őstények és az F
 1 -állatok eseté ­
ben, ha az adagolásra az elválasztás el őtt és az elválasztás utáni 2 hétben 
kerül sor. Ha a TK-adatok azt mutatják, hogy a vizsgált vegyi anyag csak kis mértékben jut át a placentán, a vemhesség utolsó hetében mesterséges 
táplálással bejuttatott adagot esetleg módosítani kell, hogy megaka ­
dályozzuk az anyaállatokra túlságosan toxikus dózis beadását. A n őstények 
a fialás napján nem kezelhet ők gyomorszondán keresztül vagy bármely 
egyéb olyan módon, amelynek során az állatokat meg kell fogni; el őnyö­
sebb kihagyni a vizsgált vegyi anyag adagolását a fialás napján, mint 
megzavarni az ellés folyamatát.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Pároztatás  
31. A P-n őstényeket egyetlen, véletlenszer űen kiválasztott, nem rokon, azonos 
dóziscsoportból származó hímmel kell elhelyezni (1:1 párosítás), amíg páro ­
sodásra utaló bizonyíték nem észlelhet ő vagy amíg 2 hét el nem telik. 
Amennyiben nincs elegend ő hím, például a hím párosodás el őtti elhullása 
miatt, akkor a hím(ek)et, amelyek már párosodtak, második n őstény(ek)kel 
is párosítani lehet (1:1), hogy minden n őstény pároztatva legyen. A 
vemhesség 0. napja definíció szerint az a nap, amikor a párosodás tényét megerősítették (hüvelydugó vagy ondó figyelhet ő meg a n őstényben). Az 
állatokat a lehet ő leghamarabb el kell különíteni, ha párosodás utáni bizo ­
nyíték figyelhet ő meg. Ha a párosodás 2 hét alatt nem történik meg, az 
állatokat el kell különíteni a párosodás minden további lehet ősége nélkül. 
Az adatok között egyértelm űen fel kell tüntetni a pároztatott párokat.
 
Az alom mérete  
32. Az ellés utáni negyedik napon módosíthatjuk az egyes almok egyedszámát 
a létszám fölötti kölykök véletlenszer ű eltávolításával, hogy az eredmény – 
amennyire lehetséges – almonként öt hím és öt n őstény utód legyen. A 
kölykök szelektív, pl. a testtömeg alapján történ ő eltávolítása nem elfogad ­
ható. Ha a hím és n őstény utódok száma nem teszi lehet ővé a nemenként öt 
azonos nem ű utódot tartalmazó almok kialakítását, részleges kiegyenlítés is 
elfogadható (például hat hím és négy n őstény).  
A kölykök kiválasztása az elválasztás utáni vizsgálatokhoz (lásd az 1. 
ábrát)  
33. Az elválasztáskor (kb. PND 21) az összes rendelkezésre álló alomból 
csoportonként legfeljebb 20 kölyköt beválogatunk a további vizsgálatokhoz a dóziscsoportokba és a kontrollcsoportba, és a nemi érésig tartjuk őket 
(kivéve, ha korábbi vizsgálatra van szükség). A kölyköket véletlenszer űen 
választjuk ki, azzal a kivétellel, hogy a nyilvánvalóan csökött utódokat (az állatok testtömege több mint két szórással alatta van az adott alom átlagos tömegének) nem kell figyelembe venni, mivel nem valószín ű, hogy a keze ­
lési csoport reprezentatív képvisel ői lesznek.
 
A 21. posztnatális napon a kiválasztott F  1 -utódokat véletlenszer űen beso­
roljuk a három kohort egyikébe az alábbiak szerint:  
1. kohort (1.A és 1.B) = Reprodukciós/fejl ődési toxicitási vizsgálat,  
2. kohort (2.A és 2.B) = Fejl ődési neurotoxicitási vizsgálat,  
3. kohort = fejl ődési immunotoxicitási vizsgálat,  
1.A kohort: Egy hím és egy n őstény/alom/csoport (20/nem/csoport): priori ­
tást élvez ő kiválasztás a szaporítórendszerre gyakorolt hatások és az álta ­
lános toxicitás els ődleges értékeléséhez.  
1.B kohort: Egy hím és egy n őstény/alom/csoport (20/nem/csoport): priori ­
tást élvez ő kiválasztás a szaporodási teljesítményének az F  1 -állatok pároz ­
tatása útján történ ő nyomonkövetési értékeléséhez, amennyiben ezt is érté ­
kelik (lásd az OECD 117. iránymutatását (39)), valamint további kórszö ­
vettani adatok gy űjtéséhez reproduktív vagy endokrin toxikus anyagok 
gyanúja esetén, vagy ha az 1.A kohort eredményei kétesek.  
2.A kohort: Csoportonként összesen 20 kölyköt (10 hímet és 10 n őstényt 
csoportonként, egy hímet vagy egy n őstényt almonként) sorolunk be ideg ­
rendszeri vizsgálatra, amelyet a feln őttek idegkórszövettani értékelése követ.  
2.B kohort: Csoportonként összesen 20 kölyköt (10 hímet és 10 n őstényt 
csoportonként, egy hímet vagy egy n őstényt almonként) sorolunk be elvá ­
lasztáskori idegkórszövettani értékelésre (PND 21 vagy PND 22). Ha nincs 
elegendő állat, akkor az állatok 2.A kohortba történ ő besorolását kell 
előnyben részesíteni.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
3. kohort: Csoportonként összesen 20 kölyök (10 hím és 10 n őstény csopor ­
tonként; almonként egy állat, ha lehetséges). További kölykökre lehet 
szükség a kontrollcsoportból, hogy betöltsék a pozitív kontroll állatok szerepét a T-sejt függ ő antitest válasz vizsgálat (TDAR) során, amelyet 
PND 56 ± 3 kell elvégezni.
 
34. Ha nincs minden kohort kiszolgálásához elegend ő számú kölyök egy alom ­
ban, az 1. kohort els őbbséget élvez, hiszen azt ki lehet b ővíteni, hogy egy 
F 2 -generációt produkáljon. Különleges aggály esetén – például ha a vegyi 
anyag gyaníthatóan neuro-, immun- vagy reprodukciós toxicitást okoz – 
további kölyköket lehet rendelni bármelyik kohorthoz. Ezeket a kölyköket 
különböző időpontokban lehet vizsgálatokra vagy kiegészít ő végpontok 
értékelésére használni. A kohortokba nem sorolt kölyköket klinikai bioké ­
miai vizsgálatnak (55. bekezdés) és makroszkópos boncolásnak (68. bekez ­
dés) vetjük alá.  
A P állatok második pároztatása  
35. A P-állatok második pároztatása általában nem ajánlott, hiszen az implan ­
tációs helyek számára vonatkozó fontos adatok elvesztéséhez vezet (és így a 
posztimplantációs és perinatális veszteségadatok elvesztéséhez, amelyek a 
lehetséges teratogén potenciál mutatói) az els ő alom esetében. A vegyi 
anyagnak kitett n őstényekre gyakorolt valamely hatás vizsgálatára vagy 
tisztázására vonatkozó igényt az szolgálja jobban, ha a vizsgálatot kib ővítik, 
hogy magába foglalja az F  1 -generáció pároztatását is. A P-hímek második 
pároztatása kezeletlen n őstényekkel azonban mindig egy lehet őség abban az 
esetben, ha kétes leleteket kell tisztázni, vagy ha az els ő pároztatás során 
olyan termékenységre gyakorolt hatást figyeltek meg, amelynek további 
jellemzésére van szükség.  
MEGFIGYELÉSEK ÉL Ő ÁLLATBAN  
Klinikai megfigyelések  
36. A P- és a kiválasztott F  1 -állatok esetében naponta egyszer általános klinikai 
megfigyelést kell végezni. Ha az adagolás gyomorszondán keresztül törté ­
nik, a klinikai megfigyeléseket az adagolás el őtti és utáni id őpontra kell 
időzíteni (a csúcs plazmakoncentrációhoz társított toxicitás lehetséges jele ­
inek észlelése érdekében). A releváns viselkedésbeli változásokat, a nehéz vagy hosszan tartó ellés jeleit és a toxicitás minden tünetét rögzíteni kell a 
jegyzőkönyvben. Az állatokat naponta kétszer, illetve hétvégeken naponta 
egyszer meg kell vizsgálni súlyos toxicitás, megbetegedés és elhullás szem ­
pontjából.
 
37. Ezenkívül az összes P- és F  1 -állatot (elválasztás után) heti rendszerességgel 
részletesen meg kell vizsgálni, ami kényelmesen elvégezhet ő az állat méré ­
sekor, minimálisra csökkentve a kezeléssel járó stresszt. A megfigyeléseket gondosan kell végezni és a vizsgálati laboratórium által meghatározott pontozásos rendszerek segítségével kell rögzíteni. Törekedni kell arra, 
hogy a vizsgálati körülmények közötti különbségek minimálisak legyenek. 
A feljegyzett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a b őr, a szőrzet, 
a szemek és a nyálkahártyák állapota, a váladékok és kiválasztott anyagok előfordulása, valamint az autonóm aktivitás (például könnyezés, sz őrzet 
felborzolódása, pupillaméret, szokatlan légzési ritmusok) tekintetében 
megfigyelhet ő változásokra. A járás, a testtartás és a kézbevételre adott 
reakció megváltozását, valamint a klónusos vagy tónusos görcsök, sztere ­
otip viselkedés (például túlzott mosdás, megkergülés) vagy bármilyen bizarr 
viselkedésmód (például öncsonkítás, hátrafelé járás) megfigyelt eseteit is fel 
kell jegyezni.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Testtömeg és táplálék-/vízfogyasztás  
38. A kezelés els ő napján, majd azt követ ően legalább hetente egyszer meg kell 
mérni a P-állatok testtömegét. Ezenkívül a P-n őstényeket a szoptatás ideje 
alatt ugyanazokon a napokon kell lemérni, mint a saját almukban lév ő 
kölyköket (lásd a 44. bekezdést). Az F  1 -állatok tömegét egyenként kell 
megmérni az elválasztáskor (PND 21), azt követ ően pedig legalább hetente. 
A testtömeget azon a napon is rögzíteni kell, amikor az állatok elérik a 
pubertást (a fityma különválása befejez ődik vagy a hüvely átjárhatóvá 
válik). Minden állat tömegét megmérjük az elaltatáskor.  
39. A takarmány- és vízfogyasztást (amennyiben a vizsgált vegyi anyag beadása 
az ivóvízben történik) a vizsgálat alatt legalább hetente rögzíteni kell, 
ugyanazon a napon, amikor az állatok testtömegét is mérik (kivéve az 
együttes tartás id őszakát). Az F  1 -állatok ketrecenkénti takarmányfogyasz ­
tását a kohortba történ ő beválasztás id őpontjától kezdve hetente kell rögzí ­
teni. 
Ivari ciklus  
40. A korábbi ismételt dózisú toxicitási vizsgálatokból esetleg már rendelke ­
zésre állhatnak a vizsgált vegyi anyag ivari ciklusra gyakorolt hatásaival 
kapcsolatos el őzetes információk, amelyeket fel lehet használni a kib ővített 
egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat vizsgált vegyi anyagra 
szabott protokolljának megtervezése során. Az ivari ciklus (hüvelyi citoló ­
giával történ ő) értékelése általában a kezelési id őszak elején indul és a 
párzás meger ősítéséig vagy a kéthetes párzási id őszak végéig folytatódik. 
Ha a nőstényeket a kezelést megel őzően már megvizsgáltuk normál ivari 
ciklusra, akkor célszer ű a kezelés elindulása után is folytatni a kenetvételt, 
de ha a kezelés kezdetekor nem specifikus hatások lehet ősége merül fel 
(például a takarmányfogyasztás jelent ős csökkenése a vizsgálat elkezdése 
után), akkor az állatoknak a párosításhoz vezet ő kéthetes kenetvételi id őszak 
kezdete el őtt akár két hét id őt is lehet adni, hogy alkalmazkodjanak a 
kezeléshez. A n őstények kezelési id őszakának ily módon történ ő meghosz ­
szabbítása esetén (azaz ha a pároztatás el őtti kezelés 4 hetes lesz) megfon ­
tolandó fiatalabb állatok beszerzése és a hímek párosítás el őtti kezelésének 
meghosszabbítása. A hüvelyi/méhnyaki sejtek vétele során vigyázni kell 
arra, hogy ne sérüljön meg a nyálkahártya, és ne alakuljon ki ezáltal álvem ­
hesség (10) (11).  
41. A hüvelyi átjárhatóság kezdetét követ ően az 1.A kohortba tartozó F  1 -nősté­
nyek hüvelyi keneteit naponta kell megvizsgálni, amíg az els ő elszarusodott 
kenet fel nem jegyezzük, annak érdekében, hogy meghatározzuk a két 
esemény közötti id őintervallumot. Az 1.A kohortba sorolt F  1 -nőstények 
ivari ciklusát is meg kell figyelni a PND 75-t ől kezdve két héten keresztül. 
Ezenkívül, ha az F  1 -nemzedék pároztatására is szükség van, az 1.B 
kohortban hüvelyi citológiát kell végezni a párok kialakításának id őpontjától 
a párzásra utaló bizonyíték észleléséig.  
Pároztatás és vemhesség  
42. A szokásos végpontokon (pl. testtömeg, takarmányfogyasztás, klinikai 
megfigyelések, beleértve a mortalitás/morbiditás ellen őrzését) kívül a 
párok kialakításának id őpontját, valamint a megtermékenyítés és a fialás 
időpontját is rögzítjük és kiszámítjuk a prekoitális intervallumot (a párok 
kialakításától a megtermékenyítésig) és a vemhesség id őtartamát (a megter ­
mékenyítést ől a fialásig). A P-n őstényeket a várható fialás id őpontjában 
gondosan meg kell vizsgálni a nehéz ellésre utaló jelek szempontjából. A 
fészkelő viselkedés vagy a szoptatási teljesítmény bármilyen eltérését fel 
kell jegyezni.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. A nap, amelyen a fialás lezajlik, a 0. laktációs nap (LD 0) az anyaállat 
számára és a 0. posztnatális nap (PND 0) az utódok számára. Másik lehe ­
tőségként az összehasonlítások a posztkoitális id őn is alapulhatnak a 
vemhesség id őtartamában mutatkozó különbségek posztnatális fejl ődési 
adatokra gyakorolt zavaró hatásának megszüntetése érdekében, de a 
fialáshoz képest számított id őtartamokat is fel kell jegyezni. Ez különösen 
fontos abban az esetben, ha a vizsgált vegyi anyag hatással van a vemhesség id őtartamára.
 
Az utódok paraméterei  
44. Az ellés után minden almot a lehet ő leghamarabb meg kell vizsgálni (PND 
0 vagy 1) a kölykök számának és ivarának, a halvaszületések és élveszü ­
letések számának, valamint a makroszkópos rendellenességeknek a megálla ­
pítása céljából (küls őleg látható rendellenességek, beleértve a farkastorkot; a 
bőr alatti vérzést; a rendellenes b őrszínt vagy textúrát; a köldökzsinór jelen ­
létét; a tej hiányát a gyomorban; a beszáradt váladék jelenlétét). Ezenkívül 
az újszülöttek els ő klinikai vizsgálatának tartalmaznia kell a testh őmérséklet, 
az aktivitási állapot és a megfogásra adott reakció min őségi értékelését. A 0. 
posztnatális napon vagy egy kés őbbi időpontban elhullott kölykökben meg 
kell határozni az esetleges defektusokat és az elhullás okát. Az él ő köly­
köket meg kell számolni és egyenként meg kell mérni a 0. vagy 1. poszt ­
natális napon, majd azt követ ően rendszeresen, például legalább a PND 4, 
7, 14 és 21 napokon. Az állatok életkorának megfelel ő klinikai vizsgála ­
tokat az utódok testtömegének mérésekor meg kell ismételni, vagy gyak ­
rabban, ha eset-specifikus megállapításokat tettünk a születéskor. A feljegy ­
zett észleléseknek ki kell terjedniük többek között a küls ő rendellenes ­
ségekre, a b őr, a szőrzet, a szemek és a nyálkahártyák állapotára, a vála ­
dékok és kiválasztott anyagok el őfordulására, valamint az autonóm aktivi ­
tásra. A testtartás, a járás bizonytalansága, a kézbevétel, valamint a tónusos 
vagy klónusos görcsök, sztereotip viselkedés vagy bizarr viselkedésmód megfigyelt eseteit is fel kell jegyezni.
 
45. Az anogenitális távolságot (AGD) a kölykökben legalább egy alkalommal 
meg kell mérni PND 0 és PND 4 között. A kölykök testtömegét azon a 
napon kell megmérni, amikor az AGD-t is mérjük, és az AGD-t normálni 
kell a kölykök méretére, ami lehet őleg a testtömeg köbgyöke (12). A 12. 
vagy 13. posztnatális napon ellen őrizni kell a mellbimbók/bimbóudvar 
jelenlétét hím kölykökben.  
46. Minden kiválasztott F  1 -állatot naponta kell értékelni a makk-fityma külön ­
válás (hímek) vagy vaginális átjárhatóság (n őstények) szempontjából, amit 
ezeknek a végpontoknak a várható elérése el őtt kell megkezdeni, hogy 
észlelni lehessen, ha az állatok korábban érik el a szexuális érést. Fel kell jegyezni a nemi szervek minden rendellenességét, mint például a tartós vaginális filamentumot, hypospadiát vagy osztott hímvessz őt. Az F
 1 -állatok 
ivarérettségét a testi fejl ődéssel kell összehasonlítani az életkornak és a 
testsúlynak a makk és a fityma különválásakor (hímek) vagy a hüvely kinyílásakor (n őstény) történ ő meghatározásával (13).
 
A potenciális fejl ődési neurotoxicitás értékelése (2.A és 2.B kohort)  
47. A neurotoxicitási értékeléshez a 2.A kohort mindegyik kezelési csoportjából 
10 hím és 10 n őstény állatot és a 2.B kohort mindegyik kezelési csoport ­
jából 10 hím és 10 n őstény állatot kell használni (mindegyik kohort eseté ­
ben: almonként 1 hím vagy 1 n őstény, minden almot legalább 1 kölyöknek 
kell képviselnie; véletlenszer ű kiválasztás). A 2.A kohort állatait riasztó 
hanghatásoknak, funkcionális megfigyelési sorozatnak, motoros aktivitási 
(lásd a 48-50. bekezdést) és neuropatológiai értékeléseknek (lásd a 74–75. 
bekezdést) kell alávetni. Törekedni kell arra, hogy minimálisak legyenek a  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
kísérleti körülmények közötti eltérések és ne legyenek szisztematikus össze ­
függésben a kezeléssel. Változók, amelyek hatással lehetnek a viselkedésre: 
zajszint (pl. szakaszos zaj), h őmérséklet, páratartalom, világítás, szagok, 
napszak és zavaró környezeti tényez ők. A neurotoxicitási vizsgálatok ered ­
ményeit a megfelel ő történeti kontroll referencia tartományokhoz viszo ­
nyítva kell értelmezni. A 2.B kohort állatait neuropatológiai értékelésre 
kell használni a 21. vagy a 22. posztnatális napon (lásd a 74-75. bekezdést).  
48. A riasztó hanghatásokra adott választ a 24. posztnatális napon (± 1 nap) kell 
megvizsgálni a 2.A kohort állatainak felhasználásával. A vizsgálat napját ellensúlyozni kell a kezelt és a kontroll csoportokban. Minden szakasz 50 
vizsgálatból áll. A riasztó hanghatásokra adott választ vizsgáló tesztben meg 
kell határozni az átlagos válasz amplitúdóját a 10 vizsgálatból álló egyes blokkokban (5 blokk, egyenként 10-10 vizsgálattal), a vizsgálati feltételeket úgy optimalizálva, hogy azok tesztmenet alatti habituációt eredményez ­
zenek. Ezeknek az eljárásoknak összhangban kell lenniük a B.53 vizsgálati 
módszerrel (35).
 
49. Egy megfelel ő időpontban a PND 63 és a PND 75 között a 2.A kohort 
állatait egy funkcionális megfigyelési sorozatnak és a motoros aktivitást vizsgáló automatizált tesztnek vetjük alá. Ezeknek az eljárásoknak össz ­
hangban kell lenniük a B.43 (33) és a B.53 vizsgálati módszerrel (35). A 
funkcionális megfigyelési sorozat magában foglalja az állat megjelenésének, viselkedésének és funkcionális integritásának alapos leírását. Ezeket az állat ­
oknak az otthonul szolgáló ketrecben, illetve az állatok áthelyezése után egy 
standard megfigyel ő karámban (nyílt területen) – ahol az állatok szabadon 
mozognak – végzett megfigyelése, valamint manipulatív tesztek útján érté ­
keljük. A tesztelésben a legkevésbé interaktívtól a leginkább interaktív felé kell haladni. A megfigyelések listáját az 1. függelék mutatja be. Minden 
állatot alaposan képzett megfigyel őknek kell megvizsgálniuk, akik 
nincsenek tisztában az állat kezelési állapotával, és szabványosított eljárá ­
sokat használnak a megfigyel ői variabilitás minimalizálása érdekében. 
Amennyiben lehetséges, célszer ű, hogy ugyanaz a megfigyel ő értékelje az 
állatokat egy adott teszt során. Ha ez nem lehetséges, demonstrálni kell a 
megfigyel ők közötti megbízhatóságot. A viselkedési vizsgálatban szerepl ő 
valamennyi paraméter esetében egyértelm ű, operatív módon meghatározott 
skálákat és pontozási kritériumokat kell használni. Lehet őség szerint 
objektív mennyiségi méréseket kell kidolgozni azokhoz a megfigyelési 
végpontokhoz, amelyek szubjektív rangsorolást igényelnek. A motoros akti ­
vitás esetében minden állatot külön-külön kell tesztelni. A tesztnek elegen ­
dően hosszú ideig kell tartania ahhoz, hogy a kontrollok esetében demonst ­
rálni lehessen az tesztmenet alatti habituációt. A motoros aktivitást olyan 
automatizált aktivitásrögzít ő készülékkel kell monitorozni, amely egyaránt 
képes az aktivitás növekedésének és csökkenésének észlelésére (vagyis a kiindulási aktivitás az eszközzel mérve ne legyen olyan alacsony, hogy 
kizárja az aktivitás csökkenésének kimutatását, és ne legyen olyan magas, 
hogy kizárja az aktivitás növekedésének kimutatását). Minden eszközt be kell vizsgálni olyan standard eljárásokkal, amelyek a lehet ő legnagyobb 
mértékben garantálják a különböz ő eszközök folyamatos és megbízható 
működését. A kezelési csoportokat a lehetséges mértékben kiegyensúlyo ­
zottan kell szétosztani a készülékek között. A kezelési csoportokat ellensú ­
lyozni kell a tesztid őpontok között, hogy kiküszöbölhet ő legyen az aktivitás 
cirkadián ritmusának zavaró hatása.
 
50. Ha a meglév ő adatok azt mutatják, hogy egyéb funkcionális vizsgálatra is 
szükség van (pl. érzékszervi, szociális, kognitív), ezeket úgy kell beillesz ­
teni, hogy ne veszélyeztessék a vizsgálatban végzett egyéb értékelések integritását. Amennyiben ezeket a vizsgálatokat ugyanazokban az állatokban hajtják végre, amelyeket a standard riasztó hanghatások vizsgálata, a funk ­
cionális megfigyelési vizsgálat és a motoros aktivitás vizsgálata során is 
használtak, a különböz ő teszteket úgy kell ütemezni, hogy minimálisra 
csökkentsék annak a kockázatát, hogy veszélyeztessék ezeknek a teszteknek az integritását. A kiegészít ő eljárások különösen akkor lehetnek hasznosak, 
ha az empirikus megfigyelés, a várható hatások, illetve a hatásmechanizmus 
egy bizonyos típusú neurotoxicitásra utalnak.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
A potenciális fejl ődési immunotoxicitás értékelése (3. kohort)  
51. Az 56. posztnatális napon (± 3 nap) a 3. kohort mindegyik kezelési csoport ­
jának állatai közül 10 hímet és 10 n őstényt (almonként 1 hímet vagy 1 
nőstényt; minden almot legalább 1 kölyök képvisel; véletlenszer ű kiválasz­
tás) egy T-sejt dependens antitest válasz vizsgálatban, azaz egy T-sejt függ ő 
antigénre, mint például a birka vörövértestre (sheep red blood cells, SRBC), 
vagy a kulcslyuk csiga hemocianinra (keyhole limpet hemocianin, KLH) 
adott primer IgM antitestreakció vizsgálatban kell felhasználni, összhangban az aktuális immunotoxicitási vizsgálati eljárásokkal (14) (15). A választ a specifikus plakk-képz ő sejteknek (PFC) a lépben való megszámlálásával 
vagy az SRBC- vagy KLH-specifikus IgM antitestek szérumtiterének 
ELISA-val történ ő meghatározásával lehet kiértékelni, a csúcsválasz 
időpontjában. A válaszok általában négy (PFC válasz) vagy öt (ELISA) 
nappal az intravénás immunizálást követ ően adják a csúcsot. Abban az 
esetben, ha az els ődleges antitestválaszt a plakk-képz ő sejtek megszámolá ­
sával vizsgálják, megengedett, hogy az állatok alcsoportjait különböz ő 
napokon értékeljük, feltéve, hogy: az alcsoport immunizálását és elaltatását úgy időzítjük, hogy a PFC-ket a válasz csúcsán számolják meg; az alcso ­
portok azonos számú hím és n őstény utódot tartalmaznak minden dózis ­
csoportból, beleértve a kontrollokat is; és az alcsoportokat körülbelül ugyan ­
abban a posztnatális életkorban értékeljük.A vizsgált vegyi anyaggal való expozíció a lépeknek a PFC-válaszhoz való összegy űjtését vagy a széru ­
moknak az ELISA-vizsgálathoz való levételét megel őző napig folytatódik.
 
A lehetséges reprodukciós toxicitás nyomonkövet ő értékelése (1.B 
kohort)  
52. Az 1.B kohortba tartozó állatokat a 90. posztnatális napon túl is kezelés 
alatt lehet tartani, és pároztatni lehet, hogy F  2 -generációt állítsanak el ő, ha 
szükséges. Azonos dóziscsoportba tartozó hímeket és n őstényeket kell 
összeköltöztetni (elkerülve a testvérek párosítását), legfeljebb két hét id őtar­
tamra, amely a 90. posztnatális napon vagy azt követ ően kezdődhet, de a 
120. posztnatális napnál nem kés őbb. Az eljárások hasonlóak a P-állatoknál 
használt eljárásokhoz. A bizonyítékok súlya alapján azonban az almokat 
már a 4. posztnatális napon el lehet altatni ahelyett, hogy végigkövetnénk 
őket az elválasztásig vagy azon túl.  
MEGFIGYELÉSEK A VIZSGÁLAT LEZÁRÁSAKOR  
Klinikai biokémia/Hematológia  
53. A P-állatokban figyelemmel kell kísérni a szisztémás hatásokat. A vizsgálat 
lezárásakor éhgyomri vérmintát kell venni egy meghatározott helyr ől tíz 
véletlenszer űen kiválasztott P-hímb ől és -nőstényből dózicsoportonként, 
amelyet megfelel ő körülmények mellett kell tárolni, és részleges vagy teljes 
körű hematológiai, klinikai biokémiai, valamint T4- és TSH-vizsgálatnak 
vagy a vizsgált vegyi anyag ismert hatásprofilja által indikált egyéb vizs ­
gálatoknak kell alávetni (lásd az OECD 151. iránymutatását (40)). A vizs ­
gálati időszak végén a következ ő hematológiai paramétereket kell megvizs ­
gálni: hematokrit, hemoglobin-koncentráció, vörösvértest-szám, teljes és differenciált vérkép, trombocitaszám és véralvadási id ő/képesség. A 
vérplazma- és vérszérum-meghatározások során vizsgálandó elemek: vércu ­
kor, összkoleszterin, karbamid, kreatinin, összprotein, albumin és legalább 
két, a májsejti hatásokat jelz ő enzim (pl. alanin-aminotranszferáz, aszpartát- 
aminotranszferáz, alkalikus foszfatáz, gamma-glutamil-transzpeptidáz és szorbitol-dehidrogenáz). További enzimek vizsgálata és az epesavak mérése 
bizonyos körülmények között hasznos információkkal szolgálhat. Ezenkívül 
az összes állatból vért lehet venni és eltárolni egy kés őbbi időpontban 
végzendő esetleges analízis céljára, amely segítséget nyújthat a kétes 
hatások tisztázásában vagy a bels ő expozíciós adatok el őállításában. Ha a 
P-állatok második pároztatása nem szerepel a tervekben, akkor a vérmin ­
tákat az állatok ütemterv szerinti elpusztításakor végzett eljárás részeként
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
vagy közvetlenül azel őtt kell levenni. Abban az esetben, ha az állatokat 
megtartják, a vérmintákat néhány nappal az állatok második alkalommal 
történő pároztatása el őtt kell levenni. Annak az esetnek a kivételével, ha 
az ismételt dózisú vizsgálatokból származó adatok azt mutatják, hogy a vizsgált vegyi anyag nem befolyásolja a paramétert, az állatok elpusztítása 
előtt vizeletvizsgálatot kell elvégezni, és a következ ő paramétereket kell 
kiértékelni: makroszkópos megjelenés, mennyiség, ozmolalitás vagy fajsúly, pH-érték, fehérje, glükóz, vér és vérsejtek, sejttörmelék. A vizeletet a vizs ­
gált vegyi anyag és/vagy a metabolit(ok) kiválasztódásának monitorozására 
is lehet gy űjteni.
 
54. Az F  1 -állatokban is figyelemmel kell kísérni a szisztémás hatásokat. A 
vizsgálat lezárásakor éhgyomri vérmintát kell venni egy meghatározott helyről tíz véletlenszer űen kiválasztott 1.A kohort hímb ől és nőstényből 
dózicsoportonként, amelyet megfelel ő körülmények mellett kell tárolni, és 
standard klinikai biokémiai vizsgálatnak kell alávetni, beleértve a pajzs ­
mirigyhormonok (T4 és TSH) szérumszintjeinek értékelését, a hematológiát (teljes és differenciált leukocita- és vörösvértest-szám) és a vizeletvizsgála ­
tot.
 
55. A 4. posztnatális napon megmaradó kölyköket makroszkópos boncolásnak 
kell alávetni, és meg kell fontolni a szérum pajzsmirigyhormon (T4) koncentrációjának mérését. Szükség esetén az újszülött (PND 4) vért a 
biokémiai/pajzsmirigyhormon analízisekhez almonként egyesíteni lehet. A 
22. posztnatális napon makroszkópos boncolásnak alávetett választott köly ­
kökből (kohortokba be nem válogatott F
 1 -kölykök) is lehet vért gy űjteni a 
T4- és TSH-analízishez.  
Spermaparaméterek  
56. A sperma paramétereit minden P-generációs hímben mérni kell, kivéve, ha a 
meglévő adatok azt mutatják, hogy a sperma paraméterei nem változtak a 
90 napos vizsgálat során. A spermaparaméterek vizsgálatát minden 1.A 
kohort hímben el kell végezni.  
57. A vizsgálat végén a here és a mellékhere tömege minden P és F  1 (1.A 
kohort) hím esetében rögzítésre kerül. Legalább egy herét és egy mellék ­
herét félre kell tenni a kórszövettani vizsgálathoz. A fennmaradó mellék ­
herét a mellékhere farkában lév ő spermiumtartalék számszer űsítésére hasz ­
náljuk (16) (17). Ezen túlmen ően, a mellékhere farkából (vagy az ondóve ­
zetékből) spermiumokat kell gy űjteni olyan módszerekkel, amelyek mini ­
málisra csökkentik a spermiumok károsodását, amely zavarná a spermiumok 
motilitásának és morfológiájának értékelését (18).  
58. A spermiumok mozgékonyságát lehet közvetlenül az állat elpusztítása után 
értékelni vagy felvételt is lehet készíteni a kés őbbi analízishez. A fokozottan 
motilis spermiumok százalékos arányát meg lehet határozni szubjektív vagy 
objektív módon számítógép által támogatott mozgáselemzés segítségével 
(19) (20) (21) (22) (23) (24). A spermiumok morfológiájának értékeléshez mellékheréb ől (vagy ondóvezetékb ől) származó spermamintát kell megvizs ­
gálni fixált vagy nedves állapotban (25), és mintánként legalább 200 sper ­
miumot kell kategorizálni normál (fej és középrész/farok egyaránt normál) 
vagy kóros spermiumként. A morfológiai sperma-rendellenességek közé tartoznak például a fúzió, az izolált fejek és a torz fej és/vagy farok (26). A torz vagy nagy spermiumfej a spermiumképz ődés hibáira utalhat.
 
59. Ha a spermaminták le vannak fagyasztva, a kenetek le vannak fixálva és a 
spermiumok mozgékonyságának elemzését szolgáló felvételeket a boncolás időpontjában rögzítettük (27), a kés őbbi elemzést a kontroll és a magas 
dózissal kezelt hímekre lehet korlátozni. Ha azonban a kezeléssel össze ­
függő hatások figyelhet ők meg, a kisebb dózissal kezelt csoportokat is 
értékelni kell.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Makroszkópos boncolás  
60. A vizsgálat befejezésekor vagy id ő előtti elhullás esetén valamennyi P- és 
F 1 -állatban makroszkóposan meg kell vizsgálni az esetleges strukturális 
rendellenességeket vagy patológiás elváltozásokat. Külön figyelmet kell szentelni a szaporítószerveknek. Az elhullásközeli állapotba került és ezért humánus módon exterminált és az elpusztult kölyköket jegyz őkönyvezni 
kell, és a nem macerált kölykökben meg kell határozni az esetleges defek ­
tusokat és/vagy az elhullás okát, majd konzerválni kell őket.
 
61. A feln őtt P- és F  1 -nőstények esetében a boncolás napján meg kell vizsgálni 
a hüvelyi kenetet, hogy meghatározzuk az ivari ciklus szakaszát, és hogy lehetővé tegyük a korreláció felállítását a szaporítószervek kórszövettanával. 
A P-nőstények (és az F
 1 -nőstények, ha vannak ilyenek) méhében megvizs ­
gáljuk az implantációs helyek jelenlétét és számát, olyan módon, amely nem veszélyezteti a kórszövettani értékelést.
 
Szervtömeg és a szövetek meg őrzése – P és F  1 felnőtt állatok  
62. A vizsgálat befejezésének id őpontjában a testtömegeket és a megfelel ő 
kohortokba (az alábbiak szerint) tartozó valamennyi P- és F  1 -felnőtt állat 
alább felsorolt szerveinek nedves tömegét a lehet ő leghamarabb meg kell 
határozni, hogy a kimetszés utáni kiszáradás elkerülhet ő legyen. Ezeket a 
szerveket ezután megfelel ő körülmények között meg kell őrizni. Eltér ő 
rendelkezés hiányában a páros szerveket külön-külön vagy együtt is le 
lehet mérni, összhangban a vizsgálatot végz ő laboratórium általános gyakor ­
latával.  
— méh (petevezetékekkel és méhnyakkal), petefészkek,  
— here, mellékhere (teljes és cauda a spermiumszám meghatározásához 
használt mintákhoz),  
— prosztata (dorzolaterális és ventrális részek együtt). A prosztata és a 
kapcsolódó szervek megtisztítása során ügyelni kell arra, hogy ne 
szúrjuk át a folyadékkal teli ondóhólyagokat. Ha kezeléssel összefügg ő 
hatás mutatkozik a prosztata teljes tömegében, a fixálás után a dorzo ­
laterális és ventrális szegmenseket gondosan szét kell választani, és külön-külön le kell mérni,
 
— ondóhólyagok a koaguláló mirigyekkel és váladékukkal (egy egység ­
ként),  
— agy, máj, vese, szív, lép, csecsem őmirigy, agyalapi mirigy, pajzsmirigy 
(fixálás után), mellékvesék és ismert célszervek vagy -szövetek.  
63. A fent felsorolt szervek mellett a perifériás ideg-, az izom-, a gerincvel ő-, a 
szem- és látóideg-, az emészt őrendszer-, a húgyhólyag-, a tüd ő-, a légcső- (a 
pajzsmiriggyel és a mellékpajzsmiriggyel), a csontvel ő-, az ondóvezeték- 
(hímek), az eml őmirigy- (hímek és n őstények), és a hüvelymintákat 
megfelelő körülmények között meg kell őrizni.  
64. Az 1.A kohort állatainak minden szervét meg kell mérni és meg kell őrizni 
a kórszövettani vizsgálathoz.  
65. A pre- és posztnatálisan kiváltott immunotoxikus hatások vizsgálatához az 
1.A kohort mindegyik kezelési csoportjából 10 hím és 10 n őstény állatot 
(almonként 1 hím vagy 1 n őstény; minden almot legalább 1 kölyöknek kell 
képviselnie; véletlenszer ű kiválasztás) a következ ő vizsgálatoknak kell 
alávetni az elaltatáskor:  
— az expozíciós útvonalhoz kapcsolódó és attól távoli területr ől származó 
nyirokcsomók lemérése (a mellékvese mirigyek, a csecsem őmirigy és a 
lép tömege mellett, amelyeket már valamennyi 1.A kohort állaton 
megmértek),  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— a lép-limfocita alcsoport analízise (CD4+ és CD8+ T-limfociták, 
B-limfociták, természetes öl ősejtek) a lép egyik felének felhasználásá ­
val, a lép másik felét a kórszövettani értékeléshez konzerváljuk.  
A lép-limfocita szubpopulációk nem immunizált (1.A kohort) állatokban 
történő elemzése meghatározza, hogy az expozíció összefügg-e a „segít ő” 
(CD4+) vagy citotoxikus (CD8+) thymus-eredet ű limfociták vagy termé ­
szetes ölősejtek (NK) (gyors válasz neoplasztikus sejtekre és kórokozókra) 
immunológiai egyensúlyi eloszlásának eltolódásával.  
66. A 1.B kohort állatok esetében a következ ő szerveket kell megmérni és a 
megfelelő szöveteib ől blokkokat készíteni:  
— vagina (nem mért),  
— méh a méhnyakkal,  
— petefészkek,  
— here (legalább egy),  
— mellékherék,  
— ondóhólyag és koaguláló mirigyek,  
— prosztata,  
— agyalapi mirigy,  
— azonosított célszervek.  
Az 1.B kohort kórszövettani értékelését akkor kell elvégezni, ha az 1.A 
kohort eredményei kétesek, illetve szaporodási vagy endokrin mérgez ő 
anyagok gyanúja merül fel.  
67. 2.A és 2.B kohort: Fejl ődési neurotoxicitási vizsgálat (PND 21 vagy PND 
22 és feln őtt utód). A 2.A kohort állatokat a viselkedési teszt után el kell 
altatni, az agytömegeket fel kell jegyezni és teljes idegkórszövettani vizs ­
gálatot kell végezni a neurotoxicitás értékelése céljából. A 2.B kohort állat ­
okat a 21. vagy 22. posztnatális napon el kell altatni, az agytömegeket fel kell jegyezni és az agyakat mikroszkóppal meg kell vizsgálni a neurotoxi ­
citás értékelése céljából. A 2.A kohortba tartozó állatoknál el őírás a perfú ­
ziós fixálás, ami választható a 2.B kohortba tartozó állatok esetében, amint 
azt a B.53 vizsgálati módszer el őírja (35).
 
Szervtömeg és a szövetek meg őrzése – F  1 elválasztott állatok  
68. A kohortokba be nem válogatott kölyköket, beleértve a csökött egyedeket, 
az elválasztás után a 22. posztnatális napon el kell altatni, kivéve, ha az 
eredmények azt mutatják, hogy él ő állatokban végzend ő további vizsgála ­
tokra van szükség. Az elaltatott kölykökön makroszkópos boncolást kell végezni, beleértve a szaporítószervek értékelését a 62. és 63. bekezdésben leírtak szerint. Annyi alomból, amennyib ől csak lehetséges, nemenként és 
csoportonként legfeljebb 10 kölyök esetében meg kell mérni az agy, a lép 
és a csecsem őmirigy tömegét, és megfelel ő körülmények között meg kell 
őrizni ezeket a szerveket. Ezenkívül ezeknek a hím és n őstény kölyköknek 
az emlőszöveteit meg lehet őrizni további mikroszkópos elemzés céljára (
 1 ) 
(lásd az OECD 151. iránymutatását (40)). A makroszkópos rendellenes ­
ségeket és a célszöveteket meg kell őrizni az esetleges szövettani vizsgálat 
céljából.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) A kutatások kimutatták, hogy az eml őmirigy, különösen az eml őmirigy fejl ődésének az 
élet korai szakaszában zajló fázisában, az ösztrogénaktivitás érzékeny végpontja. Ajánlott 
a vizsgálati módszerbe olyan végpontok beillesztése, amelyek a mindkét nemhez tartozó 
kölykök eml őmirigyét érintik, ha validálták ezeket.
 Kórszövettan – P-állatok  
69. A 62. és 63. bekezdésben felsorolt szervek teljes kórszövettani vizsgálatát 
minden magas dózissal kezelt és kontroll P-állatban el kell végezni. A 
kezeléssel összefügg ő változásokat mutató szerveket az alacsonyabb dózis ­
csoportokba tartozó állatokban is meg kell vizsgálni a NOAEL meghatá ­
rozása érdekében. El kell végezni továbbá valamennyi olyan állat szaporí ­
tószerveinek kórszövettani vizsgálatát, amelyek gyaníthatóan csökkent 
termékenységgel bírnak, így például azok esetében, amelyek nem tudtak párzani, megfoganni, utódokat nemzeni vagy egészséges utódokat a világra hozni, vagy amelyeknél az ivari ciklusra vagy a spermiumok számára, 
motilitására vagy morfológiájára gyakorolt hatásokat észleltünk, és vala ­
mennyi makroszkópos elváltozást is kórszövettani vizsgálatnak kell alávetni.
 
Kórszövettan – F  1 -állatok  
Az 1. kohort állatai  
70. A 62. és 63. bekezdésben felsorolt szervek teljes kórszövettani vizsgálatát 
minden magas dózissal kezelt és kontroll feln őtt 1.A kohort állatban el kell 
végezni. Az almokat legalább nemenként 1 kölyöknek kell képviselni. A kezeléssel összefügg ő változásokat és makroszkópos léziókat mutató szer ­
veket és szöveteket az alacsonyabb dóziscsoportokba tartozó állatokban is 
meg kell vizsgálni a NOAEL meghatározása érdekében. A limfoid szer ­
vekre pre- és posztnatális korban gyakorolt hatások értékeléséhez az össze ­
gyűjtött nyirokcsomók és csontvel ő kórszövettani vizsgálatát is el kell 
végezni az 1.A kohortba tartozó 10 hím és 10 n őstény állaton, a csecsem ő­
mirigy, a lép és a mellékvesék 1A állatokban már elvégzett kórszövettani értékelése mellett.
 
71. Szaporodási vagy endokrin mérgez ő anyagok gyanúja esetén az 1.B 
kohortba tartozó valamennyi állatnak a 66. bekezdésben leírt blokk álla ­
potba feldolgozott szaporodási és endokrin szövetein kórszövettani vizs ­
gálatot kell végezni. Az 1.B kohorton szintén szövettani vizsgálatot kell végezni, ha az a 1.A kohort eredményei kétesek.
 
72. A feln őtt nőstények petefészkeinek tüsz őkezdeményeket és növekv ő tüsző­
ket, valamint sárgatesteket is kell tartalmaznia; ezért a kórszövettani vizs ­
gálatnak az F  1 -nőstényekben a tüsz őkezdemények és a kis fejl ődő tüszők, 
valamint a sárgatestek mennyiségi értékelését kell céloznia; az állatok számának, a petefészek-szekció kiválasztásának, valamint a szekcióból vett minta méretének statisztikailag megfelel őnek kell lennie az alkalmazott 
értékelési eljáráshoz. A tüsz őket először a kontroll és a nagy dózissal kezelt 
állatokban lehet megszámlálni, és abban az esetben, ha káros hatást észlelnek az utóbbiban, az alacsonyabb dózissal kezelt állatokat is meg kell vizsgálni. A kezelt és kontroll petefészkek összehasonlításához a vizs ­
gálatoknak ki kell terjedniük a tüsz őkezdemények összeszámlálására, 
amelyekhez hozzá lehet venni a kis növekv ő tüszőket is (lásd az OECD 
151. iránymutatását (40)). A sárgatestek értékelését az ivari ciklus vizsgála ­
tával párhuzamosan kell elvégezni, hogy a ciklus szakaszát figyelembe 
lehessen venni az értékelés során. A petevezetéket, a méhet és a hüvelyt 
a szervre jellemz ő megfelel ő fejlődés szempontjából is megvizsgáljuk.
 
73. A herék részletes szövettani vizsgálatát az F  1 -hímeken végezzük el, hogy 
azonosítsuk a here differenciálására és fejl ődésére, valamint a spermatoge ­
nezisre gyakorolt kezeléssel összefügg ő hatásokat (38). Amennyiben lehet ­
séges, a rete testis részeit is meg kell vizsgálni. A mellékhere fejét, testét és 
farkát, valamint az ondóvezetéket a szervre jellemz ő megfelel ő fejlődés, 
valamint a P-hímeknél szükséges paraméterek szempontjából vizsgáljuk.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
A 2. kohort állatai  
74. A 2.A kohort valamennyi magas dózissal kezelt és kontroll állatán nemen ­
ként idegkórszövettani vizsgálatot végzünk az idegrendszeri vizsgálat befe ­
jezését követ ően (PND 75 után, de nem kés őbb, mint PND 90). Az agy 
kórszövettani vizsgálatát a 2.B kohort minden magas dózissal kezelt és 
kontroll állatán nemenként a 21. vagy 22. posztnatális napon végezzük el. A kezeléssel összefügg ő változásokat mutató szerveket vagy szöveteket az 
alacsonyabb dóziscsoportokba tartozó állatokban is meg kell vizsgálni a 
NOAEL meghatározása érdekében. A 2.A és 2.B kohortba sorolt állatok 
esetében az agy több metszetét is megvizsgáljuk a szaglóhagymák, cereb ­
rális cortex, hippocampus, bazális ganglionok, thalamus, hypothalamus, 
középagy (tectum, tegmentum, és agyi pedunculusok), agytörzs és a kisagy 
vizsgálata érdekében. Kizárólag a 2.A kohort esetében a szemeket (retina és látóideg) és a perifériás ideg-, izom- és a gerincvel őmintákat is megvizs ­
gáljuk. Ezeknek az idegkórszövettani eljárásoknak összhangban kell lenniük 
a B.53 vizsgálati módszerrel (35).
 
75. A morfometriai (kvantitatív) értékeléseket az agy reprezentatív területein 
(megbízható mikroszkopikus tájékozódási pontok alapján gondosan kivá ­
lasztott homológ szakaszok) kell végezni, és ezek az értékelések magukban foglalhatják a specifikus agyi régiók lineáris és/vagy területi méréseit is. 
Legalább három egymást követ ő metszetet kell készíteni minden tájékozó ­
dási pontnál (szint), hogy kiválasztható legyen az adott értékelend ő agyi 
terület leginkább homológ és reprezentatív metszete. A kórboncnoknak megfelelő döntést kell hoznia, hogy a mérésre el őkészített metszetek homo ­
lógok-e a mintakészlet egyéb metszeteivel, és így alkalmasak-e a beváloga ­
tásra, hiszen különösen a lineáris mérések viszonylag rövid távolságon belül is változhatnak (28). A nem homológ metszetek használata tilos. Bár a cél az, hogy az erre a célra fenntartott valamennyi állatból (10/nem/dózisszint) 
mintát vegyünk, kisebb állatszámok is elegend ők lehetnek. A nemenként és 
dózisszintenként kevesebb mint 6 állatból származó minta azonban általában nem tekinthet ő elégségesnek ehhez a vizsgálati módszerhez. Sztereológiát 
lehet használni a kezelések egyes paraméterekre, mint például bizonyos 
neuroanatómiai régiók térfogatára vagy sejtjeinek számára gyakorolt hatá ­
sainak azonosítására. A szövetminták el őkészítésének valamennyi lépése 
során, a szövetek fixálásától kezdve a szövetminták kimetszésén és a szövetek feldolgozásán át a metszetek festéséig, kiegyensúlyozott elrende ­
zést kell alkalmazni úgy, hogy minden tételnek minden dóziscsoportból kell 
reprezentatív mintákat tartalmaznia. Ha morfometriai vagy sztereológiai elemzést kell végezni, az agyszöveteket minden dózisszinten egyidej űleg 
kell a megfelel ő közegbe ágyazni annak érdekében, hogy elkerüljük a 
zsugorodási m űtermékek kialakulását, amelyek a fixálószerben való 
hosszabb tároláshoz társulhatnak.
 
JEGYZŐKÖNYVEZÉS  
Adatok  
76. Az adatokat külön-külön és táblázatos formában összefoglalva is be kell 
mutatni. Szükség esetén minden vizsgálati csoport és generáció esetében a 
következőket kell jegyz őkönyvezni: az állatok száma a vizsgálat kezdetekor, 
a vizsgálat során elpusztult vagy humánus okokból elpusztított állatok száma, minden elhullás vagy humánus elpusztítás id őpontja, a termékeny 
állatok száma, a vemhes n őstények száma, az almokat ell ő nőstények 
száma, a toxicitás jeleit mutató állatok száma. A toxicitás leírását is jegy ­
zőkönyvezni kell, beleértve kezdetének idejét, id őtartamát és súlyosságát.
 
77. A számszer ű eredményeket megfelel ő és elfogadott statisztikai módszerrel 
kell értékelni. A statisztikai módszereket a vizsgálati elrendezés részeként 
kell kiválasztani, és megfelel ően kell kezelni a nem normális adatokat (pl. 
számlálási adatok), a cenzúrázott adatokat (pl. korlátozott megfigyelési id ő), ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
a nem függetlenséget (pl. az alom hatásai és az ismételt mérések) és a nem 
egyenlő varianciákat. Az általánosított lineáris kevert modellek és a dózis- 
válasz modellek az e vizsgálati módszer által generált adatok elemzéséhez megfelelő elemzési eszközök széles körét lefedik. A jegyz őkönyvnek 
elegendő információt kell tartalmaznia az alkalmazott elemzési módszerrel 
és számítógépes programmal kapcsolatban ahhoz, hogy egy független bíráló 
vagy statisztikus értékelhesse vagy újraértékelhesse az elemzést.
 
Az eredmények értékelése  
78. A vizsgálat eredményeit a megfigyelt hatások, ezen belül a boncolási és 
mikroszkópos eredmények szempontjából kell értékelni. Az értékelésnek tartalmaznia kell a kapcsolatot, vagy annak hiányát, a dózis és a rendelle ­
nességek – beleértve a makroszkópos léziókat – jelenléte, el őfordulása és 
súlyossága között. A célszerveket, a termékenységet, a klinikai tüneteket, a reprodukciós és alomteljesítményt, a testtömeg változásait, a mortalitást és minden más toxikológiai és fejl ődési hatást is értékelni kell. Különös 
figyelmet kell fordítani az ivarspecifikus változásokra. A vizsgálati eredmé ­
nyek értékelésekor figyelembe kell venni a vizsgált vegyi anyag fizikai-kémiai tulajdonságait és az esetlegesen rendelkezésre álló toxikoki ­
netikai adatokat, beleértve a placentán át történ ő transzfert és a tejbe történ ő 
kiválasztódást is.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
79. A vizsgálati jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell a jelen vizsgálatban a P-, F  1 - 
és – adott esetben – F  2 -állatokból gy űjtött következ ő információkat:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— a vizsgált vegyi anyag kémiai, toxikokinetikai és toxikodinamikai tulaj ­
donságaira vonatkozó valamennyi rendelkezésre álló információ,  
— azonosító adatok,  
— tisztaság.  
Vivőanyag (ha van):  
— a vivőanyag megválasztásának indokolása, ha az nem víz.  
Kísérleti állatok:  
— felhasznált faj/törzs,  
— az állatok száma, kora és neme,  
— származás, tartási körülmények, takarmány, fészekrakó anyagok stb.,  
— az egyes állatok testtömege a vizsgálat kezdetekor,  
— a P-n őstények hüvelykenet-adatai a kezelés megkezdése el őtt (ha az 
adatok összegy űjtése megtörtént ebben az id őpontban),  
— a P-generáció párosításának nyilvántartása, megadva a hím és n őstény 
partnereket és a pároztatás sikeressége,  
— a feln őtt F  1 -állatok származási almának nyilvántartása.  
Vizsgálati körülmények:  
— az adagolási szintek megválasztásának indoklása,  
— a vizsgált vegyi anyag formulázásával/a táplálék el őkészítésével, az elért 
koncentrációval kapcsolatos információk,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— a készítmény stabilitása és homogenitása a viv őanyagban vagy hordo ­
zóban (pl. takarmány, ivóvíz), a vérben és/vagy a tejben a felhasználás 
és a felhasználások között tárolás feltételei mellett,  
— a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,  
— átszámítás a vizsgált vegyi anyagnak a takarmányban/ivóvízben 
meglévő koncentrációjáról (ppm) a tényleges dózisra (mg/testtömeg 
kg/nap), ha alkalmazható,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok (ezen belül a takar ­
mány összetétele, ha rendelkezésre áll),  
— a randomizálási eljárások részletes leírása, amelyeket a kölykök selejte ­
zésre történ ő kiválasztására és a kezelési csoportokba való besorolására 
használtak,  
— környezeti feltételek,  
— a vizsgáló személyzet listája, beleértve a szakmai képzéseket.  
Eredmények (összefoglaló és egyéni adatok, nemek és adagolás szerint):  
— a P- és F  1 -állatok takarmányfogyasztása, vízfogyasztása (ha rendelke ­
zésre áll), takarmányhasznosítása (egy gramm elfogyasztott takarmányra 
eső testtömeg-gyarapodás, kivéve az együttélés és a szoptatás id ősza­
kát), vizsgált vegyi anyag fogyasztása (takarmányban/ivóvízben történ ő 
adagolás esetén),  
— felszívódási adatok (ha vannak),  
— resttömeg adatok a P-generációnál,  
— a kiválasztott F  1 -állatok testtömeg adatai az elválasztás után,  
— a vizsgálat során bekövetkez ő elhullás id őpontja, illetve hogy az állatok 
életben maradtak-e az exterminálásig,  
— a klinikai megfigyelések jellege, súlyossága és id őtartama (a változások 
visszafordíthatók-e vagy sem),  
— hematológia, vizeletvizsgálat és klinikai kémiai adatok, beleértve a 
TSH- és T4-értékeket,  
— a lépsejtek fenotípusos elemzése (T-, B-, NK-sejtek),  
— csontvel ő cellularitás,  
— toxikus reakcióra vonatkozó adatok,  
— normális vagy abnormális ivari ciklust mutató P- és F  1 -nőstények száma 
és a ciklus id őtartama,  
— párzásig eltelt id ő (prekoitális intervallum, a párosítás és a párzás közötti 
napok száma),  
— a szaporodásra gyakorolt toxikus és más hatások, beleértve azoknak az 
állatoknak számát és százalékos arányát, amelyeknél megvalósult a 
párzás, a vemhesség, a fialás és a szoptatás, azoknak a hímeknek a 
számát és százalékos arányát, amelyek vemhességet váltottak ki, azoknak a n őstényeknek a számát és százalékos arányát, amelyek dysto ­
cia/elhúzódó vagy nehéz ellés jeleit mutatták,
 
— a vemhesség és – ha rendelkezésre áll – a fialás id őtartama,  
— a beágyazódások száma, az alom nagysága és a hím kölykök aránya,  
— a beágyazódás utáni veszteségek, az élveszületések és halvaszületések 
száma és százalékos aránya,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— az alom tömege és a kölykök tömege (hímek, n őstények és kombinált), 
a csökött egyedek száma, ha megállapításra került,  
— a szemmel látható rendellenességeket mutató kölykök száma,  
— az utódokra, a születés utáni növekedésre, az életképességre gyakorolt 
toxikus és egyéb hatások stb.,  
— a fizikai tájékozódási pontokra vonatkozó adatok kölykökben és egyéb 
posztnatális fejl ődési adatok,  
— az F  1 -állatok nemi érésére vonatkozó adatok,  
— adott esetben a kölykökben és feln őtt állatokban végzett funkcionális 
megfigyelésekkel kapcsolatos adatok,  
— resttömeg az elaltatáskor, valamint a P- és feln őtt F  1 -állatok abszolút és 
relatív szervtömegadatai,  
— boncolási eredmények,  
— az összes kórszövettani lelet részletes ismertetése,  
— teljes ondósejtszám a mellékhere farki részében, az el őrehaladó mozgást 
végző ondósejtek százalékos aránya, morfológiailag normál ondósejtek 
százalékos aránya és az azonosított rendellenességet mutató ondósejtek 
százalékos aránya a P- és F  1 -hímekben,  
— adott esetben a P- és F  1 -nőstények petefészkeiben található tüsz ők 
száma és érési szakaszai,  
— a sárgatestek száma az F  1 -nőstények petefészkeiben,  
— adott esetben az eredmények statisztikai feldolgozása.  
A 2. kohort paraméterei:  
— a megfigyelések és eljárások szabványosítására használt eljárások, vala ­
mint a megfigyelések pontozására szolgáló operatív definíciók részletes 
leírása,  
— az alkalmazott vizsgálati eljárások listája, alkalmazásuk indoklásával,  
— az alkalmazott viselkedési/funkcionális, neuropatológiai és morfometriás 
eljárások részletei, beleértve az automatizált eszközökre vonatkozó információkat és adatokat,
 
— az eszközök kalibrálását szolgáló és egyenérték űségüket biztosító, illetve 
a kezelési csoportoknak a vizsgálati eljárásokban való kiegyensúlyozását biztosító eljárások,
 
— a szakmai megítélést igényl ő bármilyen döntés rövid indoklása,  
— a viselkedési, funkcionális, neuropatológiai és morfometriás eredmények 
részletes leírása nemek és dóziscsoportok szerint, beleértve a kontr ­
ollokhoz viszonyított növekedést és csökkenést,  
— agytömeg,  
— a neurológiai tünetekb ől és léziókból levezetett diagnózisok, beleértve a 
természetesen el őforduló betegségeket vagy állapotokat,  
— a példaérték ű leletekről készült képek,  
— a morfometriára használt metszetek homológ voltának értékelésére szol ­
gáló kis nagyítású képek,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— az eredmények statisztikai feldolgozása, beleértve az adatok és az ered ­
mények elemzésére használt statisztikai modelleket, függetlenül attól, 
hogy szignifikánsak voltak-e vagy sem,  
— bármely más toxikus hatás és a vizsgált vegyi anyag neurotoxicitási 
potenciáljával kapcsolatban levont következtetések kapcsolata nemen ­
ként és csoportonként,  
— a toxikokinetikai információk hatása a következtetésekre,  
— a vizsgálati módszer megbízhatóságát és érzékenységét alátámasztó 
adatok (azaz a pozitív és a történeti kontroll adatok),  
— a neuropatológiai és funkcionális hatások közötti kapcsolatok, ha 
vannak ilyenek,  
— NOAEL vagy benchmark dózis az anyaállatok és az utódok esetében, 
nemenként és dóziscsoportonként,  
— az adatok értelmezésének diszkussziója az eredmények alapján, bele ­
értve azt a következtetést, hogy a vizsgált vegyi anyag okozott-e fejl ő­
dési neurotoxicitást vagy nem, valamint a NOAEL-t.  
A 3. kohort paraméterei:  
— a szérum IgM-antitest titere (SRBC- vagy KLH-szenzitizáció), vagy a 
lép IgM PFC-egységek (SRBC-szenzitizáció),  
— a TDAR-módszer teljesítményét a laboratóriumi optimalizálási folyamat 
részeként igazolni kell a vizsgálat els ő alkalommal való felállításakor, 
illetve rendszeresen (pl. évente) minden laboratóriumban,  
— az adatok értelmezésének diszkussziója az eredmények alapján, bele ­
értve azt a következtetést, hogy a vizsgált vegyi anyag okozott-e fejl ő­
dési immunotoxicitást vagy nem, valamint a NOAEL-t.  
Az eredmények tárgyalása  
Következtetések, ezen belül a szül ői és utódhatásokra vonatkozó 
NOAEL-értékek  
Rendelkezésre kell bocsátani minden olyan információt is, amelyet nem a 
vizsgálat során gy űjtöttek, de hasznos lehet az eredmények értelmezéséhez 
(pl. a hatások hasonlósága bármely ismert neurotoxikus anyaghoz).  
Az eredmények értelmezése  
80. A kib ővített egygenerációs reprodukciós toxicitási vizsgálat információkkal 
szolgál valamely vegyi anyagnak a szaporodási ciklus összes fázisában történő, ismételt expozíciója hatásairól, szükség szerint. A vizsgálat külö ­
nösen a szaporítórendszerrel, valamint az utódok fejl ődésével, növekedésé ­
vel, túlélésével és funkcionális végpontjaival kapcsolatban ad információkat 
a 90. posztnatális napig.
 
81. A vizsgálat eredményeinek értelmezésekor figyelembe kell venni a vegyi 
anyagról rendelkezésre álló összes információt, beleértve a fizikai-kémiai, valamint toxikokinetikai és toxikodinamikai tulajdonságokat, a szerkezeti 
analógokra vonatkozó lényeges információkat, és a vizsgált vegyi anyaggal 
korábban végzett toxicitási vizsgálatok eredményeit (pl. akut toxicitás, ismé ­
telt alkalmazás utáni toxicitás, mechanisztikus vizsgálatok, illetve az azt értékelő vizsgálatok, hogy vannak-e a fajok között jelent ős mennyiségi és 
minőségi különbségek az  in vivo/in vitro  metabolikus tulajdonságokban). 
Amennyiben megoldható, a makroszkópos boncolási eredményeket és a szervtömeg-adatokat a más, ismételt dózisú vizsgálatokban tett megfigyelé ­
sekkel összefüggésben kell értékelni. Az utódok növekedésének csökkenését 
a vizsgált vegyi anyagnak a tej összetételére gyakorolt hatásával kapcso ­
latban is lehet értelmezni (29).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
2. kohort (fejl ődési neurotoxicitás)  
82. Az idegrendszeri és neuropatológiai eredményeket az összes megállapítás 
összefüggésében kell értelmezni, az adatok bizonyító erején alapuló 
megközelítést szakért ői megítéléssel kombinálva. A viselkedési vagy morfo ­
lógiai eredmények mintázatait, ha vannak ilyenek, valamint a dózis-válaszra utaló bizonyítékokat meg kell vitatni. A fejl ődési neurotoxicitás értékelését 
bele kell foglalni ebbe a jellemzésbe, beleértve az emberi epidemiológiai 
vizsgálatokat vagy esettanulmányokat, illetve az állatkísérleteket (pl. toxi ­
kokinetikai adatok, szerkezet-hatás információk és egyéb toxicitási vizs ­
gálatok adatai). Az adatok értékelésének tartalmaznia kell a biológiai és a 
statisztikai szignifikancia diszkusszióját. Az értékelésnek tartalmaznia kell a 
kapcsolatot – ha van ilyen – a megfigyelt neuropatológiai és viselkedési változások között. A fejl ődési neurotoxicitási eredmények értelmezésével 
kapcsolatos iránymutatásért lásd a B.53 vizsgálati módszert (35) és a Tyl 
et al., 2008 publikációt (31).
 
3. kohort (fejl ődési immunotoxicitási vizsgálat)  
83. Az immunrendszer m űködésének TDAR-módszerrel (T-sejt dependens anti ­
test válasz) mért gátlását vagy serkentését az összes észrevétel összefüggé ­
sében kell értékelni. A TDAR eredményének jelent őségét az immunológiai 
kapcsolódású mutatókra (pl. a csontvel ő cellularitása, a limfoid szövetek 
tömege és kórszövettana, a limfocita-alcsoportok eloszlása) gyakorolt 
egyéb hatások is alátámaszthatják. A TDAR által megállapított hatások 
kevésbé értelmezhet ők lehetnek, ha alacsonyabb expozíciós koncentráci ­
óknál egyéb toxikus tüneteket figyeltek meg.  
84. A reprodukciós és neurotoxicitási eredmények értelmezésével kapcsolatban 
az OECD 43. iránymutatását kell alkalmazni (26).  
SZAKIRODALOM  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to LIFE Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69-98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530- 536.
 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.  
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Rese ­
arch to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicological 
Sciences , 49, 1-4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293-327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356-369.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1-21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408-415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84-97.  
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383-390.
 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298-303.  
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9-19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23-35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92-108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103-107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39-44.  
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237- 244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267-273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409-421.  
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 449- 
458. ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. 
pp. 319-333.  
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401-415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491-505.  
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.  
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330-337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296-313.
 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8-16.
 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717-1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpo ­
ints’,  Neurotoxicology and Teratology , 30: 349-381.
 
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.  
(33) E melléklet B.43. fejezete: Neurotoxicitási vizsgálat rágcsálókban  
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(35) E melléklet B.53. fejezete: Fejl ődési neurotoxicitási vizsgálat  
(36) E melléklet B.54. fejezete: Uterotrofikus biológiai vizsgálat rágcsálókban: 
gyors szűrővizsgálat az ösztrogénszer ű tulajdonságok kimutatására  
(37) E melléklet B.55. fejezete: Hershberger bioassay patkányokban: gyors 
szűrővizsgálat az (anti)androgén tulajdonságok kimutatására  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
1. függelék  
Mérések és megfigyelések a funkcionális megfigyelési vizsgálatban (2.A kohort)  
Saját ketrec – Nyílt terület Manipulálás Fiziológia  
Testtartás Kivétel könny űsége H őmérséklet 
Akaratlan klónusos vagy tónusos 
görcsök Kézbevétel könny űsége Testtömeg 
Szemhéjak bezárása Izomtónus Pupillareakció 
Szőrmeredezés Válasz közelítésre Pupillaméret 
Nyálzás Válasz érintésre Könnyezés Válasz zajra Hangadás Válasz farokcsípésre Hátrafelé járás Felegyenesedési válasz Járási rendellenességek Földre érkez ő lábak távolsága 
Ébredés Elüls ő végtag fogáser őssége 
Sztereotip viselkedés Hátulsó végtag fogáser őssége 
Bizarr viselkedés Foltok Légzési rendellenességek
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
2. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Vegyi anyag : egy anyag vagy keverék.  
Vizsgált vegyi anyag : bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R SZTEROIDOGENEZIS-VIZSGÁLAT  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 456. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2011) leírt módszerrel. Az OECD 1998-ban kiemelt fontosságú 
tevékenységet indított a meglév ő vizsgálati iránymutatások felülvizsgálatára, 
valamint az endokrin rendszert esetlegesen károsító vegyi anyagok kisz űré­
sére és vizsgálatára vonatkozó új vizsgálati iránymutatások kidolgozása 
érdekében. Az OECD 2002. évi ‘Koncepcionális keret az endokrin rendszert 
károsító vegyi anyagok tesztelésére és értékelésére’ cím ű dokumentuma öt 
szintet foglal magában, amelyek mindegyike különböz ő szintű biológiai 
komplexitásnak felel meg (1). Az ebben a vizsgálati módszerben leírt  in 
vitro  H295R szteroidogenezis-vizsgálat (H295R) egy humán adrenocarci ­
noma sejtvonalat (NCI-H295R sejtek) használ, és 2. szint ű ‘mechanisztikus 
adatokat szolgáltató  in vitro  vizsgálatnak’ számít, amely sz űrési és rangso ­
rolási célokra használható. A vegyi anyagok szteroidogenezisre, különösen 
a 17β-ösztradiol (E2) és a tesztoszteron (T) termelésére gyakorolt hatásainak 
szűrésére szolgáló vizsgálat kifejlesztését és szabványosítását egy több 
lépésből álló folyamat keretében végezték el. A H295R vizsgálatot optima ­
lizálták és validálták (2) (3) (4) (5).  
2. A H295R szteroidogenezis-vizsgálat célja olyan vegyi anyagok kimutatása, 
amelyek befolyásolják az E2 és a T termelését. A H295R-vizsgálat azoknak 
a xenobiotikumoknak az azonosítására szolgál, amelyek azokat az endogén komponenseket célozzák meg, amelyekb ől a koleszterint ől az E2 és/vagy a 
T termeléséig tartó sejten belüli biokémiai útvonal felépül. A H295R-vizs ­
gálatnak nem célja azoknak a vegyi anyagoknak az azonosítása, amelyek 
a hipotalamusz-hipofízis-gonád (HPG) tengelyre gyakorolt hatásuk révén befolyásolják a szteroidogenezist. A vizsgálat célja, hogy IGEN/NEM választ adjon egy vegyi anyag azon képessége tekintetében, hogy indukálja 
vagy gátolja-e a T és az E2 termelését; néhány esetben azonban kvantitatív 
eredmények is nyerhet ők (lásd az 53. és az 54. bekezdést). A vizsgálat 
eredményei a hormontermelésnek az oldószerkontrollokhoz (SC-k) képest vett relatív változásaként vannak kifejezve. A vizsgálat célja nem az, hogy 
konkrét mechanisztikus információkat nyújtson a vizsgált vegyi anyag és az 
endokrin rendszer kölcsönhatásáról. A sejtvonal alkalmazásával azonban végeztek már kutatásokat egyes enzimekre és köztes hormonokra, például a progeszteronra gyakorolt hatások azonosítására vonatkozóan is (2).
 
3. Az ebben a vizsgálati módszerben használt fogalmak és rövidítések 
meghatározását a függelék tartalmazza. Az oldatok készítésére, a sejtek 
tenyésztésére és a vizsgálat különböz ő aspektusainak végrehajtására vonat ­
kozó utasításokat tartalmazó részletes protokoll ‘A tesztoszteron- és az öszt ­
radioltermelés modulátorainak azonosítására szolgáló H295R szteroidogenezis-vizsgálat több laboratóriumban végzett validálása’ cím ű 
OECD-dokumentum I–III. függelékében található (4).
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK ÉS KORLÁTOK  
4. A szteroid nemi hormonok bioszintézisében öt különböz ő enzim vesz részt, 
amelyek hat különböz ő reakciót katalizálnak. A koleszterinnek a citokróm 
P450 (CYP) koleszterin-oldallánc hasító enzim (CYP11A) által pregneno ­
lonná történ ő enzimes átalakítása alkotja az els ő lépést a biokémiai reakciók 
sorában, amelyek a szteroid végtermékek szintézisében csúcsosodnak ki. A 
következő két reakció sorrendjét ől függően a szteroidogenezis útvonala 
kétfelé ágazik: a Δ 5 -hidroxiszteroid útvonalra és a Δ 4 -ketoszteroid útvonalra, 
amelyek az androsztendion termelésében találkoznak ismét (1. ábra).  
5. Az androsztendiont a 17 β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz (17 β-HSD) alakítja 
tesztoszteronná (T). A tesztoszteron egyszerre köztes és végs ő hormonter ­
mék. Hímekben a T-t az 5 α-reduktáz dihidrotesztoszteronná (DHT) alakít ­
hatja át, amely a sejtmembránokban, a sejtmagburokban és az androgén hatás célszöveteinek endoplazmatikus retikulumaiban található meg, például a prosztatában és az ondóhólyagban. A DHT lényegesen hatásosabb andro ­
gén, mint a T, és végtermék hormonnak is tekintik. A H295R-vizsgálat nem 
méri a DHT-t (lásd a 10. bekezdést).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Az androgén vegyi anyagokat szteroidogén útvonalon ösztrogén vegyi anya ­
gokká átalakító enzim az aromatáz (CYP19). A CYP19 a T-t 17 β-öszt­
radiollá (E2), az androsztendiont pedig ösztronná alakítja át. Az E2-t és a T-t tartják a szteroidogén út végtermék hormonjainak.
 
7. A CYP17 liáz aktivitásának a köztes szubsztrátumokkal kapcsolatos speci ­
fikussága különbözik az egyes fajok között. Emberben az enzim a Δ 5 -hidro­
xiszteroid reakcióút szubsztrátjait (pregnenolon), míg patkányban a Δ 4 - 
ketoszteroid reakcióút szubsztrátjait (progeszteron) részesíti el őnyben (19). 
A CYP17 liáz aktivitásának ezen különbségei megmagyarázhatják a vegyi 
anyagokra adott válasz különböz ő fajok közötti egyes eltéréseit, amelyek 
megváltoztatják az in vivo szteroidogenezist (6). A H295-sejtekr ől már 
kimutatták, hogy ezek tükrözik a legjobban az emberi feln őtt mellékvese 
enzimműködését és szteroidtermelési mintáját (20), de az is ismert, hogy az 
androgénszintézis Δ 5 -hidroxiszteroid és a Δ 4 -ketoszteroid útvonalának enzi ­
meit egyaránt megjelenítik (7) (11) (13) (15).  
1. ábra  
Szteroidképz ő útvonal a H295R sejtekben
  
Megjegyzés:  
Az enzimek d őlt, a hormonok félkövér bet űvel vannak szedve, a nyilak 
pedig a szintézis irányát jelzik. Szürke háttér jelzi a kortikoszteroid utakat/ termékeket. A nemi szteroid utak/termékek bekarikázva láthatók. CYP = 
citokróm P450; HSD = hidroxiszteroid-dehidrogenáz; DHEA = 
dehidroepiandroszteron.
 
8. Az emberi H295R adrenocarcinoma-sejtvonal hasznos in vitro modell 
a szteroidhormon-szintézisre gyakorolt hatások vizsgálatában (2) (7) (8) 
(9) (10). A H295R-sejtvonal azokat a géneket fejezi ki, amelyek a sztero ­
idogenezis fentebb említett összes kulcsfontosságú enzimét kódolják (11) (15) (1. ábra). Ez egyedülálló tulajdonság, mert ezeknek a géneknek az  in 
vivo expressziója a szövett ől és a fejl ődési stádiumtól függ, és jellemz ően 
egyik szövet vagy fejl ődési szakasz sem fejezi ki a szteroidogenezisben 
részt vev ő összes gént (2). A H295R-sejtek a zónásan differenciálatlan 
humán magzati mellékvese-sejtek fiziológiai jellemz őivel rendelkeznek 
(11). A sejtek egy egyedülálló  in vitro  rendszert képviselnek abban a 
tekintetben, hogy képesek el őállítani a feln őtt mellékvesekéregben és az
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
ivarmirigyekben található összes szteroid hormont, lehet ővé téve a korti ­
koszteroidok és a szteroid nemi hormonok, mint például az androgének 
és az ösztrogének szintézisére gyakorolt hatások vizsgálatát egyaránt, bár a vizsgálat validálása csak a T és az E2 kimutatására történt meg. A vizs ­
gálati rendszer által rögzített, a T- és az E2-termelés módosulásának formá ­
jában megnyilvánuló változások a vizsgált vegyi anyagok és a H295R- 
sejtek által kifejezett szteroidogén funkciók közötti különböz ő kölcsönha ­
tások következményei lehetnek. Ezek közé tartozik a génexpresszió, a szin ­
tézis vagy a szteroid hormonok el őállításában, átalakításában vagy eliminá ­
ciójában részt vev ő enzimek funkciójának modulációja (12) (13) (14). A 
hormontermelés gátlása bekövetkezhet a reakcióútban szerepl ő enzimhez 
való közvetlen kompetitív köt ődés, a kofaktorokra – mint például az 
NADPH (nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát) és a cAMP (ciklikus 
adenozin-monofoszfát) – gyakorolt hatás és/vagy a szteroidmetabolizmus 
növekedése vagy a szteroidogenezis útvonalában szerepl ő bizonyos enzimek 
génexpressziójának gátlása révén. Míg a gátlás a hormontermelésben szerepet játszó közvetlen vagy közvetett folyamatoknak egyaránt a függ ­
vénye lehet, az indukció tipikusan közvetett jelleg ű, mint például a kofak ­
torok, mint a NADPH és a cAMP befolyásolása (például a forskolin eseté ­
ben), vagy a szteroidmetabolizmus csökkentése (13), illetve a szteroidogén génexpresszió feljebb szabályozása.
 
9. A H295R-vizsgálatnak számos el őnye van:  
— egyaránt lehet ővé teszi a T- és E2-termelés növekedésének és csökke ­
nésének kimutatását,  
— lehetőséget biztosít a vegyi anyag sejtek életképességére gyakorolt lehet ­
séges hatásának, citotoxicitásának közvetlen értékelésére. Ez egy fontos tulajdonság, mivel lehet ővé teszi a citotoxicitás miatti hatások 
megkülönböztetését a vegyi anyagok és a szteroidogén utak közötti 
közvetlen kölcsönhatások alapján fellép ő hatásoktól, ami nem lehetséges 
a több, különböz ő érzékenység ű és funkciójú sejttípusból álló szöveti 
explantátum rendszerekben,
 
— nem igényli állatok használatát,  
— a H295R sejtvonal a kereskedelemben kapható.  
10. A vizsgálat alapvet ő korlátai az alábbiak:  
— A vizsgálat metabolikus képessége nem ismert, de valószín űleg 
meglehetősen korlátozott, ezért azokat a vegyi anyagokat, amelyeket 
metabolikusan aktiválni kell, a vizsgálati eljárás valószín űleg nem 
fogja érzékelni.  
— A H295R a mellékveséb ől származó szövetként rendelkezik a glüko- és 
mineralokortikoidok, illetve a nemi hormonok termelésére képes enzi ­
mekkel is, ezért a glüko- és mineralokortikoidok termelésére kifejtett hatások befolyásolhatják a T-nek és az E2-nek a vizsgálatban 
megfigyelhet ő szintjét is.
 
— A vizsgálat nem méri a DHT-t és ezért nem várható, hogy kimutassa az 
5α-reduktáz gátló vegyi anyagokat, amelyek esetében a Hershberger 
assay-t (16) lehet használni.  
— A H295R-vizsgálat nem fogja érzékelni azokat a vegyi anyagokat, 
amelyek a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely (HPG) befolyásolása 
révén zavarják a szteroidogenezist, mivel azt csak ép állatokban lehet vizsgálni.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
11. A vizsgálat célja a T- és E2-termelést befolyásoló vegyi anyagok kimuta ­
tása. A T egyúttal egy köztes termék is az E2 el őállításához vezet ő úton. A 
vizsgálat képes észlelni azokat a vegyi anyagokat, amelyek tipikusan 
gátolják vagy indukálják a szteroidogenezis-útvonal enzimeit.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. A vizsgálatot rendszerint standard sejttenyésztési körülmények között, 24- 
lyukú szövettenyészt ő lemezeken végezzük. Alternatívaként egyéb lemez ­
méreteket is lehet használni a vizsgálat elvégzésére, de a sejttelepítés körül ­
ményeit és a kísérleti feltételeket megfelel ően módosítani kell a teljesít ­
ménykritériumoknak való megfelelés érdekében.  
13. A többlyukú lemezen történt 24 órás akklimatizációs id őszak után a sejteket 
48 órán keresztül a vizsgált vegyi anyag hét koncentrációjának tesszük ki 
legalább három példányban. Negatív és pozitív kontrollként oldószert, egy 
ismert hormoninhibitort és egy hormontermelést indukáló anyagot futtatunk rögzített koncentrációban. Az expozíciós id ő végén minden lyukból eltávo ­
lítjuk a táptalajt. Az egyes lyukakban lév ő sejtek életképességét a táptalaj 
eltávolítása után azonnal elemezzük. Különböz ő módszerekkel lehet mérni a 
hormonok koncentrációját a táptalajban, beleértve a kereskedelmi forga ­
lomban kapható hormonmér ő készleteket és/vagy a m űszeres technikákat, 
mint például a folyadékkromatográfia-tömegspektrometriát (LC-MS). Az 
adatokat az oldószer kontrollhoz és a megfigyelhet ő hatást okozó legalacso ­
nyabb koncentrációhoz (LOEC) viszonyított valahányszoros változásban fejezzük ki. Ha a vizsgálat eredménye negatív, a legnagyobb vizsgált koncentrációt megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentrációként (NOEC) 
jegyzőkönyvezzük. A vegyi anyag szteroidogenezist befolyásoló képes ­
ségére vonatkozó következtetést legalább két független tesztre kell alapozni. Az első teszt dózisbehatároló vizsgálatként funkcionálhat, adott esetben a 2. 
és 3. vizsgálat koncentrációinak kiigazításával, ha oldhatósági vagy citoto ­
xicitási problémák lépnek fel, vagy ha a vegyi anyag aktivitása a vizsgált 
koncentrációtartomány végén helyezkedik el.
 
SEJTKULTÚRA ELJÁRÁS  
Sejtvonal  
14. Az NCI-H295R sejteket az Amerikai Típusú Sejtkultúra-Gy űjteménytől 
(American Type Kultúra Collections – ATCC) anyagátadási szerz ődés 
(Material Transfer Agreement – MTA) aláírásával lehet megvásárolni (  1 ). 
Bevezetés  
15. Mivel az E2-termel ő kapacitás a sejtek életkorának/passzálások számának 
növekedésével változik (2), a sejteket használat el őtt egy adott protokoll 
szerint kell tenyészteni, és fel kell jegyezni a sejtek kiolvasztása óta történt passzálások számát, valamint annak az passzálásnak a sorszámát is, amelyen 
a sejteket lefagyasztottuk és folyékony nitrogén tárolóba helyeztük. Az els ő 
szám a passzálások számát jelzi, a második szám pedig leírja annak a passzálásnak a számát, amelyen a sejteket lefagyasztottuk és betároltuk. Például, azokat a sejteket, amelyeket az ötödik passzálás után fagyasztot ­
tunk le, majd felolvasztottunk, és ismételt tenyésztést követ ően háromszor 
felosztottunk (4 passzálás, a frissen felolvasztott sejteket 1. passzálásnak tekintve), 4.5 passzálásként címkéznénk fel. A számozási rendszer egy példáját a validálási jelentés I. függeléke szemlélteti (4).
 
16. A kiegészített és fagyasztó táptalajok alapjaként alapközeget használunk. A 
kiegészített táptalaj a sejttenyésztés szükséges eleme. A fagyasztó táptalajt 
kifejezetten úgy tervezték meg, hogy lehet ővé tegye a sejtek hatásmentes 
lefagyasztását a hosszú távú tárolás céljára. Használat el őtt a Nu-szérumot 
(vagy az olyan összehasonlítható tulajdonságokkal rendelkez ő szérumot, 
amelyről kimutatták, hogy a vizsgálati teljesítményre és min őség- 
ellenőrzésre (QC) vonatkozó követelményeknek megfelel ő adatokat produ ­
kál) – amely a kiegészített táptalajok alkotórésze – analizálni kell a háttér T- és E2-koncentráció szempontjából. Az oldatok el őkészítését a validálási 
jelentés II. függeléke írja le (4).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Az eredeti ATCC-tételb ől származó H295R-sejttenyészet megkezdését 
követően a sejteket öt passzáláson keresztül kell tenyészteni (azaz a sejteket 
4-szer kell felosztani). Az ötödik passzázs sejtjeit ezután folyékony nitro ­
génben lefagyasztjuk tárolás céljából. A sejtek lefagyasztása el őtt a 
negyedik passzázs sejtjeib ől vett mintát lefuttatjuk egy QC-lemezen (lásd 
a 36. és 37. bekezdést) annak ellen őrzése céljából, hogy a hormonok terme ­
lődése és a pozitív kontroll vegyi anyagokra adott válasz megfelel-e a vizs ­
gálat min őségbiztosítási kritériumainak, amelyeket az 5. táblázat tartalmaz.  
18. A H295R-sejteket tenyészteni kell, le kell fagyasztani és folyékony nitro ­
génben kell tárolni annak érdekében, hogy folyamatosan rendelkezésre 
álljanak megfelel ő passzálású/korú sejtek a tenyésztés és a használat céljára. 
Egy új (  1 ) vagy fagyasztott (  2 ) sejttétel tenyésztésbe vétele utáni passzálások 
maximális száma, amely még elfogadható a H295R-vizsgálatban való hasz ­
nálatra, nem haladhatja meg a 10-et. Például az 5. passzázsban lefagyasztott 
tételből származó sejtkultúrák passzálásainak elfogadható száma 4.5-10.5 
lenne. Az ezekb ől a fagyasztott tételekb ől indult sejtek esetében a 19. 
bekezdésben leírt eljárást kell követni. Ezeket a sejteket legalább négy (4) további passzáláson át kell tenyészteni (passzázs-szám 4,5) a tesztelésben 
való használatot megel őzően.
 
Sejtek indítása fagyasztott állományból  
19. A sejtek fagyasztott állományból történ ő indítására vonatkozó eljárást kell 
alkalmazni, amikor egy új sejttételt tenyésztés és tesztelés céljából kieme ­
lünk a folyékony nitrogén tartályból. Ennek az eljárásnak a részleteit a 
validálási jelentés III. függeléke tartalmazza (4). A sejteket eltávolítjuk a 
folyékony nitrogén tartályból, gyorsan felolvasztjuk, kiegészített táptalajban egy centrifugacs őbe helyezzük, szobah őmérsékleten centrifugáljuk, újra ­
szuszpendáljuk a kiegészített táptalajban, majd átvisszük egy sejttenyészt ő 
edénybe. A táptalajt a következ ő napon le kell cserélni. A H295R-sejteket 
37 °C-on inkubátorban tenyésztjük 5 % CO
 2 -t tartalmazó leveg ő atmoszfé ­
rában, és a táptalajt hetente 2-3 alkalommal megújítjuk. Amikor a sejtkul ­
túra körülbelül 85–90 %-ban egybefolyik, akkor meg kell osztani. A sejtek 
megosztására azért van szükség, hogy biztosítsuk a sejtek egészségét és 
növekedését, és hogy fenntartsuk a sejtkultúrát a biológiai tesztek elvégzé ­
sére. A sejteket háromszor átöblítjük foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS, Ca
 2+ Mg 2+ nélkül), és felszabadítjuk a sejttenyészt ő edényből egy megfelel ő 
leválasztó enzim, például tripszin PBS-ben (Ca  2+ Mg 2+ nélkül) való hozzá ­
adásával. Közvetlenül azután, hogy a sejtek leválnak a sejttenyészt ő edény­
ről, az enzimes eljárást le kell állítani úgy, hogy kiegészített táptalajt adunk 
hozzá a kultúrához az enzimes kezeléshez használt térfogat háromszoros 
mennyiségében. A sejteket behelyezzük egy centrifugacs őbe, szobah őmér­
sékleten centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, és a sejtpelletet újraszuszpen ­
dáljuk kiegészített táptalajban. Megfelel ő mennyiség ű sejtoldatot áthelye ­
zünk az új sejttenyészt ő edénybe. A sejtoldat mennyiségét úgy kell beállí ­
tani, hogy a sejtek 5–7 napon belül összefolyjanak. Az ajánlott másodlagos 
tenyésztési arány 1:3-1:4. A lemezt gondosan fel kell címkézni. A sejtek most már készen állnak a vizsgálatban való felhasználásra és a felesleges sejteket le kell fagyasztani folyékony nitrogénben a 20. bekezdésben leírtak 
szerint.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) Az ‘új tétel’ kifejezés az ATCC-t ől kapott friss sejttételt jelenti. 
( 2 ) A ‘fagyasztott tétel’ kifejezés olyan sejteket jelent, amelyeket már korábban tenyésztettek 
és lefagyasztottak egy ATCC-t ől eltérő laboratóriumban.
 A H295R-sejtek lefagyasztása (a sejtek el őkészítése a folyékony nitro ­
génben való tárolásra)  
20. A H295R-sejtek fagyasztásra történ ő előkészítése érdekében a sejtek felosz ­
tására vonatkozó fentiekben leírt eljárást kell követni a sejtpelletnek a cent ­
rifugacső alján történ ő újraszuszpendálásáig. Itt a sejtpelletet a fagyasztó 
táptalajban kell újraszuszpendálni. Az oldatot átvisszük egy megfelel ően 
felcímkézett kriogén fiolába, és – 80 °C h őmérsékleten 24 órán keresztül 
fagyasztjuk, majd a kriogén fiolát folyékony nitrogénbe helyezzük tárolás céljából. Ennek az eljárásnak a részleteit a validálási jelentés III. függeléke tartalmazza (4).
 
A sejtek lemezre ültetése és el őzetes inkubálása tesztelés céljából  
21. Az, hogy a 19. bekezdésben körvonalazott módon el őkészített 24-lyukú 
lemezekb ől mennyire lesz szükség, a vizsgálandó vegyi anyagok számától 
és a tenyészt őedényekben lév ő sejtek konfluenciájától függ. Általános 
szabály, hogy a 80–90 %-ban összefolyó sejtek egy sejttenyészt ő edénye 
(75 cm  2 ) elegend ő mennyiség ű sejtet szolgáltat 1,5 (24-lyukú) lemezhez 
200 000-300 000 sejt/ml táptalaj céls űrűség mellett, aminek eredményeként 
körülbelül 50–60 %-os összefolyás érhet ő el a lyukakban 24 óra alatt (2. 
ábra). Általában ez az optimális sejts űrűség a hormontermeléshez a vizs ­
gálatban. Nagyobb s űrűség esetén a T- és E2-termelési minták megváltoz ­
nak. A vizsgálat els ő alkalommal történ ő elvégzése el őtt ajánlott tesztelni a 
200 000 és 300 000 sejt/ml közötti különböz ő ültetési s űrűségeket, és a 
lyukakban 24 óra alatt 50–60 %-os összefolyást eredményez ő sűrűséget 
kell kiválasztani a további kísérletekhez.  
2. ábra  
24-lyukú tenyészt őlemezen 24 óra után 50 %-os ültetési s űrűségű H295R-sejtek 
mikrofotogramja a lyuk szélén (A) és közepén (B)
  
22. A táptalajt lepipettázzuk a sejttenyészt ő edényből, és a sejteket 3-szor 
átöblítjük steril PBS-sel (Ca  2+ Mg 2+ nélkül). Enzimoldatot (PBS-ben) 
adunk hozzá, amely elválasztja a sejteket a sejttenyészt ő edénytől. A sejtek 
leválására biztosított megfelel ő idő után az enzimes eljárást le kell állítani 
úgy, hogy kiegészített táptalajt adunk hozzá a kultúrához az enzimes keze ­
léshez használt térfogat háromszoros mennyiségében. A sejteket behelyezzük egy centrifugacs őbe, szobah őmérsékleten centrifugáljuk, a 
felülúszót elöntjük, és a sejtpelletet kiegészített táptalajban újraszuszpendál ­
juk. A sejts űrűséget például hemocitométerrel vagy sejtszámlálóval
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
kiszámítjuk. A sejtoldatot fel kell hígítani a kívánt ültetési s űrűségre és 
alaposan össze kell keverni a homogén sejts űrűség biztosítása érdekében. 
A sejteket 1 ml sejtoldat/lyuk mennyiségben kell ültetni, illetve a lemezeket és lyukakat fel kell címkézni. A beoltott lemezeket 37 °C-on 5 % CO
 2 -t 
tartalmazó leveg ő atmoszférában 24 órán át inkubáljuk, hogy lehet ővé 
tegyük a sejteknek a lyukakban való megtapadását.  
MINŐSÉG-ELLEN ŐRZÉSI KÖVETELMÉNYEK  
23. Rendkívül fontos, hogy az adagolás során az oldatokból és mintákból 
pontos mennyiségeket helyezzünk el a lyukakban, mivel ezek a térfogatok 
határozzák meg azokat a koncentrációkat, amelyeket a vizsgálat eredménye ­
inek számítása során használunk.  
24. A sejtkultúra megkezdése és bármely azt követ ő vizsgálat el őtt minden 
laboratóriumnak bizonyítania kell a hormonmérési rendszerének érzékeny ­
ségét (29–31. bekezdés).  
25. Ha ellenanyag-alapú hormonmérési vizsgálatokat tervezünk használni, a 
vizsgálandó vegyi anyagokat a vizsgálat megkezdése el őtt meg kell vizs ­
gálni, hogy zavarják-e a 32. bekezdésben körvonalazott, a T és E2 szám ­
szerűsítésére használt mérési rendszert.  
26. A vizsgálathoz ajánlott oldószer a DMSO. Ha alternatív oldószert alkalma ­
zunk, akkor a következ őket kell meghatározni:  
— a vizsgált vegyi anyag, a forskolin és a prokloráz oldhatósága az oldó ­
szerben, valamint  
— citotoxicitás az oldószer koncentrációjának függvényében.  
Ajánlott, hogy a maximálisan megengedhet ő oldószer-koncentráció ne 
haladja meg az oldószer legkevésbé citotoxikus koncentrációjának 10-szeres 
hígítását.  
27. A vizsgálat el őször történ ő elvégzése el őtt a laboratóriumnak el kell 
végeznie a 33–35. bekezdésben leírt min ősítő kísérletet annak igazolására, 
hogy a laboratórium képes fenntartani és el őállítani a kémiai vizsgálatokhoz 
szükséges megfelel ő sejtkultúrát és kísérleti körülményeket.  
28. Ha új sejttétellel kívánunk elindítani egy tesztelést, az új tétel használata 
előtt le kell futtatni egy kontroll lemezt a sejtek teljesítményének értékelése 
céljából a 36. és 37. bekezdésben leírtak szerint.  
A hormonmér ő rendszer teljesítménye  
A módszer érzékenysége, pontossága, precizitása és keresztreaktivitás a 
mintamátrixszal  
29. Minden laboratórium az általa kiválasztott hormonmérési rendszert használ ­
hatja a H295R-sejtek T- és E2-termelésének elemzéséhez, amíg az megfelel 
a teljesítménykritériumoknak, beleértve a meghatározási határt (LOQ) is. Névlegesen ez 100 pg/ml a T és 10 pg/ml az E2 esetében, amelyek a validálási vizsgálatokban megfigyelt bazális hormonszinteken alapulnak. 
Azonban magasabb vagy alacsonyabb szintek is megfelel őek lehetnek 
attól függ ően, hogy a vizsgálatot végz ő laboratórium milyen bazális
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
hormonszintet ért el. A QC-lemezek és a tesztek futtatásának megkezdése 
előtt a laboratóriumnak bels ő hormon kontrollal kezelt kiegészített tápta ­
lajok elemzésével bizonyítania kell, hogy a használandó hormonvizsgálat kellő pontossággal és precizitással tudja mérni a hormonkoncentrációkat a 
kiegészített táptalajban ahhoz, hogy megfeleljen az 1. és 5. táblázatban 
meghatározott QC-kritériumoknak. A kiegészített táptalajba az egyes 
hormonoknak legalább három koncentrációját kell bevinni (pl. 100, 500 és 2 500 pg/ml T, 10, 50 és 250 pg/ml E2; vagy a választott hormonmérési rendszer kimutatási határain alapuló legalacsonyabb koncentráció használ ­
ható a T és E2 legalacsonyabb koncentrációjaként) és analizálni. A nem 
extrahált minták mért hormonkoncentrációinak a névleges koncentrációkhoz képest 30 %-on belül kell lennie, és az azonos minta ismételt mérései közötti variáció nem haladhatja meg a 25 %-ot (további 
QC-kritériumokért lásd még a 8. táblázatot). Ezeknek a QC-kritériumoknak 
a teljesülése esetén azt feltételezzük, hogy a kiválasztott hormonmérési vizsgálat kell őképpen pontos, precíz, és nem ad olyan keresztreakciót a 
táptalaj komponenseivel (mintamátrix), hogy az jelent ősen befolyásolná a 
vizsgálat eredményét. Ebben az esetben nincs szükség a minták hormon ­
mérés előtti extrakciójára.
 
30. Abban az esetben, ha az 1. és 8. táblázatban foglalt QC-kritériumok nem 
teljesülnek, az jelent ős mátrixhatásra utalhat, és a kísérletet extrahált kezelt 
táptalajjal kell elvégezni. A extrakciós eljárás egy példáját a validálási jelentés II. függeléke szemlélteti (4). A hormonkoncentráció méréseit az 
extrahált mintákon három példányban kell elvégezni. (
 1 ) Ha kimutatható, 
hogy a táptalaj komponensei az extrahálás után nem zavarják a hormonki ­
mutatási módszert a QC-kritériumokban meghatározottak szerint, minden további kísérleteket extrahált minták felhasználásával kell elvégezni. Ha 
az extrahálás után a QC-kritériumok nem teljesülnek, a felhasznált hormon ­
mérő rendszer nem alkalmas a H295R szteroidogenezis vizsgálat céljára, és 
alternatív hormonkimutatási módszert kell használni.
 
Standard görbe  
31. Az oldószer kontrollok (SC-k) hormonkoncentrációjának a standard görbe 
lineáris részén belül kell lennie. A legel őnyösebb az, ha az SC-értékek közel 
esnek a lineáris rész közepéhez annak érdekében, hogy a hormonszintézis 
indukciója és inhibíciója mérhet ő legyen. A táptalajok (vagy extraktok) 
mérendő hígításait ennek megfelel ően kell kiválasztani. A lineáris kapcso ­
latot megfelel ő statisztikai megközelítés segítségével kell meghatározni.  
Kémiai interferencia teszt  
32. Ha ellenanyag-alapú vizsgálatokat, például enzimkötött immunoszorbens 
vizsgálatot (ELISA) és radioimmun vizsgálatot (RIA) fognak a hormonok 
mérésére használni, a vegyi anyagok tényleges tesztelésének megkezdése 
előtt a vegyi anyagok mindegyikét meg kell vizsgálni a használni tervezett 
hormonmérési rendszerrel való lehetséges interferencia tekintetében (validá ­
lási jelentés III. függeléke (4)), mert néhány vegyi anyag zavarhatja ezeket a 
vizsgálatokat (17). Ha a hormonanalízis a T és/vagy E2 bazális hormon ­
termelés ≥ 20 %-ának megfelel ő interferencia el őfordulását mutatja ki, le 
kell futtatni egy kémiai hormonvizsgálati interferencia tesztet (például a validálási jelentés (4) III. függelékének 5.0. fejezetében leírt tesztet) a vizs ­
gált vegyi anyag törzsoldatának összes hígításán annak a küszöbdózisnak a 
meghatározására, amely mellett jelent ős (≥ 20 %) interferencia lép fel. Ha 
az interferencia kisebb mint 30 %, az eredményeket korrigálni lehet az
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Megjegyzés:  Ha extrakcióra van szükség, minden kivonattal három párhuzamos mérést 
végzünk. Minden mintát csak egyszer extrahálunk.
 interferenciával. Ha az interferencia meghaladja a 30 %-ot, az adatok 
érvénytelenek, és az adott koncentráció adatait el kell vetni. Ha egy vizsgált 
vegyi anyag több mint egy nem citotoxikus koncentráció mellett is jelent ős 
interferenciát mutat a hormonmérési rendszerrel, másik hormonmérési rend ­
szert kell használni. A szennyez ő vegyi anyagok által kiváltott interferencia 
elkerülése érdekében ajánlott, hogy a hormonokat alkalmas oldószerrel 
extraháljuk a táptalajból, a lehetséges módszerek megtalálhatók validálási jelentésben (4).
 
1. táblázat  
A hormonmér ő rendszer teljesítménykritériumai  
Paraméter Kritérium  
A mérési módszer érzékenysége Meghatározási határ (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  a ) 
A hormonextrakció hatékonysága 
(kizárólag akkor, ha extrakcióra van szükség) A bevitt hormonmennyiség átlagos 
visszanyerési aránya (a három mérés alapján) nem térhet el több mint 30 %-ban a bevitt mennyiségt ől. 
Kémiai interferencia (kizárólag 
az antitest-alapú rendszerek eseté ­
ben) Nem fordul el ő jelentős (az adott 
hormon bazális hormontermelése ≥ 
30 %-ának megfelel ő) keresztreakti ­
vitás a sejtek által termelt semelyik 
hormonnal (
 b ) ( c ) 
( a ) Megjegyzés : A módszer mérési határértékei az 5. táblázatban megadott bazális 
hormontermelési értékeken alapulnak és teljesítményalapúak. Ha magasabb 
bazális hormontermelést lehet elérni, akkor a határérték is nagyobb lehet. 
( b ) Egyes T- és E2-antitestek nagyobb százalékban is keresztreakcióba léphetnek az 
androsztendionnal és az ösztronnal. Ilyen esetekben nem lehet pontosan 
meghatározni a 17 β-HSD-re gyakorolt hatásokat. Az adatok azonban továbbra is 
hasznos információt nyújthatnak az ösztrogén- vagy androgéntermelésre gyakorolt 
hatásokról általában. Ilyen esetekben az adatokat androgén/ösztrogén válaszban 
kell kifejezni E2 és T helyett. 
( c ) Ezek a következ ők: koleszterin, pregnenolon, progeszteron, 11-dezoxikortikoszte ­
ron, kortikoszteron, aldoszteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progeszteron, dezoxikor ­
tizol, kortizol, DHEA, androsztendion, ösztron.  
Laboratóriumi jártassági teszt  
33. Ismeretlen vegyi anyagok vizsgálata el őtt a laboratóriumnak egy laborató ­
riumi jártassági teszt lefuttatásával kell demonstrálnia, hogy képes el őállítani 
és fenntartani a megfelel ő sejtkultúrát és a vizsgálat sikeres lebonyolításához 
szükséges vizsgálati körülményeket. Mivel egy vizsgálat végrehajtása közvetlenül összefügg a vizsgálatot végz ő laboratóriumi személyzettel, 
ezeket az eljárásokat részlegesen meg kell ismételni, ha változás következik 
be a laboratóriumi személyzetben.
 
34. Ezt a jártassági tesztet a 38–40. bekezdésben felsoroltakkal megegyez ő 
feltételek mellett kell elvégezni, a sejteket er ős, közepes és gyenge induk ­
torok és inhibitorok 7 növekv ő koncentrációjának, valamint egy negatív 
vegyi anyagnak kitéve (lásd a 2. táblázatot). Pontosabban, a vizsgálandó 
vegyi anyagok közé tartozik az er ős induktor forskolin (CAS-szám: 66575- 
29-9), az er ős inhibitor prokloráz (CAS-szám: 67747-09-5), a mérsékelt  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
induktor atrazin (CAS-szám: 1912-24-9), a közepes inhibitor aminoglute ­
timid (CAS-szám: 125-84-8), a gyenge induktor (E2-termelés) és gyenge 
inhibitor (T-termelés) biszfenol-A (CAS-szám: 80-05-7), és a negatív vegyi anyag humán chorion-gonadotropin (HCG) (CAS-szám: 9002-61-3), amint azt a 2. táblázat mutatja. Külön lemezeket futtatunk az egyes vegyi anya ­
gokra a 6. táblázatban bemutatott sémának megfelel ően. A napi futtatásokba 
is be kell illeszteni egy QC-lemezt (4. táblázat, 36–37. bekezdés) a jártas ­
sági tesztanyagok részére.
 
2. táblázat  
Jártassági tesztanyagok és expozíciós koncentrációk  
Jártassági tesztanyag Vizsgálati koncentrációk [ μM] 
Prokloráz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimid 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Biszfenol-A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Oldószer (DMSO) kontroll (0), 1 μl DMSO/lyuk  
A H295R jártassági tesztanyagoknak való expozícióját 24-lyukú lemezen 
kell elvégezni a laboratóriumi jártassági teszt során. Az adagolás μM-ban 
van megadva a vizsgált vegyi anyagok valamennyi dózisa esetében. A dózisokat DMSO-hoz kell hozzáadni 0,1 térfogatszázalék arányban lyukan ­
ként. Az összes tesztkoncentrációt három lyukban kell vizsgálni (6. táblá ­
zat). Az egyes vegyi anyaghoz külön lemezeket kell futtatni. Minden napi futtatásba egy QC-lemezt is be kell illeszteni.
 
35. A sejtek életképességének és a hormonoknak az elemzését a 42–46. bekez ­
désben el őírtak szerint kell elvégezni. A küszöbértéket (megfigyelhet ő 
hatást okozó legalacsonyabb koncentráció, LOEC) és a besorolásra vonat ­
kozó döntést jegyz őkönyvezni kell, és össze kell hasonlítani a 3. táblázatban 
szereplő értékekkel. Az adatok elfogadhatónak tekinthet ők, ha megfelelnek 
a 3. táblázatban foglalt LOEC-értékeknek és besorolási döntésnek.  
3. táblázat  
A jártassági tesztanyagok küszöbértékei (LOEC) és besorolási döntései  
CAS-szám LOEC [μM] Besorolási döntés 
T E2 T E2  
Prokloráz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a )(Indukció) + (Inhibíció) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Indukció) + (Indukció) 
Atrazin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Indukció) + (Indukció) 
Aminoglutetimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inhibíció) + (Inhibíció)  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS-szám LOEC [μM] Besorolási döntés 
T E2 T E2  
Biszfenol-A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inhibíció) + (Indukció) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a Negatív Negatív  
( a ) +, pozitív 
n/a: nem alkalmazható, mivel a negatív kontroll nem citotoxikus koncentrációjának való expozíció után nem történhet változás.
 
Minőség-ellenőrzési lemez  
36. A min őség-ellenőrzési (QC) lemezt a H295R-sejtek standard tenyésztési 
körülmények közötti teljesítményének ellen őrzésére, valamint az oldószeres 
kontrollokban, a pozitív és negatív kontrollokban mért hormonkoncentrá ­
ciók, valamint az egyéb QC-mérések történeti adatbázisának létrehozására 
használjuk.  
— A H295R-sejtek teljesítményét QC-lemez használatával kell értékelni 
minden egyes új ATCC tétel esetében vagy ha egy korábban lefagyasz ­
tott sejtállományt els ő alkalommal használunk, kivéve, ha a laborató ­
rium jártassági tesztjét (32-34. bekezdés) ezzel a sejttétellel futtattuk le.  
— A QC-lemez teljes értékelést ad a vizsgálati feltételekr ől (pl. a sejtek 
életképessége, oldószeres kontrollok, negatív és pozitív kontrollok, vala ­
mint intra- és inter-assay variabilitás) a vegyi anyagok vizsgálata során, 
és azt minden tesztfuttatásba be kell építeni.  
37. A QC-vizsgálatra 24-lyukú lemezen kerül sor, és ugyanazokat az inkubá ­
ciós, adagolási, sejt életképességi/citotoxicitási, hormonextrakciós és hormonelemzési eljárásokat követi, mint amelyeket a 38–46. bekezdés a 
vegyi anyagok tesztelésére leír. A QC-lemez vakpróbákat, oldószeres kontr ­
ollokat, egy ismert induktor két koncentrációját (forskolin, 1 és 10 μM), 
valamint az E2- és T-szintézis egy ismert inhibitorának két koncentrációját (prokloráz, 0,1 és 1 μM) is tartalmazza. Ezen túlmen ően pozitív kontroll ­
ként MeOH-t használunk kiválasztott lyukakban az életképességi/citotoxici ­
tási vizsgálatban. A lemezelrendezés részletes leírása a 4. táblázatban talál ­
ható. A QC-lemezen teljesítend ő kritériumokat az 5. táblázat tartalmazza. A 
T és az E2 minimális bazális hormon termelését mind az oldószer kontroll ­
ban, mind a vakpróbákban teljesíteni kell.
 
4. táblázat  
A minőség-ellenőrzési lemez elrendezése a nem kezelt és az E2- és T-termelés ismert 
gátlóinak (PRO = prokloráz) és stimulánsainak (FOR = forskolin) kitett H295R-sejtek teljesítményének vizsgálatához. Az expozíciós kísérlet befejezése és a táptalaj eltávolítása 
után 70 %-os metanol oldatot adunk hozzá minden MeOH-lyukhoz, hogy pozitív 
kontrollként szolgáljanak a citotoxicitási vizsgálat során (a citotoxicitási vizsgálatot lásd 
a validálási jelentés III. függelékben (4))
 
1 2 3 4 5 6  
A Vakpró ­
ba (  a ) Vakpró­
ba (  a ) Vakpró­
ba (  a ) Vakpróba (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Vakpróba (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Vakpróba (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 0,1 μM FOR 0,1 μM FOR 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 1 μM FOR 1 μM FOR 1 μM 
( a ) A vakpróbák sejtjeihez csak táptalajt adunk (azaz nincs oldószer). 
( b ) A metanolt (MeOH) az expozíció megszüntetése és a táptalajnak ezekb ől a lyukakból történt eltávolítása 
után adjuk hozzá. 
( c ) DMSO oldószeres kontroll (1 μl/lyuk).  
5. táblázat  
A minőség-ellenőrzési lemez teljesítménykritériumai  
T E2  
A hormon bazális terme ­
lődése az oldószeres 
kontrollban (SC) Az LOQ ≥ 5-szöröse Az LOQ ≥ 2,5-szöröse 
Indukció (10 μM fors­
kolin) Az SC ≥ 1,5-szöröse Az SC ≥ 7,5-szöröse 
Inhibíció (1 μM proklo ­
ráz) Az SC ≤ 0,5-szöröse Az SC ≤ 0,5-szöröse  
VEGYIANYAG-EXPOZÍCIÓS ELJÁRÁS  
38. Az el őinkubált sejteket eltávolítjuk az inkubátorból (21. bekezdés) és az 
adagolást megel őzően mikroszkóp alatt ellen őrizzük, hogy jó állapotban 
vannak-e (tapadás, morfológia).  
39. A sejteket biológiai biztonsági fülkében helyezzük el, a kiegészített táptalajt 
eltávolítjuk és új kiegészített táptalajjal váltjuk fel (1 ml/lyuk). Ehhez a vizsgálati módszerhez oldószerként lehet őleg DMSO-t kell alkalmazni. Ha 
azonban más oldószer használata indokolt, azt tudományos érvekkel kell 
alátámasztani. A sejteket a vizsgált vegyi anyagnak úgy tesszük ki, hogy 1 ml kiegészített táptalajhoz (lyuk térfogata) hozzáadjuk a DMSO-ban feloldott megfelel ő törzsoldat 1 μl-ét (lásd a validálási jelentés II. függelékét 
(4)). Ez azt eredményezi, hogy a DMSO végs ő koncentrációja a lyukakban 
0,1 % lesz. A megfelel ő elkeveredéshez általában el őnyös, ha a vizsgált 
vegyi anyag DMSO-ban feloldott megfelel ő törzsoldatát összekeverjük a 
kiegészített táptalajjal, hogy megkapjuk minden egyes dózis kívánt végs ő 
koncentrációját, és a keveréket közvetlenül a régi táptalaj eltávolítása után 
hozzáadjuk az egyes lyukakhoz. Ha ezt az opciót használjuk, a DMSO koncentrációja (0,1 %) konzisztens marad az összes lyukban. A két legna ­
gyobb koncentrációt tartalmazó lyukat sztereomikroszkóp segítségével vizu ­
álisan értékeljük csapadékok képz ődése vagy a zavarosság jelei szempont ­
jából, amelyek a vizsgált vegyi anyag nem komplett oldhatóságára utalnak. Ha ilyen körülmények (elfelh ősödés, csapadék képz ődése) figyelhet ők meg, 
a következ ő kisebb koncentrációt tartalmazó lyukakat is megvizsgáljuk (és 
így tovább), és azokat a koncentrációkat, amelyek nem teljesen mennek 
oldatba, ki kell zárni a további értékelésb ől és elemzésb ől. A lemezt vissza ­
helyezzük az inkubátorba, ahol 37 °C-on 5 % CO
 2 -t tartalmazó leveg ő 
atmoszférában 48 órán keresztül inkubáljuk. A vizsgált vegyi anyag 
lemez elrendezését a 6. táblázat mutatja. Az 1–7. törzsoldatok a vizsgált 
vegyi anyag növekv ő dózisainak elhelyezését mutatják.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
6. táblázat  
Adagolási séma a H295R-sejtek vizsgált vegyi anyaggal való expozíciójához 24-lyukú 
lemezen  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO 4. törzs ­
oldat 4. törzs ­
oldat 4. törzsoldat 
B 1. törzsoldat 1. törzsoldat 1. törzsoldat 5. törzs ­
oldat 5. törzs ­
oldat 5. törzsoldat 
C 2. törzsoldat 2. törzsoldat 2. törzsoldat 6. törzs ­
oldat 6. törzs ­
oldat 6. törzsoldat 
D 3. törzsoldat 3. törzsoldat 3. törzsoldat 7. törzs ­
oldat 7. törzs ­
oldat 7. törzsoldat  
40. 48 óra elteltével az expozíciós lemezeket eltávolítjuk az inkubátorból, és 
mikroszkóp alatt minden lyukban ellen őrizzük a sejtek állapotát (tapadás, 
morfológia, összefolyás foka) és a citotoxicitás jeleit. Minden egyes lyuk táptalaját két egyenl ő mennyiség ű részre osztjuk (egyenként körülbelül 490 
μl), és átvisszük két megfelel ően jelölt fiolába (azaz lyukanként egy alikvot 
tartalék mintaként szolgál). A sejtek kiszáradásának megakadályozása érde ­
kében egy id őben egy sorból vagy oszlopból távolítjuk el a táptalajt, és 
helyére a sejtéletképességi/toxicitási vizsgálathoz szükséges táptalajt töltjük be. Ha a sejtéletképességet/citotoxicitást nem kell azonnal mérni, 200 μl 
PBS-t (Ca
 2+ és Mg  2+ ionokkal) adunk az egyes lyukakhoz. A táptalajokat 
– 80 °C-on fagyasztjuk le a hormonkoncentrációk elemzését célzó további feldolgozásig (lásd a 44–46. bekezdést). Bár a T és az E2 a – 80 °C-on tartott táptalajban általában legalább 3 hónapig stabil marad, minden labo ­
ratóriumnak dokumentálnia kell a hormonok stabilitását a tárolás során.
 
41. A táptalaj eltávolítása után azonnal meghatározzuk a sejtek életképességét 
és a citotoxicitást az egyes expozíciós lemezeken.  
A sejtek életképességének meghatározása  
42. Szabadon választott sejtéletképességi/citotoxicitási vizsgálatot lehet hasz ­
nálni a vizsgált vegyi anyag sejtek életképességére gyakorolt potenciális 
hatásának meghatározására. A vizsgálatnak alkalmasnak kell lennie arra, hogy pontosan mérje az adott lyukban lév ő életképes sejtek százalékos 
arányát, vagy igazolni kell, hogy a vizsgálat közvetlenül összehasonlítható 
(lineáris függvénye) a Live/Dead® Assay-vel (lásd a validálási jelentés III. 
függelékét (4)). Egy másik vizsgálatról, az MTT-vizsgálatról [3-(4,5-dime ­
til-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid] (18) kimutatták, hogy ugyan ­
olyan jól m űködik. A sejtek életképességének a fenti módszerek alkalma ­
zásával történ ő értékelése egy relatív mérés, amely nem szükségszer űen 
mutat lineáris kapcsolatot a lyukban lév ő sejtek abszolút számával. Ezért 
az elemzőnek el kell végeznie minden lyuk szubjektív képi értékelését is, 
illetve digitális képeket kell készítenie és archiválnia kell azokat az SC-kr ől 
és a két legnagyobb nem citotoxikus koncentrációról a valós sejts űrűség 
későbbi értékelése céljára, amennyiben erre lenne szükség. Ha a vizuális 
ellenőrzés során úgy t űnik, vagy ha az életképességi/citotoxicitási vizsgálat 
azt mutatja, hogy a sejtek száma megnövekedett, a látszólagos növekedést 
ellenőrizni kell. Ha a sejtszám növekedése meger ősítésre kerül, ezt jelezni 
kell a vizsgálati jegyz őkönyvben. A sejtek életképességét az SC-k átlagos 
válaszához viszonyítva fejezzük ki, amelyet 100 %-ban életképes sejtekb ől 
állónak tekintünk, és kiszámítása az alkalmazott sejtéletképességi/citotoxici ­
tási vizsgálatnak megfelel ően történik. Az MTT-vizsgálat esetében a követ ­
kező képletet lehet használni:
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
életképes sejtek %  = (válasz a lyukban – átlagos válasz a MeOH-kezelt 
lyukakban [= 100 % halott]) ÷ (átlagos válasz az SC-lyukakban – átlagos 
válasz a MeOH-kezelt lyukakban [= 100 % halott])  
43. Az SC-k átlagos életképességéhez (= 100 %-os életképesség) viszonyított 
80 %-nál alacsonyabb életképességet mutató lyukakat nem kell figyelembe 
venni az adatok végs ő elemzésénél. A szteroidogenezis csaknem 20 %-os 
citotoxicitás mellett történ ő gátlását gondosan mérlegelni kell annak bizto ­
sítása érdekében, hogy nem a citotoxicitás az oka a gátlásnak.  
Hormonanalízis  
44. Minden laboratórium az általa kiválasztott hormonmérési rendszert használ ­
hatja a T és az E2 analíziséhez. Az egyes kezelési csoportok táptalajának tartalék alikvotjait hígítások készítésére lehet használni, hogy a koncentrá ­
ciót a standard görbe lineáris részébe hozzuk. Amint az a 29. bekezdésben 
kihangsúlyozásra került, a laboratóriumoknak a QC-futtatások vagy a vegyi 
anyagok vizsgálata el őtt belső hormon kontrollal kezelt kiegészített táptalaj 
elemzésével bizonyítania kell, hogy a hormonmérési rendszere (pl. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) megfelel a QC-kritériumoknak. Annak érdeké ­
ben, hogy a vizsgálati rendszer összetev ői ne zavarják a hormonok mérését, 
szükség lehet a hormonok kivonására a táptalajból a mérés el őtt (az 
extrakció szükséges vagy nem szükséges voltának eldöntését megalapozó feltételeket lásd a 30. bekezdésben). Az extrakciót javasolt a validálási 
jelentés III. függelékben foglalt eljárásoknak megfelel ően elvégezni (4).
 
45. Amennyiben kereskedelmi tesztkészletet használunk a hormontermelés 
mérésére, a hormonanalízist a vizsgálati készlet gyártójának kézikönyvében megadottak szerint kell végezni. A legtöbb gyártó egyedülálló eljárással 
rendelkezik a hormonanalízisek elvégzésére. A minták hígításait úgy kell 
módosítani, hogy az oldószer kontrollok várható hormonkoncentrációi az adott vizsgálat standard görbéje lineáris tartományának középpontjába 
essenek (a validálási jelentés III. függeléke (4)). A standard görbe lineáris 
részén kívüli értékeket el kell utasítani.
 
46. A végs ő hormonkoncentráció kiszámítása az alábbiak szerint történik:  
Példa: 
Kivont anyag: 450 μl táptalaj 
Rekonstituálva: 250 μl vizsgálati pufferben 
Hígítás a vizsgálatban: 1:10 (ahhoz, hogy a minta a standard 
görbe lineáris tartományába kerüljön) 
Hormonkoncentráció a vizs ­
gálatban: 150 pg/ml (már hozzáigazítva a vizsgált 
minta ml-enkénti koncentrációjához) 
Kinyerési fok: 89 % Végső hormonkoncentráció = (hormonkoncentráció (ml-enként) ÷ 
kinyerési fok) × (hígítási faktor) 
Végső hormonkoncentráció = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) 
×10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
A tesztkoncentrációk megválasztása  
47. A legalább két, egymástól független futtatást kell a vizsgálatból végezni. 
Ajánlott, hogy a kezdeti futtatáshoz a vizsgálati koncentrációkat log  10 inter­
vallumokra határozzuk meg egymástól és 10  –3 M legyen a maximális 
koncentráció, kivéve, ha olyan el őzetes, például az oldhatóság korlátaira 
vagy citotoxicitásra vonatkozó információ áll rendelkezésre, amely a vizs ­
gálati koncentrációk megválasztásának alapjául szolgálhat. Ha a vegyi 
anyag oldható, egyik tesztelt koncentrációban sem citotoxikus, és az els ő 
futtatás negatív volt minden koncentrációban, akkor ezt egy vagy több, az első futtatással megegyez ő feltételeket alkalmazó futtatásban meg kell 
erősíteni (7. táblázat). Ha az els ő futtatás eredményei nem egyértelm űek 
(azaz az SC-hez viszonyított valahányszoros változás csak egyetlen koncentrációban statisztikailag szignifikáns) vagy pozitívak (azaz a vala ­
hányszoros változás két vagy több szomszédos koncentrációban is statisz ­
tikailag szignifikáns), a vizsgálatot a 7. táblázatnak megfelel ően a kiválasz ­
tott vizsgálati koncentráció finomításával meg kell ismételni. A második és harmadik futtatásban (ha van ilyen) alkalmazott tesztkoncentrációkat az els ő 
futtatás eredményei alapján ki kell igazítani, a hatást kiváltó koncentrációkat 
1/2 log koncentráció intervallumokkal közrefogva (pl. ha 0,001, 0,01, 0,1, 
1, 10, 100, 1 000 μM eredeti futtatása indukciót eredményezett az 1 és 10 
μM koncentrációknál, a második futtatásban a vizsgált koncentrációknak 
0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM-nak kell lenniük), kivéve, ha alacsonyabb 
koncentrációkat kell alkalmazni a LOEC eléréséhez. Az utóbbi esetben a 
második futtatásban legalább öt, az els ő futtatásban vizsgált legalacsonyabb 
koncentráció alatti koncentrációt kell használni fél-logaritmikus skála segít ­
ségével. Ha a második futtatás nem er ősíti meg az els ő futtatást (azaz 
statisztikai szignifikancia nem fordul el ő a korábban pozitívan vizsgált 
koncentráció ± 1 koncentráció-növekmény értéknél), egy harmadik kísér ­
letet kell végezni az eredeti vizsgálati körülmények mellett. Az els ő futtatás 
nem egyértelm ű eredményeit negatívnak tekintjük, ha a két következ ő 
futtatás egyike sem er ősítette meg a megfigyelt hatást. A nem egyértelm ű 
eredményeket pozitív válasznak (hatás) tekintjük, ha a választ legalább még egy futtatással meg lehet er ősíteni ± 1 koncentrációnövekményen belül (az 
adatok értelmezési eljárását lásd az 55. bekezdésben).
 
7. táblázat  
A lehetséges kimenetelek döntési mátrixa  
1. futtatás 2. futtatás 3. futtatás Döntés 
Kimenetel Döntés Kimenetel Döntés Kimenetel Pozitív Negatív  
Negatív Meger ősítés (  a ) Negatív Stop X 
Negatív Meger ősítés (  a ) Pozitív Finomítás (  b ) Negatív X 
Kétes (  c ) Finomítás (  b ) Negatív Meger ősítés (  a ) Negatív X 
Kétes (  c ) Finomítás (  b ) Negatív Meger ősítés (  a ) Pozitív X 
Kétes (  c ) Finomítás (  b ) Pozitív X 
Pozitív Finomítás (  b ) Negatív Meger ősítés (  a ) Pozitív X  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
1. futtatás 2. futtatás 3. futtatás Döntés 
Kimenetel Döntés Kimenetel Döntés Kimenetel Pozitív Negatív  
Negatív Meger ősítés (  a ) Pozitív Finomítás (  b ) Pozitív X 
Pozitív Finomítás (  b ) Pozitív Stop X  
( a ) A korábbi futtatást ugyanazon kísérleti terv használatával meg kell er ősíteni. 
( b ) A vizsgálatot 1/2-log koncentrációintervallumokkal újra kell futtatni (közrefogva azt a koncentrációt, amelyik jelent ősen 
különböz ő vizsgálati eredményt adott az el őző kísérletben). 
( c ) Az SC-hez viszonyított valahányszoros változás egy adott koncentrációnál statisztikailag szignifikánsan eltér.  
A tesztlemez min őség-ellenőrzése  
48. A QC-lemezre vonatkozó kritériumokon túlmen ően a párhuzamos lyukak 
közötti eltérésekre, az ismételt kísérletekre, a hormonmérési rendszerek line ­
aritására és érzékenységére, az ugyanazon minta párhuzamos hormonmé ­
rései közötti variabilitásra, és a hormoncsúcsoknak a táptalaj extrakciója 
(ha van ilyen; az extrakciós követelmények tekintetében lásd a 30. bekez ­
dést) utáni százalékos visszanyerésére vonatkozó egyéb min őségi kritériu ­
mokat is teljesíteni kell, amelyeket a 8. táblázat tartalmaz. Az adatoknak az 
egyes paraméterekre meghatározott elfogadható tartományon belül kell 
esnie, hogy figyelembe vehessük azokat a további értékelés során. Ameny ­
nyiben ezek a feltételek nem teljesülnek, a táblázatban meg kell jegyezni, hogy a szóban forgó minta esetében a QC-kritériumok nem teljesültek, és a 
mintát újra kell elemezni vagy ki kell zárni az adathalmazból.
 
8. táblázat  
A H295R-vizsgálati tesztlemez paramétereinek elfogadható tartományai és/vagy 
variációja (%).  
LOQ: a hormonmérési rendszer meghatározási határa; SC: oldószerkontroll; DPM: percenkénti 
bomlás  
Összehasonlítandó T E2  
Bazális hormontermelés 
az SC-kben Az LOQ valahányszorosa ≥ 5-ször ≥ 2,5-szer 
Expozíciós követelmények 
– Lemezen belüli relatív szórás az SC-k esetében 
(párhuzamos lyukak) Abszolút koncentrációk ≤ 30 % ≤ 30 % 
Expozíciós követelmények 
– Lemezek közötti relatív szórás az SC-k esetében (megismételt kísérletek) Valahányszoros változás ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormonmérési rendszer – 
Érzékenység Kimutatható valahány ­
szoros növekedés az OK- 
hoz viszonyítva ≥ 5-ször ≥ 2,5-szer 
Hormonmérési rendszer – 
Ismételt mérés relatív szórása az SC-k eseté ­
ben (
 a ) Abszolút koncentrációk ≤ 25 % ≤ 25 % 
Táptalaj extrakciója – A 
belső 3H standard kinye ­
rése (ha van ilyen) DPM ≥ 65 % nominális  
( a ) Ugyanazon minta ismételt méréseire vonatkozik.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ADATELEMZÉS ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Adatelemzés  
49. A vegyi anyag által módosított hormontermelés relatív növekedésének/csök ­
kenésének értékeléséhez az eredményeket normalizálni kell az egyes teszt ­
lemezek átlagos SC-értékéhez, és az eredményeket az SC-khez viszonyított változtatásban kell kifejezni minden tesztlemezen. Minden adatot átlag ± 1 szórás formában kell kifejezni.
 
50. Az adatok elemzése során csak az olyan lyukakból származó hormonada ­
tokat kell figyelembe venni, ahol a citotoxicitás alacsonyabb volt 20 %-nál. 
A relatív változásokat a következ ő módon kell kiszámítani:  
Relatív változás  = (hormonkoncentráció a lyukban) ÷ (oldószeres kontroll 
lyukak átlagos hormonkoncentrációja).  
51. Ha a lyuk vizuális ellen őrzése során úgy t űnik, vagy ha a 42. bekezdésben 
leírt életképességi/citotoxicitási vizsgálat azt mutatja, hogy a sejtek száma megnövekedett, a látszólagos növekedést ellen őrizni kell. Ha a sejtszám 
növekedése meger ősítésre kerül, ezt jelezni kell a vizsgálati jegyz őkönyv­
ben.
 
52. Statisztikai elemzések végzése el őtt a normalitásra és a szóráshomogenitásra 
vonatkozó feltételezéseket ki kell értékelni. A normalitást standard probabi ­
lity plotok használatával vagy más megfelel ő statisztikai módszerrel (pl. 
Shapiro-Wilk-teszt) kell értékelni. Ha az adatok (valahányszoros változások) 
nem normális eloszlásúak, akkor meg kell próbálni átalakítani az adatokat, hogy megközelítsék a normális eloszlást. Ha az adatok normális vagy megközelít őleg normális eloszlásúak, a vegyi anyag koncentrációcsoportjai 
és az SC-k közötti különbségeket egy paraméteres teszttel (pl. 
Dunnett-teszt) kell elemezni, ahol a  koncentráció  a független és a  válasz  
(valahányszoros változás) a függ ő változó. Ha az adatok nem normális 
eloszlásúak, egy megfelel ő nem-paraméteres tesztet kell alkalmazni (pl. 
Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank teszt). A különbségeket  p ≤ 0,05  
esetén tekintjük szignifikánsnak. Az egyes lyukak statisztikai értékelését az átlagos értékek alapján végezzük el, amelyek független párhuzamos adat ­
pontokat testesítenek meg. Mivel nagy a dózisok közötti távolság az els ő 
futtatásban (log
 10 -skála), várható, hogy sok esetben nem lehetséges egyér ­
telmű koncentráció-válasz kapcsolatokat leírása, ha a két legnagyobb dózis 
a szigmoid görbe lineáris részén van. Ezért az els ő futtatás vagy bármely 
más adathalmaz esetében, ahol ez a feltétel bekövetkezik (például ahol a 
maximális hatékonyság nem becsülhet ő), I. típusú rögzített változós statisz ­
tikákat kell alkalmazni a fent leírtak szerint.  
53. Ha több mint két adatpont fekszik a görbe lineáris részén és ha a maximális 
hatékonyságot ki lehet számítani – amint az egyes 2. futtatások esetében várható, amelyek az expozíciós koncentrációk fél-log távolságát használják 
– probit, logit vagy egyéb megfelel ő regressziós modellt kell használni a 
hatékony koncentrációk (pl. EC50 és EC20) kiszámításához.
 
54. Az eredményeket mind grafikus (átlag ± 1 szórást képvisel ő oszlopdiagra ­
mok), mind táblázatos (LOEC/NOEC, hatásirány, és a maximális válasz ereje, amely a dózis-válasz adatok részét képezi) formátum biztosítani kell (lásd a példát a 3. ábrán). Az adatok értékelése csak akkor tekinthet ő 
érvényesnek, ha az legalább két, egymástól függetlenül végzett futtatáson 
alapul. Egy kísérlet vagy futtatás akkor tekinthet ő függetlennek, ha azt 
másik időpontban, új oldatokkal és kontrollokkal végeztük el. A 2. és 3. 
futtatásban (ha szükséges) alkalmazott koncentrációtartományt ki lehet 
igazítani az 1. futtatás eredményei alapján, hogy jobban meghatározza 
a LOEC-t tartalmazó dózis-válasz tartományt (lásd a 47. bekezdést).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
3. ábra  
Példa a H295R-vizsgálat során nyert adatok bemutatására és értékelésére grafikus és táblázatos 
formában.  
A csillagok az oldószeres kontrollhoz viszonyított statisztikailag szignifikáns különbségeket jelzik  (p < 0,05) . 
LOEC: megfigyelhet ő hatást okozó legalacsonyabb koncentráció; Maximális változás: a bármilyen 
koncentráció mellett megfigyelt válasz legnagyobb er őssége az SC-válasz átlagához (= 1) képest.
  
Vegyi anyag LOEC Maximális változás  
Forskolin 0,01 0,15-szörös 
Letrozol 0,001 29-szeres  
Az adatok értelmezési eljárása  
55. A vizsgált vegyi anyagot akkor ítéljük pozitívnak, ha a valahányszoros 
indukció két szomszédos koncentrációban legalább két független futtatás során statisztikailag eltér ( p ≤ 0,05) a kontroll oldószert ől (7. táblázat). A 
vizsgált vegyi anyagot akkor ítéljük negatívnak, ha két független futtatás 
negatív eredményt ad, vagy három futtatás esetén, ha két futtatás negatív, és 
egy kétes vagy pozitív. Ha a három független kísérlet során generált adatok nem felelnek meg a 7. táblázatban felsorolt döntési kritériumoknak, a kísér ­
leti eredmények nem értelmezhet ők. Az oldhatóság határait meghaladó vagy 
citotoxikus koncentrációnál elért eredményeket nem kell figyelembe venni az eredmények értelmezésénél.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
56. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgáló intézmény  
— létesítmény neve és helye,  
— vizsgálatvezet ő és egyéb személyzet, valamint a vizsgálattal kapcsolatos 
felelősségi körök,  
— a vizsgálat kezdetének és végének dátuma.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Vizsgált vegyi anyag, reagensek és kontrollok  
— azonosító (adott esetben név/CAS-szám), forrás, tételszám, tisztaság, 
szállító, valamint a vizsgált vegyi anyag, a reagensek és a kontrollok 
jellemzői, 
— a vizsgált vegyi anyag fizikai természete és f őbb fizikai-kémiai tulaj ­
donságai,  
— a vizsgált vegyi anyagok, reagensek és kontrollok tárolási körülményei, 
az előkészítés módja és gyakorisága,  
— a vizsgált vegyi anyag stabilitása.  
Sejtek  
— a sejtek forrása és típusa,  
— a tesztben használt sejtek passzálásainak száma (passzázsazonosító),  
— a sejtkultúrák fenntartása használt eljárás leírása.  
Vizsgálat el őtti követelmények (ha van ilyen)  
— a vegyi anyag hormonvizsgálati interferencia tesztjének leírása és ered ­
ményeinek ismertetése,  
— a hormonextrakciós hatásfok méréseinek leírása és eredményeinek 
ismertetése,  
— valamennyi elvégzend ő analitikai vizsgálat standard és kalibrációs 
görbéi,  
— a választott analitikai vizsgálatok kimutatási határértékei.  
Vizsgálati körülmények  
— a táptalaj összetétele,  
— a vizsgált vegyi anyag koncentrációja,  
— sejtsűrűség (becsült vagy mért sejtkoncentráció 24 és 48 óra után),  
— a vizsgált vegyi anyag oldhatósága (oldhatósági határérték, ha meghatá ­
roztuk),  
— inkubációs id ő és körülmények.  
Vizsgálati eredmények  
— a kontrollok és vizsgált vegyi anyagok lyukainak–a párhuzamos méré ­
seknek a nyers adatai, a hormontermelés mérésére használt m űszer 
eredeti adatformátumában (pl. OD, fluoreszcencia egységek, DPM stb.),  
— a normalitás validálása vagy az adatok transzformációjának magyará ­
zata, 
— a lyukanként mért átlagos válaszok ± 1 szórás,  
— citotoxicitási adatok (citotoxicitás okozó vizsgálati koncentrációk),  
— annak meger ősítése, hogy QC-követelmények teljesültek,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— sejttoxicitással korrigált relatív változás az oldószeres kontrollhoz viszo ­
nyítva,  
— az egyes koncentrációknál észlelt relatív változást (valahányszoros válto ­
zás) mutató oszlopdiagram, a szórás és a statisztikai szignifikancia a 
49–54. bekezdés szerint.  
Az adatok értelmezése  
— alkalmazzuk az adatértelmezési eljárást az eredményekre, és vitassuk 
meg az eredményeket.  
Diszkusszió  
— Van-e utalás a vizsgálatban arra az eshet őségre, hogy a T/E2-adatokat 
befolyásolták a glüko- és mineralokortikoid utakra kifejtett közvetett hatások?
 
Következtetések  
SZAKIRODALOM  
(1) OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals, in Appendix 2 to Chapter B.54 
of this Annex  
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114-124.
 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23 – 30.
 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Available at [http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html]
 
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/ 
30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1, 00.html]  
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Available at: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_fi ­
nal_3_29_05.pdf]  
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Stero ­
idogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78-89.
 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44-54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265-272.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137-1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488-5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the stero ­
idogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the 
H295R cell line,  Chemosphere,  80:578-584.  
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148.
 
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731-737.
 
(16) Chapter B.55 of this Annex: Hershberger Bioassay in Rats: A short-term 
Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties.  
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222-231.  
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55-63.  
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
492.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Konfluencia : az a lefedettség vagy proliferáció, amelyet a sejtek a táptalaj felü ­
letén vagy a táptalajban elérnek.  
Vegyi anyag : anyag vagy keverék.  
Relatív szórás : a statisztikai eloszlás szórásának és számtani középértékének 
hányadosa.  
CYP : a citokróm P450 monooxigenázok, egy géncsalád és a bel őlük előállított 
enzimek, amelyek a legkülönböz őbb biokémiai reakciók katalizálásában vesznek 
részt, köztük a szteroidhormonok szintézisében és anyagcseréjében is.  
DPM : percenkénti bomlásszám. Azon atomok száma adott mennyiség ű radio­
aktív anyagban, amelyek az észlelés szerint egy perc alatt lebomlanak.  
E2: a 17β-ösztradiol, a legfontosabb ösztrogén az eml ősök szervezetében.  
H295R sejtek : humán adrenocarcinoma-sejtek, amelyek a zónásan differenciá ­
latlan humán magzati mellékvesesejtek fiziológiai jellemz őivel rendelkeznek, és 
amelyek a szteroidogenezis-útvonal összes enzimét kifejezik. Az ATCC-t ől 
szerezhetők be.  
Fagyasztó táptalaj : a sejtek lefagyasztására és a fagyasztott sejtek tárolására 
használt táptalaj. Alapmédiumból, valamint BD NuSerum-ból és 
dimetil-szulfoxidból áll.  
Lineáris tartomány : az a tartomány egy hormonmérési rendszer standard görbé ­
jén, amelyen belül az eredmények a mintában jelen lév ő analit koncentrációjával 
arányosak.  
LOQ : a meghatározási határ, vagyis az a legkisebb vegyianyag-mennyiség, 
amely egy megadott konfidenciahatáron belül megkülönböztethet ő az adott 
vegyi anyag hiányától (üres érték). Ha a szöveg másként nem jelzi, e módszer 
alkalmazásában az LOQ-t jellemz ően a vizsgálati rendszer gyártója határozza 
meg.  
LOEC : a megfigyelhet ő hatást okozó legalacsonyabb koncentráció, vagyis az a 
legkisebb koncentráció, amelynél a vizsgálat által adott válasz statisztikailag eltér 
az oldószerkontrollétól.  
NOEC : a megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentráció, vagyis az a legnagyobb 
vizsgált koncentráció, amelynél a vizsgálat még nem ad pozitív választ.  
Passzázs : az a szám, ahányszor a sejteket felosztottuk a sejtkultúrának a fagyasz ­
tott állományból való elindítása után. A fagyasztott állományból indított els ő 
passzázshoz az egyes szám van hozzárendelve (1). Az egy alkalommal már felosztott sejtek alkotják a 2. passzázst, stb.
 
PBS: a Dulbecco-féle, foszfáttal pufferolt sóoldat.  
Minőség-ellenőrzés: rövidítve QC, az érvényes adatok biztosításához szükséges 
intézkedések összessége.  
Minőség-ellenőrzési lemez : olyan 24 lyukú lemez, amely két-két koncentrációt 
tartalmaz pozitív és negatív kontrollból, és az új sejttételek viselkedésének ellen ­ 
őrzésére, illetve a vegyi anyagok vizsgálatához szükséges pozitív kontroll bizto ­
sítására szolgál.  
Futtatás : új oldatokkal és kontrollokkal elvégzett független vizsgálat.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Alapközeg : az egyéb reagensek elkészítésének alapja. A Dulbecco-féle módosí ­
tott Eagle-táptalaj és a Ham-féle F-12 tápanyagkeverék 1:1 arányú keveréke 
(DMEM/F12) 15 mM HEPES-pufferben, fenolvörös és nátrium-hidrogén- karbonát nélkül. Pufferként nátrium-hidrogén-karbonáttal egészítik ki, lásd a vali ­
dálási jelentés II. függelékét (4).
 
Kiegészített táptalaj : alapközegb ől plusz BD Nu-Serum-ból és ITS+ premium 
mixből álló táptalaj, lásd a validálási jelentés II. függelékét (4).  
Szteroidogenezis : a koleszterint ől a különböz ő szteroidhormonok szintéziséhez 
vezető út. A szteroidszintézis számos intermediere, mint például a progeszteron 
és a tesztoszteron önmagukban is fontos hormonok, de egyúttal prekurzorai is a szintézis folyamatában kés őbb keletkez ő hormonoknak.
 
T: tesztoszteron, a két legfontosabb androgén egyike az eml ősök szervezetében.  
Vizsgált vegyi anyag : e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált anyag vagy 
keverék.  
Vizsgálati lemez : az a lemez, amelyen a H295R-sejteket kitesszük a vizsgált 
anyag hatásának. A vizsgálati lemezek három-három példányt tartalmaznak az 
oldószeres kontrollból, valamint a vizsgált vegyi anyag hét koncentrációszintjé ­
ből. 
Tripszin 1X : a tripszin, egy, a hasnyálmirigyben termel ődő szerin-proteáz enzim 
híg oldata, amelyet arra használunk, hogy leválasszuk a sejteket a sejttenyészt ő 
lemezről, lásd a validálási jelentés III. függelékét (4).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  TRANSZGENIKUS RÁGCSÁLÓ SZOMATIKUS ÉS CSÍRASEJT 
GÉNMUTÁCIÓS VIZSGÁLATOK  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 488. vizsgálati iránymuta ­
tásában (2013) leírt módszerrel. Az  in vitro  mutációs vizsgálatok széles 
köréhez állnak rendelkezésre európai uniós vizsgálati módszerek, amelyek ki tudják mutatni a kromoszóma- és/vagy génmutációkat. Léteznek vizs ­
gálati módszerek az  in vivo  végpontokhoz is (pl. kromoszóma-rendellenes ­
ségek és nem tervezett DNS-szintézis), ezek azonban nem mérik a génmu ­
tációt. A transzgenikus rágcsáló (TGR) mutációs tesztek kielégítik a gyakor ­
latias és széles körben elérhet ő in vivo  génmutációs tesztek iránti igényt.
 
2. A TGR mutációs teszteket alaposan felülvizsgálták (24) (33). Ezek a tesztek 
transzgenikus patkányokat és egereket használnak, amelyek a kromoszó ­
mába integrált plazmid vagy a fág shuttle vektorok több példányát is tartal ­
mazzák. A transzgének riporter géneket tartalmaznak a vizsgált vegyi anyagok által  in vivo  indukált különböz ő típusú mutációk kimutatása céljá ­
ból.
 
3. A rágcsálóban el őforduló mutációkat úgy értékeljük, hogy a transzgént 
kinyerjük és a riporter gén fenotípusát egy olyan bakteriális gazdasejtben elemezzük, amelyb ől hiányzik ez a riporter gén. A TGR génmutációs vizs ­
gálatok a rágcsálók szinte bármely szövetéb ől visszanyert, genetikailag 
semleges génekben el őidézett mutációkat mérni tudják. Ezek a vizsgálatok 
tehát megkerülik a legtöbb meglév ő korlátot, amelyek az endogén gének  in 
vivo génmutációs vizsgálataihoz kapcsolódnak (pl. a szövetek korlátozott 
alkalmassága az elemzésre, negatív/pozitív szelekció a mutációkkal szem ­
ben).
 
4. A bizonyítékok azt jelzik, hogy a transzgének hasonló módon reagálnak 
mutagénekre, mint az endogén gének, különösen a bázispár szubsztitúciók, a frameshift mutációk, és a kis deléciók és inszerciók kimutatása tekinte ­
tében (24).
 
5. A genotoxicitás vizsgálatával foglalkozó nemzetközi m űhely (International 
Workshops on Genotoxicity Testing – IWGT) jóváhagyta a TGR génmu ­
tációs vizsgálatok felvételét a génmutációk  in vivo  kimutatására szolgáló 
vizsgálatok közé, és egy protokollt javasolt a végrehajtásukra (15) (29). Ez a vizsgálati módszer ezen az ajánláson alapul. A protokoll használatát 
támogató további elemzések találhatók a szakirodalomban (16).
 
6. Várható, hogy a TGR génmutációs vizsgálatot a jöv őben össze lehet majd 
kapcsolni egy ismételt dózisú toxicitási vizsgálattal (e melléklet B.7. feje ­
zete). Adatokra van azonban szükség annak igazolására, hogy a TGR génmutációs tesztek érzékenységét nem befolyásolja az ismételt dózisú toxi ­
kológiai vizsgálatban használt, az adagolási id őszak vége és a mintavételi 
idő közötti rövidebb, egynapos id őtartam, szemben a TGR génmutációs 
tesztekben használt 3 nappal. Az adatokra annak igazolása céljából is szükség van, hogy az ismételt dózisú vizsgálat teljesítményét nem érinti 
hátrányosan a transzgenikus rágcsálótörzs használata a hagyományos 
rágcsálótörzsek helyett. Amikor ezek az adatok rendelkezésre állnak, a módszert aktualizálni fogják.
 
7. A kulcsfontosságú fogalmak meghatározásai a függelékben találhatók.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
8. Azok a TGR génmutációs vizsgálatok, amelyek esetében elegend ő adat áll 
rendelkezésre, hogy támogassák az alkalmazását ebben a vizsgálati 
módszerben, a következ ők: lacZ -bakteriofág egér (Muta™Mouse);  lacZ - 
plazmid egér;  gpt-delta (gpt és Spi  – ) egér és patkány;  lacI -egér és -patkány 
(Big Blue®), standard körülmények között elvégezve. Ezen túlmen ően a cII 
pozitív szelekciós vizsgálat használható a mutációk értékelésére a Big 
Blue® és Muta™Mouse modellekben. A mutagenezist a TGR modellekben általában mutációs gyakoriságként értékelik; szükség esetén azonban további információkat nyújthat a mutációk molekuláris elemzése (lásd a 
24. bekezdést).
 
9. A rágcsáló  in vivo  génmutációs vizsgálatok különösen fontos szerepet 
játszanak a mutagén veszély becslésében, mivel az ezekben a vizsgála ­
tokban adott válaszok az  in vivo  metabolizmustól, a farmakokinetikától, 
a DNS-javító folyamatoktól és a transzléziós DNS-szintézist ől függenek, 
bár ezek a különböz ő fajok, a különböz ő szövetek és a különböz ő típusú 
DNS-károsodások esetén eltér őek lehetnek. A génmutációk  in vivo  vizs­
gálata hasznos eszköz az  in vitro  rendszerben észlelt mutagén hatások 
további vizsgálata, valamint a más  in vivo  végpontokat használó vizsgálatok 
eredményeinek nyomonkövetése során (24). A génmutáció amellett, hogy ok-okozati összefüggésben áll a rákos megbetegedés indukciójával, fontos 
végpont a szomatikus szövetek mutációalapú, nem daganatos betegségeinek 
(12) (13), valamint a csíravonalon keresztül átadott betegségek el őrejelzése 
szempontjából is.
 
10. Ha bizonyíték van arra, hogy a vizsgált vegyi anyag vagy egy fontos 
metabolitja nem éri el egyik célszövetet sem, akkor a TGR génmutációs vizsgálat nem alkalmazható.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
11. A 8. bekezdésben leírt vizsgálatokban a megcélzott gén bakteriális vagy 
bakteriofág-eredet ű, ezért a rágcsáló genomiális DNS-éb ől való visszanyerés 
eszköze a transzgén beépítése egy λ-bakteriofágba vagy egy plazmid shuttle 
vektorba. Az eljárás magában foglalja a genomiális DNS-nek a rágcsáló 
célszövetéb ől való extrakcióját, a genomiális DNS in vitro feldolgozását 
(azaz a λ-vektorok becsomagolását, vagy a plazmidok ligációját és elektro ­
porációját a shuttle vektor helyreállítására), valamint a mutációk azt követ ő 
kimutatását a bakteriális gazdaszervezetben, megfelel ő körülmények között. 
A vizsgálatokhoz semleges transzgéneket használunk, amelyek a legtöbb 
szövetből könnyen kinyerhet ők. 
12. Az alap TGR génmutációs kísérlet során a rágcsálót meghatározott ideig 
kezeljük a vegyi anyaggal. A vegyi anyagot bármilyen megfelel ő útvonalon 
beadhatjuk, beleértve a beültetést is (pl. orvosi eszközök vizsgálata). Azt a teljes időtartamot, ameddig az állatnak a vegyi anyagot adagoljuk, adagolási 
időszaknak nevezik. Az adagolást általában egy olyan id őszak követi az 
állat elpusztítása el őtt, amelynek során a vegyi anyagot nem adagoljuk és 
amelynek során a kijavítatlan DNS-léziók stabil mutációként rögzülnek. A szakirodalomban ezt az id őszakot többféleképpen is nevezik: manifesztációs 
idő, fixációs id ő vagy expressziós id ő; az időszak vége a mintavétel 
időpontja (15) (29). Az állat elpusztítását követ ően genomiális DNS-t izolá ­
lunk a célszövet(ek)b ől és megtisztítjuk.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Adott állat egyféle szövetének több csomagolásból/ligálásból származó 
adatait általában aggregáljuk, és a mutációs gyakoriságot általában összesen 
10 5 -10 7 plakk-képz ő vagy kolóniaképz ő egység használatával értékeljük. 
Pozitív szelekciós módszer alkalmazása esetén az összes plakk-képz ő 
egységet meghatározzuk egy külön nem szelektív lemezkészlettel.  
14. A pozitív szelekciós módszereket azért fejlesztették ki, hogy megkönnyítsék 
a mutációk kimutatását mind a  gpt-génben [ gpt-delta egér és patkány,  gpt  – 
fenotípus (20) (22) (28)], mind a  lacZ -génben [Muta™Mouse vagy  lacZ - 
plazmid egér (3) (10) (11) (30)]; eközben a  lacI -gén mutációit Big Blue® 
állatokban egy nem szelektív módszerrel mutatják ki, amely színes (kék) 
plakkok képz ődésén keresztül azonosítja a mutációkat. Pozitív szelekciós 
módszer is rendelkezésre áll a λ-bakteriofág shuttle vektor  cII-génjében 
fellépő pontmutációk [Big Blue® egér vagy patkány és Muta™Mouse 
(17)] és a λ-red és - gam génekben fellép ő deléciós mutációk észlelésére 
[Spi  – szelekció  gpt-delta egérben és patkányban (21) (22) (28)]. A mutációs 
gyakoriságot úgy számítjuk ki, hogy a transzgénben mutációkat tartalmazó plakkok/plazmidok számát elosztjuk az azonos DNS-mintából kinyert 
összes plakk/plazmid számával. A TGR génmutációs vizsgálatokban a 
mutációs gyakoriság a jegyz őkönyvezett paraméter. Ezen túlmen ően, a 
mutációs gyakoriságot a független mutációkat hordozó sejtek hányadaként is meg lehet határozni; ehhez a számításhoz szükség van a klonális expan ­
zióval való korrekcióra, amelyet a kinyert mutációk szekvenálásával 
végeznek el (24).
 
15. A  lacI , lacZ , cII és a  gpt pontmutációs tesztekben kimutatott mutációk 
főként bázispár szubsztitúciós mutációk, frameshift mutációk és kis inszer ­
ciók/deléciók. Az ilyen típusú mutációk relatív aránya a spontán mutációk 
között hasonló ahhoz, mint amit az endogén  Hprt -génben megfigyeltek. A 
nagy deléciókat csak a Spi  – szelekcióval és a  lacZ  plazmid vizsgálatokkal 
lehet kimutatni (24). Az érdekl ődésre számot tartó mutációk az egérben 
vagy patkányban  in vivo  előforduló mutációk. Az  in vitro  és ex vivo  mutá­
ciók, amelyek a fág/plazmid kinyerés, replikáció vagy javítás során fordul ­
hatnak el ő, viszonylag ritkák, és egyes rendszerekben konkrétan beazono ­
síthatók vagy a bakteriális gazda/pozitív szelekciós rendszerrel kizárhatók.  
A MÓDSZER ISMERTETÉSE  
Előkészületek  
Az állatfaj kiválasztása  
16. Jelenleg már többféle transzgenikus egéren végzett génmutáció-detektálási 
modell is létezik, és ezeket a rendszereket szélesebb körben használják, mint a transzgenikus patkányos modelleket. Ha a patkány egyértelm űen alkalma ­
sabb modell, mint az egér (például amikor olyan daganat karcinogenezi ­
sének mechanizmusát vizsgáljuk, amely csak patkányokban fordul el ő, 
amikor patkányon végzett toxicitási vizsgálattal való összehasonlításra van szükség, vagy ha a patkány anyagcseréjér ől ismert, hogy jobban reprezen ­
tálja az emberi anyagcserét), meg kell fontolni a transzgenikus patkányos 
modellek használatát.
 
Tartási és etetési körülmények  
17. A kísérleti állatokat ideálisan 22 °C (± 3 °C) h őmérséklet ű helyiségben kell 
tartani. Bár a helyiség relatív páratartalmának legalább 30 %-nak kell lennie, illetve a takarítás id őtartamától eltekintve lehet őleg nem haladhatja 
meg a 70 %-ot, célértékként az 50–60 % relatív páratartalom fenntartására 
kell törekedni. A világítás legyen mesterséges, naponta 12 órás világos 
időszakkal, amelyet 12 órás sötét periódusok kövessenek. Az etetéshez
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
hagyományos laboratóriumi takarmány alkalmazható, korlátlan mennyiség ű 
ivóvíz biztosítása mellett. A takarmány megválasztását a vizsgált vegyi 
anyaggal való megfelel ő keveredés igénye is befolyásolhatja, ha a vizsgált 
vegyi anyagot ezen az úton adjuk be. Az állatokat azonos nem ű állatokból 
álló kis csoportokban (legfeljebb öt állat) kell elhelyezni, amennyiben nem 
várható agresszív viselkedés. Ha tudományos szempontból indokolt, az 
állatok egyedileg is elhelyezhet ők. 
Az állatok el őkészítése  
18. Az egészséges, fiatal, ivarérett feln őtt (a kezelés kezdetén 8–12 hetes) állat ­
okat véletlenszer űen soroljuk be a kontroll- és a kezelési csoportokba. Az 
állatokat egyenként azonosítani kell. Az állatokat legalább öt napig szok ­
tatni kell a laboratóriumi körülményekhez. A ketreceket úgy kell elrendezni, hogy a lehet ő legkisebb legyen a ketrec elhelyezésének lehetséges hatása. A 
vizsgálat kezdetén az állatok testtömege lehet őleg csak minimálisan térjen el 
egymástól, és a nemenkénti átlagos értékt ől maximum ± 20 %-kal külön ­
bözhet.
 
A dózisok el őkészítése  
19. Az állatoknak történ ő adagolás el őtt a szilárd halmazállapotú vizsgált vegyi 
anyagokat fel kell oldani vagy szuszpendálni kell megfelel ő oldószerekben 
vagy viv őanyagokban, vagy bele kell keverni a takarmányba vagy az 
ivóvízbe. A folyékony vizsgált vegyi anyagok közvetlenül vagy az adagolás előtt hígított formában alkalmazhatók. Belélegzéses expozíció esetén a vizs ­
gált vegyi anyagok fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függ ően gáz, g őz vagy 
szilárd/folyadék aeroszol formában adagolhatók. A vizsgált vegyi anyagból 
mindig friss készítményeket kell alkalmazni, kivéve akkor, ha az anyag tárolás során való stabilitása bizonyított.
 
Vizsgálati körülmények  
Oldószer/Viv őanyag  
20. Az oldószer/viv őanyag nem okozhat toxikus hatásokat a választott dózisok 
mellett, és nem alkalmazható olyan anyag, amelyr ől feltehető, hogy kémiai 
reakcióba fog lépni a vizsgált vegyi anyaggal. Ha nem jól ismert oldószert/ vivőanyagot alkalmazunk, akkor felhasználását alá kell támasztani a kompa ­
tibilitását bizonyító referenciaadatokkal. Amennyiben lehetséges, el őször 
valamilyen vizes oldószer/viv őanyag használatát ajánlatos megfontolni.
 
Pozitív kontrollok  
21. Általában szükséges párhuzamos pozitív kontrollállatokat használni. 
Azokban a laboratóriumokban azonban, amelyek igazolták a szakértelmüket 
(lásd a 23. bekezdést) és rendszeresen végzik ezeket a vizsgálatokat, a 
módszer sikerességének igazolására a korábban pozitív kontrollal kezelt állatokból származó DNS is felhasználható. Az ilyen korábbi kísérletekb ől 
származó DNS-eket ugyanabból a fajból és célszövetb ől kell venni, és 
megfelelően kell tárolni (lásd a 36. bekezdést). Párhuzamos pozitív kontr ­
ollok használatakor nem szükséges az állatokat ugyanazon az útvonalon kezelni, mint a vizsgált vegyi anyag esetében, azonban a pozitív kontr ­
olloknak bizonyítottan mutációkat kell kiváltaniuk a vizsgált vegyi anyag 
egy vagy több célszövetében. A pozitív kontroll céljára felhasznált vegyi 
anyagok dózisait úgy kell megválasztani, hogy olyan, gyenge vagy mérsé ­
kelt hatást váltsanak ki, amely kritikus a vizsgálati eljárás m űködése és 
érzékenysége szempontjából. A pozitív kontroll céljára felhasználható 
vegyi anyagokra és a hozzájuk tartozó célszövetekre az 1. táblázat tartalmaz 
példákat.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
1. táblázat  
Példák a pozitív kontroll céljára felhasználható vegyi anyagokra és azok célszöveteire  
Pozitív kontroll vegyi anyag 
és CAS-száma EINECS-név és 
EINECS-szám Jellemzők Mutációs célszövet 
Patkány Egér  
N-etil-N-nitrózurea 
[CAS-szám: 759-73-9] N-etil-N-nitrózurea 
[212-072-2] Közvetlenül ható 
mutagén Máj, tüdő Csontvel ő, vastag ­
bél, vastagbél-epit ­
helium, belek, máj, 
tüdő, lép, vese, pete ­
fészek granulosa sejtek, hím csíra ­
sejtek 
Etil-karbamát (uretán) 
[CAS-szám: 51-79-6] Uretán 
[200-123-1] Mutagén, metabo ­
lizmust igényel, 
de csak gyenge 
hatása van Csontvelő, előgyo­
mor, vékonybél, 
máj, tüdő, lép 
2,4-diamino-toluén 
[CAS-szám: 95-80-7] 4-metil-m-fenilén-diamin 
[202-453-1] Mutagén, metabo ­
lizmust igényel, pozitív az Spi
 – 
vizsgálatban is Máj Máj 
Benzo[a]pirén 
[CAS-szám: 50-32-8] Benzo[def]krizén 
[200-028-5] Mutagén, metabo ­
lizmust igényel Máj, omenta Csontvel ő, emlő, 
vastagbél, el őgyo­
mor, mirigyes gyomor, szív, máj, tüdő, hím csírasejtek
 
Negatív kontrollok  
22. Minden mintavételi id őpontban negatív kontrollokat is kell használni, 
amelyeket csak oldószerrel és viv őanyaggal kezeltünk, és a kezelésük egyé ­
biránt ugyanolyan módon történik, mint a kezelési csoportoké. Ha nem 
állnak rendelkezésre olyan történeti vagy publikált kontrolladatok, amelyek igazolják, hogy a választott oldószer/viv őanyag nem idéz el ő ártalmas vagy 
mutagén hatásokat, a viv őanyag kontroll elfogadhatóságának megállapítása 
érdekében kezeletlen kontrollokat is alkalmazni kell minden mintavételi 
időpontban.
 
A laboratórium jártasságának igazolása  
23. A szakértelmet ezekben a vizsgálatokban a publikált adatok alapján várható 
eredmények reprodukálására való képesség demonstrálásával kell megálla ­
pítani (24) a következ ő területeken: 1) mutációs gyakoriság pozitív kontroll 
vegyi anyagokkal (beleértve a gyenge válaszokat is), például az 1. táblá ­
zatban felsorolt anyagokkal, nem mutagénekkel, valamint viv őanyag kontr ­
ollokkal, és 2) transzgén kinyerése genomiális DNS-b ől (pl. csomagolás 
hatékonysága).  
A mutációk szekvenálása  
24. Jogszabályi célú alkalmazás esetében a mutációk DNS-szekvenálása nem 
szükséges, különösen, ha a kapott eredmény egyértelm űen pozitív vagy 
negatív. A szekvenálási adatok azonban hasznosak lehetnek, ha nagy inter ­
individuális variáció figyelhet ő meg. Ezekben az esetekben a szekvenálást 
arra lehet használni, hogy kizárja a jackpot vagy klonális eseményeket az egyedi mutációk arányának egy adott szövetben való azonosításával. Állat ­
onként és szövetenként körülbelül 10 mutáció szekvenálásának elegend őnek 
kell lennie annak egyszer ű megállapításához, hogy a klonális mutációk 
hozzájárultak-e a mutációs gyakorisághoz; akár 25 mutáció szekvenálására lehet viszont szükséges a mutációs gyakoriság klonalitással való matema ­
tikai korrekciójához. A mutációk szekvenálása akkor is megfontolandó, 
amikor a mutációs gyakoriság kismérték ű növekedését (azaz éppen csak
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
meghaladja a kezeletlen kontroll értékeket) figyelik meg. A mutációs spekt ­
rumnak a kezelt és a kezeletlen állatokból származó mutáns telepek közötti 
különbségei alátámasztják a mutagén hatást (29). A mutációs spektrumok hasznosak lehetnek a mechanisztikus hipotézisek kifejlesztése során is. Ha a szekvenálást bele kell foglalni a vizsgálati protokollba, nagy figyelmet kell 
fordítani az ilyen vizsgálatok elrendezésére, különös tekintettel a mintánként 
szekvenált mutációk számára, hogy elérjük az alkalmazott statisztikai modell szerinti megfelel ő erőt (lásd a 43. bekezdést).
 
ELJÁRÁS  
Az állatok száma és neme  
25. Az állatok csoportonkénti számát úgy kell el őre meghatározni, hogy elegen ­
dően nagy legyen ahhoz, hogy biztosítsa legalább a megduplázódott mutá ­
ciós gyakoriság kimutatásához szükséges statisztikai er őt. A csoportméret 
legalább öt állat, de ha a statisztikai er ő nem elegend ő, az állatok számát 
szükség szerint növelni kell. Alapesetben hím állatokat kell használni. Előfordulhatnak olyan esetek, amikor indokolt lenne csak n őstényeket tesz ­
telni, például ha n őkben alkalmazandó humán gyógyszereket tesztelnek, 
vagy amikor a n őkre jellemz ő metabolizmust vizsgálják. Ha jelent ős 
különbségek vannak a nemek között toxicitás vagy anyagcsere szempont ­
jából, akkor hímekre és n őstényekre is szükség lesz.
 
Adagolási id őszak  
26. Megfigyelések szerint a mutációk a kezelések során egyre inkább felhalmo ­
zódnak, ezért ismételt dózisú kezelésre van szükség naponkénti kezeléssel 
28 napon keresztül. Ez általában elfogadhatónak tekinthet ő a gyenge muta ­
gének által el őidézett mutációk elegend ő felhalmozódásához, illetve 
megfelelő expozíciós id őt biztosít a mutációknak a lassan osztódó szer ­
vekben való kimutatásához. Egyes értékelésekhez alternatív kezelési 
sémák is megfelel őek lehetnek, de ezeket az alternatív adagolási sémákat 
tudományosan meg kell indokolni a protokollban. A kezelések nem lehetnek rövidebbek, mint az összes releváns metabolizáló enzim teljes indukciójához szükséges id ő, és a rövidebb kezelések több, a különböz ő 
proliferációs sebesség ű szerveknek megfelel ő mintavételi id őpontot tehetnek 
szükségessé. Valamennyi rendelkezésre álló információt (pl. általános toxi ­
citás, metabolizmus és farmakokinetika) fel kell használni a protokoll igazo ­
lása során, különösen, ha a protokoll eltér a fenti szabványajánlásoktól. Bár 
a 8 hétnél hosszabb kezelési id ők növelhetik a vizsgálat érzékenységét, 
ezeket világosan meg kell magyarázni és indokolni, mivel a hosszú kezelési idők a mutációs gyakoriság látszólagos növekedését okozhatják a klonális 
expanziónak köszönhet ően (29).
 
Dózisszintek  
27. A dózisszinteket az általános toxicitást mér ő dózisbehatároló vizsgálat ered ­
ményeire kell alapozni, amelyet azonos expozíciós módon végeztünk el, 
vagy pedig a korábbi szubakut toxicitási vizsgálatok eredményeire. A dózis ­
tartományok meghatározásához ugyanazon rágcsálótörzsb ől származó nem 
transzgenikus állatokat lehet használni. A f ő vizsgálat során annak érdeké ­
ben, hogy dózis-válasz adatokat lehessen gy űjteni, a teljes vizsgálatnak egy 
negatív kontrollcsoportot is tartalmaznia kell (lásd a 22. bekezdést), vala ­
mint legalább három, egymástól megfelel ő távolságra elhelyezked ő dózisz­
szintet, kivéve, ha a határdózist használjuk (lásd a 28. bekezdést). A fels ő 
dózis a maximális tolerálható dózis (MTD) legyen. Az MTD az a dózis, 
amely olyan egyértelm ű toxicitásjeleket vált ki, hogy annál magasabb 
adagok, azonos adagolás mellett, várhatóan halált okoznak. A kis nem  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
mérgező dózisban specifikus biológiai aktivitást mutató vegyi anyagok 
(mint például a hormonok és a mitogének), valamint azok a vegyi anyagok, 
amelyek a toxikokinetikai tulajdonságok telít ődését mutatják, kivételek 
lehetnek a dózismeghatározási követelmények alól, és eseti alapon kell őket értékelni. Az alkalmazott dózisoknak át kell fogniuk a maximálistól 
a már csak kissé vagy egyáltalán nem toxikusig terjed ő tartományt.
 
Határdózis-vizsgálat  
28. Ha a dózisbehatárolási kísérletek vagy a rokon rágcsálótörzsekb ől származó 
adatok azt jelzik, hogy a legalább a határdózist tartalmazó kezelési séma (lásd lentebb) semmilyen megfigyelhet ő toxikus hatást nem hoz létre, és ha 
nem várható genotoxicitás a szerkezetileg rokon anyagokkal kapcsolatos 
adatok alapján, akkor nem szükséges a három dózis használatával végrehaj ­
tott teljes vizsgálat. 28 napos adagolási id őszak (azaz 28 db napi kezelés) 
esetén a határdózis 1 000 mg/testtömeg kg/nap. 14 napos vagy annál rövi ­
debb adagolási id őszak esetén a határdózis 2 000 mg/testtömeg kg/nap (a 28 
napi kezelést ől eltérő adagolási rendeket tudományosan meg kell indokolni 
a protokollban, lásd a 26. bekezdést).
 
A dózisok beadása  
29. A vizsgált vegyi anyagot rendszerint gyomorszondán keresztül inkubációs 
kanül segítségével, vagy hasüregbe adott injekció segítségével adjuk be. A 
vizsgálat tervezése során általánosságban az emberi expozíció várható 
útvonalát figyelembe kell venni. Ezért az egyéb expozíciós útvonalak (pél ­
dául ivóvíz, szubkután, intravénás, küls őleg, inhalációs, intratracheális, 
étrendi vagy implantáció) is elfogadhatók lehetnek, amennyiben azokat 
meg lehet indokolni. Az intraperitoneális injekció nem ajánlott, mivel az 
nem egy fiziológiailag releváns emberi expozíciós útvonal. A gyomor ­
szondán keresztül vagy injekcióval egyszerre beadható maximális folyadék ­
mennyiség a kísérleti állat méretét ől függ. A térfogat nem haladhatja meg a 
2 ml/100 g testtömeg mennyiséget. Az ennél nagyobb mennyiségek hasz ­
nálatát meg kell indokolni. A magasabb koncentrációban rendszerint foko ­
zottabb hatást kiváltó irritáló vagy maró vegyi anyagok kivételével a koncentráció megfelel ő beállításával a minimálisra kell csökkenteni a vizs ­
gált anyag mennyiségének változásait, hogy a mennyiség valamennyi 
adagolási szinten konstans legyen.
 
Mintavételi id őpontok  
Szomatikus sejtek  
30. A mintavételi id ő egy kritikus változó, mivel a mutációk rögzüléséhez szük ­
séges időtartam határozza meg. Ez az id őtartam szövetspecifikus, és úgy 
tűnik, hogy kapcsolatban áll a sejtpopuláció kicserél ődési idejével, 
amelynek szempontjából a csontvel ő és a belek gyors reagálású, a máj 
viszont sokkal lassabb reagálású szervnek számít. A mutációs gyakori ­
ságnak mind a gyorsan, mind a lassan osztódó szövetekben való mérésére megfelelő kompromisszum a 28 egymást követ ő napon történ ő kezelés (a 
26. bekezdésben jelzettek szerint), valamint az utolsó kezelés után három 
nappal történ ő mintavétel, bár a maximális mutációs gyakoriság a lassan 
osztódó szövetekben ilyen körülmények között esetleg nem manifesztálódik. Amennyiben a lassan osztódó szövetek különösen fontosak, a 28 napos adagolási id őtartam után 28 nappal történ ő későbbi mintavétel megfelel őbb 
lehet (16) (29). Ebben az esetben a kés őbbi mintavételi id őpont felváltja a 3 
napos mintavételi id őpontot, amit tudományosan is meg kell indokolni.
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Csírasejtek  
31. A TGR-vizsgálatok alkalmasak a génmutáció indukciójának tanulmányozá ­
sára hím csírasejtekben (7) (8) (27), amelyekben a spermatogenezis id őzí­
tését és kinetikáját már pontosan meghatározták (27). Az elemzés céljára 
még szuperovuláció után is alacsony számban rendelkezésre álló petesejtek, 
valamint az a tény, hogy a petesejtekben nincs DNS-szintézis, kizárják a mutáció transzgenikus vizsgálattal való meghatározását a n ői csírasejtekben 
(31).
 
32. A hím csírasejtek mintavételi id őpontjait úgy kell megválasztani, hogy a 
kitett sejttípusok széles tartományából lehessen mintát venni a csírasejt- 
fejlődés teljes folyamatában, illetve úgy, hogy a mintavételben megcélzott 
szakasz kell ő expozícióban részesüljön. A fejl ődő csírasejteknek a sperma ­
togoniális őssejtből az érett, az ondóvezetéket/mellékhere farkát elér ő sper­
miummá való progressziójához szükséges id őtartam ~49 nap egérben (36) 
és ~70 nap patkányban (34) (35). Az ondóvezetékb ől/mellékhere farkából a 
28 napos expozíció és a rákövetkez ő háromnapos mintavételi id őszak 
szerint gy űjtött felhalmozódott sperma (7) (8) fogja képviselni a spermato ­
genesis nagyjából második felében kitett sejtpopulációt, amely magában 
foglalja a meiotikus és posztmeiotikus id őszakot is, de nem tartalmazza a 
spermatogoniális vagy őssejt időszakot. Annak érdekében, hogy megfele ­
lően tudjunk mintát venni az ondóvezetékb ől/mellékhere farkából azokból a 
sejtekből, amelyek az expozíciós id ő alatt még spermatogoniális őssejtek 
voltak, egy további mintavételi id őpontra is szükség van legalább 7 héttel 
(egér) vagy 10 héttel (patkány) a kezelés befejezését követ ően. 
33. A herecsatornácskákból a 28 + 3 napos kezelési és mintavételi menetrend 
szerint kinyert sejtek egy kevert populációt tartalmaznak, amelyben a csíra ­
sejtek fejl ődésének minden szakasza képviselve van (7) (8). Ezeknek a 
sejteknek a génmutáció kimutatása céljából történ ő mintavétele nem ad 
olyan pontos értékelést azokról a szakaszokról, amelyekben a csírasejt- 
mutációkat el őidézték, mint a spermiumoknak az ondóvezetékb ől/mellék­
here farkából való mintavétele (hiszen a tubulusokból vett mintában több ­
féle csírasejt-típus fordul el ő, és lesz néhány szomatikus sejt is, amely 
szennyezi a sejtpopulációt). Ha azonban a herecsatornácskákból való sejt ­
mintavételt az ondóvezetékb ől/mellékhere farkából származó ondósejtekkel 
kombinálják, és a mintavételre a 28 + 3 napos mintavételi rend szerint kerül sor, az bizonyos szinten lefedi a csírasejt-fejl ődés fázisainak többségében 
kitett sejteket, és hasznos lehet néhány csírasejt-mutagén kimutatására.
 
Megfigyelések  
34. Naponta legalább egyszer, lehet őleg minden nap ugyanazon id őpont(ok)ban 
általános klinikai megfigyelést kell végezni, figyelembe véve az adagolást 
követően várható hatások érvényesülésének csúcsid őszakát. Fel kell jegy ­
ezni a kísérleti állatok klinikai állapotát. Naponta legalább kétszer meg kell vizsgálni az összes állatot megbetegedés és elhullás szempontjából. Minden 
állat tömegét hetente legalább egyszer, illetve elpusztításkor is le kell mérni. 
A felvett táplálék mennyiségét heti rendszerességgel le kell mérni. Ameny ­
nyiben a vizsgált vegyi anyagot az ivóvízzel adjuk be, a vízfogyasztást minden vízcsere alkalmával és legalább hetente le kell mérni. A túlzott 
toxicitás nem halálos jeleit mutató állatokat a vizsgálati id őszak befejezése 
előtt el kell altatni (23).
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
A szövetek gy űjtése  
35. A szövetek gy űjtését világosan meg kell indokolni. Mivel a mutációk 
indukcióját gyakorlatilag bármilyen szövetben tanulmányozni lehet, a 
begyűjtendő szövetek kiválasztását a vizsgálat lefolytatásának okára, illetve 
a vizsgálat alatt álló vegyi anyaggal kapcsolatban rendelkezésre álló muta ­
genitási, karcinogenitási vagy toxicitási adatokra kell alapozni. A megfon ­
tolandó lényeges tényez ők közé kell tartoznia a beadás útjának (a valószín ű 
emberi expozíciós útvonal(ak)ra alapozva), a becsült szöveti megoszlásnak, valamint a lehetséges hatásmechanizmusnak. A háttérinformációk hiányában többféle érdekesnek t űnő szomatikus szövetet is kell gy űjteni. Ezeknek 
gyorsan osztódó, lassan osztódó és az érintkezés helyén található szöveteket 
is képviselniük kell. Ezenkívül az ondóvezetékb ől/mellékhere farkából szár ­
mazó ondósejteket és a herecsatornácskákból származó fejl ődő csírasejteket 
(a 32. és 33. bekezdésben leírtak szerint) is össze kell gy űjteni és el kell 
tárolni arra az esetre, ha a jöv őben a csírasejt-mutagenitás elemzésére lenne 
szükség. A szervek tömegét meg kell mérni, és a nagyobb szervek esetében ugyanazokat a területeket kell begy űjteni az összes állatból.
 
A szövetek és a DNS tárolása  
36. A szöveteket (vagy szövethomogenizátumokat) – 70 °C-on vagy az alatt 
kell tárolni és 5 éven belül fel kell használni DNS-izolálásra. A h űtőszek­
rényben 4 °C-on, megfelel ő pufferben tárolt izolált DNS-t optimálisan 1 
éven belül kell felhasználni mutációanalízisre.  
A szövetek kiválasztása mutációanalízisre  
37. A szövetek kiválasztásának megfelel ő megfontolásokon kell alapulnia, 
például: 1) a beadási útvonal vagy az els ő érintkezés helye (pl. mirigyes 
gyomor, ha az adagolás orális, tüd ő, ha az adagolás inhalációs, vagy b őr, ha 
helyi alkalmazás történt), és 2) az általános toxicitási vizsgálatokban 
megfigyelt farmakokinetikai paraméterek, amelyek szöveti hajlamot, vissza ­
tartást vagy felhalmozódást jeleznek, vagy megmutatják a toxicitás célszer ­
veit. Ha a vizsgálatokat a karcinogenitási vizsgálatok nyomonkövetése 
céljából végezzük el, a karcinogenitás célszöveteit figyelembe kell venni. 
A szövetek elemzésre való kiválasztásának maximalizálnia kell azoknak a vegyi anyagoknak a kimutatását, amelyek közvetlenül ható  in vitro  muta­
gének, gyorsan metabolizálódnak, nagyon reaktívak vagy rosszul szívódnak 
fel, vagy azokét a vegyi anyagokét, amelyek esetében a beadás módja hatá ­
rozza meg a célszövetet (6).
 
38. Háttérinformációk hiányában és figyelembe véve az érintkezés helyét a 
beadás módja alapján, a májat és legalább egy gyorsan osztódó szövetet (pl. mirigyes gyomor, csontvel ő) kell értékelni mutagenitás szempontjából. 
A legtöbb esetben a fenti követelményeket már két gondosan kiválasztott 
szövet elemzésével teljesíteni lehet, de bizonyos esetekben három vagy több 
szövetre lehet szükség. Ha jelent ősebb ok van arra, hogy csírasejtekre 
gyakorolt hatásokat feltételezzünk, beleértve a szomatikus sejtek pozitív 
válaszait is, a csírasejt-szövetek mutációit is vizsgálni kell.
 
Mérési módszerek  
39. A mutációk kimutatására szabványos laboratóriumi vagy publikált 
módszerek állnak rendelkezésre az ajánlott transzgenikus modellekhez:  
lacZ-lambda bakteriofág és plazmid (30);  lacI -egér (2) (18);  gpt-delta egér 
(22);  gpt-delta patkány (28);  cII (17). A módosításokat meg kell indokolni 
és megfelel ően dokumentálni kell. Több csomagolás adatait összesíteni lehet 
és a plakkok vagy telepek megfelel ő számának elérésére lehet használni. Ha 
azonban nagyszámú csomagolási reakcióra van szükség, hogy elérjük a plakkok megfelel ő számát, az rossz min őségű DNS jele lehet. Ilyen 
esetekben az adatokat óvatosan kell kezelni, mert megbízhatatlanok lehet ­
nek. Az DNS-mintánkénti plakkok vagy telepek optimális száma szempont ­
jából a kell ő számú mutáció adott spontán mutációs gyakoriság melletti
 ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
felderítésének statisztikai valószín űsége az irányadó. Általában legalább 
125 000–300 000 plakkra van szükség, ha a spontán mutációs gyakoriság 
nagyságrendje 3 × 10  –5 (15). A Big Blue®  lacI -vizsgálat esetében fontos 
annak igazolása, hogy a mutáns szín fenotípusok teljes körét ki lehet mutatni megfelel ő színkontrolloknak az egyes vizsgálati lemezekkel párhu ­
zamos alkalmazásával. A szöveteket és a kapott mintákat (elemeket) blokk 
elrendezés segítségével kell feldolgozni és elemezni, ahol a viv őanyag/ol­
dószer kontrollcsoport elemeit, a pozitív kontrollcsoportot (ha van) vagy a pozitív kontroll DNS-t (adott esetben), valamint minden egyes kezelési 
csoportot együtt dolgoznak fel.
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
Az eredmények feldolgozása  
40. Az egyes állatok adatait táblázatban kell összefoglalni. A kísérleti egység 
maga az állat. A jegyz őkönyvnek tartalmaznia kell az összes plakk-képz ő 
egység (PFU) vagy telepképz ő egység (cfu) számát, a mutációk számát, 
valamint a mutációs gyakoriságot az összes állatból származó valamennyi 
szövet esetében. Ha több csomagolási/tartalék reakciót végeztek, a DNS- 
mintánkénti reakciók számát jegyz őkönyvezni kell. Noha minden egyes 
reakció adatait meg kell őrizni, csak a teljes pfu- vagy CFU-értéket szük ­
séges jegyz őkönyvezni. A toxicitásra és a klinikai tünetekre vonatkozó 
adatokat a 34. bekezdés alapján jegyz őkönyvezni kell. A mutációk szekve ­
nálásának eredményeit, valamint az ebb ől eredő, az egyes állatokra és 
szövetekre vonatkozó mutációs gyakorisági számításokat be kell mutatni.  
Statisztikai értékelés és az eredmények értelmezése  
41. Különböz ő kritériumok léteznek a pozitív eredmény meghatározására, ilyen 
például a mutációs gyakoriság növekedése a dózis függvényében vagy a 
mutációs gyakoriság egyértelm ű növekedése egy meghatározott dóziscso ­
portban az oldószer/viv őanyag kontrollcsoporthoz viszonyítva. Legalább 
három kezelt dóziscsoportot kell megvizsgálni annak érdekében, hogy 
elegendő adat álljon rendelkezésre a dózis-válasz elemzéshez. Bár az ered ­
mények biológiai jelent őségének kell az els ődleges szempontnak lennie, 
megfelelő statisztikai módszereket is lehet alkalmazni a vizsgálati eredmé ­
nyek értékelése során (4) (14) (15) (25) (26). Az alkalmazott statisztikai 
teszteknek az állatot kell kísérleti egységnek tekinteniük.  
42. E vizsgálatban nem mutagén anyagnak tekintend ő az a vizsgált vegyi 
anyag, amely esetében a hozzá tartozó eredmények egyetlen szövetben sem elégítik ki a fenti kritériumokat. A negatív eredmény biológiai jelent ő­
ségéhez a szövet expozícióját igazolni kell.
 
43. A DNS-szekvenálási elemzések esetében számos statisztikai megközelítés 
áll rendelkezésre az eredmények értelmezéséhez (1) (5) (9) (19).  
44. A válaszreakció biológiai jelent őségének értékelésekor támpontot adhat 
annak mérlegelése, hogy a megfigyelt értékek a kontrollokkal kapott 
régebbi eredmények tartományába esnek-e (32).  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
45. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— azonosítási adatok és CAS-szám, ha ismert,  
— forrás és rendelkezésre állás esetén a tételszám,  
— fizikai jelleg és tisztaság,  
— a vizsgálat elvégzése szempontjából releváns fizikai-kémiai tulajdonsá ­
gok, 
— a vizsgált vegyi anyag stabilitása, ha ismert.  
Oldószer/viv őanyag:  
— a vivőanyag kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált vegyi anyag oldhatósága és stabilitása az oldószerben/viv ő­
anyagban, ha ismert,  
— a takarmány-, ivóvíz- vagy inhalációs készítmények el őkészítése,  
— a készítmények analitikai vizsgálatai (pl. stabilitás, homogenitás, 
névleges koncentráció).  
Kísérleti állatok:  
— a felhasznált faj/törzs és megválasztásuk indokolása,  
— az állatok száma, kora és neme,  
— az állatok származása, tartási körülmények, takarmány stb.,  
— az állatok tömege a vizsgálat kezdetekor, az egyes csoportok esetében a 
testtömegtartományt, átlagértéket és a szórást is ideértve.  
Vizsgálati körülmények:  
— a pozitív és negatív (viv őanyag/oldószer) kontrollok adatai,  
— a dózisbehatároló vizsgálat adatai,  
— az adagolási szintek kiválasztásának indoklása,  
— a vizsgált vegyi anyag el őkészítésére vonatkozó részletek,  
— a vizsgált vegyi anyag beadására vonatkozó adatok,  
— a beadási mód indoklása,  
— az állati toxicitás mérésére szolgáló módszerek, beleértve adott esetben a 
kórszövettani vagy hematológiai elemzéseket, illetve az állatok 
megfigyelésének és a testtömeg mérésének gyakorisága,  
— az annak ellen őrzésére szolgáló módszerek, hogy a vizsgált vegyi anyag 
elérte-e a célszövetet vagy az általános keringési rendszert, ha negatív 
eredményt kaptak,  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— tényleges dózis (mg/testtömeg kg/nap) a vizsgált vegyi anyagnak a 
takarmányban/ivóvízben meglév ő koncentrációjából (ppm) és a fogyasz ­
tásból számítva, ha alkalmazható,  
— a táplálék és a víz min őségére vonatkozó adatok,  
— a kezelési és mintavételi menetrendek részletes leírása és kiválasztásuk 
indoklása,  
— az eutanázia módja,  
— a szövetek izolálására és tartósítására használt eljárások,  
— a rágcsáló genomiális DNS izolálásának módszerei, a transzgén geno ­
miális DNS-b ől történő kinyerése és a transzgenikus DNS-átvitele a 
bakteriális gazdaszervezetbe,  
— valamennyi sejt, készlet és reagens beszerzési forrása és tételszáma 
(adott esetben).  
— a mutációk számolására szolgáló módszerek,  
— a mutációk molekuláris elemzésének módszerei és használatuk a klona ­
litás korrekciójára és/vagy a mutációs gyakoriság kiszámítására, ha van 
ilyen.  
Eredmények:  
— az állatok állapota a vizsgálati id őszak előtt és alatt, beleértve a toxicitás 
jeleit,  
— a test és a szervek tömege az elaltatáskor,  
— az egyes szövetek/állatok esetében a mutációk száma, az értékelt 
plakkok vagy telepek száma, a mutációs gyakoriság,  
— az egyes szövetek/állatcsoportok esetében a csomagolási reakciók 
DNS-mintánkénti száma, a mutációk száma összesen, az átlagos mutá ­
ciós gyakoriság, szórás,  
— a dózis-válasz kapcsolat, ahol lehetséges,  
— az egyes szövetek/állatok esetében a független mutációk száma és az 
átlagos mutációs gyakoriság, ha a mutációk molekuláris elemzését elvé ­
gezték,  
— párhuzamos és történeti negatív kontrolladatok tartományokkal, átlag ­
értékekkel és szórásokkal,  
— a párhuzamos pozitív kontrollok (vagy a nem párhuzamos DNS-pozitív 
kontroll) adatai,  
— analitikai meghatározások, amennyiben rendelkezésre állnak (pl. a 
csomagolás során használt DNS-koncentráció, a DNS-szekvenálás 
adatai),  
— statisztikai elemzések és alkalmazott módszerek.  
Az eredmények tárgyalása  
Következtetések  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
SZAKIRODALOM  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391-396.  
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659  
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’  , Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485-7489.
 
(8) Douglas, G.R ., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197-212.
 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’ , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  86(20): 7971–7975.
 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125-136.  
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96-106.  
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
(15) Heddle, J.A ., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Doug ­
las, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253-259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Muta ­
gen., 41: 1-6.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073–9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772-778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.
 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, ENV/ 
JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Paris.  
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141-151.
 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1-2): 117- 
123. 
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), »Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control 
Data«, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.  
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays , Series on Testing and Assessment, N
 o 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Paris.  
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198- 236.
 
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididy ­
mis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, 
J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, 
the Netherlands, pp. 1071-1148.  
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Adagolási id őszak : az a teljes id őszak, amely alatt az állatot kezelik.  
Bázispár cseréje : olyan típusú mutáció, amely egyetlen DNS nukleotid bázisnak 
egy másik DNS nukleotid bázissal való cseréjét okozza.  
Kapszid : a vírusrészecskét körülvev ő fehérjeburok.  
Vegyi anyag : egy anyag vagy keverék.  
Klonális expanzió : sok sejt el őállítása egyetlen (mutáns) sejtb ől. 
Kolóniaképz ő egység (cfu) : az életképes baktériumok mér őszáma.  
Konkatamer : hosszú, folytonos biomolekula, amely sorba kapcsolódott több 
azonos másolatból áll.  
Cos-hely : 12 nukleotidból álló egyszálú DNS-szegmens, amely a lambda bakte ­
riofág dupla szálú genomának mindkét végén megtalálható.  
Deléció : olyan mutáció, amelyben egy vagy több (szekvenciális) nukleotid elvész 
a genomból.  
Elektroporáció : elektromos impulzusok alkalmazása abból a célból, hogy 
növelje a sejtmembránok permeabilitását.  
Endogén gén : a genomban őshonos gén.  
Extra-binomiális variáció : egy populáció arányának az ismételt becslések során 
mutatkozó nagyobb változékonysága, mint ami várható lenne, ha a populációnak a binomiális eloszlása lenne.
 
Frameshift mutáció : számos nukleotid inszerciója vagy deléciója által okozott 
olyan genetikai mutáció, amely nem osztható maradék nélkül hárommal, egy 
olyan DNS-szekvencián belül, amely egy fehérjét/peptidet kódol.  
Inszerció : egy vagy több nukleotid bázispár hozzáadása egy DNS-szekvenciához.  
Jackpot : nagyszámú mutáció, amelyek klonális expanzió révén keletkeztek 
egyetlen mutációból.  
Nagy deléciók : több kilobázis méret ű deléciók a DNS-ben (amelyek hatékonyan 
kimutathatók a Spi  – szelekciós és a  lacZ -plazmid vizsgálatokkal).  
Ligálás : DNS-molekulák két végének kovalens összekapcsolása DNS-ligáz alkal ­
mazásával.  
Mitogén : olyan vegyi anyag, amely arra serkenti a sejtet, hogy sejtosztódásba 
kezdjen, kiváltva ezzel a mitózist (azaz a sejtosztódást).  
Semleges gén : olyan gén, amelyet nem befolyásolnak a pozitív vagy negatív 
szelekciós nyomások.  
Csomagolás : fertőző fágrészecskék szintézise fágkapszidból és farokfehérjékb ől, 
valamint fág DNS-molekulák konkatamerjéb ől álló készítményb ől. Általánosan 
használják a lambda-vektorra klónozott (cos-helyekkel elválasztott) DNS-nek a 
fertőző lambda-részecskékbe való becsomagolására.  
Csomagolási hatékonyság : az a hatékonyság, amellyel a csomagolt bakteriofá ­
gokat visszanyerik a gazdabaktériumokban.  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plakk-képz ő egység (pfu) : az életképes bakteriofágok mér őszáma.  
Pontmutáció : általános fogalom, amely a DNS-szekvencia csak egy kis részét 
érintő mutációkat foglalja magában, beleértve a kis inszerciókat, deléciókat és 
bázispár-szubsztitúciókat.  
Pozitív szelekció : olyan módszer, amely csak a mutációk túlélését teszi lehet ővé. 
Riporter gén : olyan gén, amelynek mutációs génterméke könnyen kimutatható.  
Mintavételi id ő: annak az id őszaknak a vége az állat elpusztítása el őtt, amelynek 
során a vegyi anyagot nem adagolják és amelynek során a feldolgozatlan 
DNS-léziók stabil mutációként rögzülnek.  
Shuttle vektor : oly módon felépített vektor, amely két különböz ő gazdafajban is 
szaporodni tud; ennek megfelel ően a shuttle vektorba illesztett DNS-t két külön ­
böző sejttípusban vagy két különböz ő élőlényben is lehet tesztelni vagy manipu ­
lálni.  
Vizsgált vegyi anyag : Bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  
Transzgenikus : olyan szervezet, amelynek genomja egy másik faj génjének vagy 
génjeinek átültetése révén megváltozott.”  ▼M5 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
C. RÉSZ: AZ ÖKOTOXICITÁS MEGHATÁROZÁSÁNAK MÓDSZEREI  
TARTALOMJEGYZÉK 
C.1. AKUT TOXICITÁS HAL ESETÉBEN C.2. DAPHNIA-FAJOK AKUT IMMOBILIZÁCIÓS VIZSGÁLATA 
C.3. SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLAT, ÉDESVÍZI ALGA ÉS 
CIANOBAKTÉRIUM 
C.4. A „GYORS” BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG MEGHATÁ ­
ROZÁSA 
I. RÉSZ ÁLTALÁNOS II. RÉSZ DOC (OLDOTT SZERVES SZÉN) CSÖKKENÉSÉNEK VIZS ­
GÁLATA (C.4-A. módszer) 
III. RÉSZ. MÓDOSÍTOTT OECD-VIZSGÁLAT (DOC-CSÖKKENÉS) (C.4- 
B. módszer). 
IV. RÉSZ CO
 2 -FEJLŐDÉS-VIZSGÁLAT (C.4-C. módszer) 
V. RÉSZ MANOMETRIKUS RESPIROMETRIÁS MÉRÉS (C.4-D. 
módszer) 
VI. RÉSZ. ZÁRTPALACK-MÓDSZER (C.4-E. módszer) VII. RÉSZ MITI-VIZSGÁLAT (C.4-F. módszer) C.5. LEBOMLÁS – BIOKÉMIAI OXIGÉNIGÉNY C.6. LEBOMLÁS – KÉMIAI OXIGÉNIGÉNY C.7. LEBOMLÁS – ABIOTIKUS LEBOMLÁS: HIDROLÍZIS A PH 
FÜGGVÉNYÉBEN. 
C.8. TOXICITÁS FÖLDIGILISZTÁKRA C.9. BIOLÓGIAI LEBOMLÁS – ZAHN–WELLENS VIZSGÁLAT C.10. AEROB SZENNYVÍZTISZTÍTÁS-SZIMULÁCIÓS VIZS ­
GÁLAT: C.10-A: ELEVENISZAPOS BERENDEZÉSEK – 
C.10-B: BIOFILMEK 
C.11. BIOLÓGIAI LEBOMLÁS – ELEVENISZAP-LÉGZÉSGÁTLÁSI 
VIZSGÁLAT 
C.12. BIOLÓGIAI LEBOMLÁS – MÓDOSÍTOTT SCAS-VIZSGÁLAT C.13. BIOKONCENTRÁCIÓ VIZSGÁLATA: ÁTFOLYÁSOS HAL 
VIZSGÁLAT 
C.14. HALIVADÉKOK NÖVEKEDÉSI VIZSGÁLATA C.15. RÖVID TÁVÚ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT HALEMBRIÓKKAL 
ÉS HALLÁRVÁKKAL 
C.16. HÁZIMÉH – AKUTORÁLISTOXICITÁS-VIZSGÁLAT C.17. HÁZIMÉH – AKUTKONTAKTTOXICITÁS-VIZSGÁLAT C.18. KÉMIAI ANYAGOK TALAJON TÖRTÉN Ő ADSZORPCIÓ ­
JÁNAK VIZSGÁLATA EGYENSÚLYI RENDSZERBEN
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ADSZORPCIÓS EGYÜTTHATÓ BECSLÉSE TALAJON ÉS 
SZENNYVÍZISZAPON NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYA ­
DÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (HPLC) 
C.20.  DAPHNIA MAGNÁ N VÉGZETT REPRODUKCIÓS VIZS ­
GÁLAT 
C.21. TALAJLAKÓ MIKROORGANIZMUSOK: NITROGÉN- 
ÁTALAKÍTÁSI VIZSGÁLAT 
C.22. TALAJLAKÓ MIKROORGANIZMUSOK: SZÉNÁTALAKÍ ­
TÁSI VIZSGÁLAT 
C.23. AEROB ÉS ANAEROB ÁTALAKÍTÁS A TALAJBAN C.24. AEROB ÉS ANAEROB ÁTALAKÍTÁS VÍZI ÜLEDÉKREND ­
SZEREKBEN 
C.25. AEROB MINERALIZÁCIÓ FELSZÍNI VIZEKBEN 
– VIZSGÁLAT A BIOLÓGIAI LEBONTÁS SZIMULÁLÁSÁRA 
C.26.  LEMNA  SP. NÖVEKEDÉSGÁTLÁSI VIZSGÁLATA
 
▼M4 
C.27. SZENNYEZETT ÜLEDÉKKEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ 
TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL 
C.28. SZENNYEZETT VÍZZEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICI ­
TÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL 
C.29. GYORS BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG: SZÉN-DIOXID- 
VIZSGÁLAT LÉGMENTESEN ZÁRT EDÉNYEKBEN (A 
GŐZTÉR CO  2 -TARTALMÁNAK VIZSGÁLATA) 
C.30. BIOLÓGIAI FELHALMOZÓDÁS SZÁRAZFÖLDI KEVÉSSER ­
TÉJŰEKBEN  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. AKUT TOXICITÁS HAL ESETÉBEN  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat célja valamely anyag akut letális toxicitásának meghatá ­
rozása édesvízi halak esetében. Hasznosnak bizonyul, ha rendelke ­
zésre állnak információk az anyag vízoldékonyságáról, g őznyomásá ­
ról, kémiai stabilitásáról, disszociációs állandóiról és biológiai lebonthatóságáról annak érdekében, hogy a legmegfelel őbb vizsgálati 
módszert lehessen kiválasztani (statikus, félstatikus vagy átfolyásos) 
a vizsgálat id őtartama alatt a vizsgált anyag kielégít ően állandó 
koncentrációinak biztosításához.
 
Mind a vizsgálat tervezéséhez, mind az eredmények értelmezéséhez 
figyelembe kell venni további információkat is (ilyenek például a 
szerkezeti képlet, a tisztasági fok, szennyez ődések jellege és száza ­
lékos aránya, adalékanyagok jelenléte és mennyisége, az n-oktanol/ ­
víz megoszlási koefficiens).  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Az akut toxicitás valamely anyag hatásának való kitételkor (expozí ­
ció) rövid id őn (napokon) belül, valamely szervezetben el őidézett, 
észlelhető káros hatás. E vizsgálatban az akut toxicitást a közepes 
letális koncentrációval (LC  50 ) kell kifejezni, vagyis azzal a vízben 
mért koncentrációval, amely a kísérleti halak csoportjának 50 %-ánál 
halált okoz valamilyen folyamatos expozíciós id őtartamon belül, 
amelyet meg kell adni.  
A vizsgált anyag minden koncentrációját tömeg/térfogat 
(milligramm/liter) mértékegységben kell megadni. E koncentrációk tömeg/tömeg mértékegységben (mg · kg
 –1 ) is megadhatók.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Vizsgálható referenciaanyag annak bemutatására, hogy a laborató ­
riumi vizsgálati körülmények között nem változott-e meg jelent ős 
mértékben a vizsgált fajok reakciója.  
E vizsgálathoz nincs el őírva referenciaanyag.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Végrehajtható határérték-vizsgálat 100 mg/liter koncentrációban 
annak bemutatására, hogy az LC  50 nagyobb, mint e koncentráció.  
A halakat a vízhez adott vizsgált anyag hatásának kell kitenni, 
koncentrációk egész tartományában, 96 órás id őtartamon át. A pusz ­
tulást legalább 24 órás id őközönként fel kell jegyezni, és ahol lehet ­
séges, ki kell számítani az egyes megfigyelési id őpontokban a halak 
50 %-át elpusztító koncentrációkat (LC  50 ). 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A minőségi követelmények mind a határérték-vizsgálati, mind a 
teljes vizsgálati módszerre érvényesek.  
A kontrollcsoportban a kísérlet végéig a halpusztulásnak nem szabad 
10 %-nál nagyobbnak lennie (vagy maximum egy hal pusztulhat el, 
ha tíznél kevesebb halat használnak).  
Az oldott oxigén koncentrációjának mindvégig nagyobbnak kell 
lennie, mint a leveg őtelítettségi érték 60 %-a.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
A vizsgált anyag koncentrációit a kísérlet során mindvégig a kezdeti 
koncentráció 80 %-án belüli értéken kell tartani.  
Az olyan anyagok esetében, amelyek stabil oldatokat képezve 
könnyen oldódnak a vizsgált közegben, tehát azok, amelyek jelent ős 
mértékben nem fognak párologni, lebomlani, hidrolizálni vagy 
abszorbeálódni, a kezdeti koncentráció a névleges koncentrációval egyenlőnek tekinthet ő. Bizonyítani kell, hogy a koncentrációk a vizs ­
gálat során mindvégig megmaradnak, és a min őségi követelmények 
teljesülnek.
 
Azon anyagok esetében, amelyek:  
i. a vizsgált közegben kevéssé oldhatók; vagy  
ii. stabil emulziók vagy diszperziók létrehozására képesek; vagy  
iii. vizes oldatokban nem stabilak,  
abból kell kiindulni, hogy a kezdeti koncentráció a vizsgálat 
kezdetén az oldatban mért (vagy ha ez technikailag nem lehetséges, 
a vízoszlopban mért) koncentráció. A koncentrációt az egyensúlyba hozatal után, de a kísérleti halak behelyezése el őtt kell meghatározni.
 
Ezen esetek közül mindegyikben további méréseket kell végrehajtani 
a vizsgálat során a tényleges expozíciós koncentrációk meger ősíté­
sére, vagy annak meger ősítésére, hogy teljesülnek-e a min őségi 
követelmények.  
A pH-nak nem szabad 1 egységnél nagyobb mértékben változnia.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Típusát tekintve háromféle eljárás használható:  
Statikus vizsgálat:  
Ez olyan toxicitásvizsgálat, amelyben a vizsgált oldat nem áramlik. 
(Az oldatok mindvégig változatlanok maradnak a vizsgálat végrehaj ­
tása során.)  
Félstatikus vizsgálat:  
Olyan, a vizsgált oldat áramlása nélküli vizsgálat, amelynél rend ­
szeresen, adagonként ki kell cserélni a vizsgált oldatokat hosszabb 
időtartamok (például 24 óra) eltelte után.  
Átfolyásos vizsgálat:  
Olyan toxicitásvizsgálat, amelyben a vizet állandóan cserélik a vizs ­
gálati kamrákban, a már használt vízzel együtt elszállítva a vizsgált 
kémiai anyagot a vizsgált közeg kicserélése érdekében.  
1.6.1.  Reagensek  
1.6.1.1.  A vizsgált anyagok oldatai  
El kell készíteni a szükséges er ősségű törzsoldatokat az anyagnak 
ionmentesített vízben vagy az 1.6.1.2. pontnak megfelel ő vízben 
történő feloldásával.  
A kiválasztott vizsgált koncentrációkat a törzsoldat hígításával kell 
elkészíteni. Ha nagy koncentrációkat vizsgálnak, az anyag közvet ­
lenül a hígítóvízben feloldható.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Az anyagokat általában csak az oldhatóság határáig kell vizsgálni. 
Néhány anyagnál (például olyan anyagok esetében, amelyeknek kicsi 
a vízoldékonysága, nagy a P  ow értéke, vagy azok esetében, amelyek 
stabil diszperziót alkotnak, nem pedig valódi oldatot hoznak létre vízben) elfogadható az anyag oldhatósági határa fölötti vizsgált 
koncentráció használata a maximális oldható/stabil koncentráció 
elérésének biztosítására. Fontos azonban, hogy e koncentráció ne zavarja meg a vizsgált rendszert valamilyen más módon (például az anyagból a víz felszínén képz ődött, és a víz oxigénellátását 
akadályozó film révén).
 
Ultrahangos diszpergálás, szerves oldószerek, emulgeáló- vagy disz ­
pergálószerek használhatók alacsony vízoldékonyságú anyagok törzs ­
oldatai elkészítésének el ősegítésére, vagy a vizsgált közegben az 
ilyen anyagok diszpergálódásának segítésére. Amikor ilyen segéd ­
anyagokat használnak, minden vizsgált koncentrációnak ugyanolyan mennyiség ű segédanyagot kell tartalmaznia, és további kontrollh ­
alakat kell kitenni a segédanyag ugyanolyan koncentrációja hatásá ­
nak, mint amelyet a vizsgálati sorozatokban alkalmaznak. Minden ilyen segédanyag koncentrációját minimális értéken kell tartani, de semmi esetre sem szabad meghaladnia a 100 mg/liter értéket a vizs ­
gált közegben.
 
A vizsgálatot a pH-érték beállítása nélkül kell végrehajtani. Ha 
létezik bizonyíték a pH-érték jelent ős változására, ajánlatos a vizs ­
gálat megismétlése a pH-érték beállításával, meg kell adni az így 
kapott eredményeket. Ezen esetben be kell állítani a törzsoldat pH- értékét a hígítóvíz pH-értékére, kivéve ha különleges okok szólnak ellene. E célra a legkedvez őbb a HCl és az NaOH használata. Ezt a 
pH-korrekciót úgy kell végrehajtani, hogy ne változzon meg jelent ős 
mértékben a vizsgált anyag koncentrációja a törzsoldatban. Ha a beállítás a vizsgált vegyület valamilyen kémiai reakcióját vagy fizikai kicsapódását okozza, ezt közölni kell a jelentésben.
 
1.6.1.2.  Tároló- és hígítóvíz  
Ivóvízellátó rendszerb ől vett (klór, nehézfémek vagy más anyagok 
potenciálisan káros koncentrációival nem szennyezett), jó min őségű 
természetes víz vagy m űvíz (lásd az 1. függeléket) használható. A 10 
és 250 mg/l közötti keménység ű (CaCO  3 -ként meghatározva), 6,0 és 
8,5 közötti pH-jú vizeket kell el őnyben részesíteni.  
1.6.2.  Készülék  
Minden készüléket kémiailag inert anyagból kell készíteni:  
— automatikus hígító rendszer (átfolyásos vizsgálathoz),  
— oxigénmér ő, 
— vízkeménység meghatározására szolgáló berendezés,  
— megfelel ő készülék a h őmérséklet szabályozásához,  
— pH-mér ő. 
1.6.3.  Kísérleti hal  
A halaknak jó egészségi állapotban kell lenniük, és mindenfajta 
látható testi hibától mentesnek kell lenniük.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
A kísérlethez használt fajtákat olyan gyakorlati kritériumok alapján 
kell kiválasztani, mint például egész évbeni könny ű beszerezhet ősé­
gük, a problémamentes tartás, a vizsgálati célokra való megfelel őség, 
relatív érzékenység a kémiai anyagokra és minden olyan gazdasági, biológiai vagy ökológiai tényez ő, amelynek bármilyen hatása lehet. 
A halfajták kiválasztásakor a kapott adatok összehasonlíthatóságát és 
a nemzetközi harmonizáció szükségességét (lásd az 1. pontban hivat ­
kozott szakirodalmat) is szem el őtt kell tartani.
 
A 2. függelék ismerteti az e vizsgálat végrehajtásához javasolt 
halfajták jegyzékét; az el őnyben részesített fajták a zebradánió és a 
szivárványos pisztráng.  
1.6.3.1.  Tartás  
A kísérleti halaknak lehet őleg egyetlen állományból kell származ ­
niuk, hasonló méret űeknek és korúaknak kell lenniük. A halakat 
legalább 12 napig a következ ő körülmények között kell tartani:  
betöltés:  
a rendszernek (visszaforgatás vagy átáramoltatás) és a halfajtáknak 
megfelelően, 
víz: 
lásd az 1.6.1.2. pontot,  
világítás:  
napi 12–16 órás megvilágítás,  
oldott oxigén koncentrációja:  
a levegőtelítettségi érték legalább 80 %-a,  
etetés:  
hetente vagy naponta háromszor, amelyet a vizsgálat kezdete el őtt 24 
órával befejeznek.  
1.6.3.2.  Mortalitás  
A 48 órás szoktatási id őtartamot követ ően fel kell jegyezni az 
elpusztult állatok számát a következ ő kritériumok alkalmazásával:  
— ha a populáció 10 %-ánál több hal elpusztul 7 napon belül:  
akkor a teljes állományt le kell selejtezni,  
— ha a populáció 5 és 10 %-a pusztul el:  
akkor a tartási id ő 7 további nappal meghosszabbodik.  
Ha további pusztulás nem történik, az állomány elfogadható, 
egyébként nem,  
— ha a populáció kevesebb, mint 5 %-a pusztul el:  
akkor az állomány alkalmazható a vizsgálathoz.  
1.6.4.  Szoktatási id őtartam  
Az alkalmazás el őtt minden halat legalább 7 napig kell tartani olyan 
minőségű és hőmérséklet ű vízben, mint amit a vizsgálat során 
fognak alkalmazni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  A kísérlet végrehajtása  
A vizsgálatot megel őzheti egy el őzetes vizsgálat, amely informáci ­
ókkal szolgál arról a koncentrációtartományról, amelyet a f ő vizs­
gálatban kell használni.  
A vizsgált sorozaton kívül vizsgált anyag nélküli kontrollvizsgálatot, 
és a segédanyagot tartalmazó kontrollanyag-vizsgálatot is végre kell hajtani.
 
A vizsgált vegyület fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ ően stati­
kus, félstatikus vagy átfolyásos vizsgálatot lehet választani, a min ő­
ségi követelmények teljesítése érdekében.  
A halakat a következ ő módon kell kitenni az anyag hatásának:  
— időtartam: 96 óra,  
— állatok száma: koncentrációnként legalább 7,  
— tartályok: alkalmas űrtartalmúak, a javasolt egyeds űrűség figye ­
lembevételével,  
— egyeds űrűség: 1 g hal/liter ajánlott a statikus és a félstatikus 
vizsgálatokhoz; az átfolyásos rendszerekhez elfogadható ennél 
nagyobb egyeds űrűség is,  
— vizsgált koncentráció: legalább 5, egymástól 2,2-et nem 
meghaladó konstans tényez ővel eltérő és, amennyire lehetséges, 
a 0–100 %-os mortalitási tartományt átfed ő koncentráció,  
— víz: lásd az 1.6.1.2. pontot,  
— világítás: 12–16 órás megvilágítás naponta,  
— hőmérséklet: a fajtáknak megfelel ő (lásd a 2. függeléket), de 
minden esetben ± 1  o C-on belül,  
— az oldott oxigén koncentrációja: a kiválasztott h őmérsékleten a 
levegőtelítettségi érték nem kevesebb, mint 60 %-a,  
— etetés: nincs.  
A halakat meg kell vizsgálni az els ő 2–4 óra után, és legalább 24 
órás időközönként. A halak akkor tekinthet ők élettelennek, ha a 
farokúszó érintése nem vált ki reakciót, és nem látható semmilyen 
légzőmozgás. Az elpusztult halakat el kell távolítani, és ezt fel kell 
jegyezni. Nyilvántartást kell vezetni a látható rendellenességekr ől 
(például egyensúly-vesztés, az úszási viselkedés és a légzés változá ­
sai, pigmentáció stb.).  
Naponta végre kell hajtani a pH-érték, az oldottoxigén-koncentráció 
és a hőmérséklet méréseit.  
Határérték-vizsgálat  
Az e módszerben leírt eljárások segítségével végrehajtható a határ ­
érték-vizsgálat 100 mg/l koncentrációval annak bemutatására, hogy 
az LC  50 nagyobb, mint e koncentráció.  
Ha az anyag olyan természet ű, hogy nem érhet ő el a vizsgált vízben 
a 100 mg/l-es koncentráció, a határérték-vizsgálatot a használt közegben az anyag oldhatóságával egyenl ő koncentrációval (vagy a 
stabil diszperziót alkotó maximális koncentrációval) kell végrehajtani 
(lásd még az 1.6.1.1. pontot is).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
A határérték-vizsgálatot 7–10 hallal kell végrehajtani úgy, hogy a 
kontrollcsoportban lév ő halak száma ezzel azonos legyen. (A bino ­
miális elmélet szerint, amikor 10 hal alkalmazása mellett nem tapasz ­
taltak halálozást, akkor 99,9 %-os a megbízhatósága annak, hogy az LC
 50 nagyobb, mint a határérték-vizsgálatban használt koncentráció. 
7, 8 vagy 9 hal esetében a nulla halálozás legalább 99 %-os megbíz ­
hatóságot biztosít arra, hogy az LC  50 nagyobb, mint az alkalmazott 
koncentráció).  
Ha pusztulás következik be, a teljes vizsgálatot végre kell hajtani. Ha 
szubletális hatásokat figyelnek meg, ezeket fel kell jegyezni.  
2. ADATOK ÉS KIÉRTÉKELÉS  
Minden olyan id őtartamhoz, amikor megfigyeléseket jegyeztek fel 
(24, 48, 72 és 96 óra), fel kell rajzolni a féllogaritmusos papírra az egyes javasolt expozíciós id őtartamok során a koncentráció függ ­
vényében megállapított százalékos pusztulást.
 
Ha lehetséges, minden egyes megfigyelési id őhöz meg kell becsülni 
az LC  50 -et és a konfidenciahatárokat (p = 0,05) standard eljárások 
segítségével; ezen értékeket egy vagy legfeljebb két szignifikáns 
számjegyre kell kerekíteni (példák két számjegyre kerekítésre: a 
173,5-ből 170; 0,127-b ől 0,13; 1,21-b ől 1,2 lesz).  
Olyan esetekben, amikor a koncentráció/hatás görbe meredeksége túl 
nagy ahhoz, hogy lehet ővé váljon az LC  50 kiszámítása, elegend ő 
ezen érték grafikus becslése.  
Ha két, egymást követ ő koncentráció 2,2 arány mellett csak 0 és 
100 %-os pusztulást ad, akkor ez a két érték elegend ő azon tarto ­
mány jelzésére, amelybe az LC  50 esik. 
Ha megállapítható, hogy nem tartható fenn a vizsgált anyag stabili ­
tása vagy homogenitása, ezt közölni kell a jelentésben, és körülte ­
kintően kell eljárni az eredmények értelmezésekor.  
3. JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a kísérleti halakkal kapcsolatos információkat (tudományos név, 
törzs, szállító, mindenféle el őkezelés, számuk és méretük az 
egyes vizsgált koncentrációkban),  
— a hígítóvíz eredetét és f ő kémiai jellemz őit (pH, keménység, 
hőmérséklet),  
— alacsony vízoldékonyságú anyagok esetében a törzsoldat és vizs ­
gált oldat elkészítésének módszerét,  
— minden segédanyag koncentrációját,  
— a használt koncentrációk jegyzékét és a vizsgált oldatban a vizs ­
gált anyag koncentrációinál a stabilitással kapcsolatban rendelke ­
zésre álló minden információt,  
— kémiai elemzés esetén: a használt módszereket és kapott eredmé ­
nyeket,  
— a határérték-vizsgálat eredményeit, adott esetben,  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás kiválasztásának indokait és rész ­
leteit (például statikus, félstatikus, adagolási sebesség, átfolyási 
sebesség, leveg őztetett-e, egyeds űrűség stb.),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— a vizsgáló berendezés leírását,  
— a világítási rendszert,  
— a vizsgált oldatok oldottoxigén-koncentrációit, pH-értékeit és 
hőmérsékleteit, minden 24 órában,  
— bizonyítékot arról, hogy teljesültek a min őségi követelmények,  
— táblázatot, amely mutatja a kumulatív pusztulást minden egyes 
koncentráció és kontroll esetében (és ha szükséges, a segéd ­
anyagot tartalmazó kontroll esetében is) minden egyes javasolt 
megfigyelési id őpontban,  
— a koncentráció/hatás görbe grafikus ábrázolását a vizsgálat végén,  
— ha lehetséges, az LC  50 -értékeket minden egyes javasolt 
megfigyelési id őpontban (95 %-os konfidenciahatárokkal),  
— az LC  50 -értékek meghatározására használt statisztikai eljárásokat,  
— ha referenciaanyagot használnak, a kapott eredményeket,  
— azt a legnagyobb vizsgált koncentrációt, amely még nem okoz 
pusztulást a vizsgálat id őtartamában,  
— azt a legalacsonyabb vizsgált koncentrációt, amely 100 %-os 
pusztulást okoz a vizsgálat id őtartamában.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 203. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges és frissítések.  
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to 
Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.
 
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to 
Salmo gairdneri – Static and Flow-through methods – NFT 90- 
303 June 1985.  
(4) ISO 7346/1, /2 and /3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan –  Teleostei , Cyprini­
dae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: 
Flow-through method.
 
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden – Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata , 1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertabrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, fourteenth edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolf, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen für die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793–821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying biossay results. Water Res., 1970, vol. 
4., 3–32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65–84.
 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
1. függelék:  
Művíz 
Példa megfelel ő hígítóvízre  
Minden kémiai anyagnak analitikai tisztaságúnak kell lennie.  
A víznek jó min őségű, desztillált víznek vagy 5 μScm  –1 -nél kisebb vezet őképes­
ségű, ioncserélt víznek kell lennie.  
A víz desztillálásához használt készüléknek semmilyen rézb ől készült alkatrészt 
nem szabad tartalmaznia.  
Törzsoldatok:  
CaCl  2 ·2H 2 O (kalcium-klorid-dihidrát): 
Vízben kell feloldani, és vízzel 1 literre feltölteni. 11,76 g 
MgSO  4 ·7H 2 O (magnézium-szulfát-heptahidrát): 
Vízben kell feloldani, és vízzel 1 literre feltölteni. 4,93 g 
NaHCO  3 (nátrium-hidrogén-karbonát): 
Vízben kell feloldani, és vízzel 1 literre feltölteni. 2,59 g 
KCl (kálium-klorid): 
Vízben kell feloldani, és vízzel 1 literre feltölteni. 0,23 g  
A hígításhoz használt m űvíz 
A négy törzsoldat mindegyikéb ől 25 ml-t kell összekeverni, és vízzel 1 literre 
feltölteni.  
A keveréket addig kell leveg őztetni, amíg az oldott oxigén koncentrációja 
egyenlő nem lesz a leveg őtelítettségi értékkel.  
A pH-nak 7,8 ± 0,2-nek kell lennie.  
Ha szükséges, a pH-t NaOH-val (nátrium-hidroxiddal) vagy HCl-dal (sósavval) 
kell beállítani.  
Az így elkészített hígítóvizet 12 óráig állni kell hagyni, és nem szabad tovább 
levegőztetni.  
Ezen oldatban a Ca- és Mg-ionok összege 2,5 mmol/liter. A Ca:Mg ionok aránya 
4:1 és az Na:K ionok aránya 10:1. Ezen oldat teljes lúgossága 0,8 mmol/liter.  
A hígítóvíz elkészítésekor nem szabad megváltoztatni a víz összetételét vagy 
tulajdonságait.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
2. függelék:  
A vizsgálathoz javasolt halfajták  
Javasolt fajták Javasolt vizsgálati 
hőmérséklet-tarto ­
mány (  o C) A kísérleti állatok 
javasolt összhosz ­
szúsága (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton–Buchanan) zebradánió 20-tól 24-ig 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) amerikai cselle 20-tól 24-ig 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) ponty 20-tól 24-ig 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poecilidae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck and Schlegel 
1850) japán fogasponty 20-tól 24-ig 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) guppi 20-tól 24-ig 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centr ­
archidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) 
kékkopoltyús naphal 20-tól 24-ig 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) szivárványos piszt ­
ráng 12-től 17-ig 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
neaus 1758) jász 20-tól 24-ig 6,0 ± 2,0  
Tenyésztés  
A fent felsorolt halakat könny ű tenyészteni és/vagy könnyen beszerezhet ők az 
egész év során. Alkalmasak a tenyésztésre vagy halgazdaságokban, vagy labora ­
tóriumban, betegség- és parazitakontrollált állapotok mellett úgy, hogy a kísérleti állatok egészségesek és ismert származásúak lesznek. E halak a világ számos részén rendelkezésre állnak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
3. függelék:  
Példa koncentrációra: elpusztulás százalékban  
Példa LC  50 meghatározására féllogaritmusos papír segítségével
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA-FAJOK  AKUT IMMOBILIZÁCIÓS VIZSGÁLATA  
1. MÓDSZER  
Ez az akut immobilizációs vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 
TG 202 (2004) módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a módszer egy akut toxicitási vizsgálatot ír le, amely a vegyi 
anyagok Daphniákra gyakorolt hatását értékeli. Amennyire csak lehetett, meglév ő vizsgálati módszereket alkalmaztunk (1) (2) (3).
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Ezzel a módszerrel összefüggésben a következ ő meghatározásokat 
alkalmazzuk:  
EC 50 : az a becsült koncentráció, amely a Daphniák 50 %-át mozgás ­
képtelenné teszi valamely meghatározott expozíciós id őtartamon 
belül. Amennyiben más meghatározás kerül alkalmazásra, arról be kell számolni, a referenciájával együtt.
 
Mozgásképtelenség : Azokat az állatokat, amelyek a vizsgálati tartály 
óvatos megkeverése után 15 másodpercen belül nem képesek úszni, mozgásképtelennek kell tekinteni (még akkor is, ha a csápjaikat még 
tudják mozgatni).
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A fiatal Daphniákat, melyek a vizsgálat kezdetén 24 órásnál fiata ­
labbak, a vizsgált anyag különböz ő koncentrációinak teszik ki 48 
órás időtartamon át. Az immobilizálást 24 és 48 óra elteltével rögzí ­
tik, és összehasonlítják a kontrollértékekkel. Az eredményeket elemzik a 48 órás EC
 50 kiszámítása végett (lásd az 1.2. szakaszt a 
meghatározásokról). A 24 órás EC  50 meghatározása opcionális.  
1.4. INFORMÁCIÓ A VIZSGÁLATI ANYAGRÓL  
Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát és g őznyomását, és a 
vizsgálati oldatokban lév ő anyag mennyiségi meghatározásához 
rendelkezni kell egy olyan megbízható analitikai módszerrel, amelynél ismert a visszanyerési hatékonyság és meghatározás 
korláta. A hasznos információk közé tartozik a szerkezeti képlet, 
az anyag tisztasága, vízben való stabilitása vagy fénystabilitása, a P
 ow és a gyors biológiai lebonthatóságra vonatkozó vizsgálat ered ­
ményei (lásd C.4. módszer).  
Megjegyzés: A fizikai, kémiai tulajdonságaik miatt nehezen vizsgál ­
ható anyagok vizsgálatának útmutatóját a 4. szakasz tartalmazza.  
1.5. REFERENCIAANYAGOK  
Az EC  50 vizsgálata referenciaanyagra is elvégezhet ő a vizsgálati 
körülmények megbízhatóságának biztosítására. Erre a célra a nemzetközi körvizsgálatokban (1) (5) használt mérgez ő anyagok 
javasoltak (
 1 ). A referenciaanyagos vizsgálato(ka)t lehet őleg havonta, 
és évente legalább kétszer kell elvégezni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) E laboratóriumközi vizsgálatok eredményei és az ISO 6341 technikai kiigazítása szerint a 
kálium-dikromát (K  2 Cr 2 O 7 ) 24 órás EC  50 értéke a 0,6 mg/l–1,7 mg/l tartományban 
található.
 1.6. MIN ŐSÉGI KRITÉRIUMOK  
A vizsgálat érvényességéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak 
kell teljesülniük:  
— A kontrollokban, beleértve az szolubilizálószert tartalmazó kont ­
rollt, a Daphniák immobilizálási aránya nem haladhatja meg a 
10 %-ot,  
— A vizsgálat végéig az oldott oxigén koncentrációja legyen 
≥ 3 mg/l a kontrollban és a vizsgálati tartályokban.  
Megjegyzés: Az els ő kritérium esetében a kontroll-Daphniák legfel ­
jebb 10 %-a lehet mozgásképtelen, illetve mutathatja kór vagy 
stressz más jeleit, például elszíntelenedést, szokatlan viselkedést, mint például a víz felszínére szorulást.
 
1.7. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.7.1.  Berendezés  
A vizsgálati tartályoknak és más, a vizsgált oldatokkal érintkezésbe 
kerülő berendezések teljes mértékben üvegb ől vagy más, kémiailag 
inert anyagból kell készülniük. A vizsgálati tartályok rendszerint üveg kémcsövek vagy f őzőpoharak; ezeket minden egyes használatot 
megelőzően szabványos laboratóriumi eljárással meg kell tisztítani. 
A vizsgálati tartályokat lazán le kell fedni, csökkentve a párolgásos 
vízvesztést, és megakadályozva a por oldatokba való kerülését. Az illékony anyagokat olyan, teljesen megtöltött zárt tartályokban kell vizsgálni, amelyek elegend ően nagyok az oxigénhiány vagy a túl 
alacsony oxigénszint megakadályozásához (lásd az 1.6. szakaszt és 
az 1.8.3. szakasz els ő bekezdését).
 
Emellett a következ ő berendezések vagy azok mindegyike alkalma ­
zandó: oxigénmér ő (mikroelektródával, vagy egyéb olyan berende ­
zéssel, amely alkalmas az oldott oxigén mérésére kis térfogatú 
mintákban); pH-mér ő; megfelel ő készülék a h őmérséklet szabályozá ­
sához; a teljes szerves szénkoncentráció (TOC) meghatározására szolgáló berendezés; a kémiai oxigénigény (KOI) meghatározására szolgáló berendezés; vízkeménység meghatározására szolgáló beren ­
dezés, stb.
 
1.7.2.  Vizsgált szervezetek  
A vizsgálat során a  Daphnia magna  Straus kísérleti állatfajt kell 
előnyben részesíteni, jóllehet más megfelel ő Daphnia-fajok is (pl.  
Daphnia pulex)  használhatóak. A vizsgálat kezdetén az állatoknak 
24 órásnál fiatalabbnak kell lenniük, és a variációs képesség csök ­
kentése érdekében er ősen javasolt, hogy ne az els ő szaporulatból 
származzanak. Egészséges törzstenyészetb ől kell származniuk (azaz 
nem szabad stressz jeleit mutatniuk, ilyen például magas halálozás, hímek és ephippiumok jelenléte, az els ő szaporulat késedelme, szín ­
telen állatok, stb.). Egy adott vizsgálathoz felhasznált összes szer ­
vezet származzon ugyanabból a Daphnia-állományból létrehozott tenyészetb ől. Az állomány állatait olyan tenyésztési körülmények 
között kell tartani (fény, h őmérséklet, közeg), mint amelyeket a vizs ­
gálatban használnak. Amennyiben a Daphniák vizsgálatban alkalma ­
zandó tenyésztési közege különbözik a rutin Daphnia-tenyészetben használttól, a helyes gyakorlat az, ha a vizsgálat el őtt akklimatizációs 
időszakot iktatnak be. Erre a célra a tenyésztett Daphniákat a vizs ­
gálat kezdetét megel őzően legalább 48 órán keresztül vizsgálati 
hőmérséklet ű hígítóvízben kell tartani.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Tenyészt ővíz és hígítóvíz  
Tenyésztő- és hígítóvízként természetes víz (felszíni vagy talajvíz), 
művíz vagy klórtalanított csapvíz fogadható el, amennyiben a Daph ­
niák a tenyésztés, akklimatizálódás és vizsgálat id őtartama alatt 
abban életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. 
Bármely olyan víz, amely megfelel az elfogadható hígítóvíz 1. függelékben felsorolt kémiai tulajdonságainak, megfelel vizsgálati víznek. A vizsgálat id őtartama alatt a víz min ősége legyen állandó. 
Művíz készíthet ő analitikai tisztaságú reagensek meghatározott 
mennyiségének deionizált vagy desztillált vízhez történ ő hozzáadá ­
sával. Művíz példáit az (1) és (6) pont, illetve a 2. függelék adja 
meg. Meg kell jegyezni, hogy fémtartalmú vizsgált anyag esetében 
kerülendőek az ismert kelátképz ő anyagok, mint a 2. függelékben 
említett M4 és M7 közegek. A pH-érték legyen 6–9 közötti tarto ­
mányban. A  Daphnia Magna  esetében 140 és 250 mg/l (CaCO
 3 -ban) 
közti keménység ajánlott, míg más  Daphnia-fajok  esetében alacso ­
nyabb keménység is megfelel ő lehet. A hígítóvizet a vizsgálatra 
történő felhasználás el őtt levegőztetni lehet, hogy az oxigénkoncent ­
ráció elérje a telítettséget.  
Természetes víz használatakor a min őségi paramétereket évente 
legalább kétszer mérni kell, illetve bármikor, ha felmerül annak a gyanúja, hogy ezek a tulajdonságok jelent ős mértékben megváltoz ­
hattak (lásd az el őző bekezdést és az 1. függeléket). Nehézfém-méré ­
seket (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) is végezni kell. Klórmentesített 
csapvíz használata esetén kívánatos a napi klórelemzés. Amennyiben a hígítóvíz felszíni vagy talajvízforrásból származik, mérni kell a vezetőképességet, az összes szerves széntartalmat (TOC) vagy a 
kémiai oxigénigényt (KOI).
 
1.7.4.  Vizsgálati oldatok  
A kiválasztott koncentrációjú vizsgálati oldatokat rendszerint törzs ­
oldat hígításával készítik. A törzsoldatokat lehet őleg a vizsgálati 
anyagnak a hígítóvízben történ ő feloldásával kell elkészíteni. Az 
oldószerek, emulgeálószerek vagy diszpergálószerek használatát 
lehetőleg kerülni kell. Ugyanakkor bizonyos esetekben szükség 
lehet ezekre a szerekre a megfelel ő koncentrációjú törzsoldat készí ­
téséhez. A megfelel ő oldószerek, emulgeálószerek és diszpergáló ­
szerek példáit a (4) pont sorolja fel. A vizsgálati oldatban lév ő vizs­
gálati anyag mindenestre nem haladhatja meg a hígítóvízben való 
oldhatóság határértékét.  
A vizsgálatot a pH-érték beállítása nélkül kell végezni. Ha a pH- 
érték nem marad a 6–9 értékek tartományában, újabb vizsgálat 
végezhető, amelynél a törzsoldat pH-értékét a hígítóvíz pH-értékére 
kell beállítani a vizsgálati anyag hozzáadása el őtt. A pH-beállítást 
úgy kell elvégezni, hogy a törzsoldat-koncentrációja ne változzon jelentős mértékben, és a vizsgálati anyag ne lépjen kémiai reakcióba 
más anyaggal, vagy ne csapódjon ki. Erre a célra a HCl vagy az 
NaOH javasolt.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. ELJÁRÁS  
1.8.1.  Expozíciós körülmények  
1.8.1.1.  Vizsgálati csoportok és kontrollok  
A vizsgálati tartályokat megfelel ő mennyiség ű hígítóvízzel és a vizs ­
gálati anyag oldataival kell feltölteni. A tartályokban a leveg ő/víz 
aránya legyen azonos a vizsgálati és a kontrollcsoport esetében. Ezután a Daphniákat bele kell helyezni a vizsgálati tartályokba. Minden egyes vizsgálati koncentrációban és a kontrollokban legalább 
20 állatot kell használni – lehet őleg négy, egyenként öt állatot tartal ­
mazó csoportra osztva. Állatonként legalább 2 ml vizsgálati oldatot kell biztosítani (azaz vizsgálati tartályonként 10 ml mennyiséget öt 
Daphniára). A vizsgálat elvégezhet ő félstatikus vagy átfolyásos rend ­
szerben is, ahol a vizsgált anyag koncentrációja nem állandó.
 
A kezelt sorozatok mellett egy hígítóvizes kontrollcsoport-sorozatot 
és – adott esetben – egy, az oldószert tartalmazó kontrollcsoport- sorozatot kell beállítani.
 
1.8.1.2.  Vizsgálati koncentrációk  
A végleges vizsgálat koncentrációtartományának meghatározására 
behatároló vizsgálat végezhet ő, hacsak rendelkezésre nem állnak a 
vizsgálati anyag toxicitásra vonatkozó információk. E célból a Daph ­
niákat a vizsgálati anyag szélesen változó koncentrációinak teszik ki. Minden egyes vizsgálati koncentrációnak öt Daphniát kell kitenni, 48 
óráig vagy rövidebb ideig, és párhuzamosokra nincs szükség. Az 
expozíciós id ő csökkenthet ő (pl. 24 óra vagy kevesebb), ha a behatá ­
roló vizsgálat céljainak megfelel ő adatok rövidebb id ő alatt megsze ­
rezhetők.
 
Legalább öt vizsgálati koncentrációt használjunk. Ezeket szétválasz ­
tási tényez ővel mértani sorba kell beállítani, lehet őség szerint nem 
meghaladva a 2,2 értéket. Ötnél kevesebb koncentráció alkalmazása esetén indoklás szükséges. A legmagasabb vizsgált koncentráció eredményezzen lehet őleg 100 százalékos immobilizációt, a legalacso ­
nyabb vizsgált koncentráció pedig lehet őleg ne okozzon megfigyel ­
hető hatást.
 
1.8.1.3.  Inkubációs körülmények  
A hőmérséklet legyen 18  o C és 22  o C közötti tartományban, és 
minden egyes vizsgálatnál ± 1  o C eltéréssel legyen állandó. 16 
órás világos, és 8 órás sötét ciklus javasolt. A teljes sötétség is 
elfogadható, f őleg fényben instabil vizsgálati anyagok esetében.  
A vizsgálati tartályokat a vizsgálat alatt nem szabad leveg őztetni. A 
vizsgálatot a pH-érték módosítása nélkül kell végezni. A Daphniákat a vizsgálat alatt nem szabad etetni.
 
1.8.1.4.  Időtartam  
A vizsgálat id őtartama 48 óra.  
1.8.2.  Megfigyelések  
24 és 48 órával a vizsgálat megkezdését követ ően minden vizsgálati 
tartályban ellen őrizni kell a mozgásképtelen Daphniákat (lásd az 1.2. 
szakaszt a meghatározásokról). A mozgásképtelenség mellett minden 
rendellenes viselkedésr ől vagy jelenségr ől be kell számolni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analitikai mérések  
A vizsgálat kezdetekor és a végén a kontroll(ok)ban és a vizsgálati 
anyag legnagyobb koncentrációjában mérni kell az oldott oxigén koncentrációját és a pH-értéket. A kontrollokban az oldott oxigén 
koncentrációja feleljen meg az érvényességi kritériumnak (lásd az 
1.6. szakaszt). A pH-értéknek rendes körülmények között egyik vizs ­
gálatban sem szabad 1,5 egységet meghaladó mértékben változnia. A hőmérsékletet rendszerint kontrolltartályokban vagy környezeti leve ­
gőben mérik, és a vizsgálat során lehet őleg folyamatosan rögzíteni 
kell, de legalább a vizsgálat kezdetekor és végén.
 
A vizsgálati anyag koncentrációját legalább a legnagyobb és legki ­
sebb vizsgálati koncentrációnál kell mérni a vizsgálat kezdetekor és 
végén (4). Javasolt, hogy az eredmények a mért koncentrációkon 
alapuljanak. Ugyanakkor, ha megfelel ő bizonyíték áll rendelkezésre 
arra vonatkozóan, hogy a vizsgált anyag koncentrációját a vizsgálat során sikerült mindvégig a névleges vagy kiindulási koncentráció ± 
20 %-os sávján belül tartani, akkor az eredményeket a névleges vagy 
a mért kiindulási értékekre is lehet alapozni.
 
1.9. HATÁRÉRTÉK-VIZSGÁLAT  
Az e módszerben leírt eljárások segítségével 100 mg/l vizsgálati 
anyaggal vagy a vizsgálati közegben való oldhatósági határig (ame ­
lyik alacsonyabb) határérték-vizsgálat hajtható végre annak bizonyí ­
tására, hogy az EC  50 nagyobb, mint e koncentráció. A határérték- 
vizsgálatot 20 Daphnia használatával (lehet őleg négy darab ötös 
csoportra osztva) kell végrehajtani úgy, hogy a kontrollcsoportban lévő állatok száma ezzel azonos legyen. Ha mozgásképtelenség 
következik be, a teljes vizsgálatot el kell végezni. Minden megfigyelt 
rendellenes viselkedést rögzíteni kell.
 
2. ADATOK  
Az adatokat táblázatos formában kell összefoglalni, minden egyes 
kezelési csoport és kontroll esetében feltüntetve a felhasznált Daph ­
niák számát, és minden megfigyelt mozgásképtelenséget. A 24 órás 
és 48 órás immobilizált százalékokat a vizsgálati koncentrációk függ ­
vényében kell feltüntetni egy grafikonon. A görbék meredekségének és az EC
 50 95 %-os konfidenciaszinten (p = 0,05) történ ő kiszámí­
tásához az adatokat megfelel ő statisztikai módszerekkel elemezzük 
(pl. probit-elemzés, stb.) (7) (8).  
Ahol az EC  50 -számítás standard módszerei nem alkalmazhatóak a 
kapott adatokra, az immobilitást nem okozó legmagasabb koncentrá ­
ciót és a 100 % immobilizációt eredményez ő legkisebb koncentrációt 
kell használni az EC  50 becsléséhez (amely a két koncentráció mértani 
közepének számít).  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgálati anyag:  
— fizikai jellege és fontos fizikai-kémiai tulajdonságai,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— kémiai azonosítási adatok, beleértve a tisztaságot.  
Vizsgált fajok:  
— Daphniák faja és eredetük, szállító (ha ismert) és az alkalmazott 
tenyésztési körülmények (beleértve a forrást, táplálék fajtáját és 
mennyiségét, az etetés gyakoriságát).  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgálati tartályok leírása: a tartály típusa, az oldat térfogata, a 
Daphniák száma vizsgálati tartályonként, a vizsgálati tartályok 
száma (ismétlések) koncentrációnként,  
— a törzsoldat és a vizsgált oldat elkészítésének módszere, beleértve 
bármilyen oldószer vagy diszpergálószer használatát, az alkalma ­
zott koncentrációkat,  
— a hígítóvíz adatai: forrás és vízmin őségi jellemz ők (pH-érték, 
keménység, Ca/Mg-arány, Na/K-arány, lúgosság, vezet őképesség, 
stb.); a m űvíz összetétele, amennyiben alkalmazták,  
— inkubációs körülmények: h őmérséklet, fényintenzitás és periodi ­
citás, oldott oxigén, pH-érték, stb.  
Eredmények:  
— az immobilizált vagy más káros behatást mutató (beleértve a 
rendellenes viselkedést) Daphniák száma és százaléka a kontr ­
ollokban és az egyes kezelt csoportokban, minden egyes 
megfigyelési id őpontban, és a megfigyelt hatások jellegének 
leírása,  
— ha rendelkezésre áll, a referenciaanyaggal végzett vizsgálat ered ­
ményei és dátuma,  
— a névleges vizsgálati koncentrációk és a vizsgálati tartályokban 
lévő vizsgálati anyagok koncentrációinak meghatározására 
végzett valamennyi analízis eredménye; a módszer visszanyerési 
hatékonyságáról és a meghatározás korlátjáról is beszámolva,  
— vizsgálat során végzett összes h őmérsékletre, pH-értékre és oldott 
oxigénre vonatkozó fizikai-kémiai mérés,  
— immobilizációs EC  50 48 óránál, konfidenciaintervallumokkal, és 
a számításaikhoz használt illesztett modellek grafikonjai, a dózis ­
reakció-görbék meredeksége, és standard hibája; az EC  50 
meghatározásához használt statisztikai eljárások; (ha mérték, 
ezeket az adatokat a 24 órás immobilizálásra is meg kell adni)  
— a vizsgálati módszert ől való bármilyen eltérés magyarázata, 
illetve annak magyarázata, hogy az eltérés befolyásolta-e a vizs ­
gálati eredményeket.  
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus ( Cladocera , 
Crustacea ) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996). Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society 
for Testing and Materials. p. 65–84.
 
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
1. függelék  
AZ ELFOGADHATÓ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY KÉMIAI TULAJDONSÁGA  
Anyagok Koncentráció  
Szemcsés anyag < 20 mg/l 
Összes szerves szén < 2 mg/l Ionizálatlan ammónia <1 μg/l 
Maradék klór <10 μg/1 
Összes szerves foszfort tartalmazó növényvéd ő szer <50 μg/1 
Összes szerves klórt tartalmazó növényvéd ő szer plusz 
poliklórozott bifenilek <50 ng/1 
Összes szerves klór <25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
2. függelék  
MEGFELEL Ő VIZSGÁLATI M ŰVÍZRE VONATKOZÓ PÉLDÁK  
ISO vizsgálati víz (1)  
Törzsoldatok (egyetlen anyag) A művíz elkészítéséhez 1 liter 
vízhez a következ ő mennyi­
ségű törzsoldatot kell adni Anyagok 1 liter vízhez adott 
mennyiség (*)  
Kalcium-klorid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnézium-szulfát 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Nátrium-bikarbonát 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kálium-klorid 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Megfelel ő tisztaságú víz, pl. deionizált, desztillált vagy fordított ozmózissal el őállított 
víz, amelynek vezet őképessége lehet őleg nem haladja meg a 10 μS cm  –1 -t. 
Elendt M7 és M4 közeg  
Akklimatizálás az Elendt M4 és M7 közeghez  
Egyes laboratóriumok nehézségekbe ütköztek, amikor Daphniákat M4 és M7 
közegbe próbáltak átvinni. Fokozatos akklimatizálással, azaz a saját közegb ől 
előbb 30, majd 60, végül 100 százalékos Elendt-közegbe való áthelyezéssel 
azonban sikerült némi sikert elérni. Az akklimatizálódás akár egy hónapig is 
eltarthat.  
Előkészítés  
Nyomelem  
Először megfelel ő tisztaságú (azaz deionizált, desztillált vagy reverz ozmózissal 
előállított) víz felhasználásával egyedi nyomelemeket tartalmazó, különféle törzs ­
oldatokat (I) kell készíteni. Ezekb ől a különböz ő törzsoldatokból (I) egy második, 
egyetlen (II) törzsoldat készül, amely az összes nyomelemet tartalmazza (kombi ­
nált oldat), azaz:  
I. törzsoldat(ok) (egyes anya ­
gokból) A vízhez adott 
mennyiség (mg/l) Koncentráció (M4 
közegre vonatkoztatv a) A II. kombinált törzsoldat elkészítéséhez az I. 
törzsoldatból az alábbi mennyiséget kell vízhez 
hozzáadni (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-szeres 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000-szeres 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-szeres 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
I. törzsoldat(ok) (egyes anya ­
gokból) A vízhez adott 
mennyiség (mg/l) Koncentráció (M4 
közegre vonatkoztatv a) A II. kombinált törzsoldat elkészítéséhez az I. 
törzsoldatból az alábbi mennyiséget kell vízhez 
hozzáadni (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-szeres 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000-szeres 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-szeres 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000-szeres 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000-szeres 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-szeres 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000-szeres 1,0 1,0 
KI 65 20 000-szeres 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000-szeres 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-szeres 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000-szeres — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000-szeres — — 
Mind a Na  2 EDTA, mind a FeSO  4 -oldatot külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni. 
Ebből: 
2 l Fe-EDTA oldat 1 000-szeres 20,0 5,0  
M4 és M7 közeg  
Az M4 és M7 közegeket a II. törzsoldatból, a makroelemekb ől és a vitaminokból 
kell elkészíteni a következ őképpen:  
A vízhez adott 
mennyiség (mg/l) Koncentráció (M4 
közegre vonatkoztatva) A közeg készítésekor hozzáadott II. törzsoldat 
mennyisége (ml/l) 
M4 M7  
II. törzsoldat (kombinált 
nyomelemek) 20-szoros 50 50 
Makroelemek törzsoldatai 
(egy anyagból) 
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800 1 000-szeres 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000-szeres 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000-szeres 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000-szeres 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000-szeres 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-szeres 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-szeres 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000-szeres 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
A vízhez adott 
mennyiség (mg/l) Koncentráció (M4 
közegre vonatkoztatva) A közeg készítésekor hozzáadott II. törzsoldat 
mennyisége (ml/l) 
M4 M7  
Kombinált vitamintör ­
zsoldat — 10 000-szeres 0,1 0,1 
A kombinált vitamintörzsoldat készítéséhez 3 vitamint kell 1 liter vízhez adni, a következ őképpen: 
Tiamin-hidroklorid 750 10 000-szeres 
Ciano-kobalamine (B  12 ) 10 10 000-szeres 
Biotin 7,5 10 000-szeres  
A kombinált vitamintörzsoldatot kis aliquot részletekben, fagyasztott állapotban 
kell tartani. A közeghez a vitaminokat röviddel a felhasználás el őtt kell hozzá ­
adni.  
Megjegyzés: A végleges közeg elkészítésekor a sók kicsapódásának elkerülése 
érdekében az aliquot törzsoldatokat kb. 500–800 ml deionizált 
vízhez kell adni, majd a mennyiséget fel kell tölteni 1 literre.  
Megjegyzés: Az M4 tényészoldatról szóló els ő publikáció az Elendt, B.P. 
(1990)-ben található. Selenium deficiency in crustacea; an ultrast ­
ructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. 
Protoplasma, 154., pp. 25–33.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. SZAPORODÁSGÁTLÁSI VIZSGÁLAT, ÉDESVÍZI ALGA ÉS 
CIANOBAKTÉRIUM  
1. MÓDSZER  
A módszer egyenérték ű az OECD TG 201 (2006) (1) jel ű módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
A tudományos haladás fényében a vizsgálati módszerek id őről időre 
felülvizsgálatra és korszer űsítésre kerülnek. Szükség volt a C.3 jel ű 
vizsgálati módszer átdolgozására, hogy kiterjedjen további fajokra is, 
és hogy megfelelhessen a vegyületekkel szemben támasztott kocká ­
zatértékelési és besorolási követelményeknek. A módszer átdolgo ­
zása a kiterjedt gyakorlati tapasztalatok, az algákra ható toxicitás 
vizsgálatának területén végbement tudományos fejl ődés és a módszer 
eredeti elfogadása óta folyamatban lév ő széles kör ű hatósági alkal ­
mazás tapasztalatai alapján történt.  
1.2. DEFINÍCIÓK  
E vizsgálati módszerben az alábbi definíciók és rövidítések haszná ­
latosak:  
„Élőanyag ”: egy populációban jelen lév ő élő anyag száraz tömege 
egy adott mennyiségben kifejezve; pl. mg alga/liter vizsgálati oldat. 
Általában az „él őanyag” tömegként van definiálva, de ebben a vizs ­
gálatban a szó „tömeg/térfogat”-ot jelent. Szintén ebben a vizs ­
gálatban az él őanyag tömege helyett jellemz ően sejtszám, fluoresz ­
cencia stb. mérése történik, és az „él őanyag” kifejezés használata így 
ezekre a helyettesít ő mérőszámokra is utal.  
„Variációs együttható (CV) ”: egy paraméter változékonyságának 
dimenzió nélküli mér őszáma; definíció szerint a szórás és az átlag 
aránya. Ezt százalékos formában is ki lehet fejezni. A párhuzamos 
kontrolltenyészetekben az átlagos fajlagos szaporodási sebesség átlagos variációs együtthatóját az alábbiak szerint lehet kiszámítani:
 
1. Ki kell számítani az átlagos fajlagos szaporodási sebesség %-os 
variációs együtthatóját a naponkénti/szakaszonkénti szaporodási sebességekb ől a megfelel ő párhuzamos tenyészetekre.
 
2. Ki kell számítani az 1. pontban kiszámított összes érték átlagát, 
ami megadja a párhuzamos kontrolltenyészetekben a naponkénti/ ­
szakaszonkénti átlagos fajlagos szaporodási sebesség átlagos vari ­
ációs együtthatóját.  
„EC x ”: a vizsgálati oldatban oldott vizsgált anyag olyan koncentrá ­
ciója, ami meghatározott expozíciós id ő alatt (ha eltér a teljes vagy 
szokásos kísérleti id őtartamtól, akkor pontosan meg kell adni) a vizs ­
gált organizmus x %-os (pl. 50 %) szaporodásgátlását eredményezi. 
A szaporodási sebességb ől (r), illetve a szaporulatból (y) levezetett 
EC-értékek egyértelm ű jelölésére az „E  r C”, illetve az „E  y C” haszná ­
latos.  
„Tápoldat ”: az a teljes mesterséges tenyészt ő közeg, amelyben a 
vizsgált algák a vizsgált anyag jelenlétében szaporodnak. A vizsgált anyag feloldása általában a kísérleti oldattal történik.
 
„Szaporodási sebesség  (átlagos fajlagos szaporodási sebesség )”: az 
élőanyag expozíciós id ő alatti növekedésének logaritmusa.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
„Észlelhet ő hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) ”: az a 
legkisebb mért koncentráció, amelyben az anyagnak a kontrolltenyé ­
szethez képest észlelhet ő, statisztikailag szignifikáns (p < 0,05) 
szaporodásgátló hatása van egy adott expozíciós id ő alatt. Ugyan ­
akkor minden, az LOEC-nél nagyobb koncentrációnak az LOEC-nél 
kapottal azonos, vagy nagyobb gátló hatást kell kifejtenie. Ha ez a 
két feltétel nem teljesül, az LOEC (és ennélfogva az NOEC) megválasztását teljes kör űen meg kell indokolni.
 
„Észlelhet ő hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) ”: 
közvetlenül az LOEC alatti koncentráció.  
„Hatásváltozó ”: a toxikus hatás becslésére használt változó, amely 
különböző számítási módokkal az él őanyag leírására szolgáló bárme ­
lyik mért paraméterb ől levezethet ő. Ebben a módszerben a hatásvál ­
tozók a szaporodási sebesség, illetve a szaporulat, amelyek közvet ­
lenül az él őanyag mérésével, vagy pedig az említett helyettesít ő 
mérőszámok valamelyikének mérésével kaphatók meg.  
„Fajlagos szaporodási sebesség ”: egy mérési paraméter (ebben a 
vizsgálati módszerben az él őanyag mennyiségének változása) termé ­
szetes alapú logaritmusainak különbségéb ől és a változáshoz tartozó 
időtartamból képzett hányadosként definiált hatásváltozó.  
„Szaporulat ”: az élőanyag vizsgálat alatti mennyiségi növekedé ­
sének a kifejezésére használt mérési változó értéke; az expozíciós idő végén mért változóérték mínusz az expozíciós id ő kezdetén 
mért változóérték.
 
1.3. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
Ez a vizsgálati módszer legegyszer űbben olyan vízoldható anyagokra 
használható, amelyek a vizsgálati körülmények között valószín űleg a 
vízben maradnak. Az illékony, er ősen adszorbeálódó, színes, vízben 
rosszul oldódó, esetleg a tápoldatban lév ő tápanyagok vagy ásványi 
anyagok felvételére hatással lév ő anyagok esetében szükség lehet a 
leírt módszer bizonyos módosítására (pl. zárt rendszer, a vizsgálathoz 
használt eszközök kondicionálása). Néhány megfelel ő módosításhoz 
útmutatás található az irodalomban (2), (3) és (4).  
1.4. A VIZSGÁLAT ELVE  
A vizsgálat célja egy adott anyag által az édesvízi mikroalgákra 
és/vagy cianobaktériumokra gyakorolt hatások meghatározása. A vizsgált anyag exponenciálisan szaporodó organizmusokra hat egyszeres (batch) tenyészetekben, szokásosan 72 órán keresztül. A 
viszonylag rövid vizsgálati id őtartam ellenére több generációra kiter ­
jedő hatások vizsgálhatók.
 
A rendszerben fellép ő hatás az, hogy csökken a szaporodás a vizsgált 
anyag különböz ő koncentrációinak kitett algatenyészetekben (kísér ­
leti egységek). A hatás értékelése a koncentráció függvényében törté ­
nik, összehasonlítva a szaporodást a párhuzamos, nem kezelt kont ­
rolltenyészetekben észlelt szaporodással. A rendszerben a toxikus 
hatások teljes kifejl ődéséhez (optimális érzékenység) a tenyészetek 
számára korlátlan exponenciális szaporodást kell biztosítani – megfelelő tápkörülmények és folyamatos világítás mellett – elegen ­
dően hosszú ideig ahhoz, hogy mérni lehessen a fajlagos szaporodási 
sebesség csökkenését.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
A szaporodás és szaporodásgátlás mennyiségi meghatározásához 
mérni kell az alga él őanyag-tömegét az id ő függvényében. Az 
élőanyag mennyisége definíció szerint száraz tömeg/térfogat, pl. 
mg alga/liter tápoldat. A száraz tömeg mérése azonban bonyolult, ezért helyettesít ő paraméterek használatosak. Ezek közül a sejtszám 
a leggyakrabban használt paraméter. További helyettesít ő paramé­
terek lehetnek a sejttérfogat, a fluoreszcencia, az optikai s űrűség 
stb. A mért helyettesít ő paraméterek és az él őanyag-tömeg közötti 
átszámítási tényez őt ismerni kell.
 
A kísérlet végpontja a szaporodás gátlása, az él őanyag-tömeg 
expozíciós id ő alatti növekedésének logaritmikusaként kifejezve 
(átlagos fajlagos szaporodási sebesség). A kísérleti oldatsorozattal 
mért átlagos fajlagos szaporodási sebességekb ől meg kell határozni 
azt a koncentrációt, amely a szaporodási sebességet adott x %-os (pl. 50 %-os) mértékben gátolja, és azt E
 r C x -ként (pl. E  r C 50 ) kell 
kifejezni.  
E módszernek az EU szabályozási keretén belül történ ő alkalmazá ­
sához az eredményeket a 2.2 pontban leírt okokból kifolyólag az 
átlagos fajlagos szaporodási sebesség alapján kell kiszámítani. Ebben a vizsgálati módszerben használt másik hatásváltozó a szapo ­
rulat, amely szükséges lehet néhány országban az adott hatósági 
előírások teljesítéséhez. A szaporulat definíció szerint az expozíciós 
idő végén és az expozíciós id ő kezdetén meglév ő élőanyag töme ­
gének különbsége. A kísérleti oldatsorozatban mért szaporulatból meghatározásra kerül az a koncentráció, amely a szaporulatot adott 
x %-os (pl. 50 %-os) mértékben gátolja, és azt E
 y C x -ként (pl. E  y C 50 ) 
kell kifejezni.  
Emellett statisztikai módszerekkel meghatározható az észlelhet ő 
hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) és az észlelhet ő hatást 
még nem okozó koncentráció (NOEC).  
1.5. INFORMÁCIÓK A VIZSGÁLT ANYAGRÓL  
A kísérleti körülmények kialakításához hasznosak lehetnek egyes 
információk a vizsgált anyagról, mint pl. szerkezeti képlet, tisztaság, fényérzékenység, stabilitás a kísérleti körülmények között, fényab ­
szorpciós tulajdonságok, pK
 a és az átalakulási vizsgálatok eredmé ­
nyei, beleértve a biológiai lebonthatóságot vízben.  
A vízben való oldhatóságot, az oktanol/víz megoszlási hányadost 
(P ow ) és a vizsgált anyag g őznyomását ismerni kell, valamint rendel ­
kezésre kell állnia egy, a kísérleti oldatban jelen lév ő anyag mennyi ­
ségi meghatározására alkalmas validált módszernek, dokumentált visszanyerési hatásfokkal és kimutatási határral.
 
1.6. REFERENCIAANYAG  
A vizsgálati eljárás ellen őrzéseként a kísérlet elvégezhet ő referencia ­
anyaggal (referenciaanyagokkal), például a nemzetközi körvizs ­
gálatban (4) használt 3,5-diklór-fenollal. A kálium-bikromát szintén 
használható referenciaanyagként, zöldalgák esetében. Tanácsos legalább kétszer egy évben kísérletet végezni a referenciaanyaggal.
 
1.7. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A vizsgálat érvényességéhez a következ ő kritériumoknak kell telje ­
sülniük:  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— A kontrolltenyészetekben a él őanyag mennyiségének exponenci ­
álisan kell növekednie, legalább 16-szorosára a 72-órás kísérleti 
idő alatt. Ez 0,92 nap  –1 -es fajlagos szaporodási sebességnek felel 
meg. A leggyakrabban használt fajoknál a szaporodási sebesség rendszerint jelent ősen nagyobb ennél (lásd 1. függelék). Ez a 
kritérium az 1. függelékben felsoroltaknál lassabban szaporodó 
fajok alkalmazása esetében nem feltétlenül teljesül. Ebben az esetben a kísérleti id őt meg kell hosszabbítani, hogy legalább 
16-szoros szaporodást kapjunk a kontrolltenyészetekben úgy, 
hogy a szaporodás mindvégig exponenciális marad a kísérlet 
ideje alatt. A kísérlet ideje lerövidíthet ő (de legalább 48 órának 
kell lennie), hogy a korlátlan exponenciális szaporodás a kísérlet alatt végig fennálljon, feltéve hogy megmarad a legalább 16- 
szoros szaporodás.
 
— A szakaszonkénti (0–1., 1–2. és 2–3. nap a 72 órás kísérletnél) 
fajlagos szaporodási sebesség átlagos variációs együtthatója a 
kontrolltenyészeteknél (lásd 1.2. pont, „variációs együttható”) nem haladhatja meg a 35 %-ot. A szakaszonkénti fajlagos szapo ­
rodási sebesség kiszámítására vonatkozóan lásd a 2.2.1. pont 
második bekezdését. Ez a kritérium a párhuzamos kontrolltenyé ­
szetekre számított variációs együttható átlagértékére vonatkozik.
 
— Az átlagos fajlagos szaporodási sebesség variációs együtthatója a 
kísérleti id ő alatt a párhuzamos kontrolltenyészetekben semmikor 
sem haladhatja meg a 7 %-ot a  Pseudokirchneriella subcapitata  
fajjal és  Desmodesmus subspicatus  fajjal folytatott vizsgálatok ­
ban. A többi, kevésbé gyakran vizsgált faj esetében ez az érték nem lehet nagyobb 10 %-nál.
 
1.8. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.8.1.  Felszerelés  
A tápoldatokkal érintkezésbe kerül ő kísérleti eszközöknek és más 
felszereléseknek teljes egészében üvegb ől, vagy kémiailag semleges 
más anyagból kell készülniük. Alaposan át kell mosni őket, biztosí ­
tandó, hogy szerves vagy szervetlen szennyezések ne befolyásol ­
hassák az algák szaporodását, vagy a tápoldat összetételét.  
A kísérleti eszközök általában olyan méret ű üveglombikok, amelyek 
a vizsgálat során végzett mérésekhez megfelel ő térfogatú tenyészetet 
képesek befogadni, és biztosítják a kívánt mérték ű CO  2 -átadást a 
környezeti leveg őből (lásd az 1.8.9. pont második bekezdését). 
Figyelni kell arra, hogy a folyadéktérfogat elegend ő legyen az anali ­
tikai meghatározások elvégzéséhez (lásd az 1.8.11. pont ötödik bekezdését).
 
Ezentúl szükséges néhány, vagy az összes az alábbi eszközök közül:  
— Tenyészt őberendezés: tenyészt őszekrény vagy -fülke ajánlott, 
amelyekben a választott inkubációs h őmérsékletet ± 2 °C pontos ­
sággal tartható.  
— Fénymér ő berendezés: fontos megjegyezni, hogy a fényer ő mérési 
módszere, és f őleg az érzékel ő (kollektor) típusa hatással lesz a 
mért értékre. A mérésekhez gömb alakú (4 π) érzékelő (amely a 
mérési sík alatti és feletti bármely szögb ől érkező közvetlen és 
visszavert fényre reagál), vagy félgömb alakú (2 π) érzékel ő 
(amely a mérési sík feletti bármely szögb ől érkező fényre reagál) 
használata preferált.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Az alga él őanyag-tömegének meghatározására alkalmas berende ­
zés: az ilyen él őanyag mérésére a leggyakrabban használt helyet ­
tesítő módszer, a sejtszámlálás elvégezhet ő elektronikus részecs ­
keszámláló, Bürker-kamrával ellátott mikroszkóp, vagy áramlásos citométer segítségével. Más helyettesít ő paraméterek mérhet ők 
áramlásos citométerrel, fluoriméterrel, spektrofotométerrel vagy 
koloriméterrel. Célszer ű kiszámítani a sejtszám és a száraz 
tömeg közötti átszámítási tényez őt. Spektrofotométer használata 
esetén szükséges lehet legalább 4 cm fényúttal rendelkez ő 
küvetták használatára, hogy a módszer kis él őanyag-koncentráci ­
óknál is használható méréseket szolgáltasson.
 
1.8.2.  Vizsgált organizmusok  
A nem kitapadó mikroalgák és cianobaktériumok több faja használ ­
ható. Az 1. függelékben felsorolt törzsekr ől már bizonyították, hogy 
megfelelően használhatók ennek a vizsgálati módszernek az eljárásai 
során.  
Más faj használata esetén a törzset és/vagy az eredetet dokumentálni 
kell. Igazolni kell, hogy a vizsgálathoz kiválasztott alga exponenci ­
ális szaporodása a kísérlet ideje alatt mindvégig fennmarad az adott körülmények között.
 
1.8.3.  Tápoldat  
Két választható tápoldat, az OECD-tápoldat és az AAP-tápoldat aján ­
lott. Ezeknek a tápoldatoknak az összetétele a 2. függelékben látható. Figyelembe kell venni, hogy a két tápoldat kiindulási pH-értéke és pufferkapacitása (a pH-növekedés szabályozása) eltér ő. Ennek 
megfelelően az alkalmazott tápoldattól függ ően a vizsgálati eredmé ­
nyek különböz őek lehetnek, kiváltképp disszociáló anyagok vizs ­
gálata során.
 
Bizonyos célokhoz (pl. fémek és kelátképz ő szerek vizsgálatakor, 
vagy ha a kísérlet különböz ő pH-értékeken történik) a tápoldat 
módosítására lehet szükség. A módosított tápoldat használatát rész ­
letesen ismertetni és indokolni kell (3)(4).  
1.8.4.  Kiindulási él őanyag-koncentráció  
A kiindulási él őanyagnak minden vizsgált tenyészetben ugyanany ­
nyinak és megfelel ően kevésnek kell lennie, hogy exponenciálisan 
növekedhessen végig az expozíciós id ő alatt, a tápanyagok elfogyá ­
sának veszélye nélkül. A kiindulási él őanyag mennyisége nem 
lépheti túl a 0,5 mg száraz tömeg/l értéket. Az alábbi kiindulási sejtkoncentrációk ajánlottak:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5•10
 3 – 10  4 sejt/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 x 10  3 sejt/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 sejt/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 sejt/ml  
Synechococcus leopoliensis  5•10  4 – 10  5 sejt/ml  
1.8.5.  A vizsgált anyag -koncentrációi  
Az a koncentrációtartomány, amelyben a hatások valószín űleg fellép ­
nek, koncentrációtartomány-meghatározási vizsgálatok eredményei 
alapján állapítható meg. A végleges meghatározó vizsgálathoz 
legalább öt, 3,2-nél nem nagyobb kvóciens ű mértani sorozat szerinti 
koncentrációt kell kiválasztani. Olyan anyagok esetében, ahol a koncentráció-hatás görbe lapos, nagyobb kvóciens használata lehet 
indokolt. A koncentrációsorozatnak lehet őleg az algaszaporodási 
sebesség 5–75 %-os gátlását okozó tartományt kell lefednie.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Párhuzamos tenyészetek és kontrolltenyészetek  
A vizsgálatot úgy kell megtervezni, hogy minden vizsgált koncent ­
rációra három párhuzamos tenyészetet tartalmazzon. Ha az NOEC meghatározása nem követelmény, a vizsgálat ett ől eltérő lehet úgy, 
hogy a koncentrációk száma nagyobb lesz, az egy koncentrációhoz 
tartozó párhuzamos tenyészetek száma pedig kisebb. A párhuzamos kontrolltenyészetek számának legalább háromnak kell lennie, és ideá ­
lisan kétszer annyinak, mint az egyes vizsgált koncentrációkhoz 
tartozó párhuzamos tenyészetek száma.
 
Külön oldatsorozatot lehet készíteni a vizsgált anyag koncentráció ­
inak analitikai meghatározásához (lásd az 1.8.11. pont negyedik és hatodik bekezdését).
 
Ha a vizsgált anyag oldhatóvá tételéhez oldószert kell használni, 
akkor a vizsgálatnak további kontrolltenyészeteket is tartalmaznia kell, amelyekben az oldószernek ugyanabban a koncentrációban kell jelen lennie, mint a vizsgált tenyészetekben.
 
1.8.7.  Az oltótenyészet elkészítése  
A tápoldattal 2–4 nappal a kísérlet kezdete el őtt oltótenyészetet kell 
készíteni, hogy a vizsgált algák hozzászokjanak a kísérleti körülmé ­
nyekhez, és hogy exponenciális szaporodási fázisban legyenek a kísérleti oldatok beoltásakor. Az alga él őanyag-mennyiségét úgy 
kell beállítani, hogy a kísérlet kezdetéig az exponenciális szaporodás 
érvényesüljön az oltótenyészetben. Az oltótenyészetet a kísérleti tenyészetekkel megegyez ő körülmények között kell inkubálni. 
Mérni kell az él őanyag mennyiségének növekedését az oltótenyészet ­
ben, ellen őrizendő, hogy a vizsgált törzsnek az adott tenyésztési 
körülmények közötti szaporodása a megfelel ő tartományon belül 
marad-e. Az algatenyésztési eljárás egy példája a 3. függelékben található. Elkerülend ő a kísérlet alatt az egyidej ű sejtosztódást, 
szükség lehet esetleg az oltótenyészet egy második szaporítási 
lépésére is.
 
1.8.8.  A kísérleti oldatok elkészítése  
Minden kísérleti oldatnak azonos koncentrációban kell tartalmaznia a 
tápoldatot és a vizsgált algák kiindulási él őanyag-tömegét. A kivá ­
lasztott koncentrációjú kísérleti oldatokat rendszerint a vizsgált anyag 
törzsoldatának, a tápoldatnak és az oltótenyészetnek az összekeveré ­
sével kell el őállítani. A törzsoldatokat általában a vizsgált anyagnak 
a kísérleti oldattal való feloldásával kell elkészíteni.  
Oldószerek (pl. aceton, tercier butilalkohol és dimetil-formamid) 
használhatók hordozóanyagként a vízben rosszul oldódó anyagoknak 
a kísérleti oldatba juttatásához (2)(3). Az oldószer-koncentráció nem haladhatja meg a 100 μl/l–t, és az oldószert a kísérletsorozatban 
használt minden tenyészethez (beleértve a kontrolltenyészeteket is) 
azonos koncentrációban hozzá kell adni.
 
1.8.9.  Inkubáció  
A kísérleti lombikokat légátereszt ő dugóval kell lezárni. A lombi ­
kokat rázás után a tenyészt őberendezésbe kell helyezni. A kísérlet 
folyamán az algáknak lebegniük kell, és el ő kell segíteni a CO  2 - 
átadást. Ebb ől a célból folyamatos rázást vagy keverést kell alkal ­
mazni. A tenyészeteket 21–24 °C tartományon belüli h őmérsékleten 
kell tartani, ± 2 °C-os pontossággal szabályozva. Az 1. függelékben nem szerepl ő fajok, pl. a trópusi fajok esetében nagyobb h őmérséklet 
lehet megfelel ő, feltéve hogy az érvényességi kritériumok teljesül ­
nek. Ajánlott a lombikok véletlenszer ű elrendezése majd naponkénti 
áthelyezése az inkubátorban.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
A kísérlet során a kontrolloldatban a pH nem n őhet 1,5 egységnél 
többel. Fémek, és a kísérlet pH-ja körüli értéken részlegesen disszo ­
ciáló vegyületek esetében szükséges lehet a pH-eltolódás korlátozása a reprodukálható és jól definiált eredmények érdekében. A 0,5 pH- egységnél kisebb eltolódás biztosítása technikailag kivitelezhet ő és a 
környezeti leveg őből az oldatba történ ő CO
 2 -bevitel megfelel ő sebes­
ségének biztosításával, például a rázás intenzitásának növelésével, elérhető. Másik lehet őség a CO
 2 -igény csökkentése a kiindulási 
élőanyag mennyiségének vagy a kísérlet idejének csökkentésével.  
A felületnek, ahol a tenyészetek inkubálása történik, folytonos 
egyenletes fluoreszcens megvilágítást (pl. „hideg-fehér” vagy „nap ­
pali” fény) kell kapnia. Az alga- és cianobaktériumtörzsek fény ­
igénye eltér ő. A fényer őt úgy kell megválasztani, hogy az 
megfeleljen a vizsgált organizmusnak. A javasolt zöldalga-fajokra a 
kísérleti oldatok szintjén a fényer őt a 60–120 μE•m  –2 •s –1 tarto­
mányból kell kiválasztani, a megfelel ő érzékelővel a fotoszinteti ­
kusan hatékony, 400–700 nm-es hullámhossz-tartományban mérve. Néhány faj, f őként az  Anabaena flos-aquae  jól növekszik kisebb 
fényerő mellett, és a nagyobb fényer ő károsíthatja. Ezekre a fajokra 
a 40–60 μE•m
 –2 •s –1 tartományba es ő átlagos fényer őt kell választani. 
(A luxban kalibrált fénymér ő berendezéseknél a hideg fehér fényre 
megadott 4 440–8 880 luxos tartomány felel meg az ajánlott 60–120 
μE•m  –2 •s –1 -es fényer őnek). A fényer ő az inkubációs területen 
± 15 %-nál jobban nem térhet el az átlagtól.  
1.8.10.  A kísérlet id őtartama  
A kísérlet hossza szokásos esetben 72 óra. Használható azonban 
rövidebb vagy hosszabb kísérleti id őtartam is, feltéve, hogy az 1.7. 
pontban el őírt összes érvényességi kritérium teljesül.  
1.8.11.  Mérések és analitikai meghatározások  
Az alga él őanyag-mennyiségét a kísérlet ideje alatt minden 
lombikban legalább naponta meg kell határozni. Ha a mérések a 
kísérleti oldatból pipettával vett kis térfogatú mintákkal történnek, ezeket a mintákat nem kell visszajuttatni a lombikba.
 
Az élőanyag mennyiségének mérése mikroszkópos manuális sejt ­
számlálással vagy elektronikus részecskeszámlálással (sejtszámlálás 
és/vagy él őanyag térfogata) történik. Alternatív eljárások, pl. áram ­
lásos citometria,  in vitro  vagy  in vivo  klorofillfluoreszcencia (6)(7), 
vagy optikai s űrűség mérése is használható, feltéve, ha igazolni lehet 
az élőanyag-tömeggel fennálló kielégít ő korrelációt az él őanyag- 
tömegnek a kísérletben el őforduló tartományában.  
Az oldatok pH-ját a kísérlet kezdetén és végén meg kell mérni.  
Amennyiben az alkalmazott koncentrációtartományban a vizsgált 
anyag meghatározásához rendelkezésre áll analitikai módszer, akkor a kísérleti oldatokat elemezni kell a kiindulási koncentrációk ellen ­ 
őrzése, illetve annak ellen őrzése céljából, hogy a kísérletben haszná ­
landó koncentrációk mindvégig fennállnak-e a kísérlet során.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Elegendő lehet a vizsgált anyag egy alsó és fels ő koncentráció-határ ­
értékének, valamint a várható EC  50 érték körüli koncentrációjának a 
mérése a kísérlet kezdetén és végén, ha valószín ű, hogy a kísérlet 
során a koncentráció kevesebb mint 20 %-kal tér el a névleges értéktől. Ha nem valószín ű, hogy a koncentrációk a névleges érték 
80–120 %-án belül maradnak, ajánlott az összes kísérleti koncent ­
ráció mérése a kísérlet kezdetén és végén. Illékony, instabil és er ősen 
adszorbeálódó anyagoknál további mintavétel ajánlott 24 óránként végzendő elemzéshez a kísérlet folyamán mindvégig, hogy az anyag ­
veszteség még jobban meghatározható legyen. Ilyen anyagoknál 
további párhuzamos tenyészetek szükségesek. A vizsgált anyag koncentrációjának meghatározását minden esetben elegend ő csak 
egyetlen párhuzamos tenyészet lombikjából elvégezni az egyes kísér ­
leti koncentrációkra (vagy a párhuzamos tenyészetek egyesítésével 
készített mintából).
 
A kifejezetten a vizsgálat folyamán el őálló kísérleti koncentrációk 
méréséhez készített oldatokat a kísérlethez használtakkal megegyez ő 
módon kell kezelni, azaz ezeket is be kell oltatni algával és a kísér ­
leti körülményekkel azonos körülmények között inkubálni kell. Ha 
az oldott anyag koncentrációját kell mérni, szükséges lehet az algák eltávolítása az oldatból. Az elválasztást lehet őleg az algák kiülepe ­
déséhez elegend ő, de kis fordulatszámú centrifugálással kell végezni.
 
Ha egyértelm ű, hogy a vizsgált anyag koncentrációja kielégít ő 
módon a névleges koncentráció vagy a mért kezdeti koncentráció 
± 20 %-án belül marad a kísérlet során, akkor az eredmények érté ­
kelése alapulhat a névleges értéken vagy a mért kezdeti koncentráció értékén. Ha a névleges vagy a mért kezdeti koncentrációtól való 
eltérés nagyobb mint ± 20 %, akkor az eredmények értékelésének 
alapja a kísérlet alatti koncentrációk mértani átlaga, vagy a vizsgált anyag koncentrációjának csökkenését leíró modell (3)(8).
 
Az algaszaporodás gátlásának vizsgálata dinamikusabb vizsgálati 
rendszer, mint a legtöbb hasonló, a vízi toxicitást mér ő rövid időtar­
tamú vizsgálat. Ennek következtében a tényleges kísérleti koncent ­
rációkat esetleg nehezen lehet meghatározni, f őleg kis koncentrációk 
esetén, és ha a vizsgált anyag abszorbeálódik. Ilyen esetekben az, ha a vizsgált anyag a növekv ő élőanyagban való adszorpciója miatti 
eltűnik az oldatból, nem jelenti azt, hogy eltávozott a vizsgált rend ­
szerből. A kísérlet eredményeinek elemzése során ellen őrizni kell, 
hogy a vizsgált anyag koncentrációjának a vizsgálat során történ ő 
csökkenése együtt jár-e a szaporodásgátlás csökkenésével. Ha ez a 
helyzet áll fenn, mérlegelni lehet egy olyan megfelel ő modell alkal ­
mazását, amely leírja a vizsgált anyag koncentrációjának csökkenését (8). Ha ez nem áll fenn, akkor az eredmények elemzését megfelel ő 
lehet a kiindulási (névleges vagy mért) koncentrációkra alapozni.
 
1.8.12.  További vizsgálatok  
Az oltótenyészet normális és egészséges fenotípusának ellen őrzésére, 
illetve a kísérlet végén az algák esetleges abnormális fenotípusának 
(ami lehet a vizsgált anyag hatása) megállapítására mikroszkópos 
vizsgálatokat célszer ű végezni.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Határérték-vizsgálat  
Bizonyos körülmények között, például amikor egy el őzetes vizsgálat 
azt jelzi, hogy a vizsgált anyagnak nincs toxikus hatása 100 mg•l  –1 
koncentrációig, vagy a kísérleti oldatban való oldhatósága határáig 
(amelyik a kett ő közül kisebb), határérték-vizsgálat végezhet ő, amely 
egy kontrollcsoport és egy kezelt csoport (100 mg•l  –1 -es vagy az 
oldhatósági határral megegyez ő koncentrációval) szaporodási visel ­
kedésének összehasonlítását jelenti. Határozottan ajánlott ezt a kísér ­
letben használt koncentráció mérésével alátámasztani. A határérték- 
vizsgálatra érvényes az összes korábban leírt kísérleti körülmény és érvényességi kritérium, kivéve, hogy a kezelt párhuzamos tenyé ­
szetek számának legalább hatnak kell lennie. A kontroll- és a kezelt 
csoport hatásváltozóit az átlagok összevetésére használható statisz ­
tikai analízissel (pl. Student-féle t-próba) lehet elemezni. Ha a két csoport szórásnégyzetei nem egyenl őek, akkor egyenl őtlen szórás ­
négyzetekre korrigált t-próbát kell végezni.
 
1.8.14.  Elváltozás er ősen színezett anyagok esetén  
A besugárzást (fényer ő) az e vizsgálati módszerben meghatározott 
legfelsőbb tartományban, vagyis 120 μE m  –2 s –1 vagy e fölött kell 
elvégezni.  
A fényutat a kísérleti oldatok mennyiségének a csökkentésével 
(5–25 ml tartományban) le kell rövidíteni.  
Megfelelő keverési eljárással (például mérsékelt rázással) kell bizto ­
sítani, hogy a vizsgált algatenyészet felszíne gyakran legyen kitéve erős sugárzásnak.
 
2. ADATOK  
2.1. A SZAPORODÁSI GÖRBÉK SZERKESZTÉSE  
A kísérleti lombikokban lév ő élőanyag mennyiségét ki lehet fejezni a 
mérésre használt helyettesít ő paraméter (pl. sejtszám, fluoreszcencia) 
mértékegységében is.  
Táblázatba kell foglalni a vizsgált tenyészetekben és a kontroll ­
tenyészetekben a becsült él őanyag-koncentrációkat, a vizsgált 
anyag koncentrációival és a legalább egész órákra kerekített mérési időpontokkal együtt, és ezek alapján kell megszerkeszteni a szapo ­
rodási görbéket. Ebben az els ő szakaszban használható akár loga ­
ritmikus, akár lineáris skála, a logaritmikus skála azonban kötelez ő, 
és általában jobban megjeleníti a kísérleti id őszak alatt a szaporo ­
dási viselkedésben bekövetkez ő eltéréseket. Megjegyzend ő, hogy 
logaritmikus ábrázolás esetén az exponenciális szaporodás egyenes 
vonalat ad, és hogy a vonal meredeksége adja meg a fajlagos 
szaporodási sebességet.
 
A görbék segítségével meg kell vizsgálni, hogy a kontrolltenyészetek 
a vizsgálat során mindvégig exponenciálisan szaporodtak-e, a várt 
sebességgel. Kritikusan meg kell vizsgálni minden adatpontot és a 
görbék lefutását, valamint ellen őrizni kell az adatsorokat és eljárá ­
sokat a lehetséges hibák tekintetében. F őleg azokat az adatok 
igényelnek ellen őrzést, melyeknél az eltérés valószín űleg szisztema ­
tikus hibából ered. Ha nyilvánvaló, hogy eljárási hiba történt, illetve 
ennek nagy a valószín űsége, akkor az adott adatpontot érvénytelen ­
ként meg kell jelölni, és ki kell zárni a további statisztikai elemzés ­
ből. (Ha a két vagy három párhuzamos tenyészetb ől az egyik lombik 
algakoncentrációja nulla, az azt jelezheti, hogy a lombik nem 
megfelelően lett beoltva, vagy megtisztítva). Az érvénytelenként 
elvetett adatpontoknál az elvetést egyértelm űen indokolni kell a 
mérési jegyz őkönyvben. Csak eljárási hiba (ritka) lehet elfogadható 
indok, egyszer ű pontatlanság nem. Az érvénytelen adatpontok azono ­
sítására szolgáló statisztikai módszerek csak korlátozottan használha ­
tóak az ilyen típusú problémákra, és nem helyettesítik a szakért ői 
megítélést. Az érvénytelen adatpontokat (ilyenként megjelölve) 
célszerű megtartani az adatpontok között, feltüntetve azokat a 
későbbi grafikus vagy táblázatos megjelenítések során.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. HATÁSVÁLTOZÓK  
A vizsgálat célja a vizsgált anyag által az alga szaporodására gyako ­
rolt hatás meghatározása. Ez a vizsgálati módszer két hatásváltozót ír le, mivel a tagországoknak különböz ő preferenciáik és szabályozási 
igényeik vannak. Ahhoz, hogy a vizsgálati eredmények minden 
tagországban elfogadhatóak legyenek, a hatásokat ki kell értékelni az alább leírt mindkét hatásváltozóval (a) és b)).
 
a) Átlagos fajlagos szaporodási sebesség: ez a hatásváltozó az 
élőanyag tömegének a kísérlet alatt bekövetkez ő logaritmikus 
növekedése alapján számítható, egy napra vetítve.  
b) Szaporulat: ez a hatásváltozó a kísérlet végén mérhet ő élőanyag- 
tömeg mínusz a kiindulási él őanyag-tömeg.  
E módszernek az EU szabályozási keretén belül történ ő alkalmazá ­
sához az eredményeket az alább leírt okokból kifolyólag az átlagos fajlagos szaporodási sebesség alapján kell kiszámítani. Meg kell jegyezni, hogy e két hatásváltozóval számított toxicitásértékek nem 
hasonlíthatóak össze, és a vizsgálati eredmények felhasználása során 
a kettő közötti különbségnek tudatában kell lenni. Az átlagos 
fajlagos szaporodási sebességen alapuló EC
 x értékek (E  r C x ) a két 
megközelítés matematikai alapjának következtében általában 
nagyobbak a szaporulaton alapuló eredményeknél (E  y C x ), ha e vizs ­
gálati módszer kísérleti feltételei teljesülnek. Ez nem a két hatásvál ­
tozó érzékenysége közötti eltérésként értelmezend ő, egyszer űen az 
értékek matematikailag eltér őek. Az átlagos fajlagos szaporodási 
sebesség koncepciója az algák korlátozás nélküli tenyészetekben 
történő általános exponenciális szaporodási sémáján alapszik, ahol 
a toxicitás mértéke a szaporodási sebességre gyakorolt hatások alapján becsülhet ő, függetlenül a kontrolltenyészet fajlagos szaporo ­
dási sebességének abszolút értékét ől, a koncentráció-hatás görbe 
meredekségét ől, vagy a kísérlet id őtartamától. Ezzel szemben a „sza ­
porulat” hatásváltozón alapuló eredmények függenek az említett többi változótól. Az E
 y C x függ az egyes vizsgálatokban használt 
algafajok fajlagos szaporodási sebességét ől és a legnagyobb fajlagos 
szaporodási sebességét ől, ami a fajok, s őt még különböz ő algatör­
zsek között is eltér ő lehet. Ez a hatásváltozó nem használható az 
algafajok, de még a különböz ő törzsek mérgez ő anyagokkal szem ­
beni érzékenységének összehasonlítására sem. Noha tudományos 
szempontból a toxicitás becsléséhez az átlagos fajlagos szaporodási sebesség használata preferált, e vizsgálati módszer a szaporulaton alapuló toxicitásbecsléseket is tartalmazza, hogy kielégítse a néhány 
országban érvényben lév ő hatósági el őírásokat.
 
2.2.1.  Átlagos szaporodási sebesség  
Az adott id őszakra vonatkozó átlagos fajlagos szaporodási sebesség 
az egyes kontrolltenyészetekre és kezelt tenyészetekre az él őanyag 
mennyiségének logaritmikus növekedéseként számítható ki a követ ­
kező egyenletb ől: 
μ i-j ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i (nap  –1 ) 
ahol:  
μ i–j az átlagos fajlagos szaporodási sebesség  i-től j időpontig  
X i az élőanyag mennyisége  i időpontban  
X j az élőanyag mennyisége  j időpontban.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Minden kezelt és kontrollcsoportra ki kell számítani egy átlagot 
a szaporodási sebességre, valamint meg kell becsülni a szórás ­
négyzetet.  
Az átlagos fajlagos szaporodási sebességet ki kell számolni a teljes 
kísérleti id őszakra (általában 0–3. nap), kezdeti értékként a névle ­
gesen beoltott él őanyagot, nem pedig a mért kezdeti értéket hasz ­
nálva, mert ilyen módon általában nagyobb pontosság érhet ő el. Ha 
az élőanyag mérésére használt mér őeszköz lehet ővé teszi az oltó 
élőanyag kis mennyiségének megfelel ően pontos meghatározását 
(pl. áramlásos citométer), akkor használható a mért kezdeti élőanyag-koncentráció. A szakaszonkénti szaporodási sebességet is 
meg kell állapítani a vizsgálat minden egyes napjára vonatkozóan 
(0–1., 1–2. és 2–3. nap), ugyanúgy számítva, mint a fajlagos szapo ­
rodási sebességet, és meg kell vizsgálni, hogy a kontrolltenyészet szaporodási sebessége állandó marad-e (lásd érvényességi kritériu ­
mok, 1.7. pont). Az els ő napon kapott, a teljes átlagos fajlagos 
szaporodási sebességnél szignifikánsan kisebb fajlagos szaporodási 
sebesség késési (lag) fázist jelez. Míg a késési (lag) fázis az előtenyészet megfelel ő adagolásával minimalizálható és gyakorlatilag 
kiküszöbölhet ő a kontrolltenyészetekben, addig a vizsgált anyagnak 
kitett tenyészetekben a késési (lag) fázis a kezdeti toxicitás-stressz 
utáni helyreállást, vagy pedig a vizsgált anyagnak az expozíció elején történő elveszése (beleértve az él őanyagba történ ő szorpciót) miatti 
kisebb gátló hatást jelezhet. Ebb ől következ ően a szakaszonkénti 
szaporodási sebesség használható a vizsgált anyagnak a kísérlet 
során mutatott hatásainak az értékeléséhez. A szakaszonkénti szapo ­
rodási sebesség és az átlagos szaporodási sebesség közötti lényeges különbségek az állandó exponenciális szaporodástól való eltérést 
jelzik, és azt, hogy a szaporodási görbék alapos vizsgálata indokolt.
 
A szaporodási sebesség százalékos gátlása az egyes kezelt 
párhuzamos tenyészetekre vonatkozóan az alábbi egyenletb ől számít­
ható ki:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
ahol:  
%I r : átlagos szaporodási sebesség százalékos gátlása  
μ C : átlagos szaporodási sebesség átlaga ( μ) a kontrollcsoportban  
μ T : átlagos szaporodási sebesség átlaga a kezelt párhuzamos 
tenyészetben.  
Ha a kísérleti oldatok oldószer felhasználásával készülnek, oldószer 
nélküli kontrolltenyészetek helyett oldószeres kontrolltenyészeteket kell használni a százalékos gátlás számításakor.
 
2.2.2.  Szaporulat  
A szaporulatot az egyes kontrolltenyészetekre és kezelt tenyészetekre 
úgy kell kiszámítani, hogy a kísérlet végén mért él őanyag-tömegb ől 
kivonjuk a kiindulási él őanyag-tömeget. Minden kísérleti koncentrá ­
cióra és kontrolltenyészetre vonatkozóan ki kell számítani a szapo ­
rulatra egy átlagot, valamint meg kell becsülni a szórásnégyzetet. Az 
egyes kezelt párhuzamos tenyészetekre a szaporulatra vonatkozó százalékos gátlás (% I
 y ) az alábbiak szerint számítható ki:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
ahol:  
% I  y : százalékos szaporulatgátlás  
Y C : a szaporulat átlaga a kontrollcsoportban  
Y T : a szaporulat értéke a kezelt párhuzamos tenyészetekben.  
2.3. A KONCENTRÁCIÓ-HATÁS GÖRBE SZERKESZTÉSE  
A százalékos szaporodásgátlást ábrázolni kell a vizsgált anyag 
koncentrációjának (logaritmus) függvényében, és alaposan meg 
kell vizsgálni a görbét, figyelmen kívül hagyva azokat az adatpon ­
tokat, amelyek az els ő szakaszban érvénytelenként lettek 
megjelölve. Egy egyenest kell illeszteni az adatpontokra kézzel 
vagy számítógépes interpolációval, ami egy els ő benyomást ad a 
koncentráció-hatás összefüggésr ől, majd ezután kifinomultabb 
módszert, lehet őleg számítógépes statisztikai módszert kell hasz ­
nálni. Az adatok tervezett felhasználásának, min őségének (pontos ­
ságának) és mennyiségének, valamint a rendelkezésre álló adate ­
lemző eszközök függvényében lehet úgy dönteni (és néha jól meg 
lehet indokolni), hogy ezen a szinten befejez ődik az adatelemzés 
és a meghatározó értékek, azaz az EC  50 és az EC  10 (és/vagy EC  20 ) 
egyszerűen leolvashatók a kézzel illesztett görbér ől (lásd még 
alább a stimulációs hatásokról szóló pontot). A következ ők indo­
kolhatják a statisztikai módszer mell őzését:  
— Az adatok nem megfelel őek ahhoz, hogy számítógépes 
módszerrel további, még megbízhatóbb eredmény szülessen, mint a szakért ői megítéléssel – ilyen esetekben néhány számító ­
gépes program nem is képes megbízható megoldást adni (az 
iteráció nem konvergál stb.).
 
— Stimulációs szaporodási viselkedés nem kezelhet ő pontosan a 
rendelkezésre álló számítógépes programokkal (lásd alább).  
2.4. STATISZTIKAI ELJÁRÁSOK  
A cél kvantitatív koncentráció-hatás összefüggés el őállítása regresz ­
szióanalízissel. Használható súlyozott lineáris regresszió, a hatása ­
datok például probit, logit vagy Weibull egységekbe történ ő lineáris 
transzformációja után (9), de célszer ű előnyben részesíteni a nem 
lineáris regressziós technikákat, amelyek jobban kezelik az elkerül ­
hetetlen adatszabálytalanságokat és az egyenletes eloszlástól való eltéréseket. Akár a nulla gátlás, akár a teljes gátlás közelében a 
transzformáció megsokszorozhat bizonyos szabálytalanságokat, ami 
hibás elemzést eredményezhet (9). Meg kell jegyezni, hogy a transz ­
formációval kapott probit, logit vagy Weibull egységeket használó szabványos elemzési módszerek kvantált adatok (pl. halálozás vagy 
túlélés) használatára vannak tervezve, és a szaporodási adatokkal 
vagy az él őanyagra vonatkozó adatokkal való alkalmazásukhoz 
módosítani kell őket. Az EC
 x értékek folytonos adatokból történ ő 
meghatározására szolgáló speciális eljárásokat lásd az irodalomban, 
(10), (11) és (12). A nem lineáris regresszió használatáról a 4. függe ­
lékben található részletesebb információ.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Az EC  x értékek pontbecsléseinek kiszámításához a koncentráció- 
hatás összefüggést kell használni minden elemzend ő hatásváltozóra. 
Lehetőség szerint minden ilyen becsléshez meg kell határozni a 
95 %-os megbízhatósághoz tartozó határokat. A hatásváltozók regressziós modellhez való illeszkedésének jóságát grafikusan vagy 
statisztikai módszerrel kell megállapítani. A regresszióanalízist az 
egyedi párhuzamos tenyészetekkel kapott adatokkal kell elvégezni, nem pedig a kezelt csoportok átlagaival. Ha azonban a nem lineáris görbeillesztés bonyolult vagy nem sikerül az adatok túl nagy szórása 
miatt, a problémát meg lehet kerülni a csoportátlagok regresszió ­
analízésével, ami egy gyakorlati mód a feltehet ő érvénytelen adat ­
pontok hatásának csökkentésére. Ennek a lehet őségnek a használatát 
a szokásos eljárástól való eltérésként fel kell tüntetni a mérési jegy ­
zőkönyvben, hivatkozva arra, hogy a görbeillesztések az egyedi 
párhuzamos tenyészeteknél kapott adatokkal nem adtak jó ered ­
ményt.
 
Az EC  50 becsült értékeit és a megbízhatósági határokat visszatevéses 
mintavétellel („bootstrap” módszer) együtt alkalmazott lineáris inter ­
polációval (13) is megkaphatjuk, ha a rendelkezésre álló regressziós modellek/módszerek nem használhatók a kapott adatokkal.
 
Az LOEC és ennélfogva az NOEC becsléséhez is, illetve a vizsgált 
anyag által a szaporodási sebességre gyakorolt hatásnak a becs ­
léséhez szórásnégyzet-elemzési (ANOVA) eljárások segítségével össze kell hasonlítani a kezelt csoport átlagait. Ezután az egyes koncentrációk átlagát össze kell hasonlítani a kontrolltenyészetek 
átlagával megfelel ő többszörös adat-összehasonlító vagy trendelemz ő 
módszer segítségével. A Dunnett- vagy a Williams-féle módszer használható lehet erre a célra (14)(15)(16)(17)(18). Meg kell álla ­
pítani, hogy fennáll-e a szórásnégyzetnek az ANOVA módszerben 
feltételezett homogenitása. Ez történhet grafikusan vagy formális 
próbával (18). A Levene- és Bartlett-féle próbák megfelel őek ehhez. 
Ha a szórásnégyzet homogenitásának követelménye nem teljesül, az néha az adatok logaritmikus transzformációjával korrigálható. Ha a 
szórásnégyzet rendkívül heterogén és transzformációval nem korri ­
gálható, akkor fontolóra kell venni az olyan módszerekkel végzett elemzést, mint például a redukáló Jonkheere trendpróbák (step-down Jonkheere trend tests). Az NOEC meghatározásához további útmu ­
tatás is található az irodalomban (12).
 
Az újabb kelet ű tudományos eredmények az NOEC-koncepció elha ­
gyásának ajánlásához és az EC  x regresszión alapuló pontbecsléssel 
történő meghatározásával való helyettesítéséhez vezettek. Ehhez az 
algavizsgálathoz még nem állapítottak meg megfelel ő x értéket. A 
10–20 %-os tartomány azonban megfelel őnek tűnik (a választott 
hatásváltozótól függ ően), és célszer ű mind az EC  10 -et, mind az 
EC 20 -at megadni a mérési jegyz őkönyvben.  
2.5. SZAPORODÁSSTIMULÁCIÓ  
Kis koncentrációk mellett néha szaporodásstimuláció (negatív 
gátlás) figyelhet ő meg. Ezt vagy a hormesis (kétfázisú reagálás) 
jelensége („toxikus anyag által kiváltott stimuláció”), vagy a vizs ­
gált anyaggal együtt az alkalmazott ásványi sókat tartalmazó tápol ­
datba került szaporodásserkent ő tényezők okozhatják. Megjegy ­
zendő, hogy a szervetlen tápanyagok hozzáadásának nem lehet 
semmilyen közvetlen hatása, mert a kísérleti oldatnak a kísérlet folyamán végig feleslegben kell tartalmaznia a tápanyagot. Kis 
dózisú stimuláció gyakran figyelmen kívül hagyható az EC
 50 
kiszámítása során, hacsak mértéke nem rendkívül nagy. Ha 
azonban rendkívül nagy mérték ű, vagy pedig kis x értékre kell 
EC x -et számítani, akkor speciális eljárásokra lehet szükség. Lehe ­
tőség szerint kerülni kell a stimulációs hatások törlését az adat ­
elemzésből, és ha a rendelkezésre álló görbeilleszt ő szoftver nem 
képes kezelni a kisebb mérték ű stimulációkat, akkor visszatevéses 
mintavétellel („bootstrap” módszer) együtt alkalmazott lineáris 
interpoláció használható. Ha a stimuláció rendkívül nagy, akkor 
mérlegelni lehet hormesismodell alkalmazását (19).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. NEM A TOXIKUS ANYAG ÁLTAL KIVÁLTOTT SZAPORO ­
DÁSGÁTLÁS  
A fényt abszorbeáló anyagok a szaporodási sebesség csökkenését 
okozhatják, hiszen az árnyékolás csökkenti a kapott fény mennyi ­
ségét. Az ilyen jelleg ű fizikai hatásokat a kísérleti körülmények 
módosításával el kell választani a toxikus hatásoktól, és az előbbit külön kell dokumentálni. Útmutatás az irodalomban 
található, (2) és (3).
 
3. DOKUMENTÁCIÓ  
3.1. MÉRÉSI JEGYZ ŐKÖNYV  
A mérési jegyz őkönyvnek az alábbiakat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyag:  
— fizikai jelleg és a vonatkozó fizikai és kémiai tulajdonságok, 
beleértve a vízoldhatósági határértéket is,  
— kémiai azonosítás, beleértve a tisztaságot is.  
Vizsgált fajok:  
— a törzs, a szállító vagy az eredet, és az alkalmazott tenyésztési 
körülmények.  
Kísérleti körülmények:  
— a kísérlet kezdetének id őpontja és a kísérlet id őtartama,  
— a kísérlet kivitelezésének leírása: kísérleti eszközök, a tenyé ­
szetek mennyisége, az él őanyag sűrűsége a vizsgálat kezdetén,  
— a tápoldat összetétele,  
— kísérleti koncentrációk és párhuzamos tenyészetek (pl. párhu ­
zamos tenyészetek száma, kísérleti koncentrációk száma és az 
alkalmazott mértani sor),  
— a kísérleti oldatok készítésének leírása, beleértve az oldószerek 
használatát stb.,  
— tenyészt őkészülék,  
— fényer ő és -minőség (fényforrás, homogenitás),  
— hőmérséklet,  
— kísérleti koncentrációk: a névleges kísérleti koncentrációk és a 
lombikokban lév ő vizsgált anyag koncentrációjának meghatá ­
rozására szolgáló analízisek eredménye. A vizsgálati mátrixra vonatkozóan a mérési jegyz őkönyvben fel kell tüntetni a módszer 
visszanyerési hatékonyságát és a mennyiségi meghatározás határ ­
értékét,
 
— minden eltérés ett ől a vizsgálati módszert ől, 
— az élőanyag tömegének meghatározási módszere, valamint a mért 
paraméter és a száraz tömeg közötti korreláció bizonyítéka.  
Eredmények:  
— pH-értékek minden kezelés kezdetén és végén,  
— az élőanyag tömege minden lombikban és minden mérési pont ­
ban, valamint az él őanyag mérésének módszere,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— szaporodási görbék (az él őanyag mennyiségének ábrázolása az 
idő függvényében),  
— számított hatásváltozók minden kezelt párhuzamos tenyészetre, 
átlagokkal és variációs együtthatókkal a párhuzamos tenyésze ­
tekre,  
— a koncentráció-hatás összefüggés grafikus ábrázolása,  
— toxicitásbecslés a hatásváltozókra, pl. EC  50 , EC  10 , EC  20 és a 
kapcsolódó megbízhatósági intervallumok. Az LOEC és az 
NOEC, ha ezek kiszámítása megtörtént, és a meghatározásukhoz használt statisztikai módszer,
 
— az ANOVA módszer használata esetén a kimutatható hatás 
mértéke (pl. a legkisebb szignifikáns különbség),  
— bármilyen észlelt szaporodásstimuláció a kezelt rendszerekben,  
— bármilyen más észlelt hatás, például az algák morfológiai válto ­
zása,  
— az eredmények tárgyalása, beleértve az ett ől a vizsgálati 
módszertől való eltérés eredményeképpen a vizsgálat kimenete ­
lére gyakorolt hatásokat.  
4. IRODALOM  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibi ­
tion tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442
 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment, no. 23.  
(4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667–16.  
(5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple  in 
vitro  fluorescence method for biomass measurements in 
algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.  
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J.  In vivo  fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanog ­
raphy 22,5 (1977), pp.919–925  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological 
Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. 
Sci. Technol. 19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485–1494.
 
(12) OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for 
chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxi ­
city Assessment Center Technical Report 05–88. USEPA, 
Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482–491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
 
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
1. függelék  
A vizsgálathoz bizonyítottan alkalmas törzsek  
Zöldalgák  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (régebbi elnevezéssel  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (régebbi elnevezéssel  Scenedesmus subspicatus ) 
86.81 SAG  
Kovamoszatok  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobaktériumok  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
A törzsek eredete  
Az ajánlott törzsek egyfajú algatenyészetként beszerezhet őek az alábbi törzsgy űj­
teményekb ől (ábécésorrendben):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110–2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
Sammlung von Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
D-37073 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
A javasolt fajok fenotípusa és jellemz ői 
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Fenotípus Hajlott, 
csavart egyedi 
sejtek Ovális, főként 
egyedi sejtek Pálcák Ovális 
sejtekből álló 
fonalak Pálcák 
Méret (hossz × szélesség) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Sejttérfogat ( μm 3 /sejt) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Sejt száraz tömege (mg/sejt) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Szaporodási sebesség (  3 ) (nap  –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Elektronikus részecskeszámlálóval mérve 
( 2 ) A méretb ől számítva 
( 3 ) Leggyakrabban tapasztalt szaporodási sebesség OECD-tápoldatban kb. 70 μE•m  –2 •s –1 fényintenzitásnál és 21 °C-on.  
Egyedi ajánlások a vizsgálathoz ajánlott fajok tenyésztésére és kezelésére  
Pseudokirchneriella subcapitata és Desmodesmus subspicatus  
Ezeket a zöldalgákat általában könny ű fenntartani különféle tápoldatokban. A 
megfelelő tápoldatról a tenyészetgy űjteményekt ől szerezhet ő be információ. A 
sejtek általában különállóak, és a sejts űrűség könnyen mérhet ő elektronikus 
részecskeszámlálóval vagy mikroszkóppal.  
Anabaena flos-aquae  
Törzstenyészet fenntartására számos tápoldat használható. Különösen fontos, 
hogy megújításkor elkerüljük az egyszeres (batch) tenyészet túlfutását az expo ­
nenciális fázison, mert azután már nehéz helyreállítani a tenyészetet.  
Az Anabaena flos-aquae  fonaltelepekben fejl ődik. Ezek mérete a tenyésztési 
körülményekkel változik. Mikroszkópos vagy elektronikus részecskeszámlálóval 
végzett él őanyag-meghatározáshoz fontos lehet ezeknek a telepeknek a feltörése.  
Részminták ultrahangos kezelése használható a láncok feltörésére, hogy csök ­
kenjen a sejtszámlálás változékonysága. A fonalak rövidebb szakaszokra töré ­
séhez szükségesnél hosszabb ultrahangos kezelés roncsolhatja a sejteket. Az ultrahangos kezelés intenzitásának és hosszának minden kezelésnél azonosnak kell lennie.
 
A változékonyság kompenzálásának el ősegítése céljából elegend ően nagy számú 
mezőben kell a számlálást végezni a hemocitométerben (legalább 400 sejt). Ez 
növeli a mikroszkópos s űrűségmeghatározás megbízhatóságát.  
Elektronikus részecskeszámláló használható az  Anabaena  teljes sejttérfogatának 
meghatározásához, a sejtfonalak óvatos ultrahangos széttörése után. Az ultrahang energiáját úgy kell beállítani, hogy elkerüljük a sejtek roncsolását.
 
Örvénykever ő segítségével vagy hasonló alkalmas módszerrel biztosítani kell, 
hogy a lombikok beoltására alkalmazott algaszuszpenzió megfelel ően el legyen 
keverve és homogén legyen.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
A lombikokat kb. 150/perc fordulatszámú körpályás, vagy leng őmozgású rázó ­
asztalra kell helyezni. Más megoldásként szakaszosan keverés is használható az  
Anabaena  összetapadási hajlamának csökkentésére. Ha összetapadás történik, 
ügyelni kell arra, hogy az él őanyag-mérésekhez szükséges minták reprezentatívak 
legyenek. Az összetapadt algák szétválasztásához er őteljes keverés lehet szük ­
séges a mintavétel el őtt. 
Synechococcus leopoliensis  
A törzstenyészet fenntartására különféle tápoldatok használhatók. A megfelel ő 
tápoldatról a tenyészetgy űjteményekt ől szerezhet ő be információ.  
A Synechococcus leopoliensis  különálló pálca alakú sejtek formájában szaporo ­
dik. A sejtek nagyon kicsik, ami megnehezíti az él őanyag-meghatározáshoz szük ­
séges mikroszkópos sejtszámlálást. Jól használhatók a kb. 1 μm méret ű 
részecskék számlására alkalmas elektronikus részecskeszámlálók.  In vitro  fluoro­
metriai mérések szintén alkalmazhatóak.  
Navicula pelliculosa  
A törzstenyészet fenntartására különféle tápoldatok használhatók. A megfelel ő 
tápoldatról a tenyészetgy űjteményekt ől szerezhet ő be információ. Figyelni kell 
arra, hogy a tápoldatban lennie kell szilikátnak.  
A Navicula pelliculosa  bizonyos körülmények között telepeket hozhat létre. A 
lipidtermelés következtében az algasejtek néha hajlamosak rétegekben össze ­
gyűlni a felszínen. Ilyen körülmények között az él őanyag mennyiségének 
meghatározásához leveend ő minták esetében speciális intézkedések szükségesek 
ahhoz, hogy a minták reprezentatívak legyenek. Er őteljes rázás, pl. örvénykever ő 
használata lehet szükséges.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
2. függelék  
Tápoldatok  
A következ ő két tápoldat egyike használható:  
OECD-tápoldat: Az OECD TG 201 jel ű eredeti tápoldat, megfelel az ISO 8692- 
nek is.  
Az USA Környezetvédelmi Hatóságának (EPA) AAP-tápoldata, megfelel az 
ASTM-nek is.  
Ezeknek a tápoldatoknak az elkészítése során laboratóriumi reagenseket vagy 
analitikai tisztaságú vegyszereket, és ionmentesített vizet kell használni.  
Az AAP-tápoldat (USA EPA) és OECD TG 201 jel ű tápoldat összetétele.  
Komponens EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 •6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 •2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 •7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 •6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA•2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 •4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 •6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 •2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Az EDTA/vas mólarány kissé nagyobb 1-nél. Ez megakadályozza a vas kicsapódását, és ugyanakkor a 
kelátképz ődés a nehézfém-ionokkal a lehet ő legkisebb lesz.  
A Navicula pelliculosa  kovamoszattal végzett vizsgálat során mindkét tápol ­
dathoz Na  2 SiO  3 •9H  2 0-t kell adni úgy, hogy a koncentráció 1,4 mg Si/l legyen.  
A tápoldat pH-ját akkor kell mérni, amikor egyensúly van az oldat karbonáttar ­
talma és a környezeti leveg őben lévő CO  2 parciális nyomása között. Közelít ő 
összefüggés a 25 °C-on mért pH és a moláris bikarbonátkoncentráció között:  
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
15 mg NaHCO  3 /l-rel pH  eq = 7,5 (EPA-tápoldat), és 50 mg NaHCO  3 /l-rel pH  eq = 
8,1 (OECD-tápoldat).  
A kísérleti oldatok elemi összetétele  
Kémiai elem EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Az OECD-tápoldat elkészítése  
Tápanyagok Koncentráció a törzsoldatban 
1. törzsoldat: makrotápanyagok  
NH  4 Cl 
MgCl  2 •6H  2 O 
CaCl  2 •2H  2 O 
MgSO  4 •7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g•l  –1 
1,2 g•l  –1 
1,8 g•l  –1 
1,5 g•l  –1 
0,16 g•l  –1 
2. törzsoldat: vas  
FeCl  3 •6H  2 O 
Na 2 EDTA•2H  2 O 64 mg•l  –1 
100 mg•l  –1 
3. törzsoldat: nyomelemek  
H 3 BO 3 
MnCl  2 •4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 •6H  2 O 
CuCl  2 •2H  2 O 
Na 2 MoO  4 •2H  2 O 185 mg•l  –1 
415 mg•l  –1 
3 mg•l  –1 
1,5 mg•l  –1 
0,01 mg•l  –1 
7 mg•l  –1 
4. törzsoldat: bikarbonát  
NaHCO  3 50 g•l  –1 
Na 2 SiO  3 •9H  2 O 
A törzsoldatokat membránsz űréssel (átlagos pórusátmér ő 0,2 μm) vagy autok ­
lávban (120 °C, 15 perc) sterilizálni kell. Az oldatokat 4 °C-on, sötét helyen kell 
tárolni.  
A 2. és 4. törzsoldatokat nem szabad autoklávban kezelni, hanem membránsz ű­
réssel kell őket sterilizálni.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Készítsük el a tápoldatot az 1–4. törzsoldatokból vett megfelel ő térfogatok és víz 
összekeverésével:  
Adjunk kb. 500 ml sterilizált vízhez:  
— 10 ml-t az 1. törzsoldatból,  
— 1 ml-t az 2. törzsoldatból,  
— 1 ml-t az 3. törzsoldatból,  
— 1 ml-t az 4. törzsoldatból.  
Töltsük fel az oldatot 1 000 ml-re sterilizált vízzel.  
Várjuk meg, hogy a tápoldat egyensúlyba kerüljön a környezetben lév ő CO  2 -vel, 
szükség esetén buborékoltassunk át az oldaton steril, sz űrt levegőt néhány órán 
keresztül.  
Az AAP-tápoldat elkészítése  
A1.1. Adjunk az A1.2.1–A1.2.7. pontokban felsorolt törzsoldatok mindegyi ­
kéből 1–1 ml-t kb. 900 ml ionmentesített vagy desztillált vízhez, majd 
hígítsuk fel 1 literre.  
A1.2. A makrotápanyagok törzsoldatainak készítéséhez oldjuk fel az alábbi ­
akat 500 ml ionmentesített vagy desztillált vízben. Az A1.2.1., A1.2.2., 
A1.2.3. és A1.2.4. pontokban szerepl ő reagensek egyesíthet ők egy 
törzsoldatba.  
A1.2.1.  NaNO  3 – 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCl  2 •6H 2 O – 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 •2H 2 O – 2,205 g.  
A1.2.4.  Mikrotápanyagok törzsoldata – (lásd A1.3.).  
A1.2.5.  MgSO  4 •7H  2 O – 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 – 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 – 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 •9H  2 O Lásd az A1.1. megjegyzést.  
A1.1. megjegyzés: Csak kovamoszatfajokhoz alkalmazandó. Beadható 
közvetlenül (202,4 mg) vagy törzsoldat formájában úgy, hogy 20 mg/l 
Si legyen a tápoldatban a végkoncentráció.  
A1.3. A mikrotápanyagok törzsoldatának elkészítéséhez oldjuk fel az alábbi ­
akat 500 ml ionmentesített vagy desztillált vízben:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 – 92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 •4H  2 O – 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 – 1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 •6H  2 O – 79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 •6H  2 O – 0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 •2H  2 O – 3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 •2H  2 O – 0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA•2H  2 O – 150,000 mg.  
[Dinátrium(etilén-dinitrilo)tetraacetát].  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 •5H  2 O – 0,005 mg. Lásd az A1.2. megjegyzést.  
A1.2. megjegyzés: Csak kovamoszatfajok törzstenyészetének tápolda ­
tában alkalmazandó.  
A1.4. Állítsuk be a pH-t 7,5 ± 0,1 értékre 0,1  N vagy 1,0  N NaOH-dal vagy 
HCl-dal.  
A1.5. Sz űrjük a tápközeget steril edénybe, vagy 0,22 μm-os membránsz űrőn 
ha részecskeszámlálót használunk, vagy 0,45 μm-os szűrőn ha nem 
részecskeszámlálót használunk.  
A1.6. Felhasználásig tároljuk a tápoldatot sötét helyen, kb. 4 °C-on.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
3. függelék  
Példa algatenyésztési eljárására  
Általános megjegyzések  
A következ ő eljáráson alapuló tenyésztés célja algatenyészetek el őállítása toxici ­
tásvizsgálatokhoz.  
Az algatenyészetek bakteriális fert őződésének elkerülése érdekében megfelel ő 
módszereket kell használni. Tiszta (axenikus) tenyészetek kívánatosak lehetnek, 
de egyfajú algatenyészeteket kell létrehozni és felhasználni.  
Minden beavatkozást steril körülmények között kell végezni, elkerülend ő a bakté­
riumokkal, vagy más algákkal történ ő szennyez ődést. 
Eszközök és anyagok  
Lásd „Vizsgálati módszer: Felszerelés”.  
Eljárások algatenyészetek el őállításához  
Tápoldatok készítése:  
A tápoldat minden tápsóját tömény törzsoldatként készítjük, és sötét hideg helyen 
tároljuk. Ezeket az oldatokat sz űréssel vagy autoklávban sterilizálni kell.  
A tápoldat a megfelel ő mennyiség ű törzsoldat desztillált vízhez való hozzáadá ­
sával készül, ügyelve arra, hogy ne történjen befert őződés. Szilárd táptalajhoz 
0,8 % agart kell adni.  
Törzstenyészet:  
A törzstenyészetek kicsi algatenyészetek, melyeket rendszeresen friss tápoldatba 
juttatunk, hogy kiindulási anyagként szolgáljanak a vizsgálathoz. Ha a tenyé ­
szeteket nem használjuk rendszeresen, agarral töltött ferde kémcsövekben 
szélesztjük őket. Ezeket a tenyészeteket legalább kéthavonta egyszer átvisszük 
friss táptalajra.  
A törzstenyészetek kitenyésztése a megfelel ő táptalajt (térfogat kb. 100 ml) tartal ­
mazó Erlenmeyer-lombikokban történik. Ha az algákat 20 °C-on, folyamatos megvilágítás mellett inkubáljuk, heti átoltás szükséges.
 
„Öreg” tenyészetb ől olyan mennyiségét kell átvinni steril pipettával a friss tápta ­
lajt tartalmazó lombikba, hogy a gyorsan szaporodó fajok esetén a kezdeti koncentráció 100-szor kisebb legyen, mint az „öreg” tenyészetben.
 
A faj szaporodási sebessége a szaporodási görbéb ől határozható meg. Ha ez 
ismert, akkor megbecsülhet ő az a sűrűség, amelynek elérésekor a tenyészetb ől 
át kell vinni az új tápoldatba. Ezt azel őtt kell elvégezni, miel őtt a tenyészet eléri a 
pusztulási fázist.  
Előtenyészet:  
Az előtenyészet célja, hogy a vizsgálathoz használt tenyészet beoltásához 
megfelelő mennyiség ű algát adjon. Az el őtenyészetet a kísérleti körülmények 
között inkubáljuk és akkor használjuk fel, amikor még exponenciálisan szaporodó fázisban van, szokásosan 2–4 napos inkubációs id őszakot követ ően. A deformált 
vagy abnormális sejteket tartalmazó algatenyészeteket ki kell selejtezni.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
4. függelék  
Adatelemzés nem-lineáris regresszióval  
Általános szempontok  
Az algaszaporodási és más mikrobiológiai szaporodási vizsgálatokban a hatás – 
az élőanyag növekedése – természeténél fogva folyamatos, azaz metrikus változó 
– folyamatsebesség, ha a szaporodási sebességet használjuk, illetve annak id ő 
szerinti integrálja, ha az él őanyag tömegét választjuk. Mindkett ő olyan nem 
kezelt, párhuzamos kontrollmintákban fellép ő, megfelel ő hatás átlagához van 
viszonyítva, amelyek maximálisan reagáltak az adott körülményekre – az algás 
vizsgálatoknál ezek közül meghatározó tényez ő a fény és a h őmérséklet. A rend ­
szer statisztikai eloszlású, azaz homogén, és az él őanyag kontiniumnak tekint ­
hető, nem pedig önálló sejteknek. Ilyen rendszereknél a jellemz ő hatás szórás ­
négyzet-eloszlása kizárólag a kísérleti tényez őktől (amelyeket jellemz ően a log/­
normál vagy a normál hibaeloszlás ír le) függ. Ezzel szemben, a jellemz ő bioló­
giai kísérletek kvantált adatokkal szolgálnak, amelyeknél az önálló organizmusok tűréséről (ami jellemz ően binomiális eloszlású) gyakran feltételezik, hogy az a 
meghatározó komponens a szórásnégyzetben. A kontrollmintában fellép ő hatások 
ekkor nullával, vagy a háttérszinttel egyenl őek.
 
Egyszerű esetben a normált vagy relatív válasz, r, monoton csökken 1-t ől (nulla 
gátlás) 0-ig (100-százalékos gátlás). Megjegyzend ő, hogy minden hatással együtt 
jár egy bels ő hiba, és hogy a megjelen ő negatív gátlások csak véletlen hiba 
eredményeként számolhatók.  
Regresszióanalízis  
Modellek  
A regresszióanalízis célja, hogy egy matematikai regressziós függvény, Y = f 
(C), vagy még gyakrabban F (Z), ahol Z = log C, formájában mennyiségileg leírja a koncentráció-hatás görbét. A függvény inverze, a C = f
 –1 (Y), segít ­
ségével kiszámíthatók az EC  x értékek, köztük az EC  50 , EC  10 és EC  20 , valamint 
ezekre a 95 %-os megbízhatósághoz tartozó határok. Több egyszer ű matematikai 
függvény bizonyítottan jól leírja az algákkal végzett szaporodásgátlási vizsgála ­
tokban kapott koncentráció-hatás összefüggéseket. Ilyen függvény például a 
logisztikai egyenlet, az aszimmetrikus Weibull-egyenlet, és a log/normál eloszlási 
függvény, amelyek mind szigmoid görbék, melyek aszimptotikusan közelítenek 1-hez, ha C → 0-hoz, illetve 0-hoz, ha C → a végtelenhez.
 
Újabban ajánlott a folytonos küszöbérték-függvényre alapuló modellek (mint pl. 
a Kooijman-modell a „populációnövekedés gátlására”, Kooijman és mtsai, 1996) 
használata, akár az aszimptotikus modellek alternatívájaként. Ez a modell felté ­
telezi, hogy egy adott küszöbérték, EC0+, alatt a koncentrációknak nincs hatása, és ennek a küszöbértéknek a meghatározása a koncentráció-hatás görbe egy, a kezdőpontban nem differenciálható egyszer ű folyamatos függvény segítségével 
történő extrapolációjával és a koncentrációtengely metszésével történik.
 
Megjegyzend ő, hogy az analízis lehet a legkisebb négyzetek összegének 
módszere (állandó szórásnégyzetet feltételezve), vagy a súlyozott legkisebb négy ­
zetek módszere, ha a szórásnégyzet heterogenitása kompenzálva van.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Eljárás  
Az eljárás a következ ő: választani kell egy megfelel ő függvényt, az Y = f (C)-t, 
és nem lineáris regresszióval rá kell illeszteni az adatpontokra. Lehet őség szerint 
az egyes lombikokból származó méréseket használjuk, ne pedig a párhuzamos minták átlagait, hogy a lehet ő legtöbb információt nyerjük ki az adatokból. Ha 
viszont a szórásnégyzet értéke nagy, akkor a gyakorlati tapasztalatok azt mutat ­
ják, hogy a párhuzamos minták átlagai szilárdabb matematikai becslést eredmé ­
nyezhetnek (amelyet csak kevéssé befolyásolnak az adatokban meglév ő véletlen 
hibák), mint a minden egyes megtartott adatpont használata.
 
Az illesztett görbe és a mért adatok megszerkesztése után meg kell vizsgálni, 
hogy a görbe illeszkedése megfelel ő-e. A különbségek elemzése különösen 
hasznos eszköz lehet erre a célra. Ha a koncentráció-hatás pontokra való illesz ­
téshez választott függvény nem írja le jól a teljes görbét, vagy annak egy adott, 
alapvetően fontos részét – mint például a kis koncentrációknál jelentkez ő hatá­
sokat – akkor egy másik illesztési megoldást kell választani, a szimmetrikus helyett például aszimmetrikus görbét, mint pl. a Weibull-függvényt. Negatív 
gátlás esetén probléma lehet például a logaritmikus/normál eloszlási függvénnyel, 
ekkor szintén egy másik regressziófüggvényt kell használni. Az ilyen negatív értékek nullával vagy kis pozitív számmal történ ő helyettesítése nem ajánlott, 
mert torzítja a hibaeloszlást. Célravezet őbb lehet másik illesztést használni az 
érintett szakaszokra – például arra, ahol a szaporodásgátlás kis mérték ű –, egy 
adott EC
 low x  érték meghatározása céljából. Az illesztési egyenletb ől ki kell 
számítani (inverz számítással, C = f  –1 (Y)) az EC  x jellemző pontértékeit, és a 
mérési jegyz őkönyvben meg kell adni legalább az EC  50 -re és egy vagy két EC  low 
x -re kapott értékeket. A gyakorlati tapasztalat azt mutatja, hogy az algás vizs ­
gálatok pontossága általában elfogadhatóan pontos becslést tesz lehet ővé 10 %-os 
gátlási szinten, ha van elég adatpont – kivéve, ha zavaró tényez őként stimuláció 
fordul elő kis koncentrációknál. Az EC  20 -becslés pontossága gyakran lényegesen 
jobb, mint az EC  10 -é, mert az EC  20 rendszerint a koncentráció-hatás görbe 
középső, közelítőleg lineáris szakaszára esik. A szaporodásstimuláció miatt 
néha nehéz az EC  10 -et értelmezni. Összefoglalva, noha az EC  10 általában kielé ­
gítő pontossággal meghatározható, mindig ajánlott az EC  20 feltüntetése is a 
mérési jegyz őkönyvben.  
Súlyozó tényez ők 
A tapasztalati szórásnégyzet általában nem állandó, és rendszerint tartalmaz egy 
proporcionális tagot, ezért el őnyős rutinszer űen súlyozott regressziót végezni. Az 
ilyen analízishez használt súlyozó tényez ők általában fordítottan arányosak a 
szórásnégyzettel:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Sok regresszióelemz ő programban lehet őség van a súlyozott regresszióanalízisre 
úgy, hogy a súlyozó tényez ők egy táblázatban vannak felsorolva. Kényelmi 
szempontból a súlyozó tényez őket célszer ű normálni, megszorozva őket n/∑ w i 
-vel (ahol n az adatpontok száma), hogy az összegük egyenl ő legyen 1-gyel.  
A hatásváltozók normálása  
A kontrollmintával kapott hatások átlagával történ ő normálás elvi problémákat 
vet fel és meglehet ősen bonyolult szórásnégyzet-szerkezethez vezethet. Ha a 
szaporodásgátlás százalékos meghatározásához a kapott hatásértékeket elosztjuk a kontrollmintával kapott hatások átlagával, további hibát viszünk be, amit a 
kontrollminta átlagának hibája okoz. Ha ez a hiba nem elhanyagolhatóan kicsi, 
akkor a regresszióhoz és a megbízhatósági határokhoz használt súlyozó ténye ­
zőket korrigálni kell a kontrollminták kovarianciájával (17). Megjegyzend ő, hogy 
nagyon fontos a kontrollmintákkal kapott hatásértékek becsült átlagának a 
pontossága, hogy a lehet ő legkisebb legyen a relatív hatás általános szórásnégy ­
zete. Ez a szórásnégyzet a következ ő:
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
az i alsó index az i-dik koncentrációkat, a 0 alsó index pedig a kontrollmintákat 
jelöli  
Y i = Relatív hatás = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
szórásnégyzettel:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e ¼ (∂Y i /∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i /∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
és mivel  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 and (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
normál eloszlású adatoknál és m  i és m 0 párhuzamos mintákkal:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
a relatív hatás, Y  i , teljes szórásnégyzete így a következ ő: 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 •σ 2 /r 0 4 m 0 
A kontrollminták átlagának hibája fordítottan arányos az átlagolt párhuzamos 
kontrollminták számának négyzetgyökével, és néha indokolt lehet régebbi adatokat is felhasználni és így nagy mértékben csökkenteni a hibát. Más 
megoldásként mell őzhető az adatok normálása és az illesztést az abszolút hatás ­
értékekre kell elvégezni, beleértve a kontrollminta hatásadatait is, de ekkor újabb paraméterként be kell vezetni a kontrollminta hatásértékét, amelyre nem lineáris regresszióval el kell végezni az illesztést. A szokásos 2-paraméteres regresszió ­
egyenlet esetén ehhez a módszerhez 3 paraméter illesztése szükséges, és így több 
adatpontot igényel, mint az el őre beállított kontrollminta-hatás segítségével 
normált adatokon végzett nem lineáris regresszió.
 
Inverz megbízhatósági intervallumok  
A nem lineáris regresszió megbízhatósági intervallumainak inverz becsléssel 
történő kiszámítása meglehet ősen bonyolult és a szokásos statisztikai számító ­
gépes programcsomagokban ez a lehet őség nem is áll rendelkezésre. A körülbe ­
lüli megbízhatósági határok megkaphatók szokásos nem lineáris regressziós 
programmal, a paraméterek megváltoztatásával (Bruce and Versteeg, 1992), 
ami a matematikai egyenletnek az átírását jelenti a kívánt pontbecslésekkel, pl. az EC
 10 -zel és az EC  50 -nel mint megbecsülend ő paraméterekkel. (Legyen a függ ­
vény I = f ( α, β, koncentráció) és a definiáló egyenletek, f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 és f 
(α, β, EC  50 ) = 0,5 felhasználásával helyettesítsük be az f ( α, β, koncentráció) 
függvényt egy ekvivalens g (EC  10 , EC  50 , koncentráció) függvénnyel.  
Közvetlenebb számítás (Andersen és mtsai, 1998) végezhet ő az eredeti egyenlet 
megtartásával és az r  i és r  0 átlagok körüli Taylor-sorfejtés felhasználásával.  
Újabban a visszatevéses mintavételes (bootstrap) módszerek váltak népszer űvé. 
Ezek a módszerek mért adatokat, és véletlenszám-generátor által irányított 
gyakori mintavételt használnak a tapasztalati szórásnégyzet eloszlásának becs ­
lésére.  
Irodalom  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg,, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. A „GYORS” BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG MEGHATÁ ­
ROZÁSA  
I. RÉSZ  ÁLTALÁNOS  
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a leírás hat vizsgálati módszert ismertet, amelyek lehet ővé teszik 
a kémiai anyagok sz űrését a biológiailag könnyen végbemen ő 
lebonthatóság szempontjából, valamely aerob vizes közegben.  
a) Oldottszervesszén- („Dissolved Organic Carbon” = DOC) csök ­
kenés (C.4-A. módszer);  
b) Módosított OECD vizsgálat – DOC-csökkenés (C.4-B. módszer);  
c) Szén-dioxid-fejl ődés-vizsgálat (CO  2 ) (módosított Sturm-féle vizs ­
gálat) (C.4.-C. módszer);  
d) Manometrikus respirometria (C.4-D. módszer);  
e) Zárt palack (C.4-E. módszer);  
f) MITI (Ministry of International Trade and Industry – Japán) 
(C.4-F. módszer).  
A módszer leírásának I. része ismerteti mind a hat vizsgálathoz 
tartozó általános és közös tételeket és megjegyzéseket. Az egyes 
módszerekre sajátosan jellemz ő tételek a II–VII. részben találhatók. 
A függelékek fogalommeghatározásokat, képleteket és iránymutató anyagokat tartalmaznak.
 
Egy 1988-ban, az OECD-országok laboratóriumaiban végrehajtott 
körvizsgálat azt mutatta, hogy a módszerek egymással egyez ő ered­
ményeket adnak. Azonban a vizsgált anyag fizikai jellemz őitől 
függően a módszerek közül az egyik vagy a másik el őnyben része ­
síthető. 
1.2. A MEGFELEL Ő MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA  
A legmegfelel őbb módszer kiválasztásához lényegesek a kémiai 
anyag oldhatóságára, g őznyomására és adszorpciós jellemz őire 
vonatkozó információk. Rendszerint ismerni kell a kémiai szerkezetet vagy a képletet a paraméterek, mint például a ThOD, ThCO
 2 , DOC, 
TOC, COD (lásd az 1. és 2. függeléket) elméleti értékeinek kiszá ­
mítására és/vagy mért értékeinek ellen őrzésére.  
Azon vizsgált anyagok, amelyek vízben legalább 100 mg/l 
mértékben oldhatók, a fenti módszerek közül bármelyikkel kiértékel ­
hetők, feltéve hogy nem illékonyak, és nem adszorbeálódnak. Az 1. 
táblázat tartalmazza a megfelel ő módszereket azon kémiai anyagok ­
hoz, amelyek vízben gyengén oldhatók, illékonyak vagy adszorbeá ­
lódnak. A 3. függelék írja le azt a módot, ahogyan a vízben gyengén 
oldható és illékony anyagok kezelhet ők. Mérsékelten illékony kémiai 
anyagok a DOC-csökkenés módszerével vizsgálhatók, ha elegend ő 
gáztér van a vizsgálati tartályokban (amelyeket megfelel ően le kell 
zárni). Ezen esetben abiotikus kontrollt kell alkalmazni minden lehet ­
séges fizikai veszteség figyelembevételére.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
1. táblázat  
A vizsgálati módszerek alkalmazhatósága  
Vizsgálat Analitikai módszer Alkalmas olyan anyagokhoz, amelyek: 
rosszul 
oldódnak illékonyak adszorbeá ­
lódnak  
DOC- csökkenés Oldott szerves szén — — +/– 
Módosított OECD-vizsgálat Oldott szerves szén — — +/– CO
 2 -fejlődés-vizsgálat Respirometria: CO  2 -fejlődés + — + 
Manometrikus respirometria Manometrikus respiromet ­
ria: oxigénfogyasztás + +/– + 
Zárt palack Respirometria: oldott 
oxigén +/– + + 
MITI-vizsgálat Respirometria: oxigénfo ­
gyasztás + +/– +  
A kapott eredmények értelmezéséhez szükség van a vizsgált anyag 
tisztaságára vagy relatív arányaira vonatkozó információkra, külö ­
nösen kismérték ű lebonthatóság vagy széls őséges eredmények 
esetén.  
Nagyon hasznosnak bizonyulhatnak a vizsgált anyag baktériummal 
szembeni toxicitására vonatkozó információk (4. függelék), ezek lényegesek lehetnek az alacsony biológiai lebomlási értékek megfelelő értelmezéséhez.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Az eljárás ellen őrzéséhez a normál vizsgálatsorozattal egyidej űleg 
megfelelő lombik segítségével olyan referenciaanyagokat kell 
megvizsgálni, amelyek kielégítik a biológiailag gyors lebonthatóság 
kritériumait.  
Alkalmas kémiai anyagok az anilin (frissen desztillált), a nátrium- 
acetát és a nátrium-benzoát. E referenciaanyagok közül mindegyik lebomlik ezen módszerekben, még akkor is, ha szándékosan nem 
történt inokulum-hozzáadás.
 
Javasolt olyan referenciaanyagot keresni, amely biológiailag gyorsan 
lebontható, de amelyhez szükség van valamilyen inokulum hozzáa ­
dására. A kálium-hidrogén-ftalátot javasolták, de további bizonyí ­
tékot kell beszerezni, miel őtt ezt elfogadnánk referenciaanyagként.  
A respirometriás vizsgálatokban a nitrogéntartalmú vegyületek a 
nitrifikáció miatt hatással lehetnek az oxigénfelvételre (lásd a 2. és 
5. függeléket).  
I.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyagot ásványianyag-tápoldatban fel kell oldani vagy 
szuszpendálni, és aerob állapotok mellett, sötétben vagy diffúz 
fényben be kell oltani és inkubálni. A vizsgált oldatban az oltó ­
anyagnak tulajdonítható DOC mennyiségét a vizsgált anyagnak tulaj ­
donítható DOC-mennyiséggel összehasonlítva a lehet ő legalacso ­
nyabban kell tartani. Figyelembe kell venni az inokulum endogén 
aktivitását egyidej űleg végzett vakpróbák segítségével, amelyek 
esetében az oldat csak inokulumot tartalmaz, de vizsgált anyagot nem, jóllehet, az anyag jelenlétében a sejtek endogén aktivitása nem fog pontosan megegyezni az endogén kontrollban jelentkez ő 
aktivitással. Egyidej űleg vizsgálni kell valamely referenciaanyagot 
az eljárások m űködésének ellen őrzésére.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Általában a lebomlást az olyan paraméterek meghatározása követi, 
mint például a DOC, a CO  2 -képződés és az oxigénfelvétel, és 
elegendően gyakori id őközönként méréseket kell végrehajtani a 
biológiai lebomlás kezdete és vége megállapításának lehet ővé téte­
lére. Automata respirométer alkalmazása esetén a mérés folyamatos. 
Más paramétereken kívül esetenként a DOC-ot is mérni kell, de ezt a 
mérést rendszerint csak a vizsgálat kezdetén és végén kell elvégezni. Specifikus kémiai elemzés is használható a vizsgált anyag els ődleges 
lebomlásának kiértékelésére és a képz ődött valamennyi közbens ő 
anyag koncentrációjának meghatározására (kötelez ő a MITI-vizs ­
gálatban).
 
A vizsgálat általában 28 napig tart. Azonban a vizsgálat befejezhet ő 
a 28. nap el őtt, ha a biodegradációs görbe elért egy platót legalább 
három meghatározás során. A vizsgálatok 28 napon túlra is meghosszabbíthatók, amikor a biodegradációs görbe azt mutatja, 
hogy a biológiai lebomlás elkezd ődött, de a plató (a vízszintes 
szakasz) elérése a 28. napig nem történt meg.
 
I.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
I.5.1.  Reprodukálhatóság  
A biológiai lebomlás természete és az inokulumként használt bakté ­
riumpopulációk sokfélesége miatt a meghatározásokat legalább kétszer kell végrehajtani.
 
Általános tapasztalat, hogy minél nagyobb a vizsgált oldószerhez 
kezdetben hozzáadott mikroorganizmusok koncentrációja, annál 
kisebb lesz az ismétlések közötti eltérés (szórás). A körvizsgálatok 
azt is bemutatták, hogy nagy eltérések lehetnek a különböz ő labora­
tóriumok által nyert eredmények között, de általában megegyezés tapasztalható a biológiailag könnyen lebontható vegyületeknél.
 
I.5.2.  A vizsgálat érvényessége  
A vizsgálat akkor tekinthet ő érvényesnek, ha a vizsgálat végén vagy 
a „tíznapos ablak” végén, az adott esett ől függően, a platónál a 
vizsgált kémiai anyag eltávolításakor a vizsgálat megismétlésével 
kapott értékek széls ő értékeinek különbsége kisebb mint 20 %, és 
ha a referenciaanyag százalékos lebomlása 14 nap alatt elérte a könnyű biológiai lebonthatóság szintjét. Ha ezek közül a feltételek 
közül valamelyik nem teljesül, meg kell ismételni a vizsgálatot. A 
módszerek szigorúsága miatt az alacsony értékek nem jelentik szük ­
ségképpen azt, hogy a vizsgált anyag biológiailag nem lebontható a környezeti feltételek mellett, hanem azt jelzi, hogy további vizsgála ­
tokra lesz szükség a biológiai lebonthatóság meghatározására.
 
Ha valamely toxicitási vizsgálatban, amely mind a vizsgált anyagot, 
mind a referenciaanyagot tartalmazza, 35 %-nál kisebb lebomlás (a 
DOC alapján) vagy 25 %-nál kisebb lebomlás (a ThOD vagy ThCO  2 
alapján) történt 14 nap alatt, a vizsgált kémiai anyagról feltételez ­
hető, hogy annak gátló hatásai vannak (lásd a 4. függeléket is). A 
vizsgálatsorozatot meg kell ismételni, ha lehetséges, a vizsgált kémiai anyag kisebb koncentrációja és/vagy az inokulum nagyobb koncentrációja, de 30 mg szilárd anyag/liternél nem nagyobb 
koncentráció használatával.
 
I.6. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK ÉS EL ŐKÉSZÜLETEK  
A 2. táblázat foglalja össze a vizsgálatokra érvényes általános körül ­
ményeket. A kifejezetten az egyes vizsgálatokhoz tartozó készülékek 
és egyéb kísérleti körülmények leírása kés őbb, az adott vizsgálathoz 
tartozó címszó alatt olvasható.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
2. táblázat:  
Vizsgálati körülmények  
Vizsgálat DOC-csök ­
kenés CO 2 -fejlődés Manometrikus 
respirometria Mődositottt 
OECD-vizs ­
gálat Zárt palack MITI (I)  
A vizsgálat 
anyag 
koncentra ­
cioja 
mg/l 100 2-10 100 mg DOC/1 10-40 10-20 10-40 MG ThOD/1 50-100 5-10 
Az inoklum 
koncentrá ­
ciója (sejt/l, 
megközelít ő 
érték ≤ 30 mg/l SS 
vagy ≤ 100 ml kifolyó szennyvíz/liter 
(10
 7 – 10  8 ) 0,5 ml 
másodlagos 
szennyvíz/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
kifolyó 
szennyvíz/l 
(10 4 – 10  6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 - 10  8 ) 
Elemek 
koncentrá ­
ciója ásványi oldószerben 
(mg/l-ben) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 
Na 86 8,6 17,2 
K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 
Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 Lehet őleg 7,0 
Hőmérséklett 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = Dissolved organic Carbon (oldott 
szerves szén) ThoD = Theoretical 
Oxygen Demand (elmé ­
leti oxigén ­
igény) SS = Suspended Solids 
(Szuszpendált szilárd anyagok)
 
I.6.1.  Hígítóvíz  
Toxikus anyagok (például Cu  ++ ionok) gátló hatással járó koncent ­
rációitól mentes ioncserélt vagy desztillált vizet kell használni. E 
víznek nem szabad a vizsgált anyag által bevitt szerves széntartalom 10 %-ánál többet tartalmaznia. A vizsgált víz nagy tisztaságára a nagy vakpróbaértékek kiküszöböléséhez van szükség. A szennye ­
ződés származhat a saját szennyez ődésekből, valamint az ioncserél ő 
műgyantákból és a baktériumból vagy algából származó roncsolt 
anyagból is. Minden egyes vizsgálatsorozathoz csak egyetlen adag vizet kell használni, amelyet el őzőleg DOC-elemzéssel kell ellen ­ 
őrizni. Ilyen ellen őrzésre nincs szükség a zárt palack vizsgálathoz, 
de a víz oxigénfogyasztásának alacsonynak kell lennie.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Az ásványianyag-tápoldat törzsoldatai  
A vizsgált oldatok elkészítéséhez megfelel ő koncentrációjú ásványi ­
anyag-tápoldatokat tartalmazó törzsoldatokat kell készíteni. A követ ­
kező törzsoldatok használhatók (különböz ő hígítási arányokkal) a 
DOC-csökkenés, a módosított OECD, a CO  2 -fejlődési, a manomet ­
rikus respirometriás és a zártpalackos vizsgálati módszerekhez.  
A hígítási arányok és a MITI-vizsgálat során alkalmazandó ásványi ­
anyag-tápoldat elkészítése az adott vizsgálatok leírásában olvasható.  
Törzsoldatok:  
A következ ő törzsoldatokat kell elkészíteni analitikai tisztaságú 
reagensek segítségével. 
a) Kálium-dihidrogén-foszfát, KH  2 PO 4 8,50g 
Dikálium-hidrogén-foszfát, K  2 HPO  4 21,75g 
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, Na  2 HPO  4 . 2 
H 2 O 33,40g 
Ammónium-klorid, NH  4 Cl 0,50g 
Ezen anyagokat fel kell oldani vízben, és kiegé ­
szíteni 1 literre. Az oldat pH-jának 7,4-nek kell lennie. 
b) Kalcium-klorid, vízmentes, CaCl
 2 27,50g 
or vagy kalcium-klorid-dihidrát, CaCl  2 ·2 H  2 O 36,40g 
Ezen anyagokat fel kell oldani vízben, és kiegé ­
szíteni 1 literre. 
c) Magnézium-szulfát-heptahidrát, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50g 
Ezt az anyagot fel kell oldani vízben, és kiegé ­
szíteni 1 literre. 
d) Vas(III)-klorid-hexahidrát, FeCl  3 . 6H  2 O 0,25g 
Ezt az anyagot fel kell oldani vízben, és kiegé ­
szíteni 1 literre.  
Megjegyzés: azért, hogy ne kelljen közvetlenül a használat el őtt 
előkészíteni ezen oldatot, hozzá kell adni literenként egy csepp 
tömény HCl-ot vagy 0,4 gramm etilén-diamin-tetra-ecetsav-dinát ­
rium-sót (EDTA).  
I.6.3.  Kémiai anyagok törzsoldatai  
Ha az oldhatóság túllépi az 1 g/litert, akkor fel kell oldani szükség 
szerint 1–10 gramm vizsgált vagy referenciaanyagot ioncserélt 
vízben, és ezt ki kell egészíteni 1 literre. Egyébként a törzsoldatokat 
ásványianyag-tápoldatban kell elkészíteni, vagy közvetlenül az ásvá ­
nyianyag-tápoldathoz kell hozzáadni a vizsgált anyagot. A kevésbé oldható kémiai anyagok kezelésének módját a 3. függelék tartal ­
mazza, de a MITI-vizsgálat (C.4-F. módszer) esetében sem oldósze ­
reket, sem pedig emulgálószereket nem kell használni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inokulum  
Az inokulum különféle forrásokból származhat: lehet eleveniszap, 
szennyvíztisztítóból kifolyt víz (nem klórozott), felszíni víz és talaj, vagy ezek vegyesen. A DOC-csökkenés, a CO
 2 -fejlődés és a mano ­
metrikus respirometriás vizsgálatok esetében, ha eleveniszapot hasz ­
nálnak, azt dönt ően háztartási szennyvizet befogadó szennyvíztisztító 
telepből vagy egységb ől kell venni. Más forrásokból származó 
inokulumokkal kapcsolatban bebizonyosodott, hogy ezek az eredmé ­
nyek nagyobb szórását adják. A módosított OECD- és a zártpalack- 
vizsgálat esetében több hígított inokulumra van szükség, iszappehely nélkül, és az el őnyben részesített forrás a háztartási szennyvizet 
feldolgozó szennyvíztisztító telepb ől vagy egységb ől származó 
szennyvíz. A MITI-vizsgálathoz az inokulum több forrásból szárma ­
zik, ezek ismertetése e vizsgálat leírásában olvasható.
 
I.6.4.1.  Eleveniszapból származó inokulum  
Az eleveniszap-mintát frissen kell összegy űjteni valamely, dönt ő 
részben háztartási szennyvizet feldolgozó szennyvíztisztító telep 
vagy egység leveg őztetőtartályából. Ha szükséges, el kell távolítani 
a durva részecskéket azáltal, hogy finom sz űrőn keresztül sz űrik át a 
vizsgált mintát, ezután aerob módon kell tárolni az iszapot.  
Másik szóba jöhet ő megoldás: a durva részecskék eltávolítása után 
az iszapot ülepíteni vagy centrifugálni kell (például 1 100 g mellett 
10 percen át). A felülúszó folyadékot el kell távolítani. Az iszap 
mosható ásványianyag-tápoldatban. A koncentrált iszapot az ásványi ­
anyag-tápoldatban kell szuszpendáltatni, a 3–5 gramm szuszpendált szilárd anyag/liter koncentráció elérése érdekében, majd leveg őztetni 
kell, amíg szükséges.
 
Az iszapot megfelel ően működő hagyományos üzemb ől kell venni. 
Ha az iszapot nagysebesség ű szennyvíztisztító telepr ől kell begy űj­
teni, vagy az vélhet ően tartalmaz gátlószereket, mosni kell az isza ­
pot. Alapos keverés után le kell ülepíteni vagy centrifugálni kell az újraszuszpendált iszapot, el kell távolítani a felülúszó folyadékot, és újra kell szuszpendáltatni a mosott iszapot további ásványianyag- 
tápoldatban. Ezt az eljárást addig kell ismételni, amíg az iszap 
többlet szubsztráttól vagy gátlószert ől mentesnek nem tekinthet ő.
 
A teljes újraszuszpendálódás elérése után, vagy nem kezelt iszap 
esetében közvetlenül a használat el őtt kell mintát venni a szuszpen ­
dált szilárd részecskék száraz tömegének meghatározására.  
További alternatíva az eleveniszap homogenizálása (3–5 gramm 
szuszpendált szilárd anyag/liter). Az iszapot mechanikus kever ő­
gépben 2 percen át közepes fordulatszámmal kell keverni. Le kell ülepíteni a megkevert iszapot 30 percig, vagy ha szükséges, 
hosszabb ideig, és le kell sz űrni a folyadékot 10 ml/l ásványi ­
anyag-tápoldatot tartalmazó inokulumként való használatra.
 
I.6.4.2.  Egyéb inokulumforrások  
E források dönt ően háztartási szennyvizet feldolgozó szennyvíztisz ­
tító telep vagy egység másodlagos kezelt szennyvízéb ől származhat ­
nak. Friss mintákat kell gy űjteni, és azokat leveg ővel érintkezve 
tartani a szállítás során. A mintákat 1 órán át kell ülepedni hagyni, vagy durva sz űrőpapíron át kell sz űrni, a lesz űrt kezelt szennyvizet 
vagy filtrátumot leveg ővel érintkezve kell tartani. Ásványianyag- 
tápoldat literenként legfeljebb 100 ml ilyen típusú inokulum hasz ­
nálható.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
További inokulumforrás a felszíni víz. Ebben az esetben megfelel ő 
felszíni vízmintát kell begy űjteni, például folyóból, tóból, és a 
felhasználásig leveg ővel érintkezve kell tartani. Ha szükséges, az 
inokulumot sz űréssel vagy centrifugálással lehet s űríteni.  
I.6.5.  Az inokulum el őkondicionálása  
Az inokulum el őkondícionálható a kísérleti körülményekhez, de nem 
adaptálható el őre a vizsgált anyaghoz. Az el őkondicionálás az eleve ­
niszapnak ásványianyag-tápoldatban vagy másodlagos szennyvízben 5–7 napon keresztüli, a vizsgálati h őmérsékleten végrehajtott leve ­
gőztetéséből áll. Az el őkondicionálás esetenként javítja a vizsgálati 
módszerek pontosságát a vakpróba értékek csökkentésével. Szükség ­
telennek tekinthet ő a MITI-inokulum el őkondicionálása.
 
I.6.6.  Abiotikus kontrollok  
Amikor szükséges, ellen őrizni kell a vizsgált anyag esetleges abio ­
tikus lebomlását inokulumot nem tartalmazó, steril kontrollokban a 
DOC-csökkenés, oxigénfelvétel vagy szén-dioxid-fejl ődés meghatá ­
rozásával. A sterilizáció membránsz űrés útján (0,2 – 0,45 mikromé ­
ter) vagy megfelel ő koncentrációjú, alkalmas toxikus anyag hozzáa ­
dásával történik. Ha membránsz űrést alkalmaznak, aszeptikusan kell 
mintákat venni a steril körülmények meg őrzése érdekében. Ha 
előzőleg még nem zártuk ki a vizsgált anyag adszorpcióját, akkor 
azon vizsgálatoknak, amelyek a DOC csökkenéseként mérik a bioló ­
giai lebomlást, különösen eleveniszap inokulummal, tartalmazniuk 
kell beoltott és toxikus anyagot tartalmazó abiotikus kontrollt.  
I.6.7.  A lombikok száma  
Az egyes vizsgálatsorozatokban használandó lombikok számát az 
egyes vizsgálatok leírásai ismertetik.  
A következ ő típusú lombikokat kell használni:  
— vizsgált szuszpenzió: vizsgált anyagot és inokulumot tartalmaz,  
— inokulum-vakpróba: csak inokulumot tartalmaz,  
— eljáráskontroll: referenciaanyagot és inokulumot tartalmaz,  
— abiotikus steril kontroll: steril, csak vizsgált anyagot tartalmaz 
(lásd az I.6.6. pontot),  
— adszorpciós kontroll: vizsgált anyagot, inokulumot és sterilizáló 
szert tartalmaz,  
— toxicitáskontroll: vizsgált anyagot, referenciaanyagot és inoku ­
lumot tartalmaz.  
A vizsgált szuszpenzióban és az inokulum-vakpróbában a meghatá ­
rozásnak feltétlenül egyidej űleg kell történnie. A többi lombikban is 
ajánlott egyidej űleg elvégezni a meghatározásokat.  
Ez azonban nem mindig lehetséges. Gondoskodni kell arról, hogy 
elegendő minta vagy mért érték álljon rendelkezésre a „tíznapos 
ablakban” a százalékos csökkenés kiértékelésének lehet ővé tételére.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. ADATOK ÉS KIÉRTÉKELÉS  
A D  t (százalékos lebomlás) számításához mind a vizsgálati tartályok ­
ban, mind az inokulum-vakpróbában a paraméter kétszeri mérésének átlagát kell használni. A képleteket a kés őbbiekben ismertetett, az 
egyes vizsgálatokkal foglalkozó szakaszok tartalmazzák. A lebomlás 
folyamata grafikus ábrázolásban látható, és bemutatásra kerül a „tíz ­
napos ablak”. Ki kell számítani és megadni a jelentésben a „tíznapos ablak” végén, a platónál vagy a vizsgálat végén elért százalékos 
csökkenés mértékét, az adott esetnek megfelel ően.
 
A respirometriás vizsgálatokban a nitrogéntartalmú vegyületek a 
nitrifikáció miatt hatással lehetnek az oxigénfelvételre (lásd a 2. és 5. függeléket).
 
I.7.1.  DOC-meghatározás segítségével mért lebomlás  
A D  t százalékos lebomlást minden alkalommal, amikor mintavétel 
történt, külön kell kiszámítani a vizsgált anyagot tartalmazó lombi ­
kokhoz a kett ős DOC-mérések átlagértékeit használva, hogy megítél ­
hető legyen a vizsgálat érvényessége (lásd az I.5.2. pontot). A követ ­
kező egyenlet szolgál ennek kiszámítására:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î  
Ü 100  
ahol:  
D t = százalékos lebomlás a t id őpontban,  
G o = a beoltott, a vizsgált anyagot tartalmazó ásványianyag- 
tápoldatban a DOC-koncentrációk kezdeti átlagértéke 
(mg DOC/l),  
C t = a beoltott, a vizsgált anyagot tartalmazó ásványianyag- 
tápoldatban a DOC-koncentrációk átlagértéke t id őpontban 
(mg DOC/l),  
C bo = a vakpróba beoltott ásványianyag-tápoldatban a DOC- 
koncentrációk kezdeti átlagértéke (mg DOC/l),  
C bt = a vakpróba beoltott ásványianyag-tápoldatban a DOC- 
koncentrációk átlagértéke t id őpontban (mg DOC/1).  
Minden koncentráció mérése kísérleti úton történik.  
I.7.2.  Specifikus analízis segítségével mért lebomlás  
Amikor rendelkezésre állnak specifikus analitikai adatok, a követ ­
kező képletből lehet kiszámítani az els ődleges biológiai lebomlást:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
ahol:  
D t = % lebomlás t id őpontban, általában a 28. napon,  
S a = a vizsgált anyag maradékmennyisége a vizsgálat végén a 
beoltott közegben, (mg),  
S b = a vizsgált anyag maradékmennyisége a vakpróbában olyan 
vízzel/táptalajjal végrehajtott vizsgálat után, amelyhez csak 
a vizsgált anyagot adtuk hozzá (mg).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Abiotikus lebomlás  
Abiotikus steril kontroll használatakor a következ ő képlet segít ­
ségével kell kiszámítani a százalékos abiotikus bomlást.  
% abiotikus bomlás  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
ahol:  
C s(o) = DOC-koncentráció a steril kontrollban a 0. napon  
C s(t) = DOC-koncentráció a steril kontrollban a t-dik napon  
I.8. JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— a vizsgált és referenciaanyagokat és azok tisztaságát,  
— a vizsgálati körülményeket,  
— az inokulumot: min ősége és a mintavétel helyszíne(i), koncent ­
rációja és minden el őkondícionáló kezelés,  
— a szennyvízben jelen lév ő ipari hulladék arányát és min őségét, ha 
ismert,  
— a vizsgálati id őtartamot és h őmérsékletet,  
— rosszul oldható vizsgált anyagok esetében a végrehajtott kezelést,  
— az alkalmazott vizsgálati módszert: az eljárás minden változta ­
tását tudományosan meg kell indokolni,  
— az adatlapot,  
— minden megfigyelt gátlási jelenséget,  
— minden megfigyelt abiotikus lebomlást,  
— specifikus analitikai adatokat, ha rendelkezésre állnak,  
— köztes anyagok analitikai adatait, ha rendelkezésre állnak,  
— a százalékos lebomlásnak az id ő függvényében ábrázolt görbéjét 
a vizsgált és referenciaanyagokhoz elkészítve; a lappangási fázist, 
lebomlási fázist, tíznapos ablakot és a meredekséget világosan jelezni kell (1. függelék). Ha a vizsgálat megfelelt az érvényes ­
ségi követelményeknek, a vizsgált anyagot tartalmazó lombikok 
lebomlási százalékainak átlagértéke használható a görbe elkészí ­
téséhez,
 
— a százalékos csökkenést a „tíznapos ablak” után és a platón vagy 
a vizsgálat végén.  
II. RÉSZ  DOC (OLDOTT SZERVES SZÉN) CSÖKKENÉ ­
SÉNEK VIZSGÁLATA ( C.4-A. Módszer)  
II.1. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Egyetlen szervesszén-forrásként a vizsgált anyag ismert koncentráci ­
óját (10–40 mg DOC/l) tartalmazó, beoltott ásványianyag-tápoldat 
mért mennyiségét sötétben vagy szórt fényben 22 ± 2  o C hőmérsék­
leten kell leveg őztetni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
A lebomlást 28 napos id őtartam során gyakori id őközönként végre ­
hajtott DOC-elemzés követi. A biológiai lebomlás mértékét a DOC- 
koncentrációjának csökkenéséb ől (az inokulum-vakpróba figyelem ­
bevételével) a kezdetben jelen lév ő koncentráció százalékában kell 
kiszámítani. Az els ődleges biológiai lebomlás mértéke az inkubációs 
periódus kezdetén és végén végrehajtott kiegészít ő kémiai analízisb ől 
is kiszámítható.  
II.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
II.2.1.  Készülék  
a) Kúpos lombikok, például 250 ml-t ől 2 l-ig, a DOC-analízishez 
szükséges térfogattól függ ően; 
b) kúpos lombikok fogadására alkalmas rázógép, amelyet vagy 
termosztáttal kell felszerelni, vagy klimatizált helyiségben kell 
használni; követelmény, hogy az aerob állapotok minden lombikban fenntarthatók legyenek;
 
c) szűrőkészülék, alkalmas membránokkal;  
d) DOC-analizátor;  
e) oldott oxigén meghatározására szolgáló készülék;  
f) centrifuga.  
II.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A törzsoldatok elkészítését lásd az I.6.2. pontban.  
10 ml (a) oldatot 800 ml hígítóvízzel kell összekeverni, 1 ml (b)–(d) 
oldatot kell hozzáadni, majd 1 literre hígítóvízzel kiegészíteni.  
II.2.3.  Inokulum el őkészítése és el őkondicionálása  
Az inokulum különféle forrásokból származhat: lehet eleveniszap, 
szennyvíztisztítóból kifolyt víz, felszíni víz és talaj vagy ezek 
vegyesen.  
Lásd az I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. és I.6.5. pontot.  
II.2.4.  A lombikok el őkészítése  
Példa: 800 ml-es adagokban 2 literes kúpos lombikokba ásványi ­
anyag-tápoldatot kell bevinni, ezekhez a vizsgált és referenciaoldatok 
törzsoldataiból elegend ő mennyiséget kell hozzáadni úgy, hogy 
10–40 mg DOC/l-rel egyenl ő koncentrációt kapjanak. A pH-értéket 
ellenőrizni kell, és ha szükséges, 7,4-re kell beállítani. A lombikokat 
eleveniszappal vagy más forrásból származó inokulummal kell beol ­
tani (lásd az I.6.4. pontot) úgy, hogy 30 mg szuszpendált szilárd 
anyag/liternél nem nagyobb végleges koncentrációt kapjanak. Ezen ­
kívül inokulumkontrollokat kell készíteni ásványianyag-tápoldatban, vizsgált vagy referenciaanyagok nélkül.
 
Ha szükséges, használni lehet egy tartályt a vizsgált anyag lehetséges 
gátló hatásának ellen őrzésére olyan oldat oltásával, amely az ásvá ­
nyianyag-tápoldatban, mind a vizsgált, mind valamely referencia ­
anyag hasonló koncentrációit tartalmazza.  
Ezenkívül, ha szükséges, egy további, steril lombik is alkalmazható 
az anyag nem beoltott oldatának segítségével annak ellen őrzésére, 
hogy lebomlott-e abiotikusan a vizsgált anyag (lásd az I.6.6. pontot).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Ha a vizsgált anyagról gyanítható, hogy jelent ős mértékben adszor ­
beálódik az üvegen, iszapban stb., akkor el őzetes vizsgálatot kell 
végezni az adszorpció valószín ű mértékének és a kísérlet alkalmas ­
ságának meghatározására (lásd az 1. táblázatot). El ő kell készíteni 
egy, a vizsgált anyagot, inokulumot és sterilizálószert tartalmazó 
lombikot.  
Minden lombikban ki kell pótolni a térfogatot 1 literre ásványianyag- 
tápoldattal, és keverés után mintát kell venni mindegyikb ől a DOC 
kezdeti koncentrációjának meghatározására (lásd a 2. függelék 4. 
pontját). Le kell fedni a lombikok nyílását például alufóliával úgy, 
hogy szabad légcsere jöhessen létre a lombik és a környezete között. Ezután a lombikokat rázógépbe kell helyezni, és el kell kezdeni a vizsgálatot.
 
II.2.5.  Lombikok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban  
1. és 2. lombik: vizsgált szuszpenzió  
3. és 4. lombik: inokulum-vakpróba  
5. lombik: eljáráskontroll  
Ajánlott és amikor szükséges:  
6. lombik: abiotikus steril kontroll  
7. lombik: adszorpciós kontroll  
8. lombik: toxicitáskontroll  
Lásd még az I.6.7. pontot is.  
II.2.6.  A kísérlet végrehajtása  
A kísérlet során mindvégig kétszer kell meghatározni a DOC 
koncentrációit minden egyes lombikban olyan ismert id őközönként, 
amely elegend ően gyakori meghatározást biztosít ahhoz, hogy 
megállapítható legyen a „tíznapos ablak” kezdete és a százalékos csökkenés a „tíznapos ablak” végén. A vizsgált szuszpenzióból 
csak az egyes meghatározásokhoz szükséges minimális mennyiséget 
kell kivenni.
 
Mintavétel el őtt, ha szükséges, a lombikokban pótolni kell az elpá ­
rolgott veszteséget, megfelel ő mennyiség ű hígítóvíz (I.6.1.) hozzáa ­
dásával. Az ásványianyag-tápoldatot alaposan meg kell keverni a mintavétel el őtt, és gondoskodni kell arról, hogy a tartályok falához 
hozzátapadt anyag mintavétel el őtt feloldódjon vagy szuszpendálód ­
jon. Közvetlenül a mintavétel végrehajtása után sz űrésre van szükség 
membránsz űrővel vagy centrifugálással (lásd a 2. függelék 4. pont ­
ját). A sz űrt vagy centrifugált mintákat még ugyanazon a napon kell 
analizálni, ellenkez ő esetben 2–4
 o C hőmérsékleten kell tárolni 
maximum 48 órán át vagy –18  o C alatti h őmérsékleten hosszabb 
időtartamig.  
II.3. ADATOK ÉS JELENTÉS  
II.3.1.  Az eredmények kiértékelése  
Ki kell számítani a százalékos lebomlást a t id őpontban az 1.7.1. 
(DOC-meghatározás), és választható módon az 1.7.2. (specifikus 
analízis) pontban megadottaknak megfelel ően. 
Minden eredményt fel kell jegyezni a megadott adatlapokon.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Az eredmények érvényessége  
Lásd az I.5.2. pontot.  
II.3.3.  Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
II.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
DOC-CSÖKKENÉS VIZSGÁLATA  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/l, az anyagra vonatkoztatva  
Kezdeti koncentráció a közegben, t  0 : … mg/l az anyagra vonat ­
koztatva  
4. INOKULUM  
Forrás:  
Végrehajtott kezelés:  
Előkondicionálás, ha van ilyen:  
Szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja a reakciókeverék ­
ben: … mg/l  
5. SZÉNANALÍZIS  
Szénanalizátor:  
Lombik száma DOC n nap után (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Vizsgált kémiai 
anyag + inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, átlag 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, átlag 
C b(t) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Lombik száma DOC n nap után (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Vakpróba- 
inokulum vizsgált anyag nélkül 3 c
 1 
c 2 
c, átlag C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, átlag 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. ALAPADATOK KIÉRTÉKELÉSE  
Lombik száma % lebomlás n nap után 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Átlag (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) A D  1 -et és D  2 -t nem szabad átlagolni, ha jelent ős eltérés van közöttük.  
Megjegyzés:  hasonló adatlapok használhatók a referenciaanyagokhoz 
és a toxicitáskontrollokhoz is.  
7. ABIOTIKUS KONTROLL  (választható)  
Idő (nap) 
0 t  
DOC-koncentráció (mg/l) steril kontrollban C s(o) C s(t) 
% abiotikus lebomlás  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. SPECIFIKUS ANALÍZIS  (választható)  
A vizsgált kémiaianyag-maradék 
mennyisége a vizsgálat végén 
(mg/l) % elsődleges lebomlás  
Steril kontroll S  b ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
A vizsgált kémiaianyag-maradék 
mennyisége a vizsgálat végén 
(mg/l) % elsődleges lebomlás  
Beoltott vizsgált közeg S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
III. RÉSZ  MÓDOSÍTOTT OECD-VIZSGÁLAT (DOC- 
CSÖKKENÉS)  (C.4-B. Módszer)  
III.1. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Egyetlen szerves szénforrásként a vizsgált anyag ismert koncentráci ­
óját (10–40 mg DOC/l) tartalmazó beoltott ásványi oldószer mért mennyiségét sötétben vagy szórt fényben 22 ± 2
 o C hőmérsékleten 
kell leveg őztetni.  
A lebomlást egy 28 napos id őtartam során gyakori id őközönként 
végrehajtott DOC-elemzés követi. A biológiai lebomlás mértékét a 
DOC koncentrációjának csökkenéséb ől, (az inokulum-vakpróba 
figyelembevételével) a kezdetben jelen lév ő koncentráció százalé ­
kában kell kiszámítani. Az els ődleges biológiai lebomlás mértéke 
az inkubációs periódus kezdetén és végén végrehajtott kiegészít ő 
kémiai analízisb ől is kiszámítható.  
III.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
III.2.1. Készülék  
a) Kúpos lombikok, például 250 ml-t ől 2 l-ig, a DOC-analízishez 
szükséges térfogattól függ ően; 
b) rázógép a kúpos lombikok behelyezésére, amelyet vagy termosz ­
táttal kell felszerelni, vagy klimatizált helyiségben kell használni, követelmény, hogy az aerob állapotok minden lombikban fenn ­
tarthatók legyenek;
 
c) szűrőkészülék, alkalmas membránokkal;  
d) DOC-analizátor;  
e) oldott oxigén meghatározására szolgáló készülék;  
f) centrifuga.  
III.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A törzsoldatok elkészítését lásd az I.6.2. pontban.  
10 ml (a) oldatot 800 ml hígítóvízzel kell összekeverni, 1 ml (b)–(d) 
oldatot kell hozzáadni, majd 1 literre hígítóvízzel kiegészíteni.  
E módszer literenként csak 0,5 ml kezelt szennyvizet használ inoku ­
lumként, ezért lehetséges, hogy meg kell er ősíteni a közeget nyome ­
lemekkel és növekedési faktorokkal. Ez a következ ő oldatok mind ­
egyikéből 1 ml hozzáadásával történik 1 liter végs ő közeghez:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Nyomelemoldat: 
Mangán-szulfát-tetrahidrát, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Borsav, H  3 BO 3 57,2 mg 
Cink-szulfát-heptahidrát, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg 
Ammónium-heptamolibdát (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-keLát (FeC1  3 etiléndiamin-tetra-ecetsav) 100,0 mg 
Ezen anyagokat fel kell oldani, és kipótolni 1 000 ml- 
re hígítóvízzel 
Vitaminoldat: Élesztőkivonat 15,0 mg
 
Az éleszt őkivonatot fel kell oldani 100 ml vízben. Sterilizálni 
kell 0,2 mikrométer pórusméret ű membránon keresztülvezetve, 
vagy frissen kell elkészíteni.  
III.2.3.  Inokulum el őkészítése és el őkondicionálása  
Az inokulum dönt ően háztartási szennyvizet feldolgozó szennyvíz ­
tisztító telep vagy egység másodlagos, kezelt szennyvízéb ől szárma­
zik. Lásd az I.6.4.2. és az I.6.5. pontot.  
A felhasznált mennyiség 0,5 ml/liter ásványianyag-tápoldat.  
III.2.4.  A lombikok el őkészítése  
Példa: 800 ml-es adagokban 2 literes kúpos lombikokba ásványi ­
anyag-tápoldatot kell bevinni, ezekhez a vizsgált- és referencia ­
oldatok törzsoldataiból elegend ő mennyiséget kell hozzáadni úgy, 
hogy 10–40 mg DOC/l-rel egyenl ő koncentrációt kapjanak. Ellen ­ 
őrizni kell a pH-értéket, és ha szükséges, 7,4-re kell beállítani. A 
lombikokat kezelt szennyvízzel kell beoltani (lásd az I.6.4.2. pontot) 0,5 ml/l koncentráció mellett.
 
Ezenkívül inokulumkontrollokat kell készíteni ásványianyag-tápol ­
datban, vizsgált- vagy referenciaanyagok nélkül.  
Ha szükséges, használni lehet egy tartályt a vizsgált kémiai anyag 
lehetséges gátló hatásának ellen őrzésére olyan oldat oltásával, amely 
az ásványi közegben, mind a vizsgált, mind valamely referencia ­
anyag hasonló koncentrációit tartalmazza. Ezenkívül, ha szükséges, 
egy további, steril lombik is alkalmazható az anyag nem beoltott 
oldatának segítségével annak ellen őrzésére, hogy lebomlott-e abioti ­
kusan a vizsgált anyag (lásd az I.6.6. pontot).  
Ha a vizsgált anyagról gyanítható, hogy jelent ős mértékben adszor ­
beálódik az üvegen, iszapban stb., akkor el őzetes vizsgálatot kell 
végezni az adszorpció valószín ű mértékének és a kísérlet alkalmas ­
ságának meghatározására (lásd az 1. táblázatot). El ő kell készíteni 
egy, a vizsgált anyagot, inokulumot és sterilizálószert tartalmazó lombikot.
 
Minden lombikban ki kell pótolni a térfogatot 1 literre ásványianyag- 
tápoldattal, és a keverés után mintát kell venni minden egyes 
lombikból a DOC kezdeti koncentrációjának meghatározására (lásd a 2. függelék 4. pontját). Le kell fedni a lombikok nyílását például alufóliával úgy, hogy szabad légcsere jöhessen létre a lombik és a 
környezete között. Ezután a lombikokat rázógépbe kell helyezni, és 
el kell kezdeni a vizsgálatot.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  A lombikok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban  
1. és 2. lombik: vizsgált szuszpenzió  
3. és 4. lombik: inokulum-vakpróba  
5. lombik: eljáráskontroll  
Ajánlott és amikor szükséges:  
6. lombik: abiotikus steril kontroll  
7. lombik: adszorpciós kontroll  
8. lombik: toxicitáskontroll  
Lásd még az I.6.7. pontot is.  
III.2.6.  A vizsgálat végrehajtása  
A vizsgálat során mindvégig kétszer kell meghatározni a DOC 
koncentrációit minden egyes lombikban olyan ismert id őközönként, 
amely elegend ően gyakori meghatározást biztosít ahhoz, hogy 
megállapítható legyen a „tíznapos ablak” kezdete és a százalékos 
csökkenés a „tíznapos ablak” végén. A vizsgált szuszpenzióból 
csak az egyes meghatározásokhoz szükséges minimális mennyiséget kell kivenni.
 
Mintavétel el őtt, ha szükséges, a lombikokban pótolni kell az elpá ­
rolgott veszteséget megfelel ő mennyiség ű hígítóvíz (1.6.1.) hozzáa ­
dásával. Az ásványianyag-tápoldatot alaposan meg kell keverni a mintavétel el őtt, és gondoskodni kell arról, hogy a tartályok falához 
hozzátapadt anyag mintavétel el őtt feloldódjon vagy szuszpendálód ­
jon. Közvetlenül a mintavétel végrehajtása után sz űrésre van szükség 
membránsz űrővel vagy centrifugálással (lásd a 2. függelék 4. pont ­
ját). A sz űrt vagy centrifugált mintákat még ugyanazon a napon kell 
analizálni, ellenkez ő esetben 2–4
 o C hőmérsékleten kell azt tárolni 
maximum 48 órán át vagy –18  o C alatti h őmérsékleten hosszabb 
időtartamig.  
III.3. ADATOK ÉS JELENTÉS  
III.3.1.  Az eredmények kiértékelése  
Ki kell számítani a százalékos lebomlást a t id őpontban az I.7.1. 
(DOC meghatározás), és választható módon az I.7.2. (specifikus 
analízis) pontban megadottaknak megfelel ően. 
Minden eredményt fel kell jegyezni a megadott adatlapokon.  
III.3.2. Az eredmények érvényessége  
Lásd az I.5.2. pontot.  
III.3.3. Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
III.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
MÓDOSÍTOTT OECD-VIZSGÁLAT  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/l, az anyagra vonatkoztatva  
Kezdeti koncentráció a médiumban: … mg/l az anyagra vonat ­
koztatva  
4. INOKULUM  
Forrás:  
Végrehajtott kezelés:  
Előkondicionálás, ha van ilyen:  
Szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja a reakciókeverék ­
ben: … mg/l  
5. SZÉNANALÍZIS  
Szénanalizátor:  
Lombik száma DOC n nap után (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Vizsgált kémiai 
anyag + inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, átlag 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, átlag 
C b(t) 
Vakpróba- 
inokulum vizsgált anyag nélkül 3 c
 1 
c 2 
c, átlag C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, átlag 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. ALAPADATOK KIÉRTÉKELÉSE  
Lombik száma % lebomlás n nap után 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Lombik száma % lebomlás n nap után 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Átlag (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) A D  1 -et és D  2 -t nem szabad átlagolni, ha jelent ős eltérés van közöttük.  
Megjegyzés : hasonló adatlapok használhatók a referenciaanyagokhoz 
és a toxicitáskontrollokhoz is.  
7. ABIOTIKUS KONTROLL  (választható)  
Idő (nap) 
0 t  
DOC-koncentráció (mg/l) steril kontrollban C s(o) C s(t) 
% abiotikus lebomlás  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. SPECIFIKUS ANALÍZIS  (választható)  
A vizsgált kémiaianyag-maradék 
mennyisége a vizsgálat végén 
(mg/l) % elsődleges lebomlás  
Steril kontroll S  b 
Beoltott vizsgált közeg S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
IV. RÉSZ CO  2 -FEJLŐDÉS-VIZSGÁLAT (C.4-C. módszer)  
IV.l. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Kizárólagos szerves szénforrásként a vizsgált anyag ismert koncent ­
rációját (10–20 mg DOC vagy TOC/l) tartalmazó, definiált térfogatú beoltott ásványianyag-tápoldatot szabályozott átfolyási sebesség 
mellett, szén-dioxid-mentes leveg ő átvezetésével, sötétben vagy 
szórt fényben leveg őztetni kell. A lebomlást 28 napon át kell követni 
a termelt szén-dioxid meghatározásával, amelyet bárium- vagy nátrium-hidroxidban kell elnyeletni, és amelyet a maradék hidroxid 
titrálásával vagy szervetlen szénként kell mérni. A vizsgált anyagból 
előállított szén-dioxid-mennyiséget (a vakpróba-inokulumból szár ­
mazó mennyiség figyelembevételével helyesbítve) a ThCO
 2 százalé­
kaként kell kifejezni. A biológiai lebomlás mértéke az inkubációs 
periódus kezdetén és végén végrehajtott kiegészít ő DOC-analízisb ől 
is kiszámítható.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
IV.2.1.  Készülék  
a) 2–5 literes lombikok, mindegyik egy, csaknem a tartály aljáig ér ő 
levegőztető csővel, és egy kivezet ő nyílással ellátva;  
b) mágneses kever ők, a rosszul oldódó kémiai anyagok kiértékelé ­
sekor;  
c) gázabszorpciós üvegek;  
d) a légáram szabályozására és mérésére szolgáló készülék;  
e) szén-dioxid kivonására alkalmas berendezés a szén-dioxid-mentes 
levegő elkészítéséhez; más lehet őségként gázpalackokból szár ­
mazó CO  2 -mentes oxigén és CO  2 -mentes nitrogén keveréke hasz ­
nálható a megfelel ő arányokban (20 % O  2 : 80 % N  2 ); 
f) készülék a szén-dioxid meghatározására, vagy titrimetriás 
méréshez vagy szervetlenszén-analízishez;  
g) membránsz űrő készülék (választható);  
h) DOC-analizátor.  
IV.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A törzsoldatok elkészítését lásd az I.6.2. pontban.  
10 ml (a) oldatot 800 ml hígítóvízzel kell összekeverni, 1 ml (b)–(d) 
oldatot kell hozzáadni, majd 1 literre hígítóvízzel kiegészíteni.  
IV.2.3.  Inokulum el őkészítése és el őkondicionálása  
Az inokulum különböz ő forrásokból szerezhet ő be: lehet eleveniszap; 
kezelt szennyvíz; felszíni víz; talaj vagy ezek vegyesen.  
Lásd az I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. és I.6.5. pontot.  
IV.2.4.  A lombikok el őkészítése  
A következ ő térfogatok és tömegek jelzik a 3 liter szuszpenziót 
tartalmazó 5 literes lombikokhoz tartozó értékeket. Ennél kisebb 
térfogatú lombikok használatakor megfelel ően módosítani kell az 
értékeket, de gondoskodni kell arról, hogy pontosan mérhet ő legyen 
a fejlődött szén-dioxid.  
Minden egyes 5 literes lombikba önteni kell 2 400 ml ásványianyag- 
tápoldatot. Hozzá kell adni megfelel ő mennyiség ű előkészített eleve ­
niszapot (lásd az I.6.4.1. és I.6.5. pontot) úgy, hogy a végleges 3 
literes beoltott keverékben 30 mg/l-nél nem nagyobb szuszpendált szilárdanyag-koncentrációt kapjanak. Más megoldás: el őször hígítani 
kell az el őkészített iszapot úgy, hogy 500–1 000 mg/l szuszpenziót 
kapjanak az ásványianyag-tápoldatban, miel őtt hozzáadnánk egy 
aliquot részt az 5 literes lombik tartalmához a 30 mg/l-es koncent ­
ráció elérésére; ez utóbbi eljárás nagyobb pontosságot biztosít. Hasz ­
nálhatók más inokulumforrások is (lásd az 1.6.4.2. pontot).
 
A szén-dioxidnak a rendszerb ől történő eltávolítása érdekében a 
beoltott keverékeket CO  2 -mentes leveg ővel kell leveg őztetni egy 
éjszakán át.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Az ismételt vizsgálatokhoz alkalmazandó lombikokhoz a vizsgált 
anyagot és a referenciaanyagot külön-külön kell hozzáadni, ismert 
töménység ű törzsoldatok formájában, úgy, hogy a hozzáadott anya ­
gokkal együtt 10–20 mg DOC vagy TOC/l-koncentrációkat kapja ­
nak; néhány lombikhoz nem adnak hozzá kémiai anyagot, hanem 
meghagyják azokat inokulumkontrollnak. A rosszul oldódó vizsgált 
anyagokat közvetlenül kell a lombikokba bevinni tömeg vagy térfogat alapján, vagy azokat a 3. függelékben ismertetett módon kell kezelni.
 
Ha szükséges, használható egy lombik a vizsgált kémiai anyag eset ­
leges gátló hatásának ellen őrzésére, e lombikba mind a vizsgált, 
mind a referenciaanyagokat ugyanolyan koncentrációkban kell bevinni, mint ahogy azok a többi lombikban jelen vannak.
 
Ezenkívül, ha szükséges, egy steril lombik használható annak ellen ­ 
őrzésére, hogy lebomlik-e abiotikusan a vizsgált kémiai anyag; ehhez 
az anyag nem beoltott oldatát kell használni (lásd az I.6.6 pontot). A sterilizáció megfelel ő koncentrációjú toxikus anyag hozzáadásával 
történik.
 
Mindhárom lombikban ki kell egészíteni a szuszpenzió térfogatát 3 
literre előzőleg CO  2 -mentes leveg ővel leveg őztetett ásványianyag- 
tápoldat hozzáadásával. Tetszés szerint minták vehet ők DOC-analí ­
zishez (lásd a 2. függelék 4. pontját) és/vagy a specifikus analízishez. 
Az abszorpciós üvegeket a lombikok leveg őkivezető nyílásához kell 
csatlakoztatni.  
Ha bárium-hidroxidot használnak, három abszorpciós üveget kell 
sorba csatlakoztatni, amelyek közül mindegyik 100 ml 0,0125 M 
bárium-hidroxid-oldatot tartalmaz, minden egyes 5 literes lombikhoz. Az oldatnak kicsapódott szulfáttól és karbonáttól mentesnek kell lennie, és közvetlenül a használat el őtt meg kell határozni a koncent ­
rációját. Ha nátrium-hidroxidot használnak, csatlakoztatni kell két 
abszorpciós csapdát, amelyek közül a második ellen őrzésre szolgál 
annak bemutatására, hogy minden szén-dioxid abszorbeálásra került az elsőben. A szérumos üvegekéhez hasonló záróelemmel ellátott 
üvegek alkalmasak e célra. Mindkét üvegbe 200 ml 0,05 M 
nátrium-hidroxidot kell bevinni, amely elegend ő a vizsgált anyag 
teljes lebomlásakor fejl ődő teljes szén-dioxid mennyiségének abszor ­
beálására. A nátrium-hidroxid-oldat, még ha frissen elkészített is, 
nyomokban tartalmazni fog karbonátokat; ezt a vakpróbában lév ő 
karbonátmennyiség levonásával korrigálni kell.
 
IV.2.5.  A lombikok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban  
1. és 2. lombik: vizsgált szuszpenzió  
3. és 4. lombik: inokulum-vakpróba  
5. lombik: eljáráskontroll  
Ajánlott és amikor szükséges:  
6. lombik: abiotikus steril kontroll  
7. lombik: toxicitáskontroll  
Lásd még az I.6.7. pontot is.  
IV.2.6.  A kísérlet végrehajtása  
A kísérlet kezdetén CO  2 -mentes leveg őt kell belevezetni a szuszpen ­
ziót tartalmazó tartályokba 30–100 ml/perc átfolyási sebesség 
mellett. Szabályos id őközönként mintákat kell venni a szén-dioxid- 
abszorbensb ől a CO  2 -tartalom elemzésére. Az els ő 10 nap során 
ajánlatos az elemzéseket minden második vagy harmadik napon 
elvégezni, és ezután minden 5. napon a 28. napig azért, hogy 
meghatározható legyen a „tíznapos ablak”.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
A 28. napon mintákat kell venni (tetszés szerint) a DOC- és/vagy a 
specifikus analízis céljából, meg kell mérni a szuszpenzió pH-ját, és 
bele kell tenni 1 ml tömény sósavat minden egyes lombikba; a lombikokat egész éjszakán át a vizsgált szuszpenziókban jelen lév ő 
szén-dioxid eltávolítása érdekében szell őztetni kell. A 29. napon kell 
végrehajtani a fejl ődött szén-dioxid utolsó elemzését.
 
A CO  2 -mérések napjain el kell választani a lombikhoz legköze ­
lebbi bárium-hidroxid abszorbciós üveget, és titrálni kell a hidro ­
xid-oldatot 0,05 M HCl-dal, indikátorként fenolftaleint használva. A többi abszorbciós üveget eggyel közelebb kell tenni a lombik ­
hoz, és el kell helyezni egy új, 100 ml friss 0,0125 M bárium- 
hidroxidot tartalmazó abszorbciós üveget a sor legtávolabbi végére. Titrálást kell végezni szükség szerint, például amikor jelent ős 
csapadékképz ődés látható az els ő abszorpciós üvegben, és miel őtt 
ennek bármilyen bizonyítéka lenne látható a második üvegen, vagy 
legalább hetente. Más megoldásként, abszorbensként NaOH-t hasz ­
nálva, fecskend ővel kis térfogatú nátrium-hidroxid-oldat-mintát kell 
venni (az elemzéshez használt szénanalizátor jellemz őitől függően) 
a lombikhoz legközelebbi abszorbciós üvegb ől. A mintát be kell 
fecskendezni a szénelemz ő készülék IC-részébe a fejl ődött szén- 
dioxid közvetlen elemzéséhez.
 
A második abszorpciós csapda tartalmát csak a vizsgálat végén kell 
elemezni az összes szén-dioxid-átvitel figyelemb evételével.  
IV.3. ADATOK ÉS JELENTÉS  
IV.3.1.  Eredmények kiértékelése  
A titráláskor az abszorberben megköt ődött CO  2 -mennyiséget a 
következő összefüggés adja meg:  
mgCO  2 = (100 x C  B - 0,5 x V x C  A ) x 44  
ahol:  
V = az abszorberben a 100 ml titrálásához használt HCl térfo ­
gata (ml),  
C B = bárium-hidroxid-oldat koncentrációja (M),  
C A = a sósavoldat koncentrációja (M),  
ha a C  B értéke 0,0125 M és a C  A értéke 0,05 M, 100 ml bárium- 
hidroxid esetében a titráláshoz felhasznált térfogat 50 ml, és a CO  2 
tömegét a következ ő összefüggés adja meg:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü titráláshoz használt HC1  ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Így tehát ebben az esetben a titrált HCl-térfogatnak megfelel ően a 
fejlődött CO  2 mennyisége (mg) közötti szorzótényez ő 1,1.  
Ki kell számítani az egyedül az inokulumból és az inokulumból 
plusz a vizsgált anyagból fejl ődött CO  2 tömegét a megfelel ő titrálási 
értékek segítségével, ezek különbsége a kizárólag a vizsgált anyagból 
fejlődött CO  2 mennyisége.  
Például, ha kizárólag az inokulum esetében 48 ml kell a titráláshoz 
és az inokulum plusz vizsgált anyaghoz együttesen 45 ml, akkor  
a CO  2 inokulum esetében = 1,1 x (50 – 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
a CO  2 inokulum plusz vizsgált anyag esetében = 1,1 x (50 – 45) = 
5,5 mg  
tehát a vizsgált anyagból fejl ődött CO  2 mennyisége 3,3 mg.  
A százalékos biológiai lebomlás a következ ő összefüggésb ől 
számító ki:  
% lebomlás ¼ fejlődött mg CO  2 Ü 100 
ThCO  2 Ü mg hozzáadott vizsgált anyag  
vagy  
% lebomlás ¼ fejlődött mg CO  2 Ü 100 
vizsgálatban hozzáadott mg TOC  Ü 3; 67 
az átváltási arány 3,67 (44/12) a szén és a szén-dioxid között.  
Ki kell számítani a százalékos lebomlást minden egyes id őinter­
vallum után a mérés végrehajtásának id őpontjáig az egyes napokhoz 
kiszámított ThCO  2 értékek százalékának összeadásával.  
Nátrium-hidroxid abszorberek esetében ki kell számítani a fejl ődött 
szén-dioxid-mennyiséget, IC-ben (szervetlen szén) (mg) kifejezve, 
megszorozva az IC koncentrációját az abszorbensben az abszorbens térfogatával.
 
A százalékos lebomlást a következ ő összefüggésb ől lehet kiszámí ­
tani: 
% ThCO  2 ¼ mg IC a vizsgált anyagot tartalmazó lombikból – mg IC a vakpróbából 
vizsgált anyagként hozzáadott TOC  Ü 100 
A DOC csökkenését (választható) az I.7. pontban leírtaknak megfele ­
lően lehet kiszámítani. Ezt és minden más eredményt a megadott 
adatlapokra kell feljegyezni.  
IV.3.2.  Eredmények érvényessége  
A vizsgálat kezdetén az ásványianyag-tápoldatban lév ő vizsgált 
anyag szuszpenzió IC-tartalmának a TC 5 %-ánál kevesebbnek kell 
lennie, és a vizsgálat végén az inokulum-vakpróbában a teljes CO  2 - 
fejlődésnek általában nem szabad 40 mg/l oldószernél nagyobbnak 
lennie. Ha 70 mg CO  2 /l-nél nagyobb értékeket kapnak, alaposan meg 
kell vizsgálni az adatokat és a kísérleti módszert.  
Lásd még az I.5.2. pontot is.  
IV.3.3.  Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
IV.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
SZÉN-DIOXID-FEJL ŐDÉS-VIZSGÁLAT  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/l, az anyagra vonatkoztatva  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Kezdeti koncentráció a médiumban: … mg/l az anyagra vonat ­
koztatva  
A lombik tartalmához hozzáadott szén teljes mennyisége: 
… mg C  
ThCO  2 : … mg CO  2 
4. INOKULUM  
Forrás:  
Végrehajtott kezelés:  
Előkondicionálás, ha van ilyen:  
Szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja a reakciókeverék ­
ben: … mg/l  
5. SZÉN-DIOXID-FEJL ŐDÉS ÉS -LEBONTHATÓSÁG  
Idő 
(nap) A vizsgálatban képz ő­
dött CO  2 
(mg) A vakpróbában képz ő­
dött CO  2 
(mg) Képződött CO  2 
összesen (mg), 
a vizsgált anyag és a 
vakpróba különbsége ­
inek átlaga ThCO  2 
CO  2 
ThCO  2 Ü 100  
1 
2 átlag 3 
4 átlag 1 2 1 2 átlag  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Megjegyzés: hasonló adatlapok használhatók a referenciaanyagokhoz 
és a toxicitáskontrollokhoz is.  
6. SZÉNANALÍZIS  (választható)  
Szénanalizátor:  
Idő (nap) Vakpróba mg/liter Vizsgált anyag mg/liter  
0 (C  bo ) (C  o ) 
28 (*) (C  bt ) (C  t ) 
(*) vagy az inkubációs periódus végén.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC csökkenés  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. ABIOTIKUS LEBOMLÁS  (választható)  
% abiotikus bomlás  ¼ CO  2 Ä fejlődés steril kontrollban 28 nap után  ½mgâ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
V. RÉSZ  MANOMETRIKUS RESPIROMETRIÁS MÉRÉS  
(C.4-D. Módszer)  
V.l. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Kizárólagos szerves szénforrásként a vizsgált anyag ismert koncent ­
rációját (100 mg/l vizsgált anyag, legalább 50–100 mg ThOD/liter létrehozásához) tartalmazó, mért térfogatú, beoltott ásványianyag- 
tápoldatot kell keverni zárt lombikban, állandó h őmérsékleten 
(± 1
 o C vagy ennél kisebb eltérés mellett) legfeljebb 28 napig. 
Meg kell határozni az oxigénfogyasztást vagy a respirométer- palackban az állandó gáztérfogat fenntartásához szükséges (elekt ­
rolízis útján el őállított) oxigénmennyiség mérésével, vagy a készü ­
lékbeli térfogat- vagy nyomásváltozás (vagy a kett ő valamilyen 
kombinációjának) vizsgálatával. A fejl ődött szén-dioxidot kálium- 
hidroxid-oldatban vagy valamilyen más alkalmas abszorbensben 
nyeletik el. A vizsgált anyag által felvett oxigén (az egyidej űleg 
vizsgált vakpróba-inokulum által felvett mennyiség figyelembevéte ­
lével helyesbítve) mennyiségét a ThOD vagy a COD százalékaként 
kell kifejezni. Tetszés szerint az els ődleges biológiai lebomlás is 
kiszámítható az inkubációs periódus kezdetén és végén végrehajtott kiegészítő specifikus elemzésb ől, és elvégezhet ő a végső biológiai 
lebomlás DOC-analízise.
 
V.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
V.2.1.  Készülék  
a) alkalmas respirométer;  
b) termosztát, amely ± 1  o C vagy ennél nagyobb pontossággal képes 
a hőmérséklet fenntartására;  
c) membránsz űrő készülék (választható);  
d) szénanalizátor (választható).  
V.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A törzsoldatok elkészítését lásd az I.6.2. pontban.  
10 ml (a) oldatot 800 ml hígítóvízzel kell összekeverni, 1 ml (b)–(d) 
oldatot kell hozzáadni, majd 1 literre hígítóvízzel kiegészíteni.  
V.2.3.  Inokulum el őkészítése és el őkondicionálása  
Az inokulum különböz ő forrásokból szerezhet ő be: lehet eleveniszap; 
kezelt szennyvíz; felszíni víz; talaj vagy ezek vegyesen.  
Lásd az I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. és I.6.5. pontot.  
V.2.4.  A lombikok el őkészítése  
A vizsgált és referenciaanyagból külön lombikokban oldatokat készí ­
tenek ásványianyagtápoldatban, a törzsoldatok felhasználásával úgy, 
hogy az oldatok koncentrációja általában 100 mg anyag/liter legyen, 
ami legalább 50–100 mg ThOD/liter-értéknek felel meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Ki kell számítani a ThOD-t az ammóniumsók képz ődése alapján, 
kivéve ha nitrifikáció várható, ebben az esetben a számításnak a 
nitrátképz ődésen (lásd a 2. függelék 2. pontját) kell alapulnia.  
A pH-értékeket meg kell határozni, és ha szükséges, be kell állítani 
azokat 7,4 ± 0,2-re.  
A rosszul oldódó anyagok hozzáadására kés őbbi fázisban kerül sor 
(lásd alább).  
Ha meg kell határozni a vizsgált anyag toxicitását, akkor egy másik 
oldatot kell elkészíteni ásványianyag-tápoldatban, amely ugyanolyan 
koncentrációkban tartalmazza mind a vizsgált, mind a referencia ­
anyagokat, mint az egyes oldatok.  
Ha mérni kell a fizikai-kémiai okokra visszavezethet ő oxigénfelvé ­
telt, akkor el kell készíteni általában egy 100 mg ThOD/liter 
koncentrációjú oldatot, amelyet megfelel ő toxikus anyag hozzáadá ­
sával sterilizálnak (lásd az I.6.6. pontot).  
A szükséges térfogatú vizsgált, illetve referenciaoldatokat legalább 
két lombikba kell szétosztani. Ezenkívül további lombikokba csak ásványianyag-tápoldatot kell tenni (inokulum kontrollvizsgálathoz), illetve, ha szükséges, az összekevert vizsgált/referenciaoldatot és a 
steril oldatot.
 
Ha a vizsgált anyag rosszul oldódik, akkor azt közvetlenül e 
szakaszban tömeg vagy térfogat alapon kell az edénybe bevinni, vagy a 3. függelékben leírt módon kell azt kezelni. Káliumhidroxi ­
dot, nátronmész-pasztillákat vagy más abszorbenseket kell adagolni a 
CO
 2 -abszorbciós üvegekbe.  
V.2.5.  A lombikok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban  
1. és 2. lombik: vizsgált szuszpenzió  
3. és 4. lombik: inokulum-vakpróba  
5. lombik: eljáráskontroll  
Ajánlott és amikor szükséges:  
6. lombik: abiotikus steril kontroll  
7. lombik: toxicitáskontroll  
Lásd még az 1.6.7. pontot is.  
V.2.6.  A kísérlet végrehajtása  
Miután a lombikok elérték a kívánt h őmérsékletet, azokat be kell 
oltani a megfelel ő előkészített eleveniszappal vagy más inokulumfor ­
rással úgy, hogy a kapott szuszpendált szilárd anyag koncentrációja ne legyen 30 mg/l-nél nagyobb. Össze kell szerelni a berendezést, elindítani a kever őt, és ellen őrizni a légmentes záródást, majd meg 
kell kezdeni az oxigénfelvétel mérését. Rendszerint semmilyen 
további figyelemre nincs szükség, a mért érték leolvasásán és azokon a napi ellen őrzéseken kívül, amelyek során meg kell mérni, hogy 
fennmaradt-e a megfelel ő hőmérséklet és a megfelel ő keverés.
 
Az oxigénfelvételt a rendszeres és gyakori id őközönként leolvasott 
értékekből lehet kiszámítani a berendezés gyártója által megadott 
módszerek segítségével. Az inkubálás végén, általában a 28. napon, meg kell mérni a lombikok tartalmának pH-ját, különösen akkor, ha 
alacsony vagy (nitrogéntartalmú vegyületek esetében) meghaladja a 
ThODNH
 4 értékét.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Ha szükséges, a respirométer-palackokból a mérés elején és végén, a 
DOC- vagy a specifikus kémiai elemzés végrehajtására mintát kell 
venni (lásd a 2. függelék 4. pontját). A mérés kezdetén végrehajtott mintavételkor gondoskodni kell arról, hogy ismert legyen a palackban maradó vizsgált szuszpenzió térfogata. Amikor a nitrogént 
tartalmazó vizsgált anyag oxigént vesz fel, meg kell határozni a nitrit 
és a nitrát koncentrációjának növekedését a 28 nap alatt, a nitrifi ­
káció következtében elfogyasztott oxigén figyelembevételével (5. függelék).
 
V.3. ADATOK ÉS VIZSGÁLATI JELENTÉS  
V.3.1.  Az eredmények kiértékelése  
El kell osztani valamely adott id őt követően (az ugyanennyi id ő után 
a vakpróbainokulum-kontroll által felvett oxigén figyelembevételével 
helyesbített) a vizsgált kémiai anyagra vonatkozó oxigénfelvételt 
(mg) a felhasznált vizsgált anyag tömegével. Ezzel megkapják a mg oxigén/mg vizsgált anyag hányadosaként kifejezett BOD-t, 
vagyis
 
BOD ¼ ðmg O  2 uptake by test chemical  Ä mg O  2 uptake by blankÞ 
ðvizsgált anyag lombikban  ½mgâÞ 
O 2 [mg]) / (vizsgált anyag lombikban [mg])  
A százalékos biológiai lebomlás kiszámítható a következ ő összefüg ­
gések valamelyikéb ől: 
% biológiai lebomlás  ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg anyagÞ 
ThODðmg O  2 anyagÞ Ü 100 
vagy:  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg anyagÞ 
CODðmgO  2 anyagÞ Ü 100 
Meg kell jegyezni, hogy e két módszer nem ad szükségképpen 
azonos értéket; az els ő módszer használatát kell el őnyben részesíteni.  
Nitrogéntartalmú vizsgált anyagokhoz a megfelel ő ThOD-t kell hasz ­
nálni (NH  4 vagy NO  3 ) annak megfelel ően, hogy várható-e nitrifiká ­
ció, vagy sem (lásd a 2. függelék 2. pontját). Ha el őfordul nitrifiká ­
ció, de az nem teljes, ki kell számítani egy, a nitrifikálással elfo ­
gyasztott oxigént figyelembe vev ő korrekciós tényez őt a nitrit és 
nitrát koncentrációjában létrejöv ő változásokból (5. függelék).  
Amikor a szerves szén és/vagy a specifikus kémiai analízis mellett 
döntenek, ki kell számítani a százalékos lebomlást az I.7. pontban leírt módon.
 
Minden eredményt fel kell jegyezni a mellékelt adatlapokra.  
V.3.2.  Az eredmények érvényessége  
Az inokulum-vakpróba oxigénfelvétele általában 20–30 mg O  2 /liter, 
és nem szabad, hogy 60 mg/liternél nagyobb legyen 28 nap alatt. 60 mg/liternél nagyobb értékek esetében alaposan meg kell vizsgálni az adatokat és a kísérleti módszereket. Ha a pH-érték kívül van a 
6–8,5-ös tartományon, és a vizsgált anyag által felvett oxigén keve ­
sebb mint 60 %, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni a vizsgált anyag kisebb koncentrációjával.
 
Lásd még az I.5.2. pontot is.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
V.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
MANOMETRIKUS RESPIROMETRIÁS VIZSGÁLAT  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/liter  
Kezdeti koncentráció a médiumban, C  o : … mg/liter  
Térfogat a vizsgálólombikban (V): … ml  
ThOD vagy COD: … mg O  2 /mg vizsgált anyag (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Forrás:  
Végrehajtott kezelés:  
Előkondicionálás, ha van ilyen:  
Szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja a reakciókeverék ­
ben: … mg/l  
5. OXIGÉNFELVÉTEL: BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG  
Idő (nap) 
0 7 14 21 28  
O 2 -felvétel 
(mg), vizsgált anyag 1 
2 
a, átlag 
O
 2 -felvétel 
(mg) vakpróba 3 
4 
b, átlag 
Korrigált BOD 
(mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BOD/mg vizs ­
gált anyag ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Idő (nap) 
0 7 14 21 28  
% lebomlás  
BOD 
ThOD Ü 100  D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Átlag (*)  
V = közeg térfogata a vizsgálati lombikban. 
(*) A D  1 -et és D  2 -t nem szabad átlagolni, ha jelent ős a különbség a kett ő között.  
Megjegyzés: hasonló adatlapok használhatók a referenciaanyagokhoz 
és a toxicitáskontrollokhoz is.  
6. KORREKCIÓ A NITRIFIKÁCIÓ FIGYELEMBEVÉTE ­
LÉVEL  (lásd az 5. függeléket)  
Nap 0 28 Különbség  
i. Nitrátkoncentráció (mg N/liter) (N) 
ii. Oxigén-egyenértékben kifejezve (4,57 × N × V) 
(mg) — — 
iii. Nitritkoncentráció (mg N/liter) (N) 
iv. Oxigén-egyenértékben kifejezve (3,43 × N × V) 
(mg) — — 
ii + iv. Teljes oxigén-egyenérték — —  
7. SZÉNANALÍZIS  (választható)  
Szénanalizátor:  
Idő (nap) Vakpróba mg/liter Vizsgált anyag mg/liter  
0 (C  blo ) (C  o ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) vagy az inkubációs periódus végén.  
% DOC Ä csökkenés ¼ 1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Í Î  
Ü 100  
8. SPECIFIKUS ANALÍZIS  (választható)  
S b = a vizsgált anyag koncentrációja fizikai-kémiai (steril) 
kontrollban a 28. napon  
S a = koncentráció a beoltott lombikban a 28. napon  
% biológiai lebomlás  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
9. ABIOTIKUS LEBOMLÁS  (választható)  
a = oxigénfelvétel a steril lombikokban 28 nap után, (mg)  
oxigénfelvétel mg vizsgált anyagonként =  a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(lásd az 1. és 3. szakaszt)  
% abiotikus lebomlás =  a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
VI. RÉSZ.  ZÁRTPALACK-MÓDSZER  (C.4-E. Módszer)  
VI.1. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált kémiai anyagnak ásványianyag-tápoldatban lév ő, rendsze­
rint 2–5 mg/liter koncentrációjú oldatát be kell oltani viszonylag kis számú, vegyes populációból származó mikroorganizmussal, és 
teljesen teletöltött, zárt palackokban, sötétben, állandó h őmérsékleten 
kell tartani. A lebomlást a 28 napos id őtartam alatt a feloldódott 
oxigén analízise követi. A vizsgált anyag által felvett oxigénmeny ­
nyiséget, az egyidej űleg végrehajtott vizsgálatban a vakpróba- 
inokulum által felvett oxigén figyelembevételével helyesbítve, a 
ThOD vagy a COD százalékában kell kifejezni.
 
VI.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
VI.2.1.  Készülék  
a) BOD-palackok, üvegdugókkal, például 250–300 ml-esek;  
b) Vízfürd ő vagy inkubátor, amelyekben a palackok állandó h őmér­
sékleten (± 1  o C vagy ennél nagyobb pontosság mellett) sötétben 
tarthatók;  
c) Nagyméret ű üvegpalackok (2–5 literesek) a közeg el őkészítésére 
és a BOD-palackok megtöltésére;  
d) Oldottoxigén-mér ő, valamint reagensek a Winkler-féle titráláshoz.  
VI.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A törzsoldatok elkészítését lásd az I.6.2. pontban.  
Össze kell keverni 1 ml-t az (a)–(d) oldatokból, és azt hígítóvízzel ki 
kell egészíteni 1 literre.  
VI.2.3.  Az inokulum el őkészítése  
Az inokulum valamilyen, dönt ően háztartási szennyvizet feldolgozó 
szennyvíztisztító telep vagy egység másodlagos kezelt szennyvízéb ől 
származik. Alternatív inokulumforrás a felszíni víz. Általában egy csepp (0,05 ml) és 5 ml közötti sz űrletet kell használni ásványi ­
anyagtápoldat-literenként; kísérletezésre lehet szükség adott inoku ­
lumforrás vonatkozásában az optimális térfogat kiderítésére (lásd az 
I.6.4.2. és I.6.5. pontot).
 
VI.2.4.  A lombikok el őkészítése  
Az ásványianyag-tápoldatot legalább 20 percig kell intenzíven leve ­
gőztetni. Ugyanazon adagból származó ásványianyag-tápoldattal kell 
végrehajtani minden egyes vizsgálatsorozatot. Az oldószer általában 
a vizsgálati h őmérsékleten való 20 óra állást követ ően kész a felhasz ­
nálásra. Az oldott oxigén koncentrációját ellen őrzési célból 
kell meghatározni; az értéknek körülbelül 9 mg/liternek kell lennie 20
 o C-os hőmérsékleten. A leveg ővel telített közeg minden áthelye ­
zési és áttöltési m űveletét buborékmentesen kell végrehajtani, például 
szívócsövek segítségével.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
A BOD-palackok csoportjait kell elkészíteni a vizsgált és a refe ­
renciaanyagok meghatározására végzett egyidej ű kísérletsorozatok ­
hoz. Elegend ő számú BOD-palacknak kell rendelkezésre állnia, az 
inokulum-vakpróbákat is ideértve úgy, hogy legalább két oxigén ­
fogyasztás-mérés legyen végrehajtható a kívánt id őintervallumok ­
ban, például a 0., 7., 14., 21. és 28. nap után. Lehet, hogy további 
palackokra lesz szükség annak biztosítására, hogy azonosítható legyen a „tíznapos ablak”.
 
A teljesen kileveg őztetett ásványianyag-tápoldatot a nagy palackokba 
úgy kell beletölteni, hogy azok körülbelül 1/3 részükig legyenek megtöltve. Ezután a nagy palackokba bele kell tölteni a vizsgált anyag és a referenciaanyag törzsoldatából elegend ő mennyiséget 
úgy, hogy az anyagok végleges koncentrációja általában ne legyen 
10 mg/liternél nagyobb. Semmilyen kémiai anyagot nem lehet bele ­
önteni a vakpróba kontrolloldószert tartalmazó nagy palackba.
 
Annak biztosítására, hogy az inokulumaktivitás ne legyen korláto ­
zott, az oldott oxigén koncentrációjának nem szabad 0,5 mg/liter alá 
csökkennie a BOD-palackokban. Ez körülbelül 2 mg/literre korlá ­
tozza a vizsgált anyag koncentrációját. Azonban a nehezen lebomló 
vegyületekhez és az alacsony ThOD-érték ű vegyületekhez 5–10 mg/ ­
liter használható. Néhány esetben ajánlatos lehet a vizsgált anyagot egyidejűleg vizsgálni két különböz ő, például 2 és 5 mg/literes 
koncentráció mellett. Általában a ThOD-t az ammóniumsók képz ő­
dése alapján kell kiszámítani, de ha nitrifikáció várható, vagy ismert, 
hogy ez el őfordul, a számításnak a nitrátképz ődésen kell alapulnia 
(ThOD
 NO3 : lásd a 2. függelék 2. pontját). Azonban, ha el őfordul 
ugyan nitrifikáció, de ez nem teljes, korrekciót kell végrehajtani a 
nitrit és a nitrát koncentrációjában az elemzés által meghatározott 
változások figyelembevételével (lásd az 5. függeléket).  
Ha meg kell vizsgálni a vizsgált anyag toxicitását (például abban az 
esetben, ha el őzőleg kis mérték ű biológiai lebonthatóság volt tapasz ­
talható), akkor egy másik palacksorozat szükséges.  
Egy másik nagy palackra is szükség van a kileveg őztetett, kb. 
harmadáig megtöltött ásványianyag-tápoldat befogadására, valamint 
a vizsgált anyag és a referenciaanyag bevitelére olyan végleges 
koncentrációban, amely általában megegyezik a többi nagy palackban lév ő koncentrációval.
 
A nagy palackokban lév ő oldatokat másodlagos kifolyó szennyvízzel 
(egy cseppel vagy körülbelül 0,05 ml-t ől 5 ml/l-ig terjed ő mennyi­
séggel), vagy valamilyen más forrásból származó inokulummal, például folyóból vett vízzel (lásd az I.6.4.2. pontot) kell beoltani. 
Végül az oldatokat kileveg őztetett ásványianyag-tápoldattal kell 
kiegészíteni úgy, hogy kitöltsék a teljes térfogatot, az oldószer bevi ­
teléhez a palack aljáig leér ő csövet kell használni, azért hogy 
megfelelő keveredést érjenek el.
 
VI.2.5.  A palackok száma egy tipikus vizsgálatsorozatban  
Egy tipikus vizsgálatsorozatban a következ ő palackokra van szükség:  
— a vizsgált anyagot és az inokulumot (vizsgált szuszpenzió) tartal ­
mazó legalább 10 palack,  
— csak inokulumot (inokulum-vakpróba) tartalmazó legalább 10 
palack,  
— referenciaanyagot és inokulumot (eljáráskontroll) tartalmazó 
legalább 10 palack,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— és amikor szükséges, a vizsgált anyagot, referenciaanyagot és 
inokulumot (toxicitáskontroll) tartalmazó 6 palack. Annak bizto ­
sítására, hogy meghatározható legyen a „tíznapos ablak”, körül ­
belül kétszer ennyi palackra lehet szükség.  
VI.2.6. A kísérlet végrehajtása  
Minden egyes el őkészített oldatot a megfelel ő nagy palack alsó 
negyedéb ől kell kiadagolni (nem az aljából) egy cs ő segítségével a 
BOD-palackok megfelel ő csoportjába úgy, hogy minden BOD- 
palack teljesen tele legyen. A palackokat ezután óvatosan meg kell 
ütögetni az esetleges légbuborékok eltávolítása céljából. A palac ­
kokat a nulla id őpontban azonnal elemezni kell az oldott oxigén 
mennyiségének megállapítása céljából a Winkler- vagy az elektróda 
módszer segítségével. A palackok tartalma tartósítható a Winkler- 
módszerrel végrehajtott kés őbbi elemzéshez mangán(II)-szulfát és 
nátrium-hidroxid (els ő Winkler-reagens) hozzáadásával. A gondosan 
ledugózott palackokat, amelyek az oxigént barna mangán(III)-hidro ­
xidként kötve tartalmazzák, sötétben, 10–20  o C hőmérsékleten, 24 
óránál nem hosszabb ideig kell tárolni, miel őtt végrehajtanánk a 
Winkler-módszer hátralév ő lépéseit. A többi, másodpéldányként 
szolgáló palackot is le kell fedni dugóval, gondoskodva arról, hogy 
ne legyen bennük légbuborék, e palackokat 20  o C hőmérsékleten, 
sötét helyen kell inkubálni. Minden egyes vizsgálatsorozatot egy teljes párhuzamos sorozatnak kell kísérnie az inokulumvakpróba- értékek meghatározására. A 28 napos inkubálási id ő során bizonyos 
időközönként (legalább hetente) minden sorozatból legalább két 
palackot el kell távolítani az oldott oxigén mennyiségének meghatá ­
rozása érdekében.
 
A hetenként vett mintáknak lehet ővé kell tenniük valamely 14 napos 
időintervallum során a százalékos csökkenés kiértékelését, míg a 3–4 
naponként történ ő mintavételnek lehet ővé kell tennie a „tíznapos 
ablak” meghatározását, amelyhez körülbelül kétszer annyi palackra van szükség.
 
Nitrogéntartalmú anyagok vizsgálata esetében korrekciót kell végre ­
hajtani a nitrifikáció következtében végbemen ő oxigénfelvétel tekin ­
tetében. Ennek végrehajtására az O  2 -elektróda módszert kell hasz ­
nálni az oldott oxigén koncentrációjának meghatározására, ezután mintát kell venni a BOD-palackból a nitrit és a nitrát elemzésére. A nitrit és a nitrát koncentrációjának növekedéséb ől lehet kiszámítani 
a felhasznált oxigén mennyiségét (lásd az 5. függeléket).
 
VI.3. ADATOK ÉS JELENTÉS  
VI.3.1.  Eredmények kiértékelése  
Először ki kell számítani az egyes id őtartamok utáni BOD-t a vizs ­
gált anyag oxigénfelvételéb ől kivonva az inokulum-vakpróba oxigén ­
felvételét (mg O  2 /liter). A korrigált oxigénfelvétel értékét el kell 
osztani a vizsgált anyag koncentrációjával (mg/liter), hogy 
megkapják az adott BOD-t mg oxigén/mg vizsgált anyagként. Ki 
kell számítani a százalékos biológiai lebonthatóságot az adott BOD-nek az adott ThOD-val (a 2. függelék 2. pontjának megfelel ően 
kiszámított) vagy COD-val (elemzéssel meghatározva, lásd a 2. 
függelék 3. pontját) való elosztásával, azaz:
 
BOD ¼ a vizsgált anyag által felvett O  2 ½mgâ – a vakpróba által felvett O  2 ½mgâ 
a palackban lév ő vizsgált anyag ½mgâ ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 /mg vizsgált anyag  
% lebomlás ¼ BOD ðmg O  2=mg vizsgált anyag Þ 
ThODðmg O  2=mg vizsgált anyag Þ Ü 100 
vagy:  
% lebomlás ¼ BOD ðmg O  2=mg vizsgált anyag Þ 
CODðmg O  2=mg vizsgált anyag Þ Ü 100 
Meg kell jegyezni, hogy e két módszer nem ad szükségképpen 
azonos értéket; az els ő módszer használatát kell el őnyben részesíteni.  
Nitrogéntartalmú anyagok vizsgálatához a megfelel ő ThOD-t kell 
használni (NH  4 vagy NO  3 ) annak megfelel ően, hogy várható-e nitri ­
fikáció, vagy sem. Ha el őfordul nitrifikáció, de az nem teljes, ki kell 
számítani egy, a nitrifikálással elfogyasztott oxigént figyelembe vev ő 
korrekciós tényez őt a nitrit és nitrát koncentrációjában létrejöv ő 
változásokból (5. függelék).  
VI.3.2.  Az eredmények érvényessége  
Az inokulum-vakpróbában az oxigéncsökkenésnek nem szabad 1,5 
mg oldott oxigén/liternél nagyobbnak lennie 28 nap eltelte után. Ennél nagyobb értékek esetén meg kell vizsgálni a kísérleti módsze ­
reket. A vizsgált palackokban a maradék oxigén koncentrációjának 
soha nem szabad 0,5 mg/liter alá csökkennie. Az ilyen alacsony oxigénszintek csak akkor érvényesek, ha az oldott oxigén meghatá ­
rozására használt módszer képes pontosan mérni az ilyen alacsony 
szinteket.
 
Lásd még az I.5.2. pontot is.  
VI.3.3.  Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
VI.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
ZÁRT PALACKOS VIZSGÁLAT  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/liter  
Kezdeti koncentráció a palackban: … mg/liter  
ThOD vagy COD: … mg O  2 /mg vizsgált anyag  
4. INOKULUM  
Forrás:  
Végrehajtott kezelés:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
Előkondicionálás, ha van ilyen:  
Koncentráció a reakciókeverékben: … mg/liter  
5. OLDOTT OXIGÉN (DO) MEGHATÁROZÁSA  
Módszer: Winkler-módszer/oldott oxigén mérése elektródával  
Meghatározások a palackokból  
Inkubálás id őtartama (nap) Oldott oxigén (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Vakpróba (vizsgált 
anyag nélkül 1 C  1 
2 C  2 
Átlag 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Vizsgált anyag 1 a  1 
2 a  2 
Átlag 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Megjegyzés : hasonló adatlapok használhatók a referenciaanyagokhoz 
és a toxicitáskontrollokhoz is.  
6. KORREKCIÓ A NITRIFIKÁCIÓ FIGYELEMBEVÉTE ­
LÉVEL  (lásd az 5. függeléket)  
Inkubálás id őtartama (nap) 0 n  1 n 2 n 3 
i. Nitrátkoncentráció (mg N/liter) 
ii. Nitrátkoncentráció változása (mg N/liter) — iii. Oxigén-egyenértékben kifejezve (mg/liter) — iv. Nitritkoncentráció (mg N/liter) v. Nitritkoncentráció változása (mg N/liter) — vi. Oxigén-egyenértékben kifejezve (mg/liter) — iii. + vi. Teljes oxigén-egyenérték (mg/liter) —
 
7. OLDOTTOXIGÉN-CSÖKKENÉS: % LEBOMLÁS  
Csökkenés n nap után (mg/liter) 
n 1 n 2 n 3 
1. PALACK: (m  to – mt  x ) – (m  bo – m  bx ) 
2. PALACK: (m  to – mt  x ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Csökkenés n nap után (mg/liter) 
n 1 n 2 n 3 
1. PALACK 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
vizsgálat anyag koncentrációja  Ü ThOD kémiai anyag 
2. PALACK 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
vizsgálat anyag koncentrációja  Ü ThOD kémiai anyag 
% D átlag (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Nem adagolható, ha jelent ős különbség van az ismételt mérések között.  
m to = a vizsgálati palackban a 0 id őpontban mért érték  
m tx = a vizsgálati palackban az x id őpontban mért érték  
m bo = vakpróbában mért átlagos érték a 0 id őpontban  
m bx = vakpróbában mért átlagos érték az x id őpontban  
A 6. szakaszban a iii. + vi-ból származó nitrifikáció figyelembevé ­
telére is korrekciót kell alkalmazni.  
8. AZ OLDOTT OXIGÉN CSÖKKENÉSE AZ INOKULUM- 
VAKPRÓBÁBAN  
A vakpróba által felvett oxigén: (m  bo – m  b28 ) mg/liter. Ez 
az oxigénfelvétel fontos a vizsgálat érvényességéhez. Ennek 
1,5 mg/liternél kevesebbnek kell lennie.  
VII. RÉSZ  MITI-VIZSGÁLAT  (C.4-F. Módszer)  
VII.1. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgált anyag tenyészközegben létrehozott, különlegesen tenyész ­
tett, nem adaptált mikroorganizmusokkal beoltott, folyamatosan 
kevert oldatában vagy szuszpenziójában az oxigénfelvételt 28 
napos időtartamon át egy elsötétített, zárt, automata, 25 ± 1  o C 
hőmérsékleten tartott respirométerben mérik. A fejl ődött szén- 
dioxidot nátronmésszel nyeletik el. A biológiai lebonthatóságot az 
elméleti oxigénfelvétel (ThOD) százalékos felvételeként (a vakpróba 
felvételének figyelembevételével) kell kifejezni. Az elméleti biológiai lebonthatóság mértékét is ki kell számítani az inkubációs periódus kezdetén és végén végrehajtott kiegészít ő specifikus kémiai elemzés ­
ből, és/vagy más lehet őségként, a DOC-elemzésb ől.
 
VII.2. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
VII.2.1.  Készülék  
a) Szokásos körülmények között 6 darab, egyenként 300 ml-es és a 
CO 2 abszorbens elhelyezésére szolgáló készüléket tartalmazó 
palackkal felszerelt respirométer vagy automata elektrolitikus 
BOD-mér ő; ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Klímakamra és/vagy vízfürd ő 25 o C ± 1  o C vagy ennél nagyobb 
pontosságú;  
c) Membránsz űrő készülék (választható);  
d) Szénanalizátor (választható).  
VII.2.2.  Ásványianyag-tápoldat el őkészítése  
A következ ő törzsoldatokat kell elkészíteni analitikai min őségű 
reagensek és víz használatával (I.6.1.): 
a) Kálium-dihidrogén-foszfát, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikálium-hidrogén-foszfát, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrát 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Ammónium-klorid, NH  4 Cl 1,70 g 
Ezen anyagokat vízben kell feloldani, és 1 literre 
kiegészíteni. 
Az oldat pH-értékének 7,2-nek kell lennie. 
b) Magnézium-szulfát-heptahidrát, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g 
Vízben kell feloldani, és 1 literre kiegészíteni. 
c) Kalcium-klorid, vízmentes, CaCl  2 27,50 g 
Vízben kell feloldani, és 1 literre kiegészíteni. 
d) Vas(III)klorid-hexahidrát, FeCl  3 ·6H 2 O 0,25 g 
Vízben kell feloldani, és 1 literre kiegészíteni.  
Az (a), (b), (c) és (d) oldatok közül mindegyikb ől 3 ml-t kell venni, 
és kiegészíteni 1 literre.  
VII.2.3.  Az inokulum el őkészítése  
Friss mintákat kell tíznél nem kevesebb helyr ől összegy űjteni, főleg 
olyan területekr ől, ahol különböz ő kémiai anyagokat használnak és 
bocsátanak ki. 1 liternyi szennyvíziszap, felszíni víz, talaj stb. 
mintákat kell begy űjteni olyan helyekr ől, mint például szennyvíztisz ­
tító, ipari szennyvízkezel ő telepek, folyók, tavak, tengerek, és ezeket 
alaposan össze kell keverni. A lebeg ő, úszó anyag eltávolítása után a 
mintát állni kell hagyni, majd a felülúszó folyadék pH-ját 7 ± l-re 
kell beállítani nátrium-hidroxid vagy foszforsav hozzáadásával.  
Megfelelő térfogatú, sz űrt felülúszó folyadékot eleveniszapot tartal ­
mazó tartályba kell beletölteni, majd ezt körülbelül 23 1/2 órán át kell leveg őztetni. A leveg őztetés leállítása után 30 perccel ki kell 
engedni a felülúszó folyadék teljes térfogatának körülbelül egyhar ­
madát, és ennek helyére ezzel egyenl ő térfogatú, glükózból, 
peptonból és kálium-foszfátból egyaránt 0,1 %-ot tartalmazó (7-es pH-jú) oldatot kell a leülepedett anyaghoz hozzáadni, ezután újra 
kell kezdeni a leveg őztetést. Minden nap egyszer ismételik meg ezt 
az eljárást. A szennyvíziszap-fermentort a jól bevált gyakorlatnak megfelelően kell m űködtetni: a kifolyó szennyvízb ől nyert folya ­
dékoknak tisztáknak kell lenniük, a h őmérsékletet 25 ± 2
 o C-on 
kell tartani, a pH-nak 7 ± l-nek kell lennie, a szennyvíziszapnak 
jól leülepedettnek kell lennie, elegend ő levegőztetést kell biztosí ­
tani, hogy a keverék állandóan aerob állapotban legyen, jelen kell lenniük protozoáknak, és legalább minden harmadik hónapban meg 
kell vizsgálni a szennyvíziszap aktivitását valamely referencia ­
anyaggal összevetve. Szennyvíziszap nem használható inokulum ­
ként, amíg legalább egy hónap el nem telt a m űködtetés kezdete 
óta, de nem használható fel négy hónapnál kés őbb sem. Ezután 
rendszeres id őközönként, minden három hónapban egyszer, 
legalább 10 helyr ől mintát kell venni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Össze kell keverni a használatban lév ő eleveniszap sz űrt, felülúszó 
folyadékát a frissen gy űjtött, tíz forrásból származó keverék ezzel 
egyenlő térfogatú, sz űrt, felülúszó folyadékával, és az egyesített 
folyadékot a fentieknek megfelel ően tovább kell tenyészteni azért, 
hogy ugyanolyan aktivitáson tartsák a friss és régi iszapot. Az 
egységbe történ ő betöltés után 18–24 órával ki kell venni az inoku ­
lumként használni kívánt iszapot.  
VII.2.4.  A lombikok el őkészítése  
Az alábbi hat lombikot kell el őkészíteni:  
1. számú: a vizsgált anyag hígítóvízben, 100 mg/liter koncentráci ­
óban  
2., 3. és 4. számú: a vizsgált anyag ásványianyag-tápoldatban, 
100 mg/liter koncentrációban  
5. számú: referenciaanyag (például anilin) ásványianyag-tápoldatban, 
100 mg/liter koncentrációban  
6. számú: csak ásványianyag-tápoldat.  
A rosszul oldódó vizsgált anyagokat közvetlenül kell bevinni tömeg 
vagy térfogat alapon, vagy azokat a 3. függelékben leírt módon kell kezelni, kivéve hogy sem oldószereket, sem pedig emulgeátorokat nem szabad használni. A CO
 2 -abszorbenst az erre a célra biztosított 
specifikus tartókban kell bevinni minden lombikba. A pH-t 7,0-ra 
kell beállítani a 2., 3. és 4. lombikban.  
VII.2.5.  A vizsgálat végrehajtása  
Be kell oltani a 2., 3. és 4. (vizsgált szuszpenzió), 5. (eljáráskontroll) 
és 6. (inokulum-vakpróba) lombikokat kis térfogatú oltóanyaggal úgy, hogy 30 mg/l szuszpendált szilárd anyagot kapjanak. Az 1. lombikhoz, amely abiotikus kontrollként szolgál, nem kell inoku ­
lumot adni. Össze kell állítani a berendezést, ellen őrizni kell a 
légmentes záródást, elindítani a kever őt, majd megkezdeni az oxigén ­
felvétel mérését sötétséget biztosítva. Naponta ellen őrizni kell a 
hőmérsékletet, a kever őt és a coulometriás oxigénfelvétel-mér őt, 
valamint fel kell jegyezni a lombikok tartalmának minden változását. Le kell olvasni közvetlenül a hat lombikhoz tartozó oxigénfelvételt valamilyen megfelel ő módszerrel, például a hatpontos szalagos, öníró 
műszer segítségével, amely létrehoz egy BOD-görbét. Az inkubációs 
periódus végén, általában a 28. napon, meg kell mérni a lombikok tartalmának pH-ját, és meg kell határozni a maradék vizsgált anyag és minden közbens ő anyag koncentrációját, a vízben oldható 
anyagok esetében a DOC-koncentrációt (2. függelék 4. pontja). 
Különleges gondossággal kell eljárni az illékony kémiai anyagok esetében. Ha nitrifikáció várható, meg kell határozni a nitrát- és a nitritkoncentrációt, ha lehetséges.
 
VII.3. ADATOK ÉS VIZSGÁLATI JELENTÉS  
VII.3.1.  Az eredmények kiértékelése  
Adott időt követően el kell osztani a vizsgált anyag által felvett 
oxigén tömegét (mg) (az ugyanennyi id ő után a vakpróbainoku ­
lum-kontroll által felvett oxigén figyelembevételével végrehajtott korrekció után) a felhasznált vizsgált anyag tömegével. Ezzel megkapják a mg oxigén/mg vizsgált anyag hányadosaként kifejezett 
BOD-t, azaz:
 
BOD ¼ a vizsgált anyag által felvett O  2 ½mgâ – a vakpróba által felvett O  2 ½mgâ 
vizsgált anyag lombikban  ½mgâ 
= mg O  2 /mg vizsgált anyag  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
A százalékos biológiai lebomlást a következ ő összefüggésb ől lehet 
kiszámítani:  
% biolúgiai lebomlás  ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg kémiai anyagÞ 
ThOD ðmg O  2=mg kémiai anyagÞ Ü 100 
Keverékek esetében elemanalízisb ől lehet kiszámítani a ThOD-t 
ugyanúgy, mint egyszer ű vegyületek esetén. A használandó ThOD- 
érték (ThOD  NH4 vagy ThOD  NO3 ) attól függ, hogy nincs jelen vagy 
teljes-e a nitrifikáció (2. függelék 2. pontja). Azonban, ha el őfordul 
nitrifikáció, de ez nem teljes, korrekciót kell végrehajtani annak az oxigénnek a figyelembevételével, amelyet a nitrit és a nitrát koncent ­
rációiban létrejöv ő változásokból kiszámított nitrifikáció fogyaszt el 
(5. függelék).
 
A százalékos els ődleges biológiai lebomlást a specifikus (kiindulási) 
anyag veszteségéb ől (lásd az I.7.2. pontot) lehet kiszámítani.  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Ha a vizsgált anyagra vonatkozóan veszteség fordult el ő fizikai- 
kémiai okokra visszavezethet ően az 1. lombikban, ezt fel kell jegy ­
ezni a jelentésbe, és a vizsgált anyagnak az e lombikban a 28. nap után meglév ő koncentrációját (S
 b ) kell használni a százalékos bioló ­
giai lebomlás kiszámításához.  
A DOC-meghatározások végrehajtásakor (választható) ki kell számí ­
tani a százalékos végs ő biológiai lebomlást a következ ő összefüg ­
gésből: 
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100 %  
úgy, ahogyan ezt az I.7.1. pont ismerteti. Ha DOC-csökkenés fordult 
elő az 1. lombikban, amely a fizikai-kémiai okokból bekövetkez ő 
csökkenést méri, akkor az e lombikban lév ő DOC-koncentrációt 
kell használni a százalékos biológiai bomlás kiszámítására.  
Minden eredményt fel kell jegyezni a mellékelt adatlapokra.  
VII.3.2.  Az eredmények érvényessége  
Az inokulum-vakpróba oxigénfelvétele általában 20–30 mg O  2 /1, és 
nem szabad 60 mg/l-nél nagyobbnak lennie 28 nap alatt. 60 mg/l-nél magasabb értékek esetében alaposan meg kell vizsgálni az adatokat és a kísérleti módszereket. Ha a pH-érték a 6–8,5-ös tartományon 
kívül van, és a vizsgált anyag oxigénfogyasztása kevesebb mint 
60 %, a vizsgálatot meg kell ismételni a vizsgált anyag kisebb koncentrációjával.
 
Lásd még az I.5.2. pontot is.  
Ha az anilinnek az oxigénfogyasztásból kiszámított százalékos 
lebomlása nem lépi túl a 40 %-ot 7 nap után és a 65 %-ot 14 nap 
után, a vizsgálatot érvénytelennek kell tekinteni.  
VII.3.3.  Vizsgálati jelentés  
Lásd az I.8. pontot.  
VII.4. ADATLAP  
Példa az adatlapra.  
MITI (I) VIZSGÁLAT  
1. LABORATÓRIUM  
2. A VIZSGÁLAT KEZDETÉNEK DÁTUMA  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. VIZSGÁLT ANYAG  
Név:  
Törzsoldat-koncentráció: … mg/l, az anyagra vonatkoztatva  
Kezdeti koncentráció a médiumban: … mg/l az anyagra vonat ­
koztatva  
Reakciókeverék térfogata, V: … ml  
ThOD: … mg O  2 /1 
4. INOKULUM  
Iszapminta-vételi helyek: 
1. … 6. … 
2. … 7. … 
3. … 8. … 
4. … 9. … 5. … 10. …
 
Szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja az eleveniszapban 
mesterséges szennyvízzel végrehajtott akklimatizáció után = … 
mg/l 
Eleveniszap térfogata 1 liter végs ő közegben = … ml  
Szennyvíziszap koncentrációja a végs ő közegben = … mg/l  
5. OXIGÉNFELVÉTEL: BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG  
A vizsgálathoz használt respirométer típusa:  
Idő (nap) 
0 7 14 21 28  
O 2 -felvétel (mg), 
vizsgált anyag a 1 
a 2 
a 3 
O 2 -felvétel (mg), 
vakpróba b 
Korrigált O  2 - 
felvétel (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
BOD mg vizsgált 
anyagonként ða Ä bÞ 
C o V 1. lombik 
2. lombik 3. lombik 
% lebomlás
 
BOD 
ThOD Ü 100  1 
2 3 
Átlag (*)
 
(*) Nem átlagolható, ha jelent ős eltérés van az ismételt méréssel kapott értékek között.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Megjegyzés: Hasonló formátumok használhatók a referenciavegyü ­
lethez.  
6. SZÉNANALÍZIS  (választható)  
Szénanalizátor:  
Lombik DOC 
% DOC-csökkenés Átlag 
Mért Korrigált  
Viz + vizsgált anyag a — — 
Iszap + vizsgált anyag b  l b l – c 
Iszap + vizsgált anyag b  2 b 2 – c 
Iszap + vizsgált anyag b  3 b 3 – c 
Kontrollvakpróba c — — —  
% DOC − csökkenés  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. SPECIFIKUS KÉMIAI ELEMZÉSB ŐL SZÁRMAZÓ 
ADATOK  
Vizsgált anyag maradékmennyisége a 
vizsgálat végén % lebomlás  
Vakpróba vizsgálat vízzel s  b 
Beoltott közeg S a1 
S a2 
S a3 
% lebomlás ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Ki kell számítani a % lebomlást az a  l -es, a  2 -es, illetve a  3 -as 
lombikhoz.  
8. MEGJEGYZÉSEK  
Mellékelni kell az id ő függvényében felrajzolt BOD-görbét, ha 
az rendelkezésre áll.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
1. függelék  
RÖVIDÍTÉSEK ÉS FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
DO: Oldott oxigén: (mg/l) az oldott oxigén koncentrációja valamely vizes 
mintában.  
BOD: Biokémiai oxigénigény: valamely vizsgált vegyület metabolizálásakor a 
mikroorganizmusok által felhasznált oxigén mennyisége; g oxigénfelvétel/g vizsgált vegyületként kifejezve is használják, (lásd a C.5. módszert).
 
COD: Kémiai oxigénigény (g): valamely vizsgált vegyületnek forró, savas, 
dikromáttal végrehajtott oxidálása során felvett oxigén mennyisége; megadja a jelen lév ő oxidálható anyag mennyiségének mértékét; 
oxigénfelvétel (g)/vizsgált vegyület (g) formában is használják. (lásd a 
C.6. módszert).
 
DOC: Oldott szerves szén: az oldatban jelen lév ő szerves szén, amely átsz űr­
hető 0,45 mikrométeres sz űrőn, vagy 15 percig tartó 40 000 m.s  –2 
(± 4 000 g) intenzitású centrifugálást követ ően a felülúszóban marad.  
ThOD: Elméleti oxigénigény (mg): valamely vegyi anyag teljes oxidálásához 
szükséges teljes oxigénmennyiség; a molekuláris képletb ől számítják ki 
(lásd a 2. függelék 2. pontját), és oxigénigény (mg)/vizsgált vegyület 
(mg) formában is használják.  
ThCO  2 : Elméleti szén-dioxid-felszabadulás (mg): az a számított szén-dioxid- 
mennyiség, amelynek létre kell jönnie a vizsgált vegyület ismert vagy 
mért széntartalmából, a teljes ásványosodás során; fejl ődött szén-dioxid 
(mg)/vizsgált vegyület (mg) formában is használják.  
TOC: Összes szerves szén: az oldatban és szuszpenzióban lév ő szerves szén 
összege egy mintában.  
IC: Szervetlen szén.  
TC: Összes szén: a mintában jelen lév ő szerves és szervetlen szén összege.  
Elsődleges biológiai lebonthatóság:  
valamely anyag kémiai szerkezetében biológiai folyamattal okozott változás, 
amely ezen anyag speciális tulajdonságának elvesztését eredményezi.  
Teljes biológiai lebonthatóság (aerob):  
az a lebomlási szint, amikor a vizsgált vegyületet teljesen felhasználják a mikro ­
organizmusok szén-dioxid, víz, ásványi sók és új mikrobás, sejtalkotórészek (biomassza) létrejöttét eredményezve.
 
Biológiailag könnyen lebontható:  
olyan vegyi anyagok tetsz őleges kategorizálása, amelyek megfeleltek bizonyos, a 
teljes biológiai lebonthatóság meghatározott sz űrési vizsgálatok követelményei ­
nek; e vizsgálatok olyan szigorúak, hogy feltételezhet ő, hogy az ilyen vegyületek 
vizes környezetekben aerob körülmények között biológiailag gyorsan és teljesen 
lebomlanak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Biológiailag potenciálisan lebontható:  
azoknak a vegyi anyagoknak a kategorizálása, amelyek esetében valamilyen 
elfogadott biológiai lebonthatóság vizsgálata során egyértelm űen bizonyított a 
biológiai lebonthatóság (els ődleges vagy teljes).  
Kezelhetőség: 
biológiai szennyvízkezelés során vegyületek eltávolítás szempontjából történ ő 
kezelhetősége, anélkül, hogy káros hatással lennének a kezelési folyamat normál 
működésére. Általában a biológiailag gyorsan lebontható vegyületek kezelhet ők, 
de nem minden biológiailag potenciálisan lebontható vegyület kezelhet ő. Abio­
tikus folyamatok is végbemehetnek.  
Fáziskésés  
valamely lebonthatósági vizsgálatban a beoltástól kezd ődő és addig terjed ő 
időtartam, amíg a lebomlási százalék legalább 10 %-ra növekedett. A fáziskésés 
gyakran nagyon változékony, és gyengén reprodukálható.  
Lebomlási id ő 
a fáziskésés végét ől kezdődő és addig tartó id őtartam, amikor a lebomlás elérte a 
legnagyobb szintjének 90 %-át.  
Tíznapos ablak  
a 10 %-os lebomlás elérését közvetlenül követ ő 10 nap.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
2. függelék  
MEGFELEL Ő ÖSSZEFOGLALÓ PARAMÉTEREK KISZÁMÍTÁSA ÉS 
MEGHATÁROZÁSA  
A választott módszert ől függően, szükség lesz bizonyos összefoglaló paraméte ­
rekre. A következ ő szakasz ezen értékek levezetését írja le. E paraméterek hasz ­
nálatát az egyes módszerek ismertetik.  
1. Széntartalom  
A széntartalom az ismert elemi összetételb ől számítható ki, vagy a vizsgált 
anyag elemi analízise határozza meg.  
2. Elméleti oxigénigény (ThOD)  
Az elméleti oxigénigény (ThOD) kiszámítható, ha ismert vagy elemi analí ­
zissel meghatározásra került az elemi összetétel. A következ ő vegyület 
esetében:  
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
nitrifikáció nélkül,  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
vagy nitrifikációval,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Kémiai oxigénigény (COD)  
A kémiai oxigénigényt (COD) a C.6. módszernek megfelel ően kell 
meghatározni.  
4. Oldott szerves szén (DOC)  
Az oldott szerves szén (DOC): bármely vegyi anyagnak vagy vizes keve ­
réknek egy 0,45 mikrométeres sz űrőn átszűrhető szerves szén része.  
A vizsgálati tartályokból mintákat vesznek, és a mintákat azonnal átsz űrik 
megfelelő membránsz űrő segítségével. A sz űrlet első 20 ml-jét (a 
mennyiség csökkenthet ő kisméret ű szűrők használatakor) elvetik. Befecs ­
kendezés esetén 10–20 ml-t vagy ennél kevesebbet (a térfogat a szénana ­
lizátorhoz szükséges mennyiségt ől függ) meg őriznek a szén elemzéséhez. A 
DOC-koncentrációt olyan szervesszén-analizátor segítségével határozzák meg, amely a vizsgálatban használt kezdeti DOC-koncentráció 10 %-ával egyenérték ű, vagy annál kisebb szénkoncentráció pontos mérésére képes.
 
Azok a sz űrt minták, amelyek nem elemezhet ők ugyanazon a munkanapon, 
hűtőszekrényben, 2–4  o C-os hőmérsékleten 48 óráig vagy –18  o C-os 
hőmérséklet alatt ennél hosszabb ideig tárolhatók.  
Megjegyzések:  
A membránsz űrőket gyakran impregnálják felületaktív anyagokkal a hidro ­
filizáció biztosítására. Így tehát a sz űrő akár több mg olyan oldható szerves 
szenet is tartalmazhat, amely befolyásolhatja a biológiai lebonthatósági 
vizsgálat eredményeit. A felületaktív anyagok és más, oldható szerves 
vegyületek eltávolíthatók a sz űrőkről három, egyenként egyórás id őtar­
tamon keresztül deionizált vízben történ ő forralással. A sz űrők ezután 
egy héten át vízben tárolhatók. Eldobható sz űrőbetétek használatakor 
minden egyes adagot ellen őrizni kell, meg kell gy őződni arról, hogy nem 
szabadít-e fel oldható szerves szenet.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
A membránsz űrő típusától függ ően adszorpció útján visszamaradhat a vizs ­
gált vegyi anyag. Ezért ajánlott ezt megel őzni. 
Szűrés helyett 15 percen át 40 000 m.sec  –2 (4 000 g) melletti centrifugálás 
alkalmazható a TOC és DOC megkülönböztetésére. Ez a módszer nem megbízható 10 mg DOC/1 alatti kezdeti koncentrációnál, mivel vagy nem távozik el minden baktérium, vagy újraoldódik a szén a baktériumplazma 
részeként.
 
SZAKIRODALOM  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
edition, Am. Pub. H1th. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, 65.  
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser-und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrö βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), NormenausschuB Wasserwesen (NAW) in DIN 
Deutsches Institut für Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compo ­
unds. Chemosphere, 1984, vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
3. függelék  
ROSSZUL OLDHATÓ ANYAGOK BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁ ­
GÁNAK FELMÉRÉSE  
A rosszul oldható anyagokkal végrehajtott biológiai lebonthatósági vizsgála ­
tokban a következ ő szempontoknak kell különleges figyelmet szentelni.  
Míg a homogén folyadékok ritkán járnak mintavételi problémákkal, ajánlatos a 
szilárd anyagokat megfelel ő eszközökkel homogenizálni a homogenitás hiánya 
miatti hibák elkerülésére. Különleges gondossággal kell eljárni, amikor vegyi anyagok keverékeib ől vagy nagymennyiség ű szennyez ődéseket tartalmazó anya ­
gokból néhány mg-nyi reprezentatív minta szükséges.
 
A vizsgálatok során különböz ő formájú keverés használható. Gondosan kell 
eljárni, csak olyan mérték ű keverést szabad alkalmazni, amely éppen elegend ő 
a vegyi anyag diszpergált állapotban tartásához, és amelynél nem lép fel túlmele ­
gedés, túlzott habzás vagy a baktériumok mechanikai károsodása.  
A vegyi anyag stabil diszperzióját létrehozó emulgeálószer használható. Ez nem 
lehet toxikus a baktériumra, és a vizsgálati körülmények között nem szabad 
biológiailag lebomlania vagy habzást okoznia.  
Az oldószerekre ugyanaz a követelmény érvényes, mint az emulgeálószerekre.  
Nem ajánlott szilárd hordozóanyagok használata szilárd vizsgált anyagokhoz, 
ezek olajos anyagokhoz lehetnek alkalmasak.  
Segédanyagok, ilyenek például az emulgeálószerek, oldószerek és hordozó ­
anyagok használatakor segédanyag-vakpróbát kell végrehajtani.  
A három respirometriás vizsgálat – CO  2 , BOD, MITI – közül bármelyik hasz ­
nálható a rosszul oldható vegyületek biológiai lebonthatóságának vizsgálatára.  
SZAKIRODALOM  
— de Morsier, A. et. al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
4. függelék  
AZ OLTÓANYAGRA FELTEHET ŐEN TOXIKUS VEGYI ANYAGOK 
BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁGÁNAK FELMÉRÉSE  
Amennyiben valamely vegyi anyagot könny ű biológiai lebonthatóság vizsgála ­
tának vetik alá, és úgy t űnik, hogy biológiailag nem lebontható, a következ ő 
eljárás ajánlatos, amennyiben különbséget kell tenni a gátlás és a közömbösség 
között. (Reynolds és munkatársai, 1987)  
Hasonló vagy azonos oltóanyagot kell használni a toxicitás- és a biológiai lebont ­
hatósági vizsgálatokhoz.  
A könnyű biológiai lebonthatóság megállapítására irányuló vizsgálatokban vizs ­
gált vegyi anyagok toxicitásának értékeléséhez az iszaplégzésintenzitás-gátlási 
(aktivált szennyvíziszap légzésgátlási vizsgálata – 88/302/EGK irányelv), BOD- 
és/vagy növekedésgátló módszerek vagy ezek kombinációjának alkalmazása tűnik megfelel őnek.
 
Amennyiben el kell kerülni a toxicitásra visszavezethet ő gátlást, ajánlott a bioló ­
giailag gyors lebonthatóság megállapítására végrehajtott vizsgálatot a toxicitás ­
vizsgálatban kapott EC  50 -es értékek 1/10-ét (vagy az EC  20 -értékeknél kisebbet) el 
nem érő vizsgálatianyag-koncentrációt alkalmazni. 300 mg/l-nél nagyobb EC  50 -es 
értékű vegyületek nem valószín ű, hogy toxikus hatással rendelkeznek a biológia ­
ilag gyors lebonthatóság vizsgálatában.  
A 20 mg/l-nél kisebb EC  50 -értékek valószín űleg súlyos problémákat jelentenek a 
későbbi vizsgálat esetében. Alacsony vizsgálati koncentrációkat kell alkalmazni, 
amely szükségessé teszi a szigorú és érzékeny zártpalack-vizsgálat használatát vagy a
 14 C – címkézés ű anyag használatát. Más megoldásként, valamely 
akklimatizált oltóanyag a vizsgált anyag magasabb koncentrációjának használatát 
teheti lehet ővé. Az utóbbi esetben azonban elvész a biológiailag könny ű lebont­
hatóság vizsgálatának különös követelménye.  
SZAKIRODALOM  
Reynolds, L. et. al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
5. függelék  
A NITRIFIKÁCIÓ OKOZTA OXIGÉNFELVÉTEL FIGYELEMBEVÉ ­
TELE  
Nitrogént nem tartalmazó vizsgált anyagok biológiai lebonthatóságának oxigén ­
felvétellel történ ő értékelésében a nitrifikáció figyelmen kívül hagyása miatti 
hibák kismérték űek (5 %-nál nem nagyobbak) még akkor is, ha az oldószerben 
lévő ammónium-N oxidációja ingadozik a vizsgálati anyagot tartalmazó és a 
vakpróbatartályok között. Nitrogéntartalmú vizsgált anyagok esetében azonban súlyos hibák jelentkezhetnek.
 
Amennyiben a nitrifikáció bekövetkezett, de ez nem teljes, a reakciós keverék 
mért oxigénfelvétele helyesbíthet ő az ammónium nitritté és nitráttá oxidálásában 
felhasznált oxigén mennyiségével, ha a nitrit és a nitrát inkubálása során a koncentrációváltozásokat a következ ő egyenletek segítségével határozzák meg: 
2 NH
 4 Cl + 3O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Teljes: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Az (1) egyenletb ől az ammónium-kloridban (NH  4 C1) lévő 28 g nitrogén oxigén ­
felvétele a nitritté oxidálódás során 96 g, azaz a szorzótényez ő 3,43 (96/28). 
Hasonlóképpen a (3) egyenletb ől látható, hogy a 28 g nitrogén oxigénfelvétele, 
miközben nitráttá oxidálódik, 128 g, vagyis a szorzótényez ő 4,57 (128/28).  
Mivel a reakciók szekvenciálisak, amelyeket meghatározott és egymástól külön ­
böző baktériumfajták hajtanak végre, lehet őség van a nitrit koncentrációjának 
növelésére vagy csökkentésére; az utóbbi esetben létrehozható a nitrát egyen ­
értékű koncentrációja. Így a nitrátképz ődés során felhasznált oxigén értéke 
4,57, szorozva a nitrát koncentrációjának növekedésével, míg a nitrit képz ődé­
sével kapcsolatos oxigén értéke 3,43, szorozva a nitrit koncentrációjának növe ­
kedésével, vagy a koncentrációja csökkenése esetén az oxigénveszteség - 3,43 szorozva a koncentráció csökkenéssel.
 
Azaz: 
A nitrátképz ődés során felhasznált O  2 = 4,57 * a nitrátkoncent ­
ráció növekedése (4) 
és 
Nitritképz ődés során felhasznált O  2 = 3,43 * a nitritkoncentráció 
növekedése (5) 
és 
Nitritkoncentráció csökkenésekor az elvesztett O  2 = - 3,43 * a 
nitritkoncentráció csökkenése (6) 
úgy. hogy 
Nitrifikációból adódó O  2 -felvétel = ± 3,43 * nitritkoncentráció- 
változás + 4,57 * a nitrát-koncentráció növekedése (7) 
és így 
C-oxidációból adódó O  2 -felvétel = teljes megfigyelt felvétel – 
nitrifikációból adódó felvétel (8) 
Amennyiben csak a teljes oxidált nitrogént határozzák meg, a nitrifikáció miatti 
oxigénfelvétel els ő megközelítésben 4,57 x oxidált N-növekedés.  
A C-oxidáció következtében létrejöv ő oxigénfelvétel helyesbített értékét ezután 
összehasonlítják a ThOD NH  3 -mal a 2. függelékben bemutatott számításnak 
megfelelően. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. LEBOMLÁS – BIOKÉMIAI OXIGÉNIGÉNY  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E módszer célja a szilárd vagy folyékony szerves anyagok biokémiai 
oxigénigényének (BOD) meghatározása.  
A módszerrel kapott adatok vízben oldható vegyületekre vonatkoz ­
nak; azonban elvben illékony vegyületek és vízben kis mértékben 
oldható vegyületek is vizsgálhatók.  
A módszer csak az olyan szerves anyagokhoz alkalmazható, amelyek 
a vizsgálatban használt koncentráció mellett nincsenek gátló hatással a baktériumokra. Amennyiben a vizsgált anyag a vizsgálati koncent ­
ráció mellett nem oldható, különleges intézkedéseket kell alkalmazni 
a vizsgált anyag megfelel ő mértékű diszpergálása céljából, például az 
ultrahangos diszpergálás használatával.
 
A vizsgált anyag toxicitására vonatkozó információk hasznosaknak 
bizonyulhatnak az alacsony vizsgálati eredmények értelmezése és a megfelelő vizsgálati koncentráció kiválasztásában.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A BOD: az adott anyagot tartalmazó oldat meghatározott mennyi ­
ségének meghatározott körülmények között biokémiai oxidációjához szükséges oldott oxigén tömege.
 
Az eredményeket BOD gramm/vizsgált anyag gramm formájában 
fejezik ki.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Célszerű megfelel ő referenciaanyag használata az oltóanyag aktivitá ­
sának ellen őrzése érdekében.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Alkalmas oldószerben feloldott vagy diszpergált, el őre meghatározott 
anyagmennyiséget mikroorganizmusokkal beoltanak, és sötét helyen, állandó, meghatározott környezeti h őmérsékleten inkubálnak.
 
A BOD-t az oldott oxigéntartalomnak a vizsgálat elején és végén 
mért különbségével határozzák meg. A vizsgálat id őtartamának 
legalább 5 napnak és legfeljebb 28 napnak kell lennie.  
E vizsgálattal párhuzamosan vizsgált anyagot nem tartalmazó 
vakpróbát kell elvégezni.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A BOD-meghatározás nem tekinthet ő valamely anyag biológiai 
lebonthatósága érvényes meghatározásának. E vizsgálat csak scree ­
ning-vizsgálatnak tekinthet ő. 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Elkészítik az anyag oldatát vagy diszperzióját az alkalmazott 
módszerhez megfelel ő BOD-koncentráció megállapítása érdekében. 
Ezután megfelel ő nemzeti vagy nemzetközi szabvány alkalmazásával 
meghatározzák a BOD-t.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. ADATOK ES ÉRTÉKELÉS  
A kiválasztott standardizált módszernek megfelel ően kiszámítják az 
induló oldat BOD-értékét, majd átszámítják ezt BOD (gramm)/ ­
vizsgált anyagra (gramm).  
3. JELENTÉS  
Meg kell adni az alkalmazott módszert.  
A biokémiai oxigénigényt legalább három érvényes mérés átlagaként 
kell meghatározni.  
Minden, az eredmények értelmezése szempontjából lényeges infor ­
mációt és megjegyzést meg kell adni, különös tekintettel az anyag szennyeződéseire, fizikai állapotára, toxikus hatásaira és jellemz ő 
összetételére, amely befolyásolhatja az eredményt.
 
A vizsgálati jelentésben fel kell tüntetni, ha a biológiai nitrifikáció 
gátlása céljából segédanyagot használnak.  
4. SZAKIRODALOM  
Szabványok jegyzéke, például:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, London.
 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. LEBOMLÁS – KÉMIAI OXIGÉNIGÉNY  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E módszer célja szilárd vagy folyékony szerves anyagok kémiai 
oxigénigényének (COD) mérése tetsz őleges, standardizált módon 
megállapított laboratóriumi körülmények mellett.  
Az anyag képletére vonatkozó információk hasznosak e vizsgálat 
végrehajtásához és a kapott eredmények értelmezéséhez (például 
klórozott szerves vegyületek, szerves vegyületek vassói, halogénsók).  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A kémiai oxigénigény valamely anyag oxidálhatóságának a mértéke, 
meghatározott laboratóriumi körülmények között az anyag által felhasznált valamilyen oxidáló reagenssel egyenérték ű oxigénmeny ­
nyiségben kifejezve.
 
Az eredményt COD (gramm)/vizsgált anyag (gramm) formában 
fejezik ki.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nem kell minden új anyag vizsgálatakor referenciaanyagokat alkal ­
mazni. Ezeknek els ősorban a módszer megfelel őségének id őnkénti 
ellenőrzésére és arra kell szolgálniuk, hogy lehet ővé tegyék az össze ­
hasonlítást más módszerekkel kapott eredményekkel.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Vízben feloldott vagy diszpergált, el őre meghatározott anyagmeny ­
nyiséget oxidálnak er ős kénsavoldatban lév ő kálium-dikromáttal, 
ezüst-szulfátot használva katalizátorként, két órán át reflux mellett. Szabványosított, vas-ammónium-szulfáttal végrehajtott titrálással meghatározzák a maradék dikromátot.
 
Klórtartalmú anyagok esetében hozzáadnak higany-szulfátot (  1 ), a 
klorid okozta zavaró hatás csökkentésére.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A meghatározás tetsz őleges módja miatt a COD-t „oxidálhatósági 
mérőszámnak” kell tekinteni, és mint ilyet, gyakorlati módszerként 
használják szerves anyag mérésére.  
A klorid zavarhatja e vizsgálatot; továbbá a szervetlen redukáló- 
vagy oxidálószerek is befolyásolhatják a COD-meghatározást.  
Néhány gy űrűs vegyületet és sok illékony anyagot (például alacsony 
szénatomszámú zsírsavak) nem teljesen oxidál ez a vizsgálat.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Elkészítik az anyag oldatát vagy diszperzióját 250 és 600 mg/l 
közötti COD létrehozására.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) A higanysókat tartalmazó oldatokat használat után megfelel ő módon kell kezelni, hogy a 
higany ne kerüljön ki a környezetbe.
 Megjegyzések:  
Rosszul oldódó és nem diszpergálható anyagok esetében kimérhet ő 
körülbelül 5 mg COD-nek megfelel ő, finomra porított anyag vagy 
folyékony anyag, és vízzel együtt a kísérleti berendezésbe helyez ­
hető. 
Gyakran és különösen a rosszul oldódó anyagok esetében a kémiai 
oxigénigény (COD) el őnyösen meghatározható a módszer egyik 
változatával, azaz egy nyomáskiegyenlít ővel ellátott zárt rendszerben 
(H. Kelkenberg, 1975). E módosított változattal gyakran mennyisé ­
gileg sikeresen határozhatók meg azok a vegyületek, amelyek a hagyományos módszerrel csak nehezen határozhatók meg – ilyen 
például az ecetsav. Azonban ez a módszer sem alkalmas piridin 
esetében. Amennyiben az (1) szakirodalomban el őírt módon a 
kálium-dikromát koncentrációt 0,25 N-re (0,0416 M) növelik, ez megkönnyíti az anyag 5–10 mg-os mennyiségének közvetlen bemé ­
rését, amely lényeges a vízben rosszul oldódó anyagok COD-érté ­
kének meghatározásához ((2) szakirodalom)).
 
A COD-t ezután valamilyen alkalmas nemzeti vagy nemzetközi szab ­
ványt követve kell meghatározni.  
2. ADATOK ÉS ÉRTÉKELÉS  
A kísérleti lombikban lév ő COD-t a kiválasztott standardizált 
módszer segítségével kell kiszámítani és átszámítani COD (gramm)/ ­
vizsgált anyag (gramm) formába.  
3. JELENTÉS  
Meg kell adni a használt referencia-módszert.  
A kémiai oxigénigényt legalább három mért érték középértékeként 
kell megadni. Minden, az eredmények értelmezése szempontjából lényeges információt és megjegyzést meg kell adni, különösen az 
anyag szennyez ődéseivel, fizikai állapotával és jellemz ő tulajdonsá ­
gaival kapcsolatosakat (amennyiben ismertek), amelyek hatással lehetnek az eredményekre.
 
Amennyiben a klorid befolyásoló hatásának minimalizálása céljából 
higany-szulfátot használnak, ezt is meg kell adni a vizsgálati jelen ­
tésben.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
A szabványok jegyzéke, például:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. LEBOMLÁS – ABIOTIKUS LEBOMLÁS: HIDROLÍZIS A PH 
FÜGGVÉNYÉBEN  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD TG 111 (2004) vizs ­
gálattal.  
1.1. BEVEZETÉS  
Vegyszerek többféle úton juthatnak a felszíni vizekbe: közvetlen 
bejuttatással, permetezett anyag elsodródásával, beömléssel, a csapa ­
dékvíz-elvezet ő rendszerb ől, hulladéklerakással, ipari, háztartási vagy 
mezőgazdasági szennyvizekkel, légköri lerakódás útján; a felszíni 
vizekbe jutó vegyszerek a vízben kémiai (pl. hidrolízis, oxidáció), fotokémiai és/vagy mikrobiális folyamatokkal átalakulhatnak. Ez az 
útmutató az (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) útmutatások alapján olyan 
laboratóriumi vizsgálati módszert mutat be, amely a környezetben rendszerint el őforduló pH-értékek (4–9) mellett a vegyszerek vizes 
közegben lejátszódó abiotikus hidrolízises átalakulásának vizsgála ­
tára alkalmas.
 
A vizsgálat célja i. a pH-érték függvényében a vizsgált anyag 
hidrolízissebességének meghatározása; ii. azon hidrolízistermékek 
mibenlétének, illet őleg képz ődési és csökkenési sebességének 
meghatározása, amelyekkel él ő szervezetek találkozhatnak. Ezekre 
a vizsgálatokra olyan vegyi anyagok esetében lehet szükség, amelyek közvetlenül a vízbe jutnak, illet őleg az említett más módokon a 
környezetbe kerülhetnek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A 2. függelék szerint.  
1.3. A MÓDSZER ALKALMAZHATÓSÁGA  
A módszer általában olyan (jelzés nélküli vagy jelölt) vegyi anya ­
gokra alkalmazható, amelyek kimutatására megfelel ő pontosságú és 
érzékenység ű analitikai módszer áll rendelkezésre. Enyhén illékony 
és nem illékony, vízben megfelel ően oldható vegyületekre egyaránt 
alkalmazható. A módszert nem szabad olyan vegyi anyagokra alkal ­
mazni, amelyek vízben fokozottan illékonyak (pl. gáznem ű növény­
védő szerek, szerves oldószerek), ezért a vizsgálat során érvényesül ő 
kísérleti körülmények között nem tarthatók oldatban. A vizsgálat nehezen végezhet ő vízben csekély mértékben oldódó anyagokkal (8).
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Különböz ő pH-érték ű (4, 7 és 9) steril vizes pufferoldatokat a vizs ­
gálandó anyaggal kezelünk, majd sötétben, ellen őrzött laboratóriumi 
körülmények között (állandó h őmérsékleten) inkubáljuk őket. A 
pufferoldatokban lév ő vizsgált anyagot és a hidrolízistermékeket 
megfelelő időközönként elemezzük. A tömegmérleg könnyebben 
meghatározható, ha a vizsgált anyag jelölt (pl.  14 C-vel).  
A vizsgálati módszer többfokozatú, m űködését az 1. függelék 
mutatja be és magyarázza el. Az egyes fokozatok szükségességét a 
megelőző fokozat eredményei határozzák meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMÁCIÓK A VIZSGÁLT ANYAGRÓL  
A hidrolízis sebességének mérése jelzés nélküli vagy jelölt anyagon 
végezhető el. A jelölt anyag általában a hidrolízis folyamatának 
tanulmányozása és a tömegmérleg megállapítása szempontjából 
előnyös, ugyanakkor speciális esetekben a jelölés nem feltétlenül 
szükséges. A jelölést  14 C-vel célszer ű végezni, de más izotóp, 
például  13 C, 15 N vagy  3 H is alkalmazható. Amennyire csak lehet, 
a jelölést a molekula legstabilabb részében vagy részeiben kell 
elhelyezni. Ha például a vizsgált anyag egygy űrűs, akkor a jelölést 
ebben a gy űrűben kell elhelyezni; ha a vizsgált anyag két vagy több 
gyűrűt tartalmaz, akkor célszer ű lehet külön vizsgálatok révén tanul ­
mányozni az egyes jelölt gy űrűk sorsát, hogy megfelel ő informáci ­
ókat nyerjünk a hidrolízistermékek képz ődéséről. A vizsgálandó 
anyag tisztasága legyen legalább 95 %.  
A hidrolízisvizsgálat elvégzéséhez ismerni kell a vizsgált anyag:  
a) vízben való oldhatóságát (A.6. vizsgálati módszer);  
b) szerves oldószerekben való oldhatóságát;  
c) gőznyomását (A.4. vizsgálati módszer) és/vagy Henry-állandóját;  
d) n-oktanol/víz megoszlási együtthatóját (A.8. vizsgálati módszer);  
e) disszociációállandóját (pK  a ) (OECD 112. útmutató) (9);  
f) közvetlen és közvetett fototranszformációjának sebességét vízben 
(szükség esetén).  
Rendelkezésre kell állniuk a vizsgált anyag mennyiségi meghatározá ­
sára, valamint szükség szerint a vizes oldatokban keletkez ő hidrolí­
zistermékek mibenlétének és mennyiségének meghatározására 
alkalmas analitikai módszereknek (lásd még az 1.7.2. szakaszt).  
1.6. REFERENCIAANYAGOK  
A hidrolízistermékek mibenlétének és mennyiségének spektroszko ­
pikus és kromatográfiás vagy egyéb, kell ő érzékenység ű módsze­
rekkel történ ő meghatározásához lehet őség szerint referenciaanya ­
gokat kell használni.  
1.7. MIN ŐSÉGI KRITÉRIUMOK  
1.7.1.  Visszanyerés  
A vizsgált anyag hozzáadását követ ően azon nyomban, legalább két 
párhuzamos pufferoldaton vagy kivonaton végzett elemzés kiindulási információval szolgál az analitikai módszer megismételhet őségéről és 
a vizsgált anyag bevitelére alkalmazott eljárás egységességér ől. A 
vizsgálat kés őbbi fázisaiban a visszanyerést a tömegmérlegek adják 
meg (jelölt anyag használata esetén). Jelölt és nem jelölt anyagok esetén a visszanyerésértékeknek 90 % és 110 % között kell lenniük 
(7). Ha m űszakilag nehéz ezt a tartományt elérni, akkor nem jelölt 
anyag esetén kell ő indoklással 70 %-os visszanyerés is elfogadható.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Az analitikai módszer megismételhet ősége és érzékenysége  
A vizsgált anyag és a hidrolízistermékek mennyiségi meghatározá ­
sára alkalmazott analitikai módszer(ek) megismételhet ősége utólag 
úgy ellen őrizhető, hogy akkor, amikor már a mennyiségek meghatá ­
rozásához elegend ő hidrolízistermék keletkezett, ugyanazt a puffe ­
roldatot (vagy kivonatát) ismételt elemzésnek vetjük alá.  
Az analitikai módszer érzékenységének olyannak kell lennie, hogy a 
vizsgált anyag mennyiségének meghatározását akkor is biztosítsa, 
amikor annak koncentrációja a kezdeti koncentráció 10 %-ára vagy még kisebb értékre lecsökkent. Az adott esetnek megfelel ően az 
analitikai módszereknek olyan érzékenység űnek kell lenniük, hogy 
(a vizsgálat során bármikor) a csúcskoncentráció 25 %-áig vagy egy 
annál kisebb értékig lehet ővé tegyék az alkalmazott dózis legalább 
10 %-át kitev ő hidrolízistermékek mennyiségének meghatározását.
 
1.7.3.  A hidrolízis kinetikai adatainak konfidenciaintervalluma  
Minden regressziós együttható, reakciósebességi állandó, felezési id ő 
és bármilyen más kinetikai paraméter (pl. DT  50 ) esetében ki kell 
számítani és be kell mutatni a konfidenciaintervallumokat.  
1.8. A VIZSGÁLT MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.8.1.  Készülékek és m űszerek  
A vizsgálatokat szükség szerint üvegedényekben (pl. kémcsövekben, 
kis palackokban) kell elvégezni sötét és steril körülmények között, 
kivéve akkor, ha korábbról olyan információk állnak rendelkezésre 
(például az n-oktanol/víz megoszlási együttható alapján), hogy a vizsgált anyag az üveghez tapadhat. Ilyenkor célszer ű lehet megfon ­
tolni más anyag (például teflon) alkalmazását. Az üveghez tapadás 
problémája a következ ő módszerek valamelyikével vagy egyszerre 
többel is csökkenthet ő lehet:
 
— a vizsgálati edényhez szorbeálódott hidrolízistermékek és a vizs ­
gált anyag tömegének meghatározásával,  
— ultrahangos fürd ő alkalmazásával,  
— az egyes mintavételek id őpontjában az üvegedények oldószerrel 
történő elmosásával,  
— formulázott termékek használatával,  
— több társoldószer alkalmazásával a vizsgált anyag rendszerhez 
adagolásakor (az alkalmazott társoldószer nem hidrolizálhatja a vizsgált anyagot).
 
A különböz ő vizsgálati oldatok inkubálásához rendszerint szabályo ­
zott hőmérséklet ű vízfürdőrázóra vagy termosztatikusan szabályozott 
inkubátorra van szükség.  
Standard laboratóriumi felszerelés szükséges, beleértve különösen a 
következőket: 
— pH-mér ő, ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analitikai eszközök, mint például GC-, HPLC-, TLC-berendezés, 
beleértve a radioaktív és nem jelölt anyagok elemzésére alkal ­
mas, illetve az inverz izotópos hígításos módszerben szükséges kimutatási rendszereket,
 
— az anyagok mibenlétének meghatározására alkalmas eszközök 
(pl. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR stb.),  
— folyadékszcintillációs számláló,  
— választótölcsérek a folyadék-folyadék extrakcióhoz,  
— műszerek oldatok és kivonatok koncentrálására (pl. forgó 
bepárló),  
— hőmérséklet-szabályozó eszköz (pl. vízfürd ő). 
A kémiai reagensek között szükség van például:  
— analitikai tisztaságú szerves oldószerekre: hexánra, diklór- 
metánra stb.,  
— szcintillációs folyadékra,  
— pufferoldatokra (részletesebben lásd az 1.8.3. szakaszban).  
A hidrolízis során használt minden üveget, reagens tisztaságú vizet 
és pufferoldatot sterilizálni kell.  
1.8.2.  A vizsgált anyag bevitele  
A vizsgált anyagot vizes oldat formájában kell a különböz ő puffe­
roldatokba bevinni (lásd a 3. függeléket). Ha a megfelel ő oldódáshoz 
szükséges, a vizsgált anyag beviteléhez kis mennyiség ű, vízzel 
elegyedő oldószer (pl. acetonitril, aceton, etanol) is felhasználható, 
de ennek mennyisége rendszerint legfeljebb 1 térfogatszázalék lehet. 
Nagyobb koncentrációjú oldószer alkalmazása csak akkor engedhet ő 
meg (például rosszul oldódó vizsgált anyag esetén), ha kimutatható, hogy az oldószernek nincs hatása a vizsgált anyagok hidrolízisére.
 
Formulázott terméket rutinszer űen nem ajánlatos használni, mivel 
nem zárható ki, hogy a formulázási összetev ők befolyásolják a 
hidrolízis folyamatát. Ugyanakkor vízben rosszul oldódó vizsgált anyag vagy az üveghez hozzátapadó anyag esetében (lásd az 1.8.1. szakaszt) a formulázott anyag megfelel ő alternatívát jelenthet.
 
A vizsgált anyagból egyetlen koncentrációt kell használni; ez a 
koncentráció nem haladhatja meg a 0,01 M-t vagy a telítettségi 
koncentráció felét (lásd az 1. függeléket).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Pufferoldatok  
A hidrolízisvizsgálatot három pH-értéken kell végrehajtani: 4, 7 és 
9. Ehhez reagens tisztaságú vegyi anyagok és víz felhasználásával pufferoldatokat kell készíteni. A 3. függelék bemutat néhány hasznos 
pufferrendszert. Megjegyzend ő, hogy az alkalmazott pufferrendszer 
hatással lehet a hidrolízis sebességére, ezért ha ilyen hatást észlelünk, akkor másik pufferrendszert kell igénybe venni (
 1 ). 
Az egyes pufferoldatok pH-értékét kalibrált pH-mér ővel az el őírt 
hőmérsékleten legalább 0,1 pH pontossággal ellen őrizni kell.  
1.8.4.  Vizsgálati körülmények  
1.8.4.1.  Vizsgálati h őmérséklet  
A hidrolízisvizsgálatokat állandó h őmérsékleteken kell elvégezni. Az 
extrapoláció szempontjából fontos, hogy a h őmérséklet ± 0,5  o C-os 
tartományon belül maradjon.  
Ha a vizsgált anyag hidrolitikus viselkedése nem ismert, 50  o C-os 
hőmérsékleten el ővizsgálatot (1. fokozat) kell végezni. A magasabb 
fokozatú kinetikai vizsgálatokat legalább három h őmérsékleten (bele ­
értve az 50  o C-on elvégzett vizsgálatot is) kell elvégezni, kivéve 
akkor, ha az 1. fokozatú vizsgálatban a vizsgált anyag hidrolízis szempontjából stabilnak mutatkozott. H őmérséklet-tartományként 
10–70
 o C-ot javaslunk (lehet őleg legalább egy h őmérsékletérték 25  
o C-nál kisebb legyen), ugyanis ebben a tartományban mind a 25  o C- 
os referenciah őmérséklet, mind a területen el őforduló legtöbb h őmér­
séklet megtalálható.  
1.8.4.2  Fényviszonyok és oxigén  
A hidrolízisvizsgálatok során a fotolitikus hatásokat tetsz őleges, erre 
alkalmas módszerrel ki kell zárni. Mindent meg kell tenni az oxigén 
elkerülése érdekében (például az oldat elkészítése el őtt 5 percig 
hélium, nitrogén vagy argon buborékoltatásával).  
1.8.4.3.  A vizsgálat id őtartama  
Az elővizsgálatot 5 napig, a magasabb fokozatú vizsgálatokat a vizs ­
gált anyag 90 %-os hidrolizálásáig, de legfeljebb 30 napig kell 
végezni.  
1.8.5.  A vizsgálat végrehajtása  
1.8.5.1.  Elővizsgálat (1. fokozat)  
Az elővizsgálatot 50 ± 0,5  o C-on és 4,0, 7,0 és 9,0 pH-értékeken 
végezzük. Ha 5 nap után a hidrolízis mértéke 10 %-nál kisebb 
(t 0,5 25  o C > 1 év), akkor a vizsgált anyag hidrolízis szempontjából 
stabilnak tekintend ő, és rendszerint nincs szükség további vizsgála ­
tokra. Ha tudjuk, hogy az anyag környezeti szempontból releváns hőmérsékleteken instabil (
 2 ), akkor az el ővizsgálatot nem kell elvé ­
gezni. Az analitikai módszernek kell ő pontosságúnak és érzékenysé ­
gűnek kell lennie ahhoz, hogy a kezdeti koncentráció 10 %-os csök ­
kenése kimutatható legyen.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey és Mill foszfát helyett borát- vagy acetátpufferek alkalmazását javasolja (11). 
( 2 ) Erre vonatkozó információ más forrásokból, például szerkezetileg hasonló vegyületek 
szakirodalmi hidrolízisadataiból vagy a vizsgált anyaggal korábban elvégzett félkvanti ­
tatív hidrolízisvizsgálatokból is származhat.
 1.8.5.2.  Instabil anyagok hidrolízise (2. fokozat)  
A magasabb fokozatú (részletesebb) vizsgálatot azokon a pH-érté ­
keken kell elvégezni, amelyeken a vizsgált anyag a fenti el ővizs­
gálatban instabilnak mutatkozott. A vizsgált anyag pufferelt oldatait 
a kiválasztott h őmérsékleteken kell tartani. Az els őrendű viselkedés 
vizsgálatához minden reakcióoldatot rendesen olyan id őközönként 
kell elemezni, hogy a vizsgált anyag 10 %-os és 90 %-os hidrolízise között legalább hat, egymástól kell ő távolságban elhelyezked ő adat­
pontot kapjunk. Az egyes párhuzamos vizsgálati mintákat (külön 
reakcióedényekben tartott legalább két azonos mintát) legalább hat- hat mintavételi id őpontban ki kell venni az edényb ől, és mindegyik 
minta tartalmát elemezni kell (így legalább tizenkét párhuzamos adat ­
pontot nyerünk). Nem helyes eljárás, ha a párhuzamos mintákat egyetlen nagy minta egyenl ő részekre osztásával állítjuk el ő, és 
ezeket vizsgáljuk az egyes mintavételi id őpontokban, mert ily 
módon nincs lehet őség az adatok változatosságának elemzésére, és 
a vizsgálati oldat szennyez ődése is problémát jelenthet. A magasabb 
fokozat végén (azaz a 90 %-os hidrolízis elérése után vagy 30 nap elteltével) külön vizsgálattal ellen őrizni kell a sterilitást. Ha azonban 
bomlást (átalakulást) nem tapasztalunk, a sterilitást nem szükséges 
külön vizsgálni.
 
1.8.5.3.  A hidrolízistermékek meghatározása (3. fokozat)  
Minden olyan hidrolízisterméket, amely legalább az alkalmazott 
dózis 10 %-ának megfelel ő mennyiségben keletkezik, megfelel ő 
analitikai módszerrel azonosítani kell.  
1.8.5.4.  Kiegészít ő vizsgálatok  
Hidrolízis szempontjából instabil vizsgált anyag esetében szükséges 
lehet a 4, 7 és 9 pH-értékt ől eltérő pH-értékeken is vizsgálatokat 
végezni. Fiziológiai megfontolásból például el őfordulhat, hogy sava ­
sabb körülmények (pl. pH =1,2) közötti, fiziológiai szempontból 
releváns h őmérsékleten (37  o C) is kell vizsgálatot végrehajtani.  
2. ADATOK  
A vizsgált anyagok és a hidrolízistermékek (ha vannak) mennyiségét 
minden mintavételi id őpontra, minden pH-értékre és h őmérsékletre 
vonatkozóan az alkalmazott kezdeti koncentráció százalékában, ille ­
tőleg szükség szerint mg/l-ben is meg kell adni. Jelölt vizsgált anyag 
esetén az alkalmazott kezdeti koncentráció százalékában a tömegmér ­
leget is meg kell adni.  
A jegyzőkönyvben a vizsgált anyag koncentrációinak értékét grafi ­
kusan, az id ő függvényében logaritmikus léptékben ábrázolva kell 
megadni. Meg kell határozni a legalább az alkalmazott dózis 10 %- ának megfelel ő mennyiségben keletkez ő hidrolízistermékek mibenlé ­
tét, és a vizsgált anyag mennyiségeit jelz ő koordináta-rendszerben 
logaritmikus léptékben ábrázolni kell mennyiségüket, ezzel szemlél ­
tetve keletkezésük és csökkenésük sebességét.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. AZ EREDMÉNYEK FELDOLGOZÁSA  
Megfelelő kinetikai modellszámításokkal a felezési id őt vagy a DT  50 
értékét pontosabban is meg kell határozni. A felezési id ő, illetve a 
DT 50 értékét (konfidenciahatárokkal együtt) minden pH-értékre és 
hőmérsékletre meg kell adni, és ismertetni kell a felhasznált modellt, 
a kinetikai rendet és a korrelációs együtthatót (r  2 ). Ha vannak, a 
számításokat a hidrolízistermékekre is el kell végezni.  
Ha a sebességértékek különböz ő hőmérsékleteken elvégzett vizsgála ­
tokból származnak, akkor a hidrolízis pszeudo-els őrendű reakcióse ­
bességi állandóját (k  obs ) a hőmérséklet függvényében kell leírni. A 
számítást a k  obs savas katalizált, közömbös és lúgos katalizált hidrolí ­
zishez tartozó sebességi állandókra (rendre k  H , k  neutral  , és k  OH ) 
történő bontásával, az Arrhenius-egyenlet alapján kell elvégezni:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
ahol A  i és B  i a kelvinben megadott T abszolút h őmérséklet reciproka 
függvényében ábrázolt ln k  i értékekre lineáris regresszióval fektetett 
egyenesek regressziós állandói (metszete, illetve meredeksége). Az Arrhenius-összefüggést a savas katalizált, a közömbös és a lúgos katalizált hidrolízisre alkalmazva a pszeudo-els őrendű reakciósebes ­
ségi állandók, és így a felezési id ők olyan h őmérsékletekre is el őál­
líthatók, amelyek esetében nincs mód a reakciósebességi állandó közvetlen kísérleti meghatározására (10).
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
A legtöbb hidrolízisreakció jó közelítéssel els őrendű folyamat, tehát 
a felezési id ő független a koncentrációtól (lásd a 2. függelék 4. 
egyenletét). Ez rendszerint lehet őséget ad arra, hogy a laboratóri ­
umban 10  –2 -től 100  –3 M nagyságrend ű koncentrációval nyert ered ­
ményekből következtessünk a környezetben el őforduló értékekre 
(ahol a koncentrációk 10  –6 vagy az alatti nagyságrend űek) (10). 
Mabey és Mill (11) több olyan esetr ől is beszámolt, amikor külön ­
böző vegyi anyagok esetében megfelel ő egyezést tapasztaltak a 
hidrolízis tiszta és természetes vizekben mért reakciósebessége tekin ­
tetében, feltéve hogy mind a pH-értéket, mind a h őmérsékletet 
mérték.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek legalább a következ ő információkat kell 
tartalmaznia:  
Vizsgált anyag:  
— közhasználatú név, kémiai név, CAS-szám, szerkezeti képlet 
(radioaktívan jelölt anyag esetén a jelzés helyének feltüntetésé ­
vel) és a releváns fizikai-kémiai tulajdonságok (lásd az 1.5. 
szakaszt),  
— a vizsgált anyag tisztasága (szennyez ődések),  
— a jelölt vegyi anyag tisztasága és moláris aktivitása (ha szük ­
séges).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Pufferoldatok:  
— a készítés dátuma és részletes adatai,  
— alkalmazott puffer és víz,  
— a pufferoldatok molaritása és pH-ja.  
A vizsgálat körülményei:  
— a vizsgálatok elvégzésének napja és a végrehajtás módja,  
— a bevitt vizsgált anyag mennyisége,  
— a vizsgált anyag bevitelének módszere, az oldószerek (típus és 
mennyiség),  
— a vizsgált anyag inkubált pufferolt oldatainak térfogata,  
— az alkalmazott inkubációs rendszer leírása,  
— pH és h őmérséklet a vizsgálat alatt,  
— mintavételi id őpontok,  
— az extrakció módszere(i),  
— a pufferoldatokban lév ő vizsgált anyag és hidrolízistermékek 
mennyiségének és mibenlétének meghatározására alkalmazott módszerek,
 
— a párhuzamos minták száma.  
Eredmények:  
— az alkalmazott analitikai módszer megismételhet ősége és érzé ­
kenysége,  
— a visszanyert mennyiségek (a vizsgálat érvényességéhez szük ­
séges százalékértékeket az 1.7.1. szakasz adja meg),  
— a párhuzamos minták adatai és átlaguk táblázatos formában,  
— tömegmérleg a vizsgálatok alatt és végén (jelölt vizsgált anyag 
esetén),  
— az elővizsgálat eredményei,  
— az eredmények szöveges elemzése és értelmezése,  
— valamennyi eredeti adat és ábra.  
A következ ő információkat csak akkor kell megadni, ha a hidrolízis 
sebességét is meghatározzuk:  
— a vizsgált anyag koncentrációinak ábrázolása az id ő függvényé ­
ben, és ha van, a vizsgált hidrolízistermékek ábrázolása minden 
pH-értéken és h őmérsékleten,  
— a 20  o C/25  o C hőmérsékletre vonatkozó Arrhenius-egyenlet ered ­
ményei táblázatban összefoglalva, a pH, a reakciósebességi 
állandó [tf  –1 vagy nap  –1 ], a felezési id ő vagy a DT  50 -érték, a 
hőmérsékletek [  o C], továbbá mindezen adatok konfidenciahatárai 
és korrelációs együtthatói (r  2 ) vagy más hasonló adatai,  
— a hidrolízis vélt folyamata.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. HIVATKOZÁSOK  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.  
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Európai Unió (EU) (1995). A Bizottság 95/36/EK irányelve a 
növényvéd ő szerek forgalomba hozataláról szóló 91/414/EGK 
tanácsi irányelv módosításáról. 5. melléklet: A hatóanyag sorsa és viselkedése a környezetben.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
 
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr. 23.
 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994–2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997). 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993).
 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental conditi ­
ons. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
1. függelék  
A hidrolízisvizsgálat többfokozatú rendszere
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
2. függelék  
Fogalommeghatározások és mértékegységek  
Minden esetben  szabványos nemzetközi (SI-) mértékegységet  kell használni.  
Vizsgált anyag:  tetszőleges anyag, legyen szó kiindulási anyagról vagy átalaku ­
lási termékr ől. 
Átalakulási termék:  a vizsgált anyag biotikus vagy abiotikus átalakulási reakciói 
eredményeképpen létrejött anyag.  
Hidrolízistermék:  a vizsgált anyag hidrolitikus reakciói eredményeképpen létre ­
jött anyag.  
Hidrolízis:  valamely RX vizsgált anyag reakciója vízzel, amelynek során a 
hangsúly az OH-val helvettesít ődő X csoport összmennyiségén van: 
RX + HOH → ROH +HX [1]  
Az RX koncentrációjának csökkenési sebességét a következ ő összefüggés adja 
meg: 
sebesség = k [H  2 O] [RX] másodrend ű reakció 
vagy 
sebesség = k [RX] els őrendű reakció,  
a reakciósebességet megszabó részreakciótól függ ően. Mivel a víz jóval nagyobb 
arányban van jelen, mint a vizsgált anyag, az ilyen típusú reakciót rendszerint 
pszeudo-els őrendű reakciónak tekintjük, amelynek tapasztalati reakciósebességi 
állandóját a következ ő összefüggés adja: 
k obs = k [H  2 O] [2]  
A reakciósebességi együttható a következ ő összefüggésb ől határozható meg (*):  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
ahol 
t = az id ő; 
C o , C t pedig = az RX koncentrációja a nulladik, illetve a t id őpontban.  
Az együttható dimenziója (id ő) –1 , a reakció felezési idejét (az RX 50 %-ának 
reakciójához szükséges id őt) pedig a következ ő összefüggés adja meg:  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Felezési id ő (t 0,5 ): a vizsgált anyag 50 %-os hidrolíziséhez szükséges id ő, ha a 
reakció folyamata els őrendű kinetikával leírható. A felezési id ő független a 
koncentrációtól.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Ha a logaritmikus léptékben az id ő függvényében ábrázolt adatok nem lineáris függvényt 
(azaz nem els őrendű folyamatot) mutatnak, akkor a [3] képlet nem alkalmas a vizsgált 
vegyület hidrolízisét leíró reakciósebességi együttható meghatározására.
 DT 50 (50 %-os lebomlási id ő): az az id ő, amelyen belül a vizsgált anyag 
koncentrációja 50 %-kal lecsökken; ha a reakció folyamata nem els őrendű kine­
tikát követ, akkor ez a mennyiség nem azonos a t  0,5 felezési id ővel. 
k becslése különböz ő hőmérsékleteken  
Ha két h őmérsékleten ismerjük a reakciósebességi állandót, akkor az egyéb 
hőmérsékletekhez tartozó reakciósebességi állandó az Arrhenius-egyenletb ől 
számítható:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T vagy  ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Az l/T függvényében ábrázolt In k értékek –E/R meredekség ű egyenest adnak.  
Az előző képletben:  
k = a különböz ő hőmérsékleteken mért reakciósebességi állandó;  
E = az aktiválási energia [kJ/mol];  
T = az abszolút h őmérséklet [K];  
R = a gázállandó [8,314 J/mol.K].  
Az aktiválási energiát regresszióanalízissel vagy a következ ő egyenlettel számít ­
juk: 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
ahol T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
3. függelék  
Pufferrendszerek  
CLARK ÉS LUBS:  
CLARK- és LUBS-féle pufferkeverékek  (*) 
Összetétel pH  
0,2 N HCl és 0,2 N KCl 20  o C-on  
47,5 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 1,4 13,15 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 1,8 5,3 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl 100 ml-ig hígítva 2,2  
0,1 M kálium-ftalát + 0,1 N HCl 20
 o C-on  
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 3,0 14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 3,4 5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 3,6 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 3,8  
0,1 M kálium-ftalát + 0,1 N NaOH 20
 o C-on  
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 4,8
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) A táblázatokban szerepl ő pH-értékek a Sörensen-féle normálegyenletek (1909) felhasználásával, potenciálmé ­
résekből kerültek meghatározásra. A megfelel ő pH-értékek 0,04-dal nagyobbak a táblázatban található érté ­
keknél.
 Összetétel pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ftalát 100 ml-ig hígítva 6,0
 
CLARK- és LUBS-féle pufferkeverékek (folytatás) 
0,1 M monokálium-foszfát + 0,1 N NaOH 20  o C-on  
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml foszfát 100 ml-ig hígítva 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 0,1 M KCl-ban + 0,1 N NaOH 20  o C-on  
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 9,2
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsav 100 ml-ig hígítva 10,0  
B. KOLTHOFF ÉS VLEESCHHOUWER:  
KOLTHOFF és VLEESCHHOUWER-féle citrátpufferek  (*) 
Összetétel pH  
0,1 M monokálium-citrát és 0,1 N HCl 18  o C-on  (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 2,6 
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 2,8 
23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 3,6  
0,1 M monokálium-citrát es 0,1 N NaOH 18  o C-on  (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 4,4 
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrát 100 ml-ig hígítva 6,0  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) A penészképz ődés megakadályozása érdekében adjunk az elegyhez egy kisméret ű 
timolkristályt vagy hasonló anyagot.
 C. SÖRENSEN:  
SÖRENSEN-féle boraxkeverékek  
Összetétel 1 Sörensen 
18 o C Walbum, pH a következ ő hőmérsékleten H a 
következo ő h hőmérsékleten 
ml borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 
6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 
6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
SÖRENSEN-féle foszfátkeverékek  
Összetetel pH  
0,0667 M monokálium-foszfát + 0,0667 M dinátrium-foszfát 20  o C-on  
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICITÁS FÖLDIGILISZTÁKRA  
MESTERSÉGES TALAJBAN VÉGZETT VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
A szóban forgó laboratóriumi vizsgálatban a vizsgált anyagot olyan 
mesterséges talajhoz adják hozzá, amelyben 14 napra földigilisztákat helyeznek el. Ezt az id őszakot követ ően (másik lehet őségként hét 
nap elteltével) megvizsgálják az anyagnak a földigilisztákra gyako ­
rolt letális hatását. A módszer a vegyi anyagnak a földigilisztákra a 
bőrükön keresztül, illetve a tápcsatornából történ ő felszívódás követ ­
keztében gyakorolt hatásának viszonylag gyors kisz űrését teszi lehe ­
tővé.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁS ÉS MÉRTÉKEGYSÉG  
LC 50 : Az anyagnak az a koncentrációja, amely a vizsgálati id őszak 
alatt a kísérleti állatok 50 %-át pusztítja el.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Rendszeres id őközönként referenciaanyagot kell használni annak 
igazolására, hogy a vizsgálati rendszer érzékenysége nem változott- e jelentős mértékben.
 
Referenciaanyagként analitikai tisztaságú klór-acetamidot ajánlunk.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A talaj változó közeg, ezért a vizsgálathoz gondosan összeállított, 
mesterséges vályogtalajt kell használni. A vizsgált anyag különféle 
koncentrációival kezelt mesterséges talajban az  Eisenia foetida  (lásd 
a függelék megjegyzését) fajhoz tartozó feln őtt példányokat tartanak. 
A tárolóedények tartalmát a vizsgálat megkezdése után 14 nappal (és 
választhatóan hét nap elteltével) szétterítik egy tálcán, majd megszá ­
molják az egyes koncentrációk mellett életben maradt földigilisztá ­
kat. 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A vizsgálatot úgy kell megtervezni, hogy az a vizsgált talaj és szer ­
vezet tekintetében minél jobban ismételhet ő legyen. A kontrollcso ­
portban az elhullási arány nem haladhatja meg a 10 %-ot, különben a 
vizsgálat nem értékelhet ő. 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Anyagok  
1.6.1.1. V i z s g á l t t a l a j  
Meghatározott összetétel ű mesterséges talajt kell használni.  
a) Alapszubsztrátum (a száraz tömeg százalékában)  
— 10 % t őzegmoha (Sphagnum) (a pH 5,5 és 6,0 közötti 
értékhez a lehet ő legközelebb, úgy, hogy ne maradjon 
benne látható növénymaradvány, finomra őrölve),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolinitagyag, lehet őleg 50 %-nál több kaolinittel,  
— körülbelül 69 % ipari kvarchomok (domináns mennyiség ű 
finom homok, több mint 50 %-ban 0,05 és 0,2 mm közötti szemcsenagysággal). Ha az anyag vízben nem oszlatható el 
eléggé, edényenként 10 g homokot tartalékban kell tartani, 
hogy kés őbb hozzáadhassák a vizsgált szubsztrátumhoz,
 
— mintegy 1 % vegytiszta, porított kalcium-karbonát (CaCO  3 ) 
hozzáadásával a pH-t 6,0 ± 0,5-re állítják be.  
b) Vizsgált szubsztrátum  
A vizsgált szubsztrátum az alapszubsztrátumot, a vizsgált anyagot 
és az ionmentesített vizet tartalmazza.  
Víztartalmának az alapszubsztrátum száraz tömegének 25 és 
42 %-a közé kell esnie. A szubsztrátum víztartalmának meghatá ­
rozásához a mintát 105  o C-on állandó tömegig kell szárítani. A 
legfontosabb feltétel az, hogy a mesterséges talajt át kell nedve ­
síteni, de nem szabad azon víznek állni. Ügyelnünk kell rá, hogy 
a vizsgált anyagot és a vizsgált szubsztrátumot egyenletesen 
keverjük el egymással. A vizsgálati jelentésben fel kell jegyezni, hogyan vittük bele a vizsgált anyagot a szubsztrátumba.
 
c) Kontroll szubsztrátum  
A kontroll szubsztrátum az alapszubsztrátumból és vízb ől áll. Ha 
bármely más adalékanyagot alkalmazunk, kiegészít ő kontrollt is 
kell használni, amelyben az adott adalékanyagból ugyanannyi 
található.  
1.6.1.2. V i z s g á l a t i e d é n y e k  
Körülbelül egy liter űrtartalmú (szell őzőlyukakkal ellátott, m űanyag 
fedővel, kupakkal vagy m űanyag fóliával lefedett) üvegedények a 
szubsztrátum 500 g szárazanyag-tartalmának megfelel ő mennyi ­
ségben a nedves vizsgált talajjal, illetve a kontrolltalajjal feltöltve.  
1.6.2.  körülmények  
Az edényeket 20 ± 2  o C hőmérséklet ű klímakamrában kell tartani 
folyamatos megvilágítás mellett. A fény intenzitásának 400 és 800 lux között kell lennie.
 
A vizsgálat id őtartama 14 nap, de a mortalitást meg lehet vizsgálni a 
vizsgálat megkezdését követ ő hetedik napon is.  
1.6.3.  A kísérlet végrehajtása  
V i z s g á l t k o n c e n t r á c i ó k  
A vizsgált anyag koncentrációit az alapszubsztrátum száraz töme ­
géhez viszonyított tömegként adják meg (mg/kg).  
D ó z i s b e h a t á r o l ó v i z s g á l a t  
Azon koncentrációtartományok, amelyek 0 és 100 % közötti morta ­
litást váltanak ki, el őzetes vizsgálattal azonosíthatók azzal a céllal, 
hogy tájékozódjanak a részletes meghatározó vizsgálatban alkalmaz ­
ható koncentrációtartományokról.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Az anyagot a következ ő koncentrációkban lehet vizsgálni: 1 000; 
100; 10; 1; 0,1 mg anyag/kilogramm vizsgált talaj (száraz tömeg).  
Ha teljes kör ű meghatározó vizsgálatot akarunk végezni, az el őzetes, 
dózisbehatároló vizsgálatban minden koncentrációra és a kezeletlen kontrollra elegend ő egy-egy, 10 gilisztát tartalmazó vizsgálati 
csoport.
 
M e g h a t á r o z ó v i z s g á l a t  
Az előzetes, dózisbehatároló vizsgálat eredményeit arra használják 
fel, hogy a 0 és 100 % közötti mortalitási tartományban egy legalább 
öt koncentrációból álló mértani sort jelöljenek ki, amelyben az állandó szorzótényez ő legfeljebb 1,8.
 
Ezen vizsgálati sorral végzett vizsgálatok lehet ővé teszik az LC  50 - 
érték, illetve a konfidenciaszint lehet ő legpontosabb meghatározását.  
A meghatározó vizsgálat során koncentrációnként legalább négy 
kísérleti csoportot és négy kezeletlen kontrollt kell használni, 
amelyek mindegyike 10-10 gilisztát tartalmaz. Ezen ismétlések ered ­
ményei adják az átlagértékeket és a normál szórást.  
Ha két egymást követ ő és egymástól az 1,8-as faktort meghaladó 
mértékben nem különböz ő koncentráció csak 0 %-os és 100 %-os 
mortalitást ad, ezen értékek már elegend őek annak jelzésére, hogy az 
LC 50 melyik tartományba esik.  
A z a l a p s z u b s z t r á t u m é s a v i z s g á l t t a l a j k e v e r é k e  
A vizsgált talajt lehet őleg minden más szer hozzáadása nélkül, csak 
vízzel kell összeállítani. Közvetlenül a vizsgálat megkezdése el őtt a 
vizsgált anyag ionmentesített vízben vagy egyéb oldószerben elké ­
szített diszperzióját, illetve emulzióját elkeverik az alapszubsztrátum ­
mal, illetve finom kromatográfiás vagy ehhez hasonló szórókészü ­
lékkel egyenletesen eloszlatják az alapszubsztrátum felületén.  
Ha a vizsgált anyag nem oldódik vízben, a lehet ő legkisebb mennyi ­
ségű megfelel ő szerves oldószerben is feloldható (például hexánban, 
acetonban vagy kloroformban).  
A vizsgált anyag oldatba vitelére, diszpergálására vagy emulgeálá ­
sára csak könnyen illó oldószer használható. A vizsgált talajt a 
felhasználás el őtt át kell szell őztetni. Az elpárolgott vízmennyiséget 
pótolni kell. A kontrollhoz bármely adalékanyagból azonos mennyi ­
séget kell adni.  
Ha a vizsgált anyag szerves oldószerekben egyáltalán nem oldódik, 
nem diszpergálható, és nem emulgeálható, finomra őrölt kvarchomok 
és a vizsgált anyag 500 g száraz tömeg ű mesterséges talaj kezelésére 
elegendő mennyiségének keverékéb ől 10 g-ot kell elkeverni 490 g 
száraz tömeg ű vizsgált talajjal.  
Minden kísérleti csoportban 500 g száraz tömegnek megfelel ő 
mennyiség ű nedves vizsgált talajt helyeznek el, üvegedényenként 
10 db gilisztával, amelyeket el őzőleg hasonló nedves környezetben 
szoktattak 24 órán keresztül, majd gyorsan megmosták azokat, a 
felesleges vizet sz űrőpapírral felszívatták, és a gilisztákat a szubszt ­
rátum felületére helyezték.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
A tárolóedényeket perforált m űanyag fed ővel, kupakkal vagy fóliával 
zárják le, hogy a talajt megóvják a kiszáradástól, majd 14 napon 
keresztül tartják a vizsgálati körülmények között.  
Az értékelést a vizsgálat megkezdését követ ő 14. napon (és esetleg a 
7. napon) lehet elvégezni. A talajt üveg- vagy rozsdamentes acélle ­
mezen terítik szét. A gilisztákat megvizsgálják, és megállapítják a 
vizsgálatot túlél ők számát. Az a giliszta tekinthet ő élettelennek, 
amely az elüls ő végét érő enyhe mechanikai ingerre nem reagál.  
Ha a hetedik napon végeznek vizsgálatot, a tartályba visszatöltik a 
talajt, és a túlél ő gilisztákat ugyanarra a vizsgálati talaj felületre 
helyezik vissza.  
1.6.4.  Vizsgált organizmusok  
Vizsgált organizmusok: feln őtt Eisenia foetida  példányok (lásd a 
függelék megjegyzését) (legalább két hónaposak, amelyeknél a 
clitellum [nyereg] már kialakult), 300 és 600 mg közötti nedves súllyal. (A tenyésztési módszereket lásd a függelékben.)
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE  
A vizsgált anyag koncentrációit rögzítik, mellettük megadva az egyes 
koncentrációkhoz tartozó elhullott giliszták számát százalékban.  
Ha elegend ő adat áll rendelkezésre, a szabványmódszerrel meg kell 
határozni az LC  50 -értéket és a konfidencia-határértékeket (p = 0,05) 
(ezzel egyenérték ű módszer Litchfield és Wilcox on, 1949). A vizs ­
gált anyag LC  50 -értékét milligrammban kell megadni a vizsgált talaj 
kilogrammjára (száraz tömeg) vonatkoztatva.  
Azon esetekben, amikor a koncentrációs görbe túlságosan meredek 
az LC  50 kiszámításához, ezen érték grafikus becslése is elegend ő. 
Ha két egymást követ ő és egymástól az 1,8-as szorzótényez őnél 
nagyobb mértékben nem különböz ő koncentráció csak 0 %-os és 
100 %-os elhullást ad, ezen értékek már elegend őek annak jelzésére, 
hogy az LC  50 melyik tartományba esik.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— nyilatkozat arról, hogy a vizsgálatot a fent említett min őségi 
követelményeknek megfelel ően végezték,  
— az elvégzett vizsgálatok (el őzetes, dózisbehatároló vizsgálat 
és/vagy meghatározó vizsgálat),  
— a vizsgálati körülmények pontos leírása, illetve nyilatkozat arról, 
hogy a vizsgálatot a módszernek megfelel ően végezték-e el; 
minden eltérést jelezni kell,  
— annak pontos leírása, hogy a vizsgált anyagot hogyan keverték 
bele a vizsgált talajba,  
— a felhasznált vizsgált organizmusokkal kapcsolatos információk 
(faj, kor, súlyszéls őértékek és -átlag, tartási és tenyésztési körül ­
mények, származás),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— az LC  50 meghatározásához használt módszer,  
— az összes felhasznált adatot tartalmazó vizsgálati eredmények,  
— a vizsgált organizmusok viselkedésében megfigyelt tünetek vagy 
változások leírása,  
— a kontrollok mortalitása,  
— az LC  50 , illetve a legmagasabb vizsgált koncentráció, amely a 
vizsgálat beindítását követ ő 14 nappal (és esetleg hét nappal) 
már elhullást nem eredményezett, és a legkisebb vizsgált 
koncentráció, amely ugyanezen id őpontban már 100 %-os elhul ­
lást eredményezett,  
— a koncentráció-hatás görbe felvétele,  
— a referenciaanyaggal kapott eredmények, akár a mostani vizsgála ­
tokkal kapcsolatosan, akár korábbi min őség-ellenőrzési próbán 
nyerték azokat.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 207. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges  
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthsworms, 
Chapman and Hall, London, p. 331.  
(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Écologie et Systé ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671.  
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluation dose effect experiments. J.Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
 
(5) Commission of the European Communities, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 
1983.  
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- and 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxisitäts ­
test am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, 
in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Függelék  
A giliszták tenyésztése és tartása a vizsgálat el őtt 
Az állatok tenyésztéséhez 30–50 darab feln őtt gilisztára van szükség, amelyeket 
friss szubsztrátummal ellátott tenyészt őládába helyeznek, majd 14 nap múlva 
eltávolítják azokat. Ezen állatokat használhatják fel a további tenyészetekhez. 
A gubóból kikelt giliszta feln őtt (ivarérett) korában használható fel a vizsgála ­
tokhoz (a leírt feltételek mellett ez két-három hónap után következik be).  
Tenyésztési és tartási körülmények  
Klímakamra: 20 ± 2  o C hőmérséklet, lehet őleg folyamatos megvilágítással 
(400 és 800 lux közötti fényintenzitással).  
Tenyésztő ládák: 10–20 liter űrtartalmú, megfelel ően lapos edények.  
Szubsztrátum: Az  Eisenia foetida  többféle állati ürüléken is tenyészthet ő. 
Tenyésztőközegként 50 térfogat-százalékos t őzeg és 50 térfo ­
gat-százalékos tehén vagy lótrágya keveréke ajánlott. A közeg 
pH-értéke körülbelül 6 és 7 között legyen (ezt kalcium-karbo ­
náttal lehet szabályozni), és alacsony ionos vezet őképességgel 
kell rendelkeznie (6 mmhos-nál vagy 0,5 % sókoncentrációnál 
kevesebb). 
A szubsztrátum legyen nedves, de ne legyen túl vizes.  
A fent említett módszeren kívül még más sikeres módszer is 
alkalmazható.  
Megjegyzés : Az Eisenia foetida  két fajban létezik, amelyeket egyes taxonómusok 
külön alfajként írtak le (Bouche, 1972). Ezek morfológiailag nem különböznek, 
de egyikük, az  Eisenia foetida foetida  gyűrűin jellegzetes keresztirányú csíkozást 
vagy szalagokat találhatunk, amelyek a másikon, az  Eisenia foetida andrei  fajon 
nem jelennek meg, ellenben ennek vörösesebb színe van. Ha lehet, az  Eisenia 
foetida andrei  használatát javasoljuk. Más faj is használható, ha a hozzá szük ­
séges módszertan rendelkezésre áll.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIOLÓGIAI LEBOMLÁS  
ZAHN–WELLENS VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E módszernek az a célja, hogy felmérje a vízoldékony, nem illékony 
szerves anyagok végs ő biológiai lebontásának lehet őségeit akkor, ha 
statikus vizsgálati körülmények között viszonylag nagy töménység ű 
mikroorganizmusnak vannak kitéve.  
A szuszpendált szilárd részecskéken fizikokémiai adszorpció is létre ­
jöhet, és ezt az eredmények értékelésekor figyelembe kell venni (lásd 
a 3.2. pontot).  
A használni kívánt anyagokat 50 és 400 mg/liter közötti DOC-érté ­
keknek, valamint 100 és 1 000 mg/liter közötti COD-értékeknek megfelelő koncentrációban vizsgáljuk (DOC = oldott szerves szén; 
COD = kémiai oxigénigény). E viszonylag magas koncentrációknak 
az az előnye, hogy analitikailag megbízhatóak. Mérgez ő tulajdonságú 
vegyületek késleltethetik vagy gátolhatják a lebomlás folyamatát.
 
E módszerben az oldott szerves szén vagy a kémiai oxigénigény 
mérését a vizsgált anyag végs ő biológiai lebonthatóságának felméré ­
sére használjuk.  
Az ezzel párhuzamosan alkalmazott analitikai módszer segíthet az 
anyag primer lebomlásának meghatározásában (a kiindulási moleku ­
laszerkezet elt űnése).  
A módszer csak olyan vizsgált szerves anyagra megfelel ő, amely a 
vizsgálatban használt koncentrációban:  
— a vizsgálati körülmények között vízben oldódik,  
— páranyomása a vizsgálati körülmények között elhanyagolható,  
— a baktériumokat nem gátolja,  
— a vizsgálati rendszerben csak korlátozott mértékben szívódik fel,  
— habképz ődés útján nem vész el a vizsgált oldatból.  
A vizsgált anyag f őbb összetev őinek egymáshoz viszonyított rész ­
arányának ismerete hasznos lehet a kapott eredmények értékeléséhez, különösen azon esetekben, amikor az eredmények (lebomlási érté ­
kek) alacsonyak vagy marginálisak.
 
Az anyag mikroorganizmusokra gyakorolt mérgez ő hatásának isme ­
rete kívánatos az alacsony lebomlási értékek értékelésénél és a 
megfelelő vizsgált koncentrációk kiválasztásánál.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A vizsgálat végén nyert lebomlási mértéket, mint a „Zahn–Wellens 
vizsgálatban kapott biológiai lebonthatóságot” kell értékelni,  
D t ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
ahol:  
D T = biológiai lebomlás ( %) T id ő alatt,  
C A = DOC- (vagy COD-) értékek a vizsgált keverékben a vizs ­
gálat megkezdését követ ő három óra múlva (mg/l) (DOC 
= oldott szerves szén, COD = kémiai oxigénigény)  
C T = DOC- (vagy COD-) értékek a vizsgált keverékben minta ­
vételkor (mg/l),  
C B = DOC- (vagy COD-) értékek a vakpróbában mintavételkor 
(mg/l),  
C BA = DOC- (vagy COD-) értékek a vakpróbában a vizsgálat 
megkezdését követ ő három óra múlva (mg/l)  
A lebomlás mértékét a legközelebbi teljes százalékértékre kell kere ­
kíteni.  
A százalékos lebomlást a vizsgált anyag DOC- (vagy COD-) száza ­
lékának csökkenésével kell megadni.  
A mért vagy számított kiindulási érték és a három óra elteltével mért 
érték közötti különbség hasznos információkkal szolgálhat az anyag megsemmisítésével kapcsolatban (lásd a 3.2. pontot, Az eredmények értelmezése).
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Egyes esetekben, ha új anyagokat vizsgálunk, hasznos lehet a refe ­
renciaanyagok alkalmazása; konkrét referenciaanyagok ajánlása azonban egyel őre nem lehetséges.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Keverőszerkezettel és leveg őztetőberendezéssel ellátott, négyliteres 
üvegedénybe élesztett iszapot, ásványi tápanyagokat és egyedüli szénforrásként a vizsgált anyagot helyeznek el a vizes oldatban. A 
keveréket kevertetik, leveg őztetik, és 20 és 25
 o C hőmérséklet 
között, diffúz megvilágításban vagy sötétkamrában tartják 28 napon keresztül. A lebomlási folyamatot a sz űrt oldat DOC-, illetve 
COD-értékeinek naponkénti vagy egyéb megfelel ő időközönként 
végzett meghatározása útján követik nyomon. Az indulást követ ő 
három óra elteltével mért érték és az egyes id őközökben elt űnt 
DOC (vagy COD) mért értékeinek egymáshoz viszonyított arányát százalékos biológiai bomlás formájában fejezik ki, és ez szolgál a 
lebomlás adott id őre számított mértékéül. Az eredményt az id ő függ­
vényében ábrázolva kapják meg a biológiai bomlás görbéjét.
 
Ha specifikus analitikai módszert használnak, mérhet ő a kiindulási 
molekula koncentrációjának a biológiai bomlás következtében el őál­
lott változása is (els ődleges biológiai bonthatóság).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A vizsgálat kielégít ő mértékű ismételhet őségét körvizsgálat bizonyí ­
totta.  
A módszer érzékenységét nagymértékben a vakpróba változékony ­
sága és kisebb mértékben az oldott szerves szén, illetve a vizsgált vegyület folyadékkoncentrációjának kimutatási pontossága határozza 
meg.
 
1.6. A KÍSÉRLET VÉGREHAJTÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
1.6.1.1. R e a g e n s e k  
A vizsgálathoz használt víz: kevesebb mint 5 mg/liter szerves szenet 
tartalmazó ivóvíz. A kalcium- és magnéziumionok együttes koncent ­
rációja nem haladhatja meg a 2,7 mmol/litert; ellenkez ő esetben 
ionmentesített vagy desztillált vízzel való hígításra van szükség. 
Kénsav, analitikai reagens (A.R.): 50g/l 
Nátrium-hidroxid-oldat A.R.: 40 g/l 
Ásványitápanyag-oldat: oldjunk fel egy liter ionmentesí ­
tett vízben: 
ammónium-kloridot, NH4Cl, A.R.: 38,5 g 
nátrium-dihidrogen-foszfátot, NaH2PO4.2H2O, A.R.: 33,4 g, 
kálium-dihidrogén-foszfátot, KH2PO4, A.R.: 8,5 g, dikálium-monohidrogén-foszfátot, KH2PO4, A.R.: 21,75 g.
 
A keverék tápoldatként és pufferként egyaránt szolgál.  
1.6.1.2. K é s z ü l é k e k  
Egy és négy liter közötti űrtartalmú üvegedények (pl. üveghengerek).  
Üveg- vagy fémlapáttal ellátott és megfelel ő tengelyre szerelt keve ­
rőkészülék (a lapátnak az edény fenekét ől 5–10 cm távolságra kell 
forognia). Helyette 7 és 10 cm közötti hosszúságú, rúddal felszerelt 
mágneses kever ő is használható.  
2 és 4 mm közti bels ő átmérőjű üvegcső a levegőztetésre. A cs ő 
nyílása az edény fenekét ől kb. 1 cm-re legyen.  
Centrifuga (kb. 3 550 g).  
pH-mérő. 
Oldottoxigénkoncentráció-mér ő készülék.  
Szűrőpapírok.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Membránsz űrő készülék.  
Membránsz űrők 0,45 μm-es pórusokkal. A membránsz űrők akkor 
felelnek meg a célnak, ha meggy őződtek róla, hogy sem szenet 
nem bocsátanak ki, sem pedig a vizsgált anyagot nem abszorbeálják 
a szűrés során.  
A szervesszén-tartalom, illetve a kémiai oxigénigény meghatározá ­
sára alkalmas analitikai berendezés.  
1.6.1.3. A z i n o k u l u m e l ő k é s z í t é s e  
A biológiai szennyvíztisztítóból származó aktivált szennyvíziszapot 
(ismételten) kimossák és centrifugálják, vagy azt a vizsgálathoz hasz ­
nált vízzel ülepítik (lásd fent).  
Az aktivált iszapnak megfelel ő állapotban kell lennie. Az ilyen iszap 
valamely megfelel ően működő szennyvíztisztítóból könnyen besze ­
rezhető. Annak érdekében, hogy a lehet ő legtöbb baktériumfajt, 
illetve baktériumtörzset szerezzék be, érdemes különböz ő forrásból 
származó inokulumokat összekeverni (pl. több szennyvíztisztítóból, különböző talajkivonatokat, folyókból származó vizet stb.). A keve ­
réket a fentieknek megfelel ően kell kezelni.
 
Az aktivált iszap aktivitásának ellen őrzését lásd az alábbiakban, a 
„Funkcionális ellen őrzés” cím ű szakaszban.  
1.6.1.4. A v i z s g á l t o l d a t e l ő k é s z í t é s e  
A vizsgálathoz használt edénybe 500 ml vizet, 2,5 ml/liter ásványi ­
anyag-tápoldatot és 0,2–1,0 g szárazanyag/liter végkoncentrációjú 
aktivált iszapot kell önteni. Hozzá kell adni megfelel ő mennyiség ű 
törzsoldatot a vizsgált anyagból úgy, hogy a végs ő keverékben a 
DOC-koncentráció 50 és 400 mg/liter között legyen. Az ennek megfelelő COD-értékek 100 és 1 000 mg/liter között változnak. A 
vizsgálathoz használt vízzel ki kell egészíteni összesen egy–négy 
literre. A mennyiség megválasztása a DOC- és COD-meghatározá ­
sokhoz veend ő minták számától és az analízishez szükséges térfo ­
gattól függ.
 
Általában két liter elegend ő. Legalább egy kontrolledényt (vakot) 
kell beállítani minden vizsgálati sorhoz; ebben csak aktivált iszap 
és ásványi tápoldat van, amelyet a vizsgálati edényekben lév ő térfo­
gattal megegyez ő térfogatra kell kiegészíteni.  
1.6.2.  A kísérlet végrehajtása  
A vizsgálati edényeket mágneses vagy csavaros kever ővel diffúz 
megvilágításban vagy egy sötét szobában 20 és 25  o C közötti h őmér­
sékleten kell kikeverni. A leveg őztetést tisztítás céljából vattasz űrőn 
és szükség esetén mosópalackon keresztül fúvatott s űrített leveg ővel 
érik el. Biztosítani kell, hogy az iszap ne ülepedjen le, és az oxigén ­
koncentráció ne essen 2 mg/liter alá.  
A pH-értéket rendszeres id őközönként (pl. naponta) ellen őrizni kell, 
és szükség esetén be kell állítani 7 és 8 közé.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
A párolgási veszteséget közvetlenül a mintavétel el őtt ionmentesített 
vagy desztillált vízzel a megfelel ő mennyiségben pótolni kell. Jó 
módszer, ha a folyadék szintjét a vizsgálatok megkezdése el őtt 
jelöljük az edény falán. Minden mintavétel után új jelet tesznek (levegőztetés és keverés nélkül). Az els ő mintákat mindig a vizsgálat 
megkezdését követ ő három óra múlva veszik, hogy kiderítsék, felszí ­
vódott-e a vizsgált anyag az aktivált iszapba.
 
A vizsgált anyag elt űnését követ ően naponta vagy más rendszeres 
időközben végeznek DOC-vagy COD-meghatározást. A vizsgálati 
edényből és a vakpróbából származó mintákat gondosan átmosott 
szűrőpapíron átsz űrik. Az oldat sz űri etének els ő 5 ml-ét eldobják. 
A nehezen sz űrhető iszapot el őzetesen tízperces centrifugálással 
távolítják el. A DOC- és COD-meghatározásokat legalább két párhu ­
zamos mintán el kell végezni. A vizsgálatot 28 napon át folytatják.  
Megjegyzés:  A továbbra is zavaros mintákat membránsz űrőn szűrik 
át. A membránsz űrő nem bocsáthat ki, és nem vehet fel szerves 
anyagokat.  
A z a k t i v á l t i s z a p f u n k c i o n á l i s e l l e n ő r z é s e  
Valamely ismert anyagot tartalmazó edényt is be kell állítani a vizs ­
gálati sorba, hogy ellen őrizzék az aktivált iszap m űködőképességét. 
E célra a dietilén-glikol megfelel ő. 
A d a p t á c i ó  
Ha az elemzéseket viszonylag rövid id őközönként végzik (például 
naponta), az adaptáció a bomlási görbéb ől világosan felismerhet ő 
(lásd a 2. ábrát). Ezért nem célszer ű a vizsgálatot közvetlenül a 
hétvége el őtt megkezdeni.  
Ha az adaptáció a vizsgálati id őszak vége felé jelenik meg, a vizs ­
gálatot meg lehet hosszabbítani, amíg a lebomlás be nem fejez ődött. 
Megjegyzés:  Ha szükség van b ővebb ismeretekre az adaptálódott 
iszap viselkedésével kapcsolatosan, ugyanazt az aktivált iszapot kell még egyszer ugyanazon vizsgált anyaggal kezelni, az alábbi eljárás szerint:
 
Kikapcsolják a kever őgépet és a szell őztető berendezést, majd 
hagyják, hogy az aktivált iszap leülepedjen. Leszívják a felülúszó folyadékot, vízzel feltöltik két literre, 15 percig keverik, majd hagyják, hogy ismét leülepedjen. Miután a felülúszót ismét leszív ­
ták, a visszamaradt iszapot arra használják, hogy a vizsgálatot 
ugyanazon anyaggal a fenti 1.6.1.4. és 1.6.2. pontnak megfelel ően 
megismételjék. Az aktivált iszap ülepítés helyett centrifugálással is elkülöníthet ő.
 
Az adaptált iszapot friss iszappal is elkeverhetik literenként 0,2–1 g 
közötti száraz tömeg/liter koncentrációig.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l i t i k a i e s z k ö z ö k  
A mintákat szokásos esetben gondosan átmosott sz űrőpapíron sz űrik 
meg (a mosáshoz ionmentesített vizet kell használni).  
A továbbra is zavaros mintákat membránsz űrőn is át kell sz űrni 
(0,45 μm). 
A DOC-koncentrációt a TOC-m űszer segítségével két párhuzamos 
mintán határozzák meg a minták sz űri eteiből (az első 5 ml-t kiön ­
tik). Ha a sz űrletet nem tudják ugyanazon a napon elemezni, azokat 
másnapig h űtőszekrényben kell tárolni. Ennél hosszabb tárolás nem 
ajánlott.  
A COD-koncentráció meghatározását a minta sz űrletéből a hivatko ­
zott szakirodalomban másodikként feltüntetett dokumentumban ismertetett eljárás szerint végzik el.
 
2. ADATOK ES ÉRTÉKELÉS  
A DOC- és/vagy COD-koncentrációkat legalább két párhuzamos 
mintán kell meghatározni a fentebb említett 1.6.2. pont szerint. A 
T időben fennálló bomlás mértékét a fentebb az 1.2. pontban ismer ­
tetett képlet alapján számolják ki.  
A bomlás mértékét a legközelebbi egész százalékra kerekítik. A 
vizsgálat végén kapott bomlási értéket a jegyz őkönyvben „Biológiai 
lebonthatóság a Zahn-Wellens vizsgálat szerint” címen rögzítik.  
Megjegyzés : Ha teljes bomlást észlelünk a vizsgálati id ő lejárta el őtt, 
és az eredményt a következ ő napon megismételt elemzés is meger ő­
síti, a vizsgálatot le lehet zárni.  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— az anyag kiindulási koncentrációja,  
— minden egyéb információ és a vizsgált anyagra, a referencia ­
anyagra – ha volt –, valamint a vakpróbára vonatkozó vizsgálati eredmények,
 
— koncentráció három óra elteltével,  
— biológiai bomlási görbe, leírással,  
— dátum és helyszín, ahonnan a vizsgálati organizmusok mintáját 
vettük, adaptációs állapotuk, a felhasznált koncentráció stb.,  
— a vizsgálati eljárásban történt bármely változtatás tudományos 
okai.  
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
A DOC (COD) elt űnése, amely fokozatosan, napok vagy hetek alatt 
játszódik le, azt jelzi, hogy a vizsgált anyag biológiai úton bomlik le.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Bizonyos esetekben azonban a fizikokémiai felszívódás is szerepet 
játszhat, amit az jelez, ha rögtön az els ő három órán belül teljesen 
vagy részben elt űnik az anyag, és a kontroll-, valamint a vizsgálati 
edényben mért felülúszó folyadék mennyisége közötti különbség jóval a várt szint alatt marad.
 
További vizsgálatokra van szükség, ha az adszorpciót és a tényleges 
(vagy részleges) biológiai bomlást szándékoznak elkülöníteni.  
Számos lehet őség kínálkozik, de ezek közül a legmeggy őzőbb az, 
ha a felülúszót vagy az iszapot használják fel kiindulási törzsként (inokulum) egy alapvizsgálathoz (lehet őleg egy respirometriás vizs ­
gálathoz).
 
Azon vizsgált anyagok, amelyek DOC- (COD-) értékei a szóban 
forgó vizsgálat során gyorsan és nem felszívódás útján csökken ­
nek, biológiailag lebonthatónak tekinthet ők. A részleges és nem 
felszívódás útján történ ő kiürülés azt jelzi, hogy a vegyület 
legalább részben bomlik biológiailag. Ha a DOC- (COD-) érték 
nem vagy csak alig csökken, annak oka lehet az is, hogy a vizs ­
gált anyag gátolja a mikroorganizmusokat, amit az is jelezhet, hogy az iszap szétesik és elvész, zavaros felülúszót eredményezve. 
Ilyenkor a vizsgálatot a vizsgált anyag alacsonyabb koncentráció ­
jával kell megismételni.
 
Vegyületspecifikus analitikai módszerek vagy a  14 C izotóppal jelölt 
vizsgált anyag használata nagyobb érzékenységet tesz lehet ővé. 
Ha 14 C izotóppal jelölt vegyületet alkalmaznak, a biológiai bomlás 
tényét a  14 CO 2 kinyerési aránya fogja meger ősíteni.  
Ha az eredményeket els ődleges biológiai bomlás formájában adják 
meg, lehet őség szerint magyarázatot kell adni a kémiai szerkezet 
olyan jelleg ű változását illet ően, amely a kiindulási vegyület ismételt 
fellelésének hiányát okozza.  
A vak vizsgálati közeg válaszreakciója mellett az analitikai módszer 
hitelesítését is meg kell adni.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 302. B. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges  
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, A 
Bizottság 84/449/EGK irányelve (HL L 251., 1984.9.9., 1. o).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Függelék  
ÉRTÉKELÉSI PÉLDA 
Szerves vegyület: 4-etoxi-benzoesav 
Elméleti vizsgálati koncentráció: 600 mg/l Elméleti DOC-tartalom: 390 mg/l 
Oltóanyag (inokulum) szennyvíztisztító telep 
Koncentráció: 1 gramm szárazanyag-tartalom/liter Adaptációs állapot: nincs adaptálva Elemzés: DOC-meghatározás 
A minta mennyisége: 3 ml 
Kontrollvegyület: dietilén-glikol A vegyület toxicitása: 1 000 mg/l alatt nincs toxikus hatás 
Használt vizsgálat: fermentációs kémcs őpróba
 
Vizsgálati id ő Kontrollanyag Vizsgált anyag 
Vak DOC ­
( 1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l Nettó DOC 
mg/l Bomlás 
% DOC (  1 ) 
Mg/l Nettó DOC 
Mg/l Bomlás 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 óra 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 nap 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 nap 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 nap 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 nap 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 nap 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 
8 nap 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 
9 nap 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 nap 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Három párhuzamus meghatározás átlagértéke.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
1. ábra  
Biológiai bomlás görbéje (példa)
  
2. ábra  
A szennyviziszap adaptálása (példa)
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  AEROB SZENNYVÍZTISZTÍTÁS-SZIMULÁCIÓS VIZSGÁLAT: 
C.10-A: ELEVENISZAPOS BERENDEZÉSEK – C.10-B: BIOFILMEK  
C.10-A: Eleveniszapos berendezések  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 303. vizsgálati iránymutatá ­
sában (2001) leírt módszerrel. Az 1950-es években felismerték, hogy az újonnan bevezetett felületaktív anyagok túlzott habképz ődést okoznak a 
szennyvíztisztító telepeken és a folyókban. Az aerob szennyvíztisztítás 
során ezeket az anyagokat nem lehetett teljes mértékben eltávolítani, és 
egyes esetekben más szerves anyagok eltávolítását is korlátozták. Számos kutatás indult annak felderítésére, hogy a felületaktív anyagok hogyan távo ­
líthatók el a szennyvízb ől, illetve hogy az ipar által el őállított új vegyi 
anyagok eltávolíthatók-e egyáltalán a szennyvíztisztítás során. Erre a célra 
az aerob biológiai szennyvíztisztítás két f ő típusát (eleveniszapos és csepeg ­
tetőtestes szennyvíztisztítás) képvisel ő modellberendezéseket alkalmaztak. 
Gyakorlati szempontból – még helyi szinten is – célszer űtlen és nagyon 
költséges lett volna minden egyes új vegyi anyagot elkülönítve vizsgálni és nagyüzemi szennyvízkezel ő telepeket megfigyelni.
 
KIINDULÁSI MEGFONTOLÁSOK  
Eleveniszapos berendezések  
2. Az eleveniszapos modellek mérete a leírások szerint 300 ml és kb. 2 000 ml 
között változott. Ezek között voltak olyanok, amelyek a valódi méret ű 
szennyvíztisztító telepek mintájára készültek, azaz iszapülepít ő tartállyal 
rendelkeztek, ahonnan a leülepedett iszapot visszapumpálták egy leveg őztető 
edénybe, és olyanok is, ahol nem történt ülepítés (például Swisher (1)). A 
készülék méretét kett ős követelmény szem el őtt tartásával kellett meghatá ­
rozni: egyrészt elég nagynak kellett lennie ahhoz, hogy mechanikai szem ­
pontból m űködőképes legyen, és kell ő mennyiség ű minta vételét tegye lehe ­
tővé anélkül, hogy ez a m űködést befolyásolná, másrészt viszont nem lehe ­
tett túlzottan hely- és anyagigényes.  
3. Ez a vizsgálati módszer azt a két készüléktípust – a Husmann-berendezést 
(2) és a „lyukacsos edényt” (3)(4) – ismerteti, amelyeket széles körben és 
kielégítő módon alkalmaztak, els ő alkalommal a felületaktív anyagok kuta ­
tása során. Léteznek más modellek is, például az Eckenfelder (5), amelyek alkalmazása kielégít ő eredményt adott. Mivel ez a szimulációs vizsgálat 
viszonylag drága és munkaigényes, egyidej űleg egyszer űbb és olcsóbb 
szűrővizsgálatok is szerepeltek a kutatásban, amelyek az e melléklet C.4. 
fejezetében szerepl ő A–F módszereknél (6) kerülnek bemutatásra. A nagy 
számú felületaktív anyaggal és más vegyi anyaggal végzett kísérlet azt mutatta, hogy azok az anyagok, amelyek a sz űrővizsgálaton átmentek (bio ­
lógiailag gyorsan lebonthatók), a szimulációs vizsgálat során is lebomlottak. 
Azok az anyagok, amelyek nem mentek át a sz űrővizsgálaton, részben 
átmentek a jellegénél fogva biológiailag lebontható anyagok azonosítására szolgáló sz űrővizsgálaton (e melléklet C.12. és C.19. fejezetei (7) (8)), ám 
ez utóbbi csoportból csak néhány bomlott le a szimulációs vizsgálat során, 
míg azok a vegyi anyagok, amelyek a jellegénél fogva biológiailag lebont ­
ható anyagok azonosítására szolgáló sz űrővizsgálaton nem mentek át a 
(9)(10)(11) szimulációs vizsgálatok során sem bomlottak le.
 
4. Bizonyos célokra egyetlen üzemi feltételrendszer mellett végzett szimulációs 
vizsgálatok is elegend ők; az eredmények kifejezésére a vizsgált vegyi anyag 
vagy az oldott szerves szén (DOC) százalékos eltávolítását használjuk. Ez a vizsgálati módszer egy ilyen vizsgálatot ismertet. A fejezet el őző változa­
tával szemben, amely mindössze egyetlen – mesterségesen készített szenny ­
vizet használó, kapcsolt üzemmódban m űködő és viszonylag durva iszapel ­
vételi módszert alkalmazó – készüléktípust ismertetett, a jelenlegi szöveg
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
több változatot mutat be. A készülék típusára és üzemmódjára, valamint a 
szennyvízre és az iszapelvételre vonatkozóan egyaránt több alternatívát 
kínál. A szöveg szorosan igazodik az ISO 11733 szabvány (12) szövegéhez, amelyet az el őkészítése során alapos vizsgálatnak vetettek alá, jóllehet a 
módszer nem képezte körvizsgálat tárgyát.
 
5. Más célokra pontosabban kell ismerni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját 
a berendezés elfolyó vízében, amely egy alaposabb módszert igényel. 
Például, a vizsgálat id őszaka alatt minden nap precízebben kell ellen őrizni 
az iszapelvétel arányát, és a berendezéseket különféle arányokkal kell működtetni. Ha egy mindenre kiterjed ő módszerre van szükség, akkor mind ­
ezeken túl két vagy három eltér ő hőmérsékletérték alkalmazásával kell a 
vizsgálatokat elvégezni: egy ilyen módszert ír le Birch (13)(14) és foglal 
össze a 6. függelék. A jelenleg rendelkezésre álló ismeretek azonban nem elégségesek annak eldöntéséhez, hogy a kinetikai modellek közül melyek alkalmasak a vegyi anyagok szennyvíztisztítás során és általában véve a vízi 
környezetben történ ő biológiai lebomlása mérésére. A 6. függelékben példa ­
ként ismertetett Monod-féle kinetikai modell alkalmazhatósága az 1 mg/l és annál nagyobb koncentrációban jelen lév ő vegyi anyagokra korlátozódik, de 
egyes vélemények szerint még ez sem bizonyított. A szennyvízre jellem ­
zőhöz közelebb álló koncentrációk mellett végzett vizsgálatokat ír le a 7. 
függelék, de a 6. függelékben bemutatottakhoz hasonlóan ezek is csak egy függelékben kerülnek megjelentetésre, nem pedig külön kiadott vizsgálati módszerként.
 
Szűrők 
6. A csepegtet őtestes modellekre jóval kisebb figyelem irányult, melynek oka 
talán abban keresend ő, hogy nehézkesebbek és nagyobb helyet foglalnak el, 
mint az eleveniszapos modellek. Gerike  et al.  kapcsolt üzemmódban m űköd­
tetett csepegtet őtestes berendezéseket fejlesztett ki (15), amelyek viszonylag 
nagyméret űek (2 m magasak és 60 l térfogatúak) voltak, és minden egyes 
berendezés üzemeltetéséhez óránként 2 l szennyvízre volt szükség. Baumann et al (16) 1 méteres (14 mm bels ő átmérőjű) csövekbe helyezett gyapjúszer ű 
poliészterszalagokat használt a csepegtet őtestes szennyvíztisztítás szimulálá ­
sához, amelyeket el őzőleg 30 percig tömény eleveniszapban áztatott. A kizá ­
rólagos szénforrásként szolgáló vizsgált vegyi anyagot sóoldatban adagolták a függőlegesen elhelyezett cs őbe, a biológiai lebonthatóságot a berendezés 
elfolyó vízének oldott szerves széntartalmának (DOC) és az eltávozó gáz 
széndioxid-tartalmának mérései alapján értékelték.
 
7. A biosz űrők szimulálására alkalmazott másik módszernél (15) a vizsgált 
vegyi anyagot tartalmazó illetve nem tartalmazó szennyvizet (kb. 250 ml/h) a vízszinteshez viszonyítva kis d őlésszögben elhelyezett forgó csövek 
belsejébe adagolták, majd elemezték a berendezés felfogott elfolyó vízének 
DOC és/vagy vizsgált vegyianyag-tartalmát.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
8. E módszer célja a vízben oldható szerves vegyi anyagok aerob körülmények 
közötti, mikroorganizmusok által történ ő lebontásának és els ődleges, illetve 
teljes biológiai lebonthatóságának a meghatározása egy eleveniszapos folya ­
matot szimuláló, folyamatos üzem ű vizsgálati elrendezésben. A mikroorga ­
nizmusok számára a vizsgált szerves vegyi anyag és egy biológiailag gyorsan lebontható szerves közeg jelentik a szén- és energiaforrást.
 
9. Két folyamatos üzem ű vizsgálóberendezést (eleveniszapos szennyvíztisztítót 
vagy „lyukacsos edényt”) m űködtetünk azonos, a vizsgálat céljának 
megfelelően kiválasztott feltételek mellett. Az átlagos hidraulikus tartózko ­
dási idő általában 6 óra, az átlagos iszapkor (iszaptartózkodási id ő) 6–10 
nap. A fölösiszap-elvétel két módszer egyikével történik; a vizsgált vegyi anyagot csak az egyik berendezésbe befolyó szennyvízhez (szerves közeg ­
hez) adagoljuk, általában úgy, hogy a szerves szén (DOC) koncentráció a 10 
mg/l és 20 mg/l között legyen. A másik berendezést kontroll berendezésként 
használjuk a szerves közeg biológiai lebonthatósága meghatározására.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Gyakori mintavétel segítségével meghatározzuk – lehet őség szerint – a 
berendezés elfolyó vízének DOC-koncentrációját vagy kémiai 
oxigénigényét (COD), valamint – szükség esetén – specifikus analízis segít ­
ségével a vizsgált vegyi anyag koncentrációját annak a berendezésnek az elfolyó vizében, amelybe a vizsgált vegyi anyagot adagoltuk. Feltételezzük, 
hogy a vizsgálati berendezés és a kontroll berendezés elfolyó vízében mért 
DOC-koncentrációk vagy COD értékek különbsége a vizsgált vegyi anyagnak vagy szerves metabolitjainak tulajdonítható. A vizsgált vegyi anyag lebomlásának meghatározásához ezt a különbséget összehasonlítjuk 
a befolyó szennyvíz vizsgált vegyi anyag hozzáadásának tulajdonítható 
DOC-koncentrációjával vagy COD értékével.
 
11. A lebomlást az id ő függvényében ábrázoló görbe alapos vizsgálata általában 
lehetővé teszi a biológiai lebontás biológiai adszorpciótól való megkülön ­
böztetését, meger ősítése pedig általában a gyors biológiai lebonthatóság 
megállapítására szolgáló vizsgálat segítségével lehetséges, amelyhez abból a berendezésb ől gyűjtött akklimatizált oltóanyagot kell használni, amelybe a 
vizsgált vegyi anyagot adagoltuk.
 
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
12. Az eredmények helyes értelmezéséhez ismerni kell a vizsgált vegyi anyag 
tisztasági, vízoldékonysági, illékonysági és adszorpciós jellemz őit. Illékony 
és oldhatatlan vegyi anyagok általában csak különleges óvintézkedések megtétele esetén vizsgálhatók (lásd az 5. függeléket). Az elméleti értékek kiszámításához, illetve a paraméterek mért értékeinek ellen őrzéséhez (pél ­
dául elméleti oxigénigény (ThOD), oldott szerves szén (DOC) és kémiai 
oxigénigény (COD)) a kémiai szerkezet vagy legalább a tapasztalati képlet ismerete is szükséges.
 
13. A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására 
vonatkozó információk (lásd a 4. függeléket) hasznosak lehetnek a 
megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásánál és különösen fontosak 
lehetnek az alacsony biológiai lebomlási értékek helyes értelmezéséhez.  
MEGFELELÉSI SZINTEK  
14. A felületaktív anyagok els ődleges biológiai lebonthatósága szimulációs (iga ­
zoló) vizsgálatának eredeti követelményei szerint a meghatározott vegyi 
anyagnak legalább 80 %-os eltávolítási szintet kellett elérnie ahhoz, hogy 
a felületaktív anyag forgalmazható legyen. 80 % alatti érték esetén a felü ­
letaktív anyag csak akkor forgalmazható, ha az itt bemutatott szimulációs (igazoló) vizsgálat alkalmazása során a meghatározott vegyi anyag több mint 
90 %-a eltávolítható. A vegyi anyagok többségénél a megfelelési szint álta ­
lában nem vet fel kérdéseket, az eltávolítás százalékos értéke pedig felhasz ­
nálható a vegyi anyagok veszélyességének értékelése során alkalmazandó várható környezeti koncentráció közelít ő becsléséhez. A vizsgálatok álta ­
lában „mindent vagy semmit” eredményt hoznak. Számos vizsgálatban a 
tiszta vegyületek több mint háromnegyede 90 % feletti százalékos DOC-eltávolítást mutatott, a jelent ősebb fokú biológiai lebonthatóságot 
mutató vegyületek több mint 90 %-a pedig 80 % feletti eredményt ért el.
 
15. Az itt bemutatott vizsgálathoz használt (10 mg C/l körüli) koncentrációban 
viszonylag kevés vegyi anyag van jelen a szennyvízben (például felületaktív anyagok). Egyes vegyi anyagok esetében ez gátló koncentráció lehet, míg más estekben az alacsony koncentráció megváltoztatja az eltávolítás kineti ­
káját. A lebomlás pontosabb értékelése a módszerek módosításával, a vizs ­
gált vegyi anyag valóságosnak megfelel ő, alacsony koncentrációban történ ő 
használatával, majd a kapott adatokból számítható kinetikai állandók meghatározásával lehetséges. Az ehhez szükséges kísérleti módszerek teljes 
körű validálása, illetve a biológiai bomlási reakciókat leíró kinetikai 
modellek kidolgozása azonban még nem történt meg (lásd 7. függelék).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
16. A kísérleti eljárás helyes végrehajtásának biztosítása érdekében id őnként 
ajánlott ismert viselkedés ű vegyi anyagokat is vizsgálni a vizsgált anyaggal 
egyidejűleg. Ezek közé tartozik például az adipinsav, a 2-fenilfenol, az 1- 
naftol, a difénsav, az 1-naftoesav, stb. (9)(10)(11).  
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHET ŐSÉGE  
17. A szimulációs vizsgálatok szakirodalma jóval szegényesebb, mint a gyors 
biológiai lebonthatóságra vonatkozó vizsgálatoké. A legalább 80 %-ban 
lebomló vegyi anyagoknál az (egyidej ű) ismétlések jó reprodukálhatósági 
értéket mutatnak (10–15 %-on belül), a nehezebben lebomló vegyi anyagok esetén azonban nagyobb a variabilitás. Emellett néhány határesetnek min ő­
sülő vegyi anyag esetében nagyon eltér ő eredmények kerültek feljegyzésre a 
vizsgálat 9 hetes megengedett id őtartama alatt a különböz ő időpontokban 
(például 10 %, 90 %).
 
18. A kétféle készüléktípus alkalmazásával kapott eredmények között kicsi az 
eltérés, de egyes vegyi anyagok lebomlása nagyobb mértékben és követke ­
zetesebben volt megfigyelhet ő a háztartási szennyvízben, mint az OECD 
iránymutatása szerinti, mesterségesen készített szennyvízben.  
A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
Készülékek  
Vizsgálati elrendezés  
19. A vizsgálati elrendezés minden egyes vizsgált vegyi anyag esetén egy vizs ­
gálati berendezésb ől és egy kontroll berendezésb ől áll; ha csak specifikus 
analízis (els ődleges biológiai lebonthatóság meghatározása) elvégzésére 
kerül sor, akkor azonban egy vizsgálati berendezés is elegend ő. Egy kontroll 
berendezés ugyanazon vegyi anyag vagy különböz ő vegyi anyagok vizs ­
gálatához használt több vizsgálati berendezéshez is tartozhat. Kapcsolt berendezések alkalmazása (3. függelék) esetén mindegyik vizsgálati beren ­
dezéshez külön kontroll berendezést kell biztosítani. A vizsgálati elrendezés 
kétféle lehet: eleveniszapos szennyvíztisztítót modellez ő 
Husmann-berendezés (1. függelék, 1. ábra) vagy „lyukacsos edény” (1. függelék, 2. ábra). Mindkét esetben szükség van a befolyó szennyvíz és az elfolyó víz tárolására szolgáló megfelel ő méretű tartályokra, valamint 
adagolópumpákra, amelyek keverve vagy külön-külön adagolják a befolyó 
szennyvizet és a vizsgált vegyi anyag oldatát.
 
20. Mindegyik eleveniszapos berendezésnek rendelkeznie kell egy ismert térfo ­
gatú, körülbelül 3 liter eleveniszap befogadására alkalmas leveg őztető 
edénnyel és egy körülbelül 1,5 liter térfogatú szeparátorral (másodlagos 
tisztítás céljára); a térfogat a szeparátor magasságának változtatásával bizo ­
nyos mértékig módosítható. Eltér ő méretű edények alkalmazása a hidrau ­
likus terhelés megfelel ő módosítása esetén megengedett. Ha a vizsgálati 
helyiségben nem biztosítható a kívánatos tartományon belüli h őmérséklet, 
akkor ajánlott szabályozott h őfokú vízköpennyel körülvett edényeket hasz ­
nálni. A szeparátorból kikerül ő eleveniszapot légpumpa vagy adagoló 
szivattyú segítségével folyamatosan vagy egyenl ő hosszúságú szüneteket 
tartva szakaszosan vezetjük vissza a leveg őztető edénybe.  
21. A „lyukacsos edény” elrendezés egy porózus falú, kúpos aljú hengeres bels ő 
tartályból és egy azt körülfogó, valamivel nagyobb, ugyanolyan alakú 
vízzáró m űanyag edényb ől áll. A lyukacsos tartály elkészítésére alkalmas 
anyag a 90 μm legnagyobb pórusátmér őjű, 2 mm vastag porózus polietilén. 
Az iszap és a tisztított szerves közeg szétválasztása azon alapul, hogy a két anyag különböz őképpen halad át a lyukacsos falon. A kilép ő termék a gy űrű 
alakú részen gy űlik össze, ahonnan kifolyik a gy űjtőedénybe. Mivel az iszap 
nem ülepszik le, nem kell visszavezetni. Az egész elrendezés szabályozott
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
hőmérséklet ű vízfürdőben is kialakítható. A m űködtetés kezdeti szakasza ­
iban a lyukacsos edény eltöm ődése következtében túlfolyás fordulhat el ő. 
Ilyenkor a lyukacsos betétet ki kell cserélni egy tisztára, amelyhez az eltö ­
mődött betét kivétele el őtt egy szívócsövön keresztül át kell vezetni az 
iszapot az edényb ől egy tiszta vödörbe. Az eltöm ődött betét oldalaira tapadt 
iszapot is gondosan le kell kaparni és át kell rakni. Az eltöm ődött edény 
tisztítása során el őször gyenge vízsugárral lemossuk a visszamaradt iszapot, 
majd az edényt híg nátrium-hipoklorit oldatba és azt követ ően vízbe merít ­
jük, és végül vízzel alaposan leöblítjük.  
22. Az iszap leveg őztető edényben történ ő levegőztetéséhez mindkét elrende ­
zésben megfelel ő módszert kell alkalmazni, például porlasztókövet és s űrí­
tett leveg őt. Ha a leveg őt tisztítani kell, akkor egy megfelel ő szűrőn és 
levegőmosón kell átvezetni. Az aerob feltételek fenntartása és az iszap ­
pelyhek állandó szuszpenzióban tartása érdekében a vizsgálat során mind ­
végig elegend ő mennyiség ű levegőnek kell áthaladnia a rendszeren.  
Szűrőkészülék vagy centrifuga  
23. A minták sz űrésére szolgáló, megfelel ő pórusméret ű (0,45 μm névleges 
lyukátmér őjű) membránsz űrők, amelyek minimális mértékben adszorbeálják 
az oldható szerves vegyületeket és bocsátanak ki szerves szenet. Szerves 
szenet kibocsátó sz űrők alkalmazása esetén a kioldódó szén eltávolítása 
érdekében a sz űrőket meleg vízzel gondosan ki kell mosni. A másik lehet ­
séges megoldás a 40 000 m/s  2 gyorsulás elérésére képes centrifuga alkalma ­
zása.  
Analitikai berendezések  
24. A következ ők meghatározására alkalmas készülékek:  
— DOC (oldott szerves szén) és TOC (összes szerves szén) vagy COD 
(kémiai oxigénigény),  
— meghatározott vegyi anyag, ha szükséges,  
— lebegő anyagok, pH, víz oxigénkoncentrációja,  
— hőmérséklet, kémhatás,  
— ammónium, nitrit és nitrát, ha a vizsgálat a nitrifikációt befolyásoló 
feltételek mellett kerül elvégzésre.  
Víz 
25. Kevesebb mint 3 mg/l DOC-koncentrációjú csapvíz. Ha a lúgosság nem 
ismert, meg kell határozni.  
26. Kevesebb mint 2 mg/l DOC-koncentrációjú ionmentesített víz.  
Szerves közeg  
27. Szerves közegként mesterségesen készített szennyvíz, háztartási szennyvíz 
vagy ezek keverékének a használata megengedett. Kimutatták (11)(14), hogy 
a háztartási szennyvíz önmagában történ ő alkalmazása sok esetben maga ­
sabb százalékos DOC-eltávolítást eredményez, s őt olyan vegyi anyagok 
eltávolítását és biológiai lebontását is lehet ővé teszi, amelyek az OECD 
által meghatározott mesterségesen készített szennyvíz alkalmazása esetén 
nem bonthatók le biológiailag. Ugyancsak kimutatták, hogy a háztartási 
szennyvíz folyamatos vagy szakaszos hozzáadása gyakran stabilizálja az eleveniszapot és a dönt ő fontosságú jó ülepedési képességet. Ezért háztartási 
szennyvíz alkalmazása ajánlott. Új tétel használata el őtt mindig meg kell 
határozni a szerves közeg DOC vagy COD koncentrációját. A szerves közeg 
savasságát vagy lúgosságát ismerni kell. Ha a szerves közeg nem elég savas vagy lúgos, akkor megfelel ő puffer (nátrium-hidrogén-karbonát vagy 
kálium-dihidrogén-foszfát) hozzáadásával lehet fenntartani a 7,5 ± 0,5 körüli 
pH-értéket a leveg őztető edényben a vizsgálat során. Minden esetben egyedi 
alapon kell meghatározni, hogy mikor és mennyi puffert kell a szerves közeghez hozzáadni. Keverék folyamatosan vagy szakaszosan történ ő 
adagolása esetén gondoskodni kell arról, például vízzel való hígítás révén, 
hogy a keverék oldott szerves széntartalma (DOC) vagy kémiai 
oxigénigénye (COD) közelít őleg állandó maradjon.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Mesterségesen készített szennyvíz  
28. Csapvízben oldjunk fel literenként 160 mg peptont, 110 mg húskivonatot, 
30 mg karbamidot, 28 mg dikálium-hidrogénfoszfátot (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
nátrium-kloridot (NaCl), 4 mg kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl  2 .2H  2 O) és 
2 mg magnézium-szulfát-heptahidrátot (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Ezzel az OECD 
által meghatározott és példaként megadott módszerrel körülbelül 100 mg/l átlagos DOC-koncentrációjú befolyó szennyvíz készíthet ő. Alternatívaként 
alkalmazható más összetétel is, amely hozzávet őleg hasonló, a valódi 
szennyvízéhez közelebb álló DOC-koncentrációt eredményez. Ha kisebb 
töménység ű befolyó szennyvízre van szükség, akkor a mesterségesen készí ­
tett szennyvizet hígíthatjuk csapvízzel – például 1:1 arányban, amelynek 
segítségével 50 mg/l körüli koncentrációt érhetünk el. Mivel a hígabb 
szennyvíz alkalmazása el ősegíti a nitrifikáló organizmusok szaporodását, a 
nitrifikáló szennyvíztisztító telepek szimulációjának vizsgálata esetén ezt a módosítást el kell végezni. Desztillált vízzel kevert m űszennyvíz koncentrá ­
tumot is készíthetünk, amely 1 °C h őmérsékleten egy hétig tárolható. 
Felhasználás el őtt hígítsuk csapvízzel. (Bár ez a közeg nem teljesen 
megfelelő, például a nitrogén koncentrációja túl magas, míg a széntartalom 
viszonylag alacsony, a foszfát puffer hozzáadásán és a pepton tartalom 
növelésén kívül jobb javaslat eddig nem született).
 
Háztartási szennyvíz  
29. Elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telepr ől szár­
mazó, naponta frissen gy űjtött, ülepített szennyvizet használjunk. A durva 
részecskékt ől jobbára mentes szennyvizet az els ődleges ülepítést megel ő­
zően, az els ődleges ülepít őtartály túlfolyójából vagy az eleveniszapos 
üzem betáplálási pontjáról kell gy űjteni. A szennyvíz felhasználás el őtt 
több (általában legfeljebb hét) napig tárolható 4 °C h őmérsékleten, ameny ­
nyiben bizonyítható, hogy a DOC-koncentráció (vagy a COD) nem csökken jelentős mértékben (azaz legalább 20 %-kal) a tárolás során. Új tétel hasz ­
nálata előtt mindig be kell állítani a DOC-koncentrációt (vagy a COD-t) egy 
megfelelő állandó értékre, például csapvíz hozzáadásával, hogy a vizsgálat 
során minél kisebb zavar keletkezzen.
 
Eleveniszap  
30. Az oltóanyagként használt eleveniszapot egy els ősorban háztartási szenny ­
vizet kezel ő, megfelel ően üzemeltetett szennyvíztisztító telep vagy laborató ­
riumi méret ű eleveniszapos berendezés leveg őztető tartályából gy űjtsük.  
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai  
31. A megfelel ően oldható vegyi anyagok törzsoldatait ionmentesített víz vagy a 
mesterségesen készített szennyvíz ásványi összetev őjének felhasználásával 
készítjük el a megfelel ő koncentrációban (például 1-5 g/l). (Az oldhatatlan 
és illékony vegyi anyagokra vonatkozóan lásd az 5. függeléket.) Határozzuk meg a törzsoldat DOC és összes szerves szén (TOC) tartalmát, és a kés őb­
biekben minden új tételnél ismételjük meg a mérést. Ha a DOC és a TOC 
különbsége nagyobb, mint 20 %, akkor ellen őrizzük a vizsgált vegyi anyag 
vízoldékonyságát. A visszanyerési arány megfelel őségének ellen őrzéséhez 
(általában > 90 % várható) hasonlítsuk össze a DOC-tartalmat vagy a vizs ­
gált vegyi anyag törzsoldat specifikus analízisével meghatározott koncentrá ­
cióját a névleges értékkel. Különösen diszperziók esetén kell ellen őrizni, 
hogy a DOC használható analitikai paraméter, vagy csak a vizsgált vegyi anyagra specifikus analitikai módszert lehet alkalmazni. Diszperzió haszná ­
lata esetén a mintákat centrifugálni kell. Minden új tételre vonatkozóan meg 
kell határozni az oldott szerves széntartalmat, a kémiai oxigénigényt, illetve 
– specifikus analízissel – a vizsgált vegyi anyag tartalmat.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Határozzuk meg a törzsoldat pH értékét. A széls őséges értékek azt jelzik, 
hogy a vegyi anyag hozzáadása hatással lehet az eleveniszap pH értékére a 
vizsgálati elrendezésben. Ebben az esetben kis mennyiség ű szervetlen sav 
vagy bázis segítségével semlegesíthetjük a törzsoldatot, azaz a pH értéket 7 ± 0,5-re állíthatjuk be, ügyelve arra, hogy elkerüljük a vizsgált vegyi anyag 
kicsapódását.
 
ELJÁRÁS  
33. Az itt leírt eljárás eleveniszapos berendezés használata esetén alkalmazandó; 
„lyukacsos edény” használata esetén kis mértékben módosítani kell.  
Az oltóanyag el őkészítése  
34. A vizsgálat kezdetén eleveniszapot vagy kisszámú mikroorganizmust hasz ­
nálunk oltóanyagként a vizsgálati elrendezésben. Az oltóanyagot a felhasz ­
nálás előtt megfelel ő szellőzést biztosítva szobah őmérsékleten kell tartani, és 
24 órán belül fel kell használni. Az els ő esetben egy f őként háztartási 
szennyvizet fogadó, jól m űködő biológiai szennyvíztisztító telep vagy labo ­
ratóriumi szennyvíztisztító berendezés leveg őztető tartályából 
eleveniszap-mintát veszünk. Nitrifikáló feltételek szimulálása esetén nitrifi ­
káló szennyvíztisztító telepr ől származó mintát kell használni. Meghatá ­
rozzuk a lebeg őanyag koncentrációt, és szükség esetén ülepítéssel tömé ­
nyítjük az iszapot, hogy a lehet ő legkisebb mennyiséget kelljen a vizsgálati 
elrendezésben használni. A szárazanyag kezdeti koncentrációját 2,5 g/l-re 
kell beállítani.  
35. A második esetben háztartási szennyvizet fogadó biológiai szennyvíztisztító 
telep elfolyó vizét használjuk oltóanyagként 2–10 ml/l koncentrációban, amelyhez érdemes különféle más forrásokból – például felszíni vizekb ől – 
származó oltóanyagokat hozzáadni, hogy minél több különböz ő baktériumfaj 
legyen jelen. Ebben az esetben az eleveniszap a vizsgálati elrendezésben jön létre és képz ődik.
 
A szerves közeg adagolása  
36. A vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat alatt mindvégig gondoskodjunk 
arról, hogy a befolyó szennyvizet és az elfolyó vizet tartalmazó tartályok és a befolyó szennyvizet tartalmazó edényekb ől kivezető, illetőleg az elfolyó 
vizet tartalmazó edényekbe bevezet ő csövek mindig alaposan meg legyenek 
tisztítva, hogy ne alakulhassanak ki rajtuk mikrobatenyészetek. A vizsgálati 
elrendezést szabályozott (általában 20–25 °C) h őmérséklet ű helyiségben kell 
felállítani, vagy vízköpenyes vizsgálati berendezéseket kell alkalmazni. Készítsünk elegend ő mennyiséget a szükséges szerves közegb ől (27–29. 
bekezdés). Töltsük fel a leveg őztető edényt és a szeparátort a szerves közeg ­
gel, majd adjuk hozzá az oltóanyagot (34–35. bekezdés). Indítsuk el a levegőztetést úgy, hogy az iszapot szuszpenzióban és aerob körülmények 
között tartsuk, majd kezdjük meg a befolyó szennyvíz adagolását, valamint a 
leülepedett iszap visszavezetését. A vizsgálati és a kontrollberendezésekben 
a szerves közeget a tárolóedényb ől a leveg őztető edénybe kell adagolni 
(20–21. bekezdés), az elfolyó vizet pedig hasonló tárolóedényekben kell 
felfogni. A 6 órás szokásos hidraulikus tartózkodási id ő eléréséhez 0,5 l/h 
sebességgel kell a szerves közeget pumpálni. A sebesség beállításához az adagolt szerves közeg napi mennyiségét úgy mérjük, hogy figyeljük a tárolóedényekben található mennyiség csökkenését. A vegyi anyagok szaka ­
szos kiengedése vagy a sokkszer ű terhelés hatásainak meghatározásához más 
adagolási módszer szükséges.
 
37. Ha a szerves közeget 1 napnál hosszabb ideig tartó használatra készítjük, 
körülbelül 4 °C h őmérsékletre kell h űteni, vagy más tartósítási módszert kell 
alkalmazni a mikroorganizmusok szaporodásának és a vizsgálati berende ­
zésen kívüli biológiai lebomlás megakadályozására (29. bekezdés). Mester ­
ségesen készített szennyvíz használata esetén tömény (példáulpéldául 10- 
szeres töménység ű) törzsoldat készíthet ő (28. bekezdés), amelyet körülbelül 
4 °C hőmérsékleten lehet tárolni. Ezt a törzsoldatot használat el őtt megfelel ő 
mennyiség ű csapvízzel jól el kell keverni; alternatívaként közvetlenül a 
készülékbe adagolható, miközben a megfelel ő mennyiség ű csapvíz adago ­
lása külön történik.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
A vizsgált vegyi anyag adagolása  
38. A vegyi anyag törzsoldatából (31. bekezdés) töltsünk megfelel ő mennyiséget 
a befolyó szennyvizet tartalmazó tárolóedénybe, vagy adagoljuk közvetlenül a levegőztető edénybe egy külön adagolópumpa segítségével. A vizsgálat 
során a befolyó szennyvíz szokásos átlagos DOC-koncentrációját 10 mg/l és 
20 mg/l közötti értékre kell beállítani, a maximális koncentráció pedig nem haladhatja meg az 50 mg/l értéket. Ha a vizsgált vegyi anyag vízben rosszul oldódik, vagy toxikus hatásai lehetnek, akkor a DOC-koncentrációt 5 mg/l- 
re vagy annál alacsonyabb értékre csökkenthetjük, amennyiben létezik 
megfelelő specifikus analitikus módszer, és azt el is végeztük (a vízben 
rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagból készített diszperzió adagolásának 
speciális módszereit lásd az 5. függelékben).
 
39. A vizsgált vegyi anyag adagolásának megkezdése el őtt meg kell várni, amíg 
a rendszer állapota stabilizálódik, és a szerves közegb ől történő 
DOC-eltávolítás hatékonysága eléri a megfelel ő szintet (kb. 80 %). A vizs ­
gált vegyi anyag hozzáadása el őtt ellenőrizni kell, hogy valamennyi beren ­
dezés egyforma hatékonysággal üzemel; ellenkez ő esetben a különböz ő 
iszapok összekeveredhetnek, és egyenl ő mennyiség kerülhet vissza az 
egyes berendezésekbe. Ha (kb.) 2,5 g/l (száraz tömeg) eleveniszapot tartal ­
mazó oltóanyagot használunk, akkor a vizsgált vegyi anyag adagolását már a vizsgálat megkezdésekor el lehet indítani, mivel a kezdett ől fogva növekv ő 
mennyiségben történ ő közvetlen adagolás azzal az el őnnyel jár, hogy az 
eleveniszap jobban tud alkalmazkodni a vizsgált vegyi anyaghoz. A vizsgált vegyi anyag hozzáadásának módjától függetlenül ajánlott rendszeres id őkö­
zönként ellen őrizni az áramlási sebességet és/vagy a tárolóedény(ek)ben 
lévő mennyiségeket.
 
Az eleveniszap kezelése  
40. Az alkalmazott oltóanyagtól függetlenül az eleveniszap lebeg őanyag- 
koncentrációja – a szerves közeg min őségétől és töménységét ől, az üzemi 
feltételekt ől, a jelen lév ő mikroorganizmusok természetét ől, valamint a vizs ­
gált vegyi anyag hatásától függ ően – az 1–3 g/l (száraz tömeg) tartományon 
belül stabilizálódik a vizsgálat során.  
41. Hetente vagy gyakrabban vagy meg kell határozni a lebeg őanyag-koncent ­
rációt a leveg őztető edényekben és a fölös iszap megfelel ő hányadát el kell 
távolítani úgy, hogy a koncentráció folyamatosan 1 g/l és 3 g/l (száraz 
tömeg) között maradjon, vagy pedig gondoskodni kell arról, hogy az átlagos iszapkor értéke állandó – általában 6–10 nap –legyen. Így például 8 napos iszaptartózkodási id ő esetén az eleveniszap 1/8-át kell minden nap eltávolí ­
tani a leveg őztető edényből és megsemmisíteni. Ezt a m űveletet naponta, 
vagy, ami el őnyösebb, egy szakaszos üzem ű automata szivattyú segítségével 
kell elvégezni. A lebeg őanyag-koncentráció állandó szinten vagy egy sz űk 
tartományon belül tartása önmagában nem biztosítja, hogy az iszaptartózko ­
dási idő (SRT) – a vizsgált vegyi anyag elfolyó vízben mért koncentrációját 
meghatározó üzemi változó – értéke is állandó lesz.
 
42. A vizsgálat id őtartama alatt naponta vagy gyakrabban el kell távolítani és 
újra kell szuszpendálni a leveg őztető edény és a szeparátor falára tapadt 
iszapot. A biofilmképz ődés megakadályozása érdekében a csöveket és a 
vezetékeket rendszeresen ellen őrizni és tisztítani kell. A leülepedett iszapot 
lehetőleg szakaszos szivattyúzással áramoltassuk vissza a szeparátorból a 
levegőztető edénybe. A „lyukacsos edény” elrendezésben nem történik 
visszaáramoltatás, de ebben az esetben is gondoskodni kell arról, hogy a 
belső edényt tisztára cseréljük, miel őtt túlzottan megtelik (21. bekezdés).  
43. Husmann-berendezés alkalmazása esetén el őfordulhat, hogy rossz ülepedést 
és iszapveszteséget tapasztalunk. Ezek az alább felsorolt intézkedések legalább egyikének a vizsgálati és a kontroll berendezésnél történ ő egyidejű 
végrehajtásával orvosolhatók:
 
— Rendszeres id őközönként – például hetente – alkalmazzunk adalékként 
friss eleveniszapot vagy derít őszert (például edényenként 2 ml 50 g/l 
FeCl  3 ) de vigyázva, hogy a vizsgált vegyi anyag ne csapódjon ki vagy 
lépjen reakcióba a FeCl  3 -dal. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— Cseréljük ki a légpumpát perisztaltikus pumpára. Ezzel lehet ővé tesszük, 
hogy az iszap-visszaáramlás sebessége közel egyenl ő legyen az alkalma ­
zandó szennyvíz-beáramlási sebességgel, és anaerob zóna alakulhasson ki a leülepedett iszapban (a légpumpa geometriája a befolyó áramlási sebesség körülbelül 12-szeresére korlátozza az iszap-visszaáramoltatás 
minimális sebességét),
 
— Pumpáljuk szakaszosan az iszapot a szeparátorból a leveg őztető 
edénybe (például óránként 1–1,5 l visszaáramoltatásához 2,5 órán ­
ként 5 percig).  
— A habképz ődés miatti veszteség megel őzése érdekében használjunk 
nem toxikus habzásgátlót (például szilikonolaj) minimális koncentrá ­
cióban.  
— Rövid, lökésszer ű hullámokban fúvassunk keresztül leveg őt a szepa­
rátorban lév ő iszapon (például óránként 10 másodpercig).  
— Adagoljuk szakaszosan a szerves közeget a leveg őztető edénybe 
(például óránként 3–10 percig).  
Mintavétel és analízis  
44. Rendszeres id őközönként mérni kell a leveg őztető edényben lév ő iszap 
oldott oxigén koncentrációját, h őmérsékletét és pH-értékét. Gondoskodjunk 
arról, hogy mindig elegend ő oxigén álljon rendelkezésre (> 2 mg/l), és a 
hőmérséklet az el őírt tartományon belül legyen (általában 20–25 °C). A 7,5 
± 0,5 pH-érték fenntartásához adagoljunk kis mennyiség ű szervetlen bázist 
vagy savat a leveg őztető edénybe vagy a befolyó szennyvízhez, illetve 
növeljük a szerves közeg pufferkapacitását (lásd a 27. bekezdést). Nitrifi ­
káció esetén sav keletkezik: 1 mg N oxidációjának a terméke körülbelül 7 mg CO
 3 – dal egyenérték ű. A mérés gyakorisága, amely a napi és a heti 
mérés között mozoghat, a mérni kívánt paramétert ől és a rendszer stabilitá ­
sától függ.  
45. Mérni kell a kontroll és az ellen őrző berendezések befolyó szennyvízének 
DOC vagy COD értékét. A vizsgált vegyi anyag koncentrációját a vizs ­
gálathoz használt befolyó szennyvízben specifikus analízissel vagy a törzs ­
oldat koncentrációja (31. bekezdés), a felhasznált mennyiség és a vizsgálati 
berendezésbe adagolt szennyvíz mennyisége alapján történ ő becsléssel kell 
meghatározni. A koncentrációra vonatkozó adatok variabilitásának csökken ­
tése érdekében a vizsgált vegyi anyag koncentrációját is ajánlott kiszámítani.  
46. A gy űjtött elfolyó vízb ől vett megfelel ő mintákat (például 24 órás összetett 
minták) 0,45 μm lyukátmér őjű membránsz űrőn át kell sz űrni vagy körül ­
belül 15 percig kb. 40 000 m/s  2 intenzitással centrifugálni kell. Centrifugá ­
lást akkor kell alkalmazni, ha a sz űrés problémás. A DOC vagy COD 
meghatározását a teljes biológiai lebonthatóság méréséhez legalább egyszer 
meg kell ismételni, az els ődleges biológiai lebonthatóság méréséhez pedig – 
amennyiben ez szükséges – a vizsgált vegyi anyagra specifikus analízissel kell végezni
 
47. A COD alkalmazása csak akkor ajánlott, ha a vizsgálat során elég nagy 
koncentrációt (kb. 30 mg/l) használunk, mivel alacsony koncentrációk esetén 
analitikai nehézségeket okozhat. Er ősen adszorbeálódó vegyi anyagok esetén 
ajánlott továbbá a vegyi anyagra specifikus analitikai módszert alkalmazni az adszorbeált vegyi anyag mennyiségének mérésére az iszapban.
 
48. A mintavétel gyakoriságát a vizsgálat várható id őtartama határozza meg. 
Heti három mintavétel javasolt. Ha a berendezések már hatékonyan üzemel ­
nek, akkor a vizsgált vegyi anyag bevezetését követ ően egytől legfeljebb hat 
hétig tartó id őszak szükséges az alkalmazkodáshoz és az állandósult állapot 
eléréséhez. Lehet őség szerint 15 érvényes értéket kell gy űjteni az általában 3 
hétig tartó állandósult állapot (59. bekezdés) id őszaka alatt ahhoz, hogy a 
vizsgálat eredménye értékelhet ő legyen. A vizsgálatot akkor lehet befejezni, 
ha sikerült elérni a megfelel ő lebomlási fokot (például > 90 %), és rendel ­
kezésre áll ez a 15 érték, amely a 3 hetes id őszak munkanapjaira es ő 
analízisek eredményét képviseli. Általában törekedni kell arra, hogy a vizs ­
gált vegyi anyag adagolásának megkezdését követ ően a vizsgálat legfeljebb 
12 hétig tartson.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Nitrifikáló iszap és a vegyi anyag nitrifikációra gyakorolt hatásai vizsgálata 
esetén hetente legalább egyszer kell a vizsgálati és a kontroll berendezés 
elfolyó vizéb ől vett minták ammónium és/vagy nitrit-nitrát analízisét elvé ­
gezni.  
50. Minden analízist – különösen a nitrogén meghatározását – a mintavételt 
követő lehető legkorábbi id őpontban kell elvégezni. Ha az analízist kés őbbre 
kell halasztani, akkor a mintákkal teletöltött, szorosan lezárt üvegeket körül ­
belül 4 °C h őmérsékleten, sötétben kell tárolni. 48 óránál hosszabb ideig 
történő tárolás esetén a mintákat mélyh űtéssel, sal (például literenként 10 ml 
400 g/l töménység ű kénsavoldat hozzáadásával) vagy megfelel ő toxikus 
anyag (például literenként 20 ml 10 g/l töménység ű higany (II)-klorid-oldat) 
hozzáadásával kell tartósítani. A tartósítási módszer nem befolyásolhatja az analízis eredményét.
 
Kapcsolt vizsgálati berendezések alkalmazása  
51. Kapcsolt berendezések alkalmazása (3. függelék) esetén a vizsgálati beren ­
dezés és a hozzá tartozó kontroll berendezés leveg őztető edényei között 
naponta cseréljünk ki azonos mennyiség ű eleveniszapot (háromliteres leve ­
gőztető edény esetén 1 500 ml-b ől 150 ml-t). Ha a vizsgált vegyi anyag 
erősen adszorbeálódik az iszapon, akkor csak a szeparátorok felülúszó folya ­
dékát kell kicserélni. A vizsgálati eredmények kiszámításához mindkét esetben egy korrekciós tényez őt kell használni (55. bekezdés).
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
52. A vizsgált vegyi anyag DOC vagy COD csökkenésének százalékos értékét a 
következő képlettel számítjuk ki az adott id őpontokban történ ő értékeléshez:  
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
ahol:  
D t = %-os DOC vagy COD csökkenés a t id őpontban  
C s = a vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható, lehet őleg a törzsoldat 
alapján becsült befolyó DOC vagy COD, (mg/l)  
E = a vizsgálati berendezés elfolyó vízében mért DOC vagy COD a t 
időpontban (mg/l)  
E o = a kontroll berendezés elfolyó vízében mért DOC vagy COD a t 
időpontban (mg/l)  
53. A kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg DOC vagy COD csökkené ­
sének foka hasznos információt nyújt az eleveniszap vizsgálat során megfigyelhet ő biológiai lebontó képességének az értékeléséhez. A száza ­
lékos lebomlás az alábbi képletb ől számítható ki:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
ahol:  
D B = a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg %-os DOC vagy COD 
csökkenése a t id őpontban  
C M = a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg befolyó DOC vagy 
COD értéke (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Igény szerint a vizsgálati berendezésbe adagolt szerves közegnek és vizsgált 
vegyi anyagnak tulajdonítható százalékos DOC vagy COD csökkenés is 
kiszámítható a következ ő képletből: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
ahol:  
D T = összes %-os DOC vagy COD csökkenés a vizsgálati berendezésben  
C T = összes befolyó vagy törzsoldatokból számított DOC vagy COD a 
vizsgálati berendezésben  
54. Amennyiben specifikus analitikai módszerrel mérjük a vizsgált vegyi anyag 
eltávolítását, a következ ő képlettel számítjuk ki a vizsgált vegyi anyag 
lebomlását:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
ahol:  
D ST = a vizsgált vegyi anyag els ődleges lebomlási %-a t id őpontban  
S i = a vizsgált vegyi anyag mért vagy becsült koncentrációja a vizsgálati 
berendezés befolyó szennyvízében (mg/l)  
S e = a vizsgált vegyi anyag mért koncentrációja a vizsgálati berendezés 
elfolyó vízében a t id őpontban (mg/l)  
55. Kapcsolt üzemmód esetén a leveg őztető edényben lév ő vizsgált vegyi anyag 
iszapcserével történ ő hígításának ellensúlyozására korrekciós tényez őt kell 
alkalmazni (lásd 3. függelék). 6 órás átlagos hidraulikus tartózkodási id ő és 
a levegőztető edényben lév ő eleveniszap felének kicserélése esetén az alábbi 
képletet alkalmazva korrigálni kell a meghatározott napi lebomlási értékeket 
(D t , 52. bekezdés) ahhoz, hogy a vizsgált vegyi anyag valódi lebomlását 
(D tc ) megállapíthassuk:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
A vizsgálati eredmények bemutatása  
56. A D  t (vagy D  tc ) és D  st százalékos lebomlást az id ő függvényében ábrázoljuk 
(lásd 2. függelék). A vizsgált vegyi anyag vagy az oldott szerves szén bomlását mutató görbe alakjából az eltávolítási folyamatra vonatkozó követ ­
keztéseket lehet levonni.
 
Adszorpció  
57. Ha egy vizsgált vegyi anyag esetében a vizsgálat kezdetét ől fogva nagyfokú 
DOC-csökkenés figyelhet ő meg, akkor a vizsgált vegyi anyag lebomlása 
valószínűleg az eleveniszapban található szilárd anyagokon való adszorbeá ­
lódásának köszönhet ő. Ezt az adszorbeált vizsgált vegyi anyag specifikus 
analízissel történ ő meghatározásával lehet bizonyítani. Az adszorbeálható 
vegyi anyagok DOC-csökkenése általában nem marad mindvégig nagyfokú 
a vizsgálat során; a kezdetben tapasztalható nagyfokú eltávolítás rendszerint fokozatosan csökken, majd eléri az egyensúlyi értéket. Ha azonban az adszorbeálható vegyi anyag valamilyen módon a mikrobapopuláció akklima ­
tizálódását okozza, a vizsgált vegyi anyag DOC-csökkenése a kés őbbiekben 
növekszik, majd egy magas értéken állandósul.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Alkalmazkodási fázis  
58. A statikus sz űrővizsgálatokhoz hasonlóan a biológiai lebontást számos vizs ­
gált vegyi anyag esetében egy alkalmazkodási fázis el őzi meg. Az alkal ­
mazkodási fázisban a lebontó baktériumok akklimatizálódnak vagy alkal ­
mazkodnak, és szinte egyáltalán nem figyelhet ő meg a vizsgált vegyi 
anyag eltávolítása; ezt a baktériumok szaporodásának kezdeti id őszaka 
követi. Miután ez a szakasz véget ért, a lebontó fázis kezdetének azt az időpontot tekintjük, amikor a vizsgált vegyi anyag kezdeti mennyiségének 
körülbelül 10 % százaléka kerül eltávolításra (figyelembe véve az esetleges 
adszorpciót). Az alkalmazkodási fázis általában rendkívül változatos és kevéssé reprodukálható.
 
Állandósult állapot  
59. Egy folyamatos vizsgálat során a bomlási görbe állandó szakasza azt a fázist 
jelöli, amikor a legnagyobb fokú lebontás figyelhet ő meg. Az állandósult 
állapotnak legalább 3 hétig kell tartania, és körülbelül 15 mért értéknek kell tartoznia hozzá.
 
A vizsgált vegyi anyag átlagos lebomlási foka  
60. Számítsuk ki a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó D  t lebom­
lási értékeinek számtani közepét, majd kerekítsük a legközelebbi egész számra (1 %). Ez lesz a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka. A számtani 
közép 95 %-os konfidencia intervallumát is ajánlott kiszámítani.
 
A szerves közeg lebomlása  
61. A kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg százalékos DOC vagy COD 
csökkenését az id ő függvényében ábrázoljuk (D  B ). Az átlagos lebomlási 
fokot ugyanúgy határozzuk meg, mint a vizsgált vegyi anyag esetében 
(60. bekezdés).  
A biológiai lebontás jele  
62. Ha a vizsgált vegyi anyag nem adszorbeálódik jelent ős mértékben az eleve ­
niszapon, és a bomlási görbe a biológiai bomlási görbére jellemz ő tipikus 
alakot mutatja (alkalmazkodási fázis, lebontó fázis, állandósult állapot) (58–59. bekezdés), a mért csökkenést biztonsággal lehet a biológiai lebon ­
tásnak tulajdonítani. Ha kezdetben nagyfokú eltávolítás figyelhet ő meg, a 
szimulációs vizsgálat nem tud különbséget tenni a biológiai és a nem bioló ­
giai bomlási folyamatok között. Ebben az esetben és minden más esetben, amikor a biológiai lebontással kapcsolatban kétségek merülnek fel (például sztrippelés esetén), analizálni kell az adszorbeált vizsgált vegyi anyagot, 
vagy a biológiai folyamatokra egyértelm űen utaló paramétereken alapuló 
kiegészítő statikus biológiai lebonthatósági vizsgálatokat kell végezni. 
Ilyenek például az oxigénfelvételt vizsgáló módszerek (az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő D, E és F módszerek (6)), a széndioxid képz ődést mérő 
vizsgálat (az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő C módszer (6)) vagy a 
gőztér CO
 2 -tartalmának ISO szabvány szerinti vizsgálata (18), amelyhez a 
szimulációs vizsgálatból származó, a vizsgált vegyi anyagnak már kitett oltóanyagot használunk. Ha a DOC-eltávolítást és az adott vegyi anyag 
eltávolítását is mértük, az eltávolítási százalékok jelent ős különbsége (az 
előbbi alacsonyabb, mint az utóbbi) olyan szerves köztes termékek jelenlé ­
tére utal az elfolyó vízben, amelyek nehezebben lebonthatók lehetnek, mint 
a kiindulási vegyi anyag.
 
A vizsgálati eredmények érvényessége  
63. Az oltóanyag szokásos biológiai lebonthatóságára a szerves közeg kontroll 
berendezésben (53. bekezdés) megfigyelhet ő lebomlási fokából lehet követ ­
keztetni. A vizsgálatot akkor tekintjük érvényesnek, ha a DOC vagy COD 
csökkenés foka a kontroll berendezés(ek)ben két hét elteltével meghaladja a 
80 %-ot, és semmilyen szokatlan jelenséget nem figyeltünk meg.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Gyorsan lebontható (referencia) vegyi anyag használata esetén a biológiai 
lebomlás fokának (D  t , 52. bekezdés) nagyobbnak kell lennie, mint 90 %.  
65. Nitrifikáló feltételek mellett végzett vizsgálat esetén az átlagos elfolyó 
ammónia-N és nitrit-N koncentráció nem érheti el az 1 mg/l, illetve a 2 
mg/l értéket.  
66. Ha ezek a követelmények (63–65 bekezdés) nem teljesülnek, akkor a vizs ­
gálatot más forrásból származó oltóanyaggal meg kell ismételni, el kell 
végezni egy referencia-vegyianyag vizsgálatát, és valamennyi kísérleti eljá ­
rást ellen őrizni kell.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
67. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— azonosító adatok,  
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok.  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgálati elrendezés típusa, oldhatatlan és illékony vegyi anyagok 
vizsgálata esetén szükséges módosítások,  
— a szerves közeg típusa,  
— a szennyvízben található ipari szennyvizek aránya és jellege, ha ismert,  
— az oltóanyag és jellege, a mintavétel helye(i), az alkalmazott koncent ­
ráció és esetleges el őkezelés,  
— a vizsgált vegyi anyag törzsoldata, DOC és TOC tartalom, szuszpenzió 
esetén az elkészítés módja, a vizsgálathoz használt koncentráció, 10-20 
mg/l tartományon kívül es ő DOC-koncentráció okai; a hozzáadás 
módszere és els ő időpontja, az esetleges változtatások,  
— átlagos iszapkor és átlagos hidraulikus tartózkodási id ő, iszapelvétel 
módja, iszapduzzadás, iszapveszteség stb. elkerülésének módszerei,  
— alkalmazott analitikai módszerek,  
— vizsgálati h őmérséklet,  
— iszapduzzadás jellemz ői, iszapvolumen index (SVI), eleveniszap lebeg ő­
anyag koncentrációja (MLSS),  
— a szabványos eljárásoktól való bármely eltérés és az eredményeket eset ­
legesen befolyásoló körülmények.  
Vizsgálati eredmények:  
— mért adatok (DOC, COD, specifikus analízis, pH, h őmérséklet, oxigén ­
koncentráció, lebeg őanyag koncentráció, N-vegyületek , ha releváns,  
— D  t (vagy D  tc ), D  B , D  St számított értékei táblázatos formában és a 
bomlási görbék,  
— az alkalmazkodási fázisra és az állandósult állapotra vonatkozó informá ­
ciók, a vizsgálat id őtartama, a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka és a 
szerves közeg lebomlási foka a kontroll berendezésben, statisztikai adatokkal és a biológiai lebonthatóságra valamint a vizsgálat érvényes ­
ségére vonatkozó megállapításokkal kiegészítve,
 
— az eredmények szöveges elemzése.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
SZAKIRODALOM  
(1) Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
(2) German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents 
in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.  
(3) Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
 
(4) Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. 
Res. 12: 909-915.  
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) E melléklet C.4. fejezete: A „gyors” biológiai lebonthatóság meghatározása.  
(7) E melléklet C.12. fejezete: Biológiai lebomlás – módosított 
SCAS-vizsgálat.  
(8) E melléklet C.19. fejezete: Adszorpciós együttható (K  OC ) becslése talajon 
és szennyvíziszapon nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC).  
(9) Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157-173.
 
(10) Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conc ­
lusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
(11) Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(12) ISO 11733 (1995; felülvizsgált szöveg 2004). Szerves vegyületek eltávolí ­
tásának és biológiai lebonthatóságának meghatározása vizes közegben. Eleveniszapos szimulációs teszt.
 
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33–48.  
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340–343.  
(15) Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
 
(16) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214–220.  
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 
91–98 ISBN 011 751661 9.  
(18) ISO 14593 (1998). Vízmin őség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai 
lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szer ­
vetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
1. függelék  
1. ábra  
A biológiai lebonthatóság értékelésére szolgáló készülék  
Husmann-berendezés
  
A. Tárolóedény  
B. Adagolópumpa  
C. Leveg őztető kamra (térfogat: 3 l)  
D. Ülepít őedény  E. Légpumpa  
F. Gyűjtőedény  
G. Leveg őztető 
H. Légáramlásmér ő 
2. ábra  
A biológiai lebonthatóság értékelésére szolgáló készülék  
Lyukacsos edény
  
A. Tárolóedény  
B. Adagolópumpa  
C. Lyukacsos leveg őztető edény  
D. Nem átereszt ő anyagú küls ő edény  E. Gyűjtőedény  
F. Porlasztók ő 
G. Légáramlásmér ő ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
3. ábra  
A háromliteres lyukacsos leveg őztető edény részletes rajza
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
2. függelék Á  
Bomlási görbe példája
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
3. függelék  
[TÁJÉKOZTATÓ INFORMÁCIÓK]  
KAPCSOLT BERENDEZÉSEK ALKALMAZÁSA  
Az iszapcsere célja, hogy megpróbáljuk kiegyenlíteni az iszapokban kialakuló 
mikrobapopulációk nagyságát a vizsgálati berendezésben, amelybe a vizsgált 
vegyületet tartalmazó szennyvizet adagolunk, valamint a kontroll berendezésben, amelybe csak szennyvizet töltünk. (1). Az eljárás a „kapcsolt berendezések alkal ­
mazása” nevet kapta, a módszer pedig „kapcsolt üzemmódként” ismert. Az eljá ­
rást eredetileg eleveniszapos Husmann-berendezésekkel alkalmazták, de a „lyu ­
kacsos edény” elrendezésben is sor került már a használatára (2)(3). Mivel a kapcsolt üzemmód sem a Husmann-berendezés, sem a lyukacsos edény esetén nem eredményezett jelent ős eredménybeli eltérést a nem kapcsolt üzemmódhoz 
képest, a kapcsolt berendezések alkalmazásához szükséges id ő és energia befek ­
tetése nem hoz különösebb hasznot.
 
Az iszapcsere következtében látszólag meglehet ősen nagyarányú eltávolítás 
tapasztalható, mivel a vizsgált vegyi anyag egy része is áthelyezésre kerül, és 
ezáltal a vizsgált vegyi anyag koncentrációja közel egyenl ő lesz a vizsgálati és a 
kontroll berendezésben. Ezért korrekciós tényez őt kell használni, amelynek 
értékét a kicserélt mennyiség és az átlagos hidraulikus tartózkodási id ő határozza 
meg. A részletes számítás a szakirodalomban (1) megtalálható.  
A korrigált DOC vagy COD csökkenési fok az általános képlettel számítható ki:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ% 
ahol:  
D tc = korrigált %-os DOC vagy COD csökkenés  
D t = meghatározott %-os DOC vagy COD csökkenés  
a = eleveniszap kicserélt hányada  
r = átlagos hidraulikus tartózkodási id ő (h) 
Például, ha a leveg őztető edény tartalmának felét cseréljük ki (a = 0,5), az átlagos 
hidraulikus tartózkodási id ő pedig 6 óra, akkor korrigált érték kiszámításának 
képlete:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
SZAKIRODALOM  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Kémiai oxigénigény, DOC) in Coupled Units of the 
OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.  
(2) Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Szimulációs vizsgálat. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for 
Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. 
Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
4. függelék  
ELEVENISZAP GÁTLÁS ÉRTÉKELÉSE  
A vizsgált vegyi anyag hatása a folyamatra  
1. Léteznek olyan vegyi anyagok (vagy szennyvizek), amelyek azon túl, hogy 
a szimulációs vizsgálat során nem bomlanak le, illetve távolítódnak el, gátló 
hatást gyakorolnak az iszapban található mikroorganizmusokra. Más vegyi anyagok alacsony koncentrációban biológiailag lebonthatók, nagyobb koncentrációban viszont gátló hatásúak (hormesis). A gátló hatást vagy 
egy korábbi szakaszban már észleltük, vagy a szimulációs vizsgálatban 
alkalmazotthoz hasonló vagy azzal azonos oltóanyaggal végzett toxicitás vizsgálattal állapítható meg (1). Ilyen módszerek az oxigénfogyasztás-gátlás mérése (e melléklet C.11. fejezete (2) és ISO 8192 (3)) vagy az iszapban 
található organizmusok növekedés-gátlásának értékelése (ISO 15522 (4)).
 
2. A szimulációs vizsgálat során a gátlás abból látható, hogy a kísérleti edény 
és a kontroll edény elfolyó oldott szerves szén (DOC) vagy kémiai oxigénigény (COD) értékének különbsége nagyobb, mint a vizsgált vegyi anyag formájában hozzáadott DOC. Másként kifejezve, a vizsgált vegyi 
anyag jelenléte következtében kisebb mérték ű lesz a kezelt szerves közeg 
DOC (és biokémiai oxigénigény (BOD), kémiai oxigénigény (COD), és/vagy NH
 + 4 ) értékének a százalékos csökkenése. Ennek el őfordulása 
esetén ismételt vizsgálatot kell végrehajtani, amelynek során addig a szintig 
kell csökkenteni a vizsgált vegyi anyag koncentrációját, amikor a gátlás 
megszűnik, vagy amíg a vegyi anyag biológiai lebontása bekövetkezik. 
Abban az esetben azonban, ha a vizsgált vegyi anyag (vagy szennyvíz) minden vizsgált koncentrációban hátrányos hatással van a folyamatra, arra 
lehet következtetni, hogy a vegyi anyag biológiai úton nehezen vagy egyál ­
talán nem bontható. Mindazonáltal érdemes a vizsgálatot megismételni más forrásból származó eleveniszappal és/vagy fokozatosabb alkalmazkodást 
engedve az iszapnak.
 
3. Fordított esetben, ha a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlása az els ő 
próbálkozásra bekövetkezik a szimulációs vizsgálat során, akkor növelni kell a koncentrációt annak megállapításához, hogy az esetleges gátló hatás megállapítható legyen.
 
4. A gátlás mértékének meghatározására tett kísérlet során nem szabad elfelej ­
teni, hogy az eleveniszap mikroorganizmus-populációja változhat, azaz 
idővel ellenállóképességet szerezhet a gátló hatású vegyi anyaggal szemben.  
5. A gátlás mértékének kiszámítása:  
A teljes százalékos BOD, DOC, COD stb. csökkenés (R  o ) a vizsgálati és a 
kontroll berendezésben a következ ő képlettel számítható ki:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
ahol:  
I = a vizsgálati és a kontroll berendezés befolyó BOD, DOC, COD stb. 
értéke (mg/l)  
E = a hozzá tartozó elfolyó koncentráció (mg/l).  
Az I és E értéket korrigálni kell a vizsgálati berendezésbe adagolt vizsgált 
vegyi anyagnak tulajdonítható DOC-mennyiséggel, hogy a kiszámított 
százalékos gátlás helyes legyen.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
A vizsgált vegyi anyag jelenlétének tulajdonítható gátlás mértéke a követ ­
kező képlettel számítható ki:  
%gátlás ¼ 100ðR c Ä R t Þ=R c 
ahol:  
R c = százalékos csökkenés a kontroll berendezésekben  
R t = százalékos csökkenés a vizsgálati berendezésekben  
SZAKIRODALOM  
(1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) E melléklet C.11. fejezete: Biológiai lebomlás – eleveniszap-légzésgátlási 
vizsgálat.  
(3) ISO 8192 (2007) Vízmin őség. Az eleven iszap oxigénfogyasztás-gátlásának 
vizsgálata szén- és ammóniumoxidációval.  
(4) ISO 15522 (1999) Vízmin őség. A víz alkotóelemei által az eleven iszap 
mikroorganizmusaira kifejtett gátó hatás meghatározása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
5. függelék  
Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok – illékony vegyi anyagok  
Vízben rosszul oldódó vegyi anyagok  
A vízben rosszul oldódó és oldhatatlan vegyi anyagokkal végzett, szennyvíztisz ­
títást szimuláló vizsgálatok szakirodalma nem túl gazdag (1)(2)(3).  
Nem létezik olyan módszer a vizsgált vegyi anyag eloszlatására, amely vala ­
mennyi oldhatatlan vegyi anyagra alkalmazható lenne. Az ISO 10634 szab ­
ványban (4) leírt négy fajta módszer közül kett ő – az emulgálószer használata 
és/vagy az ultrahangos emulgálás t űnik alkalmasnak arra, hogy a szimulációs 
vizsgálat céljára megkíséreljünk diszperziót készíteni a vizsgált vegyi anyagból. 
A diszperziónak legalább 24 órán keresztül meg kell őriznie a stabilitását. A 
kellőképpen stabilizált diszperziót állandó keverés mellett egy tartályból (38. 
bekezdés) adagoljuk a leveg őztető edénybe a háztartási (mesterségesen készített) 
szennyvízt ől elkülönítve.  
Ha a diszperzió stabil, meg kell vizsgálni, hogy milyen módszert alkalmazhatunk 
a diszpergált vizsgált vegyi anyag meghatározására az elfolyó vízben, az elfolyó víz szilárdanyag-tartalmában és az eleveniszapban. Mivel a DOC általában nem alkalmas paraméter, a vizsgált vegyi anyagra specifikus módszert kell keresni. 
Ezt követ ően meghatározzuk, hogy mi történik a vizsgált vegyi anyaggal az 
eleveniszapos folyamat szimulációjának folyadék és szilárd fázisaiban. A vizsgált vegyi anyag biológiai lebonthatóságát a »tömegegyensúly« alapján ítéljük meg. Ez azonban csak az els ődleges biológiai lebonthatóságot jelzi. A teljes biológiai 
lebonthatóság kimutatását a gyors biológiai lebonthatóság respirométeres módszer 
(az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő C, F vagy D módszer (5)) segítségével 
kísérelhetjük meg, amelyhez a szimulációs vizsgálat során a vizsgált vegyi anyag hatásának már kitett iszapot használunk oltóanyagként.
 
Illékony vegyi anyagok  
A szennyvíztisztítás szimulációk illékony vegyi anyagok esetében történ ő alkal­
mazása egyaránt vitatott és problematikus. Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi 
anyagokhoz hasonlóan az illékony vegyi anyagokkal végzett szimulációs vizs ­
gálatok szakirodalma sem túl gazdag. A tökéletes elegyítésre alkalmas hagyomá ­
nyos berendezésen a következ ő módosításokat hajtjuk végre: a leveg őztető és 
ülepítő tartályokat légmentesen lezárjuk, a leveg őáramlást áramlásmér ő segít­
ségével mérjük és szabályozzuk, az eltávozó gázt az illékony szerves anyagok 
elválasztására szolgáló csapdán vezetjük keresztül. Esetenként az eltávozó gázt egy vákuumpumpa segítségével Tenax és szilikagél töltetet tartalmazó tisztító csapdán vagy h űtött csapdán vezetjük keresztül gázkromatográfia céljára. A csap ­
dázott vizsgált vegyi anyag meghatározásához analitikai módszert használunk.
 
A vizsgálat két részb ől áll. A berendezéseket el őször iszap nélkül üzemeltetjük, 
de a mesterségesen készített szennyvizet és a vizsgált vegyi anyagot a leveg őz­
tető edénybe pumpáljuk. Néhány napon keresztül elemezzük a befolyó és az 
elfolyó vízb ől, valamint az eltávozó gázból vett minták összetételét. A gy űjtött 
adatokból kiszámítható a vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történ ő százalékos 
eltávolítása (R  vs ). 
Ezt követ ően a sztrippelési vizsgálatnál alkalmazottal azonos feltételek mellett 
elvégezzük a szokásos biológiai vizsgálatot (iszappal). A berendezések hatékony működésének ellen őrzése céljából DOC vagy COD méréseket is végzünk. A 
vizsgálat els ő szakaszában alkalomszer űen meghatározzuk a vizsgált vegyi 
anyag jelenlétét a befolyó és az elfolyó vízben, valamint az eltávozó gázban; 
az alkalmazkodási fázist követ ően növeljük az analízisek gyakoriságát. Az állan ­
dósult állapot id őszaka alatt gy űjtött adatokból kiszámítható a vizsgált vegyi 
anyag különféle (fizikai és biológiai) folyamatoknak tulajdonítható összes száza ­
lékos eltávolítása (R
 T ) a folyadékfázisban, valamint a sztrippeléssel eltávolított 
arány (R  V ). ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Számítás:  
a) A vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történ ő százalékos eltávolítása (R  VP ) a 
nem biológiai vizsgálat során a következ ő képlettel számítható ki:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
ahol 
R VP = a vizsgált vegyi anyag illékonyságnak tulajdonítható eltávolítása (%),  
S VP = csapdázott vizsgált vegyi anyag, folyadékfázis koncentráció egyen ­
értékben kifejezve (mg/l),  
S IP = a vizsgált vegyi anyag befolyó koncentrációja (mg/l).  
b) A vizsgált vegyi anyag sztrippeléssel történ ő százalékos eltávolítása (R  V ) a 
biológiai vizsgálat során a következ ő képlettel számítható ki:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
ahol 
R V = a vizsgált vegyi anyag illékonyságnak tulajdonítható eltávolítása (%),  
S V = a biológiai vizsgálat során csapdázott vizsgált vegyi anyag, befolyó- 
folyadékkoncentráció egyenértékben kifejezve (mg/l),  
S I = a vizsgált vegyi anyag befolyó koncentrációja (mg/l).  
c) A vizsgált vegyi anyag különféle folyamatoknak tulajdonítható összes száza ­
lékos eltávolítása (R  T ) a biológiai vizsgálat során:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
ahol 
S E = a vizsgált vegyi anyag befolyó (folyadék) koncentrációja (mg/l).  
d) Következésképpen a biológia lebontással és adszorpcióval történ ő százalékos 
eltávolítás (R  BA ) a következ ő képlettel számítható ki:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Az vizsgált vegyi anyag adszorbeálódásának megállapítására külön vizsgála ­
tokat kell végezni; adszorbeálódás esetén további korrekció szükséges.  
e) A biológiai kezelés vizsgált vegyi anyag légkörbe történ ő kibocsátására 
gyakorolt hatására a biológiai és a nem biológiai vizsgálat során mért, sztrip ­
peléssel történ ő eltávolítási arányok (R  v és R  vp ) összehasonlításából lehet 
következtetni.  
Példa:  Benzol  
Iszaptartózkodási id ő = 4 nap  
Mesterségesen készített szennyvíz; tartózkodási id ő = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Tehát  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % and R  BA = 85 %.  
Feltételezzük, hogy a benzol nem adszorbeálódik az iszapon.  
SZAKIRODALOM  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Vízmin őség. Útmutató a vízben rosszul oldódó szerves 
vegyületek el őkészítésére és kezelésére azok vizes közegben való biológiai 
lebonthatóságának értékeléséhez.  
(5) E melléklet C.4. fejezete: A »gyors« biológiai lebonthatóság meghatározása.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
6. függelék  
Az iszaptartózkodási id ő (SRT) hatása a vegyi anyagok kezelhet őségére  
BEVEZETÉS  
1. A főszövegben ismertetett módszer annak megállapítására szolgál, hogy egy 
vizsgált vegyi anyag (amelyr ől általában tudott, hogy jellegénél fogva bioló ­
giailag lebontható, de nem gyorsan lebontható) biológiailag lebontható-e a szennyvíztisztító telepek korlátai között. Az eredményt százalékos eltávolí ­
tásként vagy százalékos biológiai lebonthatóságként fejezzük ki. Az eleve ­
niszapos berendezések üzemi feltételei és a befolyó szennyvíz típusa 
azonban nagymértékben befolyásolják a vegyi anyag elfolyó koncentráció ­
ját. A vizsgálatok során általában csak egy névleges lebeg őanyag koncent ­
rációt vagy névleges iszaptartózkodási id őt (SRT) veszünk figyelembe, 
holott az SRT értéke az alkalmazott iszapelvételi módszert ől függően napról 
napra, sőt egy napon belül is nagymértékben változhat.
 
2. Ennél a változatnál (1)(2) jóval sz űkebb határok között tartjuk az SRT 
értékét az egyes 24 órás id őszakokon belül (ahogy a nagyméret ű üzemeknél 
is történik), melynek eredményeként az elfolyó koncentráció állandóbb értéket mutat. Háztartási szennyvíz használata ajánlott, mivel egységesebb és magasabb eltávolítási százalékot eredményez. A különböz ő SRT értékek 
hatásai mellett részletesebb vizsgálattal a h őmérséklet bizonyos tartományon 
belüli változásának elfolyó koncentrációra gyakorolt hatásai is meghatároz ­
hatók.
 
3. Még nincs általános egyetértés arról, hogy milyen kinetikai modellel írható 
le a vegyi anyagok szennyvíztisztítási körülmények közötti biológiai lebom ­
lása. Mivel a módszert csak sok tonnára rúgó mennyiségben el őállított és 
ennek következtében a szennyvízben 1 mg/l feletti koncentrációban el őfor­
duló vegyi anyagok esetén történ ő alkalmazásra szánjuk, a baktérium-szapo ­
rodási sebesség szubsztrátumtól való függésének Monod-féle modelljét választottuk a gy űjtött adatok feldolgozására (1)(2). Az egyszer űsített modell 
és az alkalmazott feltevések érvényességének megállapítására különböz ő 
elsődleges biológiai lebonthatósági fokkal rendelkez ő elemekb ől álló 
alkohol-etoxilát sorozatot használtunk (2)(3).
 
Megjegyzés:  A módszernek ez a változata sokban hasonlít a C.10. fejezet A 
részében leírt vizsgálati módszerhez, ezért a következ őkben 
csak az eltéréseket ismertetjük részletesen.  
A VIZSGÁLAT ELVE  
4. Az iszaptartózkodási id ő (SRT vagy θ s ) nagyon pontos szabályozását lehe ­
tővé tevő, (szinte) folyamatos iszapelvételt biztosító »lyukacsos edény« 
típusú eleveniszapos berendezéseket különböz ő SRT és – igény szerint – 
hőmérsékleti értékekkel m űködtetünk nem kapcsolt üzemmódban. Az iszap ­
tartózkodási id őt általában 2–10 nap, a h őmérsékletet 5–20 °C között változ ­
tatjuk. A szennyvizet (lehet őleg háztartási) és a vizsgált vegyi anyag oldatát 
külön adagoljuk a berendezésbe úgy, hogy a kívánt iszaptartózkodási id ő 
(3–6 óra) és befolyó vizsgált vegyi anyag koncentráció biztosított legyen. Az összehasonlítás céljára a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó kontroll 
berendezést m űködtetünk a vizsgálati berendezéssel párhuzamosan.
 
5. Más típusú készülék is használható, de különös gondot kell fordítani arra, 
hogy az SRT jól szabályozható legyen. Például, ülepít ő edénnyel rendelkez ő 
berendezés használata esetén figyelembe kell venni az elfolyó lebeg őanyag 
veszteséget. Különleges óvintézkedéseket kell tenni továbbá az ülepít ő 
edényben lév ő iszapmennyiség eltéréseib ől adódó hibák elkerülése.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Miután a választott üzemi feltételekkel m űködtetett berendezés elérte az 
egyensúlyi állapotot, körülbelül három héten keresztül figyeljük az állandó ­
sult állapothoz tartozó átlagos vizsgált vegyi anyag és – igény szerint – DOC-koncentrációt az elfolyó vízben. A százalékos vizsgált vegyi anyag eltávolítás és – igény szerint – DOC-csökkenés értékelése mellett grafikusan 
ábrázoljuk az üzemi feltételek és az elfolyó koncentráció közötti összefüg ­
gést. Ennek alapján tentatív kinetikai állandókat számíthatunk és meghatá ­
rozhatjuk, hogy milyen feltételek mellett kezelhet ő a vizsgált vegyi anyag.
 
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
7. A C.10. fejezet A részének 12–13. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
MEGFELELÉSI SZINTEK  
8. A C.10. fejezet A részének 14–15. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
9. A C.10. fejezet A részének 16. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHET ŐSÉGE  
10. A C.10. fejezet A részének 17–18. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Készülékek  
11. Megfelel ően módosított lyukacsos edény (6.1. függelék), amely egy 3,2 mm 
vastagságú és kb. 90 μm pórusátmér őjű porózus polietilénb ől, tompavarratos 
hegesztéssel készült bels ő edényből (vagy betétb ől) áll (ez a berendezés 
masszívabb, mint a C.10. fejezet A részének 21. bekezdésében leírt válto ­
zat), amely egy áthatolhatatlan küls ő edényben helyezkedik el. Ez két 
részből áll: egy kerek alaplapból, amelybe két légvezeték és egy iszap 
elvezetésére szolgáló vezeték csatlakoztatására szolgáló lyukakat fúrtunk, 
és egy hengeres tartályból, amelyet csavarok rögzítenek az alaplaphoz, és 
amelynek a kimenete úgy van elhelyezve, hogy a lyukacsos edény térfogata ismert (3 l) legyen. Az egyik légvezetékhez egy porlasztók ő van csatlakoz ­
tatva, a másik vége nyitott, és az edényben elhelyezett porlasztók ővel derék ­
szöget zár be. Ez a rendszer biztosítja a szükséges légáramlást ahhoz, hogy 
az edény tartalma tökéletesen elkeveredjen, és az oldott oxigén koncentráció értéke 2 mg/l felett legyen.
 
12. A megfelel ő számú berendezést 5–20 °C (±1 °C) tartományon belüli szabá ­
lyozott hőmérséklet mellett üzemeltetjük vízfürd őben vagy állandó h őmér­
sékletű helyiségben. A vizsgált vegyi anyag oldatát és az ülepített szenny ­
vizet adagolópumpák segítségével juttatjuk a leveg őztető edénybe a 
megfelelő adagolási sebességet (0–1,0 ml/perc, illetve 0–25 ml/perc) bizto ­
sítva, a leveg őztető edényből történő iszapelvételre pedig egy harmadik 
szivattyút alkalmazunk. Az iszapelvételhez nagyon alacsony áramlási sebes ­
séget kell alkalmazni, amelyet a magasabb sebességre beállított szivattyú 
időkapcsoló segítségével történ ő, szakaszos m űködtetésével érhetünk el: 
például percenként 10 mp üzemid ő esetén a 3 ml/percre beállított átviteli 
teljesítmény 0,5 ml/perc iszapelvételi sebességet biztosít.  
Szűrőkészülék vagy centrifuga  
13. A C.10. fejezet A részének 23. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
Analitikai berendezések  
14. A C.10. fejezet A részének 24. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
Víz ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. A C.10. fejezet A részének 25–26. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
Szerves közeg  
16. A C.10. fejezet A részének 27. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
Mesterségesen készített szennyvíz  
17. A C.10. fejezet A részének 28. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
Háztartási szennyvíz  
18. A C.10. fejezet A részének 29. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
Eleveniszap  
19. A C.10. fejezet A részének 30. bekezdésében foglaltak alkalmazandók.  
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai  
20. A C.10. fejezet A részének 31–32. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
ELJÁRÁS  
Az oltóanyag el őkészítése  
21. A C.10. fejezet A részének 34. bekezdésében foglaltak alkalmazandók azzal, 
hogy csak eleveniszap használható (kb. 2,5 g/l).  
A vizsgálati berendezések száma  
22. Egy egyszer ű vizsgálathoz – például a százalékos eltávolítás méréséhez – 
egyetlen SRT elegend ő, de a kinetikai állandók számításához szükséges 
adatok gy űjtése már 4 vagy 5 SRT alkalmazását igényli. Általában 2–10 
nap közötti értékeket kell választani. Gyakorlati szempontból kényelmes 
megoldás, ha egy h őmérséklet mellett párhuzamosan 4 vagy 5 különböz ő 
iszaptartózkodási id ővel végezzük el a vizsgálatot; míg terjedelmesebb vizs ­
gálatoknál ugyanazokat vagy esetleg más SRT értékeket használunk az 5–20 °C tartományon belüli más h őmérsékletekkel. Az els ődleges biológiai 
lebonthatóság vizsgálatához (a f ő felhasználási terület) általában feltétel- 
rendszerenként egy berendezés elegend ő. A teljes biológiai lebonthatóság 
megítéléséhez azonban minden feltételrendszerhez külön kontroll berendezés szükséges, amelybe csak szennyvizet adagolunk a vizsgált vegyi anyag 
nélkül. Ha feltételezhet ő, hogy a vizsgált vegyi anyag jelen van az alkal ­
mazott szennyvízben, akkor az els ődleges biológiai lebonthatóság értékelé ­
séhez is kell kontroll berendezés, a számítások során pedig el kell végezni a szükséges korrekciókat.
 
A szerves közeg és a vizsgált vegyi anyag adagolása  
23. A C.10. fejezet A részének 36–39. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók, 
de a vizsgált vegyi anyag oldatát külön kell adagolni, és különböz ő isza­
pelvételi arányokat kell alkalmazni. Rendszeresen – például naponta kétszer – ellenőrizzük, hogy a befolyó, az elfolyó és az iszapelvételi sebesség a 
±10 % tűréshatáron belül van, és szükség esetén állítsuk utána az áramlási 
sebességet. Ha háztartási szennyvizet használunk, és az analitikai módszerek alkalmazása során nehézséget tapasztalunk, akkor végezzük el a vizsgálatot mesterségen készített szennyvízzel, de gondoskodjunk arról, hogy az eltér ő 
hordozóanyag ne eredményezzen eltér ő kinetikai adatokat.
 
Az eleveniszapos berendezések kezelése  
24. A C.10. fejezet A részének 40–43. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók, 
de csak az »állandó« iszap-elvétellel szabályozzuk az iszaptartózkodási id őt. 
Mintavétel és analízis  
25. A C.10. fejezet A részének 44–50. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók 
azzal a kivétellel, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációját kell csak 
meghatározni, a DOC meghatározása választható; a COD nem alkalma ­
zandó.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
26. A C.10. fejezet A részének 52–54. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
A vizsgálati eredmények bemutatása  
27. A C.10. fejezet A részének 56–62. bekezdéseiben foglaltak alkalmazandók.  
Kinetikai állandók számítása  
28. A százalékos els ődleges biológiai lebonthatóságnál reálisabb képet nyújt, ha 
a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó átlagos elfolyó koncentrációját adjuk meg, és leírjuk, hogy ez a paraméter hogyan változik az üzemi feltételek függvényében. Ehhez a 6.2. függelékben szerepl ő (6) 
egyenletet használhatjuk, amellyel meghatározható a K
 S , a μ m és a θ SC , azaz 
a kritikus iszaptartózkodási id ő. 
(A másik lehet őség, hogy egy a 2. egyenlettel (6.2. függelék) megadott 
elméleti görbét a kapott kísérleti értékekhez illeszt ő egyszerű számítógépes 
programmal határozzuk meg a K  S és a μ m közelítő értékeit. Bár egyetlen 
megoldás sem lesz egyértelm ű, a K  S és μ m elfogadható közelítését adja.)  
A vizsgálati eredmények változatossága  
29. Általános tapasztalat, hogy az egyes vegyi anyagok változatos kinetikai 
paramétereinek meghatározott értékei eltéréseket mutatnak. Vélhet őleg az 
iszapfejlődés körülményei és az alkalmazott vizsgálati körülmények (miként 
az 5. bekezdésben említett és más vizsgálatoknál) egyaránt jelent ős hatást 
gyakorolnak a kapott értékekre. A változatosság egyik aspektusának elem ­
zése során Grady et al (4) az »extant« és az »intrinzikus« kifejezéseket javasolta annak a két széls őséges fiziológiai állapotnak a leírására, 
amelyeket egy baktériumkultúra egy kinetikai kísérlet során elérhet. Ha a 
vizsgálat során nem megengedett az állapotváltozás, akkor a kinetikai para ­
méterek értékei a mikroorganizmusok származási helyére jellemz ő környe­
zeti feltételeket tükrözik; ezeket nevezzük extant, azaz »már meglév ő« érté­
keknek. A másik széls őség, amikor a vizsgálati körülmények a lehet ő 
leggyorsabb növekedési sebességet engedve a fehérjeszintetizáló rendszer teljes kifejl ődését lehet ővé teszik. Az így kapott kinetikai paraméterek intri ­
zikusak, azaz kizárólag a szubsztrátum jellegét ől és a baktériumkultúra típu ­
sától függenek. Útmutatásként elmondható, hogy ha a szubsztrátum-koncent ­
ráció kompetens mikroorganizmusokhoz viszonyított arányát (S
 o /X o ) alacso­
nyan tartjuk (például 0,025), akkor extant értékeket kapunk, míg intrinzikus értékek akkor születnek, ha ez az arány magas (például legalább 20). Az S
 o 
egyik esetben sem lehet kisebb, mint a K  s féltelítési állandó vonatkozó 
értéke.  
30. A változatosság kérdésével és a biológiai lebonthatóság kinetikai vizsgála ­
tának egyéb aspektusaival egy közelmúltban rendezett SETAC workshop is foglalkozott (5). Az ilyen és hasonló – már leírt illetve tervezett – kutatások egyre világosabb képet adnak a szennyvíztisztító telepeken végben ő folya­
matok kinetikájáról, és ezáltal lehet ővé teszik a jelenleg rendelkezésre álló 
adatok jobb értelmezését, valamint alapul szolgálnak a helytállóbb jöv őbeli 
vizsgálati módszerek kialakításához.
 
SZAKIRODALOM:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33–48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340–343.  
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742–748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
6.1. függelék  
Lyukacsos edény SRT-szabályozással
  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
6.2. függelék  
Kinetikai állandók számítása  
1. Feltételezve a Monod-féle kinetikai modell alkalmazhatóságát, valamint az 
aktív szilárd anyagok és a szubsztrátum tömegegyensúlyát az eleveniszapos rendszerben (1), a következ ő egyenlettel írható le az állandósult állapot:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
vagy  
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
ahol:  
S 1 = elfolyó szubsztrátum koncentráció (mg/l)  
K S = féltelítési állandó, a koncentráció amelynél μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = fajlagos növekedési sebesség (d  –1 ) 
μ m = μ m maximális értéke (d  –1 ) 
K d = aktív szilárd anyagok fajlagos bomlási sebessége (d  –1 ) 
θ S = átlagos iszaptartózkodási id ő, SRT (d)  
Az egyenlet vizsgálatából az alábbi következtetések vonhatók le:  
i. Az elfolyó koncentráció független a befolyó koncentrációtól (S  0 ); követ­
kezésképpen a százalékos biológiai lebomlás az S  0 befolyó koncentráci ­
ónak megfelel ően változik.  
ii. Az S  1 koncentrációt befolyásoló egyetlen üzemszabályozási paraméter az 
θ S iszaptartózkodási id ő. 
iii. Adott S  0 befolyó koncentráció mellett a kritikus iszaptartózkodási id ő: 
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
ahol:  
θ SC = kritikus iszaptartózkodási id ő, amely alatt a kompetens mikroor ­
ganizmusok kimosódnak az üzemb ől. 
iv. Mivel a (2) egyenlet többi paramétere a növekedés kinetikájával áll 
összefüggésben, a h őmérséklet valószín űleg befolyásolja az elfolyó 
szubsztrátum-szintet és a kritikus iszaptartózkodási id őt, azaz a h őmér­
séklet csökkenésével n ő az adott tisztítási fok eléréséhez szükséges iszap ­
tartózkodási id ő. 
2. Feltételezve, hogy az X  2 elfolyó lebeg őanyag koncentráció a leveg őztető 
edényben mért X  1 koncentrációhoz képest alacsony, a lebeg őanyagok töme ­
gegyensúlyát alapul véve a »lyukacsos edény« rendszerben az iszaptartózko ­
dási idő: 
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
és 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
ahol:  
V = a leveg őztető edény térfogata (l)  
X 1 = lebegőanyag koncentráció a leveg őztető edényben (mg/l)  
X 2 = elfolyó lebeg őanyag koncentráció (mg/l)  
Q 0 = befolyó áramlási sebesség (l/d)  
Q 1 = iszapelvétel áramlási sebessége (l/d)  
Tehát a Q  1 iszapelvételi sebesség szabályozásával az iszaptartózkodási id ő az 
előre meghatározott értéken tartható.  
Következtetések:  
3. A vizsgálat els ődleges célja, hogy lehet ővé tegye az elfolyó koncentráció és 
annak alapján a vizsgált vegyi anyag fogadó vizekben mérhet ő előfordulási 
szintjének az el őrejelzését.  
4. Egyes esetekben az S  1 alakulását a θ S függvényében ábrázoló görbér ől 
azonnal leolvasható a θ SC kritikus iszaptartózkodási id ő (például az 1. 
ábrán létható 3. számú görbe). Ha ez nem lehetséges, akkor az θ SC , valamint 
a μ m és a K  S közelítő értékeinek a kiszámításához a S  1 •θ S függvényében 
ábrázoljuk az S  1 alakulását.  
Az (1) egyenlet átrendezése után a következ ő egyenletet kapjuk:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Ha a K  d alacsony, akkor 1 + θ s • K  d ~ 1, és az [5] egyenlet a következ ő­
képpen írható fel:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Ez egy 1/ μ m meredekség ű egyenest ír le, amely áthalad a K  S /μ m ponton; a θ S 
~1/μ m (lásd a 2. ábrát).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
1. ábra  
Az SRT alakulása három h őmérsékletérték mellett
  
2. ábra  
Az SRT S  1 vs. S  1 regressziós egyenes T = 5 °C h őmérsékletérték mellett
  
Glosszárium:  
elfolyó koncentráció  
görbe  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
7. függelék  
ALACSONY ( μg/l) KONCENTRÁCIÓ-TARTOMÁNYBAN VÉGZETT 
VIZSGÁLAT  
1. Sok vegyi anyag általában rendkívül alacsony ( μg/l) koncentrációban van 
jelen a vízi környezetben, s őt még a szennyvizekben is. Ilyen koncentráci ­
óban feltételezhet ően nem szolgálnak els ődleges növekedési szubsztrátum ­
ként, hanem nagyobb a valószín űsége annak, hogy a természetesen el őfor­
duló különféle szénvegyületekhez hasonló módon, növekedést nem eredmé ­
nyező másodlagos szubsztrátumként kerülnek lebontásra. Következésképpen 
az ilyen vegyi anyagok lebomlása nem írható le a 6. függelékben bemutatott 
modellel. Számos alkalmazható modell létezik, és elképzelhet ő, hogy a 
szennyvíztisztító rendszerekben uralkodó körülmények között egyszerre több is m űködik párhuzamosan. E probléma megoldása még sok kutatást 
igényel.
 
2. A C.10. fejezet A része f őszövegében ismertetett eljárás alkalmazható ugyan, 
de csak az els ődleges biológiai lebonthatóság értékelésére, megfelel ően 
alacsony (< 100 μg/l) koncentrációk és validált analitikai eljárás használata 
mellett. A százalékos biológiai lebomlás kiszámítása (lásd a vizsgálati 
módszer 54. bekezdését) is lehetséges, de az abiotikus folyamatokat (adszorp ­
ció, illékonyság, stb.) is figyelembe kell venni. Példaként Nyholm és társai (1)(2) 4 órás ciklus és feltöltés-leszívás eljárás alkalmazásán alapuló kutatá ­
sára lehet hivatkozni. A kutatók 5 vegyületre határoztak meg 
pszeudo-els őrendű állandókat, amelyeket 5–100 μg/l koncentrációban 
adagoltak mesterségesen készített szennyvízhez. (A teljes biológiai lebontha ­
tóság értékeléséhez
 14 C-vel jelölt vizsgált vegyi anyagokat használhatunk. 
Ennek ismertetése meghaladja ennek a vizsgálati módszernek a kereteit, 
mivel elfogadott eljárások egyel őre nincsenek, bár az ISO 14592 szabvány 
(3) egyik javasolt módszerében útmutatást találunk a  14 C-vel jelölt vizsgált 
vegyi anyagok használatára.  
SCAS vizsgálat  
3. A kés őbbi javaslatokban egy egyszer űbb, kétlépcs ős vizsgálat szerepelt 
(4)(5)(6), amelynek során a félfolyamatos eleveniszapos (SCAS) módszer 
alkalmazását követ ően a SCAS berendezésb ől gyűjtött mintákat rövid távú 
kinetikai vizsgálatoknak vetjük alá. A SCAS berendezést ismert iszapelvételi arányokkal (az eredeti C.12. vizsgálati módszerrel ellentétben) és az OECD 
iránymutatása szerinti, mesterségesen készített szennyvíz módosított változa ­
tával vagy háztartási szennyvízzel üzemeltetjük. A mesterségesen készített szennyvizet – a változó pH-érték és a rossz iszapülepedés miatt – foszfát puffer, éleszt őkivonat, vas(III)-klorid és nyomelem mennyiségben sók hozzá ­
adásával módosítjuk, COD tartalmát pedig a pepton és a húskivonat koncent ­
rációjának növelésével mintegy 750 mg/l-re emeljük. A berendezéseket 24 órás ciklusokban m űködtetjük: a mesterségesen készített szennyvíz és a vizs ­
gált vegyi anyag legfeljebb 100 μg/l (azaz a rövid távú vizsgálat során 
használttal hozzávet őlegesen megegyez ő) koncentrációban történ ő adagolását 
a 23 óráig tartó leveg őztetést, az iszapelvételt, az ülepítést és a felülúszó 
(elfolyó) folyadék elvezetését követ ően kezdjük meg. A kiegyensúlyozott 
mikrobapopuláció fenntartása érdekében hetente egy alkalommal az összes 
iszap 10 %-át friss iszapra cseréljük.
 
4. A vizsgált vegyi anyag koncentrációját a ciklus elején és a leveg őztetési 
periódus végén mérjük, és a vizsgálatot addig folytatjuk, amíg a vizsgált 
vegyi anyag eltávolítása állandó szintet ér el; ez egy hétt ől több hónapig 
tarthat.  
Rövid távú vizsgálat  
5. A rövid távú (például 8 órás) vizsgálat célja a vizsgált vegyi anyag külön ­
böző, ismert eredet ű és múltú eleveniszapokban való lebomlása (pszeudo) 
elsőrendű sebességi állandójának a meghatározása. Az alkalmazkodási 
kísérlet (3–4. bekezdés) során a leveg őztetési periódus végén, amikor a 
szerves szubsztrátum koncentráció alacsony, iszapmintákat veszünk a SCAS reaktorokból. Összehasonlítás céljára egy párhuzamosan üzemeltetett, a vizsgált vegyi anyagnak nem kitett SCAS berendezésb ől is vehetünk isza ­
pot. Az iszap és a vizsgált vegyi anyag két vagy több eltér ő, az 1–50 μg/l 
tartományon belüli koncentrációban adagolt keverékét mesterségesen készített
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
szennyvíz vagy más szerves szubsztrátum hozzáadása nélkül leveg őztetjük. 
Legfeljebb 24 órán keresztül rendszeres id őközönként meghatározzuk az 
oldott vizsgált vegyi anyag maradék koncentrációját (például óránként, a vegyi anyag lebonthatóságától függ ően). A mintákat a megfelel ő analízist 
megelőzően centrifugálni kell.
 
Számítások  
6. A SCAS berendezésekb ől származó adatokat a vizsgált vegyi anyag száza ­
lékos eltávolításának a kiszámításához használjuk fel (54. bekezdés). Emellett a következ őképpen számíthatjuk ki a (lebeg őanyag koncentrációra vonatkoz ­
tatott) K
 1 átlagos sebességi állandót:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
ahol:  
t = leveg őztetési idő (23 h)  
C e = koncentráció a leveg őztetési periódus végén ( μg/l) 
C i = koncentráció a leveg őztetés kezdetén ( μg/l) 
SS = eleveniszap lebeg őanyag koncentrációja (g/l)  
7. A rövid távú vizsgálat során a log% maradék koncentrációt az id ő függ­
vényében ábrázoljuk. A görbe kezdeti szakaszának (10–50 % lebomlás) 
meredeksége a K  1 (pszeudo) els őrendű állandónak felel meg. Az iszap lebe ­
gőanyag koncentrációjára vonatkoztatott állandó kiszámításához a meredek ­
séget elosztjuk a lebeg őanyag koncentrációval. Az eredmény bemutatásának 
a kiinduló vizsgált vegyi anyag és lebeg őanyag koncentrációk, az iszaptar ­
tózkodási id ő, az iszapterhelés és az iszap forrása, valamint a vizsgált vegyi 
anyagnak való kitétel el őtti állapot (ha van ilyen) részletezését is tartalmaznia 
kell. 
Az eredmények változatossága  
8. A változatosság kérdésével és a biológiai lebonthatóság kinetikai vizsgála ­
tának egyéb aspektusaival egy közelmúltban rendezett SETAC workshop is foglalkozott (7). Az ilyen és hasonló – már leírt illetve tervezett – kutatások 
egyre világosabb képet adnak a szennyvíztisztító telepeken végben ő folya­
matok kinetikájáról, és ezáltal lehet ővé teszik a jelenleg rendelkezésre álló 
adatok jobb értelmezését, valamint alapul szolgálnak a helytállóbb jöv őbeli 
vizsgálati módszerek kialakításához.
 
SZAKIRODALOM  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and 
Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
 
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Vízmin őség. A vízben 
kis koncentrációban jelen lév ő szerves vegyületek aerob biológiai lebontha ­
tóságának kiértékelése.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
(5) Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodeg ­
radability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. 
King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6  th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmek  
BEVEZETÉS  
1. Szimulációs vizsgálatot általában olyan vegyi anyagoknál alkalmazunk, 
amelyek a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló sz űrővizs­
gálaton nem mentek át (az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő A–F 
módszerek (9)), a jellegénél fogva biológiailag lebontható anyagok azono ­
sítására szolgáló vizsgálaton viszont átmentek. Kivételesen akkor is alkal ­
mazható szimulációs vizsgálat, ha valamely vegyi anyagról – különösen egy sok tonnára rúgó mennyiségben el őállított vegyi anyagról – több informá ­
cióra van szükségünk, amely esetben általában eleveniszapos vizsgálatot 
(C.10. fejezet A része) végzünk. Bizonyos körülmények között azonban a 
vegyi anyag biofilmes szennyvíztisztítási módszerekkel – nevezetesen a csepegtetőtestes, forgó biológiai kontaktoros és a fluidágyas eljárásokkal – 
szembeni viselkedésére vonatkozó konkrét információ szükséges. Az ilyen 
igények kielégítésére különféle eszközöket fejlesztettek ki.
 
2. Gerike  et al . (1) nagyméret ű kísérleti csepegtet őtesteket alkalmazott, 
amelyeket kapcsolt üzemmódban m űködtetett. Ezek a berendezések nagy 
helyet foglaltak el, és viszonylag nagy mennyiség ű szennyvizet vagy mester ­
ségesen készített szennyvizet igényeltek. Truesdale  et al . (2) kisebb (6 ft x 6 
in. átmér őjű) szűrőket írt le, amelyekbe azonban még mindig elég nagy 
mennyiségben kellett a felületaktív anyagoktól mentes természetes szenny ­
vizet tölteni. Az „érett” biofilm kialakulásához hosszú, 14 hetes id őszak 
kellett, a vizsgált felületaktív anyag adagolásának megkezdése el őtti alkal­
mazkodáshoz pedig további 4–8 hétre volt szükség.  
3. Baumann  et al.  (3) egy jóval kisebb sz űrőt fejlesztett ki, amelyben egy 
eleveniszapban el őáztatott, gyapjúszer ű poliészterszalagot használtak a 
biofilmképz ődést támogató semleges közegként. Kizárólagos szénforrásként 
a vizsgált vegyi anyag szolgált, a biológiai lebonthatóságot pedig a befolyó 
és az elfolyó víz oldott szerves szén (DOC), valamint az eltávozó gáz CO  2 
tartalmának mérései alapján értékelték.  
4. Egy egészen más megközelítést alkalmazott a forgótárcsás reaktort feltaláló 
Gloyna  et al.  (4). Ebben az esetben a biofilm-képz ődés a vízszinteshez 
viszonyítva kis d őlésszögben elhelyezett forgó cs ő ismert terület ű belső 
felületén megy végbe a felülr ől befolyó szennyvíz áthaladása következtében. 
A reaktort felületaktív anyagok biológiai lebonthatóságának tanulmányozá ­
sára (5), valamint a biofilm optimális vastagságának és a filmen való opti ­
mális áthaladásnak a vizsgálatára használták (6). A reaktort ugyanezek a 
szerzők továbbfejlesztették, és többek között alkalmassá tették az eltávozó 
gáz CO  2 tartalmának a meghatározására.  
5. A forgótárcsás reaktort a Standing Committee of Analysts (UK) a vegyi 
anyagok biológiai lebonthatósága (7), valamint a szennyvizek kezelhet ősége 
és toxicitása (8) értékelésének szabványos módszereként fogadta el. Az itt bemutatott módszer el őnye egyszer űségében, tömörségében, reprodukálható ­
ságában és viszonylag korlátozott szerves közeg igényében rejlik.
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
6. A mesterségesen készített vagy háztartási szennyvizet és a vizsgált vegyi 
anyagot keverék formájában vagy külön-külön egy lassan forgó, döntött cs ő 
belsejébe vezetjük. A bels ő felületen a biosz űrők közegén jelen lév őhöz 
hasonló mikroorganizmus-réteg képz ődik. A reaktor m űködési feltételeit 
úgy kell megválasztani, hogy megfelel ő mértékű szerves anyag lebomlást 
és szükség esetén ammónium oxidációt biztosítson.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. A cs őből kifolyó vizet felfogjuk, és ülepítjük vagy sz űrjük, miel őtt az oldott 
szerves szén (DOC) és/vagy – egy specifikus módszerrel – a vizsgált vegyi 
anyag mennyiségét meghatározzuk. Összehasonlítás céljából azonos felté ­
telek mellett egyidej űleg kontroll berendezéseket m űködtetünk, amelyekbe 
nem adagolunk vizsgált vegyi anyagot. Feltételezzük, hogy a vizsgálati és a 
kontroll berendezések elfolyó vizében mért DOC-koncentrációk különbsége 
a vizsgált vegyi anyagnak és szerves metabolitjainak tulajdonítható. A vizs ­
gált vegyi anyag lebomlásának meghatározásához ezt a különbséget össze ­
hasonlítjuk a hozzáadott vizsgált vegyi anyag (DOC) koncentrációjával.  
8. A lebomlást az id ő függvényében ábrázoló görbe alapos vizsgálata általában 
lehetővé teszi a biológiai lebontás biológiai adszorpciótól való megkülön ­
böztetését. Meger ősítése általában a gyors biológiai lebonthatóság megálla ­
pítására szolgáló (oxigénfelvétel vagy széndioxid-termelés) vizsgálat segít ­
ségével lehetséges, amelyhez abból a rektorból kell a vizsgálat végén 
akklimatizált oltóanyagot gy űjteni, amelybe a vizsgált vegyi anyagot adagol ­
tuk. 
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
9. Az eredmények helyes értelmezéséhez ismerni kell a vizsgált vegyi anyag 
tisztasági, vízoldékonysági, illékonysági és adszorpciós jellemz őit. 
10. Illékony és rosszul oldódó vegyi anyagok általában csak különleges óvintéz ­
kedések megtétele esetén vizsgálhatók (lásd a C.10. fejezet A részének 5. függelékét). Az elméleti értékek kiszámításához, illetve a paraméterek mért 
értékeinek ellen őrzéséhez (például elméleti oxigénigény (ThOD), (DOC) a 
kémiai szerkezet vagy legalább a tapasztalati képlet ismerete is szükséges.
 
11. A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására 
vonatkozó információk (lásd a C.10. fejezet A részének 4. függelékét) hasz ­
nosak lehetnek a megfelel ő vizsgálati koncentrációk kiválasztásánál és külö ­
nösen fontosak lehetnek az alacsony biológiai lebomlási értékek helyes 
értelmezéséhez.  
MEGFELELÉSI SZINTEK  
12. Az eredeti követelmények szerint egy felületaktív anyagnak legalább 80 %- 
os elsődleges biológiai lebonthatósági szintet kellett elérnie ahhoz, hogy 
forgalmazható legyen. 80 % alatti érték esetén a felületaktív anyag csak akkor forgalmazható, ha az itt bemutatott szimulációs (igazoló) vizsgálat 
alkalmazása során a meghatározott vegyi anyag több mint 90 %-a eltávolít ­
ható. A vegyi anyagok többségénél a megfelelési szint általában nem vet fel kérdéseket, és az eltávolítás százalékos értéke a vegyi anyagok veszélyes ­
ségének értékelése során alkalmazandó várható környezeti koncentráció 
közelítő becsléséhez használható fel. Számos vizsgálatban a tiszta vegyü ­
letek több mint háromnegyede 90 % feletti százalékos DOC-eltávolítást mutatott, a jelent ősebb fokú biológiai lebonthatóságot mutató vegyületek 
több mint 90 %-a pedig 80 % feletti eredményt ért el.
 
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
13. A kísérleti eljárás helyes végrehajtásának biztosítása érdekében id őnként 
ajánlott ismert viselkedés ű vegyi anyagokat is megvizsgálni. Ezek közé 
tartozik például az adipinsav, a 2-fenilfenol, az 1-naftol, a difénsav, az 1- 
naftoesav.  
A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK MEGISMÉTELHET ŐSÉGE  
14. Az Egyesült Királyságban egy laboratórium megállapította, hogy a vizsgála ­
tokon belüli relatív szórás 3,5 %, a vizsgálatok közötti 5 % volt (7).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Készülékek  
Forgótárcsás reaktorok  
15. A készülék (lásd a 8. függelék 1. és 2. ábrját) fémállványra helyezett, 
gumikarimás tárcsákra szerelt akrilcsövekb ől áll, amelyek mindegyike 30,5 
cm hosszú, és 5 cm bels ő átmérővel rendelkezik. Az egyes csöveket körül ­
belül 0,5 cm szélesség ű külső perem tartja a tárcsákon, bels ő felületük durva 
fémgyapottal van érdesítve, fels ő (adagoló) nyílásukon pedig egy 0,5 cm 
szélességű perem van kialakítva, amely megakadályozza a csövekbe kerül ő 
folyadék kifolyását. A tiszta cs őbe vezetett vizsgálati közeggel való kell ő 
ideig tartó érintkezés eléréséhez a csöveket a vízszinteshez viszonyítva körülbelül 1 fokos d őlésszögben kell elhelyezni. A gumiabroncsos tárcsákat 
egy változtatható fordulatszámú motor forgatja lassú sebességgel. A csövek 
hőmérsékletének szabályozása végett egy állandó h őmérséklet ű helyiségben 
állítjuk fel a készüléket.
 
16. Ha a forgótárcsás reaktorokat egy-egy valamivel nagyobb, fedeles cs őbe 
helyezzük, és gondoskodunk arról, hogy a csatlakozásoknál ne szökhessenek ki gázok, akkor az eltávozó CO
 2 a későbbi mérés céljából lúgos oldatban 
elnyelethet ő (6). 
17. Minden egyes cs őhöz egy 20 l űrtartalmú tárolóedény csatlakozik (A), 
amelyben 24 órára elegend ő szerves közeg és – ha szükséges – hozzáadott 
vizsgált vegyi anyag van (lásd a 2. ábrát). Szükség esetén a vizsgált vegyi 
anyag oldata külön adagolható. A tárolóedény aljához közel egy kivezet ő 
nyílás van, amelyhez egy megfelel ő – példáuléldául szilikongumiból készült 
– cső segítségével egy perisztaltikus pumpán (B) keresztül egy, a döntött 
cső (C) felső (adagoló) nyílásába 2–4 cm-re benyúló üveg vagy akril továb ­
bítócső csatlakozik. Az elfolyó víz a döntött cs ő alsó nyílásán egy másik 
tárolóedénybe (D) csepeg. Az analízist megel őzően az elfolyó vizet ülepítjük 
vagy szűrjük. 
Szűrőkészülék – centrifuga  
18. A minták sz űrésére olyan, megfelel ő pórusméret ű (0,45 μm névleges lyukát ­
mérőjű) membránsz űrőket alkalmazunk, amelyek minimális mértékben 
adszorbeálják a szerves vegyületeket és bocsátanak ki szerves szenet. Szerves szenet kibocsátó sz űrők alkalmazása esetén a kioldódó szén eltávo ­
lítása érdekében a sz űrőket meleg vízzel gondosan ki kell mosni. A másik 
lehetséges megoldás a 40 000 m/s
 2 gyorsulás elérésére képes centrifuga 
alkalmazása.  
19. A következ ők meghatározására alkalmas analitikai berendezések:  
— DOC/összes szerves szén (TOC) vagy kémiai oxigénigény (COD),  
— meghatározott vegyi anyag (HPLC, GC stb.), ha szükséges,  
— pH, h őmérséklet, kémhatás,  
— ammónium, nitrit, nitrát, ha a vizsgálatok a nitrifikációt befolyásoló 
feltételek mellett kerülnek elvégzésre.  
Víz 
20. Kevesebb, mint 3 mg/l DOC-koncentrációjú csapvíz.  
21. Kevesebb, mint 2 mg/l DOC-koncentrációjú ionmentesített vagy desztillált 
víz. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Szerves közeg  
22. Szerves közegként mesterségesen készített szennyvíz, háztartási szennyvíz 
vagy ezek keveréke használható. Kimutatták, hogy a háztartási szennyvíz önmagában történ ő alkalmazása sok esetben magasabb százalékos 
DOC-eltávolítást eredményez (eleveniszapos berendezésekben), s őt olyan 
vegyi anyagok eltávolítását és biológiai lebontását is lehet ővé teszi, amelyek 
az OECD által meghatározott mesterségesen készített szennyvíz alkalmazása esetén nem bonthatók le biológiailag. Ezért háztartási szennyvíz alkalmazása 
ajánlott. Új tétel használata el őtt mindig meg kell határozni a szerves közeg 
DOC- vagy COD-koncentrációját. A szerves közeg savasságát vagy lúgos ­
ságát ismerni kell. Ha a szerves közeg nem elég savas vagy lúgos, akkor 
megfelelő puffer (nátrium-hidrogén-karbonát vagy kálium-hidrogén-foszfát) 
hozzáadásával lehet fenntartani a 7,5 ± 0,5 körüli pH-értéket a reaktorban a vizsgálat során. Minden esetben egyedi alapon kell meghatározni, hogy mikor és mennyi puffert kell a szerves közeghez hozzáadni.
 
Mesterségesen készített szennyvíz  
23. Csapvízben oldjunk fel literenként 160 mg peptont, 110 mg húskivonatot, 
30 mg karbamidot, 28 mg dikálium-hidrogén-foszfátot (K  2 HPO  4 ), 7 mg 
nátrium-kloridot (NaCl), 4 mg kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl  2 .2H  2 O) és 
2 mg magnézium-szulfát-heptahidrátot (Mg  2 SO 4 .7H  2 O). Ezzel az OECD 
által meghatározott és e helyütt példaként megadott módszerrel körülbelül 
100 mg/l átlagos DOC-koncentrációjú befolyó szennyvíz készíthet ő. Alter­
natívaként alkalmazható más olyan összetétel is, amely hozzávet őleg 
hasonló ehhez, és a valódi szennyvízéhez közelebb álló DOC-koncentrációt eredményez. Desztillált vízzel kevert olyan m űszenny­
víz-koncentrátumot is készíthetünk, amely 1 °C h őmérsékleten egy hétig 
tárolható. Szükség esetén hígítsuk csapvízzel. (Bár ez a közeg nem teljesen megfelelő, például a nitrogén koncentrációja túl magas, míg a széntartalom 
viszonylag alacsony, a foszfátpuffer hozzáadásán és a peptontartalom növe ­
lésén kívül jobb javaslat eddig nem született.)
 
Háztartási szennyvíz  
24. Elsősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító telepr ől szár­
mazó, naponta frissen gy űjtött, ülepített szennyvizet használjunk. A durva 
részecskékt ől jobbára mentes szennyvizet az els ődleges ülepít őtartály 
túlfolyójából vagy az eleveniszapos üzem betáplálási pontjáról kell gy űjteni. 
A szennyvíz felhasználás el őtt több (általában legfeljebb hét) napig tárolható 
4 °C hőmérsékleten, amennyiben bizonyítható, hogy a DOC-koncentráció 
(vagy a COD) nem csökken jelent ős mértékben (azaz legalább 20 %-kal) 
a tárolás során. Új tétel használata el őtt mindig be kell állítani a DOC- 
koncentrációt (vagy a COD-t) egy megfelel ő állandó értékre, például csapvíz 
hozzáadásával, hogy a vizsgálat során minél kisebb zavar keletkezzen.  
Kenőanyag  
25. A perisztaltikus pumpa görg őit glicerinnel vagy olívaolajjal kenjük: mind ­
kettő alkalmas a szilikongumi csövekkel való használatra.  
A vizsgált vegyi anyag törzsoldatai  
26. A megfelel ően oldható vegyi anyagok törzsoldatait ionmentesített víz vagy a 
mesterségesen készített szennyvíz ásványi összetev őjének felhasználásával 
készítjük el a megfelel ő koncentrációban (például 1 to 5 g/l). Az oldhatatlan 
vegyi anyagokra vonatkozóan lásd a C.10. fejezet A részének 5. függelékét. 
Illékony vegyi anyagok esetén ez a módszer csak akkor alkalmazható, ha módosítjuk a forgótárcsás reaktort (16. bekezdés). Határozzuk meg a törzs ­
oldat DOC és összes szerves szén (TOC) tartalmát, és a kés őbbiekben 
minden új tételnél ismételjük meg a mérést. Ha a DOC és a TOC különb ­
sége nagyobb, mint 20 %, akkor ellen őrizzük a vizsgált vegyi anyag
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
vízoldékonyságát. A visszanyerési arány megfelel őségének ellen őrzéséhez 
(általában > 90 % várható) hasonlítsuk össze a DOC-tartalmat vagy a vizs ­
gált vegyi anyag törzsoldat specifikus analízisével meghatározott koncentrá ­
cióját a névleges értékkel. Különösen diszperziók esetén kell ellen őrizni, 
hogy a DOC használható analitikai paraméter, vagy csak a vizsgált vegyi 
anyagra specifikus analitikai módszert lehet alkalmazni. Diszperzió haszná ­
lata esetén a mintákat centrifugálni kell. Minden új tételre vonatkozóan meg kell határozni az oldott szerves széntartalmat, a kémiai oxigénigényt, illetve – specifikus analízissel – a vizsgált vegyi anyag tartalmat.
 
27. Határozzuk meg a törzsoldat pH értékét. A széls őséges értékek azt jelzik, 
hogy a vegyi anyag hozzáadása hatással lehet az eleveniszap pH értékére a vizsgálati elrendezésben. Ebben az esetben kis mennyiség ű szervetlen sav 
vagy bázis segítségével semlegesíthetjük a törzsoldatot, azaz a pH értéket 7 
± 0,5-re állíthatjuk be – ügyelve arra, hogy elkerüljük a vizsgált vegyi anyag 
kicsapódását.
 
ELJÁRÁS  
A szerves közeg el őkészítése az adagoláshoz  
28. A vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat alatt mindvégig gondoskodjunk 
arról, hogy a befolyó szennyvizet és az elfolyó vizet tartalmazó tartályok és az elvezet ő csövek mindig alaposan meg legyenek tisztítva, hogy ne alakul ­
hassanak ki rajtuk mikrobatenyészetek.
 
29. Minden nap friss m űszennyvizet (23. bekezdés) használjunk, amelyet a 
szilárd anyagok vagy a törzsoldat koncentrátum csapvízzel történ ő hígítá­
sával készítünk. Egy mér őhenger segítségével mérjük ki a szükséges 
mennyiséget, és töltsük egy tiszta edénybe, amelyet a befolyó szennyvíz 
tárolására használunk. Szükség esetén a hígítás el őtt adjunk megfelel ő 
mennyiséget a vizsgált vegyi anyag vagy a referencia-vegyianyag törzsolda ­
tából a mesterségesen készített szennyvízhez. Egy külön tartályban is elké ­
szíthetjük a vizsgált vegyi anyag hígított oldatát, hogy egy külön adagoló ­
pumpa segítségével adagoljuk a döntött csövekbe, amennyiben ez a megoldás kényelmesebb, vagy a vizsgált vegyi anyaggal takarékoskodni kell.
 
30. Alternatívaként (és lehet őség szerint) használjunk ülepített háztartási szenny ­
vizet (24. bekezdés), amelyet lehet őleg minden nap frissen gy űjtsünk.  
A forgótárcsás reaktorok m űködtetése  
31. Egy vizsgált vegyi anyag értékeléséhez két egyforma forgótárcsás reaktor 
szükséges, amelyeket állandó – szokásos körülmények között 22 ± 2 °C – 
hőmérséklet ű helyiségben kell felállítani.  
32. A perisztaltikus pumpák átviteli teljesítményét úgy állítsuk be, hogy órán ­
ként 250 ± 25 ml szerves közeget továbbítsanak (a vizsgált vegyi anyag 
nélkül) a 18 ± 2 rpm fordulatszámmal forgó döntött csövekbe. A berendezés 
megfelelő működésének biztosítása és élettartamának meghosszabbítása 
érdekében a vizsgálat megkezdésekor és a vizsgálat id őszaka alatt rendszeres 
időközönként kenjük a pumpacsöveket (25. bekezdés).  
33. A csövek vízszinteshez viszonyított d őlésszögét úgy állítsuk be, hogy a 
tiszta csőbe adagolt anyag tartózkodási ideje 125 ± 12,5 mp legyen. A 
tartózkodási id ő becsléséhez adjunk nem biológiai markert (például NaCl, 
semleges festékanyag) a betöltött anyaghoz: az elfolyó csúcskoncentráció 
eléréséhez szükséges id őt tekintjük átlagos tartózkodási id őnek (ha a film 
eléri a maximális vastagságot, a tartózkodási id ő kb. 30 percre n őhet). 
34. Kimutatták, hogy ezekkel az átfolyási, sebesség és id ő értékekkel megfelel ő 
mértékű (> 80 %) DOC (vagy COD) csökkenés érhet ő el, és nitrifikált 
elfolyó szennyvíz keletkezik. Elégtelen eltávolítás vagy egy adott szenny ­
víztisztító telep teljesítményének szimulálása esetén változtatni kell az áram ­
lási sebességen. Az utóbbi esetben a szerves közeg adagolási sebességét úgy 
kell módosítani, hogy a reaktor teljesítménye megfeleljen a szennyvíztisztító 
teljesítményének.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Beoltás  
35. Mesterségesen készített szennyvíz használata esetén a mikroorganizmusok 
növekedésének beindításához elegend ő a leveg ővel történ ő érintkezés, 
máskülönben 3 napon keresztül adjunk literenként 1 ml ülepített szennyvizet 
a berendezésbe adagolt folyadékhoz.  
Mérések  
36. Rendszeres id őközönként ellen őrizzük, hogy az adagolási és a forgási 
sebesség az el őírt határértékek között van. Mérjük továbbá az elfolyó víz 
pH-értékét, különösen akkor, ha nitrifikációra számítunk.  
Mintavétel és analízis  
37. A vizsgálat céljának megfelel ő mintavételi módszert, rendszert és gyakori ­
ságot kell választani. Használhatunk például a befolyó és az elfolyó vízb ől 
vett gyors (vagy próba) mintákat, vagy hosszabb id őszakon – például 3–6 
órán – keresztül gy űjtött mintákat. Az els ő időszakban, amikor még nem 
adagoljuk a vizsgált vegyi anyagot, hetente kétszer vegyünk mintát. A mintákat membránsz űrő segítségével sz űrjük, vagy centrifugáljuk kb. 
40 000 m/s
 2 intenzitással körülbelül 15 percig (18. bekezdés). A membrán ­
szűrés előtt szükség lehet a minták ülepítésére és/vagy durva sz űrésére. A 
DOC vagy COD meghatározását legalább egyszer meg kell ismételni, és adott esetben szükség lehet a BOD, ammónium és nitrit/nitrát meghatározá ­
sára.
 
38. Minden analízist a mintavételt és a minták el őkészítését követ ő lehető legko­
rábbi időpontban kell elvégezni. Ha az analízist kés őbbre kell halasztani, 
akkor a mintákkal teletöltött, szorosan lezárt üvegeket körülbelül 4 °C 
hőmérsékleten, sötétben kell tárolni. 48 óránál hosszabb ideig történ ő tárolás 
esetén a mintákat mélyh űtéssel, savanyítással vagy megfelel ő toxikus anyag 
(például literenként 20 ml 10 g/l töménység ű higany (II)-klorid-oldat) hozzá ­
adásával kell tartósítani. A tartósítási módszer nem befolyásolhatja az 
analízis eredményét.  
Bejáratási id őszak 
39. Ez alatt az általában 2 hétig tartó, de 6 hétnél nem hosszabb id őszak alatt éri 
el a felületen képz ődő biofilm az optimális vastagságot. A DOC (vagy 
COD) csökkenés (44. bekezdés) mértéke n ő, majd beáll egy állandó értékre. 
Miután egy hasonló érték mellett mindkét berendezésnél bekövetkezett az 
állandósult állapot elérése, kiválasztjuk, hogy melyiket használjuk kontroll 
berendezésként a vizsgálat hátralev ő részében, amelynek során állandó telje ­
sítményt kell mutatnia.  
A vizsgált vegyi anyag bevezetése  
40. Ebben a szakaszban kezdjük adagolni a vizsgált vegyi anyagot a másik 
reaktorba a megfelel ő – általában 10–20 mg C/l – koncentrációban.  
Akklimatizációs id őszak 
41. Folytatjuk a heti kétszeri DOC (vagy COD) analíziseket, és ha az els ődleges 
biológiai lebonthatóságot kell értékelni, akkor specifikus analízis segít ­
ségével mérjük a vizsgált vegyi anyag koncentrációját. A vizsgált vegyi anyag bevezetését követ ően egytől hat hétig tartó – különleges körülmények 
között hosszabb – id őszak szükséges az alkalmazkodáshoz. Miután a száza ­
lékos eltávolítás (43–45. bekezdés) elérte a maximális szintet, az állandósult 
állapot id őszaka alatt körülbelül 3 héten keresztül 12–15 érvényes értéket 
kell gyűjteni az átlagos százalékos eltávolítás értékeléséhez. A vizsgálatot 
akkor lehet befejezettnek tekinteni, amikor kell ően magas lebomlási fokot 
sikerült elérni. Általában törekedni kell arra, hogy a vizsgált vegyi anyag 
adagolásának megkezdését követ ően a vizsgálat legfeljebb 12 hétig tartson.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Biofilm leválás  
42. Viszonylag rendszeres id őközönként nagy mennyiség ű fölös biofilm válik 
vagy szakad le a csövek faláról. A vizsgálatok id őszaka legalább két teljes 
növekedési és leválási ciklusra terjedjen annak érdekében, hogy az eredmé ­
nyek összehasonlíthatóságát ez ne befolyásolja.  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
43. A vizsgált vegyi anyag DOC (vagy COD) csökkenésének százalékos értékét 
a következ ő képlettel számítjuk ki az adott id őpontokban történ ő értékelés ­
hez: 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
ahol:  
D t = százalékos DOC (vagy COD) csökkenés a t id őpontban,  
Cs = a vizsgált vegyi anyagnak tulajdonítható, lehet őleg a törzsoldat 
koncentrációja és hozzáadott mennyisége alapján becsült befolyó 
DOC (vagy COD) (mg/l),  
E = a vizsgálati berendezés elfolyó vízében mért DOC (vagy COD) a t 
időpontban (mg/l),  
Eo = a kontroll berendezés elfolyó vízében mért DOC (vagy COD) a t 
időpontban (mg/l).  
A referencia-vegyianyag vizsgálata esetén a referencia-vegyianyagra vonat ­
kozóan is végezzük el a számítást.  
A kontroll reaktor teljesítménye  
44. A kontroll reaktorokba adagolt szerves közeg DOC (vagy COD) csökkené ­
sének foka hasznos információt nyújt a biofilm vizsgálat során megfigyel ­
hető biológiai lebontó képességének az értékeléséhez. A százalékos 
lebomlás az alábbi képletb ől számítható ki:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
ahol:  
Cm = a kontroll berendezésbe adagolt szerves közeg befolyó DOC vagy 
COD értéke (mg/l).  
45. Amennyiben specifikus analitikai módszerrel mérjük a vizsgált vegyi anyag 
eltávolítását, a következ ő képlettel számítjuk ki a vizsgált vegyi anyag 
lebomlását:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
ahol:  
Si = a vizsgált vegyi anyag mért vagy lehet őség szerint becsült koncent ­
rációja a vizsgálati berendezés befolyó szennyvízében (mg/l)  
Se = a vizsgált vegyi anyag mért koncentrációja a vizsgálati berendezés 
elfolyó vízében a t id őpontban (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Ha nem módosított szennyvíz esetén az analitikai módszer az S  c mg/l érté­
kével egyez ő pozitív eredményt ad, akkor a százalékos eltávolítás (D  SC ) 
kiszámítása a következ ő: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ% 
A vizsgálati eredmények bemutatása  
46. A D  t és D  ST (vagy D  SC ) százalékos lebomlást az id ő függvényében ábrázo ­
ljuk (lásd a C.10. fejezet A részének 2. függelékét). A vizsgált vegyi anyag 
százalékos eltávolítását az állandósult állapothoz tartozó 12–15 D  T (és ha 
rendelkezésre áll, D  ST ) érték (legközelebbi egész számra kerekített) számtani 
közepe és szórása alapján határozzuk meg. A bomlási görbe alakjából az 
eltávolítási folyamatokra vonatkozó következtéseket lehet levonni.  
Adszorpció  
47. Ha egy vizsgált vegyi anyag esetében a vizsgálat kezdetét ől fogva nagyfokú 
DOC-csökkenés figyelhet ő meg, akkor a vizsgált vegyi anyag lebomlása 
valószínűleg a biofilmen való adszorbeálódásának köszönhet ő. Ezt a 
biofilmről levált szilárd anyagokon adszorbeálódott vizsgált vegyi anyag 
meghatározásával lehet bizonyítani. Az adszorbeálható vegyi anyagok 
DOC-csökkenése általában nem marad mindvégig nagyfokú a vizsgálat 
során; a kezdetben tapasztalható nagyfokú eltávolítás rendszerint fokoza ­
tosan csökken, majd eléri az egyensúlyi értéket. Ha azonban az adszorbeál ­
ható vegyi anyag valamilyen módon a mikrobapopuláció akklimatizálódását 
okozza, a vizsgált vegyi anyag DOC-csökkenése a kés őbbiekben növekszik, 
majd egy magas értéken állandósul.  
Alkalmazkodási fázis  
48. A statikus sz űrővizsgálatokhoz hasonlóan a biológiai lebontást számos vizs ­
gált vegyi anyag esetében egy alkalmazkodási fázis el őzi meg. Az alkal ­
mazkodási fázisban a kompetens baktériumok akklimatizálódnak (vagy alkalmazkodnak), és szinte egyáltalán nem figyelhet ő meg a vizsgált vegyi 
anyag eltávolítása; ezt a baktériumok szaporodásának kezdeti id őszaka 
követi. Miután ez a szakasz véget ért, a lebontó fázis kezdetének önké ­
nyesen azt az id őpontot tekintjük, amikor a vizsgált vegyi anyag kezdeti 
mennyiségének körülbelül 10 % százaléka kerül eltávolításra (figyelembe véve az esetleges adszorpciót). Az alkalmazkodási fázis általában rendkívül 
változatos és kevéssé reprodukálható.
 
Állandósult állapot  
49. Egy folyamatos vizsgálat során a bomlási görbe állandó szakasza azt a fázist 
jelöli, amikor a legnagyobb fokú lebontás figyelhet ő meg. Az állandósult 
állapotnak legalább 3 hétig kell tartania, és körülbelül 12–15 mért értéknek kell tartoznia hozzá.
 
A vizsgált vegyi anyag átlagos lebomlási foka  
50. Számítsuk ki a vizsgált vegyi anyag állandósult állapothoz tartozó D  t (és ha 
rendelkezésre áll, D  st ) lebomlási értékeinek számtani közepét, majd kere ­
kítsük a legközelebbi egész számra (1 %). Ez lesz a vizsgált vegyi anyag lebomlási foka. A számtani közép 95 %-os konfidencia intervallumát is 
ajánlott kiszámítani. Hasonlóképpen számítsuk ki a kontroll berendezésbe 
adagolt szerves közeg átlagos lebomlási fokát (D
 B ). ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
A biológiai lebontás jele  
51. Ha a vizsgált vegyi anyag nem adszorbeálódik jelent ős mértékben a biofil ­
men, és a bomlási görbe a biológiai bomlási görbére jellemz ő tipikus alakot 
mutatja (alkalmazkodási fázis, lebontó fázis, állandósult állapot) (48–49. 
bekezdés), a mért csökkenést biztonsággal lehet a biológiai lebontásnak 
tulajdonítani. Ha kezdetben nagyfokú eltávolítás figyelhet ő meg, a szimulá ­
ciós vizsgálat nem tud különbséget tenni a biológiai és az abiotikus bomlási folyamatok között. Ebben az esetben és minden más esetben, amikor a 
biológiai lebontással kapcsolatban kétségek merülnek fel (például sztrippelés 
esetén), biofilm mintákon analizálni kell az adszorbeált vizsgált vegyi anya ­
got, vagy a biológiai folyamatokra egyértelm űen utaló paramétereken 
alapuló kiegészít ő statikus biológiai lebonthatósági (sz űrő-) vizsgálatokat 
kell végezni. Ilyenek például az oxigénfelvételt vizsgáló módszerek (az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő D, E és F módszerek) (9) vagy a CO
 2 
képződést mér ő vizsgálat (az e melléklet C.4. fejezetében szerepl ő C 
módszer vagy a g őztér CO  2 -tartalmának vizsgálata) (10); oltóanyagként a 
megfelelő reaktorból származó, a vizsgált vegyi anyagnak már kitett oltó ­
anyagot használunk.  
52. Ha a DOC-eltávolítást és az adott vegyi anyag eltávolítását is mértük, az 
eltávolítási százalékok jelent ős különbsége (az el őbbi alacsonyabb, mint az 
utóbbi) olyan szerves köztes termékek jelenlétére utal az elfolyó vízben, amelyek nehezebben lebonthatók lehetnek; ezt vizsgálatnak kell alávetni.
 
Validity of test results  
53. A vizsgálatot akkor tekintjük érvényesnek, ha a DOC (vagy COD) csök ­
kenés foka (D  B ) a kontroll berendezés(ek)ben 2 hetes m űködtetést követ ően 
meghaladja a 80 %-ot, és semmilyen szokatlan jelenséget nem figyeltünk meg.
 
54. Gyorsan lebontható (referencia) vegyi anyag vizsgálata esetén a biológiai 
lebomlás fokának nagyobbnak kell lennie, mint 90 %, és a megismételt 
vizsgálat során kapott érték nem mutathat 5 %-nál nagyobb eltérést. Ha ez 
a két feltétel nem teljesül, felül kell vizsgálni a kísérleti eljárásokat és/vagy más forrásból kell háztartási szennyvizet szerezni.
 
55. Hasonlóképpen, az ugyanazt a vizsgált vegyi anyagot párhuzamosan kezel ő 
berendezésekkel kapott biológiai lebonthatósági értékek között nem lehet 5 %-nál nagyobb eltérés (amennyiben párhuzamos berendezéseket haszná ­
lunk). Ha ez a feltétel nem teljesül, de az eltávolítás nagyfokú, akkor az 
elemzést még három hétig folytatni kell. Ha az eltávolítás foka alacsony, 
akkor meg kell vizsgálni a vizsgált vegyi anyag gátló hatásait, amennyiben még nem ismertek, és ha kivitelezhet ő, akkor a vizsgált vegyi anyagot 
alacsonyabb koncentrációban használva meg kell ismételni a vizsgálatot.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
56. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— azonosító adatok,  
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok.  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgálati elrendezés esetleges módosításai, különösen oldhatatlan és 
illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén,  
— a szerves közeg típusa,  
— a szennyvízben található ipari hulladékok aránya és jellege, amennyiben 
vannak és ismertek,  
— a beoltás módja,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— a vizsgált vegyi anyag törzsoldata – DOC (oldott szerves szén) és TOC 
(összes szerves szén) tartalom, szuszpenzió esetén az elkészítés módja, a 
vizsgálathoz használt koncentráció(k), 10-20 mg/l tartományon kívül es ő 
DOC-koncentráció okai; a hozzáadás módszere és els ő időpontja, a 
koncentráció esetleges változtatásai,  
— átlagos hidraulikus tartózkodási id ő (amikor még nincs biofilm növeke ­
dés), cső forgási sebessége, hozzávet őleges dőlésszög, ha meghatároz ­
ható,  
— biofilm leválás részletei, id ő és intenzitás,  
— vizsgálati h őmérséklet és tartomány,  
— alkalmazott analitikai módszerek,  
Vizsgálati eredmények:  
— mért adatok: DOC, COD, specifikus analízis, pH, h őmérséklet, 
N-vegyületek , ha releváns,  
— a számított D  t (vagy D  tc ), D  B , D  S adatok táblázatos formában és a 
bomlási görbék,  
— az alkalmazkodási fázisra és az állandósult állapotra vonatkozó informá ­
ciók, a vizsgálat id őtartama, a vizsgált vegyi anyag, a referencia-vegyi ­
anyag (ha vizsgált) és a szerves közeg (kontroll berendezésben) lebom ­
lási foka, statisztikai adatokkal és a biológiai lebonthatóságra valamint a 
vizsgálat érvényességére vonatkozó megállapításokkal kiegészítve,  
— az eredmények szöveges elemzése.  
SZAKIRODALOM  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753-758.  
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
 
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214–220.  
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.  
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trick ­
ling filter. JAOCS 43: 92–94.  
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, London.
 
(9) E melléklet C.4. fejezete: A „gyors” biológiai lebonthatóság meghatározása, 
A–F részek.  
(10) ISO 14593 (1998). Vízmin őség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai 
lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szer ­
vetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
8. függelék  
1. ábra  
Forgótárcsás reaktor
  
Glosszárium:  
felülnézet  
A/B nézet  
hajtott tárcsák  
üresjárati tárcsák  
hajtómotor  
fordulatszám-csökkent ő áttétel  
belső perem  
billentő mechanizmus  
kúpfogaskerék-hajtás  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
2. ábra  
Áramlási diagram
  
A: Adagolótartány  
B: Perisztaltikus pumpa  
C: Forgó cs ő 
D: Elfolyó víz gy űjtőtartálya  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK:  
Vizsgált vegyi anyag: Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazásával 
vizsgált anyag vagy keverék.  
Vegyi anyagok: „Meg kell jegyezni, hogy a ’vegyi anyag’ kifejezést tág érte ­
lemben használják az UNCED-szerz ődésekben és a kés őbbi dokumentumokban, 
hogy a termékeket, keverékeket, készítményeket vagy a létez ő rendszerekben a 
hatály megjelölésére használt egyéb kifejezéseket magában foglalja”.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLÓGIAI LEBOMLÁS  
ELEVENISZAP-LÉGZÉSGÁTLÁSI VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
A módszerrel úgy mutatható ki valamely vizsgált anyag hatása a 
mikroorganizmusok m űködésére, hogy meghatározott körülmények 
között a vizsgált anyag különböz ő koncentrációinak jelenlétében 
mérik a légzés sebességét.  
A módszer célja, hogy gyors sz űrést tegyen lehet ővé a mikrobioló ­
giai szennyvízkezel ő telepeket hátrányosan érint ő anyagok azonosí ­
tására, és jelezze, hogy melyek azok a koncentrációk, amelyek még nem gyakorolnak gátló hatást a biológiai lebonthatóságot vizsgáló kísérletekben.
 
A meghatározó vizsgálatot megel őzheti egy dózisbehatároló vizs ­
gálat. Ezzel tájékozódunk arról a koncentrációtartományról, amelyet 
a meghatározó vizsgálat során használnunk kell.  
A vizsgálati protokoll tartalmaz két kontrollt is, vizsgált anyag 
nélkül, egyet a vizsgálati sor elején, egy másikat pedig a végén. 
Az aktivált iszappal végzett minden vizsgálatot referenciaanyaggal is ellenőrizhetjük.
 
A módszert leginkább olyan anyagoknál lehet alkalmazni, amelyek 
vízoldékonyságuk és alacsony illékonyságuk miatt nagy valószín ű­
séggel a vízben maradnak.  
A vizsgálati közegben csak korlátozottan oldódó anyagok esetében 
nem biztos, hogy meghatározható az EC  50 . 
Az oxigén felvételén alapuló eredményekb ől téves következtetéseket 
vonhatnak le akkor, ha a vizsgált anyag hajlamos az oxidatív fosz ­
foriláció szétkapcsolására.  
A vizsgálat elvégzésekor hasznos tudnivalók a következ ők: 
— vízoldékonyság,  
— páranyomás,  
— szerkezeti képlet,  
— a vizsgált anyag tisztasági foka.  
Ajánlás  
Az aktivált iszap esetlegesen patogén mikroorganizmusokat is tartal ­
maz, ezért kell ő óvatossággal kell kezelni.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A légzési sebesség a szennyvízben található mikroorganizmusok 
oxigénfogyasztásának üteme aerob iszapban, amelyet rendszerint 
mg O  2 /mg iszap/óra mértékegységben fejezik ki.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Az adott anyag egy bizonyos koncentrációnál kifejtett gátló hatá ­
sának kiszámításához a légzési sebességet a két kontrollban mért 
légzési sebesség átlagának százalékában fejezik ki:  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ százalékos gátlás  
ahol:  
R s = az oxigén fogyásának sebessége a vizsgált anyag vizsgált 
koncentrációja mellett,  
R c1 = az oxigén fogyásának sebessége az 1. kontrollnál,  
R c2 = az oxigén fogyásának sebessége a 2. kontrollnál.  
Az EC  50 e módszer szerint a vizsgált anyagnak az a koncentrációja, 
amelynél a légzési sebesség a módszerben ismertetett körülmények mellett a kontrollban mérhet őnél 50 %-kal kevesebb.
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Referenciaanyagként a 3,5-diklór-fenol, mint ismert légzésgátló 
anyag használatát javasolják, ezt kell az aktivált iszap minden soro ­
zata esetében az EC  50 -érték szempontjából vizsgálni, így ellen őrizve, 
hogy az iszap érzékenysége nem rendellenes-e.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALAPELVE  
Szintetikus szennyvíz szabványos mennyiségeivel összekevert akti ­
vált iszap légzési sebességét mérik harmincperces és/vagy háromórás 
érintkezési id őt követően. Ugyanezen aktivált iszapnak a vizsgált 
anyag különféle koncentrációinak jelenlétében is megmérik a légzési sebességét minden más szempontból azonos feltételek mellett. A 
vizsgált anyag egy bizonyos koncentrációnál kifejtett gátló hatását 
a két kontrollban mért légzési sebesség átlagának százalékában fejezik ki. Az EC
 50 -értéket a különféle koncentrációknál mért 
meghatározások alapján számítják ki.  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
A vizsgálatok eredményei akkor érvényesek, ha:  
— a két kontroll-légzésisebesség 15 %-nál jobban nem tér el 
egymástól,  
— a 3,5-diklór-fenol hozzáadása mellett mért EC  50 - (harmincperces 
és/vagy háromórás) érték az általánosan elfogadott 5–30 mg/liter 
tartományban van.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Reagensek  
1.6.1.1. A v i z s g á l t a n y a g o l d a t a i  
A vizsgált anyag oldatait a törzsoldatból frissen készítik el a vizs ­
gálat kezdetekor. Ha az alábbiakban ajánlott eljárást követik, a törzs ­
oldat megfelel ő koncentrációja 0,5 g/liter.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. A k o n t r o l l a n y a g o l d a t a i n a k e l k é s z í t é s e  
A 3,5-diklór-fenol oldatát például elkészíthetik 0,5 g 3,5-diklór-fenol 
10 ml 1 M-os NaOH-oldatban történ ő feloldásával, amelyet desztil ­
lált vízzel tovább hígítanak megközelít őleg 30 ml-re, majd állandó 
keverés közben 0,5 M H  2 SO 4 -oldatot adnak hozzá a kicsapódási 
pontig – ehhez körülbelül 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 -re lesz szükség – és 
végül a keverék mennyiségét desztillált vízzel egy literre egészítik ki. Az oldat pH-ja ekkor 7 és 8 között kell, hogy legyen.
 
1.6.1.3. S z i n t e t i k u s s z e n n y v í z  
Szintetikus szennyvíz el őállításakor az alábbi anyagok megadott 
mennyiségeit oldják egy liter vízben:  
— 16 g pepton,  
— 11 g húskivonat,  
— 3 g karbamid,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
1. megjegyzés : A szintetikus szennyvíz „A szintetikus detergen ­
sekben használt felületaktív anyagok biológiai lebonthatóságának meghatározásához javasolt módszer” cím ű OECD-m űszaki jelen ­
tésben megadott recept százszoros koncentrátuma (1976. június 
11.), dikálium-hidrogén-foszfáttal kiegészítve.
 
2. megjegyzés : Ha az elkészített oldatot nem használják fel azonnal, 
sötét helyen 0–4  o C közötti h őmérsékleten egy hétnél nem tovább 
lehet tárolni, olyan körülmények között, amelyek nem okoznak 
változást az oldat összetételében. A tárolás el őtt a közeget sterilizál ­
hatják, vagy a peptont és a húskivonatot csak kevéssel a vizsgálatok megkezdése el őtt adják hozzá. Használat el őtt az oldatot össze kell 
keverni, és a pH-ját be kell állítani.
 
1.6.2.  Készülék  
Mérőberendezés: A készülék formája nem dönt ő jelentőségű. A 
folyadék felszíne felett azonban leveg őt kell hagyni, és a mér őfejnek 
pontosan illeszkednie kell a mér őlombik nyakára.  
Szokásos laboratóriumi berendezésekre van szükség, és különösen a 
következőkre: 
— mérőberendezés,  
— levegőztetőkészülék,  
— pH-elektród és -mér ő készülék,  
— O  2 -elektród.  
1.6.3.  Az inokulum el őkészítése  
A vizsgálathoz mikrobás inokulumként f őleg kommunális szenny ­
vizet kezel ő szennyvíztisztító telepr ől származó aktivált szennyvízi ­
szapot használnak.  
Szükség esetén a laboratóriumba való visszatéréskor rövid ideig, 
például 15 percig tartó ülepítéssel a szennyvíziszapból a durva részecskék eltávolíthatók, majd a felhasználás el őtt kidobják a fels ő 
rétegben található, finomabb szemcsés, szilárd anyagot. Az iszap 
azonban össze is keverhet ő néhány másodperces keveréssel.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Ezenkívül, feltételezve, hogy gátló anyag is jelen lehet, az iszapot 
csapvízben és izotóniás oldatban ki kell mosni. Centrifugálás után a 
felülúszót kidobják (ezt az eljárást háromszor kell megismételni).  
Az iszap kis mennyiségének megmérik a súlyát, és megszárítják azt. 
Ebből az eredményb ől kiszámítható a nedves iszapnak az a mennyi ­
sége, amelyet vízben szuszpendálni kell ahhoz, hogy a kevert folya ­
dékban olyan aktivált iszap jöjjön létre, amelynek szuszpendált 
szilárdrészecske-tartalma 2–4 g/liter között van. E szint a vizsgálati 
közegben 0,8–1,6 g/liter közötti koncentrációt eredményez, ha az alábbiakban ajánlott eljárást követik.
 
Ha az iszapot a begy űjtés napján nem tudják felhasználni, minden 
literjéhez 50 ml szintetikus szennyvizet adnak, amelyet a fentebb 
leírtak szerint készítettek el; ezt azután egy éjszakán át 20 ± 2  o C- 
os hőmérsékleten leveg őztetik. A leveg őztetést addig folytatják, amíg 
a nap folyamán sor nem kerül a felhasználásra. Használat el őtt ellen­ 
őrzik a pH-t, és szükség esetén 6–8 közötti értékre állítják be. A 
kevert folyadékban a szuszpendált szilárd részecskék mennyiségét az előző bekezdésben foglaltak szerint kell megállapítani.
 
Ha ugyanazt az iszapminta-sorozatot további napokon is fel kell 
használni (legfeljebb négy napig), minden munkanap végén további 50 ml szintetikus szennyvizet adnak az iszap minden literjéhez.
 
1.6.4.  A kísérlet végrehajtása  
Időtartam/érintkezési id ő: 30 perc és/vagy három óra, amely alatt 
folyamatosan leveg őztetni kell 
Víz: ivóvíz (szükség esetén klórmentesített) Levegőellátás: tiszta, olajmentes leveg ő. Légáram 
0,5–1 liter/perc 
Mérőberendezés: lapos fenek ű lombik, például BOD- 
lombik 
Oxigénmér ő: megfelel ő oxigénelektród, regisztrálóké ­
szülékkel 
Tápanyagoldat: szintetikus szennyvíz (lásd fentebb) Vizsgált anyag: a vizsgált oldatot a vizsgálat kezdetekor 
frissen kell elkészíteni 
Referenciaanyag: pl. 3,5-diklór-fenol (legalább 3 koncent ­
rációban) 
Kontrollok: inokulumot tartalmazó minta, a vizsgált 
anyag nélkül 
Hőmérséklet: 20 ± 2
 o C. 
A háromórás érintkezési id őre a vizsgált anyagra és a referencia ­
anyagra egyaránt javasolt vizsgálati eljárást az alábbiakban ismer ­
tetik:  
Több edényt (például egyliteres f őzőpoharakat) használnak.  
Legalább öt koncentrációt használnak, amelyek egymástól egy 
állandó 3,2-szeres tényez őnél jobban nem különböznek.  
Induláskor a nulladik percben a szintetikus szennyvíz 16 ml-ét 
vízzel 300 ml-re hígítják. Ehhez 200 ml mikrobás inokulumot 
adnak, majd a teljes keveréket (500 ml) beleöntik az els ő edénybe 
(első kontroll C  1 ). ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
A vizsgálati edényt folyamatosan leveg őztetik annak biztosítására, 
hogy az oldott O  2 -tartalom soha ne essen 2,5 mg/liter alá, és hogy 
a légzési sebesség mérését közvetlenül megel őzően az O  2 koncent­
rációja legalább 6,5 mg/liter legyen.  
A tizenötödik percben (a 15 perc önkényesen választott, de 
megfelelő hosszúságú intervallum) a fentieket megismétlik, azzal a 
különbséggel, hogy most a vizsgált anyag törzsoldatának 100 ml-ét 
adják a 16 ml szintetikus szennyvízhez, miel őtt azt vízzel 300 ml-re 
kiegészítenék, és hozzáadnák a mikrobás inokulumot az 500 ml teljes térfogatig. E keveréket azután egy második edénybe öntik, és 
a fentiek szerint leveg őztetik. Az eljárást a vizsgált anyag törzsolda ­
tának különböz ő koncentrációival 15 percenként megismétlik, ami 
által a vizsgált anyag különböz ő koncentrációi fognak rendelkezé ­
sünkre állni. Végül elkészítenek egy második kontrollt (C
 2 ). 
Három óra elteltével a pH-t feljegyzik, és az els ő edény alaposan 
elkevert tartalmát beleöntik a mér őberendezésbe, majd legfeljebb 10 
percen keresztül mérik a légzési sebességet.  
A meghatározást 15 perces id őközökben a többi edény tartalmával 
megismétlik úgy, hogy az érintkezési id ő minden edényben három 
óra legyen.  
A referenciaanyagot minden mikrobásinokulum-sorozat esetében 
azonos módon vizsgálják.  
Ettől eltérő eljárást kell alkalmazni, például egynél több oxigén ­
mérőre lesz szükség akkor, ha a méréseket 30 perces érintkezési 
idő után akarják elvégezni.  
Ha a kémiai oxigénigény mérésére van szükség, további edényeket 
készítenek el ő, amelyek tartalmazzák a vizsgált anyagot, a szintetikus 
tápoldatot, valamint vizet, de nincs bennük aktivált iszap. Az oxigén ­
igényt 30 perces és/vagy háromórás (érintkezési id ő) levegőztetés 
után mérik, és feljegyzik.  
2. ADATOK ÉS ÉRTÉKELÉS  
A légzési sebességet a rögzít őkészülék nyomvonalából számítják, 
megközelít őleg 6,5 mg O  2 /liter és 2,5 mg O  2 /liter között, vagy 10 
perces id őszak alatt, amikor a légzési sebesség lassú. A légzési 
görbének az a része, amely alatt a légzési sebességet mérjük, lineáris 
kell, hogy legyen.  
Ha a két kontroll légzési sebessége között 15 %-nál nagyobb az 
eltérés, vagy ha a referenciaanyag EC  50 -értéke (30 perces és/vagy 
háromórás) nincs az elfogadott tartományon belül (5–30 mg/liter 
között 3,5-diklór-fenolnál), a vizsgálatot érvénytelennek kell tekin ­
teni, és meg kell ismételni.  
A százalékos gátlást minden egyes vizsgálati koncentrációra kiszá ­
mítják (lásd az 1.2. pontot). A százalékos gátlást normál logarit ­
musos papíron vagy log-probit papíron a koncentráció függvényében 
ábrázoljuk, és így számítjuk ki az EC  50 -értéket.  
Az EC  50 -értékek 95 %-os konfidenciaszintjét a szabványos eljárá ­
sokkal határozhatjuk meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— vizsgált anyag: kémiai azonosítási adatok,  
— vizsgálati rendszer: az aktivált iszap forrása, koncentrációja és 
esetleges el őzetes kezelése,  
— vizsgálati körülmények:  
— a reakcióelegy pH-ja a légzési mérés el őtt, 
— vizsgálati h őmérséklet,  
— vizsgálat id őtartama,  
— referenciaanyag és mért EC  50 értéke,  
— abiotikus oxigénfelvétel (ha van).  
— eredmények:  
— valamennyi mért adat,  
— gátlási görbe és az EC  50 kiszámításának módja,  
— EC  50 és – ha lehetséges – a 95 %-os konfidenciahatárok, 
EC 20 - és EC  80 -értékek,  
— minden megfigyelés és minden eltérés a vizsgálati módszer ­
től, amely az eredményeket befolyásolhatta.  
3.2. AZ ADATOK ÉRTELMEZÉSE  
Az EC  50 -értéket úgy kell tekinteni, mint amely csupán iránymutatást 
jelent a vizsgált anyag esetleges vagy valószín ű toxicitásának megíté ­
léséhez akár az aktivált iszappal végzett szennyvízkezelés, akár a szennyvízben jelen lév ő mikroorganizmusok tekintetében, hiszen a 
tényleges környezetben el őforduló, igen bonyolult kölcsönhatásokat 
laboratóriumi vizsgálatokkal nem lehet pontosan utánozni. Ezenkívül 
az olyan típusú vizsgált anyag, amely az ammónia oxidációját gátolja, szintén adhat atipikus gátlási görbét. Ezért az ilyen grafiko ­
nokat kell ő óvatossággal kell értelmezni.
 
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) International Standard ISO 8192:1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, 
p. 245.  
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also described by:
 
(5) Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.  
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.  
(7) OECD, Párizs, 1981, 209. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(84) 30 végleges.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLÓGIAI LEBOMLÁS  
MÓDOSÍTOTT SCAS-VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
1.1. BEVEZETÉS  
E módszernek az a célja, hogy felmérje a vízoldékony, nem illékony 
szerves anyagok végs ő biológiai lebontásának lehet őségeit akkor, ha 
azok statikus vizsgálati körülmények között nagy töménység ű mikro­
organizmusnak vannak kitéve. A mikroorganizmusok életképességét 
ezen időszak alatt ülepítettszennyvíz-tápoldat naponkénti hozzáadá ­
sával lehet fenntartani. (A hétvégi követelményekhez a szennyvizet 4
 o C-os hőmérsékleten lehet tárolni. Másik megoldásként az OECD- 
megerősítési vizsgálat szintetikus szennyvizét is felhasználhatják.)  
A szuszpendált szilárd részecskéken fizikokémiai adszorpció is létre ­
jöhet, amit az eredmények értékelésekor figyelembe kell venni (lásd a 3.2. pontot).
 
A folyadékfázis hosszú visszatartási ideje (36 óra), valamint a 
tápanyagok szakaszos hozzáadása miatt a vizsgálat nem teljesen 
szimulálja a szennyvíztisztító telepen tapasztalható viszonyokat. A különféle vizsgált anyagokkal nyert eredmények azt jelzik, hogy a vizsgálati módszernek igen nagy a biológiai lebonthatósági poten ­
ciálja.
 
A vizsgálathoz el őírt feltételek igen kedvez őek a vizsgált anyag 
lebontására képes mikroorganizmusok szelekciójához és/vagy adap ­
tációjához. (Az eljárást más vizsgálatokhoz szükséges akklimatizált 
inokulum el őállítására is felhasználhatják.)  
E módszerben az oldott szerves szén koncentrációjának mérését 
használják a vizsgált anyag teljes biológiai lebonthatóságának meghatározására. A DOC-értéket kedvez őbb savanyítás és átsz űrés 
után meghatározni, nem pedig a C
 összes  – C  szervetlen  különbségének 
értékeként.  
A fenti módszer mellett párhuzamosan alkalmazott specifikus anali ­
tikai módszer segíthet az anyag primer lebomlásának értékelésében 
(a kiindulási molekulaszerkezet elt űnése).  
A módszer csak olyan szerves vizsgált anyagokra megfelel ő, 
amelyek(nek) a kísérletben használt koncentrációban:  
— a vizsgálati körülmények között vízben oldódnak (literenként 
legalább 20 mg oldott szerves szén),  
— páranyomása elhanyagolható,  
— a baktériumokat nem gátolják,  
— a vizsgálati rendszerben jelent ős mértékben nem adszorbeá ­
lódnak,  
— habképz ődés útján nem t űnnek el a vizsgált oldatból.  
Meg kell határozni a vizsgált anyag szervesszén-tartalmát.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
A vizsgált anyag f őbb összetev ői egymáshoz viszonyított részará ­
nyának ismerete hasznos lehet a kapott eredmények értékelése során, 
különösen azon esetekben, amikor az eredmények alacsony számér ­
tékűek vagy marginálisak.  
Az anyag mikroorganizmusokra gyakorolt mérgez ő hatásának isme ­
rete kívánatos az alacsony számérték ű eredmények értékelésénél és a 
megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásánál.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
C t = a vizsgált anyag koncentrációja szerves szénben kifejezve a 
levegőztetési id őszak kezdetén a szennyvízben jelen lév ő, 
illetve ahhoz hozzáadott állapotban (mg/liter),  
C t = az oldott szerves szén mennyisége a vizsgált anyag felülúszó 
folyadékában a leveg őztetési időszak végén (mg/liter),  
C c = az oldott szerves szén mennyisége a kontroll felülúszó folya ­
dékában a leveg őztetési időszak végén (mg/liter).  
A biológiai lebonthatóság mértékét e módszerben a szerves szén 
eltűnésének arányában határozzuk meg. A biológiai lebonthatóságot 
az alábbiak szerint fejezhetjük ki:  
1. A naponta hozzáadott anyag mennyiségére es ő D da százalékos 
eltávolítása:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100  [1] 
ahol:  
D da = biológiai lebonthatóság/napi hozzáadott mennyiség.  
2. Az egyes napok kezdetén jelen lév ő anyag mennyiségére es ő D ssd 
százalékos eltávolítása:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2 (b)]  
ahol:  
D ssd = biológiai lebonthatóság/anyag mennyisége a nap 
elején;  
az i és (i + 1) index a mérés napját jelzi.  
A 2(a) képlet alkalmazása akkor ajánlott, ha a kifolyó vízben a 
DOC naponta változik, míg a 2(b) képletet inkább akkor használ ­
hatjuk, ha a kifolyó vízben a DOC viszonylag állandó szinten 
marad napról napra.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Egyes esetekben, ha új anyagokat vizsgálunk, hasznos lehet a refe ­
renciaanyagok alkalmazása; konkrét referenciaanyagokat azonban egyelőre nem tudunk ajánlani.
 
A körvizsgálatban értékelt számos vegyület adatait megadják az 1. 
függelékben, azért, hogy a módszer kalibrálását id őről időre el 
lehessen végezni, és az eredmények egybevethet őek legyenek 
akkor is, ha azokat más módszer alkalmazásával nyerték.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALAPELVE  
Szennyvíztisztító telepr ől származó aktivált iszapot helyeznek egy 
félig folyamatos aktiváltiszap-egységbe (Semi-Continuous Activated Sladge unit = SCAS). Hozzáadják a vizsgált anyagot és az ülepített 
kommunális szennyvizet, majd a keveréket 23 órán keresztül leve ­
gőztetik. Ezután a leveg őztetést leállítják, az iszapot ülepítik, és a 
felülúszó folyadékot eltávolítják.
 
A levegőztetőkamrában visszamaradó iszapot a vizsgált anyag és a 
kommunális szennyvíz további mennyiségével elkeverik, majd a 
ciklust megismétlik.  
A biológiai lebonthatóságot a felülúszóban található oldott szerves 
szén mennyiségének meghatározásával állapítják meg. Ezt az értéket 
vetik egybe a csak ülepített szennyvízzel kezelt kontrollcs őben talál­
ható folyadék hasonló értékével.  
Ha specifikus analitikai módszert használunk, mérhet ő a kiindulási 
molekula koncentrációjának a biológiai bomlás következtében el őál­
lott változása is (els ődleges biológiai bomlás).  
1.5. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
Az oldott szerves szén eltávolításán alapuló módszer reprodukálha ­
tósága még nem került meghatározásra. (Az els ődleges bomlást 
tekintve, a nagymértékben bomló anyagokról igen pontos adatokat nyerhetünk.)
 
A módszer érzékenységét nagymértékben a kontrollértékek változé ­
konysága és kisebb mértékben az oldott szerves szén, illetve a vizs ­
gált vegyület folyadékkoncentrációjának az egyes ciklusok elején 
történő kimutatási pontossága határozza meg.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Előkészületek  
Megfelelő mennyiség ű tiszta leveg őztetőedényt vagy az eredeti 1,5 
literes, SCAS-vizsgálathoz használt egységet alkalmazhatják, amelybe beillesztik a leveg őbeeresztő csöveket (1. ábra) minden, a 
vizsgált anyagot tartalmazó, illetve kontrolledény esetében. Vatta ­
szűrőn áteresztett s űrített leveg őt vezetnek a vizsgálati egységekbe, 
amely szerves szenet nem tartalmazhat, és amelyet el őzetesen vízzel 
telíteni kell a párolgási veszteségek csökkentésére.
 
Literenként 1–4 gramm szuszpendált szilárd részecskét tartalmazó 
kevert folyadékot szereznek be egy f őként kommunális szennyvizet 
kezelő tisztítóm űből. A kevert folyadék mintegy 150 ml-ére van 
szükség minden egyes leveg őztetőegységhez.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
A vizsgált anyag törzsoldatait desztillált vízzel állítják el ő; normális 
esetben a szükséges koncentráció 400 mg szerves szén/liter, ami a 
vizsgált vegyület 20 mg szén/liter koncentrációját eredményezi minden leveg őztetési ciklus elején, ha biológiai bomlás nem történik.
 
Ennél nagyobb koncentrációk is megengedettek, ha a mikroorganiz ­
musokra gyakorolt toxicitás lehet ővé teszi.  
A törzsoldat szervesszén-tartalmát meg kell mérni.  
1.6.2.  Vizsgálati körülmények  
A vizsgálatot 20–25  o C közötti h őmérsékleten kell elvégezni.  
Aerob mikroorganizmusok nagy koncentrációit használják (1–4 g/liter 
közötti szuszpendáltszilárdrészecske-tartalom), és a tényleges vissza ­
tartási idő 36 óra. A hozzáadott szennyvízben található széntartalmú 
anyagok rendszerint nyolc órával az egyes leveg őztetési ciklusok 
megkezdését követ ően erőteljesen oxidálódnak. Ezt követ ően az 
iszap endogén módon lélegzik a leveg őztetési időszak végéig, amely 
időszak alatt az egyetlen rendelkezésre álló szubsztrátum a vizsgált 
anyag, hacsak az is nem metabolizálódott. E jellemz ők a keverék ismé ­
telt napi újraoltásával igen kedvez ő feltételeket teremtenek olyan 
esetekben, amikor kommunális szennyvizet használunk tápoldatként, mind az akklimatizáció, mind pedig a nagyfokú biológiai bomlás vizs ­
gálatához.
 
1.6.3.  A kísérlet végrehajtása  
Kevert folyadékmintát vesznek egy f őként háztartási szennyvizet 
kezelő tisztítóm űből vagy laboratóriumi készülékb ől, és azt a labo ­
ratóriumi felhasználásig aerob körülmények között tartják. A kevert 
folyadékból mintegy 150 ml-t töltenek be minden egyes leveg őztető­
egységbe, a vizsgált anyagot tartalmazó és a kontrollegységbe egya ­
ránt (ha az eredeti SCAS-egységet használják, az említett mennyi ­
ségeket tízzel kell megszorozni), és megkezdik a leveg őztetést. 23 
óra elteltével a leveg őztetést leállítják, és az iszapot 45 percen át 
ülepítik. Egymás után megnyitják az edények csapjait, és levesznek a felülúszó folyadékból 100 ml-t. Közvetlenül felhasználás el őtt 
mintát vesznek az ülepített kommunális szennyvízb ől, és ebb ől 
100 ml-t hozzáadnak az egyes leveg őztetőegységekben maradt iszap ­
hoz. Ezután ismét elkezdik a leveg őztetést. E szakaszban még nem 
adnak vizsgált anyagot az iszaphoz, és az egységeket naponta 
táplálják a kommunális szennyvízzel egészen addig, míg az ülepítés 
után tiszta felülúszó folyadékot nem nyernek. Ez rendszerint legfel ­
jebb két hetet vesz igénybe, amikorra a felülúszó folyadékban talál ­
ható oldott szerves szén mennyisége az egyes ciklusok elején vala ­
mely állandó érték felé közelít.
 
Ezen időszak végén az ülepített iszapokat összekeverik, és az ered ­
ményül kapott vegyes iszapból minden egységhez 50 ml-t adnak.  
A kontrollegységhez 95 ml ülepített szennyvizet és 5 ml vizet adnak, 
míg a vizsgálati egységhez 95 ml ülepített szennyvíz mellé 5 ml-t adnak hozzá a vizsgált anyag megfelel ő törzsoldatából (400 mg/liter). 
Ismét megkezdik a leveg őztetést, és újabb 23 órán keresztül folytat ­
ják. Ezután az iszapot 45 percen át ülepítik, majd a felülúszót leszív ­
ják, és meghatározzák az oldottszervesszén-tartalmat.
 
A fenti feltöltés-leszívás eljárást naponta kell ismételni az egész vizs ­
gálat folyamán.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Az ülepítés el őtt szükség lehet az egység falának megtisztítására, 
hogy a szilárd részecskék ne gy űljenek össze a folyadék szintje 
fölött. A (keresztbe) szennyez ődés megakadályozása érdekében 
minden egységnél külön kefét vagy kaparót kell használni.  
Ideális esetben az oldott szerves szén mennyiségét a felülúszó folya ­
dékban naponta határozzák meg, ám ennél kevésbé gyakori meghatá ­
rozás is megengedhet ő. Elemzés el őtt a folyadékot mosott, 0,45 μm- 
es membránsz űrőn átszűrik, és centrifugálják. A membránsz űrők 
akkor megfelel ők, ha biztosítható, hogy nem bocsátanak ki szenet, 
és nem nyelnek el semmit a vizsgált anyagból a sz űrés során. A 
minta hőmérséklete a centrifugában nem haladhatja meg a 40  o C-ot.  
A biológiai úton csekély mértékben vagy egyáltalán nem bomló 
anyagok esetében a vizsgálat ideje meghatározhatatlan, de a tapasz ­
talatok szerint legalább 12 és legfeljebb 26 hétnek kell lennie.  
2. ADATOK ES ÉRTÉKELÉS  
A vizsgálati egységekben, illetve a kontrollegységekben található 
felülúszó folyadék oldottszervesszén-mennyiségének értékét ábrázo ­
lják az id ő függvényében.  
A biológiai bomlás folyamatának el őrehaladásával a vizsgálati 
anyagban található szint közelíti a kontrollszintet. Amikor a két szint közötti különbség három egymást követ ő mérés során állan ­
dónak bizonyul, olyan számú további mérést végeznek, amely 
elegendő a kapott adatok statisztikai feldolgozásához, és kiszámítják 
a vizsgált anyag százalékos biológiai lebonthatóságát (D
 da vagy D  ssd , 
lásd az 1.2. pont).  
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek lehet őség szerint az alábbi információkat 
kell tartalmaznia:  
— minden információ a használt szennyvíz típusáról, a felhasznált 
egységről, a vizsgált anyagra vonatkozó vizsgálati eredmények ­
ről, a referenciaanyagról – ha volt –, valamint a vakpróbáról,  
— hőmérséklet,  
— biológiai bomlási görbe, a kiszámítás módjának leírásával (lásd 
az 1.2. pontot),  
— dátum és helyszín, ahonnan a vizsgálati organizmusok mintáját 
vettük, adaptációs állapotuk, koncentráció stb.,  
— a vizsgálati eljárás lépéseiben történt bármely változtatás tudomá ­
nyos okai,  
— aláírás és dátum.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Miután az ezzel a módszerrel vizsgálandó anyag biológiailag nem 
könnyen lebontható, a DOC kizárólag biológiai lebonthatóság révén való eltűnése rendes esetben fokozatosan, napok vagy hetek alatt 
játszódik le, kivéve azon eseteket, amikor a hirtelen akklimatizáló ­
dást néhány hét után az anyag átmenet nélküli elt űnése jelzi.
 
Bizonyos esetekben azonban a fizikokémiai felszívódás fontos 
szerepet játszhat; ezt az jelzi, ha rögtön az elején teljesen vagy 
részben elt űnik a hozzáadott DOC. Hogy ezt követ ően mi történik, 
az olyan tényez őkön múlik, mint az adszorpció mértéke vagy a 
szuszpendált szilárd részecskék koncentrációja a kiöntött kifolyó szennyvízben. A kontroll-, illetve a vizsgált anyagot is tartalmazó 
felülúszó DOC-koncentrációi közötti különbség rendszerint lassan 
emelkedik az eredeti alacsony értékr ől, és ez a különbség aztán 
meg is marad ezen az új értéken a vizsgálat további szakaszaiban, hacsak nem következik be akklimatizáció.
 
További vizsgálatokra van szükség, ha az adszorpciót és a tényleges 
(vagy részleges) biológiai bomlást el akarják különíteni. Ezt számos 
módon el lehet végezni, de a legmeggy őzőbb az, ha a felülúszót 
vagy az iszapot használják fel inokulumként egy alapbeállító vizs ­
gálathoz (lehet őleg egy légzésmér ő vizsgálathoz).  
Az olyan típusú vizsgált anyagok, amelyek DOC-értékei ezen vizs ­
gálatban gyorsan és nem felszívódás útján csökkennek, potenciálisan biológiailag lebonthatónak tekinthet ők. A részleges és nem felszí ­
vódás útján történ ő csökkenés azt jelzi, hogy a vegyület legalább 
részben bomlik biológiailag.
 
Ha a DOC-érték nem vagy csak alig csökken, annak oka lehet az is, 
hogy a vizsgált anyag gátolja a mikroorganizmusokat, amit az is jelezhet, hogy az iszap szétesik és elvész, zavaros felülúszót ered ­
ményezve. Ilyenkor a vizsgálatot a vizsgált anyag alacsonyabb 
koncentrációjával kell megismételni.
 
A specifikus analitikai módszerek vagy a  14 C izotóppal jelölt vizsgált 
anyag használata nagyobb érzékenységet tesz lehet ővé. Ha  14 C 
izotóppal jelölt vegyületet alkalmaznak, a biológiai bomlás tényét a  
14 CO 2 visszanyerési aránya fogja meger ősíteni.  
Ha az eredményeket els ődleges bomlás formájában is megadják, 
lehetőség szerint magyarázatot kell f űzni a kémiai szerkezet olyan 
jellegű változásához, amely a kiindulási vegyület reakciójának 
elmaradását okozza.  
A vak vizsgálati közeg reakciója mellett az analitikai módszer hite ­
lesítését is meg kell adni.  
4. HIVATKOZOTT SZAKIRODALOM  
(1) OECD, Párizs, 1981, 302. A. vizsgálati irányelv, a Tanács hatá ­
rozata, C(81) 30 végleges.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
1. függelék  
SCAS vizsgálat: az eredmény példái  
Anyag C t 
(mg/l) C t – C  c 
(mg/l) Százalékos 
bomlás 
D da Vizsgálat id őtar­
tama 
(nap) 
4-acetil-aminobenzén-szulfonát 17,2 2,0 85 40 
Tetra- propilén-benzol-szulfonát 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Dietilén-glikol 16,5 0,2 98,8 40 
Aniline 16,9 1,7 95,9 40 Ciklopentán-tetra-karboxilát 7,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
2. Függelék  
A vizsgálati berendezés példája  
1. ábra
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOKONCENTRÁCIÓ VIZSGÁLATA: ÁTFOLYÁSOS HAL 
VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a biokoncentrációs módszer megfelel az OECD TG 305-nek 
(1996).  
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a módszer a különböz ő anyagoknak a halakban található, átfo ­
lyásos körülmények közötti biokoncentrációs potenciáljának jellem ­
zésére szolgáló eljárást ír le. Bár az átfolyásos vizsgálatot el őnyben 
kell részesíteni, félstatikus rendszerek is megengedhet ők, feltéve 
hogy az érvényességi követelményeknek megfelel.  
A módszer elegend ő részlettel szolgál a vizsgálat kivitelezéséhez, 
miközben kell ő szabadságot enged a kísérlet kialakításának adaptá ­
lására az egyes laboratóriumok körülményeihez és a vizsgálati 
anyagok változó jellemz őihez. A módszer leghatékonyabban 1,5–6,0 
log P  ow -értékkel rendelkez ő stabil szerves vegyi anyagokra alkalmaz ­
ható (1), de még alkalmazható er őteljesen lipofil anyagokra (log P  ow 
> 6,0). Az el őre becsülhet ő biokoncentrációs tényez ő (BCF), amit 
néha K  B -ként is jelölnek, az ilyen er ősen lipofil anyagokra feltehe ­
tően nagyobb lesz, mint a laboratóriumi kísérletekb ől várt állandósult 
biokoncentrációs tényez ő (BCF  ss ) értéke. A kb. 9,0-ig terjed ő log 
P ow -értékkel rendelkez ő szerves vegyi anyagok el őre becsült biokon ­
centrációs tényez ője Bintein és mtsai egyenletével kapható meg (2). 
A biokoncentrációs potenciált jellemz ő paraméterekhez tartozik a 
felvételi sebességi állandó (k  1 ), a tisztulási sebességi állandó (k  2 ) 
és a BCF  ss . 
A radioaktívan jelzett vizsgálati anyagok megkönnyíthetik a víz- és 
halminták analízisét, és felhasználhatók annak eldöntésére, hogy kell- 
e bomlástermék-azonosítást és -kvantifikálást végezni. Amennyiben 
valamennyi radioaktív maradékot megmérték (például égetéssel vagy szövetfeloldással), a BCF a kiindulási vegyületen, bármely visszatar ­
tott metaboliton és az asszimilált szénen is alapul. Valamennyi radio ­
aktív maradékon alapuló BCF-eket ezért nem lehet közvetlenül 
összehasonlítani csak a kiindulási vegyület sajátos kémiai analízi ­
séből nyert BCF-fel.
 
Radioaktív jelzési vizsgálatoknál kiürülési fázis alkalmazható a 
kiindulási vegyületre alapozott BCF meghatározása céljából, és a 
fő metabolitok jellemezhet ők, amennyiben szükségesnek min ősül. 
Az anyagmetabolizmus-vizsgálatot a biokoncentráció-vizsgálattal kombinálni is lehet a szövetekben lev ő maradékok analízise és 
azonosítása révén.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
A biokoncentráció/bioakkumuláció a vizsgált anyag koncentráció ­
jának növekedése egy szervezetben/en (meghatározott szöveteiben/n) a vizsgált anyagnak a környez ő közegben lév ő koncentrációjához 
viszonyítva.
 
A biokoncentrációs tényez ő (BCF, vagy K  B ) a vizsgált anyag 
halban/on, vagy meghatározott szöveteiben/n (C  f , μg/g [ppm]) lév ő 
koncentrációja az akkumulációs vizsgálat felvételi fázisának bármely 
időpontjában és a vegyszer környez ő közegben lév ő koncentráció ­
jának hányadosa a (C  w , μg/ml [ppm]).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Az állandósult biokoncentrációs tényez ő (BCF  ss , vagy K  B ) nem 
változik jelent ősen egy hosszabb id őtartam során, amely alatt a vizs ­
gált anyag koncentrációja állandó a környez ő közegben.  
Plató, vagy állandósult állapot látható a halban mért vizsgált anyag 
(C f ) időfüggő ábráján, amennyiben a görbe párhuzamos az id őten­
gellyel, és C  f három egymást követ ő, legalább két nap különbséggel 
vett mintában ± 20 %-on belül vannak az analízisek egymáshoz képest, és nincs számottev ő különbség a három mintavételi periódus 
között. Összevont minták analízisénél legalább négy egymást követ ő 
analízis szükséges. Olyan vizsgált anyagoknál, amelyek felvétele 
lassú, sokkal megfelel őbbek a hétnapos id őközök.
 
A biokoncentrációs tényez őket, amelyeket kinetikus koncentrációs 
tényezőnek (BCF  K ) neveznek, közvetlenül a kinetikai sebességállan ­
dókból (k  1 /k 2 ) számolják.  
Az oktanol-víz megoszlási együttható (P  ow ) a vegyi anyag n-okta ­
nolban és vízben, egyensúlyban mért oldhatóságának aránya (A.8. módszer), K
 ow -vel is jelölik. A vegyi anyag vízi szervezetekbeli 
biokoncentrációs potenciálja jelzésére a P  ow logaritmusát használják.  
Az expozíciós vagy felvételi fázis az az id őtartam, amíg a hal érint ­
kezik a vizsgált anyaggal.  
A felvételi sebességi állandó (k  1 ) a vizsgált anyag koncentrációjának 
– halban/on (vagy meghatározott szöveteiben/n) való – növekedési 
sebességét definiáló numerikus érték, az expozíciós id ő alatt (k  1 l/­
nap  –1 -ben van kifejezve).  
Az expozíció utáni, vagy tisztulási (ürülési) fázis a kísérleti halból 
(vagy meghatározott szövetéb ől) a vizsgált anyagot tartalmazó 
közegből az anyagot nem tartalmazó közegbe történ ő kiürülésének 
(vagy nettó ürülése) id őtartama.  
A tisztulási (ürülési) sebességi állandó (k  2 ) a vizsgált anyag koncent ­
rációjának a halban (vagy meghatározott szöveteiben) való csökke ­
nési sebességét definiáló numerikus érték, a kísérleti halnak a kísér ­
leti anyagot tartalmazó közegb ől az anyagot nem tartalmazó közegbe 
való áthelyezését követ ően (k  2 1/nap-ban van kifejezve).  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálat két fázisból áll: az expozíciós (felvételi) és az expozíció 
utáni (tisztulási) fázisból. A felvételi fázis alatt az egy fajhoz tartozó halak különálló csoportjai a vizsgált anyag legalább két koncentrá ­
ciójával érintkeznek. Ezután átkerülnek a vizsgált anyagot nem tartal ­
mazó közegbe tisztulási fázisra. A tisztulási fázis mindig szükséges, 
kivéve, ha az anyag felvétele a felvételi fázis alatt elhanyagolható volt (pl. a BCF kisebb 10-nél). A vizsgált anyag koncentrációját a halban/on (vagy meghatározott szövetében/n) a vizsgálat mindkét 
fázisa alatt figyelemmel kísérik. A két kísérleti koncentráción 
túlmenően, a halak egy kontrollcsoportját azonos körülmények 
között tartják – leszámítva a vizsgált anyag hiányát – annak érdeké ­
ben, hogy a biokoncentráció által okozott ártalmas hatások a 
megfelelő kontrollcsoporthoz legyenek viszonyíthatók, és meghatá ­
rozható legyen a vizsgált anyag háttér-koncentrációja.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve, ha az egyensúly bizonyítottan 
már korábban beáll. A 3. függelék egyenletével lehet következtetni a 
felvételi fázis hosszára és az állandósult állapot eléréséhez szükséges időre. A tisztulási periódus ezután a hal egy másik tiszta, ugyanolyan 
közeget, de vizsgált anyagot nem tartalmazó edénybe való áthelye ­
zésével kezd ődik. Amennyiben lehetséges, a biokoncentrációs 
tényezőt lehetőleg az állandósult állapotban a halban (C
 f ) és vízben 
mért (C  w ) koncentráció arányaként (BCF  ss ) is, továbbá a felvételi 
(k 1 ) és tisztulási (k  2 ) sebességi állandó arányával, els őrendű kinetikát 
feltételezve, kinetikai biokoncentrációs tényez őként (BCF  K ) kell 
kiszámítani. Amennyiben nyilvánvalóan nem els őrendű a kinetika, 
összetettebb modelleket kell alkalmazni (5. függelék).  
Amennyiben 28 nap alatt nem áll be az állandósult állapot, a 
felvételi fázist meg kell hosszabbítani az állandósult állapot eléré ­
séig, vagy 60 napra, amelyik el őbb következik be; ezután kezd ődik 
a tisztulási fázis.  
A felvételi sebességi állandót, a tisztulási (ürülési) sebességi állandót 
(vagy állandókat, amennyiben összetettebb modellt alkalmaztak), a 
biokoncentrációs tényez őt, és amennyiben lehetséges, e paraméterek 
mindegyike esetében a konfidenciahatárokat, a halban és a vízben mért vizsgálatianyag-koncentrációt legjobban leíró modell szerint számítják ki.
 
A BCF a hal teljes nedves tömegének függvényeként van kifejezve. 
Különleges célokra azonban meghatározott szövetek és szervek (pl. 
izom, máj) is használhatók, amennyiben a hal elég nagy, illetve ha a hal ehető (filé) és nem ehet ő (zsiger) részekre osztható. Mivel 
számos szerves anyagnál egyértelm ű kapcsolat van a biokoncentrá ­
ciós potenciál és a lipofilitás között, ezért ugyanilyen kapcsolat van a 
kísérleti hal lipidtartalma és az ilyen anyagok megfigyelt biokoncent ­
rációja között is. Ezért a nagy lipofilitású (azaz log P
 ow > 3) anya ­
gokra kapott vizsgálati eredmények változatosságának e forrása csök ­
kentéséhez a biokoncentrációt a teljes testtömegen kívül a lipidtar ­
talom vonatkozásában is ki kell fejezni.  
Amennyiben megvalósítható, a lipidtartalmat ugyanazon a biológiai 
anyagon kell meghatározni, mint amit a vizsgált anyag koncentráci ­
ójának meghatározására használtak.  
1.4. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
A biokoncentrációs vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgált anyagról az 
alábbi adatokra van szükség:  
— oldhatóság vízben,  
— oktanol-víz megoszlási együttható P  ow (K ow -vel is jelölik, az 
A.8-ban megadott HPLC módszerrel meghatározva),  
— hidrolízis,  
— fototranszformáció vízben nap- vagy szimulált napsugárzásnál és 
a biokoncentrációs vizsgálatnál alkalmazott sugárzási feltételek 
mellett,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— felületi feszültség (azaz olyan anyagoknál, ahol P  ow -t nem lehet 
meghatározni),  
— gőznyomás,  
— gyors biológiai lebonthatóság (adott esetben).  
További megkövetelt információ a vizsgálat során használt halfajokra 
kifejtett toxicitás, lehet őleg az aszimptotikus (azaz az id őtől függet­
len) LC  50 . Legyen ismert pontosságú és érzékenység ű analitikai 
módszer a vizsgált anyag kvantifikálására a vizsgált oldatokban és 
a biológiai anyagban, a mintakészítés és tárolás részleteivel együtt. A 
vizsgált anyag vízben és halszövetekben érvényes analitikai kimuta ­
tási határának is ismertnek kell lenni. Amennyiben  14 C-vel jelzett 
vizsgált anyagot használnak, ismerni kell a szennyez ő anyagokhoz 
tartozó százalékos radioaktivitást.  
1.5. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
Az alábbi feltételeknek kell teljesülniük a vizsgálat érvényességéhez:  
— a hőmérséklet-ingadozás kisebb ± 2  o C-nál,  
— az oldott oxigén koncentrációja nem eshet 60 %-os telítettség alá,  
— a kamrákban a vizsgált anyag koncentrációját a felvételi fázisban 
mért értékek átlagának ± 20 %-án belül kell tartani,  
— a vizsgálat végén a kontroll és a kezelt halak mortalitásának és 
egyéb káros hatásoknak/betegségeknek 10 %-nál kisebbnek kell lenni; amennyiben a vizsgálat több hétig vagy hónapig tart, a 
pusztulásnak, vagy más ártalmas hatásnak a halak mindkét 
csoportjában kisebbnek kell lenni havi 5 %-nál, és nem halad ­
hatja meg a 30 %-ot összesen.
 
1.6. REFERENCIAVEGYÜLETEK  
Az ismert biokoncentrációs potenciálú referenciavegyületek haszná ­
lata hasznos lehet a kísérleti eljárások ellen őrzése során, amennyiben 
elvárt. Bár meghatározott anyagok még nem ajánlhatók.  
1.7. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.7.1.  Eszközök  
A vizsgálat során kerülni kell az olyan anyagok használatát, amelyek 
oldódhatnak, szorbeálódhatnak vagy kimosódhatnak az eszközökb ől, 
és ártalmasak lehetnek a halakra. Szabványos, kémiailag inert anyagból készült, a töltési sebességnek megfelel ő térfogatú négy ­
szögletes vagy hengeres tartályok használhatók. A puha m űanyag 
csövek használatát minimalizálni kell. Teflon
 ® , rozsdamentes acél 
és/vagy üvegcsövek használata ajánlott. A tapasztalatok alapján szükséges lehet a nagy abszorpciós együtthatójú anyagok, mint szin ­
tetikus piretroidok esetében, szilanizált üveg használata. Ilyen 
esetekben a felszerelést használat után el kell dobni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Víz  
A kísérletekhez általában természetes vizet kell használni, amely nem 
szennyezett, és állandó min őségű. A hígításra használt víz min ő­
ségének lehet ővé kell tennie a választott halfajok túlélését az 
akklimatizációs és a kísérleti id őszakok alatt anélkül, hogy bármilyen 
rendellenes küls ő megjelenés vagy viselkedés jelentkezne. Ideális 
esetben a vizsgált fajok bizonyítottan képesek túlélni, fejl ődni és 
szaporodni a hígítóvízben (pl. laboratóriumi tenyészetben, vagy élet ­
ciklusra vonatkozó toxicitásvizsgálatnál). A vizet legalább a pH-val, 
keménységgel, valamennyi szilárd anyaggal, összes szerves szénnel, és lehetőleg ammónium-, nitrittartalommal és alkalitással, és tengeri 
fajoknál sótartalommal is jellemezni kell. A halak optimális jólétéhez 
fontos paraméterek teljesen ismertek, de az 1. függelék megadja számos paraméter esetében az ajánlott maximális koncentrációt a vizsgált édes- és tengervízre.
 
A kísérleti id őszak alatt a víznek állandó min őségűnek kell lenni. A 
pH-értékének 6,0 és 8,5 között kell lenni, de egy adott vizsgálat során ± 0,5 pH egységnyi tartományon belül kell maradnia. Analízis 
céljából id őközönként mintákat kell venni, annak érdekében, hogy a 
hígítóvíz ne befolyásolhassa hátrányosan a vizsgálati eredményeket (például a vizsgált anyag komplexálásával), vagy ne legyen káros hatással a halállomány állapotára. Nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, 
Hg, Cd, Ni), f őbb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl, 
SO
 4 ), peszticidek (pl. összes szerves foszforvegyület és összes 
szerves klórpeszticidek), összes szerves szén és szuszpendált szilárd anyag meghatározását el kell végezni, például háromhavonta, ameny ­
nyiben a hígítóvíz ismerten viszonylag állandó min őségű. Ameny­
nyiben legalább egy éven keresztül állandónak bizonyul a vízmin ő­
ség, a vizsgálatot ritkábban és nagyobb id őközönként is el lehet 
végezni (pl. minden hat hónapban).
 
A hígítóvíz természetes részecske- és a teljes szervesszén-tartalmának 
(TOC) is a lehet ő legalacsonyabbnak kell lenni, hogy a vizsgált 
anyag ne abszorbeálódjon szerves anyagon, ami csökkenthetné a 
biológia elérhet őségét (4). A maximális elfogadható érték 5 mg/l 
szemcsés anyagok esetében (szárazanyag 0,45 μm-es szűrőn nem 
jut át) és 2 mg/l az összes szerves szén esetében (lásd 1. függelék). 
A vizet sz űrni kell felhasználás el őtt, amennyiben szükséges. A 
kísérleti halaktól (ürülék) és a táplálékmaradékból származó szerves széntartalom járulékának a lehet ő legkisebbnek kell lenni a vízben. A 
vizsgálat során a kísérleti edényben a szerves szén koncentrációja 
nem haladhatja meg a vizsgált anyagból származó szerves szén 
koncentrációját, és, amennyiben alkalmazták, az oldószer koncentrá ­
cióját 10 mg/l-nél nagyobb mértékben (± 20 %).
 
1.7.3.  Vizsgált oldat  
A vizsgált anyagból megfelel ő koncentrációjú törzsoldat készül. A 
törzsoldatot célszer ű a vizsgált anyagnak egyszer űen a hígítóvízbe 
keverésével vagy összerázással elkészíteni. Az oldószerek vagy disz ­
pergálószerek (oldódást segít ő szerek) használata nem ajánlott; 
néhány esetben azonban alkalmazhatók megfelel ő töménység ű törzs­
oldat készítése érdekében. A felhasználható oldószerek: etanol, meta ­
nol, etilén-glikol-metil-éter, etilénglikol-dimetil-éter, dimetil- formamid és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálószerek: 
Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz 0,01 % és HCO- 
40. Gondosan kell eljárni a biológiailag könnyen lebontható szerek használata esetén, mivel átfolyásos vizsgálatokban baktériumnöve ­
kedés révén problémát okozhatnak. A vizsgált anyag radioaktívan 
is jelölhet ő, és a legnagyobb tisztaságúnak kell lenni (pl. lehet őleg 
> 98 %).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Átfolyásos vizsgálatokban a vizsgált anyag törzsoldatát folyamatosan 
adagoló és hígító rendszerre (pl. állandó áramlási sebességet biztosító 
pumpa, szabályozható hígító rendszer, telít őrendszer) van szükség a 
kísérleti koncentrációk kísérleti kamrákba juttatásához. Az egyes tartályok esetében a napi öt térfogatcsere a megengedhet ő. Az átfo ­
lyásos mód részesül el őnyben, amennyiben nem alkalmazható (pl. ha 
a vizsgált szervezetekre károsan hat), félstatikus módszer használ ­
ható, feltéve hogy az érvényességi követelmények teljesülnek. A törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét legalább naponta a 
vizsgálat el őtt és után 48 órával ellen őrizni kell. Az ellen őrzés 
magában foglalja az áramlási sebesség meghatározását az egyes kísérleti tartályokban, és biztosítja, hogy ne változzon 20 %-nál nagyobb mértékben sem az egyes kamrákban, sem azok között.
 
1.7.4.  A fajok megválasztása  
A fajok megválasztásánál fontos követelmény, hogy könnyen és 
megfelelő méretben elérhet ők, és a laboratóriumban kielégít ő körül­
mények között tarthatók legyenek. A halfajok megválasztásának egyéb követelményei közé tartozik a fontosság rekreációs, kereske ­
delmi, ökológiai szempontból éppúgy, mint az összehasonlítható 
érzékenység, múltbeli sikeres használat stb.
 
Az ajánlott fajok a 2. függelékben találhatók. Más fajok is használ ­
hatók, de a kísérleti eljárást esetleg át kell dolgozni a megfelel ő 
vizsgálati körülmények biztosításához. A fajok és a kísérleti módszer megválasztásának indoklását fel kell tüntetni a jelentésben.
 
1.7.5.  A halak tartása  
Legalább két hétig a vizsgálat során alkalmazott h őmérséklet ű vízben 
akklimatizálják a törzspopulációt, és kielégít ő, a vizsgálat alatt hasz ­
nálttal megegyez ő típusú étrenden tartják őket. 
48 órás betelepítési id őszak után a mortalitást jegyz őkönyvezni kell, 
és az alábbi követelményeket kell alkalmazni:  
— amennyiben a mortalitás a populáció 10 %-ánál nagyobb hét nap 
alatt: az egész halállományt ki kell cserélni,  
— mortalitás a populáció 5–10 %-a hét nap alatt: további hét napig 
kell akklimatizálni,  
— mortalitás a populáció 5 %-ánál kisebb hét nap alatt: a tételt kell 
elfogadni – ha a második hét nap alatt a mortalitás 5 %-nál több, 
az egész tételt ki kell selejtezni.  
Beteg és rendellenesen fejl ődött halak nem használhatók a vizs ­
gálathoz. Minden beteg haltól meg kell szabadulni. A kísérletet 
megelőző két hétben és a kísérlet alatt a halak nem kaphatnak 
kezelést betegségre.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE  
1.8.1.  Elővizsgálat  
Hasznos lehet el ővizsgálatokat végezni a vizsgálati körülmények 
optimalizására a dönt ő vizsgálathoz, pl. a vizsgált anyag koncentrá ­
ciójának, a felvételi és tisztulási fázisok megválasztására.  
1.8.2.  Az expozíció körülményei  
1.8.2.1. A f e l v é t e l i f á z i s i d ő t a r t a m a  
A felvételi fázis id őtartamának el őrejelzése el őzetes tapasztalatból 
(pl. előző vizsgálatból vagy akkumulációhoz kapcsolódó vegyi 
anyagból), vagy bizonyos, a vizsgált anyag vízben való oldhatósága, vagy oktanol/víz megoszlási együtthatója ismeretét felhasználó 
tapasztalati kapcsolatokból nyerhet ő (lásd 3. függelék).
 
A felvételi fázis 28 napig tart, kivéve ha igazolható, hogy az egyen ­
súly korábban beállt. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 
28 nap alatt, a felvételi fázist ki kell terjeszteni további méréseket végezve, amíg az állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 60 napig.
 
1.8.2.2. A t i s z t u l á s i f á z i s i d ő t a r t a m a  
A felvételi fázis id őtartamának a fele rendszerint elég az anyag 
megfelelő (pl. 95 %-os) csökkenéséhez (lásd 3. függeléket a becslés 
magyarázatához). Amennyiben a 95 %-os csökkenéshez szükséges idő aránytalanul hosszú, meghaladja például a felvételi fázis 
hosszának kétszeresét (azaz több mint 56 nap), rövidebb id őtartam 
is használható (azaz amíg a vizsgált anyag koncentrációja kisebb lesz az állandósult állapotú koncentráció 10 %-ánál). Az els őrendű kine­
tikát eredményez ő egyrekeszeshal-modellnél összetettebb felvételi és 
tisztulási fázissal rendelkez ő anyagoknál azonban az ürülési sebes ­
ségi állandó meghatározására azonban hosszabb tisztulási fázis is megengedett. Az id őtartamot azonban az a periódus szabhatja meg, 
ami után a halban a vizsgált anyag koncentrációja az analitikai detek ­
tálási határ fölött marad.
 
1.8.2.3. A k í s é r l e t i h a l a k s z á m a  
A halak számát koncentrációnként úgy választják ki, hogy mintán ­
ként legalább négy hal álljon rendelkezésre minden mintavételnél. 
Amennyiben komolyabb statisztikai számításokat akarunk végezni, mintánként több hal szükséges.
 
Amennyiben kifejlett halakat használnak, rögzíteni kell, hogy 
hímeket és n őstényeket milyen arányban használnak a kísérletben. 
Amennyiben mindkét nemet használják, dokumentálni kell, hogy az expozíció kezdete el őtt a két nem között a lipidtartalom különbsége 
jelentéktelen; szükséges lehet az összes hím és az összes n őstény hal 
egybegyűjtése.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Mindegyik vizsgálatban hasonló tömeg ű halakat kell kiválasztani, a 
legkisebbek ne legyenek kisebbek a legnagyobb hal tömegének 
kétharmadánál. Ugyanabba a korcsoportba tartozzanak, és a szárma ­
zásuk is azonos legyen. Mivel a halak tömege és kora id őnként 
jelentős hatással lehet a BCF értékekre (1), ezeket a részleteket 
pontosan rögzíteni kell. Ajánlott az átlagtömeg becslése érdekében 
a vizsgálat el őtt a halpopuláció egy mintacsoportját lemérni.  
1.8.2.4. F e l t ö l t é s  
A halak méretéhez viszonyítva nagy mennyiség ű vizsgálati oldatot 
kell használni annak érdekében, hogy minimalizálni lehessen a vizs ­
gálat kezdetén a halak hozzáadásával okozott C  w és az oldott oxigén 
koncentrációjának csökkenését. Fontos, hogy a feltöltési sebesség a használt kísérleti fajnak megfelel ő legyen. Minden esetben 0,1–1,0 g 
hal (nedves tömeg) per liter víz per nap az ajánlott feltöltési sebes ­
ség. Akkor használható nagy töltési sebesség, amennyiben igazolt, hogy a vizsgált anyag megkövetelt koncentrációja fenntartható ± 20 %-os határon belül, és hogy az oldott oxigén koncentrációja 
nem esik 60 %-os telítettség alá.
 
A megfelel ő feltöltési rendszerek kiválasztásánál a halfajok 
természetes életterét kell figyelembe venni. A fenéken él ő 
halak például nagyobb alapterület ű akváriumot igényelnek, mint 
a nyíltvízi halfajok.  
1.8.2.5. T á p l á l á s  
Az akklimatizációs és kísérleti id őszak alatt a halakat megfelel ő, 
ismert lipid- és összfehérjetartalmú táplálékkal kell etetni, az egész ­
ségük meg őrzéséhez és a testtömegük fenntartásához elegend ő 
mennyiségben. A halak az akklimatizációs és kísérleti id őszakban 
naponta kapnak enni, testtömegük körülbelül 1–2 %-ának megfelel ő 
mennyiségben; ez a legtöbb halfaj esetén a lipidkoncentrációt viszonylag állandó szinten tartja a vizsgálat alatt. A táplálék mennyi ­
ségét újra kell számolni, például hetente egyszer, hogy egy állandó 
szinten legyen tartható a testtömeg és a lipidkoncentráció. Ennek kiszámításához az egyes tartályokban a halak tömege a tartályból legújabban vett halminta tömegéb ől becsülhet ő meg. A tartályban 
maradó halak nem mérhet ők le.
 
A kísérleti tartályból a maradék eledelt és az ürüléket az etetést 
követően (30 perct ől 1óráig) naponta szívócsövön keresztül el kell 
távolítani. A vizsgálat alatt a tartályokat a lehet ő legtisztábban kell 
tartani, hogy a szervesanyag-koncentráció a lehet ő legkisebb legyen, 
mivel a szerves szén jelenléte korlátozhatja a vizsgált anyag biológiai 
elérhetőségét (1).  
Miután sok táplálék hallisztb ől származik, a táplálék vizsgálatianyag- 
tartalmát is vizsgálni kell. A táplálék peszticid- és nehézfémanalízise 
is kívánatos.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. F é n y é s h ő m é r s é k l e t  
A fényperiódus rendszerint 12–16 órás, és a fajok számára megfelel ő 
hőmérsékletet (± 2  o C) kell biztosítani (lásd 2. függelék). A megvilá ­
gítás típusának és jellemz őinek ismertnek kell lenni. Figyelmet kell 
fordítani a vizsgálati anyag – a vizsgálat besugárzási körülményei 
közötti – lehetséges fotoátalakulására. Megfelel ő megvilágítást kell 
használni, hogy a fény hatására nem természetes bomlástermékek lehetőleg ne keletkezzenek. Néhány esetben megfelel ő lehet a 
290 nm alatti UV sugárzást kisz űrő ernyő használata.
 
1.8.2.7. K í s é r l e t i k o n c e n t r á c i ó k  
Átfolyási körülmények között legalább két koncentrációt kell készí ­
teni. Általában a nagyobb (vagy legmagasabb) vizsgáltanyag- 
koncentráció akut aszimptotikus LC  50 -értékének körülbelül 1 %- 
ánál és a használt analitikai módszerre vonatkozó vízben elérhet ő 
detektálási határnál legalább tízszer nagyobb legyen.  
A legnagyobb kísérleti koncentráció az akut (96 órás)/krónikus LC  50 
aránnyal is megosztható legyen (néhány vegyi anyag esetében a 
megfelelő arány 3–100 lehet). Amennyiben lehetséges, a többi 
koncentráció(ka)t úgy kell megválasztani, hogy a fenti értékt ől 10- 
es faktorral különbözzön. Amennyiben ez nem lehetséges az 1 %-os LC
 50 követelmény és az analitikai határ miatt, 10-nél kisebb faktor is 
használható, vagy fontolóra kell venni  14 C-vel jelzett vizsgált anyag 
használatát. A vizsgált anyag oldhatósága feletti koncentrációt nem 
szabad használni.  
Amennyiben szolubilizáló anyagot használnak, annak koncentrációja 
nem lehet nagyobb 0,1 ml/l-nél, és minden kísérleti tartályban 
azonosnak kell lennie. Ismerni kell, hogy mennyivel járul hozzá a kísérleti víz teljes szervesszén-tartalmához. Mindent meg kell tenni azonban az ilyen anyagok használatának elkerülése érdekében.
 
1.8.2.8. K o n t r o l l o k  
A vizsgált sorozat mellett a hígítóvíz-kontrollt, és adott esetben, egy 
szolubilizálószert tartalmazó kontrollt is be kell állítani, feltéve hogy biztosított, hogy a szernek nincs hatása a halakra. Amennyiben ez 
nem áll fenn, mindkét kontrollt el kell végezni.
 
1.8.3.  A vízmin őség mérésének gyakorisága  
A vizsgálat során minden edényben mérni kell az oldott oxigént, 
TOC-t, pH-t és h őmérsékletet. A kontrollokban és a nagyobb 
(vagy legnagyobb) koncentrációjú edényben mérni kell a teljes 
keménységet és (adott esetben) a sótartalmat. Az oldott oxigént és (adott esetben) a sótartalmat legalább háromszor kell mérni a felvé ­
teli periódusban – annak elején, közepén és a végén – és egyszer egy 
héten a tisztulási periódusban. TOC-t a vizsgálat kezdetén (a felvételi 
fázis előtt 24 és 48 órával) a halak bevitele el őtt, és a felvételi és 
tisztulási fázis alatt pedig legalább hetente egyszer kell mérni. A hőmérsékletet naponta, pH-t a periódusok kezdetén és végén, 
keménységet vizsgálatonként egyszer kell mérni. A h őmérsékletet 
ajánlott folyamatosan mérni, legalább egy edényben.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Hal- és vízmintavételezés és -analízis  
1.8.4.1. M i n t a v é t e l e z é s i ü t e m t e r v  
A kísérleti tartályokból a vizsgált anyag koncentrációjának meghatá ­
rozásához a halak bevitele el őtt, valamint a felvételi és a tisztulási 
fázis alatt kell mintát venni. Vízmintát legalább a halmintával egy 
időben és etetés el őtt kell venni. A felvételi fázis alatt meg kell 
határozni a vizsgált anyag koncentrációját az érvényességi követel ­
mények teljesülésének ellen őrzése céljából.  
A felvételi fázis alatt legalább ötször, a tisztulási fázis alatt legalább 
négyszer kell halmintát venni. Mivel egyes esetekben e mintaszámok 
alapján nehéz pontosan megbecsülni a BCF értékét, különösen, ha 
egyszerű elsőrendűtől eltérő tisztulási kinetika mutatkozik, tanácsos 
mindkét periódusban gyakrabban mintát venni (lásd 4. függelék). A külön minták tárolására és elemzésére csak akkor kerül sor, ha az 
elemzés els ő sorozata alkalmatlannak bizonyul a BCF kívánt pontos ­
ságú kiszámítására.
 
Az elfogadható mintavételi ütemterv egy példája a 4. függelékben 
található. Más feltételezett P  ow -értékkel más ütemtervet is gyorsan 
ki lehet dolgozni a 95 %-os felvétel expozíciós idejének kiszámo ­
lásával.  
A mintavételezést a felvételi fázisban addig kell folytatni, amíg az 
állandósult állapot beáll, vagy legfeljebb 28 napig. Amennyiben az állandósult állapot nem áll be 28 nap alatt, a mintavételezést addig 
kell folytatni, amíg beáll az állandósult állapot, de legfeljebb 60 
napig. A tisztulási fázis megkezdése el őtt a halak átkerülnek a tiszta 
tartályokba.
 
1.8.4.2. M i n t a v é t e l e z é s é s m i n t a k é s z í t é s  
Az analízishez a vízmintákat, például inert csövön keresztül, a kísér ­
leti tartály középs ő pontjából veszik. Mivel a vizsgált anyag bioló ­
giailag nem elérhet ő részét a biológiailag elérhet őtől nem mindig 
lehet centrifugálással vagy sz űréssel elválasztani, (f őleg erősen lipofil 
vegyszerek esetén, azaz log P  ow > 5 vegyszereknél) (1) (5), a 
mintákon nem lehet ezen eljárásokat alkalmazni.  
Ehelyett a tartályokat minél tisztábban kell tartani, és a teljes szer ­
vesszén-tartalmat a felvételi és tisztulási fázis alatt is figyelemmel 
kell kísérni.  
Minden mintavételezéskor megfelel ő számú halat (általában legalább 
négyet) kell kivenni a kísérleti kamrákból. A mintahalakat gyorsan le kell öblíteni vízzel, „szárazra” törölni, azonnal megölni a legmegfe ­
lelőbb és humánus módszerrel, ezt követ ően lemérni.
 
A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a halakat 
és a vizet lehet őleg rögtön mintavételezés után kell analizálni, és a 
vizsgálat el őrehaladtával megközelít őleg ki kell számolni a felvételi 
és a tisztulási sebességet. Az azonnali analízis lehet ővé teszi annak 
kiküszöbölését is, hogy egy platót késve ismerjenek fel.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Az azonnali analízis meghiúsulása esetén a mintákat megfelel ő 
módszerrel tárolják. A vizsgálat kezdete el őtt a különböz ő vizsgált 
anyagok tárolásának megfelel ő módszerér ől információkat kell 
szerezni – például mélyh űtés, 4  o C-on tartás, tárolás id őhossza, 
extrakció stb.  
1.8.4.3. A z a n a l i t i k a i m ó d s z e r m i n ő s é g e  
Mivel az egész eljárást alapvet ően a vizsgált anyaghoz használt 
analitikai módszer pontossága és érzékenysége határozza meg, kísér ­
lettel ellen őrizni kell a kémiai analízis pontosságát és reprodukálha ­
tóságát, és a vizsgált anyag vízb ől és halakból való visszanyerését. 
Azt is ellen őrizni kell, hogy a vizsgált anyag ne legyen észlelhet ő a 
használt hígítóvízben.  
A C  w és C  f vizsgálatból kapott értékét korrigálni kell – szükség 
szerint – visszanyeréssel és a kontrollok háttérértékével. A hal- és vízmintákkal végig úgy kell bánni, hogy minimális legyen a szennyezés és a (pl. a mintavev ő eszköz adszorpciójából ered ő) 
veszteség.
 
1.8.4.4. H a l m i n t a a n a l í z i s e  
Amennyiben a vizsgálat során radioaktívan jelzett anyagokat hasz ­
náltak, mérhet ő az össz-radioaktivitás (a kiindulási vegyületét és 
metabolitokét együttesen), vagy a minták megtisztíthatók úgy, hogy a kiindulási vegyület külön analizálható legyen. A f ő metabolitokat 
állandósult állapotban vagy a felvételi fázis végén (amelyik el őbb 
bekövetkezik) szintén lehet jellemezni. Amennyiben az összes mért radioaktivitás százalékában kifejezett BCF > 1 000 %, tanácsos lehet, sőt bizonyos vegyszer-kategóriáknál, pl. peszticideknél er ősen aján­
lott, az állandósult állapotban a halszövetekben a teljes maradék 
10 %-át meghaladó mennyiség ű bomlástermékek azonosítása és 
kvantifikálása. Amennyiben a meghatározást elvégezték a halszövet ­
ben, el kell végezni a vízben is.
 
A vizsgált anyag koncentrációját rendszerint meg kell határozni 
minden lemért halban. Amennyiben ez nem lehetséges, az egyes mintavételi alkalmakkor egyesíthet ők a minták, de az összesítés 
korlátozza az adatokra alkalmazható statisztikai eljárások számát. 
Amennyiben a statisztikai eljárás megkívánja, akkor a kívánt egye ­
sítési eljárást és az ehhez szükséges halak számát a vizsgálati módszerben rögzíteni kell (6) (7).
 
BCF-et a teljes nedves tömeg függvényeként, és az er ősen lipofil 
anyagok esetében a lipidtartalom függvényeként is ki kell fejteni. 
A hal lipidtartalmát amennyiben lehetséges, minden mintavételi alka ­
lommal meg kell határozni. A lipidtartalom meghatározására megfelelő módszereket kell alkalmazni (3. függelék, 8. és 2. hivat ­
kozás). Szabványmódszerként a kloroform/metanol extrakciós tech ­
nika ajánlott (9). A különböz ő módszerek nem adnak azonos érté ­
keket (10), ezért fontos megadni a használt módszer részleteit. Amennyiben lehetséges, a lipid analízisét a vizsgált anyag analízi ­
séhez készítettel azonos extraktumon kell elvégezni, mert a lipideket 
gyakran el kell távolítani az extraktumból, miel őtt kromatográfiásan 
elemezhet ők lennének. A hal lipidtartalma (mg/kg nedves tömeg) a 
kísérlet végén nem térhet el a kezdeti értékt ől ± 25 %-nál jobban. A 
szövet szárazanyag-tartalmát szintén rögzíteni kell, hogy a lipidkon ­
centráció átváltható legyen nedves állapotban mértr ől száraz álla ­
potban mértre.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
A vizsgált anyag felvételi görbéje a felvételi fázisban a halban/on 
(vagy meghatározott szövetben/en) mért koncentrációt az id ő függ­
vényében, aritmetikus skálán ábrázolják. Amennyiben a görbe platót 
ér el, vagyis megközelít őleg párhuzamos az id őtengellyel, az állan ­
dósult BCF  ss a következ ő képlet alapján számolható:  
C f állandósult állapotban  ðátlagÞ 
C w állandósult állapotban  ðátlagÞ 
Amennyiben nem következett be az állandósult állapot, a BCF  ss 
kielégítő pontossággal kiszámolható az „állandósult állapot”-ból, az 
egyensúly 80 %-ánál (1,6/k  2 ) vagy 95 %-ánál (3,0/k  2 ). 
A koncentrációs faktort (BCF  K ) is meghatározzák a két els őrendű 
kinetikai állandó k  1 /k 2 arányaként. A tisztulási sebességi állandó (k  2 ) 
rendszerint a tisztulási görbéb ől határozható meg (azaz a halban a 
vizsgált anyag koncentrációjának csökkenése az id ő függvényében). 
A felvételi sebességi állandó (k  1 ) ezután kiszámolható az adott k  2 és 
a C  f egy, a felvételi görbéb ől levezetett értékéb ől (lásd 5. függeléket 
is). A BCF  K és a k  1 , k 2 sebességi állandók kiszámításának megfelel ő 
módszere a számítógéppel végzett nem lineáris paraméterbecsl ő 
módszer használata (11). Grafikus módszerek is használhatók a k  1 
és k  2 kiszámítására. Amennyiben a tisztulási görbe nyilvánvalóan 
nem elsőrendű, összetettebb modelleket kell használni (lásd a 3. 
függelék hivatkozásait), és biostatisztikus tanácsát kell kikérni.  
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Amennyiben a vizsgált oldatok koncentrációi az analitikai módszer 
detektálási határához közeli szinten vannak, az eredményeket 
óvatosan kell értelmezni.  
Az egyértelm űen definiált felvételi és tisztulási görbe megbízható 
biokoncentrációs adatokat jelez. A két kísérleti koncentrációnál a 
felvételi/tisztulási állandók ingadozásának 20 % alatt kell lenni. A 
két alkalmazott kísérleti koncentráció felvételi/tisztulási sebességének jelentős különbségét rögzíteni kell, és meg kell adni rá a lehetséges 
magyarázatokat. A jól megtervezett vizsgálatokból kapott BCF-ek 
konfidenciahatára általában megközelíti a ± 20 %-ot.
 
3. JELENTÉS  
A kísérleti jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia:  
3.1. VIZSGÁLT ANYAG  
— fizikai tulajdonság, és adott esetben, fizikai-kémiai tulajdonságok,  
— kémiai jellemz ők (a szervesszén-tartalmat is beleértve, ameny ­
nyiben szükséges),  
— amennyiben radioaktívan jelzett, a jelzett atom(ok) pontos hely ­
zete, és a szennyez őkhöz kapcsolódó radioaktivitás százaléka.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. VIZSGÁLT FAJOK  
— tudományos név, törzs, származás, bármilyen el őkezelés, 
akklimatizálás, kor, mérettartomány stb.  
3.3. VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK  
— használt vizsgálati eljárás (pl. átfolyásos vagy fél sztatikus),  
— a használt megvilágítás típusa és jellemz ői és időtartama,  
— a vizsgálat kialakítása (pl. a kísérleti tartályok száma és mérete, 
víztérfogat-csere sebessége, párhuzamos minták száma, halak 
száma mintánként, kísérleti koncentrációk száma, a felvételi és a tisztulási fázis hossza, hal- és vízminták mintavételi gyakorisága),
 
— törzsoldatok el őállításának módszere és a megújítás gyakorisága 
(amennyiben használták, meg kell adni a szolubilizálószert, koncentrációját, és hogy a kísérleti víz szervesszén-tartalmához mennyiben járult hozzá),
 
— a névleges vizsgálati koncentrációk, a kísérleti edényben mért 
értékek átlaga és ezek standard deviációja, és a kiszámítás 
módszere,  
— a hígítóvíz eredete, bármely el őkezelés leírása, minden olyan 
eredmény, amely igazolja, hogy a hígítóvíz megfelel a kísérleti 
hal igényeinek, és a víz jellemz ői: pH, keménység, h őmérséklet, 
oldott oxigén koncentrációja, maradékklór-szintek (amennyiben mérték), összes szerves szén, szuszpendált szilárd anyagok, a vizsgált közeg sótartalma (amennyiben lehetséges), és bármilyen 
egyéb elvégzett mérés,
 
— vízmin őség a kísérleti edényekben, pH, keménység, TOC, 
hőmérséklet és oldottoxigén-koncentráció,  
— a táplálásra vonatkozó részletes információk (például a táplálék 
fajtája, eredete, összetétele – legalább a lipid- és fehérjetartalom, 
amennyiben lehetséges, az etetések számát és az adott táplálék 
mennyisége),  
— információk a hal- és vízminták kezelésér ől, beleértve az el őál­
lítás részleteit, tárolást, extrakciót és analitikai eljárásokat (és pontosságot) a vizsgált anyag és lipidtartalom vonatkozásában 
(amennyiben mérték).
 
3.4. EREDMÉNYEK  
— minden elvégzett el őzetes vizsgálat eredménye,  
— a kontrollhalak és az egyes expozíciós kamrákban lév ő halak 
mortalitása, és bármely megfigyelt rendellenes viselkedés,  
— a halak lipidkoncentrációja (amennyiben a kísérlet alkalmával 
meghatározták),  
— a halakban a vizsgált vegyi anyag felvételét és tisztulását mutató 
görbék (minden mért adatot feltüntetve), az állandósult állapotig 
eltelt idő, ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f és C  w (standard deviációval és tartománnyal, adott esetben) 
minden mintavételi id őpontra (C  f μg/g teljes nedves testtömeg, 
vagy meghatározott szövetei, pl. lipid tömegében [ppm] kife ­
jezve, és C  w μg/ml-ben [ppm]). A kontrollsorozat C  w értékei (a 
hátteret is rögzíteni kell),  
— az állandósult biokoncentrációs tényez ő (BCFss) és/vagy kine ­
tikus koncentrációs tényez ő (BCFK) és, adott esetben, a felvételi 
és tisztulási (ürülési) sebességi állandók 95 %-os konfidencia ­
határai (valamennyit az állat teljes tömegére vagy meghatározott 
szöveteire, és amennyiben mérték, a teljes lipidtartalomra vonat ­
koztatva kell megadni), valamennyi használt kísérleti koncentrá ­
ciónál a konfidenciahatárok és standard deviációk (ahogy megfelelőbb) és a számítás/adatelemzés módszerei,
 
— amennyiben radioaktívan jelzett anyagokat használtak, és ameny ­
nyiben szükséges, bármely kimutatott metabolit akkumulációja bemutatható,
 
— bármi szokatlan dolog a vizsgálattal kapcsolatban, bármilyen 
eltérés ezekt ől az eljárásoktól, és bármely más vonatkozó infor ­
máció,  
A „detektálási határon belül nem kimutatott” eredményeket el őzetes 
vizsgálati módszer fejlesztésével és kísérlettervezéssel kell minimali ­
zálni, mert az ilyen eredmények nem használhatók sebességi állandók számolásához.
 
4. IRODALOMJEGYZÉK  
(1) Connell D. W. (1988). Bioaccumlation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156.
 
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29–390.
 
(3) OECD Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3.  
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the 
bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Initi ­
ative Technical Support Document for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumlation Factors. July 1994.  
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or 
Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J. F. (ed.) 
Research Triangle Park, N. C. 27711.
 
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, 
Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, 
Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.  
(10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. 
J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431–1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 
1985. Final Report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Mollucsc.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
1. függelék  
Egy megfelel ő hígítóvíz kémiai jellemz ői 
Anyag Határkoncentráció  
1 Lebeg ő anyag 5 mg/l 
2 Teljes szerves szén 2 mg/l 3 Nem ionizált ammónia 1 μg/l 
4 Maradék klór 10 μg/l 
5 Szerves foszfortartalmú peszticidek 50 ng/l 6 Szerves klórtartalmú peszticidek + poliklórozott bife ­
nilek 50 ng/l 
7 Összes szerves klór 25 ng/l 
8 Alumínium 1 μg/l 
9 Arzén 1 μg/l 
10 Króm 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Réz 1 μg/l 
13 Vas 1 μg/l 
14 Ólom 1 μg/l 
15 Nikkel 1 μg/l 
16 Cink 1 μg/l 
17 Kadmium 100 ng/l 18 Higany 100 ng/l 19 Ezüst 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
2. függelék  
Vizsgálathoz ajánlott halfajok  
Ajánlott fajok Ajánlott késérleti 
hőmérseklet- 
tartomány ( °C) Kísérleti állat 
ajánlott teljes 
hossza (cm)  
1 Danio rerio  ( 1 ) (Teleostei, Cyprinidae ) (Hamilton– ­
Buchanan) Zebradánió 20–25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae ) (Rafi­
nisque) 20–25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio  (Teleostei, Cyprinidae ) (Linnaeus) 
Közönséges ponty 20–25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes  (Teleostei, Poeciliidae ) (Temminck és 
Schlegel) Japán rizshal 20–25 4,0 + 1,0 
5 Poecilia reticulata  (Teleostei. Poeciliidae ) (Peters) 
Guppi 20–25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus  (Teleostei. Centrarchidae ) 
(Rafinesque) 20–25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss  (Teleostei, Salmonidae ) (Wal­
baum) Szivárványos pisztráng 13–17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus  (Teleostei, Gasterosteidae ) 
(Linnaeus) Tüskés pikó 18–20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London. Series B., Vol. 252, p. 231  
A különböz ő országokban különböz ő torkolati és tengeri fajokat használnak, például: 
Spot Leiosromus xanthurus  
Sheephead minnow  Cyprinodon variegatus  
Silverside  Menidia beryllina  
Shiner perch  Cymatogaster aggregata  
English sole  Parophrys vetulus  
Staghorn sculpin  Leptocottus annatus  
Tüskés pikó  Gasterosteus aculeatus  
Sea bass  Dicentracus labrax  
Küsz  Albumus albumus  
A halak beszerzése  
A táblázatban felsorolt édesvízi halak könnyen tenyészthet ők, és/vagy könnyen beszerezhet ők egész 
évben, míg a tengeri és torkolati fajok bizonyos országokra korlátozódnak. A fent felsorolt halfajok 
halastóban vagy laboratóriumban is (betegségek és paraziták szempontjából ellen őrzött körülmények 
között) tenyészhet ők. Célszer ű tenyészetekb ől származó kísérleti halakat alkalmazni, mivel ezek 
egészségi állapota és származása is ismert. Ezek a halak a világ sok részében beszerezhet ők. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
3. függelék  
A felvételi és tisztulási fázis id őtartamának meghatározása  
1. A felvételi fázis id őtartamának meghatározása  
A vizsgálat elvégzése el őtt a k  2 , és így az állandósult állapot eléréséhez 
szükséges id ő néhány százalékos hibával megbecsülhet ő a k  2 és az n- 
oktanol/víz megoszlási együttható (P  ow ) vagy a k  2 és a vízben való oldha ­
tóság (s) tapasztalati összefüggéséb ől. 
A k  2 becsült értéke (nap–  1 ) megkapható például az alábbi tapasztalati 
összefüggésb ől (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (1. egyenlet)  
Egyéb összefüggéseket lásd a (2) hivatkozásban.  
Amennyiben a megoszlási hányados (P  ow ) nem ismert, az anyag vízben 
való oldhatóságának (s) ismeretéb ől becsülhet ő meg (3): 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (2. egyenlet),  
ahol:  
s = az oldhatóság (mol/l): (n = 36).  
Ezek az összefüggések csak 2 és 6,5 közé es ő log P  ow -értékkel rendelkez ő 
vegyszerekre alkalmazhatók (4).  
A k  2 -becslés felhasználásával, a felvételt és tisztulást leíró általános kine ­
tikai egyenletb ől (elsőrendű kinetika) kiszámítható az állandósult állapot 
néhány százalékának eléréséhez szükséges id ő: 
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
vagy ha C  w állandó:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (3. egyenlet)  
Az állandósult állapot közelítésekor ((t-> ∞), a 3. egyenlet egyszer űsíthető 
(5) (6):  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w vagy  C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Ekkor k  1 /k 2 ·C w a halakban mérhet ő koncentráció közelítése „állandósult 
állapotban” (C  f, s ). 
A 3. egyenlet átírható:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (4. egyenlet)  
A 4. egyenlet alkalmazásával megjósolható az állandósult állapot néhány 
százalékának eléréséhez szükséges id ő, amennyiben az 1. vagy 2. egyenlet 
felhasználásával k  2 előre megbecsült.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Iránymutatóként: statisztikailag elfogadható adatok (BCF  K ) előállításához a 
felvételi fázis statisztikailag optimális id őtartama az a periódus, ami ahhoz 
szükséges, hogy a halban mérhet ő vizsgálatianyag-koncentráció logaritmu ­
sának görbéje lineáris id őskálán felrajzolva elérje a felez őpontját, illetve 
1,6/k  2 -t, vagy az állandósult állapot 80 %-át, de ne legyen nagyobb 3,0/ ­
k 2 -nél, vagy az állandósult állapot 95 %-nál (7).  
Az állandósult állapot 80 %-ának eléréséhez szükséges id ő (4. egyenlet):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 or t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (5. egyenlet)  
A 95 %-os állandósult állapot hasonlóan:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (6. egyenlet)  
Például log P  ow = 4-es vizsgált anyag esetében a felvételi fázis (fel) id őtar­
tama (az 1., 5. és 6. egyenletet használva): 
log 10 k 2 =- 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 nap  –1 
vagy ff (80 %) = 1,6/0,652, azaz 2,45 nap (59 óra)  
ff (95 %) = 3,0/0,652, azaz 4,60 nap (110 óra)  
Hasonlóan, egy s = 10–  5 mól/l (log(s) = - 5,0) vizsgált anyag esetében az ff 
időtartama (az 1., 2., 5. és 6. egyenletet használva):  
log 10 (P ow ) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = 0,414 (5,02)+1,47  
k 2 = 0,246 nap  –1 
Ff (80 %) = 1,6/0,246, azaz 6,5 nap (156 óra)  
vagy ff (95 %) = 3,0/0,246, azaz 12,2 nap (293 óra)  
Ezenkívül:  
T eq = 6,54 x 10 =  3 P ow + 55,31 (óra)  
kifejezés használható az effektív állandósult állapot eléréséhez szükséges 
idő kiszámolásához (4).  
2. A tisztulási fázis id őtartamának el őrejelzése  
A test anyagterhelésének a kezdeti koncentráció néhány százalékára való 
csökkentéséhez szükséges id ő megbecsülhet ő a felvételi és tisztulási perió ­
dust leíró általános egyenletb ől (elsőrendű kinetika) (1) (8).  
A tisztulási fázisban C  w nullának feltételezett. Az egyenlet egyszer űsíthető: 
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f vagy  C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
ahol C f, 0 a koncentráció a tisztulási fázis kezdetén. Az 50 %-os tisztulás 
aztán t  50 időpontban következik be:  
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 vagy  t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Hasonlóan, a 95 %-os tisztulás elérésének id őpontja:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Amennyiben 80 %-os felvételt használnak az els ő periódusban (1,6/ k 2 ), és 
95 %-os ürülést a tisztulási fázisban (3,0/ k 2 ), akkor a tisztulási fázis 
megközelít őleg kétszer hosszabb a felvételi fázisnál.  
Fontos megjegyezni azonban, hogy a becslések azon a feltevésen alapul ­
nak, hogy a felvételi és tisztulási mintázat els őrendű kinetikát követ. 
Amennyiben nyilvánvalóan nem els őrendű kinetikáról van szó, összetettebb 
modellt kell alkalmazni [pl. (1) hivatkozás].  
IRODALOM ( a 3. függelékhez)  
(1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for desribing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and 
Chem. 1, pp. 309–320.  
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality 
Institute.  
(3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci.Technol. 16 (1), pp. 4–10.
 
(4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.  
(5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785–792.  
(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by 
Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N. Y.
 
(7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G E., Branson D. R. and Sauerhoff 
M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. 
Eng. 55, pp. 614–622.  
(8) Könemann H. and Van Leuween K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3–19.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
4. függelék  
Elméleti példa biokoncentrációs vizsgálatok mintavételezési ütemtervére log P  ow = 4 anyagok esetében  
Halminta Mintavételek 
Vízminták száma Halak száma mintánként Minimálisan megkövetelt 
gyakoriság (nap) Járulékos mintavételezés  
Felvételi fázis –1 
0 2 (*) 
2 45–80 hal telepítve 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Tisztulási fázis Halak áthelyezve 
vizsgált vegyi 
anyagtól mentes vízbe 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Vízminta minimum három teljestérfogat csere után lett véve. 
A zárójeles értékek a minták (víz, hal) számát jelentik, amennyiben járulékos mintavételezés történik.  
Megjegyzés : k  2 vizsgálat el őtti becslése 4,0-ás log P  ow -re 0,652 nap  –1 . A kísérlet teljes id őtartama 3 * ff = 3 * 4,6 nap. azaz 14 nap. A 
„ff” becslését 1ásd a 3. függelékben.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
5. függelék  
A megfelel ő modell kiválasztása  
A legtöbb biokoncentrációs adatról feltételezett, hogy jól leírható egy egyszer ű 
kétváltozós modellel, amely a tisztulási fázisban (féllogaritmusos papíron ábrázo ­
lva) a halakban mérhet ő koncentrációk pontjaira illeszthet ő egyenest ad. (Ameny ­
nyiben ezek a pontok nem írhatók le egyenessel meghatározott görbével, össze ­
tettebb modellt kell alkalmazni, lásd például Spacie és Hamelink, 3. függelék, 1. hivatkozás).
 
Grafikus módszer a k  2 tisztulási (ürülési) sebességi állandó meghatározására  
Az egyes halmintákban talált vizsgált anyag koncentrációját a mintavételezési 
idő függvényében kell ábrázolni féllogaritmusos papíron. Az egyenes meredek ­
sége k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Meg kell jegyezni, hogy az egyenes vonaltól való eltérések els őrendűnél össze ­
tettebb tisztulási mintázatot jelezhetnek. Az els őrendű kinetikától eltér ő tisztulási 
típusok meghatározására grafikus módszer alkalmazható.  
Grafikus módszer a k  1 felvételi sebességi állandó meghatározására  
Amennyiben k  2 adott, k  1 -et az alábbiaknak megfelel ően kell kiszámítani:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (1. egyenlet)  
A log koncentrációt az id ő függvényében (aritmetikus skálán) ábrázolva nyert 
szabályos felvételi görbe középpontjából olvasható le C  f érték.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Számitógépes módszer a felvételi és a tisztulási (ürülési) sebességi állandó 
számítására  
A biokoncentrációs tényez ő továbbá a k  1 és k  2 sebességi állandó kiszámításának 
előnyben részesített módszere a nem lineáris paraméterbecslési módszer alkalma ­
zása számítógépen. Ezek a programok k  1 és k  2 értékét az egymást követ ő idő 
koncentráció adatokból és az alábbi modell alapján találják meg:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (2. egyenlet)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (3. egyenlet)  
ahol t  c = idő a felvételi fázis végén.  
Ez a megközelítés a k  1 és k  2 standard deviációjára ad becslést.  
Mivel k  2 legtöbbször viszonylag nagy pontossággal megbecsülhet ő a tisztulási 
görbéből, és mert er ős a korreláció a k  1 és k  2 paraméter között, amennyiben 
egyidejűleg becsülték meg őket, tanácsos lehet el őször csak a tisztulási adatokból 
kiszámolni k  2 -t, és ezt követ ően nem lineáris regresszióval számolni k  1 -et a 
felvételi adatokból.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  HALIVADÉKOK NÖVEKEDÉSI VIZSGÁLATA  
1. MÓDSZER  
E növekedéssel kapcsolatos toxicitásvizsgálat megfelel az OECD TG 
215-nek (2000).  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat célja annak megállapítása, hogy a halivadékok növeke ­
désére milyen következményekkel jár, ha hosszabb id őn keresztül 
vegyi anyagok hatásának vannak kitéve. E vizsgálat egy olyan módszeren alapul, amelyet az Európai Unión belül fejlesztettek ki, 
és körvizsgálatnak vetették alá (1) (2) annak felmérésére, hogy átfo ­
lyási feltételek mellett egyes vegyi anyagok milyen hatásokat gyako ­
rolnak a szivárványos pisztráng ivadékának  (Oncorynchus mykiss)  
növekedésére. Más, kell ően dokumentált halfajok is felhasználhatók. 
Növekedési vizsgálatot végeztek már például zebrahalon  (Danio 
rerio)  (
 1 ) (3) (4) és rizshalon (medaka,  Oryzias Latipes)  (5) (6) (7).  
Lásd még az Általános bevezetés C. részét.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Legalacsonyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció 
(LOEC) : a vizsgált anyag azon legalacsonyabb kísérleti koncentrá ­
ciója, amelynél a kontrollal összevetve még megfigyelhet ő az anyag 
egy jelent ős hatása (p < 0,05). Azonban a LOEC fölötti valamennyi 
kísérleti koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely 
legalább azonos a LOEC-nél megfigyelttel, vagy er ősebb annál.  
Megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : a közvet ­
lenül a LOEC alatti kísérleti koncentráció.  
EC x : e vizsgálati módszerben a vizsgált anyag azon koncentrációja, 
amely – a kontrollal összevetve – x % eltérést okoz a növekedés ütemében.
 
Betelepítési arány : a halak nedvesen mért tömege egységnyi 
mennyiség ű vízben.  
Betelepítési s űrűség: a halak száma egységnyi mennyiség ű vízben.  
Halegyedek specifikus növekedési üteme : az egyed növekedésének 
üteme, a kiindulási tömegéhez viszonyítva.  
Specifikus növekedési ütem a tartály átlagában : egy tartályban 
lévő halpopuláció átlagos növekedési üteme egy adott koncentráció 
mellett.  
Pszeudospecifikus növekedési ütem : az egyed növekedési üteme a 
tartályban lév ő halpopuláció kezdeti súlyának átlagához viszonyítva.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish  
(Danio rerio),  a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252., 231–236.
 1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A növekedési ütemük exponenciális szakaszában lév ő halivadékokat 
– megmérésük után – kísérleti tartályban helyezik el, és szubletális koncentrációjú, vízben oldott vizsgált anyag hatásának teszik ki, 
átfolyást biztosítva, vagy amennyiben ez nem lehetséges, akkor 
megfelelő félstatikus (statikus-megújítási) feltételek mellett. A vizs ­
gálat időtartama 28 nap. A halakat naponta etetik. A táplálék adago ­
lását a halak kiindulási súlya alapján határozzák meg; az adagokat 14 
nap után újra lehet számítani. A kísérlet végén a halakat ismét lemé ­
rik. Regressziós modell segítségével elemezni kell a vizsgált anyag hatásait a növekedés ütemére, azon koncentráció meghatározása 
érdekében, amely a növekedés ütemében x % eltérést okoz, azaz 
ECx (pl. EC
 10 , EC  20 , EC  30 ) eltérést. Alternatív módon, az adatokat 
össze lehet hasonlítani a kontrollértékekkel, a „legalacsonyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció” (LOEC), majd annak 
alapján a „megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentráció” (NOEC) 
meghatározása érdekében.
 
1.4. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
Rendelkezésre kell hogy álljanak az e vizsgálat céljára kiválasztott 
fajokkal lehet őleg korábban már elvégzett, akut toxicitási vizsgálatok 
eredményei (lásd a C.1. vizsgálati módszert). Ez azt jelenti, hogy a vizsgált anyag vízoldhatósága és g őznyomása ismert, és dokumentált 
pontosságú, megbízható analitikai módszer áll rendelkezésre a vizs ­
gált oldatokban lév ő vizsgált anyag számszer űsítéséhez, továbbá 
rendelkezésre állnak az észlelés korlátaira vonatkozó adatok is.
 
A hasznos információk közé tartozik még a szerkezeti képlet, az 
anyag tisztasága, stabilitása vízzel és fénnyel szemben, a pK  a - és 
P ow -értékek, valamint a gyors biológiai lebomlásra vonatkozó vizs ­
gálatok eredményei is (lásd a C.4. vizsgálati módszert).  
1.5. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A vizsgálat érvényességéhez az alábbi feltételeknek kell teljesülniük:  
— a vizsgálat végén a mortalitási arány a kontrollcsoportban nem 
haladhatja meg a 10 %-ot,  
— a kontrollcsoportbeli halak átlagos súlyának megfelel ő mértékben 
kell növekednie ahhoz, hogy lehet ővé tegye a növekedési 
ütemben egy már szignifikánsnak tekinthet ő minimális eltérés 
érzékelését. Egy „körvizsgálat” (2) kimutatta, hogy a szivárvá ­
nyos pisztráng esetében a kontrollcsoportbeli halak átlagos töme ­
gének 28 nap alatt legalább a kiindulási átlagtömegük felével 
(azaz 50 %-kal) kell növekednie; pl. kiindulási tömege 1 g/hal (= 100 %), végs ő tömege 28 nap elteltével ≥ 1,5 g/hal ( ≥ 150 %),
 
— a kísérlet során az oldott oxigén koncentrációját mindvégig 
legalább a leveg őtelítettségi érték (ASV) 60 %-án kell tartani,  
— a kísérleti tartályokban a víz h őmérséklete a kísérlet során soha 
sem térhet el ± 1  o C- nál nagyobb mértékben, és a h őmérsékletet 
a vizsgált fajra nézve meghatározott h őmérséklet-tartományban 
egy 2  o C-nyi sávon belül kell tartani (1. függelék).  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Felszerelés  
Normál laboratóriumi felszerelés és különösen az alábbiak:  
— oxigéntartalom- és pH-érték-mér ők, ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— a víz keménységi fokának és lúgosságának mérésére szolgáló 
berendezések,  
— a hőmérséklet szabályozására és lehet őleg folyamatos figye ­
lemmel kísérésére alkalmas készülékek,  
— kémiailag semleges anyagból készült és az ajánlott betelepítési 
aránynak és betelepítési s űrűségnek megfelel ő kapacitású tartá ­
lyok (lásd 1.8.5. pont és az 1. függelék),  
— megfelel ő pontosságú mérleg (azaz ± 0,5 % pontosságú).  
1.6.2.  Víz  
A vizsgálat céljaira bármilyen víz felhasználható, amelyben a vizs ­
gált fajok kell ően hosszú ideig túlélik a vizsgálati körülményeket, és 
növekednek. A víz min őségét a kísérlet során mindvégig azonos 
szinten kell tartani. A víz pH-értékének a 6,5–8,5 tartományon belül kell lennie, azonban egy adott vizsgálat során csak ± 0,5 pH- 
egységgel térhet el a kiindulási értékt ől. Javasolt a 140 mg/l (CaCO
 3 ) 
vízkeménység választása. Annak biztosítására, hogy a víz összetétele ne befolyásolja túlzottan a vizsgálat eredményeit (pl. mert komplexet képez a vizsgált anyaggal), id őnként mintákat kell venni elemzésre. 
Mérni kell a következ őket: a nehézfémek (pl. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd és 
Ni), a fontosabb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl és SO
 4 ), 
a peszticidek (pl. összes szerves foszfor és összes szerves klór 
tartalmú peszticidek), az összes szerves szén és a szuszpendált szilárd 
anyagok koncentrációját, például háromhavonta, amennyiben a hígí ­
tóvízről tudott, hogy viszonylag állandó min őségű. Amennyiben a 
víz minősége bizonyítottan konstans legalább egy éven keresztül, 
akkor ritkábban, nagyobb id őközökkel is lehet ellen őrző méréseket 
végezni (pl. csak hathavonta egyszer). Az elfogadható min őségű 
hígítóvíz néhány kémiai tulajdonságának felsorolása a 2. függelékben található.
 
1.6.3.  Vizsgált oldatok  
A kiválasztott koncentrációjú vizsgált oldatok a törzsoldat hígításával 
készíthetők el.  
A törzsoldatot lehet őleg a vizsgált anyagnak a hígítóvízbe, mecha ­
nikai eszközök (pl. kever ő, ultrahang) segítségével történ ő bekeveré ­
sével vagy hozzákeverésével kell elkészíteni. Telítési oszlopok (old ­
hatósági oszlopok) is felhasználhatók a megfelel ő koncentrációjú 
törzsoldat elkészítéséhez.  
Egyes esetekben szükség lehet oldószerek vagy diszpergálószerek 
(oldódást segít ő szerek) használatára a megfelel ő koncentrációjú 
törzsoldat elkészítéséhez. Ilyen alkalmas oldószer lehet az aceton, 
etanol, metanol, dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid és a trietilén- 
glikol. Alkalmas diszpergálószer lehet például: Cremophor, RH40, Tween 80, Metilcellulóz 0,01 % és a HCO-40. Kell ő figyelemmel 
kell eljárni a biológiailag gyorsan lebomló szerek (pl. aceton) és/ ­
vagy az er ősen illékony összetev ők használatakor, mivel ezek az 
átfolyási vizsgálatok során fellép ő baktériumszaporodás kapcsán 
gondokat okozhatnak. A diszpergálószerek nem gyakorolhatnak lényeges hatásokat a halak növekedésére és láthatóan kedvez őtlen 
hatásokat az ivadékokra, amit csak egy oldószerrel végzett ellen őrző 
vizsgálat tárhat fel.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Az átfolyási vizsgálatok céljára olyan rendszert kell használni, amely 
folyamatosan biztosítja és hígítja a vizsgált anyag törzsoldatát (pl. 
egy adagolószivattyú, proporcionális hígító vagy egy telít őrendszer), 
annak érdekében, hogy a kísérleti tartályhoz eljusson a hígítóoldat. A kísérlet során id őnként – lehet őleg naponta – ellen őrizni kell a törzs ­
oldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét, amelynek értéke nem 
változhat 10 %-nál nagyobb mértékben a vizsgálat során. Egy „kör ­
vizsgálat” (2) bizonyította, hogy a szivárványos pisztrángok esetében hat liter/gramm hal/nap mérték ű vízcserél ődési sebesség elfogadható 
(lásd 1.8.2.2. szakasz).
 
Félstatikus (megújítási) vizsgálatok során a közeg megújításának 
gyakorisága a vizsgált anyag stabilitásától függ, azonban ajánlott a víz napi cseréje. Amennyiben korábbi stabilitási vizsgálatok (lásd 1.4. pont) arra mutattak rá, hogy nem stabil a vizsgált anyag 
koncentrációja (azaz kívül esik a névleges koncentráció 80–120 %- 
os tartományán, vagy a kiinduláskor mért koncentráció 80 %-a alá csökken) a megújítási id őszak során, akkor fontolóra kell venni egy 
átfolyási vizsgálat elvégzését.
 
1.6.4.  A halfajok kiválasztása  
E vizsgálat céljaira az ajánlott halfaj a szivárványos pisztráng  
(Oncorhynchus mykiss),  mert a legtöbb tapasztalat eddig az e fajjal 
folytatott „körvizsgálatokból” származik (1) (2). Azonban más, kellően dokumentált halfajok is felhasználhatók, de ilyenkor az eljá ­
rást esetleg módosítani kell a megfelel ő vizsgálati körülmények 
biztosítása érdekében. Például zebrahal  (Danio rerio)  (3) (4) és 
rizshal (medaka,  Oryzias Latipes)  (5) (6) (7) vizsgálatából is 
szereztek már növekedésivizsgálat-tapasztalatokat. Ebben az esetben 
a jelentésnek tartalmaznia kell az eltér ő fajok és kísérleti módszer 
kiválasztásának indoklását.
 
1.6.5.  A halak tartása  
A kísérleti halakat egyetlen tenyészet – lehet őleg egy ivásból szár ­
mazó – populációjából kell kiválasztani, és a halakat a vizsgálat megkezdése el őtt legalább két hétig a kísérlet során alkalmazandó 
körülmények, vízmin őség és megvilágítás mellett kell tartani. A napi 
etetéskor minimálisan a testsúly 2 %-ának megfelel ő adagokat kell 
kapniuk, a kéthetes tartási id őszak és a vizsgálat ideje alatt pedig 
lehetőleg a testsúly 4 %-ának megfelel ő mennyiséget.
 
Egy 48 órás szoktatási id őszakot követ ően fel kell jegyezni a morta ­
litási arányt, és alkalmazni kell az alábbi kritériumokat:  
— amennyiben hét nap alatt a populáció mortalitása 10 %-nál maga ­
sabb, az egész állományt ki kell cserélni,  
— 5 és 10 % közötti mortalitás esetén: további hét nap akklimati ­
zációs időszak beiktatása után – amennyiben a mortalitási arány 
ezt követ ően is magasabb 5 %-nál – az egész állományt ki kell 
cserélni,  
— ha hét nap után a mortalitás 5 % alatt marad, az állomány elfo ­
gadható.  
A halak a vizsgálat el őtti két hétben és a vizsgálat során nem 
kaphatnak betegség miatti kezelést.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. A VIZSGÁLAT KIALAKÍTÁSA  
A „vizsgálat kialakítása” meghatározás a kísérleti koncentráció 
számának és osztásközeinek, az egyes koncentrációszintekhez hasz ­
nált tartályok számának és a halak tartályonként létszámának a 
megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra 
tekintettel kell megtervezni:  
— a vizsgálat célja,  
— az alkalmazandó statisztikai elemzési módszer,  
— a kísérlethez szükséges anyagok beszerezhet ősége és költsége.  
Amennyiben lehetséges, a kísérleti cél megfogalmazásában rögzíteni 
kell, hogy milyen statisztikai pontossági szinten kell egy adott nagy ­
ságú eltérésnek (pl. a növekedés ütemének) érzékelhet őnek lennie, 
vagy – alternatív módon – milyen pontossággal kell tudni megbecsülni az EC
 x (pl. x = 10-nél, 20-nál vagy 30-nál, és lehet őleg 
nem kevesebb, mint 10) értékét. Ezek nélkül nem lehet határozott 
leírást adni a vizsgálatok terjedelmér ől. 
Fontos annak felismerése, hogy a valamelyik statisztikai elemzési 
módszer alkalmazására optimálisnak (az er őforrások legjobb kihasz ­
nálását biztosítónak) bizonyult módszer nem szükségszer űen opti­
mális egy másik módszer esetében. A LOEC/NOEC becsléséhez 
ajánlott tervezés ezért nem feltétlenül azonos a regressziós analízis 
esetére ajánlottal.  
A Stephan és Rogers (9) által tárgyalt okok miatt a regressziós 
elemzés a legtöbb esetben megfelel őbb, mint a varianciaelemzés. 
Amennyiben azonban nem található megfelel ő regressziós modell 
(r 2 < 0,9), akkor a NOEC/LOEC módszert kell használni.  
1.7.1.  A regressziós analízis kialakítása  
A regresszióval elemzend ő vizsgálat kialakításakor a legfontosabb 
szempontok a következ ők: 
— a vizsgálat során alkalmazott koncentrációnak magában kell 
foglalnia azon hatáskoncentrációt (pl. EC  10,20,30  ) és azon 
koncentrációtartományt, amelyen belül a vizsgált anyag hatását 
értékelni szükséges. Azon pontossági szint, amellyel a hatáskon ­
centrációra vonatkozó becsléseket el lehet végezni, akkor lesz a legmegfelel őbb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentráció ­
tartomány közepénél helyezkedik el. A megfelel ő koncentráció ­
értékek kiválasztásához hasznos lehet egy el őzetes behatároló 
vizsgálat elvégzése,
 
— a megfelel ő statisztikai modellezés érdekében a vizsgálat során 
legalább egy kontrolltartályt és még további öt, különböz ő 
koncentrációjú közeggel feltöltött kiegészít ő tartályt kell alkal ­
mazni. Adott esetben, diszpergálószer használatakor egy, a disz ­
pergálószert a legmagasabb vizsgált koncentrációban tartalmazó kontrolltartályt kell beiktatni a vizsgált sorozat mellé (lásd 1.8.3. és 1.8.4. szakasz),
 
— megfelel ő mértani vagy logaritmikus sorozatot (10) (lásd a 3. 
függelék) lehet használni. Ajánlott a kísérleti koncentrációk loga ­
ritmikus osztásközének használata,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— amennyiben hatnál több tartály áll rendelkezésre, akkor a több ­
lettartályokat vagy párhuzamos vizsgálatra lehet felhasználni, 
vagy a koncentrációtartományt fel lehet osztani az osztásköz csökkentése érdekében. Mindkét módszer egyformán javasolt.
 
1.7.2.  A NOEC/LOEC becslésének módja varianciaelemzés (ANOVA) 
használatával  
Lehetőleg minden koncentrációszinten legyen egy ismétl őtartály, és a 
statisztikai elemzést az egyes tartályok esetében kell elvégezni (11). Az ilyen ismétl őtartályok nélkül a halak tömegének egyedi eltérésén 
túl nem lehet figyelembe venni a tartályok közötti eltéréseket. 
Korábbi tapasztalatok (12) azonban azt mutatják, hogy – a vizsgált 
esetben – a „tartályok közötti” változékonyság nagyon csekély volt a „tartályon belüli” (azaz a halak közötti) változékonyság képest. Ezért az egyes halak szintjén végzett statisztikai elemzés elvégzése 
viszonylag elfogadható alternatíva.
 
Hagyományosan legalább ötféle, mértani sorozatot alkotó kísérleti 
koncentrációt használnak, lehet őleg a 3.2 értéket meg nem haladó 
szorzótényez ő alkalmazásával.  
Általában, ha a vizsgálatokat párhuzamos tartályok használatával 
végzik, az ilyen kontrolltartályok száma, s ennélfogva a halak száma is az egy koncentrációhoz tartozó teszttartályok számának 
(amelyek azonos méret űek) kétszerese (13) (14) (15). Ellenkez ő eset­
ben, azaz párhuzamos tartályok nélkül a kontrollcsoportban lév ő 
halak száma azonos az egyes kísérleti koncentrációk alapján vizsgált halak számával.
 
Amennyiben a varianciaelemzés (ANOVA) a tartályokon alapul, 
nem pedig az egyes halakon (ami megkövetelné a halak egyedi jelölését vagy „pszeudospecifikus” növekedési ütemek használatát a számításokhoz – lásd 2.1.2. szakasz), akkor elegend ő számú párhu ­
zamos tartályra van szükség az egyes „koncentrációszintek közötti 
tartályok” standard eltérésének meghatározásához. Ez azt jelenti, hogy a varianciaelemzésben a hibák szabadságfoka legalább 5 kell hogy legyen (11). Amennyiben csak a kontrollok számát duplázzák 
meg, fennáll a veszélye annak, hogy a hiba variabilitása torzul, mivel 
a kérdéses növekedési ütemek átlagértékét követve növekedhet. Mivel a növekedési ütem valószín űleg a koncentráció növekedésével 
arányosan csökken, ez általában a variabilitás túlbecsléséhez vezet.
 
1.8. ELJÁRÁS  
1.8.1.  A vizsgálati halak kiválasztása és lemérése  
Fontos a halak testtömegeltéréseinek minimumra csökkentése a vizs ­
gálat elején. A vizsgálatok során használatra javasolt különböz ő 
halfajok megfelel ő mérettartományait az 1. függelék tartalmazza. A 
vizsgálathoz felhasznált teljes halállományon belül a vizsgálat 
kezdetén az egyedek testtömegének tartományát ideális esetben az átlagos testtömeg ±10 százalékán belül célszer ű tartani, de az eltérés 
semmiképp sem lehet több 25 %-nál. Az átlagos testtömeg el őzetes 
becslése céljából javasolt a vizsgálat el őtt a halak egy részmintájának 
a tömegét lemérni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
A vizsgálat megkezdése el őtt a halállomány populációjának táplá ­
lékát 24 órán keresztül vissza kell tartani. A halakat ezt követ ően 
kell véletlenszer űen kiválasztani. Általános altatószerrel (pl. MS 
222 egy egységére számolt kétegységnyi szódabikarbonát hozzáa ­
dásával semlegesített 100 mg/l triazin-metán-szulfonát(MS 222) 
vizes oldata) elkábított halak nedves (itatóspapírral szárított) egyedi 
súlyát az 1. függelékben megadott pontossággal kell lemérni. A meghatározott mérettartományon belüli halakat kell megtartani és véletlenszer űen elosztani a tesztedények között. Fel kell jegyezni 
az egyes edényekbe helyezett halak nedvesen mért össztömegét. A 
halak altatása és megfogása (ideértve az itatóspapírral történ ő szárí­
tást és a mérlegelést is) stresszt és a halivadékok sérülését okoz ­
hatja, különösen a kisméret ű fajok esetében. Ezért a halivadékok 
kezelésekor maximális gonddal kell eljárni, hogy elkerüljük a 
stresszhatásokat és sérüléseket.
 
A halakat a kísérlet 28. napján újra le kell mérni (lásd 1.8.6. 
szakasz). Amennyiben azonban a táplálékadagolás újraszámítása 
szükséges, az ismételt mérlegelést már a 14. napon el lehet végezni (lásd 1.8.2.3. szakasz). A haltáp adagolásának módosításához a halak 
méretének lefényképezése is megfelel ő.
 
1.8.2.  Expozíciós feltételek  
1.8.2.1.  Időtartam  
A vizsgálat id őtartama > 28 nap.  
1.8.2.2.  Betelepedési arány és betelepedési s űrűség 
Fontos, hogy a betelepedési arány és a betelepedési s űrűség 
megfeleljen a kísérlethez felhasznált halfajoknak (lásd 1. függelék). Amennyiben túl magas a betelepedési s űrűség, akkor a túlzsúfoltság 
okozta stressz a növekedési ütem lassulásához és esetleg megbetege ­
désekhez vezet. A túl alacsony betelepedési s űrűség territóriumfog ­
lalási viselkedésmódokat idézhet el ő, ami szintén befolyásolja a 
növekedési ütemet. A betelepedési s űrűséget mindenképpen annyira 
alacsonyan kell tartani, hogy a vízben oldott oxigén koncentrációját 
külön leveg őztetés nélkül is legalább a leveg őtelítettségi érték 60 %- 
ának megfelel ő szinten lehessen tartani. Egy körvizsgálat (3) kimu ­
tatta, hogy a szivárványos pisztrángok esetében 40 liternyi vízben 16 
darab, egyenként 3–5 grammos hal elhelyezése az elfogadható. A 
vízcsere ajánlott gyakorisága a kísérlet során 6 liter/gramm hal/nap.
 
1.8.2.3.  Táplálás  
A halakat az elfogadható növekedési ütemet biztosítóan adagolt 
megfelelő haltáppal (1. függelék) kell etetni. Gondosan kerülni kell 
a mikrobatenyészetek kialakulását és a víz zavarossá válását. A szivárványos pisztrángok esetében a halak testsúlya 4 %-nak megfelelő arányú napi tápadagolás elégíti ki legvalószín űbben e 
feltételeket (3) (16) (17) (18). A napi adagot két egyenl ő részre 
lehet osztani és beadagolni, legalább öt óra különbséggel. Az adago ­
lást mindegyik tesztedény esetében a teljes kiindulási haltömeg alapján kell megállapítani. Amennyiben a halakat a 14. napon 
ismét lemérik, az adagolás mennyisége újraszámolható. A mérlegelés 
előtt a táplálékot 24 órán keresztül vissza kell tartani.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Az el nem fogyasztott tápot és az ürüléket minden nap gondosan, 
szívás útján kell eltávolítani a tartályok aljáról.  
1.8.2.4.  Megvilágítás és h őmérséklet  
A megvilágítási id őszakokat és a víz h őmérsékletét a vizsgált 
halfajok sajátosságaihoz kell igazítani (1. függelék).  
1.8.3.  Vizsgálati koncentrációk  
A vizsgálat felépítését ől függetlenül a vizsgált anyagból általában 
ötféle koncentráció használata szükséges (lásd 1.7.2. szakasz). A 
vizsgált anyag toxicitásának el őzetes ismerete (pl. egy akut vizs ­
gálat és/vagy tartománykeresési vizsgálatok alapján) segíthet a megfelelő koncentrációértékek kiválasztásában. Az ötnél kevesebb 
koncentrációszint alkalmazását indokolni kell. A legmagasabb 
kísérleti koncentráció nem haladhatja meg az anyag vízoldhatósági határértékét.
 
Amennyiben diszpergálószert használnak a törzsoldat el őkészítésé­
hez, az oldat végs ő koncentrációja nem lehet több, mint 0,1 ml/liter, 
és lehetőleg azonosnak kell lennie az összes tesztedényben (lásd 
1.6.3. szakasz). Mindenesetre minden lehetséges er őfeszítést meg 
kell tenni az ilyen anyagok használatának elkerülésére.  
1.8.4.  Ellen őrzések  
A hígítóvíz-ellen őrzések száma a vizsgálat kialakításától függ (lásd 
1.7–1.7.2. szakasz). Amennyiben diszpergálószert használnak, akkor 
ugyanannyi ellen őrzést kell végezni, mint amennyit a hígítóvíz-ellen ­ 
őrzések esetében.  
1.8.5.  Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága  
A vizsgálat során a vizsgált anyag koncentrációját rendszeres id őkö­
zönként meg kell állapítani (lásd az alábbiakban).  
Átfolyási vizsgálatok esetében a hígítóvíz és a mérgez ő hatású törzs ­
oldat áramlási sebességét id őszakosan – lehet őleg naponta egyszer – 
ellenőrizni kell, továbbá biztosítani kell, hogy ezen érték a vizsgálat 
során 10 %-nál nagyobb mértékben ne ingadozzon. Amennyiben a 
vizsgált anyag koncentrációértékei a névleges értékek ± 20 száza ­
lékos sávján belülre várhatók (azaz a 80–120 %-os sávon belül; lásd 1.6.2. és 1.6.3. szakasz), akkor minimális intézkedésként javasolt a 
legmagasabb és a legalacsonyabb kísérleti koncentrációk elemzése a 
vizsgálat kezdetekor, majd azt követ ően hetente egyszer. Ameny ­
nyiben a vizsgált anyag koncentrációértékei várhatóan nem maradnak a névleges értékek ± 20 százalékos sávján belül (a vizsgált anyag 
stabilitási adatai alapján), akkor javasolt az összes kísérleti koncent ­
ráció elemzése, de minden esetben ugyanazon eljárásrendnek megfelelően.
 
A félstatikus (megújítási) vizsgálatok esetében, ahol a vizsgált anyag 
koncentrációja várhatóan a névleges értékek ± 20 százalékos sávján belül marad, minimális intézkedésként javasolt a legmagasabb és a legalacsonyabb kísérleti koncentrációk elemzése a frissen elkészített 
közegre nézve a vizsgálatok kezdetekor, közvetlenül a megújítást 
megelőzően, valamint azt követ ően hetente egyszer. Amennyiben a 
vizsgált anyag koncentrációértékei várhatóan nem maradnak meg a névleges értékek ± 20 százalékos sávján belül, az összes kísérleti 
koncentrációt a stabilabb anyagoknál alkalmazottal azonos eljárás ­
rendnek megfelel ően kell elemezni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Az eredményeket célszer ű a ténylegesen mért koncentrációértékekre 
alapozni. Amennyiben azonban megfelel ő bizonyítékokkal támaszt ­
ható alá az, hogy az oldatban lév ő vizsgált anyag koncentrációját 
sikerült a vizsgálatok során mindvégig a névleges értékek vagy a kiindulási koncentráció ± 20 százalékos sávján belül tartani, akkor 
az eredményeket a névleges vagy a mért értékekre is lehet alapozni.
 
Szükség lehet a minták sz űrésére (0,45 mikron pórusméret ű szűrő­
betétet használva) vagy centrifugálására. A javasolt eljárás a centri ­
fugálás. Amennyiben azonban a vizsgált anyag nem adszorbeálódik a filter felszínén, akkor a sz űrés is elfogadható módszer.
 
A vizsgálat során mindegyik edényben mérni kell az oldottoxigén- 
koncentrációt, a pH-értéket és a h őmérsékletet. A vízkeménységet, a 
lúgosságot és a sótartalmat (amennyiben ez mérvadó szempont) mérni kell a kontrollmintákban és a legmagasabb koncentrációjú 
közeget tartalmazó egyik edényben. Minimális követelményként az 
oldottoxigén-koncentrációt és a sótartalmat (amennyiben ez mérvadó szempont) mérni kell három alkalommal (a vizsgálat elején, közepén és végén). A félstatikus (megújítási) vizsgálatok esetében javasolt az 
oldottoxigén gyakoribb mérése, lehet őleg minden vízcsere el őtt és 
után, de hetente legalább egyszer. A pH-értéket a félstatikus megújí ­
tási vizsgálatok esetében minden vízcsere elején és végén mérni kell, az átfolyási vizsgálatok esetében pedig legalább hetente egyszer. A 
vízkeménységet és a lúgosságot vizsgálatonként egyszer kell 
megmérni. A h őmérsékletet legalább egy tesztedényben folyama ­
tosan figyelemmel kell kísérni.
 
1.8.6.  Megfigyelések  
Tömegmérés: a vizsgálat végén le kell mérni az összes életben 
maradt hal nedves (itatóspapírral szárított) tömegét; vagy tesztedé ­
nyenként csoportosan mért vagy egyedi súlyt kell meghatározni. A 
halak tesztedényenkénti együttes tömegmérése kedvez őbb az egyedi 
mérésnél, mert ez utóbbinál minden egyes halat külön meg kell jelölni. Az egyes egyedek fajlagos növekedési üteme meghatározá ­
sához végzett egyedi testtömegmérések esetében a halak egyedi jelö ­
lésére stresszmentes módszert kell kiválasztani (megfelel őek lehetnek 
a fagyasztásos jelölés alternatívái, például a színes, vékony horgász ­
zsinór használata).
 
A halakat a vizsgálat id őszakában naponta meg kell vizsgálni és 
bármilyen küls ő rendellenességet (bevérzés, elszínez ődés) vagy rend ­
ellenes viselkedésmódot fel kell jegyezni. Az elpusztulásokat fel kell jegyezni, és az elpusztult egyedeket a lehet ő legrövidebb id ő alatt el 
kell távolítani a tartályból. Az elpusztult halakat nem kell pótolni, 
mivel a meghatározott telepítési tömeg és s űrűség elegend ő – a halak 
edényben mért számában beálló változás révén – a növekedési ütem módosulásának elkerüléséhez. A táplálék arányát azonban ki kell igazítani.
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE  
A vizsgálat kialakításába és eredményei elemzésébe ajánlott egy 
statisztikus bevonása, mivel e vizsgálati módszer jelent ős eltéré­
seknek ad teret a kísérletek menetének kialakításában, például ami a tesztkamrák, a kísérleti koncentrációk, a halak stb. számát illeti. A 
vizsgálat kialakításában rejl ő választási lehet őségekre való tekintettel 
a statisztikai módszerre vonatkozó külön eligazítás itt nem szerepel.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
A 10 %-ot meghaladó mortalitási arányú tesztedényekre nézve nem 
kell kiszámítani a növekedési ütemet. A mortalitási arányt azonban 
az összes kísérleti koncentrációra nézve jelezni kell.  
Bármilyen módszer is szolgáljon az adatok elemzésére, a központi 
kérdés az „r” specifikus növekedési ütem nagysága a „t  1 ” és „t  2 ” 
időpont között. Ezt különböz ő módokon lehet meghatározni, attól 
függően, hogy a halakat megjelölik-e egyedileg, illetve hogy szükség 
van-e az átlagos növekedési ráta kiszámítására.  
r 1 ¼ log e w 2 Ä log  e w 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e w 2 Ä log  e w 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 3 ¼ log e w 2 Ä log  e w 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
ahol:  
r 1 = halegyedek specifikus növekedési üteme  
r 2 = specifikus növekedési ütem a tartály átlagában  
r 3 = pszeudospecifikus növekedési ütem  
w 1 , w 2 = egy adott hal tömege, a t  1 , illetve t  2 időpontban  
log e w 1 = egy adott hal vizsgálati id őszak elején mért tömegének 
logaritmusa  
log e w 2 = egy adott hal vizsgálati id őszak végén mért tömegének 
logaritmusa  
log e W 1 = a tesztkamrában lév ő halakra vonatkozó w1 értékek 
logaritmusainak átlaga a vizsgálati id őszak elején  
log e W 2 = a tesztkamrában lév ő halakra vonatkozó w  2 értékek 
logaritmusainak átlaga a vizsgálati id őszak végén  
t 1 , t 2 = a vizsgálati id őszak elejének és végének ideje (napja)  
Az r  1 , r 2 , r 3 értékeket ki lehet számítani a 0–8. nap id őszakára 
és – adott esetben (azaz amennyiben a 14. napon is végeznek méré ­
seket) – a 0–14., illetve a 14–28. nap id őszakára.  
2.1.1.  Az eredmények regressziós elemzése (a koncentráció változására 
való reagálás modellezése)  
Ezen elemzési módszer a specifikus növekedési ütem és a koncent ­
rációértékek között hoz létre alkalmas matematikai összefüggést, és ennélfogva lehet ővé teszi az „EC
 x ” azaz bármely szükséges EC érték 
becslését. E módszer használatakor nem szükséges kiszámítani az „r” 
értékét az egyes halegyedekre (r  1 ), hanem ehelyett az „r”„kamraát ­
lag” értékére (r  2 ) lehet a számítást alapozni. Lehet őleg ez utóbbi 
módszert kell alkalmazni. Ez egyben a legkisebb halfajok kísérleti 
felhasználásához is célszer űbb megoldás.  
Az átlagos specifikus növekedési ráták (r  2 ) a koncentráció változá ­
sának függvényében grafikusan ábrázolhatók a koncentráció változá ­
sára való reagálás összefüggéseinek megvizsgálása érdekében.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Az r  2 és a koncentráció alakulása közötti összefüggés kifejezése 
érdekében egy megfelel ő indoklással alátámasztott választás szerinti, 
alkalmas modellt kell használni.  
Amennyiben a kísérletet túlél ő halak száma nem azonos a tesztedé ­
nyekben, akkor a modellillesztéses folyamatot, függetlenül attól, hogy egyszer ű vagy nem lineáris, súlyozni kell, a csoportok nem 
egyenlő létszámának a figyelembevétele érdekében.
 
A modellillesztéses módszer segítségével becsülhet ő kell, hogy 
legyen pl. az EC  20 és a középértékt ől való eltérés (akár a standard 
hibát, akár a konfidencia-intervallumot tekintve). Az illesztett modell 
grafikonját az adatokkal összevetve kell bemutatni úgy, hogy látható legyen a modell illeszkedésének megfelel ő volta (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2.  Az eredmények elemzése a LOEC becsléséhez  
Amennyiben a vizsgálat során párhuzamos tartályokat használnak 
valamennyi koncentrációszinten, akkor a LOEC becslését az átlagos specifikus növekedési ráták varianciaanalízisére (ANOVA) lehet 
alapozni (lásd 2.1. szakasz), amit egy célszer ű módszer alkalmazása 
követ (pl. a Dunnett- vagy a Williams-vizsgálat (13) (14) (15) (22)), amellyel az átlagos „r” értéket lehet összevetni valamennyi koncent ­
rációszint esetében a kontrollszámítások átlagával azon legalacso ­
nyabb koncentráció megállapítására, amelyben 0,05-ös valószín űségi 
szinten szignifikáns a változás. Amennyiben nem teljesülnek a para ­
méteres módszerre nézve megkövetelt feltételek – nem normál 
eloszlás (pl. Shapiro-Wilk-próba) vagy heterogén variancia (Bart ­
lett-próba) – akkor fontolóra lehet venni az adatok varianciahomo ­
genizálása érdekében történ ő transzformálását az ANOVA elemzés 
elvégzése el őtt, illetve egy súlyozott ANOVA elemzés végrehajtását.
 
Amennyiben a vizsgálat során nem használnak párhuzamos tartá ­
lyokat valamennyi koncentrációszinten, akkor a tartályokra alapozott 
ANOVA elemzés érzéketlen vagy kivitelezhetetlen lesz. Ebben a 
helyzetben elfogadható kompromisszumot jelent, ha az ANOVA elemzést az egyes halegyedekre vonatkozó r
 3 pszeudospecifikus 
növekedési ütemre alapozva végzik el.  
Ekkor az egyes kísérleti koncentrációkhoz tartozó átlagos r  3 érté­
keket össze lehet hasonlítani a kontrollokra vonatkozó átlagos r  3 
értékkel. A LOEC értékét ekkor a korábbiakban említettekkel azonos 
módon lehet megállapítani. Fel kell ismerni, hogy e módszer nem veszi figyelembe a tartályok közötti variabilitást – és nem is nyújt 
védelmet ellene – azon túl, amit az egyes halegyedek közötti varia ­
bilitás alapján lehet beszámítani. A tapasztalat azonban azt mutatta (9), hogy a tartályok közötti variabilitás nagyon csekély volt a tartá ­
lyon belüli (azaz egyedek közötti) variabilitáshoz képest. Ameny ­
nyiben egyes halegyedeket nem vonnak be az elemzésbe, akkor a 
kívül eső értékek azonosítására szolgáló módszert és alkalmazásának 
igazolását biztosítani kell.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
Az eredményeket kell ő óvatossággal kell értelmezni, amennyiben a 
kísérleti oldatokban mért mérgez őanyag-koncentrációk az analitikai 
módszer észlelési határa közelében lév ő szinteket érnek el, vagy – 
félstatikus (megújítási) vizsgálatok esetében – amennyiben a vizsgált 
anyag koncentrációja csökken az oldat frissen elkészített állapota és a megújítás el őtti állapota között.
 
2.3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálatról készített jelentésben ki kell térni az alábbi informá ­
ciókra:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  A vizsgált anyag  
— a vizsgált anyag fizikai jellege és fontos fizikai-kémiai tulajdon ­
ságai,  
— a kémiai azonosítási adatok, beleértve a kémiai tisztaságot és – 
adott esetben – a vizsgált anyag mennyiségének számszer űsíté­
sére szolgáló analitikai módszert.  
2.3.2.  A vizsgált fajok  
— lehetőség szerint a tudományos név,  
— törzs, méret, szállító, esetleges el őzetes kezelés stb.  
2.3.3.  Vizsgálati körülmények  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás (pl. félstatikus/megújítási, átfo ­
lyási, telepítési tömeg és s űrűség stb.),  
— a vizsgálat kialakítása (pl. a tesztedények száma, a kísérleti 
koncentrációk és ismétlések, a halak tartályonként létszáma),  
— a törzsoldat elkészítésének módszere és a vízcsere gyakorisága 
(az esetleg használt diszpergálószer nevét és koncentrációját meg kell adni),
 
— a névleges kísérleti koncentrációk, a mért értékek átlaga és 
szórása a kísérleti tartályokban, az ilyen adatok megszerzésének 
módszerei és bizonyítékok annak alátámasztására, hogy a mérések valóban az oldatban lév ő vizsgált anyag koncentráció ­
szintjeire vonatkoznak,
 
— a hígítóvíz jellemz ői: pH-érték, keménység, lúgosság, h őmérsék­
let, oldottoxigén-koncentráció, maradványklór-szintek (ameny ­
nyiben mérik), összes szerves szén, szuszpendált szilárd anyagok, 
a vizsgálati közeg sótartalma (amennyiben mérik) és bármely 
más mérési adat,  
— vízmin őség a tesztedényekben: pH-érték, keménység, h őmér­
séklet és az oldottoxigén-koncentráció,  
— részletes információk a tápanyagról (pl. a haltáp típusa, beszer ­
zési forrása, az adagolt mennyiség és az adagolás gyakorisága).  
2.3.4.  Eredmények  
— annak bizonyítása, hogy a kontrollok teljesítették a túlélés érvé ­
nyességi kritériumait, valamint adatok a különböz ő kísérleti 
koncentrációkban bekövetkez ő mortalitásról,  
— a felhasznált statisztikai analitikai módszerek és hogy a statisztika 
párhuzamos vizsgálatok eredményein vagy az egyedekre vonat ­
kozó adatokon alapul-e, az adatok kezelése és a felhasznált módszerek célszer űségének igazolása,
 
— táblázatokba foglalt adatok a halak egyedi és átlagtömegér ől a 0., 
14. (amennyiben mérik) és a 28. napon mérve, az átlagos speci ­
fikus növekedési ráta vagy a pszeudospecifikus növekedési ráta 
értékei a 0–28. nap id őszakában vagy lehet őség szerint a 0–14. 
és a 14–28. nap id őszakaiban,  
— a statisztikai elemzés eredményei (azaz regressziós analízis vagy 
ANOVA) lehet őleg táblázatos és grafikus formában bemutatva, 
valamint a LOEC (p = 0,05) és a NOEC vagy lehet őség szerint 
az EC  x értékei, adott esetben a szórás feltüntetésével,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— a halak szokatlan reakcióinak és a vizsgált anyag által el őidézett 
bármely látható elváltozás el őfordulása.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) SOLBE J. F. DE LG (1987). Environmental Effects of Chemi ­
cals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of 
Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2. Meyer, A., Bierman, C. 
H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebra ­
fish (Danio rerio), a model system in developmental biology: 
an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. 
B. 252, pp. 231-236.
 
(2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855-1870.  
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, pp.157-164.
 
(5) Yamamoto, Toki o. (1975). Series of stock cultures in biolo ­
gical fielásd Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku 
Publish. Tokio, Japan.  
(6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- 
term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Ory ­
zias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287-297.  
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA- 600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, 
Minnesota.
 
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328-338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, 
coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 pp.  
(10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of 
fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 12 December 1991.
 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A 
technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, 
Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 
120, pp. 123-133.
 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish 
Biology, 37, pp. 33-41.
 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T. F. H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
 
(18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, pp. 1485-1494.  
(19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). 
Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival 
and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA- 6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
 
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for 
chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protec ­
tion Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minne ­
sota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Asses ­
ment Center. Sept. 1988. 12 pp.  
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
1. függelék  
A VIZSGÁLATHOZ JAVASOLT HALFAJOK ÉS A MEGFELEL Ő VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK  
Fajok A vizsgálathoz 
javasolt h őmérsék­
let-tartomány 
( o C) Megvilágítási 
időszak 
(óra) Halak javasolt 
kiindulási tömege 
(gramm) Megkövetelt mérési 
pontosság Betelepítési tömeg 
(g/l) Betelepítési 
sűrűség 
(literenként) Táplálék Vizsgált id ő 
tartama 
(nap) 
Javasolt fajok:  
Oncorhynchus mykiss  
Szivárványos pisztráng 12,5—16,0 12–16 1–5 Legközelebbi 
100 mg 1,2—2,0 4 Lazacivadékok különleges 
szárított tápláléka >28 
Más, jól dokumentált fajok  
Danio rerio  
Zebrahal 21–25 12–16 0,050—0,100 Legközelebbi 
1 mg 0,2—1,0 5–10 Él ő táplálék  (Brachionus arte ­
mia) >28 
Oryzias latipes  
Rizshal (Medaka) 21–25 12–16 0,050—0,100 Legközelebbi 
1 mg 0,2—1,0 5–20 Él ő táplálék  (Brachionus Arte ­
mia) >28
2. függelék  
AZ ELFOGADHATÓ MIN ŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB 
KÉMIAI TULAJDONSÁGA  
ANYAG MEGNEVEZÉSE KONCENTRÁCIÓÉR ­
TÉKEK  
Lebegőanyag < 20 mg/liter 
Összes szerves szén < 2 mg/liter Nem ionizált ammónia < 1 μg/liter 
Maradek klór < 10 μg/liter 
Összes szerves foszfortartalmú peszticid < 50 ng/liter 
Összes szerves klórtartalmú peszticid pluszpoliklórozott 
bifenilek < 50 ng/liter 
Összes szerves klór < 25 ng/liter
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
3. függelék  
Toxicitási vizsgálatok céljaira alkalmas koncentrációértékek logaritmikus sorozatai (9)  
Oszlop (koncentrációértékek száma 100 és 10 vagy 10 és 1 között) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Egy oszlopból öt (vagy több) egymást követ ő koncentrációértéket lehet kiválasztani. Az x oszlopban szerepl ő koncentrációértékek 
közötti középértékek a (2x + 1) oszlopban találhatók meg. A felsorolt értékek mennyiség vagy tömegszázalék (mg/liter vagy 
mikrogramm/liter) formájában kifejezett koncentrációértékeket jelenthetnek. Az értékeket adott esetben a 10 bármely hatványával  
meg lehet szorozni vagy el lehet osztani. Az 1. oszlop adatai akkor használhatók, ha jelent ős a bizonytalanság a toxicitás szintjét 
illetően. ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  RÖVID TÁVÚ TOXICITÁSI VIZSGÁLAT HALEMBRIÓKKAL 
ÉS HALLÁRVÁKKAL  
1. MÓDSZER  
E rövid távú toxicitásvizsgálati módszer az OECD TG 212 (1998) 
megfelelője. 
1.1. BEVEZETÉS  
A halembriókon és hallárvákon végzett rövid távú toxicitásvizsgálat 
olyan rövid távú vizsgálat, amely az újonnan megtermékenyült 
petétől a szikzacskós ivadéki állapot végéig terjed ő fejlődési szaka ­
szokat fedi le. Az embrió- és lárvateszt során táplálék adagolására nem kerül sor, és ezért a vizsgálatot addig kell befejezni, amíg az ivadékokat még táplálja a saját szikzacskójuk.
 
A vizsgálata célja meghatározni a vizsgált fajokra és azok fejl ődési 
szakaszaira vegyi anyagok által gyakorolt letális és – korlátozott mértékig – a szubletális hatásokat. E vizsgálat hasznos informáci ­
ókkal szolgálhat, amennyiben a) hidat képez a letális és szubletális 
vizsgálatok között; b) el ővizsgálatként alkalmazható a korai életcik ­
lusra vonatkozó valamennyi vagy krónikus toxicitási vizsgálatok esetében; és c) olyan fajok vizsgálatára is felhasználható, amelyek 
tenyésztési módszerei nem kell ően fejlettek ahhoz, hogy lefedjék az 
endogén táplálkozásról az exogén jelleg űre való váltás id őszakát.
 
Emlékeztetni kell arra, hogy csak a halak életciklusának minden 
szakaszát felölel ő vizsgálatok képesek általában pontos becslést 
adni a vegyi anyagok halakra gyakorolt krónikus toxicitásáról, továbbá hogy az egyes életszakaszokban alkalmazott csökkentett expozíció csökkentheti a teszt érzékenységét, s ezért a krónikus 
toxicitás mértékének alábecsléséhez vezethet. Ezért várható, hogy a 
halembriókon és hallárvákon végzett toxicitási vizsgálat kevésbé lesz érzékeny, mint a halak korai életciklusát vizsgáló valamennyi vizs ­
gálat, különösen ami a lipofil (log P
 ow > 4), illetve a mérgez ő 
hatásukat sajátságos módon kifejt ő vegyi anyagokat illeti. A kétféle 
vizsgálat között az érzékenység tekintetében mutatkozó kisebb különbségek a nem specifikus, narkotikus hatásmechanizmusú 
vegyi anyagok esetében várhatók (1).
 
E vizsgálat publikálását megel őzően a halembriók és hallárvák 
körében a legtöbb tapasztalatot az édesvízi  Danio rerio  Hamilton- 
Buchanan nev ű hallal (Teleostei, Cyprinidae, közönséges nevén 
zebrahal) szerezték. Ezért a vizsgálatnak az e fajra vonatkozó végre ­
hajtásáról az 1. függelék részletes útmutatást nyújt. Ez természetesen nem zárja ki olyan más fajok használatát, amelyekre nézve szintén 
ismertek tapasztalatok (lásd az IA. és IB. táblázatot).
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Legalacsonyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció 
(LOEC) : a vizsgált anyag azon legalacsonyabb kísérleti koncentrá ­
ciója, amelynél a kontrollal összevetve még megfigyelhet ő az anyag 
egy jelent ős hatása (p < 0,05). Azonban a LOEC fölötti koncentrá ­
ciónak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább azonos a LOEC-nél megfigyelttel, vagy súlyosabb annál.
 
Megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentráció (NOEC) : a közvet ­
lenül a LOEC alatti kísérleti koncentráció.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A halembriók és hallárvák a vízben oldott vizsgált anyag széles 
tartományon belüli koncentrációinak vannak kitéve. A tervezés során választani lehet a félstatikus és az átfolyási eljárás közül. A 
választást a vizsgált anyag jellege határozza meg. A vizsgálat azzal 
kezdődik, hogy frissen megtermékenyített petéket helyeznek a kísér ­
leti kamrákba, és akkor ér véget, amikor a kísérleti kamrák valame ­
lyikében bármelyik lárva szikzacskója teljesen felszívódik, vagy 
amennyiben elkezd ődik a kontrollcsoportokban az éhezés miatti 
pusztulás. A letális és szubletális hatásokat ki kell értékelni, és össze kell hasonlítani a kontrollcsoportbeli értékekkel, a legalacso ­
nyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció (LOEC), és ennek 
kapcsán a megfigyelhet ő hatást nem okozó koncentráció (NOEC) 
meghatározása érdekében. Alternatív módon a hatásokat egy regresz ­
sziós modellel lehet elemezni azon koncentráció megállapítása érde ­
kében, amely egy adott százaléknyi hatást vált ki (azaz LC/EC
 x , 
C/EC  x , ahol az x egy meghatározott százalék mérték ű hatás).  
1.4. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
Rendelkezésre kell hogy álljanak az e vizsgálat céljára kiválasztott 
fajokkal lehet őleg korábban már végzett, akut toxicitási vizsgálatok 
eredményei (lásd a C.1. vizsgálati módszert). Az eredmények hasz ­
nosak lehetnek a korai életszakaszokat vizsgáló vizsgálat során alkal ­
mazandó kísérleti koncentrációk megfelel ő tartományának kiválasz ­
tásában. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldhatóságának (ideértve a 
vizsgálathoz felhasznált vizet is) és g őznyomásának értékeit. Megbíz ­
ható analitikai módszerrel kell rendelkezni a kísérleti oldatokban lév ő 
vizsgált anyag számszer űsítésére, amelynek pontossága és észlelé ­
sének korlátai ismertek és dokumentáltak.  
A vizsgálati körülmények megállapítása tekintetében hasznos infor ­
mációk közé tartozik még a szerkezeti képlet, az anyag tisztasága, stabilitása fénnyel, illetve a vizsgálat körülményeivel szemben, a pKa és P
 ow értékek, valamint a gyors biológiai lebomlásra vonatkozó 
vizsgálatok eredményei (lásd a C.4. vizsgálati módszert).  
1.5. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A vizsgálat érvényességéhez az alábbi feltételeknek kell teljesülniük:  
— a kontrollcsoportokban és – amennyiben szükséges – az oldó ­
szeres kontrollokban a megtermékenyített peték összesített 
túlélési arányszámai nagyobbak a 2. és 3. függelékben meghatá ­
rozott határértékeknél vagy egyenl ők azokkal,  
— a kísérlet során az oldott oxigén koncentrációját mindvégig 
legalább a leveg ő telítettségi érték (ASV) 60 és 100 %-a között 
kell tartani,  
— a víz h őmérséklete a vizsgálat során a tesztedényekben, illetve 
bármelyik két egymást követ ő nap között 1,5  o C-nál nagyobb 
mértékben nem változhat, és a h őmérsékletet a vizsgált fajra 
nézve meghatározott h őmérséklet-tartományon belül kell tartani 
(lásd 2. és 3. függelék).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Tesztedények  
Üvegből vagy más, kémiailag semleges anyagból készült edényeket 
kell használni. Az edényeknek elég nagyoknak kell lenniük ahhoz, 
hogy lehet ővé tegyék a betelepítési arány betartását (lásd 1.7.1.2. 
szakasz). Javasolt a tesztedények véletlenszer ű elhelyezése a vizs ­
gálatra kijelölt területen. A teljesen véletlenszer ű elrendezéssel 
szemben célszer űbb a véletlenszer űen elhelyezett blokkok alkalma ­
zása, ahol mindegyik blokkban képviselve van mindegyik kezelési 
mód, amennyiben léteznek a blokkelrendezés révén ellen őrizhető, 
szisztematikusan érvényesül ő hatások a laboratóriumban. Ameny ­
nyiben ilyen blokkokba rendezésre kerül sor, akkor ennek tényét 
az adatok kés őbbi elemzései során figyelembe kell venni. A teszt ­
edényeket védeni kell a nem kívánt zavaró hatásoktól.  
1.6.2.  A halfajok kiválasztása  
A vizsgálat céljaira javasolt halfajok listáját az 1A. táblázat tartal ­
mazza. Ez nem zárja ki más fajok használatát (amelyre példák az 1B. 
táblázatban találhatók), de az eljárást ekkor esetleg módosítani kell a megfelelő feltételek biztosítása érdekében. Ebben az esetben a jelen ­
tésnek tartalmaznia kell a fajok és a kísérleti módszer kiválasztá ­
sának indoklását.
 
1.6.3.  A halivadék tartása  
A halivadék megfelel ő feltételek melletti tartására vonatkozó rész ­
letek az OECD TG 210 jel ű dokumentumban (  1 ) és a (2) (3) (4) (5) 
(6) számú szakirodalmi hivatkozásban találhatók.  
1.6.4.  Az embriók és lárvák kezelése  
Az embriókat és lárvákat a f ő tartályon belül elhelyezett, oldalaiknál 
vagy végeiknél lukacsos kisebb edényekben lehet kitenni a tartályon átfolyó vizsgált oldat hatásának. E kisebb tartályokban a turbulenci ­
amentes áramlást úgy lehet elérni, hogy az edényeket egy olyan 
karra függesztjük fel, amely fel-le mozgatható, ügyelve, hogy az 
organizmusok mindig a vizsgált oldatban legyenek; egy szifonzáras öblítőrendszert is be lehet építeni. Lazacfélék megtermékenyített 
petéit olyan rácsokon vagy hálókon lehet tartani, amelyek nyílásai 
elég nagyok ahhoz, hogy a petékb ől kibújó lárvák átessenek rajtuk. 
A teljes napi megújítással járó félstatikus vizsgálatok során Pasteur- pipettákat lehet használni az embriók és lárvák kiemelésére (lásd 1.6.6. szakasz).
 
Amennyiben a peték f ő kísérleti tartályon belüli tartására kis tartá ­
lyokat, rácsokat vagy hálókat használnak, akkor a lárvák kikelése után ezeket a visszatartó eszközöket el kell távolítani (
 1 ), kivéve, 
ha a halak szökésének megakadályozása érdekében van rájuk szük ­
ség. Amennyiben szükség lenne a lárvák áthelyezésére, akkor azokat 
nem szabad kitenni a leveg ő hatásának, és nem szabad hálót hasz ­
nálni halaknak a peték tárolására használt tartályból való kiemelésére 
(ilyen elővigyázatosságra nincs feltétlenül szükség egyes kevésbé 
sérülékeny halfajok, pl. ponty esetén). Az ilyen áthelyezés id őzítése 
az egyes fajoktól függ ően változik, és nincs mindig szükség rá. A 
félstatikus módszernél f őzőpoharakat vagy alacsony falú edényeket 
lehet használni, és – amennyiben szükséges – ezeket a f őzőpohár alja 
fölé kismértékben emelt hálóval lehet felszerelni. Amennyiben az ilyen tartóedények térfogata megfelel ő a betelepítési szinttel kapcso ­
latos követelmények teljesítéséhez (lásd 1.7.1.2. szakasz), akkor 
nincs is feltétlenül szükség az embriók vagy lárvák áthelyezésére.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Párizs, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test”.
 1.6.5.  Víz  
A vizsgálathoz bármely olyan víz felhasználható, amely megfelel a 
4. függelékben az elfogadható min őségű hígítóvízre vonatkozó 
kémiai jellemz őknek, és amelyben a vizsgálatnak alávetett állatfajok 
legalább olyan jó túlélési eredményeket mutatnak, mint ami a 2. és 3. 
függelékben le van írva. A víz min őségét a kísérlet során mindvégig 
azonos szinten kell tartani. A víz pH-értéke az adott vizsgálat során mindvégig csak ± 0,5 pH-egységgel térhet el a kiindulási értékt ől. 
Annak biztosítására, hogy a hígítóvíz ne gyakoroljon nem kívánt 
hatást a vizsgálat eredményeire (pl. mert komplexet képez a teszt ­
anyaggal), illetve ne gyakoroljon kedvez őtlen hatásokat az ivadék ­
állomány teljesítményére, id őnként mintákat kell venni elemzésre. 
Mérni kell a következ ő összetev őket: a nehézfémek (pl. Cu, Pb, 
Zn, Hg, Cd és Ni), a fontosabb anionok és kationok (pl. Ca, Mg, Na, K, Cl és SO
 4 ), a peszticidek (pl. összes szervesfoszfor- és összes 
szervesklór-tartalmú peszticid), az összes szerves szén és a szuszpen ­
dált szilárd anyagok koncentrációját, például háromhavonta, ameny ­
nyiben a hígítóvízr ől tudott, hogy viszonylag állandó min őségű. 
Amennyiben a víz min ősége bizonyítottan konstans legalább egy 
éven keresztül, akkor ritkábban, nagyobb id őközökkel is lehet ellen ­ 
őrző méréseket végezni (pl. csak hathavonta egyszer).  
1.6.6.  Vizsgált oldatok  
A kiválasztott koncentrációjú vizsgált oldatok a törzsoldat hígításával 
készíthetők el.  
A törzsoldatot lehet őleg a vizsgált anyagnak a hígítóvízbe, mecha ­
nikai eszközök (pl. kever ő, ultrahang) segítségével történ ő bekeveré ­
sével vagy hozzákeverésével kell elkészíteni. Telítési oszlopok (old ­
hatósági oszlopok) is felhasználhatók a megfelel ő koncentrációjú 
törzsoldat elkészítéséhez. A lehet őségekhez mérten kerülni kell az 
oldószerek vagy diszpergálószerek használatát, bár ilyen vegyüle ­
tekre egyes esetekben szükség lehet egy megfelel ő töménység ű törzs­
oldat előállításához. Alkalmas oldószer lehet az aceton, etanol, meta ­
nol, dimetil-formamid és a trietilén-glikol. Alkalmas diszpergálószer 
lehet például: a Cremophor RH40, Tween 80, Metilcellulóz 0,01 % 
és a HCO-40. Kell ő figyelemmel kell eljárni a biológiailag gyorsan 
lebomló szerek (pl. aceton) és/vagy az er ősen illékony összetev ők 
használatakor, mivel ezek az átfolyási vizsgálatok során fellép ő 
bakteriális szintetikus aktivitás miatt okozhatnak gondokat. Ameny ­
nyiben diszpergálószereket kell használni, azok nem gyakorolhatnak lényeges hatásokat a túlélésre, és láthatóan kedvez őtlen hatásokat a 
korai életszakaszban, amit csak egy oldószerrel végzett ellen őrző 
vizsgálat tárhat fel. Törekedni kell azonban az ilyen anyagok hasz ­
nálatának kerülésére.
 
Félstatikus vizsgálatok során két különböz ő vízcseremódszer közül 
lehet választani: i. új vizsgált oldatokat készítenek tiszta edényekben 
és a kísérlet korábbi fázisait túlél ő petéket és lárvákat a régi oldat kis 
mennyiségével együtt kíméletesen áttelepítik az új edényekbe, kerülve az él őlények érintkezését a leveg ővel; vagy ii. az organiz ­
musokat visszatartják az edényben, miközben a vizsgálat céljaira 
használt víz egy részét (legalább háromnegyedét) lecserélik. A 
közeg megújításának gyakorisága a vizsgált anyag stabilitásától függ, azonban ajánlott a víz napi cseréje. Amennyiben a korábbi stabilitási vizsgálatok (lásd 1.4. szakasz) arra mutattak rá, hogy 
nem stabil a vizsgált anyag koncentrációja (azaz kívül esik a 
névleges koncentráció 80–120 %-os tartományán, vagy a kiindu ­
láskor mért koncentráció 80 %-a alá csökken) a megújítási id őszak 
során, akkor fontolóra kell venni egy átfolyási vizsgálat lefolytatását. 
Minden esetben gondosan ügyelni kell arra, hogy elkerüljük a 
lárvákat ér ő stresszhatásokat a vízcserem űveletek során.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Az átfolyási vizsgálatok céljára olyan rendszert kell használni, amely 
folyamatosan biztosítja és hígítja a vizsgált anyag törzsoldatát (pl. 
egy adagolószivattyú, proporcionális hígító vagy egy telít őrendszer), 
annak érdekében, hogy a kísérleti kamrákhoz eljusson a hígítóoldat. A kísérlet során megfelel ő időnként – lehet őleg naponta – ellen őrizni 
kell a törzsoldatok és a hígítóvíz áramlási sebességét, amelynek 
értéke nem változhat 10 %-nál nagyobb mértékben a vizsgálat során. A 24 óránként legalább öt kísérleti kamrányi vízcserének megfelel ő 
áramlási sebességet találták megfelel őnek.
 
1.7 ELJÁRÁS  
A szakirodalom hasznos információkat tartalmaz a halembriók és 
hallárvák toxicitási vizsgálatai során mutatott teljesítményér ől, 
amelyek közül néhányat példaként e szövegrész szakirodalmi hivat ­
kozásai tartalmaznak (7) (8) (9).  
1.7.1.  Expozíciós feltételek  
1.7.1.1.  Időtartam  
A vizsgálatot lehet őleg a peték megtermékenyítését követ ő 30 percen 
belül meg kell kezdeni. Az embriókat a csírakorong osztódásának 
kezdete el őtt, vagy közvetlenül utána, vagy bármely id őpontban, 
mielőtt a gasztrulastádium kialakulna, a tesztoldatba kell helyezni. 
A kereskedelmi szállítótól kapott peték esetében nincs mód a vizs ­
gálat azonnali megkezdésére a megtermékenyítés után. Mivel a 
kezdés késleltetése komolyan befolyásolja a vizsgálat érzékenységét, a vizsgálatot a megtermékenyítést követ ő nyolc órán belül minden ­
képpen el kell kezdeni. Mivel az expozíciós id ő alatt a lárvák nem 
kapnak táplálékot, a vizsgálatot még az el őtt be kell fejezni, miel őtt a 
kísérleti kamrák valamelyikében bármelyik lárva szikzacskója teljesen felszívódik, vagy elkezd ődik a kontrollcsoportokban az 
éhezés miatti pusztulás. Az id őtartam a használt fajtól függ. Néhány 
javasolt id őtartam a 2. és 3. függelékben található.
 
1.7.1.2.  Betelepítés  
A vizsgálat kezdetén használt megtermékenyített peték számának 
elegendőnek kell lennie a statisztikai követelmények kielégítéséhez. 
A petéket véletlenszer űen kell elosztani a különböz ő kezelési módok 
között, és koncentrációszintenként legalább három párhuzamos 
edény között egyenletesen elosztott, tartályonként legalább 
30 megtermékenyített petét kell behelyezni (illetve törekedni kell a lehető legegyenletesebb elosztásra, mert egyes fajok esetében nehéz a 
teljesen egyenl ő adagok kimérése). A betelepítési arányt (a vizsgált 
oldat egységnyi mennyiségére jutó biomassza) mindenképpen 
annyira alacsonyan kell tartani, hogy a vízben oldott oxigén koncent ­
rációját külön leveg őztetés nélkül is a leveg őtelítettségi érték 
legalább 60 %-ának megfelel ő szinten lehessen tartani. Az átfolyási 
vizsgálatok esetében javasolt a 24 órára számítottan 0,5 g/liternél, 
illetve bármely id őpontban 5 g/liter oldatnál nem magasabb betelepí ­
tési arány tartása (2).
 
1.7.1.3.  Megvilágítás és h őmérséklet  
A megvilágítási id őszakokat és a víz h őmérsékletét a vizsgált 
halfajok sajátosságaihoz kell igazítani (lásd 2. és 3. függelék). A 
hőmérséklet alakulásának figyelemmel kíséréséhez célszer ű lehet 
egy további tesztedény beiktatása.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Vizsgálati koncentrációk  
A vizsgált anyagból általában ötféle, egy 3.2 érték ű konstans 
tényezőt meg nem haladó osztások szerint beállított koncentráció 
használata szükséges. A tényleges vizsgálatok során a kísérleti 
koncentrációk tartományának kiválasztásakor célszer ű mérlegelni az 
LC50-et az expozíciós id őszakhoz viszonyító görbét. Egyes 
esetekben célszer ű lehet az ötnél kevesebb koncentrációszint alkal ­
mazása (pl. a határérték-vizsgálatoknál), valamint a sz űkebb koncent ­
ráció-intervallumok használata. Az ötnél kevesebb koncentrációszint 
alkalmazását indokolni kell. Nem szükséges vizsgálni a vizsgált anyag koncentrációját a 96 óránál LC50-nél vagy a 100 mg/l 
értéknél magasabb értékek esetében aszerint, hogy melyik érték az 
alacsonyabb. A vizsgált anyagokat a vizsgálathoz használt vízben való oldhatóságuk határértéke feletti tartományban nem kell vizs ­
gálni.
 
Amennyiben diszpergálószert használnak a vizsgált oldat elkészíté ­
séhez (lásd 1.6.6. szakasz), az oldat végs ő koncentrációja nem lehet 
több, mint 0,1 ml/liter, és azonosnak kell lennie az összes vizsgálati 
edényben.  
1.7.3.  Ellen őrzések  
A normál vizsgált sorozatokon kívül egy hígítóvíz-kontrolltartályt 
(szükség szerint két példányban) és – amennyiben célszer ű – egy, 
a diszpergálószert tartalmazó kontrolltartályt kell m űködtetni.  
1.7.4.  Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága  
A vizsgálat során a vizsgált anyag koncentrációját rendszeres id őkö­
zönként meg kell állapítani.  
A félstatikus vizsgálatok során, amennyiben a vizsgált anyag 
koncentrációértékei a névleges értékek ± 20 százalékos sávján 
belülre várhatók (azaz a 80–120 %-os sávon belül; lásd 1.4. és 1.6.6. szakasz), akkor minimális intézkedésként javasolt a legmagasabb és a legalacsonyabb kísérleti koncentrációk elemzése, a frissen készült 
anyagon és közvetlenül a vízcsere el őtt legalább három, a vizsgálat 
során időben egyenletesen elosztott alkalommal (azaz az elemzéseket 
az azonos oldatból vett mintán kell végezni, amikor az oldat frissen készült és a megújítás alkalmával).
 
Amennyiben a vizsgált anyag koncentrációértékei várhatóan nem 
maradnak a névleges értékek ± 20 százalékos sávján belül (a vizsgált 
anyag stabilitási adatai alapján), akkor javasolt az összes koncent ­
ráció elemzése ugyanazon eljárásrendnek megfelel ően (legalább 
három, a vizsgálat során id őben egyenletesen elosztott alkalommal). 
A vizsgált anyag koncentrációértékeinek a vízcserét megel őző 
meghatározását minden egyes kísérleti koncentráció esetében csak 
egyetlen párhuzamos tartályra nézve kell elvégezni. A meghatá ­
rozások között legfeljebb hét nap telhet el. Az eredményeket célszer ű 
a ténylegesen mért koncentrációértékekre alapozni. Amennyiben 
azonban megfelel ő bizonyítékokkal támasztható alá, hogy az 
oldatban lév ő vizsgált anyag koncentrációját sikerül a vizsgálatok 
során mindvégig a névleges értékek vagy a kiindulási koncentráció ± 20 százalékos sávján belül tartani, akkor az eredményeket a 
névleges vagy a mért kezdeti értékekre is lehet alapozni.
 
Az átfolyási vizsgálat esetében megfelel ő lehet a félstatikus vizsgála ­
tokkal kapcsolatban leírthoz hasonló mintavételi eljárás alkalmazása 
(azonban a „régi” oldatok mérése ebben az esetben nem alkalmaz ­
ható). Amennyiben azonban a vizsgálat id őtartama több mint hét 
nap, tanácsos a mintavételek számát az els ő héten növelni (pl. 
három méréssorozatra), a koncentrációértékek stabilan tartásának 
biztosítása érdekében.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Szükség lehet a minták centrifugálására vagy sz űrésére (0,45 mikron 
pórusméret ű szűrőbetétet használva). Mivel a centrifugálás és a 
szűrés sem képes mindenkor arra, hogy szétválassza a vizsgált 
anyag biológiailag nem használható részét a biológiailag használha ­
tótól, a mintákat nem feltétlenül szükséges ilyen kezeléseknek 
alávetni.  
A vizsgálat során valamennyi kísérleti tartályban mérni kell az oldot ­
toxigén-koncentrációt, a pH-értéket és a h őmérsékletet. A vízke ­
ménységet, a lúgosságot és a sótartalmat (amennyiben ez mérvadó 
szempont) mérni kell a kontrollmintákban és a legmagasabb koncent ­
rációjú közeget tartalmazó egyik edényben. Minimális követelmény ­
ként az oldottoxigén-koncentrációt és a sótartalmat (amennyiben ez mérvadó szempont) három alkalommal kell mérni (a vizsgálat elején, 
közepén és végén). A félstatikus vizsgálatok esetében javasolt az 
oldott oxigén gyakoribb mérése, lehet őleg minden vízcsere el őtt és 
után, de hetente legalább egyszer. A pH-értéket a félstatikus vizs ­
gálatok esetében minden vízcsere elején és végén mérni kell, az 
átfolyási vizsgálatok esetében pedig legalább hetente egyszer. A 
keménységet vizsgálatonként egyszer kell megmérni. A h őmérsék­
letet naponta mérni kell, és változásait lehet őleg legalább egy vizs ­
gálati edényben folyamatosan figyelemmel kell kísérni.
 
1.7.5.  Megfigyelések  
1.7.5.1.  Az embrionális fejl ődés fázisa  
A vizsgált anyag hatásának való expozíció kezdetén az embrionális 
(gasztrula) fejl ődési fázis azonosítását a lehet ő legpontosabban kell 
elvégezni. Erre a megfelel ően tartósított és megtisztított peték egy 
reprezentatív mintája használható. Az embrionális fázisok leírását és 
illusztrációját illet ően még a szakirodalom is felhasználható (2) (5) 
(10) (11).  
1.7.5.2.  A peték kikelése és túlélése  
A kikelés és túlélés folyamatait naponta egyszer meg kell figyelni és 
a tapasztalt számadatokat fel kell jegyezni. A vizsgálat elején hasznos lehet az ennél gyakoribb megfigyelések végzése (pl. az első három órában félóránként), mivel egyes esetekben a túlélési 
idők hossza fontosabb lehet az elhullások számánál (pl. amennyiben 
akut toxikus hatások figyelhet ők meg). Az elpusztult embriókat és 
lárvákat észlelésükkor azonnal el kell távolítani, mert gyorsan bomlásnak indulnak. Az elhullott egyedek kiemelésekor különös 
gonddal kell kerülni a szomszédos embriók/lárvák megütését, vagy 
fizikai megsértését, mivel e szervezetek igen sérülékenyek és érzé ­
kenyek. Az elhullás kritériumai az életciklus szakaszától függ ően 
változnak:
 
— peték : különösen a korai szakaszokban az áttetsz őség jelent ős 
csökkenése és színbeli elváltozás, amit a fehérjék koagulációja és/vagy kicsapódása okoz, ami fehér opálos színt eredményez,
 
— embriók : a testmozgás és/vagy szívverés hiánya, és/vagy opálos 
elszíneződés olyan fajoknál, amelyek embriói normál körülmé ­
nyek között áttetsz ők, 
— lárvák : mozdulatlanság és/vagy légz őmozgások és/vagy a szív ­
verés hiánya, és/vagy a központi idegrendszer opálos elszínez ő­
dése és/vagy reakció elmaradása fizikai ingerekre.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Rendellenes küllem  
A vizsgálat id őtartamától és a leírt rendellenesség jellegét ől függően 
megfelelő időközönként fel kell jegyezni a rendellenes testformájú 
és/vagy pigmentációjú lárvák számát, illetve a szikzacskó felszívó ­
dásának mértékét. Meg kell jegyezni, hogy rendellenesen fejl ődött 
embriók és lárvák természetes körülmények között is el őfordulnak, 
és egyes fajok esetében a kontrollcsoportban mennyiségük akár néhány százalékot is elérhet. A rendellenesen fejl ődött állatokat 
csak elpusztulásukkor kell a kísérleti edényb ől eltávolítani.
 
1.7.5.4.  Rendellenes viselkedés  
A rendellenes viselkedésmódokat – pl. hiperventilláció, koordiná ­
latlan úszásmód és a fajra nem jellemz ő nyugalom – a vizsgálat 
teljes időtartamától függ ő időközönként fel kell jegyezni. Bár e hatá ­
sokat nehéz számszer űsíteni, de amennyiben megfigyelhet ők, akkor 
segíthetnek a mortalitási adatok értelmezésében, azaz információkkal 
szolgálnak az anyag toxikus hatásmechanizmusáról.  
1.7.5.5.  Hosszúság  
A vizsgálat végén ajánlott az egyedi hosszúságok megmérése: szab ­
ványos, villás elágazású vagy teljes hosszúságot lehet mérni. Ameny ­
nyiben azonban a farokuszonyon rothadás vagy kimaródás, pusztulás 
jelei fordulnak el ő, akkor a szabványos hosszakat kell használni. 
Altalánosságban, egy jól végrehajtott vizsgálatban a párhuzamos kontrollok között el őforduló hosszúságeltérések együtthatója < 
20 % kell hogy legyen.
 
1.7.5.6.  A lárvák tömege  
A vizsgálat végén le lehet mérni az egyedek tömegét is; a száraztö ­
meg-adatok (24 órán át 60  o C-on tartva) célszer űbbek az (itatóspa ­
pírral szárított) nedvestömeg-meghatározásnál. Általánosságban, egy 
jól végrehajtott vizsgálatban a párhuzamos kontrollok között el őfor­
duló súlyeltérések együtthatója < 20 % kell hogy legyen.  
E megfigyelések eredménye az alábbi adatok némelyike vagy mind ­
egyike, amelyek a statisztikai elemzések céljára rendelkezésre állnak majd:
 
— kumulált mortalitás,  
— az egészséges lárvák száma a vizsgálat végén,  
— a kikelés kezdetéig és végéig eltelt id ő (azaz 90 %-os kikelés 
minden ismétlésben),  
— a napi lárvakikelések száma,  
— a vizsgálat végén túlél ő állatok hosszúsága (és tömege),  
— a deformált vagy rendellenes küllem ű lárvák száma,  
— a rendellenes viselkedésmódot mutató lárvák száma.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
A vizsgálat kialakításába és eredményei elemzésébe ajánlott egy 
statisztikus bevonása, mivel e vizsgálati módszer jelent ős eltéré­
seknek ad teret a kísérletek menetének kialakításában, például ami 
a tesztkamrák, a kísérleti koncentrációk számát vagy a megterméke ­
nyített peték induláskori számát és a mért paraméterek eltéréseit illeti. A vizsgálat kialakításában rejl ő választási lehet őségekre tekin ­
tettel, a statisztikai módszerre vonatkozó külön eligazítás itt nem 
szerepel.
 
A LOEC és NOEC értékeinek becsléséhez szükséges a párhuzamos 
eredmények közti eltérések analízise (ANOVA) vagy a kontingenci ­
atáblázatos módszerek alkalmazása. Az egyedi koncentrációszintek és a kontrollcsoport szintjei esetében kapott eredmények közötti összetett összehasonlítás érdekében hasznosnak bizonyulhat a 
Dunnett-módszer (12) (13). További hasznos példák is rendelkezésre 
állnak (14) (15). Ki kell számolni és jegyz őkönyvezni kell az 
ANOVA vagy más eljárások használatával feltárható hatások (azaz a vizsgálat teljesít őképességének) mértékét. Megjegyzend ő, hogy 
nem minden, az 1.7.5.6. szakaszban felsorolt megfigyelés alkalmas 
az ANOVA használatával történ ő statisztikai elemzés céljaira. így 
például a kumulált mortalitást és a vizsgálat végén talált egészséges lárvák számát a probit módszerek használatával lehet elemezni.
 
Amennyiben az LC/EC  x értékeket kell megbecsülni, akkor megfelel ő 
– pl. logisztikai – görbé(ke)t kell a vizsgált adatokhoz illeszteni olyan statisztikai módszerek használatával, mint amilyen a legkisebb 
négyzetek módszere vagy a nem lineáris legkisebb négyzetek 
módszere. A görbé(ke)t úgy kell paraméterezni, hogy az érdekl ődésre 
számot tartó LC/EC
 x értéket és annak standard hibáját közvetlenül 
lehessen megbecsülni. Ez nagymértékben megkönnyíti az LC/EC  x 
körüli konfidencia-határértékek kiszámítását. Kivéve, ha nyomós 
érvek szólnak a különböz ő konfidenciaszintek alkalmazása mellett, 
akkor kétoldali 95 %-os konfidenciaszintet célszer ű meghatározni. 
Az illesztési eljárásnak lehet őleg eszközként kell szolgálnia az illesz ­
kedés hiánya jelent őségének felmérésére. A görbék illesztésére 
grafikus módszerek is felhasználhatók. A regressziós elemzés az 1.7.5.6. szakaszban felsorolt összes megfigyelés elemzésére megfelelő.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE  
Az eredményeket kell ő óvatossággal kell értelmezni, amennyiben a 
kísérleti oldatokban mért mérgez őanyag-koncentrációk az analitikai 
módszer észlelési határához közel lév ő szinteket érnek el. A vizsgált 
anyag vízoldhatóságát meghaladó koncentrációértékekre vonatkozó 
eredmények értelmezésekor kell ő óvatossággal kell eljárni.  
2.3. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
2.3.1.  A vizsgált anyag  
— a vizsgált anyag fizikai jellege és fizikai-kémiai tulajdonságai,  
— a kémiai azonosítási adatok, beleértve a kémiai tisztaságot és – 
adott esetben – a vizsgált anyag mennyiségének számszer űsíté­
sére szolgáló analitikai módszer.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  A vizsgált fajok  
— tudományos név, törzs, az ikrás n őstények száma (azaz hány 
nőstényt használtak a kísérlethez szükséges peteszám el őállításá­
hoz), szállító, valamint a megtermékenyített peték begy űjtésének 
módszere és az ezt követ ő kezelése.  
2.3.3.  Vizsgálati körülmények  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás/módszer (pl. félstatikus vagy 
átfolyási, a megtermékenyítést ől a vizsgálat elkezdéséig eltelt 
idő, betelepítés stb.),  
— megvilágítási periódus(ok),  
— a vizsgálat kialakítása (pl. a tesztedények és párhuzamosok 
száma, az embriók létszáma a párhuzamos edényekben),  
— a törzsoldat elkészítésének módszere és a vízcsere gyakorisága 
(az esetleg használt diszpergálószer nevét és koncentrációját meg kell adni),
 
— a névleges kísérleti koncentrációk, a mért értékek és azok átlaga 
és szórása a tesztedényekben, az ilyen adatok megszerzésének módszerei és – amennyiben a vizsgált anyag vízben oldható a 
vizsgált koncentrációértékek szintje alatt is – bizonyítékok annak 
alátámasztására, hogy a mérések valóban az oldatban lév ő vizs­
gált anyag koncentrációszintjeire vonatkoznak,
 
— a hígítóvíz jellemz ői: pH-érték, keménység, h őmérséklet, oldot ­
toxigén-koncentráció, maradványklórszintek (amennyiben mérik), 
összes szervesszén-tartalom, szuszpendált szilárd anyagok, a vizsgált közeg sótartalma (amennyiben mérik) és bármely más mérési adat,
 
— vízmin őség a tesztedényekben: pH-érték, keménység, h őmér­
séklet és az oldottoxigén-koncentráció.  
2.3.4.  Eredmények:  
— a vizsgált anyag stabilitására vonatkozó el őzetes vizsgálatok 
eredményei,  
— annak bizonyítása, hogy a kontrollok megfelelnek a vizsgált 
fajok teljes túlélési elfogadhatósági normáinak (lásd 2. és 3. 
függelék),  
— adatok az embrió és lárva fejl ődési fázisok mortalitási/túlélési 
arányairól és az összesített mortalitási/túlélési arányokról,  
— a kikelésig eltelt napok és a kikelt példányok száma,  
— hossz-(és tömeg-) adatok,  
— az esetleges morfológiai rendellességek el őfordulása és jellem ­
zése,  
— az esetleges viselkedésbeli eltérések el őfordulása és leírása,  
— az adatok statisztikai elemzése és kezelése,  
— az ANOVA segítségével elemzett vizsgálatokra nézve a legala ­
csonyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció (LOEC) 
értéke p = 0,05-nél és megfigyelhet ő hatást nem okozó koncent ­
ráció (NOEC) értéke minden egyes kiértékelt reakcióra nézve, 
beleértve a felhasznált statisztikai módszer leírását és annak jelzé ­
sét, hogy milyen mérték ű hatást sikerült feltárni,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— a regressziós analízissel elemzett vizsgálatok esetében az LC/EC  x 
értéke, a konfidencia-intervallumok és a számításhoz felhasznált 
illesztettmodell grafikonja,  
— a leírt vizsgálati módszert ől tett esetleges eltérések magyarázata.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) KRISTENSEN P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of 
Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other 
FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
 
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research 
Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.  
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, pp. 121-173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachy ­
danio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and 
Chemistry, 6, pp. 61-71.
 
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 
807-821.
 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.
 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply 
Company, North Carolina. 36 pp.  
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J. G. (1980). 
Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proce ­
edings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phila ­
delphia.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS l/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio 
reri o. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, pp. 126-134.  
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylo ­
genetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model 
system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, 
Series B, 252: pp. 231-236.
 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and 
Environmental Safety 32, pp. 19-28.  
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
 
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
 
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic 
T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. 
(1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead 
minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.
 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.  
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
 
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.
 
1. A. táblázat  
A vizsgálatokhoz ajánlott halfajok  
Édesvízi halak  
Oncorhynchus mykiss  
Szivárványos pisztráng (9) (16)  
Danio rerio  
Zebrahal (7) (17) (18)  
Cvprinus caprio  
Közönséges ponty (8) (19)  
Oryzias latipes  
Japán rizshal/Medaka (20) (21)  
Pimephales promelas  
Nagyfejű cselle (8) (22)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
1. B. táblázat  
Példák más, jól dokumentált és tesztelésre használható halfajokra  
ÉDESVÍZI TENGERI  
Carassius auratus  
Ezüstkárász (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (nincs magyar neve) (23) (24) 
(25) 
Lepomis macrochirus  
Nagy naphal (8)  Clupea harengus  
Hering (24) (25)  
Gadus morhua  
Tőkehal (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
Tarka fogasponty (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
1. függelék  
ÚTMUTATÓ ZEBRAHAL-  (BRACHYDANIO RERIO)  EMBRIÓK ÉS 
SZIKZACSKÓS LÁRVÁK TOXICITÁSI VIZSGÁLATÁNAK 
VÉGREHAJTÁSÁHOZ  
BEVEZETÉS  
A zebrahalak India keleti, koromandel partján, gyorsfolyású patakokban élnek. A 
pontyfélék családjához tartozó közönséges akváriumi halak, amelyek tartásával és életkörülményeivel kapcsolatos információk bármelyik, a trópusi halakkal foglal ­
kozó szakkönyvben megtalálhatók. Biológiájukat és alkalmazásukat a halászati 
kutatásban Laale ismertette.
 
A zebrahal csak ritkán hosszabb 45 mm-nél. Hengeres testét 7–9 fémes-sötétkék 
vízszintes, ezüstösen csillogó csík díszíti. E mintázat a farokúszón és a farok 
alatti úszón folytatódik. A hal háta sárgászöld szín ű. A hímek karcsúbbak a 
nőstényeknél. A n őstények ezüstösebbek és hasuknál duzzadtabbak, különösen 
ívás előtt. 
A felnőtt halak a víz h őmérséklete, pH-értéke és keménységi foka tekintetében 
jelentős ingadozásokat képesek elviselni. Az egészséges, jó min őségű ikrákat 
rakó halak tartásához azonban optimális körülményeket kell biztosítani.  
A szaporodási id őszakban a hím üldözi és fejével bökdösi a n őstényt, és a 
kipréselődött ikrákat azonnal meg is termékenyíti. Az átlátszó és nem tapadós 
ikrák a vízfenékre hullanak alá, ahol szüleik olykor meg is eszik őket. A fény 
befolyásolja a halak ívását. Amennyiben a reggeli fény megfelel ő, a halak rend ­
szerint a hajnalt követ ő korai órákban rakják le ikráikat.  
A nőstény heti rendszerességgel alkalmanként több száz ikra lerakására képes.  
A TENYÉSZHALAK TARTÁSÁNAK, SZAPORÍTÁSÁNAK ÉS A KORAI 
FEJLŐDÉSI STÁDIUMOKBAN LEV Ő EGYEDEK TARTÁSÁNAK FELTÉ ­
TELEI  
Megfelelő számú egészséges halat kell kiválasztani, és megfelel ő minőségű 
vízben kell tartani (lásd 4. függelék) a tervezett ikráztatás el őtt legalább két hétig. 
Hagyni kell, hogy a halak csoportjának tagjai a vizsgálat során használandó ikrák lerakása el őtt legalább egyszer párosodjanak. A halpopuláció s űrűsége ezen 
időszakban nem haladhatja meg az 1 gramm hal/liter fajlagos értéket. Rendszeres 
vízcsere vagy víztisztító rendszer használata esetén ennél magasabb egyeds űrűség 
is lehetséges. A tárolótartályokban a h őmérsékletet 25 ± 2
 o C-on kell tartani. A 
halaknak változatos étrendet kell biztosítani, amely állhat például a kereskede ­
lemben kapható szárított haleledelb ől, élő, frissen kikelt sóféregb ől, árvaszúnyog ­
lárvából, Daphniából és televény férgekb ől (Enchytraeids).  
Az alábbiakban vázolt kétféle eljárás a gyakorlatban az elvégzend ő vizs­
gálathoz szükséges megfelel ő nagyságú, egészséges és megtermékenyített 
ikrákat eredményez:  
i) Nyolc n őstényt és 16 hímet 50 liter hígítóvizet tartalmazó, a közvetlen fény ­
sugárzástól védett és legalább 48 óráig zavartalanul hagyott tartályban kell tartani. A vizsgálat megkezdése el őtti nap délutánján az akvárium alján egy 
ívatótálcát kell elhelyezni. Az ívatótálca 5–7 cm magas (plexiüvegb ől vagy 
más alkalmas anyagból készült) keretb ől és felül 2–5 mm pórusméret ű durva 
hálóból, alul pedig 10–30 mikron finomságú szitaszövetb ől áll. A nagyobb 
pórusméret ű hálóhoz szétbontott nejlonkötelekb ől készült „ívatófákat” kell 
erősíteni. Miután a halakat 12 órán át sötétben tartják, gyenge fény bekap ­
csolására az ívás folyamata beindul. Az ívást követ ő kettő–négy óra múlva ki 
kell venni az ívatótálcát és be kell gy űjteni az ikrákat. Az ívatótálca haszná ­
latával megakadályozható, hogy a halak felfalják az ikrákat, ugyanakkor az 
ikrák összegy űjtése is egyszer űbb. A vizsgálati célra szánt ikrák lerakása el őtt 
a halakat legalább egyszer ívatni kell.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) A tervezett ívatás el őtt legalább két hétig kell 5–10 n őstényt, illetve hímet 
egyedenként elkülönítve tartani. 5–10 nap elteltével a n őstények hasa kezd 
megduzzadni, és az ivarnyílás környéke kidudorodik. A hímeken ez nem látható. Az ívatásra a fent leírt ívatótálcával felszerelt akváriumban kerül sor. A tartályt hígítóvízzel töltik fel úgy, hogy a víz szintje 5–10 cm-rel 
ellepje a hálót. A tervezett ivást megel őző napon egy n őstényt és két hímet 
kell a tartályba helyezni. A víz h őmérsékletét fokozatosan egy fokkal az 
akklimatizációs h őmérséklet fölé kell emelni. A fény kikapcsolása után a 
lehető legnagyobb nyugalmat kell biztosítani a tartály környékén. Reggel 
gyenge fény bekapcsolására az ívás folyamata beindul. 2–4 óra elteltével a 
halakat ki kell venni és az ikrákat be kell gy űjteni. Amennyiben az egy 
nősténytől begyűjthetőnél több ikrára van szükség, akkor párhuzamosan 
több ikráztatótartályt lehet m űködtetni. Az egyes n őstényeknek a vizsgálat 
megkezdése el őtti, korábbi szaporodási sikerét (az ikrák száma és min ősége 
alapján) feljegyezve ki lehet választani a tenyésztési szempontból a legsike ­
resebbnek ígérkez ő példányokat.
 
Az ikrákat gumiballonnal felszerelt (legalább 4 mm bels ő átmérőjű) üvegcsö ­
vekben kell a tesztedényekbe áthelyezni. Az ikrákkal együtt áthelyezett víz mennyiségének a szállításkor a lehet ő legkisebb kell lennie. Az ikrák s űrűsége 
nagyobb, mint a vízé, tehát az ikrák lesüllyednek, és így kikerülnek a cs őből. 
Ügyelni kell arra, hogy az ikrákat (és lárvákat) ne érje leveg ő. Az egyes 
adagokból származó mintákat mikroszkóppal megvizsgálva kell biztosítani, hogy ne történjenek rendellenességek az ivadékfejl ődés kezdeti fázisaiban. Az 
ikrák fert őtlenítése nem megengedett.
 
Az ikrák mortalitása a megtermékenyítést követ ő első 24 órában a legmagasabb. 
Ebben az id őszakban gyakran 5–40 %-os mortalitás tapasztalható. A sikertelen 
megtermékenyítés és a fejl ődés rendellenességei miatt az ikrák degenerálódnak. 
Úgy tűnik, hogy az egyes ikraadagok min ősége a nőstény hal adottságaitól függ, 
mivel egyes n őstények rendre jó min őségű ikrákat produkálnak, míg mások 
sohasem. A fejl ődés üteme és az ikrák kikelési aránya is adagonként változó. 
A sikeresen megtermékenyített ikrák és a szikzacskós lárvák túlélési aránya jó, általában meghaladja a 90 %-ot. 25
 o C-on az ikrák a megtermékenyítést követ ő 
3–5 napon belül kikelnek, a szikzacskó pedig az ivadékok a megtermékenyítést 
követő mintegy 13 napon belül felszívódik.  
Az embrionális fejl ődés folyamatát Hisaoka és Battle írta le részletesen (2). Az 
ikrák és az éppen kikelt lárvák átlátszósága miatt a halak fejl ődése jól nyomon 
követhető és a deformált változatok jelenléte megfigyelhet ő. Az ívást követ ő 
mintegy négy óra elteltével megkülönböztethet ők a megtermékenyített és a 
meg nem termékenyített ikrák (3). E vizsgálat céljaira az ikrákat és lárvákat 
kis térfogatú tesztedényekbe helyezik, és mikroszkóp alatt tanulmányozzák.  
A vizsgálatnak a korai egyedfejl ődési stádiumokra alkalmazandó feltételeit a 2. 
függelék sorolja fel. A hígítóvíz optimális pH-értéke 7,8, keménysége 250 mg/ ­
CaCO  3 /liter víz.  
SZÁMÍTÁSOK ÉS STATISZTIKA  
Két szakaszból álló módszer használata ajánlott. Els őként a mortalitásra, a rend ­
ellenes fejl ődésre és a kikelési id őre vonatkozó adatok statisztikai elemzésére 
kerül sor. Ezt követi a testhossz statisztikai elemzése azon koncentrációértékek 
tekintetében, amelyek esetében az el őbb említett adatokkal kapcsolatban nem 
tapasztaltak kedvez őtlen hatásokat. E módszer használata azért tanácsos, mert a 
toxikus anyag specifikusan elpusztíthatja a kisebb halakat, késleltetheti a kikelési időt és jelent ősen torzult egyedeket produkálhat, ezért eltorzított testhosszered ­
ményekre vezethet. Továbbá így a kezelésenként megmérend ő halak száma nagy ­
jából azonos marad, biztosítván a vizsgálat statisztikájának érvényességét.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
AZ LC  50 ÉS EC  50 MEGHATÁROZÁSA  
Az életben maradt embriók és lárvák százalékos arányát ki kell számítani, és az 
Abbott-képlet (4) szerint a kontroll mortalitási értékeivel kell korrigálni:  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
ahol:  
P = korrigált százalékos túlélés  
P' = megfigyelt százalékos túlélés a teszt koncentrációinál  
C = százalékos túlélés a kontrollban  
Amennyiben lehetséges, az LC  50 -et a vizsgálat végén egy megfelel ő módszerrel 
meg kell határozni.  
Amennyiben kívánatos a morfológiai rendellenességek befoglalása az LC  50 
statisztikákba, erre vonatkozóan Stephan idézett m űve (5) ad útmutatást.  
A LOEC ÉS A NOEC BECSLÉSE  
Az ikra és ivadék túlélési kísérlet egyik célja a nem zéró koncentrációértékek 
összevetése a kontrollcsoporttal, azaz a LOEC értékének meghatározása. Ezért a többszörös összehasonlítás módszerét kell hasznosítani (6) (7) (8) (9) (10).
 
SZAKIRODALOM  
(1) LAALE H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachy­
danio rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 
pp. 121-173.  
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages 
of the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 
311 pp.  
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, pp. 173-181.  
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 
766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, pp. 69-81.  
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Compa ­
ring Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
 
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Cont ­
rol. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.
 
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H., Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
2. függelék  
VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK, ID ŐTARTAM ÉS A JAVASOLT FAJOK TÚLÉLÉSI KRITÉRIUMAI  
Faj Hőmérséklet 
( o C) Sótartalom 
(0/00) Megvilágítás 
(óra) Fázisok id őtartama 
(nap) 
A vizsgálat átlagos id őtartama Kontrollcsoport túlélési aránya 
(min., %) 
Embrió Szikzacskós 
lárva Kikelés sikeres ­
sége A lárvák túlélése  
ÉDESVÍZI  
Brachydanio rerio  
Zebrahal 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban) a kikelést követ ő 5. napig (8-10 nap) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30–35 25–30 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban) a kikelést követ ő 20. napig (50–55 
nap) 66 70  
Cyprinus carpio  
Közönséges ponty 21–25 — 12–16 5 >4 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban) a kikelést követ ő 4. napig (8-9 nap) 80 75  
Oryzias latipes  
Japán rizshal/Medaka 24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban) a kikelést követ ő 5. napig (13–16 nap) 80 80  
Pimephales promelas  
Nagyfejű cselle 25 ± 2 — 16 4-5 5 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban) a kikelést követ ő 4. napig (8-9 nap) 60 70  
( 1 ) Embriókra vonatkozik. 
( 2 ) Lárvákra vonatkozik. 
( a ) A lárvákat és embriókat a kikelés után egy hétig sötétben kell tartani, kivéve a vizsgálatok idejét. Ezt követ ően a vizsgálat folyamán mindvégig félhomályt kell fenntartani.
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
3. függelék  
Más, jól dokumentált halfajokra vonatkozó vizsgálati körülmények, id őtartam és túlélési kritériumok  
Faj Hőmérséklet 
( o C) Sótartalom 
(0/00) Megvilágítás 
(óra) Fázisok idotartama (nap) 
Az embrió- és a szikzacskóvizsgálat jellemz ő 
időtartama Kontrollcsopo rt túlélési aránya, 
(min., %) 
Embrió Szikzacskós 
lárva Kikelés sikeres ­
sége A lárvák túlélése  
ÉDESVÍZI FAJOK  
Carassius auratus  
Ezüstkárász 24 ± 1 — — 3–4 >4 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 4. napig (7 nap) — 80  
Leopomis macrochirus  
Nagy naphal 21 ± 1 — 16 3 >4 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 4. napig (7 nap) — 75 
TENGERI  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (nincs magyar 
neve) 22 –25 15–22 12 1,5 10 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 5. napig (6-7 nap) 80 60  
Clupea harengus  
Hering 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 3. napig (23-27 nap) 60 80  
Gadus morhua  
Tőkehal 5± 1 5–30 12 14–16 3–5 A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 3. napig (18 nap) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow 25 ± 1 15–30 12 — — A megtermékenyítés után a lehet ő legko­
rábban (a korai gasztrula fejl ődési szakasz ­
ban), a kikelést követ ő 4/7. napig (28 nap) >75 80
4. függelék  
AZ ELFOGADHATÓ MIN ŐSÉGŰ HÍGÍTÓVÍZ NÉHÁNY FONTOSABB 
KÉMIAI TULAJDONSÁGA  
Anyag megnevezése Koncentrációértékek  
Lebegőanyag < 20 mg/l 
Összes szerves szén < 2 mg/l 
Nem ionizált ammónia < 1 μg/l 
Maradék klór < 10 μg/1 
Összes szerves foszfortartalmú peszticid < 50 ng/l Összes szerves klórtartalmú peszticid es poliklórozott 
bifenilek < 50 ng/1 
Összes szerves klór < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  HÁZIMÉH – AKUTORÁLISTOXICITÁS-VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ezen akuttoxicitás-vizsgálat megfelel az OECD TG 213-nak (1998).  
1.1. BEVEZETÉS  
E toxicitásvizsgálat olyan laboratóriumi módszer, amelyet annak 
felmérésére dolgoztak ki, hogy a növényvéd ő szerek és más vegyi 
anyagok milyen mérték ű akut orális toxicitást gyakorolnak a feln őtt 
dolgozó háziméhekre.  
Az anyagok toxikus jellemz őinek a felmérése és értékelése a házi ­
méhekre gyakorolt akut orális toxicitás mértékének a meghatározását igényelheti, pl. olyan körülmények között, amikor valószín ű, hogy a 
méhek ki lesznek téve egy adott vegyi anyag hatásának. Az akuto ­
rálistoxicitás-vizsgálatot a peszticidek és más vegyi anyagok méhekre gyakorolt inherens toxicitásának meghatározására végzik. A vizsgálat eredményeit felhasználják annak meghatározására, hogy szükség 
van-e további min ősítésre. E módszer különösen azon többlépcs ős 
programokban használható jól, amelyekben a peszticidek méhekre kifejtett hatását el őször a laboratóriumokban, majd részlegesen tere ­
pen, végül terepen vizsgálják (1). A peszticideket hatóanyaguk 
formájában vagy formulázott termékként lehet vizsgálni.
 
Toxikus referenciaanyagot használnak a méhek érzékenységének és a 
vizsgálati eljárás pontosságának az ellen őrzésére.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Akut orális toxicitás:  a vizsgált anyag egyszeri, orálisan adott dózi ­
sának beadásától számított legfeljebb 96 órás id őszakon belül jelent ­
kező károsító hatás.  
Dózis:  a vizsgált anyag elfogyasztott mennyisége. A dózis az egy 
kísérleti állatnak beadott vizsgált anyag mikrogrammban kifejezett mennyisége (mg/méh). Az egyes méhekre jutó dózis tényleges 
mennyisége nem számítható ki pontosan, mert a méheket kollektívan 
tápláljuk, ezért csak egy átlagos dózist lehet megbecsülni (az összesen elfogyasztott vizsgált anyag osztva az egy méhkasban lévő kísérleti méhek számával).
 
LD 50 (közepes halálos dózis):  szájon át: a vizsgált anyag statiszti ­
kailag megállapított egyszeri olyan dózisa, amely orálisan beadva az állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD
 50 értékét a vizsgált 
anyag egy méhre jutó mennyiségével (mg/méh) fejezik ki. A pesz ­
ticidek esetében a vizsgált anyag lehet az aktív hatóanyag, vagy az egy vagy több hatóanyagot tartalmazó formulázott termék.
 
Mortalitás:  egy állat akkor nyilvánítható elhullottnak, ha teljesen 
mozdulatlan.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálat során a kifejlett dolgozó háziméheknek  (Apis mellifera)  
vizes cukoroldatban különböz ő töménységben diszpergált vizsgált 
anyagot adagolnak. Ezután a méheket tesztanyagot nem tartalmazó cukoroldattal táplálják. A mortalitást legalább 48 órán át naponta feljegyzik és összehasonlítják a kontrollcsoport adataival. Ha az 
elhullási arány a 24. és a 48. óra között is növekszik, míg a kont ­
rollcsoportban elfogadható szinten, azaz < 10 %-on marad, helyén ­
való a vizsgálat id őtartamát maximum 96 órára meghosszabbítani. 
Az eredményeket elemzik a 24. és a 48. órai LD
 50 érték, illetve ha a 
vizsgálat id őtartamát meghosszabbítják, akkor a 72. és a 96. órai 
LD 50 érték meghatározásához.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGÉNEK KRITÉRIUMAI  
A vizsgálat érvényességéhez a következ ő feltételeknek kell teljesül ­
niük:  
— a vizsgálat végén a teljes kontrollcsoport létszámához viszonyí ­
tott átlagos mortalitás nem haladhatja meg a 10 %-ot,  
— a toxikus referenciaanyag LD  50 értéke megfelel a kijelölt tarto ­
mánynak.  
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  A méhek befogása  
A vizsgálatokhoz azonos eredet ű, fiatal, kifejlett dolgozó házimé ­
heket használnak, azaz azonos életkorú, tápláltsági fokú stb. méhe ­
ket. A méheket megfelel ően táplált, egészséges, lehet őleg beteg ­
ségektől mentes és királyn ővel rendelkez ő, ismert el őéletű és fizio­
lógiai állapotú kolóniákból fogják be. A méheket a felhasználás 
reggelén vagy azt megel őző estén célszer ű befogni, és a következ ő 
napig a vizsgálati körülmények között tartják őket. Az utódokat nem 
tartalmazó keretekr ől gyűjtött méhek alkalmasak. Kerülni kell a kora 
tavasszal vagy kés ő ősszel történ ő befogást, mivel a méhek fizioló ­
giája ebben az id őszakban megváltozik. Ha a vizsgálatokat mégis 
kora tavasszal vagy kés ő ősszel végzik, a méheket „inkubátorban” 
elő lehet csalogatni és egy hétig „méhkenyérrel” (a lépb ől gyűjtött 
pollennel) és cukros vízzel lehet táplálni. A vegyi anyagokkal, pl. 
antibiotikumokkal, méhatka elleni szerekkel stb. kezelt méheket toxi ­
citásvizsgálatok céljaira csak az utolsó kezelést ől számított négy hét 
elteltével szabad felhasználni.  
1.5.2.  Tartási és etetési feltételek  
Könnyen tisztítható és jól szell őző dobozokat kell használni. Erre a 
célra bármilyen alkalmas anyag felhasználható, pl. rozsdamentes 
acél, drótháló, m űanyagból készült, vagy eldobható, fából készült 
stb. doboz. Dobozonként tíz méhb ől álló csoportok használata java ­
solt. A vizsgálati dobozok méreteit a méhek létszámához igazítják, 
azért, hogy elegend ő helyük legyen.  
A méheket 25 ± 2  o C hőmérséklet ű sötét kísérleti szobában tartják. A 
vizsgálat során végig megmérik és feljegyezik a relatív páratartalom értékét, amelyet általában 50–70 % között tartanak. A méhekkel 
kapcsolatos minden tevékenység, beleértve a kezelést és megfigye ­
léseket, végezhet ő világosban (nappali fény mellett). Táplálékként 
500 g/liter (azaz 50 tömegszázalékos) végkoncentrációjú vizes cuko ­
roldatot adnak. A meghatározott tesztanyagmennyiséget tartalmazó 
táplálékot az állatoknak tetszés szerinti módon adhatják. Az etet ő­
rendszernek lehet ővé kell tennie, hogy dobozonként fel lehessen 
jegyezni a táplálékbevitelt (lásd 1.6.3.1. szakasz). A táplálék beadá ­
sához egy (mintegy 50 mm hosszú és 10 mm széles, a nyitott végén 
kb. 2 mm átmér őre leszűkített) üvegcsövet lehet használni.
 
1.5.3.  A méhek el őkészítése  
A befogott méheket a teszthelyiségben véletlenszer űen elhelyezett 
dobozok között osztják el.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
A méheket a vizsgálat megkezdése el őtt maximum két órán át éhez ­
tethetik. Javasolt a méhek táplálékának visszatartása a kezelés el őtt, 
hogy valamennyi méh béltartalma azonos legyen a vizsgálat kezde ­
tekor. A vizsgálat megkezdése el őtt a haldokló méheket eltávolítják, 
és egészségesekkel pótolják.  
1.5.4  A dózisok el őkészítése  
Ha a vizsgált anyag oldható vízben, akkor az közvetlenül belekever ­
hető az 50 %-os töménység ű cukoroldatba. A vízben rosszul oldódó 
ipari termékek és anyagok esetében fel lehet használni a méhekre kis mértékben mérgez ő segédanyagokat – szerves oldószereket, emulge ­
áló- vagy diszpergálószereket (pl. aceton, dimetil-formamid, dimetil- 
szulfoxid). A segédanyag töménysége a vizsgált anyag oldhatósá ­
gától függ, és azt az összes vizsgált koncentrációérték esetében azonos szinten tartják. Általában azonban megfelel az 1 %-os töménység ű segédanyag, és ezt a szintet nem célszer ű túllépni.
 
Megfelelő kontrolloldatokat készítenek el ő, azaz ha oldószert vagy 
diszpergáló anyagot használnak a vizsgált anyag feloldásához, akkor két különálló kontrollcsoportot alkalmaznak: az egyiket a vizes 
oldatra, a másikat az oldatok adagolásához használt koncentrációjú 
oldószerrel/segédanyaggal javított cukoroldatra.
 
1.6. VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
1.6.1.  Kezelt csoportok és kontrollcsoportok  
A vizsgált dózisok és a párhuzamos vizsgálatok száma meg kell, 
hogy feleljen az LD  50 95 %-os konfidenciahatár mellett történ ő 
meghatározására vonatkozó statisztikai követelményeknek. A vizs ­
gálathoz szokványos esetben öt, olyan mértani sort képez ő dózisra 
van szükség, amelyek 2.2 értéket meg nem haladó szorzótényez ővel 
különböznek egymástól és az LD  50 tartományát fedik le. A hígítási 
tényezőt és az adagoláshoz használt koncentrációértékek számát 
azonban a hatásgörbe meredekségének függvényében (pusztulás a dózis függvényében) és az eredmények elemzéséhez kiválasztott statisztikai módszer figyelembevételével határozzák meg. A vizsgálat 
előtt elvégzett, dózisbehatároló vizsgálat lehet ővé teszi az adago ­
láshoz megfelel ő koncentrációértékek kiválasztását.
 
Legalább három, egyenként tíz méhb ől álló ún. párhuzamosan kezelt 
csoportnak adják be az egyes kísérleti koncentrációknak megfelel ő 
dózist. A vizsgálatsorozatban részt vev őkön kívül legalább három, 
egyenként tíz méhb ől álló kontrollcsoportot kell vizsgálni. Ha szük ­
séges (lásd 1.5.4. rész), külön oldószeres/segédanyagos kontrollokat 
is alkalmaznak.  
1.6.2.  Toxikus referenciaanyag  
A tesztsorozattal párhuzamosan egy, a toxikus referenciaanyagot 
tartalmazó sorozatot is be kell állítani. A várható LD  50 értékek lefe ­
dése érdekében legalább három dózist választanak ki. Mindegyik vizsgált dózis esetében legalább három, egyenként tíz méhet tartal ­
mazó, ún. párhuzamosokat alkalmaznak. A leggyakrabban használt 
toxikus referenciaanyag a dimetoát, amelyre nézve a bizonyított orális LD
 50 24 óra alatt a 0,10–0,35 mg hatóanyag/egyed tarto ­
mányba esik (2). Egyéb toxikus referenciaanyagok is elfogadhatóak, 
de csak olyan esetekben, ahol elegend ő adat áll rendelkezésre a 
várható dózisreakció ellen őrzésére (pl. parathion).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Expozíció  
1.6.3.1.  A dózisok beadása  
Mindegyik kezelt csoport egyedeinek 100–200 ml-nyi, a vizsgált 
anyagot megfelel ő koncentrációban tartalmazó 50 %-os cukoroldatot 
adnak be. Nagyobb mennyiségre van szükség, ha a készítményben 
rosszul oldódó, alacsony toxicitású vagy a formulázásból adódóan alacsony hatóanyag-tartalmú termékek vannak, mert ezeket nagyobb arányban kell a cukoroldathoz keverni. Megfigyelik, hogy az egyes 
csoportok milyen mennyiségben fogyasztottak a kezelt táplálékból. 
Ha elfogyasztották a felkínált élelmet (rendszerint 3-4 órán belül), akkor az etet őtálat kiveszik a dobozból, és helyére egy tisztán cuko ­
roldatot tartalmazó tálat tesznek. Ezután a cukoroldatot korlátozás 
nélkül adagolják. Egyes vegyületek esetében magasabb koncentráció ­
értékeknél a vizsgált dózis visszautasítása miatt a méhek esetleg keveset vagy semmit sem fogyasztanak. Maximum 6 óra elteltével 
az el nem fogyasztott, kezelt táplálékot tiszta cukoroldattal váltják 
fel. Megmérik, hogy mennyi fogyott a kezelt táplálékból (pl. a megmaradó táplálék térfogatának/tömegének mérésével).
 
1.6.3.2.  Időtartam  
A vizsgálat javasolt id őtartama a vizsgált oldatok tisztán cukorol ­
dattal való felváltását követ ően még 48 óra. Ha a mortalitás az 
első 24 óra után továbbra is 10 %-nál nagyobb mértékben növekszik, 
akkor a vizsgálat id őtartamát maximum 96 órára kell meghosszabbí ­
tani, feltéve, hogy a kontrollcsoportban a mortalitás nem haladja meg 
a 10 %-ot.  
1.6.4.  Megfigyelések  
Feljegyezik a mortalitás alakulását a vizsgálat megkezdését követ ő 4. 
órában, majd azt követ ően a 24. és 48. órában (azaz a dózis beadását 
követően). Ha a meghosszabbított megfigyelési id őszakra van szük ­
ség, akkor a további értékeléseket 24 órás id őközönként kell elvé ­
gezni, legfeljebb a 96. óráig, feltéve, hogy a kontrollcsoportban a 
mortalitás nem haladja meg a 10 %-ot.  
Megmérik az egyes csoportok által elfogyasztott táplálék mennyi ­
ségét. Az adott 6 óra alatt a kezelt és a kezeletlen táplálékból való fogyasztás mértékének összevetése tájékoztat a kezelt étrend ízletes ­
ségéről.
 
A vizsgálat id őszaka alatt feljegyeznek minden, a normálistól eltér ő 
magatartásformát.  
1.6.5.  Tűrésteszt  
Egyes esetekben (pl. amikor a vizsgált anyag várható toxicitása 
alacsony) t űréstesztet lehet végezni, 100 mg aktív hatóanyag/egyed 
felhasználásával, annak bemutatására, hogy az LD  50 nagyobb ezen 
értéknél. Ugyanezt az eljárást követik, beleértve a vizsgált dózisra 
vonatkozó három ún. párhuzamosan kezelt csoportot, a megfelel ő 
kontrollokat, az elfogyasztott kezelt táplálék mennyiségének értékel ő 
felmérését és a toxikus referenciaanyag használatát. Ha mortalitás 
tapasztalható, a teljes kör ű vizsgálatot végzik el. Ha szubletális 
hatások figyelhet ők meg (lásd 1.6.4. szakasz), azokat feljegyezik.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. ADATOK  
Az adatokat táblázat formájában foglalják össze, mindegyik kezelt 
csoportnál, valamint kontroll- és toxikusreferenciaanyag-csoportnál 
feltüntetve a kísérlethez felhasznált méhek számát, az egyes 
megfigyelési id őpontokban tapasztalt mortalitást, valamint a rend ­
ellenes magatartást mutató méhek számát. A mortalitási adatokat a megfelelő statisztikai módszerekkel elemzik (pl. probitanalízis, 
mozgóátlag, binomiális valószín űség) (3) (4). A hatásgörbéket mind ­
egyik ajánlott megfigyelési id őpontban grafikonon rögzítik, és a 
görbék meredekségét és a közepes halálos dózisokat (LD
 50 ) a 
95 %-os konfidenciahatárhoz kiszámítják. A kontrollcsoport mortali ­
tásának korrekcióját az Abbott-képlet használatával lehet elvégezni (4) (5). Ha a méhek nem fogyasztották el a vizsgált anyaggal kezelt táplálék teljes mennyiségét, meghatározzák az egyes csoportok által 
elfogyasztott vizsgált anyaggal bevitt dózis nagyságát. Az LD
 50 
értékét az egy méhre jutó vizsgált anyag mg-jában fejezik ki.  
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésben a következ ő információk szerepelnek:  
2.2.1  A vizsgált anyag:  
— az anyag fizikai természete és f őbb fizikai-kémiai tulajdonságai 
(pl. stabilitása vízben, g őznyomás),  
— kémiai azonosító adatok, beleértve a szerkezeti képletet és a 
kémiai tisztaságot (azaz peszticidek esetében a hatóanyag(ok) megnevezését és koncentrációját).
 
2.2.2.  A vizsgált fajok:  
— tudományos név, származás, hozzávet őleges életkor (hetekben 
kifejezve), a befogás módszere és dátuma,  
— a kolóniákra vonatkozó információk, ahonnan a begy űjtött 
állatok származnak, beleértve a méhek egészségi állapotát, bármi ­
lyen kifejlett kori betegséget, esetleges el őkezeléseket stb.  
2.2.3.  Vizsgálati körülmények:  
— a kísérleti helyiség h őmérséklete és relatív páratartalma,  
— elhelyezési körülmények, pl. a dobozok típusa, mérete és anyaga,  
— a törzsoldat és a vizsgált oldatok készítésének módszere (ha 
oldószert használnak, meg kell adni a nevét és töménységét),  
— a törzsoldat készítésének módja és az újrakezdés gyakorisága (az 
esetlegesen használt, oldódást segít ő szer nevét és koncentrációját 
meg kell adni), a vizsgálat körülményei, pl. a felhasznált kísérleti koncentrációk száma, a kontrollok száma; minden egyes kísérleti koncentrációra és kontrollra nézve az ún. párhuzamosok és az 
egy dobozban lév ő méhek száma,
 
— a vizsgálat id őpontja.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Eredmények:  
— előzetes koncentrációhatárokat felmér ő vizsgálat eredményei, ha 
végeztek ilyet,  
— nyers adatok: mortalitás minden egyes vizsgált dózisra és minden 
egyes megfigyelési id őpontra nézve,  
— a hatásgörbék grafíkonja a vizsgálat végén,  
— LD  50 értékek 95 % konfidenciahatárhoz, minden egyes javasolt 
megfigyelési id őpontokban, a vizsgált anyagra és a toxikus refe ­
renciaanyagra nézve,  
— az LD  50 meghatározásához használt statisztikai eljárások,  
— mortalitás a kontrollcsoportokban,  
— más megfigyelt vagy mért biológiai hatások, pl. a méhek abnor ­
mális viselkedése (beleértve a vizsgált dózis elutasítását), az elfo ­
gyasztott táplálék mértéke kezelt és a kezeletlen csoportoknál,  
— bármilyen eltérés az itt leírt vizsgálati módszerekt ől, valamint 
bármely más releváns információ.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) EPPO/COUNCIL OF Europe (1993). Decision-Making Scheme 
for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection 
Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., Mclndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, pp. 119-125.  
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  HÁZIMÉH – AKUTKONTAKTTOXICITÁS-VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ezen akutkontakttoxicitás-vizsgálat megfelel az OECD TG 214-nek 
(1998).  
1.1. BEVEZETÉS  
E toxicitásvizsgálat olyan laboratóriumi módszer, amelyet annak 
felmérésére dolgoztak ki, hogy a növényvéd ő szerek és más vegyi 
anyagok milyen mérték ű akut kontakt toxicitást gyakorolnak a 
felnőtt dolgozó háziméhekre.  
Az anyagok toxikus jellemz őinek a felmérése és értékelése a házi ­
méhekre gyakorolt akut kontakt toxicitás mértékének a meghatá ­
rozását igényelheti, pl. olyan körülmények között, amikor valószín ű, 
hogy a méhek ki lesznek téve egy adott vegyi anyag hatásának. Az akutkontakttoxicitás-vizsgálatot a peszticideknek és más vegyi anya ­
goknak a méhekre gyakorolt inherens toxicitásának meghatározására 
végzik. A vizsgálat eredményeit felhasználják annak meghatározá ­
sára, hogy szükség van-e további min ősítésre. E módszer különösen 
azon többlépcs ős programokban használható jól, amelyekben a pesz ­
ticidek méhekre kifejtett hatását el őször a laboratóriumban, majd 
részlegesen terepen, végül terepen vizsgálják (1). A peszticideket 
hatóanyaguk formájában (a.s.) vagy formulázott termékként lehet vizsgálni.
 
Toxikus referenciaanyagot kell használni a méhek érzékenységének 
és a vizsgálati eljárás pontosságának az ellen őrzésére.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Akut kontakt toxicitás : egyszeri, helyileg alkalmazott tesztanyagdó ­
zis, maximum 96 órán belül jelentkez ő károsító hatása.  
Dózis : a vizsgált anyag elfogyasztott mennyisége. A dózis az egy 
kísérleti állatnak beadott vizsgált anyag mikrogrammban kifejezett mennyisége ( μg/méh).
 
Kontakt LD  50 (közepes halálos dózis) : valamely anyag statisztika ­
ilag megállapított egyszeri olyan dózisa, amely érintkezés útján az 
állatok 50 %-ának elhullását okozza. Az LD  50 értéket a vizsgált 
anyag egy méhre jutó mennyiségével ( μg/méh) fejezzük ki. A pesz ­
ticidek esetében a vizsgált anyag lehet a hatóanyag, vagy egy vagy több hatóanyagot tartalmazó formulázott termék is.
 
Halálozás : egy állat akkor nyilvánítható elhullottnak, ha teljesen 
mozdulatlan.  
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A vizsgálat során a kifejlett dolgozó háziméheket  (Apis mellifera)  a 
vizsgált anyag megfelel ő hordozóanyagban, különböz ő tömény ­
ségben oldott dózisaival kezelik úgy, hogy azt közvetlenül a torra cseppentik. A vizsgálat id őtartama 48 óra. Ha az elhullási arány a 24. 
és 48. óra között is növekszik, míg a kontrollcsoportban egy elfo ­
gadható szinten, azaz £ 10 %-on marad, helyénvaló a vizsgálat 
időtartamát legfeljebb 96 órára meghosszabbítani. A elhullást 
naponta rögzítik és összehasonlítják a kontrollértékekkel. Az ered ­
ményeket elemzik a 24. és a 48. órai LD
 50 érték, illetve ha a vizs ­
gálatot meghosszabbítják, akkor a 72. és 96. órai LD  50 érték 
meghatározásához.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGÉNEK KRITÉRIUMAI  
A vizsgálat érvényességéhez a következ ő feltételeknek kell teljesül ­
niük:  
— a vizsgálat végére a teljes kontrollcsoport létszámához viszonyí ­
tott átlagos mortalitás nem haladhatja meg a 10 %-ot,  
— a toxikus referenciaanyag LD  50 értéke megfelel a kijelölt tarto ­
mánynak.  
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.5.1.  A méhek befogása  
A vizsgálatokhoz fiatal, kifejlett dolgozó háziméheket használnak, 
azaz azonos életkorú, tápláltsági fokú, fajú stb. méheket. A méheket 
megfelelően táplált, és – amennyire csak lehetséges – betegségekt ől 
mentes és királyn ővel rendelkez ő, ismert el őéletű és fiziológiai álla ­
potú kolóniákból fogják be. A méheket a felhasználás reggelén vagy 
az azt megel őző estén célszer ű befogni, és a következ ő napig a 
vizsgálati körülmények között tartják őket. Az ivadékokat nem tartal ­
mazó keretekr ől gyűjtött méhek alkalmasak. Kerülni kell a kora 
tavasszal vagy kés ő ősszel történ ő befogást, mivel a méhek fizioló ­
giája ezen id őszakban megváltozik. Ha a vizsgálatokat mégis kora 
tavasszal vagy kés ő ősszel végzik, a méheket inkubátorba téve el ő 
lehet csalogatni és egy hétig „méhkenyérrel” (a lépr ől gyűjtött 
pollennel) és cukros vízzel lehet táplálni. A vegyi anyagokkal, pl. 
antibiotikummal, méhatka elleni szerekkel stb. kezelt méheket toxi ­
citásvizsgálatok céljaira csak az utolsó kezelést ől számított négy hét 
elteltével szabad felhasználni.  
1.5.2.  Tartási és etetési feltételek  
Könnyen tisztítható és jól szell őző dobozokat kell használni. E célra 
bármilyen alkalmas anyag felhasználható, pl. rozsdamentes acél, drótháló, m űanyag vagy eldobható, fából készült stb. dobozok. A 
vizsgálati dobozok méreteit a méhek létszámához igazítják, hogy 
elegendő helyük legyen. Dobozonként tíz méhb ől álló csoportok 
használata javasolt.
 
A méheket 25 ± 2  o C hőmérséklet ű sötét teszthelyiségben tartják. A 
vizsgálat során végig megmérik és feljegyzik a relatív páratartalom értékét, amelyet általában 50–70 % között tartanak. A méhekkel 
kapcsolatos minden tevékenység, beleértve a kezelést és megfigye ­
léseket, végezhet ő világosban (nappali fény mellett). Táplálékként 
500 g/liter (azaz 50 tömegszázalékos) végkoncentrációjú vizes cuko ­
roldatot alkalmaznak, és a vizsgálat ideje alatt korlátozás nélkül 
adagolják méhetet ő berendezés felhasználásával. Ez lehet egy 
üvegcső (körülbelül 50 mm hosszú és 10 mm széles, amelynek 
nyitott végén körülbelül 2 mm átmér őre leszűkített).
 
1.5.3.  A méhek el őkészítése  
A befogott méheket a vizsgált anyag elhelyezése érdekében szén- 
dioxiddal vagy nitrogénnel lehet elkábítani. Minimalizálni kell az alkalmazott narkotikum mennyiségét és az expozíció id őtartamát. A 
vizsgálat megkezdése el őtt a haldokló méheket eltávolítják, és egész ­
ségesekkel pótolják.
 
1.5.4.  A dózisok el őkészítése  
A vizsgált anyagot valamilyen hordozóanyagban, azaz szerves oldó ­
szerben oldva vagy detergenst tartalmazó vizes oldatban alkalmaz ­
zák. Szerves oldószerként el őnyben részesül az aceton, de a méhekre 
kis mértékben mérgez ő egyéb szerves oldószereket is lehet használni 
(pl. dimetil-formamid, dimetil-szulfoxid). A vízben diszpergált 
formulázott termékek és az er ősen poláros szerves anyagok esetében, 
amelyek szerves oldószerekben nem oldódnak, a kísérlethez használt oldatokat könnyebb felvinni, ha azt a kereskedelemben szokásos 
detergens (pl. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween) híg oldatában 
készítik el ő.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
A megfelel ő kontrolloldatokat el őkészítik, azaz ha oldószert vagy 
diszpergálószert használnak a vizsgált anyag feloldásához, akkor 
két különálló kontrollcsoportot alkalmaznak, egyet vízzel, egyet pedig az oldószerrel/diszpergálószerrel kezelve.
 
1.6. VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
1.6.1.  Kezelt csoportok és kontrollcsoportok  
A vizsgált dózisok és a párhuzamos vizsgálatok száma meg kell, 
hogy feleljen az LD  50 95 %-os konfidenciahatár mellett történ ő 
meghatározására vonatkozó statisztikai követelményeknek. A vizs ­
gálathoz szokványos esetben öt, olyan mértani sort képez ő dózisra 
van szükség, amelyek 2.2 értéket meg nem haladó szorzótényez ővel 
különböznek egymástól, és az LD  50 tartományát fedik le. A dózisok 
számát azonban a hatásgörbe (pusztulás a dózis függvényében) mere ­
dekségének függvényében és az eredmények elemzéséhez kiválasz ­
tott statisztikai módszer figyelembevételével határozzák meg. A vizs ­
gálat előtt elvégzett, dózisbehatároló vizsgálat lehet ővé teszi a 
megfelelő dózisok kiválasztását.  
Legalább három, egyenként tíz méhb ől álló ún. párhuzamos kezelt 
csoportot használnak fel minden egyes kísérleti koncentrációnak megfelelő dózishoz.
 
A vizsgálatsorozatban részt vev őkön kívül legalább három, egyen ­
ként tíz méhb ől álló kontrollcsoportot vizsgálnak. Ha szerves oldó ­
szert vagy detergenst használnak, az oldószerre vagy a detergensre nézve három további, egyenként tíz méhb ől álló kontrollcsoportot 
vizsgálnak.
 
1.6.2.  Toxikus referenciaanyagok  
A tesztsorozattal párhuzamosan egy, a toxikus referenciaanyagot 
tartalmazó sorozatot is be kell állítani. A várható LD  50 értékek lefe ­
dése érdekében legalább három dózist választanak ki. Mindegyik vizsgált dózis esetében legalább három, egyenként tíz méhet tartal ­
mazó, ún. párhuzamost alkalmaznak. A javasolt referenciaanyag a 
dimetoát, amelynek 24 órás kontakt LD
 50 értéke a 0,10–0,30 μg 
hatóanyag/egyed (2) tartományba esik. Egyéb toxikus referencia ­
anyagok is elfogadhatóak, azonban csak olyan esetekben, ahol elegendő adat áll rendelkezésre a várható dózisreakció ellen őrzésére 
(pl. paration).
 
1.6.3.  Expozíció  
1.6.3.1.  A dózisok beadása  
Az elkábított méheket egyenként kezelik küls őleg a vizsgált anyag ­
gal. A méheket véletlenszer űen rendelik a különböz ő vizsgált dózi ­
sokhoz és kontrollokhoz. Mindegyik méh torának háti részére viszik 
fel mikroapplikátorral a vizsgált anyagot a megfelel ő koncentráci ­
óban tartalmazó oldat egy μl mennyiségét. Indokolt esetben más 
mennyiségeket lehet alkalmazni. A felvitelt követ ően a méheket 
elosztják a kísérleti dobozok között, és ellátják cukoroldattal.  
1.6.3.2.  Időtartam  
A vizsgálat id őtartama lehet őség szerint 48 óra. Ha a mortalitás a 24. 
és a 48. óra között 10 %-nál nagyobb mértékben növekszik, a vizs ­
gálat időtartamát maximum 96 órára meghosszabbítják, feltéve, hogy 
a kontrollcsoportban a mortalitás nem haladja meg a 10 %-ot.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Megfigyelések  
Feljegyzik a mortalitás alakulását a dózis bevitelét követ ő negyedik 
órában, ezt követ ően a 24. és a 48. órában. Ha a meghosszabbított 
megfigyelési id őszakra van szükség, akkor a további értékeléseket 24 
órás időközönként végezik el, legfeljebb a 96. óráig, feltéve, hogy a 
kontrollcsoportban a mortalitás nem haladja meg a 10 %-ot.  
A vizsgálat id őszaka alatt feljegyeznek minden, a normálistól eltér ő 
magatartásformát.  
1.6.5.  Tűrésteszt  
Egyes esetekben (pl. amikor valamely vizsgált anyag várható toxici ­
tása alacsony) t űréstesztet lehet végezni, 100 μg hatóanyag/egyed 
dózis felhasználásával annak bemutatására, hogy az LD  50 nagyobb 
ezen értéknél. Ugyanezt az eljárást követik, beleértve a vizsgált 
dózisra vonatkozó három ún. párhuzamos kezelt csoportot, a megfelelő kontrollokat, valamint a toxikus referenciaanyag használa ­
tát. Ha mortalitás tapasztalható, teljes kör ű vizsgálatot végeznek el. 
Ha szubletális hatások figyelhet ők meg (lásd 1.6.4. szakasz), azokat 
feljegyzik.
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. ADATOK  
Az adatokat táblázat formájában foglalják össze, mindegyik kezelt 
csoportnál, valamint kontroll- és toxikus referenciaanyaggal kezelt 
csoportnál feltüntetve a kísérlethez felhasznált méhek számát, az egyes megfigyelési id őpontokban tapasztalt mortalitást, valamint a 
rendellenes magatartást tanúsító méhek számát. A mortalitási 
adatokat megfelel ő statisztikai módszerekkel elemezik (pl. probitana ­
lízis, mozgóátlag, binomiális valószín űség) (3) (4). A hatásgörbéket 
mindegyik ajánlott megfigyelési id őpontban (azaz a 24., 48. és adott 
esetben a 72. és 96. órában) grafikonon rögzítik, és a görbék mere ­
dekségét és a közepes halálos dózisokat (LD
 50 ) a 95 %-os konfiden ­
ciahatárhoz kiszámítják. A kontrollcsoport mortalitásának korrekci ­
óját az Abbott-képlet alkalmazásával lehet elvégezni (4) (5). Az 
LD 50 értékét az egy méhre jutó vizsgált anyag μg-jában fejezik ki.  
2.2 VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésben a következ ő információknak kell szerepel ­
niük:  
2.2.1.  A vizsgált anyag:  
— az anyag fizikai természete és f őbb fizikai-kémiai tulajdonságai 
(pl. stabilitása vízben, g őznyomás),  
— kémiai azonosító adatok, beleértve a szerkezeti képletet és a 
kémiai tisztaságot (azaz peszticidek esetén a hatóanyag(ok) 
megnevezését és koncentrációját).  
2.2.2.  A vizsgált fajok:  
— tudományos név, származás, hozzávet őleges életkor (hetekben 
kifejezve), a befogás módszere és dátuma,  
— a kolóniákra vonatkozó információk, ahonnan a begy űjtött 
állatok származnak, beleértve a méhek egészségi állapotát, bármi ­
lyen kifejlett kori betegséget, esetleges el őkezeléseket stb.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Vizsgálati körülmények:  
— a kísérleti helyiség h őmérséklete és relatív páratartalma,  
— elhelyezési körülmények, beleértve a dobozok típusát, méretét és 
anyagát,  
— a vizsgált anyag beadásának módszerei, pl. a hordozó oldószer, 
alkalmazott vizsgált oldat mennyisége, felhasznált narkotikum,  
— a vizsgálat körülményei, pl. felhasznált vizsgált dózisok száma, a 
kontrollok száma; minden egyes vizsgált dózisra és kontrollra nézve az ún. párhuzamosok és az egy dobozban lév ő méhek 
száma,
 
— a vizsgálat id őpontja.  
2.2.4.  Eredmények:  
— előzetes koncentrációhatárokat felmér ő vizsgálat eredményei, ha 
végeztek ilyet,  
— nyers adatok: mortalitás minden egyes vizsgált dózisra és minden 
egyes megfigyelési id őpontra nézve,  
— a hatásgöbék grafikonja a vizsgálat végén,  
— LD  50 értékek, 95 %-os konfidenciahatárhoz, az egyes javasolt 
megfigyelési id őpontokban, a vizsgált anyagra és a toxikus refe ­
renciaanyagra nézve,  
— az LD  50 meghatározásához használt statisztikai eljárások,  
— mortalitás a kontrollcsoportokban,  
— más megfigyelt vagy mért biológiai hatások és a méhek bármi ­
lyen abnormális reakciója,  
— bármilyen eltérés az itt leírt vizsgálati módszerekt ől, valamint 
bármely más releváns információ.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) EPPO/COUNCIL OF Europe (1993). Decision-Making Scheme 
for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N. 1, pp. 151- 165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  KÉMIAI ANYAGOK TALAJON TÖRTÉN Ő ADSZORPCIÓ ­
JÁNAK VIZSGÁLATA EGYENSÚLYI RENDSZERBEN  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG 106-nak: a talajon történ ő 
adszorpció/deszorpció meghatározása egyensúlyi rendszerben (2000).  
1.1. BEVEZETÉS  
A módszer az adszorpciós vizsgálat kialakításához figyelembe veszi 
a talaj kiválasztására vonatkozó körvizsgálatot és m űhelymunkát (1) 
(2) (3) (4), valamint a meglév ő nemzeti iránymutatásokat (5) (6) (7) 
(8) (9) (10) (11).  
Az adszorpciós/deszorpciós vizsgálatok segítségével információkat 
nyerhetünk a vegyszerek mobilitására, illetve ezeknek a bioszféra talaj, víz és leveg ő kompartmentjei közötti megoszlására nézve 
(12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Az információt 
fel lehet használni a következ ők előrejelzésére vagy becslésére: vala ­
mely vegyi anyag hozzáférhet ősége a lebontás szempontjából (22) 
(23), élőlények általi felvétel és átalakítás (24); az anyag mozgása a 
talaj profilban (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); talajból való 
kipárolgás (21) (29) (30); a talajból természetes vizekbe irányuló 
bemosódás (18) (31) (32). Adszorpciós adatokat összehasonlítási és modellezési célra lehet használni (19) (33) (34) (35).
 
A talajban egy vegyi anyag szilárd és folyadékfázis közti megoszlása 
összetett folyamat, amely több különböz ő tényezőtől függ: az anyag 
kémiai jellegét ől (12) (36) (37) (38) (39) (40), a talaj jellemz őitől (4) 
(12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49), valamint olyan éghajlati tényez őktől, mint a csapadék, h őmérséklet, napsu ­
gárzás és szél. Így valamely vegyi anyag talajba való adszorbeáló ­
dásának folyamatában részt vev ő számos jelenséget és mechanizmust 
nem lehet teljes mértékben meghatározni olyan egyszer űsített labo ­
ratóriumi modellel, mint ez a módszer. Azonban, még ha e kísérlet nem is tudja lefedni az összes, a környezetben el őforduló esetet, 
elégséges tájékoztatást ad az adott vegyi anyag adszorpciójának 
környezeti jelent őségéről.
 
Lásd még az Általános bevezetést.  
1.2. ALKALMAZÁSI KÖR  
A módszer célja valamely anyag talajra vonatkozó adszorpciós/ ­
deszorpciós magatartásának a vizsgálata. A célkit űzés olyan szorp ­
ciós érték megállapítása, amelyet fel lehet használni a megoszlás 
előrejelzésére különféle környezeti feltételek között; e célból vala ­
mely vegyszer különféle talajokra vonatkozó egyensúlyi adszorpciós koefficiensét a talaj jellemz őinek (pl. szervesszén-tartalom, agyagtar ­
talom, talajszerkezet és pH-érték) függvényeként határozzák meg. 
Különböz ő talajtípusokat kell felhasználni annak érdekében, hogy 
az adott anyag természetben el őforduló talajokkal létrejöv ő kölcsön­
hatásait a lehet ő legszélesebb körben lefedjék.
 
E módszerben az adszorpció azt a folyamatot képviseli, amely kere ­
tében a vegyi anyag a talajszemcsék felületéhez köt ődik; e módszer 
nem tesz különbséget a különféle adszorpciós folyamatok (fizikai és kémiai adszorpció), valamint olyan folyamatok között, mint felület ­
katalizált lebomlás, tömeges adszorpció vagy kémiai reakció. A talaj 
kolloid méret ű szemcséin (átmér ő < 0,2 μm) bekövetkez ő adszorp­
ciót nem veszik figyelembe.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Az adszorpció szempontjából legfontosabbnak tartott talajparamé ­
terek a következ ők: szervesszén-tartalom (3) (4) (12) (13) (14) (41) 
(43) (44) (45) (46) (47) (48); agyagtartalom és talajtextúra (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48), az ionizálható vegyületek esetében a pH-érték (3) (4) (42). Az adott anyag adszorpcióját/ ­
deszorpcióját esetleg befolyásoló egyéb talajparaméterek az effektív 
kationcserél ő-kapacitás (ECEC), az amorf vas- és alumínium-oxid- 
tartalom, különösen vulkanikus és trópusi talajok esetében (4), vala ­
mint a talaj fajlagos felülete (49).
 
A vizsgálat kialakítása olyan, hogy eltér ő szervesszén-tartalommal, 
agyagtartalommal és talajszerkezettel, valamint pH-értékkel rendel ­
kező különböz ő talajtípusokban értékeli valamely vegyszer adszorp ­
cióját. Három szintb ől épül fel:  
1.szint:  — a talaj/oldat arány,  
— az adszorpciós egyensúly beálltáig eltelt id ő és az 
egyensúlyi helyzetben a vizsgált anyagból adszorbeált mennyiség,
 
— a vizsgált anyag adszorpciója a tesztedények felületén, 
valamint a vizsgált anyag stabilitása a vizsgálat ideje 
alatt.  
2.szint: „ Screening” teszt: az adszorpciót öt különböz ő talajtí­
pusban vizsgálják. Egyetlen koncentráció alkalmazásával vizsgálják az adszorpció kinetikáját, és meghatározzák a 
K
 d és K  oc megoszlási együtthatókat.  
3.szint:  A Freundlich-féle adszorpciós izotermák meghatározása 
annak megállapítására, hogy a koncentráció hogyan befo ­
lyásolja az adszorpció mértékét.  
Deszorpció tanulmányozása deszorpciós kinetika/ ­
Freundlich-féle deszorpciós izotermák segítségével (1. függelék).
 
1.3. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Jel Fogalommeghatározás Mértékegység  
A t i adszorpció mértéke t  i időpontban % 
A eq adszorpció mértéke adszorpciós egyensúly helyzetben %  
m s ads ðt i Þ a vizsgált anyag talajban adszorbeált tömege t  i időpontban μg 
m s ads ðΔt i Þ a vizsgált anyag talajban adszorbeált tömege a A  ti időin­
tervallumban μg 
m s ads ðeqÞ a vizsgált anyag talajban adszorbeált tömege adszorpciós 
egyensúlyi helyzetben μg 
m 0 a vizsgált anyag tömege a kémcs őben az adszorpciós 
vizsgálat kezdetén μg 
m m ads ðt i Þ a vizsgált anyag az analízisre kivett térfogatban ( v a A ) 
tömege a t  i időpontban μg 
m aq ads ðeqÞ az anyag tömege a törzsoldatban adszorpciós egyensúlyi 
helyzetben μg 
M talaj a talajfázis mennyisége, talaj szárazanyagtartalomban 
kifejezve g ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Jel Fogalommeghatározás Mértékegység  
C st az anyag oldott mennyiségének tömegkoncentrációja μg cm  -3 
C 0 a talajjal érintkezésben lév ő vizsgált oldat kezdeti tömeg ­
koncentrációja μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ az anyag tömegkoncentrációja a vizes fázisban abban a t  i 
időpontban, amikor az elemzést végzik μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ a talajban adszorbeált anyagtartalom adszorpciós egyen ­
súlyi helyzetben μg g  -1 
C aq ads ðeqÞ az anyag tömegkoncentrációja a vizes fázisban adszorpciós 
egyensúlyi helyzetben μg cm  -3 
V 0 a talajjal (az adszorpciós vizsgálat során) érintkez ő vizes 
fázis kezdeti térfogata cm 3 
v a A a vizsgált anyag mérésére használt aliquota térfogata cm  3 
K d adszorpciós megoszlási koefficiens cm  3 g -1 
K oc szerves szénre vonatkoztatott adszorpciós koefficiens cm  3 g -1 
K om szerves anyagra vonatkoztatott megoszlási koefficiens cm  3 g -1 
K F ads Freundlich-féle adszorpciós koefficiens μg 1-1/n (cm  3 ) 
1/n Freundlich-féle exponens  
D t i deszorpció mértéke a t  i időpontban %  
D Δt i deszorpció mértéke a Δt i időintervallumban % 
K des látszólagos deszorpciós koefficiens cm  3 g -1 
K F des Freundlich-féle deszorpciós koefficiens μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ a vizsgált anyag talajból deszorbeált tömege t  i időpontban μg 
m m des ðΔt i Þ a vizsgált anyag talajból deszorbeált tömege Δt i időinter­
vallumban μg 
m m des ðeqÞ az anyag analitikus módon meghatározott tömege a vizes 
fázisban deszorpciós egyensúlyi helyzetben μg 
m aq des ðeqÞ a vizsgált anyag deszorbeált össztömege deszorpciós 
egyensúlyi helyzetben μg 
m s des ðΔt i Þ az anyag talajban adszorbeálva maradó tömege At  i időin­
tervallum után μg 
m aq A a vizsgált anyagnak az abszorpciós egyensúlyi helyzet 
elérését követ ően a tökéletlen folyadékeltávolítás miatt 
talajban megmaradt tömege μg 
C s des ðeqÞ a talajban adszorbeálva maradó vizsgált anyag tartalom 
deszorpciós egyensúlyi helyzetben μg g -1 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Jel Fogalommeghatározás Mértékegység  
C aq des ðeqÞ a vizsgált anyag tömegkoncentrációja vizes fázisban 
deszorpciós egyensúlyi helyzetben μg cm  -3 
V T a talajjal érintkezésben lév ő vizes fázis össztérfogata a 
„folytatásos” módszerrel végrehajtott deszorpciós kinetikai 
kísérlet során cm 3 
v R az adszorpciós egyensúlyi helyzet elérését követ ően a 
kémcsőből eltávolított és azonos térfogatú 0,01 M CaCl  2 
oldattal pótolt vizes fázis mennyisége cm 3 
v a D a kémcsőből (i) időpontban a vizsgált anyag analizálása 
céljából kiemelt aliquot minta térfogata a „folytatásos” 
módszerrel végzett deszorpciós kinetikai kísérletben cm 3 
V r r az (i) kémcs őből a vizsgált anyag mérésére kiemelt oldat 
térfogata a párhuzamos módszerrel végzett deszorpciós 
kinetikai kísérletben cm 3 
V r F a kémcsőből a vizsgált anyag mérésére kivett oldat térfo ­
gata deszorpciós egyensúlyi helyzetben cm 3 
MB tömegkiegyenlítés % 
m E a talajból és a tesztedény faláról két lépésben extrahált 
vizsgált anyag össztömege μg 
V rec az adszorpciós egyensúlyi helyzet után visszanyert felül ­
úszó térfogata cm 3 
P ow oktanol/víz megoszlási koefficiens 
pKa disszociációs állandó 
S w vízoldhatóság g l  -1 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A radioaktívan jelölt vagy nem jelölt tesztanyag ismert térfogatú és 
koncentrációjú, 0,01 M CaCl  2 -ben készült oldatait 0,01 M CaCl  2 -vel 
ekvilibrált, ismert száraz tömeg ű talajmintákhoz adják. A keveréket 
megfelelő ideig rázzák. A talajszuszpenziókat ezt követ ően centrifu ­
gálással és szükség esetén sz űréssel elválasztják, és a vizes fázist 
elemzik. A talajmintában adszorbeálódott vizsgáltanyag-mennyiséget a kezdetben az oldatban jelen lév ő vizsgált anyagmennyiség és a 
kísérlet végén fennmaradó mennyiség különbözeteként adják meg 
(közvetett módszer).
 
Másik lehet őségként a vizsgált anyag adszorbeálódott mennyiségét 
közvetlenül is meg lehet határozni a talaj elemzésével (közvetlen módszer). Ezen eljárást, amely magában foglalja a megfelel ő oldó­
szerrel lépésekben történ ő talajextrakciót, olyan esetekben ajánlják, 
ahol az anyag oldatkoncentrációjában beálló különbözetet nem lehet pontosan meghatározni. Ilyen esetek pl. a vizsgált anyag adszorp ­
ciója a kísérleti edény falán, a vizsgált anyag instabilitása a kísérlet 
ideje alatt, gyenge adszorpció, amely az oldatban csak kis koncent ­
rációváltozást eredményez; és az alacsony koncentrációt eredmé ­
nyező erőteljes adszorpció, amelyet nem lehet pontosan meghatá ­
rozni. Ha radioaktívként jelölt anyagot használnak, a talajextrakció 
elkerülhet ő, ha a talajmintát hevítik, és folyadékszcintillációs szám ­
lálással határozzák meg a tesztanyag mennyiségét. A folyadékszcin ­
tillációs számlálás azonban olyan nem specifikus eljárás, amely nem tud különbséget tenni a tesztanyag és az átalakulási termékei között; 
ezért csak akkor kell használni, ha a vizsgált vegyi anyag a vizsgálat 
tartama alatt stabil.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓ  
Analitikai tisztaságú reagenseket kell használni. Ismert összetétel ű és 
lehetőleg legalább 95 % tisztaságú, jelöletlen vagy ismert összetétel ű, 
radioaktívként jelölt, radioaktivitás szempontjából is ismert tisztaságú 
vizsgált anyagok használata ajánlott. Rövid felezési idej ű jelzők 
esetén bomlási korrekciókat kell alkalmazni.  
Az adszorpciós-deszorpciós vizsgálat elvégzése el őtt a vizsgált 
anyagról a következ ő információnak kell rendelkezésre állnia:  
a) vízoldhatóság (A.6);  
b) gőznyomás (A.4) és/vagy a Henry-törvény szerinti állandó;  
c) abiotikus lebomlás: hidrolízis a pH függvényében (C.7);  
d) megoszlási koefficiens (A.8);  
e) gyors biológiai lebonthatóság (C.4) vagy az anyag aerob és 
anaerob transzformációja a talajban;  
f) ionizálható anyagok pKa értéke;  
g) közvetlen fotolízis vízben (azaz UV-VIS adszorbciós spektrum 
vízben, kvantumhozam) és fotodegradáció a talajban.  
1.6. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
A vizsgálat olyan vegyi anyagokra alkalmazandó, amelyekre nézve 
kielégítő pontosságú analitikai módszer áll rendelkezésre. Az ered ­
mények megbízhatóságát befolyásolni képes fontos tényez ő, külö­
nösen olyan esetben, amikor a közvetett módszert követik, a vizsgált 
anyag stabilitása a vizsgálat id őtartama alatt. Ezért a stabilitást ellen ­ 
őrizni kell el őzetes vizsgálat során; ha az el őkísérletben a teszt terve ­
zett időtartama alatt átalakulást figyelnek meg az anyagon, akkor 
ajánlott a f ő vizsgálatot a talaj- és vizes fázisok mindegyikének 
elemzésével elvégezni.  
E vizsgálat végrehajtása során vízben csak kevéssé oldódó vizsgált 
anyagok (Sw< 10-4 g l  -1 ), valamint er ős töltéssel rendelkez ő 
anyagok esetében nehézségek merülhetnek fel amiatt, hogy a vizes fázisban a koncentrációt analitikai módszerekkel nem lehet megfelel ő 
pontossággal mérni. Ilyen esetekben további lépéseket kell tenni. E 
jogszabály vonatkozó szakaszai iránymutatást nyújtanak az ilyen 
problémák kezeléséhez.
 
Illékony anyagok vizsgálata során ügyelni kell a veszteségek elkerü ­
lésére.  
1.7. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.7.1.  Eszközök és reagensek  
Szabványos laboratóriumi felszerelés, különösen a következ ők: 
a) Kémcsövek vagy edények a kísérletek végzéséhez. Fontos, hogy 
e kémcsövek vagy edények:  
— pontosan illeszkedjenek a centrifugába, a kezelési és áthelye ­
zési hibák minimalizálása érdekében,  
— közömbös (inert) anyagból készüljenek, ami minimálisra 
csökkenti a felületükön a vizsgálat anyag adszorpcióját.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Rázókészülék: körforgó rázógép vagy ezzel egyenérték ű berende­
zés; a készülék a rázatás során tartsa szuszpenzióban a talajt.  
c) Centrifuga: lehet őleg nagy sebesség ű, pl. centrifugálás er ő > 
3 000 g, h őszabályozós, illetve legyen képes a vizes oldatokból 
eltávolítani a 0,2 μm-nél nagyobb átmér őjű szemcséket. A rázatás 
és centrifugálás során a tesztedényeket le kell fedni a párolgás és a vízveszteség elkerülése érdekében; az ezeken jelentkez ő 
adszorpció minimalizálása érdekében deaktivált felszín ű, mint 
pl. teflonbevonatú csavaros tet őt kell alkalmazni.
 
d) Szabadon választható: sz űrőberendezés; 0,2 μm pórusméret ű, 
steril, egyszer használatos filterekkel. Különös gonddal kell eljárni a filterek anyagának kiválasztásakor annak érdekében, hogy elkerüljék a vizsgált anyag bármilyen veszteségét ezeken; 
a rosszul oldódó vizsgált anyagok esetében nem ajánlatos szerves 
szűrőanyagot használni.
 
e) Analitikai berendezések, amelyek alkalmasak a vizsgált vegyi 
anyag koncentrációjának mérésére.  
f) Laboratóriumi szárítószekrény, amely 103  o C és 110  o C közötti 
hőmérsékletet tud tartani.  
1.7.2.  Talajok jellemzése és kiválasztása  
A talajokat három olyan paraméterrel kell jellemezni, amelyeket 
nagyrészt felel ősnek tartanak az adszorpcióért: szervesszén-tartalom, 
agyagtartalom és talajszerkezet, valamint a pH-érték. Mint az már korábban szerepelt (lásd Alkalmazási kör), a talaj más fizikai-kémiai 
tulajdonságai befolyásolhatják egy adott anyag adszorpcióját/ ­
deszorpcióját, ilyen esetekben azokat is figyelembe kell venni.
 
A talaj jellemzésére használt módszerek nagyon fontosak, és jelen ­
tősen befolyásolhatják az eredményeket. Ezért ajánlatos a talaj pH- 
értékét 0,01 M CaCl  2 -oldatban mérni (ez az adszorpciós/deszorpciós 
vizsgálatban használt oldat) a megfelel ő ISO-módszer szerint (ISO- 
10390-1). Ajánlott továbbá az egyéb jelent ős talajtulajdonságok 
szabványmódszer szerinti meghatározása (pl. az ISO „Talajanalízis kézikönyv” szerint); amely lehet ővé teszi, hogy a szorpciós adatok 
nemzetközileg egységes, szabványosított talaj paramétereken alapul ­
janak. A talaj elemzésére és jellemzésére rendelkezésre álló szab ­
ványmódszerekre vonatkozó iránymutatás megtalálható a szakiro ­
dalomban (50-52). A talajvizsgálati módszerek kalibrálásához aján ­
lott referenciatalajokat használni.
 
Az adszorpciós/deszorpciós kísérletekhez használt talajok kiválasztá ­
sára vonatkozó iránymutatás az 1. táblázatban szerepel. A hét kivá ­
lasztott talaj lefedi a mérsékelt égövben megtalálható talajtípusokat. Az ionizálható vizsgált anyagok esetében a kiválasztott talajoknak széles pH-érték tartományt kell lefedniük ahhoz, hogy értékelni 
lehessen az anyag adszorpcióját ionizált és nem ionizált formában 
is. Arra nézve, hogy a vizsgálat különféle szakaszaiban hány külön ­
böző talajt kell használni, „A vizsgálat végrehajtása” cím ű szakasz 
(1.9.) nyújt iránymutatást.
 
Ha egyéb talajtípusokat részesítenek el őnyben, ezeket ugyanezekkel 
a paraméterekkel kell jellemezni és azok tulajdonságainak hasonló 
eltérést kell mutatnia, mint az 1. táblázatban ismertetettek, még akkor 
is, ha nem pontosan felelnek meg a kritériumoknak.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
1. táblázat  
Adszorpcióhoz-deszorpcióhoz használt talajminták kiválasztására vonatkozó iránymutatás  
Talajtípus pH-tartomany (0,01 M 
CaCl  2 oldatban) Szervesszén-tartalom 
( %) Agyagtartalom ( %) Talaj textúrája (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65–80 agyagos talaj 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20–40 agyagos vályogtalaj 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15–25 iszapos vályogtalaj 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15–30 vályogtalaj 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) vályogos homok ­
talaj 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65 agyagos vályogta ­
laj/agyagos talaj 
7 < 4,5 > 10 < 10 homoktalaj/vá ­
lyogos homoktalaj  
( 1 ) A FAO és az US-rendszer szerint (85). 
( 2 ) A vonatkozó változók lehet őleg a megadott tartományon belüli értékeket mutassanak. Ha azonban nehézségek 
merülnek fel a megfelel ő talajanyag megtalálásában, elfogadhatóak a jelzett minimum alatti értékek is. 
( 3 ) A 0,3 %-nál kisebb szervesszén-tartalmú talajok megzavarhatják a szervesanyag-tartalom és az adszorpció közötti 
összefüggést. Így ajánlatos legalább 0,3 % szervesszén-tartalmú talajokat használni.  
1.7.3.  Talajminták gy űjtése és tárolása  
1.7.3.1.  Gyűjtés 
Nincs konkrét ajánlott mintavételi eljárás vagy eszköz; a mintavételi 
technika a vizsgálat céljától függ (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
A következ őket kell figyelembe venni:  
a) szükség van a terep „el őéletére” vonatkozó részletes információra; 
ez magában foglalja a terepelhelyezkedést, a növényzetet, a pesz ­
ticidekkel és/vagy trágyákkal történt kezeléseket, biológiai után ­
pótlását vagy véletlen szennyez ődéseket. A mintavételre vonat ­
kozó ISO-szabvány (ISO 10381-6) ajánlásait kell követni a minta ­
vételi helyszín leírása tekintetében;  
b) a mintavételi helyszínt az UTM (Universal Transversal Mercator- 
Projection/European Horizontal Datum) vagy földrajzi koordi ­
náták segítségével kell meghatározni; ez lehet ővé teszi ugyanazon 
talajtípus újbóli gy űjtését a jöv őben, vagy segítséget tud nyújtani 
a különböz ő országokban használt különféle besorolási rend ­
szerek szerinti talaj meghatározásban. Az A. szintb ől, legfeljebb 
20 cm mélységb ől kell a talajmintát begy űjteni. Különösen a 
hetedik talajtípus esetében, ha a talaj részeként egy Oh-szint is jelen van, annak szerepelnie kell a mintában.
 
A talajmintákat olyan konténerek felhasználásával és olyan h őmér­
sékleti viszonyok között kell szállítani, amelyek garantálják, hogy az 
eredeti talajtulajdonságok jelent ősen nem változnak meg.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Tárolás  
Előnyben részesül a terepr ől frissen vett talajok használata. Csak 
amennyiben ez nem lehetséges, akkor lehet a talajt szobah őmérsék­
leten, leveg őn szárított állapotban tárolni. A tárolás idejére nézve 
nincs ajánlott határérték, de a három évnél tovább tárolt talajokat 
felhasználás el őtt újra kell elemezni szervesszén-tartalmuk, pH- 
értékük és a CEC tekintetében.  
1.7.3.3.  Talajminták kezelése és el őkészítése a vizsgálathoz  
A talajmintákat szobah őmérsékleten (lehet őleg 20–25  o C között) 
levegőn szárítják. A fellazítást minimális er őkifejtéssel kell végezni, 
hogy a talaj eredeti textúrája a lehet ő legkisebb mértékben változzon. 
A talajokat < 2 mm részecskeméretre szitálják; a szitálási folyamat 
tekintetében a talajmintavételre vonatkozó ISO-szabvány (ISO 10381-6) ajánlásait kell követni. Ajánlatos a gondos homogenizálás, mivel ez lehet ővé teszi az eredmények megismételhet őségét. A 
talajok nedvességtartalmát a talajból vett három mintából határozzák 
meg. A három mintát 105
 o C-on, tömegállandóságig (kb. 12 órán át) 
szárítják. A talaj tömege minden számításnál a száraz tömeg, azaz a talaj nedvességtartalommal korrigált súlya.
 
1.7.4.  A vizsgált anyag el őkészítése a talajra történ ő alkalmazáshoz  
A vizsgált anyagot desztillált vagy deionizált vizes 0,01 M CaCl  2 - 
oldatban feloldják; a CaCl  2 -oldatot a centrifugálás javítása és a kati ­
oncsere minimalizálása érdekében a vizes oldatfázisként alkalmaz ­
zák. A törzsoldat koncentrációja lehet őleg legyen három nagyság ­
renddel nagyobb, mint az alkalmazott elemzési módszer kimutatási határa. Ez a küszöbérték biztosítja a pontos méréseket az e módszer alapjául szolgáló módszer vonatkozásában; ezenkívül a törzsoldat 
koncentrációja lehet őleg ne érje el a vizsgált anyag vízoldhatósági 
határát.
 
A törzsoldatot lehet őleg közvetlenül a talajmintákra történ ő felvitelt 
megelőzően kell el őkészíteni, és sötét, elzárt helyen 4  o C hőmérsék­
leten kell tárolni. A tárolási id ő a vizsgált anyag stabilitásától és 
oldatbeli koncentrációjától függ.  
Csak a nehezen oldható anyagok (Sw < 10-4 g l  -1 ) esetében lehet 
szükség oldást segít ő anyagra. Ez az oldódást segít ő anyag: a) legyen 
vízzel elegyed ő, mint a metanol vagy az acetonitril; b) koncentrá ­
ciója ne haladja meg a törzsoldat teljes térfogatának 1 %-át, és legyen ennél kevesebb a vizsgált anyag azon oldatában, amely érint ­
kezésbe kerül a talajjal (lehet őleg legyen 0,1 %-nál kevesebb); és c) 
ne legyen felületaktív anyag, és ne lépjen vegyületképz ő reakcióba a 
vizsgált vegyi anyaggal. Az oldást segít ő anyag használatát a vizs ­
gálati jelentésben ismertetni kell és meg is kell indokolni.
 
A nehezen oldható anyagok esetében alkalmazható másik módszer 
az, hogy szerves oldószerben feloldott tesztanyagot adnak a talajból és a (desztillált vagy ionmentes vízzel készült) 0,01 M CaCl
 2 - 
oldatból álló tesztrendszerhez („spiking”). A vizes fázisban a szerves 
oldószer tartalmát a lehet ő legalacsonyabb szinten kell tartani, álta ­
lában a 0,1 % értéket nem meghaladva. A szerves oldattal történ ő 
elegyítés következménye, hogy a térfogat ezután már nem reprodu ­
kálható. Így további hiba állhat el ő, mivel a vizsgált anyag és az 
oldószer koncentrációja nem azonos az összes vizsgálatban.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. AZ ADSZORPCIÓS/DESZORPCIÓS KÍSÉRLET ELVÉGZÉ ­
SÉNEK EL ŐFELTÉTELEI  
1.8.1.  Elemzési módszer  
A szorpciós mérések pontosságát befolyásolni képes kulcsfontosságú 
paraméterek a következ őek: az elemzési módszer pontossága az oldat 
és az adszorbeált fázisok elemzése során, a vizsgált anyag stabilitása és tisztasága, az adszorpciós egyensúlyi helyzet elérése, az oldatkon ­
centráció változásának mértéke, a talaj/oldat arány és az egyensúlyi 
folyamat beállítása során a talajszerkezet változásai (35) (59–62). A 
pontosság kérdésében szerepet játszó néhány példát a 2. függelék tartalmazza.
 
Az alkalmazott elemzési módszer megbízhatóságát annál a koncent ­
rációtartománynál kell ellen őrizni, amely a vizsgálat során valószí ­
nűleg felmerül. A kísérletet végz ő belátása szerint kialakíthat 
megfelelő módszert a megfelel ő pontossággal, precizitással, reprodu ­
kálhatósággal, kimutatási határértékkel és visszanyerési hatékonyság ­
gal. Az ilyen vizsgálatok elvégzésének módjára vonatkozóan irány ­
mutatást ad az alábbi kísérlet.  
0,01 M CaCl  2 megfelelő mennyiségét, pl. 100 cm  3 -t, 4 órán át 
rázatunk pl. 20 g tömeg ű, nagy adszorpciós kapacitással rendelkez ő 
talajjal, azaz olyannal, amelynek magas a szervesszén- és agyagtar ­
talma; e tömeg és térfogat az elemzési igényt ől függően változhat, de 
az 1:5 talaj/oldat arány a megfelel ő kiindulási pont. A keveréket 
centrifugáljuk, és a vizes fázist sz űrni lehet. A vizsgált anyag törzs ­
oldatának megfelel ő mennyiségét hozzáadjuk a megsz űrt keverékhez, 
azért, hogy a vizsgálat során valószín űleg bekövetkez ő koncentráci ­
ótartományba es ő névleges koncentrációt érjük el. E mennyiség ne 
haladja meg a vizes fázis végleges térfogatának 10 %-át, hogy a 
preekvilibrációs oldat jellegét a lehet ő legkevésbé változtassuk 
meg. Az oldatot elemezzük.  
Egy talajból és CaCl  2 -oldatból (vizsgált anyag nélkül) álló vakpróbát 
is be kell állítani az analitikai módszer m űhibáinak kisz űrése és a 
talaj által okozott mátrixhatás ellen őrzése céljából.  
A szorpciós mérésekre alkalmazható elemzési módszerek közé 
tartozik a gáz-folyadék kromatográfia (GLC), a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC), a tömegspektrometria (pl. GC-MS, HPLC-MS) és a folyadékszcintillációs számlálás (radioaktívként 
jelölt anyagok esetén). Az alkalmazott elemzési módszert ől függet­
lenül az min ősül alkalmasnak, amelynél a visszanyerés a névérték 
90 %-a és 110 %-a között van. A megoszlás után a kimutatás és értékelés lehet ővé tétele érdekében az elemzési módszer kimutatási 
határértékeinek legalább két nagyságrenddel a névleges koncentráció 
alatt kell lenniük.
 
Az adszorpciós vizsgálatok elvégzéséhez rendelkezésre álló elemzési 
módszerek jellemz ői és dedikálási határa fontos szerepet játszanak a 
vizsgálati körülmények meghatározásában és a vizsgálat kivitelezé ­
sében. E módszer egy általános vizsgálati eljárást követ és ajánláso ­
kat, iránymutatásokat ad alternatív megoldásokra olyan esetekben, 
ahol az elemzési módszer és a laboratóriumi felszerelés korlátokat 
állíthat.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Az optimális talaj/oldat arányok kiválasztása  
A szorpciós vizsgálatokhoz a megfelel ő talaj-oldat arány kiválasztása 
a K  d megoszlási koefficienst ől és az adszorpció kívánt relatív fokától 
függ. Az anyag koncentrációjának változása az oldatban, az adszorp ­
ciós egyenlet formája és az elemzési módszer detektálási határa 
meghatározza a mérés statisztikus pontosságát a vegyszer oldatbeli koncentrációjának kimutatásában. Ezért általában a gyakorlatban hasznos néhány el őre meghatározott arányt beállítani, amelyeknél 
az adszorbeált százalékos arány 20 % felett van, és lehet őleg > 
50 % (62), ugyanakkor figyelmet kell fordítani arra, hogy a vizes fázisban a vizsgált anyag koncentrációja elég magas maradjon ahhoz, 
hogy pontosan lehessen mérni. Ez különösen a nagy adszorpciós 
arányok esetében fontos.
 
A megfelel ő talaj/oldat arányok kiválasztásához kézenfekv ő 
megközelítés a K  d érték becslésén alapul, amelyet vagy el ővizsgála­
tok, vagy bevett becslési technikák segítségével (3. függelék) hatá ­
roznak meg. A megfelel ő arány ezután kiválasztható egy olyan 
grafikon segítségével, amely a meghatározott adszorpciós százalé ­
kokra vonatkozó talaj/oldat arányt a K  d függvényében ábrázolja (1. 
ábra). Ekkor az a feltételezés, hogy az adszorpciós egyenlet lineáris ­
( 1 ) (6). Az alkalmazandó összefüggést úgy kapják meg, ha a K  d -re 
vonatkozó 4. egyenletet az 1. egyenlet alakjára hozzák:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
vagy logaritmusos formában fejezik ki, feltéve hogy 
R = m  talaj /V0 and A  eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
1. ábra:  A talaj-oldat arányszámok és a K  d közötti reláció az adszor ­
beált vizsgált anyag különböz ő százalékos mértékeinél  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 Az 1. ábra a különböz ő adszorpciós szintekhez szükséges talaj/oldat 
arányszámokat mutatja a K  d függvényeként. Pl. egy 1:5 talaj/oldat 
aránnyal és K  d = 20 érték mellett kb. 80 % adszorpció következik 
be. Ugyanezen K  d mellett 50 %-os adszorpció eléréséhez 1:25 arányt 
kell alkalmazni. E rugalmas megközelítéssel választhatja ki a kísér ­
letet végz ő a kísérlet céljainak leginkább megfelel ő talaj/oldat arányt.  
Nagyobb nehézségek adódnak azokban a tartományokban, ahol a 
vegyszer nagyon er ősen vagy csak nagyon kis mértékben adszorbe ­
álódik. Abban az esetben, ha alacsony szint ű adszorpció következik 
be, 1:1 talaj/oldat arány ajánlott, bár néhány nagy szervesanyagtar ­
talmú talajfajtánál bizonyos körülmények között kisebb arányra lehet szükség a s űrű szuszpenzió eléréséhez. Az oldat koncentrációjának 
kis változását mér ő elemzési módszertannal kapcsolatban gondosan 
kell eljárni; különben az adszorpciós mérés pontatlan lesz. Másrészről nagyon magas K
 d megoszlási koefficiensnél akár 1:100 
talaj/oldat arányig is el lehet menni ahhoz, hogy jelent ős mennyiség ű 
tesztanyag maradjon az oldatban. Gondot kell azonban fordítani az 
alapos keverésre, és megfelel ő időt kell hagyni a rendszernek az 
egyensúlyi állapot eléréséhez. Az ilyen széls őséges esetek kezelé ­
sének másik megközelítése, ha a megfelel ő elemzési módszertan 
hiányzik, a K  d érték előrejelzése pl. a P  ow értékeken alapuló becslési 
technikákkal (3. függelék). Ez az eljárás különösen hasznos lehet kevéssé adszorbeálódó/poláros vegyszerek esetén, amelyeknél P
 ow 
< 20, valamint a lipofil/nagy abszorpcióképesség ű vegyszerek esetén, 
amelyeknél P  ow > 104.  
1.9. A VIZSGÁLAT VÉGREHAJTÁSA  
1.9.1.  Vizsgálati körülmények  
Minden kísérletet szobah őmérsékleten és – ha lehetséges – 20  o C és 
25 o C közötti állandó h őmérsékleten végeznek el.  
A centrifugálási feltételeknek lehet ővé kell tennie a 0,2 μm-nél 
nagyobb részecskék kiülepedését az oldatból. Ez az érték a legkisebb méretű olyan részecskékre vonatkozik, amelyek még szilárd részecs ­
kéknek min ősülnek, és ez a határérték a szilárd és kolloid részecskék 
között. A centrifugálási feltételek meghatározására vonatkozó irány ­
mutatás a 4. függelékben szerepel.
 
Ha a centrifugálóberendezés nem tudja garantálni a 0,2 μm-nél 
nagyobb részecskék ülepítését, akkor alkalmazni lehet a centrifugálás és 0,2 μm-es pórusméret ű filterrel történ ő szűrés kombinációját. 
Ezeket a sz űrőket alkalmas inert anyagból kell készíteni, hogy el 
lehessen kerülni a sz űrés folyamán bekövetkez ő veszteségét. Minden 
esetben bizonyítani kell, hogy a sz űrés során nem következik be a 
vizsgált anyag vesztesége.
 
1.9.2.  1. szint – el őzetes vizsgálat  
Az előzetes vizsgálat elvégzésének célját már meghatározta az Alkal ­
mazási kör cím ű szakasz. Az ilyen vizsgálat összeállítására vonat ­
kozó iránymutatást az alább javasolt kísérlet adja meg.  
1.9.2.1.  Optimális talaj/oldat arányok kiválasztása  
Két talajtípust és három talaj/oldat arányt használnak (hat kísérlet). 
Az egyik talajtípus magas szervesszén- és alacsony agyagtartalommal 
rendelkezik, a másik pedig alacsony szervesszén-és magas agyagtar ­
talommal. A következ ő talaj-oldat arányok használata javasolt:  
— 50 g talaj és a vizsgált anyag vizes oldatának 50 cm  3 mennyisége 
(1:1 arány),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g talaj és a vizsgált anyag vizes oldatának 50 cm  3 mennyisége 
(1:5 arány),  
— 2 g talaj és a vizsgált anyag vizes oldatának 50 cm  3 mennyisége 
(1:25 arány).  
A minimális talajmennyiség, amellyel a kísérletet el lehet végezni, a 
laboratóriumi eszközökt ől és az alkalmazott elemzési módszerek 
teljesítőképességét ől függ. Ajánlatos legalább 1 g használata, el őnyö­
sebb azonban a 2 g a vizsgálat megbízható eredményeinek biztosí ­
tására.  
Egy kontrollmintát, amely csak a vizsgált anyag 0,01 M CaCl  2 - 
oldatát tartalmazza (talajt nem), pontosan ugyanazoknak a lépés ­
eknek kell alávetnünk, mint a vizsgálati rendszereket, annak érdeké ­
ben, hogy ellen őrizni lehessen a vizsgált anyag stabilitását CaCl  2 - 
oldatban és annak esetleges adszorpcióját a tesztedények falán.  
Talajmintánként elvégeznek egy vakpróbát, amely során azonos 
mennyiség ű talajt és 50 cm  3 0,01 M CaCl  2 -oldatot (vizsgált anyag 
nélkül) pontosan ugyanazoknak a lépéseknek vetnek alá, mint a vizs ­
gálati rendszereket. Ez háttérkontrollként szolgál az elemzés során az 
interferáló anyagok vagy szennyezett talajok kisz űrésére.  
Minden kísérletet, beleértve a kontroll és vak kísérleteket, legalább 
kétszer kell elvégezni. A vizsgálathoz összesen el őkészítend ő minták 
számát az alapul szolgáló módszertan segítségével lehet kiszámítani.  
Az előzetes vizsgálat és a f ő vizsgálat módszerei általában azonosak, 
a kivételeket megemlítjük, ahol ez jelent őséggel bír.  
A levegőn szárított talajmintákat rázással hozzuk egyensúlyi hely ­
zetbe, legalább 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 -oldattal, a kísérlet napja el őtti 
éjszakán (12 órával el őbb). Ezt követ ően a vizsgált anyag törzsolda ­
tának megfelel ő mennyiségét hozzáadják, azért hogy a végleges 
térfogat 50 cm  3 legyen. A törzsoldat így hozzáadott mennyisége: 
a) nem haladhatja meg az 50 cm  3 -es végtérfogat 10 %-át, hogy a 
lehető legkevésbé változtassa meg az egyensúlyba hozatal el őtt az 
oldat jellegét; és b) lehet őleg az elemzési módszer kimutatási határ ­
értékénél legalább két nagyságrenddel nagyobb kiindulási koncentrá ­
ciót eredményezzen a talajjal érintkez ő vizsgált anyag kiindulási 
koncentrációjában (C  0 ); ez a küszöb lehet ővé teszi a pontos méré ­
seket még akkor is, ha er őteljes adszorpció (> 90 %) következik be, 
valamint az adszorpciós izotermák kés őbbi meghatározását. Aján ­
latos továbbá, hogy az anyag kiindulási koncentrációja (C  0 ) lehetőleg 
ne haladja meg az anyag oldhatósági határának felét.  
Az alábbiakban bemutatnak egy példát a törzsoldat (C  st ) koncentrá ­
ciójának kiszámítására. Feltételeznek 0,01 μg cm  -3 kimutatási határ ­
értéket és 90 % adszorpciót; így a vizsgált anyag talajjal érintkez ő 
kiindulási koncentrációja lehet őleg 1 μg cm  -3 (a kimutatási határ ­
értéknél két nagyságrenddel nagyobb). Feltéve, hogy a törzsoldatból 
a rendszerhez a maximális ajánlott mennyiséget hozzáadják, azaz 5 cm
 3 -t a 45 cm  3 térfogatú 0,01 M CaCl  2 ekvilibrációs oldathoz (a 
törzsoldat így a vizes fázis 50 cm  3 -es végtérfogatának 10 %-a), akkor 
a tömény oldat koncentrációja 10 μg cm  -3 kell hogy legyen; ami 
három nagyságrenddel nagyobb, mint az elemzési módszer kimuta ­
tási határértéke.  
A talajjal történ ő érintkezés el őtt és után is meg kell mérni a vizes 
fázis pH-értékét, mivel ez fontos szerepet játszik a teljes adszorpciós 
folyamatban, különösen ionizálható anyagok esetén.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
A keveréket addig rázzák, amíg eléri az adszorpciós egyensúlyi hely ­
zetet. Az egyensúlyi helyzet elérésének ideje a talajokban igen válto ­
zatos, a vegyi anyagtól és a talajtól is függ; 24 órás id őszak általában 
elégséges (77). Az el őzetes vizsgálatok végzésekor, a 48 órás rázatás 
során többször mintát vesznek (pl. 4., 8., 24. és 48. órában). Az 
elemzési id őket rugalmasan kell kialakítani, a laboratórium munka ­
rendjére tekintettel.  
A vizsgált anyag vizes oldatában történ ő elemzésére két lehet őség 
van: a) párhuzamos módszer; és b) a „folytatásos” módszer. Hang ­
súlyozni kell, hogy bár a párhuzamos módszer alkalmazása id őigé­
nyesebb, az eredmények matematikai feldolgozása egyszer űbb (5. 
függelék). A követend ő módszer kiválasztását azonban a kísérletet 
végzőre hagyják, akinek figyelembe kell vennie a rendelkezésre álló 
laboratóriumi felszereléseket és eszközöket.  
a) párhuzamos módszer: azonos talaj/oldat arányú mintákat készí ­
tenek elő, annyit, ahány id őintervallumnál az adszorpciós kine ­
tikát tanulmányozni kívánják. A centrifugálás, és amennyiben 
szükséges, sz űrés után az els ő kémcső vizes fázisát a lehet ő 
legteljesebben visszaállítják és megmérik, pl. 4 óra után, a második kémcs ő esetében 8 óra után, a harmadik kémcs ő 
esetében 24 óra után stb.
 
b) „folytatásos” módszer: mindegyik talaj/oldat arányhoz csak két 
minta készül. Meghatározott id őközönként a keveréket centrifu ­
gálják a fázisok szétválasztása érdekében. A vizes fázisból kivett 
kis mennyiség ű oldat tesztanyagtartalmát azonnal meghatározzák; 
ezt követ ően a kísérlet az eredeti keverékkel folytatódik. Ha a 
centrifugálás után sz űrést is alkalmaznak, a laboratóriumban 
lennie kell olyan berendezésnek, amely a kis térfogatok sz űrésére 
alkalmas. Ajánlatos az analízisre kivett mennyiségek össztérfo ­
gatát úgy meghatározni, hogy az ne haladja meg az oldat teljes térfogatának 1 %-át, hogy a talaj/oldat arány jelent ősen ne 
változzon és a vizsgálat során az adszorpcióra rendelkezésre 
álló oldott anyag tömege ne csökkenjen.
 
A százalékos adszorpciót ( A t i ) minden (t  i ) időpontban kiszámítják a 
névleges kezdeti koncentráció és a mintavétel t  i időpontjában mért 
koncentráció alapján, amelyet a vakminta kapott értékével korrigá ­
lunk. Elkészítik az  A t i érték időfüggését ábrázoló görbét (5. függelék 
1. ábra) az adszorpciós egyensúlyi plató elérésének megbecslése érdekében (
 1 ). Kiszámítják az egyensúlyi K  d értéket is. E K  d érték 
alapján az 1. ábráról kiválasztják a megfelel ő talaj/oldat arányokat 
úgy, hogy az adszorpció elérje a 20 % feletti és lehet őleg > 50 % 
mértéket (61). Minden vonatkozó egyenletet és ábrázolási alapelvet tartalmaz az adatokról és jelentéskészítésr ől szóló szakasz és az 5. 
függelék.
 
1.9.2.2.  Adszorpciós ekvilibrációs id ő és az egyensúlyi helyzetben adszorbeált 
vizsgált anyag mennyiségének meghatározása  
Mint már említésre került, az  A  t i vagy  C  aq ads idő függvényében 
történő ábrázolása lehet ővé teszi az adszorpciós egyensúlyi plató 
elérésének és az egyensúlyi állapotban adszorbeált vizsgált anyag 
mennyiségének becslését. Az 5. függelék 1. és 2. ábrája példákat mutat az ilyen grafikai ábrázolásra. Az ekvilibrációs id őnek azon 
időszakot nevezik, amelyre a rendszernek a plató eléréséhez szük ­
sége van.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) A vizes fázisban lév ő vizsgált anyag koncentrációját  C  aq ads Ê Ì  
az idő függvényében ábrá ­
zoló grafikonok is használhatók az egyensúlyi plató elérésének megbecslésére (lásd 5. 
függelék 2. ábra).
 Ha egy adott talaj esetében nem plató, hanem folyamatos növekedés 
észlelhető, ez olyan tényez ők miatt lehet, mint a biodegradáció vagy 
lassú diffúzió. A biodegradációt úgy lehet kimutatni, hogy a kísér ­
letet a talaj sterilizált mintájával megismételjük. Ha még ebben az esetben sem jön létre a plató, a kísérletet végz őnek más jelenségeket 
kell keresnie, amelyek a konkrét vizsgálatban szerepet játszhatnak; 
ezt a kísérleti feltételek (h őmérséklet, rázási id ő, talaj/oldat arányok) 
megfelelő módosításával lehet elvégezni. A kísérletet végz őre hárul 
annak eldöntése, hogy a vizsgálati eljárást folytatja-e annak dacára, 
hogy esetleg nem sikerül egyensúlyi állapotot elérni.
 
1.9.2.3.  Adszorpció a tesztedény falán és a vizsgált anyag stabilitása  
A kontrollminták elemzésével bizonyos információkat lehet nyerni a 
vizsgált anyagnak a tesztedény falán történ ő adszorpciójáról, vala ­
mint annak stabilitásáról. Ha az elemzési módszer standard eltérését meghaladó koncentrációcsökkenést figyelnek meg, felmerülhet az 
abiotikus bomlás és/vagy adszorpció a tesztedény falán. E két jelen ­
séget úgy lehet megkülönböztetni, hogy alaposan lemossák a tartály falát megfelel ő oldószer ismert térfogatával, és a nyert oldat teszt ­
anyagtartalmát meghatározzák. Ha a tesztedény falán nem figyelnek 
meg adszorpciót, a koncentrációcsökkenés a vizsgált anyag abiotikus instabilitását mutatja. Ha adszorpciót észlelnek, a tesztet más anyagból készült edényben kell kivitelezni. Az e kísérletb ől adódó, 
a tesztedények falán történ ő adszorpcióra vonatkozó adatokat 
azonban nem lehet közvetlenül kivetíteni a talaj/oldat kísérletre. A talaj jelenléte is befolyásolja ezen adszorpciót.
 
A vizsgált anyag stabilitására vonatkozó további információt az 
anyag tömegegyensúlyának az id ő függvényében történ ő meghatá ­
rozásával lehet nyerni. Ez azt jelenti, hogy a vizes fázist, a talajt és a tesztedény falait a vizsgált anyagra nézve elemzik. A hozzáadott vizsgált tesztanyagtömege és a vizsgált vegyi anyag vizes fázisú 
tömegének, a talaj kivonatoknak és a tesztedény falain adszorbeált 
anyag tömegének összege közötti különbözet a lebomlott, elpárol ­
gott, illetve a nem extrahált tömeggel egyenl ő. A tömegegyensúly 
meghatározásának elvégzéséhez az szükséges, hogy a kísérlet id őtar­
tama alatt megvalósuljon az adszorbciós egyensúlyi helyzet.
 
A tömegegyensúlyt mindkét talaj esetében talajonként egyetlen olyan 
talaj/oldat arány esetében határozzák meg, amikor a tesztanyag mennyiségének csökkenése 20 % feletti, illetve lehet őleg 50 % feletti 
az egyensúlyi állapotban. Amikor a talaj/oldat arány meghatározására 
irányuló vizsgálatban az utolsó vizesfázis-minta analízisét 48 óra után befejezik, a fázisokat centrifugálással, és ha szükséges, sz űréssel 
szétválasztják. A vizes fázist a lehet ő legnagyobb mértékben eltávo ­
lítják, és a vizsgált anyag extrahálása érdekében megfelel ő extraháló 
oldószert (legalább 95 % extrakciós együttható) adnak a talajhoz. Legalább két egymást követ ő extrahálás ajánlott. Meghatározzák a 
talajban és a tesztedények falán extraktumokban lév ő vizsgáltanyag- 
mennyiséget és kiszámítják a tömegegyensúlyt (10. egyenlet, Adatok 
és jelentéskészítés). Ha ez 90 %-nál kevesebb, a vizsgált anyag a vizsgálat id őtartamára nézve instabilnak min ősül. A vizsgálatot 
azonban a vizsgált anyag instabilitásának figyelembevételével foly ­
tatni lehet; ebben az esetben ajánlatos a f ő vizsgálat során mindkét 
fázis elemzése.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  2. szint – Adszorpciós kinetika a vizsgált anyag egyetlen koncentrá ­
ciójánál  
Öt, az 1. táblázatból kiválasztott talajt használnak. Az el őzetes vizs ­
gálatban használt egy vagy több talaj alkalmazása el őnyös. Ebben az 
esetben a 2. szintet nem kell megismételni az el őzetes vizsgálatban 
használt talajokra nézve.  
Az ekvilibrációs id őt, a talaj/oldat arányt, a bemérend ő talaj tömegét, 
a vizes fázis talajjal érintkez ő térfogatát és a vizsgált anyag koncent ­
rációját az oldatban az el őzetes vizsgálat eredményei alapján 
választják ki. Az elemzést lehet őleg kb. 2, 4, 6, 8 (esetleg 10) és 
24 órás kezelést követ ően kell elvégezni; a rázási id őt legfeljebb 48 
órára meg lehet hosszabbítani, amennyiben a megfelel ő talaj/oldat 
arány meghatározására irányuló vizsgálatok alapján hosszabb ekvi ­
librációs id őre van szükség. Az elemzés id őpontjait azonban rugal ­
masan lehet kezelni.  
Mindegyik kísérletet (egy talaj és egy oldat) legalább kétszer kell 
elvégezni, hogy elemezni lehessen az eredmények varienciáját. 
Minden kísérletnél egy vakpróbát is végeznek. Ez a talajból és 0,01 M CaCl
 2 -oldatból áll, amely vizsgált anyagot nem tartalmaz, 
és tömegét és térfogatát tekintve megegyezik a kísérletben alkalma ­
zottakkal. A nem várt tényez ők kiszűrésére ugyanazon vizsgálati 
eljárásnak vetik alá az ellen őrző mintát is, amely csak a vizsgált 
anyagot tartalmazza 0,01 M CaCl  2 -oldatban (talaj nélkül).  
Mindegyik  A t i időpontban vagy  A Δt i időintervallumban (a követel ­
ményeknek megfelel ően) kiszámítják a százalékos adszorpciót és az 
idő függvényében ábrázolják. Kiszámítják továbbá az egyensúlyi 
deszorpciós együtthatót (K  d ), valamint a szerves szénre vonatkozta ­
tott adszorpciós együtthatót (K  oc ) (apoláros szerves vegyületekre).  
Az adszorpciós kinetikai vizsgálat eredményei:  
A lineáris K  d -érték általában pontosan írja le egy anyag szorpciós 
tulajdonságait (35), (78) és kifejezi a talajban található vegyszerek jellemző mobilitását. Például általában a K
 d < 1 cm  3 g -1 jellemzőjű 
vegyszerek kvalitatívan mobilnak min ősülnek. Hasonló, a K  oc -érté­
keken alapuló mobilitási besorolási rendszert dolgoztak ki MacCall és munkatársai (16). Ezenkívül a K
 oc és DT-50 (  1 ) közötti viszony 
alapján ki oldódási besorolási rendszerek is léteznek (32) (79).  
Az eltérések analízise szerint továbbá (61) a 0,3 cm  3 g-l alatti K  d 
értékeket nem lehet pontosan becsülni a vizes fázisban a koncent ­
ráció csökkenése alapján, még a (pontosság szempontjából) legked ­
vezőbb talaj/oldat arány, azaz az 1:1 arány alkalmazásánál sem. 
Ebben az esetben ajánlatos mindkét fázis – talaj és oldat – elemzése.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT  50 : a vizsgált anyag 50 %-ának lebomlási ideje.
 A fenti megállapításokra tekintettel ajánlatos valamely anyag talajban 
tanúsított adszorpciós viselkedésére és mobilitási potenciáljára 
irányuló vizsgálatot lefolytatni, amely során az adszorpciós izoter ­
mákat Freundlich elmélete szerint határozzák meg. Ehhez pedig – ha a tesztmódszerben megjelölt vizsgálati eljárást alkalmazzuk –, a K
 d 
értéke pontosan meghatározható. A pontos meghatározás akkor lehet ­
séges, ha a K  d -t a talaj/oldat arányával megszorozva az eredmény > 
0,3, és ha a koncentráció vizes fázisbeli csökkenésére alapulnak a mérések (közvetett módszer), vagy K
 d > 0,1, ha mindkét fázist 
elemzik (közvetlen módszer) (61).  
1.9.2.5.  3. szint – Adszorpciós izotermák és deszorpciós kinetika/deszorpciós 
izotermák  
1.9.2.5.1. A d s z o r p c i ó s i z o t e r m á k  
Öt vizsgált anyagkoncentrációt alkalmaznak, amelyek lehet őleg két 
nagyságrendet fednek le; e koncentrációk kiválasztásában figyelembe kell venni a vízoldhatóságot és az el őálló vizes egyensúlyi koncent ­
rációkat. A vizsgálat során azonos talaj/oldat arányt kell fenntartani 
az egyes talajokra nézve. Az adszorpciós vizsgálatot a fent ismer ­
tettek szerint végzik el, azzal az egy különbséggel, hogy a vizes fázist csak egyszer, (a 2. szint vizsgálatai alapján) az egyensúly 
kialakulásához szükséges id ő elteltével határozzák meg. Megmérik 
az oldat egyensúlyi koncentrációját, és az adszorbeált mennyiséget vagy a vizsgált anyagnak az oldatbeli kimerüléséb ől vagy a 
közvetlen módszerb ől számítják ki. A talaj által grammonként 
adszorbeált tömeget a vizsgált anyag egyensúlyi koncentrációjának 
függvényeként ábrázolják (lásd Adatok és jelentéskészítés).
 
Az adszorpciós izotermák meghatározására irányuló vizsgálatok 
eredményei:  
Az eddig javasolt matematikai adszorpciós modellek közül a Freund ­
lich-féle izoterma az egyik leggyakrabban használt, adszorpciós 
folyamatok leírására szolgáló modell. Az adszorpciós modellek értel ­
mezésére és fontosságára vonatkozóan részletesebb információ a szakirodalomban található (41) (45) (80) (81) (82).
 
Megjegyzés:  Meg kell említeni, hogy a különböz ő anyagok KF 
(Freundlich-féle adszorpciós koefficienst) értékeinek összehasonlítása csak akkor lehetséges, ha ezeket a KF-értékeket azonos mértékegy ­
ségben fejezik ki (83).
 
1.9.2.5.2. D e s z o r p c i ó s k i n e t i k a  
E kísérlet célja annak vizsgálata, hogy valamely vegyszer reverzibi ­
lisen vagy irreverzibilisen adszorbeálódik-e valamely talajban. Ez az 
információ fontos, mivel a deszorpciós folyamat is fontos szerepet 
játszik a vegyszerek környezeti talajban tanúsított magatartásában. Ezen túlmen ően a deszorpciós adatok hasznos bemen ő adatokat 
jelentenek az átmosódás és a kioldódás szimulált számítógépes 
modellezéséhez. Ha deszorpciós vizsgálatot kívánnak végezni, aján ­
latos az alábbiakban ismertetett vizsgálatot minden egyes rendszerre elvégezni, amelyre nézve a megel őző adszorpciós kinetikai kísérlet 
során pontosan meg lehetett határozni a K
 d -értéket.  
Hasonlóan az adszorpciós kinetikai vizsgálathoz, a deszorpciós kine ­
tikai kísérletnél két lehet őség szerint lehet eljárni: a) a párhuzamos 
módszer; és b) a „folytatásos” módszer. A követend ő módszertan 
kiválasztása a kísérletet végz őn múlik, akinek figyelembe kell vennie 
a rendelkezésre álló laboratóriumi felszereléseket és eszközöket.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) párhuzamos módszer: mindegyik talajra nézve, amelyet a 
deszorpciós vizsgálat elvégzésére kiválasztanak, azonos talaj/oldat 
arányú mintákat készítenek, annyit, ahány id őintervallumra vizs ­
gálni kívánják a deszorpciós kinetikát. Lehet őség szerint ugyan ­
azokat az id őintervallumokat kell használni, mint az adszorpciós 
kinetikai kísérletnél; a teljes id őtartamot azonban meg lehet 
hosszabbítani annak érdekében, hogy a rendszer elérje a deszorp ­
ciós egyensúlyt. Minden kísérletben (egy talaj, egy oldat) egy vakmintát is vizsgálnak. Ez a talajból és 0,01 M CaCl
 2 oldatból 
áll, vizsgált anyagot nem tartalmaz, tömegét és térfogatát tekintve 
megegyezik a kísérletben alkalmazottakkal. Kontrollmintaként a vizsgált anyag 0,01 M CaCl
 2 oldatban (talaj nélkül) oldott 
formáját azonos vizsgálati eljárásnak vetik alá. Az összes talaj 
os keveréket addig rázzák, amíg eléri az adszorpciós egyensúlyi 
helyzetet (a korábban a 2. szintnél meghatározott módon). Ezt követően a fázisokat centrifugálással szétválasztják, és a vizes 
fázisokat a lehet ő legnagyobb mértékben eltávolítják. Az eltávo ­
lított oldat térfogatát azonos térfogatú 0,01 M CaCl
 2 -oldattal 
helyettesítik vizsgált anyag nélkül, és az új keverékeket újra rázatják. Az els ő kémcső vizes fázisát a lehet ő legnagyobb 
mértékben eltávolítják, és elemzik, pl. 2 óra után, a második 
kémcsőét 4 óra után, a harmadik kémcs őét 6 óra után stb., 
amíg a deszorpciós egyensúlyt elérik.
 
b) „folytatásos” módszer: az adszorpciós kinetikai kísérletet köve ­
tően a keveréket centrifugálják, és a vizes fázist a lehet ő legna­
gyobb mértékben eltávolítják. Az eltávolított oldat térfogatát 
azonos térfogatú 0,01 M CaCl  2 -oldattal, vizsgált anyag nélkül 
pótolják. Az új keveréket addig rázzák, amíg eléri a deszorpciós egyensúlyi helyzetet. Ezen id őszak alatt, meghatározott id őközön­
ként a keveréket centrifugálják, hogy a fázisokat szétválasszák. A 
vizes fázis egy kis aliquot részét azonnal elemzik a vizsgált anyagra nézve; majd a kísérlet az eredeti keverékkel folytatódik. Az egyes kivett aliquotok térfogata az oldat össztérfogatának 
1 %-ánál kevesebb. A keverékhez azonos mennyiség ű friss 0,01 
M CaCl
 2 -oldatot adnak a talaj oldat arány fenntartásához, és a 
rázás a következ ő időintervallumig folytatódik.  
A százalékos deszorpciót mindegyik  ðD t i Þ időpontban és/vagy ðD Δt i Þ 
időintervallumban (a vizsgálat szükségleteinek megfelel ően) kiszá ­
mítják, és az id ő függvényében ábrázolják. Az egyensúlyi K  des 
deszorpciós koefficienst is kiszámítják. Az összes vonatkozó 
egyenlet szerepel az Adatok és jelentéskészítés szakaszban, valamint 
az 5. függelékben.  
Deszorpciós kinetikai kísérletek eredményei:  
A deszorpció  D t i és a százalékos adszorpció  A t i idő függvényében 
létrehozható közös ábrái lehet ővé teszik az adszorpciós folyamat 
reverzibilitásának becslését. Ha a deszorpciós egyensúlyt még az 
adszorpciós egyensúly kialakulásához szükséges id ő kétszeresén 
belül elérik, és az összdeszorpció az adszorbeált mennyiség 75 %- ánál több, az adszorpció reverzibilisnek min ősül.
 
1.9.2.5.3. D e s z o r p c i ó s i z o t e r m á k  
A Freundlich-féle deszorpciós izotermákat az adszorpciós izoterma 
kísérlethez használt talajokra határozzák meg. A deszorpciós vizs ­
gálatot a Deszorpciós kinetika cím ű szakaszban ismertetettek szerint 
folytatják le, azzal az egyetlen különbséggel, hogy a vizes fázist csak 
egyszer, a deszorpciós egyensúlyi helyzetben elemzik. Kiszámítják a 
deszorbeálódott vizsgált anyag mennyiségét. A deszorpciós egyen ­
súlyi helyzetben a talajban adszorbeáltan maradó vizsgáltanyag- tartalmat a vizsgált anyag oldatban lév ő egyensúlyi koncentráció ­
jának függvényében ábrázolják (lásd az Adatok és jelentés készítés 
című szakaszt és az 5. függeléket).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
Az elemzésb ől kapott adatokat táblázat formájában mutatják be (lásd 
6. függelék). Megadják az egyedi mérések eredményeit és a számí ­
tott átlagokat. Az adszorpciós izotermák grafikus megjelenítését is 
csatolják. A számításokat az alábbiakban leírtak szerint végzik.  
Feltételezik, hogy 1 cm  3 vizes oldat tömege 1 g. A talaj/oldat arányt 
tömeg/tömeg vagy tömeg/térfogatömeg/térfogat egységekben azonos 
mértékegységgel lehet kifejezni.  
2.1. ADSZORPCIÓ  
Az A t i adszorpciót a vizsgálati feltételek mellett a talajban adszor ­
beált anyagnak a vizsgálat kezdetekor jelen lév ő mennyiségéhez 
viszonyított százalékos arányban határozzák meg. Ha a vizsgált anyag stabil, és jelent ősen nem adszorbeálódik a tesztedény falán, 
az
 A t i értéket mindegyik ti id őpontban a következ ő egyenlet szerint 
számítják ki:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
ahol:  
A t i = adszorpció mértéke a t  i időpontban ( %);  
m s ads ðt i Þ = a vizsgált anyag talajban adszorbeált tömege t  i 
időpontban ( μg); 
m 0 = a vizsgált anyag tömege a kémcs őben a vizsgálat 
kezdetén ( μg). 
Az A t i százalékos adszorpció arányának a párhuzamos és a „folyta ­
tásos” módszer szerinti kiszámítására vonatkozó részletes információt 
az 5. függelék adja meg.  
A K  d megoszlási koefficiens a talaj fázisban lév ő anyagtartalom és a 
vizes oldatban található anyag tömegkoncentrációjának aránya azon vizsgálati feltételek mellett, amikor beáll az adszorpciós egyensúlyi helyzet.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
ahol:  
C s ads ðeqÞ = a talajban adszorbeált anyagtartalom adszorpciós 
egyensúlyi helyzetben ( μg.g -1 ) 
C aq ads ðeqÞ = az anyag tömegkoncentrációja a vizes fázisban 
adszorpciós egyensúlyi helyzetben ( μg.cm  -3 ). Ezt a 
koncentrációt analitikusan, a vakpróbákból származó 
értékek figyelembevételével határozzák meg;  
m s ads ðeqÞ = a vizsgált anyag talajban adszorbeálódott tömege 
adszorpciós egyensúlyi helyzetben ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = a vizsgált anyag tömege az oldatban adszorpciós 
egyensúlyi helyzetben ( μg) 
M talaj = a talajfázis mennyisége, talaj szárazanyag-tarta ­
lomban kifejezve (g)  
V 0 = a talajjal érintkez ő vizes fázis kiindulási térfogata 
(cm  3 ) 
The relation between Aeq and Kd is given by  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
ahol:  
A eq = az adszorpció mértéke adszorpciós egyensúlyi 
helyzetben, %.  
A szervesszén-tartalomra vonatkoztatott K  oc adszorpciós koefficiens 
a K  d megoszlási koefficienst a talajminta szervesszén-tartalmához 
viszonyítja:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
ahol:  
%OC = a szerves szén aránya a talajmintában (g g  -1 ). 
A K  oc koefficiens olyan érték, amely önmagában jellemzi a 
nagyobbrészt apoláros szerves vegyületeknek a talajok vagy üledékek szervesszén-tartalma és a víz közötti megoszlását. E vegy ­
szerek adszorpcióját a szorbeáló szilárd anyag szervesanyag-tartal ­
mával korrelálják (7); így a K
 oc értékek a humuszfrakciók specifikus 
jellemzőitől függnek, amelyek jelent ősen eltérnek szorpciós kapacitás 
tekintetében, az eredet, képz ődés stb. eltérései miatt.  
2.1.1.  Adszorpciós izotermák  
A Freundlich-féle adszorpciós izoterma egyenlet az adszorbeált vizs ­
gált anyag mennyiségét az egyensúlyi helyzetben lév ő oldatban talál ­
ható vizsgáltanyag-koncentrációjához viszonyítja (8. egyenlet).  
Az adatokat az „Adszorpció” cím ű pont alatt ismertetett módon 
kezelik, és mindegyik kémcs őben kiszámítják az adszorpciós vizs ­
gálat után a talajon adszorbeálódott vizsgált anyag tartalmat 
(C s ads ðeqÞ), amelyet máshol x/m-ként jelölnek). Feltételezik, hogy 
az egyensúlyi helyzet beállt, és a  C s ads ðeqÞ) az egyensúlyi értéket 
mutatja:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m talaj ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
:V 0 
m talaj (μg g  -1 ) (7) 
A Freundlich-féle adszorpciós egyenlet a következ ő (8): 
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads:C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
vagy lineáris formában:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
ahol:  
K F ads = Freundlich-féle adszorpciós koefficiens: 
mértékegysége cm  3 g -1 . ha 1/n = 1; minden más esetben 
az 1/n meredekséget a  K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n .g -1 dimen­
ziójában fejezik ki  
n = regressziós konstans; az 1/n általában 0,7–1,0 között 
van, ami azt jelzi, hogy a szorpciós adatok gyakran nem teljesen lineárisak.
 
A (8) és (9) egyenletet ábrázolják és a  K F ads és 1/n értékeket regresz ­
sziós analízissel elemzik a 9. egyenlet alkalmazásával. A logarit ­
musos egyenlet r  2 korrelációs koefficiensét is kiszámítják. Az ilyen 
ábrázolás egy példáját mutatja be a 2. ábra.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
2. ábra  Freundlich-féle adszorpciós görbe, normál és linearizált  
2.1.2.  Tömegegyensúly  
A tömegegyensúlyt (MB) az adszorpciós vizsgálatot követ ően anali­
tikusan visszanyerhet ő anyag és az anyagnak a vizsgálat kezdetekor 
meglévő névleges mennyisége arányaként határozzák meg.  
Az adatok kezelése attól függ, hogy az oldószer mennyiben 
elegyedik a vízzel. A vízzel elegyed ő oldószerek esetén a „Deszorp ­
ció” cím alatt ismertetett módon lehet az adatokat kezelni az oldószer 
kivonása révén visszanyert anyagmennyiség meghatározásához. Ha 
az oldószer kevésbé elegyedik a vízzel, meg kell határozni a vissza ­
nyert tesztanyagmennyiséget.  
Az adszorpciós tömegegyensúlyt (MB) a következ őképpen számítják 
ki; feltételezik, hogy a (mE) kifejezés megfelel a talajból és a teszt ­
edény faláról szerves oldószerrel extrahált tömegek összegének:  
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
ahol:  
MB = tömegegyensúly ( %)  
m E = a talajból és a tesztedény falairól két lépésben extrahált 
vizsgált anyag össztömege ( μg) 
C 0 = a talajjal érintkezésben lév ő vizsgált oldat kiindulási 
tömegkoncentrációja ( μg cm  -3) 
V rec = az adszorpciós ekvilibriumban visszanyert felülúszó térfo ­
gata (cm  3 . 
2.2. DESZORPCIÓ  
A (D) deszorpciót a vizsgálat feltételei mellett deszorbeált vizsgált 
anyagnak a korábban adszorbeált anyagmennyiségéhez viszonyítva 
határozzák meg:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
ahol:  
D t i = deszorpció mértéke t  i időpontban ( %)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = a vizsgált anyag talajból deszorbeált tömege t  i 
időpontban ( μg) 
m s ads ðeqÞ = a vizsgált anyag talajon adszorbeált tömege adszorp ­
ciós egyensúlyi helyzetben ( μg). 
A párhuzamos és „folytatásos” módszerek esetén a  D t i deszorpció 
arányának kiszámítására vonatkozó részletes információ az 5. függe ­
lékben található.  
A vizsgálati feltételek mellett a K  des látszólagos deszorpciós koeffi ­
ciens a talajfázisban maradó anyagtartalom és a vizes oldatban 
deszorbeálódott anyag tömegkoncentrációjának aránya a deszorpciós egyensúly elérésekor:
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
ahol:  
K des = deszorpciós koefficiens (cm  3 g -1 ) 
m aq des ðeqÞ = a vizsgált anyag talajból deszorbeálódott össztömege 
deszorpciós egyensúlyi helyzetben ( μg) 
V T = a talajjal érintkez ő vizes fázis össztérfogata a 
deszorpciós kinetikai kísérlet során (cm  3 ). 
Az m aq des ðeqÞ kiszámítására vonatkozó útmutatás az 5. függelékben a 
„Deszorpció” cím alatt található.  
Megjegyzés:  
Ha az el őbbi adszorpciós vizsgálatot a párhuzamos módszerrel 
végezték, a 12. egyenletben a V  T térfogat egyenl ő a V  0 térfogattal.  
2.2.1.  Deszorpciós izotermák  
A Freundlich-féle deszorpciós izoterma egyenlet a talajban adszor ­
beáltan maradó vizsgáltanyag-tartalmat a deszorpciós egyensúlyi helyzetben az oldatban maradó vizsgált anyag koncentrációhoz viszonyítja (16. egyenlet).
 
Az egyes kémcsövekre nézve a deszorpciós egyensúlyi helyzetben 
talajban adszorbeáltan maradó anyagtartalmat a következ őképpen 
számítják ki:  
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m talaj (μg g  -1 ) (13) 
definíciója:  
m aq des ðeqÞ ¼ m  m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m  aq A (μg) (14) 
ahol:  
C s des ðeqÞ = a talajon adszorbeálva maradó vizsgált anyagtar ­
talom deszorpciós egyensúlyi helyzetbe  11 (μg g  -1 ) 
m m des ðeqÞ = a vizsgált anyag analitikus módon meghatározott 
tömege a vizes fázisban deszorpciós egyensúlyi 
helyzetben ( μg) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = a vizsgált anyagnak az adszorpciós egyensúlyi 
helyzet elérését követ ően a tökéletlen folyadékeltá ­
volítás miatt fennmaradt tömege ( μg) 
m aq des ðeqÞ = az anyag tömege az oldatban adszorpciós egyensúlyi 
helyzetben ( μg) 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = a kémcs őből a vizsgált anyag mérésére kivett oldat térfo ­
gata deszorpciós egyensúlyi helyzetben (cm  3 ) 
V R = az adszorpciós egyensúlyi helyzet elérését követ ően 
a kémcs őből eltávolított telülúszó és azonos tértogatú 
0,01 M CaCl  2 -oldattal pótolt térfogat (cm  3 ) 
A Freundlich-féle deszorpciós egyenlet a következ ő: 
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
vagy lineáris formában:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n · log C  aq des ðeqÞ (17) 
ahol:  
K F des = Freundlich-féle deszorpciós koefficiens  
n = regressziós konstans  
C aq des ðeqÞ = az anyag tömegkoncentrációja a vizes fázisban 
deszorpciós egyensúlyi helyzetben ( μg.cm  -1 ). 
A 16. és 17. egyenletet ábrázolni lehet, és a  K F des és 1/n értékét a 17. 
egyenlet alapján regressziós analízissel számítják ki.  
Megjegyzés:  
Ha a Freundlich-féle adszorpciós vagy deszorpciós exponens 1/n 
egyenlő 1-gyel, a Freundlich-féle adszorpciós vagy deszorpciós 
kötési állandó ( K F ads és K  F des ) egyenl ő az adszorpciós, illetve 
deszorpciós egyensúlyi állandóval (K  d és K  des ), és a C  s ábrázolása 
a C  aq függvényében lineáris lesz. Ha az exponensek nem egyenl ők 1- 
gyel, a C  s ábrázolása a C  aq függvényében nem lineáris és az adszorp ­
ciós és deszorpciós állandók az izotermák mentén változnak.  
2.2.2.  Vizsgálati jelentés  
A vizsgálati jelentésben a következ ő információknak kell szerepel ­
niük:  
— a felhasznált talajminták részletes jellemzése, beleértve:  
— a származási hely földrajzi azonosítása (szélességi, hosszú ­
sági fok),  
— mintavétel dátuma,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— használat jellege (pl. term őföld, erdő stb.),  
— mintavételi mélység,  
— homok-/vályog-/agyagtartalom,  
— pH-értékek (0,01 M CaCl  2 -ben),  
— szervesszén-tartalom,  
— szervesanyag-tartalom,  
— nitrogéntartalom,  
— C/N arány,  
— kationcsere-kapacitás (mmol/kg),  
— a talajminták gy űjtésével és tárolásával kapcsolatos minden infor ­
máció,  
— adott esetben a vizsgált anyag adszorpciójának/deszorpciójának 
értelmezésére vonatkozó összes releváns információ,  
— az egyes paraméterek meghatározásához használt módszerek 
felsorolása,  
— a vizsgált anyagra vonatkozó információ (szükség szerint),  
— a vizsgálati h őmérsékletek,  
— a centrifugálás körülményei,  
— a vizsgált anyag elemzésénél alkalmazott analitikus eljárás,  
— a vizsgált anyag törzsoldatának elkészítéséhez használt bármi ­
lyen, oldódást segít ő anyag használatának indoklása,  
— a számításokban végrehajtott korrekciók magyarázata, ameny ­
nyiben releváns,  
— az adatlapon feltüntetend ő adatok (6. függelék) és a grafikonok,  
— a vizsgálati eredmények értelmezéséhez segítséget nyújtó minden 
információ és megfigyelés.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) Kukowski h. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045. Part II.
 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987) Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045. Part I.
 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ ­
Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): 
Application for registration of a pesticide. Section G. Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially 
dangerous to health or especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agricul ­
ture and Forestry, Braunschweig, Germany.  
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), FNRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena” in 
Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance 
ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.  
(14) Hasset J. J., and Banwart W. L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S. S. S. A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29-35.
 
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dish ­
burger H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and 
Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, 
AOAC, Washington DC.
 
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, pp. 185-190.
 
(18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Deter ­
mination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J. Agric. Food Chem., 18, pp. 524-528.  
(19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901-932.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269-273.  
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6- bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45-52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3, pp. 961-971.
 
(25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.  
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.  
(27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V. H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732-210.  
(29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization” in 
Organic chemicals in the soil environment (C. A. I. Goring 
and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G, 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide teachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340-350.  
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
 
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H. H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80-101.
 
(36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572-576.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.  
(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffici ­
ents, water solubilities, bioconcentration factors, and the para ­
chor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.  
(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. 
Proc. 32: pp. 222-234.
 
(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1-17.  
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C. A. I. and Hamaker J. W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
 
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
 
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparati ­
ons” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for dist ­
ributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documenta ­
tion, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. 
E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indust ­
rial sites.  
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesti ­
cide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc, 34, pp. 
353-354.  
(60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109-138.
 
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.  
(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique”. Weed Res. 21, pp. 227-231.  
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction 
of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Environ. Qual., 10(3), pp. 382-386.
 
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
„Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227-231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
 
(67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
 
(68) Lyman W. J., Reehl W. F. and Rosenblatt D. H. (1990). 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic 
Toxicology (eds J. G Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 
707, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compo ­
unds”. Science, Vol. 206, pp. 831-832.  
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C, 
(1981), „Sorption of /-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 
pp. 38-42.
 
(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833-846.
 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité”. 
Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 2493- 2504.  
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373- 1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – comparison of different stationary phases”. Chemosphere 27 (12), pp. 2341-2352.
 
(77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed 
Research, Vol. 7, pp. 29-36.  
(78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H. H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, ACS Symp. Ser. 259, American 
Chemical Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S. C. I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
 
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S. N. and Smith, D, 
(1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc, pp.3973-93.
 
(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.  
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint Internati ­
onal Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
1. függelék  
A vizsgálat terve
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
2. függelék  
AZ ELEMZÉSI MÓDSZER PONTOSSÁGÁNAK ÉS A 
KONCENTRÁCIÓ VÁLTOZÁSÁNAK HATÁSA AZ ADSZORPCIÓS 
EREDMÉNYEK PONTOSSÁGÁRA  
Az alábbi táblázatból (84) egyértelm űen kiderül, hogy amikor nagyon csekély a 
különbség az oldatban lév ő vizsgált anyag kiindulási tömege (m  0 = 110 μg) 
között, akkor az egyensúlyi koncentráció eredményének mérésekor bekövetkez ő 
5 % mérési hiba a talaj által adszorbeált anyag tömegének ( m aq ads ðeqÞ) kiszámí ­
tásakor 50 %-os hibát, a K  d kiszámításakor 52,4 %-os hibát eredményez. 
Talaj mennyisége m  talajl = 10 g 
Oldat térfogata V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
FOR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg vagy 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 valós 
érték 10 1,00 valós 
érték 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
FOR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg vagy 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 valós 
érték 60,0 6,00 valós 
érték 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FOR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg vagy 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 valós 
érték 108,9 10,89 valós 
érték 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m talaj: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m talaj 
m s ads ðeqÞ = a vizgált anyag tömege a szilárd fázisban, egyensúly esetén μg 
m aq ads ðeqÞ = a vizgált anyag tömege egyensúlyi vizes fázisban, μg 
C s ads ðeqÞ = a szilárd fázis tesztanyagtartalma egyensúlyban, μg, g  -1 
C aq ads ðeqÞ = a vizsgált anyag tömegkoncentrációja egyensúlyi vizes fázisban, μg cm  -3 
R = a  m aq ads ðeqÞ meghatározásakor elkóvetett analitikai hiba  
R‡ = az analitikai hiba (R) miatt bekövetkezó számítási hiba  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
3. függelék  
ELJÁRÁSOK A K  d ÉRTÉKÉNEK BECSLÉSÉRE  
1. Ezek a módszerek lehet ővé teszik a K  d értékének a becslését, vizsgálva a 
következő tényezők valamelyikével mutatott korrelációt: pl. P  ow értékek 
(12) (39) (63–68), vízoldhatósági adatok (12) (19) (21) (39) (68–73), 
vagy polaritási adatok, amelyek reverz fázisú HPLC-s vizsgálatokkal nyer ­
hetők (74–76). Az 1. és 2. táblázatban látható egyenletek alapján kiszá ­
mítják a K  oc és a K  om értékeit, ezután pedig indirekt módon a K  d -t az 
alábbi egyenletek alapján:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. E korrelációk alapgondolata két kiinduló feltételezésen alapul: (1) egy adott 
anyag adszorpcióját f őként a talaj szervesanyag-tartalma befolyásolja; és (2) 
a lezajló kölcsönhatások túlnyomórészt nem poláros jelleg űek. Ennek ered ­
ményeként, ezek az összefüggések: (1) nem vagy csak bizonyos mértékig alkalmazhatók a poláros anyagokra; és (2) nem alkalmazhatók olyan esetek ­
ben, amikor nagyon csekély a talaj szervesanyag-tartalma (12). Ezenfelül 
bár kielégít ő bizonyossággal megállapítható a korreláció a P
 ow értéke és az 
adszorpció mértéke között (1), nem mondható el ugyanez a vízoldhatóság és az adszorpció mértéke közötti összefüggésr ől (19) (21), ahol az eddigi 
vizsgálatok er ősen ellentmondásos eredményekre vezettek.
 
3. Az adszorpciós koefficiens és az oktanol/víz megoszlási koefficiens közötti 
korrelációra, valamint a vízoldhatóságra vonatkozó néhány példa szerepel az 1., illetve 2. táblázatban.
 
1. táblázat:  
Példák az adszorpciós megoszlási koefficiens és az oktanol/víz megoszlási koefficiens közötti korrelációra: 
további példákért lásd (12) (68)  
Anyagok Korreláció Szerz ők 
Szubsztituált ureák log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Animás klórozott vegyületek log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  a al . (1983) (65) 
Különféle peszticidek log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gersel és Mingelgrin (1984) (66) 
Aromás szénhidrogének log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles és Mantoura (1987) (67)  
2. táblázat:  
Példák az adszorpciós megoszlási koefficiens és a vízoldhatóság közötti korrelációra; további példákért lásd 
(68) (69)  
Anyagok Korreláció Szerz ők 
Különféle peszticidek log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl és Mingelgrin (1984) (66) 
Alifás, aromás klórozott 
vegyületek log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
Alfa-naftol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Ciklikus, alifás aromás 
vegyületek log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,0095,3 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Különféle vegyületek log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
4. függelék  
SZÁMÍTÁSOK A CENTRIFUGÁLÁS KÖRÜLMÉNYEINEK MEGHATÁ ­
ROZÁSÁHOZ  
1. A centrifugálás idejét az alábbi képlettel lehet kiszámítani, gömb formájú 
részecskéket feltételezve:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Az egyszer űsítés érdekében a paraméterek itt nem SI mértékegységben 
vannak megadva (g, cm).  
ahol:  
ω = forgási sebesség (= 2 p pm/60) rad s  -l 
rpm = fordulatszám/perc  
η = oldat viszkozitása, g s  -1 cm -1 
r p = részecske sugara, cm  
ρ s = talaj s űrűsége, g cm  3 
ρ aq = oldat s űrűsége, g cm  3 
R t = a centrifuga rotorjának középpontja és a centrifugacs őben lévő 
oldat teteje közötti távolság, cm  
R b = a centrifuga rotorjának középpontja és a centrifugacs ő alja 
közötti távolság, cm  
R b – R  t = a centrifugacs őben lévő talaj/oldat keverék hossza, cm  
A bevett gyakorlat szerint a számított id őértékek kétszerese biztosítja a 
tökéletes szétválasztást.  
2. Az (1) egyenlet tovább egyszer űsíthető, ha az oldat viszkozitását ( η) és 
sűrűségét (ρ aq ) azonosnak tekintjük a 25  o C hőmérséklet ű víz viszkozitá ­
sával és s űrűségével; tehát η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 és ρ aq = 1,0 g.cm  -3 . 
Ebből adódóan a centrifugálási id ő hosszát a (2) egyenlet adja meg:  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. A (2) egyenlet alapján nyilvánvaló, hogy a centrifugálás körülményeinek, 
azaz az id ő (t) és a sebesség (rpm) meghatározása során alapvet ően két 
paraméter fontos, annak érdekében, hogy el lehessen különíteni meghatá ­
rozott méret ű récsecskéket (a mi esetünkben a 0,1 mm sugarúakat); (1) a 
talaj sűrűsége és (2) a centrifugacs őben lévő elegy hossza (R  t -R b ), azaz 
azon távolság, amelyet az oldat felszíni tet őpontja és a cs ő alja között egy 
talajrészecske megtesz; nyilvánvaló, hogy egy rögzített térfogat esetében a csőben lévő elegy hossza a cs ő sugara négyzetének függvénye.
 
4. Az 1. ábra bemutatja a centrifugálás id őtartamát (t) különböz ő talaj sűrű­
ségek esetében, a centrifugálás sebességének függvényében, az 1b. ábra pedig ugyanezt a keverék hosszának a centrifugacs őben függvényeként 
ábrázolja. Az 1a. ábrából egyértelm űen látható a talaj s űrűsűge által gyako ­
rolt hatás; például egy átlagosnak mondható 3000 ford/perc fordulatszám mellett a centrifugálási id ő megközelít őleg 240 perc, 1,2 g cm
 -3 talajsűrűség 
esetén, míg mindössze 50 perc a 2,0 cm  -3 sűrűségű talaj esetén. Hasonló ­
képpen, az 1b. ábra alapján, egy átlagosnak mondható 3000 ford/perc 
fordulatszám mellett a centrifugálási id ő mintegy 50 perc egy 10 cm hosszú 
elegy esetén, míg mindössze 7 perc egy 1 cm hosszú elegy esetén. Fontos azonban megtalálni a centrifugálási paraméterek közötti optimális egyen ­
súlyt, ahol a lehet ő legkisebb mintahosszra van szükség, és ami lehet ővé 
teszi a kísérletez ő számára a fázisok centrifugálást követ ő elkülönítését.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Továbbá a talaj/oldat fázisok elválasztása kísérleti feltételeinek meghatá ­
rozásakor fontos figyelembe venni egy harmadik „pszeudofázis”-t, a kollo ­
idok lehetséges jelenlétét. Ezek a 0,2 mm-nél kisebb méret ű anyagré ­
szecskék jelent ős hatást gyakorolhatnak az anyag egész adszorpciós mecha ­
nizmusára a talaj szuszpenzióban. Ha a centrifugálást a fent leírtak szerint 
hajtják végre, akkor a kolloidok a vizes fázisban maradnak, és azzal együtt 
kerülnek elemzésre. Az általuk gyakorolt hatásra vonatkozó információk ezért elvesznek.
 
Ha a kísérletet végz ő laboratórium rendelkezik ultracentrifugával vagy 
ultraszűrő berendezésekkel, akkor elmélyültebben lehet tanulmányozni az 
anyag talajban való adszorpcióját, illetve deszorpcióját, beleértve az 
anyagnak a kolloidrészecskék felületén bekövetkez ő adszorpcióját. Ebben 
az esetben 60 000 rpm fordulatszámú ultracentrifugálást vagy 100 000 Dalton porozitású ultrasz űrőt kell használni a három fázis, azaz a talaj, a 
kolloidok és az oldat szétválasztására. A vizsgálat menetét ezért ennek 
megfelelően úgy kell módosítani, hogy mindhárom fázist alá lehessen 
vetni az anyagokra vonatkozó elemzésnek.
 
1a. ábra:
  
A centrifugálási id ő (t) változása a centrifugálás sebességének (rpm) függ ­
vényében, különböz ő talajsűrűségek (p  s ) mellett. R  t = 10 cm, R  b – R  t = 
10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g.s -1 cm -1 és ρ aq = 1,0 g.1 cm  -3 25 o C-on  
1b. ábra:
  
A centrifugálási id ő (t) változása a centrifugálás sebességének (rpm) függ ­
vényében, a centrifugacs őbe helyezett keverék különböz ő hosszúsága 
esetén, (R  b – R  t ) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10-  3 g.s-  1 cm-  1 , ρ aq = 
1,0 g.cm-  3 25 o C-on és ρ s = 2,0 g.cm-  3 mellett.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
5. függelék  
AZ ADSZORPCIÓ (A, %) ÉS A DESZORPCIÓ (D, %) KISZÁMÍTÁSA  
Az eljárás id őskálája a következ ő:
 
Valamennyi számítás esetében feltételezzük, hogy a vizsgált anyag stabil, és nem 
adszorbeálódik jelent ős mértékben az edény falán.  
ADSZORPCIÓ (A %)  
a) Párhuzamos módszer  
Minden egyes kémcs őre (i) és minden egyes id őpontra (t  i ) nézve az alábbi 
képlet alapján kell a százalékos adszorpciót kiszámítani:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Az egyenlet elemei az alábbi módon számíthatók ki: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
ahol:  
A t i = százalékos adszorpció ( %) t  i időpontban  
m s ads ðt i Þ = a vizsgált anyag talajon mért tömege a t  i időpontban, amikor 
a vizsgálatot végrehajtják (mg)  
m 0 = a vizsgált anyag tömege a kémcs őben, a vizsgálat kezdetén 
(mg)  
C 0 = a talajjal érintkez ő vizsgák oldat kiindulási tömegkoncentrá ­
ciója (mg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ = az anyag tömegkoncentrációja vizes fázisban abban a t  i 
időpontban, amikor az elemzést végzik (mg cm  -3 ); e 
koncentráció meghatározása analitikai úton történik, figye ­
lembe véve a vak próbákkal kapott értékeket  
V 0 = a talajjal érintkez ő vizsgálati oldat kimdulási térfogata (cm  3 ) 
A százalékos adszorpció értékeit  A  t i ill. C aq ads ðt i Þ az idő függvényében 
grafikusan kell ábrázolni, valamint meg kell határozni azt az id őt, amelyre 
a szorpciós ekvilibrium eléréséhez szükség volt. Az ilyen grafikus ábrázolás 
példáját az 1., illetve 2. ábra mutatja be.
  
1. ábra  
Adszorpciós egyensúly grafikus ábrázolása
  
2. ábra  
A vizsgált anyag tömegkoncentrációja vizes fázisban (C  aq ) az idő függ­
vényében  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) „Folytatásos” módszer  
Az alábbi egyenletek figyelembe veszik, hogy az adszorpciós eljárás végre ­
hajtása során a vizes fázis kis aliquotáiban a vizsgált anyagot meghatározott időtartamonként mérik.
 
— Minden egyes id őtartam során a vizsgált anyag talajon adszorbeálódott 
mennyiségét az alábbi módon lehet kiszámítani:  
— az els ő Δ ti = t i – t 0 időintervallumra nézve:  
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— a második id őintervallumra nézve:  
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— a harmadik Δt 3 = t 3 – t 2 időintervallumra nézve:  
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · V 0 Ä 2 · v a A 
v a A   !  (6) 
— az n-edik Δt n = t n – t n-1 időintervallumra nézve:  
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Az egyes id őintervallumokra vonatkozó százalékos adszorpció  A Δt i az 
alábbi egyenlet segítségével számítható ki:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
(ðA t i Þ) időpontra vonatkozó százalékos adszorpciót az alábbi egyenlet 
adja:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Az adszorpció  A t i ill. A Δt i értékeit (a vizsgálat igényei szerint) az id ő 
függvényében grafikusan kell ábrázolni, valamint meg kell határozni azt 
az időt, amelyre a szorpciós egyensúly eléréséhez szükség volt.  
— A t  eq ekvilibrációs id ő elteltével:  
— a vizsgált anyag talajon adszorbeálódott tömege:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— a vizsgált anyag oldatban lév ő tömege  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— és a százalékos adszorpció egyensúlyi állapotban:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100ð%Þ (12) 
A fent használt paraméterek jelentése az alábbi:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = a talajon adszorbeált tesztanyag 
tömege a Dt  1 , Dt  2 … illetve Dt  n 
időintervallumban (mg)  
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = a ( v a A ) aliquotokban, a t  1 , t 2 ,..., 
t n időpontban mért tesztanyag 
tömege (μg) 
m s ads ðeqÞ = az anyag talajon adszorbeáló ­
dott tömege adszorpciós egyen ­
súlyi helyzetben (mg)  
m aq ads ðeqÞ = az anyag tömege az oldatban 
adszorpciós egyensúlyi hely ­
zetben (mg)  
v a A = a vizsgált anyag mérésére hasz ­
nált aliquot térfogata (cm  3 ) 
A Δt i = a százalékos adszorpció 
mértéke adott Dt  i időinterval­
lumban ( %)  
A eq = a százalékos adszorpció 
adszorpciós egyensúlyi hely ­
zetben ( %).  
DESZORPCIÓ D ( %)  
Azt a t  0 időpontot tekintik a deszorpciós kinetikai kísérlet kezdetének, amikor a 
vizsgált anyagot tartalmazó oldat maximálisan (az adszorpciós egyensúly elérését 
követően) kinyert térfogatát ugyanolyan térfogatú 0,01 M CaCl  2 -oldattal pótolják.  
a) Párhuzamos módszer  
A t i időpontban megmérik az i (  V  i 
r Ê Ì  
) próbacs őből vett vizes fázisban lév ő 
vizsgált anyag tömegét, és a deszorbeálódott tömeget az alábbi egyenlet 
segítségével számítják ki:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
A deszorpciós ekvilibriumban t  i = t eq és ezért  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
A (Δ ti ) időszak során deszorbeálódott vizsgált anyag tömege az alábbi 
egyenlettel számítható ki:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
A százalékos deszorpció kiszámítható:  
a t i időpontra nézve az alábbi egyenlettel:  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
és a (Δ ti ) időintervallumra nézve az alábbi egyenlettel:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
ahol a fent használt paraméterek jelentése az alábbi:  
D t i = százalékos deszorpció a t  i időpontban ( %)  
D Δt i = a Δt i intervallumnak megfelel ő százalékos deszorpció ( %)  
m aq des ðt 1 Þ = a vizsgált anyag deszorbeálodott tömege a t  i időpontban 
(μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ = a vizsgált anyag deszorbeálodott tömege a D  ti időinterval­
lumban (μg) 
m m des ðt i Þ = a vizsgált anyag t  i időpontban analitikus módon mért 
tömege a  V r i térfogatú oldatban, amelyet az elemzés céljára 
vettek ki ( μg) 
m aq A = a vizsgák anyagnak az adszorpciós ekvilibrium elérését 
követően a tökéletlen folyadékeltávolítás miatt a talajban 
maradt tömege ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = az anyag tömege az oldatban adszorpciós egyensúlyi hely ­
zetben (μg) 
V R = az adszorpciós egyensúlyi helyzet elérését követ ően a 
kémcsőből eltávolított, és azonos térfogatú 0,01 M CaCl  2 
oldattal pótolt felülúszó-térfogat, (cm  3 ) 
V r i = Az (i) kémcs őből a vizsgált anyag mérésére kiemelt oldat 
térfogata a deszorpciós kinetikai kísérletben (cm  3 ) 
A D t i , illetve a  D Δt i deszorpciós értékeket (a vizsgálat igényei szerint) az 
idő függvényében grafikusan kell ábrázolni, valamint meg kell határozni azt 
az időt, amelyre a deszorpciós egyensúly eléréséhez szükség volt.  
b) „Folytatásos” módszer  
Az alábbi egyenletek figyelembe veszik azt, hogy a deszorpciós vizsgálatot 
megelőző adszorpciós vizsgálatot a vizes fázis kis aliquotáiban ( ðv A 
a Þ) lévő 
vizsgált anyag mennyiségének mérésével hajtották végre (lásd az „1.9. A 
vizsgálat végrehajtása” pontban ismertetett soros módszert). Feltételezzük, hogy: a) a felülúszó azon mennyiségét, amelyet a kémcs őből az adszorpciós 
kinetikai kísérletet követ ően eltávolítanak, azonos térfogatú 0,01 M CaCl
 2 - 
oldattal (V  g ) pótolják; és b) a vizes fázisnak az adszorpciós kinetikai 
kísérlet során a talajjal érintkez ő össztérfogata (V  T ) a deszorpciós vizsgálat 
során konstans marad és kiszámítható az alábbi egyenlettel:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Egy t  i időpontban:  
— A vizsgált anyag mennyiségét egy kivett kis térfogatban (  v a D Ê Ì  
) 
meghatározzuk, és a deszorbeálódott tömeg az alábbi egyenlet segít ­
ségével kiszámítható:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— A deszorpciós ekvilibriumban t  i = t eq és ezért  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
— A százalékos deszorpció  D t i a következ ő egyenlet segítségével számít ­
ható ki:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Egy adott ( Δt i ) időintervallumban:  
Minden egyes id őintervallumra nézve a deszorbeálódott anyag mennyisége 
az alábbiak szerint számítható ki:  
— az els ő Δt 1 = t 1 – t 0 időintervallumra nézve:  
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— a második Δt 2 = t 2 – t 1 időintervallumra nézve:  
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
and 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— az n-dik Δt n = t n – t n-1 intervallumra nézve:  
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
and 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Végül, az egyes id őintervallumokra vonatkozó százalékos deszorpció  D Δt i az alábbi egyenlettel számítható ki:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
a t i időpontra vonatkozó  D t i százalékos deszorpció az alábbi egyenlettel 
számítható ki:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
ahol a fent használt paraméterek jelentése az alábbi:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = a talajon adszorbeálva maradó 
vizsgált anyag tömege a Δt 1 , 
Δt 2 …, illetve Δt n időintervallum 
után (μg) 
m aq des ðΔt 1 Þ, m aq des ðΔt 2 Þ,... , m aq des ðΔt n Þ = a Δt 1 , Δt 2 ..., illetve Δt n időinter­
vallum során deszorbeálódott 
vizsgák anyag tömege ( μg) 
m m des ðt 1 Þ, m m des ðt 2 Þ,... , m m des ðt n Þ = a (  v D 
a Ê Ì  
) aliquotokban, a t  1 , t 2 , 
… illetve t  n időpontban mért 
tesztanyag tömege ( μg) 
V T = a talajjal érintkezésben lév ő 
vizes fázis össztérfogata a.„foly ­
tatásos” mód- szerrel végrehaj ­
tott deszorpciós kinetikai kíséri 
a során (cm  3 ) 
m A 
aq = a vizsgált anyagnak az adszorp ­
ciós egyensúlyi helyzet elérését követően a tökéletlen folyadé ­
keltávolítás miatt visszamaradó 
tömege (μg)
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = az adszorpciós egyensúlyi 
helyzet elérését követ ően a 
kémcsőből eltávo- lított felül ­
úszó és azonos térfogatú 0,01 M CaCl
 2 -oldattal pótok térfogat 
(cm  3 ) 
v D 
a = az (i) kémcs őből a vizsgált 
anyag mérésére kiemelt aliquot térfogata a „folytatásos” 
módszerrel végzett deszorpciós 
kinetikai kísérletben (cm
 3 ) 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
6. függelék  
TALAJON TÖRTÉN Ő ADSZORPCIÓ/DESZORPCIÓ VIZSGÁLATA: ADATKÖZL Ő LAPOK  
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Bemért talajmennyiség g 
Talaj száraz tömege g 
CaCl  2 -oldat térfogata cm  3 
Az oldat névleges végkoncentrációja μg cm  -3 
Az oldat analitikai módszerrel meghatározott végkoncent ­
rációja μg cm  -3 
Az alkalmazott analitikai módszer alapelve:  
Az analitikai modell kalibrálása:  
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Az alkalmazott analitikai módszertan: Közvetett  □ Párhuzamos  □ Közvetlen  □ 
Serial □ 
Adszorpciós vizsgálat: vizsgált minták  
Jele Mértékegy ­
sége Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő 
Kémcsövek száma 
Bemért talajmennyiség — S 
Talaj száraz tömege m  talaj g 
A bemért talajban jelen lev ő víz 
(kiszámított) térfogata V ws cm 3 
A talaj ekvilibrálásához felhasz ­
nált 0,01 M CaCl  2 -oldal térfo ­
gata cm 3 
Törzsoldat térfogata cm  3 
A talajjal érintkezésben lév ő 
vizes fázis össztérfogata v 0 cm 3 
A vizsgált oldat kiindulási 
koncentrációja C 0 μg.cm  -3 
A vizsgált anyag tömege a 
vizsgálat kezdetén m 0 μg ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Jele Mértékegy ­
sége Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő Ekvilibrációs 
idő 
Rázatás és centrifugálás után  
KÖZVETETT MÓDSZER 
Párhuzamos módszer 
A vizsgált anyagnak a vakpróba 
értékeivel korrigált koncentrá ­
ciója a vizes fázisban  C aq ads ðt i Þ μg.cm  -3 
Folytatásos módszer 
A vizsgált anyag VAa 
aliquotban mért tömege  m m ads ðt i Þ μg 
KÖZVETLEN MÓDSZER 
A vizsgált anyag talajon 
adszorbeálódott tömege  m s ads ðt i Þ μg 
Adszorpció kiszámítása 
Adszorpció  A  t i % 
A Δt i % 
Átlagok 
Adszorpciós koefficiens K  d cm 3 .g -1 
Átlagok 
A szerves széntartalomra számí ­
tott adszorpciós koefficiens K oc cm 3 .g -1 
Átlagok  
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adszorpciós vizsgálat: vakpróbák és kontroll  
Jele Mérték- 
egysége Vakpróba Vakpróba Kontroll  
Kémcsövek száma 
Bemért talajmennyiség S 0 0 Víz mennyisége a bemért talajban 
(számított) cm
 3 — — 
A hozzáadott 0,01 M CaCl  2 -oldat 
térfogata cm 3 
A vizsgált anyag hozzáadott törzs ­
oldatának térfogata cm 3 0 0 
A vizes fázis össztérfogata (számitott) cm  3 — —  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Jele Mérték- 
egysége Vakpróba Vakpróba Kontroll  
A vizsgált anyag kiindulási koncent ­
rációja vizes fázisban μg.cm  -3 
Rázatás és centrifugálás után 
Koncentráció a vizes fázisban μg.cm-  3 
Megjegyzés: szükség szerint a táblázat további oszlopokkal b ővíthető. 
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Tömegegyensúly  
Jele Mérték- 
egyscége  
Kémcsövek száma 
Bemért talajmennyiség — g 
Talaj száraz tömege m  talaj g 
Viz mennyisége a bemért talajban (szá ­
mított) V ws ml 
A talaj ekvilibrálásához felhasznált 0,01 
M CaCl  2 -oldat térfogata ml 
Törzsoldat térfogata cm  3 
A talajjal érintkezésben lév ő vizes fázis 
össztérfogata V 0 cm 3 
A vizsgált oldat kiindulási koncentrációja C  0 μg.cm  -3 
Ekvilibrációs id ő — h  
Rázatás és centrifugálás után  
A tesztanyagnak a vakpróba értékeivel 
korrigált koncentrációja adszorpciós 
egyensúlyban  C aq ads ðeqÞ μg.cm  -3 
Ekvilibrációs id ő t  eq h 
Első hígítás oldószerrel 
Vizes fázis eltávolított térfogata V  rec cm 3 
Oldószer hozzáadott térfogata Δv cm  3 
Első extrakció oldószerrel 
Oldószerben analizált jel S  E1 var. 
A vizsgált anyag koncentrációja az 
oldószerben C E1 μg.cm  -3 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Jele Mérték- 
egyscége  
A talajból és az edény falairól extrahált 
anyag tömege m El μg.cm  -3 
Második hígítás oldószerrel 
Az oldószer eltávolított mennyisége ΔV s cm 3 
Az oldószer hozzáadott mennyisége Δv’ cm  3 
Második extrakció oldószerrel 
Oldószerben analizált jel S  E2 van 
A vizsgált anyag koncentrációja az 
oldószerben C E2 μg.cm  -3 
A talajból és az edény falairól extrahált 
anyag tömege M E2 μg 
A vizsgált anyag két lépésben extrahált 
össztömege m E μg 
Tömegegyensúly MB %  
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adszorpciós izotermák  
Jele Mértékegy ­
sége 
Kémcsövek száma 
Bemért talajmennyiség — g 
Talaj száraz tömege E g 
Víz térfogata a bemért talajban 
(számított) V WS cm 3 
A talaj ekvilibrálásához felhasz ­
nált 0,01 MCaCl  2 -oldat terfbgata cm 3 
A hozzáadott törzsoldat térfo ­
gata cm 3 
A talajjal érintkezésben lév ő 
vizes fázis össztérfogata (számí ­
tott) V 0 cm 3 
Oldat koncentrációja C  0 μg •cm  -3 
Ekvilibrációs id ő — ó  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Jele Mértékegy ­
sége 
Rázatás és centrifugálás ulán  
A vizsgált anyagnak a vakpróba 
értékeivel korrigált koncentrá ­
ciója a vizes fázísban  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Hőmérséklet  o C 
1 g talaj által adszorbeált tesz ­
lattyag tömege  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressziós analízis:  
A K  ads F értéke:  
Az l/n értéke:  
Regressziói koefficiens. r  2 : 
A vizsgált anyag megnevezése:  
A vizsgált talaj:  
A talaj szárazanyag-tartalma (105  o C, 12 óra): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . %  
Hőmérséklet: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Az alkalmazott analitikai módszertan: Közvetett  □ Párhuzamos  □ „Folytatá ­
sos” □ 
Közvetlen  □ 
Deszorpciós vizsgálat  
Jele Mértékegysége Időinter­
vallum Időinter­
vallum Időinter­
vallum Időinter­
vallum  
Az adszorpciós lépésb ől kapott próbacs ő 
száma 
A talajon adszorbeált vizsgált anyag 
tömege, adszorpciós egyensúlyi hely ­
zetben  m s ads ðeqÞ μg 
A 0,01 M 0,01 M CaCl  2 -oldattal pótolt 
vizes fázis eltávolított mennyiségének térfogata V
 0 V R cm 3 
A talajjal érintkezésben 
levő vizes fázis össztérfo ­
gata PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
A vizsgált anyagnak az adszorpciós 
egyensúlyi helyzet elérését követ ően, a 
tökéletlen térfogat helyettesítés miatt 
fennmaradt tömege  m aq A μg 
Deszorpciós kinetika  
A t i időpontban a talajból deszorbeálódott 
vizsgált anyag tömege (számított érték)  m m des ðt i Þ μg 
Az (i) kémcs őből a vizs­
gált anyag mérése PM V  i r cm! 
SM V  D a cm 3 
A t i időpontban a talajból deszorbeálódott 
vizsgált anyag tömege (számított érték)  m aq des ðt i Þ μg 
A Δti időintervallumban a talajból 
deszorbeálódott vizsgált anyag tömege (számított érték)
 m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Jele Mértékegysége Időinter­
vallum Időinter­
vallum Időinter­
vallum Időinter­
vallum  
Deszorpciós százalék  
Deszorpció a t  i időpontban D  ti % 
Deszorpció a Δt i idóintervallumban  D  Δt i % 
Látszólagos deszorpciós koefficiens K  des 
PM: = párhuzamos módszer  
SM: = folytatásos módszer  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ADSZORPCIÓS EGYÜTTHATÓ BECSLÉSE TALAJON ÉS 
SZENNYVÍZISZAPON NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYA ­
DÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (HPLC)  
1. MÓDSZER  
E módszer megfelel az OECD TG121-nek (2001).  
1.1. BEVEZETÉS  
Anyagok talajokon és szennyvíziszapokon mutatott szorpciós (meg ­
kötődési) viselkedését a C.18 vizsgálati módszer használatával kísér ­
letileg meghatározott paraméterek révén lehet leírni. Az egyik fontos paraméter az adszorpciós koefficiens, amely az adott anyagnak talajban/iszapban fennálló koncentrációja és ugyanazon anyag vizes 
fázisban, adszorpciós egyensúlyi helyzetben rögzíthet ő koncentrá ­
ciója közötti arányként fejezhet ő ki. A talaj K
 oc szervesszén-tartal ­
mára vonatkoztatott adszorpciós koefficiens megmutatja, hogy a vegyi anyag mennyire képes köt ődni a talaj vagy a szennyvíziszap 
szervesanyag-tartalmához, és lehet ővé teszi az összehasonlítást 
különböző vegyi anyagok között. E paraméter értékét a vízoldha ­
tóság és az n-oktanol/víz megoszlási koefficiens közötti korreláció révén lehet megbecsülni (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Az e vizsgálatban leírt kísérleti módszer nagyhatékonyságú folya ­
dékkromatográfot (HPLC) használ a talajokon és szennyvíziszapokon 
mutatott K  oc adszorpciós koefficiens becsléséhez (8). A becsült ered ­
mények megbízhatóbbak a QSAR módszerrel (9) kaphatóknál. Becs ­
lési módszer lévén nem képes teljeskör űen kiváltani a C.18 vizsgálati 
módszer esetében használt tömeges egyensúlyi kísérleteket. A K  oc 
becsült értékének ismerete azonban hasznos lehet a 
C.18 módszernek megfelel ően végzend ő adszorpciós/deszorpciós 
vizsgálatokhoz szükséges, megfelel ő vizsgálati paraméterek kiválasz ­
tásakor, a K  d (megoszlási koefficiens) vagy a K  f (Freundlich-féle 
adszorpciós koefficiens) értékének a 3. egyenlet szerinti kiszámítá ­
sánál (lásd 1.2. szakasz).  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
K d : a megoszlási koefficiens (szilárd anyag/víz) egy olyan vizsgált 
anyag „C” egyensúlyi koncentrációértékeinek az arányaként fejez ­
hető ki, amely anyagot egy szorbensb ől (talaj vagy szennyvíziszap) 
és egy vizes fázisból álló, kétfázisú rendszerben oldanak fel; ez egy 
dimenzió nélküli érték, mivel a koncentráció értékét mindkét 
fázisban tömeg/tömeg fejezik ki. Ha a koncentráció vizes fázisbeli értékét tömeg/térfogat alapon adják meg, akkor a mértékegység ml/g
 - 
l . A K  d értéke a szorbens anyag tulajdonságaitól függ ően változhat, 
és függhet a koncentrációtól.  
K d ¼ C talaj 
C aq vagy  C iszap 
C aq (1) 
ahol:  
C talaj = talajban lév ő vizsgált anyag koncentrációja egyensúlyi 
helyzetben ( μg.g -1 ) 
C iszap = az iszapban lév ő vizsgált anyag koncentrációja egyen ­
súlyi helyzetben ( μg.g -1 ) 
C aq = a vizes fázisban lév ű vizsgált anyag koncentrációja 
egyensúlyi helyzetben ( μg.g -1 , μg.ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : a Freundlich-féle adszorpciós koefficiens a vizsgált anyag 
talajban vagy szennyvíziszapban mért (x/m) koncentrációjaként hatá ­
rozható meg, akkor, amikor az C  aq egyensúlyi koncentráció a vizes 
fázisban l-gyel egyenl ő; a mértékegység mg.g  -1 szorbens. Ez az érték 
a szorbens anyag tulajdonságaival együtt változhat.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
ahol:  
x/m = egyensúlyi helyzetben lév ő szorbens anyag m (gramm) 
mennyiségében elnyelt vizsgált anyag x mennyisége (mg)  
l/n = a Freundlich-féle adszorpciós izoterma meredeksége  
C aq = a vizsgált anyag koncentrációja vizes fázisban egyensúlyi 
helyzetben ( μg.ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc = a szorbens anyag szervesszén-tartalmában (f  oc ) kifejezett K  d 
megoszlási koefficiens vagy K  f Freundlich-féle adszorpciós koeffici ­
ens; különösen a nem ionos vegyi anyagok esetében ez egy közelít ő 
pontosságú jelz őszáma az anyag és a szorbens közti adszorpció 
mértékének, és összehasonlításokat tesz lehet ővé különböz ő vegyi 
anyagok között. A K  d és K  f mértékegységét ől függően a K  oc 
dimenzió nélküli érték lehet, vagy mg × g  _1 vagy mg × mf  1 szerves 
anyag mértékegységgel fejezhet ő ki. 
Koc ¼ Kd 
foc dimenzió nélküli vagy ml ·g Ä1 Ê Ì  
vagy  Kf 
foc μg · g Ä1 Ê Ì  (3) 
A K  oc és K  d közötti összefüggés nem mindig lineáris, és ezért a K  oc 
értékei talajonként változhatnak, azonban változékonyságuk a K  d 
vagy a K  f értékeihez képest kis mérték ű. 
A K  oc adszorpciós koefficiens a (k) kapacitási faktorból vezethet ő le, 
felhasználva a kiválasztott referenciavegyületekb ől levezetett log k' / 
log K  oc kalibrációs görbét.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
ahol:  
t R = a vizsgált- és referenciaanyagok HPLC-s retenciós ideje 
{perc}  
t 0 = a HPLC holtideje (perc) (lásd 1.8.2. szakasz)  
P OW : Az oktanol/víz megoszlási koefficiens az n-oktanolban és 
vízben lév ő oldott anyag koncentrációértékeinek az arányaként fejez ­
hető ki: ez dimenzió nélküli érték.  
P ow ¼ C oktanol  
C aq ð¼ K ow Þ (5) 
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
A módszer használata el őtt meg kell ismerni az anyag szerkezeti 
képletét, tisztaságát és disszociációs állandóját (ha ez értelmezhet ő). 
A vízben és szerves oldószerekben való oldhatóságra, az oktanol/víz 
megoszlási koefficiensre és a hidrolízis során mutatott tulajdonsá ­
gokra vonatkozó információk ismerete is hasznos.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Ahhoz, hogy meg lehessen állapítani egy vizsgált anyag mért HPLC- 
retenciósid ő-adatai és K  oc adszorpciós koefficiense közötti korrelá ­
ciót, előbb meg kell szerkeszteni a log k' / log K  oc kalibrációs görbét. 
Ehhez legalább hat referenciapontot kell használni, egyet-egyet a vizsgált anyag várt értéke alatt, illetve fölött kiválasztva. A módszer 
pontossága lényegesen javul, ha olyan referenciaanyagokat használ ­
nak, amelyek szerkezetüket tekintve hasonlóak a vizsgált anyaghoz. Ha ilyen adatok nem állnak rendelkezésre, akkor a felhasználónak kell kiválasztania a megfelel ő kalibrációs anyagokat. Ebben az 
esetben általánosabb, strukturálisan heterogén anyagokat kell kivá ­
lasztani. A javasolt referenciaanyagok és ezek K
 oc -értékeinek jegy ­
zéke a függelékben található, az 1. táblázatban a szennyvíziszapra, illetve a 3. táblázatban a talajra vonatkozóan. Más kalibrációs 
anyagok kiválasztását meg kell indokolni.
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
A HPLC módszerhez a kereskedelemben kapható és lipofil és 
poláros oldalláncokat tartalmazó ciánopropil szilárd fázissal töltött analitikai kolonnákat használnak. Közepesen poláris, szilika alapú 
állófázis használatos: 
–O -Si –CH
 2 – CH  2 – CH  2 –CN 
szilika nem poláris közeg poláris oldal ­
lánc 
A vizsgálati módszer alapelve hasonló az A.8. módszerhez (megosz ­
lási koefficiens, HPLC módszer). Miközben a vizsgált anyag a mozgófázissal együtt végighalad a kolonnán, a vizsgált anyag reak ­
cióba lép az állófázissal. A mozgó- és állófázis közötti megoszlás 
eredményeként a vizsgált anyag késleltetetten jelenik meg. A poláris és nem poláris köt őhelyekkel egyaránt rendelkez ő állófázis kett ős 
összetétele lehet ővé teszi a reakció létrejöttét egy adott molekula 
poláris és nem poláris csoportjaival, hasonló módon ahhoz, ahogyan 
ez a talaj és a szennyvíziszap mátrixokban lév ő szerves anyagoknál 
is lezajlik. Mindez lehet ővé teszi a kolonnánál tapasztalt retenciós 
idő és a szerves anyag adszorpciós koefficiens közötti összefüggés 
megállapítását.
 
A pH-érték komoly hatást gyakorol a szorpciós viselkedésre, külö ­
nösen a poláris anyagok esetében. A mez őgazdasági hasznosítású 
talajokban vagy a szennyvíztisztítók tartályaiban a pH-érték általában 
5,5 és 7,5 között ingadozik. Az ionképz ő anyagokra nézve kétféle 
vizsgálatot kell elvégezni, megfelel ő pufferoldatokban mind az ioni ­
zált, mind a nem ionizált változattal, de csak olyan esetekben, 
amikor a vizsgált vegyület legalább 10 százaléka disszociálódik az 
5,5–7,5 pH-érték tartományon belül.  
Mivel az értékelés céljaira csak a HPLC kolonnában való retenció és 
az adszorpciós koefficiens közötti összefüggést használják, nincs 
szükség kvantitatív analitikai módszerre, és csak a retenciós id őt 
kell meghatározni. Ha rendelkezésre áll a referenciaanyagok egy megfelelő készlete és szabványos kísérleti feltételeket biztosítani 
lehet, akkor a módszer gyors és hatékony módot kínál a K
 oc adszorp­
ciós koefficiens becsléséhez.  
1.5. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
A HPCL módszer olyan (jelölt vagy jelöletlen) kémiai anyagok 
esetében alkalmazható, amelyekre nézve egy megfelel ő észlelési 
rendszer (pl. spektrofotométer, radioaktivitás érzékel ő) áll rendelke ­
zésre, és amelyek kell ően stabilak a kísérlet végrehajtása alatt. Külö ­
nösen hasznos lehet e módszer olyan vegyi anyagok esetében, amelyeket nehéz tanulmányozni másfajta kísérleti rendszerekkel (azaz illékony anyagok; olyan anyagok, amelyek nem oldódnak 
vízben olyan koncentrációban, amit analitikus módszerekkel már 
mérni lehetne; anyagok, amelyek nagyfokú affinitást mutatnak az inkubációs rendszerek bels ő felületeivel). A módszer használható 
olyan elegyek esetében, amelyek nem adnak szétváló elúciós sávo ­
kat. Ilyen esetben a vizsgált anyagkeverék vegyületei log K
 oc érté­
keinek a fels ő és alsó határértékeit meg kell adni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
A szennyez ődések olykor megnehezíthetik a HPLC eredmények 
értelmezését, azonban jelent őségük csekély marad mindaddig, amíg 
a vizsgált anyagot analitikai módszerekkel egyértelm űen be lehet 
azonosítani és el lehet különíteni a szennyez ő anyagoktól.  
A módszert a függelék 1. táblázatában felsorolt anyagokra validálták, 
és már alkalmazták egy sor további, az alábbi vegyületcsoportokba 
sorolt vegyi anyagokra nézve:  
— aromás aminok (pl. trifluralin, 4-klór-nilin, 3,5-dinitroanilin, 4- 
metilanilin, N-metilanilin, 1-naftilamin),  
— aromás karboxilsavészterek (pl. benzoesavas metilészter, 3,5- 
dinitrobenzoesavas etilészter),  
— aromás szénhidrogének (pl. toluol, xilol, etilbenzol, nitrobenzol),  
— aryloxyphenoxypropionsav észterek (pl. diclofop-metil, fenoxap ­
rop-etil, fenoxaprop-P-etil),  
— benzimidazol és imidazol fungicidek (pl. karbendazim, fuberida ­
zol, triazoxid),  
— karboxilsavamidok (pl. 2-klórbenzamid, N, N-dimetilbenzamid, 
3,5-dinitrobenzamid, N-metilbenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitro ­
benzamid),  
— klórozott szénhidrogének (pl. endoszulfán, DDT, hexakloroben ­
zol, quintozol, 1,2,3-triklórbenzol),  
— szerves foszfortartalmú rovarirtók (pl. azinfosz-metil, disulfoton, 
fenamifosz, izofenfosz, pirozofosz, sulprofosz, triazofosz),  
— fenolok (pl. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklórfenol, 
2,4,6-triklórfenol, 1-naftol),  
— fenilurea-származékok (pl. izoproturon, monolinuron, pency ­
curon),  
— pigment festékanyagok (pl. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, 
Direct Red 81),  
— poliaromás szénhidrogének (pl. acenaftén, naftalin),  
— 1,3,5-triazin gyomirtók (pl. prometrin, propazin, simazin, 
terbutrin),  
— triazolszármazékok (pl. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, 
triapentenol).  
A módszer nem alkalmazható olyan anyagokra, amelyek akár az 
eluenssel, akár az állófázissal reakcióba lépnek. Ugyancsak nem alkalmazható olyan anyagokra, amelyek különleges módon lépnek reakcióba a szervetlen komponensekkel (pl. komplexképzés az anya ­
gásványokkal). A módszer nem feltétlenül m űködik felületaktív 
anyagok, szervetlen vegyületek és közepesen er ős vagy er ős szerves 
savak és bázisok esetén. Az 1,5-t ől 5-ig terjed ő log K
 oc értékek 
határozhatók meg. Ionizálható anyagokat pufferolt mozgófázis hasz ­
nálatával kell mérni, de óvatosan kell eljárni, hogy elkerüljék a 
puffer komponensek vagy a vizsgált anyag kicsapódását.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. MIN ŐSÉGI KRITÉRIUMOK  
1.6.1.  Pontosság  
Egy adott vizsgált anyag adszorpciós koefficiensét általában az 
egyensúlyi módszerrel (lásd a függelék 1. táblázata) meghatározott 
érték ± 0,5 log egységen belüli pontossággal lehet becsülni. Nagyobb 
pontosságot akkor lehet elérni, ha a referenciaanyagok strukturálisan rokonságban állnak a vizsgált anyaggal.
 
1.6.2.  Megismételhet őség 
Az értékek meghatározását legalább kétszer el kell végezni. Az 
egyedi mérésekb ől származtatott log K  oc értékeknek a 0,25 log 
egység tartományon belül kell maradniuk.  
1.6.3.  Reprodukálhatóság  
A módszer alkalmazásával eddig nyert tapasztalatok alátámasztják a 
módszer validitását. A HPLC módszer vizsgálata, amelyhez 48 olyan anyagot (f őként peszticideket) használtak fel, amelyekre nézve 
megbízható adatok álltak rendelkezésre a talajon mért K
 oc értékekről, 
R = 0,95 korrelációs koefficienset eredményezett (10) (11).  
11 laboratórium bevonásával elvégzett összehasonlító vizsgálatra 
került sor a módszer tökéletesítése és validitása érdekében (12). Az 
eredményeket a függelék 2. táblázata tartalmazza.  
1.7. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.7.1.  Az adszorpciós koefficiens el őzetes becslése  
A P  ow (= K  ow ) oktanol/víz megoszlási koefficiens és – bizonyos 
mértékig – a vízoldhatóság az adszorpció mértékének jelz őszámai­
ként használhatók fel, különösen a nem ionos anyagok esetében, s ennélfogva az értéktartományok el őzetes behatárolására alkalmazha ­
tók. A vegyi anyagok több csoportjára vonatkozóan is publikáltak 
már különféle hasznos korrelációkat (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Készülék  
Egy pulzálásmentes pumpával és egy alkalmas érzékel ő készülékkel 
felszerelt folyadékkromatográfra van szükség. Javasolt egy injektáló 
hurokvezetékkel felszerelt szelep használata. Kémiailag kötött keres ­
kedelmi cyanopropil szilika alapú töltet használata javasolt (pl. Hipersil és Zorbax CN). Az injektáló rendszer és az analitikai 
kolonna közé egy, azonos anyagtöltet ű előtétoszlopot lehet 
elhelyezni. A különféle szállítóktól származó kolonnák szétválasztási képessége jelent ősen eltérhet egymástól. Iránymutatásként, a követ ­
kező k' kapacitási faktorokkal rendelkezzen: log k' > 0,0 a log K
 oc = 
3,0, valamint log k' > 0,4 a log K  oc = 2,0 érték esetében, ha mozgó ­
fázisként metanol és víz 55:45 arányú keverékét használják.  
1.7.3.  Mozgófázis  
A már vizsgált többféle mozgófázis közül a következ ő kettő haszná­
lata ajánlott:  
— metanol/víz (55:45 v/v),  
— metanol/0,01 M citrátpuffer, pH-érték 6,0 (55:45 v/v).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Az elúciós oldat elkészítéséhez HPLC-min őségű metanol és desztil ­
lált víz vagy citrátpuffer használatos. A keveréket használat el őtt 
gázmentesíteni kell. Izokratikus elúciót célszer ű alkalmazni. Ha a 
metanol/víz elegy nem felel meg a célnak, ki lehet próbálni más szerves oldószerek és víz keverékeit, pl. etanol/víz vagy acetonitril/ ­
víz keverékeket. Az ionizálható vegyületek esetében pufferoldat 
használata javasolt a pH-érték stabilizálása érdekében. Ügyelni kell az egyes szerves fázis/puffer keverékek esetében esetleg el őforduló 
csapadék/sókicsapódás és a kolonnatöltet min őségromlásának elkerü ­
lésére.
 
Nem szabad adalékanyagokat (pl. ion-pár reagenseket) használni, 
mert ezek hatással lehetnek az állófázis szorpciós képességeire. Az 
állófázis ilyen változásai pedig irreverzibilisek lehetnek. Emiatt az adalékanyagok használatával járó kísérleteket kötelez ően külön 
kolonnában kell végrehajtani.
 
1.7.4.  Oldott anyagok  
A vizsgált és referenciaanyagokat a mozgó fázisban kell feloldani.  
1.8 A VIZSGÁLAT VÉGREHAJTÁSA  
1.8.1.  Vizsgálati körülmények  
A mérések során fel kell jegyezni a h őmérsékletet. Hangsúlyozottan 
javasolt a szabályozott h őmérséklet ű oszlop használata, hogy bizto ­
sítható legyen a kísérleti körülmények állandó értéken tartása a kalib ­
rációs és becslési m űveletek, valamint a vizsgált anyag mérései 
során.  
1.8.2.  A to holtid ő meghatározása  
A to holtid ő meghatározására két különböz ő módszer használható 
(lásd még 1.2. szakasz).  
1.8.2.1.  A to holtid ő meghatározása egy homológ sor segítségével  
Erről az eljárásról bebizonyosodott, hogy megbízható és szabványos 
to értékeket eredményez. A részleteket lásd az A.8 vizsgálati 
módszernél: n-oktanol/víz megoszlási koefficiens, HPLC módszer.  
1.8.2.2.  A to holtid ő meghatározása olyan inert anyagok által, amelyeknél a 
kolonnán való áthaladás során nem lép fel retenció  
Ez az eljárás a formamid, urea vagy nátrium-nitrát alapú oldatok 
befecskendezésén alapul. A méréseket legalább kétszer el kell végezni.
 
1.8.3  A tR retenciós id ő meghatározása  
A referenciaanyagokat az 1.3. szakaszban leírtaknak megfelel ően kell 
kiválasztani. Retenciós idejük meghatározása érdekében ezeket keve ­
rékstandardként lehet beinjektálni, feltéve, hogy bizonyítható, hogy 
az egyes referenciaanyagok retenciós idejét nem befolyásolja más 
referenciaanyagok jelenléte. A kalibrálást rendszeres id őközönként, 
naponta legalább kétszer meg kell ismételni, hogy számításba lehessen venni a kolonna teljesítményében esetleg bekövetkez ő 
váratlan változásokat. Az a legjobb gyakorlat, ha a kalibrációs célú 
injektálásokat a vizsgált anyag beinjektálása el őtt és után végzik el, 
azt meger ősítendő, hogy a retenciós id őtartamok változatlanok. A 
kolonnák túlterhelésének megel őzése érdekében a vizsgált anyagokat 
a lehető legkisebb adagokban kell egymástól elkülönítetten beinjek ­
tálni, és retenciós idejüket ezután kell meghatározni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
A mérések megbízhatósága fokozásának érdekében az értékek 
meghatározását legalább kétszer meg kell ismételni. Az egyedi 
mérési adatokból származtatott log K  oc értékeknek egy 0,25 log 
egység tartományba kell esniük.  
1.8.4.  Értékelés  
A k' kapacitási faktorokat a kiválasztott referenciaanyagok to holti ­
dejéből és tR retenciós idejéb ől, a 4. egyenlet használatával kell 
kiszámolni (lásd 1.2. szakasz). A referenciaanyagok log k adatait 
ekkor a függelék 1. és 3. táblázatában megadott egyensúlyi kísérle ­
tekből levezetett log K  oc értékekhez viszonyítva kell grafikusan ábrá ­
zolni. A grafikon segítségével ekkor a vizsgált anyag log k' értékét lehet felhasználni a log K
 oc értékének meghatározásához. Ha a tény ­
legesen kapott eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált anyag log 
K oc értékei kívül esnek a kalibrációs tartományon, akkor a vizs ­
gálatot más, a célnak jobban megfelel ő referenciaanyagok használa ­
tával meg kell ismételni.  
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
A vizsgálati jelentésben a következ ő információknak kell szerepel ­
niük:  
— a vizsgált anyagok és referenciaanyagok megnevezése, tisztasá ­
guk, valamint – adott esetben – pKa értékeik megjelölése,  
— a műszer leírása és a vizsgálati körülmények, pl. az analitikai (és 
az előtét-) kolonnák típusa és méretei, az észlelés eszközei, a 
mozgófázis (a komponensek aránya és pH-érték közötti kapcso ­
lat), a mérések h őmérséklet-tartománya,  
— holtid ő és a holtid ő meghatározására használt módszer,  
— a kolonnába beadagolt vizsgált anyagok és referenciaanyagok 
mennyisége,  
— a kalibráció céljára felhasznált referenciavegyületek retenciós 
ideje,  
— a regresszió egyenes jellemz ői (log k' és log K  oc között) és a 
regressziós egyenes grafikonja,  
— a vizsgált vegyület átlagos retenciós adatai és becsült log K  oc 
értéke,  
— kromatogramok.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) W. J. LYMAN, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosp ­
here, 17, 167.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffici ­
ents, water solubilities, bioconcentration factors, and the para ­
chor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D. W. Schmedding (1983). 
Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic subs ­
tances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
pp. 297-312.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic compo ­
unds, Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121-128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosp ­
here, 27(12), pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
függelék  
1. Táblázat  
A talajokra és szennyvíziszapokra vonatkozó K  oc értékek és a HPLC kiválasztási módszerrel számított értékek 
összehasonlítása  ( 1 ), ( 2 ) 
Anyag megnevezése CAS-szám Log K  oc 
szennyvízi ­
szapoknál HPLC Δ Log K  oc 
talajoknál HPLC Δ 
Atrazine 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantrén 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Benzoesavas fenilészter 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Diklóranilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107 – 119.  
2. Táblázat  
A HPLC módszer tökéletesítése és validálása érdekében 11 részt vev ő laboratórium által végzett összehasonlító 
vizsgálatok eredményei  ( 1 ) 
Log K  oc K oc Log K  oc 
(OECD 106) (HPLC módszer)  
Atrazine 1912-24-9 1,81 78 ±16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ±64 8 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.o.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
3. Táblázat  
Ajánlott referenciaanyagok a talaj adszorpciós adatokra alapozott HPLC kiválasztási módszer alkalmazásához  
Referenciaanyag megnevezése CAS-szám Log K  oc átlag­
értékek az 
egyensúlyi vizs ­
gálatból A K  oc ad at ok 
száma Log S. D. Forrás  
Acetanilide 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetilbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metilbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metilbenzoát 9 3-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
lzoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-nitrobenzamid 64 5-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbendazim 1060 5-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxid 724 59-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofosz 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalin 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endoszulfán-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiokarb 20 32-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 6340 5-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-triklórbenzol 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
g-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Petition 5 5- 3 8-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pitrazofosz 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
a-endoszulfán 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofop-metil 51538-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantrén 8 5-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (keverék) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffízlenten organischer Chemikalien mit der HLPC. UBA R 
Report No. 106 01044 (1994). 
( b ) B. V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere. 22. pp. 285-304. 
( c ) Az iparág által szolgáltatott adatok.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  DAPHNIA MAGNÁN  VÉGZETT REPRODUKCIÓS 
VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
E reprodukciós toxicitási vizsgálati módszer megfelel az OECD TG 
21 l-nek (1998).  
1.1. BEVEZETÉS  
E vizsgálat els ődleges célja annak felmérése, hogy a vegyi anyagok 
milyen hatást gyakorolnak a  Daphnia magna  reprodukciós teljesít ­
ményére.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK ÉS MÉRTÉKEGYSÉGEK  
Szülők: a vizsgálat kezdetén jelen lév ő nőstény Daphnia-egyedek, 
amelyek szaporodási teljesítménye e vizsgálat tárgyát képezi.  
Szaporulat : azon fiatal Daphnia-egyedek, amelyek a vizsgálat során 
születnek a szül őktől. 
Legalacsonyabb megfigyelhet ő hatást okozó koncentráció 
(LOEC) : azon legalacsonyabb vizsgálati koncentráció, amelynél a 
kontrollcsoporttal összevetve megfigyelhet ő a vizsgált anyag statisz ­
tikailag jelent ős hatása a reprodukcióra és a szül ők mortalitására (p < 
0,05) a megfigyelt behatási periódusban. Azonban a LOEC-szint feletti valamennyi vizsgálati koncentrációnak olyan ártalmas hatást kell kifejtenie, amely legalább egyenl ő a LOEC-szinten megfigyelttel 
vagy súlyosabb annál. Amennyiben e két feltétel nem teljesíthet ő, 
akkor kimerít ő magyarázatot kell adni arra, hogy hogyan történt a 
LOEC (és ennélfogva a NOEC) kiválasztása.
 
Hatástalan koncentráció: a közvetlenül a LOEC  alatti vizsgálati 
koncentráció, amely – a kontrollcsoporttal való összevetésben – nem 
fejt ki statisztikailag jelent ős hatást (p < 0,05), a meghatározott 
expozíciós id őszak alatt.  
EC x : ez a vízben oldott vizsgált anyag azon koncentrációja, amely a  
Daphnia magna  reprodukciójában x % csökkenést okoz meghatá ­
rozott expozíciós id őszak alatt.  
Belső növekedési ráta : a populáció növekedésének mértéke, amely 
a reprodukciós teljesítményb ől és a korspecifikus pusztulásból 
tevődik össze (20) (21) (22). Az egyensúlyi populációk esetében 
ez pontosan nulla. A növeked ő populációknál pozitív, a csökken ő 
populációknál negatív. Ez utóbbi nyilvánvalóan nem fenntartható, és végül kihaláshoz vezet.
 
Érzékelési határ a legalacsonyabb  koncentráció, amelyet érzékelni 
lehet, de számszer űsíteni már nem.  
Meghatározási határ : a számszer űsíthetően mérhet ő legalacsonyabb 
koncentráció.  
Mortalitás : egy állat akkor tekinthet ő kimúltnak, ha mozdulatlan, 
azaz ha nem képes úszni, vagy ha a tesztedény enyhe rázogatása után 15 másodpercen belül nem figyelhet ő meg mozgás a függe ­
lékben vagy az utóbélben. (Más meghatározás használata esetén ezt 
a hozzá tartozó irodalmi hivatkozással együtt kell megadni.)
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Fiatal, a vizsgálat kezdetekor 24 órásnál nem id ősebb nőstény Daph ­
niákat (a szül őket) a vízhez különféle koncentrációszintekben adagolt 
vizsgálati anyag hatásának kell kitenni. A vizsgálat id őtartama 21 
nap. A vizsgálati id őszak végén fel kell mérni a vizsgálat végén 
még életben lév ő szülők élő szaporulatának teljes számát. Ez azt 
jelenti, hogy a vizsgálat során kimúlt szül ő állatok szaporulatát ki 
kell zárni a számításból. A szül ők reprodukciós teljesítményét más 
módokon is ki lehet fejezni (pl. az els ő utód megjelenésének napjától 
számítva a naponta egy állatra jutó él ő utódok száma), ezt azonban a 
vizsgálati id őszak végén még él ő szülőkre jutó él ő utódok teljes 
száma mellett, kiegészítésként lehet jelenteni. A vizsgált anyag hatá ­
sának kitett állatok szaporulatát össze kell hasonlítani a kontrollcso ­
port szaporulatával, a legalacsonyabb megfigyelhet ő hatást okozó 
koncentráció (LOEC), s ezzel összefüggésben a hatástalan legmaga ­
sabb koncentráció (NOEC) szintjének meghatározása érdekében. 
Ezen túlmen ően lehetőség szerint egy regressziós modell segít ­
ségével kell az adatokat elemezni azon koncentrációszint becslése érdekében, amely egy x százaléknyi csökkenést okoz a szaporulatban 
(például EC
 50 , EC  20 , illetve az EC  10 ). 
A jelentésbe bele kell foglalni a szül ők túlélési arányát és az els ő 
ivadékok megjelenésének idejét is. Vizsgálni lehet továbbá a vizsgált 
anyag más paraméterekre gyakorolt hatásait is, mint pl. a növekedés (pl. testhossz) és a valószín ű belső növekedési ráta.
 
1.4. A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
Rendelkezésre kell hogy álljanak a  Daphnia magna  fajjal végzett 
akut toxicitási vizsgálatok eredményei (lásd a C.2. módszer 1. része). Az eredmények a reprodukciós vizsgálatok során hasznosak lehetnek 
a vizsgálati koncentrációk megfelel ő tartományának megállapításá ­
ban. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát és g őznyomását, 
és egy olyan megbízható analitikai módszerrel kell rendelkezni a vizsgálati oldatokban lév ő anyag számszer ű meghatározásához, 
amelynek visszanyerési hatékonysága és mérési határa ismert.
 
A vizsgált anyagra vonatkozó azon információkhoz, amelyek hasz ­
nosak lehetnek a vizsgálati körülmények megállapításához, tartozik 
még a szerkezeti képlet, az anyag tisztasága, fénystabilitása, stabili ­
tása vizsgálati körülmények között, pKa és megoszlási koefficiens (n-oktanol/víz) értékek, valamint a biológiai lebonthatóságra vonat ­
kozó vizsgálat eredményei is (lásd a C.4. módszert).
 
1.5. ÉRVÉNYESSÉGI KRITÉRIUMOK  
A vizsgálat érvényesságéhez az alábbi teljesítménykritériumoknak 
kell teljesülniük a kontrollcsoport(ok)ban:  
— a vizsgálat végén a szül ők (nőstény Daphnia) mortalitási aránya 
nem haladja meg a 20 %-ot,  
— a vizsgálat végén még él ő szülők élő szaporulatának átlagos 
száma >= 60.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Felszerelés  
A vizsgálati edények és minden más, a vizsgálati oldatokkal közvet ­
lenül érintkez ő más felszerelések üvegb ől vagy más, kémiailag 
közömbös anyagból készülnek. A vizsgálati edények általában üveg ­
lombikok.  
Ezenfelül szükség lehet az alábbi berendezések némelyikére vagy 
mindegyikére:  
— oxigénmér ő (mikroelektróddal vagy más olyan berendezés segít ­
ségével, amelynek a rendeltetése csekély mennyiség ű mintában 
az oldott oxigén mérése),  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— megfelel ő hőmérséklet-szabályozó készülék,  
— pH-mér ő, 
— a vízkeménységet meghatározó készülékek,  
— a víz összes szervesszén-koncentrációjának (TOC) vagy a kémiai 
oxigénigény (COI) meghatározására alkalmas készülék,  
— megfelel ő berendezés a fény szabályozására és intenzitásának 
mérésére.  
1.6.2.  Vizsgált organizmus  
A vizsgálat során használt állatfaj a  Daphnia magna Straus . Más 
Daphnia-fajokat is fel lehet használni, feltéve, hogy azok kielégítik 
a megfelel ő érvényességi kritériumokat (az egyes Daphnia-fajokra 
jellemző szaporodási kritériumok a kontrollban teljesülnek). Más 
Daphnia-fajok használata esetén ezeket egyértelm űen azonosítani 
kell és alkalmazásukat meg kell indokolni.  
A klónt lehet őleg genotípusos meghatározással kell beazonosítani. 
Kutatások (1) kimutatták, hogy az „A” Klón (amely a franciaországi 
IRCHA-ból származik) (3) reprodukciós teljesítménye következe ­
tesen kielégíti az e módszerben leírt feltételek mellett tenyésztett, a vizsgálatot túlél ő egyes szül őkre átlagosan jutó >= 60 utód érvényes ­
ségi kritériumot. Emellett azonban más klónok is elfogadhatók, 
feltéve, hogy a Daphnia tenyészetr ől kimutatható, hogy kielégíti a 
vizsgálat érvényességi kritériumait.
 
A vizsgálat kezdetekor az állatok nem lehetnek id ősebbek 24 óránál, 
és nem származhatnak az els ő szaporulatból. Az állatoknak egész ­
séges törzstenyészetb ől kell származniuk (azaz nem mutathatják a 
stressz jeleit, mint pl. magas mortalitás, hímek vagy ephippia jelen ­
léte, késedelem az els ő szaporulat létrehozásában, színtelen állatok 
stb.). A törzstenyészet állatait hasonló tenyésztési körülmények között kell tartani (megvilágítás, h őmérséklet, közeg, táplálék és 
állatok mennyisége térfogategységre számolva), mint a vizsgálat 
céljaira alkalmazandókat. Ha a vizsgálat során használandó tenyész ­
folyadék jellemz ői eltérnek azon közeg jellemz őitől, amelyben a 
Daphniákat szokásos módon tenyésztik, akkor megfelel ő egy szoká ­
sosan mintegy háromhetes akklimatizációs id őszak biztosítása a vizs ­
gálat előtt (azaz egy generációnyi id ő), a szülők stresszmentesítése 
érdekében.
 
1.6.3.  Tenyészfolyadék  
Javasolt egy teljeskör űen meghatározott tenyészfolyadék használata a 
vizsgálat során. Így elkerülhet ő az adalékanyagok (pl. alga, talajki ­
vonatok stb.) használata, amelyeket nehéz jellemezni, és mindez 
elősegíti a laboratóriumok közötti szabványosítás lehet őségét. E 
célra az Elendt M4 (4) és M7 tenyészfolyadék (lásd az 1. függeléket) bizonyult alkalmasnak. Azonban másfajta tenyészfolyadékok (pl. (5) 
és (6)) is elfogadhatók, feltéve, hogy a Daphnia tenyészet teljesít ­
ménye bizonyíthatóan kielégíti a vizsgálat validitási kritériumait.
 
Nem definiált adalékokat tartalmazó tenyészfolyadékok használata 
esetén az ilyen adalékokat egyértelm űen meg kell határozni, és 
megfelelő információkat kell megadni a vizsgálati jelentésben össze ­
tételükről és különösen a széntartalmukról, mert az hozzájárulhat az 
alkalmazott etetéshez. Javasolt a szerves adalékot tartalmazó törzs ­
oldat összes szerves széntartalmának (TOC) és/vagy a kémiai oxigénigényének (COI) meghatározása, és annak becslése, hogy ez mennyivel járul hozzá az elkészített tesztoldat TOC/COI tartalmához. 
Javasolt a tenyészoldat (algák hozzáadása el őtti) TOC szintjét 2 mg/l 
alatt tartani (7).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Fémtartalmú anyagok vizsgálatakor fontos annak felismerése, hogy a 
tesztfolyadék tulajdonságai (pl. keménységi fok, kelátképz ő képes­
ség) hatással lehetnek a vizsgálati anyag toxicitására. Emiatt kívá ­
natos a teljeskör űen meghatározott tenyészfolyadék használata. 
Jelenleg azonban a  Daphnia magna  hosszú távú tenyésztésére alkal ­
masnak ítélt, teljeskör űen meghatározott tenyészoldat az Elendt M4 
és M7. Mindkét tenyészoldat tartalmaz EDTA kelátképz ő kompo­
nenst. Az eddigi vizsgálatok (2) kimutatták, hogy – szemben az EDTA-t egyáltalán nem tartalmazó közegekkel – a kadmium „lát ­
szólagos toxicitása” általában alacsonyabb, amennyiben a reproduk ­
ciós vizsgálatot az M4 és M7 közegben végzik el. Ezért az M4 és M7 használata nem javasolt a fémtartalmú anyagok vizsgálatához, és célszerű kerülni az ismert kelátképz ő szereket tartalmazó másfajta 
közegek használatát is. A fémtartalmú anyagok vizsgálatához taná ­
csos alternatív közeg használata, mint pl. az EDTA-t nem tartalmazó, ASTM szerint el őállított kemény édes m űvíz (7), hozzáadott tengeri 
algakivonattal (8). Az ASTM szerint el őállított kemény édes m űvíz 
és az algakivonat ilyen kombinációja is alkalmas a  Daphnia magna  
hosszú távú tenyésztéséhez és vizsgálatához (2), bár így is kifejt egy enyhe kelátképz ő hatást a beadagolt tengerialga-kivonatban megtalál ­
ható szerves komponens következtében.
 
A vizsgálat kezdetekor és annak során az oldottoxigén-koncentráció 
3 mg/l fölött van. A pH-értéknek a 6–9 tartományba kell esnie, és az 
nem változhat egyik vizsgálat során sem 1,5 egységnél nagyobb mértékben. Javasolt a 140 mg/l CaCO
 3 -nál nagyobb keménység 
használata. Az e szintet elér ő és ezt meghaladó feltételek mellett 
elvégzett vizsgálatok bizonyították a szaporodási képesség össz ­
hangját a validitási kritériumokkal (9) (10).  
1.6.4.  Vizsgálati oldatok  
A kiválasztott koncentrációnak megfelel ő vizsgálati oldatokat rend ­
szerint a törzsoldat hígításával készítik el. A törzsoldatokat lehet őleg 
az anyagnak a tesztoldatban való feloldásával kell elkészíteni.  
Egyes esetekben szerves oldószerekre vagy diszpergálószerekre van 
szükség a megfelel ő koncentrációjú törzsoldat létrehozásához, de 
lehetőség szerint kerülni kell az ilyen anyagok használatát. Az 
alkalmas oldószerek példái: aceton, etanol, metanol, dimetilformamid és a trietilénglikol. Alkalmas diszpergálószer lehet például: 
Cremophor RH40, metilcellulóz 0,01 % és a HCO-40. A vizsgálati 
oldatokokban lév ő vizsgált anyag semmiképpen sem haladhatja meg 
a vizsgálati közegben való oldékonyság határértékét.
 
Az oldószerek használatára a vízbe pontosan adagolható törzsoldat 
előállítása érdekében kerül sor. A végs ő vizsgálati közegben javasolt 
koncentrációjuknál (azaz <= 0,1 ml/l) a fent felsorolt oldószerek nem 
gyakorolnak toxikus hatást, és nem fokozzák a vizsgált anyag vízold ­
hatóságát.  
A diszpergálószerek segíthetnek a pontos adagolásban és diszperzi ­
óban. A végs ő vizsgálati közegben javasolt koncentrációjuknál (azaz 
<= 0,1 ml/l) a fent felsorolt diszpergálószerek nem gyakorolnak 
toxikus hatást, és nem fokozzák a vizsgált anyag vízoldékonyságát.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. A VIZSGÁLAT ELRENDEZÉSE  
A kezelések vizsgálati edények közötti elosztását és a vizsgálati 
edények összes kés őbbi kezelését véletlenszer ű sorrendben kell 
végezni. Az ebb ől eredő hibákat a koncentrációhatásnak tulajdonít ­
hatjuk. Különösen igaz ez, ha a kísérleti egységeket kezelési vagy 
koncentráció szerinti sorrendben vizsgálják, s ekkor egyes, az id ővel 
összefügg ő hatások (mint pl. a kezel ő személy fáradtsága vagy más 
jellegű hibák) jelent ősebb hatásokat eredményezhetnek magasabb 
koncentrációknál. Továbbá, ha a vizsgálati eredményeket valószín ű­
síthetően befolyásolja a vizsgálat egy kezdeti vagy környezeti vonat ­
kozású feltétele – pl. a laboratóriumon belüli elhelyezés –, akkor 
fontolóra kell venni a vizsgálat leállítását.  
1.8. VIZSGÁLAT  
1.8.1.  A vizsgálat körülményei  
1.8.1.1.  Időtartam  
A vizsgálat id őtartama 21 nap.  
1.8.1.2.  Tesztállatok elrendezése  
Minden, egyenként 50–100 ml vizsgálati közeget tartalmazó vizs ­
gálati edénybe egy szül ő kerül.  
Néha szükségessé válhat nagyobb térfogatok használata a vizsgált 
anyag koncentrációjának meghatározására használt analitikai eljárás 
követelményeinek a teljesítése érdekében, bár a koncentráció párhu ­
zamos edényben is mérhet ő. Amennyiben 100 ml-nél nagyobb térfo ­
gatot használnak, akkor szükségessé válhat a Daphniáknak adott 
táplálékadag növelése, a megfelel ő táplálékmennyiség és a validitási 
kritériumok betartásának biztosítása érdekében. Átfolyásos vizs ­
gálatok esetében – m űszaki okokból – számba lehet venni alternatív 
vizsgálati koncepciók kialakítását is (pl. négy, egyenként tíz állatból 
álló csoport behelyezése egy nagyobb tesztel ő térfogatba), azonban a 
vizsgálati koncepció minden változtatásáról be kell számolni.  
1.8.1.3  Az állatok száma  
A félstatikus vizsgálatok esetében minden egyes koncentrációszintnél 
legalább tíz, egyedileg elhelyezett állatra, továbbá a kontrollcsopor ­
tokban is legalább tíz állatra van szükség.  
Az átfolyásos vizsgálatokhoz célszer ű minden egyes koncentráció ­
szinthez tartozóan negyven állatot négy, egyenként tíz állatból álló csoportba osztani (1). Kisebb számú vizsgálati egyed is felhasznál ­
ható, ez esetben koncentrációszintenként minimum húsz állat bevo ­
nása javasolt, amelyeket egyenl ő létszámban kell felosztani legalább 
két edénybe (pl. négy párhuzamos, egyenként öt darab Daphniával). Meg kell jegyezni, hogy amennyiben az állatokat csoportokban tart ­
ják, akkor lehetetlen a szaporulatot úgy kifejezni, mint a vizsgálat 
végén még életben lév ő szülő élő utódainak összlétszáma, ha közben 
egyes szül ők elpusztulnak. Ezen esetekben a szaporulatot a „vizs ­
gálat kezdetekor jelenlév ő szülőkre jutó él ő szaporulat összlétszáma” 
formájában lehet kifejezni.
 
1.8.1.4.  Táplálék  
A félstatikus vizsgálatoknál lehet őleg naponta kell a táplálékot 
beadni, de legalább hetente háromszor (azaz a tesztoldatok cseréjével 
megegyez ően). Az ett ől való eltéréseket (pl. az átfolyásos vizsgála ­
toknál) jelezni kell.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
A vizsgálat során a szül őknek beadott étrendet lehet őleg a következ ő 
élő algasejtekb ől (egy vagy több felhasználásával) kell összeállítani:  
Chlorella  sp., Selenastrum capricornutum  (napjainkban  Pseudokirch ­
neriella subcapitata  (11)) és  Scenedesmus subspicatus . A beadott 
étrendet az egyes szül őknek biztosítandó szerves szén (C) mennyi ­
ségére kell alapozni. Kutatások (12) bizonyították, hogy a  Daphnia 
magna  esetében a 0,1 és 0,2 mg C/Daphnia/nap közötti adagok 
elegendőek a validitási kritériumokat kielégít ő megfelel ő szaporulat ­
szám eléréséhez. Az adagolást a vizsgálat id őtartama alatt vagy 
egyenletesen lehet végezni, vagy, amennyiben megfelel őbbnek 
látszik, akkor kezdetben egy alacsonyabb szint alkalmazható, majd az fokozatosan növelhet ő, figyelembe véve a szül ők növekedésének 
ütemét. Ebben az esetben is az adagolásnak mindenkor meg kell 
maradnia a 0,1–0,2 mg C/Daphnia/nap tartományon belül.
 
Amennyiben helyettesít ő méréseket alkalmaznak (pl. algasejtszám 
vagy fényelnyelés) az élelemadagban szükséges széntartalom adago ­
lása érdekében (célszer űségi okokból, hiszen a széntartalom mérése 
időigényes elfoglaltság), úgy minden egyes laboratóriumnak ki kell 
dolgoznia a saját nomogramját, amely az algatenyészet széntartal ­
mával kapcsolatos helyettesít ő paraméterekre vonatkozik (lásd a 2. 
függelékben a nomogramok elkészítéséhez adott tanácsokat). A 
nomogramokat évente legalább egyszer ellen őrizni kell, vagy még 
gyakrabban, amennyiben id őközben megváltoznak az algatenyészeti 
feltételek. A széntartalom helyettesít ő mérésére a fény elnyelés vizs ­
gálata jobb módszernek bizonyult, mint a sejtek száma (13).  
A Daphniáknak egy koncentrált algaszuszpenziót kell adni, hogy 
elkerüljük a hígulást a tesztedényekben. Az algakoncentrátumot cent ­
rifugálással lehet nyerni, amit desztillált vízben, ionmentes vízben vagy Daphnia tenyészfolyadékban történ ő reszuszpenzió követ.
 
1.8.1.5.  Megvilágítás  
16 órán keresztül, 15–20 μE· m -2 ·s -1 szintet meg nem haladó fénye ­
rejű megvilágítás.  
1.8.1.6.  Hőmérséklet  
A vizsgálati közeg h őmérséklete 18–22  o C között van. Emellett a 
hőmérséklet – lehet őség szerint – egyik vizsgálat esetében sem 
változik e tartományon belül 2  o C-nál nagyobb mértékben (pl. 
18–20, 19–21 vagy 20–22  o C). Helyes módszer lehet egy további 
vizsgálati edényt a h őmérséklet alakulásának nyomon követésére 
beállítani.  
1.8.1.7.  Leveg őztetés  
A vizsgálati edényeket tilos a vizsgálat során leveg őztetni.  
1.8.2.  Vizsgálati koncentráció  
Szokásos esetben legalább ötfajta olyan vizsgálati koncentrációt kell 
geometrikus sorban elrendezni, amelyek egymástól lehet őleg egy 
3.2-es szorzófaktornál jobban nem különböznek, és minden vizs ­
gálati koncentrációhoz megfelel ő számú párhuzamost kell használni 
(lásd 1.8.1.3. szakasz). Ötnél kevesebb vizsgálati koncentráció hasz ­
nálatát indokolni kell. Az anyagokat nem szabad a vizsgálati 
közegben való oldékonysági limitjük felett vizsgálni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
A koncentrációtartomány határainak meghatározása során az alábbi ­
akat kell szem el őtt tartani:  
(i) Amennyiben a cél a LOEC/NOEC érték megállapítása, akkor a 
legalacsonyabb vizsgálati koncentrációnak kell ően alacsonynak 
kell lennie ahhoz, hogy a termékenység mértéke ezen koncent ­
rációnál ne legyen lényegesen alacsonyabb, mint a kontrollcso ­
portban. Ellenkez ő esetben a vizsgálatot egy csökkentett legala ­
csonyabb koncentrációszinten meg kell ismételni.  
(ii) Amennyiben a cél a LOEC/NOEC érték megállapítása, akkor a 
legmagasabb vizsgálati koncentrációnak kell ően magasnak kell 
lennie ahhoz, hogy a termékenység mértéke ezen koncentráci ­
ónál lényegesen alacsonyabb legyen, mint a kontrollcsoportban. Ellenkező esetben a vizsgálatot egy megnövelt legmagasabb 
koncentrációszinten meg kell ismételni.
 
(iii) Amennyiben a reprodukcióra gyakorolt hatásokra vonatkozó 
EC x -t kívánjuk meghatározni, akkor tanácsos kell ően nagy 
koncentrációértékeket használni az EC  x megfelelő konfidencia ­
szinten történ ő meghatározása érdekében. Amennyiben a repro ­
dukcióra gyakorolt hatásokra vonatkozó EC  50 -t kell felbecsülni, 
akkor tanácsos, hogy a legmagasabb vizsgálati koncentráció ezen EC
 50 -nél magasabb legyen. Bár ellenkez ő esetben is lehet ­
séges az EC  50 megállapítása, a konfidenciatartomány nagyon 
széles lesz, és emiatt fennáll annak a veszélye, hogy nem lehet kielégít ően értékelni az alkalmazott modell megfelel őségét.
 
(iv) A vizsgálati koncentráció tartományából lehet őleg ki kell hagyni 
minden olyan koncentrációt, amely statisztikailag jelent ős hatást 
gyakorol a feln őtt egyedek túlélésére, mivel ez megváltoztatná a 
vizsgálat jellegét, és az egyszer űen a reprodukciós teljesítmény 
megállapítására irányuló vizsgálatból egy komplexebb statisz ­
tikai elemzést megkövetel ő, kombinált reprodukciós és mortali ­
tási vizsgálat alakulna ki.  
A vizsgált anyag toxicitására vonatkozó el őzetes ismeretek (pl. egy 
akuttoxicitás-vizsgálatból és/vagy koncentráció meghatározására 
vonatkozó el őzetes vizsgálatokból származók) segíthetnek a 
megfelelő vizsgálati koncentrációk kiválasztásában.  
Amennyiben oldószert vagy diszpergálószert használnak a vizsgálati 
oldatok elkészítésének el ősegítéséhez (lásd 1.6.4. szakasz), akkor a 
vizsgálati edényekben mért végs ő koncentráció nem lehet magasabb 
0,1 ml/l-nél, és értékének azonosnak kell lennie valamennyi vizs ­
gálati edényben.  
1.8.3.  Kontrollcsoportok  
A vizsgált anyaggal kezelt vizsgálati sorozatokkal párhuzamosan a 
vizsgálati közeg egy kontrollcsoport-sorozatát és – adott esetben – 
egy, oldószert vagy diszpergálószert tartalmazó kontrollcsoport-soro ­
zatot kell beállítani. Ebben az esetben az oldószer vagy diszpergáló ­
szer koncentrációja azonos a vizsgált anyagot tartalmazó edényekben 
használt koncentrációval. Megfelel ő számú párhuzamost kell hasz ­
nálni (lásd 1.8.1.3. szakasz).  
Egy jól végrehajtott vizsgálat során általában a kontrollcsoportban 
lévő egy szül őre jutó él ő szaporulat variációs koefficiense az 
átlagos szám körül <= 25 %, ha a szül őket elkülönítve tartják a 
tesztelés során.  
1.8.4.  A vizsgálati közeg megújítása  
A közeg megújításának gyakorisága a vizsgált anyag stabilitásától 
függ, azonban hetente legalább három csere szükséges. Amennyiben az előzetes stabilitási vizsgálatok (lásd 1.4. pont) azt mutatták, hogy 
a vizsgált anyag koncentrációja nem stabil (azaz kívül esik a nominál 
koncentráció 80–120 %-os tartományán, vagy a kiinduláskor mért koncentráció 80 %-a alá csökken) a két megújítás közötti maximális időtartam (azaz három nap) alatt, úgy számba kell venni a vizsgálati 
közeg gyakoribb megújításának lehet őségét vagy egy átfolyásos vizs ­
gálat alkalmazását.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Amennyiben a közeget félstatikus vizsgálatok során megújítják, 
akkor a vizsgálati edényekb ől egy második sorozatot is be kell állí ­
tani, és a szül őket pl. egy megfelel ő átmérőjű üvegpipetta segít ­
ségével kell áthelyezni. A Daphniákkal együtt áthelyezett vizsgálati közeg mennyiségét a minimumra kell csökkenteni.
 
1.8.5.  Megfigyelések  
A vizsgálat során tett megfigyelések eredményeit eredménylapokon 
kell rögzíteni (lásd a példákat a 3. és 4. függelékben). Amennyiben más mérések elvégzése is követelmény (lásd 1.3. és 1.8.8. pont), akkor további megfigyelések elvégzése is szükséges lehet.
 
1.8.6.  Utódok  
Az egyes szül őktől származó utódokat lehet őleg naponta ki kell 
emelni és meg kell számlálni az els ő utódnemzedék megjelenésének 
napjától kezdve, annak megakadályozására, hogy a kicsik elfogyasz ­
szák a feln őtteknek szánt táplálékot. E módszer alkalmazásában csak 
az élő utódokat kell megszámlálni, de feljegyezhet ő az abortált peték 
és az elhullott ivadékok számát is.  
1.8.7.  Mortalitás  
Lehetőleg naponta fel kell jegyezni a szül ő állatok mortalitását, 
legalább az utódok megszámlálásával megegyez ő gyakorisággal.  
1.8.8.  Egyéb paraméterek  
Bár e módszert alapvet ően a reprodukcióra gyakorolt hatások felmé ­
rése érdekében dolgozták ki, általa azonban más hatások is kell ő 
részletességgel számszer űsíthetők, statisztikai elemzéseket lehet ővé 
téve. A növekedési ütem mérése igen kívánatos cél, mert ezzel infor ­
mációk nyerhet ők az esetleges szubletális hatásokról, amely haszno ­
sabb lehet a kizárólag a reprodukciós hatásokra irányuló méréseknél; 
a szülők hosszának (azaz a léctüske nélkül mért testhossznak) a 
mérése javasolt a vizsgálatok végén. A többi, mérhet ő vagy számít ­
ható paraméter közé tartozik az els ő utódnemzetség (majd a követ ­
kező csoportok) megjelenéséig eltelt id ő, az egy szül őre jutó utódok 
száma és mérete, az abortált utódok száma, hímek vagy ephippia jelenléte és a populáció bels ő növekedési üteme.
 
1.8.9.  Az analitikai meghatározások és mérések gyakorisága  
Az oxigénkoncentrációt, a h őmérsékletet, a keménységet és a pH- 
értéket hetente legalább egyszer mérni kell, a közeg megújítása el őtt 
és után, a kontrollcsoportokban és a legmagasabb vizsgáltanyag- koncentrációt tartalmazó edényekben.
 
A vizsgálat során szabályos id őközönként meg kell határozni a vizs ­
gáltanyag-koncentrációit.  
A félstatikus vizsgálatok során, amennyiben a vizsgált anyag 
koncentrációja a nominális koncentráció ± 20 százalékos sávján belülre várható (azaz a 80–120 %-os sávon belül; lásd 1.4. és 1.8.4. pont), minimális intézkedésként javasolt a legmagasabb és a legala ­
csonyabb vizsgálati koncentrációk elemzése, az anyag frissen elké ­
szített és a kicserélés idején meglév ő állapotában, a vizsgálat els ő 
hete során, egy alkalommal (azaz az elemzéseket az azonos oldatból vett mintán kell elvégezni; el őször, amikor az oldat frissen elkészült, 
majd a megújítás alkalmával). E meghatározásokat ezt követ ően 
legalább hetente egyszer meg kell ismételni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Az olyan vizsgálatok során, ahol a vizsgált anyag koncentrációja 
nem várható a nominális koncentráció ± 20 százalékos sávján 
belülre, elemezni kell az összes vizsgálati koncentrációt a frissen elkészült oldatoknál és a megújítás alkalmával. Azonban az olyan vizsgálatok esetében, ahol a vizsgált anyag kezdetkor mért koncent ­
rációja nem marad meg a nominális koncentráció ± 20 százalékos 
sávján belül, viszont elégséges bizonyíték hozható fel annak bemu ­
tatására, hogy a kezdeti koncentrációk megismételhet ők és stabilak 
(azaz a kezdeti koncentrációértékek 80–120 %-os tartományán belül 
vannak), a kémiai jelleg ű méréseket a vizsgálat 2. és 3. hetében a 
legmagasabb és a legalacsonyabb vizsgálati koncentrációk meghatá ­
rozására lehet lecsökkenteni. Mindegyik esetben a vizsgált anyag koncentrációjának a megújítást megel őző meghatározását csak 
minden egyes vizsgálati koncentráció egyetlen másodpéldányán 
kell elvégezni.
 
Az átfolyásos vizsgálatok esetében megfelel ő a félstatikus vizsgála ­
toknál leírtakhoz hasonló mintavételi eljárás alkalmazása (azonban 
a „régi” oldatok mérése nem alkalmazható ezen esetben). Az els ő 
hét során azonban tanácsos lehet a mintavételi esetek számát megnövelni (pl. három méréssorozatra), a vizsgálati koncentrációk stabilitásának biztosítása érdekében. Az ilyen típusú vizsgálatok 
esetében a hígítóvíz és a vizsgált anyag átfolyási sebességét 
naponta kell ellen őrizni.
 
Amennyiben bizonyítható, hogy a vizsgálandó anyag koncentrációja 
a vizsgálat teljes id őtartama alatt mindvégig sikeresen a nominális 
vagy a kezdetkor mért koncentráció ± 20 százalékán belül marad, akkor az eredményeket a nominális vagy a kezdeti értékekre lehet alapozni. Ha a nominális vagy a kezdeti koncentrációhoz képest az 
eltérés nagyobb ± 20 százaléknál, akkor az eredményeket az id ő 
függvényében kifejezett súlyozott átlaghoz képest lehet kifejezni (lásd az 5. függelékben).
 
2. ADATOK ÉS JELENTÉSKÉSZÍTÉS  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE  
E vizsgálat célja annak megállapítása, hogy a vizsgált anyag milyen 
hatást gyakorol a vizsgálati id őszak végén még életben lév ő szülők 
élő utódainak összlétszámára. Az egy szül őre jutó utódok összlét ­
számát minden egyes vizsgálai edényre (illetve párhuzamosra) nézve 
ki kell számítani. Ha valamely párhuzamosban a szül ő elpusztul a 
vizsgálat során, vagy kiderül róla, hogy hím, akkor az ilyen párhu ­
zamost ki kell hagyni az elemzésb ől. Az elemzést ekkor ugyanazon 
koncentráció csökkentett számú párhuzamosára kell alapozni.  
A vegyszerek reprodukciós képességre gyakorolt hatásaira vonat ­
kozó LOEC – és ennélfogva a NOEC – értékének meghatározá ­
sához ki kell számítani minden koncentráció összes párhuzamo ­
sában az átlagos reprodukciós teljesítményt és a standard deviációt; 
e számítást varianciaelemzéssel (ANOVA) lehet elvégezni. Ekkor 
az egyes koncentrációk átlagát egy megfelel ő többtényez ős 
módszer segítségével össze kell vetni a kontrollcsoport középérté ­
keivel. Ehhez a Dunnett- vagy a Williams-féle vizsgálatok 
megfelelőek lehetnek (14) (15) (16) (17). Ellen őrizni kell, hogy 
a varienciahomogenitására vonatkozó ANOVA-hipotézis megfelelő-e. Javasolt, hogy ezt a formális tesztelés (18) helyett 
inkább grafikus ábrázolási módszer segítségével végezzék el; a 
Bartlett-féle vizsgálat szintén megfelel ő. Ha a homogenitási feltétel 
nem teljesül, akkor az ANOVA-t megel őzően az eredmények 
transzformálását kell elvégezni a varienciahomogenitás biztosítá ­
sára, vagy súlyozott ANOVA-t kell használni. Ki kell számítani 
és jegyzőkönyvezni kell az ANOVA használatával kimutatható 
hatás (azaz a legkevésbé szignifikáns különbség) nagyságát.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Azon koncentráció becsléséhez, amely a reprodukciós teljesítmény 
50 %-os csökkenését okozza (EC  50 ) egy alkalmas, pl. egy logisztikus 
görbét kell használni, amelyet a statisztikai eljárással kapott adatokra kell illeszteni, pl. a legkisebb négyzetek elve alapján. A görbe para ­
métereit úgy kell meghatározni, hogy az EC
 50 és annak standard 
hibája közvetlenül felmérhet ő legyen. Ez jelent ősen megkönnyíti a 
EC 50 konfidenciatartomány kiszámítását. Hacsak nem szólnak külö ­
nösen er ős érvek az eltér ő konfidenciatartományok alkalmazása 
mellett, akkor kétoldalú 95 %-os konfidenciatartományokat kell 
megszabni. Az illeszkedési eljárásnak lehet őleg olyannak kell lennie, 
hogy egyben biztosítsa az illeszkedés hiánya szignifikáns becs ­
lésének eszközét. Ezt el lehet végezni grafikus módon, vagy úgy, hogy a négyzetek maradékösszegét felosztjuk „illeszkedés hiánya” és 
„tisztán hiba komponensek” elemekre, és elvégezzük az illeszkedés 
hiányára vonatkozó szignifikanciavizsgálatot. Mivel a magas szint ű 
szaporodást eredményez ő kezelések valószín űleg nagyobb mérték ű 
varianciát idéznek el ő az utódok számában, mint az alacsony szapo ­
rodást eredményez ő kezelések, számba kell venni a megfigyelt 
értékek megfelel ő súlyozását, hogy érzékeltetni lehessen a külön ­
böző, kezelésben részesül ő csoportok eltér ő varianciáit (további 
háttér-információkat lásd a (18) szakirodalomban).
 
A végső körvizsgálatból (2) kapott adatok elemzése alapján egy 
logisztikus görbe hozzáigazítására került sor az alábbi modell hasz ­
nálatával, bár más, alkalmas módszerek is használhatók:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
ahol:  
Y = a vizsgálat végén az egy életben maradt szül őre jutó utódok 
összlétszáma (külön számítva minden egyes edényre)  
X = az anyag koncentrációja  
c = az utódok várható száma, amennyiben x = 0  
X 0 = az EC  50 értéke a populációban  
b = a meredekséget jellemz ő paraméter  
E modell valószín űleg igen sok helyzetben megfelel, azonban el őfor­
dulnak olyan vizsgálatok, amelyekre nem alkalmazható. A fentiekben 
javasolt módon ellen őrizni szükséges a modell validitását az adott 
helyzetre. Egyes esetekben, amikor az alacsony koncentrációk foko ­
zott hatásokat váltanak ki, egy hormesis-modell alkalmasnak bizo ­
nyulhat (19).  
Más, a koncentrációhoz köt ődő hatások, mint az EC  10 vagy EC  20 
becslését is el lehet végezni, bár el őnyös lehet az EC  50 becsléséhez 
felhasznált modellhez képest a paraméterek egy másfajta meghatá ­
rozása.  
2.2. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentés a következ őket tartalmazza:  
2.2.1  A vizsgált anyag  
— fizikai állapota és releváns fizikai-kémiai tulajdonságai,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— a kémiai azonosítási adatok, beleértve a tisztaságot.  
2.2.2.  Vizsgált fajok  
— a klón (meg kell jelölni, ha a genetikailag tipizált), a szállító 
vagy eredet (amennyiben ismert) és az alkalmazott tenyésztési 
körülmények. Jelenteni és indokolni kell, ha a  Daphnia magnától  
eltérő fajt használnak.  
2.2.3.  Vizsgálati körülmények  
— az alkalmazandó vizsgálati eljárás (pl. fél statikus vagy átfolyá ­
sos, térfogat, az egy literre jutó Daphnák számában kifejezett 
terhelés),  
— fény-sötét periodicitás és fényintenzitás,  
— a vizsgálat kialakítása (pl. párhuzamosok száma, párhuzamoson ­
kénti szül őszám),  
— a felhasznált tenyészfolyadék részletes leírása,  
— hozzáadott szerves anyagok (amennyiben ilyenre sor kerül), bele ­
értve azok összetételét, eredetét, elkészítési módját, a törzsoldat készítmények TOC/COI tartalmát, a vizsgálati közegben mutat ­
kozó TOC/COI becslését,
 
— részletes információk az etetésr ől, beleértve a mennyiséget (mg 
C/Daphnia/nap) és az ütemezést (pl. táplálékok típusai), beleértve az algáknál a speciális elnevezést/fajt, továbbá – amennyiben ismert – a törzset és a tenyésztési körülményeket,
 
— a törzsoldat elkészítésének módszere és megújításának gyakori ­
sága (az esetleg használt oldószer vagy diszpergálószer megneve ­
zését és koncentrációját meg kell adni).  
2.2.4.  Eredmények:  
— a vizsgált anyag stabilitására vonatkozó el őzetes vizsgálatok 
eredményei,  
— a nominális vizsgálati koncentrációk és az összes olyan elemzés 
eredménye, amelyek célja a vizsgált anyag vizsgálati edényekben 
mért koncentrációjának a meghatározása (lásd a mintaadatlapokat 
a 4. függelékben); az analízis visszanyerési hatékonyságát és a meghatározás korlátait is jegyz őkönyvezni kell,
 
— a vizsgálati edényekben lév ő víz min ősége (azaz pH-érték, 
hőmérséklet, oldottoxigén-koncentráció, TOC és/vagy COI 
értékek és keménység, adott esetben) (lásd az eredménylapokat a 3. függelékben),
 
— az élő utódok teljes nyilvántartása minden egyes szül őnél (lásd az 
eredménylapokat a 3. függelékben),  
— az elhullott szül ők száma és az elhullás bekövetkezésének a napja 
(lásd az eredménylapokat a 3. függelékben),  
— a kontrollcsoportbeli szaporodási képesség variációs koefficiense 
(a vizsgálati id őszak végén az egy él ő szülőre jutó él ő utódok 
összlétszámára alapozva),  
— a vizsgálati id őszak végén az egy szül őre jutó él ő utódok teljes 
számát ábrázoló grafikon (minden párhuzamosban), a vizsgált anyag koncentrációjának függvényében,
 
— a reprodukcióra vonatkozó, legalacsonyabb megfigyelhet ő 
hatást okozó koncentráció (LOEC), beleértve a felhasznált 
statisztikai módszerek leírását, és annak jelzését, hogy milyen mértékű hatást lehetett kimutatni, továbbá a szaporodásra már 
nem hatásos koncentráció (NOEC); szükség esetén bele kell 
foglalni a jelentésbe a szül ők mortalitására vonatkozó LOEC/ ­
NOEC értékeket is,
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— szükség esetén a reprodukcióra vonatkozó EC  x és a konfidenci ­
atartomány, valamint a számításhoz használt, illesztett modell 
grafikonja, a dózisreakció görbe meredeksége és a standard hibája,
 
— más megfigyelt biológiai hatások vagy egyéb mérések: jelenteni 
kell minden megfigyelt vagy mért más jelleg ű biológiai hatást 
(pl. szülők növekedése), a megfelel ő indoklással együtt,  
— az előírt vizsgálati módszert ől való bármely eltérés magyarázata.  
3. SZAKIRODALOM  
(1) OECD TEST GUIDELINE Programme, Report of the 
Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
 
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.
 
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.
 
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine 
Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohi o.
 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P. A. 20 pp.
 
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; prob ­
lems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Lokke, 
H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.
 
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.
 
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a stan ­
dard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three 
commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobi ­
ol., 128, pp. 459-466.  
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp. 1096-1121.  
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N. Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93-96.  
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative 
Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New 
York, pp. 532.  
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G, McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
1. függelék  
TELJESKÖR ŰEN MEGHATÁROZOTT ELENDT M7 ÉS M4 KÖZEG 
ELŐÁLLÍTÁSA  
Akklimatizálás az elendt M7 ás M4 közeghez  
Egyes laboratóriumok nehézségekbe ütköztek, amikor Daphniát próbáltak átvinni 
M4 (1) és M7 közegbe. Fokozatos akklimatizálással (azaz a saját közegb ől előbb 
30, majd 60, végül 100 százalékos Elendt közegbe való áthelyezéssel) azonban sikerült bizonyos eredményeket elérni. Az akklimatizáció akár egy hónapig is eltarthat.
 
ELŐÁLLÍTÁS  
Nyomelemek  
Először megfelel ő tisztaságú (azaz deionizált, desztillált vagy reverz ozmózissal 
előállított) víz felhasználásával egyedi nyomelemeket tartalmazó, különféle törzs ­
oldatokat (I) kell készíteni. E különféle törzsoldatokból (I) egy második, egyetlen törzsoldat (II) készül, amely már tartalmazza az összes nyomelemet (kombinált 
oldat), azaz:
 
Törzsoldatok I (egyes 
anyagokból) A vízhez adott 
mennyiség 
mg/l Koncentráció (az 
M4 tenyészol-datra 
vonatkoztatva) 
-szoros A (II) kombinált törzsoldat elkészíté ­
séhez az (I) törzsoldatból az alábbi 
mennyiséget kell vízhez hozzáadni 
ml/1 
M4 M7 
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 * 6H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Mind a Na  2 EDTA, mind a FeSO  4 oldatot külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni. Ez a 
következőt eredményezi: 
21 Fe-EDTA solution 1 000-fold 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4 és M7 közeg  
Az M4 és M7 tenyészoldatot a (II) törzsoldatból, makroelemekb ől és vitami ­
nokból kell elkészíteni a következ őképpen:  
A vízhez adott 
mennyiség 
mg/l Koncentráció (az 
M4 tenyészoldatra 
vonatkoztatva) 
-szoros A tenyészoldat elkészítéséhez hozzáa ­
dott törzsoldat mennyisége 
(ml/l) 
M4 M7 
A II. törzsoldat, nyomelemekkel kombinálva 20 50 50 
Makroelem-törzsoldatok (egyetlen anyag) CaCl
 2 * 2 H  2 0 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 0 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 0 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombinált vitamintörzsoldat — 10 000 0,1 0,1 A kombinált vitamintörzsoldalt készítéséhez 3 vitamint kell 1 liter vízhez adni, a következ őképpen: 
Thiamin hidroklorid 750 10 000 — — 
Cianokobalamin (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotin 7,5 10 000 — —  
A kombinált vitamintörzsoldatot kis aliquot mennyiségekben, fagyasztott állapotban kell tartani. A tenyészoldathoz a vitaminoka t 
röviddel a felhasználás el őtt kell hozzáadni.  
Megjegyzések:  A végleges tenyészoldat elkészítésekor a sók kicsapódásának elkerülése érdekében a kis adag törzsoldatokat kb. 
500–800 ml deionizált vízhez kell adni, majd a mennyiséget fel kell tölteni 1 literre. 
Az M4 tenyészoldatról szóló els ő publikáció az Elendt, B. P. (1990)-ben található. Selenium deficiency in crustacea; an 
ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154., pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
2. függelék  
ÖSSZES SZERVES SZÉN (TOC) MEGHATÁROZÁSA ÉS NOMOGRAM 
KÉSZÍTÉSE ALGAALAPÚ TÁPLÁLÉK TOC-TARTALMÁNAK 
ÁBRÁZOLÁSÁRA  
Ismert, hogy az algaalapú táplálék széntartalmát általában nem közvetlenül kell 
mérni, hanem olyan helyettesít ő paraméterekkel rendelkez ő korrelációk (azaz 
nomogramok) alapján, mint pl. az algaszám vagy a fényabszorbancia.  
A TOC értékét az UV-sugárzásra alapozott vagy a perszulfátos módszerek helyett 
inkább magas h őmérséklet ű oxidáció által célszer ű mérni. (Lásd: The Instrumental 
Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related 
Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).  
A nomogram elkészítéséhez az algákat a tenyészfolyadéktól centrifugálással el 
kell különíteni, amit desztillált vízben való reszuszpenzió követ. A helyettesít ő 
paramétert és a TOC-koncentrációt, minden mintában három példányban kell mérni. Kizárólag desztillált vizet tartalmazó vakmintákat kell elemezni, és a 
TOC-koncentrációt az algát tartalmazó minta TOC-koncentrációjából kell 
levonni.
 
A nomogram lineárisan fut a szénkoncentrációk megkövetelt tartományában.  
Megjegyzés: E példákat nem szabad konverzióra használni; alapvet ő fontosságú, 
hogy a laboratóriumok elkészítsék a saját nomogramjukat.
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
3. függelék  
MINTAADATLAP A KÖZEGMEGÚJÍTÁS, FIZIKAI/KÉMIAI FIGYELEMMEL KÍSÉRÉS SORÁN KELETKEZETT ADATOK, ETETÉS, DAPHNIA-REPRODUKCIÓ ÉS FELN ŐTT 
ÁLLATOK MORTALITÁSÁNAK JEGYZ ŐKÖNYVEZÉSÉHEZ  
Kísérlet sorszama Kezd őnap: Klón: Tenyészoldat: Táplálék típusa: Vizsgált anyag: Névl. konc.: 
Nap 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Közegmegújítás 
(x-szel jelöljük) 
PH (  1 ) új 
régi 
0 2 mg/l (  1 ) új 
regi 
Hőmérséklet (  o C) (  1 ) új 
regi 
Beadott táplálék 
(x-szel jelöljük) 
Élettelen utód (  2 ) Összes 
1. edény 
2 
3 4 5
 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Kísérlet sorszama Kezd őnap: Klón: Tenyészoldat: Táplálék típusa: Vizsgált anyag: Névl. konc.: 
Nap 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Összes 
Kumulált feln őttkori 
mortalitás (
 3 ) 
( 1 ) Jelölje meg, hogy melyik edényt használták a kísérlethez. 
( 2 ) Jelölje a megfelel ő mezőben a pusztult utódot „U”. 
( 3 ) Jelölje a megfelel ő mezőben a feln őtt állatok mortalitását „SZ”.
 4. függelék  
MINTAADATLAP KÉMIAI ELEMZÉSEK EREDMÉNYEINEK JEGYZ ŐKÖNYVEZÉSÉHEZ  
a) Mért koncentrációk  
Névleges konc. 1. heti minta 2. heti minta 3. heti minta 
friss régi friss régi friss régi  
b) Mért koncentrációk a névleges koncentrációk százalékában  
Névleges konc. 1. heti minta 2. heti minta 3. heti minta 
friss régi friss régi friss régi  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
5. függelék  
IDŐARÁNYOSAN SÚLYOZOTT ÁTLAG SZÁMÍTÁSA  
Időarányosan súlyozott átlag  
Mivel a vizsgált anyag koncentrációja a közeg megújításai közötti id őinterval­
lumban csökkenhet, szükséges mérlegelni, hogy melyik az a koncentráció, 
amelyet reprezentatívnak kell kiválasztani azon koncentrációsáv meghatározása 
szempontjából, amelynek a Daphnia szül ők ki vannak téve. A kiválasztást bioló ­
giai és statisztikai megfontolásokra kell alapozni. Például amennyiben úgy t űnik, 
hogy a reprodukciót f őként az alkalmazásra kerül ő legmagasabb koncentráció 
befolyásolja, akkor azt kell alkalmazni. Amennyiben azonban fontosabbnak 
látszik a toxikus anyag halmozott vagy hosszabb id ő alatt jelentkez ő hatása, 
akkor egy átlagos koncentráció választása a célszer űbb. Ebben az esetben az 
időarányosan súlyozott átlagkoncentráció a megfelel ő, mivel ez figyelembe 
veszi a pillanatnyi koncentrációnak az id ő függvényében történ ő változásait.  
1. ábra  
Példa az id őarányosan súlyozott középértékre
  
Az 1. ábra egy (egyszer űsített) hétnapos, a közeg megújítását a 0., 2. és 4. napra 
ütemező vizsgálatot mutat be.  
— A vékony, cikcakkos vonal ábrázolja a koncentrációt az id ő függvényében. 
Feltételezhet ő, hogy a koncentrációcsökkenés egy exponenciális csökkenési 
folyamatot követ.  
— A hat, kis négyzettel jelzett pont jelöli az egyes közegmegújítási id őszakok 
elején és végén mért koncentrációkat.  
— A vastag vonal jelzi az id őarányosan súlyozott átlagot.  
Az időarányosan súlyozott átlagot úgy kell kiszámítani, hogy az id őarányosan 
súlyozott átlag nagysága megegyezzen a koncentrációgörbe alatti területtel. A 
fenti példa számítási menetét az 1. táblázat mutatja be.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
1. táblázat  
Az időarányosan súlyozott átlag számítása  
Közegmegújítás száma Napok Konc. 0 Konc. 1 Ln(Konc.0) Ln(Konc.1) Terület  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Napok száma, összesen: 7 Összterület 50,091 
IA átlag 7,156
 
A „napok” kifejezés a megújítási folyamat napjainak a számát jelenti.  
A „Konc. 0” kifejezés az egyes megújítási id őszakok kezdetekor mért koncentráció.  
A „Konc. 1” kifejezés az egyes megújítási id őszakok végén mért koncentráció.  
A „Ln(Konc. 0)” kifejezés a „Konc. 0” természetes alapú logaritmusa.  
A „Ln(Konc. 1)” kifejezés a „Konc. 1” természetes alapú logaritmusa.  
A „terület” az egyes megújítási id őszakokra megszerkesztett exponenciális görbe alatti terü ­
letet jelöli. A következ ő képlettel kell kiszámítani:  
Area ¼ Konc 0 Ä Konc 1 
LnðKonc 0Þ Ä LnðKonc 1Þ Ü Napok  
Az időarányosan súlyozott átlag („IA átlag”) a „Teljes terület” és az „Összes 
nap” hányadosa.  
A Daphnia reprodukciós vizsgálat céljaira természetesen a táblázatot úgy kell 
kiterjeszteni, hogy az 21 napot fedjen le.  
Egyértelm ű, hogy ha csak a közeg egyes megújítási id őszakainak az elején és 
végén végeznek megfigyeléseket, akkor nincs mód annak a meger ősítésére, hogy 
a csökkenés valóban exponenciális. Egy másfajta görbe a „Terület”-re nézve 
másfajta számítási eredményre vezetne. Az exponenciális csökkenési folyamat azonban valószín űsíthető, és egyéb információk hiányában valószín űleg a legjobb 
görbét adja.
 
Óvatosságra int azonban, ha a megújítási id őszak végén a kémiai analízis nem 
mutat ki semmilyen anyagot. Ha nem lehet megbecsülni, hogy milyen gyorsan 
tűnt el a vizsgált anyag az oldatból, akkor lehetetlen reálisan megítélni a görbe 
alatti terület nagyságát, s emiatt lehetetlen megállapítani egy ésszer ű, időará­
nyosan súlyozott átlagot.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  TALAJLAKÓ MIKROORGANIZMUSOK: NITROGÉNÁTALA ­
KÍTÁSI VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer az OECD TG 216 (2000) módszer megfele ­
lője. 
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a vizsgálati módszer egy olyan laboratóriumi módszert ismertet, 
amelynek célja annak vizsgálata, hogy az egyes vegyületek egyszeri 
expozíció esetén milyen hosszú távú hatásokat gyakorolnak a talaj ­
lakó mikroorganizmusok nitrogénátalakítási aktivitására. A vizsgálat elsősorban az Európai és Földközi-tenger Melléki Növényvédelmi 
Szervezet ajánlásain alapul (1). Azonban más iránymutatásokat, 
ezen belül a German Biologische Bundesanstalt (2), az Egyesült Államok Környezetvédelmi Hivatala (3), a SETAC (4), valamint a Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (5) iránymutatásait is figye ­
lembe vettünk. Az 1995-ben az olaszországi Belgiratéban megrende ­
zett, a talajok/üledékek kiválasztásával kapcsolatos OECD-munka ­
értekezleten (6) megegyezés született az e vizsgálatban alkalmazandó talajok számáról és típusáról. A talajminták gy űjtéséről, kezelésér ől 
és tárolásáról szóló ajánlások egy ISO-útmutatón (7) és a belgiratei 
munkaértekezlet ajánlásain alapulnak. A vizsgálandó anyagok toxikus jellemz őinek meghatározása és értékelése során szükség 
lehet a talaj mikrobiális aktivitására gyakorolt hatások meghatározá ­
sára, például olyan esetben, ha adatokra van szükség a növényvéd ő 
szereknek a talaj mikroflórájára gyakorolt esetleges mellékhatásaival kapcsolatban, vagy ha a talajlakó mikroorganizmusoknak növény ­
védő szerektől eltérő vegyületekkel szembeni expozíciója várható. 
A nitrogénátalakítási vizsgálat végrehajtásának célja az ilyen vegyü ­
leteknek a talaj mikroflórájára gyakorolt hatásainak meghatározása. Amennyiben mez őgazdasági vegyi anyagok (pl. növényvéd ő szerek, 
műtrágyák, erdészeti vegyi anyagok) vizsgálatáról van szó, mind a 
nitrogénátalakítási, mind a szénátalakítási vizsgálatot el kell végezni. 
Ha nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata történik, elég a 
nitrogénátalakítási vizsgálatot elvégezni. Ha azonban a nitrogénátala ­
kítási vizsgálat az ilyen vegyületek esetében olyan EC
 50 -értékeket 
eredményez, amelyek a kereskedelmi forgalomban kapható nitrifiká ­
ciógátló szerek (pl. nitrapirin) esetében tapasztalt tartományba esik, további információk gy űjtése érdekében a szénátalakítási vizsgálatot 
is el lehet végezni.
 
A talajok él ő és élettelen komponensekb ől épülnek fel, amelyek 
komplex és heterogén elegyek formájában léteznek. A mikroorganiz ­
musok számos fajjal fontos szerepet játszanak a term őtalajok szerves ­
anyag-tartalmának lebontásában és átalakításában, hozzájárulva a talajok termékenységének különféle aspektusaihoz. Az ilyen bioké ­
miai folyamatokat megzavaró hosszú távú hatások potenciálisan 
megzavarhatják a tápanyag-körforgalmat, ami megváltoztathatja a 
talaj termékenységét. Szén- és nitrogénátalakítás minden term őta­
lajban folyik. Bár az e folyamatokért felel ős mikrobaközösségek 
talajonként eltér őek, az átalakítási útvonalak lényegében azonosak.
 
Az ismertetett vizsgálati módszer célja valamely anyagnak az aerob 
feltalajokban zajló nitrogén-átalakítási folyamatra gyakorolt hosszú távú káros hatásainak kimutatása. A vizsgálati módszer lehet ővé 
teszi az anyagnak a talaj mikrofl órája által végzett szénátalakítására 
gyakorolt hatásainak becslését. A nitrátképz ődés a szén-nitrogén 
kötések felbomlása után megy végbe. Ha tehát a kezelt és az ellen ­ 
őrző talajmintákban azonos a nitrátképz ődés sebessége, nagyon való ­
színű, hogy a f őbb szénlebontási útvonalak épek és m űködőképesek. 
A vizsgálathoz választott szubsztrátban (porított lucernaliszt) kedvező (általában 12:1 és 16:1 közötti) a szén-nitrogén arány. 
Emiatt a vizsgálat során csökken a szénéhezés, és ha a vegyi 
anyag károsítja a mikrobaközösségeket, azok 100 napon belül hely ­
reállítódhatnak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Azokat a teszteket, amelyekb ől ezt a vizsgálati módszert kifejlesztet ­
ték, elsősorban olyan anyagokhoz dolgozták ki, amelyek esetében 
előre jelezhet ő a talajba kerül ő mennyiség. Ez a helyzet például a 
növényvéd ő szerek esetében, amelyeknél ismert a szántóföldi alkal ­
mazás mértéke. A mez őgazdasági vegyi anyagok esetében elegend ő 
két, a várt vagy becsült alkalmazási mérték szempontjából releváns 
dózist alkalmazni. A mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálhatók 
aktív összetev őként (a.ö.) vagy formulázott termékként is. A vizs ­
gálat azonban nem korlátozódik kizárólag a mez őgazdasági vegyi 
anyagokra. Mind a vizsgálandó anyagnak a talajban alkalmazott 
mennyiségét, mind az adatok kiértékelésének módját módosítva, a vizsgálat mez őgazdasági vegyi anyagoktól eltér ő vegyületekre is 
alkalmazható, amelyek esetében nem ismert a talajba várhatóan 
bejutó mennyiség. A mez őgazdasági vegyi anyagoktól eltér ő vegyü­
letek esetében tehát egy sor koncentrációnál meg kell határozni a nitrogén-átalakításra gyakorolt hatásokat. Az ilyen vizsgálatokkal kapott adatok dózis-válasz görbék elkészítésére és EC
 x -értékek 
számítására használhatók fel, ahol x jelentése % hatás.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
„Nitrogénátalakítás”: a nitrogéntartalmú szerves anyagok mikroorga ­
nizmusok által végzett, ammonifikáción és nitrifikáción keresztüli végső lebontása a megfelel ő szervetlen végtermékké, nitráttá.
 
„EC  x (hatásos koncentráció)”: a vizsgálandó anyag olyan talajbeli 
koncentrációja, amely x %-osan gátoljaátolja a nitrogén nitráttá alakulását.
 
„EC  50 (közepes hatásos koncentráció)”: a vizsgálandó anyag olyan 
talajbeli koncentrációja, amely 50 százalékosan (50 %-osan) gátolja a 
nitrogén nitráttá alakulását.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs.  
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Átszitált talajt porított növényi liszttel fel kell javítani, majd vagy 
kezelni kell a vizsgálandó anyaggal, vagy kezeletlenül kell hagyni 
(kontroll). Mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén minimá ­
lisan két vizsgálati koncentráció alkalmazása ajánlott, amelyeket a szántóföldeken várható legmagasabb koncentráció függvényében kell megválasztani. Az inkubálás 0., 7., 14. és 28. napja után a kezelt 
és ellenőrző talajmintákat megfelel ő oldószerrel extrahálni kell, és 
meg kell határozni a kivonatokban lév ő nitrát mennyiségét. Ezt 
követően történik a kezelt talajokban mért nitrátképz ődés arányának 
összehasonlítása a kontrollokban mérttel, valamint a kezelt és az 
ellenőrző talajminták közötti százalékos eltérés kiszámítása. Minden 
vizsgálatot legalább 28 napig kell végezni. Ha a 28. napon a kezelt és nem kezelt talajok közötti különbség 25 % vagy annál nagyobb, a 
méréseket legfeljebb 100 napig folytatni kell. Ha nem mez őgazda­
sági vegyi anyagok vizsgálata történik, a vizsgálandó anyag egy sor különböző koncentrációjátoncentrációját kell a talajmintákhoz adni, 
és 28 napos inkubálás után meg kell mérni a kezelt és az ellen őrző 
mintákban képz ődött nitrát mennyiségét. A különféle koncentrációk 
alkalmazásával kapott vizsgálati eredményeket regressziós modell segítségével kell elemezni, majd ki kell számítani az EC
 x -értékeket 
(azaz az EC  50 -et, az EC  25 -öt és/vagy az EC  10 -et). Lásd a fogalom ­
meghatározásokat.  
1.5. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A mezőgazdasági vegyi anyagokkal kapott vizsgálati eredmények 
értékelése az ellen őrző és a kezelt talajminták nitráttartalma közötti 
viszonylag kis különbségeken (azaz az átlag ± 25 %-a) alapul, így az ellenőrző minták közötti nagy eltérések hamis eredményekhez vezet ­
hetnek. A párhuzamos ellen őrző minták közötti eltérésnek ±15 %-nál 
kisebbnek kell lennie.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Eszközök  
Kémiailag inert anyagból készült vizsgálati edényeket kell használni. 
Ezeknek megfelel ő, a talajok inkubálására alkalmazott eljárással, 
például az ömlesztve inkubálással vagy egyedi talajminták sorozata ­
ként történ ő inkubálásával összhangban lév ő kapacitásúnak kell 
lenniük (lásd az 1.7.1.2. szakaszt). Ügyelni kell egyrészt a vízvesz ­
teség minimalizálására, másrészt a gázcsere lehet ővé tételére a vizs ­
gálat során (például a vizsgálati edények perforált polietilén fóliával 
fedhetők le). Illékony anyagok vizsgálata esetén zárható és légmen ­
tesen záródó edényeket kell alkalmazni. Az edényeknek olyan mére ­
tűnek kell lenniük, hogy a talajminta térfogatuk körülbelül egyne ­
gyedéig töltse fel őket. 
Szabványos laboratóriumi eszközöket és ezen belül a következ őket 
kell használni:  
— keverőberendezés: mechanikai rázógép vagy ezzel egyenérték ű 
más berendezés,  
— centrifuga (3 000 g) vagy sz űrőeszköz (nitrátmentes sz űrő­
papírral),  
— a nitrátanalízishez megfelel ő érzékenységet és reprodukálható ­
ságot biztosító m űszer. 
1.6.2.  A talajok kiválasztása és száma  
Csak egyféle talaj használható. A javasolt talajjellemz ők a követ ­
kezők: 
— homoktartalom: legalább 50 % és legfeljebb 75 %,  
— pH: 5,5–7,5,  
— szervesszén-tartalom: 0,5–1,5 %,  
— meg kell mérni a mikrobiális biomasszát (8) (9), amelynek szén ­
tartalma a talaj teljes szervesszén-tartalmának legalább 1 %-a kell 
hogy legyen.  
Az esetek többségében az ilyen jellemz őkkel rendelkez ő talaj a 
legrosszabb helyzetet reprezentálja, mivel minimális a vizsgálandó vegyület adszorpciója, viszont maximális a hozzáférhet ősége a 
mikroflóra számára. Következésképpen általában nincs szükség más 
talajokkal végzett vizsgálatokra. Bizonyos körülmények között azon ­
ban, például amikor a vizsgálandó anyag várható f ő felhasználási 
területe a különleges talajok, például a savanyú erd őtalajok vagy 
az elektrosztatikus töltéssel rendelkez ő vegyületek esetében is, 
szükség lehet egy másik talajtípus alkalmazására is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  A talajminták begy űjtése és tárolása  
1.6.3.1.  Gyűjtés 
Részletes információkkal kell rendelkezni annak a szántóföldi terü ­
letnek a történetér ől, ahonnan a vizsgálati talajminta begy űjtése törté ­
nik. Ilyen részletek például a pontos hely, a növénytakaró, a növény ­
védő szerekkel végzett kezelések id őpontjai, a szerves és szervetlen 
trágyák alkalmazásai, a biológiai anyagok hozzáadása vagy a véletlen szennyezések. A talajminták gy űjtéshez olyan helyet kell 
választani, amely hosszú távon használható erre a célra. Megfelel őek 
például az állandó legel ők, az évente gabonatermést (kivéve kukori ­
cát) hozó területek vagy a zöldtrágyával s űrűn bevetett területek. 
Követelmény, hogy a kiválasztott mintagy űjtési helyet a mintagy űj­
tést megel őzően legalább egy évig ne kezeljék növényvéd ő szerek­
kel. Továbbá legalább hat hónapig ne kapjon szerves trágyázást. Ásványi m űtrágya alkalmazása csak akkor elfogadható, ha a haszon ­
növény igényeinek megfelel ően történik, és a m űtrágyázást követ ően 
legalább három hónapig nem szabad talajmintákat venni. Kerülni kell az ismert biocid hatású m űtrágyákkal (pl. kalcium-ciánamiddal) 
kezelt talajok alkalmazását.
 
Kerülni kell a mintavételt hosszú (30 napnál hosszabb) ideig tartó 
szárazság vagy elvizesedés esetén, illetve közvetlenül ilyen 
időszakok után. Szántott talajok esetében a mintákat 0–20 cm mély ­
ségből kell venni. Legel ők vagy egyéb olyan talajok esetében, 
amelyeket hosszú ideig (legalább egy vegetációs periódusig) nem 
szántanak fel, a mintavétel maximális mélysége 20 cm-nél kicsit 
több (pl. 25 cm) is lehet.  
A talajmintákat olyan edényekben és olyan h őmérsékleti feltételek 
mellett kell elszállítani, amelyek garantálják, hogy a talaj eredeti 
tulajdonságai nem módosulnak szignifikáns mértékben.  
1.6.3.2.  Tárolás  
Legelőnyösebb a frissen gy űjtött talajok alkalmazása. Ha a laborató ­
riumi tárolás nem kerülhet ő el, a talajok sötétben, 4 ± 2  o C-on 
legfeljebb három hónapig tárolhatok. A talajok tárolása során aerob körülményeket kell biztosítani. Ha a talajminták begy űjtése olyan 
területeken történt, ahol a talaj az év legalább három hónapjában 
fagyott, szóba jöhet hat hónapos, mínusz 18
 o C és mínusz 22  o C 
közötti h őmérsékleten való tárolás is. Minden egyes kísérlet el őtt 
meg kell mérni a tárolt talajok mikrobiális biomasszáját, és a 
biomassza széntartalmának el kell érnie a talaj teljes szervesszén- 
tartalmának legalább 1 %-át (lásd az 1.6.2. szakaszt).  
1.6.4.  A talaj kezelése és el őkészítése a vizsgálatra  
1.6.4.1.  Előinkubálás  
Tárolt talaj használata esetén (lásd az 1.6.3.2. szakaszt) ajánlatos 2- 
től 28 napig terjed ő előinkubálást alkalmazni. Az el őinkubálás során 
a talaj h őmérsékletének és nedvességtartalmának hasonlónak kell 
lennie a vizsgálat során alkalmazott h őmérséklethez és nedvességtar ­
talomhoz (lásd az 1.6.4.2. és az 1.7.1.3. szakaszt).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fizikai-kémiai tulajdonságok  
A talajból manuálisan el kell távolítani a nagyobb tárgyakat (például 
köveket, növényi részeket stb.), majd a túlzott kiszáradást kerülve a talajt nedvesen át kell szitálni úgy, hogy a részecskeméret legfeljebb 
2 mm legyen. A talajminta nedvességtartalmát desztillált vagy 
ioncserélt vízzel a maximális víztartó képesség 40–60 %-ára kell beállítani.
 
1.6.4.3.  Szerves szubsztráttal történ ő javítás  
A talajt megfelel ő szerves szubsztráttal, például 12:1 és 16:1 közötti 
C:N arányú, porított zöldlucernaf ű-liszttel (f ő összetev ő: Medicago 
sativa ) fel kell javítani. A javasolt lucerna-talaj arány 5 g lucerna per 
1 kilogramm talaj (szárazsúly).  
1.6.5.  A vizsgálandó anyag el őkészítése a talajon történ ő alkalmazáshoz  
A vizsgálandó anyagot általában hordozó segítségével kell alkal ­
mazni. A hordozó lehet víz (vízben oldható anyagok esetében) vagy valamely inert szilárd anyag, így például finom kvarchomok 
(részecskeméret: 0,1–0,5 mm). Kerülni kell a vízt ől eltérő folyékony 
hordozók (például szerves oldószerek, így például aceton, kloroform) alkalmazását, mivel ezek károsíthatják a mikroflórát. Ha hordozóként 
homokot használunk, a homok be is vonható a megfelel ő oldó­
szerben feloldott vagy szuszpendált vizsgálandó anyaggal. Ilyen esetekben az oldószert a talajba való bekeverés el őtt el kell párolog ­
tatni. Ahhoz, hogy a vizsgálandó anyag optimális módon oszoljon 
szét a talajban, a következ ő arány ajánlott: 10 g homok per 1 kilo ­
gramm talaj (szárazsúly). Az ellen őrző mintákat ugyanilyen mennyi ­
ségű vízzel és/vagy kvarchomokkal kell kezelni.
 
Illékony vegyületek vizsgálata esetén, amennyire lehet, kerülni kell a 
kezelés közbeni veszteséget, valamint a vegyület talajban való homogén eloszlásának biztosítására is törekedni kell (például a vizs ­
gálandó anyagot több helyen is be kell injektálni a talajba).
 
1.6.6.  Vizsgálati koncentrációk  
Mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén legalább két 
koncentrációt kell alkalmazni. Az alacsonyabb koncentrációnak legalább a gyakorlatban a talajba várhatóan bejutó legnagyobb 
mennyiségnek kell megfelelnie, a magasabb koncentrációnak pedig 
az alacsonyabb koncentráció valamely többszörösének kell lennie. A talajhoz adott vizsgálandó anyag koncentrációját 5 cm-es mélységig egyenletes beépülést és 1,5 g/cm
 3 -es talaj térfogats űrűséget feltéte ­
lezve kell kiszámolni. A közvetlenül a talajra kihordott mez őgazda­
sági vegyi anyagok vagy az olyan vegyületek esetében, amelyeknek a talajba bejutó mennyisége el őre jelezhet ő, az ajánlott vizsgálati 
koncentrációk a következ ők: a maximális becsült környezeti koncent ­
ráció (PEC) és ennek ötszöröse. Azoknak az anyagoknak az eseté ­
ben, amelyeket egy idényben várhatóan több alkalommal is kihor ­
danak a talajokra, a vizsgálathoz alkalmazandó koncentráció a PEC- értéknek a kihordások maximálisan várható számával történ ő 
megszorzásával számítható ki. A vizsgált magasabb koncentrációnak 
azonban nem szabad meghaladnia az egyszeri maximális alkalmazási arány tízszeresét. Nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata 
esetén legalább öt, mértani sort alkotó koncentrációt kell alkalmazni. 
A vizsgált koncentrációknak le kell fedniük az EC
 x -értékek meghatá ­
rozásához szükséges tartományt.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. A VIZSGÁLAT VÉGREHAJTÁSA  
1.7.1.  Az expozíció körülményei  
1.7.1.1.  Kezelés és kontroll  
Mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén a talajt három, 
egyenlő tömegű részre kell osztani. Két részlethez a terméket is 
tartalmazó hordozót kell keverni, a harmadikhoz pedig csak hordozót (kontroll). Ajánlatos a kezelt és nem kezelt talajokat is legalább három másolati mintában vizsgálni. Nem mez őgazdasági vegyi 
anyagok vizsgálata esetén a talajt hat, egyenl ő tömegű részletre 
kell osztani. Öthöz a vizsgálandó anyagot is tartalmazó hordozót kell keverni, a hatodikhoz pedig csak hordozót. A kezeléseket és 
az ellenőrző kísérleteket is ajánlatos legalább három másolati 
mintában végezni. Vigyázni kell arra, hogy az anyag homogén módon legyen eloszlatva a kezelt talajmintákban. A bekeverés során el kell kerülni a talaj tömörödését vagy összecsomósodását.
 
1.7.1.2.  A talajminták inkubálása  
A talajminták inkubálása kétféle módon történhet: az egyes kezelt és 
nem kezelt talajokból vagy ömlesztett mintákat kell készíteni, vagy 
egy sor önálló és egyforma méret ű részmintát. Illékony vegyületek 
vizsgálata esetén azonban a vizsgálatot csak egy önálló részmin ­
tákból álló sorozattal kell elvégezni. A talajok ömlesztve történ ő 
inkubálása esetén minden kezelt és nem kezelt talajt nagy mennyi ­
ségben kell elkészíteni, és a vizsgálat során szükség szerint ezekb ől 
kell részmintákat venni a különféle analízisekhez. Az, hogy kiindu ­
lásképpen milyen mennyiséget kell készíteni az egyes kezelésekhez és ellenőrző vizsgálatokhoz, függ a részminták méretét ől, az analí ­
zishez használt másolati minták számától, valamint a mintavételek 
várható maximális számától. A részminták vétele el őtt az ömlesztve 
inkubált talajokat alaposan össze kell keverni. Ha a talajok inkubá ­
lása önálló részminták sorozataként történik, az egyes kezelt és nem 
kezelt ömlesztett talajmintákat a szükséges számú részmintára kell 
felosztani, amelyeket azután igény szerint kell felhasználni. Olyan kísérleteknél, amikor várhatóan több mint két alkalommal kell majd mintát venni, elegend ő számú részmintát kell készíteni ahhoz, 
hogy azokból minden másolati mintára és mintavételi alkalomra 
jusson. A teszttalajokat legalább három másolati mintában kell aerob körülmények között inkubálni (lásd az 1.7.1.1. szakaszt). Minden egyes vizsgálat során megfelel ő gőztérrel rendelkez ő 
edényeket kell használni annak érdekében, hogy ne alakuljanak ki 
anaerob körülmények. Illékony anyagok vizsgálata esetén a vizs ­
gálatot csak egy önálló részmintákból álló sorozattal kell elvégezni.
 
1.7.1.3.  A kísérlet körülményei és id őtartama  
A vizsgálatot sötétben, 20 ± 2  o C-os szobah őmérsékleten kell elvé ­
gezni. A talajmintákat a vizsgálat id őtartama alatt a talaj maximális 
víztartó kapacitásának 40 és 60 százaléka közötti értéken kell tartani 
(lásd az 1.6.4.2. szakaszt) ± 5 %-os eltéréssel. Szükség esetén desz ­
tillált vagy ioncserélt víz adható a mintákhoz.  
A vizsgálat minimális id őtartama 28 nap. Mez őgazdasági vegyi 
anyagok vizsgálata esetén össze kell hasonlítani a kezelt és az ellen ­ 
őrző mintákban mért nitrátképz ődési sebességet. Ha a 28. napon ezek 
több mint 25 %-kal eltérnek egymástól, a vizsgálatot addig kell 
folytatni, amíg a különbség 25 %-ra vagy az alá nem csökken, vagy legfeljebb 100 napig, ha az a korábbi id őpont. A nem mez ő­
gazdasági vegyi anyagok esetében a vizsgálat a 28 nap után véget ér. 
A 28. napon meg kell határozni a kezelt és az ellen őrző talajminták 
nitráttartalmát, és ki kell számítani az EC
 x -értékeket.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Mintavétel és a talajok elemzése  
1.7.2.1.  Talajminta-vételi program  
Mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén a 0., 7., 14. és 28. 
napon meg kell mérni a talajminták nitráttartalmát. Ha hosszabb 
időtartamú vizsgálatot kell végezni, a nitráttartalomméréseket a 28. 
nap után 14 naponta kell végezni.  
Nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén legalább öt 
vizsgálati koncentrációt kell alkalmazni, és a talajminták nitráttar ­
talmát az expozíciós id őszak kezdetén (0. nap) és végén (28. nap) 
kell megmérni. Szükség esetén be lehet iktatni egy köztes mérést is, 
például a 7. napon. A 28. napon kapott adatok segítségével meg kell határozni a vegyület EC
 x -értékeit. Szükség esetén a talaj kiindulási 
nitráttartalmának megadására a 0. napon az ellen őrző mintákban mért 
adatokat lehet felhasználni.  
1.7.2.2.  A talajminták analízise  
Minden mintavételi id őpontban meg kell határozni az egyes kezelt és 
ellenőrző másolati mintákban keletkezett nitrát mennyiségét. A nitrát 
kinyerése a talajból úgy történik, hogy a mintákat egy extrakciós 
oldószerrel, például 0,1 M kálium-klorid oldattal rázatni kell. A javasolt arány 5 ml KCl-oldat 1 gramm talaj szárazsúly-egyenértékre. Az extrahálás optimalizálásra érdekében a talajmintát és az extrak ­
ciós oldatot tartalmazó edények legfeljebb félig lehetnek. Az 
elegyeket 60 percig 150 rpm fordulatszámon kell rázatni. Ezt köve ­
tően az elegyeket centrifugálni vagy sz űrni kell, és a folyadékfá ­
zisban kell meghatározni a nitrát mennyiségét. A részecskementes 
folyékony kivonatok az analízist megel őzően mínusz 20 ± 5
 o C-on 
legfeljebb hat hónapig tárolhatók.  
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Mezőgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálat esetén le kell 
jegyezni az egyes másolati talajmintákban képz ődött nitrát mennyi ­
ségét, és a másolati minták átlagát táblázatos formában kell megadni. 
A nitrogénátalakítási arányokat megfelel ő és általánosan elfogadott 
statisztikai módszerekkel (például F-teszt, 5 %-os szignifikanciaszint) kell kiértékelni. A képz ődött nitrát mennyiségét mg nitrát/kg talaj 
(szárazsúly)/nap egységekben kell kifejezni. Az egyes kezeléseknél 
mért nitrátképz ődési sebességeket össze kell hasonlítani az ellen őrző 
mintában mérttel, és ki kell számítani az ellen őrző mintától való 
százalékos eltérést.
 
Nem mez őgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálat esetén meg 
kell határozni az egyes másolati mintákban képz ődött nitrát mennyi ­
ségét, és dózis-válasz görbét kell felvenni az EC  x -értékek becslésé ­
hez. A kezelt minták 28 nap után mért nitráttartalmát (mg nitrát/kg 
talaj (szárazsúly)) össze kell hasonlítani az ellen őrző mintákban mért ­
tel. Ezekb ől az adatokból ki kell számítani az egyes vizsgálati 
koncentrációkra vonatkozó %-os gátlási értékeket. A százalékos érté ­
keket a koncentráció függvényében kell ábrázolni, majd statisztikai 
eljárások alkalmazásával ki kell számítani az EC  x -értékeket. A 
számított EC  x -értékek konfidenciahatárát (p = 0,95) is a szabványos 
eljárások segítségével kell meghatározni (10) (11) (12).  
A nagy mennyiség ű nitrogént tartalmazó vizsgálandó anyagok növel ­
hetik a vizsgálat során képz ődött nitrát mennyiségét. Ha magas 
koncentrációban történik az ilyen anyagok (azaz olyan vegyi anya ­
gok, amelyek várhatóan ismételt kihordással kerülnek felhasználásra) vizsgálata, gondoskodni kell a megfelel ő ellenőrző mintákról (talaj 
plusz vizsgálandó anyag, növényi liszt hozzáadása nélkül). Az ilyen 
ellenőrző mintákból származó adatokat is figyelembe kell venni az 
EC
 x -értékek számításakor.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Ha a mez őgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálatok eredmé ­
nyeinek értékelésekor az alacsonyabb koncentrációjú kezeléssel (azaz a maximális becsült koncentrációval) és az ellen őrző mintákkal 
kapott nitrátképz ődési arányok különbsége a 28. nap utáni mintavé ­
teli időpontok valamelyikénél nem haladja meg a 25 %-ot, azt a 
következtetést kell levonni, hogy a terméknek nincs hosszú távú hatása a talajokban zajló nitrogénátalakításra. A nem mez őgazdasági 
vegyi anyagokkal végzett vizsgálatok esetében a vegyületek értéke ­
léséhez az EC
 50 -, EC  25 - és/vagy EC  10 -értékeket kell használni.  
3. JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
a talaj teljes kör ű azonosítása, ezen belül:  
— a terület földrajzi meghatározása (földrajzi hosszúság és széles ­
ség),  
— a terület történetével kapcsolatos információk (növénytakaró, 
növényvéd ő szerekkel való kezelés, m űtrágyázás, véletlen szeny ­
nyezések stb.),  
— földhasználat (például mez őgazdasági talaj, erd ő stb.),  
— a mintavétel mélysége (cm),  
— homok-/iszap-/agyagtartalom ( % szárazsúly),  
— pH (vízben),  
— szervesszén-tartalom ( % szárazsúly),  
— nitrogéntartalom ( % szárazsúly),  
— kiindulási nitrátkoncentráció (mg nitrát/kg szárazsúly),  
— kationcserél ő kapacitás (mmol/kg),  
— mikrobiális biomassza a teljes szervesszén-tartalom százalékában 
kifejezve,  
— hivatkozások az egyes paraméterek meghatározásához alkalma ­
zott módszerekre,  
— a talajminták gy űjtésével és tárolásával kapcsolatos minden infor ­
máció,  
— adott esetben a talaj el őinkubálásával kapcsolatos részletek.  
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai jelleg és adott esetben fizikai-kémiai tulajdonságok,  
— -– kémiai azonosító adatok, és ezen belül adott esetben a szer ­
kezeti képlet, tisztaság (növényvéd ő szerek esetében az aktív 
összetevő százalékos aránya), nitrogéntartalom.  
Szubsztrát:  
— a szubsztrát származása,  
— összetétel (lucernaliszt, zöldlucernaf ű-liszt),  
— szén- és nitrogéntartalom ( % szárazsúly),  
— szitaméret (mm).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Vizsgálati körülmények:  
— a talaj szerves szubsztráttal való javításának részletei,  
— a vizsgálandó vegyi anyag alkalmazott koncentrációinak száma 
és adott esetben a koncentrációk megválasztásának indoklása,  
— a vizsgálandó anyag talaj on való alkalmazásának részletei,  
— inkubálási h őmérséklet,  
— a talaj nedvességtartalma a vizsgálat kezdetén és a vizsgálat alatt,  
— az alkalmazott talajinkubálási módszer (ömlesztett minták vagy 
önálló részminták sorozata),  
— másolati minták száma,  
— mintavételi id őpontok,  
— a talaj nitráttartalmának extrahálására alkalmazott módszer.  
Eredmények:  
— a nitrátmeghatározáshoz alkalmazott analitikai eljárás és beren ­
dezés,  
— táblázatos formában megadott adatok, ezen belül a nitrátmé ­
rések egyedi és átlagértékei,  
— a másolati minták közötti eltérések a kezelt és ellen őrző 
mintákban,  
— adott esetben a számításoknál alkalmazott korrekciók magyará ­
zata, 
— az egyes mintavételi id őpontokban mért nitrátképz ődési sebes ­
ségek százalékos eltérése vagy adott esetben a 95 százalékos konfidenciahatárral meghatározott EC
 50 -érték, a többi EC  x -érték 
(az EC  25 vagy az EC  10 ) konfidenciaintervallumokkal, és a dózis- 
válasz görbe grafikonja,  
— az eredmények statisztikai kezelése,  
— az eredmények értelmezését segít ő minden információ és 
megfigyelés.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SET AC-Europe, Bruxelles.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 Janvier 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (Talajmin őség – 
Mintavétel – A mikrobiális folyamatok laboratóriumi értékelé ­
sére szolgáló talaj begy űjtésére, kezelésére és tárolására vonat ­
kozó iránymutatás.)
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate- induced respiration method. (Talajmin őség. A talaj mikrobiális biomasszájának 
meghatározása. 1. rész: Szubsztrátindukált respirációs 
módszer.)
 
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation- extraction method. 
(Talajmin őség. A talaj mikrobiális biomasszájának meghatá ­
rozása. 2. rész: G őzextrakciós módszer.)  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Then, 96, 99-113.
 
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  TALAJLAKÓ MIKROORGANIZMUSOK: SZÉNÁTALAKÍTÁSI 
VIZSGÁLAT  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer az OECD TG 217 (2000) módszer megfelel ője. 
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a vizsgálati módszer egy olyan laboratóriumi módszert ismertet, 
amelynek célja annak vizsgálata, hogy a növényvéd ő szerek és 
esetleg más vegyi anyagok egyszeri expozíció esetén milyen poten ­
ciális hosszú távú hatásokat gyakorolnak a talajlakó mikroorganiz ­
musok szénátalakítási aktivitására. A vizsgálat els ősorban az Európai 
és Földközi-tenger Melléki Növényvédelmi Szervezet ajánlásain alapul (1). Azonban más iránymutatásokat, ezen belül a German 
Biologische Bundesanstalt (2), az Egyesült Államok Környezetvé ­
delmi Hivatala (3) és a SET AC (4) iránymutatásait is figyelembe vettünk. Az 1995-ben az olaszországi Belgirateban megrendezett, a talajok/üledékek kiválasztásával kapcsolatos OECD-munkaértekez ­
leten (5) megegyezés született az e vizsgálatban alkalmazandó 
talajok számáról és típusáról. A talajminták gy űjtéséről, kezelésér ől 
és tárolásáról szóló ajánlások egy ISO-útmutatón (6) és a belgiratei munkaértekezlet ajánlásain alapulnak.
 
A vizsgálandó anyagok toxikus jellemz őinek meghatározása és érté ­
kelése során szükség lehet a talaj mikrobiális aktivitására gyakorolt hatások meghatározására, például olyan esetben, ha adatokra van 
szükség a növényvéd ő szereknek a talaj mikroflórájára gyakorolt 
esetleges mellékhatásaival kapcsolatban, vagy ha a talaj lakó mikro ­
organizmusoknak növényvéd ő szerektől eltérő vegyületekkel szem ­
beni expozíciója várható. A szénátalakítási vizsgálat végrehajtásának 
célja az ilyen vegyületeknek a talaj mikroflórájára gyakorolt hatása ­
inak meghatározása. Amennyiben mez őgazdasági vegyi anyagok (pl. 
növényvéd ő szerek, m űtrágyák, erdészeti vegyi anyagok) vizsgála ­
táról van szó, mind a szénátalakítási, mind a nitrogénátalakítási vizs ­
gálatot el kell végezni. Ha nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizs ­
gálata történik, elég a nitrogénátalakítási vizsgálatot elvégezni. Ha azonban a nitrogénátalakítási vizsgálat az ilyen vegyületek esetében olyan EC
 50 -értékeket eredményez, amelyek a kereskedelmi forga ­
lomban kapható nitrifikációgátló szerek (pl. nitrapirin) esetében 
tapasztalt tartományba esik, további információk gy űjtése érdekében 
a szénátalakítási vizsgálatot is el lehet végezni.  
A talajok él ő és élettelen komponensekb ől épülnek fel, amelyek 
komplex és heterogén elegyek formájában léteznek. A mikroorganiz ­
musok számos fajjal fontos szerepet játszanak a term őtalajok szerves ­
anyag-tartalmának lebontásában és átalakításában, hozzájárulva a 
talajok termékenységének különféle aspektusaihoz. Az ilyen bioké ­
miai folyamatokat megzavaró hosszú távú hatások potenciálisan megzavarhatják a tápanyag-körforgalmat, ami megváltoztathatja a talaj termékenységét. Szén- és nitrogénátalakítás minden term őta­
lajban folyik. Bár az e folyamatokért felel ős mikrobaközösségek 
talajonként eltér őek, az átalakítási útvonalak lényegében azonosak.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Ennek a vizsgálati módszernek a célja valamely anyagnak az aerob 
feltalajokban zajló szénátalakítási folyamatra gyakorolt hosszú távú 
káros hatásainak kimutatása. A vizsgálati módszer érzékeny a szénát ­
alakításért felel ős mikrobaközösségek méretében és aktivitásában 
bekövetkez ő változásokra, mivel ez kémiai stresszt és szénéhezést 
okoz ezekben a közösségekben. A vizsgálathoz alacsony szerves ­
anyag-tartalmú homokos talajt kell használni. Ezt a talajt kezelni kell a vizsgálandó anyaggal, majd gyors mikrobiális anyagcserét biztosító körülmények között inkubálni kell. Ilyen körülmények 
között hamar kimerülnek a talaj könnyen hozzáférhet ő szénforrásai. 
Ez szénéhezést okoz, ami elpusztítja a mikrobákat és egyben nyugalmi állapotot és/vagy spóraképzést idéz el ő. Ha a vizsgálat 
több mint 28 napig tart, e reakciók összessége a kontroll- (kezeletlen) 
talajokban a metabolikusan aktív mikrobiális biomassza progresszív 
elvesztéseként mérhet ő (7). Ha valamely vegyi anyag jelenléte a 
vizsgálat körülményei között befolyást gyakorol a szénstresszelt talajban található biomasszára, akkor a biomassza nem tud vissza ­
térni ugyanarra a szintre, mint a kontrolltalajokban. A vizsgálandó 
anyag által a vizsgálat során bármikor el őidézett zavaró hatás tehát 
gyakran egészen a vizsgálat végéig fennmarad.
 
Azokat a teszteket, amelyekb ől ezt a vizsgálati módszert kifejlesztet ­
ték, elsősorban olyan anyagokhoz dolgozták ki, amelyek esetében 
előre jelezhet ő a talajba kerül ő mennyiség. Ez a helyzet például a 
növényvéd ő szerek esetében, amelyeknél ismert a szántóföldi alkal ­
mazás mértéke. A mez őgazdasági vegyi anyagok esetében elegend ő 
két, a várt vagy becsült alkalmazási mérték szempontjából releváns dózist alkalmazni. A mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálhatók 
aktív összetev őként (a.ö.) vagy formulázott termékként is. A vizs ­
gálat azonban nem korlátozódik kizárólag a megbecsülhet ő környe­
zeti koncentrációval rendelkez ő anyagokra. Mind a vizsgálandó 
anyagnak a talajban alkalmazott mennyiségét, mind az adatok kiérté ­
kelésének módját módosítva, a vizsgálat mez őgazdasági vegyi anya ­
goktól eltér ő vegyületekre is alkalmazható, amelyek esetében nem 
ismert a talajba várhatóan bejutó mennyiség. A nem mez őgazdasági 
vegyi anyagok esetében tehát egy sor koncentrációnál meg kell hatá ­
rozni a szénátalakításra gyakorolt hatásokat. Az ilyen vizsgálatokkal 
kapott adatok dózis-válasz görbék elkészítésére és EC
 x -értékek 
számítására használhatók fel, ahol x jelentése % hatás.  
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
„Szénátalakítás”: szerves anyagok mikroorganizmusok által végzett 
lebontása a megfelel ő szervetlen végtermékké, azaz szén-dioxiddá.  
„EC  x (hatásos koncentráció)”: a vizsgálandó anyag olyan talajbeli 
koncentrációja, amely x %-osan gátolja a szén szén-dioxiddá 
alakulását.  
„EC  50 (közepes hatásos koncentráció)”: a vizsgálandó anyag olyan 
talajbeli koncentrációja, amely 50 százalékosan (50 %-osan) gátolja a 
szén szén-dioxiddá alakulását.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Nincs.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az átszitált talajt a vizsgálandó anyaggal kell kezelni, vagy kezelet ­
lenül kell hagyni (kontroll). Mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata 
esetén minimálisan két vizsgálati koncentráció alkalmazása ajánlott, 
amelyeket a szántóföldeken várható legmagasabb koncentráció függ ­
vényében kell megválasztani. Az inkubálás 0., 7., 14. és 28. napja után a kezelt és az ellen őrző talajmintákhoz glükózt kell keverni, 
majd 12 órán át folyamatosan mérni kell a glükózindukált légzési 
sebességet. A légzési sebességet a felszabaduló szén-dioxidban (mg 
szén-dioxid/kg száraz talaj/óra) vagy az elfogyasztott oxigénben (mg oxigén/kg talaj/óra) kell kifejezni. A kezelt talajokban mért közepes 
légzési rátát össze kell hasonlítani az ellen őrző minta esetében mért ­
tel, majd ki kell számítani a kezelt és az ellen őrző talajminták közötti 
százalékos eltérést. Minden vizsgálatot legalább 28 napig kell végezni. Ha a 28. napon a kezelt és nem kezelt talajok közötti 
különbség 25 % vagy annál nagyobb, a méréseket 14 napos inter ­
vallumokban, legfeljebb 100 napos id őtartamig folytatni kell. Ha 
nem mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata történik, a vizsgálandó 
anyag egy sor különböz ő koncentrációját kell a talajmintákhoz adni, 
és 28 nap után meg kell mérni a kezelt és az ellen őrző mintákban a 
glükózindukált légzési sebességeket (azaz a képz ődő szén-dioxid 
vagy az elfogyasztott oxigén átlagos mennyiségét). A különböz ő 
koncentrációk alkalmazásával kapott vizsgálati eredményeket 
regressziós modell segítségével kell elemezni, majd ki kell számítani 
az EC
 x -értékeket (azaz az EC  50 -et, az EC  25 -öt és/vagy az EC  10 -et). 
Lásd a fogalommeghatározásokat.  
1.5. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A mezőgazdasági vegyi anyagokkal kapott vizsgálati eredmények 
értékelése az ellen őrző és a kezelt talajmintákban felszabaduló 
szén-dioxid vagy elfogyasztott oxigén közötti viszonylag kis különb ­
ségeken (azaz az átlag ± 25 %-a) alapul, így az ellen őrző minták 
közötti nagy eltérések hamis eredményekhez vezethetnek. A párhu ­
zamos ellen őrző minták közötti eltérésnek ±15 %-nál kisebbnek kell 
lennie.  
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.6.1.  Eszközök  
Kémiailag inert anyagból készült vizsgálati edényeket kell használni. 
Ezeknek megfelel ő, a talajok inkubálására alkalmazott eljárással, 
például az ömlesztve inkubálással vagy egyedi talajminták sorozata ­
ként történ ő inkubálással megfelel ő összhangban lév ő kapacitásúnak 
kell lenniük (lásd az 1.7.1.2. szakaszt). Ügyelni kell egyrészr ől a 
vízveszteség minimalizálására, másrészr ől a gázcsere lehet ővé téte­
lére a vizsgálat során (például a vizsgálati edények perforált polie ­
tilén fóliával fedhet ők le). Illékony anyagok vizsgálata esetén zárható 
és légmentesen záródó edényeket kell alkalmazni. Az edényeknek olyan méret űnek kell lenniük, hogy a talajminta-térfogatuk körül ­
belül egynegyedéig töltse fel őket.
 
A glükózindukált légzés meghatározásához inkubálórendszerekre és 
a szén-dioxid-termelés vagy az oxigénfogyasztás mérésére alkalmas műszerekre van szükség. Ilyen rendszerekre és m űszerekre példák a 
(8), (9), (10) és (11) hivatkozásban találhatók.
 
1.6.2.  A talajok kiválasztása és száma  
Csak egyféle talaj használható. A javasolt talajjellemz ők a követ ­
kezők: 
— homoktartalom: legalább 50 % és legfeljebb 75 %,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5,  
— szervesszén-tartalom: 0,5–1,5 %,  
— meg kell mérni a mikrobiális biomasszát (12) (13), amelynek 
széntartalma a talaj teljes szervesszén-tartalmának legalább 1 %-a kell hogy legyen.
 
Az esetek többségében az ilyen jellemz őkkel rendelkez ő talaj a 
legrosszabb helyzetet reprezentálja, mivel minimális a vizsgálandó 
vegyület adszorpciója, viszont maximális a hozzáférhet ősége a 
mikroflóra számára. Következésképpen általában nincs szükség más talajokkal végzett vizsgálatokra. Bizonyos körülmények között azon ­
ban, például amikor a vizsgálandó anyag várható f ő felhasználási 
területe a különleges talajok, például a savanyú erd őtalajok vagy 
az elektrosztatikus töltéssel rendelkez ő vegyületek esetében is, 
szükség lehet ennek egy másik talajtípussal való helyettesítésre.
 
1.6.3.  A talajminták begy űjtése és tárolása  
1.6.3.1.  Gyűjtés 
Részletes információkkal kell rendelkezni annak a szántóföldi terü ­
letnek a történetér ől, ahonnan a vizsgálati talajminta begy űjtése törté ­
nik. Ilyen részletek például a pontos hely, a növénytakaró, a növény ­
védő szerekkel végzett kezelések id őpontjai, a szerves és szervetlen 
trágyák alkalmazásai, a biológiai anyagok hozzáadása vagy a véletlen szennyezések. A talajminták gy űjtéshez olyan helyet kell 
választani, amely hosszú távon használható erre a célra. Megfelel őek 
például az állandó legel ők, az évente gabonatermést (kivéve kukori ­
cát) hozó területek vagy a zöldtrágyával s űrűn bevetett területek. 
Követelmény, hogy a kiválasztott mintagy űjtési helyet a mintagy űj­
tést megel őzően legalább egy évig ne kezeljék növényvéd ő szerek­
kel. Továbbá legalább hat hónapig ne kapjon szerves trágyázást. Ásványi m űtrágya alkalmazása csak akkor elfogadható, ha a haszon ­
növény igényeinek megfelel ően történik, és a m űtrágyázást követ ően 
legalább három hónapig nem szabad talajmintákat venni. Kerülni kell 
az ismert biocid hatású m űtrágyákkal (pl. kalcium-ciánamiddal) 
kezelt talajok alkalmazását.
 
Kerülni kell a mintavételt hosszú (30 napnál hosszabb) ideig tartó 
szárazság vagy elvizesedés esetén, illetve közvetlenül ilyen időszakok után. Szántott talajok esetében a mintákat 0–20 cm mély ­
ségből kell venni. Legel ők vagy egyéb olyan talajok esetében, 
amelyeket hosszú ideig (legalább egy vegetációs periódusig) nem szántanak fel, a mintavétel maximális mélysége 20 cm-nél kicsit több (pl. 25 cm) is lehet. A talajmintákat olyan edényekben és 
olyan hőmérsékleti feltételek mellett kell elszállítani, amelyek garan ­
tálják, hogy a talaj eredeti tulajdonságai nem módosulnak szignifi ­
káns mértékben.
 
1.6.3.2.  Tárolás  
Legelőnyösebb a frissen gy űjtött talajok alkalmazása. Ha a laborató ­
riumi tárolás nem kerülhet ő el, a talajok sötétben, 4 ± 2  o C-on 
legfeljebb három hónapig tárolhatók. A talajok tárolása során aerob körülményeket kell biztosítani. Ha a talajminták begy űjtése olyan 
területeken történt, ahol a talaj az év legalább három hónapjában 
fagyott, szóba jöhet hat hónapos, mínusz 18
 o C hőmérsékleten 
való tárolás is. Minden egyes kísérlet el őtt meg kell mérni a tárolt 
talajok mikrobiális biomasszáját, és a biomassza széntartalmának el 
kell érnie a talaj teljes szervesszén-tartalmának legalább 1 %-át (lásd 
az 1.6.2. szakaszt).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  A talaj kezelése és el őkészítése a vizsgálatra  
1.6.4.1.  Előinkubálás  
Tárolt talaj használata esetén (lásd az 1.6.4.2. és az 1.7.1.3. szakaszt) 
ajánlatos 2-t ől 28 napig terjed ő előinkubálást alkalmazni. Az el őin­
kubálás során a talaj h őmérsékletének és nedvességtartalmának 
hasonlónak kell lennie a vizsgálat során alkalmazott h őmérséklethez 
és nedvességtartalomhoz (lásd az 1.6.4.2. és az 1.7.1.3. szakaszt).  
1.6.4.2.  Fizikai-kémiai tulajdonságok  
A talajból manuálisan el kell távolítani a nagyobb tárgyakat (például 
köveket, növényi részeket stb.), majd a túlzott kiszáradást kerülve a talajt nedvesen át kell szitálni úgy, hogy a részecskeméret legfeljebb 
2 mm legyen. A talajminta nedvességtartalmát desztillált vagy 
ioncserélt vízzel a maximális víztartó képesség 40–60 %-ára kell beállítani.
 
1.6.5.  A vizsgálandó anyag el őkészítése a talajon történ ő alkalmazáshoz  
A vizsgálandó anyagot általában hordozó segítségével kell alkal ­
mazni. A hordozó lehet víz (vízben oldható anyagok esetében) vagy valamely inert szilárd anyag, így például finom kvarchomok 
(részecskeméret: 0,1–0,5 mm). Kerülni kell a vízt ől eltérő folyékony 
hordozók (például szerves oldószerek, így például aceton, kloroform) alkalmazását, mivel ezek károsíthatják a mikroflórát. Ha hordozóként homokot használunk, a homok be is vonható a megfelel ő oldó­
szerben feloldott vagy szuszpendált vizsgálandó anyaggal. Ilyen 
esetekben az oldószert a talajba való bekeverés el őtt el kell párolog ­
tatni. Ahhoz, hogy a vizsgálandó anyag optimális módon oszoljon szét a talajban, a következ ő arány ajánlott: 10 g homok per 1 kilo ­
gramm talaj (szárazsúly). Az ellen őrző mintákat ugyanilyen mennyi ­
ségű vízzel és/vagy kvarchomokkal kell kezelni.
 
Illékony vegyületek vizsgálata esetén kerülni kell a kezelés közbeni 
veszteséget, valamint a vegyület talajban való homogén eloszlásának biztosítására is törekedni kell (például a vizsgálandó anyagot több helyen is be kell injektálni a talajba).
 
1.6.6.  Vizsgálati koncentrációk  
Növényvéd ő szerek és egyéb, megbecsülhet ő környezeti koncentrá ­
cióval rendelkez ő vegyületek vizsgálata esetén legalább két koncent ­
rációt kell alkalmazni. Az alacsonyabb koncentrációnak legalább a 
gyakorlatban a talajba várhatóan bejutó legnagyobb mennyiségnek kell megfelelnie, a magasabb koncentrációnak pedig az alacsonyabb koncentráció valamely többszörösének kell lennie. A talajhoz adott 
vizsgálandó anyag koncentrációját 5 cm-es mélységig egyenletes 
beépülést és 1,5 g/cm
 3 -es talaj térfogats űrűséget feltételezve kell 
kiszámolni. A közvetlenül a talajra kihordott mez őgazdasági vegyi 
anyagok vagy az olyan vegyületek esetében, amelyeknek a talajba 
bejutó mennyisége el őre jelezhet ő, az ajánlott vizsgálati koncentrá ­
ciók a következ ők: a megbecsülhet ő környezeti koncentráció (PEC) 
és ennek ötszöröse. Azoknak az anyagoknak az esetében, amelyeket egy idényben várhatóan több alkalommal is kihordanak a talajokra, a 
vizsgálathoz alkalmazandó koncentráció a PEC-értéknek a kihor ­
dások maximálisan várható számával történ ő megszorzásával számít ­
ható ki. A vizsgált magasabb koncentrációnak azonban nem szabad meghaladnia az egyszeri maximális alkalmazási arány tízszeresét.
 
Nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén legalább öt, 
mértani sort alkotó koncentrációt kell alkalmazni. A vizsgált 
koncentrációknak le kell fedniük az EC  x -értékek meghatározásához 
szükséges tartományt.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. A VIZSGÁLAT VÉGREHAJTÁSA  
1.7.1.  Az expozíció körülményei  
1.7.1.1.  Kezelés és kontroll  
Mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén a talajt három, 
egyenlő tömegű részre kell osztani. Két részlethez a terméket is 
tartalmazó hordozót kell keverni, a harmadikhoz pedig csak hordozót (kontroll). Ajánlatos a kezelt és nem kezelt talajokat is legalább három másolati mintában vizsgálni. Nem mez őgazdasági vegyi 
anyagok vizsgálata esetén a talajt hat, egyenl ő tömegű részletre 
kell osztani. Öthöz a vizsgálandó anyagot is tartalmazó hordozót kell keverni, a hatodikhoz pedig csak hordozót. A kezeléseket és 
az ellenőrző kísérleteket is ajánlatos legalább három másolati 
mintában végezni. Vigyázni kell arra, hogy az anyag homogén módon legyen eloszlatva a kezelt talajmintákban. A bekeverés során el kell kerülni a talaj tömörödését vagy összecsomósodását.
 
1.7.1.2.  A talajminták inkubálása  
A talajminták inkubálása kétféle módon történhet: az egyes kezelt és 
nem kezelt talajokból vagy ömlesztett mintákat kell készíteni, vagy 
egy sor önálló és egyforma méret ű részmintát. Illékony vegyületek 
vizsgálata esetén azonban a vizsgálatot csak egy önálló részmin ­
tákból álló sorozattal kell elvégezni. A talajok ömlesztve történ ő 
inkubálása esetén minden kezelt és nem kezelt talajt nagy mennyi ­
ségben kell elkészíteni, és a vizsgálat során szükség szerint ezekb ől 
kell részmintákat venni a különféle analízisekhez. Az, hogy kiindu ­
lásképpen milyen mennyiséget kell készíteni az egyes kezelésekhez 
és ellenőrző vizsgálatokhoz, függ a részminták méretét ől, az analí ­
zishez használt másolati minták számától, valamint a mintavételek várható maximális számától. A részminták vétele el őtt az ömlesztve 
inkubált talajokat alaposan össze kell keverni. Ha a talajok inkubá ­
lása önálló részminták sorozataként történik, az egyes kezelt és nem 
kezelt ömlesztett talajmintákat a szükséges számú részmintára kell felosztani, amelyeket azután igény szerint kell felhasználni. Olyan kísérleteknél, amikor várhatóan több mint két alkalommal kell 
majd mintát venni, elegend ő számú részmintát kell készíteni ahhoz, 
hogy azokból minden másolati mintára és mintavételi alkalomra jusson. A teszttalajokat legalább három másolati mintában kell aerob körülmények között inkubálni (lásd az 1.7.1.1. szakaszt). 
Minden egyes vizsgálat során megfelel ő gőztérrel rendelkez ő 
edényeket kell használni annak érdekében, hogy ne alakuljanak ki anaerob körülmények. Illékony anyagok vizsgálata esetén a vizs ­
gálatot csak egy önálló részmintákból álló sorozattal kell elvégezni.
 
1.7.1.3.  A kísérlet körülményei és id őtartama  
A vizsgálatot sötétben, 20 ± 2  o C-os szobah őmérsékleten kell elvé ­
gezni. A talajmintákat a vizsgálat id őtartama alatt a talaj maximális 
víztartó kapacitásának 40 és 60 százaléka közötti értéken kell tartani (lásd az 1.6.4.2. szakaszt) ± 5 %-os eltéréssel. Szükség esetén desz ­
tillált vagy ioncserélt víz adható a mintákhoz.
 
A vizsgálat minimális id őtartama 28 nap. Mez őgazdasági vegyi 
anyagok vizsgálata esetén össze kell hasonlítani a kezelt és az ellen ­ 
őrző mintákban felszabaduló szén-dioxid vagy elfogyasztott oxigén 
mennyiségét. Ha a 28. napon ezek több mint 25 %-kal eltérnek egymástól, a vizsgálatot addig kell folytatni, amíg a különbség 
25 %-ra vagy az alá nem csökken, vagy legfeljebb 100 napig, ha 
az a korábbi id őpont. Nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata 
esetén a vizsgálat a 28. nap után véget ér. A 28. napon meg kell határozni a kezelt és az ellen őrző talajmintákban felszabaduló szén- 
dioxid vagy elfogyasztott oxigén mennyiségét, és ki kell számítani az 
EC
 x -értékeket.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Mintavétel és a talajok elemzése  
1.7.2.1.  Talajminta-vételi program  
Mezőgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén a 0., 7., 14. és 28. 
napon meg kell mérni a talajmintákban a glükózindukált légzési 
sebességeket. Ha hosszabb id őtartamú vizsgálatot kell végezni, a 
további méréseket a 28. nap után 14 naponta kell végezni.  
Nem mez őgazdasági vegyi anyagok vizsgálata esetén legalább öt 
vizsgálati koncentrációt kell alkalmazni, és a talajminták glükózindu ­
kált légzését az expozíciós id őszak kezdetén (0. nap) és végén (28. 
nap) kell megmérni. Szükség esetén be lehet iktatni egy köztes mérést is, például a 7. napon. A 28. napon kapott adatokból meg 
kell határozni a vegyi anyag EC
 x -értékét. Szükség esetén a 0. napon 
az ellenőrző mintákban mért adatok segítségével meg lehet becsülni, 
hogy a talajban eredetileg milyen mennyiségben volt jelen metabo ­
likusan aktív mikrobiális biomassza (12).  
1.7.2.2.  A glükózindukált légzési sebesség mérése  
Minden mintavételi id őpontban meg kell határozni az egyes kezelt és 
ellenőrző másolati mintákban tapasztalható glükózindukált légzési 
sebességet. A talajmintákhoz olyan mennyiség ű glükózt kell keverni, 
hogy az azonnali maximális légzési választ váltson ki. Az adott 
talajban a maximális válasz kiváltásához szükséges glükózmennyi ­
séget előzetes vizsgálatokkal lehet meghatározni, amelyhez egy sor 
különböző glükózkoncentrációt kell alkalmazni (14). A 0,5–1,5 % 
szerves szént tartalmazó homokos talajok esetében azonban általában 
elegendő, ha 2 000 - 2 000 mg/kg talaj (szárazsúly) mennyiségben 
adunk hozzá glükózt. A glükóz tiszta kvarchomokkal (10 g homok/ ­
kg talaj (szárazsúly)) porrá őrölhető és homogén módon a talajhoz 
keverhető. 
A glükózzal feljavított talajmintákat a légzési sebességet folyamato ­
san, óránként vagy kétóránként mér ő, megfelel ő berendezésben (lásd 
az 1.6.1. szakaszt), 20 ± 2  o C-on inkubálni kell. A felszabaduló szén- 
dioxidot vagy elfogyasztott oxigént 12 órán át folyamatosan mérni kell, és a mérést a lehet ő leghamarabb, azaz a glükóz hozzáadása 
után 1-2 órán belül el kell kezdeni. Meg kell mérni a 12 óra alatt 
felszabaduló szén-dioxid vagy elfogyasztott oxigén teljes mennyi ­
ségét, és ebb ől meg kell határozni a közepes légzési sebességeket.
 
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Mezőgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálat esetén le kell 
jegyezni az egyes másolati talajmintákban felszabaduló szén-dioxid 
vagy elfogyasztott oxigén mennyiségét, és a másolati minták átlagát táblázatos formában kell megadni. Az eredményeket megfelel ő és 
általánosan elfogadott statisztikai módszerekkel (például F-teszt, 
5 %-os szignifikanciaszint) kell kiértékelni. A glükózindukált légzési 
sebességet szén-dioxid/kg talaj (szárazsúly)/óra vagy mg oxigén/talaj (szárazsúly)/óra egységekben kell kifejezni. Az egyes kezeléseknél mért közepes szén-dioxid képz ődési vagy közepes oxigénfogyasztási 
sebességeket össze kell hasonlítani az ellen őrző mintában mérttel, és 
ki kell számítani az ellen őrző mintától való százalékos eltérést.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Nem mez őgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálat esetén meg 
kell határozni az egyes másolati mintákban a felszabaduló szén- 
dioxid vagy az elfogyasztott oxigén mennyiségét, és dózis-válasz görbét kell felvenni az EC
 x -értékek becsléséhez. A kezelt mintákban 
28 nap után mért glükózindukált légzési sebességeket (mg szén- 
dioxid/kg talaj (szárazsúly)/óra vagy mg oxigén/talaj (szárazsúly)/ ­
óra) össze kell hasonlítani az ellen őrző mintákban mérttel. Ezekb ől 
az adatokból ki kell számítani az egyes vizsgálati koncentrációkra vonatkozó %-os gátlási értékeket. A százalékos értékeket a koncent ­
ráció függvényében kell ábrázolni, majd statisztikai eljárások alkal ­
mazásával ki kell számítani az EC
 x -értékeket. A számított EC  x - 
értékek konfidenciahatárát (p = 0,95) is a szabványos eljárások segít ­
ségével kell meghatározni (15) (16) (17).  
2.2. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Ha a mez őgazdasági vegyi anyagokkal végzett vizsgálatok eredmé ­
nyeinek értékelésekor az alacsonyabb koncentrációjú kezeléssel (azaz a maximális becsült koncentrációval) és az ellen őrző mintákkal 
kapott légzési sebességek különbsége a 28. nap utáni mintavételi 
időpontok valamelyikénél nem haladja meg a 25 %-ot, akkor azt a 
következtetést kell levonni, hogy a terméknek nincs hosszú távú 
hatása a talajokban folyó szénátalakításra. A nem mez őgazdasági 
vegyi anyagokkal végzett vizsgálatok esetében a vegyületek értéke ­
léséhez az EC
 50 -, EC  25 - és/vagy EC  10 -értékeket kell használni.  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
a talaj teljes kör ű azonosítása, ezen belül:  
— a terület földrajzi meghatározása (földrajzi hosszúság és 
szélesség),  
— a terület történetével kapcsolatos információk (növénytakaró, 
növényvéd ő szerekkel való kezelés, m űtrágyázás, véletlen szeny ­
nyezések stb.),  
— földhasználat (például mez őgazdasági talaj, erd ő stb.),  
— a mintavétel mélysége (cm),  
— homok-/iszap-/agyagtartalom ( % szárazsúly),  
— pH (vízben),  
— szervesszén-tartalom ( % szárazsúly),  
— nitrogéntartalom ( % szárazsúly),  
— kationcserél ő kapacitás (mmol/kg),  
— kiindulási mikrobiális biomassza a teljes szervesszén-tartalom 
százalékában kifejezve,  
— hivatkozások az egyes paraméterek meghatározásához alkalma ­
zott módszerekre,  
— a talajminták gy űjtésével és tárolásával kapcsolatos minden infor ­
máció,  
— adott esetben a talaj el őinkubálásával kapcsolatos részletek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Vizsgálandó anyag:  
— fizikai jelleg és adott esetben fizikai-kémiai tulajdonságok,  
— kémiai azonosító adatok és ezen belül adott esetben a szerkezeti 
képlet, tisztaság (növényvéd ő szerek esetében az aktív összetev ő 
százalékos aránya), nitrogéntartalom.  
Vizsgálati körülmények:  
— a talaj szerves szubsztráttal való javításának részletei,  
— a vizsgálandó vegyi anyag alkalmazott koncentrációinak száma 
és adott esetben a koncentrációk megválasztásának indoklása,  
— a vizsgálandó anyag talaj on való alkalmazásának részletei,  
— inkubálási h őmérséklet,  
— a talaj nedvességtartalma a vizsgálat kezdetén és a vizsgálat alatt,  
— az alkalmazott talaj inkubálási módszer (ömlesztett minták vagy 
önálló részminták sorozata),  
— másolati minták száma,  
— mintavételi id őpontok.  
Eredmények:  
— a légzési sebesség mérésére alkalmazott módszer és berendezés,  
— táblázatos formában megadott adatok, ezen belül a szén-dioxid 
vagy oxigén mennyiségek egyedi és átlagértékei,  
— a másolati minták közötti eltérések a kezelt és ellen őrző 
mintákban,  
— adott esetben a számításoknál alkalmazott korrekciók magyará ­
zata, 
— az egyes mintavételi id őpontokban mért glükózindukált légzési 
sebességek százalékos eltérése, vagy adott esetben a 95 száza ­
lékos konfidenciahatárral meghatározott EC  50 -érték, a többi EC  x - 
érték (azaz az EC  25 vagy az EC  10 ) konfidencia-intervallumokkal 
és a dózis-válasz görbe grafikonja,  
— adott esetben az eredmények statisztikai kezelése,  
— az eredmények értelmezését segít ő minden információ és 
megfigyelés.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SET AC-Europe, Brussels.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory. (Talajmin őség – 
Mintavétel – A mikrobiális folyamatok laboratóriumi értékelé ­
sére szolgáló talaj begy űjtésére, kezelésére és tárolására vonat ­
kozó iránymutatás.)  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. 
Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831-871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 
(Talajmin őség. Útmutató a talajban lev ő szerves vegyi anyagok 
aerob feltételek melletti biológiai lebonthatóságának laborató ­
riumi vizsgálatára.)  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions. (Talajmin őség. Laboratóriumi 
inkubációs rendszerek a talajban lév ő szerves vegyi anyagok 
aerob feltételek mellett végbemen ő mineralizációjának vizs ­
gálatához.)  
(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate- induced respiration 
method. (Talajmin őség. A talaj mikrobiális biomasszájának 
meghatározása. 1. rész: Szubsztrátindukált respirációs módszer.)
 
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 
(Talajmin őség. A talaj mikrobiális biomasszájának meghatá ­
rozása. 2. rész: G őzextrakciós módszer.)  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Inf ­
luence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbi ­
cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., 
Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROB ÉS ANAEROB ÁTALAKÍTÁS A TALAJBAN  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer az OECD TG 307 (2002) módszer 
megfelelője. 
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a vizsgálati módszer meglév ő iránymutatásokon alapul (1) (2) (3) 
(4) (5) (6) (7) (8) (9). Az ennél a vizsgálati módszernél ismertetett 
módszer célja a vegyi anyagok talajban zajló aerob és anaerob átala ­
kításának értékelése. A kísérletek során meghatározható i. a vizs ­
gálandó anyag átalakulási sebessége; valamint ii. azon átalakulási termékek jellege, illetve keletkezésének és elt űnésének sebessége, 
amelyekkel a növények és talajlakó szervezetek kapcsolatba kerül ­
hetnek. Az ilyen vizsgálatokra olyan vegyi anyagok esetében van szükség, amelyeket közvetlenül a talajokra hordanak ki, vagy amelyek valószín űleg bekerülnek a talaj környezetbe. Az ilyen labo ­
ratóriumi vizsgálatok eredményei a kapcsolódó szántóföldi vizs ­
gálatok mintavételi és elemzési protokolljainak kidolgozásához is felhasználhatók.
 
Az egy talajtípussal végzett aerob és anaerob vizsgálatok általában 
elegendőek az átalakítási útvonalak értékeléséhez (8) (10) (11). Az 
átalakulási sebességeket legalább három további talajban meg kell 
határozni (8) (10).  
Az 1995-ben az olaszországi Belgirateban megrendezett, a talajok/ ­
üledékek kiválasztásával kapcsolatos OECD-munkaértekezleten (10) 
megegyezés született az e vizsgálatban alkalmazandó talajok számáról és típusáról. A vizsgált talajtípusoknak reprezentatívnak kell lenniük azon környezeti feltételek vonatkozásában, ahol a hasz ­
nálat vagy kibocsátás történik. Azokat a vegyi anyagokat például, 
amelyek kibocsátása a szubtrópusi-trópusi éghajlaton történhet, Ferrasol vagy Nitosol (FAO-rendszer) talajokkal kell vizsgálni. A munkaértekezleten az ISO-útmutató (15) alapján ajánlásokat fogal ­
maztak meg a talajminták gy űjtésével, kezelésével és tárolásával 
kapcsolatosan is. Ennél a módszernél esik szó a rizstalajok alkalma ­
zásáról is.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
„Vizsgálandó anyag”:  bármely anyag, legyen az a kiindulási vegyü ­
let, vagy megfelel ő átalakulási termék.  
„Átalakulási termékek”:  minden olyan anyag, amely a vizsgálandó 
anyag biotikus vagy abiotikus átalakulási reakciói nyomán keletke ­
zik, beleértve a CO  2 -t, illetve a megkötött maradványokban lév ő 
összes termék.  
„Megkötött maradványok”:  A „megkötött maradványok” a talaj ­
ban, növényekben vagy állatokban jelen lév ő olyan vegyületek, 
amelyek a kiindulási vegyület vagy annak anyagcsereterméke(i)/ ­
átalakulási termékei formájában extrahálás után is a mátrixban maradnak. Az extrakciós módszer alapjában véve nem változtathatja meg magukat a vegyületeket vagy a mátrix szerkezetét. A kötés 
jellege részben mátrixmódosító extrakciós módszerek, valamint kifi ­
nomult analitikai technikák segítségével tisztázható. Ez idáig kova ­
lens, ionos és szorpciós kötéseket, valamint bezáródásokat azonosí ­
tottak ilyen módon. A megkötött maradványok létrejötte általános ­
ságban szignifikánsan csökkenti a biológiai elérhet őséget és biológiai 
hozzáférhet őséget (12) (az IUPAC 1984-ben módosította (13)).
 
„Aerob átalakulás”:  molekuláris oxigén jelenlétében végbemen ő 
reakciók (14).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
„Anaerob átalakulás”:  molekuláris oxigén kizárásával végbemen ő 
reakciók (14).  
„Talaj”:  ásványi és szerves kémiai komponensek keveréke, amelyek 
közül az utóbbiak magas szén- és nitrogéntartalmú, valamint nagy 
molekulasúlyú vegyületek, amelyeket apró él ő szervezetek (f őleg 
mikroorganizmusok) népesítenek be. A talajok kétféle állapotban kezelhetők:
 
a) érintetlen talajok, különféle talajtípusok jellegzetes rétegz ődésé­
vel, ahogy azok a múltban kialakultak;  
b) megbolygatott talajok, például ahogy általában szántóföldeken 
találhatók, vagy amikor ásással mintákat vesznek bel őlük és e 
vizsgálati módszer céljára azokat felhasználják (14).  
„Mineralizáció”:  a szerves vegyületek teljes mérték ű lebomlása 
aerob körülmények között CO  2 -vé és H  2 0-vá, illetve anaerob körül ­
mények között CH  4 -gyé, CO  2 -vé és H  2 0-vá. E vizsgálati módszer 
vonatkozásában a  14 C-jelölt vegyületek alkalmazásakor a minerali ­
záció kiterjedt lebomlást jelent, amelynek során egy jelölt szénatom oxidálódik, és megfelel ő mennyiség ű
 14 CO 2 szabadul fel (14).  
„Felezési id ő”: t0,5, a vizsgálandó anyag 50 %-ának átalakulásához 
szükséges id ő, ha az átalakulás els őrendű kinetikával leírható; a 
felezési id ő független a koncentrációtól.  
„DT 50 (lebomlási id ő 50)”:  az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag koncentrációja 50 %-kal csökken; akkor nem azonos 
a felezési id ővel (t0,5), ha az átalakulás nem els őrendű kinetikát 
követ.  
„DT  75 (lebomlási id ő 75)”:  az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag koncentrációja 75 %-kal csökken.  
„DT 90 (lebomlási id ő 90)”:  az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag koncentrációja 90 %-kal csökken.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Az átalakulási termékek spektroszkópiás és kromatográfiás módsze ­
rekkel történ ő jellemzéséhez és/vagy azonosításához referenciaanya ­
gokat kell alkalmazni.  
1.4. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
A módszer minden vegyi anyaghoz alkalmazható (legyen az nem 
jelölt vagy jelölt anyag), amelyhez létezik kielégít ően pontos és 
érzékeny analitikai módszer. Enyhén illékony, nem illékony, vízben 
oldható és vízben nem oldható vegyületekhez is alkalmazható. A vizsgálat nem alkalmazható olyan vegyi anyagokra, amelyek a talajban nagymértékben illékonyak (például gáz alakú növényvéd ő 
szerek, szerves oldószerek), és ezért nem lehet őket a vizsgálat kísér ­
leti körülményei között a talajban tartani.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. A VIZSGÁLANDÓ ANYAGGAL KAPCSOLATOS INFORMÁ ­
CIÓK  
Az átalakulás sebességének mérésére nem jelölt vagy jelölt vizs ­
gálandó anyag is alkalmazható. Jelölt anyagra olyankor van szükség, 
ha az átalakulás útvonalait kívánjuk tanulmányozni vagy anyagmér ­
leget kívánunk felállítani. A  14 C-jelölés az ajánlott, de más izotópok, 
így például C, N, H vagy P is alkalmazható. Amennyire csak lehet ­
séges, a jelölést a molekula legstabilabb részén vagy részein kell 
elhelyezni (  1 ). A vizsgálandó anyagnak legalább 95 %-os tisztasá ­
gúnak kell lennie.  
A talajban zajló aerob és anaerob átalakulás vizsgálatának elvégzése 
előtt a vizsgálandó anyaggal kapcsolatban az alábbi információkkal 
kell rendelkezni:  
a) oldhatóság vízben (A6. módszer);  
b) oldhatóság szerves oldószerekben;  
c) gőznyomás (A4. módszer) és Henry-törvény állandó;  
d) n-oktanol/víz megoszlási hányados (A8. módszer);  
e) kémiai stabilitás sötétben (hidrolízis) (C7. módszer);  
f) pKa, ha valamelyik molekula hajlamos a protonálódásra vagy 
deprotonálódásra (112. számú OECD-iránymutatás) (16).  
További hasznos információk lehetnek a vizsgálandó anyagnak a 
talaj lakó mikroorganizmusokra gyakorolt toxicitásával kapcsolatos 
adatok (C.21. és C.22. vizsgálati módszer) (16).  
A vizsgálandó anyagok és átalakulási termékeik mennyiségi és min ő­
ségi meghatározására szolgáló analitikai módszereknek (köztük az extrakciós és gázleköt ő módszereknek) rendelkezésre kell állniuk.
 
1.6. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Talajmintákat a vizsgálandó anyaggal kell kezelni, és ellen őrzött 
laboratóriumi körülmények között (állandó h őmérséklet és talajned ­
vesség) sötétben, biométer-típusú lombikban vagy átfolyásos rend ­
szerekben inkubálni kell őket. Megfelel ő időközönként talajmintákat 
kell venni, amelyekben extrahálás után meg kell határozni a vizs ­
gálandó anyagot, illetve az átalakulási termékeket. Megfelel ő 
adszorpciós eszközök segítségével illékony termékek is gy űjthetők 
elemzés céljára.  14 C-jelölt anyagok alkalmazásával, a fejl ődő 14 CO 2 
befogása után megmérhet ők a vizsgálandó anyag különféle minera ­
lizációs sebességei, és megállapítható az anyagmérleg, ezen belül a lekötött maradványok képz ődése is.
 
1.7. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
1.7.1.  Visszanyerés  
A vizsgálandó anyag hozzáadása után azonnal legalább két másolati 
talajmintát elemezve megkaphatók az analitikai módszer ismételhet ő­
ségével és a vizsgálandó anyag alkalmazására szolgáló eljárás egységességével kapcsolatos els ő információk. A kísérletek kés őbbi 
szakaszában a visszanyeréseket a vonatkozó anyagmérlegek adják. A 
visszanyeréseknek jelölt vegyületek esetében 90 % és 110 % között 
(8), nem jelölt vegyületek esetében pedig 70 % és 110 % között (3) kell mozogniuk.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Ha a vizsgálandó anyag például egy gy űrűt tartalmaz, akkor ezt a gy űrűt kell megjelölni; 
ha a vizsgálandó anyag két vagy több gy űrűt is tartalmaz, külön vizsgálatokra lehet 
szükség az egyes jelölt gy űrűk sorsának megismeréséhez, illetve az átalakulási termékek 
keletkezésével kapcsolatos információk összegy űjtéséhez.
 1.7.2.  Az analitikai módszer megismételhet ősége és érzékenysége  
A vizsgálandó anyag és átalakulási termékei mennyiségi meghatá ­
rozása vonatkozásában (a kiindulási extrakciós hatékonyság kivéte ­
lével) az analitikai módszer megismételhet ősége az átalakulási 
termékek megjelenéséhez elegend ő ideig történ ő inkubálás után 
ugyanannak a talaj kivonatnak két másolati mintában történ ő méré­
sével ellen őrizhető. 
Az adott vizsgálandó anyagra és átalakulási termékeire az analitikai 
módszer kimutathatósági határértékének (LOD) legalább 0,01 mg.kg  -1 
talaj (mint vizsgálandó anyag), vagy – ha az a kisebb – az alkalma ­
zott dózis 1 %-ának kell lennie. Meg kell határozni továbbá a mennyiségi meghatározás határértékét (LOQ) is.
 
1.7.3.  Az átalakulási adatok pontossága  
Ha a vizsgálandó anyag koncentrációját az id ő függvényében 
regressziós analízisnek vetik alá, akkor megfelel ő információk nyer ­
hetők az átalakulási görbe megbízhatóságáról, és lehet ővé válik a 
konfidenciahatárok kiszámítása a felezési id őkhöz (pszeudo-els ő­
rendű kinetika esetén) vagy a DT  50 -értékekhez, illetve adott esetben 
a DT  75 - és DT  90 -értékekhez is.  
1.8. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.8.1.  Berendezés és reagensek  
Az inkubálórendszerek statikus, zárt rendszerekb ől vagy megfelel ő 
átfolyásos rendszerekb ől állnak (7) (17). Megfelel ő átfolyásos tala ­
jinkubáló berendezésekre és biométer-típusú lombikokra az 1., illetve 
2. ábrán láthatók példák. Mindkét inkubálórendszernek megvannak az előnyei és korlátai (7) (17).
 
Szabványos laboratóriumi eszközökre van szükség, különösen a 
következőkre: 
— analitikai m űszerek, például GLC-, HPLC-, TLCLC-berendezés, 
ezen belül a radioaktívan jelölt vagy nem jelölt anyagok analízi ­
sére vagy a fordított izotóphígítási módszerhez alkalmazható 
megfelelő detektáló rendszerek,  
— minőségi meghatározásra alkalmazható m űszerek (például MS, 
GC-MS, HPLC-MS, NMR stb.),  
— folyadékszcintillációs számláló,  
— oxidálószer a radioaktív anyagok elégetéséhez,  
— centrifuga,  
— extrakciós készülék (például centrifugacsövek hideg extrahá ­
láshoz és Soxhlet-készülék reflux alatt végzett folytonos extrahá ­
láshoz),  
— oldatok és kivonatok töményítésére szolgáló berendezések (pl. 
rotációs evaporátor),  
— vízfürd ő, 
— mechanikai kever őeszközök (pl. dagasztógép, rotációs kever ő). ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Az alkalmazott kémiai reagensek például az alábbiak:  
— NaOH, analitikai min őségű, 2 mol dm  -3 , vagy más megfelel ő 
bázis (pl. KOH, etanolamin),  
— H  2 SO 4 , analitikai min őségű, 0,05 mol. dm  -3 , 
— etilén-glikol, analitikai min őségű, 
— szilárd adszorpciós anyagok, például nátronmész, és poliuretán 
dugók,  
— szerves oldószerek, analitikai min őségű, például aceton, 
metanol stb.,  
— szcintillációs folyadék.  
1.8.2.  A vizsgálandó anyag alkalmazása  
A vizsgálandó anyag talajhoz adásához és abban történ ő eloszla­
tásához azt el őször fel kell oldani (ioncserélt vagy desztillált) 
vízben vagy ha szükséges, minimális mennyiség ű acetonban vagy 
más szerves oldószerben (6), amelyben a vizsgálandó anyag 
kellően oldható és stabil. A kiválasztott oldószer mennyisége 
azonban nem gyakorolhat szignifikáns hatásokat a talaj mikrobiális aktivitására (lásd az 1.5. és az 1.9.2–1.9.3. szakaszt). Kerülni kell 
az olyan oldószerek, például a kloroform, a diklór-metán és egyéb 
halogénezett oldószerek alkalmazását, amelyek gátolják a mikrobi ­
ális aktivitást.
 
A vizsgálandó anyag szilárd formában, például kvarchomokkal 
keverve (6) vagy elég száraz és sterilezett, kis térfogatú teszttalaj ­
részmintában is a talajhoz adható. Ha a vizsgálandó anyagot oldószer 
alkalmazásával adjuk a talajhoz, az oldószernek el kell párolognia a vizsgálandó anyaggal kezelt részminta eredeti, nem steril talajmin ­
tához történ ő hozzáadása el őtt.
 
Általános vegyi anyagok esetében, amelyeknél a talajba való bejutás 
fő útvonala a szennyvíziszap vagy a mez őgazdasági tevékenységek, 
a vizsgálandó anyagot el őször iszaphoz kell keverni, és ebben a 
formában kell a talajmintába juttatni (lásd az 1.9.2. és az 1.9.3. 
szakaszt).  
A formulázott termékek alkalmazása általában nem ajánlott. A 
rosszul oldódó vizsgálandó anyagok esetében azonban megfelel ő 
alternatíva lehet a formulázott anyag alkalmazása.  
1.8.3.  Talajok  
1.8.3.1.  A talaj kiválasztása  
Az átalakulási útvonal meghatározásához reprezentatív talajok alkal ­
mazhatók, így például ajánlott az olyan homokos vályog vagy iszapos vályog vagy vályog, vagy a vályogos homok (a FAO és az USDA osztályozása szerint (18)), amelynek pH-ja 5,5 és 8,0 
közötti, szervesszén-tartalma 0,5–2,5 %, mikrobiális biomasszája 
pedig legalább a teljes szervesszéntartalom 1 %-ának megfelel ő (10).
 
Az átalakulási sebesség vizsgálatokhoz legalább három további olyan 
talajt kell alkalmazni, amelyek jól reprezentálnak egy sor megfelel ő 
talajtípust. A különféle talajokban eltér őnek kell lenniük a szervesz ­
szén-tartalom, a pH, az agyagtartalom és a mikrobiális biomassza 
értékeinek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
A talajokat legalább a szerkezet ( %homok, %iszap, %agyag) (a 
FAO és az USDA osztályozása szerint (18)), a pH, a kationcserél ő 
kapacitás, a szerves szén, a térfogats űrűség, a vízvisszatartási 
jellemzők ( 1 ) 1 és mikrobiális biomassza (csak az aerob vizsgálatok ­
hoz) szempontjából jellemezni kell. Az eredmények értelmezéséhez 
hasznosak lehetnek a talajok tulajdonságaival kapcsolatos további 
információk is. A talajok jellemz őinek meghatározására a (19), 
(20), (21), (22) és (23) hivatkozásban ajánlott módszerek alkalmaz ­
hatók. A mikrobiális biomasszát a szubsztrátindukált légzési (SIR) 
módszerrel (25) (26) vagy alternatív módszerekkel (20) kell 
meghatározni.  
1.8.3.2.  A talajok gy űjtése, kezelése és tárolása  
Részletes információkkal kell rendelkezni annak a szántóföldi terü ­
letnek a történetér ől, ahonnan a vizsgálati talajminta begy űjtése törté ­
nik. Ilyen részletek például a pontos hely, a növénytakaró, a növény ­
védő szerekkel végzett kezelések, a szerves és szervetlen trágyákkal 
végzett kezelések, a biológiai anyagok hozzáadása vagy egyéb szennyezések. Nem alkalmazhatók átalakulási vizsgálatokhoz olyan 
talajok, amelyeket az elmúlt négy évben a vizsgálandó anyaggal 
vagy szerkezeti analógjaival kezeltek (10) (15).
 
A talajt frissen kell begy űjteni a területr ől (az A-rétegb ől vagy a 
felső 20 cm-es rétegb ől) a benne lév ő talajnedvességgel együtt, 
amely megkönnyíti a szitálást. A rizsföldekr ől származó talajok kivé ­
telével kerülni kell a mintavételt a hosszabb (> 30 napos) szárazsá ­
gok, fagyok vagy áradások idején vagy közvetlenül ezek után (14). 
A mintákat úgy kell szállítani, hogy közben minimális legyen a talaj víztartalmának változása, és – lehet őség szerint – sötétben kell 
tartani, illetve biztosítani kell a szabad leveg őbeáramlást. Erre a 
célra általában megfelel egy lazán összekötött polietilén zsák.
 
A talajt a mintavételt követ ően a lehet ő leggyorsabban fel kell 
dolgozni. El kell távolítani bel őle a növényi részeket, a nagyobb 
méretű talajfaunát és a köveket, majd 2 mm-es szitán át kell szitálni, 
ami eltávolítja a kisebb köveket, az állati és növényi törmeléket is. A szitálás el őtt meg kell akadályozni a talaj er őteljes kiszáradását és 
összeprésel ődését (15).
 
Ha a téli id őszakban (a talaj fagyottsága vagy a hótakaró miatt) 
nehézkessé válik a mintavétel, akkor üvegházban, növénytakaró (pl. fű vagy fű/lóhere keverék) alatt tárolt készletekb ől is vehet ő 
talajminta. A frissen gy űjtött talajokon végzett vizsgálatok a legel ő­
nyösebbek, de ha a begy űjtött és feldolgozott talajt a vizsgálatok 
megkezdése el őtt tárolni kell, akkor a mikrobiális aktivitás 
megőrzése érdekében ez csak megfelel ő körülmények között és 
csak korlátozott ideig (4 ± 2
 o C-on legfeljebb három hónapig) 
megengedett (  2 ). A biológiai átalakulási kísérletekhez alkalmazott 
talajok begy űjtésével, kezelésével és tárolásával kapcsolatos részletes 
instrukciók a (8), (10), (15), (26) és (27) hivatkozásban találhatók.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) A talajok vízvisszatartási jellemz ői mérhetők szántóföldi kapacitásként, vízmegtartó 
kapacitásként vagy vízszívó er őként (pF). A magyarázatokat lásd az 1. függelékben. A 
vizsgálati jelentésben ki kell térni arra, hogy a talajok vízvisszatartási jellemz őit és 
térfogatsűrűségét érintetlen szántóföldi mintákban vagy vagy megbolygatott (feldolgo ­
zott) mintákban mérték-e. 
( 2 ) A legfrissebb kutatási eredmények szerint –20  o C -on a mérsékelt éghajlatról származó 
talajok három hónapnál tovább is eltarthatók (28) (29) anélkül, hogy szignifikénsan 
csökkenne a mikrobiális aktivitás.
 Mielőtt a feldolgozott talaj felhasználásra kerülne ehhez a vizsgálat ­
hoz, a mintákat el ő kell inkubálni a csírázás lehet ővé tétele és 
a magok eltávolítása, valamint a mikrobiális anyagcsere-egyen ­
súlynak a mintavételi vagy tárolási körülményekr ől az inkubációs 
körülményekre való átállást követ ően történ ő helyreállítása 
érdekében. Általában megfelel ő, ha az el őinkubálást 2–28 napig 
végezzük olyan h őmérsékleten és olyan nedvesség mellett, amely 
nagyjából megközelíti a vizsgálati körülményekre jellemz ő viszo­
nyokat (15). A tárolás és el őinkubálás együttes id őtartama nem 
haladhatja meg a három hónapot.  
1.9. A VIZSGÁLAT VÉGREHAJTÁSA  
1.9.1.  Vizsgálati körülmények  
1.9.1.1.  Vizsgálati h őmérséklet  
A talajokat a vizsgálat teljes id őtartama alatt sötétben és olyan 
állandó h őmérsékleten kell inkubálni, amely reprezentatív a használat 
vagy kibocsátás területén uralkodó éghajlati viszonyokra. Az ajánlott 
hőmérséklet minden olyan vizsgálandó anyag esetében 20 ± 2  o C, 
amelyek mérsékelt éghajlaton bejuthatnak a talajba. A h őmérsékletet 
nyomon kell követni.  
A hidegebb éghajlatokon (pl. az északi országokban vagy az őszi-téli 
időszakban) alkalmazott vagy kibocsátott anyagok esetében 
további talajmintákat is inkubálni kell, de alacsonyabb h őmérsékleten 
(pl. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Nedvességtartalom  
Az aerob körülmények között végzett átalakulási vizsgálatok 
esetében a talaj nedvességtartalmát (  1 ) úgy kell beállítani, hogy a 
pF-értéket 2,0 és 2,5 között tartsuk (3). A talaj nedvességtartalmát víztömeg/száraz talaj tömeg egységben kell kifejezni, és rendszeresen 
ellenőrizni kell (például kéthetente) inkubációs lombik tömegének 
megmérésével, és a vízveszteség víz (lehet őleg sterilsz űrt csapvíz) 
hozzáadásával történ ő kompenzálásával. Figyelni kell arra, hogy a 
víz hozzáadásakor megakadályozzuk vagy minimálisra csökkentsük a 
vizsgálandó anyag és/vagy az átalakulási termékek párolgási és/vagy 
esetleges fotodegradációs veszteségeit.
 
Az anaerob vagy rizsföldi körülmények között végzett átalakulási 
vizsgálatoknál a talajt elárasztással kell víztelítetté tenni.  
1.9.1.3.  Aerob inkubációs körülmények  
Az átfolyásos rendszerekben az aerob körülményeket a rendszer 
időről időre vízzel történ ő átöblítésével vagy nedves leveg ő folya­
matos átfúvásával kell fenntartani. A biométer lombikokban a 
légcserét diffúzió segítségével kell fenntartani.  
1.9.1.4.  Steril aerob körülmények  
A vizsgálandó anyag abiotikus átalakulásának jelent őségével kapcso ­
latban úgy nyerhet ők információk, hogy a mintákat sterilezzük (a 
sterilezési módszereket lásd a (16) és (29) hivatkozásban), hozzá ­
adjuk a steril vizsgálandó anyagot (például az oldat sterilsz űrőn 
keresztül történ ő hozzáadásával) és nedves leveg ővel átszell őztetjük, 
az 1.9.1.3. szakaszban leírtak szerint. A rizstalajok esetében a talajt és a vizet sterilizálni kell, az inkubálást pedig az 1.9.1.6. szakaszban leírtak szerint kell végezni.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) A talaj nem lehet sem túl nedves, sem túl száraz annak érdekében, hogy fenntartható 
legyen a talaj mikroflórájának megfelel ő szellőzése és tápanyagellátása. Az optimális 
mikrobanövekedéshez az ajánlott nedvességtartalom a víztartóképesség (WHC) 40 és 
60 %-a között, illetve 0,1 és 0,33 bar között mozog (6). Ez utóbbi tartomány pF 
2,0–2,5-nek felel meg. A különböz ő talajtípusok tipikus nevességtartalma a 2. függe ­
lékben található.
 1.9.1.5.  Anaerob inkubációs körülmények  
Anaerob körülmények kialakításához és fenntartásához a vizsgálandó 
anyaggal kezelt és 30 napig vagy egy felezési id őig vagy egy DT  50 - 
ig (amelyik a három közül a legrövidebb) aerob körülmények között 
inkubált talajt vízzel kell elárasztani (1–3 cm-es vízréteg), az inku ­
bációs rendszert pedig inert gázzal (például nitrogénnel vagy argon ­
nal) kell átöblíteni (  1 ). A vizsgálati rendszernek lehet ővé kell tennie a 
különféle méréseket, így például a pH, az oxigénkoncentráció és a 
redoxpotenciál meghatározását, továbbá csapdákat is tartalmaznia 
kell az illékony termékek befogására. A biométer-típusú rendszert le kell zárni a leveg ő diffúzióval történ ő bejutásának megakadályo ­
zása érdekében.
 
1.9.1.6.  Rizstalajok inkubációs körülményei  
A rizstalajokban végbemen ő átalakulások tanulmányozására a talajt 
körülbelül 1–5 cm vízréteggel kell elárasztani, majd a vizsgálandó 
anyagot a vízfázisba kell juttatni (9). Javasolt legalább 5 cm mély ­
ségű talajréteg alkalmazása. A rendszer leveg ővel átszell őztetett, 
ugyanúgy, mint az aerob feltételek esetén. Nyomon kell követni, 
és rögzíteni kell a vizes réteg pH-ját, oxigénkoncentrációját és redox ­
potenciálját. Az átalakulási vizsgálatok megkezdése el őtt legalább 
kéthetes el őinkubálási id őszakra van szükség (lásd az 1.8.3.2. 
szakaszt).  
1.9.1.7.  A vizsgálat id őtartama  
A sebesség- és útvonalvizsgálatok id őtartama általában nem haladhatja 
meg a 120 napot (  2 ) (3) (6) (8), mivel azt követ ően egy, a természetes 
utánpótlástól izolált mesterséges laboratóriumi rendszerben id ővel a 
talaj mikrobiális aktivitásának csökkenése lenne várható. Ahol az a vizsgálandó anyag csökkenésének, valamint a f ő átalakulási termékek 
képződésének és csökkenésének jellemzéséhez szükséges, a vizs ­
gálatok meghosszabbíthatók (például 6 vagy 12 hónapra) (8). A 
hosszabb inkubációs id őtartamokat a vizsgálati jelentésben meg kell 
indokolni, és csatolni kell az ilyen hosszabb id őtartamok során és 
végén elvégzett biomasszamérések eredményeit is.
 
1.9.2.  A vizsgálat végrehajtása  
Minden inkubációs lombikba (lásd a 3. függelék 1. és 2. ábráját) 
körülbelül 50–200 g talajt (szárazsúlyra vetítve) kell behelyezni, 
majd azt az 1.8.2 szakaszban leírt módszerek egyikének alkalmazá ­
sával a vizsgálandó anyaggal kell kezelni. Ha a vizsgálandó anyag alkalmazásához szerves oldószert használunk, azt párologtatással el 
kell távolítani a talajból. A talajt ezután spatulával és/vagy a lombik 
rázogatásával alaposan össze kell keverni. Ha a vizsgálatot rizsföldi körülmények között végezzük, a talajt és a vizet a vizsgálandó anyag alkalmazása után alaposan össze kell keverni. A kezelt talajok kis 
részleteiben (pl. 1-1 g-jában) meg kell határozni a vizsgálandó anyag 
mennyiségét az egyenletes eloszlás ellen őrzése érdekében. Az ezt 
kiváltó alternatív módszert lásd lent.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) A feltalajokban túlnyomóan aerob viszonyok uralkodnak és ugyanígy a felszín alatti 
talajokban is, ahogyan azt egy, az Európai Unió által szponzorált kutatási program (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, fieldsite, 
seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. 
Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, 
Sweden] is igazolta. Anaerob feltételek csak alkalomszer űen, a talajok er ős esőzések 
utáni elárasztásakor alakulnak ki, illetve amikor a rizsföldeket elárasztják. 
(
 2 ) Az aerob vizsgálatokat jóval a 120. nap el őtt is be lehet fejezni, ha addigra egyértelm űen 
elértük a végleges átalakítási útvonalat és a teljes mineralizációt. A vizsgálat 120 napon 
túl is befejezhet ő, illetve akkor is, ha a vizsgálandó anyag legalább 90 %-a átalakult, de 
csak akkor, ha már legalább 5 % CO  2 képződött.
 A kezelési aránynak meg kell felelnie az adott növényvéd ő szer 
legmagasabb, a használati utasításban javasolt alkalmazási arány ­
ának, és a terepen megfelel ő talaj mélységig (például a talaj fels ő 
10 cm-es rétege (  1 ) egységes beépülést kell biztosítania. A talajba 
való beépülés nélkül csak a levélzetre vagy a talajra alkalmazott 
vegyületek esetében például 2,5 cm a megfelel ő mélység annak 
kiszámításához, hogy mennyi vegyületet kell az egyes lombikokba bejuttatni. A talajba beépül ő vegyületek esetében a megfelel ő 
mélység a használati utasításban megadott beépülési mélység. Álta ­
lános vegyi anyagok esetében az alkalmazási arányt az alapján kell 
megbecsülni, hogy melyik a legjellemz őbb bejutási útvonal; ha a 
talajba jutás f ő útvonala például a szennyvíziszap, a vegyületet 
olyan koncentrációban kell az iszapba bejuttatni, amely tükrözi az 
iszapban várható koncentrációt, és a talajhoz adandó iszap mennyi ­
ségének tükröznie kell a mez őgazdasági talajok normál iszapterhelé ­
sét. Ha ez a koncentráció nem elég magas a f ő átalakulási termékek 
azonosításához, hasznos lehet külön talajminták nagyobb koncentrá ­
ciókkal történ ő inkubálása, de kerülni kell a talaj mikrobiális funk ­
cióját befolyásoló túlzott mennyiségeket (lásd az 1.5 és az 1.8.2. szakaszt).
 
Vagy nagyobb mennyiség ű (1-2 kg) talaj is kezelhet ő a vizsgálandó 
anyaggal, megfelel ő keverő berendezésben alaposan elkeverve és 
végül kis, 50–200 g-os részletekben az inkubációs lombikba téve 
(például mintaosztók segítségével). A kezelt talaj kis (például 1 g- 
os) részleteiben meg kell határozni a vizsgálandó anyag mennyiségét, így ellenőrizve annak egyenletes talajbeli eloszlását. Az ilyen eljárás 
azért előnyös, mert lehet ővé teszi a vizsgálandó anyag még egyen ­
letesebb eloszlását a talajban.
 
A nem kezelt talajmintákat is ugyanolyan (aerob) körülmények 
között kell inkubálni, mint a vizsgálandó anyaggal kezelt mintákat. Ezeket a mintákat a biomasszának a vizsgálat során és végén történ ő 
meghatározására kell felhasználni.
 
Ha a vizsgálandó anyagot szerves oldószer(ek)ben történ ő feloldás 
után visszük fel a talajra, az azonos mennyiség ű oldószerrel vagy 
oldószerekkel kezelt talajmintákat ugyanolyan (aerob) körülmények 
között kell inkubálni, mint a vizsgálandó anyaggal kezelt mintákat. Ezeket a mintákat a vizsgálatok elején, alatt és végén végzett biomasszamérésekhez kell felhasználni, amelyekkel az oldó ­
szer(ek)nek a mikrobás biomasszára gyakorolt esetleges hatásai 
mérhetők fel.
 
A kezelt talajokat tartalmazó lombikokat vagy az 1. ábrán bemutatott 
átfolyásos rendszerhez kell kapcsolni, vagy a 2. ábrán bemutatott adszorpciós oszloppal kell lezárni (lásd a 3. függeléket).
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) A kiindulási koncentráció területi alapon történ ő kiszámítása a következ ő egyenlet segít ­
ségével:  
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = kiindulási koncentráció a talajban [mg ·kg -1 ] 
A = alkalmazásiarány [kg · ha -1 ]; 1 = a szántóföldi talajréteg vastagsága [m]; d=a talaj 
száraz térfogat s őrősége [kg· m -3 ]. 
Általános szabály, hogy az 1 kg · ha -1 alkalmazási arány a talaj felsi, mintegy 10cm-es 
rétegében 1 mg · kg -1 koncentrációt alakít ki (feltéve, hogy a térfogats őrőség 1 g· cm  -3 ).
 1.9.3.  Mintavétel és mérés  
Megfelelő időközönként párhuzamos inkubációs lombikokat kell 
eltávolítani, és a talajmintákat megfelel ő, különböz ő polaritású oldó ­
szerekkel kell extrahálni, majd meg kell határozni bennük a vizs ­
gálandó anyagot és/vagy az átalakulási termékeket. Egy jól megter ­
vezett vizsgálatban elegend ő számú lombikot használunk ahhoz, 
hogy minden egyes mintavételi id őpontban két lombikból tudjuk 
mérést végezni. Az egyes talajminták inkubálása során és végén 
különböző időközönként (az els ő hónapban 7 naponta, majd utána 
17 naponta) el kell távolítani az adszorpciós oldatot vagy szilárd adszorpciós anyagot, és meg kell bennük határozni az illékony 
termékeket. A közvetlenül az alkalmazás után vett talajmintán (0. 
napi minta) kívül legalább öt további mintavételi pontot kell beik ­
tatni. Az id őközöket úgy kell megválasztani, hogy meghatározható 
legyen a vizsgálandó anyag csökkenésének mintázata és az átalaku ­
lási termékek képz ődésének és csökkenésének mintázata (például 0., 
1., 3., 7. nap; 2, 3 hét; 1, 2, 3 hónap stb.).
 
14 C-jelölt vizsgálandó anyag alkalmazása esetén a nem extrahálható 
radioaktivitást égetéssel kell meghatározni, és minden egyes minta ­
vételi intervallumra anyagmérleget kell számítani.  
Az anaerob és a rizstalajos inkubálás esetén a talajban és a vizes 
fázisban együttesen kell meghatározni a vizsgálandó anyagot és az 
átalakítási termékeket, vagy az extrahálás és mérés el őtt szűréssel 
vagy centrifugál ással kell szétválasztani őket. 
1.9.4.  Opcionális vizsgálatok  
A hőmérsékletnek és a talajnedvességnek a vizsgálandó anyag és/ ­
vagy átalakítási termékei talajbeli átalakulására gyakorolt hatásának 
becsléséhez hasznos lehet, ha más h őmérsékleteken és talajnedves ­
ségek mellett is végzünk aerob, nem steril vizsgálatokat.  
A nem extrahálható radioaktivitás további jellemzése megkísérelhet ő 
például szuperkritikus folyadékextrakcióval is.  
2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
A vizsgálandó anyag, az átalakulási termékek, az illékony anyagok 
(csak %-osan), és a nem extrahálható rész mennyiségét minden egyes mintavételi intervallumra az alkalmazott kiindulási koncentráció %- ában, illetve adott esetben mg.kg
 -1 talaj (szárazsúlyra vetítve) 
egységben kell megadni. Az alkalmazott kiindulási koncentráció 
százalékában anyagmérleget is fel kell állítani minden egyes minta ­
vételi intervallumra. A vizsgálandó anyag koncentrációit az id ő függ­
vényében ábrázolva megbecsülhet ő a vizsgálandó anyag átalakulá ­
sának felezési ideje vagy DT  50 -értéke. Meg kell határozni a f ő átala­
kulási termékeket, valamint ezek koncentrációját is fel kell venni az idő függvényében, hogy képz ődési és csökkenési sebességük 
megállapítható legyen. F ő átalakulási termék minden olyan termék, 
amely a vizsgálat során bármikor az alkalmazott dózis legalább 
10 %-nak megfelel ő mennyiségben van jelen.
 
A befogott illékony termékek is adhatnak némi információt a vizs ­
gálandó anyag és annak átalakulási termékei talajból való elillanási 
hajlamáról.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
A felezési id ő vagy DT  50 -értékek, illetve adott esetben a DT  75 - és 
DT 90 -értékek pontosabb meghatározását megfelel ő kinetikai modell ­
számítások alkalmazásával kell elvégezni. A felezési id őt és a DT  50 - 
értékeket az alkalmazott modell leírásával, a kinetika rend űségével és 
a determinációs koefficienssel (r  2 ) együtt kell a jelentésben feltün ­
tetni. Az els őrendű kinetikát kell el őnyben részesíteni, kivéve, ha r  2 
< 0,7. Adott esetben a számításokat a f ő átalakulási termékekre is 
alkalmazni kell. A megfelel ő modellekre példák a (31)–(35) hivat ­
kozásban találhatók.  
A sebességvizsgálatok több különböz ő hőmérsékleten történ ő 
végzése esetén az átalakítási sebességeket kísérleti h őmérséklet tarto ­
mányon belül a h őmérséklet függvényében kell leírni az alábbi 
Arrhenius-összefüggés alkalmazásával:  
k ¼ A·e ÄB=T vagy  lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
ahol In A és B az In k-nak az l/T függvényében való lineáris 
regressziójával el őállított legjobb illesztés ű egyenes tengelymetsze ­
téből és meredekségb ől származó regressziós állandók; a k a T 
hőmérsékletnél kapott sebességi állandó; T pedig a h őmérséklet 
Kelvinben megadva. Ügyelni kell arra, hogy abban az esetben, ha az átalakítást a mikrobiális hatás szabályozza, akkor az Arrhenius- 
összefüggés csak egy igen korlátozott h őmérsékleti tartományban 
lesz érvényes.
 
2.2. ÉRTÉKELÉS ÉS AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE  
Bár a vizsgálatokat mesterséges laboratóriumi rendszerekben végez ­
zük, az eredmények lehet ővé teszik a vizsgálandó anyagok átala ­
kulási sebességének, valamint az átalakulási termékek képz ődési és 
csökkenési sebességének szántóföldi körülmények közötti becslését 
(36) (37).  
A vizsgálandó anyag átalakulási útvonalának vizsgálata információt 
szolgáltat arról, hogy az alkalmazott anyag szerkezete milyen válto ­
zásokon megy keresztül a talajban a kémiai és mikrobiális reakciók 
hatására.  
3. JELENTÉS  
VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— hétköznapi név, kémiai elnevezés, CAS-szám, szerkezeti képlet 
(radioaktívan jelölt anyagok alkalmazása esetén a jelölés(ek) 
elhelyezkedése) és a lényeges fizikai-kémiai tulajdonságok (lásd az 1.5. szakaszt),
 
— a vizsgálandó anyag tisztasága (szennyezései),  
— a jelölt anyagok radiokémiai tisztasága és specifikus aktivitása 
(adott esetben).  
Referenciaanyagok:  
— az átalakítási termék jellemzésére és/vagy azonosítására alkalma ­
zott referenciaanyagok kémiai elnevezése és szerkezete.  
Vizsgált talajok:  
— a gyűjtés helyével kapcsolatos adatok,  
— a talajmintavétel id őpontja és az alkalmazott eljárás,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— a talajok tulajdonságai, például a pH, a szervesszén-tartalom, a 
szerkezet ( % homok, % iszap, % agyag), a kationcserél ő kapa­
citás, a térfogats űrűség, a vízvisszatartási jellemz ők, és a mikro ­
biális biomassza,  
— adott esetben a talaj tárolásának id őtartama és körülményei.  
Vizsgálati körülmények:  
— a vizsgálatok elvégzésének id őpontjai,  
— a vizsgálandó anyag alkalmazott mennyisége,  
— az alkalmazott oldószerek és a vizsgálandó anyag alkalmazására 
használt módszer,  
— a kezdetben kezelt és az egyes analízisek id őpontjában megmin ­
tázott talaj tömege,  
— az alkalmazott inkubációs rendszer ismertetése,  
— légáramsebesség (csak az átfolyásos rendszerek esetében),  
— a kísérleti rendszer h őmérséklete,  
— a talaj nedvességtartalma az inkubálás során,  
— mikrobiális biomassza az aerob vizsgálatok kezdetekor, alatt és 
végén,  
— pH, oxigénkoncentráció és redoxpotenciál az anaerob és rizsföldi 
vizsgálatok kezdetekor, alatt és végén,  
— extrakciós módszer(ek),  
— a vizsgálandó anyagnak és fontosabb átalakulási termékeinek a 
talajban és az adszorpciós anyagokban történ ő mennyiségi és 
minőségi meghatározására alkalmazott módszerek,  
— másolati minták és ellen őrző minták száma.  
Eredmények:  
— a mikrobiális aktivitás meghatározásának eredményei,  
— az alkalmazott analitikai módszerek megismételhet ősége és érzé ­
kenysége,  
— visszanyerési arányok (egy érvényes vizsgálat %-os értékei az 
1.7.1. szakaszban vannak feltüntetve),  
— az alkalmazott kiindulási dózis %-ában és adott esetben mg.kg  -1 
talaj (szárazsúlyra vetítve) egységben is kifejezett eredmények 
táblázatos összefoglalása,  
— anyagmérleg a vizsgálatok közben és végén,  
— a nem extrahálható (kötött) talajbeli radioaktivitás vagy marad ­
ványok jellemzése,  
— a felszabaduló CO  2 és más illékony vegyületek mennyisége,  
— a talajbeli koncentráció id őbeli függvényének ábrázolása a vizs ­
gálandó anyagra és adott esetben annak f ő átalakulási termékeire,  
— felezési id ő vagy DT  50 -, DT  75 - és DT  90 -értékek a vizsgálandó 
anyagra és adott esetben annak f ő átalakulási termékeire, a konfi ­
denciahatárokkal együtt,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— a steril körülmények közötti abiotikus lebontási sebesség becs ­
lése, 
— a vizsgálandó anyag és adott esetben annak f ő átalakulási 
termékei átalakulási kinetikájának becslése,  
— adott esetben az átalakítás javasolt útvonalai,  
— az eredmények tárgyalása és értelmezése,  
— nyers adatok (minta kromatogramok, átalakítási sebességek 
mintaszámításai, és az átalakulási termékek azonosításnak módja).
 
4. SZAKIRODALOM  
1. US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assess ­
ment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
 
2. Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
3. Európai Unió (EU) (1995). A Bizottság 1995. július 14-i 95/36/ ­
EK irányelve a növényvéd ő szerek forgalomba hozataláról szóló 
91/414/EGK tanácsi irányelv módosításáról. AII. melléklet A. 
része és III. melléklet A. része: A növényvéd ő szerek sorsa és 
viselkedése a környezetben.  
4. Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour 
of the product and its metabolites in soil, water and air.  
5. BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzens ­
chutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
6. ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions. (Talajmin őség. Útmutató a talajban lev ő 
szerves vegyi anyagok aerob feltételek melletti biológiai lebont ­
hatóságának laboratóriumi vizsgálatára.)
 
7. ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals 
in soil under aerobic conditions. (Talajmin őség. Laboratóriumi 
inkubációs rendszerek a talajban lév ő szerves vegyi anyagok 
aerob feltételek mellett végbemen ő mineralizációjának vizsgála ­
tához)  
8. SET AC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
9. MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil -Aerobic metabolism study in soil 
under paddy field conditions (flooded).  
10. OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
11. Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
 
12. DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
13. T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
14. OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15. ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. (Talajmin őség – Mintavétel – A mikrobiális folyamatok labora ­
tóriumi értékelésére szolgáló talaj begy űjtésére, kezelésére és 
tárolására vonatkozó iránymutatás.)
 
16. A 67/548/EGK irányelv V. melléklete.  
17. Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1,85-114.
 
18. Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
19. Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
20. Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. AL. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
21. ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
22. Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
 
23. Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
24. Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method 
for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
 
25. ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass -Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method. (Talajmin őség. 
A talaj mikrobiális biomasszájának meghatározása. 1. rész: 
Szubsztrátindukált respirációs módszer. 2. rész: G őzextrakciós 
módszer.)
 
26. Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesti ­
cide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. 
Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.  
27. Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesti ­
cides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Sympo ­
sium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
28. Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
 
29. Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In 
Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 
(SETAC-Europe).
 
30. Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197-200.  
31. Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. 
Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32. Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
 
33. Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135-172.  
34. Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nachrichten Bayer 39, 
188-204.
 
35. Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47-60.  
36. Gustafson DL, Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.  
37. Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
1. függelék  
VÍZSZÍVÓ ER Ő, SZÁNTÓFÖLDI VÍZKAPACITÁS (FC) ÉS VÍZTARTÓ KÉPESSÉG 
(WHC)  ( 1 ) 
A vízoszlop magassága 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Megegyzések  
10 7 7 10  4 Száraz talaj 
1,6 · 10 4 4,2 16 Hervadáspont 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Szántóföldi vízkapacitás 
tartomány (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (közelítés) 
1 0 0,001 Vízzel telített talaj
 
( a ) pF = a vízoszlopmagasság cm-ben kifejezett értékéknek logaritmusa. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Homokban körülbelül 10 %-os, vályogban körülbelül 35 %-os, agyagban pedig körülbelül 45 %-os víztar ­
talomnak felel meg. 
( d ) A szántóföldi vízkapacitás nem állandó, hanem talajtípusként eltér ő, és pF 1,5 és 2,5 között változik.  
A vízszívó er őt vízoszlop-cm vagy bar mértékegységben mérjük. A szívóer ő nagysága igen széles 
tartományban mozoghat, ezért egyszer űen csak pF-értékként adjuk meg, amely a vízoszlop-cm érték 
logaritmusa.  
A szántóföldi vízkapacitás azt a vízmennyiséget jelenti, amelyet egy természetes talaj egy hosszabb 
esőzés vagy kell ő mértékű öntözés után 2 nappal gravitáció ellenében tárolni tud. A szántóföldi 
vízkapacitást érintetlen talajban, in situ, a terepen határozzák meg. A mérés tehát nem alkalmazható 
megbolygatott, laboratóriumi talajmintákra. A megbolygatott mintákban meghatározott FC-értékek nagyobb szisztematikus varianciát mutathatnak.
 
A víztartó képességet (WHC) laboratóriumban határozzák meg érintetlen és megbolygatott tala ­
jokban úgy, hogy egy talajoszlopot kapilláris transzport útján vízzel telítenek. Különösen jól alkal ­
mazható megbolygatott talajok esetében, és akár 30 %-kal is meghaladhatja a szántóföldi vízkapa ­
citást (1). Emellett egyszer űbben meghatározható kísérletileg, mint a megbízható FC-értékek.  
Megjegyzések  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
2. függelék  
KÜLÖNBÖZ Ő ORSZÁGOKBÓL SZÁRMAZÓ KÜLÖNBÖZ Ő TALAJTÍPUSOK 
NEDVESSÉGTARTALMA (G VÍZ/100 G SZÁRAZ TALAJ)  
Talajnedvesség 
Talajtípus Ország 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Homok Németország 28,7 8,8 3,9 
Vályogos homok Németország 50,4 17,9 12,1 
Vályogos homok Svájc 44,0 35,3 9,2 
Iszapos vályog Svájc 72,8 56,6 28,4 Agyoagos vályog Brazília 69,7 38,4 27,3 Agyoagos vályog Japán 74,4 57,8 31,4 Homokos vályog Japán 82,4 59,2 36,0 Iszapos vályog USA 47,2 33,2 18,8 Homokos vályog USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Víztartó képesség  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
3. függelék  
1. ábra  
Példa vegyi anyagok talajbeli átalakulásának vizsgálatára szolgáló át folyásos készülékre  ( 1 ) ( 2 )
 
2. ábra  
Példa vegyi anyagok talajbeli átalakulásának vizsgálatára szolgáló biométer-típusú 
lombikra  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123–157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 C.24.  AEROB ÉS ANAEROB ÁTALAKÍTÁS VÍZI 
ÜLEDÉKRENDSZEREKBEN  
1. MÓDSZER  
Ez a vizsgálati módszer az OECD TG 308 (2002) módszer 
megfelelője. 
1.1. BEVEZETÉS  
A sekély és mély felszíni vizekbe a vegyi anyagok például a követ ­
kező útvonalakon keresztül juthatnak be: közvetlen alkalmazás, 
permetszéthordás, felszíni elfolyás, belvízelvezetés, hulladéklerakás, 
ipari, háztartási vagy mez őgazdasági szennyvizek és légköri kiülepe ­
dés. Ez a vizsgálati módszer egy olyan laboratóriumi módszert ismertet, amellyel szerves anyagok aerob és anaerob átalakulását 
vizsgálhatjuk vízi üledékrendszerekben. Ez a módszer meglév ő 
irányelveken alapul (1) (2) (3) (4) (5) (6). Az 1995-ben az olasz ­
országi Belgirateban megrendezett, a talajok/üledékek kiválasztásával kapcsolatos OECD-munkaértekezleten (7) megegyezés született az e 
vizsgálatban alkalmazandó üledékek számáról és típusáról. A munka ­
értekezlet egy ISO Útmutató (8) alapján ajánlásokat fogalmazott meg az üledékminták gy űjtéséről, kezelésér ől és tárolásáról is. Az ilyen 
vizsgálatokra olyan vegyi anyagok esetében van szükség, amelyek 
közvetlenül a vizekbe kerülnek, vagy amelyek a fenti útvonalakon át 
valószínűleg bekerülnek a vízi környezetbe.
 
A természetes vízi üledékrendszerekben a fels ő vízfázis gyakran 
aerob. Az üledék felszíni rétege lehet aerob vagy anaerob is, a 
mélyebb üledék viszont általában anaerob. Ez a dokumentum aerob és anaerob vizsgálatokat is ismertet annak érdekében, hogy a fenti lehetőségek mindegyikét felölelje. Az aerob vizsgálat egy aerob 
üledékréteg felett elhelyezked ő aerob vízoszlopot szimulál, ahol az 
aerob üledékréteget alulról egy anaerob gradiens határolja. Az anaerob vizsgálat egy teljesen anaerob víz-üledék rendszert szimulál. Ha a körülmények arra utalnak, hogy jelent ős mértékben el kell térni 
az itt megfogalmazott ajánlásoktól, például amiatt, hogy ép üledék ­
magokat vagy olyan üledékeket használunk, amelyek esetleg érint ­
kezésbe léphettek a vizsgálandó anyaggal, akkor a célra más módszerek is rendelkezésre állnak (9).
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Minden esetben SI (Standard International) egységeket kell hasz ­
nálni.  
„Vizsgálandó anyag” : bármely anyag, legyen az a kiindulási vegyü ­
let, vagy megfelel ő átalakulási termék.  
„Átalakulási termékek”:  minden olyan anyag, amely a vizsgálandó 
anyag biotikus és abiotikus átalakulási reakcióiban keletkezik, 
ideértve a CO  2 -t és minden kötött maradványt is.  
„Kötött maradványok” : a „kötött maradványok” a talajban, növé ­
nyekben vagy állatokban jelen lév ő olyan vegyületek, amelyek a 
kiindulási anyag vagy anyagcsereterméke(i) formájában extrakció 
után is a mátrixban maradnak. Az extrakciós módszer alapjában véve nem változtathatja meg magukat a vegyületeket vagy a mátrix szerkezetét. A kötés jellege részben mátrixmódosító extrak ­
ciós módszerek, illetve kifinomult analitikai technikák segítségével 
tisztázható. Ez idáig kovalens, ionos és szorpciós kötéseket, vala ­
mint zárványokat azonosítottak ilyen módon. A kötött maradvá ­
nyok létrejötte általában szignifikánsan csökkenti a biológiai 
elérhetőséget és biológiai hozzáférhet őséget (10) [az IUPAC 
1984-ben módosította (11)].
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
„Aerob átalakulás”: ( oxidáló): molekuláris oxigén jelenlétében 
végbemen ő reakciók (12).  
„Anaerob átalakulás” : (redukáló): molekuláris oxigén kizárásával 
végbemen ő reakciók (12).  
„Természetes vizek” : tavakból, folyókból, patakokból stb. származó 
felszíni vizek.  
„Üledék” : ásványi és szerves kémiai komponensek keveréke, 
amelyek közül az utóbbiak magas szén- és nitrogéntartalmú és nagy molekulasúlyú vegyületek. A természetes vizekb ől ülepednek 
ki és azzal határfelületet képeznek.
 
„Mineralizáció” : a szerves vegyületek teljes mérték ű lebomlása 
aerob körülmények között CO  2 -dá és H  2 O-zé, illetve anaerob 
körülmények között CH  4 -ná, CO  2 -dá és H  2 O-zé. E vizsgálati 
módszer vonatkozásában radioaktívan jelölt vegyületek alkalmazá ­
sakor a mineralizáció egy molekula nagyfokú lebomlását jelenti, 
amelynek során egy jelölt szénatom kvantitatívan oxidálódik vagy redukálódik, és az ennek megfelel ő mennyiség ű
 14 CO 2 , 
illetve  14 CH 4 szabadul fel.  
„Felezési id ő”: t  0,5 , a vizsgálandó anyag 50 %-ának átalakulásához 
szükséges id ő, ha az átalakulás els őrendű kinetikával írható le; a 
felezési id ő független a kiindulási koncentrációtól.  
„DT  50 (lebomlási id ő 50)” : az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag kiindulási koncentrációja 50 %-kal csökken.  
„DT  75 (lebomlási id ő 75)” : az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag kiindulási koncentrációja 75 %-kal csökken.  
„DT  90 (lebomlási id ő 90)” : az az id őtartam, amely alatt a vizs ­
gálandó anyag kiindulási koncentrációja 90 %-kal csökken.  
1.3. REFERENCIAANYAGOK  
Az átalakulási termékek spektroszkópiás és kromatográfiás módsze ­
rekkel történ ő azonosításához és/vagy mennyiségi méréséhez referen ­
ciaanyagokat kell alkalmazni.  
1.4. A VIZSGÁLANDÓ ANYAGGAL KAPCSOLATOS INFORMÁ ­
CIÓK  
Az átalakulás sebességének mérésére nem jelölt vagy izotóppal jelölt 
vizsgálandó anyagot is alkalmazhatunk, bár el őnyben kell részesíteni 
a jelölt anyagokat. Jelölt anyagra olyankor van szükség, ha az átala ­
kulási útvonalakat kívánjuk tanulmányozni vagy anyagmérleget akarunk felvenni. A
 14 C jelölés az ajánlott, de más izotópok, így 
például  13 C, 15 N, 3 H vagy  32 P is alkalmazható. A jelölést lehet őleg 
a molekula legstabilabb részén vagy részein kell elhelyezni (  1 ). A 
vizsgálandó anyag kémiai és/vagy radiokémiai tisztaságának legalább 95 %-nak kell lennie.
 
A vizsgálat elvégzése el őtt az alábbi információkkal kell rendelkezni 
a vizsgálandó anyagról:  
a) oldhatóság vízben (A.6. módszer);  
b) oldhatóság szerves oldószerekben;  
c) gőznyomás (A.4. módszer) és Henry-állandó;  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Ha például a vizsgálandó anyag egy gy űrűt tartalmaz, akkor ezt a gy űrűt kell megjelölni. 
Ha a vizsgálandó anyag két vagy több gy űrűt is tartalmaz, esetleg külön vizsgálatot kell 
végezni az egyes jelölt gy űrűk sorsának megismeréséhez, illetve az átalakulási termékek 
keletkezésével kapcsolatos információk összegy űjtéséhez.
 d) n-oktanol/víz megoszlási hányados (A8. módszer);  
e) adszorpciós koefficiens (adott esetben K  d , K  f vagy K  oc ) (C.18. 
módszer);  
f) hidrolízis (C7. módszer);  
g) disszociációs állandó (pK  a ) [112. számú OECD Útmutató] (13);  
h) vizsgálandó anyag kémiai szerkezete és adott esetben az izotóp ­
jelölés(ek) elhelyezkedése.  
Megjegyzés : A jelentésben azt is fel kell tüntetni, hogy a méréseket 
milyen hőmérsékleten végeztük.  
További hasznos információk lehetnek a vizsgálandó anyag mikro ­
organizmusokra gyakorolt toxicitásával kapcsolatos információk, a gyors és/vagy inherens biológiai lebonthatósággal kapcsolatos 
adatok, valamint a talajbeli aerob és anaerob átalakulással összefügg ő 
adatok.
 
Rendelkezésre kell hogy álljanak a vizsgálandó anyagoknak és átala ­
kulási termékeiknek vízben és üledékben történ ő mennyiségi és 
minőségi meghatározására szolgáló analitikai módszerek (ezen 
belül az extrakciós és edényzettisztítási módszerek) (lásd az 1.7.2. szakaszt).
 
1.5. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ELVE  
Az itt ismertetett módszer egy aerob és egy anaerob vízi üledékrend ­
szert (lásd az 1. függeléket) alkalmaz, amely lehet ővé teszi, hogy:  
(i) mérjük a vizsgálandó anyag átalakulásának sebességét a víz- 
üledék rendszerben;  
(ii) mérjük a vizsgálandó anyag átalakulásának sebességét az 
üledékben;  
(iii) mérjük a vizsgálandó anyag és/vagy átalakulási termékei mine ­
ralizációjának sebességét (ha  14 C-jelölt vizsgálandó anyagot 
alkalmazunk);  
(iv) azonosítsuk és mennyiségileg is meghatározzuk az átalakulási 
termékeket a víz- és az üledékfázisban, és ezen belül anyagmér ­
leget is készítsünk (ha jelölt vizsgálandó anyagot alkalmazunk);  
(v) sötétben (például az algavirágzást elkerülend ő) és állandó 
hőmérsékleten történ ő inkubálással mérjük a vizsgálandó 
anyag és átalakulási termékei megoszlását a két fázis között. 
Ha az adatok indokolják, meg kell határozni a felezési id őt, 
valamint a DT  50 -, DT  75 - és DT  90 -értékeket is, de a kísérleti 
időszakot jóval meghaladó id őtartamokra nem szabad extrapo ­
lálni (lásd az 1.2. szakaszt).  
Legalább két-két üledékre és a hozzájuk kapcsolódó vizekre van 
szükség az aerob, illetve az anaerob vizsgálatokhoz (7). Lehetnek azonban olyan esetek is, amikor több mint kétféle vízi üledéket 
kell használni, így például olyan vegyi anyag esetében, amely édes ­
vizekben és/vagy tengeri környezetben is megjelenhet.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
A módszer bármilyen kémiai anyaghoz alkalmazható (legyen az nem 
jelölt vagy jelölt anyag), amelyhez létezik kielégít ően pontos és 
érzékeny analitikai módszer. Enyhén illékony, nem illékony, vízben 
oldható és vízben kevéssé oldható vegyületekre is alkalmazható. A 
vizsgálat nem alkalmazható olyan vegyületekre, amelyek a vízben nagymértékben illékonyak (pl. gázalakú növényvéd ő szerek, szerves 
oldószerek), és ezért nem lehet őket a vizsgálat kísérleti körülményei 
között a vízben és/vagy az üledékben tartani.
 
A módszerrel az eddigiekben vegyi anyagok édesvizekben és üledé ­
keikben történ ő átalakulását vizsgálták, de elvben torkolati/tengeri 
rendszerekhez is alkalmazható. Nem alkalmas azonban folyóvízi 
vagy nyílttengeri körülmények szimulálására.  
1.7. MIN ŐSÉGI KÖVETELMÉNYEK  
1.7.1.  Kinyerési fok  
A vizsgálandó anyag hozzáadása után azonnal legalább két párhu ­
zamos víz- vagy üledékminta extraktumát elemezve kaphatjuk az analitikai módszer ismételhet őségével és a vizsgálandó anyag alkal ­
mazására szolgáló eljárás egységességével kapcsolatos els ő informá­
ciókat. A kísérletek kés őbbi szakaszában a kinyerési fokokat a vonat ­
kozó anyagmérlegek adják (ha jelölt anyagot alkalmazunk). Jelölt vegyi anyagok esetén 90 % és 110 % közé (6), nem jelölt vegyi 
anyagok esetén pedig 70 % és 110 % közé kell esnie a kinyerési 
foknak.
 
1.7.2.  Az analitikai módszer ismételhet ősége és érzékenysége  
A vizsgálandó anyag és átalakulási termékei mennyiségi meghatá ­
rozására használt analitikai módszer ismételhet őségét az átalakulási 
termékek megjelenéséhez elegend ő ideig végzett inkubálás után a 
vízből vagy üledékb ől egy extrahálással nyert kivonat két párhu ­
zamos mérésével ellen őrizhetjük (a kezdeti extrakciós hatásfok kivé ­
telével).  
Az adott vizsgálandó anyagra és átalakulási termékeire az analitikai 
módszer kimutatási határának (limit of detection, LOD) vízben vagy 
üledékben legalább 0,01 mg.kg  –1 -nak (mint vizsgálandó anyag), 
vagy – ha az a kisebb – egy vizsgálati rendszerben alkalmazott kiindulási mennyiség 1 %-ának kell lennie. Meg kell állapítani 
emellett a mennyiségi meghatározás határát (limit of qualification, 
LOQ) is.
 
1.7.3.  Az átalakulási adatok pontossága  
Ha a vizsgálandó anyag koncentrációjának id őfüggvényét regressziós 
analízisnek vetjük alá, akkor megfelel ő információkat kaphatunk az 
átalakulási görbe pontosságáról, és lehet ővé válik a konfidencia ­
határok kiszámítása a felezési id őkhöz (pszeudo-els őrendű kinetika 
esetén) vagy a DT  50 -értékekhez, illetve adott esetben a DT  75 - és 
DT 90 -értékekhez is.  
1.8. A MÓDSZER ISMERTETÉSE  
1.8.1.  Vizsgálati rendszer és készülék  
A vizsgálatot üvegedényekben (pl. palackokban és centrifugacsövek ­
ben) kell végezni, kivéve ha az el őzetes információk (így például az 
n-oktanol/víz megoszlási hányados, a szorpciós adatok stb.) szerint a vizsgálandó anyag megtapadhat az üvegfelületen, ilyenkor esetleg fontolóra kell venni más szerkezeti anyag (így például teflon) alkal ­
mazását. Az alábbi módszerek alkalmazásával enyhíthetjük a problé ­
mát, ha ismert, hogy a vizsgálandó anyag megtapad az üvegfelületen:
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— meghatározzuk az üvegfelülethez köt ődő vizsgálandó anyag és 
átalakulási termékek tömegét,  
— a vizsgálat végén minden üvegedényt oldószerrel mosunk,  
— formulázott terméket alkalmazunk (lásd még az 1.9.2. szakaszt),  
— a vizsgálandó anyagot nagyobb mennyiség ű társoldószerrel 
együtt vezetjük be a vizsgálati rendszerbe; csak olyan társoldó ­
szert szabad használni, amely nem oldja a vizsgálandó anyagot.  
A tipikus vizsgálati készülékekre, azaz a gázátfolyásos és a biométer- 
típusú rendszerre a 2., illetve 3. függelékben láthatunk példákat (14). 
További alkalmazható inkubáló rendszereket ismertet a (15) hivatko ­
zás. A kísérleti berendezést úgy kell kialakítani, hogy lehet ővé tegye 
a lég- vagy nitrogéncserét és az illékony termékek befogását. A berendezés méreteit pedig úgy kell megválasztani, hogy teljesüljenek 
a vizsgálatra vonatkozó követelmények (lásd az 1.9.1 szakaszt). A 
ventillációt vagy óvatos buborékoltatással, vagy a vízfelszín feletti levegő- vagy nitrogénbefújással kell biztosítani. Ez utóbbi esetben 
ajánlatos lehet a vizet felülr ől óvatosan kevertetni, hogy az oxigén 
vagy a nitrogén egyenletesebben oszoljon szét a vízben. Nem szabad 
CO
 2 -mentes leveg őt használni, mivel az a víz pH-jának növekedését 
eredményezheti. Az üledék perturbációja egyik esetben sem kívána ­
tos, és lehet őség szerint minél inkább kerülni kell. Az enyhén illé ­
kony vegyi anyagokat biométer-típusú rendszerben kell vizsgálni a 
vízfelszín óvatos kevertetése mellett. Alkalmazható továbbá légköri levegős vagy nitrogénes gáztérrel rendelkez ő zárt rendszer is, amely 
az illékony termékek elnyeletésére bels ő fiolákat tartalmaz (16). 
Aerob vizsgálatok esetében rendszeresen cserélni kell a gáztérben 
lévő levegőt, hogy kompenzálni lehessen a biomassza oxigénfo ­
gyasztását.
 
Az illékony átalakulási termékek gy űjtésére alkalmas elnyelet ő folya­
dékok többek között a következ ők: a szén-dioxidhoz 1 mol.dm  –3 
koncentrációjú kálium-hidroxid- vagy nátrium-hidroxid-oldat (  1 ), 
szerves vegyületekhez pedig az etilén-glikol, az etanol-amin vagy 2 %-os xilolos paraffinoldat. Az anaerob körülmények között képződő illékony vegyületek, mint a metán, például molekulaszi ­
tákkal köthet ők meg. További lehet őség, hogy az ilyen illékony 
vegyületeket CuO-dal töltött kvarccsövön átvezetve 900
 o C hőmér­
sékleten CO  2 -dá oxidáljuk, és a képz ődött CO  2 -ot lúgos abszor ­
berben fogjuk fel (17).  
A vizsgálandó anyag és az átalakulási termékek elemzéséhez külön ­
féle laboratóriumi m űszerek szükségesek (pl. gáz-folyadék kroma ­
tográf [GLC], nagy teljesítmény ű folyadékkromatográf [HPLC], 
vékonyréteg-kromatográf [TLC] tömegspektrométer [MS], gázkromatográf/tömegspektrométer [GC-MS], folyadékkromatográf/ ­
tömegspektrométer [LC-MS], magmágneses rezonancia berendezés 
[NMR] stb.), a radioaktívan jelölt vagy nem jelölt anyagokhoz 
alkalmas detektorrendszerrel. Ha radioaktívan jelölt anyagot alkalma ­
zunk, akkor folyadékszcintillációs számlálóra és oxidáló éget őkam­
rára is szükség van (az üledékmintáknak a radioaktivitás-mérés el őtti 
elégetéséhez).
 
A fizikai, kémiai és biológiai mérésekhez (lásd az 1.8.2.2. szakasz 1. 
táblázatát) további szokványos laboratóriumi eszközök, illetve 
esetenként további üvegeszközök, vegyszerek és reagensek is szük ­
ségesek.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Mivel az ilyen lúgos elnyelet ő oldatok a szell őztetőlevegőben lévő, illetve az aerob 
kísérletekben a légzés nyomán képz ődő szén-dioxidot is megkötik, rendszeres id őközön­
ként cserélni kell őket, hogy meg lehessen el őzni a telít ődésüket és abszorpciós kapaci ­
tásuk ezzel járó csökkenését.
 1.8.2.  A vízi üledékminták kiválasztása és száma  
A mintavételi helyeket minden esetben a vizsgálat céljával össz ­
hangban kell kiválasztani. A mintavételi helyek kiválasztásakor figyelembe kell venni a korábbi mez őgazdasági, ipari vagy háztartási 
tevékenységek vízgy űjtőre és a felvizekre gyakorolt hatását is. Nem 
szabad olyan üledékeket alkalmazni, amelyek az el őző 4 évben a 
vizsgálandó anyaggal vagy szerkezeti analógjaival szennyez ődtek.
 
1.8.2.1.  Az üledék kiválasztása  
Az aerob vizsgálatokhoz általában kétféle üledéket kell alkalmazni 
(7), amelyeknek szerves széntartalom és szerkezet szempontjából 
el kell térniük egymástól. Az egyik üledéknek legyen magas 
(2,5–7,5 %) szervesszén-tartalma, és legyen finomszerkezet ű, a 
másiknak pedig legyen alacsony (0,5–2,5 %) a szervesszén-tartalma, és legyen durvaszerkezet ű. A szervesszén-tartalom különbségének 
általában legalább 2 %-nak kell lennie. A „finomszerkezet” 
> 50 % [agyag + iszap] (
 1 ) -tartalmat, a „durvaszerkezet” pedig 
< 50 % [agyag + iszap]-tartalmat jelent. A két üledék [agyag + iszap]-tartalma különbségének általában legalább 20 % 
kell lennie. Olyan esetekben, amikor a vegyi anyag sós vizekbe is 
eljuthat, legalább az egyik mintaként tengeri eredet ű víz-üledék rend ­
szert kell használni.
 
A szigorúan anaerob vizsgálatban a két üledéket (és kapcsolódó 
vizeiket) a felszíni víztestek anaerob zónáiból kell venni (7). Mind 
az üledék-, mind pedig a vízfázist óvatosan és az oxigén kizárása 
mellett kell kezelni és szállítani.  
Az üledékek kiválasztásakor más paraméterek is fontosak lehetnek, 
amelyeket minden esetben egyedileg kell fontolóra venni. Például az 
üledékek pH-tartománya is fontos lehet az olyan vegyi anyagok vizs ­
gálata szempontjából, amelyeknek átalakulása és/vagy szorpciója pH- függő. A szorpció pH-függését jellemezheti a vizsgálandó anyag 
pK
 a -értéke is.  
1.8.2.2.  A víz-üledék minták jellemzése  
A táblázat összefoglalja a víz és az üledék legfontosabb mérend ő 
és (az alkalmazott módszerre való hivatkozással együtt) rögzítend ő 
paramétereit, valamint azt, hogy ezeket a paramétereket a vizs ­
gálatok melyik fázisában kell meghatározni. Tájékoztatásul: alkalmas elemzési módszerek találhatók a (18), a (19), a (20) és a (21) hivatkozásban.
 
Esetenként még további paramétereket is mérni és jelenteni kell (pl. 
édesvizek esetében: lebeg őanyag, lúgosság, vízkeménység, vezet őké­
pesség, NO  3 /PO  4 [arány és egyedi értékek]; az üledékek esetében: 
kationcserél ő kapacitás, víztartó képesség, karbonáttartalom, összes 
nitrogén és foszfor; valamint tengeri rendszerekben a sótartalom). 
Különösen az anaerob átalakulás szempontjából hasznos lehet még a redoxkörülmények értékeléséhez a víz és az üledék nitrát-, szulfát-, biológiailag hozzáférhet ő vas- és esetleges egyéb elektronakceptor- 
tartalmának meghatározása is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) Az [agyag + iszap] az üledék < 50 m részecskeméret ű ásványi frakciója.
 A víz-üledék minták jellemzésére szolgáló paraméterek mérése (7) (22) (23).  
Paraméter A vizsgálati eljárás szakaszai 
minta­
gyűjtés mintake­
zelés után akklimati ­
záció 
kezdete vizsgálat 
kezdete vizsgálat 
közbülső 
szakaszai vizsgálat 
vége 
Víz 
Eredetforrás X Hőmérséklet x 
pH X X X X X 
TOC X X X 
O
 2 -koncentráció* X X X X X 
Redoxpotenciál* X X X X  
Üledék  
Eredetforrás X A réteg mélysége X 
pH x X X X X 
Szemcseméret-eloszlás X TOC X X X X Mikrobális biomassza (**) X X X Redoxpotenciál (*) érzék ­
szervi (szín/ 
szag) X X X X
 
(*) A legfrissebb kutatási erednények igazolták, hogy a víz oxigénkoncentrációjának és redoxpotenciáljának mérése nem 
rendelkezik sem mechanisztikus, sem prediktív értékkel a felszíni vizek mikrobapopulációinak növekedése és fejl ő­
dése szempontjából (24) (25). Az aerob biológiai átalakulási sebességek és útvonalak értelmezését és értékelését 
jobban segíti a biológiai oxigénigény (BOI. a mintavételkor, illetve a vizsgálat kezdetén és végén), a mikro- és 
makrotápanyagok. a Ca, az Mg és az Mn (a vizsgálat kezdetén és végén) vízben, illetve az összes N és az összes P (a 
mintavételkor és a vizsgálat végén) üledékben történ ő meghatározása. 
(**) Az aerob vizsgálatokhoz mikrobalégzési rátamódszer (26), gázzal történ ő fertőtlenítési módszer (27) vagy mikrosz ­
kópos számlálás (pl. baktériumok, sugárgombák, gombák és teljes kolóniák): az anaerob vizsgálatokhoz metánkép ­
ződési sebesség.  
1.8.3.  Mintavétel, kezelés és tárolás  
1.8.3.1.  Mintavétel  
Az üledékekb ől történő mintavételhez a fenéküledékek mintavéte ­
léről szóló ISO-útmutatótervezetet (8) kell használni. Az üledék 
teljes 5–10 cm-es fels ő rétegéből üledékmintákat kell venni. Az 
ehhez társított vizet ugyanarról a helyr ől kell venni, és ugyanabban 
az időben, mint az üledéket. Az anaerob vizsgálathoz az üledék és 
víz mintavételét, valamint szállítását oxigén kizárása mellett kell 
végezni (28) (lásd az 1.8.2.1. szakaszt). Egyes mintavev ő eszközöket 
a (8) és a (23) hivatkozás ismertet.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Kezelés  
Az üledéket 2 mm-es szitán végzett nedves sz űréssel választjuk el 
a víztől, nagy feleslegben alkalmazva azonos helyr ől származó, 
helyileg elvezetett vizet. Ezt követ ően inkubáló lombikban ismert 
mennyiség ű üledéket és vizet a kívánt arányban egymáshoz keve ­
rünk (lásd az 1.9.1. szakaszt), és el őkészítjük az akklimatizálódási 
periódusra (lásd az 1.8.4. szakaszt). Az anaerob vizsgálathoz a kezelés minden lépését oxigén kizárása mellett kell végezni (29) 
(30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Tárolás  
A frissen gy űjtött üledék és víz alkalmazása a legel őnyösebb, de ha 
tárolás szükséges, akkor az üledéket és a vizet a fentiek szerint le kell szűrni, majd sötétben, 4 ± 2
 o C-on (13), vízzel elárasztva (6- 
10 cm-es vízréteg) kell együtt tárolni őket, legfeljebb négy hétig (7) 
(8) (23). Az aerob vizsgálatokhoz alkalmazott mintákat szabad leve ­
gőbeáramlás mellett kell tárolni (pl. nyitott edényekben), az anaerob 
vizsgálatok esetében viszont oxigén kizárásával. Vigyázni kell arra, hogy a szállítás és tárolás során az üledék és a víz ne fagyjon ki, 
illetve az üledék ne száradjon ki.
 
1.8.4.  Az üledék/víz minták el őkészítése a vizsgálathoz  
A vizsgálandó anyag hozzáadása el őtt akklimatizációs id őszakot kell 
hagyni, amelyhez minden üledék/víz mintát a f ő vizsgálathoz hasz ­
nált inkubáló edénybe kell tenni, és az akklimatizáció idején pontosan ugyanazokat a körülményeket kell fenntartani, mint a f ő 
vizsgálatban (lásd az 1.9.1. szakaszt). Az akklimatizációs id őszak 
ahhoz szükséges, hogy a rendszer a pH, a víz oxigénkoncentrációja, 
az üledék és a víz redoxpotenciálja és a fázisok makroszkopikus elkülönülése tekintetében viszonylag stabillá váljon. Az akklimati ­
záció időtartama általában egy-két hét, de semmiképpen sem halad ­
hatja meg a négy hetet. Az ebben a szakaszban végzett mérések 
eredményeit is fel kell tüntetni a jelentésben.
 
1.9. A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE  
1.9.1.  Kísérleti körülmények  
A vizsgálatot az inkubálóberendezésben kell végezni (lásd az 1.8.1. 
szakaszt) úgy, hogy a víz és az üledék térfogatának aránya 3:1 és 4:1 között legyen, az üledék vastagsága pedig 2,5 cm (± 0,5 cm) (
 1 ). 
Javasolt az egyes inkubáló edényekbe minimum 50 g üledéket (szá ­
razsúly) tenni.  
A vizsgálatot sötétben, 10  o C és 30  o C közötti állandó h őmérsékleten 
kell végezni. A legmegfelel őbb a (20 ± 2)  o C. Egyes esetekben, a 
vizsgálattól várt információk függvényében fontolóra lehet venni, 
hogy a méréseket más, alacsonyabb h őmérsékleten (pl. 10  o C-on) 
is elvégezzék. Az inkubálási h őmérsékletet folyamatosan ellen őrizni 
kell, és a jelentésben is fel kell tüntetni.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) A legutóbbi kutatások szerint a 4  o C-on való tárolás az üledék szervesszén-tartalmának 
csökkenését okozhatja, ami esetleg a mikrobiális aktivitás csökkenéséhet vezethet (34).
 1.9.2.  A vizsgálandó anyag kezelése és alkalmazása  
A vizsgálathoz egyféle koncentrációban kell használni a vegyi 
anyagot (  1 ). A közvetlenül a vizekbe jutott növényvéd ő szerek 
esetében a címkén lév ő maximális adagolást kell a vizsgálati 
edényben lév ő víz felszíne alapján kiszámolt maximális alkalma ­
zási rátának venni. Minden más esetben a környezeti kibocsátá ­
sokon alapuló el őrejelzések alapján kell kiválasztani az alkalma ­
zandó koncentrációt. Ügyelni kell arra, hogy a vizsgálandó anyagot 
olyan koncentrációban alkalmazzuk, amely lehet ővé teszi az átala ­
kulási útvonal jellemzését, valamint az átalakulási termékek képz ő­
désének és fogyásának mérését. Olyan esetekben, amikor a vizs ­
gálandó anyag koncentrációja a vizsgálat kezdetén közel van a 
kimutatási határhoz és/vagy a vizsgálandó anyag alkalmazási rátá ­
jának 10 %-át kitev ő mennyiségben jelen lév ő fő átalakulási 
termékeket nem lehet könnyen kimutatni, akkor magasabb (pl. 
tízszeres) dózisok alkalmazására lehet szükség. Ha azonban maga ­
sabb tesztkoncentrációkat alkalmazunk, ellen őrizni kell, hogy nem 
gyakorolnak-e jelent ős káros hatásokat a víz-üledék rendszer 
mikrobális aktivitására. Ahhoz, hogy a vizsgálandó anyag állandó 
koncentrációban legyen jelen a különféle méret ű edényekben, indo ­
koltnak tűnhet az alkalmazott anyagmennyiség megfelel ő beállítása 
az alapján, hogy hogyan aránylik egymáshoz az edénybeli és a terepi vízoszlopmélység (amely utóbbit 100 cm-nek feltételezzük, 
de ettől eltérő mélységek is alkalmazhatók). Ilyen számításra lásd a 
4. függelékben található példa.
 
A vizsgálandó anyagot ideálisan vizes oldat formájában kell a vizs ­
gálati rendszer vízfázisába juttatni. Ha elkerülhetetlen, akkor a vizs ­
gálandó anyag bejuttatására és eloszlatására a vizsgálati rendszerben 
kis mennyiségben felhasználhatunk vízzel elegyed ő oldószereket is 
(például acetont, etanolt), de az oldószerek mennyisége nem halad ­
hatja meg az 1 térfogatszázalékot, és nem lehetnek káros hatásaik a vizsgálati rendszer mikrobális aktivitására. A vizsgálandó anyag 
vizes oldatának el őállításakor is gondosan kell eljárni, és a teljes 
homogenitás érdekében oldatkészít ő oszlopot vagy el őkeverést is 
lehet alkalmazni. Érdemes a vizes fázist óvatosan megkeverni, miután a vizes oldatot a rendszerbe juttattuk, vigyázva arra, hogy 
az üledéket a lehet ő legkevésbé keverjük fel.
 
Formulázott termékek alkalmazása általában nem ajánlott, mivel a 
készítmény összetev ői befolyásolhatják a vizsgálandó anyag és/vagy 
az átalakulási termékek megoszlását a víz- és az üledékfázis között. A vízben rosszul oldódó vizsgálandó anyagok esetében azonban 
megfelelő alternatíva lehet a formulázott anyag alkalmazása.
 
Az inkubáló edények száma a mintavétel gyakoriságától függ (lásd 
az 1.9.3. szakaszt). Megfelel ő számú vizsgálati rendszert kell alkal ­
mazni ahhoz, hogy minden mintavételhez két-két rendszert tudjunk felhasználni. Ha minden egyes vízi üledékrendszerhez van kontroll ­
egység, ezeket nem szabad a vizsgálandó anyaggal kezelni. A kont ­
rollegységeket arra használhatjuk, hogy a vizsgálat végén meghatá ­
rozzuk az üledék mikrobás biomasszáját, illetve a víz és az üledék teljes szervesszén-tartalmát. A kontrollegységek közül kett őt 
(mindkét víziüledék-mintához egyet-egyet) arra használhatunk fel, 
hogy az akklimatizációs id őszakban nyomon kövessük az üledékben 
és a vízben a megfelel ő paramétereket (lásd az 1.8.2.2. szakasz 
táblázatát). Ha a vizsgálandó anyagot oldószerrel juttatjuk be a rend ­
szerbe, akkor még további két kontrollegységre van szükség, hogy 
mérni tudjuk az oldószernek a vizsgálati rendszer mikrobális aktivi ­
tására gyakorolt káros hatásait is.
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Ha az alacsonyabb koncentrációkat kell ő pontossággal lehet mérni, hasznos lehet a vizs ­
gálat elvégzése egy másik koncentrációértékkel is az olyan vegyi anyagok esetén, 
amelyek többféle útvonalon is bejuthatnak a felszíni vizekbe, ezért szignifikánsan eltér ő 
koncentrációban jelenhetnek meg.
 1.9.3.  A vizsgálat id őtartama és a mintavétel  
A kísérlet id őtartama általában nem lehet több 100 napnál (6). Akkor 
fejezhető be, amikor elegend ő eredmény van a bomlási útvonal és a 
víz/üledék megoszlás lefutásának megállapítására, vagy amikor a 
vizsgálandó anyag 90 %-a az átalakulás és/vagy az elpárolgás 
miatt elfogy a rendszerb ől. A vizsgálat kezdetét is beleszámítva 
legalább hat alkalommal kell mintákat venni, ez kiegészíthet ő a 
megfelelő mintavételi rend és vizsgálati id őtartam meghatározására 
szolgáló, opcionális el őzetes vizsgálattal (lásd az 1.9.4. szakaszt), ha 
korábbi vizsgálatok alapján nem áll rendelkezésre elegend ő adat a 
vizsgálandó anyagról. Hidrofób anyagok esetében a vizsgálat kezdeti 
szakaszában esetleg további mintavételi id őpontok beiktatására is 
szükség lehet a víz- és üledékfázis közötti megoszlási hányados meghatározásához.
 
A megfelel ő mintavételi id őpontokban komplett inkubálóedényeket 
veszünk ki a vizsgálatokhoz (mindig kett őt a párhuzamos mérések ­
hez). Az üledéket és felette lév ő vizet külön-külön analizáljuk (  1 ). A 
felszíni vizet óvatosan kell eltávolítani, vigyázva arra, hogy eközben 
ne keverjük fel az üledéket. A vizsgálandó anyag és az átalakulási termékek kivonását és jellemzését megfelel ő analitikai eljárásokkal 
kell elvégezni. Gondoskodni kell arról, hogy eltávolítsuk az esetle ­
gesen az inkubáló edény falán vagy az illékony anyagok befogására 
használt elnyelet ők összeköt ő vezetékein megtapadt anyagokat is.
 
1.9.4.  Opcionális el őzetes vizsgálat  
Ha a vizsgálat id őtartamát és a mintavételi rendet nem lehet 
meghatározni a vizsgálandó anyaggal kapcsolatos más vizsgálatok 
eredményei alapján, célszer ű lehet opcionális el őzetes vizsgálatot 
végezni a végleges vizsgálathoz javasolttal egyez ő körülmények 
között. A jelentésben a megfelel ő kísérleti körülményeket és az 
előzetes vizsgálatok eredményeit is össze kell foglalni.  
1.9.5.  Mérések és elemzések  
Minden egyes mintavételi id őpontban meg kell határozni, és fel kell 
jegyezni a vizsgálandó anyag és az átalakulási termékek koncentrá ­
cióját mind a vízben, mind az üledékben (abszolút koncentráció és az alkalmazott mennyiséghez viszonyított százalékos arány). Általában minden olyan átalakulási terméket azonosítani kell, amely bármelyik 
mintavételi id őpontban a teljes víz-üledék rendszerben alkalmazott 
radioaktivitás > 10 %-át reprezentáló mennyiségben detektálható, kivéve, ha ennek elhagyása megfelel ően megindokolható. Meg kell 
fontolni a fenti küszöbérték alatt maradó, de vizsgálat során folya ­
matosan növekv ő mennyiség ű átalakulási termékek azonosítását is, 
mert ezeknél tartós fennmaradásra utalhatnak az eredmények. Az esetleges perzisztencát mindig egyedileg kell értékelni és a jelen ­
tésben megfelel ően indokolni.
 
A gáz/illékony komponens elnyelet ő rendszerben mért eredményeket 
(CO  2 és egyéb anyagok, pl. illékony szerves vegyületek) is minden 
mintavételi id őpontra fel kell tüntetni a jelentésben. Szerepeltetni kell 
a mineralizációs rátákat. Meg kell adni az üledékben lév ő nem 
extrahálható (kötött) maradványokat is minden mintavételi pontra.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Azokban az esetekben, ha az anaerob átalakulási termékek könnyen és gyorsan újraoxi ­
dálódhatnak, az anaerob körülményeket a mintavétel id őtartama alatt is fenn kell tartani.
 2. ADATOK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
Mindegyik mintavételre ki kell számítani a hozzáadott radioaktivitás 
teljes mérlegét vagy kinyerési fokát (lásd az 1.7.1. szakaszt). Az 
eredményeket a hozzáadott radioaktivitás százalékában kell kifejezni. 
A radioaktivitásnak a víz és az üledék közötti megoszlását koncent ­
rációértékként és százalékos arányként is meg kell adni minden mintavételi id őpontban.
 
Ki kell számolni a vizsgálandó anyag felezési idejét, DT  50 -értékét, 
valamint adott esetben DT  75 - és DT  90 -értékét is a konfidenciahatá ­
rokkal együtt (lásd az 1.7.3. szakaszt). Információt lehet kapni a vizsgálandó anyag vízre és üledékre vonatkoztatott kiürülési sebes ­
ségéről is a megfelel ő kiértékel ő módszerek segítségével. Ilyen 
módszerek például a pszeudo-els őrendű kinetikák alkalmazása, a 
grafikus vagy numerikus megoldásokat alkalmazó empirikus görbe ­
illesztési technikák, illetve a még komplexebb eljárások, amelyek 
például egy- vagy több-kompartmentumos modelleket alkalmaznak. 
Ezzel kapcsolatos további részletek a szakirodalomban találhatók (35) (36) (37).
 
Minden megközelítésnek megvannak a maga el őnyei és hátrányai és 
komplexitásuk tekintetében is igen sokfélék lehetnek. Az els őrendű 
kinetika feltételezése a bomlási és megoszlási folyamatok túlzott leegyszer űsítését jelentheti, de amikor lehetséges, könnyen érthet ő 
és mind a szimulációs modellek, mind a becsült környezeti koncent ­
rációk számítása szempontjából értékes eredményt (sebességi állandó 
vagy felezési id ő) szolgáltat. Az empirikus módszerek vagy a lineáris 
transzformációk jobb görbeillesztést eredményezhetnek, így ponto ­
sabban lehet becsülni a felezési id őket, a DT
 50 -értékeket, valamint 
adott esetben a DT  75 - és a DT  90 -értékeket is. A kapott állandók 
alkalmazhatósága azonban korlátozott. A kompartmentumos (környe ­
zeti elemeket alkalmazó) modellekkel egy sor hasznos állandót kaphatunk, amelyek a kockázatfelmérések szempontjából értékesek, 
mivel leírják a vegyi anyag különböz ő környezeti elemekben 
végbemen ő degradációját és megoszlási arányait is, továbbá felhasz ­
nálhatók a f ő átalakulási termékek képz ődéséhez és lebomlásához 
tartozó sebességi állandók becslésére is. A módszer kiválasztását 
minden esetben megfelel ően indokolni kell, és a kísérletez őnek grafi­
kusan és/vagy statisztikailag igazolnia kell az illesztés jóságát.
 
3. JELENTÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JELENTÉS  
A vizsgálati jelentésnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgálandó anyag:  
— hétköznapi név, kémiai elnevezés, CAS-szám, szerkezeti képlet 
(radioaktívan jelölt anyagok alkalmazása esetén a jelölés(ek) elhelyezkedése) és a lényeges fizikai-kémiai tulajdonságok (lásd az 1.5. szakaszt),
 
— a vizsgálandó anyag tisztasága (szennyezései),  
— a jelölt vegyi anyagok radiokémiai tisztasága és moláris aktivi ­
tása (adott esetben).  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referenciaanyagok:  
— az átalakulási termék jellemzésére és/vagy azonosítására alkalma ­
zott referenciaanyagok kémiai elnevezése és szerkezete.  
A vizsgálathoz használt üledékek és vizek:  
— a vízi üledékminták vételének mintavételi helye(i) és ez(ek) 
ismertetése, ezen belül lehet őleg a korábbi szennyezések törté ­
nete,  
— a víz-üledék rendszerek gy űjtésével, esetleges tárolásával és 
akklimatizációjával kapcsolatos összes információ,  
— a víz-üledék minták tulajdonságai, az 1.8.2.2. szakasz tábláza ­
tában foglaltak szerint.  
Kísérleti körülmények:  
— az alkalmazott vizsgálati rendszerek (pl. átfolyásos, biométer, a 
szellőzés módja, a keverési módszer, a víz térfogata, a víz- és az 
üledékréteg vastagsága, a tesztedény méretei stb.),  
— a vizsgálandó anyag bejuttatása a vizsgálati rendszerbe: a vizs ­
gálatban alkalmazott koncentrációk, a párhuzamos és kontroll ­
mérések száma, a vizsgálandó anyag alkalmazásának módja (pl. 
oldószer használata) stb.,  
— inkubálási h őmérséklet,  
— a mintavételek id őpontjai,  
— extrakciós módszerek és hatékonyságuk, valamint az analitikai 
módszerek és kimutatási határok,  
— az átalakulási termékek jellemzésére/azonosítására alkalmazott 
módszerek,  
— a kísérleti protokolltól vagy vizsgálati feltételekt ől való eltérések 
a vizsgálat folyamán.  
Eredmények:  
— reprezentatív elemzések nyers adatai (minden nyers adatot a 
GLP-archívumban kell tárolni),  
— az alkalmazott analitikai módszerek ismételhet ősége és érzé ­
kenysége,  
— kinyerési fokok (az érvényes vizsgálat százalékértékeit az 1.7.1. 
szakasz adja meg),  
— az alkalmazott kiindulási dózis százalékában és mg.kg  -1 
egységekben kifejezett, az üledékre, vízre és teljes rendszerre 
vonatkoztatott (utóbbira csak százalékos) eredmények táblázatos 
összefoglalása a vizsgálandó anyagra, valamint adott esetben az 
átalakulási termékekre és a nem extrahálható radioaktivitásra is,  
— anyagmérleg a vizsgálatok közben és végén,  
— a vízfrakcióban, az üledékfrakcióban és a teljes rendszerben 
végbemen ő átalakulás (ezen belül mineralizáció) grafikus 
megjelenítése,  
— mineralizációs sebességek,  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— felezési id ő, DT  50 (esetenként DT  75 és DT  90 is) a vizsgálandó 
anyagra és adott esetben annak f ő átalakulási termékeire az 
üledékben, vízben és a teljes rendszerben, a konfidenciahatárok feltüntetésével,
 
— a vizsgálandó anyag és adott esetben f ő átalakulási termékeinek 
átalakulási kinetikájának becslése,  
— adott esetben az átalakítás feltételezett útvonalai,  
— az eredmények diszkussziója.  
4. SZAKIRODALOM  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for 
registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section 
G.2.1 (a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides 
in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.
 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SET AC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Bioche ­
mistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 
16,631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollu ­
tion Control Federation, Washington D.C.  
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines 
for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine 
environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biot ­
ransformation in surface waters: multivariate analyses of envi ­
ronmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.  
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G, van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
 
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation- extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening 
of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 
1527-1550.  
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for 
assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds 
under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffici ­
ents of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxi ­
col. 58, 961-968.  
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz –Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47-60.  
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and 
Diseases, pp 1349-1354.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
1. függelék  
ÚTMUTATÓ AZ AEROB ÉS ANAEROB VIZSGÁLATI RENDSZE ­
REKHEZ  
Aerob vizsgálati rendszer  
Az ebben a módszerben ismertetett aerob vizsgálati rendszer egy aerob vízré ­
tegból (a tipikus oxigénkoncentráció 7 és 10 mg.l  -1 közötti) és egy üledékrétegb ől 
áll, amelynek felszíni része aerob, felszín alatti része pedig anaerob (az üledék anaerob zónájában a tipikus átlagos redoxpotenciál) 80 és –190 mV között változik). A víz felszíne felett nedvesített leveg őt vezetnek át minden inkubációs 
egységen, hogy kell ő oxigénszintet tartsanak a gáztétben.
 
Anaerob vizsgálati rendszer  
Az anaerob vizsgálati rendszernél a vizsgálati eljárás lényegében megegyezik az 
anaerob rendszernél vázolttal, azzal a különbséggel, hogy itt minden inkubációs 
egységen nedvesített nitrogént vezetnek át a víz felszíne felett, hogy nitro 
géngázteret tartsanak fenn. Ha a redoxpotenciál (E  h ) - 100 mV-nál alacsonyabb, 
akkor az üledék és a víz is anaerobnak tekinthet ő. 
Az anaerob vizsgálatban, a mineralizació vizsgálata magában foglalja a képz ődött 
szén-dioxid és metán mérését is.  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
2. függelék  
PÉLDA EGY GÁZÁTVEZETÉSES KÉSZÜLÉKRE
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
3. függelék  
PÉLDA EGY BIOMÉTER-KÉSZÜLÉKRE
  ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
4. függelék  
MINTASZÁMÍTÁS A TESZTEDÉNYBEN ALKALMAZANDÓ 
DÓZISHOZ  
A henger bels ő átmérője: = 8 cm 
Vízoszlopmélység az üledék nélkül: = 12 cm Vízfelszín nagysága: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Alkalmazási arány: 500 g vizsgálandó anyag/ha 
5 μg/cm  2 -nek felel meg 
Teljes μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
A mennyiség korrigálása a 100 cm-es mély ­
ségre: 
12 × 251,5 + 100 = 30,18 μg 
A vízoszlop térfogata: 50,3 × 12 = 603 ml Koncentráció a vízben: 30,18 × 603 = 0,050 μg/ml vagy 50 μg/l
 ▼B 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROB MINERALIZÁCIÓ FELSZÍNI VIZEKBEN 
– VIZSGÁLAT A BIOLÓGIAI LEBONTÁS SZIMULÁLÁSÁRA  
1. MÓDSZER  
Ez a módszer megegyezik az OECD TG 309 (2004) (1) jel ű 
módszerrel.  
1.1. BEVEZETÉS  
A vizsgálat célja az aerob természetes vízben, kis koncentrációban 
jelenlévő vizsgálati anyag biológiai lebontása id őtartamának 
meghatározása, és a megfigyelések reakciókinetikai kifejezések 
szerinti számszer űsítése. Maga a szimuláció egy laboratóriumi, 
rázó-lombikos egymenetes vizsgálat, amelynek a segítségével termé ­
szetes felszíni vizek (édes-, brakk- vagy tengervíz) mintáiban jelen 
lévő szerves anyagok aerob biológiai lebontásának sebessége 
megadható. A módszer alapja az ISO/DIS 14592–1 (2), de magában hordozza a C.23 és a C.24 (3)(4) módszerek egyes elemeit is. Lehe ­
tőség van arra, hogy hosszú vizsgálati id ő esetén az egymenetes 
működtetést félfolyamatos m űködtetésre változtassuk a vizsgálati 
mikrokozmosz romlásának megel őzése céljából. A szimulációs vizs ­
gálat alapvet ő célja a felszíni vízben jelen lév ő vizsgálni kívánt 
anyag mineralizációjának meghatározása, ahol a mineralizáció a 
lebontás kinetikája kifejézésének az alapját képezi. Emellett azonban 
a vizsgálat másodlagos célja, hogy információt szolgáltasson az elsődleges lebontásról és a keletkez ő fő transzformációs termékekr ől. 
Ez utóbbiak azonosítása, és amennyiben lehetséges, koncentrációjuk 
számszerűsítése a nagyon lassan mineralizálódó anyagok (pl. ha a 
teljes maradvány
 14 C izotóp felezési ideje meghaladja a 60 napot) 
esetében különösen fontos. Az analitikai megkötésekb ől következ ően 
a fő transzformációs termék azonosításához és mennyiségi meghatá ­
rozásához a vizsgálati anyagot jellemz ően magasabb koncentrációban 
(pl. > 100 μg/l) kell alkalmazni.  
Ebben a vizsgálatban alacsony koncentráció alatt olyan koncentráció ­
értéket értünk (pl. kisebb mint 1–100 μg/l), amely elég alacsony 
ahhoz, hogy biztosítsa azt, hogy a vizsgálatban kapott biológiai lebontási kinetika jól tükrözze a környezetben várható kinetikát. A vizsgálathoz használt természetes vízben található biológiailag 
lebontható szén szubsztrátok teljes mennyiségéhez képest a vizsgálati 
anyag csak kis koncentrációban van jelen, és csak másodlagos szubsztrátként fog szolgálni. Ez maga után vonja, hogy a várható biológiai lebontási kinetika els őrendű (nem-növekedési kinetika), és 
hogy a vizsgálati anyag lebontása kometabolizmussal történhet. A 
kinetika els őrendűségéből következik, hogy a lebontás sebessége 
(mg/l/nap) arányos a szubsztrát koncentrációjával, amelynek értéke az időben folyamatosan csökken. A valódi els őrendű kinetikában a 
specifikus lebontási sebességi állandó, a k, független az id őtől és a 
koncentrációtól. Vagyis k értéke nem változik jelent ősen egy kísérlet 
során, és a különböz ő kísérletekben éppen alkalmazott vizsgálati 
anyag koncentrációjának hatására sem. Lényegében a specifikus 
lebontási sebességi állandó értéke megegyezik a koncentráció 
időegységenkénti relatív változásával: k = (1/C) • (dC/dt). Bár 
rendesen az el őírt kritériumok teljesülése mellett az els őrendű kine­
tika várható, lehetnek bizonyos körülmények, amelyek között más 
kinetikák megfelel őbbek. Az els őrendű kinetikától való eltérést 
tapasztalhatunk, ha tömegátviteli jelenség, például a diffúziósebesség határozza meg a biotranszformáció sebességét, és nem a biológiai reakció sebessége. Ezek az adatok azonban majdnem mindig leírha ­
tóak pszeudo-els őrendű kinetikával, ha bevezetünk egy koncentráció- 
függő sebességi állandót is.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
A kísérletek megtervezését és a kapott eredmények értelmezését 
megkönnyíti, ha a vizsgálat megkezdése el őtt megfelel ő informá­
ciók (pl. szabványos sz űrővizsgálatokból) állnak rendelkezésre a 
nagy koncentrációjú vizsgálati anyag biológiai lebonthatóságáról, valamint abiotikus lebontásáról, a transzformációs termékekr ől és 
vonatkozó fizikokémiai tulajdonságaikról. A teljes biológiai 
lebontás mértékének meghatározását a
 14 C-jelölt vizsgálati anyag 
alkalmazása, és annak a vizsgálat végén kapott fázismegoszlása teszi lehet ővé. Jelöletlen vizsgálati anyag alkalmazása esetén a 
teljes biológiai lebontás mértékének megállapítása csak akkor lehet ­
séges, ha a vizsgálati anyag koncentrációja magas és a f ő transz­
formációs termékek ismertek.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Elsődleges biológiai lebontás : Egy kémiai anyagban a mikroorga ­
nizmusok által létrehozott szerkezeti változás (transzformáció), amely a kémiai azonosság elvesztésével jár.
 
Funkcionális biológiai lebontás : Egy kémiai anyagban a mikroor ­
ganizmusok által létrehozott szerkezeti változás (transzformáció), 
amely a kiindulási anyag egy specifikus tulajdonságának elveszté ­
sével jár.  
Teljes aerob biológiai lebontás : Egy kémiai anyag oxigén jelenlé ­
tében történ ő, mikroorganizmusok általi lebontása szén-dioxiddá, 
vízzé és a jelen lév ő bármely más elem ásványi sóivá (mineralizá ­
ció), valamint új biomassza és szerves mikrobiális bioszintézis- 
termékek létrehozása.  
Mineralizáció : Egy vegyi vagy szerves anyag oxigén jelenlétében 
történő, mikroorganizmusok általi lebontása szén-dioxiddá, vízzé és a 
jelen lévő bármely más elem ásványi sóivá.  
Lappangási fázis : A vizsgálat kezdetét ől addig eltelt id ő, amíg a 
lebontást végz ő mikrobák adaptációja megtörténik, és a vegyi anyag 
vagy a szerves anyag biológiai lebontásának mértéke a detektálható 
szint fölé emelkedik (pl. a legmagasabb elméleti biológiai lebontás 10 %-a, vagy ennél kisebb érték a mérési módszer pontosságától függően)
 
A legmagasabb biológiai lebontási szint : A vizsgált vegyi vagy 
szerves anyag biológiai lebontásának mértéke százalékban, amely 
felett további biológiai lebontás a vizsgálat folyamán már nem történik.
 
Elsődleges szubsztrát : A természetes szén- és energiaforrások 
összessége, amely a mikrobiális biomassza növekedésére és fenntar ­
tására fordítódik.  
Másodlagos szubsztrát : Egy olyan, kis koncentrációban jelen lév ő 
szubsztrátkomponens, amelynek a lebontása csak elhanyagolhatóan 
kis szén- és energiaforrást jelent az érintett mikroorganizmus számára, a f ő komponensek (els ődleges szubsztrát) lebontásával szol ­
gáltatott szén- és energiaforráshoz viszonyítva.
 
Lebontási sebességi állandó : Egy els őrendű, vagy pszeudo-els ő­
rendű kinetikus sebességi állandó, k (nap  –1 ), ami a lebontási folya ­
matok sebességét jelzi. Egymenetes kísérletben k a lappangási fázis 
vége után nyert lebontási görbe kezdeti szakaszából következtethet ő. ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Felezési id ő, t 1/2 (nap) : Az elsőrendű reakció sebességének leírására 
használt kifejezés. A koncentráció felére csökkenéséhez szükséges 
időintervallum. A felezési id ő és a lebontási sebességi állandó a 
t 1/2 = ln2/k egyenlet szerint aránylik egymáshoz.  
Lebontásos felezési id ő, DT  50 (nap) : A biológiai lebontási vizsgálat 
eredményének számszer űsítésére használt kifejezés. Az a lappangási 
fázist is tartalmazó id őintervallum, amely az 50 %-os biológiai 
lebontási érték eléréséhez szükséges.  
Mennyiségi meghatározás határa (LOD) és a mérhet őségi határ 
(LOQ) : A mennyiségi meghatározás határa (LOD) az adott anyagnak 
az a koncentrációja, amely alatt az anyag egyértelm ű azonosításához 
szükséges jel nem különböztethet ő meg az analitika háttérzajától. A 
mérhetőségi határ (LOQ) az adott anyagnak az a koncentrációja, 
amely alatt a koncentráció nem határozható meg elfogadható pontos ­
sággal.  
Oldott szerves széntartalom (DOC) : A vízminta szerves széntartal ­
mának az a része, amely nem távolítható el meghatározott fázis szétválasztással (pl. 15 percig tartó 40 000 ms
 –2 -es centrifugálással 
vagy 0,2 – 0,45 μm pórusátmér őjű membránon keresztül történ ő 
szűréssel).  
Teljes szerves  14 C aktivitás (TOA) : A szerves széntartalomhoz 
tartozó teljes  14 C aktivitás.  
Oldott szerves  14 C aktivitás (DOA) : Az oldott szerves széntarta ­
lomhoz tartozó teljes  14 C aktivitás.  
Szemcsés szerves  14 C aktivitás (POA) : A szemcsés szerves szén ­
tartalomhoz tartozó teljes  14 C aktivitás.  
1.3. A VIZSGÁLAT ALKALMAZHATÓSÁGA  
Ez a szimulációs vizsgálat kis koncentrációban alkalmazott nem illé ­
kony, vagy kis mértékben illékony szerves anyagok vizsgálatára alkalmas. A légkör felé nyitott (pl. vattadugóval lezárt) lombikok alkalmazása mellett a gyakorlatban az 1 Pa•m
 3 /mol-nál (kb. 10  –5 
atm•m  3 /mol) kisebb Henry-állandójú anyagok tekinthet ők nem illé ­
konynak. A g őztérrel rendelkez ő zárt lombikok esetében a kis 
mértékben illékony anyagok (Henry-állandójuk < 100 Pa•m  3 /mol 
vagy < 10  –3 atm•m  3 /mol) is vizsgálhatóak anélkül, hogy anyagvesz ­
teség lépne fel. A megfelel ő óvintézkedések elhagyása esetén a  14 C- 
jelölt anyag elvesztése léphet fel, amikor a CO  2 eltávozik a rend ­
szerből. Ilyen esetekben szükséges lehet a CO  2 visszatartása egy 
belső lúg abszorbenssel, vagy egy küls ő abszorbens rendszerrel 
(direkt  14 CO 2 meghatározás; lásd 3. melléklet). A biológiai lebontási 
kinetika meghatározásához a vizsgálati anyag koncentrációjának kisebbnek kell lennie a vízben való oldhatósági határánál. Meg kell jegyezni azonban, hogy a vízben való oldhatóság szakirodalmi 
értékei jelent ősen magasabbak lehetnek, mint a vizsgálati anyag 
természetes vízben való oldhatósága. Lehet őség van arra is, hogy a 
vízben különösen gyengén oldódó vizsgálati anyagok oldhatóságát megállapítsuk a vizsgált természetes vizek alkalmazásával.
 
A biológiai lebontást szimuláló módszer használható mind durva 
részecskékt ől mentes víz („nyílt vízi vizsgálat”), mind pedig olyan 
zavaros felszíni vizek esetében, amelyek pl. a víz/üledék határfelü ­
lethez közel fordulhatnak el ő („lebegő-üledék vizsgálat”).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. A VIZSGÁLAT ALAPELVE  
A vizsgálatot egy adagban hajtják végre, vagy csak felszíni vízben 
inkubálva a vizsgálati anyagot („nyílt vízi vizsgálat”), vagy 0,01–1 g/l száraztömeg ű lebegő szilárd anyaggal/üledékkel kiegészített 
felszíni vízben inkubálva a vizsgálati anyagot (lebeg ő üledék vizs ­
gálat). Ez utóbbi módszer szimulálja a lebeg ő szilárd anyagot vagy 
felkavart üledéket tartalmazó víztestet. A lebeg ő szilárd anyag/üledék 
ilyen koncentráció-intervallumának alsó tartománya jellemz ő a 
legtöbb felszíni vízre. A vizsgálati lombikok inkubálása aerob körül ­
mények között, rázatva, környezeti h őmérsékleten, sötétben történik. 
A lebontásos kinetika meghatározásához legalább két különböz ő 
vizsgálatianyag-koncentráció alkalmazása szükséges. A koncentráci ­
óknak ötös-tizes szorzófaktorral kell eltérniük egymástól, és a környezetben várható koncentrációtartományt kell mutatniuk. A vizs ­
gálati anyag maximális koncentrációja nem lépheti túl a 100 μg/l–t, 
de 10 μg/l alatti, vagy még kisebb tesztkoncentrációkat részesítenek 
előnyben annak biztosításához, hogy a biológiai lebontás valóban 
elsőrendű kinetikát kövessen. A minimális koncentráció nem lehet 
több 10 μg/l-nél, de az 1–2 μg/l, vagy az 1 μg/l-nél kisebb a lege ­
lőnyösebb. Normál esetben az ilyen alacsony koncentrációk 
megfelelő analízise a kereskedelmi forgalomból beszerezhet ő
 14 C- 
jelzett anyagokkal elvégezhet ő. Az analitikai módszer korlátjai 
miatt gyakran lehetetlen a vizsgálati anyag koncentrációjának kívánt 
pontosságú mérése abban az esetben, ha a vizsgálati anyag bemérési 
koncentrációja ≤ 100 μg/l (lásd az 1.7.2. pont második bekezdését). 
A fő transzformációs termék azonosításához és mennyiségi meghatá ­
rozásához, illetve ha nem áll rendelkezésre alacsony mennyiségi 
meghatározási határral bíró specifikus analitikai módszer, a vizsgálati 
anyag magas koncentrációban is alkalmazható (> 100 μg/l és néha > 
1 mg/l). Ilyen esetekben a kapott eredmények nem használhatóak az elsőrendű lebontási sebességi állandó és a felezési id ő számításához, 
hiszen a lebontás valószín űleg nem els őrendű kinetikát követ.
 
A lebontás nyomon követése megfelel ő időpontokban mért maradó  
14 C koncentráció mérésével, vagy specifikus kémiai vizsgálat hasz ­
nálata esetén a vizsgálati anyag maradvány koncentrációjának méré ­
sével történik. A molekula legstabilabb részének  14 C-jelölése bizto ­
sítja a teljes mineralizáció értékének meghatározását, míg a molekula kevésbé stabil részének jelölése, valamint a specifikus vizsgálat hasz ­
nálata teszi lehet ővé az els ődleges biológiai lebontás mértékének 
becslését. Mindamellett a legstabilabb rész nem feltétlenül foglalja 
magában a molekula vonatkozó funkciós csoportját (ami egy speci ­
ális tulajdonsággal, pl. toxicitással, bioakkumulációval stb. lehet kapcsolatos). Ebben az esetben célszer ű lehet olyan vizsgálati 
anyag alkalmazása, amely a funkcionális részen
 14 C-jelölt, hogy az 
adott tulajdonság megsz űnése követhet ővé váljon.  
1.5. INFORMÁECIÓK A VIZSGÁLATI ANYAGRÓL  
Radioaktívan jelölt és nem jelölt anyagok egyaránt használhatóak a 
vizsgálat során. Ajánlott a  14 C-jelöléses technika. A jelölésnek 
normál esetben a molekula legstabilabb részét kell érintenie (lásd 
az 1.4. szakaszt is). Egynél több aromás gy űrűt tartalmazó anyagok 
esetében célszer ű minden gy űrű egy vagy több szénatomjának  14 C- 
jelölése. Emellett javasolt a kapcsolódó, könnyen lebontható csoportok mindkét oldalán egy vagy több szénatom jelölése is. A 
vizsgálati anyag kémiai és/vagy radiokémiai tisztaságának > 95 %- 
nak kell lennie. Radioaktívan jelölt anyagok esetében javasolt a kb. 50 μCi/mg (1,85 MBq), vagy még nagyobb specifikus aktivitás, ami 
megkönnyíti a
 14 C mérést a kis kezdeti koncentrációjú vizsgálatok ­
ban. A vizsgálati anyagokról az alábbi információkkal kell rendel ­
kezni:  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— vízben való oldhatóság [A.6. módszer],  
— szerves oldószer(ek)ben való oldhatóság (oldószerrel együtt 
alkalmazott, vagy vízben rosszul oldódó anyagok),  
— disszociációs állandó (pKa), amennyiben az anyag hajlamos a 
protonálódásra, illetve deprotonálódásra [OECD TG 112] (5),  
— gőznyomás [A.4 módszer] és Henry-állandó,  
— kémiai stabilitás vízben és sötétben (hidrolízis) [C.7. módszer].  
Amennyiben vízben rosszul oldódó anyagot vizsgálunk tengervízben, 
hasznos tudni a kisózási állandót (vagy „Setschenow-állandót”) K  s , 
amely a log (S/S’) = K  s C m egyenletb ől fejezhet ő ki, ahol S és S’ az 
anyag oldhatósága édes-, illetve tengervízben és C  m a moláris sókon ­
centráció értéke.  
Ha a vizsgálatokat „lebeg ő üledék vizsgálatként” végezzük el, az 
alábbi információkkal kell rendelkezni:  
— n-oktanol/víz megoszlási együttható [A.8. módszer],  
— adszorpciós együttható [C.18. módszer].  
További fontos adatok lehetnek:  
— a vizsgálati anyag környezeti koncentrációja, ha ez ismert, vagy 
becsült,  
— a vizsgálati anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxicitása 
[C.11. módszer],  
— gyors és/vagy inherens lebonthatóságáról [C.4 A–F, C.12, C.9, 
OECD TG 302 (5) módszerek],  
— aerob vagy anaerob lebonthatóság a talaj és üledék/víz transz ­
formációs kísérletekben [C.23., C.24. módszer].  
1.6. REFERENCIAANYAG  
Referenciaanyagként célszer ű egy aerob körülmények között 
könnyen lebontható anyagot (pl. anilin, vagy nátrium-benzoát) hasz ­
nálni. Az anilin és nátrium-benzoát lebontásának várható id őtartama 
rendszerint kevesebb mint 2 hét. A referenciaanyag használatával megbizonyosodhatunk arról, hogy a mikrobiális aktivitás a teszt ­
vízben bizonyos határokon belül mozog, azaz, hogy a vízminta 
tartalmazz aktív mikrobiális populációt.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. MIN ŐSÉGI KRITÉRIUMOK  
1.7.1.  Visszanyerés (recovery)  
Közvetlenül a vizsgálati anyag hozzáadása után minden egyes 
kiindulási vizsgálati koncentrációt  14 C aktivitásméréssel, vagy nem 
jelölt anyag esetén kémiai analízissel ellen őrizni kell legalább ellen ­
mintában. Ez információval szolgál az analitikai módszer alkalmaz ­
hatóságáról és ismételhet őségéről, valamint a vizsgálati anyag elosz ­
lásának homogenitásáról. A kés őbbi adatkiértékelések során célszer ű 
a kezdeti  14 C aktivitás, vagy vizsgálatianyag-koncentráció adattal 
számolni a névleges koncentráció helyett, hiszen a szorpció miatti veszteségek és az adagolási hibák ezáltal kompenzálhatóak.
 14 C- 
jelölt vizsgálati anyag esetében a kísérlet végén történ ő visszanyerés 
értékét tömegkiegyenlítéssel adják meg (lásd 1.8.9.4. pont utolsó bekezdése). Ideális esetben a radioaktívan jelölt izotóp tömegki ­
egyenlítése 90 és 110 % közötti tartományban mozog, míg a nem 
jelölt vizsgálati anyag esetében a pontos analitikának 70–110 % 
közötti kezdeti visszanyerést kell eredményeznie. Ezeket a számokat mint elérend ő céltartományokat, és nem mint a vizsgálat elfogadha ­
tósági kritériumait kell kezelni. Az analízis megbízhatóságát választ ­
hatóan a kiindulásinál kisebb vizsgálatianyag-koncentrációra, vagy a 
fő transzformációs termékekre is meg lehet határozni.
 
1.7.2.  Az analitikai módszer ismételhet ősége és érzékenysége  
A vizsgálati anyag és a transzformációs termékek mennyiségi 
meghatározásához az analitikai módszer ismételhet őségét (a kiindu ­
lási kivonás hatékonyságát is beleértve), amennyiben szükséges, a felszíni vízminta 5 független kivonatának analízisével kell ellen ­ 
őrizni.
 
Az analitikai módszernek a vizsgálati anyagra és a transzformációs 
termékekre vonatkozó mennyiségi meghatározási határa (LOD) a tesztrendszerben alkalmazott kiindulási mennyiség legalább 1 %-a 
legyen. A mérhet őségi határnak (LOQ) az alkalmazott koncentráció 
10 %-ával egyenl őnek, vagy annál kevesebbnek kell lennie. Számos 
szerves anyag és transzformációs termékeik kémiai analízise gyakran megkívánja a vizsgálati anyag viszonylag magas koncentrációjának 
(azaz > 100 μg/l) alkalmazását.
 
1.8. A VIZSGÁLATI MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.8.1.  Eszközök  
A vizsgálatok megfelel ő térfogatú (pl. 0,5 vagy 1,0 literes), szilikon-, 
vagy gumidugóval lezárt kúp, vagy henger alakú lombikokban, 
illetve CO  2 -biztos tet ővel (pl. butilgumi-szeptum) ellátott szérumlom ­
bikokban végezhet őek. A vizsgálat megvalósításának másik módja, 
ha nagyszámú lombikot használunk és minden mintavételi 
időpontban legalább kétszer feldolgozzuk a lombikok teljes tartalmát 
(lásd az 1.8.9.1. pont utolsó bekezdését). Radioaktívan nem jelölt, nem illékony vizsgálati anyagok esetében gázbiztos dugók vagy fedelek nem szükségesek, a kívülr ől történő beszennyez ődéstől 
megóvó laza vattadugók megfelel őek (lásd az 1.8.9.1. pont második 
bekezdését). A kis mértékben illékony anyagok tesztelését biométer- típusú rendszerekben végezhetjük, a vízfázis óvatos kevertetése mellett. A felhasználásukat megel őzően hővel vagy autoklávozással 
a laboreszközök sterilizálhatóak, így a bakteriális beszennyez ődésük 
kizárható. Ezek mellett az alábbi általános laboreszközök kerülnek felhasználásra:
 
— rázógép vagy mágneses kever ő a tesztlombikok folyamatos 
kevertetéséhez,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifuga,  
— pH mér ő, 
— turbiditásmér ő a zavarosság mértékének meghatározására,  
— hevítőkemence vagy mikrohullámú süt ő a száraz tömeg meghatá ­
rozására,  
— membránsz űrő apparátus,  
— autokláv vagy h őlégsterilizáló az üvegeszközök sterilizálásához,  
— 14 C-jelölt anyagokkal végzett munkához szükséges felszerelés,  
— műszer a  14 C-activitás megkötött CO  2 -t tartalmazó oldatminták ­
ból, vagy szükség esetén üledékmintákból történ ő mennyiségi 
meghatározásához,  
— specifikus kémiai analízis alkalmazása esetén a vizsgálati anyag 
(és a referenciaanyag) méréséhez szükséges analitikai berendezés 
(pl. gázkromatográf, nagynyomású folyadékkromatográf).  
1.8.2.  A vizsgálati anyag törzsoldatai  
A vizsgálat- és referenciaanyag törzsoldatainak elkészítéséhez 
ioncserélt vizet használunk (lásd az 1.8.7. pont els ő bekezdését). 
Az ioncserélt víznek a mikroorganizmusokra toxikus anyagoktól mentesnek kell lennie, és oldott szerves széntartalma (DOC) nem lehet több 1 mg/l-nél (6).
 
1.8.3.  A felszíni vízminta begy űjtése és szállítása  
A felszíni vízminta vételére szolgáló mintavételi helyet mindenkor a 
vizsgálat céljainak megfelel ően kell kiválasztani. A mintavételi hely 
kiválasztásakor figyelembe kell venni a mez őgazdasági, az ipari és a 
háztartási eredet ű korábbi hatásokat. Amennyiben ismeretes, hogy az 
elmúlt négy évben a vízbázis a vizsgálati anyaggal, vagy annak szerkezeti analógjaival szennyez ődött, akkor tesztvíz vételére nem 
használható, hacsak a vizsgálatot végz őnek nem kifejezetten az a 
célja, hogy korábban szennyezett területen vizsgálja a lebontási sebességét. A víz pH-ját és h őmérsékletét a mintavételi helyszínen 
kell megmérni. Továbbá fel kell jegyezni a mintavétel mélységét és a 
vízminta állagát is (szín és zavarosság) (lásd 3. pont). Az aerob 
körülmények jelenlétének bizonyításához – hacsak ez már a területen végzett el őző kísérletek és azok eredményei alapján, valamint a küls ő 
megjelenés alapján nyilvánvalóan el nem dönthet ő – a víz és az 
üledék felszíni rétege oxigén-koncentrációjának és/vagy redoxpoten ­
ciáljának mérése is szükséges. A felszíni vizet alaposan kitisztított edényben szállítsuk. A szállítás során a minta h őmérséklete jelen ­
tősen nem haladhatja meg a vizsgálat h őmérsékletét. Ha a szállítás 
2–3 óránál hosszabb id őt vesz igénybe, a mintát ajánlatos 4 °C-ra 
hűteni. A vízminta fagyasztása tilos.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  A felszíni vízminta tárolása és el őkészítése  
A vizsgálatot célszer ű a mintavételt követ ő egy napon belül elvé ­
gezni. Ha szükséges a minta tárolása, a tárolás id őtartamát minima ­
lizálni kell, és semmilyen körülmények között sem szabad 4 hétnél 
tovább tárolni. A felhasználásig a vízmintát leveg őztetés mellett 
tartsuk 4 °C-on. A felhasználás el őtt távolítsuk el a durva részecs ­
kéket (pl. kb. 100 μm pórusméret ű nylon sz űrőn vagy durva sz űrő­
papíron történ ő átszűréssel, vagy ülepítéssel).  
1.8.5.  Üledékkel kiegészített vízminta el őkészítése (választható)  
A lebegőüledékes iszap vizsgálathoz (a durva részecskékt ől az 1.8.4. 
pontban leírtak szerint sz űréssel megszabadított) természetes 
vízmintát tartalmazó lombikokba juttassunk felszíni üledéket, hogy szuszpenziót kapjunk. A lebeg ő szilárd anyag koncentrációjának 0,01 
és 1 g/l közöttinek kell lennie. A felszíni üledéknek a vízminta 
kivételi helyér ől kell származnia. A vízbázis adott környezetét ől 
függően a felszíni üledék lehet nagy szervesszén-tartalmú 
(2,5–7,5 %) és finom szerkezet ű, vagy kis szervesszén-tartalmú 
(0,5–2,5 %) és durva szerkezet ű (3). A felszíni üledék el őkészíté­
sekor átlátszó m űanyagcső segítségével emeljünk ki több üledékda ­
rabot, a mintavétel után azonnal vágjuk le a fels ő aerob réteget (a 
felszíntől max. 5 mm-es mélységig), és egyesítsük ezeket. Az így 
kapott üledéket nagy légter ű edényben kell szállítani, hogy az üledék 
aerob körülmények között maradjon (ha a szállítási id ő 2–3 óránál 
több, hűtsük 4 °C-ra). Az üledékmintából 10-szeres mennyiség ű 
vízzel készítsünk szuszpenziót, és a felhasználásig leveg őztetés 
mellett 4 °C-on tartsuk. Ha szükséges az üledék tárolása, a tárolás 
időtartamát minimalizálni kell, és semmilyen körülmények között 
sem szabad 4 hétnél tovább tárolni.
 
1.8.6.  Félfolyamatos eljárás (opcionális)  
Ha hosszú várakozási id őnek kell eltelnie azel őtt, hogy a vizsgálati 
anyag szignifikáns mérték ű lebontását lehetne mérni, akkor hosszabb 
inkubációra (több hónap) lehet szükség. Ha ez az anyag korábbi vizsgálatai alapján ismert, akkor a vizsgálat félfolyamatos eljárással kezdhető, ami lehet ővé teszi a tesztvíz vagy szuszpenzió egy 
részének id őről időre történő kicserélését (lásd 2. melléklet). Másik 
megoldásként a szokásos egymenetes vizsgálat átalakítható félfolya ­
matos vizsgálattá, ha a vizsgálati anyagnál az egymenetes eljárással körülbelül 60 nap alatt sem tapasztalunk lebontást (lásd az 1.8.8.3. 
pont második bekezdése).
 
1.8.7.  A vizsgálati anyag (vagy referenciaanyag) bejuttatása a rend ­
szerbe  
A vízben jól oldódó (> 1 mg/l) és kis illékonyságú (Henry-állandó < 
1 Pa•m  3 /mól vagy < 10  –5 atm•m  3 /mól) anyagokból ioncserélt vízzel 
(lásd 1.8.2. pont) törzsoldat készíthet ő. Ebből megfelel ő mennyiséget 
a tesztedényekbe juttatva beállíthatjuk a kívánt koncentrációkat. A 
hozzáadott törzsoldat térfogatát a gyakorlatilag lehetséges minimum szinten kell tartani (ha lehetséges, a végs ő folyadéktérfogat 10 %-a 
alatt). Egy másik lehetséges módszer a vizsgálati anyag feloldása 
nagyobb térfogatú tesztvízben, ami a szerves oldószer használatának 
alternatívájaként tekinthet ő.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Ha ez elkerülhetetlen, a vízben rosszul oldódó nem illékony anyagok 
törzsoldatait illékony szerves oldószer felhasználásával is el őállíthat­
juk, de a tesztrendszerbe juttatott oldószer mennyisége nem lépheti túl az 1 tf %-ot, és nem lehet káros hatása a mikrobás aktivitásra, vagy a vizsgálati anyag stabilitására a vizes oldatban. Az oldószert 
annyira ki kell űzni az oldatból, hogy lehet őleg csak nagyon kis 
mennyiségben maradjon, ami már jelent ős mértékben nem emeli a 
tesztvíz vagy szuszpenzió DOC koncentrációját. Ezt anyagspecifikus analízissel, vagy ha lehetséges DOC analízissel kell ellen őrizni (6). 
Figyelmet kell fordítani arra, hogy a bejuttatott oldószer mennyiségét 
az abszolút szükséges mennyiségre korlátozzuk, és biztosítani kell, hogy a vizsgálati anyag feloldódhasson a tesztvíz végleges térfoga ­
tában. A vizsgálati anyagnak a reakcióedényekbe történ ő bejuttatá ­
sára szolgáló más módszereket a (7) és (8) referencia tartalmazza. 
Abban az esetben, ha a vizsgálati anyaghoz szerves oldószert adunk, tesztvizes (más adalék nélküli) oldószer-kontrollt és referencia szubsztrát-kontrollt is alkalmazni kell. Ez utóbbit hasonlóan kezeljük, 
mint a viv őoldószerben oldott vizsgálati anyaggal kiegészített aktív 
tesztedényeket. Az oldószer-kontrollok célja, hogy megvizsgáljuk a szolvens által okozott, a mikrobapopulációra gyakorolt lehetséges gátló hatást, amit a referenciaanyag lebontási kinetikája jelez el őre.
 
1.8.8.  Tesztkörülmények  
1.8.8.1.  Teszth őmérséklet  
Az inkubációnak sötétben vagy szórt fényben, kontrollált h őmérsék­
leten (± 2 °C) kell történnie, amely lehet terepi h őmérséklet vagy 
20–25 °C-os szobah őmérséklet. A terepi h őmérséklet a minta minta ­
vételkor mért tényleges h őmérséklete, vagy a mintavételi hely átlagos 
terepi hőmérséklete.  
1.8.8.2.  Kevertetés  
A kevertetés a folyamatos rázatás vagy keverés révén gondoskodik a 
részecskék és a mikrobák szuszpenzióban tartásáról. A kevertetés elősegíti a gáztérb ől az oxigén bejutását a folyadékfázisba, ezáltal 
az aerob körülmények megfelel ő módon fenntarthatóak. Helyezzük a 
lombikokat a rázógépbe (kb. 100 rpm-es kevertetés) vagy használ ­
junk mágneses kever őt. A kevertetésnek folyamatosnak kell lennie. 
Mindazonáltal a rázatásnak vagy a keverésnek a homogén szusz ­
penzió fenntartása mellett a lehet ő legenyhébbnek kell lennie.
 
1.8.8.3.  A vizsgálat id őtartama  
A vizsgálat id őtartama általános esetben nem lépi túl a 60 napot, 
hacsak a félfolyamatos eljárás szerint a vizsgálati szuszpenziót id őről 
időre nem cseréljük (lásd a 1.8.6. pontot és a 2. mellékletet). Az 
egymenetes vizsgálati periódus is kiterjeszthet ő azonban maximum 
90 napra, ha a vizsgálati anyag lebontása az els ő 60 napon belül 
megkezdődött. A lebontás rendszeres id őközönkénti nyomon köve ­
tése a visszamaradó  14 C aktivitás, vagy a kibocsátott  14 CO 2 (lásd 
1.8.9.4. pont) mérésével és/vagy a kémiai analízissel (lásd 1.8.9.5. 
pont) történik. A lebontási folyamat értékelhet őségéhez az inkubációs 
időnek megfelel ően hosszúnak kell lennie. A lebontás mértékének 
lehetőleg 50 % felett kell lennie, lassan bomló anyagoknál a lebontás 
mértékének megfelel őnek (normális esetben 20 % feletti lebontás) 
kell lennie ahhoz, hogy biztosítsa a kinetikus lebontásos sebességi 
állandó becsülhet őségét.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
A vizsgálati rendszerben a pH-t és az oxigénkoncentrációt rendsze ­
resen mérni kell, hacsak az ugyanarról a területr ől származó víz- és 
üledékmintákkal végzett hasonló vizsgálatokból lesz űrhető tapaszta­
latok ezt szükségtelenné nem teszik. Bizonyos körülmények között a vízben vagy üledékben sokkal nagyobb koncentrációban jelen lév ő 
elsődleges szubsztrátok metabolizmusa elegend ő CO
 2 -termelődést és 
oxigénfogyást eredményez ahhoz, hogy a vizsgálat során a kísérleti körülmények jelent ősen megváltozzanak.
 
1.8.9.  Kísérleti eljárás  
1.8.9.1.  A lombikok el őkészítése nyílt vízi vizsgálathoz  
Juttassunk megfelel ő mennyiség ű tesztvizet a tesztlombikokba, a 
lombikokat térfogatuk kb. harmadáig töltve, de legalább kb. 100 ml tesztvizet töltve beléjük. Több lombik használata esetén (ami lehet ővé teszi a lombik teljes tartalmának feldolgozását minden 
mintavételi id őpontban) is kb. 100 ml a kívánt tesztvíz-mennyiség, 
mivel a kis mintatérfogatok hatással lehetnek a lappangási fázis hosszára. A vizsgálati anyag törzsoldatból történ ő bejuttatása az 
1.8.2. és 1.8.7. pontokban leírtak szerint történik. Hogy a lebontási 
kinetika meghatározása és a kinetikus lebontásos sebességi állandó 
számíthatóvá váljon, a vizsgálati anyagot legalább két, egymástól ötös-tizes szorzófaktorral eltér ő koncentrációban kell használni. 
Mindegyik választott koncentrációnak 100 μg/l-nél kisebbnek kell 
lennie, lehet őleg a < 1–10 μg/l tartományban.
 
Zárjuk le a lombikokat a leveg ő és CO  2 számára áthatolhatatlan 
dugókkal vagy fedelekkel.  14 C izotóppal nem jelölt nem-illékony 
vizsgálati anyagok esetében elegend ő laza vattadugókat használni a 
légkörből érkező szennyezések elkerülésére (lásd 1.8.1. pont), feltéve 
hogy az összes f ő transzformációs termék ismerten nem illékony, és 
indirekt CO  2 meghatározást (lásd 3. melléklet) alkalmazunk.  
Inkubáljuk a lombikokat a választott h őmérsékleten (lásd 1.8.8.1. 
pont). Különítsünk el mintákat a kémiai analízishez vagy a  14 C 
méréshez a vizsgálat kezdetén (azaz miel őtt a biológiai lebontás 
megindulna; 1.7.1. pont), majd végig a vizsgálat folyamán megfelel ő 
időközönként. A mintavétel történhet úgy, hogy minden párhuza ­
mosból kis mennyiség ű mintát (pl. 5 ml-es alikvótok) veszünk, 
vagy minden egyes mintavételi id őpontban feldolgozhatjuk teljes 
lombikok tartalmát. A vizsgálati anyag mineralizációját meghatároz ­
hatjuk indirekt és direkt módon is (lásd 3. melléklet). A sebességi állandó megbízható becsléséhez általában legalább öt mintavételi pont szükséges a lebontási fázisban (azaz a lappangási fázist köve ­
tően), hacsak nem igazolható, hogy három mérési pont elégséges a 
gyorsan bomló anyagok esetében. Lassan bomló anyagoknál a lebon ­
tásos fázisban több mérés is könnyen kivitelezhet ő, ennek következ ­
tében a k számításához több adatpontot használhatunk. Mivel a 
biológiai lebontás sebessége eltér ő, egy fix mintavételi ütemterv 
nem határozható meg, bár ha a lebontás lassú heti egy mintavétel elvégzése ajánlatos. Ha a vizsgálati anyag lebontása gyors, az els ő 
három napban napi egy mintát, majd ezt követ ően két-háromnaponta 
egy mintát kell venni. Bizonyos körülmények között (például 
gyorsan hidrolizáló anyagok esetében) óránkénti mintavételre is szükség lehet. A vizsgálat megkezdése el őtt ajánlott el ővizsgálatok 
lefolytatása a mintavételi intervallumok meghatározására. Ha a 
mintákat további specifikus analízisnek is alá kell vetni, akkor taná ­
csos több mintát venni, majd az analizálandókat a kísérlet végén, a visszafelé mérés stratégiáját alkalmazva (azaz az utoljára levett mintákat analizáljuk el őször) kiválasztani (a minták tárolás közbeni 
stabilitására vonatkozó útmutatót lásd az 1.8.9.5. pont második 
bekezdésében).
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  A lombikok és minták száma  
Állítsunk be megfelel ő számú tesztlombikot, hogy rendelkezésre 
álljanak a követez ők: 
— minden egyes vizsgálati anyag-koncentrációhoz legalább két 
párhuzamos (lehet őleg legalább 3), vagy minden egyes koncent ­
rációhoz számos tesztlombik, ha minden mintavételkor teljes 
lombikok tartalmának feldolgozása történik (F  T -vel jelölve),  
— tesztlombikok az tömegkiegyenlítés-kalkulációhoz legalább két 
párhuzamosban minden egyes tesztkoncentrációhoz (F  M -mel 
jelölve),  
— vizsgálati anyag nélküli vak kontroll; legalább egy, csak teszt ­
vizet tartalmazó tesztlombik (F  B -mel jelölve),  
— referenciakontroll; a referenciaanyagot (pl. anilin vagy nátrium- 
benzoát) tartalmazó tesztlombikok két párhuzamosban (F  C -vel 
jelölve). A referenciakontroll célja a mikrobiális aktivitás mini ­
mumának ellen őrzése. Ha lehetséges, radioaktívan jelölt referen ­
ciaanyag is használható, még akkor is, ha a vizsgálati anyag lebontását kémiai analízissel követjük,
 
— steril kontroll; egy-két sterilizált tesztvizet tartalmazó lombik az 
abiotikus lebontás, vagy a vizsgálati anyag más, nem biológiai eredetű elvesztésének vizsgálatához (F
 S -sel jelölve). A biológiai 
aktivitás leállítható a tesztvíz autoklávozásával (121 °C; 20 perc), 
mérgező anyag hozzáadásával (pl. 10–20 g/l nátrium-azid 
(NaN  3 ), 100 mg/l higany-klorid (HgCl  2 ), vagy 100 mg/l forma ­
lin), vagy gammasugárzással. HgCl  2 használata esetén ezeket 
mint veszélyes hulladékot kell ártalmatlanítani. Nagy mennyi ­
ségben alkalmazott vizes üledékeknél a steril körülményeket nem könny ű kialakítani, ebben az esetben ismételt (pl. három ­
szori) autoklávozás javasolt. Figyelembe kell venni, hogy az 
autoklávozás hatására az üledék szorpciós tulajdonságai megvál ­
tozhatnak,
 
— tesztvizet, referenciaanyagot és tesztvizet tartalmazó oldószer 
kontrollok; azonos mennyiség ű oldószerrel és a vizsgálati 
anyag alkalmazásával megegyez ő módon el őállított lombikok 
két párhuzamosban. Ennek célja az oldószer esetleges gátló hatá ­
sának megállapítása a referenciaanyag lebontásának meghatá ­
rozásán keresztül.  
A vizsgálat megtervezése során a vizsgálatot kivitelez ő személynek 
fontolóra kell vennie, hogy számára inkább a nagyobb számú kísér ­
leti ismétlés, vagy ezzel szemben a nagyobb számú mintavétel a fontosabb. A szükséges lombikok pontos száma a lebontás mérésére 
szolgáló módszert ől függ (lásd az 1.8.9.1. pont harmadik bekezdését; 
az 1.8.9.4. pontot és a 3. mellékletet).
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Minden mintavételi id őpontban minden lombikból két mintát (pl. 
5ml-es alikvótokat) kell venni. Ha számos lombik használatos, 
hogy teljes lombikok tartalmát fel lehessen dolgozni, akkor minden mintavételi id őpontban legalább két lombikot kell feláldozni (lásd az 
1.8.9.1. pont els ő bekezdését).
 
1.8.9.3.  Lombikok el őkészítése lebeg ő üledék vizsgálathoz [választható]  
Ha szükséges, juttassunk megfelel ő mennyiség ű tesztvizet és 
üledéket a tesztedényekbe (lásd 1.8.5. pont). A lombikoknak a 
lebegő üledék vizsgálathoz történ ő előkészítése megegyezik a nyílt 
vízi vizsgálatnál leírtakkal (lásd 1.8.9.1. és 1.8.9.2. pontok). Hasz ­
náljunk inkább szérumpalackokat vagy hasonló alakú lombikokat. Helyezzük a lezárt lombikokat vízszintesen a rázógépbe. A nem
 
14 C-jelölt, nem-illékony anyagokat tartalmazó nyitott lombikokat 
nyilvánvalóan függ őlegesen kell elhelyezni, ebben az esetben 
mágneses keverés, vagy üveggel bevont mágnesrudak használata ajánlott. Ha szükséges, a megfelel ő aerob körülmények eléréséhez 
levegőztessük a reakcióedényeket.
 
1.8.9.4.  Radiokémai mérések  
A képződő 14 CO 2 mérhető indirekt, vagy direkt módon (lásd 3. 
melléklet). Az indirekt  14 CO 2 meghatározás a tesztvíz vagy szusz ­
penzió kezdeti  14 CO 2 aktivitásának, és a mintavétel alkalmával a 
minta pH 2–3-ra történ ő lesavanyítása és a CO  2 kiűzése után mért 
teljes maradó aktivitásnak a különbsége alapján történik. Így a szer ­
vetlen széntartalom is távozik, és a maradó aktivitás a szerves 
anyagtól származik. Ha a vizsgálati anyag átalakulása során illékony fő transzformációs termék képz ődik, az indirekt
 14 CO 2 meghatározás 
nem használható (lásd 3. melléklet). Amennyiben lehetséges, a  
14 CO 2 képződését minden egyes mintavételi pontban legalább egy 
lombikban direkt módon kell mérni (lásd 3. melléklet). Ez a módszer lehetővé teszi mind az tömegkiegyenlítés, mind a biológiai lebontási 
folyamat nyomon követését, de használata korlátozott a zárt 
lombikos vizsgálatok esetében.
 
Ha a vizsgálat során a termel ődő 14 CO 2 -t direkt módon mérjük, erre 
a célra a vizsgálat kezdetekor több lombikot kell beállítani. Ha a vizsgálati anyagból illékony f ő transzformációs termék képz ődik, 
ez a módszer az ajánlott. A többi tesztlombik tartalmát minden 
mérési pontban pH 2–3-ra savanyítjuk, és a
 14 CO 2 -t belső vagy 
külső abszorbenssel kötjük meg (lásd 3. melléklet).  
A 14 C-jelölt vizsgálati anyag és a f ő transzformációs termék koncent ­
rációját esetleg radiokromatográfiásan (pl. vékonyréteg-kromatográ ­
fia, RAD-TLC), vagy radiokémiai detekcióval, HPLC (nagynyomású 
folyadékkromatográfia) segítségével is meghatározhatjuk.  
Opcionálisan a maradó radioaktivitás (lásd 1. melléklet), a vizsgálati 
anyag és a transzformációs termék fázismegoszlását is meghatároz ­
hatjuk.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
A vizsgálat végén a tömegkiegyenlítést direkt  14 CO 2 méréssel kell 
megállapítani, olyan független tesztlombikokból, amelyekb ől a vizs­
gálat folyamán nem vettünk mintákat (lásd 3. melléklet).  
1.8.9.5.  Specifikus kémiai analízis  
Ha lehetőség van érzékeny, specifikus analitikai módszer használa ­
tára, az els ődleges biológiai lebontás mértéke az izotópos jelölés 
helyett a vizsgálati anyag teljes maradó koncentrációjának mérésével 
állapítható meg. Amennyiben jelölt vizsgálati anyagot használunk (a teljes mineralizáció mérésére), a specifikus kémiai analízis ezzel párhuzamosan elvégezhet ő, hasznos többlet-információval szolgál, 
és ellenőrizhetjük vele a módszert. A specifikus kémiai analízis a 
vizsgálati anyag lebontása során keletkez ő transzformációs termék 
mérésére is használható, és ez ajánlott is olyan anyagok esetében, amelyek mineralizációs felezési ideje 60 napnál hosszabb. A vizs ­
gálati anyag és a transzformációs termék koncentrációját minden 
mintavételi pontban mérni kell és ki kell értékelni (koncentrációban vagy százalékos formában). Általánosságban az alkalmazott koncent ­
ráció 10 %-a ≤, bármely mintavételi id őpontban kimutatható transz ­
formációs termékeket azonosítani kell, hacsak nincs más értelm ű 
ésszerű indoklás. A kísérlet során folyamatosan emelked ő koncent­
rációban jelen lév ő transzformációs termékek azonosítását is meg 
kell fontolni, még akkor is, ha ezek nem érik el a fenti határt, 
mivel ez a lebontással szembeni ellenállóképességet jelezhet. Ha a 
vizsgálati anyag gyors abiotikus lebontása lehetségesnek t űnik (pl. 
hidrolízis), akkor fontolóra kell venni a transzformációs termékek analízisét a steril kontrollokban. A transzformációs termékek 
mennyiségi és min őségi meghatározását az adott esetben kell eldön ­
teni, és az indoklásokkal együtt a kiértékelésben közzétenni. A szerves oldószerrel végzett extrakciós technikákat a megfelel ő anali­
tikai módszer el őírásai alapján kell elvégezni.
 
Minden mintát 2 és 4 °C között, légmentesen kell tárolni, ha az 
analízis 24 órán belül megtörténik (ajánlott). Hosszabb tárolásnál a mintákat – 18 °C alá kell fagyasztani, vagy kémiai módszerrel tartó ­
sítani kell. Utóbbi módszerhez a savanyítás nem javasolt, hiszen ezek 
a minták instabilak lehetnek. Ha a mintákat 24 órán belül nem analizálják és hosszabb tárolásra kerülnek, akkor egy tárolási stabi ­
litás-vizsgálatot kell kapcsolni a kísérlethez, hogy a vizsgált vegyü ­
letek kémiai stabilitása – 18 °C alatt vagy tartósított állapotban 
demonstrálható legyen. Oldószeres extrakciós vagy szilárd fázisú extrakciós (SPE) lépést is magában foglaló analitikai módszereknél az extrakciót azonnal a mintavétel után, vagy a fagyasztott minta 
maximum 24 óráig tartó tárolása után el kell végezni.
 
Az analitikai módszer érzékenységének függvényében a pont 16. 
sorában jelzetteknél nagyobb mintatérfogatok lehetnek szükségesek. A vizsgálat könnyedén kivitelezhet ő 2–3 literes lombikokban egy 
literes teszttérfogatokkal, amely lehet ővé teszi kb. 100 ml minta 
levételét.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. ADATOK ÉS DOKUMENTÁLÁSUK  
2.1. AZ EREDMÉNYEK KEZELÉSE  
2.1.1.  Az adatok ábrázolása  
Kerekítsük a mintavételi id őpontokat egész órákra (hacsak az anyag 
lényeges mérték ű lebontása nem percek kérdése), de ne egész 
napokra. Ábrázoljuk a vizsgálati anyag becsült maradó aktivitását (
 14 C-jelölt anyagok esetében), vagy maradó koncentrációját (nem 
jelölt anyagok esetében) az id ő függvényében mind lineáris, mind 
fél-logaritmikus skálán (lásd 1a., 1b. ábra). Ha lebontás játszódik le, 
hasonlítsuk össze az F  T lombikok eredményeit az F  S lombikokéval. 
Ha a vizsgálati anyagos lombikok (F  T ) eredményeinek átlaga keve ­
sebb mint 10 %-kal tér el a steril lombikokétól (F  S ), akkor megálla ­
pítható, hogy a tapasztalt lebontás alapvet ően abiotikus. Amennyiben 
az F  S lombikokban a lebontás kisebb mérték ű, az értékekkel korri ­
gáljuk az F  T lombikoknál kapott értékeket (kivonással), hogy 
becsülni tudjuk a biológiai lebontás mértékét. Ha a f ő transzformá ­
ciós termékek választható analízisét elvégeztük, akkor ezek keletke ­
zését és fogyását is ábrázolni kell a vizsgálati anyag fogyása mellett.  
Határozzuk meg a lappangási fázis t  L hosszát a lebontási görbéb ől 
(fél-logaritmikus ábrázolás) úgy, hogy extrapoláljuk ennek lineáris részét a zéró lebontásig, vagy úgy, hogy meghatározzuk a 10 %-os 
lebontáshoz szükséges id őt (lásd 1a., 1b. ábra). A fél-logaritmikus 
ábrából becsüljük meg az els őrendű sebességi állandót (k) és stan ­
dard hibáját az id ő függvényében felvett ln (maradó
 14 C aktivitás 
vagy vizsgálati anyag-koncentráció) lineáris regressziójából. F őleg a  
14 C méréseknél csak a görbének lappangási fázis vége utáni kezdeti 
lineáris szakaszát használjuk, és a kiválasztásnál a kisszámú, repre ­
zentatív adatokat részesítsük el őnyben a nagyobb számú, de bizony ­
talan adatokkal szemben. A bizonytalanság tartalmazza a mért 
maradó  14 C aktivitások javasolt direkt felhasználásából ered ő hibákat 
(lásd lent). Ha a lebontás kétfázisú lefutást követ, néha fontos lehet két különböz ő sebességi állandó számítása. Ebb ől a célból a lebon ­
tási görbe két különböz ő fázisa definiálható. Az ugyanabból a 
lombikból vett minták esetében a párhuzamosokban minden egyes 
lombikra számítani kell a sebességi állandót (k) és a felezési id őt (t
 ½ 
= ln2/k); vagy ha a lombik teljes tartalmát analizáljuk (lásd az 
1.8.9.2. pont utolsó bekezdése), akkor az eredmények átlagából. 
Amikor az els ő módszert használjuk, a sebességi állandót és a fele ­
zési időt megadjuk a párhuzamosok minden egyes lombikjára, és 
ezek átlagát is a standard hibával. Magas koncentrációjú vizsgálati anyag esetében a lebontási görbe jelent ősen eltérhet az egyenest ől 
(fél-logaritmikus ábrázolás) és az els őrendű kinetika érvénytelen 
lehet. Ennek következtében a felezési id ő megadásának nincs 
értelme. Egy limitált adattartományra azonban használható pszeudo- elsőrendű kinetika, és a lebontási felezési id ő DT
 50 (az 50 %-os 
lebontáshoz szükséges id ő) becsülhet ő. Ugyanakkor fontos szem 
előtt tartani, hogy a lebontás id őtartama a kiválasztott adattartomá ­
nyon túl a DT  50 használatával nem határozható meg, mivel ez az 
érték csupán ennek az adatsornak a sajátja. A statisztikai számítá ­
sokat és a görbeillesztést könnyít ő segédeszközök könnyen hozzáfér ­
hetőek, és az ilyen típusú szoftverek alkalmazása ajánlott is.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Specifikus kémiai analízis elvégzése esetén határozzuk meg a lebon ­
tási állandókat és felezési id őket az els ődleges lebontásra, a teljes 
mineralizációra leírtak szerint (lásd fent). Ha az els ődleges lebontás a 
meghatározó folyamat, néha a teljes lebontási id őtartam pontjai 
felhasználhatóak. Ennek oka az, hogy szemben a  14 C aktivitásmérés ­
sel, ezek a mérések direktek.  
Ha 14 C-jelölt anyagot használunk, a tömegkiegyenlítést a bemért 
kezdeti koncentráció százalékában kell kifejezni, legalább a vizsgálat 
végeztével.  
2.1.2.  Maradó aktivitás  
Amikor a  14 C-jelzett szerves anyag lebontódik, a  14 C nagy része  
14 CO 2 -dá alakul, míg a másik része a biomassza növekedésére 
és/vagy extracelluláris metabolitok szintézisére használódik fel. 
Ennek következtében az anyag biológiai lebontásának maximális szintje nem eredményezi széntartalmának 100 %-os átalakulását
 
14 CO 2 -dá. A  14 C bioszintézis-termékekbe épül be, majd ezt 
követően, a másodlagos mineralizációnak köszönhet ően lassan,  
14 CO 2 formában felszabadul. Ezen okok miatt a maradó  14 C 
aktivitás (a CO  2 kiűzése után) vagy az id ő függvényében felvett 
termelődő 14 CO 2 ábrázolásakor a lebontás befejez ődése után egy 
„lecsengési fázist” fogunk látni. Ez bonyolultabbá teszi az adatok 
kinetikai interpretációját, ezért csupán a görbe kezdeti szakaszát (a lappangási fázis befejez ődése után és a kb. 50 %-os lebontási 
szint elérése el őtt) használjuk a lebontási sebességi állandó 
számításához. Ha a vizsgálati anyag lebomlik, a teljes maradó 
szerves
 14 C aktivitás mindig nagyobb, mint a maradó intakt 
vizsgálati anyaghoz kapcsolható  14 C aktivitás. Ha a vizsgálati 
anyag els őrendű reakció szerint bomlik, és egy állandó α 
mennyisége CO  2 -dá mineralizálódik, a  14 C csökkenés görbéjének 
(teljes szerves  14 C az idő függvényében) kezdeti meredeksége α- 
szorosa lesz a vizsgálati anyag koncentrációjának (vagy egészen pontosan a vizsgálati anyag
 14 C-gyel jelölt részének) megfelel ő 
görbe meredekségének. A teljes szerves  14 C aktivitás korrigá ­
latlan mért értékeit használva a számított lebontási sebességi állandó ennek következtében csak óvatos becslés lesz. Különféle egyszerűsítő feltételeken alapuló, a vizsgálati anyag koncentráci ­
óját a mért radiokémiai aktivitásokból becsl ő módszer a szak ­
irodalomból ismert (2)(9)(10)(11). Az ilyen eljárások a legköny ­
nyebben a gyorsan bomló anyagokra alkalmazhatóak.
 
2.2. AZ EREDMÉNYEK INTERPRETÁCIÓJA  
Amennyiben k függetlennek bizonyul az alkalmazott koncentrációtól 
(azaz a k számított értéke közel azonos a különböz ő vizsgálati 
anyag-koncentrációk esetén) megállapítható, hogy az els őrendű 
sebességi állandó reprezentatív az adott körülményekre, azaz a vizs ­
gálati anyagra, a vízmintára és a teszth őmérsékletre. Hogy az ered ­
mények milyen mértékben általánosíthatóak és vetíthet őek ki más 
rendszerekre, csak szakért ői vélemények alapján határozható meg. 
Amennyiben a vizsgálati anyagot magas koncentrációban alkalmaz ­
zuk, és így a lebontás nem els őrendű kinetikát követ, az adatok nem 
használhatóak fel els őrendű lebontási sebességi állandó és a 
megfelelő felezési id ő megadásához. Az ilyen adatok azonban még 
mindig használhatóak a teljes mineralizáció mértékének becslésére 
és/vagy a transzformációs termékek kimutatására és mennyiségi 
meghatározására.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Amennyiben a biológiai lebontáson kívüli egyéb, a vizsgálati anyag 
mennyiségének csökkenésével járó folyamatok (hidrolízis vagy vola ­
tilizáció) sebessége ismert, ezek értékét a teljes koncentráció csök ­
kenési sebességéb ől a vizsgálat során kivonva egy közelít ő biológiai 
lebontási sebességet kaphatunk. A hidrolízis-adatokhoz a steril kont ­
rollból vagy nagyobb koncentrációjú párhuzamos vizsgálati anyag- 
kísérletből juthatunk.  
A 14 CO 2 indirekt és direkt meghatározása (lásd 1.8.9.4. pont és 3. 
melléklet) csupán a vizsgálati anyag CO  2 -dá történ ő mineralizációja 
mértékének mérésére használható. A  14 C-jelölt vizsgálati anyag 
koncentrációját és a f ő transzformációs termék (lásd 1.8.9.4. pont 
harmadik bekezdését) keletkezését radiokromatográfiával (RAD- 
TLC) vagy HPLC-vel analizálhatjuk. A felezési id ő direkt meghatá ­
rozásához szükséges, hogy ne legyen jelen f ő transzformációs termék 
(definíció szerint az alkalmazott vizsgálati anyag 10 %-a ≤). Ha a 
definíció szerint ilyen anyag jelen van, az adatok részletes kiértéke ­
lésére van szükség. Ez jelenthet megismételt vizsgálatot, és/vagy a transzformációs termék azonosítását (lásd 1.8.9.5. pont els ő bekez­
dése), hacsak a termék sorsa a gyakorlatban egyértelm űen meg nem 
állapítható (pl. a lebontási útvonal ismerete). Mivel a vizsgálati 
anyag CO
 2 -dá alakult hányada változó (er ősen függ a vizsgálati 
anyag és más hozzáférhet ő szubsztrátok koncentrációjától, a teszt ­
körülményekt ől és a mikrobiális populációtól) ez a vizsgálat nem 
alkalmas a teljes biológiai lebontás közvetlen számítására, amit pl. 
a DOC fogyási vizsgálatban láthatunk, de az eredmények hasonlóak a respirometriás vizsgálatból kaphatóakkal. A mineralizáció mértéke 
így a teljes biológiai lebontás minimális szintjénél kisebb, vagy azzal 
egyenlő lesz. Hogy még teljesebb képet kapjunk a teljes biológiai 
lebontásról (mineralizáció és biomasszába történ ő beépülés), a
 14 C 
fázismegoszlásának analízisét a vizsgálat végén el kell végezni (lásd 
1. melléklet). A  14 C a diszpergált fázisban a bakteriális biomasszába 
beépült  14 C-ből és a szerves részecskékhez tapadt  14 C-ből fog állni.  
2.3. A VIZSGÁLAT VALIDITÁSA  
Amennyiben a referenciaanyag nem bomlik le a várt id őtartam alatt 
(anilinre és nátrium-benzoátra általában kevesebb mint két hét), a vizsgálat validitása kétségbe vonható és további ellen őrzése szük ­
séges, vagy a vizsgálatot új vízmintával meg kell ismételni. A 
módszer egy ISO-körméréses tesztsorozatában, amelyben Európa- 
szerte hét laboratórium vett részt, az anilinre alkalmas lebontási sebességi állandó a 0,3–1,7 nap
 –1 -es tartományban mozgott, 20  o C- 
on 0,8 nap  –1 -es átlaggal és ± 0,4 nap  –1 standard hibával (t  ½ = 0,9 
nap). A vizsgált vízmintákra vonatkozóan milliliterenként 10  3 –10  4 
CFU-nak (telepképz ő egység) megfelel ő bakteriális biomassza- 
tartalmat írtak le. A lebontási sebességek az ásványi anyagban dúsabb közép-európai vizekben nagyobbak voltak, mint a skandináv 
oligotróf vizekben, amit a különböz ő ásványianyag-ellátottság, vagy 
a kémiai anyagokkal való el őzetes kitettség okozhat.
 
A kísérlet végén a teljes visszanyerésnek (anyagmérleg) 90 és 110 % 
között kell lennie radioaktívan jelölt anyagoknál, míg nem jelölt anyagok esetében a kezdeti visszanyerésnek (recovery) a kísérlet kezdetén 70 és 110 % között kell lennie. Az említett tartományok 
azonban csak megcélzandó értékek, és nem használhatók a vizsgálat 
elfogadhatósági kritériumaiként.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. VIZSGÁLATI JEGYZ ŐKÖNYV  
A vizsgálat típusának (azaz nyílt vízi vagy lebeg ő üledék vizsgálat) 
egyértelm űen meg kell jelennie a vizsgálat jegyz őkönyvében, 
amelynek az alábbi információt is tartalmaznia kell:  
Vizsgálati anyag és referenciaanyag(ok):  
— közkelet ű nevek, kémiai elnevezések (ajánlottak a IUPAC és/ ­
vagy CAS elnevezések), CAS számok, szerkezeti képletek (ha 
az alkalmazott anyag radioaktívan jelölt a  14 C pozíciójának 
megjelölésével) és a vizsgálati anyag és referenciaanyag fontos fizikokémiai tulajdonságai (lásd 1.5. és 1.6. pont),
 
— a transzformációs termék azonosításához és mennyiségi 
meghatározásához használt standardok kémiai elnevezései, CAS számai, szerkezeti képletei (ha az alkalmazott anyag 
radioaktívan jelölt, a
 14 C pozíciójának megjelölésével), fontos 
fizikokémiai tulajdonságai,  
— a vizsgálati anyag és referenciaanyag tisztasága (szennyezései),  
— a jelölt vegyület radiokémiai tisztasága és specifikus aktivitása 
(ahol szükséges).  
Felszíni víz:  
A levett vízmintáról az alábbi minimális információkat közre kell 
adni:  
— a mintavételi hely fekvése és leírása, ha lehetséges, szennyezett ­
ségi előtörténete,  
— a mintavétel id őpontja,  
— ásványi anyagok (totál N, ammónium, nitrit, nitrát, totál P, oldott 
ortofoszfát),  
— mintavételi mélység,  
— a minta állaga (pl. szín és zavarosság),  
— DOC és TOC,  
— BOD,  
— hőmérséklet és pH a mintavétel helyén és idején,  
— oxigén vagy redoxpotenciál (csak abban az esetben kötelez ő, ha 
az aerob körülmények megléte nem nyilvánvaló),  
— ionerősség vagy konduktivitás (tengervíz és brakk víz esetében),  
— lebegő szilárd anyagok (zavaros minta esetén),  
— egyéb, esetleg fontos információk a mintavétel id őpontjában a 
mintavétel helyszínér ől (pl. a folyók, vagy tengeráramlatok aktu ­
ális vagy múltbéli adatai, közeli f ő kiömlések és ezek típusa, 
időjárási körülmények a mintavétel id őpontját megel őzően), 
és választhatóan:  
— mikrobiális biomassza (pl. akridinnarancs direkt sejtszám vagy 
telepképz ő egység),  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— szervetlen szén,  
— klorofill-a koncentráció, mint az alga- biomassza speciális 
mérése.  
Ezen túlmen ően lebegő üledék vizsgálat végzése esetén az alábbi 
információkat kell rendelkezésre bocsátani az üledékr ől: 
— az üledék mintavételi mélysége,  
— az üledék állaga (úgymint színes, saras, iszapos, vagy homokos),  
— textúra (pl. durva homok, finom homok, iszap és agyag %-ban),  
— a lebeg ő szilárd anyag száraztömege g/l-ben, TOC koncentráció 
vagy égetés során fellép ő tömegcsökkenés mint a szervesanyag- 
tartalom mér őszáma,  
— pH,  
— oxigén vagy redoxpotenciál (csak abban az esetben kötelez ő, ha 
az aerob körülmények megléte nem nyilvánvaló).  
Tesztkörülmények:  
— a mintavétel és a laboratóriumi felhasználás között eltelt id ő, 
mintatárolás és a minta el őkezelése, a vizsgálatok kivitelezésének 
időpontja,  
— az alkalmazott vizsgálati anyag mennyisége, tesztkoncentráció és 
referenciaanyag,  
— a vizsgálati anyag alkalmazásának módszere, oldószer használata,  
— a használt felszíni víz és üledék (ha használjuk) térfogata, és az 
egyes időközönként analízisre levett minták térfogata,  
— az alkalmazott tesztrendszer leírása,  
ha a kivitelezés nem sötétben folyik, a szórt fényre vonatkozó infor ­
máció;  
— információ a steril kontrollok beállításának módszereir ől (pl. 
hőmérséklet, az autoklávozások ideje és száma),  
— inkubációs h őmérséklet,  
— információ az analitikai technikákról, a radiokémiai mérési 
módszerekr ől, a tömegkiegyenlítés ellen őrzésének és a fázismeg ­
oszlás mérésének (amennyiben használjuk) módszerér ől, 
— a párhuzamosok száma.  
Eredmények:  
— a visszanyerés százaléka (lásd 1.7.1. pont),  
— az alkalmazott analitikai módszer ismételhet ősége és érzékeny ­
sége, beleértve a mennyiségi meghatározási határt (LOD) és a 
mérhetőségi határt (LOQ) (lásd 1.7.2. pont),  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— az összes mért adat (beleértve a mintavételi id őpontokat) és 
számított érték táblázatos formában, a lebontási görbe minden 
egyes tesztkoncentrációra minden párhuzamosban, a logaritmikus ábrázolás meredekségének korrelációs koefficiense, a becsült lappangási fázis és az els őrendű vagy pszeudo-els őrendű sebes­
ségi állandó (ha lehet), és a megfelel ő lebontási felezési id ő 
(vagy féléletid ő, t
 50 ), 
— fontos értékek, mint az egyedi mintákból kapott eredmények 
átlagai, pl. a lappangási fázis hossza, lebontási sebességi állandó, 
lebontási felezési id ő (vagy t  50 ), 
— a rendszer nem adaptálódottként, vagy adaptálódottként történ ő 
kategorizálása a lebontási görbe lefutásából, vagy a tesztkoncent ­
ráció esetleges hatásából,  
— a végs ő anyagmérleg-ellen őrzés eredményei és a fázismegoszlás- 
mérések eredményei (ha vannak),  
— a mineralizálódott  14 C aránya és specifikus kémiai analízis hasz ­
nálata esetén az els ődleges biológiai lebontás végs ő szintje,  
— az alkalmazott és f ő transzformációs termékek azonosítása, 
moláris koncentrációja és százalékos aránya (lásd az 1.8.9.5. 
pont első bekezdése), ahol szükséges,  
— a transzformáció feltételezett lebontási útja, ahol szükséges,  
— az eredmények összegzése.  
4. IRODALOM  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test  
2. ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concent ­
rations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
3. Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
4. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determina ­
tion of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon 
(DOC).  
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the 
subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous 
medium.  
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment. No 22 (to be published summer 2000).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394–401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283.  
11. ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
1. melléklet  
A 14 C Fázismegoszlása  
Az eljárás ellen őrzéséhez a maradó teljes szerves  14 C aktivitás (TOA) rutinvizs ­
gálatait ki kell egészíteni a tömegkiegyenlítés-mérésekkel, amelyek magukban foglalják a képz ődő, abszorbenssel megkötött
 14 CO 2 direkt meghatározását is 
(lásd 3. melléklet). A pozitív  14 CO 2 termelődés önmagában közvetlen bizonyíték 
a biológiai lebontásra, szemben az abiotikus lebontással, vagy más anyagvesztési mechanizmussal, mint a volatilizáció és a szorpció. A biológiai lebontási visel ­
kedést jellemz ő hasznos többletinformáció nyerhet ő a részecskék membránsz ű­
réssel vagy centrifugálással történ ő eltávolítását követ ően, az oldat fázis (oldott 
szerves
 14 C aktivitás, DOA) és a szuszpenzió fázis (szuszpendált szerves  14 C 
aktivitás, POA) közötti TOA megoszlásának méréséb ől. A POA a mikrobiális 
biomasszára és más részecskékre kitapadt vizsgálati anyagból, és e mellett a 
vizsgálati anyag széntartalmának azon részéb ől áll, amely a szaporodó sejtek 
anyagának szintézisére fordítódik, és így beépül a szuszpendált biomassza frak ­
cióba. Az oldott  14 C szerves anyag képz ődése DOA-ként mérhet ő a biológiai 
lebontás végén (a degradáció-id ő görbe telítési szakasza).  
Számítsuk ki a maradó  14 C fázismegoszlását a kiválasztott, 0,22–0,45 μm-es 
szűrőkön átszűrt mintákban. A sz űrő anyaga nem adszorbeálhat jelent ősebb 
mennyiség ű vizsgálati anyagot (a polikarbonát filterek megfelel őek lehetnek). 
Ha a vizsgálati anyag szorpciója a filteren túl nagy mérték ű (a kísérletet megel ő­
zően tesztelni kell), használatát mell őzzük, helyette nagysebesség ű centrifugálás 
(2 000 g; 10 perc) használható.  
A szűrlettel vagy a centrifugált mintával járjunk el a 3. melléklet sz űretlen 
mintákra leírt módszere szerint. Oldjuk fel a membránfiltert a megfelel ő szcin­
tillációs folyadékban, és mérjük a beütésszámot a szokott módon, a kioltás 
korrigálására normálisan a küls ő standard-arány módszert, vagy mintaoxidálást 
használva. Ha centrifugálást használtunk, reszuszpendáljuk a részecskéket tartal ­
mazó fázist 1–2 ml desztillált vízben, és juttassuk szcintillációs üvegcsébe. Ezt követően mossuk még kétszer, 1–1 ml desztillált vízzel, és a mosóvizet is 
juttassuk az üvegcsébe. Ha szükséges, a folyadékszcintillációs méréshez a szusz ­
penzió gélbe is ágyazható.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
2. melléklet  
Félfolyamatos eljárás  
A nehezen bomló anyagok megfelel ő lebontásának eléréséhez meghosszabbított, 
több hónapos inkubáció is szükséges lehet. A tesztid őszak hossza normál esetben 
nem haladhatja meg a 60 napot, hacsak az eredeti vízminta jellemz őinek fenn ­
tartása nem a tesztszuszpenzió lecserélésével történik. Mindamellett a tesztperió ­
dust ki lehet terjeszteni maximum 90 napra a tesztszuszpenzió lecserélése nélkül is, ha a vizsgálati anyag lebontása az els ő 60 napon belül megkezd ődött.
 
Hosszú idej ű inkubáció során a mikrobiális populáció diverzitása különböz ő 
anyagvesztési mechanizmusok, valamint a vízminta alapvet ő ásványisó-tartal ­
mának és els ődleges széntartalmú szubsztrátjainak kimerülése miatt lecsökkenhet. 
A lassan bomló anyagok esetében a lebontási sebesség pontos meghatározásához ezért a félfolyamatos vizsgálat alkalmazása ajánlott. Ha az el őzetes tapasztalatok 
alapján a vizsgálati anyag 20 %-os lebontásának eléréséhez egy három hónapos 
inkubáció várható, a vizsgálatot a félfolyamatos eljárással kell el ősegíteni. A 
másik megoldás az lehet, hogy ha a vizsgálati anyag lebontása egymenetes körülmények között körülbelül 60 nap alatt nem történik meg, akkor a normál egymenetes vizsgálatot a félfolyamatos vizsgálatra váltjuk. A félfolyamatos 
eljárás is leállítható és egymenetes kísérletként folytatható, ha jellemz ő lebontás 
történik (pl. > 20 %).
 
A félfolyamatos vizsgálatban a vizsgálati szuszpenzió térfogatának körülbelül 
harmadát kéthetente a kiindulási koncentrációra beállított, vizsgálati anyaggal 
ellátott, frissen vett vízzel cseréljük le. Ha a választható lebeg ő üledék vizsgálatot 
hajtjuk végre, akkor üledéket adunk ugyanígy cserevízhez, a kezdeti koncentrá ­
ciót (0,01 és 1 g/l között) hozva létre. A lebeg ő üledék vizsgálat kivitelezése 
során fontos, hogy a rendszert teljesen felszuszpendáljuk a vízcseréhez is, vala ­
mint hogy a tartózkodási id őnek azonosnak kell lennie a szilárd anyagokra és a 
vízre, mivel egyébként a kívánt hasonlóságot a homogén vizes rendszerekkel elveszthetjük. Ezen okok miatt a félfolyamatos eljárás alkalmazása során a lebeg ő 
üledék kezdeti koncentrációjának a megadott intervallum alsó tartományába kell 
esnie.
 
A vizsgálati anyag el őírt hozzáadásába beleértend ő, hogy a vizsgálati anyag 
kezdeti koncentrációját a tesztszuszpenzió részleges megújításával nem lépjük túl, ennélfogva az adaptáció jelensége, ami a vizsgálati anyag magas koncentrá ­
cióinál gyakran fellép, kiküszöböl ődik. Mivel az eljárás mind re-inokulációval, 
mind a kimerül ő ásványi anyagok és els ődleges szubsztrátok pótlásával jár, a 
vizsgálat hossza alapjában véve korlátlanul megnyújtható. Fontos megjegyezni, hogy félfolyamatos eljárás alkalmazása esetén a vizsgálati anyag maradó koncent ­
rációját korrigálni kell az egyes cserék során hozzáadott és eltávolított vizsgálati 
anyag-mennyiséggel. A teljes és az oldott vizsgálati anyag-koncentráció a csekély 
mértékben adszorbeálódó vegyületek esetében felcserélhet ő egymással. A 
szorpció az adott körülmények között (0,1–1 g szilárd anyag/l) a log K
 ow < 3 
értékű (neutrális, lipofil vegyületekre érvényes) anyagokra vonatkozóan elhanya ­
golható (< 5 %). Ezt a következ ő számítási példán keresztül mutatjuk be. 0,1 g/l 
szilárd anyag durván 10 mg szénnek felel meg literenként (szénfrakció, f  C = 
0,01). Ha feltételezzük, hogy:  
Log K  ow (vizsgálati anyag) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Megoszlási koefficiens, K  d = f C × K  oc 
akkor a teljes koncentráció oldott frakciója (C-víz (C  w )/C-teljes (C  t ): 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
3. melléklet  
A 14 CO  2 meghatározása  
Indirekt  14 CO  2 meghatározás  
Rutinmérésekhez az indirekt módszer általában a legkevésbé id őigényes és 
legpontosabb módszer, ha a vizsgálati anyag nem illékony és nem alakul át 
illékony transzformációs termékekké. Egyszer űen juttassuk a sz űretlen mintákat, 
pl. 5 ml térfogatú szcintillációs üvegcsékbe. Kezdetben a megfelel ő aktivitás a 
mintákban 5 000 dpm–10 000 dpm (80–170 Bq), és a minimum kezdeti aktivitás kb. 1 000 dpm. Az egy-két csepp tömény H
 3 PO 4 -val vagy HCl-val pH 2–3-ra 
történő savanyítás után a CO  2 -t ki kell űzni a rendszerb ől. Ez kb. fél-egy órán át 
tartó leveg ő-átbuborékoltatással történhet. Más megoldásként az üvegcsék inten ­
zíven rázathatók 1–2 óráig (például mikrotányéros rázón), vagy óvatosabb rázatás mellett egy éjszakán keresztül. A CO
 2 kiűzésének hatásfokát ellen őrizni kell (a 
levegőztetés vagy a rázatási periódus meghosszabbításával). Ezután a vizes 
minták beütésszámának meghatározására alkalmas szcintillációs folyadékot adunk a rendszerbe, majd a minta vortexes homogenizálása után a radioaktivitás folyadék szcintillációs méréssel, a vizsgálat vakok (F
 B ) háttéraktivitásának kivo ­
násával meghatározható. Hacsak a tesztvíz nem nagyon színes, vagy nem 
tartalmaz nagy koncentrációban részecskéket, a minták rendes körülmények között egységes kioltást mutatnak, és elegend ő külső standard alkalmazásával 
kioltási korrekciót végezni. Ha a tesztvíz nagyon színes, a kioltási korrekciót 
belső standard hozzáadása révén szükséges kalkulálni. Ha részecske-koncentráció 
magas, nem mindig lehetséges homogén oldathoz vagy gélhez jutni, vagy nagy lehet a kioltás eltérése a minták között. Ilyen esetekben az alábbiakban bemuta ­
tott tesztzagy-mérési módszert kell alkalmazni. Ha a vizsgálat mint lebeg ő üledék 
vizsgálatot végezzük el, a
 14 CO 2 mérést indirekt módon kell elvégezni egy 
homogén 10 ml-es tesztvíz/szuszpenzió mintából, ahol a fázisokat megfelel ő 
sebességű (pl. 40 000 m/s  2 -en 15 percig) centrifugálással szeparáltuk. Ezután a 
vizes fázissal a fentiek szerint járunk el. A  14 C aktivitás mérése a lebeg ő részecs­
kéket tartalmazó fázisból (POA) úgy történik, hogy az üledéket kevés vízben 
reszuszpendáljuk, majd szcintillációs üvegcsékbe juttatjuk és szcintillációs folya ­
dékot adunk hozzá, hogy gél jöjjön létre (erre a célra speciális szcintillációs folyadékok szerezhet őek be). A részecskék természetét ől (pl. szervesanyag-tartal ­
muk) függ ően megvalósítható lehet a minták szövet-szolubilizálóval történ ő, egy 
éjszakán keresztüli emésztése, majd a szcintillációs folyadék hozzáadását megelőző vortexes homogenizálása. Más megoldásként a POA oxigénfelesleg ­
ben, mintaoxidálóval történ ő hevítés segítségével is meghatározható. A mérés 
során mindig használni kell bels ő standardokat, valamint szükséges lehet kioltási 
korrekciókat végrehajtani bels ő standard hozzáadásával, minden egyes egyedi 
mintára vonatkozóan.
 
Direkt  14 CO  2 meghatározás  
Ha a képz ődő 14 CO 2 -t közvetlenül mérjük, akkor a vizsgálat kezdetekor több 
lombikot kell beállítani, majd begy űjtéskor a vzsgálati lombikokat pH 2–3 közé 
kell savanyítani minden egyes mérési pontnál, és a  14 CO 2 -t fel kell fogni egy (a 
vizsgálat kezdetekor minden egyes vizsgálati lombikba behelyezett) bels ő vagy 
külső abszorberrel. Az abszorbeáló anyag lehet lúg (pl. 1 N NaOH oldat, vagy 
NaOH golyó), etanolamin vagy egy etanolamin-alapú, kereskedelmi forgalomból beszerezhet ő abszorber. A
 14 CO 2 direkt méréséhez a lombikokat le kell zárni pl. 
butilgumi szeptummal.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
1a. ábra  
Példa az adatok grafikus ábrázolására (maradó aktivitás az id ő függvényében)
  
1b. ábra  
Példa az adatok fél-logaritmikus ábrázolására (ln maradó aktivitás az id ő függvényében)
  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SP. NÖVEKEDÉSGÁTLÁSI VIZSGÁLATA  
1. MÓDSZER  
A módszer egyenérték ű az OECD TG 221 (2006) jel ű vizsgálatával 
(1). Az európai uniós hatóságok széles körben egyetértenek abban, hogy az er ősen színezett anyagok esetében a Lemna-vizsgálat 
megfelelő módon helyettesíti az algákon végzett vizsgálatot (2)(3).
 
1.1. BEVEZETÉS  
Ez a vizsgálati módszer különböz ő anyagok által a  Lemna  (békalen ­
cse) nemzetséghez tartozó édesvízi növényekre kifejtett toxikus hatás 
meghatározására szolgál. A módszer meglév ő iránymutatásokon (4) ­
(5)(6)(7)(8)(9) alapul, de azoktól több kulcsfontosságú kérdés tekin ­
tetében, a legfrissebb kutatási eredmények és szakmai egyeztetések 
figyelembevétele érdekében eltér. A javasolt módszer validálása 
nemzetközi körvizsgálattal (10) történt.  
A vizsgálati módszer  Lemna gibba  és Lemna minor  felhasználásával 
végzendő toxicitási vizsgálatot ír le; mindkét fajon számos vizs ­
gálatot végeztek, és a fent említett szabványosított vizsgálatok is ezekre vonatkoznak. A  Lemna  nemzetség rendszertana nehezen leír ­
ható, amit tovább bonyolít a létez ő fenotípusok nagy száma. Bár a  
Lemna  nemzetségben a genetikai eltérések a toxikus anyagokkal 
szembeni viselkedés változatosságát eredményezhetik, err ől a válto­
zóról egyel őre kevés adat áll rendelkezésre ahhoz, hogy az ismerte ­
tendő eljárás keretében konkrét klón használatát ajánlhassunk. 
Megjegyzend ő, hogy a vizsgálat nem steril körülmények között 
zajlik, de az eljárás egyes szakaszaiban er őfeszítéseket kell tenni 
annak érdekében, hogy más él ő szervezetek zavaró hatása a lehet ő 
legkisebb legyen.
 
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a vizsgálati oldat cseréjével 
végzett (félstatikus és átfolyásos) és a vizsgálati oldat cseréje nélkül 
végzett (statikus) vizsgálatokat. A vizsgálat céljától és a jogszabályi 
követelményekt ől függően a félstatikus és az átfolyásos vizsgálat 
alkalmazását például az oldatból gyorsan eltávozó (illékony, fény hatására lebomló, kicsapódó vagy biológiailag lebomló) anyagok 
esetén érdemes megfontolni. További iránymutatást a (11) irodalom 
tartalmaz.
 
1.2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Az eljárás alkalmazásában:  
Élőanyag-tömeg : a populációban lév ő élő anyag száraz tömege. A 
vizsgálat során az él őanyag-tömeg helyett jellemz ően helyettesít ő 
mennyiségeket, például levélszámot vagy levélterületet mérünk, és 
ezekre a helyettesít ő mennyiségekre is „él őanyag-tömegként” hivat ­
kozunk.  
Klorózis : a levélszövet sárgulása.  
Klón : egy adott egyedb ől ivartalan szaporodással létrejöv ő szervezet 
vagy sejt. Az azonos klónhoz tartozó egyedek tehát genetikai szem ­
pontból azonosak.  
Telep : egymáshoz kapcsolódó anya- és leánylevelek (általában 2–4) 
összessége. Néha növénynek is nevezik.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : a vizsgálati oldatban feloldott vizsgált anyag azon koncentrá ­
ciója, amely adott expozíciós id ő alatt a  Lemna  növekedésének x %- 
os (például 50 %-os) csökkenését okozza (az expozíciós id őt külön 
meg kell adni, ha eltér a vizsgálat rendes vagy teljes id őtartamától). 
Hogy egyértelm ű legyen, hogy az EC értékét a növekedési sebes ­
ségből vagy a kihozatalból nyertük-e, növekedési sebesség esetén 
„E r C”-t, kihozatal esetén „E  y C”-t írunk, majd ezt követ ően megadjuk 
a mérési változót, például: „E  r C (levélszám)”.  
Átfolyásos vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati 
oldatot folyamatosan cseréljük.  
Levél : a békalencse növény egyetlen különálló, „levélszer ű” struk­
túrája. Ez a szaporodásra képes legkisebb egység (egyed).  
Púposság : púpos vagy duzzadt megjelenést mutató levelek.  
Növekedés : a vizsgálat ideje alatt a mérési változóban (például a 
levélszámban, a száraz tömegben, a nedves tömegben vagy a levél ­
területben) bekövetkez ő növekedés.  
Növekedési sebesség  (átlagos fajlagos növekedési sebesség ): az 
élőanyag-tömeg logaritmikus növekedése az expozíciós id ő alatt.  
Észlelhet ő hatást okozó legkisebb koncentráció (LOEC) : az a 
legkisebb vizsgált koncentráció, amely mellett adott expozíciós id ő 
alatt az anyag statisztikailag szignifikáns mértékben (p < 0,05) csök ­
kenti a növekedést a kontrolltenyészethez képest. Az LOEC felett 
ugyanakkor minden koncentrációnak legalább akkora káros hatást 
kell eredményeznie, mint amelyet az LOEC okoz. Ha ez a két feltétel nem elégíthet ő ki, az LOEC (és így az NOEC) megválasztását rész ­
letesen indokolni kell.
 
Mérési változók : minden olyan változó, amelyet a vizsgálat 
végpontjának egy vagy több különböz ő hatásváltozó segítségével 
történő kifejezése érdekében mérünk. Ebben az eljárásban mérési 
változó a levélszám, a levélterület, a nedves tömeg és a száraz tömeg.
 
Monokultúra : egyetlen növényfajból álló tenyészet.  
Nekrózis : elhalt (például fehér vagy vízzel átitatott) levélszövet.  
Észlelhet ő hatást még nem okozó koncentráció (NOEC) : az a vizs ­
gált koncentráció, amely közvetlenül az LOEC alatt helyezkedik el.  
Fenotípus : az élőlény észlelhet ő, génjei és a környezet kölcsönhatása 
által meghatározott jellemz ői. 
Hatásváltozók : a toxikus hatás becslésére szolgáló, az él őanyag- 
tömeget leíró mérési változókból különböz ő számítási módszerekkel 
származtatott változók. Ebben az eljárásban hatásváltozó a növeke ­
dési sebesség és a kihozatal, amelyeket a levélszámból, a levélterü ­
letből, a nedves tömegb ől és a száraz tömegb ől mint mérési válto ­
zókból származtatunk.  
Félstatikus (oldatcserés) vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során 
a vizsgálati oldatot bizonyos id őközönként lecseréljük.  
Statikus vizsgálat : olyan vizsgálat, amelynek során a vizsgálati 
oldatot nem cseréljük le.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
A vizsgálat végpontja : az az általános jellemz ő, amelyre a vizsgálat 
irányul, és amely a vizsgált vegyület hatására a kontrolltenyészethez 
képest megváltozik. Ebben az eljárásban a vizsgálat végpontja a növekedésgátlás, amely különböz ő, egy vagy több mérési változóból 
származtatott hatásváltozók segítségével fejezhet ő ki.
 
Vizsgálati oldat : az a teljes, szintetikus tápoldat, amelyben a vizsgált 
növények a vizsgált anyag jelenlétében növekednek. A vizsgált 
anyag általában oldott formában van jelen a vizsgálati oldatban.  
Kihozatal : az élőanyag-tömeget leíró mérési változó értéke az expo ­
zíciós idő végén, mínusz ugyanezen változó értéke az expozíciós id ő 
kezdetén.  
1.3. A VIZSGÁLAT ELVE  
Exponenciálisan növeked ő, a Lemna  nemzetséghez tartozó növény ­
tenyészeteket monokultúraként hét napig növekedni hagyunk a vizs ­
gált anyag különböz ő koncentrációinak jelenlétében. A vizsgálat 
célja: a vizsgálat id őtartama alatt a vizsgált anyag vegetatív növeke ­
désre gyakorolt hatásának számszer ű kifejezése alkalmasan 
megválasztott mérési változók értékelése alapján. Els ődleges mérési 
változóként a levélszám szolgál. Emellett legalább még egy mérési 
változót (a levelek összterületét, a száraz tömeget vagy a nedves tömeget) is mérni kell, mert bizonyos anyagok más mérési változókat sokkal inkább befolyásolnak, mint a levélszámot. A vizsgált anyag 
hatásainak számszer ű kifejezése érdekében a vizsgálati oldatban 
bekövetkez ő növekedést összehasonlítjuk a kontrolltenyészetben 
bekövetkez ő növekedéssel, és meghatározzuk azt az EC
 x (például 
EC 50 ) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) 
növekedésgátlást idéz el ő. 
A vizsgálat végpontjaként a növekedésgátlás szolgál, amelyet a 
mérési változóban az expozíciós id ő alatt bekövetkez ő logaritmikus 
növekedéssel (az átlagos fajlagos növekedési sebességgel) fejezünk 
ki. A vizsgálati oldatokra egyenként kiszámított átlagos fajlagos 
növekedési sebességek alapján meghatározzuk azt az E  r C x (például 
E r C 50 ) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) 
növekedésgátlást idéz el ő. 
Az eljárás másik hatásváltozója a kihozatal, amelyre bizonyos 
országok esetében a jogszabályi követelmények teljesítéséhez lehet 
szükség. A kihozatal a mérési változóknak az expozíciós id ő végén 
érvényes értéke és az expozíciós id ő kezdetén érvényes értéke 
közötti különbséget jelenti. A vizsgálati oldatokra egyenként kiszá ­
mított kihozatalok alapján meghatározzuk azt az E  y C x (például 
E y C 50 ) koncentrációt, amely egy adott x %-os (például 50 %-os) 
növekedésgátlást idéz el ő. 
Statisztikai eljárással meghatározható továbbá az észlelhet ő hatást 
okozó legkisebb koncentráció (LOEC) és az észlelhet ő hatást még 
nem okozó koncentráció (NOEC) értéke is.  
1.4. A VIZSGÁLT ANYAG ADATAI  
Rendelkezésre kell állnia egy olyan analitikai eljárásnak, amellyel a 
vizsgálati oldatban lév ő anyag mennyisége kell ő pontossággal 
meghatározható.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
A vizsgálati körülmények rögzítése érdekében célszer ű lehet tájéko ­
zódni többek között a vizsgált anyag szerkezeti képletér ől, tisztaságá ­
ról, vízben való oldhatóságáról, vízben és fény hatására tanúsított stabilitásáról, pK
 a és K  ow értékéről, gőznyomásáról és biológiai 
lebonthatóságáról. A vízben való oldhatóságból és a g őznyomásból 
meghatározható a Henry-állandó, amely megmutatja, mennyire kell 
arra számítani, hogy a vizsgálat során a vizsgált anyag jelent ős 
mennyiségben eltávozik. Ennek alapján eldönthet ő, kell-e külön 
gondoskodni az így adódó veszteségek ellensúlyozásáról. Ha a vizs ­
gált anyag oldhatóságára és stabilitására vonatkozó információk 
bizonytalanok, célszer ű ezeket a vizsgálat körülményei, azaz a vizs ­
gálati oldat, h őmérséklet és fényviszonyok mellett meghatározni.  
Ha különösen fontos a vizsgálati oldat pH-értékének szabályozása, 
például könnyen hidrolizálódó fémek vagy egyéb anyagok vizsgálata esetén, akkor ajánlatos a vizsgálati oldatot pufferrel kiegészíteni (lásd 
az 1.7.4. szakasz els ő bekezdését). A (11) irodalom további irány ­
mutatást ad olyan anyagok vizsgálatához, amelyek fizikai-kémiai jellegzetességeiknél fogva nehezen vizsgálhatók.
 
1.5. REFERENCIAANYAG  
A vizsgálati eljárás referenciaanyag(ok), mint például a nemzetközi 
körvizsgálatban (10) alkalmazott 3,5-diklór-fenol segítségével ellen ­ 
őrizhető. Referenciaanyaggal legalább évente kétszer (ha ennél 
ritkábban végzünk vizsgálatot, akkor a vizsgált anyag toxicitásának 
meghatározásával párhuzamosan mindig) ajánlott vizsgálatot végezni.  
1.6. A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
A vizsgálat akkor érvényes, ha a kontrolltenyészetben a levélszám 
megkettőződési ideje 2,5 napnál (60 óránál) kisebb, ami hét nap alatt 
körülbelül hétszeres növekedést, illetve 0,275 1/nap átlagos fajlagos növekedési sebességet jelent. A jelen módszerben ismertetett vizs ­
gálati oldat és vizsgálati körülmények alkalmazása esetén ez a 
feltétel statikus vizsgálattal kielégíthet ő (8). Várható, hogy a feltétel 
félstatikus és átfolyásos vizsgálat esetén is kielégíthet ő. A megkett ő­
ződési idő számítását a 2.1. szakasz ismerteti.
 
1.7. A MÓDSZER LEÍRÁSA  
1.7.1.  Eszközök  
Minden, a vizsgálati oldattal érintkez ő eszköz üvegb ől vagy más, 
kémiailag semleges anyagból legyen. A tenyésztés és a vizsgálat céljára felhasznált üvegeszközök sterilek legyenek, és meg kell 
őket tisztítani minden olyan kémiai szennyez ődéstől, amely a vizs ­
gálati oldatba bemosódhatna. A vizsgálati edények legyenek kell ően 
szélesek ahhoz, hogy a kontrolltenyészetekben a különböz ő telepek 
levelei a vizsgálat végéig átfedésmentesen növekedhessenek. Nem 
jelent problémát, ha a gyökér az edény alját éri, de ajánlatos legalább 
20 mm mélység ű és legalább 100 ml térfogatú vizsgálati edényeket 
alkalmazni. Ha ezek a feltételek teljesülnek, a vizsgálati edények megválasztása nem kritikus. A korábbiakban a kell ő méretű üveg 
főzőpoharak, kristályosító tégelyek és üveg Petri-csészék egyaránt 
alkalmasnak bizonyultak. A vizsgálati edényeket a párolgás és a véletlen szennyez ődések megakadályozása érdekében le kell fedni 
oly módon, hogy a leveg ő cserélődhessen. A vizsgálati edény, külö ­
nösen pedig a fed ő lehetőleg ne keltsen árnyékot vagy okozza a fény 
spektrális jellemz őinek módosulását.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
A tenyészeteket és a vizsgálati edényeket ne tartsuk együtt. A 
legjobb megoldás, ha külön környezeti növeszt őkamrákat, inkubáto ­
rokat vagy helyiségeket veszünk igénybe. A fényviszonyok és a hőmérsékletek szabályozhatók legyenek, és állandó szinten kell 
őket tartani (lásd az 1.7.8. szakaszt).
 
1.7.2.  Vizsgált szervezet  
A vizsgálat során  Lemna gibba  vagy  Lemna minor  egyedeket kell 
használni. A toxicitási vizsgálatokhoz korábban már felhasznált 
békalencsefajok rövid leírását az 1. függelék adja meg. A növény ­
anyag törzsgy űjteményből, más laboratóriumból vagy a terepr ől 
nyerhető. A terepr ől származó növényanyag tenyészetét felhasználás 
előtt legalább nyolc hétig a vizsgálat során alkalmazandóval 
megegyez ő tápoldatban kell tartani. A tenyészet kialakításához a 
növényanyagot nyilvánvaló szennyez ődéstől mentes helyszínr ől kell 
begyűjteni. A más laboratóriumból vagy törzsgy űjteményből szár­
mazó növényanyagot legalább három hétig kell hasonló körülmények 
között tartani. A mérési jegyz őkönyvben mindig rögzíteni kell a 
növényanyag eredetét és a vizsgálathoz felhasznált fajt és klónt (ha ismert).
 
Olyan monokultúrát használjunk, amelyet más él ő szervezetek, 
például algák vagy egysejt űek szemmel érzékelhet ő módon nem 
szennyeznek. Az egészséges  L. minor  növények kett ő–öt levélb ől 
állnak, míg a  L. gibba  egészséges telepei akár hét levelet is tartal ­
mazhatnak.  
A vizsgálat során felhasznált növények min ősége és egységessége 
jelentősen befolyásolja a vizsgálat eredményeit, ezért megválasztásuk 
során kell ő gondossággal kell eljárni. Fiatal, gyorsan növekv ő, 
látható sérülést ől és fakulástól (klorózistól) mentes egyedeket kell 
felhasználni. A jó min őségű tenyészetet az jellemzi, hogy nagy 
arányban tartalmaz legalább két levélb ől álló telepeket. A sok egye ­
dülálló levél kedvez őtlen környezeti körülményekre, például 
tápanyaghiányra utal, ezért ilyen tenyészetekb ől vett egyedeket 
nem szabad a vizsgálatban felhasználni.  
1.7.3.  Tenyésztés  
Az átoltás gyakoriságának csökkentése érdekében (például ha egy 
ideig előreláthatóan nem végzünk  Lemna -vizsgálatokat) a tenyészet 
csökkentett fényviszonyok mellett és h őmérsékleten (4–10 °C) tart ­
ható. A tenyésztés körülményeit részletesen a 2. függelék ismerteti. Ha olyan nyilvánvaló jeleket figyelünk meg, amelyek algák vagy 
más élő szervezetek okozta szennyez ődésre utalnak, akkor a  
Lemna -levelek egy részét felületi sterilizálásnak kell alávetni, majd 
másik oldatba kell áthelyezni (lásd a 2. függeléket), a fennmaradó szennyezett tenyészetet pedig hulladékként el kell távolítani.
 
A vizsgálatok el őtt legalább hét nappal elegend ő mennyiség ű telepet 
csíramentesen friss, steril oldatba kell áthelyezni, majd hét–tíz napon át a vizsgálatnak megfelel ő körülmények között tartani.
 
1.7.4.  Vizsgálati oldat  
Lemna minor  és Lemna gibba  esetén eltér ő oldatot ajánlott alkal ­
mazni az alábbiak szerint. Kell ő körültekintéssel meg kell fontolni 
pH-puffer alkalmazását a vizsgálati oldatban (MOPS (4-morfolinpro ­
pánszulfonsav, CAS-szám: 1132–61–2; EINECS-szám: 214–478–5 a  
L. minor  és NaHCO  3 a L. gibba  vizsgálati oldatában), ha gyanítható, 
hogy az oldat reakcióba léphet a vizsgált anyaggal és befolyásolhatja 
a toxikus hatást. Az érvényességi kritériumok betartása mellett Stein ­
berg-féle tápoldat (12) is alkalmazható.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
A L. minor  tenyésztése és vizsgálata során a svéd szabvány (SIS) 
szerinti  Lemna -tápoldat módosított változatát ajánlott alkalmazni. E 
tápoldat összetételét a 3. függelék ismerteti.  
A L. gibba  tenyésztése és vizsgálata során a 3. függelék szerinti 
20X–AAP tápoldatot ajánlott alkalmazni.  
A 3. függelék szerinti Steinberg-féle tápoldat ugyancsak alkalmas  L. 
minor  esetén, és az érvényességi kritériumok betartása mellett  L. 
gibba  esetén is alkalmazható.  
1.7.5.  Vizsgálati oldatok  
A vizsgálati oldatokat általában törzsoldat hígításával állítjuk el ő. A 
vizsgált anyag törzsoldatait általában úgy készítjük, hogy az anyagot tápoldatban feloldjuk.
 
A vizsgált anyag legnagyobb vizsgálati koncentrációja általában ne 
haladja meg az anyag vizsgálati körülmények között érvényes vízben 
való oldhatóságát. Megjegyzend ő azonban, hogy a  Lemna  nemzetség 
egyedei a víz felszínén úsznak, ezért olyan anyagok hatásának is ki lehetnek téve, amelyek jellemz ően a víz és a leveg ő határfelületén 
fordulnak el ő (például vízben nehezen oldódó vagy víztaszító anya ­
gok, felületaktív anyagok). Ilyenkor az expozíció nem a vizsgálati 
oldatban lév ő anyag következtében áll el ő, és a vizsgálati koncent ­
ráció a vizsgált anyag jellemz őitől függően meghaladhatja a vízben 
való oldhatóságot. Vízben kismértékben oldódó vizsgált anyag esetén 
szükséges lehet szerves oldó- vagy diszpergálószer alkalmazásával 
nagy koncentrációjú törzsoldatot vagy -diszperziót készíteni annak érdekében, hogy könnyebb legyen a vizsgálati anyagból a pontos mennyiséget a vizsgálati oldathoz adagolni, és könnyebben végbe ­
menjen az oldódás vagy a diszperzióképz ődés. Ilyen anyag alkalma ­
zását lehet őség szerint kerülni kell. A segédoldószer vagy -diszper ­
gálószer alkalmazása nem járhat fitotoxikus hatással. A széles körben alkalmazott oldószerek közül például az aceton vagy a dimetil- 
formamid 100 μl/l koncentrációig nem okoz fitotoxikus hatást. Az 
esetleg alkalmazott oldó- vagy diszpergálószer végs ő koncentrációja 
– amelyet a mérési jegyz őkönyvben rögzíteni kell – a lehet ő legki­
sebb legyen (legfeljebb 100 μl/l), és az oldó- vagy diszpergálószert a 
vizsgálathoz és a kontrolltenyészet esetében azonos koncentrációban 
kell alkalmazni. A (11) irodalom b ővebb iránymutatást ad a disz ­
pergálószerekre vonatkozóan.
 
1.7.6.  Vizsgálati csoportok és kontrollcsoportok  
A vizsgált anyag  Lemna -fajokra gyakorolt toxikus hatásának el őzetes 
ismerete alapján, amely származhat például koncentrációtartomány- 
meghatározási vizsgálatból, megválaszthatók az alkalmas vizsgálati 
koncentrációk. A végleges toxicitási vizsgálatnak általában öt, egymással mértani sorozatot alkotó vizsgálati koncentrációra kell kiterjednie. A koncentrációk sorozatának hányadosa általában ne 
legyen 3,2-nél nagyobb, de lapos koncentráció–hatás görbe esetén 
ennél nagyobb érték lehet indokolt. Ötnél kevesebb koncentráció alkalmazását indokolni kell. Minden koncentrációval legalább három párhuzamos tenyészetet kell megvizsgálni.
 
A vizsgálati koncentrációk tartományának kijelölése során (akár a 
koncentrációtartomány-meghatározási vizsgálatot, akár a végleges 
vizsgálatot megel őzően) a következ őket célszer ű megfontolni.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— EC  x meghatározása esetén a kell ő konfidenciaszint biztosítása 
érdekében a vizsgálati koncentrációknak közre kell fogniuk az 
EC x értékét. Ha például az EC  50 értéket kívánjuk meghatározni, 
akkor a legnagyobb vizsgálati koncentrációnak nagyobbnak kell lennie EC
 50 -nél. Ha az EC  50 kívül esik a vizsgálati koncentrációk 
tartományán, akkor a kiadódó konfidenciaintervallumok szélesek 
lesznek, és el őfordulhat, hogy nem végezhet ő el a modell statisz ­
tikai illesztése.  
— LOEC és/vagy NOEC meghatározása esetén a legkisebb vizs ­
gálati koncentráció legyen elegend ően kicsiny ahhoz, hogy a 
növekedési sebesség ne legyen jelent ősen kisebb, mint a kont ­
rollcsoportban. A legnagyobb koncentráció ugyanakkor legyen elegendően nagy ahhoz, hogy a növekedési sebesség jelent ősen 
kisebb legyen, mint a kontrollcsoportban. Ha ez nem teljesül, a 
vizsgálatot más koncentrációtartománnyal meg kell ismételni (kivéve akkor, ha a legnagyobb koncentráció megegyezik az oldhatósági határral vagy az el őírt maximális határkoncentráció ­
val, például 100 mg/l-rel).
 
Az egyes vizsgálatok mellett kontrolltenyészeteket is kell vizsgálni a 
vizsgálati edényekével megegyez ő táptalaj, levél- és telepszám, 
környezeti körülmények és eljárások alkalmazásával, de a vizsgált 
anyag nélkül. Segédoldószer vagy -diszpergálószer alkalmazása esetén egy további kontrolltenyészet is szükséges, amelyben az oldó- vagy diszpergálószer azonos koncentrációban van jelen, mint 
a vizsgálati edényekben. Legalább a koncentrációnként alkalmazott 
edényszámmal megegyez ő, ideális esetben kétszer annyi párhuzamos 
kontrolltenyészetet (illet őleg szükség szerint oldószeres edényt) kell 
alkalmazni.
 
Ha nem kívánjuk meghatározni az NOEC értékét, a vizsgálati terv 
módosítható oly módon, hogy több koncentrációt, de koncentráción ­
ként kevesebb párhuzamos tenyészetet tartalmazzon. A párhuzamos kontrolltenyészetek száma azonban ilyenkor is legalább három 
legyen.
 
1.7.7.  Expozíció  
Kettő–négy látható levélb ől álló telepeket a kiindulási tenyészetb ől 
csíramentesen a kísérleti edényekbe helyezünk, véletlenszer űen 
elosztva. A kísérleti edényekbe egyenként összesen 9–12 levél kerül ­
jön. Minden kísérleti edényben azonos számú levél és telep legyen. 
A módszer alkalmazása és a körvizsgálat során szerzett tapasztalatok azt mutatják, hogy a készítmények közötti, a növekedési sebesség alapján meghatározott növekedésgátlás 4–7 %-os értékének (a kiho ­
zatal alapján meghatározott növekedésgátlás 10–15 %-os értékének) 
megfelelő nagyságú növekedéskülönbség kimutatásához elegend ő, ha 
készítményenként három párhuzamos tenyészetet és edényenként 9–12 kiindulási levelet alkalmazunk (10).
 
Az inkubátorban a kísérleti edényeket véletlenszer ű elrendezésben 
kell elhelyezni annak érdekében, hogy a fényer ősség és a h őmér­
séklet térbeli változatossága minél kisebb hatást gyakoroljon a vizs ­
gálatokra. A megfigyelések végzésekor (vagy gyakrabban) az 
edényeket véletlenszer űen vagy blokkonkénti kiosztási terv alapján 
át kell rendezni.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Ha az el őzetesen elvégzett stabilitásvizsgálatok azt jelzik, hogy a 
vizsgált anyag koncentrációja a vizsgálat id őtartama (7 nap) alatt 
nem tartható fenn (azaz a mért koncentráció a kezdeti mért koncent ­
ráció 80 %-a alá csökken), akkor félstatikus vizsgálatot ajánlatos végezni. Ennek keretében a telepeket a vizsgálat során legalább két 
alkalommal (a 3. és az 5. napon) friss vizsgálati és kontrolloldatokba 
kell helyezni. A friss oldatba helyezés gyakorisága a vizsgált anyag stabilitásától függ; nagymértékben instabil vagy illékony anyagok esetén a közel állandó koncentráció fenntartása gyakoribb oldatcserét 
igényelhet. Bizonyos esetekben átfolyásos vizsgálatot célszer ű 
végezni (11)(13).
 
Ez az eljárás nem tartalmazza a levélre történ ő felvitellel (permete ­
zéssel) megvalósuló expozíciót; err ől lásd a (14) irodalmat.  
1.7.8.  Inkubációs körülmények  
Folyamatos meleg- vagy hidegfehér fluoreszcens megvilágítást alkal ­
mazzunk oly módon, hogy a fotoszintetikusan aktív sugárzásban (400–700 nm), a fényforrástól a  Lemna -levelekkel megegyez ő távol­
ságban lév ő pontokban mért fényintenzitás a 85–135 μE/m
 2 s tarto­
mányban el őzetesen felvett értéknek feleljen meg (ez 6 500–10 000 
lux értéket jelent). A vizsgálat területén a fényintenzitás az el őze­
tesen felvett értékt ől legfeljebb ±15 %-kal térhet el. A fényer ősség 
érzékelésére és mérésére szolgáló módszer, különösen pedig a fény ­
érzékelő befolyásolja a mért értéket. A gömbérzékel ők (amelyek a 
mérési sík alatt és felett tetsz őleges irányból érkez ő fény mérésére 
alkalmasak) és a „koszinuszos” érzékel ők (amelyek csak a mérési sík 
felett tetsz őleges irányból érkez ő fény mérésére alkalmasak) 
előnyben részesítend ők az egytengely ű érzékelőkkel szemben, mert 
a jelen módszerben el őírt többpontos fényforrás esetén nagyobb érté ­
keket szolgáltatnak.  
A vizsgálati edényekben a h őmérséklet 24 ± 2 °C legyen. A vizs ­
gálat során a kontrolltenyészet tápoldatának pH-értéke nem növe ­
kedhet 1,5-nél nagyobb mértékben. Az 1,5-nél nagyobb eltérés 
ugyanakkor nem teszi érvénytelenné a vizsgálatot, ha kimutatható, hogy az érvényességi feltételek teljesülnek. A pH-érték eltolódása egyes különleges esetekben, például instabil anyag vagy fém vizs ­
gálata esetén fokozott körültekintést tesz szükségessé. További irány ­
mutatást a (11) irodalom tartalmaz.
 
1.7.9.  A vizsgálat id őtartama  
A vizsgálat a növények vizsgálati edényekbe helyezése után 7 nappal 
fejeződik be.  
1.7.10.  Mérések és analitikai vizsgálatok  
A vizsgálat kezdetén meg kell számlálni a vizsgálati edényekben 
lévő leveleket, és az értéket fel kell jegyezni a mérési jegyz őkönyv­
ben; a számlálás során ügyelni kell arra, hogy a kiálló, vizuálisan elkülönül ő leveleket vegyük figyelembe. A szabályszer űnek vagy 
rendellenesnek t űnő levelek számát a vizsgálat kezdetén, az expo ­
zíció időtartama alatt legalább háromnaponta (azaz a hét nap során 
legalább kétszer), valamint a vizsgálat végén kell meghatározni. Fel kell jegyezni a növények fejl ődésében beálló változásokat, például a 
levélméret vagy a megjelenés változásait, a nekrózisra, a klorózisra 
vagy a púposságra utaló jeleket, a telepek felbomlását vagy az úszó ­
képesség megsz űnését, a gyökerek hosszának vagy megjelenésének 
megváltozását. Fel kell továbbá jegyezni a vizsgálati oldat jellegze ­
tességeit (például oldatlan anyag jelenléte, algaképz ődés a vizsgálati 
edényben) is.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
A vizsgálat során a levélszám mellett a vizsgált anyagnak a követ ­
kező mérési változók közül legalább egy továbbira gyakorolt hatását 
is meg kell határozni:  
i. a levelek összterülete;  
ii. száraz tömeg;  
iii. nedves tömeg.  
A levelek összterülete azért el őnyös mérési változó, mert a vizsgálat 
kezdetén, folyamán és végén minden vizsgálati és kontrolltenyészetre külön-külön meghatározható. A száraz és a nedves tömeget a vizs ­
gálat elején a vizsgálatban alkalmazandó kiindulási tenyészet szem ­
pontjából reprezentatív mintán, majd a vizsgálat végén az egyes vizsgálati és kontrolltenyészetek növényanyagán kell meghatározni. Ha a levélterületet nem mérjük, a száraz tömeg mérését el őnyben 
kell részesíteni a nedves tömeg mérésével szemben.
 
A levelek összterülete, a száraz tömeg és a nedves tömeg a követ ­
kezőképpen határozható meg:  
i. A levelek összterülete. A telepekben el őforduló levelek összterü ­
lete meghatározható képelemzés segítségével. Videokamerával (például az edényt világító testre helyezve) rögzíthet ők a vizs­
gálati edény és a növények körvonalai, majd a kiadódó kép 
digitalizálható. Ismert terület ű síkidomokhoz hasonlítva meghatá ­
rozható a vizsgálati edényekben lév ő levelek összterülete. Kell ő 
gondossággal ki kell küszöbölni a vizsgálati edény pereme miatti zavarás hatását. Másik, munkaigényesebb lehet őség, ha a vizs ­
gálati edényeket és a növényeket lefényképezzük, a kiadódó 
körvonalak mentén kivágjuk az alakokat, majd levélterület-elem ­
zővel vagy milliméterpapíron meghatározzuk a levélterületet. 
Egyéb technikák (például a papírból kivágott terület egységnyi 
területű idomokhoz hasonlítása a tömegek összevetése alapján) 
ugyancsak megoldást jelenthetnek.
 
ii. Száraz tömeg. A telepeket összegy űjtjük a vizsgálati edényekb ől, 
desztillált vagy ionmentesített vízzel leöblítjük őket, leitatjuk a 
felesleges vizet, és a telepeket 60 °C-on tömegállandóságig hevít ­
jük. A kapcsolódó gyökereket nem távolítjuk el. A száraz tömeget legalább 0,1 mg pontossággal kell kifejezni.
 
iii. Nedves tömeg. A telepeket el őzetesen megmért tömeg ű, kerek 
aljukon kis (1 mm-es) lyukakkal ellátott polisztirol (vagy más kémiailag semleges anyagból készült) csövekbe helyezzük. A csöveket ezt követ ően 3 000 1/perc fordulatszámon, szobah őmér­
sékleten 10 percig centrifugáljuk. Megmérjük a most már szárí ­
tott telepeket tartalmazó csövek tömegét, és a nedves tömeget az üres csövek tömegének levonásával nyerjük.
 
1.7.10.1.  A mérések és az analitikai vizsgálatok gyakorisága  
Statikus vizsgálat esetén a vizsgálat elején és végén megmérjük az 
egyes készítmények pH-értékét. Félstatikus vizsgálat esetén a pH- 
értéket minden oldatcsere alkalmával meghatározzuk mind a friss, 
mind az elhasznált oldaton.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
A fényintenzitást a növeszt őkamrában, az inkubátorban vagy a vizs ­
gálati helyiségben a fényforrástól a  Lemna -levelekkel megegyez ő 
távolságban elhelyezked ő pontokban mérjük. Fényintenzitást a vizs ­
gálat során legalább egyszer kell mérni. A növeszt őkamrában, az 
inkubátorban vagy a vizsgálati helyiségben azonos körülmények 
között külön erre a célra tartott edényben legalább naponta mérjük 
a tápoldat h őmérsékletét.  
A vizsgálat során alkalmas id őközönként meg kell határozni a vizs ­
gált anyag koncentrációját. Statikus vizsgálat esetén a koncentrációt legalább a vizsgálat elején és végén kell meghatározni.
 
Félstatikus vizsgálat esetén, ha a vizsgált anyag koncentrációja 
várhatóan nem marad a névleges koncentráció ± 20 %-os környe ­
zetében, akkor minden friss vizsgálati oldatot elkészítésekor, 
továbbá minden lecserélt oldatot analitikai vizsgálatnak kell 
alávetni (lásd az 1.7.7. szakasz harmadik bekezdését). Olyan vizs ­
gálatok esetén ugyanakkor, amelyekben a vizsgált anyag mért kezdeti koncentrációja ugyan nem a névleges koncentráció ± 
20 %-os környezetében van, de adatokkal kell ően bizonyítható, 
hogy a kezdeti koncentrációk megismételhet ők és stabilak (azaz 
a kezdeti koncentráció 80–120 %-os környezetében vannak), akkor az analitikai vizsgálatokat elegend ő csak a legkisebb és a 
legnagyobb vizsgálati koncentráción elvégezni. Az oldatcsere el őtt 
a vizsgált anyag koncentrációját minden esetben elegend ő vizs­
gálati koncentrációnként egy párhuzamos oldaton (vagy az edények párhuzamos tenyészetenként egyesített tartalmán) elvégezni.
 
Átfolyásos vizsgálat esetén a félstatikus vizsgálathoz hasonló rend ­
ben, így a vizsgálat elején, felénél és végén kell mintákat venni, de 
ilyenkor nincs értelme az „elhasznált” oldat vizsgálatának. Átfo ­
lyásos vizsgálat esetén naponta ellen őrizni kell az oldószer és a vizs ­
gált anyag vagy a vizsgált anyag törzsoldata adagolási sebességét.  
Ha kimutatható, hogy a vizsgált anyag koncentrációját a vizsgálat 
időtartama alatt sikerült a névleges vagy a mért kezdeti koncentráció 
± 20 %-os környezetében tartani, akkor az eredmények a névleges 
vagy mért kezdeti értékek alapján elemezhet ők. Ha a névleges vagy 
a mért kezdeti koncentrációtól való eltérés meghaladja a ± 20 %-ot, akkor az eredményeket az expozíció idején érvényes koncentráció ­
értékek mértani középértéke vagy a vizsgált anyag koncentrációjának 
csökkenését leíró modellek alapján kell elemezni (11).
 
1.7.11.  Határérték-vizsgálat  
Egyes esetekben, például ha el őzetesen elvégzett vizsgálatok azt 
jelzik, hogy a vizsgált anyag 100 mg/l koncentrációig vagy az 
adott vizsgálati oldatban való oldhatósági határig (a kett ő közül a 
kisebbikig) nem okoz toxikus hatást, akkor egy kontrollcsoport és egyetlen (100 mg/l koncentrációnak vagy az adott vizsgálati oldatban 
való oldhatósági határhoz tartozó koncentrációnak megfelel ő) expo­
zíciónak kitett csoport összehasonlításával úgynevezett határérték- vizsgálat végezhet ő. A vizsgálat során fokozottan ajánlatos elemezni 
az expozíció koncentrációját. A határérték-vizsgálat során biztosítani 
kell valamennyi fent leírt vizsgálati körülmény fennállását és érvé ­
nyességi feltétel teljesülését azzal az eltéréssel, hogy kétszer annyi párhuzamos készítményt kell vizsgálni. A kontrollcsoportban és az expozíciónak kitett csoportban tapasztalt növekedés olyan statisztikai 
próbával (például a Student-féle t-próbával) elemezhet ő, amely a 
középértékek összehasonlításán alapul.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
2.1. MEGKETT ŐZŐDÉSI IDŐ 
A vizsgálat során a levélszám megkett őződéséhez szükséges T  d idő 
meghatározásához és az erre vonatkozó érvényességi feltétel (lásd az 
1.6. szakaszt) ellen őrzéséhez a kontrolltenyészetek adataira a követ ­
kező összefüggést kell alkalmazni:  
T d = ln 2/μ, 
ahol μ a 2.2.1. szakasz els ő és második bekezdése szerint meghatá ­
rozott átlagos fajlagos növekedési sebesség.  
2.2. HATÁSVÁLTOZÓK  
A vizsgálat célja annak meghatározása, milyen hatást gyakorol a 
vizsgált anyag a  Lemna -telepek vegetatív növekedésére. Ez a vizs ­
gálati módszer két hatásváltozót tartalmaz, mert a tagállamok igényei 
és a tagállamokban érvényes szabályozás eltér ő. Hogy a vizsgálati 
eredmények valamennyi tagállamban elfogadhatók legyenek, a hatást mindkét alábbi hatásváltozó alapján meg kell határozni:
 
a) átlagos fajlagos növekedési sebesség: ezt a hatásváltozót a levél ­
szám logaritmusának, valamint egy további mért paraméter (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) loga ­
ritmusának napi változása alapján számítjuk a kontrolltenyészetek 
és az egyes expozíciónak kitett tenyészetek figyelembevételével. Ezt a mennyiséget relatív növekedési sebességnek is nevezik (15);
 
b) kihozatal: ezt a hatásváltozót a levélszám, valamint egy további 
mért paraméter (a levelek összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) értékének napi változása alapján számítjuk a kont ­
rolltenyészetek és az egyes expozíciónak kitett tenyészetek figye ­
lembevételével.
 
Megjegyzend ő, hogy a két hatásváltozó alapján számított toxicitás ­
értékek nem hasonlíthatók egymáshoz, és a vizsgálatok eredménye ­
inek felhasználása során erre a különbségre tekintettel kell lenni. A jelen vizsgálati módszerben el őírt vizsgálati körülmények betartása 
mellett a két számítási eljárás matematikai háttere következtében az 
átlagos fajlagos növekedési sebességen alapuló EC
 x értékek (E  r C x ) 
általában nagyobbra adódnak, mint a kihozatalon alapuló EC  x 
értékek (E  y C x ). Ezt az eltérést nem szabad úgy értelmezni, hogy 
egyik hatásváltozó érzékenyebb lenne a másiknál; egyszer űen arról 
van szó, hogy a két érték matematikailag mást jelent. Az átlagos 
fajlagos növekedési sebesség a békalencse korlátozatlan tenyésze ­
tekben tanúsított általános exponenciális növekedési mintáján alapul, és a toxicitást a növekedési sebességre kifejtett hatás alapján, a kont ­
rolltenyészetekben tapasztalható növekedési sebesség abszolút nagy ­
ságától, a koncentráció–hatás görbe meredekségét ől és a vizsgálat 
időtartamától függetlenül becsli. A kihozatalból származtatott ered ­
mények ezzel szemben mindezekt ől a változóktól is függnek. Az 
E
 y C x függ a békalencse egyes vizsgálatokban felhasznált egyedeinek 
fajlagos növekedési sebességét ől és a legnagyobb fajlagos növeke ­
dési sebességt ől, amely fajonként, s őt klónonként is eltér ő lehet. Ez a 
hatásváltozó nem alkalmas az egyes békalencsefajok vagy klónok 
toxikus hatással szembeni érzékenységében fennálló különbségek 
megítélésére. Bár tudományos szempontból a toxikus hatást indokol ­
tabb az átlagos fajlagos növekedési sebességb ől meghatározni, ez a 
vizsgálati módszer a kihozatalon alapuló toxicitásszámítást is tartal ­
mazza, mert egyes országok hatályos jogszabályi követelményei ezt 
is szükségessé teszik.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
A toxicitást a levélszám és egy további mérési változó (a levelek 
összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) alapján is meg 
kell határozni, mert bizonyos anyagok egy másik mérési változót sokkal er ősebben befolyásolhatnak, mint a levélszámot. Ez a hatás 
nem volna kimutatható, ha csak a levélszámból indulnánk ki.
 
A levélszám, valamint a többi feljegyzett mérési változó (a levelek 
összterülete, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) értékét az egyes mérések alkalmával a koncentrációértékek szerint táblázatba kell rendezni. A további adatelemzés, azaz az LOEC, az NOEC vagy 
az EC
 x meghatározása során a párhuzamos tenyészetek külön- 
külön vett adataiból, nem pedig az egyes csoportok középértékéb ől 
kell kiindulni.  
2.2.1.  Átlagos fajlagos növekedési sebesség  
Az adott id őszakhoz tartozó átlagos fajlagos növekedési sebességet a 
növekedést leíró változók (levélszám, valamint egy további mérési 
változó: a levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg) logaritmusának növekedéseként számítjuk a vizsgálati és a kontroll ­
tenyészetek minden egyes példányára külön-külön, a következ ő 
összefüggés szerint:
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
ahol:  
– μ i–j : az átlagos fajlagos növekedési sebesség az „i”-t ől a „j” 
időpillanatig  
– N  i : a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolltenyé ­
szetben az „i” id őpillanatban  
– N  j : a mérési változó értéke a vizsgálati vagy a kontrolltenyé ­
szetben a „j” id őpillanatban  
– t: az „i”-t ől „j”-ig terjed ő időtartam.  
A vizsgálati és a kontrollcsoportok mindegyikére meg kell határozni 
a növekedési sebesség középértékét és tapasztalati szórásnégyzetét.  
Az átlagos fajlagos növekedési sebességet a vizsgálat teljes id őtarta­
mára (tehát úgy, hogy a fenti összefüggésben „i” a vizsgálat kezde ­
tét, „j” a vizsgálat végét jelöli) kell meghatározni. Minden egyes 
vizsgálati koncentrációra és kontrollcsoportra meg kell határozni az 
átlagos fajlagos növekedési sebesség középértékét és tapasztalati szórásnégyzetét. Emellett (például a növekedési görbék logaritmikus transzformáltjának szemügyre vételével) becslést adunk a növekedési 
sebesség szakaszonkénti értékére is annak érdekében, hogy megítél ­
hető legyen a vizsgált anyag által az expozíciós id őszak folyamán 
kifejtett hatás. Ha a szakaszonkénti növekedési sebesség és az átlagos növekedési sebesség között nagy különbséget tapasztalunk, 
az azt jelenti, hogy a növekedés mintája er ősen eltér az állandó 
kitevőjű exponenciális növekedést ől és különösen ajánlott a növeke ­
dési görbék részletes vizsgálata. Ilyenkor a biztonság javára járunk el, ha az összehasonlítást a legnagyobb gátlás id őszakában a vizsgált 
tenyészetekben és az ugyanebben az id őszakban a kontrolltenyésze ­
tekben tapasztalt fajlagos növekedési sebesség között végezzük.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
A növekedési sebesség I  r százalékos gátlását ezután koncentráción ­
ként (készítménycsoportonként) a következ ő összefüggésb ől kell 
meghatározni:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
ahol:  
– % I  r : vaz átlagos fajlagos növekedési sebesség százalékos gátlása  
– μ C : a μ középértéke a kontrollcsoportban  
– μ T : a μ középértéke a vizsgált csoportban.  
2.2.2.  Kihozatal  
A kihozatalra gyakorolt hatást vizsgálati edényenként, két mérési 
változó: a levélszám és egy további mérési változó (a levelek össz ­
területe, a száraz tömeg vagy a nedves tömeg) vizsgálat kezdetén és 
vizsgálat végén mért értékéb ől számítjuk. A száraz tömeg és a 
nedves tömeg esetében a kezdeti él őanyag-tömeget a vizsgálati 
edények tartalmának összeállításához (lásd az 1.7.3. szakasz második 
bekezdését) használt tételb ől származó levelekb ől vett mintán hatá ­
rozzuk meg. Minden egyes vizsgálati koncentráció és kontrollcsoport esetén kiszámítjuk a kihozatal középértékét és tapasztalati szórás ­
négyzetét. Az átlagos százalékos kihozatalgátlás (% I
 y ) készítmény ­
csoportonként határozható meg a következ ő összefüggésb ől: 
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
ahol:  
– % I  y : a kihozatal százalékos csökkenése  
– b  C : az él őanyag-tömeg végs ő értéke és kiindulási értéke 
közötti különbség a kontrollcsoportban  
– b  T : az él őanyag-tömeg végs ő értéke és kiindulási értéke 
közötti különbség a vizsgált csoportban.  
2.2.3.  A koncentráció–hatás görbék elkészítése  
El kell készíteni a hatásváltozóhoz tartozó átlagos százalékos gátlás 
értékét (a 2.2.1., illetve a 2.2.2. szakasz utolsó bekezdésében meghatározott I
 r vagy I  y értéket) a vizsgálati koncentráció logarit ­
musa függvényében ábrázoló koncentráció–hatás görbéket.  
2.2.4.  Az EC  x becslése  
Az EC  x (például EC  50 ) becslését mind az átlagos fajlagos növekedési 
sebesség (E  r C x ), mind a kihozatal (E  y C x ) alapján el kell végezni, 
amelyeket viszont a levélszámból és egy további mérési változóból (levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg) egyaránt ki 
kell számítani. Ez azért szükséges, mert egyes vizsgálati anyagok a 
levélszámra és a második mérési változóra eltér ő hatást gyakorolnak. 
Ennek megfelel ően tehát minden x gátlási szinthez négy EC
 x toxi­
citási paramétert állítunk el ő: E r C x (levélszám); E  r C x (levelek össz ­
területe, száraz tömeg vagy nedves tömeg); E  y C x (levélszám); és 
E y C x (levelek összterülete, száraz tömeg vagy nedves tömeg).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. STATISZTIKAI SZÁMÍTÁSOK  
A statisztikai számítások célja, hogy regressziószámítással kvantitatív 
koncentráció–hatás összefüggést állítsunk el ő. Lehetőség van arra, 
hogy a hatásadatok – például probit-, logit- vagy Weibull-modell 
(16) szerinti – linearizációs transzformálását követ ően súlyozott line ­
áris regressziót végezzünk, de el őnyösebb inkább nemlineáris 
regressziót alkalmazni, mert ez jobban kezeli az adatok elkerülhe ­
tetlen irregularitását és a sima eloszlástól való eltérést. A nulla és a 
teljes gátlás környezetében az irregularitást a transzformáció felna ­
gyíthatja, ami a számítás szempontjából el őnytelen (16). Megjegy ­
zendő, hogy a probit-, logit- vagy Weibull-transzformáltat alkalmazó 
szokásos számítási módszerek els ősorban kvantált (például elhalá ­
lozás kontra túlélés) adatok feldolgozására alkalmasak, így módosí ­
tást igényelnek, ha a növekedési sebességre vagy a kihozatalra kívánjuk őket alkalmazni. Az EC
 x -értékek folytonos adatokból való 
számítására alkalmas módszereket a (17), (18) és (19) irodalom 
ismertet.  
Az egyes hatásváltozók elemzéséhez a koncentráció–válasz összefüg ­
gésből állítsuk el ő az EC  x egyes pontokban becsült értékét. Ha lehet ­
séges, meg kell határozni az egyes becslések 95 %-os konfidencia ­
határát. A hatásadatok regressziós modellhez illeszkedésének jóságát grafikus vagy statisztikai módszerrel kell megállapítani. A regresz ­
sziószámítást az egyes vizsgálati edényeken nyert értékekkel, nem 
pedig a vizsgálati csoportok középértékével kell elvégezni.
 
Ha a rendelkezésre álló regressziós modellek/módszerek nem alkal ­
masak a konkrét adatok elemzésére, az EC  50 -re vonatkozó becs ­
léseket és a konfidenciahatárokat „bootstrap” technikával együtt 
alkalmazott lineáris interpolációval (20) is el őállíthatjuk.  
Az LOEC, és így az NOEC becsült értékének el őállítása érdekében 
varianciaanalízis (ANOVA) segítségével összevetjük az egyes készít ­
ményekhez tartozó középértékeket. Az egyes koncentrációkhoz 
tartozó középértékeket ezután alkalmasan megválasztott többszörös 
összehasonlító módszerrel vagy trendpróbával a kontrollcsoporton nyert középértékhez hasonlítjuk. Hasznos lehet a Dunnett- és a Willi ­
ams-próba alkalmazása (21)(22)(23)(24). Lényeges ellen őrizni, hogy 
fennáll-e az ANOVA-nak a szórásnégyzetek homogenitására vonat ­
kozó feltevése. Ezt az ellen őrzést grafikusan vagy formális próbával 
(25) végezhetjük. Erre a célra a Levene- és a Bartlett-próba alkalmas. A szórásnégyzetek homogenitására vonatkozó feltevés nem teljesü ­
lése gyakran kiküszöbölhet ő az adatok logaritmikus transzformálásá ­
val. Ha a szórásnégyzetek heterogenitása túlságosan széls őségesnek 
bizonyul, és transzformációval nem javítható, akkor célszer ű 
megfontolni például a lépésenkénti Jonkheere-trendpróba alkalmazá ­
sát. Az NOEC meghatározásához további útmutatást ad a (19) 
irodalom.
 
A legújabb kutatási eredmények alapján az az ajánlás fogalmazható 
meg, hogy az NOEC kiszámítása helyett célszer űbb az EC  x értékét 
becsülni pontonkénti regresszióval. A jelen  Lemna -vizsgálathoz 
egyelőre nem áll rendelkezésre alkalmas x érték, bár a 10 és 20 % 
közötti tartomány megfelel őnek látszik (a választott hatásváltozótól 
függően), és ajánlott mind az EC  10 , mind az EC  20 értéket jegy ­
zőkönyvbe foglalni.  
3. JEGYZ ŐKÖNYVEZÉS  
3.1. VIZSGÁLATI JEGYZ ŐKÖNYV  
A vizsgálati jegyz őkönyv tartalmazza a következ ő információkat:  
Vizsgált anyag:  
— fizikai jelleg és fizikokémiai tulajdonságok, vízben való oldható ­
sági határ,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— kémiai azonosító adatok (pl. CAS-szám), tisztaság.  
Vizsgált faj:  
— tudományos név, klón (ha ismert) és eredet.  
Vizsgálati körülmények:  
— alkalmazott vizsgálati eljárás (statikus, félstatikus vagy átfolyá ­
sos), 
— a vizsgálat megkezdésének id őpontja és id őtartama,  
— vizsgálati oldat,  
— a kísérleti terv ismertetése: vizsgálati edények és fed ők, oldattér ­
fogatok, telep- és levélszámok vizsgálati edényenként a vizsgálat megkezdésekor,
 
— vizsgált koncentrációk (szükség szerint névleges és mért értékek) 
és a párhuzamos tenyészetek száma koncentrációnként,  
— a törzs- és a vizsgálati oldatok elkészítésének módszere, az 
esetleg alkalmazott oldó- vagy diszpergálószer,  
— hőmérséklet a vizsgálat folyamán,  
— fényforrás, a fény intenzitása és homogenitása,  
— a vizsgálati és a kontrolloldatok pH-értékei,  
— a vizsgált anyag koncentrációi és az analízis módszere a 
megfelelő minőség-ellenőrzési adatokkal együtt (az érvényesség 
vizsgálata, a szórás vagy az analízis konfidenciahatára),  
— a levélszám és a további mérési változók (száraz tömeg, nedves 
tömeg vagy levélterület) meghatározásának módszere,  
— a jelen vizsgálati módszert ől való esetleges eltérések.  
Eredmények:  
— nyers mérési adatok: levélszám és a további mérési változók 
minden egyes vizsgálati és kontrolltenyészetben minden adatfel ­
vételkor és analízis alkalmával,  
— az egyes mérési változók középértékei és szórásai,  
— növekedési görbék minden egyes koncentrációra (logaritmikusan 
transzformált mérési változókkal ajánlott megadni, lásd a 2.2.1. 
szakasz második bekezdését),  
— megkett őződési idő, illetve növekedési sebesség a kontrolltenyé ­
szetben, a levélszám alapján,  
— hatásváltozók számított értéke minden párhuzamos tenyészetre, 
továbbá vizsgálati csoportonként a középérték és a szórásnégyzet,  
— a koncentráció–hatás összefüggés grafikus formában,  
— a hatásváltozók toxikus végpontjának becsült értékei, például 
EC 50 , EC  10 , EC  20 és a hozzájuk tartozó konfidenciaintervallu ­
mok. Ha kiszámítottuk, az LOEC, illetve az NOEC értéke, 
továbbá a számításhoz alkalmazott statisztikai módszer,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— ANOVA alkalmazása esetén a hatás kimutatásának mérethatára 
(például a legkisebb szignifikáns különbség),  
— a vizsgálatok során észlelt esetleges növekedésserkentés,  
— fitotoxicitásra utaló esetleges látható jelek, valamint a vizsgálati 
oldatokkal kapcsolatos észrevételek,  
— az eredmények szöveges összefoglalása és értékelése, ezen belül 
a jelen vizsgálati módszert ől való eltérések vizsgálati eredmé ­
nyekre gyakorolt hatásának elemzése.  
4. IRODALOM  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test  
(2) A Lemna-vizsgálat színezett anyagokra való alkalmazását az 
EU Manual of Decisions (2006. július) 13.5.3. szakasza 
tárgyalja: http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals  
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 
7.8.3 Summary of difficult substance testing issues:  
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.
 
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.
 
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp.  
(7) SSI – Svéd Szabványügyi Intézet. (1995). Vízmin őség. A növe ­
kedésgátlás meghatározása (7-d)  Lemna minor , békalencse. SS 
02 82 13. 15pp. (svéd nyelven).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater 
Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 pp  
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.
 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and 
Assessment No.23.  
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3–77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353–359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481–483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.
 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
1. függelék  
A Lemna  nemzetség leírása  
A Lemna  nemzetséghez tartozó, békalencseként közismert vízinövények a  
Lemnaceae  családba tartoznak, amelynek négy nemzetsége számos világszerte 
elterjedt fajt felölel. Különböz ő megjelenésüket és rendszertanukat a szakiro ­
dalom kimerít ően ismerteti (1)(2). A  Lemna gibba  és a  L. minor  a mérsékelt 
éghajlati övezet jellegzetes képvisel ői; a toxicitási vizsgálatokban többnyire 
ezeket alkalmazzák. Mindkét fajnak úszó vagy alámerül ő, korong alakú levelei 
és nagyon vékony, az egyes levelek alsó felszínének közepér ől eredő gyökerei 
vannak. A  Lemna -fajok többnyire nem virágzanak, a szaporodás érdekében a 
növények vegetatív úton új leveleket hoznak létre (3). Az id ősebb növényekhez 
képest a fiatalabbak általában halványabbak, rövidebb gyökereik vannak és két- három, különböz ő méretű levélből állnak. A  Lemna -növények kis mérete, 
egyszerű struktúrája, ivartalan szaporodása és rövid generációs ideje a nemzetség 
fajait különösen alkalmassá teszi laboratóriumi vizsgálatokra (4)(5).
 
Mivel az egyes fajok el őreláthatóan eltér ő mértékben lesznek érzékenyek a 
különböző behatásokra, az érzékenységet kizárólag fajon belül szabad összeha ­
sonlítani.  
Példák a vizsgálatokban korábban már alkalmazott  Lemna -fajokra, fajon ­
ként szakirodalmi hivatkozásokkal  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. 
EPA 712-C-96–156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l'inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Vízmin őség. A növekedésgátlás 
meghatározása (7-d)  Lemna minor , békalencse. SS 02 82 13. 15pp. (svéd 
nyelven).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 
733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96–156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
A Lemna -fajok beszerzési forrásai  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel. +1-416-978-3641  
Fax.+1-416-978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
United States  
phone 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SWEDEN  
Tel. +46 8 674 7240  
Fax +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Germany  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Irodalom  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the desc ­
riptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
2. függelék  
A törzstenyészetek tartása  
A törzstenyészetek alacsony h őmérsékleteken (4–10 °C) hosszabb ideig átoltás 
nélkül is fenntarthatók. A  Lemna  tápoldata megegyezhet a vizsgálatok során 
alkalmazottal, de a törzstenyészetek más, tápanyagokban gazdag oldatban is tart ­
hatók.  
Időről időre néhány fiatal, világoszöld növényt csíramentes eljárással friss tápol ­
datot tartalmazó növeszt őedénybe helyezünk. A javasolt h űvösebb körülmények 
között elegend ő lehet akár háromhavonta is átoltást végezni.  
Kémiailag tiszta (savval lemosott) és steril üveg növeszt őedényeket alkalmaz ­
zunk, és a kezelés során biztosítsunk csíramentes körülményeket. A törzskultúra 
(például algával vagy gombákkal történ ő) fertőződése esetén meg kell kísérelni a 
szennyező organizmusok eltávolítását. Algák és a legtöbb más szennyez ő orga­
nizmus esetén ez felületi fert őtlenítéssel valósítható meg. A fert őződött növény ­
anyagból mintát veszünk, és a gyökereket levágjuk. A növényeket ezután tiszta 
vízben intenzíven megrázzuk, majd 30 másodperc és 5 perc közötti id őtartamra 
0,5 térfogatszázalékos nátrium-hipoklorit-oldatba merítjük. A növényanyagot ezután steril vízben átöblítjük, majd több részletben friss tápoldatot tartalmazó 
növesztőedényekbe helyezzük. A kezelés eredményeképpen számos levél elhal, 
különösen hosszabb expozíciós id ő esetén, de a fennmaradók közül néhány álta ­
lában fert őzésmentes lesz. Ez a tenyészet a kés őbbiekben újabbak leoltására 
használható fel.
 ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
3. függelék  
Tápoldatok  
L. minor  és L. gibba  esetén eltér ő tápoldatot ajánlott alkalmazni.  L. minor  esetén 
a svéd szabvány (SIS) szerinti tápoldat módosított változatát, míg  L. gibba  esetén 
a 20X–AAP tápoldatot javasoljuk. Az alábbiakban megadjuk minkét tápoldat 
összetételét. A tápoldatok elkészítése során reagens vagy analitikai tisztaságú 
vegyületeket és ionmentesített vizet kell alkalmazni.  
Svéd szabvány (SIS) szerinti Lemna-tápoldat  
— Az I–V. törzsoldatot autoklávozással (120 °C, 15 perc) vagy membránsz ű­
réssel (körülbelül 0,2 μm pórusméret) sterilizáljuk.  
— A VI. (és szükség esetén a VII.) törzsoldatot kizárólag membránsz űréssel 
sterilizáljuk, autoklávozás nem alkalmazható.  
— A steril törzsoldatokat hideg, sötét helyen tároljuk. Az I–V. törzsoldatot hat 
hónap elteltével ki kell önteni, míg a VI. (és szükség esetén a VII.) törzsoldat 
eltarthatósági ideje egy hónap.  
Törzsoldat 
száma Anyag Koncentráció a 
törzsoldatban (g/l) Koncentráció a 
kész tápoldatban 
(mg/l) Kész tápoldat 
Kémiai elem Koncentráció 
(mg/l)  
I. NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II. MgSO  4 • 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III. CaCl  2 • 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV. Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V. H 3 BO 3 
MnCl  2 • 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 • 2H  2 O 
ZnSO  4 • 7H  2 O 
CuSO  4 • 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 • 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 0,0020 
VI. FeCl
 3 • 6H  2 O 
Na 2 -EDTA•2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
– 0,17 
– 
VII. MOPS (puffer) 490 490 — —  
— Egy liter SIS szerinti tápoldat elkészítéséhez 900 ml ionmentesített vízhez a 
következőket adagoljuk:  
— 10 ml az I. törzsoldatból,  
— 5 ml a II. törzsoldatból,  
— 5 ml a III. törzsoldatból,  
— 5 ml a IV. törzsoldatból,  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml az V. törzsoldatból,  
— 5 ml a VI. törzsoldatból,  
— 1 ml a VII. törzsoldatból (ha szükséges).  
Megjegyzés:  A VII. törzsoldatot (MOPS puffer) bizonyos vizsgált anyagok 
esetében kell alkalmazni (lásd az 1.4. szakasz utolsó bekezdését).  
— A pH-értéket 0,1 vagy 1 mol HCl vagy NaOH hozzáadásával 6,5 ± 0,2 
értékre állítjuk, majd a térfogatot ionmentesített víz hozzáadásával egy literre kiegészítjük.
 
20X–AAP tápoldat  
A törzsoldatokat steril desztillált vagy ionmentesített vízzel készítjük.  
A steril törzsoldatokat hideg, sötét helyen tároljuk. Ilyen körülmények között 
eltarthatósági idejük legalább 6–8 hét.  
A 20X–AAP tápoldat el őállításához öt, tápanyagokat tartalmazó törzsoldatot 
(A1., A2., A3., B és C) készítünk reagens min őségű vegyületek felhasználásával. 
A tápoldat el őállításához kb. 850 ml ionmentesített vízhez 20 ml-t adunk minden 
törzsoldatból. A pH-értéket 0,1 vagy 1 mol HCl vagy NaOH hozzáadásával 7,5 ± 0,1 értékre állítjuk, majd a térfogatot ionmentesített víz hozzáadásával egy literre kiegészítjük. Ezután a tápoldatot egy kb. 0,2 μm pórusméret ű membránsz űrőn át 
steril edénybe sz űrjük.
 
A vizsgálatok céljára szánt tápoldatot egy-két nappal a felhasználás el őtt kell 
elkészíteni annak érdekében, hogy pH-értékük stabilizálódhasson. A tápoldat pH-értékét felhasználás el őtt ellenőrizni kell, és szükség esetén 0,1 vagy 1 mol 
HCl vagy NaOH hozzáadásával a fentieknek megfelel ően újra be kell állítani.
 
Törzsoldat 
száma Anyag Koncentráció a 
törzsoldatban 
(g/l) (  1 ) Koncentráció a 
kész tápoldatban 
(mg/l) (*) Kész tápoldat 
Kémiai elem Koncentráció 
(mg/l) (*)  
A1. NaNO  3 
MgCl  2 •6H  2 O 
CaCl  2 •2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2. MgSO
 4 •7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3. K 2 HPO  4 •3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B. H 3 BO 3 
MnCl  2 •4H  2 O 
FeCl  3 •6H  2 O 
Na 2 EDTA•2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 •6H  2 O 
Na 2 MoO  4 •2H  2 O 
CuCl  2 •2H  2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg/l 1,4 mg/l 
7,3 mg/l 
0,012 mg/l 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg/l 
29 μg/l 
145 μg/l 
0,24 μg/l B 
Mn Fe 
– 
Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 0,66 
– 
31 μg/l 
7,1 μg/l 
58 μg/l 
0,080 μg/l 
C. NaHCO
 3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Eltér ő előírás hiányában.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Lábjegyzet: Az elméletileg szükséges hidrogén-karbonát-koncentráció (amely 
mellett nincs szükség a pH-érték jelent ős mértékű utánállítására) 
15 mg/l, nem 300 mg/l. A 20X–AAP tápoldattal végzett korábbi vizsgálatok és a jelen módszerhez kapcsolódó körvizsgálat azonban egyaránt 300 mg/l-en alapult. [I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. 
(1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and 
Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.]
 
STEINBERG-féle tápoldat (az ISO 20079 szerint)  
Koncentrációk és törzsoldatok  
— A módosított Steinberg-féle tápoldatot az ISO 20079 kizárólag  Lemna minor  
esetére írja el ő (mert a szabvány csak  Lemna minor  alkalmazását engedélye ­
zi), de korábbi vizsgálatok  Lemna gibba  esetén is kedvez ő eredményekre 
vezettek.  
— A tápoldat készítése során reagens vagy analitikai tisztaságú anyagokat és 
ionmentesített vizet kell alkalmazni.  
— A tápoldatot elkészíthetjük törzsoldatokból vagy a tízszeres töménység ű 
oldatból, amely maximális oldatkoncentrációt tesz lehet ővé kicsapódás nélkül.  
1. táblázat  
pH-stabilizált STEINBERG-féle tápoldat (Altenburger szerint módosítva)  
Anyag Tápoldat  
Makroelemek  móltömeg mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 • 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 • 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelemek  móltömeg μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 • 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 • 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 • 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 • 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
Dinátrium-EDTA-dihidrát 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
2. táblázat  
Törzsoldatok (makroelemek)  
1. Makroelemek (50-szeres töménység ű) g/l  
1. törzsoldat:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
2. törzsoldat:  
MgSO  4 • 7H  2 O 5,00  
3. törzsoldat:  
Ca(NO  3 ) 2 • 4H  2 O 14,75  
3. táblázat  
Törzsoldatok (mikroelemek)  
2. Mikroelemek (1 000-szeres töménység ű) mg/l  
4. törzsoldat:  
H 3 BO 3 120,0  
5. törzsoldat:  
ZnSO  4 • 7H  2 O 180,0  
6. törzsoldat:  
Na 2 MoO  4 • 2H  2 O 44,0  
7. törzsoldat:  
MnCl  2 • 4H  2 O 180,0  
8. törzsoldat:  
FeCl  3 • 6H  2 O 760,00 
Dinátrium-EDTA-dihidrát 1 500,00  
— A 2. és 3., illetve külön a 4–7. törzsoldat egyesíthet ő (a kívánt koncentrációk 
figyelembevételével).  
— A hosszabb eltarthatóság érdekében kezeljük a törzsoldatokat autoklávban 
121 °C-on 20 percig, vagy végezzünk membránsz űréses (0,2 μm) sterilizálást. 
A 8. törzsoldat esetében fokozottan ajánlott membránsz űréses (0,2 μm) steri­
lizálást végezni.  
A végleges koncentrációjú (módosított) STEINBERG-féle tápoldat elké ­
szítése  
— A kicsapódás elkerülése érdekében mintegy 900 ml ionmentesített vízhez 
adjunk az 1., 2. és 3. törzsoldatból (2. táblázat) egyaránt 20 ml-t.  
— Az oldathoz adjunk a 4., 5., 6., 7. és 8. törzsoldatból (3. táblázat) egyaránt 
1,0 ml-t.  
— A pH-érték 5,5 ± 0,2 legyen (ezt az értéket minél kevesebb NaOH-oldat vagy 
HCl hozzáadásával állítsuk be).  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Víz hozzáadásával egészítsük ki az oldat térfogatát 1 000 ml-re.  
— Ha a törzsoldatok sterilizáltak és megfelel ő minőségű vizet alkalmazunk, 
akkor további sterilizálás nem szükséges. Ha a végleges tápoldatot sterili ­
záljuk, a 8. törzsoldatot az autoklávozás (121 °C-on 20 percig) után kell hozzáadni.
 
A 10-szeres töménység ű (módosított) STEINBERG-féle tápoldat elkészítése 
ideiglenes tárolásra  
— A kicsapódás elkerülése érdekében mintegy 30 ml vízhez adjunk az 1., 2. és 
3. törzsoldatból (2. táblázat) egyaránt 20 ml-t.  
— Az oldathoz adjunk a 4., 5., 6., 7. és 8. törzsoldatból (3. táblázat) egyaránt 
1,0 ml-t. Víz hozzáadásával egészítsük ki az oldat térfogatát 1 000 ml-re.  
— Ha a törzsoldatok sterilizáltak és megfelel ő minőségű vizet alkalmazunk, 
akkor további sterilizálás nem szükséges. Ha a végleges tápoldatot sterili ­
záljuk, a 8. törzsoldatot az autoklávozás (121 °C-on 20 percig) után kell hozzáadni.
 
— A (végleges koncentrációjú) tápoldat pH-értéke 5,5 ± 0,2 legyen.  ▼M1 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  SZENNYEZETT ÜLEDÉKKEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ 
TOXICITÁSI VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 218. vizsgálati iránymutatá ­
sában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak 
rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak 
való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. A  Chironomus riparius  és 
Chironomus tentans  árvaszúnyog fajokkal végzett toxicitás vizsgálati 
protokollokon alapul, amelyeket Európában (1)(2)(3) és Észak-Amerikában 
(4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak vetettek alá (1)(6)(9). Más 
jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például  Chironomus yoshimatsui  
(10)(11) is használhatók.  
2. A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv az üledék 
szennyezése a vizsgált anyaggal. A megfelel ő expozíciós forgatókönyv a 
vizsgálat tervezett felhasználásától függ. Az üledékszennyezési forgatókönyv 
az üledékben tartósan jelen lév ő vegyi anyagok felhalmozódását hivatott 
szimulálni. Ennél az expozíciós elrendezésnél a szennyezett üledék egy üledékből és vízből álló vizsgálati elrendezés részét képezi.
 
3. Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizs ­
gálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anya ­
goknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes 
toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kiala ­
kulásához szükséges id őtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai 
tulajdonságaitól függ. Az er ősen adszorbeálódó (például log K
 ow > 5) 
vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépül ő anyagok esetében fontos expo ­
zíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az er ősen lipofil 
anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megel őzően az 
üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre 
épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehet ő legyen. A vizsgálat id őtartama a  C. riparius  és 
a C. yoshimatsui  esetében 20–28 nap, a  C. tentans  esetében 28–65 nap. Ha 
egy meghatározott célra – például egy instabil vegyület hatásainak a vizs ­
gálatára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók.
 
4. A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szük ­
séges idő. Ha kiegészít ő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák 
túlélésének és fejl ődésének mérését csak a tíznapos id őszak eltelte után 
ajánlott megkezdeni, megfelel ő számú ismétlést alkalmazva.  
5. Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos el őny­
nyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben:  
— a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy repro ­
dukálható „szabványosított közeget” biztosít, és nem kell szennyezés ­
mentes, tiszta üledékforrást keresni,  
— a vizsgálatok bármikor elkezdhet ők anélkül, hogy a vizsgálathoz hasz ­
nált üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell el őzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása 
végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szük ­
séges mennyiség ű üledék terepen történ ő gyűjtésével kapcsolatos költ ­
ségeket is csökkenti,
 
— a mesterséges üledék alkalmazása lehet ővé teszi a különböz ő anyagok 
toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelel ő rangsorolását.  
6. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
7. Első fejlődési szakaszban lév ő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált 
vegyi anyag különböz ő koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. Az 
üledéket a vizsgált anyaggal szennyezzük, majd els ő fejlődési szakaszban 
lévő lárvákat helyezünk a kísérleti edényekbe, amelyekben az üledék és víz 
koncentrációját el őzőleg stabilizáltuk. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és 
fejlődésének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap eltel ­
tével is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelel ő számú ismétlést 
alkalmazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével 
megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélé ­
sének, illetve fejl ődésének x %-os csökkenését okozná (például EC  15 , EC  50 , 
stb.), vagy statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhet ő 
hatást nem okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhet ő hatást okozó legki ­
sebb koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó érté ­
keket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll 
értékekkel.  
A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
8. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy 
számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált 
anyag mennyiségi meghatározásához a fed ővízben, a pórusvízben és az 
üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy 
keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai 
lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezít ő fizikai és kémiai tulaj ­
donságokkal rendelkez ő anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom 
(12) nyújt további tájékoztatást.
 
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
9. A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának 
megerősítése céljából rendszeres id őközönként érdemes 
referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és 
validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgez ő referenciaanyagok 
például a következ ők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és 
a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13).  
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
10. A következ ő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes 
legyen:  
— A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a 
vizsgálat végén (1)(6).  
— A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követ ően kell 
megjelenniük a kifejlett C. riparius és C. yoshimatsui példányoknak; a 
C. tentans esetében ehhez 20–65 nap szükséges.  
— A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az 
oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a leveg ő alkal­
mazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 száza ­
lékának kell lennie, a fed ővíz pH-értékének pedig minden edényben a 
6–9 tartományon belülre kell esnie.  
— a víz h őmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízh őmérséklet 
szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó 
hőmérséklet ű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség h őmér­
sékletét megfelel ő időközönként ellen őrizni kell.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Vizsgálati edények  
11. A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmér ője 8 cm. 
Amennyiben az üledék és a fed ővíz megfelel ő mélysége biztosított, ett ől 
eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm  2 nagyságú üledékfelü ­
letet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fed ővíz mélységének aránya 1:4 
legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkez ő 
egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegb ől vagy más kémiailag 
semleges anyagból (például teflon) kell készülniük.  
A fajok kiválasztása  
12. A vizsgálatot lehet őleg a  Chironomus riparius  fajjal végezzük. Chironomus 
tentans is alkalmazható, de nehezebben kezelhet ő, és hosszabb vizsgálati 
időszakot igényel. Chironomus yohimatsui szintén használható. A 2. függe ­
lékben részletezett tenyésztési módszerek a Chironomus riparius fajra vonat ­
koznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a Chironomus tentans (4) 
és a Chironomus yoshimatsui (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése el őtt ellenőrzésképpen 
fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetb ől szár­
maznak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat el őtt megtenni.
 
Üledék  
13. Lehet őleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy m űüle­
dék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, 
akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg 
kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszer ­
kezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szeny ­
nyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal verseng ő vagy az azt fogyasztó 
egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizs ­
gálatban való felhasználás el őtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az 
elkövetkez ő vizsgálat során uralkodókkal megegyez ő körülmények között 
hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizs ­
gálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges 
üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16):  
a) 4–5 % (száraz tömeg) t őzeg, amelynek pH-ja a lehet ő legközelebb esik 
az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecs ­
keméret ≤ 1 mm) és kizárólag leveg őn szárított t őzeget használjunk.  
b) 20 % (száraz tömeg) kaolinagyag (lehet őleg 30 % feletti kaolinit tarta ­
lommal).  
c) 75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, 
amely részecskéinek több mint 50 százaléka 50 és 200 μm közötti szem ­
csemérettel rendelkezik).  
d) Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 
30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk.  
e) A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre 
történő beállításához szükséges mennyiség ű vegytiszta min őségű 
kalcium-karbonát (CaCO  3 ). A végtermékként kapott keveréknek 2 % 
(± 0,5 %) szerves széntartalommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelel ő mennyiség ű tőzeg és homok hozzáadásával 
érünk el.
 
14. A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származ ­
nia. Ellen őrizni kell, hogy az üledék összetev őiben nem fordulnak el ő 
kémiai szennyez ődések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, 
szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetev ők keverése is elfogadott, 
amennyiben bizonyítható, hogy a fed ővíz hozzáadását követ ően az üledék 
nem esik szét összetev őire (például a vízben lebeg ő tőzegrészecskékre), és a 
tőzeget vagy az üledéket megfelel ően kondicionáltuk.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Víz 
15. Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonsá ­
gaival rendelkez ő bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyészt ővízként és 
kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talaj ­
víz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfo ­
gadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A 
vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között 
kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO
 3 
értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, 
hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás 
alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkal ­
mazható). A vizsgálat teljes id őtartama alatt ugyanazt a víztípust kell hasz ­
nálni. A 4. függelékben felsorolt vízmin őségi jellemz őket évente legalább 
kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a 
gyanúja annak, hogy e jellemz ők jelentős mértékben megváltoztak.  
Törzsoldatok – szennyezett üledékek  
16. A választott koncentrációjú szennyezett üledéket általában úgy készítjük, 
hogy a vizsgált anyag oldatát közvetlenül az üledékhez adjuk. A vizsgált anyag ionmentesített vízben oldott törzsoldatát hengerszék vagy tápkever ő 
segítségével vagy kézzel elkeverjük a mesterséges üledékkel. Ha a vizsgált 
anyag rosszul oldódik vízben, akkor a célnak megfelel ő, lehető legkisebb 
mennyiség ű szerves oldószerben (például hexán, aceton vagy kloroform) 
oldhatjuk. Ezt követ ően az oldatot vizsgálati edényenként 10 g finom kvar ­
chomokkal elkeverjük. Az oldószert hagyjuk elpárologni, hogy teljes 
mértékben eltávozzon a homokból; majd a homokot összekeverjük a vizs ­
gálati edényenként szükséges megfelel ő mennyiség ű üledékkel. A vizsgált 
anyag oldódásának megkönnyítéséhez, diszpergálásához vagy emulgeálá ­
sához csak gyorsan párolgó szer használható. Nem szabad elfelejteni, 
hogy az üledék elkészítése során a vizsgált anyag és a homok keverékéb ől 
származó homokot is figyelembe kell venni (azaz az üledéket kevesebb homokkal kell készíteni). Biztosítani kell az üledékhez adott vizsgált 
anyag egyenletes eloszlását az üledékben. Szükség esetén részminták anali ­
zálásával határozzuk meg a homogenitás fokát.
 
A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE  
17. A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk 
számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények 
számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását 
jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megter ­
vezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizs ­
gálatnak a megtervezését ismertetjük.  
A regressziós analízis megtervezése  
18. A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskon ­
centrációt (például EC  15 , EC  50 ) és azt a koncentrációtartományt, amelyen 
belül a vizsgált anyag érdekl ődésre számot tartó hatással rendelkezik. A 
hatáskoncentráció becsléseknek (EC  x ) a pontossága és különösképpen az 
érvényessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentráci ­
ótartományon belül helyezkedik el. A lehet ő legkisebb pozitív koncentráci ­
ónál jóval alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány 
kiválasztásához hasznos lehet el őzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 
27. bekezdés).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Az EC  x becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik 
koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés 
lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegend ő vizsgálati 
koncentrációt használni. A rákövetkez ő koncentráció legfeljebb kétszerese 
legyen az el őzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz 
görbe lapos). Az eltér ő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának 
emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csök ­
kenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott 
koncentráció intervallum sz űkítése általában a konfidencia intervallum csök ­
kenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejl ődési sebes ­
ségének a becslése esetén további ismétlések szükségesek.  
A NOEC/LOEC becslésének megtervezése  
20. A LOEC vagy a NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább 
négy ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkez ő koncentráció legfeljebb 
kétszerese legyen az el őzőnek. Az ismétlések számának elegend őnek kell 
lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os 
szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelel ő valószínűséggel kimutasson 
egy statisztikai próba. A fejl ődési ütem esetében általában 
varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát (17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor 
a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) 
vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk.
 
Határérték-vizsgálat  
21. Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll 
koncentrációval), ha az el őzetes behatároló vizsgálat során nem voltak 
megfigyelhet ő hatások. A határérték-vizsgálat célja annak a koncentrációnak 
a meghatározása, amely elég nagy ahhoz, hogy az elvégzett vizsgálat lehe ­
tővé tegye a döntéshozók számára a vizsgált anyag lehetséges toxikus hatá ­
sainak a kizárását, és annak a határértéknek a megállapítását, amelyen túli koncentrációknak az el őfordulása semmilyen esetben sem várható. Az aján ­
lott koncentráció 1 000 mg/kg (száraz tömeg). Általában mind a kezelés, 
mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizonyítni kell, 
hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelel ő valószín űséggel képes 
kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejl ődési ütem és súly) 
esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási 
feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenl ő szórásnégyzeteket feltételez ő 
t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey 
próba alkalmazható. A kikelési arány esetében a Fisher-féle egzakt próba a 
megfelelő.
 
ELJÁRÁS  
Expozíciós körülmények  
A szennyezett üledék – víz elrendezés el őállítása  
22. Az üledék vizsgált anyaggal való szennyezését a „C.8: Toxicitás földigilisz ­
tákra” cím ű vizsgálati módszernél leírt eljárás szerint ajánlott elvégezni (14). 
A szennyezett üledéket elhelyezzük az edényekben, majd felöntjük vízzel 
úgy, hogy az üledék és a fed ővíz mennyiségének az aránya 1:4 legyen (lásd 
a 11. és a 15. bekezdést). Az üledékrétegnek 1,5–3 cm mélynek kell lennie. Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetev őire essen szét, és a finom anyag a vízrétegben 
felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy m űanyag lappal, miközben a 
vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követ ően eltávolítunk. Erre a 
célra más eszközök is alkalmasak lehetnek.
 
23. A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint 
fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha 
szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesí ­
tett vizet használjunk.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizálódás  
24. A vízzel fedett szennyezett üledék el őállítását követ ően hagyjuk, hogy a 
vizsgált anyag a vízfázisból az üledékbe kerüljön, és abban eloszoljon (3)(4)(6)(13). Ez lehet őleg a vizsgálat során alkalmazottal megegyez ő 
hőmérsékleti és leveg őztetési viszonyok mellett történjen. Az ekvilibrációs 
idő üledék és vegyi anyag specifikus, tartama óráktól napokig terjedhet, de 
ritka esetekben több (4–5) hetet is igénybe vehet. Mivel ez alatt az id ő alatt 
számos vegyi anyag lebomolhat, az egyensúlyi állapot beálltának megvárása 
helyett 48 órás ekvilibrációs id őszak alkalmazása ajánlott. Ezen ekvilibrációs 
idő elteltével mérjük meg a vizsgált anyagnak legalább a legnagyobb és a 
legalacsonyabb koncentrációját a fed ővízben, a pórusvízben és az üledékben 
(38. bekezdés). Ezek a vizsgált anyagra vonatkozó analitikai meghatá ­
rozások lehet ővé teszik a tömegegyensúly kiszámítását és az eredmények 
mért koncentrációk alapján történ ő kifejezését.
 
A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása  
25. A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történ ő behelye­
zése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetb ől gyűjtött petecsomókat 
tenyésztőközeget tartalmazó kisméret ű edényekbe. A törzstenyészetb ől vett 
vagy frissen készített tenyészt őközeg egyaránt használható. Ez utóbbi hasz ­
nálata esetén adjunk a tenyészt őközeghez kis mennyiség ű táplálékot, például 
zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelb ől készített szusz ­
penzió szüredékéb ől néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen 
lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal 
a peterakást követ ően kezdenek kikelni (a  Chironomus riparius  esetében ez 
20 °C-on 2–3 nap, a  Chironomus tentans  és a  Chironomus yoshimatui  
esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejl ődése 
négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az 
első fejlődési szakaszban lév ő lárvákat kell gy űjteni (2–3 vagy 1–4 nappal 
a kikelést követ ően). Az árvaszúnyoglárvák fejl ődési szakaszát a fejszé ­
lesség alapján ellen őrizhetjük (6).  
26. Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz 
darab, tetsz őlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa vég ű pipetta 
segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le a víz leveg őztetését, és a behelyezést követ ő 24 órás id őszakon keresztül 
hagyjuk így (lásd a 25. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati 
tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelel ően az EC pont becsléséhez 
legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentráci ­
ónként.
 
A vizsgálathoz használt koncentrációk  
27. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához 
hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag koncentrációinak nagy osztásköz ű sorozatát használjuk. Annak érdekében, 
hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges 
változatában alkalmazandó lárvas űrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük 
ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehet ővé teszi a megfelel ő 
vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség.
 
28. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló 
vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekez ­
désben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontroll edények  
29. A vizsgálat során a megfelel ő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) bizto ­
sításához szükséges számú – a vizsgált anyaggal nem szennyezett üledéket tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele 
oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatá ­
sainak az ellen őrzése céljára külön kontroll edények szükségesek.
 
Vizsgálati elrendezés  
30. Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízmi ­
nőségi jellemz ők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusok ­
nak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken 
az oldott oxigénszint, túlságosan megn ő a kiválasztási termékek koncentrá ­
ciója, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékb ől és hatást gyako ­
rolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rend ­
szerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehet ővé tévő vizsgálati 
elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fed ővíz minőségének javítá ­
sára szolgáló módszerek, így például a leveg őztetés, általában elégségesek, 
és előnyben részesítend ők. 
Táplálék  
31. A lárvákat lehet őség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell 
etetni. Az els ő 10 napban a fiatal lárvák számára megfelel őnek tűnik 
naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a  C. yoshimatui  esetében 0,35–0,5 mg) 
haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, 
például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat 
hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegend őnek 
kell lennie. Gombaképz ődés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálék ­
adagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismé ­
telni. Erősen adszorbeálódó (példáull log K
 ow > 5) vagy az üledékbe kova ­
lens kötéssel beépül ő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélé ­
sének és természetes fejl ődésének biztosításához szükséges mennyiség ű 
táplálékot még a stabilizálódás id őszaka előtt a mesterséges üledékbe kever ­
hetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 
0,5 % (száraz tömeg) finomra őrölt nagy csalán ( Urtica dioica ), fehér eperfa 
(Morus alba ), fehér here ( Trifolium repens ), paraj ( Spinacia oleracea ) 
levelet vagy más növényi anyagot ( Cerophyl  vagy alfa-cellulóz) adhatunk 
az üledékhez).  
Inkubációs körülmények  
32. A lárvák vizsgálati edényekbe történ ő behelyezését követ ően lehetőleg 24 
órán keresztül finoman leveg őztessük a fed ővizet, és a vizsgálat egész 
időtartama alatt biztosítsunk gyenge leveg őztetést (ügyelve arra, hogy az 
oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a leveg ő telítettségi 
érték (ASV) 60 százaléka alá. A leveg őt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel 
rögzített üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy 
vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfonto ­
landó, hogy az üledék-víz elrendezés leveg őztetésétől eltekintsünk.  
33. A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó h őmérséklet mellett hajtsuk végre.  C. 
tentans  használata esetén 23 °C, a  C. yoshimatui  esetében pedig 25 °C az 
ajánlott h őmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 
500–1 000 lux fényintenzitással.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Expozíciós id őtartam  
34. A kitétel a lárvák szennyezett üledéket tartalmazó, illetve kontroll edényekbe 
történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós id őtartam a  
C. riparius  és a  C. yoshimatsui  esetében 28 nap,  C. tentans  használata 
esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok el őbb kikelnek, akkor a vizsgálatot 
legalább öt nappal azt követ ően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben 
az utolsó kifejlett példány megjelent.  
Megfigyelések  
Kikelés  
35. Meg kell határozni a fejl ődési időt és a kikelt kifejlett hím és n őstény 
árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismer ­
hetők 
36. A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellen őrizni a kontroll 
edényekben megfigyelhet őhöz képest rendellenesnek értékelhet ő viselkedést 
(például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható id őszaka alatt 
naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegy ­
ezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követ ően az 
árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekb ől. A vizsgálat befejezése 
előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe 
kerülésének megel őzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni 
továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhet ő számát. A kikelés méréséhez 
az 5. függelék nyújt útmutatást.  
Fejlődés és túlélés  
37. Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejl ődési adatait is be kell mutatni, akkor 
már a vizsgálat kezdetét ől fogva a kés őbbiekben használható kiegészít ő 
kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekb ől származó üledéket átszitáljuk 
egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritéri ­
umai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. 
A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlél ő 
lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, 
majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre es ő átlagos száraz tömegét. A 
túlélő lárvák fejl ődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszé ­
lesség mérése segítségével tehetjük meg.
 
Analitikai mérések  
A vizsgált anyag koncentrációja  
38. A vizsgálat megkezdése (azaz a lárvák behelyezése) el őtt kezelésenként 
legalább egy edényb ől vegyünk ömlesztett üledék mintát a vizsgált anyag 
koncentrációjának analitikai meghatározásához az üledékben. A fed ővíz, a 
pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál vett mintáit 
ajánlott legalább a vizsgálat kezdetén és végén analizálni (lásd a 24. bekez ­
dést). A vizsgált anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag viselkedésér ől/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben.
 
39. Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az 
analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gy űjthetők a kísérleti 
edényekb ől anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással 
lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigye ­
lések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekb ől származó mintákon 
kell elvégezni
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással 
történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Sz űrést is lehet alkalmazni, ameny ­
nyiben bizonyított, hogy sz űrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a 
minta mérete túl kicsi, akkor el őfordulhat, hogy nem analizálható a koncent ­
ráció a pórusvízben.  
Fizikai és kémiai paraméterek  
41. A kísérleti edények pH-ját és h őmérsékletét megfelel ő módon kell mérni 
(lásd a 10. bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncent ­
rációnál meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll 
edényekben és egy kísérleti edényben.  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
42. E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és n őstény árvaszú ­
nyogok összes számára és fejl ődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat 
esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltér ő érzékenységére, akkor a 
hímekre és a n őstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés 
céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisz ­
tikai megítélésére például a χ
 2 -r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 
nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy 
edényre es ő átlagos száraz tömegét.  
43. A száraz tömeg alapján meghatározott és kifejezett hatáskoncentrációkat 
lehetőleg a vizsgálat kezdetén mért üledékkoncentrációk alapján kell kiszá ­
mítani (lásd a 38. bekezdést).  
44. Az EC  50 vagy bármely más EC  x pontbecsléséhez az edényenkénti statiszti ­
kákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely EC  x konfidencia inter ­
vallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható 
mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek 
módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az EC
 x értékeket az eredeti 
válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani.  
45. Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történ ő 
meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatíva ­
ként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetek ­
ben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek.
 
Kikelési arány  
46. A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával 
elemezhet ők a lefelé lépeget ő eljárást alkalmazva, amennyiben arra számí ­
tunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvá ­
rásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát 
vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy 
Holm-féle eljárással történ ő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentráci ­
óhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran „extra-binomiális” variá ­
ciónak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle 
egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), 
majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na):  
ER ¼ n e 
n a 
ahol:  
ER = kikelési arány  
n e = kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma  
n a = behelyezett lárvák egy edényre jutó száma  
47. Egy másik, legf őképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkal ­
mazható lehet őség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, 
és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett 
próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy 
ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt.
 
48. Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket el őször négyzet ­
gyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átala ­
kítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat 
kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használ ­
hatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyö ­
kének az arkusz szinuszát (sin
 –1 ) adja.  
49. A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például 
probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelel ő 
szoftverrel stb.) számítjuk ki az EC  x értékeket. Ha a regressziós analízis 
alkalmatlannak bizonyul (például kett őnél kevesebb részleges válasz esetén), 
más nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszer ű 
interpolációt használunk.  
Fejlődési ütem  
50. Az átlagos fejl ődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történ ő behelyezését ől 
(a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos id őtar­
tamot jelenti. (A valódi fejl ődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a 
lárvák életkorát a behelyezés id őpontjában). A fejl ődési ütem a fejl ődési idő 
reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejl ődés egy napra es ő részét fejezi ki. 
Az ilyen jelleg ű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejl ő­
dési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normá ­
lishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejl ődési idő. Ennélfogva a 
fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását 
teszi lehet ővé, mint a fejl ődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejl ő­
dési ütemhez tartozó EC  x értékek becslésére regressziós analízist használunk 
(például (23), (24)).  
51. A következ ő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellen őrzési 
napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az 
ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti id őinter­
vallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejl ődési ütemet a 
következő képlet szerint számítjuk ki:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
ahol:  
x: egy edényre jutó átlagos fejl ődési ütem  
i: ellenőrzési intervallum indexe  
m: ellenőrzési intervallumok maximális száma  
ƒ i : az i ellen őrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma  
n e : kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (=  P ƒ i ) 
x i : az i ellen őrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejl ődési üteme  
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
ahol:  
day  i : ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma)  
l i : az i ellen őrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 
nap) 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
52. A vizsgálati jegyz őkönyvnek legalább a következ ő információkat kell tartal ­
maznia:  
Vizsgált anyag:  
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (víz ­
oldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az 
üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.),  
— kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, 
CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag 
mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét.  
A vizsgálathoz felhasznált faj:  
— a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az orga ­
nizmusok származása és tenyésztési körülményei,  
— a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk,  
— a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történ ő behelye­
zésükkor.  
Vizsgálati körülmények:  
— az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék,  
— természetes üledék esetén az üledékminta gy űjtésének helye és a minta ­
vételi hely leírása, beleértve lehet őség szerint a szennyezés történetét; 
jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha 
indokolt),  
— a mesterséges üledék el őállítása: összetev ők és jellemz ők (szerves szén ­
tartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén),  
— a vizsgálathoz használt víz el őállítása (mesterségesen készített víz 
esetén) és jellemz ői (oxigénkoncentráció, pH, vezet őképesség, kemény ­
ség, stb. a vizsgálat kezdetén),  
— az üledék és a fed ővíz mélysége,  
— a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel 
és pórusvíz nélkül,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— vizsgálati edények (anyag és méret),  
— az üledékszennyezés módszere: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, 
ismétlésszám és esetlegesen használt oldószer,  
— a szennyezett üledék-víz elrendezés stabilizálódása és egyensúlyi fázisa: 
időtartam és körülmények,  
— inkubációs körülmények: h őmérséklet, fényciklus és intenzitás, leveg őz­
tetés (gyakoriság és intenzitás),  
— a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészí ­
tését, mennyiségét és a táplálás rendjét.  
Eredmények:  
— a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a 
kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei,
 
— a víz min ősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, h őmérséklet, oldott 
oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom,  
— az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk,  
— a kikelt hím és n őstény árvaszúnyogok egy edényre és napra es ő száma,  
— ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma,  
— a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejl ődési szakaszra jutó 
átlagos száraz tömege,  
— ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím 
és nőstény árvaszúnyogok együttesen),  
— kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti 
átlagos fejl ődési üteme (hím és n őstény árvaszúnyogok együttesen),  
— toxicitási végpontok – például EC  x (és a hozzá tartozó konfidencia 
intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek,
 
— az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszert ől 
való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.  
SZAKIRODALOM  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA 
Workshop held in the Netherlands.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverteb ­
rates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first 
edition dated June 1994.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
(14) E melléklet C.8. vizsgálati módszere: Toxicitás földigilisztákra.  
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103–117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
E vizsgálati módszer alkalmazásában a következ ő fogalommeghatározások alkal ­
mazandók:  
Mesterséges üledék  vagy formulázott, kevert vagy m űüledék: a természetes 
üledék fizikai összetev őinek az imitálására használt anyagok keveréke.  
Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerül ő víz.  
Pórusvíz  vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet 
kitöltő víz.  
Szennyezett üledék : a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett üledék.  
Vizsgált vegyi anyag:  Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazá ­
sával vizsgált anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
2. függelék  
Ajánlások a  Chironomus riparius  tenyésztéséhez  
1. Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb edényekben 
tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvar ­
chomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelel ő 
szubsztrátumnak bizonyult (ebb ől vékonyabb, pár milliméternyi réteg is 
elegendő). Ezt követ ően töltsünk néhány centiméternyi megfelel ő vizet az 
edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megel őzése érdekében 
szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge leveg őztetést. A lárvatenyészt ő edényeket tartsuk 
egy megfelel ő ketrecben, amelyb ől a kikelő kifejlett példányok nem tudnak 
kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példányoknak a mozgásra, mert ellenkez ő esetben nem fognak párosodni (minimum kb. 30 
× 30 × 30 cm).
 
2. A ketreceket tartsuk szobah őmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó h őmérsék­
letű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 lux) 
és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légned ­
vesség gátolhatja a szaporodást.  
Hígítóvíz  
3. Bármilyen alkalmas természetes vagy m űvíz használható. Általában kútvizet, 
klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat el őtt a vizet leveg őz­
tetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt vizet. Ehhez 
a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyészt ő edényekb ől ügyelve 
arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne pusztítsuk.
 
A lárvák táplálása  
4. Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra 
Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyb ől naponta 
körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy 
vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú 
haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket kapjunk. Ebb ől a készítményb ől naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez 
(használat el őtt felrázandó). Az id ősebb lárvák kaphatnak ennél többet.
 
5. A táplálék mennyiségét a vízmin őséghez kell igazítani. Ha a tenyészt őközeg 
zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék 
mennyiségét szigorú ellen őrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a táplálék, 
akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor fokozódik a 
mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény 
a fejlődési ütem lassulását okozhatja.  
6. Az újonnan létesített tenyészt ő edényekhez zöldalga (például  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ) sejtek is adhatók.  
A kikelt kifejlett példányok táplálása  
7. Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített 
cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Kikelés  
8. 20 ± 2 °C h őmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap eltel ­
tével kezdenek megjelenni a lárvatenyészt ő edényekben. A hímek tollas 
csápjuk alapján könnyen megkülönböztethet ők. 
Petecsomók  
9. Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyészt őketrecben, a lárva ­
tenyésztő edényekben hetente háromszor ellen őrizni kell a lerakott zselatin ­
szerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell 
helyezni egy tenyészt ővíz-mintát tartalmazó kisméret ű edénybe. A petecso ­
mókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy 
toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel.  
10. Az els ő fejlődési szakaszban lév ő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük.  
Új tenyészetek létesítése  
11. A stabil tenyészetekb ől hetente vagy – a vizsgálati követelményekt ől 
függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a 
régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követ ően eltávo ­
lítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igényl ő módon biztosítható a 
kifejlett példányok rendszeres utánpótlása.  
A vizsgálathoz használt »M4« és »M7« oldatok el őállítása  
12. Az »M4« közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az »M7« 
közeg ugyanúgy készül, mint az »M4«, azzal a különbséggel, hogy az 1. 
táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az »M7« esetében négyszer alacsonyabb, mint az »M4« készítésekor. Az »M7« közegr ől szóló publi ­
káció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz hasz ­
nált oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell el őállítani, mert a 
törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H
 2 O, NaNO3, KH2PO4 és 
K2HPO4 koncentrációk nem megfelel ők. 
Az »M7« közeg el őállítása  
13. Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzs ­
oldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). 
Az »M7« közeg el őállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az 
egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyi ­
ségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készítünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblázatban 
meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás el őtt az »M7« 
közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tarta ­
ni). A közeget leveg őztetni és stabilizálni kell.
 
SZAKIRODALOM  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
1. táblázat  
Nyomelemek törzsoldatai az M4 és M7 közeghez  
(I) törzsoldatok Ion-mentesített 
vízzel 1 literre 
hígított 
mennyiség (mg) A (II) kombinált törzsoldat el őállítá­
sához az (I) törzsoldatok következ ő 
mennyiségeit (ml) elegyítjük és 
ionmentesített vízzel 1 literre 
hígítjuk Végleges koncentráció a 
vizsgálathoz használt oldatban (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Ezeknek az anyagoknak az esetében a fent jelzett módon eltér az M4 és az M7. 
( 2 ) Ezeket az oldatokat külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni.  
2. táblázat  
Makrotápanyagok törzsoldatai az M4 és M7 közeghez  
Ion-mentesített vízzel 
1 literre hígított 
mennyiség 
(mg) Makrotápanyagok törzs ­
oldatainak M4 és M7 közeg 
előállításához használt 
mennyisége 
(ml/l) Végleges koncentráció 
a vizsgálathoz használt 
M4 és M7 oldatban 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
3. táblázat  
Vitamin-törzsoldatok az M4 és M7 közeghez. A három vitaminoldatból egyetlen kombinált 
vitamin-törzsoldatot készítünk  
Ion-mentesített vízzel 1 
literre hígított 
mennyiség 
(mg) Vitamin- törzsoldat M4 és 
M7 közeg el őállításához 
használt mennyisége 
(ml/l) Végleges koncentráció a 
vizsgálathoz használt 
M4 és M7 oldatban 
(mg/l)  
Tiamin-hidroklorid 750 0,1 0,075 
Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
SZAKIRODALOM  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Kultúrad in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Kultúra Conditions on LIFE History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
3. függelék  
MESTERSÉGES ÜLEDÉK KÉSZÍTÉSE  
Az üledék összetétele  
A mesterséges üledék összetétele a következ ő: 
Összetevő Jellemz ők Üledék száraz 
tömegének %-a  
Tőzeg T őzegmoha, amelynek pH-ja 
a lehető legközelebb esik az 
5,5-6,0 értékhez, és nem 
tartalmaz látható növény ­
maradványokat, finomra őrölve (részecskeméret ≤ 
1 mm) és leveg őn szárítva 4 - 5 
Kvarchomok Szemcseméret: a részecskék 
több mint 50 százaléka a 50–200 μm tartományban 75 - 76 
Kaolinit agyag Kaolinit tartalom ≥ 30 % 20 
Szerves szén T őzeg és homok hozzáadá ­
sával beállítva 2 (± 0,5) 
Kalcium-karbonát Porított, vegytiszta CaCO
 3 0,05 - 0,1 
Víz Vezet őképesség ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Elkészítés  
A levegőn szárított t őzeget finom porrá őröljük. Nagyteljesítmény ű homogenizáló 
készülék segítségével ionmentesített vízzel szuszpenziót készítünk a szükséges 
mennyiség ű tőzegporból. A szuszpenzió pH-ját CaCO  3 hozzáadásával beállítjuk 
5,5 ± 0,5 értékre. A pH és a mikrobiológiai összetétel stabilizálása végett 20 ± 2 °C hőmérsékleten lassú keveréssel legalább két napig kondicionáljuk a szusz ­
penziót. Az ezt követ ően ismét megmért pH-nak 6,0 ± 0,5 értéket kell mutatnia. 
Ezek után a szuszpenziót összekeverjük a többi összetev ővel (homok és kaoli ­
nagyag), valamint az ionmentesített vízzel úgy, hogy az üledék száraz tömegének 30–50 százaléka közötti víztartalommal rendelkez ő, homogén üledéket kapjunk. 
A végtermékként kapott keverék pH-ját ismételten megmérjük, és szükség esetén 
CaCO
 3 hozzáadásával beállítjuk 6,5–7,5 értékre. Az üledékb ől vett minta alapján 
meghatározzuk a száraz tömeget és a szerves széntartalmat. Ezt követ ően az 
árvaszúnyogokkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás el őtt ajánlott 
a mesterséges üledéket hét napig a vizsgálatban használni kívántakkal megegyez ő 
körülmények között kondicionálni.  
Tárolás  
A mesterséges üledék el őállításához használt száraz összetev ők száraz, h űvös 
helyen, szobah őmérsékleten tárolhatók. Az összeállított (nedves) üledék a vizs ­
gálatban való felhasználás el őtt nem tárolható. Az el őállításának záró lépését 
képező 7 napos kondicionálási id őszakot követ ően azonnal fel kell használni.  
SZAKIRODALOM  
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
4. függelék  
Az elfogadható hígítóvíz kémiai tulajdonságai  
Anyag Koncentráció  
Szemcsés anyag < 20 mg/l 
Összes szerves szén < 2 mg/l Ionizálatlan ammónia < 1 μg/l 
Keménység CaCO
 3 koncentrációban kifejezve < 400 mg/l (*) 
Maradék klór < 10 μg/l 
Összes szerves foszfort tartalmazó növényvéd ő szer < 50 ng/l 
Összes szerves klórt tartalmazó növényvéd ő szer plusz 
poliklórozott bifenilek < 50 ng/l 
Összes szerves klór < 25 ng/l  
(*) Meg kell azonban jegyezni, hogy ha a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag 
között gyaníthatóan kölcsönhatás alakul ki, akkor lágyabb vizet kell alkalmazni (és ezért 
az Elendt-féle M4 közeg ilyen esetben nem alkalmazható).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
5. függelék  
Útmutató az árvaszúnyoglárvák kikelésének figyelemmel kíséréséhez  
A vizsgálati edényekre csapdákat helyezünk a kikelt példányok számára. A 
csapdák a 20. naptól a vizsgálat végéig szükségesek. Ezek egy példáját mutatja be az alábbi ábra:
 
A: nylon háló  
B: fejjel lefelé fordított m űanyagpohár  
C: vizsgálati edény, kiönt ő nélkül  D: hálós vízcserél ő nyílás  
E: víz  
F: üledék  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  SZENNYEZETT VÍZZEL VÉGZETT ÜLEDÉK-VÍZ TOXICITÁSI 
VIZSGÁLAT ÁRVASZÚNYOGLÁRVÁKKAL  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 219. vizsgálati iránymutatá ­
sában (2004) leírt módszerrel. E vizsgálati módszer célja a kétszárnyúak 
rendjébe tartozó édesvízi üledéklakó árvaszúnyoglárvák vegyi anyagoknak való tartós kitettsége hatásainak az értékelése. F őként a BBA mesterséges 
talajjal és vízoszlopban való expozíciós forgatókönyvvel végzett üledék-víz 
vizsgálati elrendezésre vonatkozó iránymutatásán alapul (1). Figyelembe 
veszi továbbá a  Chironomus riparius  és Chironomus tentans  árvaszúnyog 
fajokkal végzett toxicitás vizsgálati protokollokat, amelyeket Európában és Észak-Amerikában (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) dolgoztak ki, és körvizsgálatnak 
vetettek alá (1)(6)(9). Más jól dokumentált árvaszúnyog fajok, például  
Chironomus yoshimatsui  (10)(11) is használhatók.
 
2. A vizsgálati módszer által alkalmazott expozíciós forgatókönyv a víz szeny ­
nyezése. A megfelel ő expozíciós forgatókönyv a vizsgálat tervezett felhasz ­
nálásától függ. A vízoszlopban való expozíción alapuló forgatókönyv a 
vízoszlop szennyezését foglalja magában, amely a növényvéd ő szerek 
permetezéssel történ ő vízbe jutását hivatott szimulálni, és a pórusvízben 
mérhető kezdeti csúcskoncentrációkra terjed ki. A vizsgálat id őtartamánál 
hosszabb ideig tartó felhalmozódással járó folyamatok kivételével más 
típusú expozíciók (többek között a vegyi anyagok kiömlése) esetén is hasz ­
nos. 
3. Az anyagok, amelyek üledéklakó organizmusokra gyakorolt hatását vizs ­
gálni kell, általában hosszú ideig maradnak ebben a környezetben. Az üledéklakó organizmusok többféle módon lehetnek kitéve ezeknek az anya ­
goknak. Az egyes expozíciós útvonalak viszonylagos fontossága és a teljes 
toxikus hatás egyes expozíciós útvonalaknak tulajdonítható részének kiala ­
kulásához szükséges id őtartam az érintett vegyi anyag fizikai és kémiai 
tulajdonságaitól függ. Az er ősen adszorbeálódó (például log K
 ow > 5) 
vagy az üledékbe kovalens kötéssel beépül ő anyagok esetében fontos expo ­
zíciós útvonal lehet a szennyezet táplálék megemésztése. Az er ősen lipofil 
anyagok toxicitása alulbecsülésének elkerülése érdekében megfontolandó, hogy a táplálékot a vizsgált anyaggal való szennyezést megel őzően az 
üledékbe keverjük. Az itt bemutatott vizsgálati módszer a tartós kitettségre 
épül, amely azt a célt szolgálja, hogy valamennyi lehetséges expozíciós útvonal figyelembe vehet ő legyen. A vizsgálat id őtartama a  C. riparius  és 
a C. yoshimatsui  esetében 20–28 nap, a  C. tentans  esetében 28–65 nap. Ha 
egy meghatározott célra – például instabil vegyületek hatásainak a vizsgála ­
tára – rövid távú adatok kellenek, a felesleges ismétlések tíz nap után eltávolíthatók.
 
4. A mért végpontok a kikelt kifejlett példányok száma és a kikeléshez szük ­
séges idő. Ha kiegészít ő rövid távú adatokra van szükség, akkor a lárvák 
túlélésének és fejl ődésének mérését csak a tíznapos id őszak eltelte után 
ajánlott megkezdeni, megfelel ő számú ismétlést alkalmazva.  
5. Mesterséges üledék használata ajánlott. A mesterséges üledék számos el őny­
nyel rendelkezik a természetes üledékkel szemben:  
— a kísérlet változékonysága kisebb, mivel a mesterséges üledék egy repro ­
dukálható „szabványosított közeget” biztosít, és nem kell szennyezés ­
mentes, tiszta üledékforrást keresni,  
— a vizsgálatok bármikor elkezdhet ők anélkül, hogy a vizsgálathoz hasz ­
nált üledék szezonális változékonyságát figyelembe kellene venni, és az üledéket nem kell el őzetes kezelésnek alávetni a honos fauna eltávolítása 
végett; a mesterséges üledék alkalmazása a rutinvizsgálatokhoz szük ­
séges mennyiség ű üledék terepen történ ő gyűjtésével kapcsolatos költ ­
ségeket is csökkenti,
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— a mesterséges üledék alkalmazása lehet ővé teszi a különböz ő anyagok 
toxicitásának összehasonlítását és ennek megfelel ő rangsorolását: a termé ­
szetes és a mesterséges üledékkel végzett vizsgálatokból származó toxici ­
tási adatok számos vegyi anyag esetében összehasonlíthatók voltak (2).  
6. A használt fogalmak meghatározását az 1. függelék tartalmazza.  
A VIZSGÁLAT ELVE  
7. Első fejlődési szakaszban lév ő árvaszúnyoglárvákat teszünk ki a vizsgált 
anyag különböz ő koncentrációinak üledék-víz elrendezésekben. A vizsgálat 
kezdetén els ő fejlődési szakaszban lév ő lárvákat helyezünk az üledék-víz 
elrendezést tartalmazó vizsgálati edényekbe, majd ezt követ ően a vizsgált 
anyaggal szennyezzük a vizet. Az árvaszúnyoglárvák kikelésének és fejl ő­
désének ütemét a vizsgálat végén mérjük. Szükség esetén 10 nap elteltével 
is mérhetjük a lárvák túlélését és súlyát (megfelel ő számú ismétlést alkal ­
mazva). A kapott adatokból regressziós modell segítségével megbecsüljük azt a koncentrációt, amely a kikelésnek vagy a lárvák túlélésének, illetve fejlődésének x %-os csökkenését okozná (például EC
 15 , EC  50 , stb.), vagy 
statisztikai hipotézisvizsgálattal meghatározzuk a megfigyelhet ő hatást nem 
okozó koncentrációt, illetve a megfigyelhet ő hatást okozó legkisebb 
koncentrációt (NOEC/LOEC). Az utóbbi esetben a hatást okozó értékeket statisztikai vizsgálatok segítségével össze kell hasonlítani a kontroll értékek ­
kel.
 
A VIZSGÁLT ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
8. Ismerni kell a vizsgált anyag vízoldékonyságát, páranyomását, mért vagy 
számított megoszlását az üledékben, valamint stabilitását vízben és az üledékben. Rendelkezni kell egy megbízható analitikai módszerrel a vizsgált anyag mennyiségi meghatározásához a fed ővízben, a pórusvízben és az 
üledékben, amelynek pontossága és kimutatási határa ismert és dokumentált. 
Hasznos információ a vizsgált anyag szerkezeti képlete és kémiai tisztasága. Ugyancsak hasznos információ, hogy milyen kémiai folyamatokon megy keresztül a vizsgált anyag (például disszipáció, nem biológiai és biológiai 
lebomlás, stb.). A vizsgálat elvégzését megnehezít ő fizikai és kémiai tulaj ­
donságokkal rendelkez ő anyagok vizsgálatára vonatkozóan a szakirodalom 
(12) nyújt további tájékoztatást.
 
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
9. A vizsgálati protokoll és a vizsgálati körülmények megbízhatóságának 
megerősítése céljából rendszeres id őközönként érdemes 
referencia-vegyianyagokkal elvégezni a vizsgálatot. Körvizsgálatokban és 
validálási vizsgálatokban eredményesen használt mérgez ő referenciaanyagok 
például a következ ők: lindane, trifluralin, pentaklórfenol, kadmium-klorid és 
a kálium-klorid (1)(2)(5)(6)(13).  
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
10. A következ ő feltételeknek kell teljesülniük ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes 
legyen:  
— A lárvák kikelésének aránya a kontroll edényekben legalább 70 % a 
vizsgálat végén (1)(6).  
— A kontroll edényekben 12–23 nappal a behelyezést követ ően kell 
megjelenniük a kifejlett  C. riparius  és C. yoshimatsui  példányoknak; a  
C. tentans  esetében ehhez 20–65 nap szükséges.  
— A vizsgálat végén mindegyik edényben meg kell mérni a pH-t és az 
oldott oxigén koncentrációját. Az oxigénkoncentrációnak a leveg ő alkal­
mazott hőmérséklet melletti telítettségi értéke (ASV) legalább 60 %-ának 
kell lennie, a fed ővíz pH-értékének pedig minden edényben a 6–9 tarto ­
mányon belülre kell esnie.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— a víz h őmérséklete legfeljebb ± 1,0 °C-kal változhat. A vízh őmérséklet 
szabályozásának egyik lehetséges módja, hogy a vizsgálatot állandó 
hőmérséklet ű helyiségben végezzük, amely esetben a helyiség h őmér­
sékletét megfelel ő időközönként ellen őrizni kell.  
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Vizsgálati edények  
11. A vizsgálatot 600 ml-es üvegedényekben végezzük, amelyek átmér ője 8 cm. 
Amennyiben az üledék és a fed ővíz megfelel ő mélysége biztosított, ett ől 
eltérő edények is alkalmazhatók. Lárvánként 2–3 cm  2 nagyságú üledékfelü ­
letet kell biztosítani. Az üledékréteg és a fed ővíz mélységének aránya 1:4 
legyen. A vizsgálati edényeknek és a vizsgálati elrendezéssel érintkez ő 
egyéb készülékeknek teljes mértékben üvegb ől vagy más kémiailag 
semleges anyagból (például teflon) kell készülniük.  
A fajok kiválasztása  
12. A vizsgálatot lehet őleg a  Chironomus riparius  fajjal végezzük.  Chironomus 
tentans  is alkalmazható, de nehezebben kezelhet ő, és hosszabb vizsgálati 
időszakot igényel.  Chironomus yohimatsui  szintén használható. A 2. függe ­
lékben részletezett tenyésztési módszerek a  Chironomus riparius  fajra vonat ­
koznak. A szakirodalomban más fajok – úgymint a  Chironomus tentans  (4) 
és a Chironomus yoshimatsui  (11) – tenyésztési körülményeire vonatkozó 
tudnivalók is megtalálhatók. A vizsgálat megkezdése el őtt ellenőrzésképpen 
fajmeghatározást kell végezni, de ha a példányok saját tenyészetb ől szár­
maznak, akkor ezt nem szükséges minden vizsgálat el őtt megtenni.  
Üledék  
13. Lehet őleg mesterséges üledék (más néven formulázott, kevert vagy m űüle­
dék) használata ajánlott. Ha azonban mégis természetes üledéket használunk, 
akkor azt jellemezni kell (legalább a pH-t és a szerves széntartalmat meg kell határozni, de más paraméterek, például a C/N arány és a szemcseszer ­
kezet vizsgálata is ajánlott), és mentesnek kell lennie mindenféle szeny ­
nyezéstől, valamint az árvaszúnyoggal verseng ő vagy az azt fogyasztó 
egyéb organizmusoktól. Az árvaszúnyoglárvákkal végzett toxicitási vizs ­
gálatban való felhasználás el őtt ajánlott továbbá a természetes üledéket az 
elkövetkez ő vizsgálat során uralkodókkal megegyez ő körülmények között 
hét napon keresztül kondicionálni. E vizsgálat során az alábbi, a C.8. vizs ­
gálati módszerben (14) alkalmazott mesterséges talajon alapuló mesterséges üledék alkalmazása ajánlott (1)(15)(16):
 
a) 4–5 % (száraz tömeg) t őzeg, amelynek pH-ja a lehet ő legközelebb esik 
az 5,5–6,0 értékhez; fontos, hogy por alakú, finomra őrölt (részecs ­
keméret ≤ 1 mm) és kizárólag leveg őn szárított t őzeget használjunk.  
b) 20 % (száraz tömeg) kaolinagyag (lehet őleg 30 % feletti kaolinit tarta ­
lommal).  
c) 75–76 % (száraz tömeg) kvarchomok (túlnyomó részben finom homok, 
amely részecskéinek több mint 50 %-a 50 és 200 μm közötti szemcse ­
mérettel rendelkezik).  
d) Annyi ionmentesített víz, amely ahhoz szükséges, hogy végtermékként 
30-50 % nedvességtartalmú keveréket kapjunk.  
e) A végtermékként kapott üledékkeverék pH-jának 7,0 ± 0,5 értékre 
történő beállításához szükséges mennyiség ű vegytiszta min őségű 
kalcium-karbonát (CaCO  3 ). 
f) A végtermékként kapott keveréknek 2 % (±0,5 %) szerves széntarta ­
lommal kell rendelkeznie, amelyet az a) és c) pont szerinti megfelel ő 
mennyiség ű tőzeg és homok hozzáadásával érünk el.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. A tőzegnek, a kaolinagyagnak és a homoknak ismert forrásból kell származ ­
nia. Ellen őrizni kell, hogy az üledék összetev őiben nem fordulnak el ő 
kémiai szennyez ődések (például nehézfémek, szerves klórvegyületek, 
szerves foszforvegyületek, stb.) A mesterséges üledék elkészítésének egy példáját a 3. függelék mutatja be. Száraz összetev ők keverése is elfogadott, 
amennyiben bizonyítható, hogy a fed ővíz hozzáadását követ ően az üledék 
nem esik szét összetev őire (például a vízben lebeg ő tőzegrészecskékre), és a 
tőzeget vagy az üledéket megfelel ően kondicionáltuk.
 
Víz 
15. Az elfogadható hígítóvíz 2. és 4. függelékben felsorolt kémiai tulajdonsá ­
gaival rendelkez ő bármely víz alkalmas a vizsgálathoz. Tenyészt ővízként és 
kísérleti vízként bármely alkalmas víz, természetes víz (felszíni vagy talaj ­
víz), mesterséges víz (lásd a 2. függeléket) vagy klórtalanított csapvíz elfo ­
gadható, amelyben az árvaszúnyoglárvák a tenyésztés és a vizsgálat időszaka alatt életben maradnak anélkül, hogy stressz jeleit mutatnák. A 
vizsgálat kezdetén a vizsgálathoz alkalmazott víz pH-értékének 6 és 9 között 
kell lennie, keménysége pedig nem haladhatja meg a 400 mg/l CaCO
 3 
értéket. Ennél lágyabb vizet kell azonban alkalmazni akkor, ha gyanítható, 
hogy a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag között kölcsönhatás 
alakul ki (és ezért ebben az esetben az Elendt-féle M4 közeg nem alkal ­
mazható). A vizsgálat teljes id őtartama alatt ugyanazt a víztípust kell hasz ­
nálni. A 4. függelékben felsorolt vízmin őségi jellemz őket évente legalább 
kétszer kell mérni, illetve minden olyan alkalommal, amikor fennáll a 
gyanúja annak, hogy e jellemz ők jelentős mértékben megváltoztak.  
Törzsoldatok – szennyezett víz  
16. A vizsgálathoz használt koncentrációk kiszámítása a vízoszlopban, azaz az 
üledék feletti vízrétegben mérhet ő koncentrációk alapján történik. A vizs ­
gálathoz használt, választott koncentrációjú oldatokat általában törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldatokat lehet őség szerint a vizsgált anyag 
vizsgálathoz használt közegben való feloldásával kell elkészíteni. Egyes 
esetekben oldószer vagy diszpergálószer használatára lehet szükség a megfelelő töménység ű törzsoldat el őállításához. Alkalmas oldószerek 
például a következ ők: aceton, etanol, metanol, etilénglikol-dimetiléter, dime ­
tilformamid és trietilén-glikol. A felhasználható diszpergálószerek: 
Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulóz (0,01 %-os) és HCO-40. Az oldódást segít ő szer csak minimális (azaz ≤ 0,1 ml/l) koncentrációban 
lehet jelen a végtermékként kapott, vizsgálathoz használandó közegben, és 
minden kezeléshez ugyanazt a szert kell használni. Az oldódást segít ő szer 
nem lehet jelent ős hatással a túlélésre, és nem lehet látható hátrányos hatása 
az árvaszúnyoglárvákra a csak oldószerrel kezelt kontrollcsoporttal végzett vizsgálat által feltártak alapján.
 
A VIZSGÁLAT MEGTERVEZÉSE  
17. A vizsgálat megtervezése a vizsgálat során alkalmazott koncentrációk 
számának és osztásközének, az egyes koncentrációkkal használt edények 
számának, valamint a lárvák edényenkénti számának a megválasztását jelenti. Ideális esetben a vizsgálatot az alábbiakra tekintettel kell megter ­
vezni. Az EC pontnak és a NOEC becslésének, valamint a határérték-vizs ­
gálatnak a megtervezését ismertetjük. A hipotézisvizsgálat els ődleges 
módszere a regressziós analízis.
 
A regressziós analízis megtervezése  
18. A vizsgálat során alkalmazott koncentrációknak le kell fedniük a hatáskon ­
centrációt (például EC  15 , EC  50 ) és azt a koncentrációtartományt, amelyen 
belül a vizsgált anyag érdekl ődésre számot tartó hatással rendelkezik. A 
hatáskoncentráció becsléseknek (EC  x ) a pontossága és különösképpen az érvé ­
nyessége általában jobb, ha a hatáskoncentráció a vizsgált koncentrációtarto ­
mányon belül helyezkedik el. A lehet ő legkisebb pozitív koncentrációnál jóval  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
alacsonyabb és a legnagyobb koncentrációnál jóval magasabb értékek 
extrapolálását kerülni kell. Az alkalmazandó koncentrációtartomány kiválasz ­
tásához hasznos lehet el őzetes behatároló vizsgálatot végezni (lásd 27. 
bekezdés).  
19. Az EC  x becsléséhez legalább öt koncentrációt kell vizsgálni, és mindegyik 
koncentráció esetében három ismétlést kell alkalmazni. A jó modellbecslés 
lehetővé tétele érdekében minden esetben tanácsos elegend ő vizsgálati 
koncentrációt használni. A rákövetkez ő koncentráció legfeljebb kétszerese 
legyen az el őzőnek (kivételt képeznek azok az esetek, amikor a dózis-válasz 
görbe lapos). Az eltér ő választ kiváltó vizsgálati koncentrációk számának 
emelkedése esetén az egyes kezeléseknél alkalmazott ismétlésszám csök ­
kenthető. Az ismétlésszám növelése vagy a vizsgálat során alkalmazott 
koncentráció intervallum sz űkítése általában a konfidencia intervallum csök ­
kenéséhez vezet. A lárvák tíznapos túlélési arányának és fejl ődési sebes ­
ségének a becslése esetén további ismétlések szükségesek.  
A NOEC/LOEC becslésének megtervezése  
20. A LOEC/NOEC becsléséhez öt koncentrációt kell vizsgálni legalább négy 
ismétlést alkalmazva úgy, hogy a rákövetkez ő koncentráció legfeljebb 
kétszerese legyen az el őzőnek. Az ismétlések számának elegend őnek kell 
lennie ahhoz, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os 
szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelel ő valószínűséggel kimutasson 
egy statisztikai próba. A fejl ődési ütem esetében általában 
varianciaanalízist (ANOVA), például Dunnett vagy Williams próbát 
(17)(18)(19)(20) lehet alkalmazni. Ha a kikelési arányt vizsgáljuk, akkor 
a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni-féle korrekcióval) vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk.
 
Határérték-vizsgálat  
21. Határérték-vizsgálatot akkor lehet végezni (egy vizsgálati és egy kontroll 
koncentrációval), ha az el őzetes behatároló vizsgálat során nem voltak 
megfigyelhet ő hatások. A határérték-vizsgálat célja annak jelzése, hogy a 
vizsgált anyagra vonatkozó toxikus érték nagyobb, mint a vizsgált koncent ­
rációs határérték. Ennél a vizsgálati módszernél nem lehet meghatározni az ajánlott koncentrációt; ez a szabályozók megítélését ől függ. Általában mind 
a kezelés, mind a kontroll esetében legalább hat ismétlés szükséges. Bizo ­
nyítni kell, hogy a kontrollhoz viszonyított 20 %-os különbséget 5 %-os szignifikancia-szint (p = 0,05) mellett megfelel ő valószín űséggel képes 
kimutatni egy statisztikai próba. Metrikus válasz (fejl ődési ütem és súly) 
esetén alkalmas statisztikai módszer a t-próba, ha az adatok az alkalmazási 
feltéteknek (normalitás, szóráshomogenitás) megfelelnek. Ha a feltételek nem teljesülnek, akkor a nem egyenl ő szórásnégyzeteket feltételez ő 
t-próba vagy egy nemparaméteres próba, például a Wilcoxon-Mann-Whithey 
próba alkalmazható.
 
ELJÁRÁS  
Expozíciós körülmények  
A szennyezett víz – üledék elrendezés el őállítása  
22. A vizsgálati edényekbe megfelel ő mennyiség ű mesterséges üledéket (lásd a 
3. függelék 13–14. bekezdéseit) helyezünk úgy, hogy az üledékréteg 
legalább 1,5 cm legyen. 6 cm mélységig vizet adunk hozzá (lásd a 15. 
bekezdést). Az üledékréteg és a víz mélységének az aránya legfeljebb 1:4 lehet, és az üledékréteg mélysége nem haladhatja meg a 3 cm-t. A vizs ­
gálathoz használt organizmusok behelyezése el őtt hét napon keresztül 
finoman leveg őztessük az üledék-víz elrendezés (lásd a 14. bekezdést és a 
3. függeléket). Annak elkerülése érdekében, hogy a vizsgálathoz használt víz hozzáadása során az üledék összetev őire essen szét, és a finom anyag a 
vízrétegben felkavarodjon, az üledéket letakarhatjuk egy m űanyag lappal, 
miközben a vizet ráöntjük, amelyet közvetlenül a felöntést követ ően eltávo ­
lítunk. Erre a célra más eszközök is alkalmasak lehetnek.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. A vizsgálati edényeket le kell fedni (például üveglappal). Az eredeti vízszint 
fenntartása érdekében a vizsgálat során pótoljuk az elpárolgott vizet, ha 
szükséges. A sófelhalmozódás elkerülése végett desztillált vagy ionmentesí ­
tett vizet használjunk.  
A vizsgálathoz használt organizmusok hozzáadása  
24. A vizsgálathoz használt organizmusok vizsgálati edényekbe történ ő behelye­
zése előtt négy-öt nappal helyezzük a tenyészetb ől gyűjtött petecsomókat 
tenyésztőközeget tartalmazó kisméret ű edényekbe. A törzstenyészetb ől vett 
vagy frissen készített tenyészt őközeg egyaránt használható. Ez utóbbi hasz ­
nálata esetén adjunk a tenyészt őközeghez kis mennyiség ű táplálékot, például 
zöldalgát és/vagy finomra őrölt pehely formájú haleledelb ől készített szusz ­
penzió szüredékéb ől néhány cseppet (lásd a 2. függeléket). Csak frissen 
lerakott petecsomókat szabad használni. A lárvák általában néhány nappal 
a peterakást követ ően kezdenek kikelni (a  Chironomus riparius  esetében ez 
20 °C-on 2–3 nap, a  Chironomus tentans  és a  Chironomus yoshimatui  
esetében pedig 23 °C-on, illetve 25 °C-on 1–4 nap). A lárvák fejl ődése 
négy, egyenként 4–8 napig tartó szakaszra osztható. A vizsgálathoz az 
első fejlődési szakaszban lév ő lárvákat kell gy űjteni (2–3 vagy 1–4 nappal 
a kikelést követ ően). Az árvaszúnyoglárvák fejl ődési szakaszát a fejszé ­
lesség alapján ellen őrizhetjük (6).  
25. Mindegyik szennyezett üledéket és vizet tartalmazó vizsgálati edénybe húsz 
darab, tetsz őlegesen kiválasztott lárvát helyezünk egy tompa vég ű pipetta 
segítségével. A lárvák vizsgálati edénybe helyezésének ideje alatt állítsuk le 
a víz leveg őztetését, és a behelyezést követ ő 24 órás id őszakon keresztül 
hagyjuk így (lásd a 24. és a 32. bekezdést). Az alkalmazott vizsgálati tervnek (lásd a 19. és a 20. bekezdést) megfelel ően az EC pont becsléséhez 
legalább 60, a NOEC meghatározásához 80 lárvát használjunk koncentráci ­
ónként.
 
26. Huszonnégy órával a lárvák behelyezését követ ően a vizsgált anyaggal 
szennyezzük a fed ővíz-réteget, és ismét gyenge leveg őztetést biztosítunk. 
Pipettával kis mennyiséget juttatunk a vízfelszín alá a vizsgált anyag olda ­
tából. Ezt követ ően a fedővizet gondosan megkeverjük, ügyelve arra, hogy 
az üledék ne kavarodjon fel.  
A vizsgálathoz használt koncentrációk  
27. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációk meghatározásához 
hasznos lehet behatároló vizsgálatot végezni. E célra a vizsgált anyag 
koncentrációinak nagy osztásköz ű sorozatát használjuk. Annak érdekében, 
hogy az egy árvaszúnyoglárvára jutó felület megfeleljen a vizsgálat végleges változatában alkalmazandó lárvas űrűségnek, a lárvákat annyi ideig tesszük 
ki a vizsgált anyag egyes koncentrációinak, amely lehet ővé teszi a megfelel ő 
vizsgálati koncentrációk becslését anélkül, hogy ismétlésekre lenne szükség.
 
28. A vizsgálat végleges változatában használt koncentrációkat a behatároló 
vizsgálat eredménye alapján határozzuk meg. Legalább öt, a 18–20. bekez ­
désben leírt módszerrel kiválasztott koncentrációt kell használni.  
Kontroll edények  
29. A vizsgálat során a megfelel ő ismétlésszám (lásd a 19–20. bekezdést) bizto ­
sításához szükséges számú – csak üledéket, a vizsgált anyagot viszont nem tartalmazó – kontroll edényt kell alkalmazni. Ha a vizsgált anyag bevitele 
oldószer segítségével történt (lásd a 16. bekezdést), akkor az oldószer hatá ­
sainak az ellen őrzése céljára külön kontroll edények szükségesek.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Vizsgálati elrendezés  
30. Statikus elrendezést alkalmazunk. Kivételes esetekben – például ha a vízmi ­
nőségi jellemz ők nem felelnek meg a vizsgálathoz használt organizmusok ­
nak, vagy befolyásolják a kémiai egyensúlyt (például túlságosan lecsökken 
az oldott oxigénszint, túlságosan megn ő a kiválasztási termékek koncentrá ­
ciója, vagy ásványi anyagok lúgozódnak ki az üledékb ől és hatást gyako ­
rolnak a víz pH-jára és/vagy keménységére) – félstatikus vagy átfolyó rend ­
szerű, a fedővíz szakaszos vagy folyamatos cseréjét lehet ővé tévő vizsgálati 
elrendezések is alkalmazható. Mindazonáltal a fed ővíz minőségének javítá ­
sára szolgáló módszerek, így például a leveg őztetés, általában elégségesek, 
és előnyben részesítend ők. 
Táplálék  
31. A lárvákat lehet őség szerint naponta vagy legalább hetente háromszor kell 
etetni. Az els ő 10 napban a fiatal lárvák számára megfelel őnek tűnik 
naponta lárvánként 0,25–0,5 mg (a  C. yoshimatui  esetében 0,35–0,5 mg) 
haleledelt adni (amely lehet vizes szuszpenzió vagy finomra őrölt eledel, 
például Tetra-Min vagy Tetra-Phyll; a részleteket lásd a 2. függelékben). Az idősebb lárváknak valamivel több táplálékra lehet szükségük: a vizsgálat 
hátralevő részében lárvánként naponta 0,5–1 mg mennyiségnek elegend őnek 
kell lennie. Gombaképz ődés vagy a lárvák pusztulása esetén a táplálék ­
adagot valamennyi kísérleti és kontroll edényben csökkenteni kell. Ha a gombák szaporodása nem állítható meg, akkor a vizsgálatot meg kell ismé ­
telni. Erősen adszorbeálódó (például log K
 ow > 5) vagy az üledékbe kova ­
lens kötéssel beépül ő anyagok vizsgálata esetén az organizmusok túlélé ­
sének és természetes fejl ődésének biztosításához szükséges mennyiség ű 
táplálékot még a stabilizálódás id őszaka előtt a mesterséges üledékbe kever ­
hetjük. Erre a célra haleledel helyett növényi anyagot használjunk (például 
0,5 % finomra őrölt nagy csalán ( Urtica dioica ), fehér eperfa ( Morus alba ), 
fehér here ( Trifolium repens ), paraj ( Spinacia oleracea ) levelet vagy más 
növényi anyagot ( Cerophyl  vagy alfa-cellulóz) adhatunk az üledékhez).  
Inkubációs körülmények  
32. A lárvák vizsgálati edényekbe történ ő behelyezését követ ően lehetőleg 24 
órán keresztül finoman leveg őztessük a fed ővizet, és a vizsgálat egész 
időtartama alatt biztosítsunk gyenge leveg őztetést (ügyelve arra, hogy az 
oldott oxigén koncentrációja ne süllyedjen a leveg ő telítettségi 
érték (ASV) 60 %-a alá. A leveg őt az üledékréteg fölött 2–3 cm-rel rögzített 
üveg Pasteur pipettán keresztül vezessük be (másodpercenként egy vagy néhány buborék). Illékony vegyi anyagok vizsgálata esetén megfontolandó, 
hogy az üledék-víz elrendezés leveg őztetésétől eltekintsünk.
 
33. A vizsgálatot 20 °C (± 2 °C) állandó h őmérséklet mellett hajtsuk végre.  C. 
tentans  használata esetén 23 °C, a  C. yoshimatui  esetében pedig 25 °C az 
ajánlott h őmérséklet (± 2 °C). 16 órás fényperiódust alkalmazzunk, 
500–1 000 lux fényintenzitással.  
Expozíciós id őtartam  
34. A kitétel a lárvák szennyezett vizet tartalmazó, illetve kontroll edényekbe 
történő behelyezésekor veszi kezdetét. A maximális expozíciós id őtartam a  
C. riparius  és a  C. yoshimatsui  esetében 28 nap,  C. tentans  használata 
esetén 65 nap. Ha az árvaszúnyogok el őbb kikelnek, akkor a vizsgálatot 
legalább öt nappal azt követ ően lehet befejezni, hogy a kontroll edényekben 
az utolsó kifejlett példány megjelent.  
MEGFIGYELÉSEK  
Kikelés  
35. Meg kell határozni a fejl ődési időt és a kikelt kifejlett hím és n őstény 
árvaszúnyogok összes számát. A hímek tollas csápjukról könnyen felismer ­
hetők ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. A kísérleti edényekben legalább hetente háromszor kell ellen őrizni a kontroll 
edényekben megfigyelhet őhöz képest rendellenesnek értékelhet ő viselkedést 
(például üledék elhagyása, szokatlan úszás). A kikelés várható id őszaka alatt 
naponta meg kell számolni a kikelt árvaszúnyogokat. Naponta fel kell jegy ­
ezni a kikelt kifejlett egyedek nemét és számát. Az azonosítást követ ően az 
árvaszúnyogokat ki lehet engedni az edényekb ől. A vizsgálat befejezése 
előtt lerakott petecsomókat dokumentálni kell, és az új lárvák üledékbe 
kerülésének megel őzése érdekében el kell távolítani. Fel kell jegyezni 
továbbá a ki nem kelt bábok megfigyelhet ő számát. A kikelés méréséhez 
az 5. függelék nyújt útmutatást.  
Fejlődés és túlélés  
37. Ha a lárvák 10 napos túlélési és fejl ődési adatait is be kell mutatni, akkor 
már a vizsgálat kezdetét ől fogva a kés őbbiekben használható kiegészít ő 
kontroll edényeket kell alkalmazni. Az ezekb ől származó üledéket átszitáljuk 
egy 250 μm-es szitán, amelyen a lárvák fennmaradnak. Az elhullás kritéri ­
umai a mozdulatlanság, illetve a mechanikai ingerekre adott válasz hiánya. A hiányzó lárvákat is elhullottnak kell tekinteni (a vizsgálat elején elpusztult 
lárvákat a mikroorganizmusok már lebonthatták). Meghatározzuk a túlél ő 
lárvák edényenkénti (elhullott lárvák maradványai nélküli) száraz tömegét, majd kiszámítjuk az egyedek egy edényre es ő átlagos száraz tömegét. A 
túlélő lárvák fejl ődési szakaszának a meghatározása is hasznos; ezt a fejszé ­
lesség mérése segítségével tehetjük meg.
 
Analitikai mérések  
A vizsgált anyag koncentrációja  
38. A fed ővíz, a pórusvíz és az üledék legnagyobb és legkisebb koncentrációnál 
vett mintáit legalább a vizsgálat kezdetén (lehet őleg egy órával a vizsgált 
anyaggal történ ő szennyezést követ ően) és végén analizálni kell. A vizsgált 
anyag így meghatározott koncentrációja tájékoztatást nyújt a vizsgált anyag 
viselkedésér ől/megoszlásáról a víz-üledék elrendezésben. Mivel a vizsgálat 
kezdetén történ ő mintavétel az üledékb ől hatással lehet a vizsgálati elrende ­
zésre (például a vizsgálathoz használt lárvák eltávolítása révén), külön kísér ­
leti edényeket kell használni az analitikai meghatározások vizsgálat kezdetén 
és adott esetben a vizsgálat során (lásd a 39. bekezdést) történ ő elvégzésé ­
hez. Az üledékre vonatkozó mérések nem feltétlenül szükségesek abban az esetben, ha a vizsgált anyag megoszlása a víz és az üledék között egyértel ­
műen meghatározható egy – például az üledék vízhez viszonyított aránya, a 
szennyezés típusa, az üledék szerves széntartalma tekintetében – összeha ­
sonlítható körülmények között végzett víz/üledék vizsgálat segítségével.
 
39. Ha a vizsgálat közben is végzünk méréseket (például a 7. napon), és az 
analízishez nagy minták szükségesek, amelyek nem gy űjthetők a kísérleti 
edényekb ől anélkül, hogy a mintavétel a vizsgálati elrendezésre hatással 
lenne, az analitikai meghatározásokat ugyanolyan kezelésnek alávetett (a 
vizsgálathoz használt organizmusokat is beleértve), de a biológiai megfigye ­
lések céljára nem használt, külön vizsgálati edényekb ől származó mintákon 
kell elvégezni  
40. A pórusvíz elkülönítésére ajánlott módszer például a 10 000 g intenzitással 
történő centrifugálás 4 °C-on 30 percig. Sz űrést is lehet alkalmazni, ameny ­
nyiben bizonyított, hogy sz űrő nem adszorbeálja a vizsgált anyagot. Ha a 
minta mérete túl kicsi, akkor el őfordulhat, hogy nem analizálható a koncent ­
ráció a pórusvízben.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fizikai és kémiai paraméterek  
41. A vizsgálathoz használt víz pH-ját és oldott oxigén koncentrációját, valamint 
a kísérleti edények h őmérsékletét megfelel ő módon kell mérni (lásd a 10. 
bekezdést). A vizsgálat kezdetén és végén a legnagyobb koncentrációnál 
meg kell mérni a víz keménységét és ammónia tartalmát a kontroll 
edényekben és egy kísérleti edényben.  
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
42. E vizsgálat célja a vizsgált anyag kikelt kifejlett hím és n őstény árvaszú ­
nyogok összes számára és fejl ődési ütemére, illetve 10 napos vizsgálat 
esetében a lárvák túlélésére és súlyára gyakorolt hatásainak a meghatározása. 
Ha semmi nem utal a nemek statisztikailag eltér ő érzékenységére, akkor a 
hímekre és a n őstényekre vonatkozó eredmények a statisztikai elemzés 
céljára összevonhatók. Az érzékenység nemek közötti különbségének statisz ­
tikai megítélésére például a χ 2 -r x 2 próba alkalmazható. Szükség esetén 10 
nap elteltével meg kell határozni a lárvák túlélését és az egyedek egy edényre es ő átlagos száraz tömegét.
 
43. A fed ővízben mért koncentrációkként kifejezett hatáskoncentrációkat lehe ­
tőleg a vizsgálat kezdetén mért koncentrációk alapján kell kiszámítani (lásd 
a 38. bekezdést).  
44. Az EC  50 vagy bármely más EC  x pontbecsléséhez az edényenkénti statiszti ­
kákat valódi ismétléseknek kell tekinteni. Bármely EC  x konfidencia inter ­
vallumának a kiszámítása során vagy figyelembe kell venni az edények 
közötti eltéréseket, vagy ki kell mutatni, hogy az eltérés elhanyagolható mértékű. Ha a modell mérési pontokhoz illesztéséhez a legkisebb négyzetek 
módszerét használjuk, akkor a szóráshomogenitás javítása érdekében az 
edényenkénti statisztikákat transzformálni kell. Az EC
 x értékeket az eredeti 
válaszértékekre való visszatranszformálás után kell kiszámítani.  
45. Ha a statisztikai elemzés célja a NOEC/LOEC hipotézisvizsgálattal történ ő 
meghatározása, az edények közötti eltérések figyelembevételére például hierarchikus varianciaanalízist (nested ANOVA) kell végezni. Alternatíva ­
ként ennél robosztusabb próbák (21) is helyénvalók lehetnek olyan esetek ­
ben, amikor az ANOVA szokásos alapfeltevései nem teljesülnek.
 
Kikelési arány  
46. A kikelési arányok kvantális adatok, amelyek a Cochran-Armitage próbával 
elemezhet ők a lefelé lépeget ő eljárást alkalmazva, amennyiben arra számí ­
tunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és az adatok ennek az elvá ­
rásnak megfelelnek. Ha ez nem így van, akkor a Fisher-féle egzakt próbát vagy a Mantel-Haenszel próbát használhatjuk a p-értékek Bonferroni- vagy Holm-féle eljárással történ ő korrekciójával. Ha az ugyanazon koncentráci ­
óhoz tartozó ismétlések közötti eltérések bizonyítottan nagyobbak, mint amit 
a binomiális eloszlás indokolna (amelyet gyakran „extra-binomiális” variá ­
ciónak neveznek), akkor egy robusztus Cochran-Armitage vagy Fisher-féle egzakt próbát kell alkalmazni, mint amilyet például a (21) javasol.
 
47. Meg kell határozni az egy edényre jutó kikelt árvaszúnyogok számát (ne), 
majd el kell osztani a behelyezett lárvák számával (na):  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
ahol:  
ER = kikelési arány  
n e = kikelt árvaszúnyogok egy edényre jutó száma  
n a = behelyezett lárvák egy edényre jutó száma  
48. Egy másik, legf őképp nagy minták és extra-binomiális variáció esetén alkal ­
mazható lehet őség, hogy a kikelési arányt folyamatos változóként kezeljük, 
és amennyiben arra számítunk, hogy a dózis-válasz függvény monoton, és ez az elvárás összhangban áll a kapott ER adatokkal, a Williams próbához hasonló eljárást alkalmazunk. Ha a monotonitás nem áll fenn, a Dunnett 
próbát lehet alkalmazni. A nagy mintát itt úgy értelmezzük, hogy az egy 
ismétlésre (edényre) jutó kikelt és nem kikelt árvaszúnyogok száma egyaránt meghaladja az ötöt.
 
49. Az ANOVA módszerek alkalmazásához az ER értékeket el őször négyzet ­
gyök arkusz-szinusz vagy Freeman-Tukey transzformáció segítségével átala ­
kítjuk, hogy a normálishoz közeli eloszlást kapjunk, és a szórásokat 
kiegyenlítsük. Abszolút gyakoriságok esetén a Cochran-Armitage, a Fisher-féle egzakt (Bonferroni) vagy a Mantel-Haenszel próbát használ ­
hatjuk. A négyzetgyök arkusz-szinusz transzformáció az ER négyzetgyö ­
kének az arkusz szinuszát (sin
 –1 ) adja.  
50. A kikelési arányok meghatározásához regressziós analízissel (vagy például 
probit (22), logit, Weibull, kereskedelmi forgalomban kapható megfelel ő 
szoftverrel) számítjuk ki az EC  x értékeket. Ha a regressziós analízis alkal ­
matlannak bizonyul (például kett őnél kevesebb részleges válasz esetén), más 
nemparaméteres módszert, például mozgóátlag-módszert vagy egyszer ű 
interpolációt használunk.  
Fejlődési ütem  
51. Az átlagos fejl ődési idő a lárvák kísérleti edényekbe történ ő behelyezését ől 
(a vizsgálat 0. napjától) az árvaszúnyogok kikeléséig tartó átlagos id őtar­
tamot jelenti. (A valódi fejl ődési idő kiszámításához figyelembe kell venni a 
lárvák életkorát a behelyezés id őpontjában). A fejl ődési ütem a fejl ődési idő 
reciproka (egysége: 1/nap), és a lárvafejl ődés egy napra es ő részét fejezi ki. 
Az ilyen jelleg ű üledék-toxicitási vizsgálatok értékeléséhez inkább a fejl ő­
dési ütemet használjuk, mivel kisebb a szórása, homogénebb és a normá ­
lishoz közelebb álló eloszlást mutat, mint a fejl ődési idő. Ennélfogva a 
fejlődési ütem hatásosabb paraméteres vizsgálati eljárások alkalmazását 
teszi lehet ővé, mint a fejl ődési idő. A folyamatos változónak tekintett fejl ő­
dési ütemhez tartozó EC  x értékek becslésére regressziós analízist használunk 
(például (23)(24)).  
52. A következ ő statisztikai próbákhoz feltételezzük, hogy az x. ellen őrzési 
napon megfigyelt számú árvaszúnyog az x. nap és az x–1. nap (l = az 
ellenőrzések közötti intervallum hossza, általában 1 nap) közötti id őinter­
vallum közepén kelt ki. Az egy edényre jutó átlagos fejl ődési ütemet ( x) a 
következő képlet szerint számítjuk ki:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
ahol:  
x: egy edényre jutó átlagos fejl ődési ütem  
i: ellenőrzési intervallum indexe  
m: ellenőrzési intervallumok maximális száma  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : az i ellen őrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok száma  
n e : kikelt árvaszúnyogok száma összesen a kísérlet végén (=  P ƒ i ) 
x i : az i ellen őrzési intervallumban kikelt árvaszúnyogok fejl ődési üteme  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
ahol:  
day  i : ellenőrzési nap (a behelyezés óta eltelt napok száma)  
l i : az i ellen őrzési intervallum hossza (napokban kifejezve, általában 1 
nap) 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
53. A vizsgálati jegyz őkönyvnek legalább a következ ő információkat kell tartal ­
maznia:  
Vizsgált anyag:  
— fizikai jelleg és adott esetben a fizikai és kémiai tulajdonságok (víz ­
oldékonyság, páranyomás, talajra (vagy ha rendelkezésre áll, az 
üledékre) vonatkozó megoszlási hányados, stabilitás vízben, stb.),  
— kémiai azonosító adatok (közönséges név, kémiai név, szerkezeti képlet, 
CAS-szám, stb.,) beleértve a kémiai tisztaságot és a vizsgált anyag 
mennyiségi meghatározásának analitikai módszerét.  
A vizsgálathoz felhasznált faj:  
— a vizsgálathoz felhasznált állatok: faj, tudományos elnevezés, az orga ­
nizmusok származása és tenyésztési körülményei,  
— a petecsomók és a lárvák kezelésére vonatkozó információk,  
— a vizsgálathoz felhasznált állatok életkora az edényekbe történ ő behelye­
zésükkor.  
Vizsgálati körülmények:  
— az alkalmazott üledék, azaz természetes vagy mesterséges üledék,  
— természetes üledék esetén az üledékminta gy űjtésének helye és a minta ­
vételi hely leírása, beleértve lehet őség szerint a szennyezés történetét; 
jellemzők: pH, szerves széntartalom, C/N arány és szemcseszerkezet (ha 
indokolt),  
— a mesterséges üledék el őállítása: összetev ők és jellemz ők (szerves szén ­
tartalom, pH, nedvességtartalom, stb. a vizsgálat kezdetén),  
— a vizsgálathoz használt víz el őállítása (mesterségesen készített víz 
esetén) és jellemz ői (oxigénkoncentráció, pH, vezet őképesség, kemény ­
ség, stb. a vizsgálat kezdetén),  
— az üledék és a fed ővíz mélysége,  
— a fedővíz és a pórusvíz mennyisége; a nedves üledék tömege pórusvízzel 
és pórusvíz nélkül,  
— vizsgálati edények (anyag és méret),  
— a törzsoldatok el őállításának módszere és a vizsgálathoz használt 
koncentrációk,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— a vizsgált anyag bevitele: alkalmazott vizsgálati koncentrációk, ismétlés ­
szám és esetlegesen használt oldószer,  
— inkubációs körülmények: h őmérséklet, fényciklus és intenzitás, leveg őz­
tetés (gyakoriság és intenzitás),  
— a táplálásra vonatkozó információk, beleértve a táplálék típusát, elkészí ­
tését, mennyiségét és a táplálás rendjét.  
Eredmények:  
— a névleges vizsgálati koncentrációk, a mért vizsgálati koncentrációk és a 
kísérleti edények vizsgált anyag koncentrációjának a meghatározására használt analízisek eredményei,
 
— a víz min ősége a vizsgálati edényekben, azaz pH, h őmérséklet, oldott 
oxigén, vízkeménység és ammóniatartalom,  
— az elpárolgott víz pótlása a vizsgálati edényekben, ha pótoljuk,  
— a kikelt hím és n őstény árvaszúnyogok egy edényre és napra es ő száma,  
— ki nem kelt lárvák egy edényre jutó száma,  
— a lárvák egy edényre és – adott esetben – egy fejl ődési szakaszra jutó 
átlagos száraz tömege,  
— ismétlésenkénti és vizsgálati koncentrációnkénti százalékos kikelés (hím 
és nőstény árvaszúnyogok együttesen),  
— kikelt kifejlett árvaszúnyogok ismétlésenkénti és kezelési arányonkénti 
átlagos fejl ődési üteme (hím és n őstény árvaszúnyogok együttesen),  
— toxicitási végpontok – például EC  x (és a hozzá tartozó konfidencia 
intervallum), NOEC és/vagy LOEC – becsült értékei, valamint a 
meghatározásukhoz használt statisztikai módszerek,  
— az eredmények szöveges elemzése, beleértve az e vizsgálati módszert ől 
való eltérések vizsgálat kimenetelére gyakorolt hatását.  
SZAKIRODALOM  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
 
(2) Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 
3738. August 1994. WRc, UK.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA 
Workshop held in the Netherlands.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverteb ­
rates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. 
Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first 
edition dated June 1994.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Kultúra 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
 
(14) E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.  
(15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103–117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clus ­
tered binary data. Biometrics 48:577–585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
E módszer alkalmazásában a következ ő fogalommeghatározások alkalmazandók:  
Mesterséges üledék  vagy formulázott, kevert vagy m űüledék: a természetes 
üledék fizikai összetev őinek az imitálására használt anyagok keveréke.  
Fedővíz: a vizsgálati edényben az üledék felé kerül ő víz.  
Pórusvíz  vagy szemcseközi víz: az üledék és a talaj szemcséi közötti helyet 
kitöltő víz.  
Szennyezett víz : a vizsgált vegyi anyaggal szennyezett víz.  
Vizsgált vegyi anyag:  Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazá ­
sával vizsgált anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
2. függelék  
Ajánlások a  Chironomus riparius  tenyésztéséhez  
1. Az árvaszúnyoglárvákat kristályosító csészékben vagy nagyobb 
edényekben tenyésztjük. Az edény aljára szórjunk vékony réteg (kb. 5–10 mm) kvarchomokot. A szilikagél (például Merck, cikkszám: 8117) is megfelelő szubsztrátumnak bizonyult (ebb ől vékonyabb, pár milliméternyi 
réteg is elegend ő). Ezt követ ően töltsünk néhány centiméternyi megfelel ő 
vizet az edénybe. A vízszint fenntartása és a kiszáradás megel őzése érde ­
kében szükség szerint pótoljuk az elpárolgott vizet. Cserélhetjük is a vizet, ha kell. Biztosítsunk gyenge leveg őztetést. A lárvatenyészt ő edényeket 
tartsuk egy megfelel ő ketrecben, amelyb ől a kikel ő kifejlett példányok 
nem tudnak kiszökni. A ketrecben legyen elég hely a kikelt kifejlett példá ­
nyoknak a mozgásra, mert ellenkez ő esetben nem fognak párosodni 
(minimum kb. 30 × 30 × 30 cm).
 
2. A ketreceket tartsuk szobah őmérsékleten vagy 20 ± 2 °C állandó h őmér­
sékletű helyiségben, 16 órán keresztül világosban (fényintenzitás kb. 1 000 
lux) és 8 órán keresztül sötétben. Dokumentálták, hogy a 60 % RH alatti légnedvesség gátolhatja a szaporodást.
 
Hígítóvíz  
3. Bármilyen alkalmas természetes vagy m űvíz használható. Általában kútvi ­
zet, klórtalanított csapvizet vagy mesterséges közeget (például Elendt-féle M4 vagy M7 közeget, lásd lentebb) használunk. Használat el őtt a vizet 
levegőztetni kell. Szükség esetén cserélhetjük a tenyésztéshez használt 
vizet. Ehhez a használt vizet öntsük le vagy szívjuk ki a tenyészt ő 
edényekb ől ügyelve arra, hogy a lárvák által épített lakócsöveket el ne 
pusztítsuk.
 
A lárvák táplálása  
4. Az árvaszúnyoglárvákat pehely formájú haleledellel (Tetra Min®, Tetra 
Phyll® vagy hasonló, védett márkájú haltáppal) etessük, amelyb ől naponta 
körülbelül 250 mg-ot adjunk minden edényhez porrá őrölve szárazon vagy 
vizes szuszpenzióban, amelynek az elkészítéséhez 1,0 g pehely formájú 
haleledelt keverjünk el 20 ml hígítóvízben úgy, hogy homogén keveréket 
kapjunk. Ebb ől a készítményb ől naponta 5 ml-t adjunk minden edényhez 
(használat el őtt felrázandó). Az id ősebb lárvák kaphatnak ennél többet.  
5. A táplálék mennyiségét a vízmin őséghez kell igazítani. Ha a tenyészt ő­
közeg zavarossá válik, akkor csökkenteni kell a mennyiséget. Az adott táplálék mennyiségét szigorú ellen őrzés alatt kell tartani. Ha túl kevés a 
táplálék, akkor a lárvák a vízrétegbe vándorolnak, ha túl sok, akkor foko ­
zódik a mikrobatevékenység és csökken az oxigénkoncentráció. Mindkét körülmény a fejl ődési ütem lassulását okozhatja.
 
6. Az újonnan létesített tenyészt ő edényekhez zöldalga (például  Scenedesmus 
subspicatus , Chlorella vulgaris ) sejtek is adhatók.  
A kikelt kifejlett példányok táplálása  
7. Egyes kísérletek szerint a kikelt kifejlett példányok számára egy telített 
cukoroldatba mártott vattakorong szolgálhat táplálékként.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Kikelés  
8. 20 ± 2 °C h őmérsékleten a kifejlett példányok körülbelül 13–15 nap eltel ­
tével kezdenek megjelenni a lárvatenyészt ő edényekben. A hímek tollas 
csápjuk alapján könnyen megkülönböztethet ők. 
Petecsomók  
9. Miután a kifejlett példányok megjelentek a tenyészt őketrecben, a lárva ­
tenyésztő edényekben hetente háromszor ellen őrizni kell a lerakott zselatin ­
szerű petecsomókat, amelyeket gondosan el kell távolítani, és át kell 
helyezni egy tenyészt ővíz-mintát tartalmazó kisméret ű edénybe. A petecso ­
mókat új tenyészetek létrehozására (például 2–4 petecsomó/edény) vagy 
toxicitási vizsgálatok céljára használjuk fel.  
10. Az els ő fejlődési szakaszban lév ő lárváknak 2–3 napon belül kell kikelniük.  
Új tenyészetek létesítése  
11. A stabil tenyészetekb ől hetente vagy – a vizsgálati követelményekt ől 
függően – ritkábban friss lárvatenyészetek hozhatók létre, miközben a 
régebbi edényeket a kifejlett árvaszúnyogok megjelenését követ ően eltávo ­
lítjuk. Ezzel a rendszerrel minimális kezelést igényl ő módon biztosítható a 
kifejlett példányok rendszeres utánpótlása.  
A vizsgálathoz használt „M4” és „M7” oldatok el őállítása  
12. Az „M4” közeg leírása Elendt (1990) munkájában megtalálható. Az „M7” 
közeg ugyanúgy készül, mint az „M4”, azzal a különbséggel, hogy az 1. táblázatban feltüntetett anyagok koncentrációja az „M7” esetében négyszer 
alacsonyabb, mint az „M4” készítésekor. Az „M7” közegr ől szóló publi ­
káció előkészületben van (Elendt, személyes közlés). A vizsgálathoz hasz ­
nált oldatot azért nem Elendt és Bias (1990) szerint kell el őállítani, mert a 
törzsoldatok elkészítéséhez megadott NaSiO3 5 H
 2 O, NaNO3, KH2PO4 és 
K2HPO4 koncentrációk nem megfelel ők. 
Az „M7” közeg el őállítása  
13. Az (I) törzsoldatok mindegyikét külön kell elkészíteni, majd az (I) törzs ­
oldatokból egy (II) kombinált törzsoldatot készítünk (lásd az 1. táblázatot). Az „M7” közeg el őállításához a (II) kombinált törzsoldat 50 ml-ét és az 
egyes makrotápanyagok törzsoldatainak a 2. táblázatban megadott mennyi ­
ségeit ionmentesített vízzel 1 literre hígítjuk. Vitamin-törzsoldatot készí ­
tünk, amelyhez három vitamint ionmentesített vízhez adunk a 3. táblá ­
zatban meghatározottak szerint, majd röviddel a felhasználás el őtt az 
„M7” közeghez adunk 0,1 ml-t a kombinált vitamin törzsoldatból. (A 
vitamin-törzsoldatot kis aliquot részekben, fagyasztott állapotban kell tarta ­
ni). A közeget leveg őztetni és stabilizálni kell.
 
1. táblázat  
Nyomelemek törzsoldatai az M4 és M7 közeghez  
(I) törzsoldatok Ion-mentesített 
vízzel 1 literre 
hígított 
mennyiség (mg) A (II) kombinált törzsoldat el őállítá­
sához az (I) törzsoldatok következ ő 
mennyiségeit (ml) elegyítjük és 
ionmentesített vízzel 1 literre 
hígítjuk Végleges koncentráció a 
vizsgálathoz használt oldatban (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
(I) törzsoldatok Ion-mentesített 
vízzel 1 literre 
hígított 
mennyiség (mg) A (II) kombinált törzsoldat el őállítá­
sához az (I) törzsoldatok következ ő 
mennyiségeit (ml) elegyítjük és 
ionmentesített vízzel 1 literre 
hígítjuk Végleges koncentráció a 
vizsgálathoz használt oldatban (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Ezeknek az anyagoknak az esetében a fent jelzett módon eltér az M4 és az M7. 
( 2 ) Ezeket az oldatokat külön kell elkészíteni, majd összeönteni és azonnal autoklávban kezelni.  
2. táblázat  
Makrotápanyagok törzsoldatai az M4 és M7 közeghez  
Ion-mentesített vízzel 
1 literre hígított 
mennyiség 
(mg) Makrotápanyagok 
törzsoldatainak M4 és M7 
közeg előállításához hasz ­
nált mennyisége 
(ml/l) Végleges koncentráció 
a vizsgálathoz használt 
M4 és M7 oldatban 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
3. táblázat  
Vitamin-törzsoldatok az M4 és M7 közeghez  
A három vitaminoldatból egyetlen kombinált vitamin-törzsoldatot készítünk.  
Ion-mentesített vízzel 1 
literre hígított 
mennyiség 
(mg) Vitamin- törzsoldat M4 és 
M7 közeg el őállításához 
használt mennyisége 
(ml/l) Végleges koncentráció a 
vizsgálathoz használt 
M4 és M7 oldatban 
(mg/l)  
Tiamin-hidroklorid 750 0,1 0,075 
Cianokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotin 7,5 0,1 0,00075  
SZAKIRODALOM  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25–33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Kultúrad in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Kultúra Conditions on LIFE History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
3. függelék  
MESTERSÉGES ÜLEDÉK KÉSZÍTÉSE  
Az üledék összetétele  
A mesterséges üledék összetétele a következ ő: 
Összetevő Jellemz ők üledék száraz 
tömegének %-a  
Tőzeg T őzegmoha, amelynek pH-ja 
a lehető legközelebb esik az 
5,5-6,0 értékhez, és nem 
tartalmaz látható növény ­
maradványokat, finomra őrölve (részecskeméret ≤ 
1 mm) és leveg őn szárítva 4–5 
Kvarchomok Szemcseméret: a részecskék 
több mint 50 százaléka a 
50–200 μm tartományban 75–76 
Kaolinit agyag Kaolinit tartalom ≥ 30 % 20 
Szerves szén T őzeg és homok hozzáadá ­
sával beállítva 2 (±0,5) 
Kalcium-karbonát Porított, vegytiszta CaCO
 3 0,05 - 0,1 
Víz Vezet őképesség ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Elkészítés  
A levegőn szárított t őzeget finom porrá őröljük. Nagyteljesítmény ű homogenizáló 
készülék segítségével ionmentesített vízzel szuszpenziót készítünk a szükséges mennyiség ű tőzegporból. A szuszpenzió pH-ját CaCO
 3 hozzáadásával beállítjuk 
5,5 ± 0,5 értékre. A pH és a mikrobiológiai összetétel stabilizálása végett 20 
± 2 °C hőmérsékleten lassú keveréssel legalább két napig kondicionáljuk a szusz ­
penziót. Az ezt követ ően ismét megmért pH-nak 6,0 ± 0,5 értéket kell mutatnia. 
Ezek után a szuszpenziót összekeverjük a többi összetev ővel (homok és kaoli ­
nagyag), valamint az ionmentesített vízzel úgy, hogy az üledék száraz tömegének 30–50 százaléka közötti víztartalommal rendelkez ő, homogén üledéket kapjunk. 
A végtermékként kapott keverék pH-ját ismételten megmérjük, és szükség esetén 
CaCO
 3 hozzáadásával beállítjuk 6,5–7,5 értékre. Az üledékb ől vett minta alapján 
meghatározzuk a száraz tömeget és a szerves széntartalmat. Ezt követ ően az 
árvaszúnyogokkal végzett toxicitási vizsgálatban való felhasználás el őtt ajánlott 
a mesterséges üledéket hét napig a vizsgálatban használni kívántakkal megegyez ő 
körülmények között kondicionálni.  
Tárolás  
A mesterséges üledék el őállításához használt száraz összetev ők száraz, h űvös 
helyen, szobah őmérsékleten tárolhatók. Az összeállított (nedves) üledék a vizs ­
gálatban való felhasználás el őtt nem tárolható. Az el őállításának záró lépését 
képező 7 napos kondicionálási id őszakot követ ően azonnal fel kell használni.  
SZAKIRODALOM:  
E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
4. függelék  
Az elfogadható hígítóvíz kémiai tulajdonságai  
Anyag Koncentráció  
Szemcsés anyag < 20 mg/l 
Összes szerves szén < 2 mg/l Ionizálatlan ammónia < 1 μg/l 
Keménység CaCO
 3 koncentrációban kifejezve < 400 mg/l (*) 
Maradék klór < 10 μg/l 
Összes szerves foszfort tartalmazó növényvéd ő szer < 50 ng/l 
Összes szerves klórt tartalmazó növényvéd ő szer plusz 
poliklórozott bifenilek < 50 ng/l 
Összes szerves klór < 25 ng/l  
(*) Meg kell azonban jegyezni, hogy ha a keménységet okozó ionok és a vizsgált anyag 
között gyaníthatóan kölcsönhatás alakul ki, akkor lágyabb vizet kell alkalmazni (és ezért 
az Elendt-féle M4 közeg ilyen esetben nem alkalmazható).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
5. függelék  
Útmutató az árvaszúnyoglárvák kikelésének figyelemmel kíséréséhez  
A vizsgálati edényekre csapdákat helyezünk a kikelt példányok számára. A 
csapdák a 20. naptól a vizsgálat végéig szükségesek. Ezek egy példáját mutatja be az alábbi ábra:
 
A: nylon háló  
B: fejjel lefelé fordított m űanyagpohár  
C: vizsgálati edény, kiönt ő nélkül  D: hálós vízcserél ő nyílás  
E: víz  
F: üledék  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  GYORS BIOLÓGIAI LEBONTHATÓSÁG: SZÉN-DIOXID- 
VIZSGÁLAT LÉGMENTESEN ZÁRT EDÉNYEKBEN (A G ŐZTÉR 
CO  2 -TARTALMÁNAK VIZSGÁLATA)  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 310. vizsgálati iránymutatá ­
sában (2006) leírt módszerrel. A módszer olyan sz űrővizsgálat, amely a 
vegyi anyagok gyors biológiai lebonthatóságának értékelésére szolgál, és hasonló információkat nyújt, mint az e melléklet C.4. fejezetében ismertetett 
A–F vizsgálati módszerek. Ezért azok a vegyi anyagok, amelyek esetében ez 
a vizsgálati módszer pozitív eredményt ad, biológiailag könnyen lebontha ­
tónak, és ennek következtében a környezetben gyorsan lebomlónak tekint ­
hetők.
 
2. A rosszul oldható és er ősen adszorbeálódó vegyi anyagok esetében hagyo ­
mányosan általában a jól bevált szén-dioxid-módszer (CO  2 -módszer) (1) az 
elsődleges választás, amely a szerves vegyületek biológiai lebonthatósá ­
gának eredeti Sturm-féle vizsgálatán (2) alapul, és a mikrobatevékenység eredményeként felszabaduló szén-dioxid mérésével határozza meg a bioló ­
giai lebonthatóságot. Oldható (de nem illékony) vegyi anyagok esetében is 
erre a módszerre esik a választás, mivel sokan a szén-dioxid-fejl ődést 
tekintik a mikrobatevékenység egyetlen kétségbevonhatatlan bizonyítékának. Az oldott szerves szén eltávolítása egyaránt lehet fizikai-kémiai folyamatok – adszorpció, volatilizáció, precipitáció, hidrolízis – és mikrobatevékenység 
eredménye, oxigénfogyasztás pedig számos nem biológiai reakcióban is 
megfigyelhet ő; CO
 2 viszont ritkán keletkezik szerves vegyületekb ől nem 
biológiai úton. Az eredeti és a módosított Sturm-féle vizsgálatban (1)(2) a CO
 2 eltávolítása a folyadékfázisból történik, és a CO  2 gáz-átbuborékoltatás 
eredményeként kerül az elnyelet ő edényekbe (a CO  2 eltávolítására megfelel ő 
kezeléssel alkalmassá tett leveg őt buborékoltatnak át a folyékony közegen), 
míg a Larson-féle változatban (3)(4) a CO  2 úgy kerül a reakcióedényb ől az 
abszorberekbe, hogy a vizsgálati edény folyamatos rázása mellett CO  2 - 
mentes leveg őt vezetnek keresztül a g őztéren. A reakcióedény rázása csak 
a Larson-féle módosításban szerepel; az ISO 9439 szabvány (5) és az Egye ­
sült Államokban alkalmazott eredeti változat (6) csak oldhatatlan anyagok esetében ír el ő keverést, és mindkett őben gáz-átbuborékoltatás, nem pedig a 
gőztér cseréje szerepel. Egy másik hivatalos, Gledhill módszerén (8) alapuló 
és az USA Környezetvédelmi Hivatala (EPA) által elfogadott módszer (7) szerint a CO
 2 -t a légkör felé zárt, rázott reakcióedényen belül közvetlenül a 
gázfázisból nyeletik el lúgban, miként a klasszikus Warburg–Barcroft-féle 
respirométer-palackban.  
3. Kimutatták azonban, hogy a szabványos, módosított Sturm-féle vizsgálat 
számos vegyi anyag esetében történ ő alkalmazása során szervetlen 
szén (IC) halmozódik fel a közegben (9). 20 mg C/l koncentrációban hasz ­
nált anilin lebomlása során 8 mg/l IC koncentrációt is mértek. Ezért a lúgban elnyeletett CO
 2 nem ad valódi képet arról, hogy a lebomlás során 
az egyes köztes id őpontokban mennyi CO  2 keletkezik mikrobiológiai folya ­
matok eredményeként. Ennek következtében egyes vegyi anyagoknál, amelyek az oldott szerves szén (DOC) eltávolítása alapján biológiailag gyorsan lebonthatónak min ősülnének, nem teljesül az a követelmény, 
amely szerint a biológiailag gyorsan lebontható anyagok esetében a CO
 2 - 
fejlődés elméleti maximumának (ThCO  2 ) több mint 60 %-át el kell érni a 
„tíznapos ablakban” (a 10 %-os biológiai lebomlás elérését közvetlenül követő 10 napban).
 
4. Ha a százalékos lebomlás értéke a vártnál alacsonyabb, akkor lehetséges, 
hogy IC halmozódott fel a vizsgálathoz használt oldatban. Ekkor a lebont ­
hatóság a gyors biológiai lebonthatóság megállapítására szolgáló további 
vizsgálatokkal értékelhet ő. ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. A Sturm-féle módszertan egyéb hátrányai (nehézkesség, id őigényesség, 
nagyobb kísérleti hibalehet őség, és az illékony vegyi anyagok vizsgálatára 
való alkalmatlanság) arra ösztönözték a kutatókat, hogy a gázátáramoltatás (10)(11) helyett egy – a Gledhill által javasolttól eltér ő – zárt edényes 
technikát keressenek. Boatman et al. (12) a korábbi módszerek áttekintését 
követően egy olyan zárt elrendezést alkalmazott, amelyben a közeg savas 
kezelését követ ően a CO
 2 az inkubálás végén a g őztérbe távozik. A CO  2 
mérésére a g őztérből automatikusan vett minták szervetlenszén-tartalmának 
gázkromatográfiás analízisét ((GC)/IC) használták, de a folyadékfázis oldott 
szervetlenszén-tartalmát (DIC) nem vették figyelembe. Emellett az alkalma ­
zott edények nagyon kicsik (20 ml) voltak, és csak 10 ml közeget tartal ­
maztak, ami problémákat okozott: például az oldhatatlan vizsgált anya ­
gokból szükségszer űen nagyon kis mennyiséget kellett bevinni, és/vagy 
előfordulhatott, hogy a beoltott közegben nem vagy nem kell ő mennyi­
ségben voltak jelen a vizsgált vegyi anyagok lebontására képes mikroorga ­
nizmusok.  
6. E nehézségek leküzdéséhez Struijs és Stoltenkamp (13), valamint az anaerob 
körülmények közötti biológiai lebonthatóság vizsgálatában (15) használt készülékkel szerzett tapasztalataikból ihletet merít ő Birch és Fletcher (14) 
független kutatásai járultak hozzá. Az el őbbi szerz őpáros módszere (13) a 
gőztér CO
 2 -tartalmának savas kezelést és ekvilibrációt követ ő mérésén 
alapult, míg az utóbb említettek (14) mind a gázfázisban, mind a folyadék ­
fázisban mérték a DIC értékét, és semmilyen kezelést nem alkalmaztak; a 
keletkező IC 90 %-a a folyadékfázisban volt jelen. A Sturm-féle vizsgálattal 
összehasonlítva mindkét módszer rendelkezik el őnyökkel, mivel a vizsgálati 
elrendezés kompakt és jobban kezelhet ő, alkalmas az illékony vegyi 
anyagok vizsgálatára, és lehet ővé teszi a felszabaduló CO  2 késleltetett méré ­
sének az elkerülését.  
7. Ezt a két megközelítést ötvözte a g őztér CO  2 -tartalmának vizsgálatára vonat ­
kozó ISO-szabvány (16), amelyet körvizsgálatnak is alávetettek (17), és amely az itt bemutatott vizsgálati módszernek is az alapját képezi. Ugyan ­
csak ezt a két megközelítést használja fel az EPA módszere (18). A CO
 2 
mérésének két ajánlott módszere létezik: a g őztér CO  2 -tartalmának meghatá ­
rozása savas kezelést követ ően (13) és az IC meghatározása a folyadékfá ­
zisban lúgfölösleg hozzáadása után. Az utóbbi módszert Peterson vezette be annak a CONCAWE által végzett körvizsgálatnak (19) a során, amelynek 
tárgya a g őztér CO
 2 -tartalma vizsgálatának módosított, a jellegüknél fogva 
biológiailag lebontható anyagok értékelésére alkalmas módszere volt. Az itt bemutatott vizsgálati módszer tartalmazza a gyors biológiai lebonthatóság meghatározására vonatkozóan e melléklet C.4. fejezetében ismertetett 
módszereken az 1992-es átdolgozás (20) keretében végrehajtott módosításo ­
kat, így a vizsgálati körülmények (közeg, id őtartam stb.) egyebekben 
megegyeznek a módosított Sturm-féle vizsgálatban alkalmazottakkal (20). Birch és Fletcher (14) kimutatták, hogy a g őztér CO
 2 -tartalmának e vizs ­
gálata nagyon hasonló eredményeket adott, mint az átdolgozott vizsgálati 
módszerekre ugyanazon vegyi anyagokkal elvégzett OECD-körvizsgálat (21).
 
A VIZSGÁLAT ELVE  
8. A kizárólagos szén- és energiaforrásként szolgáló vizsgált vegyi anyagot – 
általában 20 mg C/l koncentrációt alkalmazva – vegyes mikroorganizmus-populációval beoltott, ásványi sókat tartalmazó puffer ­
közegben inkubáljuk. A vizsgálatot az aerob körülmények közötti teljes 
biológiai lebomláshoz szükséges oxigént tartalmazó g őztérrel rendelkez ő, 
légmentesen zárt palackokban végezzük. A vizsgált vegyi anyag aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomlása során felszabaduló szén- 
dioxid meghatározásához megmérjük, hogy a kísérleti palackokban 
mennyivel több szervetlen szén (IC) keletkezik, mint a vakpróbákhoz hasz ­
nált, csak a beoltott közeget tartalmazó palackokban. A biológiai lebomlás mértékét az IC-termel ődés elméleti maximuma (ThIC) százalékában fejezzük 
ki, a kezdetben bevitt vizsgált vegyi anyag (mint szerves szén) mennyisége 
alapján.
 
9. A DOC-csökkenés és/vagy a vizsgált vegyi anyag els ődleges biológiai 
lebonthatósága is mérhet ő (20).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
A VIZSGÁLT VEGYI ANYAGRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK  
10. A százalékos lebomlás kiszámításához ismerni kell a vizsgált vegyi anyag 
szerves széntartalmát (tömegszázalékban kifejezve), amely a kémiai szer ­
kezet alapján vagy méréssel határozható meg. Illékony vizsgált vegyi 
anyagok esetében a g őztér és a folyadék térfogata közötti megfelel ő arány 
meghatározását segíti a mért vagy számított Henry-állandó. A vizsgált vegyi anyag mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó informá ­
ciók a megfelel ő vizsgálati koncentrációk kiválasztásához és a rossz bioló ­
giai lebonthatóságra utaló eredmények értelmezéséhez hasznosak: ameny ­
nyiben nem bizonyított, hogy a vizsgált vegyi anyag nincs gátló hatással a mikrobatevékenységre, ajánlott a gátló hatás ellen őrzésére szolgáló kont ­
rolledényt (lásd a 24. bekezdést) szerepeltetni a vizsgálatban.
 
A MÓDSZER ALKALMAZHATÓSÁGA  
11. A vizsgálat a vízben oldható és a nem oldható vegyi anyagok vizsgálatára 
egyaránt alkalmas, bár a vizsgált vegyi anyag megfelel ő eloszlatását bizto ­
sítani kell. Az ajánlott 1:2 g őztér-folyadék térfogatarány alkalmazása mellett 
az illékony vegyi anyagok 50 Pa.m  3 .mol  –1 Henry-állandóig vizsgálhatók, 
mivel így a vizsgált vegyi anyag aránya a g őztérben nem fogja meghaladni 
az 1 %-ot (13). Illékonyabb vegyi anyagok vizsgálata esetén kisebb térfo ­
gatú gőztér is használható, de biológiai hasznosíthatóságuk korlátozó 
tényező lehet, különösen akkor, ha vízben rosszul oldódnak. A felhaszná ­
lóknak úgy kell megválasztaniuk a g őztér és a folyadék térfogatának arányát 
és a vizsgált vegyi anyag koncentrációját, hogy elegend ő oxigén álljon 
rendelkezésre az aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomláshoz 
(azaz kerülni kell a magas szubsztrátumkoncentrációt és a kis g őztértérfo­
gatot). Erre a kérdésre vonatkozóan a szakirodalom (13)(23) nyújt útmuta ­
tást. 
REFERENCIA-VEGYIANYAGOK  
12. Az eljárás ellen őrzése érdekében érdemes egyidej űleg olyan 
referencia-vegyianyagokat is vizsgálni, amelyek biológiai lebonthatósága 
ismert. Vízben oldható vegyi anyagok vizsgálata esetén anilin, nátrium- benzoát vagy etilénglikol, rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén pedig 1-oktanol használható erre a célra (13). E vegyületeknek a ThIC 
százalékában kifejezett biológiai lebomlásának 14 napon belül több mint 
60 %-ot kell elérnie.
 
REPRODUKÁLHATÓSÁG  
13. A módszer ISO-körvizsgálata (17) során a következ ő eredmények születtek 
az ajánlott körülmények között, a vizsgált vegyi anyag 20 mg C/l koncent ­
rációban történ ő alkalmazása mellett.  
Vizsgált vegyi 
anyag Százalékos biológiai 
lebomlás közép ­
értéke 
(28 nap alatt) Relatív szórás 
(%) Laboratóriumok 
száma  
Anilin 90 16 17 
1-oktanol 85 12 14  
A vizsgálaton belüli variabilitást (megismételhet őséget) illet ően megállapít ­
ható, hogy anilin alkalmazása esetén szinte valamennyi vizsgálatsorozatban alacsony, 5 %-ot nem meghaladó volt a relatív szórás. A gyengébb megismételhet őséget mutató két esetben a nagyobb variabilitást valószín űleg 
az okozta, hogy a vakpróbákban magas volt az IC-termel ődés. Az 1-oktanol 
alkalmazása gyengébb megismételhet őséget eredményezett, de a vizsgálat ­
sorozatok 79 %-ában még így is 10 % alatt maradt a relatív szórás. Ebben az esetben adagolási hibák okozhatták a vizsgálaton belüli nagyobb varia ­
bilitást, mivel nagyon kis mennyiség ű (3–4 μl) 1-oktanolt kellett befecs ­
kendezni a lezárt kísérleti palackokba. A vizsgált vegyi anyag kisebb koncentrációban történ ő alkalmazása nagyobb relatív szórást eredményezett, 
különösen a 10 mg C/l értéknél alacsonyabb koncentrációk esetében. Az 
oltóanyagban lév ő összes szervetlen szén (TIC) koncentrációjának csökken ­
tésével ez részben kiküszöbölhet ő volt.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Egy EU-körvizsgálat (24) során, amelyben öt felületaktív anyagot alkal ­
maztak 10 mg C/l koncentrációban, a következ ő eredmények születtek:  
Vizsgált vegyi anyag Százalékos biológiai 
lebomlás közép ­
értéke 
(28 nap alatt) Relatív szórás 
(%) Laboratóriumok 
száma  
Tetrapropilén- 
benzol-szulfonát 17 45 10 
Diizooktil-szulfoszuk ­
cinát 
(anionos) 72 22 9 
Hexadecil-trimetil- (*) 
ammónium-klorid 
(kationos) 75 13 10 
Izononilfenol-(etoxi ­
lát) 9 
(nem ionos) 41 32 10 
Kókusz-amido-propil- 
dimetilhidroxi- 
szulfobetain 
(amfoter) 60 23 11  
(*) A toxikus hatás semlegesítése SiO  2 hozzáadásával történt.  
Az eredmények azt mutatják, hogy a nehezebben lebomló felületaktív 
anyagok esetében általában véve nagyobb volt a variabilitás. A vizsgálaton 
belüli variabilitás az esetek 90 %-ában nem érte el a 15 %-ot, a legmaga ­
sabb érték 30–40 % volt.  
MEGJEGYZÉS: A felületaktív anyagok többségükben nem azonos szerke ­
zetű molekulákból állnak, hanem több izomer, homológ 
stb. keverékei, amelyek lebomlása nem egyforma alkal ­
mazkodási fázist követ ően, eltérő reakciósebesség mellett 
történik, „zavaros”, laposabb görbét eredményezve, ezért előfordulhat, hogy a „tíznapos ablakban” nem érhet ő el a 
60 %-os megfelelési érték, holott az egyes molekulafajták 
önmagukban vizsgálva 10 nap alatt elérnék a 60 % feletti szintet. Ez a jelenség más összetett keverékek esetében is megfigyelhet ő.
 
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
Készülékek  
15. A szokásos laboratóriumi készülékek és:  
a) üveg szérumpalackok, butilkaucsuk septummal rendelkez ő alumíniumku ­
pakkal lezárva. Az ajánlott méret a 160 ml körüli össztérfogattal rendel ­
kező „125 ml-es” palack (ebben az esetben mindegyik palacknak ismert, 
160 ± 1 ml térfogatúnak kell lennie). Kisebb edény is használható, 
amennyiben az eredmények megfelelnek a 66. és a 67. bekezdésben leírt feltételeknek;
 
b) szénanalizátor vagy a szervetlen szén mérésére alkalmas egyéb m űszer 
(pl. gázkromatográf);  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) fecskend ők nagy pontosságú gáz- és folyadékminta-vételhez;  
d) orbitális rázókészülék szabályozott h őmérséklet ű környezetben;  
e) CO  2 -mentes leveg ő-utánpótlás, amely leveg ő nátronmész-granulátumon 
történő átvezetésével vagy 80 % N  2 /20 % O  2 összetétel ű gázkeverék 
alkalmazásával oldható meg (nem kötelez ő, lásd a 28. bekezdést);  
f) membránsz űrő berendezés 0,20–0,45 μm pórusmérettel (nem kötelez ő); 
g) szervesszén-analizátor (nem kötelez ő). 
Reagensek  
16. Mindvégig analitikai tisztaságú reagenseket használjunk.  
Víz 
17. Olyan desztillált vagy ionmentesített vizet kell használni, amelynek összes 
szervesszén-koncentrációja ≤ 1 mg/l. Ez az ajánlott dózisban alkalmazott 
vizsgált vegyi anyaggal a vizsgálat kezdetén bevitt szerves széntartalom legfeljebb 5 %-ának felel meg.
 
Törzsoldatok az ásványisó-tartalmú közeg el őállításához  
18. A törzsoldatok és az ásványisó-tartalmú közeg hasonló az ISO 14593 szab ­
vány (16) és a gyors biológiai lebonthatóság vizsgálata kapcsán a C.4. 
fejezetben leírt vizsgálati módszer (20) által el őírthoz. Magasabb ammó ­
nium-klorid-koncentráció (0,5 g/l helyett 2,0 g/l) alkalmazása csak nagyon kivételes esetekben szükséges, például ha a vizsgált vegyi anyag koncent ­
rációja > 40 mg C/l. A törzsoldatokat h űtve kell tárolni, és hat hónap után – 
kicsapódásra vagy mikroorganizmus-növekedésre utaló jel esetén korábban 
– meg kell semmisíteni. A következ ő törzsoldatokat kell elkészíteni:
 
a) 8,50 g kálium-dihidrogén-foszfátot (KH  2 PO 4 ), 
21,75 g dikálium-hidrogén-foszfátot (K  2 HPO  4 ), 
33,40 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) és  
0,50 g ammónium-kloridot (NH  4 Cl) 
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk. 7,4 (± 0,2) pH-jú oldatot kell 
kapnunk. Ha ez nem így van, akkor új oldatot kell készíteni.  
b) 36,40 g kalcium-klorid-dihidrátot (CaCl  2 .2H  2 O) 
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk.  
c) 22,50 g magnézium-szulfát-heptahidrátot (MgSO  4 .7H  2 O) 
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk.  
d) 0,25 g vas(III)-klorid-hexahidrátot (FeCl  3 .6H  2 0) 
vízben feloldunk, és 1 literre hígítunk, és hozzáadunk egy csepp tömény 
HCl-t.  
Ásványisó-tartalmú közeg el őállítása  
19. Az a) jel ű oldatból 10 ml-t körülbelül 800 ml vízzel elkeverünk (17. bekez ­
dés), majd hozzáadunk a b), a c) és a d) jel ű oldatok mindegyikéb ől 1 ml-t, 
és az így kapott elegyet vízzel 1 literre hígítjuk (17. bekezdés).  
Egyéb reagensek  
20. Tömény foszforsav (H  3 PO 4 ) (> 85 % m/V).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Nátrium-hidroxid-oldat (7M)  
21. Oldjunk fel 280 g nátrium-hidroxidot (NaOH) 1 liter vízben (17. bekezdés). 
Határozzuk meg az oldat DIC-koncentrációját, és ezt az értéket vegyük figyelembe a vizsgálat eredményének kiszámítása során (lásd az 55. és a 
61. bekezdést), különös tekintettel a 66. bekezdés b) pontjában szerepl ő 
érvényességi kritériumra. Ha a DIC-koncentráció túl magas, készítsünk friss oldatot.
 
Vizsgált vegyi anyag  
22. Ha a vizsgált vegyi anyag megfelel ően oldható vízben, akkor készítsünk 
vízben (17. bekezdés) vagy a vizsgálathoz használt közegben (19. bekezdés) 
lehetőleg a vizsgálathoz használandó végleges koncentráció százszorosának 
megfelelő koncentrációjú törzsoldatot; ha a törzsoldat pH-ja nem megfelel ő, 
akkor be kell állítani. A törzsoldatot adjuk az ásványisó-tartalmú közeghez 
úgy, hogy 2 és 40 mg C/l közötti, lehet őleg 20 mg C/l végleges szervesszén- 
koncentrációt kapjunk. Ennél alacsonyabb koncentráció esetén az eredmé ­
nyek pontossága romolhat. Az oldható és az oldhatatlan folyékony vizsgált 
anyagok nagy pontosságú fecskend ő segítségével közvetlenül bejuttathatók 
az edényekbe. A rosszul oldható, illetve oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok speciális kezelést igényelhetnek (25). A választási lehet őségek a következ ők:
 
a) ismert lemért mennyiségek közvetlen bejuttatása;  
b) ultrahangos diszpergálás a hozzáadás el őtt; 
c) szétoszlatás emulgeálószer segítségével, amelynek mikrobatevékenységet 
gátló vagy serkent ő hatását a hozzáadás el őtt ellenőrizni kell;  
d) a folyékony vizsgált vegyi anyag – vagy megfelel ő, illékony oldószerrel 
készített oldata – adszorbeálása semleges közegen vagy eszközön (pél ­
dául üvegszálas sz űrőn), majd az esetleg használt oldószer elpárologta ­
tása, és ismert mennyiségek bejuttatása;  
e) a vizsgált vegyi anyag könnyen párolgó oldószerrel készített oldata 
ismert mennyiségének bejuttatása az üres kísérleti edénybe, majd az oldószer elpárologtatása.
 
A c), a d) és az e) pontban említett szerek mikrobatevékenységet gátló vagy 
serkentő hatását a hozzáadás el őtt vizsgálattal ellen őrizni kell (lásd a 42. 
bekezdés b) pontját).  
Referencia-vegyianyag  
23. Vízzel készítsünk a vizsgálathoz használandó végleges koncentráció (20 mg 
C/l) lehet őleg százszorosának megfelel ő koncentrációjú törzsoldatot az (old ­
ható) referencia-vegyianyagból (17. bekezdés).  
Gátló hatás ellen őrzése  
24. A gyors biológiai lebonthatóság értékeléséhez használt körülmények között 
a vizsgált vegyi anyagok gyakran nem mutatnak jelent ős mértékű lebomlást. 
Ennek egyik lehetséges oka, hogy a vizsgált vegyi anyag a vizsgálat során alkalmazott koncentrációban gátló hatást gyakorol az oltóanyagra. A gátló hatás lehetséges okként vagy közrem űködő tényezőként való (utólagos) 
azonosításának megkönnyítése érdekében a gátló hatás ellen őrzése beépít ­
hető a vizsgálati tervbe. A másik lehet őség, hogy a gátló hatás ellen őrzése 
kizárja az ilyen zavaró kölcsönhatásokat, és kimutatja, hogy a lebomlás hiánya vagy csekély mértéke kizárólag annak tulajdonítható, hogy a vizsgált 
vegyi anyag a vizsgálati körülmények között nem hozzáférhet ő a mikrobák 
számára. A vizsgált vegyi anyag (aerob) mikroorganizmusokra gyakorolt toxikus hatására vonatkozó információk beszerzéséhez készítsünk a vizsgált vegyi anyagból és a referencia-vegyianyagból (19. bekezdés) oldatot a vizs ­
gálathoz használt közegben úgy, hogy mindkett ő az alkalmazott koncentrá ­
cióban legyen jelen az oldatban (lásd a 22. és a 23. bekezdést).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Oltóanyag  
25. Az oltóanyag különféle forrásokból származhat: lehet eleveniszap, szenny ­
víztisztító elfolyó vize (klórozatlan), felszíni víz és talaj, vagy ezek keveréke (20). A forrás biológiai lebontó képességét referencia-vegyianyag segít ­
ségével ellen őrizzük. Bármely forrásból is származzanak, a vizsgált vegyi 
anyagnak korábban már kitett mikroorganizmusok nem alkalmazhatók, ha az eljárás célja a gyors biológiai lebonthatóság vizsgálata.
 
Figyelmeztetés: Az eleveniszap, a szennyvíz és a szennyvíztisztító elfolyó 
vize kórokozókat tartalmazhat, ezért körültekintéssel kell kezelni.
 
26. A tapasztalatok alapján az oltóanyag optimális mennyisége az a mennyiség, 
amely:  
— elégséges biológiai lebontó képességet biztosít,  
— a referencia-vegyianyag esetében a meghatározott százalékos lebomlást 
eredményezi (lásd a 66. bekezdést),  
— milliliterenként 10  2 –10  5 darab telepképz ő egységet biztosít a végtermék ­
ként kapott keverékben,  
— szokásos körülmények között 4 mg/l lebeg őanyag-koncentrációt biztosít 
a végtermékként kapott keverékben eleveniszap használata esetén; a 
koncentráció 30 mg/l értékig elfogadható, de ez jelent ős mértékben 
növelheti a CO  2 -fejlődést a vakpróbákban (26),  
— a vizsgált vegyi anyaggal bevitt kezdeti szervesszén-koncentráció keve ­
sebb mint 10 %-át adja,  
— biztosítja, hogy a vizsgálathoz használt oldat 1 literére általában 1–10 ml 
oltóanyag jusson.  
Eleveniszap  
27. Az eleveniszapot frissen kell gy űjteni elsősorban háztartási szennyvizet 
fogadó szennyvíztisztító telep vagy laboratóriumi méret ű szennyvíztisztító 
berendezés leveg őztető tartályából. Szükség esetén a durva szemcséket szitá ­
lással el kell távolítani (például 1 mm  2 szemnagyságú szitaháló segítségé ­
vel), és az iszapot a felhasználásig aerob körülmények között kell tartani.  
28. A másik lehet őség a durva részecskék eltávolítása utáni ülepítés vagy cent ­
rifugálás (például 1 100 g intenzitással 10 percig). A felülúszó folyadékot 
távolítsuk el. Az iszapot át lehet mosni az ásványi oldattal. A tömény 
iszapot az ásványi oldatban szuszpendáljuk úgy, hogy 3–5 g/l lebeg ő­
anyag-koncentrációt kapjunk. Ezt követ ően az iszapot a szükséges id őn 
keresztül leveg őztessük.  
29. Az iszapot megfelel ően működő hagyományos szennyvíztisztító telepr ől kell 
gyűjteni. Ha az iszapot nagy terhelés ű szennyvíztisztítóból kellett gy űjte­
nünk, vagy úgy gondoljuk, hogy gátló hatású anyagokat tartalmaz, akkor 
mosni kell. Az újraszuszpendált iszapot alapos keverést követ ően ülepítsük 
vagy centrifugáljuk, majd távolítsuk el a felülúszó folyadékot, és a mosott iszapot ismét szuszpendáljuk egy újabb adag ásványi közegben. Ezt az 
eljárást addig ismételjük, amíg az iszap a fölös szubsztrátumtól vagy gátló 
anyagoktól mentesnek tekinthet ő.
 
30. A teljes újraszuszpendálódás elérése után, vagy ha kezeletlen iszapot hasz ­
nálunk, vegyünk mintát közvetlenül a felhasználás el őtt a lebeg őanyagok 
száraz tömegének meghatározása céljából.  
31. Egy további lehet őség az eleveniszap homogenizálása (3–5 g/l lebeg őanyag- 
koncentráció). Az iszapot Waring laboratóriumi turmixgépben közepes sebességgel 2 percig keverjük. Az így kezelt iszapot 30 percen vagy szükség esetén hosszabb id őn keresztül hagyjuk ülepedni, majd az oltóanyagként 
használni kívánt folyadékot dekantáljuk úgy, hogy az ásványi közeg minden 
literére körülbelül 10 mg oltóanyag jusson.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. A vakpróbákban a CO  2 -fejlődés még tovább csökkenthet ő az iszap egy 
éjszakán keresztüli, CO  2 -mentes leveg ővel történ ő levegőztetésével. Ebben 
a vizsgálatban olyan oltóanyagot használjunk, amelynek eleveniszap-eredet ű 
lebegőanyag-koncentrációja 4 mg/l (13).  
Szennyvíztisztító tisztított elfolyó vize  
33. Alternatívaként els ősorban háztartási szennyvizet fogadó szennyvíztisztító 
telep vagy laboratóriumi méret ű szennyvíztisztító berendezés tisztított 
elfolyó vizéb ől is származhat az oltóanyag. A mintát aerob körülmények 
között kell tartani, és a gy űjtés napján fel kell használni, vagy szükség 
esetén előkondicionálni kell. A durva szemcsés anyag eltávolítása végett 
az elfolyó vizet durva sz űrőn át kell sz űrni, és meg kell mérni a pH-ját.  
34. IC-tartalmának csökkentése érdekében 1 órán keresztül buborékoltassunk át 
a szüredéken CO  2 -mentes leveg őt (15. bekezdés e) pont), miközben a pH-t 
foszforsav segítségével tartsuk 6,5 értéken (20. bekezdés). Nátrium-hidro ­
xiddal állítsuk vissza a pH eredeti értékét (21. bekezdés), és körülbelül 1 
órás ülepítést követ ően vegyünk megfelel ő mennyiség ű felülúszó folyadékot 
oltóanyagnak. Az átbuborékoltatás csökkenti az oltóanyag IC-tartalmát. Például ha a sz űrt és átbuborékoltatott elfolyó víz ajánlott maximális lite ­
renkénti mennyiségét (100 ml) használtuk oltóanyagként, a vakpróbákban az 
edényekben jelen lév ő IC mennyisége a 0,4–1,3 mg/l tartományon belül volt 
(14), ami a vizsgált vegyi anyaggal bevitt szén 2–6,5 %-ának felel meg 20 mg C/l koncentráció alkalmazása esetén és 4–13 %-ának, ha az alkalmazott 
koncentráció 10 mg C/l.
 
Felszíni víz  
35. Megfelel ő felszíni vízb ől mintát veszünk. A mintát aerob körülmények 
között kell tartani, és a mintavétel napján fel kell használni. A mintát 
szükség esetén sz űréssel vagy centrifugálással koncentráljuk. Az egyes 
kísérleti edényekben használandó oltóanyagnak meg kell felelnie a 26. bekezdésben meghatározott követelményeknek.
 
Talaj  
36. Megfelel ő talajból mintát veszünk a talajfelszín alatt legfeljebb 20 cm mély ­
ségből. A kövek, a növénymaradványok és a gerinctelen állatok eltávolítását 
követően a talajmintát 2 mm-es szitahálón átszitáljuk (ha a minta túl nedves 
az azonnali szitáláshoz, akkor a szitálás megkönnyítése érdekében leveg őn 
kicsit szárítjuk). A mintát aerob körülmények között tartjuk, és a mintavétel napján felhasználjuk. (Ha a mintát lazán bekötött fekete polietilén tasakban 
szállítjuk, akkor abban 2–4 °C h őmérsékleten legfeljebb egy hónapig tárol ­
ható.)
 
Az oltóanyag el őkondicionálása  
37. Az oltóanyag el őkondicionálható a kísérleti körülményekhez, de nem adap ­
tálódhat el őre a vizsgált vegyi anyaghoz a kísérlet megkezdése el őtt. 
Előkondicionálással csökkenthet ő a vakpróbákban tapasztalható CO  2 -fejlő­
dés. Az el őkondicionálás azt jelenti, hogy az eleveniszapot a vizsgálathoz 
használt közegben való, 30 mg/l koncentrációra történ ő feloldást követ ően 
CO 2 -mentes nedves leveg ővel legfeljebb 5–7 napig leveg őztetjük a vizsgálat 
során alkalmazandó h őmérsékleten.  
VIZSGÁLATI ELJÁRÁS  
A palackok száma  
38. A vizsgálathoz szükséges palackok száma (lásd a 15. bekezdés a) pontját) az 
analízisek gyakoriságától és a vizsgálat id őtartamától függ.  
39. Ajánlott a palackokat hármasával analízisnek alávetni olyan id őintervallu ­
monként, amely lehet őséget ad a „tíznapos ablak” meghatározására. Emellett 
a vizsgálat végén az a), a b) és a c) sorozatból (lásd a 42. bekezdést) legalább öt palackot (15. bekezdés a) pont) kell analizálni, hogy a száza ­
lékos biológiai lebomlás középértékének 95 %-os konfidenciaintervallumai 
kiszámíthatók legyenek.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Beoltott közeg  
40. Az oltóanyagot úgy kell használni, hogy 4 mg/l eleveniszap-eredet ű száraz­
anyag-koncentrációt kapjunk. Közvetlenül a felhasználás el őtt készítsünk 
elegendő mennyiség ű beoltott közeget, például 2 ml megfelel ően kezelt, 
2 000 mg/l koncentrációjú eleveniszap (27–32. bekezdés) 1 liter ásvá ­
nyisó-közeghez való hozzáadásával (19. bekezdés). Szennyvíztisztító tisztí ­
tott elfolyó vizének használata esetén legfeljebb 100 ml elfolyó vizet (33. bekezdés) kell 900 ml ásványisó-közeghez adni (19. bekezdés), és a 
közeggel 1 literre hígítani.
 
A palackok el őkészítése  
41. A beoltott közeg aliquot részeit adagoljuk a palackokba úgy, hogy a g őztér 
és a folyadék térfogataránya 1:2 legyen (például egy 160 ml befogadóké ­
pességű palackba 107 ml kerüljön). Ett ől eltérő térfogatarány is alkalmaz ­
ható, de a 11. bekezdésben foglaltakat figyelembe kell venni. Mindegyik oltóanyagtípus esetében ügyelni kell arra, hogy a beoltott közeg megfelel ően 
legyen elkeverve, és így a kísérleti palackok között egyformán elosztható 
legyen.
 
42. Az el őkészített palacksorozatoknak (15. bekezdés a) pont) a következ őket 
kell tartalmazniuk:  
a) a kísérleti palackok (F  T ) tartalmazzák a vizsgált anyagot;  
b) a vakpróbákhoz használt kontrollpalackok (F  B ) csak a vizsgálathoz hasz ­
nált közeget és az oltóanyagot tartalmazzák; ha a vizsgált anyag kísérleti 
edényekbe történ ő bejuttatásához bármilyen vegyi anyagot, oldószert, 
egyéb szert vagy üvegszálas sz űrőt használtunk, akkor a palackoknak 
ezeket is tartalmazniuk kell;  
c) az eljárás ellen őrzésére használt edények (F  C ) referencia-vegyianyagot 
tartalmaznak;  
d) amennyiben szükségesek, a vizsgált vegyi anyag lehetséges gátló hatá ­
sának ellen őrzésére használt edények (F  I ) a vizsgált vegyi anyagot az F  T , 
a referencia-vegyianyagot az F  C palackokkal megegyez ő koncentrációban 
tartalmazzák (24. bekezdés);  
e) a lehetséges nem biológiai lebomlási folyamatok ellen őrzésére használt 
edényekhez (F  S ) az a) pontban leírtakon túl 50 mg/l HgCl  2 -t kell adni 
vagy az edényeket más módon (például autoklávban) sterilizálni kell.  
43. A vízben oldható vizsgált vegyi anyagok és referencia-vegyianyagok bejut ­
tatása vizes törzsoldat formájában történik (22., 23. és 24. bekezdés) úgy, hogy 10–20 mg C/l koncentrációt kapjunk.
 
44. Az oldhatatlan vizsgált vegyi anyagok és referencia-vegyianyagok a vizsgált 
vegyi anyag természetének megfelel ően különféle módszerekkel juttathatók 
a palackokba (lásd a 22. bekezdés a)–e) pontját) a beoltott közeg hozzáadása 
előtt vagy után, a vizsgált vegyi anyag kezelésének módszerét ől függően. A 
22. bekezdés a)–e) pontjában felsorolt eljárások alkalmazása esetén a vakpróbákhoz használt F
 B palackokat (42. bekezdés b) pont) hasonló 
módon kell kezelni, de a vizsgált vegyi anyag vagy a referencia-vegyianyag 
nélkül.  
45. Az illékony vizsgált vegyi anyagokat a lezárt palackokba kell befecsken ­
dezni (47. bekezdés) mikrofecskend ő segítségével. A dózist a befecskende ­
zett mennyiség és a vizsgált vegyi anyag s űrűsége alapján kell kiszámítani.  
46. Az edényekbe szükség esetén vizet kell adagolni úgy, hogy mindegyik 
edényben egyforma legyen a folyadék mennyisége. A g őztér és a folyadék 
térfogatarányát (általában 1:2), valamint a vizsgált vegyi anyag koncentrá ­
cióját úgy kell megválasztani, hogy a g őztérben elegend ő oxigén álljon 
rendelkezésre a teljes biológiai lebomláshoz.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Ezt követ ően valamennyi palackot le kell zárni, például butilkaucsuk 
septummal ellátott alumínium kupakkal. Az illékony vizsgált vegyi anya ­
gokat ekkor kell bejuttatni (45. bekezdés). A vizsgálathoz használt oldat DOC-koncentrációja csökkenésének figyelése és a kezdeti IC-koncentráció vagy más meghatározandó tényez ők nulladik id őpontban végzett analízise 
esetén (steril kontrollok, 42. bekezdés e) pont), megfelel ő mintát kell venni a 
kísérleti edényb ől. A kísérleti edényt és tartalmát ezt követ ően meg kell 
semmisíteni.
 
48. A lezárt palackokat (15. bekezdés d) pont) a tartalmuk alapos elkeverése és 
szuszpenzióban tartása céljára megfelel ő rázási sebességet (pl. 150–200 rpm) 
biztosító rotációs rázókészülékre helyezzük (15. bekezdés d) pont), és sötét ­
ben, 20 °C ± 1 °C értéken tartott h őmérsékleten inkubáljuk.  
Mintavétel  
49. A mintavétel menete az alkalmazkodási fázis hosszától és a vizsgált vegyi 
anyag biológiai lebomlásának reakciósebességét ől függ. Az analízis céljára 
felhasznált palackokat a legalább hetente vagy – a teljes bomlási görbe megrajzolásához – gyakrabban (például hetente kétszer) végzett mintavétel napján megsemmisítjük. Az F
 T , az F  B és az F  C , valamint – ha használjuk – 
az F  I és az F  S palackokból (42. bekezdés) a szükséges számú darabot 
levesszük a rázókészülékr ől. A vizsgálat id őtartama általában 28 nap. Ha 
a biológiai bomlás görbéjéb ől arra lehet következtetni, hogy az állandósult 
állapot a 28. nap el őtt beállt, akkor a 28. napnál korábban is be lehet fejezni 
a vizsgálatot. A százalékos biológiai lebomlás relatív szórását, illetve konfi ­
denciahatárait a vizsgálat 28. napjára megmaradt öt palackból vett minták analízisének eredményeib ől kell kiszámítani. A gátló hatás és a nem bioló ­
giai lebomlási folyamatok ellen őrzésére használt palackokból nem kell olyan 
gyakran mintát venni, mint a többi palackból: az 1. és a 28. napon végzett mintavétel elegend ő.
 
Szervetlen szén (IC) analízise  
50. A palackokban végbemen ő CO  2 -fejlődést a szervetlen szén (IC) koncentrá ­
ciója inkubációs id őszak alatti növekedésének mérésével határozzuk meg. A 
vizsgálat során keletkez ő IC-mennyiség mérésére két ajánlott módszer léte ­
zik, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Mivel a két módszer kissé eltér ő 
eredményre vezethet, ugyanazon vizsgálatsorozaton belül csak az egyiket használjuk.
 
51. Az a) módszer alkalmazása akkor ajánlott, ha a közeg tartalmazhatja például 
az üvegszálas sz űrőpapír és/vagy az oldhatatlan vizsgált vegyi anyag marad ­
ványait. Ha szénanalizátor nem áll rendelkezésre, akkor gázkromatográfot is 
használhatunk ennek az analízisnek az elvégzéséhez. Fontos, hogy a g őztér 
gáztartalmának elemzésekor a palackok h őmérséklete a vizsgálat során hasz ­
nált hőmérséklettel megegyez ő vagy ahhoz közeli legyen. Az IC mérésére 
szénanalizátort használó laboratóriumok a b) módszert egyszer űbbnek talál ­
hatják. Fontos, hogy a CO  2 karbonáttá alakításához használt nátrium-hidro ­
xid-oldat (21. bekezdés) vagy frissen készüljön, vagy IC-tartalma ismert legyen, hogy a vizsgálat eredményeinek kiszámítása során ezt az értéket 
vehessük figyelembe (lásd a 66. bekezdés b) pontját).
 
a) módszer: 3 alatti pH-értéket eredményez ő savas kezelés  
52. Az egyes analízissorozatok el őtt az IC-analizátort megfelel ő IC-etalonnal (pl. 
N 2 -ben 1 tömegszázalék CO  2 ) kalibrálni kell. A mintavételre felhasznált 
palackok mindegyikébe a septum kupakon keresztül tömény foszforsavat (20. bekezdés) fecskendezünk, hogy a pH-t 3 alatti értékre csökkentsük 
(például 107 ml vizsgálati közeghez 1 ml-t adunk). Ezt követ ően a palac ­
kokat visszahelyezzük a rázókészülékre. A vizsgálathoz használt h őmérsék­
leten egy óráig folytatott rázást követ ően a palackokat levesszük a rázóké ­
szülékről, és mindegyik palack g őzteréből aliquot résznyi (pl. 1 ml) mintát 
veszünk, amelyet az IC-analizátorba fecskendezünk. A mért 
IC-koncentrációt mg C/l mértékegységben jegyezzük fel.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. A módszer elve, hogy a 3 alatti pH-t eredményez ő savas kezelést és a 
20 °C-on történ ő ekvilibrációt követ ően a folyadék- és a gázfázis közötti 
– koncentrációként mért – CO  2 -megoszlás egyensúlyi állandója 1,0 (13). Ezt 
a következ őképpen legalább egyszer ki kell mutatni a vizsgálati elrendezésre 
vonatkozóan:  
Készítsünk 5 és 10 mg/l IC-koncentrációjú palackokat vízmentes nátrium- 
karbonát (Na  2 CO 3 ) CO  2 -mentes vízben készített oldatát alkalmazva, 
amelyhez tömény foszforsavval (20. bekezdés) savasítsuk úgy a vizet, 
hogy a pH 6,5 legyen, és egy éjszakán buborékoltassunk át rajta CO  2 - 
mentes leveg őt, majd lúggal emeljük a pH-t semleges szintre. Gondoskod ­
junk arról, hogy a g őztér és a folyadék térfogatának aránya ugyanolyan 
legyen, mint a vizsgálatok során (pl. 1:2). Az 52. bekezdésben leírtak szerint 
végezzük el a savas kezelést és az ekvilibrációt, majd mind a g őztérben, 
mind a folyadékfázisban mérjük meg az IC koncentrációját. Ellen őrizzük a 
két koncentráció kísérleti hibahatáron belüli egyezését. Ha az egyezés nem 
áll fenn, akkor ellen őrizni kell az eljárást. Az IC folyadék- és gázfázis 
közötti megoszlásának ezt az ellen őrzését nem kell minden vizsgálat alkal ­
mával elvégezni, valószín űleg a kalibráció során a legcélszer űbb végrehaj ­
tani. 
54. A DOC-csökkenés mérése esetén (csak vízben oldható vizsgált vegyületek 
esetében) a külön (savas kezelésnek nem alávetett) palackok folyadékfázi ­
saiból vett mintákat membránsz űrővel történ ő szűrést követ ően a DOC- 
analizátorba fecskendezzük. Ezek a palackok szükség szerint az els ődleges 
biológiai lebonthatóság mérésére szolgáló további analízisek céljára is felhasználhatók.
 
b) módszer: a CO  2 karbonáttá alakítása  
55. Az egyes analízissorozatok el őtt az IC-analizátort megfelel ő etalonnal – 
például nátrium-bikarbonát (NaHCO  3 ) CO  2 -mentes vízben készített, 0–20 
mg/l tartományon belüli IC-koncentrációjú oldata (lásd az 53. bekezdést) 
felhasználásával – kalibrálni kell. A mintavételre felhasznált palackok mind ­
egyikébe a septum kupakon keresztül nátrium-hidroxid-oldatot (7M, 21. bekezdés) fecskendezünk (például 107 ml közeghez 1 ml-t adunk), majd a 
palackokat a vizsgálathoz használt h őmérsékleten egy órán keresztül rázó ­
készülékkel kezeljük. Az egy napon felhasznált palackok mindegyikéhez ugyanazt az NaOH oldatot használjuk, de ez nem szükséges a vizsgálat során végrehajtott valamennyi mintavétel esetében. Ha a mintavételek alkal ­
mával az abszolút vak IC-értékeket is meg kell határozni, akkor az NaOH- 
oldat IC-koncentrációját minden egyes használat alkalmával meg kell hatá ­
rozni. A rázókészülékr ől való levételt követ ően hagyjuk ülepedni a palackok 
tartalmát. Mindegyik palack esetében fecskend ővel szívjunk fel megfelel ő 
mennyiséget (pl. 1 000-b ől 50 μl) a folyadékfázisból. A mintákat fecsken ­
dezzük az IC-analizátorba, és jegyezzük fel az IC-koncentráció értékeit. E módszer használata során gondoskodni kell arról, hogy az alkalmazott anali ­
zátor képes legyen a lúgos minták kezelésére.
 
56. A módszer elve, hogy a lúgos oldat hozzáadását és a rázást követ ően elha­
nyagolható lesz az IC koncentrációja a g őztérben. Ezt IC-etalont használva 
legalább egyszer ellen őrizni kell a vizsgálati elrendezésre vonatkozóan, 
amelynek során a lúg hozzáadását és az ekvilibrációt követ ően mind a 
gőztérben, mind a folyadékfázisban meg kell mérni az IC koncentrációját 
(lásd az 53. bekezdést). A g őztérben nullához kell közelítenie a koncentrá ­
ciónak. A lényegében teljes mérték ű CO  2 -abszorpciónak ezt az ellen őrzését 
nem szükséges minden vizsgálat alkalmával elvégezni.  
57. A DOC-csökkenés mérése esetén (csak vízben oldható vizsgált vegyületek 
esetében) a külön (hozzáadott lúgot nem tartalmazó) palackok folyadékfázi ­
saiból vett mintákat membránsz űrővel történ ő szűrést követ ően a DOC- 
analizátorba fecskendezzük. Ezek a palackok szükség szerint az els ődleges 
biológiai lebonthatóság mérésére szolgáló további analízisek céljára is 
felhasználhatók  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kiszámítása  
58. A vizsgált vegyi anyag 100 %-os mineralizációját, azaz teljes széntartalma 
CO 2 -vé alakulását feltételezve a ThIC vakpróbákban keletkez ő mennyiséget 
meghaladó része az egyes kísérleti palackokba a vizsgálat kezdetén bejutta ­
tott TOC mennyiséggel egyenl ő, vagyis:  
ThIC ¼ TOC : 
Az összes szervetlen szén (TIC) tömege (mg) az egyes palackokban: 
TIC ¼ ðmg C a folyadékfázisban  þ mg C a g őztérbenÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ [1] egyenlet  
ahol:  
V L = a folyadék térfogata a palackban (liter)  
CL = IC koncentrációja a folyadékban (mg/l szénkoncentráció);  
VH = a g őztér térfogata (liter);  
CH = IC koncentrációja a g őztérben (mg/l szénkoncentráció).  
A TIC kiszámítását az IC mérésére használható két analitikai módszerrel a 
60. és a 61. bekezdés ismerteti. A százalékos biológiai lebomlás ( % D ) 
mindkét esetben: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 [2] egyenlet  
ahol:  
TIC  t = a kísérleti palack TIC értéke a t id őpontban (mg);  
TIC  b = a vakpróbák TIC értékeinek középértéke a t id őpontban (mg);  
TOC = a kísérleti edénybe bejuttatott TOC kezdeti értéke (mg).  
A százalékos biológiai lebomlást (% D) a kísérleti (F  T ), a referencia-vegyi ­
anyagot tartalmazó (F  C ) és – ha a vizsgálatban szerepelnek – a gátló hatás 
ellenőrzésére használt (F  I ) palackokra egyaránt ki kell számítani az egyes 
mintavételi id őpontokig keletkez ő TIC megfelel ő mennyiségéb ől. 
59. Ha a steril kontrollok (F  S ) TIC-tartalma jelent ős növekedést mutat a vizs ­
gálat időszaka alatt, akkor ebb ől a vizsgált vegyi anyag nem biológiai úton 
történő lebomlására lehet következtetni, amit a D értékének [2] egyenlettel 
történő kiszámítása során figyelembe kell venni.  
3 alatti pH-értéket eredményez ő savas kezelés  
60. Mivel a 3 alatti pH-értéket eredményez ő savas kezelés kiegyenlíti a TIC 
koncentrációját a folyadék- és a gázfázisban, az IC-koncentrációt csak a 
gázfázisban kell mérni. Tehát az [1] egyenletb ől 
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , ahol V  B = a szérumpalack térfogata.  
A CO  2 karbonáttá alakítása  
61. Ennél a módszernél is az [1] egyenlettel végezzük a számításokat, de mivel 
az IC mennyisége a gázfázisban elhanyagolható, ezt nem vesszük figye ­
lembe, vagyis  V H Ü C H ¼ 0 és  TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Az eredmények kifejezése  
62. A százalékos biológiai lebomlást (D) az inkubálási id ő függvényében ábrá ­
zoló biológiai bomlási görbének lehet őség szerint mutatnia kell az alkalmaz ­
kodási fázist, a biológiai lebontási fázist, a tíznapos ablakot és az állandósult 
állapotot, azaz azt a fázist, amelyben a maximális lebomlási fok elérése után 
a görbe egy adott értéknél vízszintessé válik. Ha a párhuzamos kísérleti edények (F
 T ) értékei hasonlók (20 %-nál kisebb különbséget mutatnak), 
akkor elegend ő a középértékek görbéjét megrajzolni (lásd 2. függelék, 1. 
ábra); ha nem, akkor minden egyes edény görbéjét meg kell rajzolni. Meg 
kell határozni a százalékos biológiai lebomlás állandósult állapothoz tartozó középértékét vagy a legmagasabb értékét (például amikor a görbe állandó ­
sult állapothoz tartozó szakasza csökkenést mutat), de az utóbbi esetben 
értékelni kell, hogy nem hibás értékr ől van-e szó. A vizsgálati jegy ­
zőkönyvben a biológiai lebomlás így meghatározott maximális szintjét kell 
„a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlási fokaként” feltüntetni. Ha a 
kísérleti edények száma nem volt elegend ő az állandósult állapot megjele ­
nítéséhez, akkor a vizsgálat utolsó napján mért adatokat kell a középérték kiszámításához felhasználni. Ez az utolsó érték – öt ismétlés középértéke – jelzi a százalékos biológiai lebomlás meghatározásának pontosságát. A jegy ­
zőkönyvben a „tíznapos ablak” végén kapott értéket is szerepeltetni kell.
 
63. Ugyanezzel a módszerrel meg kell rajzolni a referencia-vegyianyag (F  C ) és – 
ha a vizsgálatban szerepelt – a nem biológiai lebomlási folyamatok és a gátló hatás ellen őrzésére használt edények (F
 S és F  I ) görbéjét.  
64. Dokumentálni kell továbbá a vakpróbákhoz használt kontrollpalackokban 
(F B ) és – ha a vizsgálatban szerepeltek – a nem biológiai lebomlási folya ­
matok ellen őrzésére használt edényekben (F  S ) jelen lév ő TIC mennyiségét.  
65. Számítsuk ki a keverék egyetlen összetev ője, a referencia-vegyianyag 
alapján várható elméleti IC-hozam felhasználásával az F  I -vel jelölt 
edényekhez tartozó D értéket. Ha a 28. napon [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] x 
100 > 25 %, akkor feltételezhet ő, hogy a vizsgált vegyi anyag gátló hatással 
volt az oltóanyag aktivitására, és ez lehet a vizsgálati körülmények között 
kapott alacsony D  FT értékek magyarázata. Ebben az esetben a vizsgálatot 
alacsonyabb vizsgálati koncentrációval meg kell ismételni, és lehet őség 
szerint az oltóanyag DIC-tartalmát és a vakpróbákban keletkez ő TIC 
mennyiségét is csökkenteni kell, mert ellenkez ő esetben az alacsonyabb 
koncentráció alkalmazása csökkenteni fogja a módszer pontosságát. Alter ­
natív megoldásként használhatunk másik oltóanyagot. Ha a nem biológiai lebomlási folyamatok ellen őrzésére használt F
 S palackban a TIC mennyi ­
ségének jelent ős (> 10 %) növekedése figyelhet ő meg, akkor lehetséges, 
hogy nem biológiai lebomlási folyamatok mentek végbe.  
Az eredmények érvényessége  
66. A vizsgálat akkor tekinthet ő érvényesnek, ha:  
a) a referencia-vegyianyagot tartalmazó F  C edényekben a százalékos 
lebomlás középértéke 60 % fölé emelkedik az inkubálás 14. napjáig; és  
b) a vakpróbákhoz használt F  B edényekben jelen lév ő TIC mennyiségének 
középértéke a vizsgálat végén meghaladja a 3 mg C/l értéket.  
Ha ezek a követelmények nem teljesülnek, akkor a vizsgálatot egy másik 
forrásból származó oltóanyaggal meg kell ismételni, és/vagy felül kell vizs ­
gálni az eljárásokat. Például ha az a probléma, hogy a vakpróbákban sok IC keletkezik, akkor a 27–32. bekezdésben leírt eljárást kell alkalmazni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Százalékos lebomlás a referencia-vegyianyagot tartalmazó F  C edényekben. 
( 2 ) Százalékos lebomlás az F  I edényekben.
 67. Ha kimutatásra került, hogy a vizsgált vegyi anyagnak nincs gátló hatása 
(65. bekezdés), és mégsem sikerül elérni a ThIC 60 % százalékát, akkor a 
vizsgálatot emelt koncentrációjú oltóanyaggal (legfeljebb 30 mg/l eleveni ­
szap, illetve literenként 100 ml szennyvíztisztító elfolyó vizének használata esetén) vagy más forrásokból származó oltóanyagokkal meg lehet ismételni, 
különösen akkor, ha a lebomlás a 20–60 % tartományon belül volt.
 
Az eredmények értelmezése  
68. A ThIC 60 %-a feletti biológiai lebomlás a tíznapos ablakban ennél a vizs ­
gálatnál azt mutatja, hogy a vizsgált vegyi anyag aerob körülmények között biológiailag gyorsan lebontható.
 
69. Ha a ThIC 60 %-aként meghatározott megfelelési értéket nem sikerül elérni, 
akkor meg kell határozni a közeg pH-értékét azokban a palackokban, 
amelyek nem lettek savval vagy lúggal kezelve; a 6,5 alatti érték arra 
utalhat, hogy nitrifikáció zajlott le. Ebben az esetben a vizsgálatot emelt koncentrációjú pufferoldattal meg kell ismételni.
 
Vizsgálati jegyz őkönyv  
70. Állítsunk össze egy táblázatot, amely az egyes mintavételi napokon felhasz ­
nált minden egyes kísérleti palackhoz (F  T ), referencia-vegyianyagot tartal ­
mazó palackhoz (F  C ) és – ha a vizsgálatban szerepel – gátló hatás ellen ­ 
őrzésére szolgáló kontrollpalackhoz (F  I ) tartozó % D értékeket mutatja. 
Dokumentáljuk a vakpróbákban (F  B ) és a steril kontrollokban (F  S ) keletkez ő 
TIC mennyiségét, a DOC értékeket és/vagy az egyéb meghatározandó érté ­
keket, valamint ezek százalékos csökkenését.  
71. Határozzuk meg az állandósult állapothoz tartozó % D értékek középértékét, 
vagy használjuk a legmagasabb értéket, ha a biológiai bomlási görbe állan ­
dósult állapothoz tartozó szakasza csökken ő, és a jegyz őkönyvben ezt 
tüntessük fel „a vizsgált vegyi anyag biológiai lebomlási fokaként”. Az 
utóbbi esetben ellen őrizni kell, hogy nem hibás értékr ől van-e szó.  
72. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ ő információkat kell tartalmaznia:  
Vizsgált anyag:  
— közönséges név, kémiai név, CAS-szám, szerkezeti képlet és a releváns 
fizikai és kémiai tulajdonságok,  
— a vizsgált vegyi anyag kémiai tisztasága (szennyezettsége).  
Vizsgálati körülmények:  
— hivatkozás erre a vizsgálati módszerre,  
— az alkalmazott vizsgálati elrendezés leírása (pl. az edény térfogata, a 
gőztér és a folyadék térfogataránya, keverési módszer stb.),  
— a vizsgált vegyi anyag és a referencia-vegyianyag vizsgálati elrendezésbe 
történő bevitele: alkalmazott vizsgálati koncentrációk és az egyes kísér ­
leti palackokba adagolt szénmennyiség, oldószer esetleges használata,  
— az alkalmazott oltóanyag részletezése, esetleges el őkezelés és el őkondi­
cionálás,  
— inkubálási h őmérséklet,  
— az IC-analízis elvének validálása,  
— az alkalmazott IC-analizátor (és bármely egyéb alkalmazott analitikai 
módszer) f ő jellemzői, 
— a párhuzamos edények száma.  
Eredmények:  
— nyers adatok és a biológiai lebonthatóság számított értékei táblázatos 
formában,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— a vizsgált és a referencia-vegyianyagok százalékos lebomlását az id ő 
függvényében ábrázoló grafikon, az alkalmazkodási fázis, a bomlási 
fázis, a tíznapos ablak és a meredekség,  
— százalékos lebomlás az állandósult állapotban, a vizsgálat végén és a 
tíznapos ablak végén,  
— a vizsgálati eredmények esetleges elvetésének oka,  
— az alkalmazott eljárás szempontjából releváns bármely egyéb körülmény,  
— az eredmények szöveges elemzése.  
SZAKIRODALOM  
(1) E melléklet C.4. fejezete: A „gyors” biológiai lebonthatóság meghatározása 
– CO  2 -fejlődés-vizsgálat (C.4-C. módszer)  
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 
159-167.  
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
(4) Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic cons ­
tants, Chemosphere 33: 1195-1210.  
(5) ISO 9439 (1990; felülvizsgált szöveg: 1999). Vízmin őség. Szerves vegyü ­
letek vizes közegben való teljes, aerob, biológiai lebonthatóságának kiérté ­
kelése. Szén-dioxid-fejl ődéssel járó vizsgálat (Sturm).  
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
(9) Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
 
(10) Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
(12) Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
 
(13) Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
 
(14) Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosp ­
here 23: 507-524.  
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust 
H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodeg ­
radation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999) Vízmin őség. Szerves vegyületek teljes aerob biológiai 
lebonthatóságának kiértékelése vizes közegben. A lezárt edényzet szer ­
vetlen széntartalmának meghatározásán alapuló módszer (a g őztér CO  2 - 
tartalmának vizsgálata).  
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, 
Chemosphere 34: 1813-1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance, Washington, DC.  
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: 
description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219- 
3235.  
(20) E melléklet C.4. fejezete: A „gyors” biológiai lebonthatóság meghatározása  
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodeg ­
radability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. 
Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.  
(22) E melléklet C.11. fejezete: Eleveniszap-légzésgátlási vizsgálat.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
 
(24) EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research 
Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
(25) ISO 10634 (1996) Vízmin őség. Útmutató a vízben rosszul oldódó szerves 
vegyületek el őkészítésére és kezelésére azok vizes közegben való biológiai 
lebonthatóságának értékeléséhez.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
1. függelék  
RÖVIDÍTÉSEK ÉS FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
IC: Szervetlen szén  
ThCO  2 : Elméleti szén-dioxid-felszabadulás (mg): az a számított szén-dioxid- 
mennyiség, amelynek a vizsgált vegyi anyag ismert vagy mért széntartalmából létre kell jönnie a teljes mineralizáció során; mg fejl ődött szén-dioxid/mg vizsgált 
vegyi anyag formában is használják.
 
DOC:  Oldott szerves szén: az oldatban jelen lév ő szerves szén, vagy a 0,45 
mikrométeres sz űrőn átszűrhető, vagy 15 percig tartó kb. 4 000 g (kb. 40 000 
m sec  –2 ) intenzitású centrifugálást követ ően a felülúszó folyadékban maradó 
szerves szén.  
DIC:  Oldott szervetlen szén.  
ThIC:  Elméleti szervetlenszén-termel ődés. 
TIC:  Összes szervetlen szén.  
Biológiailag gyorsan lebontható:  Önkényes besorolás, amelybe olyan vegyi 
anyagok tartoznak, amelyek bizonyos meghatározott, a teljes biológiai lebontha ­
tóság meghatározására szolgáló sz űrővizsgálatok követelményeinek megfeleltek; 
ezek a vizsgálatok olyan szigorúak, hogy feltételezhet ő, hogy az ilyen vegyi 
anyagok vízi környezetben aerob körülmények között biológiailag gyorsan és teljesen lebomlanak.
 
Tíznapos ablak:  A 10 %-os biológiai lebomlás elérését közvetlenül követ ő 10 
nap. 
Jellegénél fogva biológiailag lebontható:  Besorolás, amelybe olyan vegyi 
anyagok tartoznak, amelyekre nézve a biológiai lebonthatóság valamely vizs ­
gálata egyértelm űen igazolta az els ődleges vagy teljes biológiai lebonthatóságot.  
Aerob körülmények közötti teljes biológiai lebomlás:  Az a lebomlási szint, 
amely akkor következik be, amikor a vizsgált vegyületet teljesen felhasználják a 
mikroorganizmusok, és ez szén-dioxid, víz, ásványi sók és új mikrobás sejtalko ­
tórészek (biomassza) keletkezését eredményezi.  
Mineralizáció:  A mineralizáció egy szerves vegyület teljes lebontása aerob 
körülmények között CO  2 -re és H  2 O-ra, anaerob körülmények között pedig 
CH 4 -re, CO  2 -re és H  2 O-ra.  
Alkalmazkodási fázis:  A vizsgálat kezdetét ől addig az id őpontig tartó id őszak, 
amikor a lebontó mikroorganizmusok akklimatizálódása és/vagy alkalmazkodása bekövetkezik, és a vizsgált vegyi anyag vagy szerves anyag biológiai lebomlása észlelhető szintet ér el (például a maximális elméleti biológiai lebomlás 10 %-át 
vagy ennél alacsonyabb szintet a mérési technika pontosságától függ ően).
 
Bomlási fázis:  Az alkalmazkodási fázis végét ől a maximális lebomlási szint 
90 %-ának eléréséig tartó id őszak 
Állandósult állapot:  Az állandósult állapot az a fázis, amelyben a lebomlás 
maximális szintet ér el, és a biológiai bomlási görbe vízszintessé válik.  
Vizsgált vegyi anyag:  Bármely, e vizsgálati módszer alkalmazásával vizsgált 
anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
2. függelék  
Példa a biológiai bomlási görbére  
1. ábra  
1-oktanol biológiai lebomlása a g őztér CO  2 tartalmának vizsgálata során
  
Glosszárium  
biológiai lebomlás  
lebontási fázis  
a biológiai lebomlás maximális szintje  
állandósult állapot  
Tíznapos ablak  
Vizsgálat ideje (nap)  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOLÓGIAI FELHALMOZÓDÁS SZÁRAZFÖLDI 
KEVÉSSERTÉJ ŰEKBEN  
BEVEZETÉS  
1. Ez a vizsgálati módszer egyenérték ű az OECD 317. vizsgálati iránymutatá ­
sában (2010) leírt módszerrel. A vegyi anyagok környezetben bekövetkez ő 
sorsára vonatkozó vizsgálati módszerek közül a „Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat” (e melléklet C.13. fejezete (49)) 1996-ban, a „Bio ­
lógiai felhalmozódás fenékiszapban él ő üledéklakó kevéssertéj űekben” (53) 
2008-ban került kiadásra. A vegyi anyagok vízi környezetben él ő szerveze ­
tekre vonatkozó biológiai felhalmozódására vonatkozó adatok azonban nehezen vagy egyáltalán nem extrapolálhatók szárazföldi szervezetekre, például földigilisztákra. A vegyi anyagok talajban való biológiai felhalmo ­
zódása értékelésére jelenleg a vizsgált vegyi anyag lipofilitásán alapuló 
modellszámításokat – például (14) (37) – használunk, például ahogy az EU szakmai útmutatója (19) leírja. A kompartment specifikus vizsgálati módszer iránti igény már megfogalmazódott a szakirodalomban (például 
(55)). Egy ilyen módszer különösen fontos a szárazföldi táplálékláncokban 
végbemen ő másodlagos mérgezés értékeléséhez (4). A halaktól különböz ő 
szervezetekben való biológiai felhalmozódás vizsgálatára több nemzeti módszer létezik (például (2) és (72)). Az American Society for Testing 
and Materials kidolgozott egy módszert a szennyezett talajokból származó 
anyagok trágyagilisztákban (Eisenia fetida, Savigny) és televényférgekben való biológiai felhalmozódásának a mérésére (3). A biológiai felhalmozódás mesterségesen szennyezett talajban való meghatározásának egy nemzetkö ­
zileg elfogadott módszere – például (25) (29) – javíthatja a vegyi anyagok 
szárazföldi ökoszisztémákra gyakorolt kockázatának az értékelését.
 
2. A talajban él ő lebontó gerinctelen állatok ki vannak téve a talajhoz kötött 
vegyi anyagok hatásainak. Az ezen állatok közé tartozó szárazföldi kevés ­
sertéjűek fontos szerepet játszanak a talaj szerkezete és funkciója szempont ­
jából (15) (20). A szárazföldi kevéssertéj űek a talajban és részben a talaj ­
felszínen (különösen az alomrétegben) élnek; a biomasszát tekintve gyakran a legnépesebb fajokat képviselik (54). A talajban végzett bioturbációs tevé ­
kenységük révén és zsákmányállatként ezek az állatok jelent ős mértékben 
befolyásolhatják a vegyi anyagok más szervezetek, például gerinctelen 
állatok (például ragadozó atkák és bogarak; például (64)), illetve gerinces ragadozók (például róka, sirály) számára való biológiai hozzáférhet őségét 
(18) (62). A szárazföldi kevéssertéj űek közé tartozó egyes fajok ökotoxiko ­
lógiai vizsgálatokban való jelenlegi felhasználását az 5. függelék ismerteti.
 
3. Az ASTM a földigilisztafélék családjába tartozó trágyagilisztával (Eisenia 
fetida) és a közönséges televényféreggel (Enchytraeus albidus) végzett labo ­
ratóriumi talajtoxicitási és bioakkumulációs vizsgálatokra vonatkozó irányadó útmutatója (3) számos alapvet ő és hasznos részletet közöl a talajból 
felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódása itt bemutatott vizs ­
gálatának az elvégzésével kapcsolatban. A vizsgálati módszer ismertetése hivatkozik továbbá az OECD 315. vizsgálati iránymutatására (Biokoncent ­
ráció vizsgálata: átfolyásos hal vizsgálat) (49) és C.51. fejezetére (Biológiai 
felhalmozódás fenékiszapban él ő üledéklakó kevéssertéj űekben) (53). A 
talajból felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódásának vizsgála ­
tára vonatkozó gyakorlati tapasztalatok és szakirodalom – például (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) – ugyancsak fontos 
információforrásként szolgálnak ehhez a vizsgálati módszerhez.
 
4. Ez a vizsgálati módszer leginkább a talajon való adszorbeálódásra hajlamos 
stabil, semleges szerves vegyi anyagok vizsgálatára alkalmas. Lehet ővé teszi 
továbbá a talajrészecskékhez köt ődő stabil fémorganikus vegyületek bioló ­
giai felhalmozódásának a vizsgálatát. Fémek és más nyomelemek esetében ugyancsak alkalmazható.
 
ELŐFELTÉTELEK  
5. Vegyi anyagok szárazföldi kevéssertéj űekben való biológiai felhalmozódását 
eddig nehézfémek (lásd például (63)), valamint 3,0 és 6,0 közötti log K  ow 
értékekkel rendelkez ő megmaradó szerves vegyi anyagok – például (40) – 
esetében vizsgálták. Ilyen vizsgálatok vonatkoztak még a következ őkre: 
— 6,0 feletti log K  ow értéket mutató vegyi anyagok (szuperhidrofób vegyi 
anyagok),  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— olyan vegyi anyagok, amelyek él ő szervezetekben való biológiai felhal ­
mozódásra való képessége ismert, például felületaktív vagy er ősen 
adszorbeálódó vegyi anyagok,  
— vegyi anyagok, amelyek szerkezeti jellemz ői utalnak a biológiai felhal ­
mozódás képességére, például ismert biológiai felhalmozódási potenci ­
állal rendelkez ő vegyi anyagokkal analógok, és  
— fémek.  
6. A vizsgálat megkezdése el őtt bizonyos információknak – mint amilyen 
például a közönséges név, a kémiai név (lehet őleg IUPAC név), a szerkezeti 
képlet, a CAS regisztrációs szám, a kémiai tisztaság, a biztonsági el őírások, 
a megfelel ő tárolási körülmények és az analitikai módszerek – rendelkezésre 
kell állniuk a vizsgált vegyi anyagokról. Mindezek mellett ismerni kell a 
következő információkat:  
a) oldhatóság vízben;  
b) oktanol-víz megoszlási hányados (K  ow ); 
c) talaj- víz megoszlási hányados K  oc -ként kifejezve,  
d) páranyomás;  
e) lebomlási képesség (például talajban, vízben);  
f) ismert metabolitok.  
7. A vizsgált vegyi anyag lehet radioaktívan jelölt vagy nem jelölt. Az analízis 
megkönnyítése érdekében azonban ajánlott radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyagot használni. A döntést a kimutathatósági határértékek alapján kell meghozni, vagy attól függ ően, hogy a kiindulási vegyi anyagra és metabo ­
litjaira vonatkozó mérések szükségesek-e. Radioaktívan jelölt vizsgált vegyi 
anyag használata és az összes radioaktív maradvány mérése esetén fontos jellemezni a kiindulási vegyi anyag és a kiindulási vegyi anyagtól eltér ő 
jelölt anyag százalékarányát a talajban és a vizsgálathoz használt organiz ­
musokban található radioaktívan jelölt maradványok esetében egyaránt, 
például az állandósult állapot id őszaka alatt vagy a felvételi fázis végén 
gyűjtött mintákban, hogy a kiindulási vizsgált vegyi anyag és a talajban 
található metabolitok biológiai felhalmozódási tényez ője (BAF) kiszámítható 
legyen (50. bekezdés). Az itt bemutatott módszer módosítható, például annak érdekében, hogy a radioaktívan nem jelölt szerves vizsgált vegyi anyagok vagy fémek méréséhez elegend ő biomassza álljon rendelkezésre. 
Az összes radioaktív maradvány mérése esetén (az extrakciót, égetést vagy 
szövetstabilizálódást követ ő folyadékszcintillációs számlálással) a biológiai 
felhalmozódási tényez őt a kiindulási vegyi anyag és metabolitjai határozzák 
meg. A BAF kiszámítását lehet őség szerint az organizmusokban mért 
kiindulási vizsgált vegyi anyag és az összes radioaktív maradvány alapján 
kell végezni. Ezt követ ően a biológiai felhalmozódási tényez őből kiszámít ­
ható a féreg lipidtartalmára és a talaj szerves széntartalmára (OC) vonatkoz ­
tatott bióta-talaj felhalmozódási tényez ő (BSAF) a különböz ő biológiai 
felhalmozódási vizsgálatok eredményeinek az összehasonlítása végett.
 
8. Ismerni kell a vizsgált vegyi anyag vizsgálathoz használt fajokra gyakorolt 
toxikus hatását, például a felvételi fázis id őtartamához tartozó hatáskoncent ­
rációt (EC  x ) vagy a letális koncentrációt (LC  x ) (például (19)). A vizsgált 
vegyi anyag választott koncentrációja lehet őleg az akut aszimptotikus LC  50 
körülbelül 1 %-ának feleljen meg, és legalább tízszer nagyobb legyen, mint 
a használt analitikai módszerrel talajban kimutatható határérték. Lehet őség 
szerint a szubletális végpontokkal végzett hosszú távú vizsgálatokból szár ­
mazó toxicitási értékeket kell el őnyben részesíteni (51) (52). Ha ilyen adatok 
nem állnak rendelkezésre, akkor egy akut toxicitási vizsgálat nyújthat 
hasznos információt (lásd például (23)).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Rendelkezni kell egy ismert pontosságú, precizitású és érzékenység ű, 
megfelelő analitikai módszerrel a vegyi anyag mennyiségi meghatározására 
a vizsgálathoz használt oldatokban, a talajban és a biológiai anyagban, a minták el őállítására és tárolására vonatkozó részletes eljárásokkal, valamint 
az anyagbiztonsági adatlapokkal. Ismerni kell továbbá a vizsgált tétel 
talajban és féregszövetben való analitikai kimutathatóságának határértékeit. 
14 C-vel jelölt vizsgált vegyi anyag használata esetén ismerni kell a fajlagos radioaktivitást (Bq/mol) és a szennyez ő anyagokhoz tartozó százalékos 
radioaktivitást. A vizsgált vegyi anyag fajlagos radioaktivitásának olyan 
nagynak kell lennie, hogy az analízist megkönnyítse, de a vizsgálathoz 
használt koncentráció ne váltson ki toxikus hatásokat.
 
10. A vizsgálat mesterséges talajjal és természetes talajokkal egyaránt végez ­
hető. Természetes talaj használata esetén a vizsgálat megkezdése el őtt 
ismerni kell például a talaj vagy a talajösszetev ők eredetét, a pH-t, a szerves 
széntartalmat, a részecskeméret-eloszlást (homok, iszap és agyag százalék ­
aránya) és a víztartó képességet (WHC) (3) (48).  
A VIZSGÁLAT ELVE  
11. A vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódását jellemz ő paraméterek a 
biológiai felhalmozódási tényez ő (BAF), a felvételi sebességi állandó (k  s ) és 
az ürülési sebességi állandó (k  e ). Meghatározásaikat az 1. függelék tartal ­
mazza.  
12. A vizsgálat két fázisra oszlik: a felvételi (expozíciós) fázisra és az ürülési 
(expozíció utáni) fázisra. A felvételi fázisban kell ő ismétlésszámot alkal ­
mazva férgek csoportjait tesszük ki a vizsgált vegyi anyaggal mesterségesen szennyezett talaj hatásának. A kísérleti állatok mellett a vizsgált vegyi anyagtól eltekintve ugyanolyan körülmények között tartott kontrollcsopor ­
tokat alkalmazunk. Mérjük a kísérleti organizmusok száraz tömegét és lipid ­
tartalmát. A kontrollcsoportba tartozó férgek esetében is meg lehet tenni ugyanezt. Analitikai háttérértékek (vakértékek) a kontrollcsoportba tartozó férgekből és a talajból vett minták elemzésével kaphatók. Az ürülési 
fázishoz a férgeket át kell helyezni a vizsgált vegyi anyagot nem tartalmazó 
talajba. Az ürülési fázis csak akkor hagyható el, ha az expozíciós fázisban jelentős mértékű volt a vizsgált vegyi anyag felvétele. Az ürülési fázis arról 
nyújt tájékoztatást, hogy a kísérletben részt vev ő szervezetek milyen 
ütemben választják ki a vizsgált vegyi anyagot (például (27)). Ha a felvételi 
fázis során nem állt be állandósult állapot, akkor a kinetikai paramétereket – a kinetikai biológiai felhalmozódási tényez őt (BAF
 k ), valamint a felvételi és 
az ürülési sebességi állandó(ka)t – a felvételi és az ürülési fázisokban kapott 
eredmények szimultán illesztése alapján kell meghatározni. A vizsgált vegyi 
anyag koncentrációját a férgekben/férgeken a vizsgálat mindkét fázisa során mindvégig figyelemmel kell kísérni.
 
13. A felvételi fázisban az állandósult állapot eléréséig legfeljebb 14 napig 
(televényférgeknél) vagy 21 napig (földigilisztáknál) kell mintákat venni a mérések elvégzéséhez (11) (12) (67). Az állandósult állapot akkor követ ­
kezik be, amikor a férgekben mért koncentrációt az id ő függvényében 
mutató görbe az id őtengellyel párhuzamossá válik, és a legalább kétnaponta 
vett mintákon végzett koncentrációanalízisek statisztikai összehasonlítása (például varianciaanalízis, regressziós analízis) három egymást követ ő 
esetben legfeljebb ± 20 %-os eltérést mutat.
 
14. Az ürülési fázishoz a vizsgálathoz használt organizmusokat át kell helyezni 
olyan edényekbe, amelyek ugyanazt a szubsztrátumot tartalmazzák, de a 
vizsgált vegyi anyag nélkül. Az ürülési fázis során 14 napon keresztül 
(televényférgeknél) vagy 21 napon keresztül (földigilisztáknál) kell mintákat venni a mérések elvégzéséhez, kivéve, ha a korábbi analitikai meghatá ­
rozások a vizsgált vegyi anyag 90 %-os csökkenését mutatták a férgekben. 
A vizsgált vegyi anyagnak az ürülési fázis végén a férgekben mért koncent ­
rációját ki nem választott maradványokként kell dokumentálni. Lehet őleg
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
egyaránt ki kell számítani az állandósult állapothoz tartozó biológiai felhal ­
mozódási tényez őt (BAFss) – a láthatóan beállt állandósult állapotban a 
férgekben (Ca) és a talajban (Cs) mért koncentrációk hányadosaként – és a kinetikai biológiai felhalmozódási tényez őt (BAFK) – a talajból való 
felvétel sebességi állandója (ks) és az ürülési sebességi állandó (ke) hánya ­
dosaként (a meghatározásokat lásd az 1. függelékben), els őrendű kinetikát 
feltételezve (a számításokat lásd a 2. függelékben). Ha nyilvánvalóan nem elsőrendű a kinetika, akkor más modelleket kell alkalmazni.
 
15. A felvételi sebességi állandót, az ürülési sebességi állandót (vagy más 
modellek használata esetén állandókat), a kinetikai biológiai felhalmozódási tényezőt (BAF
 K ) és – amennyiben lehetséges – e paraméterek mindegyike 
esetében a konfidenciahatárokat számítógépes módszerrel kell kiszámítani 
modellegyenletekb ől (az útmutatást lásd a 2. függelékben). Bármely modell 
esetében az illeszkedés megfelel ősége meghatározható például a korrelációs 
együttható vagy a determinációs együttható alapján (az együttható 1-hez 
közeli értéke jelzi a jó illeszkedést), vagy khi-négyzet próbával. A becsült 
paraméterek szórásából vagy konfidenciahatárából is következtetni lehet a modell illeszkedésének megfelel őségére.
 
16. Erősen lipofil vizsgált anyagok esetén a vizsgálati eredmények variabilitá ­
sának csökkentése érdekében a biológiai felhalmozódási tényez őket a lipid ­
tartalomra és a szerves széntartalomra vonatkoztatva kell kifejezni (a talaj 
szerves széntartalmának (OC) hány kilogrammja jut a férgek lipidtartal ­
mának egy kilogrammjára). Ez a megközelítés azon a tényen alapul, hogy a vegyi anyagok egyes osztályainál nyilvánvaló összefüggés áll fenn a 
biológiai felhalmozódási potenciál és a lipofilitás között, amint azt halaknál 
egyértelm űen kimutatták (47). Az ilyen vegyi anyagok biológiai felhalmo ­
zódása a hal lipidtartalmától függ. A fenékiszapban él ő organizmusoknál is 
hasonló korrelációt állapítottak meg, például (30) (44). A szárazföldi kevés ­
sertéjűeknél is kimutattak hasonló összefüggést, például (5) (6) (7) (14). Ha 
elegendő féregszövet áll rendelkezésre, akkor a kísérleti állatok lipidtar ­
talmát ugyanabból a biológiai anyagból lehet meghatározni, mint amit a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározására használunk. A 
másik lehet őség, hogy kontroll állatokat használunk a lipidtartalom méré ­
sére.
 
A VIZSGÁLAT ÉRVÉNYESSÉGE  
17. A következ ő feltételeknek kell teljesülniük mind a kontrollok, mind a keze ­
lések során ahhoz, hogy a vizsgálat érvényes legyen:  
— A vizsgálat végén a felvételi és az ürülési fázisban mért mortalitás 
összességében nem haladhatja meg a behelyezett férgek összlétszámának 10 %-át (földigilisztáknál), illetve 20 %-át (televényférgeknél).
 
— Eisenia fetida  és Eisenia andrei  használata esetén a felvételi és az 
ürülési fázis végén mért tömegveszteség középértéke nem haladhatja 
meg az egyes fázisok elején mért kezdeti friss tömeg 20 %-át.  
A MÓDSZER LEÍRÁSA  
A vizsgálathoz használt fajok  
18. A biológiai felhalmozódás vizsgálatához a szárazföldi kevéssertéj űek közé 
tartozó több faj is ajánlott. A leggyakrabban használt fajok az Eisenia fetida vagy Eisenia andrei (földigiliszta-félék), illetve az Enchytraeus albidus, 
Enchytraeus crypticus vagy Enchytraeus luxuriosus (televényférgek), 
amelyek leírását az 5. függelék tartalmazza.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Készülékek  
19. A berendezés valamennyi részét illet ően kerülni kell az olyan anyagok 
használatát, amelyek oldódhatnak, adszorbeálhatják a vizsgált vegyi anyagot, vagy amelyekb ől más vegyi anyagok mosódhatnak ki, illetve amelyek ártal ­
masak lehetnek a vizsgálathoz használt állatokra. Szabványos, kémiailag 
semleges anyagból készült, a terhelés mértékének – vagyis a kísérleti állatok számának – megfelel ő térfogatú négyszögletes vagy hengeres edények hasz ­
nálhatók. A vizsgálathoz használt közeggel érintkez ő felszerelések rozs ­
damentes acélból, m űanyagból vagy üvegb ől készülhetnek. A vizsgálati 
edényeket megfelel ő módon le kell fedni, hogy a férgek ne szökhessenek 
ki belőlük, de az elegend ő levegőellátás biztosított legyen. Magas adszorp ­
ciós együtthatóval rendelkez ő vegyi anyagok, például szintetikus piretroidok 
vizsgálata esetén szilanizált üveg használata lehet szükséges. Ilyenkor a felszerelést használat után meg kell semmisíteni (49). Ügyelni kell, hogy a radioaktívan jelölt vizsgált tételek és illékony vegyi anyagok ne kikerül ­
hessenek ki a vizsgálati elrendezésb ől. Megfelel ő abszorbenst tartalmazó 
csapdák (például üveg gázmosó palackok) alkalmazásával meg kell akadályozni a maradványok elillanását a vizsgálati edényekb ől.
 
Talaj  
20. A vizsgálathoz olyan min őségű talajt kell használni, amely lehet ővé teszi a 
vizsgálathoz használt organizmusok túlélését és lehet őség szerinti szaporo ­
dását az alkalmazkodási és a vizsgálati id őszakok alatt anélkül, hogy rend ­
ellenes megjelenést vagy viselkedést mutatnának. A férgeknek bele kell 
ásniuk magukat a talajba.  
21. A vizsgálat során az e melléklet C.8. fejezetében (48) leírt mesterséges talajt 
ajánlott szubsztrátumként használni. A biológiai felhalmozódási vizsgála ­
tokhoz való használatra szánt mesterséges talaj el őállítását és a mesterséges 
talaj tárolására vonatkozó ajánlásokat a 4. függelék tartalmazza. A leveg őn 
szárított mesterséges talaj a felhasználásig szobah őmérsékleten tárolható.  
22. Szennyezésmentes helyr ől származó természetes talajok is szolgálhatnak a 
vizsgálathoz és/vagy a férgek tenyésztéséhez használt talajként. A termé ­
szetes talajokat jellemezni kell legalább a következ őkkel: származás (gy űjtés 
helye), pH, szerves széntartalom, részecskeméret-eloszlás (homok, iszap és agyag százalékaránya), maximális víztartó képesség (WHC
 max ) és száza ­
lékos víztartalom (3). A talajban, illetve a talajösszetev őkben található 
mikro-szennyez ő anyagok analízise a felhasználás el őtt hasznos informáci ­
ókat szolgáltathat. Mez őgazdasági földterületr ől származó talaj használata 
esetén meg kell gy őződni arról, hogy a talajt nem kezelték növényvéd ő­
szerrel vagy kezelt állatoktól származó trágyával a mintavételt megel őző 
legalább egy évben, illetve szerves trágyával a mintavételt megel őző 
legalább fél évben (50). A természetes talajok kevéssertéj űekkel végzett 
ökotoxikológiai laboratóriumi vizsgálatok során történ ő felhasználás el őtti 
kezelésének leírása a szakirodalomban megtalálható (3). A természetes tala ­
jokat a lehet ő legrövidebb ideig szabad csak a laboratóriumban tárolni.  
A vizsgált anyag bevitele  
23. A vizsgált vegyi anyagnak be kell épülnie a talajba. Ehhez figyelembe kell 
venni a vizsgált vegyi anyag fizikai és kémiai tulajdonságait. Ha a vizsgált 
vegyi anyag vízben oldható, akkor a talajba keverés el őtt vízben fel kell 
oldani. Vízben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok esetén egy vagy több (mesterséges) talajösszetev ő vizsgált vegyi anyaggal való bevonása az aján ­
lott szennyezési eljárás. A kvarchomokot vagy annak egy részét például át 
lehet itatni a vizsgált vegyi anyag megfelel ő szerves oldószerrel készített 
oldatával, amelyet aztán lassan elpárologtatunk, amíg a homok megszárad.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
Ezt követ ően a bevont részt össze lehet keverni a nedves talajjal. Ennek az 
eljárásnak az a legf őbb előnye, hogy a talajba nem kerül oldószer. Termé ­
szetes talaj használata esetén a vizsgált vegyi anyag bejuttatásához szeny ­
nyezhetjük a talaj egy leveg őn szárított részét a vizsgált vegyi anyaggal a 
mesterséges talajra vonatkozóan az imént bemutatott módon, vagy a nedves 
talajba keverhetjük a vizsgált vegyi anyagot, majd a következ ő lépésben 
elpárologtatjuk az oldódást segít ő szert, amennyiben ilyet használtunk. A 
nedves talaj oldószerekkel való érintkezését általában amennyire csak lehet kerülni kell. Figyelembe kell venni a következ őket (3):
 
— Ha nem vizet használunk oldószerként, akkor olyan oldószert kell hasz ­
nálni, amely vízzel elegyíthet ő, és/vagy eltávolítható (például elpárolog ­
tatható) úgy, hogy csak a vizsgált vegyi anyag maradjon a talajban.  
— Az oldószer vizsgálatára szolgáló kontroll használata esetén negatív 
kontroll nem szükséges. Az oldószer vizsgálatára szolgáló kontroll 
edénynek a legnagyobb koncentrációban kell tartalmaznia a talajhoz 
adott oldószert, amelynek ugyanabból a tételb ől kell származnia, mint 
amelyet a törzsoldat készítéséhez használtunk. Az oldódást segít ő 
megfelelő szer kiválasztásának f ő szempontjai az oldószer toxikus hatása 
és illékonysága, valamint a vizsgált vegyi anyag választott oldószerben 
való oldhatósága.  
24. Vízben és szerves oldószerekben rosszul oldódó vizsgált vegyi anyagok 
esetén a kívánt vizsgálati koncentráció eléréséhez vizsgálati edényenként 
2,0–2,5 g finomra őrölt kvarchomokot összedolgozhatunk a vizsgált vegyi 
anyag megfelel ő mennyiségével például mozsárban. A kvarchomok és a 
vizsgált vegyi anyag e keverékét hozzáadjuk az el őnedvesített talajhoz, és 
alaposan elkeverjük megfelel ő mennyiség ű ionmentesített vízzel úgy, hogy a 
szükséges nedvességtartalmat kapjuk. A végtermékként kapott keveréket 
elosztjuk a vizsgálati edények között. Az eljárást minden egyes vizsgálati koncentráció esetén megismételjük, és egy vizsgálati edényenként 2,0–2,5 g finomra őrölt kvarchomokot tartalmazó, megfelel ő kontroll edényt is készí ­
tünk.
 
25. A szennyezést követ ően meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag koncent ­
rációját a talajban. A vizsgálathoz használt organizmusok behelyezése el őtt 
ellenőrizni kell a vizsgált vegyi anyag homogén eloszlását a talajban. A 
szennyezési módszert és az adott szennyezési eljárás indoklását dokumen ­
tálni kell (24).  
26. A talaj és a pórusvíz fázis közötti egyensúlynak ideális esetben a vizs ­
gálathoz használt organizmusok behelyezése el őtt be kell állnia; 20 °C 
hőmérsékleten erre négy napot ajánlott számítani. Számos vízben rosszul 
oldódó szerves vegyi anyag esetében az adszorbeálódott és oldott frakciók közötti valódi egyensúly eléréséhez napokra vagy hónapokra lehet szükség. A vizsgálat céljától függ ően, például ha a környezeti feltételeket kell 
utánozni, a mesterségesen szennyezett talaj hosszabb ideig „érlelhet ő”, 
például fémek esetében három héten keresztül 20 °C h őmérséklet mellett 
(22).
 
A vizsgálathoz használt organizmusok tenyésztése  
27. A férgeket lehet őleg állandó laboratóriumi tenyészetben kell tartani. Az  
Eisenia fetida  és az  Eisenia andrei , valamint a televényféreg fajok labora ­
tóriumi körülmények közötti tenyésztésének módszereire vonatkozóan az 5. 
függelék ad útmutatást (lásd még (48) (51) (52)).  
28. A vizsgálathoz használt férgeken nem lehetnek megfigyelhet ő betegségek, 
rendellenességek és paraziták.  
A VIZSGÁLAT ELVÉGZÉSE  
29. A vizsgálathoz használt organizmusokat a felvételi fázisban tesszük ki a 
vizsgált vegyi anyag hatásának. A felvételi fázis 14 nap (televényférgeknél) 
vagy 21 nap (földigilisztáknál), kivéve, ha kimutatható, hogy az állandósult 
állapot elérése ennél el őbb bekövetkezett.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Az ürülési fázishoz a férgeket át kell helyezni a vizsgált vegyi anyagot nem 
tartalmazó talajba. Az els ő mintavételt az ürülési fázis kezdete után 4 – 24 
órával kell végezni. A 21 napos felvételi fázisra és 21 napos ürülési fázisra vonatkozó mintavételi ütemtervekre a 3. függelék mutat be példákat.
 
A vizsgálathoz használt organizmusok  
31. A szárazföldi televényférgek számos fajánál az egyedtömeg nagyon kicsi 
(például az  Enchytraeus albidus  esetében egy egyed nedves tömege 5–10 
mg, az  Enchytraeus crypticus  vagy az  Enchytraeus luxuriosus  esetében 
pedig még kevesebb); a tömegmérések és a kémiai analízisek elvégzéséhez szükség lehet az egyes ismétlésekhez tartozó férgek együttes vizsgálatára 
(azaz az adott ismétléshez tartozó valamennyi férget fel kell használni 
ahhoz, hogy egyetlen analitikai szöveteredményt kapjunk). Minden egyes ismétléshez 20 televényféreg egyedet kell használni, és legalább három ismétlést kell alkalmazni. Ha a vizsgált vegyi anyag analitikai kimutatható ­
sági határértéke magas, több féregre lehet szükség. Ha a vizsgálathoz 
nagyobb egyedtömeggel rendelkez ő fajokat használunk ( Eisenia fetida  és 
Eisenia andrei ), akkor egy egyedet tartalmazó ismétlések is használhatók.
 
32. A vizsgálathoz hasonló tömeg ű földigilisztákat (például az  Eisenia fetida  és 
az Eisenia andrei  esetében 250–600 mg tömeg ű egyedeket) kell használni. 
A televényférgeknek (például  Enchytraeus albidus ) körülbelül 1 cm 
hosszúnak kell lenniük. Az egy adott vizsgálathoz használt valamennyi 
féregnek ugyanabból a forrásból kell származnia, és kifejlett állatnak kell 
lennie, amelynél a nyereg (clitellum) már kialakult (lásd az 5. függeléket). Mivel az állatok tömege és kora hatással lehet a BAF értékekre (például az eltérő lipdtartalom és/vagy a peték jelenléte következtében), ezeket a para ­
métereket pontosan dokumentálni kell, és figyelembe kell venni az eredmé ­
nyek értelmezése során. Az expozíciós id őszak alatt lerakott gubók is befo ­
lyásolhatják a BAF értékeket. Az átlagos nedves és a száraz tömeg becslése végett ajánlott a vizsgálat el őtt lemérni a vizsgálathoz használt férgek egy 
részmintáját.
 
33. A talaj férgekhez viszonyított arányának elég nagynak kell lennie ahhoz, 
hogy a felvételi fázisban minél kevésbé csökkenjen a vizsgált vegyi anyag 
koncentrációja a talajban.  Eisenia fetida , illetve  Eisenia andrei  használata 
esetén 50 g (száraz tömeg), a televényférgek esetében pedig 10–20 g (száraz tömeg) egy féregre jutó minimális talajmennyiség biztosítása ajánlott. Az edényeknek 2–3 cm (televényférgeknél), illetve 4–5 cm (földigilisztáknál) 
talajréteget kell tartalmazniuk.
 
34. A tenyészetb ől kivesszük a vizsgálathoz használni kívánt férgeket (például 
ékszerész csipesszel televényférgek használata esetén). A kifejlett állatokat 
nem kezelt kísérleti talajba helyezzük, hogy akklimatizálódjanak, és 
tápláljuk (lásd a 36. bekezdést). Ha a vizsgálati körülmények eltérnek a tenyésztési körülményekt ől, akkor 24–72 órás akklimatizálódási id őszak 
szükséges ahhoz, hogy a férgek alkalmazkodjanak a vizsgálati körülmények ­
hez. Az akklimatizációt követ ően a földigilisztákat tiszta vizet tartalmazó 
üvegedényekbe (például petri-csészékbe) helyezzük, és leöblítjük, majd azt követően lemérjük a tömegüket, miel őtt a vizsgálathoz használt talajba 
helyeznénk őket. A mérés el őtt a férgeket finoman az edény széléhez kell 
ütögetni, vagy enyhén megnedvesített papírtörölköz ővel óvatosan meg kell 
őket törölgetni, hogy a felesleges vizet eltávolíthassuk róluk.
 
35. A vizsgálathoz használt organizmusok viselkedését figyelni és dokumentálni 
kell. A földigilisztákkal végzett kísérletekben az állatok (a kontroll és a 
kezelt csoport egyaránt) akkor mutatnak normális viselkedést, ha néhány órán belül beássák magukat a talajba; ezt a férgek vizsgálati edényekbe való behelyezését követ ő 24 órán belül ellen őrizni kell. Ha a földigiliszták 
nem ássák be magukat a talajba (például a felvételi fázis félidejét több mint 
10 %-kal meghaladó id őszak elteltével), az vagy arra utal, hogy a vizsgálati
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
körülmények nem megfelel ők, vagy arra, hogy a vizsgálathoz használt orga ­
nizmusok nem egészségesek. Ilyen esetben a vizsgálatot le kell állítani, és 
meg kell ismételni. A televényférgek f őként a talajszemcsék közti póru ­
sokban élnek, és kültakarójuk gyakran csak részben érintkezik a környez ő 
szubsztrátummal; a televényférgek esetében az expozíciót egyenérték űnek 
tételezzük fel függetlenül attól, hogy beássák-e magukat a talajba, vagy 
sem, és az utóbbi esetben a vizsgálatot nem feltétlenül szükséges megismé ­
telni.  
Táplálás  
36. Ha a vizsgálathoz használt talaj összes szerves széntartalma alacsony, akkor 
a férgeket táplálni kell. Mesterséges talaj használata esetén az ajánlott heti táplálékadag (amelyet hetente egyszer kell adni) a földigilisztáknál a talaj száraz tömegének minden grammjára 7 mg szárított istállótrágya, televény ­
férgeknél pedig a talaj száraz tömegének minden grammjára 2–2,5 mg őrölt 
zabpehely (11). Az els ő táplálékadagot közvetlenül a vizsgálathoz használt 
organizmusok behelyezését követ ően kell a talajba keverni. Lehet őleg 
ugyanolyan típusú táplálékot kell használni, mint a tenyésztés során (lásd 
az 5. függeléket).
 
Fény és h őmérséklet  
37. A vizsgálatot szabályozott, 16 órás világos és 8 órás sötét periódusból álló 
ciklusokat alkalmazva kell végezni, lehet őleg úgy, hogy a vizsgálati edények 
400–800 lx fényt kapjanak (3). A vizsgálat teljes id őszaka alatt 20 ± 2 °C 
hőmérsékletet kell biztosítani.  
Vizsgálati koncentrációk  
38. A vizsgálathoz egyetlen koncentrációt használunk. A további koncentrá ­
ció(k) szükségességét indokolni kell. Az analitikai kimutathatósági határ ­
értékhez közeli toxicitású (EC  x ) vegyi anyag vizsgálata esetén nagy fajlagos 
aktivitást biztosító radioaktív jelölésre van szükség. Fémek esetén a koncent ­
rációnak a szövetre és a talajra jellemz ő háttérszint felett kell lennie.  
Ismétlések  
39. A kinetikai mérésekhez (a felvételi és az ürülési fázisban) mintavételi 
pontonként legalább három ismétlést kell alkalmazni minden egyes kezelt edény esetében. Összességében az ismétlésszámnak elegend őnek kell lennie 
ahhoz, hogy a felvételi és az ürülési fázisban valamennyi mintavételt el 
lehessen végezni a megfelel ő időpontban.
 
40. A biológiai megfigyelésekhez és mérésekhez (például a száraz és nedves 
tömeg aránya, lipidtartalom), valamint a férgek és a talaj háttér-koncentrá ­
ciójának analíziséhez használt negatív kontrollok esetében legalább 12 ismétlés szükséges (négy a vizsgálat kezdetén, négy a felvételi fázis végén 
és négy az ürülési fázis végén végzett mintavételekhez), amennyiben a vízen 
kívül más oldószert nem használunk. Ha a vizsgált vegyi anyaggal való szennyezéshez oldódást segít ő szert használtunk, akkor a kezelt ismétlések 
mellett a vizsgált vegyi anyagon kívül minden egyéb összetev őt tartalmazó 
kontrollokat is be kell állítani a szolubilizáló szer hatásának az ellen őrzésére 
(négy ismétlést a vizsgálat kezdetén, négyet a felvételi fázis végén és négyet az ürülési fázis végén végzett mintavételekhez). Ebben az esetben a negatív kontrollok esetében további négy ismétlésre (oldószert nem tartalmazó 
edények) lehet szükség a felvételi fázis végén végzett választható mintavé ­
telekhez. Ezek az ismétlések az oldószer kontrollal való biológiai összeha ­
sonlításra szolgálnak, amelyb ől az oldószer vizsgálathoz használt organiz ­
musokra gyakorolt lehetséges hatásáról kaphatunk tájékoztatást. Ajánlatos 
elegendő számú (például nyolc) további tartalék ismétlést is biztosítani 
mind a kezelt, mind a kontroll edényekhez.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
A talajmin őség-mérés gyakorisága  
41. A vizsgálat kezdetén, valamint a felvételi és az ürülési fázisok végén meg 
kell mérni a talaj pH-ját és nedvességtartalmát, valamint a vizsgálat elvég ­
zésére szolgáló helyiség (állandó) h őmérsékletét. A talaj nedvességtartalmát 
hetente egyszer ellen őrizni kell, amelyhez meg kell mérni a vizsgálati 
edények tömegét, és a tényleges értékeket össze kell hasonlítani a vizsgálat kezdetén mért kiindulási értékekkel. A vízveszteséget ionmentesített víz hozzáadásával pótolni kell.
 
A féreg- és talajminták gy űjtése és analízise  
42. A földigilisztával és televényféreggel végzett biológiai felhalmozódási vizs ­
gálatok felvételi és ürítési fázisaira vonatkozó ütemterv egy példáját a 3. 
függelék mutatja be.  
43. A vizsgált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához a férgek 
behelyezése el őtt, valamint a felvételi és az ürülési fázis során talajmintákat 
kell venni a vizsgálati edényekb ől. A vizsgálat során meg kell határozni a 
vizsgált vegyi anyag koncentrációjának alakulását a férgekben és a talajban. Általában a talajra jellemz ő összkoncentrációt szokás mérni. Kiegészítés ­
képpen a pórusvízre jellemz ő koncentráció is mérhet ő; ebben az esetben a 
vizsgálat megkezdése el őtt ki kell dolgozni az indoklást és a megfelel ő 
módszereket, amelyeknek a jegyz őkönyvben is szerepelniük kell.
 
44. A felvételi és az ürülési fázis során legalább hat alkalommal kell féreg- és 
talajmintákat gy űjteni. Ha a vizsgált vegyi anyag stabilitása bizonyított, a 
talajanalízisek száma csökkenthet ő. A felvételi fázis kezdetén és végén aján ­
lott legalább három ismétlést analizálni. Ha a talajban mért koncentráció a felvételi fázis végén több mint 30 %-kal eltér a kezdeti koncentrációtól, akkor a más napokon vett talajmintákat is analizálni kell.
 
45. Minden egyes mintavétel alkalmával el kell távolítani a férgeket az adott 
edény talajtartalmából (például az edény talajtartalmát egy nem túl mély 
tálon szétterítjük, majd egy puha ékszerész csipesszel kiemeljük a férgeket), és vízzel gyorsan át kell öblíteni egy nem túl mély pohárban vagy acéltál ­
ban. A fölösleges vizet el kell távolítani (lásd a 34. bekezdést). A férgeket 
óvatosan át kell helyezni egy el őre lemért edénybe, majd azonnal le kell 
mérni a béltartalommal együtt.
 
46. Ezt követ ően hagyni kell, hogy a földigiliszták ( Eisenia  sp.) az éjszaka 
folyamán kiürítsék a béltartalmukat, például egy lefedett petri-csészében elhelyezett nedves sz űrőpapíron (lásd a 34. bekezdést). A béltartalom 
ürítését követ ően a biomassza vizsgálat id őszaka alatti esetleges csökkené ­
sének az értékelése céljából meg kell határozni a férgek tömegét (lásd az 
érvényességi kritériumokat a 17. bekezdésben). A televényférgek tömegének mérését és szövetelemzését a béltartalom ürítése nélkül kell elvégezni, ám ez 
a férgek kis mérete miatt technikailag nehezen lenne kivitelezhet ő. A 
végleges tömeg meghatározását követ ően a férgeket azonnal el kell pusztí ­
tani a lehet ő legmegfelel őbb módszert alkalmazva (például folyékony hidro ­
génnel vagy –18 °C alatti h őmérsékletre történ ő fagyasztással).
 
47. Az ürülési fázis során a férgek szennyezett béltartalma tiszta talajra cseré ­
lődik. Ez azt jelenti, hogy ha a közvetlenül az ürülési fázis el őtt vett 
mintában szerepl ő férgeken a béltartalom ürítése nélkül végezzük el a méré ­
seket (televényférgek esetében), akkor azok a szennyezett talajból álló béltartalmat is tartalmazni fogják. A vízi kevéssertéj űek esetében azt felté ­
telezzük, hogy az ürülési fázis els ő 4–24 órájában a szennyezett béltartalom 
nagy része tiszta üledékre cserél ődik, például (46). Földigiliszták esetében 
hasonló eredmények születtek a radioaktívan jelölt kadmium és cink felhal ­
mozódására vonatkozó vizsgálatok során (78). A televényférgek esetében az ürülési fázisban els őként vett mintában mért koncentrációt lehet a béltar ­
talom kiürülése utáni szövetkoncentrációnak tekinteni. Annak ellensúlyozása 
végett, hogy a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a nem szennyezett talaj általi hígítás miatti csökkenhet az ürülési fázisban, a béltartalom tömegét a férgek nedves tömegének az elpusztult férgek tömegéhez viszonyított 
aránya, illetve a férgek száraz tömegének az elpusztult férgek tömegéhez 
viszonyított aránya alapján is meg lehet becsülni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. A lebomlás vagy egyéb veszteségek elkerülése érdekében a talaj- és féreg ­
mintákat lehet őleg közvetlenül az edényb ől való eltávolítást követ ően 
(vagyis 1–2 napon belül) kell analizálni, és ajánlott közelít ő felvételi és 
ürülési sebesség értékeket számítani, ahogy a vizsgálat halad el őre. Ha az 
analízist késleltetni kell, akkor a mintákat megfelel ő módszert alkalmazva, 
például mélyh űtve (≤ -18 °C) kell tárolni.  
49. Ellen őrizni kell, hogy a kémiai analízis pontossága és reprodukálhatósága, 
valamint a vizsgált vegyi anyag talaj- és féregmintákból való visszanyerése 
megfelel az adott módszernek; dokumentálni kell az extrakciós hatékonysá ­
got, a kimutathatósági határértéket (LOD) és a mennyiségi meghatározás határértékét (LOQ). Hasonlóképpen ellen őrizni kell, hogy a vizsgált vegyi 
anyag nem mutatható ki a háttérnél nagyobb koncentrációban a kontroll 
edényekben. Ha a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a vizsgálathoz hasz ­
nált organizmusokban (C
 a ) a kontroll férgek esetében nagyobb, mint 0, ezt a 
kinetikai paraméterek számításánál figyelembe kell venni (lásd a 2. függe ­
léket). A vizsgálat során a mintákat mindvégig úgy kell kezelni, hogy a 
szennyeződés és a veszteség (például a vizsgált vegyi anyag mintavev ő 
eszközön való adszorbeálódása következtében) a lehet ő legkisebb mérték ű 
legyen.  
50. Radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyagok használata esetén lehet őség van a 
kiindulási anyag és a metabolitok analízisére. A vizsgált kiindulási vegyi anyag és a metabolitok mennyiségi meghatározása az állandósult állapotban 
vagy a felvételi fázis végén fontos információkat szolgáltat. A mintákat ezt 
követően „meg kell tisztítani”, hogy a vizsgált kiindulási vegyi anyag 
mennyisége külön is meghatározható legyen. Ajánlott azonosítani azokat a metabolitokat, amelyek önmagukban meghaladják az analizált minta (min ­
ták) összes radioaktivitásának 10 %-át.
 
51. Dokumentálni és a jegyz őkönyvben is szerepeltetni kell az összes vissza ­
nyerést, a vizsgált vegyi anyag visszanyerését a férgekben, a talajban és – ha 
a vizsgálatban szerepelnek – az elpárolgott vizsgált anyag elnyelésére szol ­
gáló abszorbenst tartalmazó csapdákban.  
52. Az adott vizsgálati edényb ől vett mintában szerepl ő egyedek összevonása a 
földigilisztánál kisebb televényférgek használata esetén elfogadható. Az ismétlések számának csökkenésével járó összevonás azonban korlátozza az adatok feldolgozására alkalmazható statisztikai eljárásokat. Ha egy adott 
statisztikai eljárást kell alkalmazni, vagy a próba erejének el kell érnie 
egy bizonyos szintet, akkor a vizsgálat során olyan számú ismétlést kell alkalmazni, amely a kívánt összevonás mellett az ezeknek a követelmé ­
nyeknek való megfelelést is biztosítja.
 
53. A BAF értékét ajánlott egyaránt kifejezni az összes száraz súly függ ­
vényében és – ha szükséges (azaz er ősen hidrofób vegyi anyagok esetén) 
– a lipidtartalom függvényében. A lipidtartalom meghatározására megfelel ő 
módszereket kell alkalmazni (egyes létez ő módszerek – például (31) (58) – e 
célra történ ő adaptálásával). Ezek a módszerek a kloroform/metanol extrak ­
ciós technikára épülnek. A klórozott oldószerek használata azonban kerü ­
lendő, a Bligh- és Dyer-féle módszer (9) szakirodalomban (17) leírt módo ­
sítását kell alkalmazni. Mivel el őfordulhat, hogy a különböz ő módszerek 
eltérő értékeket eredményeznek, az alkalmazott módszert részletesen ismer ­
tetni kell. Amennyiben lehetséges, vagyis ha elegend ő féregszövet áll 
rendelkezésre, akkor a lipidanalízist a vizsgált anyag analíziséhez használttal 
azonos mintán vagy extraktumon kell elvégezni, mivel a lipideket gyakran 
el kell távolítani az extraktumból ahhoz, hogy kromatográfiás módszerrel analizálható legyen (49). A másik lehet őség, hogy kontroll állatokat hasz ­
nálunk a lipidtartalom mérésére, amelyre majd a BAF értékeket vonatkoz ­
tathatjuk. Ha ezt az utóbbi megközelítést használjuk, akkor a felszerelés 
kevésbé szennyez ődik a vizsgált vegyi anyaggal.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
ADATOK ÉS JEGYZ ŐKÖNYVVEZETÉS  
Az eredmények kezelése  
54. A vizsgált anyag felvételi görbéje az id ő függvényében, aritmetikus skálán 
ábrázolja a vizsgált anyag férgekben/férgeken mért koncentrációjának alaku ­
lását a felvételi fázisban. Amennyiben a görbe kiegyenesedett, vagyis elérte az állandósult állapotot (a meghatározásokat lásd az 1. függelékben), az 
állandósult állapothoz tartozó BAF
 ss biológiai felhalmozódási tényez őt a 
következőképpen kell kiszámítani:  
C a az állandúsult állapotban vagy a felvételi fázis végén  ðközépértékÞ 
C s az állandósult állapotban vagy a felvételi fázis végén  ðközépértékÞ 
C a a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a vizsgálathoz használt organiz ­
musban  
C s a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a talajban  
55. Ha nem állt be az állandósult állapot, akkor a BAF  ss helyett a kinetikai 
biológiai felhalmozódási tényez őt (BAF  K ) kell kiszámítani a sebességi 
állandók alapján, az alábbiak szerint:  
— A BAF  K -t a k  s és a k  e hányadosaként kell meghatározni.  
— A felvételi és az ürülési sebességet lehet őleg párhuzamosan kell kiszá ­
mítani (lásd a 11. egyenletet a 2. függelékben).  
— Az ürülési sebességi állandó (k  e ) meghatározása általában az ürülési 
görbe alapján történik (amely a vizsgált tétel férgekben mért koncentrá ­
ciójának az alakulását ábrázolja az ürülési fázisban). Ezt követ ően a 
felvételi sebességi állandó kiszámítható a k  e adott értékéb ől, valamint 
a C  a felvételi görbéb ől levezetett értékéb ől – ezeknek a módszereknek a 
leírását lásd a 2. függelékben. A BAF  K és a sebességi állandók meghatá ­
rozásához lehet őleg számítógéppel végzett nemlineáris paraméterbecslést 
kell használni. Ha az ürülés folyamata nyilvánvalóan nem az els őrendű 
kinetikát követi, akkor összetettebb modelleket kell alkalmazni.  
Vizsgálati jegyz őkönyv  
56. A vizsgálati jegyz őkönyvnek a következ őket kell tartalmaznia:  
Vizsgált vegyi anyag:  
— A vizsgált vegyi anyag talajban él ő kevéssertéj űekre gyakorolt akut vagy 
hosszú távú toxikus hatására vonatkozóan rendelkezésre álló információk (például EC
 x , LC  x , NOEC)  
— kémiai tisztaság, fizikai jelleg, valamint fizikai és kémiai tulajdonságok, 
például log K  ow , vízben való oldhatóság,  
— kémiai azonosító adatok; a vizsgált tétel származása, a használt oldószer 
meghatározása és koncentrációja,  
— radioaktívan jelölt vizsgált vegyi anyag használata esetén a jelölt atomok 
pontos elhelyezkedése, a fajlagos radioaktivitás és a radiokémiai tiszta ­
ság. 
A vizsgálathoz felhasznált faj:  
— tudományos név, törzs, származás, esetleges el őkezelés, akklimatizáció, 
életkor, mérettartomány, stb.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Vizsgálati körülmények:  
— az alkalmazott vizsgálati eljárás,  
— az alkalmazott megvilágítás típusa és jellemz ői, valamint a fényperió ­
dus(ok),  
— a vizsgálat kialakítása (például vizsgálati edények száma és mérete, 
talajtömeg és a talajréteg magassága, ismétlések száma, egy ismétlésre jutó férgek száma, vizsgálati koncentrációk száma, a felvételi és az 
ürítési fázisok id őtartama, mintavételi gyakoriság),
 
— a vizsgálati edény anyagának indoklása,  
— a vizsgálati tétel el őkészítése és alkalmazása, valamint az adott módszer 
választásának okai,  
— a névleges vizsgálati koncentrációk, a vizsgálati edényekben mért 
értékek középértékei és szórásuk, valamint az ezen értékek el őállításának 
módszere,  
— a mesterséges talaj összetev őinek a forrása vagy – természetes közeg 
használata esetén – a talaj származása, esetleges el őkezelés leírása, kont ­
roll eredmények (túlélés, biomassza képz ődés, szaporodás), a talaj 
jellemzői (pH, összes szerves széntartalom, részecskeméret-eloszlás 
(homok, iszap és agyag százalékaránya), WHC  max , százalékos víztar ­
talom a vizsgálat elején és végén, valamint az elvégzett egyéb mérések),  
— a talaj- és féregminták kezelésének részletes bemutatása, beleértve az 
előkészítés részleteit, a tárolást, a szennyezési eljárásokat, az extrakciót 
és az analitikai eljárásokat (és pontosságukat) a férgekre és a talajra 
vonatkozóan, valamint a lipidtartalmat (ha a mérése szerepelt a vizs ­
gálatban) és a vizsgált tétel visszanyerését.  
Eredmények:  
— a férgek mortalitása a kontroll és az egyes vizsgálati edényekben, 
bármely megfigyelt rendellenes viselkedés (például talajkerülés, tele ­
vényférgekkel végzett biológiai felhalmozódási vizsgálat esetén a szapo ­
rodás hiánya),  
— a talaj és a vizsgálathoz használt organizmusok száraz és nedves töme ­
gének az aránya (hasznos a viszonyításhoz),  
— a férgek nedves tömege az egyes mintavételi id őpontokban; földigiliszt ­
áknál a vizsgálat kezdetén és az egyes mintavételi id őpontokban a béltar ­
talom ürítése el őtt és után mért nedves tömeg,  
— a vizsgálathoz használt organizmusok lipidtartalma (ha meghatározásra 
került),  
— a vizsgált vegyi anyag férgek általi felvételének és férgekb ől való kiürü ­
lésének kinetikáját ábrázoló görbék, valamint az állandósult állapot eléréséhez szükséges id ő,
 
— a mintavételi id őpontokhoz tartozó C  a és C  s (szórással és tartománnyal 
együtt, esett ől függően) (a C  a a férgek nedves és száraz tömegének 
kg-jára jutó g-ban, a C  s a talaj nedves és száraz tömegéhez kg-jára 
jutó g-ban kifejezve). Ha a bióta-talaj felhalmozódási tényez őt (BSAF) 
is meg kell határozni (például a különböz ő lipidtartalmú állatokkal 
végzett kett ő vagy több vizsgálat eredményeinek az összehasonlítása 
céljára), a C  a az organizmus lipidtartalmának kg-jára jutó g-ban, a C  s 
pedig a talaj szerves szén (OC) tartalmának kg-jára jutó g-ban is kife ­
jezhető, 
— ezeken kívül a jegyz őkönyvben szerepelhet még a BAF (amely azt fejezi 
ki, hogy a talaj hány grammja jut a férgek kilogrammjára), a talajból 
való felvétel sebességi állandója (amely azt fejezi ki, hogy egy napra vetítve a talaj hány grammja jut a férgek kilogrammjára), valamint a k
 e 
ürülési sebességi állandó (amely az egy napra jutó ürülés mértékét fejezi 
ki); a BSAF (amely azt fejezi ki, hogy a talaj szerves széntartalmának 
hány kilogrammja jut a férgek lipidtartalmának egy kilogrammjára),  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— ha a vizsgálatban a mérése szerepelt, a következ ők talajban és a vizs ­
gálathoz használt állatokban kimutatott százaléka: a kiindulási vegyi 
anyag, a metabolitok és a megkötött maradványok (azaz a vizsgált vegyi anyag közönséges extrakciós módszerekkel nem kinyerhet ő száza­
léka),
 
— az adatok statisztikai elemzéséhez használt módszerek.  
Az eredmények értékelése:  
— az eredmények megfelelése a 17. bekezdésben felsorolt érvényességi 
kritériumoknak,  
— nem várt vagy szokatlan eredmények, például a vizsgált vegyi anyag 
nem teljes mérték ű kiürülése a vizsgálathoz használt állatokból.  
SZAKIRODALOM  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ- 
HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
 
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American 
Society for Testing and Materials, E 1688-00a.  
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Internati ­
onal, E1676-04: 26 pp.  
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. 
Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments. 
Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & 
Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154–165.  
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms 
(Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.  
(8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
(9) Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.  
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P 
(2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environ ­
mental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
 
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchy­
traeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.  
(13) Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.  
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2–29.  
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, pp. 555–576.  
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shell ­
fish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and 
Testing Programme.  
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 29: 140–145.  
(19) Az Európai Parlament és a Tanács 2006. December 18-I 1907/2006/EK 
rendelete a vegyi anyagok regisztrálásáról, értékelésér ől, engedélyezésér ől 
és korlátozásáról (REACH), az Európai Vegyianyag-ügynökség létrehozá ­
sáról, az 1999/45/EK irányelv módosításáról, valamint a 793/93/EGK tanácsi rendelet, az 1488/94/EK bizottsági rendelet, a 76/769/EGK tanácsi irányelv, a 91/155/EGK, a 93/67/RGK, a 93/105/EK és a 2000/21/EK 
bizottsági irányelv hatályon kívül helyezésér ől, HL L 396., 2006.12.30., 
1. o.
 
(20) Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
(21) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisi ­
erten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). 
Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt 
Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Available for download at: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
(23) Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
(25) EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.  
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, 
Ökotox. 15: 78–84.  
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for biocon ­
centration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
 
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods 
for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 
1099–1105.  
(32) Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
 
(33) Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
 
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisent ­
raeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.  
(35) ISO 11268-2 (1998) Talajmin őség. Szennyez ő anyagok hatása a földigi ­
lisztára ( Eisenia fetida ). 2. rész: A reprodukciós hatások meghatározása.  
(36) Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080–2090.  
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, 
DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability 
of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
 
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.  
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
(48) E melléklet C.8. fejezete: Toxicitás földigilisztákra.  
(49) E melléklet C.13. fejezete: Biokoncentráció vizsgálata: átfolyásos hal vizs ­
gálat.  
(50) E melléklet C.21. fejezete: Talajlakó mikroorganizmusok: nitrogén-átalakí ­
tási vizsgálat.  
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia 
Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris.  
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
(54) Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.  
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
 
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, 
In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
 
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on 
Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.  
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
 
(64) Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413–433.
 
(65) Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). 
Carolinea 57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
(68) Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scrog ­
gins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac 
Press, Pensacola, 67–81.
 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167–1171.
 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation – Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, 
Duluth, MN, March 2000.  
(73) Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
(75) Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023–1033.  
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
(77) Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodp ­
lain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
(79) Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
1. függelék  
FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK  
Biológiai felhalmozódás:  a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése 
egy szervezetben/szervezeten a vizsgált vegyi anyagnak a környez ő közegben 
lévő koncentrációjához viszonyítva. A biológiai felhalmozódás biokoncentrációs 
és biomagnifikációs folyamatok eredménye (lásd lentebb).  
Biokoncentráció:  a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése egy szer ­
vezetben/szervezeten – a vegyi anyagnak kizárólag a környez ő közegből való 
(vagyis a testfelületen keresztüli és talajemésztéssel történ ő) felvétele eredménye ­
ként – a vizsgált vegyi anyagnak a környez ő közegben lév ő koncentrációjához 
viszonyítva.  
Biomagnifikáció:  a vizsgált vegyi anyag koncentrációjának növekedése egy szer ­
vezetben/szervezeten – kizárólag szennyezett táplálékból vagy zsákmányállatból való felvétel eredményeként – a vizsgált vegyi anyagnak a szennyezett táplá ­
lékban vagy zsákmányállatban lév ő koncentrációjához viszonyítva. A biomagni ­
fikáció a vizsgált tétel táplálékhálón belüli átadásához vagy felhalmozódásához 
vezethet.
 
Ürülés:  a vizsgált vegyi anyag kiürülése a vizsgálathoz használt organizmus 
szövetéből aktív vagy passzív folyamatok eredményeként, amelyek a vizsgált 
vegyi anyag környez ő közegben való jelenlétét ől vagy hiányától függetlenül 
mennek végbe.  
Biológiai felhalmozódási tényez ő (BAF): a vizsgált vegyi anyag biológiai felhal ­
mozódási vizsgálat felvételi fázisának bármely id őpontjában a vizsgálathoz hasz ­
nált organizmusban/organizmuson mért koncentrációjának (C  a , a férgek száraz 
tömegének kg-jára jutó grammban kifejezve) és a vegyi anyag környez ő 
közegben lév ő koncentrációjának a hányadosa (C  s , a talaj száraz tömegének 
kg-jára jutó grammban kifejezve); a BAF azt fejezi ki, hogy a talaj hány kilo ­
grammja jut a férgek egy kilogrammjára.  
Állandósult állapothoz tartozó biológiai felhalmozódási tényez ő (BAF  ss ): az 
állandósult állapothoz tartozó BAF, amely nem változik jelent ősen egy hosszabb 
időtartamon keresztül, amely alatt a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a 
környező közegben (C  s , a talaj száraz tömegének kg-jára jutó grammban kife ­
jezve) állandó.  
A közvetlenül a talajból való felvétel sebességi állandója és az ürülési sebességi 
állandó (k  s és k  e , lásd lentebb) hányadosából számított  biológiai felhalmozódási 
tényezőt kinetikai biológiai felhalmozódási tényez őnek (BAF  K ) nevezzük.  
Bióta-talaj felhalmozódási tényez ő (BSAF): a vizsgált vegyi anyag vizsgálathoz 
használt organizmusban/organizmuson mért, lipidtartalomra vonatkoztatott 
koncentrációjának és a vizsgált vegyi anyag talajban mért, szerves széntartalomra vonatkoztatott koncentrációjának a hányadosa az állandósult állapotban. A C
 a -t 
az organizmus lipidtartalmának kilogrammjára jutó grammban, a C  s -t a talaj 
szerves széntartalmának kilogrammjára jutó grammban fejezzük ki; a BSAF azt 
fejezi ki, hogy a talaj szerves széntartalmának hány kilogrammja jut a férgek lipidtartalmának egy kilogrammjára.
 
Állandósult állapot  vagy  plató : az expozíciós fázisban párhuzamosan végbe ­
menő felvételi és ürülési folyamatok közötti egyensúly. Az állandósult állapot 
akkor következik be, amikor a BAF alakulását az id ő függvényében ábrázoló 
görbe párhuzamossá válik az id őtengellyel, és a legalább kétnapos id őközönként 
vett három egymást követ ő mintán végzett BAF analízis eredménye 20 %-nál 
kisebb eltérést mutat, és a három mintavételi id őszak nem mutat statisztikailag 
számottev ő eltéréseket. Ha a vizsgált vegyi anyag felvétele lassú, helyénvalóbb 
lehet a hétnapos id őközök alkalmazása (49).  
Szerves szén – víz megoszlási hányados  (K  oc ): a vegyi anyag talaj szerves szén 
frakciójában/frakcióján és vízben mért koncentrációjának a hányadosa az egyen ­
súlyi állapotban.  
Oktanol – víz megoszlási hányados  (K  ow ): a vegyi anyag n-oktanolban és 
vízben való oldhatóságának a hányadosa az egyensúlyi állapotban, esetenként 
P ow -val is jelölik. A vegyi anyag vízi szervezetekben való felhalmozódási képes ­
ségének kifejezésére a K  ow logaritmusát (log K  ow ) használjuk.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Felvételi vagy expozíciós fázis:  azt az id őtartamot jelöli, amelyen keresztül a 
vizsgálathoz használt organizmusok ki vannak téve a vizsgált vegyi anyag hatá ­
sának.  
Talajból való felvétel sebességi állandója  (k s ): a vizsgált tétel vizsgálathoz 
használt organizmusban/organizmuson mért koncentrációjának a vizsgált tétel talajfázisból való felvétele eredményeként bekövetkez ő növekedésének az ütemét 
meghatározó számérték. A k
 s azt fejezi ki, hogy egy napra vetítve a talaj hány 
grammja jut a férgek kilogrammjára.  
Ürülési fázis : azt az id őtartamot jelöli, amelyen keresztül a vizsgált vegyi anyag 
vizsgálathoz használt organizmusokból való kiürülését (vagy a vizsgálathoz hasz ­
nált organizmusokban való nettó csökkenését) vizsgáljuk a vizsgálathoz használt 
organizmusok szennyezett közegb ől a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe 
való áthelyezését követ ően. 
Ürülési sebességi állandó  (k e ): a vizsgált tétel vizsgálathoz használt organizmus ­
ban/organizmuson mért koncentrációjának a vizsgálathoz használt organizmusok 
vizsgált anyagot tartalmazó közegb ől a vizsgált anyagot nem tartalmazó közegbe 
való áthelyezését követ ő csökkenésének az ütemét meghatározó számérték; a k  e 
az egy napra jutó ürülés mértékét fejezi ki.  
Vizsgált vegyi anyag:  Bármely, ennek a vizsgálati módszernek az alkalmazá ­
sával vizsgált anyag vagy keverék.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
2. függelék  
A felvételi és az ürülési paraméterek kiszámítása  
A biológiai felhalmozódási vizsgálatok f ő végpontja a biológiai felhalmozódási 
tényező (BAF). A BAF értéke az állandósult állapotban a vizsgálathoz használt 
organizmusban mért koncentráció (C  a ) és a talajban mért koncentráció (C  s ) 
hányadosaként számítható ki. Ha a felvételi fázisban nem következik be az 
állandósult állapot, az állandósult állapothoz tartozó biológiai felhalmozódási 
tényező (BAF  ss ) helyett a kinetikai biológiai felhalmozódási tényez őt (BAF  K ) 
kell kiszámítani a sebességi állandókból. Jelezni kell azonban, hogy a BAF az állandósult állapothoz tartozó koncentrációkon alapul-e vagy sem.
 
A BAF  K , a talajból való felvétel sebességi állandója (k  s ) és az ürülési sebességi 
állandó (k  e ) meghatározása általában számítógéppel végzett nemlineáris paramé ­
terbecsléssel történik, például a szakirodalomban (68) leírt modellek alapján. Ezek a számítógépes programok az egymást követ ő időpontokban gy űjtött 
koncentráció adatokból és a következ ő modellegyenletekb ől számítják ki a 
BAF
 K , a k  s és a k  e értékeit: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [1. egyenlet]  
vagy 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [2. egyenlet]  
ahol:  
C a = a vegyi anyag koncentrációja a férgekben [nedves vagy száraz tömeg 
kg-jára jutó g]  
k s = szövetben való felvételi sebességi állandó [a talaj egy napra vetítve a férgek 
kg-jára jutó grammja]  
C s = a vegyi anyag koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg kg-jára 
jutó g]  
k e = ürülési sebességi állandó [1/nap]  
t c = a felvételi fázis végének id őpontja  
Ha a vizsgált vegyi anyag hatásának ki nem tett férgekben a háttér-koncentráció 
– például a 0. napon – jelent ős mértékben eltér a nullától (ez például fémek 
esetén fordulhat el ő), akkor a háttér-koncentrációt (C  a,0 ) bele kell foglalni az 
egyenletekbe, amelyek így a következ ők: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [3. egyenlet]  
és 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [4. egyenlet]  
Ha a felvételi fázisban a vizsgált vegyi anyag koncentrációja a talajban jelent ős 
csökkenést mutat, akkor a következ ő modellek alkalmazhatók (például (67) (79)): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [5. egyenlet]  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
ahol:  
C s = a vegyi anyag koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg kg-jára 
jutó g]  
k 0 = talajban való lebomlás sebességi állandója [1/nap]  
C 0 = a vegyi anyag kezdeti koncentrációja a talajban [nedves vagy száraz tömeg 
kg-jára jutó g] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [6. egyenlet] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [7. egyenlet]  
ahol:  
C a = a vegyi anyag koncentrációja a férgekben [nedves vagy száraz tömeg 
kg-jára jutó g]  
k s = szövetben való felvételi sebességi állandó [a talaj egy napra vetítve a férgek 
kg-jára jutó grammja]  
k 0 = talajban való lebomlás sebességi állandója [1/nap]  
k e = ürülési sebességi állandó [1/nap]  
t c = a felvételi fázis végének id őpontja.  
Amennyiben a felvételi fázis alatt beáll az állandósult állapot (vagyis t = ∞), az 
1. egyenlet 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [1. egyenlet]  
leegyszer űsíthető a következ őképpen:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
vagy 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [8. egyenlet]  
Ezt követ ően a vizsgált tétel állandósult állapothoz tartozó koncentrációja a féreg ­
szövetben (C  a,ss ) kiszámítható a k  s /k e x C  s képlettel.  
A bióta-talaj felhalmozódási tényez ő (BSAF) a következ őképpen számítható ki: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [9. egyenlet]  
ahol f  oc a szerves szén frakció a talajban, f  lip pedig a lipid frakció a féregben, 
amelyeket lehet őleg a vizsgálat során gy űjtött mintákon kell meghatározni a 
száraz, illetve a nedves tömeg alapján.  
Az ürülés kinetikája az ürülési fázisból származó adatokból, az alábbi modell ­
egyenlet és számítógépes nemlineáris paraméterbecslés alkalmazásával modellez ­
hető. Ha az id ő függvényében ábrázolt adatpontok a vizsgált tétel állatokban mért 
koncentrációjának folyamatos exponenciális csökkenését jelzik, akkor az ürülés időbeli alakulása egyrekeszes modellel (9. egyenlet) jellemezhet ő. 
C
 a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [10. egyenlet]  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Az ürülési folyamatok esetenként kétfázisúak, azaz a korai fázisban a C  a gyors 
csökkenése figyelhet ő meg, amelyet az ürülés kés őbbi fázisaiban a vizsgált 
tételek koncentrációjának lassúbb csökkenése vált fel, például (27) (68). A két fázis azzal a feltevéssel értelmezhet ő, hogy a szervezet két különböz ő részből áll, 
amelyekb ől eltérő sebességgel ürül ki a vizsgált tétel. Ebben az esetben tanul ­
mányozni kell a vonatkozó szakirodalmat, például (38) (39) (40) (78).
 
A fenti modellegyenletekkel egyszerre is kiszámíthatók a kinetikai paraméterek 
(k s és k  e ), ha az els őrendű kinetikai modellt a felvételi és az ürülési fázisból 
származó valamennyi adatra egyidej űleg alkalmazzuk. A felvételi és az ürülési 
sebességi állandók együttes kiszámítását lehet ővé tévő módszer leírása a szak ­
irodalomban (41), (73) és (70) megtalálható. 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[11. egyenlet]  
Megjegyzés:  A felvételi és ürülési paraméterek egyesített felvételi és ürülési 
adatokból történ ő egyidejű becslése esetén a 11. egyenletben az 
»m« deszkriptor teszi lehet ővé a számítógépes program számára 
az egyenletben szerepl ő résztényez ők hozzárendelését az adott 
fázishoz tartozó adathalmazokhoz és az értékelés helyes elvégzését 
(a felvételi fázis esetén m = 1; az ürülési fázis esetén m = 2).  
Mindazonáltal ezeket a modellegyenleteket kell ő körültekintéssel kell használni, 
különösen akkor, ha a vizsgált vegyi anyag biológiai hozzáférhet ősége vagy 
(biológiai) lebomlása a vizsgálat folyamán változik (lásd például (79)).  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
3. függelék  
PÉLDÁK A TALAJBÓL FELVETT VIZSGÁLT VEGYI ANYAG BIOLÓ ­
GIAI FELHALMOZÓDÁSA VIZSGÁLATÁNAK ÜTEMTERVÉRE  
Földigilisztával végzett vizsgálat  
a) Felvételi fázis 8 különböz ő napon történ ő mintavétellel a kinetikai számí ­
tások céljára  
Nap Tennivaló  
– 6 Az elkészített talaj kondicionálása 48 órán keresztül, 
– 4 A talajfrakció szennyezése a vizsgált vegyi anyag oldatával; az 
esetlegesen használt oldószer elpárologtatása; a talajösszetev ők 
összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati edényekben; ekvi ­
libráció 4 napon keresztül a vizsgálati körülmények között (fémmel szennyezett talaj esetén 3 napon keresztül), 
– 3 – – 1 A vizsgálathoz felhasználandó organizmusok kiemelése az 
akklimatizációs tenyészetb ől; a talajösszetev ők előkészítése és 
nedvesítése, 
0 a h őmérséklet és a talaj pH-jának mérése; talajminták gy űjtése a 
kezelt edényekb ől és az oldószer kontrollokból a vizsgált vegyi 
anyag koncentrációjának a meghatározásához; táplálékadag 
adása; a férgek tömegének lemérése és a férgek véletlenszer ű 
elosztása a vizsgálati edények között; elegend ő féreg-alminta 
elkülönítése az analitikai háttérértékek, a nedves és száraz tömeg, valamint a lipidtartalom meghatározásához; a vizsgálati edények 
tömegének lemérése a talaj nedvességtartalmának az ellen őrzése 
végett; zárt vizsgálati elrendezés használata esetén a leveg őellátás 
ellenőrzése, 
1 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gy űjtése a vizs ­
gált tétel koncentrációjának a meghatározásához, 
2 Ugyanaz, mint az 1. napon, 3 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása, 
4 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
5 – 6 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
7 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati 
edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartal ­
mának ellen őrzésére, és az elpárolgott víz pótlása, 
8 – 9 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
10 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
11 – 13 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
14 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati 
edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartal ­
mának ellen őrzésére, és az elpárolgott víz pótlása, 
15 – 16 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
17 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
18 – 20 Ugyanaz, mint a 3. napon,
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Nap Tennivaló  
21 Ugyanaz, mint az 1. napon; a h őmérséklet és a talaj pH-jának 
mérése; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellen őrzésére; a felvételi fázis vége; a 
férgek áthelyezése a fennmaradó expozíciós edényekb ől tiszta 
talajt tartalmazó edényekbe az ürítési fázishoz (béltartalom-ürítés 
nélkül); talaj- és féregminták gy űjtése az oldószer kontrollokból. 
Az expozíció el őtti tennivalókat (ekvilibrációs fázis) a vizsgált 
vegyi anyag tulajdonságainak a figyelembevételével kell 
ütemezni. 
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (leg ­
alább munkanapokon).
 
b) Ürülési fázis  
Nap Tennivaló  
– 6 A talajösszetev ők előállítása és nedvesítése; az elkészített talaj 
kondicionálása 48 órán keresztül, 
– 4 A talajösszetev ők összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati 
edényekben; inkubálás 4 napon keresztül a vizsgálati körülmé ­
nyek között, 
0 (a felvételi fázis 
vége) A hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a férgek tömegének 
lemérése és a férgek véletlenszer ű elosztása a vizsgálati edények 
között; táplálékadag adása; a férgek áthelyezése a fennmaradó 
expozíciós edényekb ől tiszta talajt tartalmazó edényekbe; talaj- 
és féregminták gy űjtése 4 – 6 óra elteltével a vizsgált vegyi 
anyag koncentrációjának a meghatározásához, 
1 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gy űjtése a vizs ­
gált vegyi anyag koncentrációjának a meghatározásához, 
2 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
3 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása, 
4 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
5–6 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
7 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati 
edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartal ­
mának ellen őrzésére, és az elpárolgott víz pótlása, 
8–9 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
10 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
11–13 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
14 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag adása; a vizsgálati 
edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartal ­
mának ellen őrzésére, és az elpárolgott víz pótlása, 
15–16 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
17 Ugyanaz, mint az 1. napon,  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Nap Tennivaló  
18–20 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
21 Ugyanaz, mint az 1. napon; a h őmérséklet és a talaj pH-jának 
mérése; a vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellen őrzésére; talaj- és féregminták gy űj­
tése az oldószer kontrollokból. 
Az ürülési fázis kezdete el őtt ugyanúgy kell el őkészíteni a talajt, 
mint a felvételi fázis el őtt. 
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (leg ­
alább munkanapokon).
 
Televényféreggel végzett vizsgálat  
a) Felvételi fázis 8 különböz ő napon történ ő mintavétellel a kinetikai számí ­
tások céljára  
Nap Tennivaló  
– 6 Az elkészített talaj kondicionálása 48 órán keresztül, 
– 4 A talajfrakció szennyezése a vizsgált vegyi anyag oldatával; az 
esetlegesen használt oldószer elpárologtatása; a talajösszetev ők 
összekeverése; a talaj szétosztása a vizsgálati edényekben; ekvi ­
libráció 4 napon keresztül a vizsgálati körülmények között 
(fémmel szennyezett talaj esetén 3 napon keresztül), 
– 3 – – 1 A vizsgálathoz felhasználandó organizmusok kiemelése az 
akklimatizációs tenyészetb ől; a talajösszetev ők előkészítése és 
nedvesítése, 
0 a h őmérséklet és a talaj pH-jának mérése; talajminták gy űjtése a 
kezelt edényekb ől és az oldószer kontrollokból a vizsgált vegyi 
anyag koncentrációjának a meghatározásáho; táplálékadag hozzá ­
adása a talajhoz; a férgek tömegének lemérése és a férgek vélet ­
lenszerű elosztása a vizsgálati edények között; elegend ő féreg- 
alminta elkülönítése az analitikai háttérértékek, a nedves és száraz tömeg, valamint a lipidtartalom meghatározásához; a vizsgálati edények tömegének lemérése a talaj nedvességtartalmának az 
ellenőrzése végett; zárt vizsgálati elrendezés használata esetén a 
levegőellátás ellen őrzése, 
1 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása; talaj- és féregminták gy űjtése a vizs ­
gált tétel koncentrációjának a meghatározásához, 
2 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
3 A leveg őellátás ellen őrzése, a férgek viselkedésének és a h őmér­
sékletnek a dokumentálása, 
4 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
5–6 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
7 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag hozzáadása a talajhoz; a 
vizsgálati edények tömegének ismételt lemérése a talaj nedves ­
ségtartalmának ellen őrzésére, és az elpárolgott víz pótlása, 
9 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
10 Ugyanaz, mint a 3. napon,
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Nap Tennivaló  
11 Ugyanaz, mint az 1. napon, 
12–13 Ugyanaz, mint a 3. napon, 
14 Ugyanaz, mint az 1. napon; táplálékadag hozzáadása a talajhoz; a 
hőmérséklet és a talaj pH-jának mérése; a vizsgálati edények 
tömegének ismételt lemérése a talaj nedvességtartalmának ellen ­ 
őrzésére; a felvételi fázis vége; a férgek áthelyezése a fennmaradó 
expozíciós edényekb ől tiszta talajt tartalmazó edényekbe az 
ürítési fázishoz (béltartalom-ürítés nélkül); talaj- és féregminták gyűjtése az oldószer kontrollokból. 
Az expozíció el őtti tennivalókat (ekvilibrációs fázis) a vizsgált 
vegyi anyag tulajdonságainak a figyelembevételével kell ütemezni. 
A 3. napnál leírt tennivalókat minden nap el kell végezni (leg ­
alább munkanapokon).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
4. függelék  
Mesterséges talaj – Az el őállításra és a tárolásra vonatkozó ajánlások  
Mivel az adott forrásból származó természetes talaj nem biztos, hogy az egész év 
folyamán rendelkezésre áll, és a talajban él ő organizmusok, valamint a mikro- 
szennyező anyagok jelenléte befolyásolhatják a vizsgálatot, ajánlott az e melléklet 
C.8. fejezetében (Toxicitás földigilisztákra) (48) leírtaknak megfelel ően készített 
mesterséges szubsztrátumot használni ebben a vizsgálatban. Ez a talaj számos faj 
számára lehet ővé teszi a túlélést, a növekedést és a szaporodást, teljes mértékben 
szabványosított, és rendelkezésre állnak a vizsgálati és tenyésztési körülmények laboratóriumon belüli és laboratóriumok közötti összehasonlításának az adatai.
 
Talajösszetev ők 
Tőzeg: 10 % Az OECD 207. iránymutatása (48) szerinti 
tőzegmoha, 
Kvarchomok: 70 % Ipari kvarchomok (leveg őn szárított); szem ­
cseméret: a részecskék több mint 50 száza ­
léka a 50–200 μm tartományban, de minden 
részecske mérete ≤ 2 mm, 
Kaolinit agyag: 20 % Kaolinit tartalom ≥ 30 %, 
Kalcium-karbonát: ≤ 1 % Porított, vegytiszta CaCO  3 . 
A mesterséges talaj szerves széntartalma igény szerint csökkenthet ő, például a 
tőzegtartalom száraz talaj 4–5 %-ára való csökkentésével és a homoktartalom 
ennek megfelel ő növelésével. A szerves széntartalom csökkentése esetén kisebb 
a lehetősége a vizsgált vegyi anyag talajon (szerves szénen) való adszorbeálódá ­
sának, miközben a vizsgált vegyi anyag hozzáférhet ősége a férgek számára javul 
(74). Kimutatták, hogy az alacsonyabb – például 2,7 % (33), (61), szerves szén ­
tartalmú természetes talajokban vizsgált  Enchytraeus albidus  és az  Eisenia fetida  
esetében a szaporodással kapcsolatos érvényességi kritériumok teljesülnek, és a tapasztalatok szerint ez az 5 %-os t őzegtartalommal rendelkez ő mesterséges 
talajjal is elérhet ő.
 
Előállítás  
A talaj száraz összetev őit alaposan összekeverjük (például nagyüzemi méret ű 
laboratóriumi kever őgéppel). Ezt körülbelül egy héttel a vizsgálat megkezdése 
előtt kell megtenni. Az összekevert száraz talajösszetev őket a vizsgált tétellel 
való szennyezés el őtt ionmentesített vízzel legalább 48 órán keresztül nedvesítjük 
a savasság kiegyensúlyozása/stabilizálása céljából. A pH meghatározásához a 
talaj és 1 M KCl oldat 1:5 arányú keverékét használjuk. Ha a pH a szükséges 
tartományon (6,0 ± 0,5) kívül van, akkor megfelel ő mennyiség ű CaCO  3 -t kell a 
talajhoz adni, vagy új adag talajt kell készíteni.  
A mesterséges talaj maximális víztartó képességét (WHC) az ISO 11268-2 szab ­
vány (35) szerint kell meghatározni. A vizsgálat megkezdése el őtt legalább két 
nappal a száraz mesterséges talajt annyi ionmentesített víz vagy m űvíz hozzáa ­
dásával nedvesítjük, hogy a végs ő víztartalom körülbelül felét kapjuk. A végs ő 
víztartalom a maximális WHC 40–60 %-a. A vizsgálat kezdetén az el őnedvesített 
talajt annyi adagra osztjuk, ahány vizsgálati koncentrációt és kontrollt használunk a vizsgálathoz, és a vizsgált tétel oldata és/vagy ionmentesített víz vagy m űvíz 
hozzáadásával a nedvességtartalmat beállítjuk a WHC
 max 40–60 %-ának 
megfelelő szintre. A nedvességtartalmat a vizsgálat kezdetén és végén meg kell 
határozni (105 °C-on). Az optimális nedvességtartalmat a faj igényei határozzák meg (a nedvességtartalom a következ őképpen is ellen őrizhető: ha a talajt a 
kezünkkel finoman összenyomjuk, kis vízcseppeknek kell megjelenniük az 
ujjaink között).
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Tárolás  
A mesterséges talaj száraz összetev ői a felhasználás id őpontjáig szobah őmérsék­
leten tárolhatók. Az elkészített, el őnedvesített talajt a szennyezés el őtt legfeljebb 
három napig lehet h űvös helyen tárolni; gondoskodni kell arról, hogy minél 
kevesebb víz párologhasson el bel őle. A vizsgált tétellel szennyezett talajt 
azonnal fel kell használni, kivéve, ha olyan információk állnak rendelkezésre, 
amelyek szerint az adott talaj tárolása nem befolyásolja a vizsgált tétel toxikus 
hatását és biológiai hozzáférhet őségét. Ebben az esetben a szennyezett talajmin ­
tákat az adott vizsgált tétel esetében ajánlott körülmények között lehet tárolni az analízis elvégzéséig.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
5. függelék  
A talajból felvett vizsgált vegyi anyag biológiai felhalmozódásának 
vizsgálatához ajánlott szárazföldi kevéssertéj ű féregfajok  
Földigiliszták  
A vizsgálathoz ajánlott faj a földigilisztafélék (Lumbricidae) családjába tartozó  
Eisenia fetida  (Savigny 1826). 1972 óta két alfajt különböztetünk meg ( Eisenia 
fetida  és Eisenia andrei  (10)). Jaenike (36) szerint ezek valódi, külön fajok. Az  
Eisenia fetida  könnyen felismerhet ő a gyűrűin keresztülfutó élénksárga csíkozá ­
sáról, míg az  Eisenia andrei  egységes sötétvörös szín ű. A valószín űleg a Fekete- 
tenger vidékér ől származó földigiliszták ma már világszerte elterjedtek, külö ­
nösen az olyan, antropogén tevékenység hatására létrejött él őhelyeken, mint a 
komposzthalmok. Mindkét földigilisztaféle egyaránt használható ökotoxikológiai 
és biológiai felhalmozódási vizsgálatokhoz.  
Az Eisenia fetida  és az  Eisenia andrei  kereskedelmi forgalomban beszerezhet ő, 
például horgászcsaliként. Más földigilisztafélékkel összehasonlítva életciklusuk rövid, körülbelül 2–3 hónap alatt érik el az ivarérett kort (szobah őmérsékleten). 
A 20–24 °C körüli h őmérséklet az optimális a számukra. A viszonylag nedves, 
közel semleges pH-jú, magas szervesanyag-tartalommal rendelkez ő tenyésztala ­
jokat kedvelik. Mivel ezeket a fajokat immár 25 éve széles körben használják a szabványosított ökotoxikológiai vizsgálatokban, tenyésztésük jól meghatározott 
(48) (77).
 
Mindkét faj állati eredet ű trágyák széles körében tenyészthet ő. Az ISO szab ­
ványban (35) ajánlott tenyészt őközeg ló- vagy szarvasmarhatrágya és t őzeg 
fele-fele arányú keveréke. A közegnek 6–7 körüli pH-értékkel (kalcium-karbo ­
náttal szabályozható) és alacsony ionos vezet őképességgel (6 mS/cm-nél alacso ­
nyabb vezet őképességgel vagy 0,5 %-nál alacsonyabb sókoncentrációval) kell 
rendelkeznie, valamint ammóniával vagy állati vizelettel b őségesen szennye ­
zettnek kell lenni. Használható továbbá kereskedelmi forgalomban beszerezhet ő, 
adalékanyagoktól mentes kertészeti célú talaj vagy az OECD iránymutatása (48) 
szerinti mesterséges talaj, illetve ezek fele-fele arányú keveréke. A szubszt ­
rátumnak nedvesnek kell lennie, de ne legyen túl vizes. A tenyésztéshez 10–50 liter térfogatú tartályok a megfelel ők.
 
Ahhoz, hogy szabványos életkorú és tömeg ű giliszták álljanak a rendelkezé ­
sünkre, a legcélszer űbb gubókból kezdeni a tenyésztést. Tehát a friss szubszt ­
rátumot tartalmazó tenyészt őedényekbe kifejlett férgeket kell helyezni, amelyek 
lerakják a gubókat. A gyakorlati tapasztalatok szerint körülbelül 100 kifejlett féreg/1 kg szubsztrátum (nedves tömeg) populációs űrűséggel jó szaporodási 
ütem érhet ő el. A kifejlett férgeket 28 nap elteltével el kell távolítani. A gubókból 
kikelő földigilisztákat ivarérett korban, azaz legalább 2, de nem több mint 12 
hónap elteltével lehet a vizsgálat céljára felhasználni.
 
A fent bemutatott fajok egyedei akkor tekinthet ők egészségeseknek, ha a szubszt ­
rátumban mozognak, nem próbálják elhagyni azt, és folyamatosan szaporodnak. 
A nagyon lassú mozgás vagy a farokrész sárga színe (az  Eisenia fetida  esetében) 
a szubsztrátum kimerülésére utal. Ebben az esetben friss szubsztrátum használata vagy a tartályban lév ő állatok számának a csökkentése ajánlott.
 
Kiegészít ő válogatott irodalomjegyzék  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1–58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1–81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49–55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180–201.  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1–171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
 
Televényférgek  
A vizsgálathoz ajánlott faj az  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (közönséges 
televényféreg). A gy űrűsférgek (Annelida) törzsébe tartozó televényférgek 
(Enchytraeidae) családján belül az  Enchytraeus albidus  az egyik legnagyobb 
méretű faj (akár a 15 mm-t is elérheti), és világszerte elterjedt (például (8)). 
Az Enchytraeus albidus  tengeri, édesvízi és szárazföldi él őhelyeken egyaránt 
megtalálható, f őként rothadó szerves anyagban (hínár, komposzt), ritkábban 
réteken fordul el ő (42). Ez a széles ökológiai tolerancia, valamint egyes morfo ­
lógiai változatok arra utalnak, hogy a fajon belül különböz ő fajták lehetnek.  
Az Enchytraeus albidus  kereskedelmi forgalomban beszerezhet ő, haleledelként 
árulják. Ellen őrizni kell, hogy a tenyészetben ne legyenek más, általában kisebb 
fajok (60). A tenyészet ilyen szennyez ődése esetén az összes férget vízzel át kell 
mosni egy petri-csészében. Ezt követ ően ki kell válogatni a kifejlett  Enchytraeus 
albidus  példányokat (sztereomikroszkóp segítségével), és új tenyészetet kell léte ­
síteni. Az összes többi férget meg kell semmisíteni. A televényférgek életciklusa rövid, 33 nap (18 °C-on), illetve 74 nap (12 °C-on) alatt érik el az ivarérett kort. 
A vizsgálathoz csak olyan tenyészetet szabad felhasználni, amelyen legalább 5 
héten keresztül (egy generáció) semmilyen probléma nem volt megfigyelhet ő a 
laboratóriumban.
 
A célra az  Enchytraeus  nemzetségbe tartozó más fajok is alkalmasak, különösen 
az Enchytraeus luxuriosus.  Ez a nemrégiben leírt (65) faj valódi talajlakó. Más 
televényféreg fajok használata esetén a használt fajt egyértelm űen azonosítani, a 
választást pedig indokolni kell a jegyz őkönyvben.  
Az Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) ugyanabba a fajcsoportba 
tartozik, mint az  Enchytraeus luxuriosus . A természetes környezetben való léte ­
zése még nem bizonyított, eddig csak földigiliszta-tenyészetekben és 
komposztban való el őfordulásáról számoltak be (Römbke 2003). Eredeti ökoló ­
giai igényei tehát nem ismertek. A közelmúltban különféle természetes talajokon végzett laboratóriumi kutatások azonban meger ősítették, hogy ez a faj széles kör ű 
toleranciát mutat az olyan talajtulajdonságokkal szemben, mint a pH és a textúra 
(Jänsch et al. 2005). Az elmúlt években gyakran használták ezt a fajt ökotoxi ­
kológiai vizsgálatokban, mivel könnyen tenyészthet ő és vizsgálható (például 
Kuperman et al. 2003). Kis mérete (3 – 12 mm; átlagosan 7 mm (Westheide 
& Müller 1996)) miatt azonban nehezebben kezelhet ő, mint az  Enchytraeus 
albidus . Ha az  Enchytraeus albidus  helyett ezt a fajt használjuk, akkor lehet – 
de nem szükséges – kisebb vizsgálati edényt alkalmazni. Ezenkívül azt is figye ­
lembe kell venni, hogy ez a faj nagyon gyorsan szaporodik, generációs ideje 20 
± 2 °C h őmérsékleten nem éri el a 20 napot (Achazi et al. 1999), magasabb 
hőmérsékleten pedig még ennél is rövidebb.
 
Az Enchytraeus albidus  (és más televényféreg fajok) egyedei mesterséges talaj és 
kereskedelmi forgalomban beszerezhet ő, szennyezésmentes, adalékanyagokat 
nem tartalmazó, kertészeti célú talaj keverékét tartalmazó, nagyméret ű műanyag 
tartályokban tenyészthet ők (például 30 × 60 × 10 cm vagy 20 × 12 × 8 cm, 
amely a kisméret ű férgek tenyésztésére alkalmas). A komposzt kerülend ő, mivel 
toxikus vegyi anyagokat, például nehézfémeket tartalmazhat. A tenyésztéshez használt talajból használat el őtt háromszor megismételt mélyh űtéssel el kell távo ­
lítani a benne él ő állatokat. Mesterséges talaj önmagában is használható, de 
lassúbb szaporodási ütemet eredményezhet, mint a kevert tenyésztalaj. A szubszt ­
rátumnak 6,0 ± 0,5 pH-értékkel kell rendelkeznie. A tenyészetet 15 ± 2 °C hőmérsékleten, fényt ől elzártan, inkubátorban kell tartani. A 23 °C fölötti h őmér­
sékletet feltétlenül kerülni kell. A mesterséges/természetes talajnak nedvesnek 
kell lennie, de ne legyen túl vizes. Ha a talajt a kezünkkel finoman összenyom ­
juk, kis vízcseppeknek kell megjelenniük. Az oxigénhiányos körülményeket feltétlenül kerülni kell (például fedél használata esetén elég nagy nyílásoknak 
kell lenniük rajta ahhoz, hogy a megfelel ő levegőcsere biztosított legyen). A 
tenyésztalajt leveg őztetés céljából hetente egyszer óvatosan át kell keverni.
 ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
A férgeket igény szerint, de hetente legalább egyszer kell etetni zabpehellyel, 
amelyet a talaj felszínén kialakított mélyedésbe kell helyezni, majd földdel 
befedni. Ha a legutóbbi etetési id őpontban adott táplálék megmarad, a táplálék 
adagolását megfelel ően módosítani kell. Ha a megmaradó táplálékon penész ­
gomba jelenik meg, akkor egy új adag zabpehelyre kell cserélni. A szaporodás 
serkentése érdekében a zabpehely kéthetente kiegészíthet ő kereskedelmi forga ­
lomban beszerezhet ő, vitaminnal dúsított fehérjeporral. Három hónap elteltével az 
állatokat át kell helyezni egy frissen készített tenyészetbe vagy szubsztrátumba. A zabpelyhet légmentesen zárt edényekben kell tárolni és használat el őtt autok­
lávban kezelni, vagy felmelegíteni a lisztatka (például  Glyzyphagus sp. , Astig­
mata, Acarina) vagy ragadozó atka (például  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , 
Gamasida, Acarina) fert őzés elkerülése végett. A fert őtlenítést követ ően a táplá ­
lékot meg kell őrölni, hogy könnyen a talajfelületre szórható legyen. További 
lehetséges táplálékforrások a süt őélesztő vagy a TetraMin
 ® haleledel.  
Általánosságban a tenyésztési körülmények akkor megfelel ők, ha a férgek nem 
próbálják meg elhagyni a szubsztrátumot, gyorsan mozognak a talajban, kültaka ­
rójuk fényes, nem tapadnak rá talajszemcsék, többé-kevésbé fehéres árnyalatú, és ha különböz ő életkorú férgek láthatók. Alapvet ően a férgek akkor tekinthet ők 
egészségesnek, ha folyamatosan szaporodnak.
 
Kiegészít ő válogatott irodalomjegyzék  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
 
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.”  ▼M4 2008R0440 — HU — 24.08.2014 — 005.001 — 1467