02009R0152 — HU — 24.05.2017 — 006.002

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű és nem vált ki joghatást. Az EU intézményei semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért. A jogi aktusoknak – ideértve azok bevezető hivatkozásait és preambulumbekezdéseit is – az Európai Unió Hivatalos Lapjában közzétett és az EUR-Lex portálon megtalálható változatai tekintendők hitelesnek. Az említett hivatalos szövegváltozatok közvetlenül elérhetők az ebben a dokumentumban elhelyezett linkeken keresztül

►B A BIZOTTSÁG 152/2009/EK RENDELETE (2009. január 27.) a takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszerek megállapításáról (EGT-vonatkozású szöveg) (HL L 054, 2009.2.26., 1. o)

Módosította:





Helyesbítette:









▼B

A BIZOTTSÁG 152/2009/EK RENDELETE

(2009. január 27.)

a takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszerek megállapításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)







▼M3

1. cikk

A takarmányok hatósági ellenőrzésére, különös tekintettel az alkotóelemek, többek között a géntechnológiával módosított szervezeteket (GMO-kat) tartalmazó, azokból álló, illetve azokból előállított anyagok, az 1831/2003/EK rendelet ( 1 ) szerinti takarmány-adalékanyagok és a 2002/32/EK európai parlamenti és tanácsi irányelv ( 2 ) szerinti nemkívánatos anyagok meghatározására szolgáló mintavételezést az I. mellékletben meghatározott módszereknek megfelelően kell elvégezni.

Az I. mellékletben foglalt mintavételi módszer alkalmazandó a takarmányoknál előforduló peszticid-szermaradványok 2005. február 23-i 396/2005/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet ( 3 ) szerinti meghatározására irányuló ellenőrzés, valamint a 619/2011/EU rendeletnek való megfelelés ellenőrzése során.

▼B

2. cikk

Az analitikai vizsgálat céljára szolgáló minták előkészítését és az eredmények megadását a II. mellékletben előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

3. cikk

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló analitikai vizsgálatokat a III. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmány-alapanyagok és ►C1 takarmánykeverékek ◄ összetételének ellenőrzésére), a IV. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő engedélyezett adalékanyagok szintjének ellenőrzésére), az V. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő nemkívánatos anyagok ellenőrzésére) és a VI. mellékletben (A takarmányok hatósági ellenőrzése során az állati eredetű alkotóelemek meghatározására szolgáló analitikai módszerek) előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

4. cikk

►C1 A baromfitakarmány-keverék ◄ energiaértékét a VII. mellékletnek megfelelően kell kiszámítani.

5. cikk

Megerősítés céljából a VIII. mellékletben a már nem engedélyezett adalékanyagok takarmányokban való illegális jelenlétének ellenőrzésére előírt analitikai módszereket kell használni.

6. cikk

A 71/250/EGK, a 71/393/EGK, a 72/199/EGK, a 73/46/EGK, a 76/371/EGK, a 76/372/EGK, a 78/633/EGK, a 81/715/EGK, a 84/425/EGK, a 86/174/EGK, a 93/70/EGK, a 93/117/EK, a 98/64/EK, az 1999/27/EK, az 1999/76/EK, a 2000/45/EK, a 2002/70/EK és a 2003/126/EK irányelv hatályát veszti.

A hatályon kívül helyezett irányelvekre történő hivatkozásokat az e rendeletre történő hivatkozásoknak kell tekinteni, és a IX. mellékletben található megfelelési táblázatokkal összhangban kell értelmezni.

7. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ezt a rendeletet 2009. augusztus 26-tól kell alkalmazni.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.

▼M3









I. MELLÉKLET

MINTAVÉTELI MÓDSZEREK

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló mintavételezést az alábbiakban leírt módszerek szerint kell elvégezni. Az így nyert mintákat a mintavételi tételek reprezentatív részének kell tekinteni.

A reprezentatív mintavétel célja kisebb mennyiséget venni a tételből oly módon, hogy e mennyiség bármely jellemző tulajdonságának meghatározásával az adott tulajdonságot illetően a teljes tételre érvényes középértéket kapjunk. A mintavételezés során a tétel különböző részeiből ismételten elemi mintákat kell venni. Ezen elemi mintákat össze kell keverni annak érdekében, hogy az így nyert átlagolt mintából reprezentatív osztással reprezentatív végső mintákat lehessen kialakítani.

Ha a mintavételre kerülő takarmányadagok szemrevételezés alapján minőségi eltérést mutatnak a takarmány ugyanazon tételének többi részéhez képest, a szóban forgó adagokat el kell különíteni és altételként kell kezelni őket. Amennyiben a takarmányt nem lehet különálló altételekre osztani, azt egyetlen tételként kell mintavételezni. Ebben az esetben erről a tényről említést kell tenni a mintavételi jegyzőkönyvben.

Ha az e rendelet előírásai alapján mintavételezett takarmányról megállapítják, hogy nem felel meg az uniós követelményeknek, továbbá az egy azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel részét képezi, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

2. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

— Tétel : azonosított mennyiségű takarmány, amely közös jellemzőkkel rendelkezik, úgymint eredet, fajta, a csomagolás típusa, csomagoló, feladó, címkézés, valamint – előállítási folyamat esetében – az egyetlen üzemben egységes előállítási paraméterek mellett előállított termelési egység vagy – amennyiben azokat egymás után folyamatosan állítják elő és együtt tárolják – több ilyen egység.

— Mintavételi tétel : egy tétel, illetve a tétel vagy altétel egy azonosított része.

— Lepecsételt minta : pecséttel oly módon ellátott minta, hogy a pecsét felsértése vagy eltávolítása nélkül ne lehessen hozzáférni a mintához.

— Elemi minta : a mintavételi tétel egy pontjából vett mennyiség.

— Átlagolt minta : ugyanazon mintavételi tételből vett elemi minták egyesítésével nyert minta.

— Redukált minta : az átlagolt minta olyan része, amelyet az utóbbiból reprezentatív redukálási folyamattal nyernek.

— Végső minta : a redukált minta vagy a homogenizált átlagolt minta egy része.

— Laboratóriumi minta : a laboratórium részére szánt minta (a laboratóriumba érkező minta), amely lehet végső, redukált vagy átlagolt minta.

3. ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

— A mintavételt végző személyzet: a mintavételezést az illetékes hatóságok által erre a feladatra felhatalmazott személyek végzik.

— A mintát pecséttel kell ellátni úgy, hogy a pecsét felsértése vagy eltávolítása nélkül ne lehessen hozzáférni a mintához. A pecsétjelnek egyértelműen azonosíthatónak és jól láthatónak kell lennie. Egy másik lehetőség szerint a mintát zárható edénybe kell helyezni oly módon, hogy azt a tárolóedény vagy tartály visszafordíthatatlan roncsolása nélkül ne lehessen felnyitni, elkerülve így a tárolóedény vagy tartály esetleges újrafelhasználását.

— A minta azonosítása: a mintát letörölhetetlenül meg kell jelölni és azonosítani kell oly módon, hogy egyértelmű kapcsolata a mintavételi jegyzőkönyvvel megállapítható legyen.

— Valamennyi átlagolt mintából legalább kettő végső mintát kell venni: egyet az ellenőrzéshez (hatósági ellenőrzés), egyet pedig a takarmányipari vállalkozó részére (védelem). Adott esetben referencia céljából is lehet végső mintát venni. Amennyiben a teljes átlagolt minta homogenizált, a végső mintákat a homogenizált átlagolt mintából kell venni, ha ez az eljárás nem ütközik az adott tagállam takarmányipari vállalkozói jogokra vonatkozó jogszabályaiba.

4. BERENDEZÉS

4.1. A mintavételi eszközöket olyan anyagokból kell készíteni, amelyek nem szennyezhetik a mintavételre kerülő termékeket. A többszöri használatra szánt eszközöknek könnyen tisztíthatónak kell lenniük a keresztszennyeződések elkerülése érdekében.

4.2. Szilárd takarmányok mintavételére ajánlott eszközök 4.2.1. Kézi mintavétel 4.2.1.1. Lapos fenekű, függőleges oldalú lapát. 4.2.1.2. Nyílással vagy rekeszekkel rendelkező mintavételi szúrcsap. A mintavételi szúrcsap méretének összhangban kell lennie a mintavételi tétel jellemzőivel (a tartály mélysége, a göngyöleg nagysága stb.), valamint a takarmány részecskeméretével. Amennyiben a mintavételi szúrcsapon több nyílás található, e nyílásokat rekeszekkel kell elválasztani, vagy a szúrcsapnak lépcsősen elhelyezett, szekvenciális nyílásokkal kell rendelkeznie annak biztosítására, hogy a mintavételezés a szúrcsap egymás mellett elhelyezkedő különböző pontjain történjen. 4.2.2. Gépi mintavétel Mozgásban lévő takarmányok mintavételére megfelelő gépi eszközök használhatók. Az eszköz megfelelőnek tekinthető, ha alkalmas legalább az anyagáram teljes keresztmetszetének mintavételezésére. A (magas áramlási sebességgel) mozgásban lévő takarmányok esetében automata mintavevőket lehet használni. 4.2.3. Mintaosztó Ha lehetséges és indokolt, a minta megközelítően egyenlő részekre való felosztására tervezett eszközt kell használni a redukált minták reprezentatív elkészítéséhez.

5. AZ ELEMI MINTÁK SZÁMÁRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK

— Az elemi minták számára vonatkozóan az 5.1. és 5.2. pontban leírt mennyiségi követelmények alkalmazandók az 500 tonnát meg nem haladó tömegű és a reprezentatív módon mintavételezhető tételek esetében. A bemutatott mintavételi eljárás érvényes a mintavételi tétel előírt maximális méreténél nagyobb mennyiségekre is, feltéve, hogy figyelmen kívül hagyják az elemi minták alábbi táblázatokban feltüntetett maximális számát, hogy az elemi minták számának meghatározása az eljárás megfelelő részénél megadott négyzetgyökös képlettel történik (lásd: az 5.3. pont), valamint hogy az átlagolt minta minimális méretét arányosan növelték. Ez nem zárja ki egy nagy tétel kisebb altételekre történő felosztását, amelyet követően minden egyes altételt az 5.1. és 5.2. pontban leírt eljárással összhangban kell mintavételezni.

— A mintavételi tételnek akkorának kell lennie, hogy minden egyes alkotórészéből mintát lehessen venni.

— Igen nagy tömegű (> 500 tonna) tételek és altételek, valamint azon tételek esetében, amelyek szállítása vagy tárolása nem teszi lehetővé az e fejet 5.1. és 5.2. pontja szerinti mintavételi eljárást, az 5.3. pontban bemutatott eljárást kell alkalmazni.

— Ha a takarmányipari vállalkozót kötelező monitoringrendszer keretében jogszabályok kötelezik az e rendeletben foglaltaknak való megfelelésre, a vállalkozó a működési jellemzők figyelembevétele érdekében – az illetékes hatóság engedélyét követően – eltérhet az e fejezetben megállapított mennyiségi követelményektől, feltéve, hogy az illetékes hatóság számára kielégítő módon bizonyította a mintavételi eljárás egyenértékűségét a reprezentativitás tekintetében.

— Különleges esetekben, amikor (a csomagolási forma, szállítás és tárolás módja stb. miatt) a mennyiségi követelmények szerinti mintavételi módszer nem alkalmazható a tételen bekövetkező elfogadhatatlan gazdasági kár miatt” alternatív mintavételi módszert lehet alkalmazni, feltéve, hogy az a lehetőségekhez képest reprezentatív, továbbá azt teljes körűen leírják és dokumentálják.

5.1. A takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzése kapcsán az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

5.1.1. Ömlesztett szilárd takarmány







A mintavételi tétel tömege Az elemi minták minimális száma ≤ 2,5 tonna 7 > 2,5 tonna a mintavételi tételt (*1) kitevő tonnák számának √20-szorosa, legfeljebb 40 elemi minta (*1) Amennyiben az eredmény törtszám, fel kell kerekíteni a legközelebbi egész számra.

5.1.2. Ömlesztett folyékony takarmány







A mintavételi tétel tömege Az elemi minták minimális száma ≤ 2,5 tonna vagy ≤ 2 500 liter 4 (*1) > 2,5 tonna vagy > 2 500 liter 7 (*1) (*1) Amennyiben nem lehet homogén folyadékot elérni, növelni kell az elemi minták számát.

5.1.3. Kiszerelt takarmány

A (szilárd és folyékony) takarmányt zsákokba, göngyölegekbe, dobozokba, hordókba stb. lehet csomagolni, amelyek a táblázatban egységek néven szerepelnek. A nagy egységek (≥ 500 kg vagy liter) esetében a mintavételezésnek az ömlesztett takarmányokra érvényes előírásokkal összhangban kell történnie (lásd: az 5.1.1. és az 5.1.2. pont).







A mintavételi tétel tömege Azon egységek minimális száma, amelyekből (legalább) egy elemi mintát kell venni (*1) 1–20 egység 1 egység (*2) 21–150 egység 3 egység (*2) 151–400 egység 5 egység (*2) > 400 egység a mintavételi tételt (*3) kitevő egységek √számának egy negyede, legfeljebb 40 egység (*1) Ha egy egység felbontása befolyásolhatja a vizsgálatot (pl. romlandó nedves takarmányoknál), az elemi mintának a felbontatlan egységnek kell lennie. (*2) Az 1 kg-ot vagy 1 litert meg nem haladó egységek esetében az elemi mintának egy eredeti egység tartalmának kell lennie. (*3) Amennyiben az eredmény törtszám, fel kell kerekíteni a legközelebbi egész számra.

5.1.4. Takarmánytömbök és nyalósók

A 25 egységből álló mintavételi tételenként legalább egy, legfeljebb 4 tömböt vagy nyalósót kell mintaként venni.

Az egyenként 1 kg-ot meg nem haladó tömegű tömbök és nyalósók esetében az elemi mintának egy tömbnek vagy egy nyalósónak kell lennie.

5.1.5. Szálastakarmány/zöldtakarmány







A mintavételi tétel tömege Az elemi minták minimális száma (*1) ≤ 5 tonna 5 > 5 tonna a mintavételi tételt (*2) kitevő tonnák számának √5-szorosa, legfeljebb 40 elemi minta (*1) Elismert tény, hogy bizonyos helyzetekben (pl. silótakarmányok esetében) a tétel elfogadhatatlan mértékű sérülése nélkül nem lehet teljesíteni az elemi minták számára vonatkozó előírást. Ekkor alternatív módszerhez lehet folyamodni, és még e rendelet alkalmazásának megkezdése előtt útmutató készül az ilyen típusú tételek mintavételezéséhez. (*2) Amennyiben az eredmény törtszám, fel kell kerekíteni a legközelebbi egész számra.

5.2. A takarmányban egyenetlenül eloszló anyagok és termékek ellenőrzése kapcsán az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

Az elemi minták számára vonatkozóan itt ismertetett követelményeket az alábbi esetekben kell alkalmazni:

— takarmány-alapanyagokban előforduló aflatoxinok, anyarozs, más mikotoxinok és káros botanikai szennyeződések ellenőrzése,

— alkotóelemek, többek között a géntechnológiával módosított anyagok okozta keresztszennyeződés, illetve a takarmány-alapanyagokban feltételezhetően egyenetlenül eloszló anyagok ellenőrzése.

Amennyiben az ellenőrzést végző hatóságnak erős a gyanúja, hogy ez az egyenetlen eloszlás valamely alkotóelem, illetve az összetett takarmányban található valamely anyag okozta keresztszennyeződés nyomán is fellép, az alábbi táblázatban feltüntetett mennyiségi követelményeket lehet alkalmazni.







A mintavételi tétel tömege Az elemi minták minimális száma < 80 tonna Lásd: az 5.1. pont szerinti mennyiségi követelmények. Az elemi minták szükséges számát meg kell szorozni 2,5-tel. ≥ 80 tonna 100

5.3. Az igen nagyméretű tételek esetében az elemi mintákra vonatkozó mennyiségi követelmények

A nagyméretű mintavételi tételek (> 500 tonna) esetében az elemi minták szükséges száma = 40 elemi minta + √tonna a takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzése esetén, vagy 100 elemi minta + √tonna a takarmányban feltételezhetően egyenetlenül eloszló anyagok és termékek ellenőrzése esetén.

6. AZ ÁTLAGOLT MINTÁRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK







Mintavételi tételenként egy átlagolt minta szükséges. A takarmány jellege Az átlagolt minta minimális tömege (*1) (*2) 6.1. Ömlesztett takarmány 4 kg 6.2. Kiszerelt takarmányok 4 kg (*3) 6.3. Folyékony vagy félfolyékony takarmányok 4 liter 6.4. Takarmánytömbök vagy nyalósók 6.4.1. 1 kg-nál nagyobb egyedi tömeg 4 kg 6.4.2. legfeljebb 1 kg-os egyedi tömeg négy eredeti tömb vagy nyalósó tömege 6.5. Szálastakarmány/zöldtakarmány 4 kg (*4) (*1) A nagy értékű megmintázott takarmány esetében az előírtnál kisebb mennyiségű átlagolt mintát lehet venni azzal a feltétellel, hogy mindezt a mintavételi jegyzőkönyvben ismertetik és dokumentálják. (*2) A takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszereknek a géntechnológiával módosított anyagok – amelyek esetében az engedélyezési eljárás függőben van vagy amelyek esetében az engedély lejárt – jelenléte tekintetében történő megállapításáról szóló, 2011. június 24-i 619/2011/EU bizottsági rendelet (HL L 166., 2011.6.25., 9. o.) előírásainak megfelelően a géntechnológiával módosított anyagok jelenlétének ellenőrzésére szolgáló átlagolt mintának legalább 35 000 magot/szemet kell tartalmaznia. Ez azt jelenti, hogy a kukorica esetében az átlagolt minta tömege legalább 10,5 kg, a szójabab esetében pedig 7 kg. Más magvak és szemek, mint például az árpa, a köles, a zab, a rizs, a rozs, a búza és a repcemag tekintetében az átlagolt minta 4 kg-os tömege több mint 35 000 magnak felel meg. (*3) Kiszerelt takarmányok esetében is előfordulhat, hogy a kiszerelési egységek méretének függvényében az átlagolt minta tömege nem éri el a 4 kg-ot. (*4) A kis fajlagos tömegű szálastakarmányok és zöldtakarmányok (pl. széna, szalma) tekintetében az átlagolt minta minimális tömegének 1 kg-nak kell lennie.

7. A VÉGSŐ MINTÁKRA VONATKOZÓ MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK

Végső minták

Legalább egy végső minta elemzése szükséges. Az analizálásra szolgáló végső minta nem lehet kisebb a következőknél:







Szilárd takarmányok 500 g (*1) (*2) (*3) Folyékony vagy félfolyékony takarmányok 500 ml (*1) (*1) A 619/2011/EU rendelet előírásainak megfelelően a géntechnológiával módosított anyagok jelenlétének ellenőrzésére szolgáló végső mintának legalább 10 000 magot/szemet kell tartalmaznia. Ez azt jelenti, hogy a kukorica esetében a végső minta tömege legalább 3 000 g, a szójabab esetében pedig 2 000 g. Más magvak és szemek, mint például az árpa, a köles, a zab, a rizs, a rozs, a búza és a repcemag tekintetében a végső 500 g-os minta tömege több mint 10 000 magnak felel meg. (*2) Amennyiben az átlagolt minta tömege lényegesen kevesebb, mint 4 kg vagy liter (lásd: a 6. fejezet lábjegyzetei), az előírtnál kisebb mennyiségű végső mintát lehet venni azzal a feltétellel, hogy mindezt a mintavételi jegyzőkönyvben ismertetik és dokumentálják. (*3) Hüvelyesek, gabonafélék és fán termő héjas gyümölcsűek mintavételezésekor a peszticid-szermaradványok meghatározásához vett végső minta tömegének – a 2002/63/EK bizottsági irányelv (HL L 187., 2002.7.16., 30. o.) rendelkezéseivel összhangban – legalább 1 kg-nak kell lennie.

8. IGEN NAGYMÉRETŰ TÉTELEK, ILLETVE OLY MÓDON TÁROLT VAGY SZÁLLÍTOTT TÉTELEK MINTAVÉTELEZÉSE, AMELY NEM TESZI LEHETŐVÉ A MINTAVÉTELEZÉSÉT A TÉTEL EGÉSZÉBEN

8.1. Általános elvek

Amennyiben egy tétel szállítási vagy tárolási módja nem teszi lehetővé, hogy elemi mintákat vegyünk a tétel valamennyi részéből, a mintavételezésre lehetőleg akkor kell sort keríteni, amikor a tétel mozgásban van.

Takarmányok tárolására szolgáló nagyméretű raktárak esetében a raktárak üzemeltetőit ösztönözni kell olyan berendezések felszerelésére, amelyek segítségével (automatikusan) mintát lehet venni az ott tárolt teljes tételből.

Az e 8. fejezetben meghatározott mintavételi eljárások alkalmazása esetén a takarmányipari vállalkozó vagy annak képviselője tisztában van a mintavételi eljárással. Ha a takarmányipari vállalkozó vagy annak képviselője kétségbe vonja a mintavételi eljárást, lehetővé kell tennie az illetékes hatóság számára, hogy a vállalkozó saját költségén a tétel minden részéből mintát tudjon venni.

8.2. Hajóval szállított nagy tételek

8.2.1. A hajóval szállított nagy tételek dinamikus mintavételezése

A hajóval szállított nagy tételek mintavételezésére lehetőleg akkor kell sort keríteni, amikor az mozgásban van (dinamikus mintavételezés).

A mintavételezést rakterenként (fizikailag elkülöníthető egységenként) kell végezni. A rakterek kiürítése azonban egymás után, részlegesen történik, ezért a kezdeti fizikai elkülönítés a tárolólétesítménybe történő áthelyezést követően már nem áll fenn. A mintavételezést ennek megfelelően vagy a kezdeti fizikai elkülönítés, vagy a tárolólétesítménybe történő áthelyezést követő elkülönítés függvényében lehet elvégezni.

A hajó rakterének kiürítése néhány napot is igénybe vehet. A mintavételezést rendszerint a kiürítés teljes időtartama alatt, szabályos időközönként kell végezni. Hatósági ellenőr jelenléte azonban nem mindig lehetséges vagy célszerű a teljes kiürítési művelet alatt. A mintavételezést tehát a tétel egy részén (mintavételi tétel) is el lehet végezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik.

Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

Abban az esetben is, ha a hatósági mintát automata mintavevő segítségével veszik, indokolt az ellenőr jelenléte. Amennyiben azonban az automatikus mintavételezés előre beállított paraméterekkel történik, és a csalás bármely formáját megelőzendő a mintákat pecséttel ellátott tárolóedényekbe gyűjtik, az ellenőrnek kizárólag a mintavételezés megkezdésekor és befejezésekor, valamint akkor kell jelen lennie, amikor a tárolóedényeket cserélni kell.

8.2.2. A hajóval szállított nagy tételek statikus mintavételezése

Statikus mintavételezés esetén a felülről hozzáférhető tárolók (silók) tekintetében előírt eljárást kell alkalmazni (lásd: 8.4.1. pont).

A mintavételezést a tétel/raktér hozzáférhető részén (felülről) kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.3. A raktárakban tárolt nagy tételek mintavételezése

A mintavételezést a tétel hozzáférhető részén kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.4. A raktározási létesítmények (silók) mintavételezése

8.4.1. A felülről (könnyen) hozzáférhető silók mintavételezése

A mintavételezést a tétel hozzáférhető részén kell elvégezni. Az elemi minták számának meghatározása a mintavételi tétel méretének figyelembevételével történik. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.4.2. A felülről nem hozzáférhető (zárt) silók mintavételezése

8.4.2.1. Felülről nem hozzáférhető (zárt), 100 tonnát meghaladó kapacitású silók

Az ilyen típusú silókban tárolt takarmányból nem lehet statikusan mintát venni. Ezért amennyiben el kell végezni a silóban tárolt takarmány mintavételezését, továbbá nincs lehetőség a tétel mozgatására, meg kell állapodni a létesítmény üzemeltetőjével, hogy az értesíteni fogja az ellenőrt a siló kiürítésének időpontjáról annak érdekében, hogy mintát lehessen venni a mozgásban lévő takarmányból.

8.4.2.2. Felülről nem hozzáférhető (zárt), legfeljebb 100 tonna kapacitású silók

A mintavételi eljárás 50–100 kg közötti mennyiségben a takarmány tartályba történő engedéséből és e mennyiség megmintázásából áll. Az átlagolt minta mérete a teljes tételnek, az elemi minták száma pedig a silóból mintavételezési céllal a tartályba engedett takarmány mennyiségének felel meg. Ha azonos osztályú vagy megnevezésű takarmánytétel egy részének mintavételezése esetén azt állapítják meg, hogy a tétel szóban forgó része nem felel meg az uniós követelményeknek, abból kell kiindulni, hogy a tétel többi része sem biztonságos, kivéve, ha a részletes átvizsgálás során nem bizonyítható, hogy a tétel többi része nem felel meg az uniós követelményeknek.

8.5. Nagyméretű zárt tartályokban tárolt ömlesztett takarmány mintavételezése

Az ilyen típusú tételekből sokszor csak a tartályból történő eltávolítás során lehet mintát venni. Bizonyos esetekben erre nincs lehetőség a behozatal vagy az ellenőrzés helyén, ezért a mintavételezésre a tartály kiürítésekor kell sort keríteni.

9. A MINTAVÉTELRE, A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSÉRE ÉS CSOMAGOLÁSÁRA VONATKOZÓ UTASÍTÁSOK

9.1. Általános megjegyzések

A mintákat indokolatlan késedelem nélkül kell vételezni és előkészíteni, mindvégig ügyelve a szükséges óvintézkedések betartására, amelyek biztosítják azt, hogy a termék ne változzon meg, illetve ne szennyeződjön. A mintákkal közvetlenül érintkező eszközöknek, felületeknek és tartályoknak tisztáknak és szárazaknak kell lenniük.

9.2. Elemi minták

A teljes mintavételi tételből véletlenszerűen, körülbelül egyforma nagyságú elemi mintákat kell venni.

Az elemi minta minimális tömege 100 gramm, illetve 25 gramm a kis fajlagos tömegű szálastakarmányok és zöldtakarmányok esetében.

Amennyiben a 8. fejezetben meghatározott mintavételi eljárásra vonatkozó szabályok alapján kevesebb mint 40 elemi mintát kell venni, az elemi minták méretét az átlagolt minta előírt méretének függvényében kell meghatározni (lásd: 6. fejezet).

Kiszerelt takarmány kis tételeinek mintavételezésekor – amikor is a mennyiségi követelmények szerint korlátozott számú elemi mintát kell venni – az elemi minta egy olyan eredeti egység tartalma, amelynek tartalma nem haladja meg az 1 kg-ot vagy az 1 litert.

Kis egységű (pl.: < 250 g) kiszerelt takarmány mintavételezésekor az elemi minta mérete az egység méretéről függ.

9.2.1. Ömlesztett takarmány

Adott esetben, a mintavételi tétel mozgatása közben (berakodáskor, illetve kirakodáskor) is végre lehet hajtani a mintavételt.

9.2.2. Kiszerelt takarmány

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, minden egység tartalmának egy részét szúrcsap vagy lapát segítségével ki kell venni. Ha szükséges, az egységek egyenkénti kiürítése után is le lehet venni a mintákat.

9.2.3. Homogén vagy homogenizálható folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, az egységek tartalmát szükség esetén homogenizálni kell, és minden egyes egységből ki kell venni egy bizonyos mennyiséget.

Az elemi mintákat a tartályok kiürítésekor is lehet vételezni.

9.2.4. Nem homogenizálható, folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk az előírt számú egységet, a különböző rétegekből kell a mintákat levenni.

A tartályok tartalmának kiürítésekor is lehet mintákat venni, ám ebben az esetben az első frakciókat el kell önteni.

A minta összesített űrtartalmának mindkét esetben legalább 10 liternek kell lennie.

9.2.5. Takarmánytömbök és nyalósók

Miután a mintavétel elvégzésére az 5. fejezet szerint kiválasztottuk a kívánt számú blokkot vagy tömböt, minden blokk vagy tömb egy részét lehet venni. Nem homogén blokk vagy tömb gyanúja esetén a teljes blokkot vagy tömböt fel lehet mintaként használni.

Az egyenként 1 kg-ot meg nem haladó tömegű blokkok és tömbök esetében az elemi minta egy blokk vagy egy tömb.

9.3. Átlagolt minták elkészítése

Az átlagolt minta kialakítása érdekében az elemi mintákat össze kell keverni.

9.4. Végső minták elkészítése

Az átlagolt mintában lévő anyagot gondosan össze kell keverni ( 4 ).

— Valamennyi vizsgálati mintát egy, a célnak megfelelő külön tartályba/edénybe kell tenni. Minden szükséges óvintézkedést meg kell tenni a minta összetételének a szállítás vagy tárolás során előforduló esetleges megváltozásának, illetve a minta beszennyeződésének vagy meghamisításának elkerülése érdekében.

— A takarmányban egyenletesen eloszló alkotóelemek vagy anyagok ellenőrzésekor az átlagolt minta tömegét reprezentatív módon, lehetőleg mechanikus vagy automata osztóval minimum 2 kg-ra vagy 2 literre lehet csökkenteni (redukált minta) ( 5 ). Peszticid-szermaradványok hüvelyesekben, gabonafélékben és fán termő héjas gyümölcsűekben való jelenlétének ellenőrzésekor a redukált minta minimális tömegének 3 kg-nak kell lennie. Ha a takarmány jellege nem teszi lehetővé az osztó használatát, vagy az osztó nem elérhető, a mintát a negyedeléses módszer segítségével lehet csökkenteni. Ezt követően a redukált mintákból megközelítőleg egyenlő számú (ellenőrzési, védelmi és referencia célra szánt) végső mintát kell készíteni a 7. fejezetben bemutatott mennyiségi követelményeknek megfelelően. Alkotóelemek, többek között géntechnológiával módosított anyagok, illetve a takarmány-alapanyagokban feltételezhetően egyenetlenül eloszló anyagok ellenőrzésekor az átlagolt minta: — teljesen homogenizált kell, hogy legyen, majd végső mintákra kell azt felosztani, vagy — tömegét mechanikus vagy automata osztóval legalább 2 kg-ra, illetve 2 literre kell csökkenteni ( 6 ). A mintát szükség esetén negyedeléses módszerrel is lehet csökkenteni, de kizárólag abban az esetben, ha a takarmány jellege nem teszi lehetővé az osztó használatát. A géntechnológiával módosított anyagok jelenlétének 619/2011/EU rendelet szerinti ellenőrzésekor a redukált mintának legalább 35 000 magot/szemet kell tartalmaznia annak érdekében, hogy el lehessen érni a hatósági, valamint a védelmi és a referenciacélra szánt végső minták esetében érvényes, minimálisan 10 000 mag/szem számot (lásd: a 6. fejezet (**) jelölésű és a 7. fejezet (*) jelölésű lábjegyzete).

9.5. A minta csomagolása

A tartályokat, illetve csomagokat le kell pecsételni és címkével kell ellátni oly módon, hogy a pecsét felsértése nélkül ne lehessen kinyitni azokat. A pecsétnek magában kell foglalnia a teljes címkét.

9.6. A minták laboratóriumba történő küldése

A mintát – a vegyelemző számára szükséges információkkal együtt – indokolatlan késedelem nélkül el kell küldeni az arra a kijelölt vizsgálati laboratóriumba.

10. MINTAVÉTELI JEGYZŐKÖNYV

Minden egyes mintáról jegyzőkönyvet kell vezetni, amely lehetővé teszi az egyes mintavételi tételek és azok méretének egyértelmű azonosítását.

Jegyzőkönyvbe kell foglalni az e rendeletben meghatározott mintavételi eljárástól történő bármely eltérést.

A jegyzőkönyvet elérhetővé kell tenni a hatósági ellenőrző laboratórium, továbbá a takarmányipari vállalkozó és/vagy a takarmányipari vállalkozó által kijelölt laboratórium számára.









II. MELLÉKLET

A TAKARMÁNYVIZSGÁLATI MÓDSZEREKRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

A. MINTÁK ANALITIKAI VIZSGÁLATRA TÖRTÉNŐ ELŐKÉSZÍTÉSE

1. Cél

Az alábbiakban leírt eljárások az I. mellékletben megállapított rendelkezéseknek megfelelő mintavételezés után, az ellenőrző laboratóriumoknak megküldött minták analitikai vizsgálat céljából történő előkészítésére vonatkoznak.

A laboratóriumi mintákat oly módon kell előkészíteni, hogy a vizsgálati módszerekben előírt kimért mennyiségek homogének és a végső mintákra jellemzőek legyenek.

2. Óvintézkedések

A követendő mintaelőkészítési eljárás függ az alkalmazandó vizsgálati módszertől és az ellenőrizendő alkotóelemektől, illetve anyagoktól. Ezért elsőrendű fontosságú annak biztosítása, hogy a követett minta-előkészítési eljárás megfeleljen az alkalmazott vizsgálati módszernek, valamint az ellenőrizendő alkotóelemeknek, illetve anyagoknak.

Minden szükséges műveletet oly módon kell elvégezni, hogy minimális legyen a minta beszennyeződésének és összetétele megváltozásának lehetősége.

Az őrlést, keverést és rostálást haladéktalanul végre kell hajtani azért, hogy a minta a lehető legrövidebb ideig érintkezzen a levegővel és a fénnyel. Kerülni kell az olyan daráló- és őrlőgépek használatát, amelyek a mintát érzékelhetően felmelegítik.

A különösen hőérzékeny takarmányok esetében a kézi őrlés alkalmazása javasolt. Figyelmet kell fordítani annak biztosítására is, hogy az eszköz maga ne lehessen szennyeződés forrása.

Ha az előkészítést nem lehet a minta nedvességtartalmának jelentős megváltozása nélkül elvégezni, akkor a nedvességtartalmat az előkészítés előtt és után is meg kell határozni a III. melléklet A. részében meghatározott módszer szerint.

3. Az eljárás

3.1. Általános eljárás

A vizsgálati aliquotot a végső mintából kell venni. Az átlós negyedeléssel történő mintavétel nem ajánlott, mivel magas eloszlási hibát tartalmazó vizsgálati aliquotokat eredményezhet.

3.1.1. Előkészítés nélkül őrölhető takarmányok

— Keverjük össze az átrostált végső mintát, és vegyük fel egy megfelelően tiszta, száraz, légmentesen záródó tartályba. Közvetlenül a vizsgálatra szánt mennyiség (vizsgálati aliquot) kimérése előtt keverjük újra össze a teljes homogenitás elérése érdekében.

3.1.2. Szárítás után őrölhető takarmányok

— Amennyiben a vizsgálati módszerekben másképpen nem írják elő, a III. melléklet A. részében említett nedvességmeghatározási módszer 4.3. pontja szerint leírt előzetes szárítási eljárásnak megfelelően szárítsuk a végső mintát 8–12 %-os nedvességtartalmúra. Ezt követően a 3.1.1. szakaszban leírtak szerint járjunk el.

3.1.3. Folyékony vagy félfolyékony takarmányok

— Vegyük fel a végső mintát egy megfelelően tiszta, száraz, légmentesen záródó tartályba. Közvetlenül a vizsgálatra szánt mennyiség (vizsgálati aliquot) kimérése előtt alaposan keverjük össze a teljes homogenitás elérése érdekében.

3.1.4. Egyéb takarmányok

— Azok a végső minták, amelyek a fent említett eljárások egyikével sem készíthetők elő, bármely egyéb, olyan eljárással kezelhetők, amely biztosítja, hogy a vizsgálatra kimért mennyiségek (vizsgálati aliquotok) homogének és a végső mintákra jellemzőek legyenek.

3.2. A szemrevételezéses vagy mikroszkópos vizsgálat, illetve a teljes egészében homogenizált átlagolt minta esetében alkalmazandó külön eljárás

— A szemrevételezéses (mikroszkóp alkalmazása nélküli) ellenőrzés a teljes laboratóriumi minta felhasználásával történik.

— Mikroszkópos ellenőrzés esetén a laboratórium redukálhatja az átlagolt mintát, vagy tovább redukálhatja a már redukált mintát. A védelem és adott esetben a referencia céljait szolgáló végső mintákat a hatósági ellenőrzéshez használt végső mintákra érvényes eljárással egyenértékű eljárást követve kell venni.

— Amennyiben a teljes átlagolt minta homogenizált, a végső mintákat a homogenizált átlagolt mintából kell venni.

4. A minták tárolása

A mintákat olyan hőmérsékleten kell tárolni, amely összetételüket nem változtatja meg. A vitaminok vagy fényre különösen érzékeny anyagok vizsgálatára szánt mintákat a fény esetleges hátrányos hatását kizáró feltételek mellett kell tárolni.

B. A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK SORÁN HASZNÁLT REAGENSEKRE ÉS ESZKÖZÖKRE VONATKOZÓ RENDELKEZÉSEK

1. Amennyiben a vizsgálati módszerekben másképpen nem írják elő, minden analitikai reagensnek analitikai tisztaságúnak (a. t.) kell lennie. Nyomelem-analízis végrehajtásakor a reagensek tisztaságát vakpróbával kell ellenőrizni. Az így kapott eredmények a reagensek esetleges további tisztítását tehetik szükségessé.

2. A vizsgálati módszerek leírásában említett bármely oldatkészítési, hígítási, öblítési vagy mosási művelet esetében, ahol az alkalmazott oldószer vagy hígítószer fajtáját nem tüntetik fel, vizet kell használni. Általános szabályként ioncserélt vagy desztillált vizet kell használni. A vizsgálati módszerekben jelzett különleges esetekben a vizet speciális tisztítási eljárásokkal kell kezelni.

3. Az ellenőrző laboratóriumokban megtalálható alapfelszerelésre való tekintettel a vizsgálati módszerek leírásában csak a speciális vagy speciális használatot megkövetelő eszközöket és készülékeket említik. Ezeknek tisztáknak kell lenniük, különösen a nagyon kis anyagmennyiségek meghatározása esetén.

C. A VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ALKALMAZÁSA ÉS AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

1. Extrahálási eljárás

Számos módszer külön extrahálási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő extrahálási eljárást is lehet követni, feltéve, hogy az alkalmazott extrahálási eljárás hatékonysága a vizsgált mátrix tekintetében bizonyítottan egyenértékű a módszerben említett eljárás extrahálási hatékonyságával.

2. Tisztítási eljárás

Számos módszer külön tisztítási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő tisztítási eljárást is lehet követni, feltéve, hogy az alkalmazott tisztítási eljárás a vizsgált mátrix tekintetében bizonyítottan a módszerben említett eljárással egyenértékű vizsgálati eredményt ad.

3. Meghatározások száma

Nemkívánatos anyagok vizsgálata esetében, ha az első meghatározás eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák. Eltérő esetben párhuzamos vizsgálatra (második meghatározásra) van szükség ahhoz, hogy kizárjuk a minták belső keresztszennyeződésének, valamint esetleges összecserélődésének veszélyét. A mérési bizonytalanságot is figyelembe véve, a két meghatározás számtani középértéke szolgál a megfelelőség ellenőrzésére.

Valamely anyag vagy összetevő feltüntetett mennyiségére végzett vizsgálat esetében, ha az első meghatározás eredménye igazolja a feltüntetett mennyiséget, azaz az vizsgálati eredmény a feltüntetett tartalom elfogadható szórási tartományába esik, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák. Ettől eltérő esetben párhuzamos vizsgálatra (második meghatározásra) van szükség ahhoz, hogy kizárjuk a minták belső keresztszennyeződésének, valamint esetleges összecserélődésének veszélyét. A mérési bizonytalanságot is figyelembe véve, a két meghatározás számtani középértéke szolgál a megfelelőség ellenőrzésére.

Néhány esetben az elfogadható szórási tartományról jogszabályok rendelkeznek, mint például a takarmányok forgalomba hozataláról és felhasználásáról, az 1831/2003/EK rendelet módosításáról, valamint a 79/373/EGK tanácsi irányelv, a 80/511/EGK bizottsági irányelv, a 82/471/EGK, 83/228/EGK, 93/74/EGK, 93/113/EK és 96/25/EK tanácsi irányelv és a 2004/217/EK bizottsági határozat hatályon kívül helyezéséről szóló, 2009. július 13-i 767/2009/EK európai parlamenti és tanácsi rendelet ( 7 ).

4. Az alkalmazott vizsgálati módszer jegyzőkönyvi feltüntetése

A vizsgálati jegyzőkönyvben fel kell tüntetni az alkalmazott vizsgálati módszert.

5. Az vizsgálati eredmények jegyzőkönyvi feltüntetése

A vizsgálati eredményt a vizsgálati módszerben meghatározott módon és megfelelő helyiérték-számmal kell kifejezni, és ha szükséges, akkor a végső minta előkészítés előtti nedvességtartalmára kell korrigálni.

6. Mérési bizonytalanság és visszanyerési arány nemkívánatos anyagok vizsgálata esetében

A 2002/32/EK irányelv szerinti nemkívánatos anyagok tekintetében valamely takarmányozásra szánt termék akkor minősül meg nem felelőnek a megengedett határérték szempontjából, ha úgy ítélik meg, hogy a 12 %-os nedvességtartalmú takarmányra vonatkoztatott vizsgálati eredmény – figyelembe véve a kiterjesztett mérési bizonytalanságot és a visszanyerési korrekciót – meghaladja a megengedett határértéket. A megfelelés megállapítására a mért koncentrációt alkalmazzák a visszanyerés alapján végzett korrekció, valamint a kiterjesztett mérési bizonytalanság kivonása után. Ezt az eljárást csak olyan esetekben lehet alkalmazni, amikor a vizsgálati módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság becslését és a visszanyerési korrekciót (pl. mikroszkópos elemzésnél nem lehetséges).

A vizsgálati eredményt a következők szerint kell a jegyzőkönyvben feltüntetni (amennyiben az alkalmazott vizsgálati módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság és a visszanyerés becslését):

a) visszanyerésre korrigáltan, ebben az esetben fel kell tüntetni a visszanyerés mértékét. Nem szükséges feltüntetni a visszanyerési korrekciót, ha a visszanyerés aránya 90–110 % közötti;

b) x +/– U formában, ahol x a vizsgálati eredmény, U a kiterjesztett mérési bizonytalanság, a kiterjesztési tényező 2, amely körülbelül 95 %-os konfidenciaszintet eredményez.

Ha azonban a vizsgálat eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, és feltéve, hogy megfelelő minőségi eljárásokat alkalmaznak és az analízis célja kizárólag a jogszabályi rendelkezéseknek való megfelelés ellenőrzése, a vizsgálati eredményeket fel lehet tüntetni a jegyzőkönyvben a visszanyerési korrekció nélkül, és ezekben az esetekben el lehet hagyni a visszanyerés arányának és a mérési bizonytalanságnak jegyzőkönyvi feltüntetését.

▼B









III. MELLÉKLET

ANALITIKAI MÓDSZEREK A TAKARMÁNY-ALAPANYAGOK ÉS ►C1 TAKARMÁNYKEVERÉKEK ◄ ÖSSZETÉTELÉNEK ELLENŐRZÉSÉRE

A. A NEDVESSÉGTARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok nedvességtartalmának meghatározását. Illóanyagokat (mint például szerves savakat) tartalmazó takarmányok esetében figyelembe kell venni, hogy a nedvességtartalommal együtt jelentős mennyiségű illóanyag meghatározása történik.

Nem vonatkozik a tejtermékek mint takarmány-alapanyagok analízisére, az ásványi anyagok és a túlnyomórészt ásványi anyagokból álló keverékek analízisére, az állati és növényi zsírok és olajok és olajos magvak és olajtartalmú gyümölcsök analízisére.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát, a takarmány jellege szerint, meghatározott körülmények között szárítjuk. A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg. Amennyiben magas nedvességtartalmú, szilárd takarmányokkal dolgozunk, előzetes szárítást kell végezni.

3. Eszközök

3.1. Nem nedvszívó anyagból készült, könnyen tisztítható aprítógép, amelynek használata gyors és egynemű őrlést tesz lehetővé anélkül, hogy észrevehető mennyiségű hőtermeléssel járna, a lehető legnagyobb mértékben megakadályozza a külső levegővel történő érintkezést, és megfelel a 4.1.1. és 4.1.2. pontban foglalt követelményeknek (pl. kalapácsos törő vagy vízhűtéses mikroaprítók, összecsukható kúpos malmok, finommozgású-lassú fordulatú vagy fogaskerekes aprítók).

3.2. 1 mg pontosságú analitikai mérleg.

3.3. Nem rozsdásodó fémből vagy üvegből készült, légmentes záródást biztosító fedéllel ellátott száraz tartályok; megfelelő munkafelület, amely lehetővé teszi a vizsgálati minta 0,3 g/cm2 körüli mennyiségben történő terítését.

3.4. Elektromos fűtésű izotermikus, megfelelően ►C3 szellőztethető szárítószekrény ◄ (± 2 oC), amely gyors hőfokszabályozást tesz lehetővé ( 8 ).

3.5. Szabályozható, elektromos fűtésű ►C3 vákuum szárítószekrény ◄ olajszivattyúval és forró, száraz levegő vagy szárítóanyag (pl. kalcium-oxid) bejuttatására alkalmas szerkezettel ellátva.

3.6. Megfelelő szárítóanyagot tartalmazó, vastag, perforált fém- vagy porcelánlemezes exszikkátor.

4. A vizsgálat módja

Megjegyzés: Az ebben a szakaszban leírt műveleteket a mintacsomagok kibontása után azonnal el kell végezni. Az elemzést legalább egyszer meg kell ismételni.

4.1. Előkészítés

4.1.1. A 4.1.2. és a 4.1.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Szükség esetén aprítsuk fel vagy oszlassuk el úgy, hogy a nedvességtartalma egyenletes legyen (lásd 6. pont).

4.1.2. Gabona- és darafélék

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Őröljük le úgy, hogy a kapott részecskék legalább 50 %-a átjusson egy 0,5 mm-es szembőségű szitán, és ne maradjon vissza 10 %-nál több egy kerek szemű, 1 mm-es szembőségű szitán.

4.1.3. Folyékony vagy kenőcsös állagú takarmányok, túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok

Mérjünk ki 25 g mintát 10 mg pontossággal, adjunk hozzá megfelelő mennyiségű vízmentes homokot, 10 mg pontossággal kimérve, és keverjük addig, amíg homogén masszát nem kapunk.

4.2. Szárítás

4.2.1. ►C3 4.2.1. A 4.2.2. és a 4.2.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 1 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 103 oC-ra előmelegített szárítószekrénybe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe. Hagyjuk száradni négy órán át attól az időponttól számítva, amikor a szárítószekrény hőfoka újból elérte a 103 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

Túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok esetén szárítsuk további 30 percen át 130 oC-on a szárítószekrényben. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át. ◄

▼C3

4.2.2. Gabonafélék, liszt, darafélék és derce

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g aprított mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 130 oC-ra előmelegített szárítószekrénybe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe. Hagyjuk száradni két órán át attól az időponttól számítva, amikor a szárítószekrény hőfoka újból elérte a 130 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

▼B

4.2.3. Több mint 4 % szacharózt vagy ►C1 laktózt tartalmazó takarmánykeverékek: ◄ takarmány-alapanyagok, mint a szentjánoskenyér, a hidrolizált gabonatermékek, a malátamagvak, a szárított répaszelet, a hal- és cukorlevek; a 25 %-nál több ásványi sót ►C1 beleértve a kristályvíztartalmat is) tartalmazó takarmánykeverékek. ◄

▼C3

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 80–85 oC-ra előmelegített vákuum szárítószekrénybe (3.5.). Annak megakadályozása érdekében, hogy a szárítószekrény hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a szárítószekrénybe.

Emeljük a nyomást 100 torr-ra, és hagyjuk a mintát száradni ezen a nyomáson négy órán át száraz, forró levegő áramoltatásával vagy szárítóanyag (20 mintához kb. 300 g) felhasználásával. Utóbbi esetben a kívánt nyomás elérésekor kapcsoljuk le a vákuumszivattyút. A szárítási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a szárítószekrény hőmérséklete visszaáll 80–85 oC-ra. Óvatosan állítsuk vissza a szárítószekrényben a légköri nyomást. Nyissuk ki a szárítószekrényt, azonnal helyezzük vissza a tartály fedelét, vegyük ki a tartályt a szárítószekrényből, hagyjuk hűlni 30–45 percen át az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg-os pontossággal. Szárítsuk további 30 percen át a vákuum szárítószekrényben 80–85 oC-on, és mérjük le újra. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át.

▼B

4.3. Előszárítás

4.3.1. A 4.3.2. pont alatt nem szereplő takarmányok

A magas nedvességtartalmú szilárd takarmányokat, amelyek nehezen apríthatók fel, előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan mintából 10 mg pontossággal (a préselt vagy agglomerált mintákat kissé fel is lazíthatjuk, ha szükséges) egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). ►C3 Hagyjuk száradni 60–70 oC-os szárítószekrényben, amíg a nedvességtartalom 8–12 % körüli értékre csökken. Vegyük ki a szárítószekrényből, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban egy órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. ◄ Ezután aprítsuk fel azonnal a 4.1.1. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.1. vagy a 4.2.3. pontban feltüntetett módon, a takarmány jellege szerint.

4.3.2. Gabonafélék

A 17 %-nál magasabb nedvességtartalmú gabonaféléket előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan gabonából 10 mg pontossággal egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). ►C3 Hagyjuk száradni 5–7 percen át 130 oC-os szárítószekrényben. Vegyük ki a szárítószekrényben, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban két órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. ◄ Őröljük meg azonnal a 4.1.2. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.2. pontban feltüntetett módon.

5. Az eredmények kiszámítása

A minta százalékosan kifejezett nedvességtartalmát (X) az alábbi képletek segítségével számítjuk ki:

5.1. Szárítás előszárítás nélkül

ahol:

m = a vizsgálati minta eredeti tömege, grammban;

m0 = a száraz vizsgálati minta tömege, grammban.

5.2. Szárítás előszárítással

ahol:

m = a vizsgálati minta eredeti tömege, grammban,

m1 = a vizsgálati minta tömege, grammban, előszárítás után,

m2 = a vizsgálati minta tömege, grammban, aprítás vagy őrlés után,

m0 = a száraz vizsgálati minta tömege, grammban.

5.3. Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg a nedvességtartalom abszolút értékének 0,2 %-át.

6. Észrevételek

Ha az aprítás szükségesnek bizonyul, és úgy tűnik, hogy ez befolyásolja a termék nedvességtartalmát, a takarmány-alkotóelemek analízisének eredményét az eredeti minta nedvességtartalmának megfelelően korrigálni kell.

B. AZ ÁLLATI ÉS NÖVÉNYI ZSÍROK ÉS OLAJOK NEDESSÉGTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az állati és növényi zsírok és olajok víz- és illóanyag-tartalmának meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát 103 oC-on, a tömegállandóság eléréséig szárítjuk (két egymást követő mérés közötti tömegveszteségnek 1 mg-nál kevesebbnek kell lennie). A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg.

3. Eszközök

3.1. Rozsdamentes anyagból készült, 8–9 cm átmérőjű és körülbelül 3 cm magas, lapos fenekű edény.

3.2. Rögzített üveggömbbel és a felső végén kiterjedési csővel rendelkező hőmérő, amely körülbelül 80 oC-tól legalább 110 oC-ig beosztással rendelkezik és körülbelül 10 cm hosszú.

3.3. Homokfürdő vagy elektromos főzőlap.

3.4. Hatékony szárítóközeget tartalmazó exszikkátor.

3.5. Analitikai mérleg.

4. A vizsgálat módja

Mérjünk ki mg pontossággal 20 g homogenizált mintát a hőmérőt (3.2.) tartalmazó száraz, lemért edénybe (3.1.). A hőmérővel folyamatosan kevergetve hevítsük a homokfürdőn vagy a főzőlapon (3.3.) úgy, hogy a hőmérséklet körülbelül hét perc alatt érje el a 90 oC-ot.

Csökkentsük a hőt, ügyelve az edény aljáról felszálló buborékok gyakoriságára. A hőmérséklet nem haladhatja meg a 105 oC-ot. Folytassuk az edény alján lévő anyag keverését, amíg a buborékképződés le nem áll.

A teljes kiszárítás érdekében hevítsük az edényt néhányszor 103 ± 2 oC-ra, miközben két hevítés között 93 oC-ra hűtjük tartalmát. Ezután hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni az exszikkátorban (3.4.), és mérjük le. Ismételjük addig a műveletet, amíg a két egymást követő mérés közötti tömegveszteség már nem haladja meg a 2 mg-ot.

Megjegyzés: A minta tömegének növekedése a többszöri hevítést követően a zsír oxidációját jelzi, ebben az esetben az eredményt a tömeg növekedését közvetlenül megelőző mérés alapján kell kiszámítani.

5. Az eredmények kiszámítása

A mintára vonatkoztatott, százalékosan kifejezett nedvességtartalmat (X) a következő képlettel lehet kiszámítani:

ahol:

m = a vizsgálati minta tömege, grammban;

m1 = az edény hevítés előtti tömege, grammban, a tartalmával együtt;

m2 = az edény hevítés utáni tömege, grammban, a tartalmával együtt.

A 0,05 %-nál kisebb eredményeket a „0,05 %-nál kisebb” megnevezéssel kell feljegyezni.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredményeként kapott nedvességtartalmak eltérésének abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,05 %-ot.

C. A NYERSFEHÉRJE-TARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

E módszer lehetővé teszi a takarmányok nyersfehérje-tartalmának meghatározását a Kjeldahl-módszer szerint meghatározott nitrogéntartalom alapján.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát katalizátor jelenlétében kénsavval roncsoljuk. A savas oldatot nátrium-hidroxid-oldattal lúgosítjuk. Az ammóniát lepároljuk, és ismert mennyiségű kénsavban vesszük fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid standardoldatával titráljuk.

Alternatív megoldásként a felszabadult ammóniát bőséges bórsavoldatba desztilláljuk, majd sósav- vagy kénsavoldattal titráljuk.

3. Reagensek

3.1. Kálium-szulfát.

3.2. Katalizátor: réz(II)-oxid, CuO vagy réz(II)-szulfát-pentahidrát, CuSO4 5H2O.

3.3. Granulált cink.

3.4. Kénsav, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,25 mól/l.

3.6. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,10 mól/l.

3.7. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,05 mól/l.

3.8. Metilvörösindikátor; oldjunk fel 300 mg metilvöröst 100 ml etanolban, σ = 95–96 % (v/v)

3.9. Nátrium-hidroxid-oldat (technikai minőségű is használható) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Nátrium-hidroxid, normál mérőoldat, c (NaOH) = 0,25 mól/l.

3.11. Nátrium-hidroxid, normál mérőoldat, c (NaOH) = 0,10 mól/l.

3.12. Granulált horzsakő, sósavban mosott és meggyújtott.

3.13. Acetanilid (olvadáspont = 114 oC, N-tartalom = 10,36 %).

3.14. Szacharóz (nitrogénmentes).

3.15. Bórsav (H3BO3).

3.16. Metilvörösindikátor-oldat: oldjunk fel 100 mg metilvöröst 100 ml etanolban vagy metil-alkoholban.

3.17. Brómkrezol-zöld-oldat: oldjunk fel 100 mg brómkrezol-zöldet 100 ml etanolban vagy metil-alkoholban.

3.18. Bórsavas oldat (10 g/l – 40 g/l, a használt eszköztől függően).

Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a metilvörös és a brómkrezol indikátort a bórsavas oldathoz kell adni. Ha 1 liter bórsavas oldatot készítünk, a térfogat kiigazítása előtt 7 ml metilvörösindikátor-oldatot (3.16.) és 10 ml brómkrezol-zöld oldatot (3.17.) kell hozzáadni.

A használt víztől függően a bórsavas oldat pH-ja tételenként változhat. Pozitív vakpróbához gyakorta szükség lehet kis mennyiségű lúg hozzáadására.

Megjegyzés: Rendszerint jó eredményt ad körülbelül 3–4 ml NaOH-nak (3.11.) 1 liter 10 g/l bórsavas oldathoz való hozzáadása. Tároljuk az oldatot szobahőmérsékleten, és tárolás közben védjük a fénytől és az ammóniagáz-forrásoktól.

3.19 Sósav, normál mérőoldat, c(HC1) = 0,10 mól/l.

Megjegyzés: A normál mérőoldatok más koncentrációi (3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. és 3.19.) is használhatók, ha ezt a számításokban korrigáljuk. A koncentrációt mindig négytizedes pontossággal kell megadni.

4. Eszközök

A Kjeldahl-eljárás szerinti roncsolás, desztillálás és titrálás elvégzésére alkalmas készülék.

5. A vizsgálat módja

5.1. Roncsolás

Mérjünk ki 0,001 g pontossággal 1 g mintát, és helyezzük be a roncsoló lombikjába. Adjunk hozzá 15 g kálium-szulfátot (3.1.), megfelelő mennyiségű katalizátort (3.2.) (0,3 –0,4 g réz(II)-oxidot vagy 0,9 –1,2 g réz(II)-szulfát-pentahidrátot), 25 ml kénsavat (3.4.) és szükség szerint néhány szemcse horzsakövet (3.12.), majd keverjük össze.

Először mérsékelten hevítsük a lombikot, szükség esetén időnként keverjük meg annak tartalmát, egészen addig, amíg a massza karbonizálódik és a hab eltűnik; ezt követően erősebben hevítsük, amíg a folyadék erős forrásba nem jön. A hevítés akkor megfelelő, ha a forrásban levő sav a lombik falán lecsapódik. Kerüljük a lombik oldalának túlhevítését és azt, hogy ahhoz szerves részecskék tapadjanak.

Amikor az oldat feltisztult és világoszöld színűvé vált, folytassuk a forralást további két órán át, majd hagyjuk lehűlni az oldatot.

5.2. Lepárlás

Óvatosan adjunk hozzá annyi vizet, amennyi a szulfátok teljes feloldódásához elegendő. Engedjük lehűlni, majd szükség szerint adjunk hozzá néhány szemcsényi cinket (3.3.). Folytassuk az 5.2.1. vagy az 5.2.2. pont szerint.

5.2.1. Lepárlás kénsavba

A lepárlókészülék gyűjtőlombikjába mérjünk be pontosan 25 ml kénsavat (3.5. vagy 3.7.), a feltételezett nitrogéntartalomtól függően. Adjunk hozzá néhány csepp metilvörösindikátort (3.8.).

Kapcsoljuk össze a Kjeldahl-lombikot a lepárlókészülék hűtőjével, és legalább 1 cm mélyen merítsük be a hűtő végét a gyűjtőlombikban lévő folyadékba (lásd a 8.3. észrevételt). Lassan, ammóniaveszteség nélkül öntsünk 100 ml nátrium-hidroxid oldatot (3.9.) a Kjeldahl-lombikba (lásd a 8.1. észrevételt). Hevítsük a lombikot az ammónia lepárlódásáig.

5.2.2. Lepárlás bórsavba

Amennyiben a párlat ammóniatartalmának titrálását manuálisan végezzük, az alább megadott eljárást kell alkalmazni. Amennyiben a lepárlóegység teljesen automatikusan a párlat ammóniatartalmát is titrálja, kövessük a gyártó utasításait a lepárlóegység működtetése tekintetében.

Tegyünk a hűtő kifolyójához 25–30 ml bórsavas oldatot (3.18.) tartalmazó gyűjtőlombikot úgy, hogy az adagolócső a bórsavas oldat szintje alatt legyen. Állítsuk be a lepárlóegységet 50 ml nátrium-hidroxid oldat (3.9.) adagolására. A lepárlóegységet a gyártó utasításainak megfelelően működtessük, és pároljuk le a nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával felszabadult ammóniát. Gyűjtsük össze a párlatot a bórsavas fogadóoldatban. A párlat mennyisége (a gőzlepárlás ideje) a minta nitrogéntartalmától függ. Kövessük a gyártó utasításait.

Megjegyzés: Félautomata lepárlóegység esetében a nátrium-hidroxid felesleg hozzáadása és a gőzlepárlás automatikusan történik.

5.3. Titrálás

Folytassuk az 5.3.1. vagy a 5.3.2. pont szerint.

5.3.1. Kénsav

A gyűjtőlombikban levő kénsavfelesleget a végpont eléréséig titráljuk nátrium-hidroxid oldattal (3.10. vagy 3.11.) az alkalmazott kénsav-koncentrációtól függően.

5.3.2. Bórsav

A gyűjtőlombik tartalmát a normál sósavmérőoldattal (3.19.) vagy normál kénsavmérőoldattal (3.6.) titráljuk büretta segítségével, és olvassuk le a használt párlat mennyiségét.

Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a végpont elérése akkor történik, amikor a rózsaszín első jele megjelenik a tartalomban. Becsüljük meg a büretta eredményét 0,05 ml pontossággal. Egy megvilágított mágneses keverőlemez vagy fotometrikus detektor segíthet a végpont megjelenítésében.

Ez történhet automatikusan automata titrálóval felszerelt gőzlepárló használatával.

Kövessük a gyártó utasításait az adott lepárló vagy lepárló/titráló működtetésekor.

Megjegyzés: Automata titrálórendszer használatakor a titrálás a lepárlás kezdetekor rögtön megkezdődik és 1 %-os bórsavas oldatot (3.18.) használunk. Teljesen automatikus lepárlórendszer használatakor az ammónia automatikus titrálása potenciometrikus pH-rendszer alkalmazásával végpont-meghatározással is elvégezhető. Ebben az esetben pH-mérővel felszerelt automata titrálót használunk. A pH-mérőt a szokásos laboratóriumi pH-kalibrálási eljárásokat követve megfelelően kalibrálni kell a 4–7 közötti pH tartományra. A titrálás pH-végpontjának elérése 4,6 -os pH értéknél következik be, ami a titrációs görbe legmeredekebb pontja (inflexiós pont).

5.4. Vakpróba

A reagensek nitrogénmentességének igazolására végezzünk vakpróbát (roncsolás, lepárlás és titrálás) a minta helyett 1 g szacharózt (3.14.) használva.

6. Az eredmények kiszámítása

A számításokat a 6.1. vagy a 6.2. pont szerint végezzük.

6.1. Számítás az 5.3.1. pont szerinti titrálás esetén

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

V0 = a vakpróbában használt NaOH (3.10. vagy 3.11.) térfogata (ml).

V1 = a minta titrálásához használt NaOH (3.10. vagy 3.11.) térfogata (ml).

c = a nátrium-hidroxid (3.10. vagy 3.110.) koncentrációja (mól/l).

m = a minta tömege (g).

6.2. Számítás az 5.3.2. pont szerinti titrálás esetén

6.2.1. Sósavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

m = a vizsgált adag g-ban kifejezett tömege;

c = a normál sósav-mérőoldat (3.19.) koncentrációja (mól/l);

V0 = a vakpróbában használt sósav térfogata (ml);

V1 = a vizsgált adaghoz használt sósav térfogata (ml).

6.2.2. Kénsavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

m = a vizsgált adag g-ban kifejezett tömege

c = a normál kénsav-mérőoldat (3.6.) koncentrációja (mól/l)

V0 = a vakpróbában használt kénsav (3.6.) térfogata (ml)

V1 = a vizsgált adaghoz használt kénsav (3.6.) térfogata (ml)

7. A módszer validálása

7.1. Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

— 20 %-nál alacsonyabb nyersfehérje-tartalom esetén a 0,2 %-ot abszolút értékben,

— 20 % és 40 % közötti nyersfehérje-tartalom esetén a magasabb érték 1,0 %-át,

— 40 %-nál magasabb nyersfehérje-tartalom esetén a 0,4 %-ot abszolút értékben.

7.2. Pontosság

Végezzük el az analízist (roncsolás, lepárlás és titrálás) 1,5 –2,0 g acetaniliden (3.13.) 1 g szacharóz (3.14.) jelenlétében; 1 g acetanilid 14,80 ml kénsavat (3.5.) fogyaszt. A visszanyerés mértékének legalább 99 %-osnak kell lennie.

8. Észrevételek

8.1. A készülék lehet kézi, félautomata vagy automata típusú. Ha az alkalmazott készülék esetében a roncsolási és a lepárlási lépések között mintaátvitelre van szükség, ezt anyagveszteség nélkül kell végrehajtani. Ha a lepárlókészülék lombikja nincs felszerelve csepegtetőtölcsérrel, a nátrium-hidroxidot közvetlenül a lombik és a hűtő összekapcsolása előtt kell hozzáadni, a folyadékot lassan az edény belső oldala mentén folyatva.

8.2. Ha a roncsolt anyag megszilárdul, a fent megadottnál nagyobb mennyiségű kénsavval (3.4.) kezdjük újra a meghatározást.

8.3. Alacsony nitrogéntartalmú termékek esetén a gyűjtőlombikba mérendő kénsav (3.7.) térfogata szükség esetén 10 vagy 15 ml-re csökkenthető, és vízzel 25 ml-re feltölthető.

8.4. Rutinanalízishez más analitikai módszerek is használhatóak a nyersfehérje meghatározására, de a C. részben leírt Kjeldahl-módszer a referencia-módszer. Minden mátrix esetében egyedileg kell igazolni, hogy az alternatív (pl. DUMAS) módszerrel kapott eredmények egyenértékűek a referenciamódszerrel kapott eredményekkel. Mivel az alternatív módszerrel kapott eredmények – még az egyenértékűség igazolását követően is – eltérhetnek kissé a referenciamódszerel kapott eredményektől, az analitikai jelentésben meg kell említeni a nyersfehérje meghatározására használt analitikai módszert.

D. A KARBAMID MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban lévő karbamid szintjének meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízben szuszpendáljuk egy derítőszerrel. A szuszpenziót leszűrjük. A szűrlet karbamidtartalmát, 4-dimetil-amino-benzaldehid (4-DMAB) hozzáadása után, az optikai sűrűség 420 nm-es hullámhosszon való megmérésével határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. 4-dimetil-amino-benzaldehid-oldat: oldjunk fel 1,6 g 4-DMAB -t 100 ml 96 %-os etanolban, és adjunk hozzá 10 ml sósavat (ρ201,19 g/ml). A reagens legfeljebb kéthetes időtartamon keresztül áll el.

3.2. Carrez I. oldat: oldjunk fel vízben 21,9 g cink-acetátot, Zn(CH3COO)2·2H2O és 3 g jégecetet. Töltsük fel vízzel 100 ml-re.

3.3. Carrez II. oldat: vízben oldjunk fel 10,6 g kálium-[hexaciano-ferrát(II)]-ot, K4 Fe (CN)6 3H2O. Töltsük fel vízzel 100 ml-re.

3.4. Aktív szén, amely nem abszorbeálja a karbamidot (ezt ellenőrizni kell).

3.5. Karbamid, 0,1 %-os oldat (w/v).

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Kémcsövek: 160 × 16 mm, csiszolt üvegdugóval.

4.3. Spektrofotométer.

5. A vizsgálat módja

5.1. A minta elemzése

Mérjünk ki a mintából 2 g-ot mg-nyi pontossággal, és 1 g aktív szénnel (3.4.) együtt helyezzük egy 500 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 400 ml vizet és 5 ml Carrez I. oldatot (3.2.), keverjük kb. 30 másodpercig, majd adjunk hozzá 5 ml Carrez II. oldatot (3.3.). Keverjük a forgódobon harminc percig. Töltsük térfogatra vízzel, rázzuk fel, és szűrjük le.

Vegyünk el 5 ml-t az áttetsző, színtelen szűrletekből, öntsük csiszolt üvegdugóval ellátott kémcsövekbe, adjunk hozzájuk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), és keverjük fel. Helyezzük a kémcsöveket vízfürdőbe 20 oC-on (+/- 4 oC). Tizenöt perc elteltével a spektrofotométer segítségével, 420 nm-en mérjük meg a mintaoldat optikai sűrűségét, és ezt hasonlítsuk össze a vakpróbához a reagensekből készített oldattal.

5.2. Kalibrációs görbe

Vegyünk el a karbamid oldatból (3.5.) 1, 2, 4, 5 és 10 ml-t, öntsük 100 ml-es mérőlombikokba, és töltsük fel őket térfogatra vízzel. Vegyünk el 5 ml-t minden egyes oldatból, és mindegyikhez adjunk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), homogenizáljuk, és a fentiek szerint mérjük meg az optikai sűrűséget összehasonlítva az 5 ml 4-DMAB oldatot és 5 ml vizet tartalmazó karbamidmentes kontrolloldattal. Szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

6. Az eredmények kiszámítása

A kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg a mintában lévő karbamidmennyiséget.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7. Észrevételek

7.1. 3 %-ot meghaladó karbamidtartalom esetén, csökkentsük a minta nagyságát 1 g-ra vagy hígítsuk az eredeti oldatot úgy, hogy 500 ml-ben ne legyen több 50 mg karbamidnál.

7.2. Alacsony karbamidtartalom esetén növeljük a minta nagyságát mindaddig, amíg a szűrlet áttetsző és színtelen marad.

7.3. Ha a minta olyan egyszerű nitrogéntartalmú elegyeket tartalmaz, mint az aminosavak, akkor az optikai sűrűséget 435 nm-en kell mérni.

E. AZ ILLÓ NITROGÉNBÁZISOK MEGHATÁROZÁSA

I. MIKRODIFFÚZIÓVAL

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázisokat mikrodiffúzióval, kálium-karbonát oldat használatával kiszorítjuk, bórsavas oldatban fogjuk fel, és kénsavval titráljuk.

3. Reagensek

3.1. 20 %-os (w/v) triklór-ecetsav oldat.

3.2. Indikátor: oldjunk fel 33 mg brómkrezol-zöldet és 65 mg metilvöröst 100 ml 95–96 %-os (v/v) etanolban.

3.3. Bórsavas oldat: 1 literes mérőlombikban oldjunk fel 10 g bórsavat 200 ml, 95–96 %-os (v/v) etanolban és 700 ml vízben. Adjunk hozzá 10 ml indikátort (3.2.). Keverjük össze, és ha szükséges, állítsuk be az oldat színét világos vörösre nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával. Ezen oldat 1 ml-je maximum 300 μg NH3-t fog megkötni.

3.4. Telített kálium-karbonát oldat: oldjunk fel 100 g kálium-karbonátot 100 ml forrásban lévő vízben. Hagyjuk lehűlni, majd szűrjük le.

3.5. 0,1 mól/liter koncentrációjú kénsav.

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Üveg vagy műanyag Conway-küvetták (lásd az ábrát).

4.3. 1/100 ml-es fokbeosztásos mikrobüretták.

5. A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Pipettázzunk 1 ml bórsavas oldatot (3.3.) a Conway-küvetta középső részébe és 1 ml mintaszűrletet a küvetta koronarészébe. Fedjük le részlegesen a bezsírozott fedéllel. Tegyünk 1 ml telített kálium-karbonát oldatot (3.4.) gyorsan a küvetta koronarészébe, majd zárjuk le légmentesen a küvettát a fedéllel. Forgassuk el a küvettát óvatosan a vízszintes síkban úgy, hogy a két reagens összekeveredjen. Hagyjuk inkubálódni legalább négy órán át szobahőmérsékleten vagy egy órán át 40 oC-on.

Mikrobüretta (4.3.) segítségével titráljuk az illó bázisokat a bórsavoldatban kénsavval (3.5.).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6. Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,01 mól/liter koncentrációjú H2SO4 0,34 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg:

— 1,0 %-osnál alacsonyabb ammóniatartalom esetén relatív értékben a 10 %-ot,

— 1,0 %-os vagy annál magasabb ammóniartartalom esetén abszolút értékben a 0,1 %-ot.

7. Észrevételek

Ha a minta ammóniatartalma meghaladja a 0,6 %-ot, az eredeti szűrletet hígítani kell.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. DESZTILLÁLÁSSAL

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a karbamidot gyakorlatilag nem tartalmazó halliszt ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását. Csak 0,25 %-nál alacsonyabb ammóniatartalom esetén alkalmazható.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázist forrásponton szorítjuk ki magnézium-oxid hozzáadásával, és meghatározott mennyiségű kénsavban fogjuk fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid oldattal titráljuk vissza.

3. Reagensek

3.1. 20 %-os (w/v) triklór-ecetsav oldat.

3.2. Magnézium-oxid.

3.3. Habzásgátló emulzió (pl. szilikon).

3.4. 0,5 mól/liter koncentrációjú kénsav.

3.5. 0,5 mól/liter koncentrációjú nátrium-hidroxid oldat.

3.6. 0,3 %-os metilvörös-oldat 95–96 % (v/v) etanolban.

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Kjeldahl-féle lepárlókészülék.

5. A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal, és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Vegyünk a tiszta szűrletből elegendő mennyiséget, hogy a feltételezett illó nitrogénbázis-tartalmat meg tudjuk határozni (100 ml mennyiség rendszerint megfelel a célnak). Hígítsuk fel 200 ml-re, és adjunk hozzá 2 g magnézium-oxidot (3.2.), valamint néhány csepp habzásgátló emulziót (3.3.). Az oldatnak lakmuszpapírral mérve lúgos kémhatásúnak kell lennie; ha nem az, adjunk hozzá egy kevés magnézium-oxidot (3.2.). Folytassuk a nyersfehérje meghatározására az 5.2. vagy 5.3. pontban ismertetett módszer szerint (e melléklet C. része).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6. Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,05 mól/liter koncentrációjú H2SO41,7 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg relatív értékben az ammóniatartalom 10 %-át.

F. AZ AMINOSAVAK MEGHATÁROZÁSA (A TRIPTOFÁN KIVÉTELÉVEL)

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a takarmányok szabad (szintetikus és természetes) és összes (peptidhez kötött és szabad) aminosav-tartalmának meghatározását teszi lehetővé, aminosav-analizátort használatával. A módszer a következő aminosavakra alkalmazható: cisztein, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aszparaginsav, glutaminsav, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, szerin, tirozin és valin.

A módszer nem tesz különbséget az aminosav sói között, és nem különbözteti meg az aminosavak D és L formáit. A módszer nem érvényes triptofán vagy az aminosavak hidroxi analógjainak meghatározására.

2. Vizsgálati alapelv

2.1. Szabad aminosavak

A szabad aminosavakat híg sósavval extraháljuk. Az együtt extrahált nitrogéntartalmú makromolekulákat szulfoszalicilsavval csapatjuk ki, és szűréssel távolítjuk el. A szűrt oldat kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

2.2. Összes aminosav

A választott eljárás függ a vizsgált aminosavaktól. A ciszteint és a metionint a hidrolízis előtt ciszteinsavvá, illetve metionin-szulfonná kell oxidálni. A tirozint az oxidálatlan minták hidrolizátumaiból kell meghatározni. Az (1) bekezdésben felsorolt összes többi aminosav akár oxidált, akár oxidálatlan mintából meghatározható.

Az oxidálást 0 oC-on végezzük perhangyasav/fenol keverékével. A oxidálószer-felesleget nátrium-diszulfittal bontjuk le. Az oxidált vagy oxidálatlan mintát sósavval (3.20.) hidrolizáljuk 23 órán keresztül. A hidrolizátum kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en (prolin esetében 440 nm-en) végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

3. Reagensek

Kétszer desztillált vizet vagy ezzel egyenértékű minőségű vizet kell használni (vezetőképessége < 10 μS).

3.1. Hidrogén-peroxid, w (w/w) = 30 %.

3.2. Hangyasav, w (w/w) = 98–100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Nátrium-diszulfit.

3.5. Nátrium-hidroxid.

3.6. 5-szulfo-szalicilsav-dihidrát.

3.7. Sósav, sűrűsége megközelítőleg 1,18 g/ml.

3.8. tri-nátrium-citrát-dihidrát.

3.9. 2,2 '-Tiodietanol (tiodiglikol).

3.10. Nátrium-klorid.

3.11. Ninhidrin.

3.12. Petroléter, forráspont-tartomány: 40–60 oC.

3.13. Norleucin vagy más, belső standardként történő használatra alkalmas vegyület.

3.14. Nitrogéngáz (10 ppm-nél kevesebb oxigénnel).

3.15. 1-oktanol.

3.16. Aminosavak.

3.16.1. Az 1. pontban felsorolt standard anyagok. Tiszta vegyületek kristályvíztartalom nélkül. Használat előtt egy hétig szárítsuk vákuumban P2O5 vagy H2SO4 felett.

3.16.2. Ciszteinsav.

3.16.3. Metionin-szulfon.

3.17. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 7,5 mól/l:

Oldjunk fel 300 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.18. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 1 mól/l:

Oldjunk fel 40 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.19. Hangyasav-fenol oldat:

Elegyítsünk 889 g hangyasavat (3.2.) 111 g vízzel és adjunk hozzá 4,73 g fenolt (3.3.).

3.20. Hidrolízis keverék c = 6 mól HCl /l 1 g fenol/l tartalommal:

Adjunk egy g fenolt (3.3.) 492 ml HCl-hez (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.21. Extraháló keverék, c = 0,1 mól HCl/l 2 %-os tiodiglikol tartalommal: Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), hígítsuk megközelítőleg 900 ml vízzel, adjunk hozzá 20 ml tiodiglikolt (3.9.), és vízzel töltsük fel 1 l-re (ne keverjük össze közvetlenül a 3.7.-et és 3.9.-et).

3.22. 5-szulfo-szalicilsav ß = 6 %:

Oldjunk fel 60 g 5-szulfo-szalicilsavat (3.6.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.23. Oxidáló keverék (perhangyasav-fenol):

Elegyítsünk 0,5 ml hidrogén peroxidot (3.1.) 4,5 ml hangyasav-fenol oldattal (3.19.) egy kis főzőpohárban. Inkubáljuk 20–30 oC-on egy órán át a perhangyasav keletkezéséhez, majd hűtsük le jeges vízfürdőben (15 percig), mielőtt a mintához adnánk.

Figyelem: Kerüljük a bőrrel való érintkezést, és viseljünk védőruházatot.

3.24. Citrátpuffer, c = 0,2 mól Na+/l, pH 2,20 :

Oldjunk fel 19,61 g nátrium-citrátot (3.8.), 5 ml tiodiglikolt (3.9.), 1 g fenolt (3.3.) és 16,50 ml HCl-t (3.7.) megközelítőleg 800 ml vízben. Állítsuk be a pH-t 2,20 -re. Töltsük fel vízzel 1 literre.

3.25. Eluáló pufferek, a használt analizátor feltételei szerint készítve (4.9.).

3.26. Ninhidrin reagens, a használt analizátor feltételei szerint készítve (4.9.).

3.27. Aminosavak standardoldata. Ezeket az oldatokat 5 oC alatt kell tárolni.

3.27.1. Aminosavak standard törzsoldata (3.16.1.).

c = 2,5 μmól/l, mindegyik sósavban.

Kereskedelmi forgalomban kapható.

3.27.2. Ciszteinsav és metionin-szulfon standard törzsoldata, c = 1,25 μmól/ml.

1 literes mérőlombikban citrátpufferban (3.24.) oldjunk fel 0,2115 g ciszteinsavat (3.16.2.) és 0,2265 g metionin szulfont (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig citrátpufferrel. Legfeljebb 12 hónapig tároljuk 5 oC alatt. Nem használjuk ezt az oldatot, ha a standard törzsoldat (3.27.1.) tartalmaz ciszteinsavat és metionin szulfont.

3.27.3. Belső standard pl. norleucin standard törzsoldata, c = 20 μmól/ml.

Mérőlombikban oldjunk fel 0,6560 g norleucint (3.13.) citrátpufferben (3.24.), majd az oldatot töltsük fel 250 ml-re citrátpufferrel. Legfeljebb 6 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

3.27.4. Standard aminosavak kalibrálóoldata hidrolizátumokkal való használatra, c = 5 nmól/50 μl ciszteinsav és metionin szulfon és c = 10 nmól/50 μl más aminosav. Egy 100 ml-es főzőpohárban oldjunk fel 30 ml citrátpufferben (3.24.) 2,2 g nátrium-kloridot (3.10.). Adjunk hozzá 4,00 ml standard aminosav-törzsoldatot (3.27.1.), 4,00 ml ciszteinsav és metionin szulfon standard törzsoldatot (3.27.2.) és 0,50 ml-t a belső standard (3.27.3.) standard törzsoldatából, ha ilyet használunk. A pH-t állítsuk 2,20 -re nátrium-hidroxiddal (3.18.).

Öntsük át a teljes mennyiséget egy 50 ml-es mérőlombikba, töltsük fel jelig citrátpufferrel (3.24.), és keverjük össze.

Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

Lásd még az Észrevételek 9.1. pontját.

3.27.5. Standard aminosavak kalibrálóoldata hidrolizátumokkal való használatra, az 5.3.3.1. pont szerint készítve és a kivonatokkal való használatra (5.2.). A kalibrálóoldat a 3.27.4. pont szerint készül, de elhagyjuk a nátrium-kloridot.

Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

4. Eszközök

4.1. 100 vagy 250 ml-es visszafolyós hűtővel ellátott gömblombik.

4.2. 100 ml-es, csavaros tetejű, gumi/teflon béléses bórszilikát üveglombik (pl. Duran, Schott) ►C3 szárítószekrényben ◄ történő használatra.

4.3. Intenzív szellőztetésű és + 2 oC-nál nagyobb pontosságú hőmérséklet-szabályozóval ellátott ►C3 szárítószekrény ◄ .

4.4. pH-mérő (három tizedesjegyig)

4.5. 0,22 μm-es membránszűrő.

4.6. Centrifuga.

4.7. Rotációs vákuumbepárló.

4.8. Mechanikus vagy mágneses keverőberendezés.

4.9. Aminosav-analizátor vagy HPLC-berendezés ioncserélő oszloppal, készülék ninhidrinhez, utókolonnás derivatizáláshoz és fotometriás detektor.

A kolonna szulfonált polisztirol gyantával van töltve, amely képes az aminosavak egymástól és más ninhidrin-pozitív anyagoktól való elválasztására. A puffer és ninhidrin vonal áramlását ±0,5 %-os áramlási stabilitású szivattyúk biztosítják a standard kalibrálás és a minta analízisének időszakában.

Néhány aminosav-analizátornál olyan hidrolízises eljárások is alkalmazhatók, amelyekben a hidrolizátum nátriumkoncentrációja k = 0,8 mól/l, és amelyek tartalmazzák az oxidációs lépésből származó valamennyi hangyasavmaradékot. Más analizátorok nem biztosítanak megfelelő elválasztást bizonyos aminosavak esetében, ha a hidrolizátum feleslegben tartalmaz hangyasavat, és/vagy magas benne a nátrium-ion koncentráció. Ebben az esetben a sav térfogatát a hidrolízis után és a pH-beállítás előtt mintegy 5 ml-re való bepárlással csökkentjük. A bepárlást vákuum alatt és maximum 40 oC-on kell végezni.

5. A vizsgálat módja

5.1. A minta előkészítése

A mintát úgy őröljük meg, hogy átjusson egy 0,5 mm-es szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.12.) extrahálni kell.

5.2. A szabad aminosavak meghatározása takarmányokban és előkeverékekben

Az előkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) mérjünk be 0,2 mg pontossággal egy Erlenmeyer-lombikba, és adjunk hozzá 100,0 ml extraháló keveréket (3.21.). Rázassuk a keveréket 60 percig mechanikus rázógép vagy mágneses keverő segítségével (4.8.). Hagyjuk leülepedni az üledéket, és a felülúszó oldatból pipettázzunk 10,0 ml-t egy 100 ml-es főzőpohárba.

Keverés közben adjunk hozzá 5,0 ml szulfoszalicilsavat (3.22.), és folytassuk a keverést mágneses keverő segítségével 5 percig. A felülúszó folyadékot szűrjük le, vagy centrifugáljuk a csapadék leválasztása céljából. A kapott oldat 10,0 ml-ét tegyük egy 100 ml-es főzőpohárba, és állítsuk be a pH-t 2,20 -ra nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.), majd töltsük át egy megfelelő térfogatú mérőlombikba citrát-puffer segítségével (3.24.), és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Ha belső standardot használunk, adjunk 1,00 ml belső standardot (3.27.3.) minden 100 ml végső oldathoz, és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával, az 5.4. pont szerint.

Ha a kivonatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, akkor azokat 5 oC alatt kell tárolni.

5.3. Összes aminosav meghatározása

5.3.1. Oxidáció

0,2 mg pontossággal mérjünk ki 0,1 –1 g-ot az előkészített mintából (5.1.):

— egy 100 ml-es gömblombikba (4.1.) nyitott hidrolízishez (5.3.2.3.), vagy

— egy 250 ml-es gömblombikba (4.1.), ha alacsony nátriumkoncentrációra van szükség (5.3.3.1.), vagy

— egy csavaros tetejű 100 ml-es palackba (4.2.), (zárt hidrolízishez 5.3.2.4.).

A kimért mintamennyiségnek hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal és legfeljebb 100 mg nedvességtartalommal kell rendelkeznie.

Helyezzük a lombikot/palackot jeges vízfürdőbe, és hűtsük le 0 oC-ra, adjunk hozzá 5 ml oxidációs keveréket (3.23.), és keverjük össze egy hajlított végű üvegspatulával. Zárjuk le légmentesen a spatulát is magában foglaló lombikot/palackot, tegyük a lezárt tartályt tartalmazó jeges vízfürdőt 0 oC-os hűtőszekrénybe, és hagyjuk állni 16 órán keresztül. 16 óra múlva vegyük ki a hűtőszekrényből, és a feleslegben lévő oxidáló reagenst 0,84 g nátrium-diszulfit (3.4.) adagolásával bontsuk le.

Folytassuk a műveletet az 5.3.2.1. pont szerint.

5.3.2. Hidrolízis

5.3.2.1. Az oxidált minták hidrolízise

Az 5.3.1. pont szerint elkészített oxidált mintához adjunk 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), ügyelve arra, hogy lemossuk az edény falára és a spatulára tapadt mintamaradékot.

Az alkalmazott hidrolízis-eljárástól függően az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.2. A nem oxidált minta hidrolízise

Mérjünk be egy 100 ml-es vagy egy 250 ml-es gömblombikba (4.1.) vagy egy 100 ml-es csavaros fedelű palackba (4.2.) 0,1 –1 g-ot az előkészített mintából (5.1.) 0,2 mg pontossággal. A mintából bemért adagnak hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal kell rendelkeznie. Óvatosan adjunk hozzá 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), és keverjük őket össze. Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.3. Nyitott hidrolízis

Tegyünk 3 üveggyöngyöt a lombikban lévő keverékbe (ami az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint készült), és forraljuk folyamatos buborékolás mellett, reflux alatt, 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, mossuk ki a hűtőt 5 ml citrát-pufferrel (3.24.). Vegyük le a lombikot, és hűtsük le jeges vízfürdőben.

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.4. Zárt hidrolízis

▼C3

Tegyük az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint elkészített keveréket tartalmazó palackot egy 110 oC-os szárítószekrénybe (4.3.). A (gázfejlődésnek tulajdonítható) nyomás kialakulásának megelőzése és a robbanás elkerülése érdekében az első órában helyezzük a csavaros fedelet az edény nyílására. Ne zárjuk le az edényt a fedővel. Egy óra elteltével zárjuk le az edényt a fedővel, és hagyjuk a szárítószekrényben (4.3.) 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, vegyük ki az edényt a szárítószekrényből, óvatosan nyissuk fel a palack fedelét, és tegyük a palackot jeges vízfürdőbe. Hagyjuk lehűlni.

▼B

A pH beállításához alkalmazott eljárástól függően (5.3.3.) a palack tartalmát teljes egészében vigyük át egy 250 ml-es főzőpohárba vagy egy 250 ml-es gömblombikba citrát-puffer segítségével (3.24.).

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.3. A pH beállítása

Az aminosav-analizátor (4.9.) nátriummal szembeni tűrőképességétől függően az 5.3.3.1. vagy az 5.3.3.2. pont szerint végezzük el a pH beállítását.

5.3.3.1. Alacsony nátriumkoncentrációt igénylő kromatográfiás rendszerek (4.9.) esetén:

Tanácsos belső standard törzsoldatot (3.27.3.) használni alacsony nátriumkoncentrációt igénylő aminosav-analizátorok alkalmazása esetén (amikor a sav térfogatát csökkenteni kell).

Ebben az esetben bepárlás előtt adjunk 2,00 ml belső standard törzsoldatot (3.27.3.) a hidrolizátumhoz.

Adjunk 2 csepp 1-oktanolt (3.15.) az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint nyert hidrolizátumhoz.

Rotációs bepárló segítségével (4.7.) csökkentsük a térfogatot 5–10 ml-re vákuum alatt, 40 oC-on. Ha a térfogat véletlenül 5 ml alá csökken, akkor a hidrolizátumot ki kell önteni, és az analízist újra kell kezdeni.

Nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.) állítsuk be a pH-t 2,20 -re, és az 5.3.4. ponttal folytassuk a műveletet.

5.3.3.2. Minden más típusú aminosav-analizátor (4.9.) esetén:

Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint kapott hidrolizátumokat részlegesen semlegesítsük úgy, hogy keverés közben óvatosan hozzáadunk 17 ml nátrium-hidroxid-oldatot (3.17.), mialatt a hőmérsékletet 40 oC alatt tartjuk.

Szobahőmérsékleten állítsuk be a pH-t 2,20 -re a 3.17. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal és végül a 3.18. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal. Folytassuk a műveletet az 5.3.4. pont szerint.

5.3.4. Mintaoldat a kromatográfiához

A beállított pH-jú hidrolizátumot (5.3.3.1. vagy 5.3.3.2.) maradék nélkül, citrát-pufferrel vigyük át egy 200 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig a pufferrel (3.24.).

Ha még nem használtunk belső standardot, adjunk hozzá 2,00 ml belső standardot (3.27.3.), és töltsük fel jelig citrát-pufferrel (3.24.). Keverjük össze alaposan.

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával (5.4.).

Ha a mintaoldatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, 5 oC alatt kell őket tárolni.

5.4. Kromatográfia

Kromatográfiás vizsgálat előtt a kivonatot (5.2.) vagy a hidrolizátumot (5.3.4.) állítsuk be szobahőmérsékletre. Rázzuk fel a keveréket, és szűrjünk át megfelelő mennyiséget egy 0,2 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kapott tiszta oldatot vessük alá ioncserés kromatográfiának aminosav-analizátor segítségével (4.9.).

Az injektálást lehet kézzel vagy automatikusan végezni. Ügyeljünk arra, hogy – ± 0,5 %-os eltéréssel – azonos mennyiségű oldatot tegyünk az oszlopra a standardok és minták analíziséhez, kivéve, amikor belső standardot használunk, valamint, hogy a nátrium-aminosav arányok, amennyire csak lehet, megegyezzenek a standardban és a mintában.

A kalibrálás gyakorisága általában a ninhidrin reagens és az analitikai rendszer stabilitásától függ. A standardot vagy a mintát citrát-pufferrel (3.24.) hígítjuk annak érdekében, hogy a standard csúcsterülete a minta aminosav csúcsterületének 30–200 %-a legyen.

Az aminosavak kromatográfiás vizsgálata az alkalmazott analizátor és a használt gyanta típusától függően némiképp eltérhet. A választott rendszernek képesnek kell lennie arra, hogy az aminosavakat elválassza egymástól és a ninhidrin-pozitív anyagoktól. A működési tartományban a kromatográfiás rendszer reakciójának egyenesen arányosnak kell lennie a kolonnára felvitt aminosavak mennyiségével.

A kromatográfiás lépésnél az alábbiakban említett csúcs-mélyponti arányt alkalmazzuk, amikor (a meghatározandó aminosavak vonatkozásában) ekvimoláris oldatot analizálunk. Az ekvimoláris oldatnak az aminosav-analizátor rendszerrel (4.9.). pontosan mérhető aminosavak maximális mennyiségének legalább 30 %-át tartalmaznia kell.

A treonin-szerin szétválasztásánál a kromatogramon a két egymást átfedő aminosav közül a kisebb csúcs-mélyponti aránya ne haladja meg a 2:10 értéket (ha csak cisztein, metionin, treonin és lizin meghatározásáról van szó, a szomszédos csúcsok nem megfelelő elválása hátrányosan befolyásolja a meghatározást). Minden más aminosav esetében a szétválasztásnak jobbnak kell lennie, mint 1:10.

A rendszernek el kell tudnia választani a lizint a „mesterséges lizin képződményektől” és az ornitintől.

6. Az eredmények kiszámítása

Minden aminosavra megmérjük a minta és a standard csúcsterületét, és kiszámítjuk a minta egy kg-jában lévő aminosav g-ban kifejezett mennyiségét (X).

Ha belső standardot használunk, szorozzuk meg

-vel.

A = a hidrolizátum vagy a kivonat csúcsterülete

B = a kalibráló standardoldat csúcsterülete

C = a hidrolizátumban vagy a kivonatban lévő belső standard csúcsterülete

D = a belső standard, kalibráló standardoldat csúcsterülete

M = a meghatározandó aminosav móltömege

c = a standard koncentrációja μmól/l-ben

m = a minta tömege (g) (ha szárított vagy zsírtalanított, akkor az eredeti tömegre korrigálva)

V = ml összes hidrolizátum (5.3.4.) vagy ml kivonat (6.1.) számított teljes hígítási térfogata

Mind a cisztin, mind a cisztein mint cisztein-sav kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de cisztinként kerül kiszámításra (C6H12N2O4S2, MW 240,30 g/mól), ha MW 120,15 g/mólt (= 0,5 × 240,30 g/mól) használunk.

A metionin metionin-szulfonként kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de metioninként kerül kiszámításra a metionin molekulatömegének (MW = 149,21 g/mol) használatával.

A hozzáadott szabad metionin extrahálás után metioninként kerül meghatározásra, és a számításhoz ugyanezt a molekulatömeget (M) használjuk.

6.1. A szabad aminosavak (5.2.) meghatározása esetén a kivonatok teljes hígítási térfogatát (F) a következőképpen számítjuk ki:

V = a végső kivonat térfogata

7. A módszer értékelése

A módszert nemzetközi összehasonlító vizsgálat során ellenőrizték, amelyet 1990-ben végeztek négy különböző takarmány (kevert sertéstáp, brojlertápkeverék, fehérjekoncentrátum, előkeverék) felhasználásával. A szélsőértékek kizárásával kapott átlagértékeket és standard szórásokat az ebben a pontban található táblázatok mutatják be:







Átlagértékek g/kg-ban Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 N = 17 9,55 n = 13 Brojlertápkeverék 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 N = 18 13,93 n = 16 Fehérjekoncentrátum 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 N = 17 47,74 n = 15 Előkeverék 58,42 n = 16 — 90,21 N = 16 98,03 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

7.1. Ismételhetőség

A fent említett összehasonlító vizsgálat ismételhetőségét „laboratóriumon belüli szórásként” kifejezve az alábbi táblázatok mutatják:







Laboratóriumon belüli szórás (Sr) g/kg Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Brojlertápkeverék 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Fehérjekoncentrátum 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Előkeverék 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma







A laboratóriumon belüli szórás (Sr) relatív szórása ( %) Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Brojlertápkeverék 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Fehérjekoncentrátum 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Előkeverék 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

7.2. Reprodukálhatóság

A fent említett összehasonlító vizsgálatra vonatkozóan, a különböző laboratóriumok közötti szórásértékeket az alábbi táblázat adja meg:







Laboratóriumon belüli szórás (SR) g/kg Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Brojlertápkeverék 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Fehérjekoncentrátum 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Előkeverék 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma







A laboratóriumon belüli szórás (SR) relatív szórása ( %) Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Brojlertápkeverék 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Fehérjekoncentrátum 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Előkeverék 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

8. Referenciaanyagok használata

A módszer helyes alkalmazását lehetőség szerint hitelesített referenciaanyagokon végzett ismételt mérésekkel kell ellenőrizni. Hitelesített aminosav-kalibrálóoldattal végzett kalibrálás javasolt.

9. Észrevételek

9.1. Az aminosav-analizátorok közötti különbségek miatt a standard aminosavak (lásd 3.27.4. és 3.27.5.) és a hidrolizátumok (lásd 5.3.4.) kalibrálóoldatainak végső koncentrációit irányadónak kell tekinteni.

A berendezés lineáris reakciójának tartományát valamennyi aminosavra ellenőrizni kell.

A standardoldatot citrát-pufferrel hígítjuk, hogy a csúcsterületek a tartomány közepére essenek.

9.2. Amennyiben nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás berendezést használunk a hidrolizátumok elemzéséhez, a gyártó ajánlásainak megfelelően kell a kísérleti körülményeket optimalizálni.

9.3. Ha 1 %-nál több kloridot tartalmazó takarmányokra (koncentrátum, ásványi takarmányok, kiegészítő takarmányok) alkalmazzuk a módszert, előfordulhat a metionin alulértékelése, és ezért speciális kezelést kell végezni.

G. A TRIPTOFÁN MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

A módszer a takarmányokban található összes és a szabad triptofán meghatározására szolgál. Nem különbözteti meg a D- és az L-formákat.

2. Vizsgálati alapelv

Az összes triptofán meghatározásához a mintát alkalikus körülmények között, telített bárium-hidroxid-oldattal hidrolizáljuk, majd 110 oC-ra hevítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 20 órán át. Hidrolízis után belső standardot adunk hozzá.

A szabad triptofán meghatározásához a mintát enyhén savas körülmények között extraháljuk belső standard jelenlétében.

A hidrolizátumban vagy a kivonatban található triptofánt és a belső standardot HPLC-módszerrel, fluoreszcens detektálással határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. Bideszt vagy azzal egyenértékű minőségű vizet kell használni (konduktivitás < 10 μS/cm).

3.2. Standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %).

3.3. Belső standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított α-metil-triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %).

3.4. Bárium-hidroxid oktahidrát (BaCO3 képződésének elkerülése érdekében ügyelnünk kell arra, hogy a Ba(OH)2 .0,8 H2O-t ne tegyük ki túlzott mértékben levegő hatásának, mert ez zavarhatja a meghatározást) (lásd az Észrevételek 9.3. pontját).

3.5. Nátrium-hidroxid.

3.6. Ortofoszforsav, w (w/w) = 85 %.

3.7. Sósav, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Metil-alkohol, HPLC minőségű.

3.9. Petroléter, forráspont-tartomány: 40–60 oC.

3.10. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 1 mól/l:

Oldjunk fel 40,0 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

3.11. Sósav, c = 6 mól/l:

Vegyünk 492 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.12. Sósav, c = 1 mól/l:

Vegyünk 82 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.13. Sósav, c = 0,1 mól/l:

Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.14. Ortofoszforsav, c = 0,5 mól/l:

Vegyünk 34 ml ortofoszforsavat (3.6.), és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

3.15. Triptofán (3.2.) koncentrált oldata, c = 2,50 μmol/ml:

Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2553 g triptofánt (3.2.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

3.16. Koncentrált belső standardoldat, c = 2,50 μmol/ml:

Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2728 g α-metil-triptofánt (3.3.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

3.17. A triptofán kalibráló standardoldata és a belső standard:

Vegyünk 2,00 ml-t a triptofán koncentrált oldatából (3.15.) és 2,00 ml-t a koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatból (3.16.). Oldjuk fel vízben (3.1.) és metil-alkoholban (3.8.) a kész hidrolizátuméval körülbelül azonos térfogatra és körülbelül azonos metil-alkohol koncentrációra (10–30 %).

Az oldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.

Készítés során közvetlen napfényhatástól óvjuk.

3.18. Ecetsav

3.19. 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol.

3.20. Etanolamin w (w/w) > 98 %

3.21. 1 g 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) 100 ml metil-alkoholban készített oldata (3.8.).

3.22. Mozgófázis a HPLC-hez: 3,00 g ecetsav (3.18.) + 900 ml víz (3.1.) +1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) metil-alkoholban (3.8.) készített oldatának (3.21.) 50,0 ml-e (1 g/100 ml). A pH-t állítsuk 5,00 -re etanolaminnal (3.20.). Az oldatot vízzel (3.1.) töltsük fel 1 000 ml-re.

4. Eszközök

4.1. HPLC-berendezés spektrofluorometriás detektorral

4.2. Folyadékkromatográfiás oszlop, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm töltet, vagy azzal egyenértékű oszlop

4.3. pH-mérő

4.4. Polipropilén lombik, 125 ml térfogatú, széles nyakkal és csavaros zárókupakkal

4.5. 0,45 μm-es membránszűrő

4.6. Autokláv, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar

4.7. Mechanikus vagy mágneses keverőberendezés

4.8. Kémcsőkeverő (vortex).

5. A vizsgálat módja

5.1. A minták elkészítése

Őröljük meg a mintát annyira, hogy az átjusson egy 0,5 mm-es szemméretű szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.9.) extrahálni kell.

5.2. A szabad triptofán (kivonat) meghatározása

1 mg-os pontossággal mérjünk be az elkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) egy Erlenmeyer-lombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml sósavat, k = 0,1 mól/l (3.13.) és 5,00 ml koncentrált belső standardoldatot (3.16.). Rázzuk vagy keverjük 60 percen át mechanikus rázógépen vagy mágneses keverőn (4.7.). Engedjük a zagyot leülepedni, majd pipettázzunk a felülúszó oldatból 10,0 ml-t főzőpohárba. Adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Nátrium-hidroxiddal (3.10.) állítsuk a pH-t 3,0 -ra. Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt (3.8.), hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (körülbelül a kalibráló standardoldat (3.17.) térfogatával megegyező térfogatra).

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a kivonatokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 oC-on legfeljebb három napig tárolhatók.

5.3. Az összes triptofán (hidrolizátum) meghatározása

Az elkészített mintából (5.1.) mérjünk be 0,2 mg-os pontossággal 0,1 –1 g-ot a polipropilén lombikba (4.4.). A kimért mintamennyiség nitrogéntartalmának kb. 10 mg-nak kell lennie. Adjunk hozzá 8,4 g bárium-hidroxid-oktahidrátot (3.4.) és 10 ml vizet. Keverjük össze kémcsőkeverővel (4.8.) vagy mágneses keverőn (4.7.). A teflonbevonatú mágnest hagyjuk a keverékben. Mossuk le 4 ml vízzel az edény falát. Helyezzük rá a csavaros zárókupakot, és lazán zárjuk le a lombikot. Helyezzük autoklávba (4.6.) forró vízzel, és gőzöljük 30–60 percig. Zárjuk be az autoklávot, és autoklávozzuk 110 (±2) oC hőmérsékleten 20 órán át.

Az autokláv kinyitása előtt csökkentsük a hőmérsékletet kevéssel 100 oC alá. A Ba(OH)2 .0,8 H2O kikristályosodásának elkerülése érdekében adjunk a meleg keverékhez 30 ml, szobahőmérsékletű vizet. Óvatosan rázzuk vagy keverjük össze. Adjunk hozzá 2,00 ml koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatot (3.16.). Hűtsük az edényeket víz- vagy jégfürdőben 15 percen át.

Ezután adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Tartsuk az edényt a hűtőfürdőben, és keverés közben semlegesítsük az oldatot sósavval (3.11.), majd állítsuk a pH-t 3,0 -ra sósavval (3.12.). Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt, hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (például 100 ml-re). Ügyeljünk, hogy a metil-alkohol hozzáadása ne okozzon kicsapódást.

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a hidrolizátumokat nem lehet a készítés napján analizálni, a