2009R0152 — HU — 18.04.2012 — 001.001

Ez a dokumentum kizárólag tájékoztató jellegű, az intézmények semmiféle felelősséget nem vállalnak a tartalmáért

►B A BIZOTTSÁG 152/2009/EK RENDELETE (2009. január 27.) a takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszerek megállapításáról (EGT-vonatkozású szöveg) (HL L 054, 26.2.2009, p.1)

Módosította:









▼B

A BIZOTTSÁG 152/2009/EK RENDELETE

(2009. január 27.)

a takarmányok hatósági ellenőrzése során alkalmazott mintavételi és vizsgálati módszerek megállapításáról

(EGT-vonatkozású szöveg)







AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA, tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre, tekintettel a takarmány- és élelmiszerjog, valamint az állat-egészségügyi és az állatok kíméletére vonatkozó szabályok követelményeinek történő megfelelés ellenőrzésének biztosítása céljából végrehajtott hatósági ellenőrzésekről szóló, 2004. április 29-i 882/2004/EK európai parlamenti és tanácsi rendeletre ( 1 ) és különösen annak 11. cikke (4) bekezdésének a), b) és c) pontjára, mivel: (1) A 70/373/EGK irányelv végrehajtása céljából a következő jogi aktusokat fogadták el, és ezek a 882/2004/EK rendelet 61. cikkének (2) bekezdése értelmében hatályban maradnak: — a Bizottság 1971. június 15-i 71/250/EGK első irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 2 ), — a Bizottság 1971. november 18-i 71/393/EGK második irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 3 ), — a Bizottság 1972. április 27-i 72/199/EGK harmadik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 4 ), — a Bizottság 1972. december 5-i 73/46/EGK negyedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 5 ), — a Bizottság 1976. március 1-jei 76/371/EGK első irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi mintavételi módszerek meghatározásáról ( 6 ), — a Bizottság 1976. március 1-jei 76/372/EGK hetedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 7 ), — a Bizottság 1978. június 15-i 78/633/EGK nyolcadik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 8 ), — a Bizottság 1981. július 31-i 81/715/EGK kilencedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 9 ), — a Bizottság 1984. július 25-i 84/425/EGK tizedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 10 ), — a Bizottság 1986. április 9-i 86/174/EGK irányelve a baromfitakarmány energiaértékére vonatkozó számítási módszer meghatározásáról ( 11 ), — a Bizottság 1993. július 28-i 93/70/EGK tizenegyedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 12 ), — a Bizottság 1993. december 17-i 93/117/EK tizenkettedik irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról ( 13 ), — a Bizottság 1998. szeptember 3-i 98/64/EK irányelve a takarmányokban lévő aminosavak, nyersolajok és zsírok, valamint az olaquindox meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszerek létrehozásáról és a 71/393/EGK irányelv módosításáról ( 14 ), — a Bizottság 1999. április 20-i 1999/27/EK irányelve a takarmányokban lévő amprólium, diklazuril és karbadox meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszerek meghatározásáról, a 71/250/EGK és 73/46/EGK irányelvek módosításáról, valamint a 74/203/EGK irányelv hatályon kívül helyezéséről ( 15 ), — a Bizottság 1999. július 23-i 1999/76/EK irányelve a takarmányokban lévő lazalocid-nátrium meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszer létrehozásáról ( 16 ), — a Bizottság 2000. július 6-i 2000/45/EK irányelve a takarmányokban található A-vitamin, E-vitamin és triptofán meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszerek létrehozásáról ( 17 ), — a Bizottság 2002. július 26-i 2002/70/EK irányelve a takarmányok dioxin- és dioxinjellegű-PCB-tartalmának meghatározására vonatkozó követelmények megállapításáról ( 18 ), — a Bizottság 2003. december 23-i 2003/126/EK irányelve a takarmányok hatósági ellenőrzése során, az állati eredetű alkotóelemek meghatározására szolgáló analitikai módszer meghatározásáról ( 19 ). (2) Tekintettel arra, hogy a 70/373/EGK irányelvet felváltotta a 882/2004/EK rendelet, helyénvaló az említett irányelvet végrehajtó jogi aktusokat egyetlen rendelettel felváltani. Ugyanakkor a módszereket a tudományos és műszaki ismeretek alakulására figyelemmel ki kell igazítani. El kell hagyni az elérni kívánt cél vonatkozásában a továbbiakban már nem érvényes módszereket. A takarmányok előállítási, tárolási, szállítási és forgalmazási módja terén a közelmúltban bekövetkezett fejlődés figyelembevétele érdekében tervbe van véve a mintavételre vonatkozó rendelkezések megfelelő időben történő módosítása, mindazonáltal jelenleg a mintavételre vonatkozó meglévő rendelkezések fenntartása a helyénvaló. (3) Ezért a 71/250/EGK, a 71/393/EGK, a 72/199/EGK, a 73/46/EGK, a 76/371/EGK, a 76/372/EGK, a 78/633/EGK, a 81/715/EGK, a 84/425/EGK, a 86/174/EGK, a 93/70/EGK, a 93/117/EK, a 98/64/EK, az 1999/27/EK, az 1999/76/EK, a 2000/45/EK, a 2002/70/EK és a 2003/126/EK irányelvet hatályon kívül kell helyezni. (4) Az e rendeletben előírt intézkedések összhangban vannak az Élelmiszerlánc- és Állat-egészségügyi Állandó Bizottság véleményével, mivel: ELFOGADTA EZT A RENDELETET:







1. cikk

A mikroorganizmusok és a peszticidmaradványok kivételével a takarmány-összetevők, az adalékanyagok és a nemkívánatos anyagok, illetve termékek meghatározása tekintetében végzett, a takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló mintavételezést az I. mellékletben előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

2. cikk

Az analitikai vizsgálat céljára szolgáló minták előkészítését és az eredmények megadását a II. mellékletben előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

3. cikk

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló analitikai vizsgálatokat a III. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmány-alapanyagok és összetett takarmányok összetételének ellenőrzésére), a IV. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő engedélyezett adalékanyagok szintjének ellenőrzésére), az V. mellékletben (Analitikai módszerek a takarmányokban lévő nemkívánatos anyagok ellenőrzésére) és a VI. mellékletben (A takarmányok hatósági ellenőrzése során az állati eredetű alkotóelemek meghatározására szolgáló analitikai módszerek) előírt módszerek szerint kell végrehajtani.

4. cikk

Az összetett baromfitakarmány energiaértékét a VII. mellékletnek megfelelően kell kiszámítani.

5. cikk

Megerősítés céljából a VIII. mellékletben a már nem engedélyezett adalékanyagok takarmányokban való illegális jelenlétének ellenőrzésére előírt analitikai módszereket kell használni.

6. cikk

A 71/250/EGK, a 71/393/EGK, a 72/199/EGK, a 73/46/EGK, a 76/371/EGK, a 76/372/EGK, a 78/633/EGK, a 81/715/EGK, a 84/425/EGK, a 86/174/EGK, a 93/70/EGK, a 93/117/EK, a 98/64/EK, az 1999/27/EK, az 1999/76/EK, a 2000/45/EK, a 2002/70/EK és a 2003/126/EK irányelv hatályát veszti.

A hatályon kívül helyezett irányelvekre történő hivatkozásokat az e rendeletre történő hivatkozásoknak kell tekinteni, és a IX. mellékletben található megfelelési táblázatokkal összhangban kell értelmezni.

7. cikk

Ez a rendelet az Európai Unió Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő huszadik napon lép hatályba.

Ezt a rendeletet 2009. augusztus 26-tól kell alkalmazni.

Ez a rendelet teljes egészében kötelező és közvetlenül alkalmazandó valamennyi tagállamban.









I. MELLÉKLET

MINTAVÉTELI MÓDSZEREK

1. CÉL ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLET

A takarmányok hatósági ellenőrzésére szolgáló mintavételezést az alábbiakban leírt módszerek szerint kell elvégezni. Az így nyert mintákat a mintavételi tételek reprezentatív részének kell tekinteni.

2. A MINTAVÉTELT VÉGZŐ SZEMÉLYZET

A mintavételezést a tagállamok által erre a feladatra felhatalmazott személyek végzik.

3. FOGALOMMEGHATÁROZÁSOK

Mintavételi tétel: egy egységet képező, vélelmezetten egységes tulajdonságokkal rendelkező termékmennyiség.

Elemi minta: a mintavételi tétel egy pontjából vett mennyiség.

Átlagolt minta: ugyanazon mintavételi tételből vett elemi minták összessége.

Redukált minta: az átlagolt minta reprezentatív része, amelyet osztási folyamattal nyernek az átlagolt mintából.

Végső minta: a redukált minta vagy a homogenizált átlagolt minta egy része.

4. ESZKÖZÖK

4.1. A mintavételi eszközöket olyan anyagokból kell készíteni, amelyek nem szennyezhetik a mintavételre kerülő termékeket. Ezen eszközök tekintetében a tagállamok hatósági engedélyezést írhatnak elő.

4.2. Szilárd takarmányok mintavételére ajánlott eszközök

4.2.1. Kézi mintavétel

4.2.1.1. Lapos fenekű, függőleges oldalú lapát.

4.2.1.2. Nyílással vagy rekeszekkel rendelkező mintavételi szúrcsap. A mintavételi szúrcsap méretének összhangban kell lennie a mintavételi tétel jellemzőivel (a tartály mélysége, a göngyöleg nagysága stb.), valamint a takarmány részecskeméretével.

4.2.2. Gépi mintavétel

Mozgásban lévő takarmányok mintavételére engedélyezett gépi eszközök használhatók.

4.2.3. Mintaosztó

A minta megközelítően egyenlő részekre való felosztására tervezett eszköz, amely elemi minták vételére, valamint redukált és végső minták elkészítésére is használható.

5. MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEK







5.A. A takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzésére vonatkozóan 5.A.1. Mintavételi tétel A mintavételi tételnek akkorának kell lennie, hogy minden egyes alkotórészéből mintát lehessen venni. 5.A.2. Elemi minták 5.A.2.1. Ömlesztett takarmány: Az elemi minták minimális száma: 5.A.2.1.1. 2,5 tonnát meg nem haladó mintavételi tételek hét 5.A.2.1.2. 2,5 tonnát meghaladó mintavételi tételek √ a mintavételi tételt (1) kitevő tonnák számának húszszorosa, de legfeljebb 40 elemi minta 5.A.2.2. Kiszerelt takarmány: Mintavételre kerülő töltött göngyölegek minimális száma (2): 5.A.2.2.1. Egy kg-nál nagyobb tömegű csomagok esetében: 5.A.2.2.1.1. 1–4 csomagból álló mintavételi tételek minden csomag 5.A.2.2.1.2. 5–16 csomagból álló mintavételi tételek 4 5.A.2.2.1.3. 16-nál több csomagból álló mintavételi tételek √ a mintavételi tételt (1) alkotó csomagok száma, de legfeljebb 20 csomag 5.A.2.2.2. Legfeljebb egy kg-os csomagok esetében 4 5.A.2.3. Folyékony vagy félfolyékony takarmányok: Mintavételre szánt tartályok minimális száma (2): 5.A.2.3.1. Egy liternél nagyobb tartályok esetében: 5.A.2.3.1.1. 1–4 tartályból álló mintavételi tételek minden tartály 5.A.2.3.1.2. 5–16 tartályból álló mintavételi tételek 4 5.A.2.3.1.3. 16-nál több tartályból álló mintavételi tételek √ a mintavételi tételt (1) alkotó tartályok száma, de legfeljebb 20 tartály 5.A.2.3.2. Legfeljebb egyliteres tartályok esetében: 4 5.A.2.4. Takarmánytömbök és nyalósók Mintavételre szánt tömbök és blokkok minimális száma (2): 25 egységből álló mintavételi tételenként egy tömb vagy blokk, de legfeljebb 4 tömb vagy blokk 5.A.3. Átlagolt minta Mintavételi tételenként egy átlagolt minta szükséges. Az átlagolt mintát alkotó elemi minták összmennyisége nem lehet kevesebb a következőknél: 5.A.3.1. Ömlesztett takarmány 4 kg 5.A.3.2. Kiszerelt takarmány: 5.A.3.2.1. egy kg-nál nagyobb tömegű csomagok esetében: 4 kg 5.A.3.2.2. legfeljebb egy kg-os csomagok esetében 4 eredeti csomag tartalmának a tömege 5.A.3.3. Folyékony vagy félfolyékony takarmányok: 5.A.3.3.1. egy liternél nagyobb tartályok esetében 4 liter 5.A.3.3.2. legfeljebb egyliteres tartályok esetében 4 eredeti tartály tartalmának térfogata 5.A.3.4. Takarmánytömbök vagy nyalósók: 5.A.3.4.1. egy kg-nál nagyobb egyedi tömeg esetén 4 kg 5.A.3.4.2. legfeljebb egy kg-os egyedi tömeg esetén 4 eredeti tömb vagy blokk tömege 5.A.4. Végső minták Szükség esetén az átlagolt minta csökkentésével kapjuk meg a végső mintákat. Legalább egy végső minta elemzése szükséges. Az analizálásra szolgáló végső minta nem lehet kisebb a következőknél: Szilárd takarmányok 500 g Folyékony vagy félfolyékony takarmányok 500 ml 5.B. A takarmányban feltételezhetően egyenetlenül eloszló nemkívánatos anyagok, illetve termékek, mint pl. az aflatoxinok, az anyarozs, a ricinus és a kenderfélék ellenőrzésére vonatkozóan a takarmány-alapanyagokban (3) 5.B.1. Mintavételi tétel: lásd az 5.A.1. pontot 5.B.2. Elemi minták 5.B.2.1. Ömlesztett takarmányok: lásd az 5.A.2.1. pontot 5.B.2.2. Kiszerelt takarmányok: Mintavételre szánt csomagok minimális száma: 5.B.2.2.1. 1–4 csomagból álló mintavételi tételek minden csomag 5.B.2.2.2. 5–16 csomagból álló mintavételi tételek 4 5.B.2.2.3. 16-nál több csomagból álló mintavételi tételek √ a mintavételi tételt (1) kitevő csomagok száma, legfeljebb 40 csomag 5.B.3. Átlagolt minták Az átlagolt minták száma a mintavételi tétel méretének megfelelően változik. Az alábbiakban megadásra kerül a mintavételi tételenkénti átlagolt minták minimális száma. Az átlagolt mintát alkotó elemi minták teljes tömege nem lehet kevesebb 4 kg-nál. 5.B.3.1. Ömlesztett takarmány A mintavételi tétel tömege tonnában: Az átlagolt minták minimális száma mintavételi tételenként: legfeljebb 1 1 1-nél több, de legfeljebb 10 2 10-nél több, de legfeljebb 40 3 40-nél több 4 5.B.3.2. Kiszerelt takarmányok: A mintavételi tétel mérete csomagok számában megadva: Az átlagolt minták minimális száma mintavételi tételenként: 1–16 1 17–200 2 201–800 3 800-nál több 4 5.B.4. Végső minták Az egyes átlagolt minták osztásával kapjuk meg a végső mintákat. Átlagolt mintánként legalább egy végső minta elemzése szükséges. Az analizálásra szolgáló végső minta tömege nem lehet kisebb 500 g-nál. (1) Amennyiben az eredmény törtszám, fel kell kerekíteni a legközelebbi egész számra. (2) Az 1 kg-ot vagy 1 litert meg nem haladó csomagok vagy tartályok vagy az egyenként legfeljebb 1 kg tömegű blokkok vagy tömbök esetében az elemi minta egy eredeti csomag vagy tartály tartalma, egy blokk vagy egy tömb. (3) Az 5.A. pontban megadott módszerek szolgálnak a teljes és kiegészítő takarmányokban az aflatoxinok, anyarozs, ricinus és a kenderfélék ellenőrzésére.

6. A MINTAVÉTELRE, A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSÉRE ÉS CSOMAGOLÁSÁRA VONATKOZÓ UTASÍTÁSOK

6.1. Általános szabályok

A mintákat a lehető leggyorsabban kell vételezni és előkészíteni, mindvégig ügyelve a szükséges óvintézkedések betartására, amelyek biztosítják azt, hogy a termék ne változzon meg, illetve ne szennyeződjön. A mintákkal közvetlenül érintkező eszközök, felületek és tartályok tiszták és szárazak legyenek.

6.2. Elemi minták

6.2.A. A takarmányban egyenletesen eloszló anyagok és termékek ellenőrzésére vonatkozóan

A teljes mintavételi tételből véletlenszerűen, körülbelül egyforma nagyságú elemi mintákat kell venni.

6.2.A.1. Ömlesztett takarmány

A mintavételi tételt képzeletben több, megközelítően egyenlő részre kell felosztani. Az elemi minták számáról rendelkező 5.A.2. pontban meghatározott számú részt véletlenszerűen ki kell választani, és minden egyes részből legalább egy mintát kell venni.

Adott esetben, a mintavételi tétel mozgatása közben (berakodáskor, illetve kirakodáskor) is végre lehet hajtani a mintavételt.

6.2.A.2. Kiszerelt takarmány

Miután a mintavétel elvégzésére az 5.A.2. pont szerint kiválasztottuk az előírt számú csomagot, minden csomag tartalmának egy részét szúrcsap vagy lapát segítségével ki kell venni. Ha szükséges, a csomagok egyenkénti kiürítése után is lehet mintákat venni. Az esetlegesen előforduló csomókat össze kell törni az egyes átlagolt mintákban külön-külön (ha kell, ki is lehet venni a csomókat, majd porlasztás után visszatenni a mintába).

6.2.A.3. Homogén vagy homogenizálható folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5.A.2. pont szerint kiválasztottuk az előírt számú tartályt, a tartályok tartalmát szükség esetén homogenizálni kell, és minden egyes tartályból ki kell venni egy bizonyos mennyiséget.

Az elemi mintákat a tartályok kiürítésekor is lehet vételezni.

6.2.A.4. Nem homogenizálható, folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Miután a mintavétel elvégzésére az 5.A.2. pont szerint kiválasztottuk az előírt számú tartályt, mintákat kell venni a különböző rétegekből.

A tartályok tartalmának kiürítésekor is lehet mintákat venni, ám ebben az esetben az első frakciókat el kell önteni.

A minta összesített űrtartalmának mindkét esetben legalább 10 liternek kell lennie.

6.2.A.5. Takarmánytömbök és nyalósók

Miután a mintavétel elvégzésére az 5.A.2. pont szerint kiválasztottuk a kívánt számú blokkot vagy tömböt, minden blokk vagy tömb egy részét kell venni.

6.2.B. A takarmányokban feltételezhetően egyenetlenül eloszló nemkívánatos anyagok, illetve termékek, mint pl. az aflatoxinok, az anyarozs, a ricinus és a kenderfélék ellenőrzésére vonatkozóan a takarmány-alapanyagokban

A mintavételi tételt az átlagolt mintákról szóló 5.B.3. pontban meghatározott számnak megfelelően több, megközelítően egyenlő részre kell felosztani. Amennyiben ez a szám nagyobb egynél, az 5.B.2. pontban meghatározott elemi minták összes számát megközelítőleg egyenlően kell elosztani a különböző részeken. Ezután körülbelül egyenlő nagyságú mintákat kell venni ( 20 ) oly módon, hogy az egyes részekből vett minták összmennyisége ne legyen kevesebb az egyes átlagolt mintákra nézve előírt minimális 4 kg-nál. A különböző részekből vett elemi mintákat nem kell összesíteni.

6.3. Átlagolt minták elkészítése

6.3.A. A takarmányokban egyenletesen eloszló anyagok, illetve termékek ellenőrzésére vonatkozóan

Az elemi minták összekeverésével kapunk egységes átlagolt mintát.

6.3.B. A takarmányokban feltételezhetően egyenetlenül eloszló nemkívánatos anyagok, illetve termékek, mint pl. az aflatoxinok, az anyarozs, a ricinus és a kenderfélék ellenőrzésére vonatkozóan a takarmány-alapanyagokban

A mintavételi tétel egyes részeiből vett elemi mintákat össze kell keverni, majd el kell készíteni az 5.B.3. pontban meghatározott számú mintát, ügyelve arra, hogy minden egyes átlagolt minta eredete feljegyzésre kerüljön.

6.4. Végső minták elkészítése

Minden egyes átlagolt minta anyagát óvatosan össze kell keverni, hogy homogenizált mintát kapjunk ( 21 ). Ha szükséges, az átlagolt mintát mechanikus vagy automatikus osztó, illetve a negyedelő módszer segítségével le kell csökkenteni minimum 2 kg-ra vagy 2 literre (redukált minta).

Ezt követően legalább három, megközelítőleg azonos mennyiségű, az 5.A.4. vagy 5.B.4. pont mennyiségi követelményeihez igazodó végső mintát kell elkészíteni. Minden egyes vizsgálati mintát egy, a célnak megfelelő külön tartályba kell tenni. Minden szükséges óvintézkedést meg kell tenni a minta összetételének a szállítás vagy tárolás során előforduló esetleges megváltozásának, illetve a minta beszennyeződésének vagy meghamisításának elkerülése érdekében.

6.5. Végső minták csomagolása

A tartályokat, illetve csomagokat le kell pecsételni és címkével kell ellátni – a pecsétnek magában kell foglalnia a teljes címkét – oly módon, hogy a pecsét felsértése nélkül ne lehessen kinyitni azokat.

7. MINTAVÉTELI JEGYZŐKÖNYV

Minden egyes mintavételről jegyzőkönyvet kell vezetni, amely lehetővé teszi az egyes mintavételi tételek egyértelmű azonosítását.

8. A MINTÁK CÉLÁLLOMÁSA

Minden egyes átlagolt minta esetében legalább egy végső mintát késedelem nélkül el kell küldeni az erre kijelölt vizsgálati laboratóriumba, a vegyelemző számára szükséges információkkal együtt.









II. MELLÉKLET

A TAKARMÁNYANALITIKAI MÓDSZEREKRE VONATKOZÓ ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK

A. MINTÁK ANALITIKAI VIZSGÁLATRA TÖRTÉNŐ ELŐKÉSZÍTÉSE

1. Cél

Az alábbiakban leírt vizsgálati módszerek az I. mellékletben megállapított rendelkezéseknek megfelelő mintavételezés után, az ellenőrző laboratóriumoknak megküldött végső minták analitikai vizsgálat céljából történő előkészítésére vonatkoznak.

A mintákat oly módon kell előkészíteni, hogy az analitikai módszerekben előírt kimért mennyiségek homogének és a végső mintákra jellemzőek legyenek.

2. Szükséges óvintézkedések

A követendő minta-előkészítési eljárás függ az alkalmazott analitikai módszertől. Ezért elsőrendű fontosságú annak biztosítása, hogy a követett minta-előkészítési eljárás megfeleljen az alkalmazott analitikai módszernek.

Minden szükséges műveletet oly módon kell elvégezni, hogy minimális legyen a minta beszennyeződésének és összetétele megváltozásának lehetősége.

Az őrlést, keverést és rostálást a lehető leggyorsabban kell végrehajtani, hogy a minta a lehető legrövidebb ideig érintkezzen a levegővel és a fénnyel. Kerülni kell az olyan daráló- és őrlőgépek használatát, amelyek a mintát érzékelhetően felmelegítik.

A különösen hőérzékeny takarmányok esetében a kézi őrlés alkalmazása javasolt. Figyelmet kell fordítani annak biztosítására is, hogy az eszköz maga ne lehessen nyomelemekkel történő szennyezés forrása.

Ha az előkészítést nem lehet a minta nedvességtartalmának jelentős megváltozása nélkül elvégezni, akkor a nedvességtartalmat az előkészítés előtt és után is meg kell határozni a III. melléklet A. részében meghatározott módszer szerint.

3. A vizsgálat módja

Megfelelő osztási módszer alkalmazásával – például váltakozó lapátolással, álló vagy forgó mintaosztóval – osszuk fel a mintát megfelelő, analitikai vizsgálat céljára és referenciaként szolgáló részmintákra. Az átlós negyedeléssel történő mintavétel nem ajánlott, mivel magas eloszlási hibát tartalmazó részmintákat eredményezhet. A referenciamintát tegyük egy megfelelően tiszta, száraz, légmentesen záródó edénybe, majd készítsük elő az analitikai vizsgálatra szolgáló részt, legalább 100 grammot, az alábbiak szerint.

3.1. Előkészítés nélkül őrölhető takarmányok

Amennyiben az analitikai módszerekben másképp nem írják elő, szükség esetén őrlés után, rostáljuk át a minta teljes mennyiségét egy 1 mm szemátmérőjű, négyzetes szemű rostán (az ISO R565 ajánlásának megfelelően). Kerüljük a túlőrlést.

Keverjük össze az átrostált mintát, és vegyük fel egy megfelelően tiszta, száraz, légmentesen záródó edénybe. Közvetlenül az analízisre szánt mennyiség kimérése előtt keverjük össze újra.

3.2. Szárítás után őrölhető takarmányok

Amennyiben az analitikai módszerekben másképp nem írják elő, a III. melléklet A. részében említett nedvességmeghatározási módszer 4.3. pontja szerint leírt előzetes szárítási eljárásnak megfelelően szárítsuk ki a mintát 8–12 %-os nedvességtartalmúra. Ezt követően a 3.1. szakaszban leírtak szerint járjunk el.

3.3. Folyékony vagy félfolyékony takarmányok

Vegyük fel a mintát egy megfelelően tiszta, száraz, légmentesen záródó edénybe. Közvetlenül az analízisre szánt mennyiség kimérése előtt alaposan keverjük össze.

3.4. Egyéb takarmányok

Azok a minták, amelyek a fent említett eljárások egyikével sem készíthetők elő, bármely egyéb, olyan eljárással kezelhetők, amelyek biztosítják, hogy az analízisre kimért mennyiségek homogének és a végső mintákra jellemzőek legyenek.

4. A minták tárolása

A mintákat olyan hőmérsékleten kell tárolni, amely nem változtatja meg az összetételüket. A vitaminok vagy fényre különösen érzékeny anyagok analízisére szánt mintákat barna üvegedényben kell tárolni.

B. AZ ANALITIKAI MÓDSZEREK SORÁN HASZNÁLT REAGENSEKRE ÉS ESZKÖZÖKRE VONATKOZÓ RENDELKEZÉSEK

1. Amennyiben az analitikai módszerekben másképp nem írják elő, minden analitikai reagensnek analitikai tisztaságúnak (a. t.) kell lennie. Nyomelem-analízis végrehajtásakor a reagensek tisztaságát vakpróbával kell ellenőrizni. Az így kapott eredmények a reagensek esetleges további tisztítását teszik szükségessé.

2. Az analitikai módszerek leírásakor említett bármely oldatkészítési, hígítási, öblítési vagy mosási művelet esetében, ahol az alkalmazott oldószer vagy hígítószer fajtáját nem tüntetik fel, vizet kell használni. Általános szabályként ioncserélt vagy desztillált vizet kell használni. Az analitikai módszerekben jelzett különleges esetekben a vizet speciális tisztítási eljárásokkal kell kezelni.

3. Az ellenőrző laboratóriumokban megtalálható alapfelszerelésre való tekintettel, az analitikai módszerek leírásakor csak a speciális vagy speciális használatot megkövetelő eszközök és készülékek kerülnek említésre. Ezeknek tisztának kell lenniük, különösen nagyon kis anyagmennyiségek meghatározása esetén.

C. AZ ANALITIKAI MÓDSZEREK ALKALMAZÁSA ÉS AZ EREDMÉNYEK KIFEJEZÉSE

1. Extrahálási eljárás

Számos módszer egy bizonyos extrahálási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő extrahálási eljárást is lehet követni, feltéve, ha az alkalmazott extrahálási eljárás hatékonysága az analizált mátrix tekintetében bizonyítottan egyenértékű a módszerben említett eljárás extrahálási hatékonyságával.

2. Tisztítási eljárás

Számos módszer egy bizonyos tisztítási eljárást határoz meg. Főszabályként a módszerben említettől eltérő tisztítási eljárást is lehet követni feltéve, ha az alkalmazott tisztítási eljárás az analizált mátrix tekintetében bizonyítottan a módszerben említett eljárással egyenértékű analitikai eredményt ad.

3. Jelentés a használt analitikai módszerről

Általában a takarmányokban található minden anyag meghatározására egyedi analitikai módszer kerül bevezetésre. Amennyiben több módszer adott, az ellenőrző laboratórium által alkalmazott konkrét módszert fel kell tüntetni az analitikai bizonylaton.

4. Meghatározások száma

Az analitikai bizonylatban közölt eredménynek, a minta elkülönített részein, kielégítő ismételhetőséggel elvégzett, legalább két meghatározásból nyert átlagértéknek kell lennie.

Nemkívánatos anyagokra végzett analízis esetében azonban, ha az első meghatározás eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák.

Valamely feltüntetett anyagra vagy összetevőre végzett analízis esetében, ha az első meghatározás eredménye igazolja a feltüntetett tartalom jelenlétét, azaz az analitikai eredmény a feltüntetett tartalom elfogadható szórási tartományába esik, nincs szükség további meghatározásokra, feltéve, hogy a megfelelő minőségügyi eljárásokat alkalmazzák.

Egyes esetekben ezt az elfogadható szórási tartományt a jogszabályok – úgymint a 79/373/EGK tanácsi irányelv ( 22 ) – határozzák meg.

5. Az analitikai eredmények jelentése

Az analitikai eredményt az analitikai módszerben meghatározott módon és megfelelő helyiérték-számmal kell kifejezni, és ha szükséges, akkor a végső minta előkészítés előtti nedvességtartalmára kell korrigálni.

6. Mérési bizonytalanság és visszanyerési arány nemkívánatos anyagokra végzett analízis esetében

A 2002/32/EK irányelv értelmében vett nemkívánatos anyagok – többek között a dioxinok és a dioxinszerű PCB-k – tekintetében valamely állati takarmányozásra szánt termék akkor minősül nem felelőnek a megengedett határérték szempontjából, ha úgy ítélik meg, hogy az analitikai eredmény – figyelembe véve a kiterjesztett mérési bizonytalanságot és a visszanyerési korrekciót – meghaladja a megengedett határértéket. A megfelelés megállapítására az elemzett koncentrációt alkalmazzák a visszanyerés alapján végzett korrekció, valamint a kiterjesztett mérési bizonytalanságnak az elemzés eredményéből történő kivonása után. Ezt az eljárást csak olyan esetekben lehet alkalmazni, amikor az analitikai módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság becslését és a visszanyerési korrekciót (pl. mikroszkópos elemzésnél nem lehetséges).

Az analitikai eredményt a következők szerint kell jelenteni (amennyiben az alkalmazott analitikai módszer lehetővé teszi a mérési bizonytalanság és a visszanyerés becslését):

a) visszanyerésre korrigáltan, ebben az esetben fel kell tüntetni a visszanyerés mértékét. Nem szükséges feltüntetni a visszanyerési korrekciót, ha a visszanyerés aránya 90–110 % közötti;

b) x +/– U formában, ahol x a vizsgálati eredmény, U a kiterjesztett mérési bizonytalanság, a kiterjesztési tényező 2, amely körülbelül 95 %-os konfidenciaszintet eredményez.

Ha azonban az analízis eredménye jelentősen (> 50 %) alacsonyabb, mint a megengedett határérték, és feltéve, hogy megfelelő minőségi eljárásokat alkalmaznak és az analízis célja kizárólag a jogszabályi rendelkezéseknek való megfelelés ellenőrzése, az analitikai eredményeket lehet visszanyerési korrekció nélkül jelenteni, és ezekben az esetekben el lehet hagyni a visszanyerés arányának és a mérési bizonytalanságnak a jelentését.









III. MELLÉKLET

ANALITIKAI MÓDSZEREK A TAKARMÁNY-ALAPANYAGOK ÉS ÖSSZETETT TAKARMÁNYOK ÖSSZETÉTELÉNEK ELLENŐRZÉSÉRE

A. A NEDVESSÉGTARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok nedvességtartalmának meghatározását. Illóanyagokat (mint például szerves savakat) tartalmazó takarmányok esetében figyelembe kell venni, hogy a nedvességtartalommal együtt jelentős mennyiségű illóanyag meghatározása történik.

Nem vonatkozik a tejtermékek mint takarmány-alapanyagok analízisére, az ásványi anyagok és a túlnyomórészt ásványi anyagokból álló keverékek analízisére, az állati és növényi zsírok és olajok és olajos magvak és olajtartalmú gyümölcsök analízisére.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát, a takarmány jellege szerint, meghatározott körülmények között szárítjuk. A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg. Amennyiben magas nedvességtartalmú, szilárd takarmányokkal dolgozunk, előzetes szárítást kell végezni.

3. Eszközök

3.1. Nem nedvszívó anyagból készült, könnyen tisztítható aprítógép, amelynek használata gyors és egynemű őrlést tesz lehetővé anélkül, hogy észrevehető mennyiségű hőtermeléssel járna, a lehető legnagyobb mértékben megakadályozza a külső levegővel történő érintkezést, és megfelel a 4.1.1. és 4.1.2. pontban foglalt követelményeknek (pl. kalapácsos törő vagy vízhűtéses mikroaprítók, összecsukható kúpos malmok, finommozgású-lassú fordulatú vagy fogaskerekes aprítók).

3.2. 1 mg pontosságú analitikai mérleg.

3.3. Nem rozsdásodó fémből vagy üvegből készült, légmentes záródást biztosító fedéllel ellátott száraz tartályok; megfelelő munkafelület, amely lehetővé teszi a vizsgálati minta 0,3 g/cm2 körüli mennyiségben történő terítését.

3.4. Elektromos fűtésű izotermikus, megfelelően szellőztethető kemence (± 2 oC), amely gyors hőfokszabályozást tesz lehetővé ( 23 ).

3.5. Szabályozható, elektromos fűtésű vákuumkemence olajszivattyúval és forró, száraz levegő vagy szárítóanyag (pl. kalcium-oxid) bejuttatására alkalmas szerkezettel ellátva.

3.6. Megfelelő szárítóanyagot tartalmazó, vastag, perforált fém- vagy porcelánlemezes exszikkátor.

4. A vizsgálat módja

Megjegyzés: Az ebben a szakaszban leírt műveleteket a mintacsomagok kibontása után azonnal el kell végezni. Az elemzést legalább egyszer meg kell ismételni.

4.1. Előkészítés

4.1.1. A 4.1.2. és a 4.1.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Szükség esetén aprítsuk fel vagy oszlassuk el úgy, hogy a nedvességtartalma egyenletes legyen (lásd 6. pont).

4.1.2. Gabona- és darafélék

Vegyünk legalább 50 g-ot a mintából. Őröljük le úgy, hogy a kapott részecskék legalább 50 %-a átjusson egy 0,5 mm-es szembőségű szitán, és ne maradjon vissza 10 %-nál több egy kerek szemű, 1 mm-es szembőségű szitán.

4.1.3. Folyékony vagy kenőcsös állagú takarmányok, túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok

Mérjünk ki 25 g mintát 10 mg pontossággal, adjunk hozzá megfelelő mennyiségű vízmentes homokot, 10 mg pontossággal kimérve, és keverjük addig, amíg homogén masszát nem kapunk.

4.2. Szárítás

4.2.1. A 4.2.2. és a 4.2.3. pont alatt nem szereplő takarmányok

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 1 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 103 oC-ra előmelegített kemencébe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a kemence hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a kemencébe. Hagyjuk száradni négy órán át attól az időponttól számítva, amikor a kemence hőfoka újból elérte a 103 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a kemencéből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

Túlnyomórészt olajokból és zsírokból álló takarmányok esetén szárítsuk további 30 percen át 130 oC-on a kemencében. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át.

4.2.2. Gabonafélék, liszt, darafélék és derce

Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g aprított mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 130 oC-ra előmelegített szárítókemencébe. Annak megakadályozása érdekében, hogy a kemence hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a kemencébe. Hagyjuk száradni két órán át attól az időponttól számítva, amikor a kemence hőfoka újból elérte a 130 oC-ot. Helyezzük vissza a tartályra a fedelet, a tartályt vegyük ki a kemencéből, hagyjuk hűlni 30–45 percig az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg pontossággal.

4.2.3. Több mint 4 % szacharózt vagy laktózt tartalmazó összetett takarmányok: takarmány-alapanyagok, mint a szentjánoskenyér, a hidrolizált gabonatermékek, a malátamagvak, a szárított répaszelet, a hal- és cukorlevek; a 25 %-nál több ásványi sót (beleértve a kristályvíztartalmat is) tartalmazó összetett takarmányok. Fedelével együtt mérjünk le egy tartályt (3.3.) 0,5 mg pontossággal. Mérjünk a lemért tartályba 5 g mintát 1 mg pontossággal, és terítsük el egyenletesen. Helyezzük a tartályt fedél nélkül 80–85 oC-ra előmelegített vákuumkemencébe (3.5.). Annak megakadályozása érdekében, hogy a kemence hőfoka a kívánatos érték alá süllyedjen, a tartályt a lehető leggyorsabban helyezzük a kemencébe. Emeljük a nyomást 100 torr-ra, és hagyjuk a mintát száradni ezen a nyomáson négy órán át száraz, forró levegő áramoltatásával vagy szárítóanyag (20 mintához kb. 300 g) felhasználásával. Utóbbi esetben a kívánt nyomás elérésekor kapcsoljuk le a vákuumszivattyút. A szárítási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a kemence hőmérséklete visszaáll 80–85 oC-ra. Óvatosan állítsuk vissza a kemencében a légköri nyomást. Nyissuk ki a kemencét, azonnal helyezzük vissza a tartály fedelét, vegyük ki a tartályt a kemencéből, hagyjuk hűlni 30–45 percen át az exszikkátorban (3.6.), és mérjük le 1 mg-os pontossággal. Szárítsuk további 30 percen át a vákuumkemencében 80–85 oC-on, és mérjük le újra. A két mérés különbsége nem haladhatja meg a nedvességtartalom 0,1 %-át.

4.3. Előszárítás

4.3.1. A 4.3.2. pont alatt nem szereplő takarmányok

A magas nedvességtartalmú szilárd takarmányokat, amelyek nehezen apríthatók fel, előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan mintából 10 mg pontossággal (a préselt vagy agglomerált mintákat kissé fel is lazíthatjuk, ha szükséges) egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). Hagyjuk száradni 60–70 oC-os kemencében, amíg a nedvességtartalom 8–12 % körüli értékre csökken. Vegyük ki a kemencéből, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban egy órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. Ezután aprítsuk fel azonnal a 4.1.1. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.1. vagy a 4.2.3. pontban feltüntetett módon, a takarmány jellege szerint.

4.3.2. Gabonafélék

A 17 %-nál magasabb nedvességtartalmú gabonaféléket előszárításnak kell alávetni az alábbiak szerint:

Mérjünk le 50 g-ot az aprítatlan gabonából 10 mg pontossággal egy megfelelő tartályba (pl. 20×12 cm-es, 0,5 cm-es peremmel ellátott alumíniumtálca). Hagyjuk száradni 5–7 percen át 130 oC-os kemencében. Vegyük ki a kemencéből, hagyjuk fedél nélkül hűlni a laboratóriumban két órán át, és mérjük le 10 mg pontossággal. Őröljük meg azonnal a 4.1.2. pontban feltüntetett módon, és szárítsuk a 4.2.2. pontban feltüntetett módon.

5. Az eredmények kiszámítása

A minta százalékosan kifejezett nedvességtartalmát (X) az alábbi képletek segítségével számítjuk ki:

5.1. Szárítás előszárítás nélkül

ahol:

m = a vizsgálati minta eredeti tömege, grammban;

m0 = a száraz vizsgálati minta tömege, grammban.

5.2. Szárítás előszárítással

ahol:

m = a vizsgálati minta eredeti tömege, grammban,

m1 = a vizsgálati minta tömege, grammban, előszárítás után,

m2 = a vizsgálati minta tömege, grammban, aprítás vagy őrlés után,

m0 = a száraz vizsgálati minta tömege, grammban.

5.3. Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg a nedvességtartalom abszolút értékének 0,2 %-át.

6. Észrevételek

Ha az aprítás szükségesnek bizonyul, és úgy tűnik, hogy ez befolyásolja a termék nedvességtartalmát, a takarmány-alkotóelemek analízisének eredményét az eredeti minta nedvességtartalmának megfelelően korrigálni kell.

B. AZ ÁLLATI ÉS NÖVÉNYI ZSÍROK ÉS OLAJOK NEDESSÉGTARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi az állati és növényi zsírok és olajok víz- és illóanyag-tartalmának meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát 103 oC-on, a tömegállandóság eléréséig szárítjuk (két egymást követő mérés közötti tömegveszteségnek 1 mg-nál kevesebbnek kell lennie). A tömegveszteséget méréssel határozzuk meg.

3. Eszközök

3.1. Rozsdamentes anyagból készült, 8–9 cm átmérőjű és körülbelül 3 cm magas, lapos fenekű edény.

3.2. Rögzített üveggömbbel és a felső végén kiterjedési csővel rendelkező hőmérő, amely körülbelül 80 oC-tól legalább 110 oC-ig beosztással rendelkezik és körülbelül 10 cm hosszú.

3.3. Homokfürdő vagy elektromos főzőlap.

3.4. Hatékony szárítóközeget tartalmazó exszikkátor.

3.5. Analitikai mérleg.

4. A vizsgálat módja

Mérjünk ki mg pontossággal 20 g homogenizált mintát a hőmérőt (3.2.) tartalmazó száraz, lemért edénybe (3.1.). A hőmérővel folyamatosan kevergetve hevítsük a homokfürdőn vagy a főzőlapon (3.3.) úgy, hogy a hőmérséklet körülbelül hét perc alatt érje el a 90 oC-ot.

Csökkentsük a hőt, ügyelve az edény aljáról felszálló buborékok gyakoriságára. A hőmérséklet nem haladhatja meg a 105 oC-ot. Folytassuk az edény alján lévő anyag keverését, amíg a buborékképződés le nem áll.

A teljes kiszárítás érdekében hevítsük az edényt néhányszor 103 ± 2 oC-ra, miközben két hevítés között 93 oC-ra hűtjük tartalmát. Ezután hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni az exszikkátorban (3.4.), és mérjük le. Ismételjük addig a műveletet, amíg a két egymást követő mérés közötti tömegveszteség már nem haladja meg a 2 mg-ot.

Megjegyzés: A minta tömegének növekedése a többszöri hevítést követően a zsír oxidációját jelzi, ebben az esetben az eredményt a tömeg növekedését közvetlenül megelőző mérés alapján kell kiszámítani.

5. Az eredmények kiszámítása

A mintára vonatkoztatott, százalékosan kifejezett nedvességtartalmat (X) a következő képlettel lehet kiszámítani:

ahol:

m = a vizsgálati minta tömege, grammban;

m1 = az edény hevítés előtti tömege, grammban, a tartalmával együtt;

m2 = az edény hevítés utáni tömege, grammban, a tartalmával együtt.

A 0,05 %-nál kisebb eredményeket a „0,05 %-nál kisebb” megnevezéssel kell feljegyezni.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán elvégzett két párhuzamos meghatározás eredményeként kapott nedvességtartalmak eltérésének abszolút értéke nem haladhatja meg a 0,05 %-ot.

C. A NYERSFEHÉRJE-TARTALOM MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

E módszer lehetővé teszi a takarmányok nyersfehérje-tartalmának meghatározását a Kjeldahl-módszer szerint meghatározott nitrogéntartalom alapján.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát katalizátor jelenlétében kénsavval roncsoljuk. A savas oldatot nátrium-hidroxid-oldattal lúgosítjuk. Az ammóniát lepároljuk, és ismert mennyiségű kénsavban vesszük fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid standardoldatával titráljuk.

Alternatív megoldásként a felszabadult ammóniát bőséges bórsavoldatba desztilláljuk, majd sósav- vagy kénsavoldattal titráljuk.

3. Reagensek

3.1. Kálium-szulfát.

3.2. Katalizátor: réz(II)-oxid, CuO vagy réz(II)-szulfát-pentahidrát, CuSO4 5H2O.

3.3. Granulált cink.

3.4. Kénsav, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,25 mól/l.

3.6. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,10 mól/l.

3.7. Kénsav, normál mérőoldat, c(H2SO4) = 0,05 mól/l.

3.8. Metilvörösindikátor; oldjunk fel 300 mg metilvöröst 100 ml etanolban, σ = 95–96 % (v/v)

3.9. Nátrium-hidroxid-oldat (technikai minőségű is használható) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Nátrium-hidroxid, normál mérőoldat, c (NaOH) = 0,25 mól/l.

3.11. Nátrium-hidroxid, normál mérőoldat, c (NaOH) = 0,10 mól/l.

3.12. Granulált horzsakő, sósavban mosott és meggyújtott.

3.13. Acetanilid (olvadáspont = 114 oC, N-tartalom = 10,36 %).

3.14. Szacharóz (nitrogénmentes).

3.15. Bórsav (H3BO3).

3.16. Metilvörösindikátor-oldat: oldjunk fel 100 mg metilvöröst 100 ml etanolban vagy metil-alkoholban.

3.17. Brómkrezol-zöld-oldat: oldjunk fel 100 mg brómkrezol-zöldet 100 ml etanolban vagy metil-alkoholban.

3.18. Bórsavas oldat (10 g/l – 40 g/l, a használt eszköztől függően). Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a metilvörös és a brómkrezol indikátort a bórsavas oldathoz kell adni. Ha 1 liter bórsavas oldatot készítünk, a térfogat kiigazítása előtt 7 ml metilvörösindikátor-oldatot (3.16.) és 10 ml brómkrezol-zöld oldatot (3.17.) kell hozzáadni. A használt víztől függően a bórsavas oldat pH-ja tételenként változhat. Pozitív vakpróbához gyakorta szükség lehet kis mennyiségű lúg hozzáadására. Megjegyzés: Rendszerint jó eredményt ad körülbelül 3–4 ml NaOH-nak (3.11.) 1 liter 10 g/l bórsavas oldathoz való hozzáadása. Tároljuk az oldatot szobahőmérsékleten, és tárolás közben védjük a fénytől és az ammóniagáz-forrásoktól.

3.19 Sósav, normál mérőoldat, c(HC1) = 0,10 mól/l. Megjegyzés: A normál mérőoldatok más koncentrációi (3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. és 3.19.) is használhatók, ha ezt a számításokban korrigáljuk. A koncentrációt mindig négytizedes pontossággal kell megadni.

4. Eszközök

A Kjeldahl-eljárás szerinti roncsolás, desztillálás és titrálás elvégzésére alkalmas készülék.

5. A vizsgálat módja

5.1. Roncsolás

Mérjünk ki 0,001 g pontossággal 1 g mintát, és helyezzük be a roncsoló lombikjába. Adjunk hozzá 15 g kálium-szulfátot (3.1.), megfelelő mennyiségű katalizátort (3.2.) (0,3–0,4 g réz(II)-oxidot vagy 0,9–1,2 g réz(II)-szulfát-pentahidrátot), 25 ml kénsavat (3.4.) és szükség szerint néhány szemcse horzsakövet (3.12.), majd keverjük össze.

Először mérsékelten hevítsük a lombikot, szükség esetén időnként keverjük meg annak tartalmát, egészen addig, amíg a massza karbonizálódik és a hab eltűnik; ezt követően erősebben hevítsük, amíg a folyadék erős forrásba nem jön. A hevítés akkor megfelelő, ha a forrásban levő sav a lombik falán lecsapódik. Kerüljük a lombik oldalának túlhevítését és azt, hogy ahhoz szerves részecskék tapadjanak.

Amikor az oldat feltisztult és világoszöld színűvé vált, folytassuk a forralást további két órán át, majd hagyjuk lehűlni az oldatot.

5.2. Lepárlás

Óvatosan adjunk hozzá annyi vizet, amennyi a szulfátok teljes feloldódásához elegendő. Engedjük lehűlni, majd szükség szerint adjunk hozzá néhány szemcsényi cinket (3.3.). Folytassuk az 5.2.1. vagy az 5.2.2. pont szerint.

5.2.1. Lepárlás kénsavba

A lepárlókészülék gyűjtőlombikjába mérjünk be pontosan 25 ml kénsavat (3.5. vagy 3.7.), a feltételezett nitrogéntartalomtól függően. Adjunk hozzá néhány csepp metilvörösindikátort (3.8.).

Kapcsoljuk össze a Kjeldahl-lombikot a lepárlókészülék hűtőjével, és legalább 1 cm mélyen merítsük be a hűtő végét a gyűjtőlombikban lévő folyadékba (lásd a 8.3. észrevételt). Lassan, ammóniaveszteség nélkül öntsünk 100 ml nátrium-hidroxid oldatot (3.9.) a Kjeldahl-lombikba (lásd a 8.1. észrevételt). Hevítsük a lombikot az ammónia lepárlódásáig.

5.2.2. Lepárlás bórsavba

Amennyiben a párlat ammóniatartalmának titrálását manuálisan végezzük, az alább megadott eljárást kell alkalmazni. Amennyiben a lepárlóegység teljesen automatikusan a párlat ammóniatartalmát is titrálja, kövessük a gyártó utasításait a lepárlóegység működtetése tekintetében.

Tegyünk a hűtő kifolyójához 25–30 ml bórsavas oldatot (3.18.) tartalmazó gyűjtőlombikot úgy, hogy az adagolócső a bórsavas oldat szintje alatt legyen. Állítsuk be a lepárlóegységet 50 ml nátrium-hidroxid oldat (3.9.) adagolására. A lepárlóegységet a gyártó utasításainak megfelelően működtessük, és pároljuk le a nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával felszabadult ammóniát. Gyűjtsük össze a párlatot a bórsavas fogadóoldatban. A párlat mennyisége (a gőzlepárlás ideje) a minta nitrogéntartalmától függ. Kövessük a gyártó utasításait.

Megjegyzés: Félautomata lepárlóegység esetében a nátrium-hidroxid felesleg hozzáadása és a gőzlepárlás automatikusan történik.

5.3. Titrálás

Folytassuk az 5.3.1. vagy a 5.3.2. pont szerint.

5.3.1. Kénsav

A gyűjtőlombikban levő kénsavfelesleget a végpont eléréséig titráljuk nátrium-hidroxid oldattal (3.10. vagy 3.11.) az alkalmazott kénsav-koncentrációtól függően.

5.3.2. Bórsav

A gyűjtőlombik tartalmát a normál sósavmérőoldattal (3.19.) vagy normál kénsavmérőoldattal (3.6.) titráljuk büretta segítségével, és olvassuk le a használt párlat mennyiségét.

Kolorimetriás végpont-meghatározás alkalmazásakor a végpont elérése akkor történik, amikor a rózsaszín első jele megjelenik a tartalomban. Becsüljük meg a büretta eredményét 0,05 ml pontossággal. Egy megvilágított mágneses keverőlemez vagy fotometrikus detektor segíthet a végpont megjelenítésében.

Ez történhet automatikusan automata titrálóval felszerelt gőzlepárló használatával.

Kövessük a gyártó utasításait az adott lepárló vagy lepárló/titráló működtetésekor.

Megjegyzés: Automata titrálórendszer használatakor a titrálás a lepárlás kezdetekor rögtön megkezdődik és 1 %-os bórsavas oldatot (3.18.) használunk. Teljesen automatikus lepárlórendszer használatakor az ammónia automatikus titrálása potenciometrikus pH-rendszer alkalmazásával végpont-meghatározással is elvégezhető. Ebben az esetben pH-mérővel felszerelt automata titrálót használunk. A pH-mérőt a szokásos laboratóriumi pH-kalibrálási eljárásokat követve megfelelően kalibrálni kell a 4–7 közötti pH tartományra. A titrálás pH-végpontjának elérése 4,6-os pH értéknél következik be, ami a titrációs görbe legmeredekebb pontja (inflexiós pont).

5.4. Vakpróba

A reagensek nitrogénmentességének igazolására végezzünk vakpróbát (roncsolás, lepárlás és titrálás) a minta helyett 1 g szacharózt (3.14.) használva.

6. Az eredmények kiszámítása

A számításokat a 6.1. vagy a 6.2. pont szerint végezzük.

6.1. Számítás az 5.3.1. pont szerinti titrálás esetén

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

V0 = a vakpróbában használt NaOH (3.10. vagy 3.11.) térfogata (ml).

V1 = a minta titrálásához használt NaOH (3.10. vagy 3.11.) térfogata (ml).

c = a nátrium-hidroxid (3.10. vagy 3.110.) koncentrációja (mól/l).

m = a minta tömege (g).

6.2. Számítás az 5.3.2. pont szerinti titrálás esetén

6.2.1. Sósavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

m = a vizsgált adag g-ban kifejezett tömege;

c = a normál sósav-mérőoldat (3.19.) koncentrációja (mól/l);

V0 = a vakpróbában használt sósav térfogata (ml);

V1 = a vizsgált adaghoz használt sósav térfogata (ml).

6.2.2. Kénsavas titrálás

A tömegszázalékban kifejezett nyersfehérje-tartalom kiszámítása a következő képlettel történik:

ahol:

m = a vizsgált adag g-ban kifejezett tömege

c = a normál kénsav-mérőoldat (3.6.) koncentrációja (mól/l)

V0 = a vakpróbában használt kénsav (3.6.) térfogata (ml)

V1 = a vizsgált adaghoz használt kénsav (3.6.) térfogata (ml)

7. A módszer validálása

7.1. Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

— 20 %-nál alacsonyabb nyersfehérje-tartalom esetén a 0,2 %-ot abszolút értékben,

— 20 % és 40 % közötti nyersfehérje-tartalom esetén a magasabb érték 1,0 %-át,

— 40 %-nál magasabb nyersfehérje-tartalom esetén a 0,4 %-ot abszolút értékben.

7.2. Pontosság

Végezzük el az analízist (roncsolás, lepárlás és titrálás) 1,5–2,0 g acetaniliden (3.13.) 1 g szacharóz (3.14.) jelenlétében; 1 g acetanilid 14,80 ml kénsavat (3.5.) fogyaszt. A visszanyerés mértékének legalább 99 %-osnak kell lennie.

8. Észrevételek

8.1. A készülék lehet kézi, félautomata vagy automata típusú. Ha az alkalmazott készülék esetében a roncsolási és a lepárlási lépések között mintaátvitelre van szükség, ezt anyagveszteség nélkül kell végrehajtani. Ha a lepárlókészülék lombikja nincs felszerelve csepegtetőtölcsérrel, a nátrium-hidroxidot közvetlenül a lombik és a hűtő összekapcsolása előtt kell hozzáadni, a folyadékot lassan az edény belső oldala mentén folyatva.

8.2. Ha a roncsolt anyag megszilárdul, a fent megadottnál nagyobb mennyiségű kénsavval (3.4.) kezdjük újra a meghatározást.

8.3. Alacsony nitrogéntartalmú termékek esetén a gyűjtőlombikba mérendő kénsav (3.7.) térfogata szükség esetén 10 vagy 15 ml-re csökkenthető, és vízzel 25 ml-re feltölthető.

8.4. Rutinanalízishez más analitikai módszerek is használhatóak a nyersfehérje meghatározására, de a C. részben leírt Kjeldahl-módszer a referencia-módszer. Minden mátrix esetében egyedileg kell igazolni, hogy az alternatív (pl. DUMAS) módszerrel kapott eredmények egyenértékűek a referenciamódszerrel kapott eredményekkel. Mivel az alternatív módszerrel kapott eredmények – még az egyenértékűség igazolását követően is – eltérhetnek kissé a referenciamódszerel kapott eredményektől, az analitikai jelentésben meg kell említeni a nyersfehérje meghatározására használt analitikai módszert.

D. A KARBAMID MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányokban lévő karbamid szintjének meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízben szuszpendáljuk egy derítőszerrel. A szuszpenziót leszűrjük. A szűrlet karbamidtartalmát, 4-dimetil-amino-benzaldehid (4-DMAB) hozzáadása után, az optikai sűrűség 420 nm-es hullámhosszon való megmérésével határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. 4-dimetil-amino-benzaldehid-oldat: oldjunk fel 1,6 g 4-DMAB -t 100 ml 96 %-os etanolban, és adjunk hozzá 10 ml sósavat (ρ201,19 g/ml). A reagens legfeljebb kéthetes időtartamon keresztül áll el.

3.2. Carrez I. oldat: oldjunk fel vízben 21,9 g cink-acetátot, Zn(CH3COO)2·2H2O és 3 g jégecetet. Töltsük fel vízzel 100 ml-re.

3.3. Carrez II. oldat: vízben oldjunk fel 10,6 g kálium-[hexaciano-ferrát(II)]-ot, K4 Fe (CN)6 3H2O. Töltsük fel vízzel 100 ml-re.

3.4. Aktív szén, amely nem abszorbeálja a karbamidot (ezt ellenőrizni kell).

3.5. Karbamid, 0,1 %-os oldat (w/v).

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Kémcsövek: 160 × 16 mm, csiszolt üvegdugóval.

4.3. Spektrofotométer.

5. A vizsgálat módja

5.1. A minta elemzése

Mérjünk ki a mintából 2 g-ot mg-nyi pontossággal, és 1 g aktív szénnel (3.4.) együtt helyezzük egy 500 ml-es mérőlombikba. Adjunk hozzá 400 ml vizet és 5 ml Carrez I. oldatot (3.2.), keverjük kb. 30 másodpercig, majd adjunk hozzá 5 ml Carrez II. oldatot (3.3.). Keverjük a forgódobon harminc percig. Töltsük térfogatra vízzel, rázzuk fel, és szűrjük le.

Vegyünk el 5 ml-t az áttetsző, színtelen szűrletekből, öntsük csiszolt üvegdugóval ellátott kémcsövekbe, adjunk hozzájuk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), és keverjük fel. Helyezzük a kémcsöveket vízfürdőbe 20 oC-on (+/- 4 oC). Tizenöt perc elteltével a spektrofotométer segítségével, 420 nm-en mérjük meg a mintaoldat optikai sűrűségét, és ezt hasonlítsuk össze a vakpróbához a reagensekből készített oldattal.

5.2. Kalibrációs görbe

Vegyünk el a karbamid oldatból (3.5.) 1, 2, 4, 5 és 10 ml-t, öntsük 100 ml-es mérőlombikokba, és töltsük fel őket térfogatra vízzel. Vegyünk el 5 ml-t minden egyes oldatból, és mindegyikhez adjunk 5 ml 4-DMAB oldatot (3.1.), homogenizáljuk, és a fentiek szerint mérjük meg az optikai sűrűséget összehasonlítva az 5 ml 4-DMAB oldatot és 5 ml vizet tartalmazó karbamidmentes kontrolloldattal. Szerkesszük meg a kalibrációs görbét.

6. Az eredmények kiszámítása

A kalibrációs görbe segítségével határozzuk meg a mintában lévő karbamidmennyiséget.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

7. Észrevételek

7.1. 3 %-ot meghaladó karbamidtartalom esetén, csökkentsük a minta nagyságát 1 g-ra vagy hígítsuk az eredeti oldatot úgy, hogy 500 ml-ben ne legyen több 50 mg karbamidnál.

7.2. Alacsony karbamidtartalom esetén növeljük a minta nagyságát mindaddig, amíg a szűrlet áttetsző és színtelen marad.

7.3. Ha a minta olyan egyszerű nitrogéntartalmú elegyeket tartalmaz, mint az aminosavak, akkor az optikai sűrűséget 435 nm-en kell mérni.

E. AZ ILLÓ NITROGÉNBÁZISOK MEGHATÁROZÁSA

I. MIKRODIFFÚZIÓVAL

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a takarmányok ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázisokat mikrodiffúzióval, kálium-karbonát oldat használatával kiszorítjuk, bórsavas oldatban fogjuk fel, és kénsavval titráljuk.

3. Reagensek

3.1. 20 %-os (w/v) triklór-ecetsav oldat.

3.2. Indikátor: oldjunk fel 33 mg brómkrezol-zöldet és 65 mg metilvöröst 100 ml 95–96 %-os (v/v) etanolban.

3.3. Bórsavas oldat: 1 literes mérőlombikban oldjunk fel 10 g bórsavat 200 ml, 95–96 %-os (v/v) etanolban és 700 ml vízben. Adjunk hozzá 10 ml indikátort (3.2.). Keverjük össze, és ha szükséges, állítsuk be az oldat színét világos vörösre nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával. Ezen oldat 1 ml-je maximum 300 μg NH3-t fog megkötni.

3.4. Telített kálium-karbonát oldat: oldjunk fel 100 g kálium-karbonátot 100 ml forrásban lévő vízben. Hagyjuk lehűlni, majd szűrjük le.

3.5. 0,1 mól/liter koncentrációjú kénsav.

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Üveg vagy műanyag Conway-küvetták (lásd az ábrát).

4.3. 1/100 ml-es fokbeosztásos mikrobüretták.

5. A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Pipettázzunk 1 ml bórsavas oldatot (3.3.) a Conway-küvetta középső részébe és 1 ml mintaszűrletet a küvetta koronarészébe. Fedjük le részlegesen a bezsírozott fedéllel. Tegyünk 1 ml telített kálium-karbonát oldatot (3.4.) gyorsan a küvetta koronarészébe, majd zárjuk le légmentesen a küvettát a fedéllel. Forgassuk el a küvettát óvatosan a vízszintes síkban úgy, hogy a két reagens összekeveredjen. Hagyjuk inkubálódni legalább négy órán át szobahőmérsékleten vagy egy órán át 40 oC-on.

Mikrobüretta (4.3.) segítségével titráljuk az illó bázisokat a bórsavoldatban kénsavval (3.5.).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6. Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,01 mól/liter koncentrációjú H2SO4 0,34 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg:

— 1,0 %-osnál alacsonyabb ammóniatartalom esetén relatív értékben a 10 %-ot,

— 1,0 %-os vagy annál magasabb ammóniartartalom esetén abszolút értékben a 0,1 %-ot.

7. Észrevételek

Ha a minta ammóniatartalma meghaladja a 0,6 %-ot, az eredeti szűrletet hígítani kell.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. DESZTILLÁLÁSSAL

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer lehetővé teszi a karbamidot gyakorlatilag nem tartalmazó halliszt ammóniában kifejezett illó nitrogénbázis-tartalmának meghatározását. Csak 0,25 %-nál alacsonyabb ammóniatartalom esetén alkalmazható.

2. Vizsgálati alapelv

A mintát vízzel extraháljuk, majd az oldatot derítjük és szűrjük. Az illó nitrogénbázist forrásponton szorítjuk ki magnézium-oxid hozzáadásával, és meghatározott mennyiségű kénsavban fogjuk fel, amelynek feleslegét nátrium-hidroxid oldattal titráljuk vissza.

3. Reagensek

3.1. 20 %-os (w/v) triklór-ecetsav oldat.

3.2. Magnézium-oxid.

3.3. Habzásgátló emulzió (pl. szilikon).

3.4. 0,5 mól/liter koncentrációjú kénsav.

3.5. 0,5 mól/liter koncentrációjú nátrium-hidroxid oldat.

3.6. 0,3 %-os metilvörös-oldat 95–96 % (v/v) etanolban.

4. Eszközök

4.1. Billenődobos keverőgép: kb. 35–40 fordulatszám/perc teljesítménnyel.

4.2. Kjeldahl-féle lepárlókészülék.

5. A vizsgálat módja

Mérjünk le 10 g mintát 1 mg pontossággal, és tegyük egy 100 ml vizet tartalmazó 200 ml-es mérőlombikba. Keverjük a keverőgépben 30 percen át. Adjunk hozzá 50 ml triklór-ecetsavas oldatot (3.1.), töltsük fel térfogatra vízzel, rázzuk össze alaposan, majd szűrjük át hajtogatott szűrőn.

Vegyünk a tiszta szűrletből elegendő mennyiséget, hogy a feltételezett illó nitrogénbázis-tartalmat meg tudjuk határozni (100 ml mennyiség rendszerint megfelel a célnak). Hígítsuk fel 200 ml-re, és adjunk hozzá 2 g magnézium-oxidot (3.2.), valamint néhány csepp habzásgátló emulziót (3.3.). Az oldatnak lakmuszpapírral mérve lúgos kémhatásúnak kell lennie; ha nem az, adjunk hozzá egy kevés magnézium-oxidot (3.2.). Folytassuk a nyersfehérje meghatározására az 5.2. vagy 5.3. pontban ismertetett módszer szerint (e melléklet C. része).

Végezzünk vakpróbát ugyanezzel az eljárással, de az analizálandó minta hozzáadása nélkül.

6. Az eredmények kiszámítása

1 ml 0,05 mól/liter koncentrációjú H2SO41,7 mg ammóniának felel meg.

Az eredményt a minta százalékában fejezzük ki.

Ismételhetőség

Az ugyanazon mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg relatív értékben az ammóniatartalom 10 %-át.

F. AZ AMINOSAVAK MEGHATÁROZÁSA (A TRIPTOFÁN KIVÉTELÉVEL)

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer a takarmányok szabad (szintetikus és természetes) és összes (peptidhez kötött és szabad) aminosav-tartalmának meghatározását teszi lehetővé, aminosav-analizátort használatával. A módszer a következő aminosavakra alkalmazható: cisztein, metionin, lizin, treonin, alanin, arginin, aszparaginsav, glutaminsav, glicin, hisztidin, izoleucin, leucin, fenilalanin, prolin, szerin, tirozin és valin.

A módszer nem tesz különbséget az aminosav sói között, és nem különbözteti meg az aminosavak D és L formáit. A módszer nem érvényes triptofán vagy az aminosavak hidroxi analógjainak meghatározására.

2. Vizsgálati alapelv

2.1. Szabad aminosavak

A szabad aminosavakat híg sósavval extraháljuk. Az együtt extrahált nitrogéntartalmú makromolekulákat szulfoszalicilsavval csapatjuk ki, és szűréssel távolítjuk el. A szűrt oldat kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

2.2. Összes aminosav

A választott eljárás függ a vizsgált aminosavaktól. A ciszteint és a metionint a hidrolízis előtt ciszteinsavvá, illetve metionin-szulfonná kell oxidálni. A tirozint az oxidálatlan minták hidrolizátumaiból kell meghatározni. Az (1) bekezdésben felsorolt összes többi aminosav akár oxidált, akár oxidálatlan mintából meghatározható.

Az oxidálást 0 oC-on végezzük perhangyasav/fenol keverékével. A oxidálószer-felesleget nátrium-diszulfittal bontjuk le. Az oxidált vagy oxidálatlan mintát sósavval (3.20.) hidrolizáljuk 23 órán keresztül. A hidrolizátum kémhatását pH = 2,20 értékre állítjuk be. Az aminosavakat ioncserés kromatográfiával választjuk szét, és ninhidrines reakcióval, 570 nm-en (prolin esetében 440 nm-en) végzett fotometriás detektálással határozzuk meg.

3. Reagensek

Kétszer desztillált vizet vagy ezzel egyenértékű minőségű vizet kell használni (vezetőképessége < 10 μS).

3.1. Hidrogén-peroxid, w (w/w) = 30 %.

3.2. Hangyasav, w (w/w) = 98–100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Nátrium-diszulfit.

3.5. Nátrium-hidroxid.

3.6. 5-szulfo-szalicilsav-dihidrát.

3.7. Sósav, sűrűsége megközelítőleg 1,18 g/ml.

3.8. tri-nátrium-citrát-dihidrát.

3.9. 2,2'-Tiodietanol (tiodiglikol).

3.10. Nátrium-klorid.

3.11. Ninhidrin.

3.12. Petroléter, forráspont-tartomány: 40–60 oC.

3.13. Norleucin vagy más, belső standardként történő használatra alkalmas vegyület.

3.14. Nitrogéngáz (10 ppm-nél kevesebb oxigénnel).

3.15. 1-oktanol.

3.16. Aminosavak.

3.16.1. Az 1. pontban felsorolt standard anyagok. Tiszta vegyületek kristályvíztartalom nélkül. Használat előtt egy hétig szárítsuk vákuumban P2O5 vagy H2SO4 felett.

3.16.2. Ciszteinsav.

3.16.3. Metionin-szulfon.

3.17. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 7,5 mól/l: Oldjunk fel 300 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.18. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 1 mól/l: Oldjunk fel 40 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.19. Hangyasav-fenol oldat: Elegyítsünk 889 g hangyasavat (3.2.) 111 g vízzel és adjunk hozzá 4,73 g fenolt (3.3.).

3.20. Hidrolízis keverék c = 6 mól HCl /l 1 g fenol/l tartalommal: Adjunk egy g fenolt (3.3.) 492 ml HCl-hez (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.21. Extraháló keverék, c = 0,1 mól HCl/l 2 %-os tiodiglikol tartalommal: Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), hígítsuk megközelítőleg 900 ml vízzel, adjunk hozzá 20 ml tiodiglikolt (3.9.), és vízzel töltsük fel 1 l-re (ne keverjük össze közvetlenül a 3.7.-et és 3.9.-et).

3.22. 5-szulfo-szalicilsav ß = 6 %: Oldjunk fel 60 g 5-szulfo-szalicilsavat (3.6.) vízben, és vízzel töltsük fel 1 l-re.

3.23. Oxidáló keverék (perhangyasav-fenol): Elegyítsünk 0,5 ml hidrogén peroxidot (3.1.) 4,5 ml hangyasav-fenol oldattal (3.19.) egy kis főzőpohárban. Inkubáljuk 20–30 oC-on egy órán át a perhangyasav keletkezéséhez, majd hűtsük le jeges vízfürdőben (15 percig), mielőtt a mintához adnánk. Figyelem: Kerüljük a bőrrel való érintkezést, és viseljünk védőruházatot.

3.24. Citrátpuffer, c = 0,2 mól Na+/l, pH 2,20: Oldjunk fel 19,61 g nátrium-citrátot (3.8.), 5 ml tiodiglikolt (3.9.), 1 g fenolt (3.3.) és 16,50 ml HCl-t (3.7.) megközelítőleg 800 ml vízben. Állítsuk be a pH-t 2,20-re. Töltsük fel vízzel 1 literre.

3.25. Eluáló pufferek, a használt analizátor feltételei szerint készítve (4.9.).

3.26. Ninhidrin reagens, a használt analizátor feltételei szerint készítve (4.9.).

3.27. Aminosavak standardoldata. Ezeket az oldatokat 5 oC alatt kell tárolni.

3.27.1. Aminosavak standard törzsoldata (3.16.1.). c = 2,5 μmól/l, mindegyik sósavban. Kereskedelmi forgalomban kapható.

3.27.2. Ciszteinsav és metionin-szulfon standard törzsoldata, c = 1,25 μmól/ml. 1 literes mérőlombikban citrátpufferban (3.24.) oldjunk fel 0,2115 g ciszteinsavat (3.16.2.) és 0,2265 g metionin szulfont (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig citrátpufferrel. Legfeljebb 12 hónapig tároljuk 5 oC alatt. Nem használjuk ezt az oldatot, ha a standard törzsoldat (3.27.1.) tartalmaz ciszteinsavat és metionin szulfont.

3.27.3. Belső standard pl. norleucin standard törzsoldata, c = 20 μmól/ml. Mérőlombikban oldjunk fel 0,6560 g norleucint (3.13.) citrátpufferben (3.24.), majd az oldatot töltsük fel 250 ml-re citrátpufferrel. Legfeljebb 6 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

3.27.4. Standard aminosavak kalibrálóoldata hidrolizátumokkal való használatra, c = 5 nmól/50 μl ciszteinsav és metionin szulfon és c = 10 nmól/50 μl más aminosav. Egy 100 ml-es főzőpohárban oldjunk fel 30 ml citrátpufferben (3.24.) 2,2 g nátrium-kloridot (3.10.). Adjunk hozzá 4,00 ml standard aminosav-törzsoldatot (3.27.1.), 4,00 ml ciszteinsav és metionin szulfon standard törzsoldatot (3.27.2.) és 0,50 ml-t a belső standard (3.27.3.) standard törzsoldatából, ha ilyet használunk. A pH-t állítsuk 2,20-re nátrium-hidroxiddal (3.18.). Öntsük át a teljes mennyiséget egy 50 ml-es mérőlombikba, töltsük fel jelig citrátpufferrel (3.24.), és keverjük össze. Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt. Lásd még az Észrevételek 9.1. pontját.

3.27.5. Standard aminosavak kalibrálóoldata hidrolizátumokkal való használatra, az 5.3.3.1. pont szerint készítve és a kivonatokkal való használatra (5.2.). A kalibrálóoldat a 3.27.4. pont szerint készül, de elhagyjuk a nátrium-kloridot. Legfeljebb 3 hónapig tároljuk 5 oC alatt.

4. Eszközök

4.1. 100 vagy 250 ml-es visszafolyós hűtővel ellátott gömblombik.

4.2. 100 ml-es, csavaros tetejű, gumi/teflon béléses bórszilikát üveglombik (pl. Duran, Schott) kemencében történő használatra.

4.3. Intenzív szellőztetésű és + 2 oC-nál nagyobb pontosságú hőmérséklet-szabályozóval ellátott kemence.

4.4. pH-mérő (három tizedesjegyig)

4.5. 0,22 μm-es membránszűrő.

4.6. Centrifuga.

4.7. Rotációs vákuumbepárló.

4.8. Mechanikus vagy mágneses keverőberendezés.

4.9. Aminosav-analizátor vagy HPLC-berendezés ioncserélő oszloppal, készülék ninhidrinhez, utókolonnás derivatizáláshoz és fotometriás detektor. A kolonna szulfonált polisztirol gyantával van töltve, amely képes az aminosavak egymástól és más ninhidrin-pozitív anyagoktól való elválasztására. A puffer és ninhidrin vonal áramlását ±0,5 %-os áramlási stabilitású szivattyúk biztosítják a standard kalibrálás és a minta analízisének időszakában. Néhány aminosav-analizátornál olyan hidrolízises eljárások is alkalmazhatók, amelyekben a hidrolizátum nátriumkoncentrációja k = 0,8 mól/l, és amelyek tartalmazzák az oxidációs lépésből származó valamennyi hangyasavmaradékot. Más analizátorok nem biztosítanak megfelelő elválasztást bizonyos aminosavak esetében, ha a hidrolizátum feleslegben tartalmaz hangyasavat, és/vagy magas benne a nátrium-ion koncentráció. Ebben az esetben a sav térfogatát a hidrolízis után és a pH-beállítás előtt mintegy 5 ml-re való bepárlással csökkentjük. A bepárlást vákuum alatt és maximum 40 oC-on kell végezni.

5. A vizsgálat módja

5.1. A minta előkészítése

A mintát úgy őröljük meg, hogy átjusson egy 0,5 mm-es szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.12.) extrahálni kell.

5.2. A szabad aminosavak meghatározása takarmányokban és előkeverékekben

Az előkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) mérjünk be 0,2 mg pontossággal egy Erlenmeyer-lombikba, és adjunk hozzá 100,0 ml extraháló keveréket (3.21.). Rázassuk a keveréket 60 percig mechanikus rázógép vagy mágneses keverő segítségével (4.8.). Hagyjuk leülepedni az üledéket, és a felülúszó oldatból pipettázzunk 10,0 ml-t egy 100 ml-es főzőpohárba.

Keverés közben adjunk hozzá 5,0 ml szulfoszalicilsavat (3.22.), és folytassuk a keverést mágneses keverő segítségével 5 percig. A felülúszó folyadékot szűrjük le, vagy centrifugáljuk a csapadék leválasztása céljából. A kapott oldat 10,0 ml-ét tegyük egy 100 ml-es főzőpohárba, és állítsuk be a pH-t 2,20-ra nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.), majd töltsük át egy megfelelő térfogatú mérőlombikba citrát-puffer segítségével (3.24.), és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Ha belső standardot használunk, adjunk 1,00 ml belső standardot (3.27.3.) minden 100 ml végső oldathoz, és a lombikot töltsük fel jelig a pufferoldattal (3.24.).

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával, az 5.4. pont szerint.

Ha a kivonatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, akkor azokat 5 oC alatt kell tárolni.

5.3. Összes aminosav meghatározása

5.3.1. Oxidáció

0,2 mg pontossággal mérjünk ki 0,1–1 g-ot az előkészített mintából (5.1.):

— egy 100 ml-es gömblombikba (4.1.) nyitott hidrolízishez (5.3.2.3.), vagy

— egy 250 ml-es gömblombikba (4.1.), ha alacsony nátriumkoncentrációra van szükség (5.3.3.1.), vagy

— egy csavaros tetejű 100 ml-es palackba (4.2.), (zárt hidrolízishez 5.3.2.4.).

A kimért mintamennyiségnek hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal és legfeljebb 100 mg nedvességtartalommal kell rendelkeznie.

Helyezzük a lombikot/palackot jeges vízfürdőbe, és hűtsük le 0 oC-ra, adjunk hozzá 5 ml oxidációs keveréket (3.23.), és keverjük össze egy hajlított végű üvegspatulával. Zárjuk le légmentesen a spatulát is magában foglaló lombikot/palackot, tegyük a lezárt tartályt tartalmazó jeges vízfürdőt 0 oC-os hűtőszekrénybe, és hagyjuk állni 16 órán keresztül. 16 óra múlva vegyük ki a hűtőszekrényből, és a feleslegben lévő oxidáló reagenst 0,84 g nátrium-diszulfit (3.4.) adagolásával bontsuk le.

Folytassuk a műveletet az 5.3.2.1. pont szerint.

5.3.2. Hidrolízis

5.3.2.1. Az oxidált minták hidrolízise

Az 5.3.1. pont szerint elkészített oxidált mintához adjunk 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), ügyelve arra, hogy lemossuk az edény falára és a spatulára tapadt mintamaradékot.

Az alkalmazott hidrolízis-eljárástól függően az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.2. A nem oxidált minta hidrolízise

Mérjünk be egy 100 ml-es vagy egy 250 ml-es gömblombikba (4.1.) vagy egy 100 ml-es csavaros fedelű palackba (4.2.) 0,1–1 g-ot az előkészített mintából (5.1.) 0,2 mg pontossággal. A mintából bemért adagnak hozzávetőlegesen 10 mg nitrogéntartalommal kell rendelkeznie. Óvatosan adjunk hozzá 25 ml hidrolíziskeveréket (3.20.), és keverjük őket össze. Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.3. Nyitott hidrolízis

Tegyünk 3 üveggyöngyöt a lombikban lévő keverékbe (ami az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint készült), és forraljuk folyamatos buborékolás mellett, reflux alatt, 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, mossuk ki a hűtőt 5 ml citrát-pufferrel (3.24.). Vegyük le a lombikot, és hűtsük le jeges vízfürdőben.

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.2.4. Zárt hidrolízis

Tegyük az 5.3.2.1. vagy az 5.3.2.2. pont szerint elkészített keveréket tartalmazó palackot egy 110 oC-os kemencébe (4.3.). A (gázfejlődésnek tulajdonítható) nyomás kialakulásának megelőzése és a robbanás elkerülése érdekében az első órában helyezzük a csavaros fedelet az edény nyílására. Ne zárjuk le az edényt a fedővel. Egy óra elteltével zárjuk le az edényt a fedővel, és hagyjuk a kemencében (4.3.) 23 órán keresztül. Amikor a hidrolízis befejeződött, vegyük ki az edényt a kemencéből, óvatosan nyissuk fel a palack fedelét, és tegyük a palackot jeges vízfürdőbe. Hagyjuk lehűlni.

A pH beállításához alkalmazott eljárástól függően (5.3.3.) a palack tartalmát teljes egészében vigyük át egy 250 ml-es főzőpohárba vagy egy 250 ml-es gömblombikba citrát-puffer segítségével (3.24.).

Az 5.3.3. pont szerint folytassuk a műveletet.

5.3.3. A pH beállítása

Az aminosav-analizátor (4.9.) nátriummal szembeni tűrőképességétől függően az 5.3.3.1. vagy az 5.3.3.2. pont szerint végezzük el a pH beállítását.

5.3.3.1. Alacsony nátriumkoncentrációt igénylő kromatográfiás rendszerek (4.9.) esetén:

Tanácsos belső standard törzsoldatot (3.27.3.) használni alacsony nátriumkoncentrációt igénylő aminosav-analizátorok alkalmazása esetén (amikor a sav térfogatát csökkenteni kell).

Ebben az esetben bepárlás előtt adjunk 2,00 ml belső standard törzsoldatot (3.27.3.) a hidrolizátumhoz.

Adjunk 2 csepp 1-oktanolt (3.15.) az 5.3.2.3. vagy az 5.2.3.4. pont szerint nyert hidrolizátumhoz.

Rotációs bepárló segítségével (4.7.) csökkentsük a térfogatot 5–10 ml-re vákuum alatt, 40 oC-on. Ha a térfogat véletlenül 5 ml alá csökken, akkor a hidrolizátumot ki kell önteni, és az analízist újra kell kezdeni.

Nátrium-hidroxid-oldattal (3.18.) állítsuk be a pH-t 2,20-re, és az 5.3.4. ponttal folytassuk a műveletet.

5.3.3.2. Minden más típusú aminosav-analizátor (4.9.) esetén:

Az 5.3.2.3. vagy az 5.3.2.4. pont szerint kapott hidrolizátumokat részlegesen semlegesítsük úgy, hogy keverés közben óvatosan hozzáadunk 17 ml nátrium-hidroxid-oldatot (3.17.), mialatt a hőmérsékletet 40 oC alatt tartjuk.

Szobahőmérsékleten állítsuk be a pH-t 2,20-re a 3.17. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal és végül a 3.18. pont alatti nátrium-hidroxid-oldattal. Folytassuk a műveletet az 5.3.4. pont szerint.

5.3.4. Mintaoldat a kromatográfiához

A beállított pH-jú hidrolizátumot (5.3.3.1. vagy 5.3.3.2.) maradék nélkül, citrát-pufferrel vigyük át egy 200 ml-es mérőlombikba, és töltsük fel jelig a pufferrel (3.24.).

Ha még nem használtunk belső standardot, adjunk hozzá 2,00 ml belső standardot (3.27.3.), és töltsük fel jelig citrát-pufferrel (3.24.). Keverjük össze alaposan.

Folytassuk a műveletet a kromatográfiával (5.4.).

Ha a mintaoldatok vizsgálatára nem ugyanazon a napon kerül sor, 5 oC alatt kell őket tárolni.

5.4. Kromatográfia

Kromatográfiás vizsgálat előtt a kivonatot (5.2.) vagy a hidrolizátumot (5.3.4.) állítsuk be szobahőmérsékletre. Rázzuk fel a keveréket, és szűrjünk át megfelelő mennyiséget egy 0,2 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kapott tiszta oldatot vessük alá ioncserés kromatográfiának aminosav-analizátor segítségével (4.9.).

Az injektálást lehet kézzel vagy automatikusan végezni. Ügyeljünk arra, hogy – ± 0,5 %-os eltéréssel – azonos mennyiségű oldatot tegyünk az oszlopra a standardok és minták analíziséhez, kivéve, amikor belső standardot használunk, valamint, hogy a nátrium-aminosav arányok, amennyire csak lehet, megegyezzenek a standardban és a mintában.

A kalibrálás gyakorisága általában a ninhidrin reagens és az analitikai rendszer stabilitásától függ. A standardot vagy a mintát citrát-pufferrel (3.24.) hígítjuk annak érdekében, hogy a standard csúcsterülete a minta aminosav csúcsterületének 30–200 %-a legyen.

Az aminosavak kromatográfiás vizsgálata az alkalmazott analizátor és a használt gyanta típusától függően némiképp eltérhet. A választott rendszernek képesnek kell lennie arra, hogy az aminosavakat elválassza egymástól és a ninhidrin-pozitív anyagoktól. A működési tartományban a kromatográfiás rendszer reakciójának egyenesen arányosnak kell lennie a kolonnára felvitt aminosavak mennyiségével.

A kromatográfiás lépésnél az alábbiakban említett csúcs-mélyponti arányt alkalmazzuk, amikor (a meghatározandó aminosavak vonatkozásában) ekvimoláris oldatot analizálunk. Az ekvimoláris oldatnak az aminosav-analizátor rendszerrel (4.9.). pontosan mérhető aminosavak maximális mennyiségének legalább 30 %-át tartalmaznia kell.

A treonin-szerin szétválasztásánál a kromatogramon a két egymást átfedő aminosav közül a kisebb csúcs-mélyponti aránya ne haladja meg a 2:10 értéket (ha csak cisztein, metionin, treonin és lizin meghatározásáról van szó, a szomszédos csúcsok nem megfelelő elválása hátrányosan befolyásolja a meghatározást). Minden más aminosav esetében a szétválasztásnak jobbnak kell lennie, mint 1:10.

A rendszernek el kell tudnia választani a lizint a „mesterséges lizin képződményektől” és az ornitintől.

6. Az eredmények kiszámítása

Minden aminosavra megmérjük a minta és a standard csúcsterületét, és kiszámítjuk a minta egy kg-jában lévő aminosav g-ban kifejezett mennyiségét (X).

Ha belső standardot használunk, szorozzuk meg

.

A = a hidrolizátum vagy a kivonat csúcsterülete

B = a kalibráló standardoldat csúcsterülete

C = a hidrolizátumban vagy a kivonatban lévő belső standard csúcsterülete

D = a belső standard, kalibráló standardoldat csúcsterülete

M = a meghatározandó aminosav móltömege

c = a standard koncentrációja μmól/l-ben

m = a minta tömege (g) (ha szárított vagy zsírtalanított, akkor az eredeti tömegre korrigálva)

V = ml összes hidrolizátum (5.3.4.) vagy ml kivonat (6.1.) számított teljes hígítási térfogata

Mind a cisztin, mind a cisztein mint cisztein-sav kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de cisztinként kerül kiszámításra (C6H12N2O4S2, MW 240,30 g/mól), ha MW 120,15 g/mólt (= 0,5 × 240,30 g/mól) használunk.

A metionin metionin-szulfonként kerül meghatározásra az oxidált minta hidrolizátumaiban, de metioninként kerül kiszámításra a metionin molekulatömegének (MW = 149,21 g/mol) használatával.

A hozzáadott szabad metionin extrahálás után metioninként kerül meghatározásra, és a számításhoz ugyanezt a molekulatömeget (M) használjuk.

6.1. A szabad aminosavak (5.2.) meghatározása esetén a kivonatok teljes hígítási térfogatát (F) a következőképpen számítjuk ki: V = a végső kivonat térfogata

7. A módszer értékelése

A módszert nemzetközi összehasonlító vizsgálat során ellenőrizték, amelyet 1990-ben végeztek négy különböző takarmány (kevert sertéstáp, brojlertápkeverék, fehérjekoncentrátum, előkeverék) felhasználásával. A szélsőértékek kizárásával kapott átlagértékeket és standard szórásokat az ebben a pontban található táblázatok mutatják be:







Átlagértékek g/kg-ban Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 N = 17 9,55 n = 13 Brojlertápkeverék 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 N = 18 13,93 n = 16 Fehérjekoncentrátum 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 N = 17 47,74 n = 15 Előkeverék 58,42 n = 16 — 90,21 N = 16 98,03 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

7.1. Ismételhetőség

A fent említett összehasonlító vizsgálat ismételhetőségét „laboratóriumon belüli szórásként” kifejezve az alábbi táblázatok mutatják:







Laboratóriumon belüli szórás (Sr) g/kg Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Brojlertápkeverék 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Fehérjekoncentrátum 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Előkeverék 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma







A laboratóriumon belüli szórás (Sr) relatív szórása ( %) Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Brojlertápkeverék 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Fehérjekoncentrátum 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Előkeverék 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

7.2. Reprodukálhatóság

A fent említett összehasonlító vizsgálatra vonatkozóan, a különböző laboratóriumok közötti szórásértékeket az alábbi táblázat adja meg:







Laboratóriumon belüli szórás (SR) g/kg Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Brojlertápkeverék 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Fehérjekoncentrátum 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Előkeverék 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma







A laboratóriumon belüli szórás (SR) relatív szórása ( %) Referenciaanyag Aminosav Treonin Ciszt(e)in Metionin Lizin Kevert sertéstáp 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Brojlertápkeverék 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Fehérjekoncentrátum 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Előkeverék 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = a részt vevő laboratóriumok száma

8. Referenciaanyagok használata

A módszer helyes alkalmazását lehetőség szerint hitelesített referenciaanyagokon végzett ismételt mérésekkel kell ellenőrizni. Hitelesített aminosav-kalibrálóoldattal végzett kalibrálás javasolt.

9. Észrevételek

9.1. Az aminosav-analizátorok közötti különbségek miatt a standard aminosavak (lásd 3.27.4. és 3.27.5.) és a hidrolizátumok (lásd 5.3.4.) kalibrálóoldatainak végső koncentrációit irányadónak kell tekinteni. A berendezés lineáris reakciójának tartományát valamennyi aminosavra ellenőrizni kell. A standardoldatot citrát-pufferrel hígítjuk, hogy a csúcsterületek a tartomány közepére essenek.

9.2. Amennyiben nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás berendezést használunk a hidrolizátumok elemzéséhez, a gyártó ajánlásainak megfelelően kell a kísérleti körülményeket optimalizálni.

9.3. Ha 1 %-nál több kloridot tartalmazó takarmányokra (koncentrátum, ásványi takarmányok, kiegészítő takarmányok) alkalmazzuk a módszert, előfordulhat a metionin alulértékelése, és ezért speciális kezelést kell végezni.

G. A TRIPTOFÁN MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

A módszer a takarmányokban található összes és a szabad triptofán meghatározására szolgál. Nem különbözteti meg a D- és az L-formákat.

2. Vizsgálati alapelv

Az összes triptofán meghatározásához a mintát alkalikus körülmények között, telített bárium-hidroxid-oldattal hidrolizáljuk, majd 110 oC-ra hevítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 20 órán át. Hidrolízis után belső standardot adunk hozzá.

A szabad triptofán meghatározásához a mintát enyhén savas körülmények között extraháljuk belső standard jelenlétében.

A hidrolizátumban vagy a kivonatban található triptofánt és a belső standardot HPLC-módszerrel, fluoreszcens detektálással határozzuk meg.

3. Reagensek

3.1. Bideszt vagy azzal egyenértékű minőségű vizet kell használni (konduktivitás < 10 μS/cm).

3.2. Standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %).

3.3. Belső standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított α-metil-triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %).

3.4. Bárium-hidroxid oktahidrát (BaCO3 képződésének elkerülése érdekében ügyelnünk kell arra, hogy a Ba(OH)2 .0,8 H2O-t ne tegyük ki túlzott mértékben levegő hatásának, mert ez zavarhatja a meghatározást) (lásd az Észrevételek 9.3. pontját).

3.5. Nátrium-hidroxid.

3.6. Ortofoszforsav, w (w/w) = 85 %.

3.7. Sósav, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Metil-alkohol, HPLC minőségű.

3.9. Petroléter, forráspont-tartomány: 40–60 oC.

3.10. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 1 mól/l: Oldjunk fel 40,0 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

3.11. Sósav, c = 6 mól/l: Vegyünk 492 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.12. Sósav, c = 1 mól/l: Vegyünk 82 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.13. Sósav, c = 0,1 mól/l: Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 literre.

3.14. Ortofoszforsav, c = 0,5 mól/l: Vegyünk 34 ml ortofoszforsavat (3.6.), és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 literre.

3.15. Triptofán (3.2.) koncentrált oldata, c = 2,50 μmol/ml: Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2553 g triptofánt (3.2.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

3.16. Koncentrált belső standardoldat, c = 2,50 μmol/ml: Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2728 g α-metil-triptofánt (3.3.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 oC-on maximum négy hétig.

3.17. A triptofán kalibráló standardoldata és a belső standard: Vegyünk 2,00 ml-t a triptofán koncentrált oldatából (3.15.) és 2,00 ml-t a koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatból (3.16.). Oldjuk fel vízben (3.1.) és metil-alkoholban (3.8.) a kész hidrolizátuméval körülbelül azonos térfogatra és körülbelül azonos metil-alkohol koncentrációra (10–30 %). Az oldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni. Készítés során közvetlen napfényhatástól óvjuk.

3.18. Ecetsav

3.19. 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol.

3.20. Etanolamin w (w/w) > 98 %

3.21. 1 g 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) 100 ml metil-alkoholban készített oldata (3.8.).

3.22. Mozgófázis a HPLC-hez: 3,00 g ecetsav (3.18.) + 900 ml víz (3.1.) +1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) metil-alkoholban (3.8.) készített oldatának (3.21.) 50,0 ml-e (1 g/100 ml). A pH-t állítsuk 5,00-re etanolaminnal (3.20.). Az oldatot vízzel (3.1.) töltsük fel 1 000 ml-re.

4. Eszközök

4.1. HPLC-berendezés spektrofluorometriás detektorral

4.2. Folyadékkromatográfiás oszlop, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm töltet, vagy azzal egyenértékű oszlop

4.3. pH-mérő

4.4. Polipropilén lombik, 125 ml térfogatú, széles nyakkal és csavaros zárókupakkal

4.5. 0,45 μm-es membránszűrő

4.6. Autokláv, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar

4.7. Mechanikus vagy mágneses keverőberendezés

4.8. Kémcsőkeverő (vortex).

5. A vizsgálat módja

5.1. A minták elkészítése

Őröljük meg a mintát annyira, hogy az átjusson egy 0,5 mm-es szemméretű szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 oC-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.9.) extrahálni kell.

5.2. A szabad triptofán (kivonat) meghatározása

1 mg-os pontossággal mérjünk be az elkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) egy Erlenmeyer-lombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml sósavat, k = 0,1 mól/l (3.13.) és 5,00 ml koncentrált belső standardoldatot (3.16.). Rázzuk vagy keverjük 60 percen át mechanikus rázógépen vagy mágneses keverőn (4.7.). Engedjük a zagyot leülepedni, majd pipettázzunk a felülúszó oldatból 10,0 ml-t főzőpohárba. Adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Nátrium-hidroxiddal (3.10.) állítsuk a pH-t 3,0-ra. Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt (3.8.), hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (körülbelül a kalibráló standardoldat (3.17.) térfogatával megegyező térfogatra).

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a kivonatokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 oC-on legfeljebb három napig tárolhatók.

5.3. Az összes triptofán (hidrolizátum) meghatározása

Az elkészített mintából (5.1.) mérjünk be 0,2 mg-os pontossággal 0,1–1 g-ot a polipropilén lombikba (4.4.). A kimért mintamennyiség nitrogéntartalmának kb. 10 mg-nak kell lennie. Adjunk hozzá 8,4 g bárium-hidroxid-oktahidrátot (3.4.) és 10 ml vizet. Keverjük össze kémcsőkeverővel (4.8.) vagy mágneses keverőn (4.7.). A teflonbevonatú mágnest hagyjuk a keverékben. Mossuk le 4 ml vízzel az edény falát. Helyezzük rá a csavaros zárókupakot, és lazán zárjuk le a lombikot. Helyezzük autoklávba (4.6.) forró vízzel, és gőzöljük 30–60 percig. Zárjuk be az autoklávot, és autoklávozzuk 110 (±2) oC hőmérsékleten 20 órán át.

Az autokláv kinyitása előtt csökkentsük a hőmérsékletet kevéssel 100 oC alá. A Ba(OH)2 .0,8 H2O kikristályosodásának elkerülése érdekében adjunk a meleg keverékhez 30 ml, szobahőmérsékletű vizet. Óvatosan rázzuk vagy keverjük össze. Adjunk hozzá 2,00 ml koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatot (3.16.). Hűtsük az edényeket víz- vagy jégfürdőben 15 percen át.

Ezután adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat (3.14.). Tartsuk az edényt a hűtőfürdőben, és keverés közben semlegesítsük az oldatot sósavval (3.11.), majd állítsuk a pH-t 3,0-ra sósavval (3.12.). Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt, hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (például 100 ml-re). Ügyeljünk, hogy a metil-alkohol hozzáadása ne okozzon kicsapódást.

A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.

A standardoldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a hidrolizátumokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 oC-on legfeljebb három napig tárolhatók.

5.4. Meghatározás HPLC-vel

Az izokratikus elúcióra vonatkozó következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; más paraméterek is alkalmazhatók, feltéve, hogy ezzel egyenértékű eredményeket adnak (lásd még az Észrevételek 9.1. és 9.2. pontját).







Folyadékkromatográfiás oszlop (4.2.): C18, 125 mm × 4 mm, 3 μm-es töltettel, vagy ezzel egyenértékű berendezés. Oszlophőmérséklet: szobahőmérséklet Mozgófázis (3.22.): 3,00 g ecetsav (3.18.) + 900 ml víz (3.1.) + az 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) metil-alkohollal (3.8.) készült oldatának (3.21.) (1 g/100 ml) +50,0 ml-e. A pH-t etanolaminnal (3.20.) állítsuk 5,00-re. Töltsük fel vízzel (3.1.) 1 000 ml-re. Átáramlási sebesség: 1 ml/perc. Teljes futásidő: körülbelül 34 perc Kimutatási hullámhossz: gerjesztés: 280 nm, emisszió: 356 nm. Befecskendezett mennyiség: 20 μl.

6. Az eredmények kiszámítása

100 g mintában lévő triptofán grammban kifejezett mennyiségét (X) az alábbiak szerint számítjuk.

A = a belső standard, standard kalibrálóoldat (3.17.) csúcsterülete

B = a triptofán -kivonat (5.2.) vagy -hidrolizátum (5.3.) csúcsterülete

V1 = a kalibrálóoldathoz (3.17.) hozzáadott koncentrált triptofánoldat (3.15.) térfogata ml-ben (2 ml)

c = a kalibrálóoldathoz (3.17.) hozzáadott koncentrált triptofánoldat (3.15.) koncentrációja, μmol/ml-ben (= 2,50)

V2 = az extrahálásnál (5.2.) (= 5,00 ml) vagy a hidrolizátumhoz (5.2.) (= 2,00 ml) hozzáadott, koncentrált belső standardoldat (3.16.) térfogata ml-ben

C = a belső standard, kivonat (5.2.) vagy hidrolizátum (5.3.) csúcsterülete

D = a triptofán, standard kalibrálóoldat (3.17.) csúcsterülete

V3 = a standard kalibrálóoldathoz (3.17.) hozzáadott, koncentrált belső standardoldat (3.16.) térfogata, ml-ben (= 2,00 ml)

m = a minta tömege, g-ban (szárított és/vagy zsírtalanított minta esetében az eredeti tömegre korrigált)

M = a triptofán molekulatömege (= 204,23 g/mol)

7. Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 10 %-át.

8. A körvizsgálat eredményei

Közösségi körvizsgálatra került sor (negyedik körvizsgálat), amelynek során három mintát vizsgáltak meg a hidrolízis módszerének hitelesítése céljából, 12 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizálták. Az eredmények a következő táblázatban szerepelnek:







1. minta Sertéstáp 2. minta L-triptofánnal kiegészített sertéstáp 3. minta Takarmánykoncentrátum sertések számára L 12 12 12 n 50 55 50 Átlag [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = eredményeket beküldő laboratóriumok száma

n = a (Cochran- és Dixon-próbával azonosított) kiugró értékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek száma

sr = az ismételhetőség szórása

SR = a reprodukálhatóság szórása

r = ismételhetőség

R = reprodukálhatóság

CVr = az ismételhetőség relatív szórása, %

CVR = a reprodukálhatóság relatív szórása, %

Egy másik közösségi körvizsgálatot is végeztek (harmadik körvizsgálat), amelynek során két mintát vizsgáltak meg a szabad triptofán kivonására használt módszer hitelesítése céljából, 13 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizálták. Az eredmények a következő táblázatban szerepelnek:







4. minta Búza és szója keveréke 5. minta Búza és szója keveréke (= 4. minta), hozzáadott triptofánnal (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Átlag [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = eredményeket beküldő laboratóriumok száma

n = a (Cochran- és Dixon-próbával azonosított) kiugró értékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek száma

sr = az ismételhetőség szórása

SR = a reprodukálhatóság szórása

r = ismételhetőség

R = reprodukálhatóság

CVr = az ismételhetőség relatív szórása, %

CVR = a reprodukálhatóság relatív szórása, %

Egy további közösségi körvizsgálatot is végeztek, amelynek során négy mintát vizsgáltak meg a triptofán hidrolízisére használt módszer hitelesítése céljából, hét laboratóriumban. Az eredmények az alábbi táblázatban szerepelnek. Mindegyik mintát többször (5) analizálták.







1. minta Kevert sertéstáp (CRM 117) 2. minta Alacsony zsírtartalmú halliszt (CRM 118) 3. minta Szójaliszt (CRM 119) 4. minta Fölözött tejpor (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Átlag [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = eredményeket beküldő laboratóriumok száma

n = a (Cochran- és Dixon-próbával azonosított) kiugró értékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek száma

sr = az ismételhetőség szórása

SR = a reprodukálhatóság szórása

r = ismételhetőség

R = reprodukálhatóság

CVr = az ismételhetőség relatív szórása, %

CVR = a reprodukálhatóság relatív szórása, %

9. Észrevételek

9.1. Speciális kromatográfiás paraméterek alkalmazása a triptofán és az α-metil-triptofán jobb elválasztását teheti lehetővé. Izokratikus elúció, majd grádiens oszlopon történő tisztítás:



Folyadékkromatográfiás oszlop: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm töltet, vagy ezzel egyenértékű oszlop Oszlophőmérséklet: 32 oC Mozgófázis: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metil-alkohol, 95+5 (V+V). B: Metil-alkohol Grádiens program: 0 perc 100 % A 0 % B 15 perc 100 % A 0 % B 17 perc 60 % A 40 % B 19 perc 60 % A 40 % B 21 perc 100 % A 0 % B 33 perc 100 % A 0 % B Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc Teljes futtatási idő: körülbelül 33 perc.

9.2. A kromatográfia a HPLC típusától és az oszloptöltetként alkalmazott anyagtól függően változik. A választott rendszernek képesnek kell lennie a triptofán és a belső standard alapvonalon történő elválasztására. Fontos továbbá, hogy a bomlástermékek jól elváljanak a triptofántól és a belső standardtól. A belső standard nélküli hidrolizátumokat is futtatni kell a belső standard alatti alapvonal szennyezettségének ellenőrzése céljából. Fontos, hogy a futtatási idő elég hosszú legyen az összes bomlástermék eluálásához, mert különben a későn eluálódó csúcsok zavarhatják a későbbi kromatográfiás futtatásokat. A kromatográfiás rendszernek a működési tartományban lineáris választ kell adnia. A lineáris választ a belső standard állandó (a normális) koncentrációjával és a triptofán változó koncentrációival kell mérni. Fontos, hogy mind a triptofán-, mind a belső standard csúcsok nagysága a HPLC/fluoreszcens rendszer lineáris tartományába essen. Ha a triptofán- és/vagy a belső standard csúcs(ok) túl kicsi(k) vagy túl nagy(ok), az analízist meg kell ismételni más mintamérettel és/vagy más végtérfogattal.

9.3. Bárium-hidroxid Állás hatására a bárium-hidroxid egyre nehezebben oldódik. Ennek következtében a HPLC-meghatározáshoz használt oldat zavaros lesz, ami alacsony triptofánértékeket eredményezhet.

H. NYERSOLAJOK ÉS ZSÍROK MEGHATÁROZÁSA

1. Cél és alkalmazási terület

Ez a módszer az állati takarmányokban lévő nyersolajok és zsírok meghatározására szolgál. Nem vonatkozik az olajos magvakra és olajtartalmú gyümölcsökre.

A továbbiakban leírt két módszer használata a takarmány jellegétől és összetételétől, valamint az analitikai vizsgálat céljától függ.

1.1. A. eljárás – Közvetlenül extrahálható nyersolajok és zsírok

Ez a módszer a növényi eredetű takarmány-alapanyagok esetében alkalmazható, kivéve azokat, amelyek a B. módszer tárgykörébe esnek.

1.2. B. eljárás – Összes nyersolaj és zsír

Ez a módszer az állati eredetű takarmány-alapanyagok és minden összetett takarmány esetében alkalmazható. Mindazon anyagokra alkalmazandó, amelyekből az olajok és a zsírok teljesen nem extrahálhatók előzetes hidrolízis nélkül (pl. sikér, élesztő, burgonyafehérjék és extrudálás, a pelyhesítés és a melegítés révén készített termékek).

1.3. Az eredmények értelmezése

Mindazon esetekben, amikor magasabb eredményt kapunk a B. eljárással, mint az A. eljárással, a B. eljárással kapott eredményt tekintsük a helyes értéknek.

2. Vizsgálati alapelv

2.1. A. módszer

A mintát petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepároljuk, a maradékanyagot megszárítjuk, és megmérjük.

2.2. B. módszer

A mintát melegítés közben sósavval kezeljük. A keveréket lehűtjük, és leszűrjük. A maradékanyagot kimossuk, megszárítjuk és a meghatározást az A. módszer szerint végezzük el.

3. Reagensek

3.1. Petroléter, forráspont tartománya: 40–60 oC. Brómszáma kisebb legyen 1-nél, és a bepárlási maradékanyaga kisebb legyen, mint 2 mg/100 ml.

3.2. Nátrium-szulfát, vízmentes.

3.3. Sósav, c = 3 mól/l

3.4. Szűrési segédanyag, pl. Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4. Eszközök

4.1. Extrahálókészülék. Amennyiben szifonnal ellátott készülékről van szó (Soxhlet-készülék) a visszafolyás mértéke körülbelül óránként 10 ciklus legyen; ha nem szifonos típust használunk, a visszafolyás mértéke körülbelül percenként 10 ml legyen.

4.2. Extrahálótégely, petroléterben oldható anyagoktól mentes, a 4.1. pont követelményeinek megfelelő porozitással.

4.3. Szárítókemence, amely lehet 75 ± 3 oC-ra beállított vákuumkemence vagy 100 ± 3 oC-ra beállított légkeveréses kemence.

5. A vizsgálat módja

5.1. A. módszer (lásd 8.1. pont)

1 mg pontossággal mérjünk ki 5 g mintát, töltsük át egy extraháló tégelybe (4.2.), és fedjük be egy zsírmentes gyapotvattatamponnal.

Tegyük az extraháló tégelyt az extrahálókészülékbe (4.1.), és extraháljuk hat órán keresztül petroléterrel (3.1.). A petroléter-kivonatot egy horzsakődarabokat ( 24 ) tartalmazó, száraz, lemért lombikba gyűjtsük.

Pároljuk be az oldószert. A lombikot másfél órán át tartsuk a szárítókemencében (4.3.), hogy a maradékanyag megszáradjon. Hagyjuk kihűlni egy exszikkátorban, és mérjük meg a tömegét. Ismét szárítsuk 30 percig annak biztosítása érdekében, hogy az olajok és zsírok tömege stabilizálódjon (a tömegveszteség a két egymást követő mérés között legfeljebb 1 mg lehet).

5.2. B. módszer

1 mg pontossággal mérjünk ki 2,5 g mintát (lásd 8.2. pont), tegyük egy 400 ml-es főzőpohárba vagy egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba, adjunk hozzá 100 ml sósavat (3.3.) és horzsakődarabokat. Fedjük le a főzőpoharat egy óraüveggel, vagy csatlakoztassunk az Erlenmeyer-lombikhoz egy visszafolyós hűtőt. Lassú lángon vagy főzőlapon enyhén forraljuk fel, és tartsuk így egy órán keresztül. Ne hagyjuk, hogy az anyag odatapadjon az edény falához.

Hűtsük le, és adjunk hozzá annyi szűrési segédanyagot (3.4.), amely elég ahhoz, hogy megakadályozza a szűrés folyamán keletkező olaj- vagy zsírveszteséget. Szűrjük át egy nedvesített, zsírmentes, kettős szűrőpapíron. Addig mossuk hideg vízzel a maradékanyagot, amíg semleges szűrletet nem kapunk. Ellenőrizzük, hogy a szűrlet nem tartalmaz olajat vagy zsírokat. Ezek jelenléte azt jelzi, hogy a mintát a hidrolízis előtt petroléterrel extrahálni kell az A. módszer szerint.

Tegyük a maradékanyagot tartalmazó kettős szűrőpapírt egy óraüvegre, és szárítsuk a légkeveréses kemencében (4.3.) másfél órán keresztül, 100 oC ± 3 oC-on.

Tegyük a száraz maradékanyagot tartalmazó kettős szűrőpapírt egy extrahálótégelybe (4.2.), és fedjük le egy zsírmentes üvegvatta tamponnal. Helyezzük az extrahálótégelyt egy extrahálókészülékbe (4.1.), és folytassuk a műveletet az 5.1. pont második és harmadik bekezdése szerint.

6. Az eredmény kifejezése

A maradékanyag tömegét a minta százalékában fejezzük ki.

7. Ismételhetőség

Ugyanazon a mintán, ugyanazon analitikus által végzett két párhuzamos meghatározás eredménye közötti különbség nem haladhatja meg:

— az 5 % alatti nyersolaj és zsírtartalmaknál a 0,2 %-ot, abszolút értékben,

— 5–10 % közötti olaj- és zsírtartalom esetében a 4,0 %-ot, a legmagasabb eredményhez viszonyítva,

— a 10 % feletti nyersolaj és zsírtartalmaknál a 0,4 %-ot, abszolút értékben.

8. Észrevételek

8.1. Magas olaj- és zsírtartalmú termékeknél, amelyeket nehéz felaprítani, vagy amelyek nem alkalmasak arra, hogy homogén vizsgálati mintát képezzünk belőlük, a következőképpen járjunk el: 1 mg pontossággal mérjünk ki 20 g mintát, és keverjük össze 10 g vagy annál több vízmentes nátriumszulfáttal (3.2.). Extraháljuk petroléterrel (3.1.) az 5.1. pont szerint. A kapott kivonatot töltsük fel petroléterrel (3.1.) 500 ml-re, és keverjük össze. Helyezzünk 50 ml oldatot egy horzsakődarabokat tartalmazó, száraz, lemért kis lombikba. Pároljuk be az oldószert, szárítsuk, majd az 5.1 pont utolsó bekezdésében leírtak szerint járjunk el. Távolítsuk el az oldószert az extrahálótégelyben hagyott maradékanyagból, aprítsuk fel a maradékanyagot 1 mm-es finomságúra, tegyük vissza az extrahálótégelybe (ne adjunk hozzá nátriumszulfátot), és az 5.1. pont második és harmadik bekezdésében leírtak szerint folytassuk a műveletet. Az olaj- és zsírtartalmat a minta százalékában számítsuk ki a következő képlet segítségével: (10m1 + m2) × 5 ahol: m1 = a maradéka