Neuvoston asetuksen (EY) N:o 1234/2007 (1) 120 g artiklan ensimmäisessä kohdassa tarkoitettujen määritysmenetelmien luettelo ja kuvaus

(julkaistu 10 päivänä heinäkuuta 2009 annetun komission asetuksen (EY) N:o 606/2009 (2) 15 artiklan 2 kohdan mukaisesti)

2010/C 43/01

Jäljempänä olevassa taulukossa esitetään luettelo määritysmenetelmistä, joita sovelletaan rypäletuotteiden tuotantoa koskevassa yhteisön lainsäädännössä vahvistettujen raja-arvojen ja vaatimusten valvonnassa. Kolmannessa sarakkeessa on viite asianomaisen parametrin vastaavaan määritysmenetelmään, joka kuvataan OIV:n viinien ja rypäleen puristemehujen kansainvälisten määritysmenetelmien kokoelman (Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des moûts) tämän julkaisun päivämääränä saatavilla olevassa viimeisimmässä painoksessa (2009). Kunkin parametrin osalta kuvataan vain vertailumenetelmät (OIV:n luokittelun mukainen I tyyppi tai II tyyppi), lukuun ottamatta parametreja, joille ei ole tällä hetkellä voimassaolevaa I tai II tyypin menetelmää. Menetelmien kuvaus on tiedonannon liitteessä.

Huomautus:

OIV:n kokoelman liitteessä A olevassa I jaksossa on määritelty eri määritysmenetelmätyypit, esimerkiksi I tyyppi (Ensisijainen vertailumenetelmä), II tyyppi (Vertailumenetelmä) ja IV tyyppi (Väliaikainen menetelmä).

Lyijyn ja kadmiumin määritysmenetelmät kuvataan nykyisellään 28 päivänä maaliskuuta 2007 annetussa komission asetuksessa (EY) N:o 333/2007 (3) (liitteessä oleva C.3 kohta). Koska 23 päivänä helmikuuta 2006 annetun asetuksen (EY) N:o 401/2006 (4) liitteessä II olevassa 4 kohdassa vahvistetaan yleiset vaatimukset okratoksiini A:n määritysmenetelmille, sille ei ole tarpeen kuvata erityistä rypäletuotteisiin sovellettavaa menetelmää.

MÄÄRITYSMENETELMIEN LUETTELO

OIV:ssä tarkistetaan parhaillaan eräiden määritysmenetelmien kuvausta. Kuvaukset julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin kokoelman Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa.

(1) EUVL L 299, 16.11.2007.

(2) EUVL L 193, 24.7.2009, s. 1.

(3) EUVL L 88, 29.3.2007, s. 29.

(4) EUVL L 70, 9.3.2006, s. 12.

LIITE

SISÄLLYSLUETTELO

1. TIHEYS JA SUHTEELLINEN TIHEYS 20 °C:SSA (OIV-AS2-01-MASVOL) – I tyypin menetelmä

2. RYPÄLEEN PURISTEMEHUN, TIIVISTETYN RYPÄLEEN PURISTEMEHUN JA PUHDISTETUN TIIVISTETYN RYPÄLEEN PURISTEMEHUN SOKERIPITOISUUDEN MÄÄRITYS REFRAKTOMETRILLÄ (OIV-AS2-02-SUCREF) – I tyypin menetelmä

3. KOKONAISKUIVA-AINE (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Kuiva-aineen kokonaispitoisuus – I tyypin menetelmä

4. VEDEN HAPPI-18- JA HAPPI-16ISOTOOPPIEN SUHTEEN MÄÄRITYS VIINISSÄ (OIV-AS-2-09-MOUO18) – II tyypin menetelmä

5. FOLIN-CIOCALTEU-LUKU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – IV tyypin menetelmä

6. GLUKOOSI JA FRUKTOOSI (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – II tyypin menetelmä

7. SOKERIEN (SAKKAROOSI) MÄÄRITYS HPLC-KROMATOGRAFIALLA (OIV-AS-311-03-SUCRES) – II tyypin menetelmä

8. RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN JA VIININ VÄKEVÖINNIN HAVAITSEMINEN DEUTERIUMIN YDINMAGNEETTISTA RESONANSSIA SOVELTAMALLA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – I tyypin menetelmä

9. ALKOHOLIPITOISUUS TILAVUUSPROSENTTEINA (OIV-AS-312-01-TALVOL) – I tyypin menetelmä

10. VIINIETANOLIN TAI RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN JA PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN KÄYMISESTÄ SAADUN ETANOLIN 13 C- ja 12 C-ISOTOOPPIEN SUHTEEN MÄÄRITYS MASSASPEKTROMETRILLÄ (OIV-AS-312-06-ETHANO) – II tyypin menetelmä

11. KOKONAISHAPPOPITOISUUS (OIV-AS-313-01-ACITOT) – I tyypin menetelmä

12. HAIHTUVAT HAPOT (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – I tyypin menetelmä

13. SITRUUNAHAPPO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – II tyypin menetelmä

14. SORBIINIHAPPO (OIV-AS-313-14-ACISOR) – IV tyypin menetelmä

15. pH (OIV-AS-313-15-PH) – I tyypin menetelmä

16. L-ASKORBIINIHAPON JA D-ISOASKORBIINIHAPON MÄÄRITYS SAMANAIKAISESTI HPLC-KROMATOGRAFIAN JA UV-DETEKTION AVULLA (OIV-AS-313-22-ACASCO) – II tyypin menetelmä

17. HIILIDIOKSIDI (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – II tyypin menetelmä

18. VIININ SISÄLTÄMÄN HIILIDIOKSIDIN MÄÄRITYS MANOMETRISELLÄ MENETELMÄLLÄ (OIV–AS314-04-CO2MAN) – II tyypin menetelmä

19. HELMEILEVIEN VIINIEN JA KUOHUVIINIEN PAINEEN MITTAUS (OIV-AS-314-02-SURPRES) – I tyypin menetelmä

20. Viinin sisältämän lysotsyymin määritys HPLC-kromatografian avulla (OIV-AS-315-14) – IV tyypin menetelmä

21. SULFAATIT (OIV-AS-321-05-SULFAT) – II tyypin menetelmä

22. RAUTA (OIV-AS-322-05-FER) – IV tyypin menetelmä

23. KUPARI (OIV–AS-322-06) – IV tyypin menetelmä

24. RIKKIDIOKSIDI (OIV-AS-323-04-DIOSU) – II tyypin menetelmä

1 TIHEYS JA SUHTEELLINEN TIHEYS 20 °C:SSA (OIV-AS2-01-MASVOL) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄT

Tiheys on tietyn viinimäärän tai rypäleen puristemehumäärän massan suhde sen tilavuuteen 20 °C:ssa. Tiheys ilmoitetaan grammoina millilitrassa ja sen tunnus on ρ20 oC.

Suhteellinen tiheys 20 °C:ssa tai tiheys 20 °C/20 °C on tietyn viinimäärän tai rypäleen puristemehumäärän massan suhde saman vesimäärän massaan 20 °C:ssa desimaalilukuna ilmaistuna. Sen tunnus on

2. MENETELMIEN PERIAATE

Tiheys ja suhteellinen tiheys 20 °C:ssa mitataan määritettävästä näytteestä

joko pyknometrillä: vertailumenetelmä,

tai hydrostaattisella vaa’alla tai sähköisellä tiheysmittarilla.

Huomautus:

Hyvin tarkoissa määrityksissä tiheys on korjattava rikkidioksidin vaikutuksen suhteen.

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 · S ρ20 °C = korjattu tiheys ρ′20 °C = havaittu tiheys S = kokonaisrikkidioksidi, g/l

3. NÄYTTEEN VALMISTAMINEN

Jos viini tai rypäleen puristemehu sisältää huomattavia määriä hiilidioksidia, suurin osa siitä voidaan poistaa ravistelemalla 250 ml viiniä 1 000 ml:n pullossa tai suodattamalla alipaineessa läpi putken, jossa on 2 g vanua.

4. VERTAILUMENETELMÄ

4.1. Välineistö

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti:

4.1.1. Noin 100 ml:n pyrex-lasinen pyknometri (1), jossa on irrallinen hioksellinen lämpömittari, jonka 1/10 asteen välein oleva asteikko on välillä 10–30 °C. Lämpömittarin on oltava hyväksytty (kuva 1).

Pyknometrissä on 25 mm:n pituinen, sisähalkaisijaltaan enintään 1 mm oleva sivuputki, joka päättyy hiokseen. Sivuputkeen voidaan liittää ”keräyspullo”, joka koostuu putkesta, jonka toisessa päässä on kartiohios ja toisessa päässä kapea poistoputki. Sitä käytetään paisuntasäiliönä.

Laitteen molempien hiosten on oltava hyvin huolellisesti tehtyjä.

4.1.2. Ulkotilavuudeltaan pyknometrin kokoinen taara (vähintään 1 ml:n tarkkuudella), jonka massa on sama kuin pyknometrin massa, joka on täytetty nesteellä, jonka tiheys on 1,01 (2,0 % natriumkloridiliuos (m/v)).

Lämpöeristevaippa, joka mukautuu täydellisesti pyknometrin muotoon.

4.1.3. Tasavarsivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 300 g ja tarkkuus 0,1 mg,

tai

yksikuppivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 200 g ja tarkkuus 0,1 mg.

4.2. Pyknometrin kalibrointi

Pyknometrin kalibroinnissa määritetään

— tyhjän pyknometrin taara,

— pyknometrin tilavuus 20 °C:ssa,

— vedellä täytetyn pyknometrin massa 20 °C:ssa.

4.2.1. Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessä

Taara asetetaan tasavarsivaa'an vasempaan vaakakuppiin ja puhdas kuiva pyknometri, joka on varustettu paisuntasäiliöllä, oikeaan vaakakuppiin. Lisätään punnuksia siihen vaakakuppiin, jossa pyknometri on, kunnes tasapaino on saavutettu. Kirjataan punnuksien paino p grammaa.

Pyknometri täytetään huolellisesti huoneenlämpöisellä tislatulla vedellä ja lämpömittari asetetaan paikoilleen: pyknometri kuivataan huolellisesti ja se kiedotaan lämpöeristevaippaan. Sekoitetaan kääntelemällä säiliötä, kunnes lämpömittarin osoittama lämpötila ei muutu. Säädetään taso tarkalleen sivuputken reunaan. Kuivataan sivuputki ja asetetaan paisuntasäiliö paikoilleen: luetaan lämpötila t °C huolellisesti ja korjataan lukema mittarin mahdollisen epätarkkuuden suhteen. Punnitaan vedellä täytetty pyknometri ja luetaan paino p' grammoina, kun tasapaino saavutetaan.

Laskeminen

Tyhjän pyknometrin taaraus: tyhjän pyknometrin taara= p + m m= pyknometrin sisältämän ilman massa m= 0,0012 (p – p′).

Tilavuus 20 °C:ssa: V20 °C= (p + m – p′) · Ft Ft= taulukosta 1 saatu kerroin lämpötilalle t °C V20 °C on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella.

Veden massa 20 °C:ssa: M20 °C= V20 °C · 0,998203 0,998203= jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa.

4.2.2. Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessä

Määritetään

— puhtaan ja kuivan pyknometrin massa: P

— vedellä täytetyn pyknometrin massa P1 lämpötilassa t °C kohdassa 4.2.1 kuvatulla tavalla

— taaran massa: T0

Laskeminen

Tyhjän pyknometrin taaraus:

tyhjän pyknometrin taara= P – m m= pyknometrin sisältämän ilman massa m= 0,0012 (P1 – P)

Tilavuus 20 °C:ssa: V20 °C= [P1 – (P – m)] · Ft Ft= taulukosta 1 saatu kerroin lämpötilalle t °C

Tilavuus 20 °C:ssa on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella.

Veden massa 20 °C:ssa: M20 °C= V20 °C · 0,998203 0,998203= jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa.

4.3. Mittausmenetelmä

4.3.1. Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessä

Täytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (kohta 3) ja menetellään kohdassa 4.2.1 kuvatulla tavalla.

p″ on se paino grammoina, joka vaaditaan tasapainon saavuttamiseksi lämpötilassa t °C.

Pyknometrin sisältämän nesteen massa = p + m – p″.

Näennäinen tiheys t °C:ssa:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Tiheys 20 °C:ssa lasketaan jäljempänä olevien korjaustaulukoiden avulla tutkitun nesteen tyyppi huomioon ottaen: kuiva viini (taulukko II), luonnollinen tai tiivistetty rypäleen puristemehu (taulukko III), makea viini (taulukko IV).

Viinin suhteellinen tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203.

4.3.2. Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessä

Taara punnitaan. Sen massa on T.

Lasketaan dT = T1 – T0.

Tyhjän pyknometrin massa mittaushetkellä = P – m + dT.

Täytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (kohta 3) ja menetellään kohdassa 4.2.1 kuvatulla tavalla. P2 on sen massa t °C:ssa.

Pyknometrin sisältämän nesteen massa t °C:ssa = P2 – (P – m + dT).

Näennäinen tiheys t °C:ssa:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/V20 °C

Lasketaan tutkitun nesteen tiheys 20 °C:ssa (kuiva viini, luonnollinen tai tiivistetty rypäleen puristemehu, makea viini) kohdassa 4.3.1 esitetyllä tavalla.

Suhteellinen tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203.

4.3.3. Tiheysmittausten toistettavuus

kuivat ja puolimakeat viinit: r = 0,00010

makeat viinit: r = 0,00018

4.3.4. Tiheysmittausten uusittavuus

kuivat ja puolimakeat viinit: R = 0,00037

makeat viinit: R = 0,00045

TAULUKKO I

Kertoimet F

joilla pyrex-lasisen pyknometrin t °C:ssa sisältämän veden massa on kerrottava pyknometrin tilavuuden laskemiseksi 20 °C:ssa

[Ks. menetelmän AS2 - 01 liitteessä II oleva taulukko I, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

TAULUKKO II

Lämpötilakorjaukset c kuivien viinien ja kuivien viinien, joista alkoholi on poistettu, pyrex-lasisella pyknometrillä t °C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa

[Ks. menetelmän AS2 - 01 liitteessä II oleva taulukko II, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

ρ20 = ρ t ± c/1 000 – jos t °C on alle 20 °C + jos t °C on yli 20 °C

TAULUKKO III

Lämpötilakorjaukset c luonnollisen ja tiivistetyn rypäleen puristemehun pyrex-lasisella pyknometrillä t °C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa

[Ks. menetelmän AS2 - 01 liitteessä II oleva taulukko III, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

ρ20 = ρ t ± c/1 000 – jos t °C on alle 20 °C + jos t °C on yli 20 °C

TAULUKKO IV

Lämpötilakorjaukset c vähintään 13 til-% jäännössokeria sisältävien viinien pyrex-lasisella pyknometrillä t °C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa

[Ks. menetelmän AS2 - 01 liitteessä II oleva taulukko IV, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

ρ20 = ρ t ± c/1 000 – jos t °C on alle 20 °C + jos t °C on yli 20 °C

2 RYPÄLEEN PURISTEMEHUN, TIIVISTETYN RYPÄLEEN PURISTEMEHUN JA PUHDISTETUN TIIVISTETYN RYPÄLEEN PURISTEMEHUN SOKERIPITOISUUDEN MÄÄRITYS REFRAKTOMETRILLÄ (OIV-AS2-02-SUCREF) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. MENETELMÄN PERIAATE

Rypäleen puristemehun, tiivistetyn rypäleen puristemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun sokeripitoisuus g/l ja g/kg saadaan vastaavasta taulukosta taitekertoimen avulla. Taitekerroin esitetään 20 °C:ssa lukuarvona tai sakkaroosin massaprosentteina.

2. VÄLINEISTÖ

2.1. Abbe-refraktometri

Käytetyssä refraktometrissä on oltava asteikko, josta näkyy:

— joko sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella,

— tai taitekertoimet neljän desimaalin tarkkuudella.

Refraktometrissä on oltava lämpömittari, jonka asteikko ulottuu mittausalueelle + 15 – 25 °C, ja kiertovesijärjestelmä, joka mahdollistaa mittausten tekemisen 20 °C ± 5 °C lämpötilassa.

Tämän laitteen käyttöohjeita on noudatettava tarkasti, erityisesti kalibroinnin ja valonlähteen osalta.

3. NÄYTTEEN VALMISTAMINEN

3.1 Rypäleen puristemehut ja tiivistetyt rypäleen puristemehut

Rypäleen puristemehu suodatetaan tarvittaessa kuivan, neljään osaan taitetun harson läpi, ensimmäiset suodostipat hylätään ja määritys tehdään suodatetusta tuotteesta.

3.2 Puhdistetut tiivistetyt rypäleen puristemehut

Konsentraation mukaan käytetään joko puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua tai liuosta, joka saadaan laimentamalla 200 g puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua 500 g:ksi vedellä; punnitseminen on tehtävä tarkasti.

4. SUORITUS

Saatetaan näytteen lämpötila lähelle 20 °C:ta. Asetetaan pieni näyte refraktometrin alemmalle prismalle ja tarkastetaan, että prismojen ollessa tiukasti toisiaan vasten näyte peittää lasipinnan kokonaan. Mittaus tehdään käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.

Luetaan sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella tai taitekerroin neljän desimaalin tarkkuudella.

Samasta valmistetusta näytteestä tehdään vähintään 2 määritystä. Kirjataan lämpötila t °C.

5. LASKEMINEN

5.1. Lämpötilakorjaus

5.1.1. Laitteet, joissa asteikko on sakkaroosin massaprosentteja: lämpötilan korjaamisessa käytetään taulukkoa I.

5.1.2. Laitteet, joissa asteikko on taitekerroin: etsitään t °C:ssa mitattu taitekerroin taulukosta II, josta saadaan (sarake 1) sakkaroosin massaprosentti t °C:ssa. Tämä arvo korjataan lämpötilan suhteen ja ilmoitetaan 20 °C:ssa taulukon I avulla.

5.2. Rypäleen puristemehun ja tiivistetyn rypäleen puristemehun sokeripitoisuus

Etsitään sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa taulukosta II, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhden desimaalin tarkkuudella.

5.3. Puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun sokeripitoisuus

Etsitään sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa taulukosta III, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhden desimaalin tarkkuudella.

Jos mittaus tehdään laimennetusta puhdistetusta tiivistetystä rypäleen puristemehusta, tulos kerrotaan laimennuskertoimella.

5.4 Rypäleen puristemehun, tiivistetyn rypäleen puristemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun taitekerroin

Etsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan taitekerroin 20 °C:ssa. Tämä taitekerroin esitetään neljän desimaalin tarkkuudella.

Huomautus: Rypäleen puristemehun, tiivistetyn rypäleen puristemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun potentiaalinen alkoholipitoisuus voidaan määrittää 25 päivänä heinäkuuta 2000 annetun komission asetuksen (EY) N:o 1623/2000 (EYVL L 194, 31.7.2000) liitteessä I olevan vastaavuustaulukon avulla.

TAULUKKO I

Tehtävät korjaukset, jos sakkaroosin massaprosentti on määritetty muussa lämpötilassa kuin 20 oC

[Ks. menetelmän AS2 - 02 liitteessä oleva taulukko I, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

TAULUKKO II

Taulukossa esitetään rypäleen puristemehun ja tiivistetyn rypäleen puristemehun sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Pitoisuus on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprosentti 20 oC:ssa tai taitekerroin 20 oC:ssa. Myös tiheys 20 oC:ssa on esitetty.

[Ks. menetelmän AS2 - 02 liitteessä oleva taulukko II, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

TAULUKKO III

Taulukossa esitetään puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Pitoisuus on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprosentti 20 oC:ssa tai taitekerroin 20 o C:ssa. Myös tiheys 20 oC:ssa on esitetty.

[Ks. menetelmän AS2 - 02 liitteessä oleva taulukko III, sellaisena kuin se on kuvattuna OIV:n kokoelmassa Recueil International des méthodes d’analyse]

3. KOKONAISKUIVA-AINE (OIV-AS-2-03-EXTSEC) KUIVA-AINEEN KOKONAISPITOISUUS – I TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄ

Kokonaiskuiva-aineen eli kuiva-aineen kokonaispitoisuuden muodostavat kaikki aineet, jotka eivät haihdu määritellyissä fysikaalisissa olosuhteissa. Näiden fysikaalisten olosuhteiden on oltava sellaiset, että kuiva-aineen muodostavat aineet muuttuvat mahdollisimman vähän.

Sokeriton kuiva-aine on kokonaiskuiva-ainepitoisuuden ja kokonaissokeripitoisuuden välinen erotus.

Vähennetty kuiva-aine on kokonaiskuiva-ainepitoisuus, josta on vähennetty 1 g/l ylittävä kokonaissokeripitoisuus, 1 g/l ylittävä kaliumsulfaattipitoisuus, mahdollinen mannitoli sekä muut viiniin mahdollisesti lisätyt kemikaalit.

Jäännöskuiva-aine on sokeriton kuiva-aine, josta on vähennetty viinihappona ilmoitetut kiinteät hapot.

Kuiva-aine ilmoitetaan grammoina litrassa ja se on määritettävä 0,5 g:n tarkkuudella.

2. MENETELMÄN PERIAATE

[Tämän määritysmenetelmän kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaus julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin kokoelman Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa. Siihen asti viitteellinen kuvaus on komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteessä olevassa 4 jaksossa.]

4 VEDEN HAPPI-18- JA HAPPI-16ISOTOOPPIEN SUHTEEN MÄÄRITYS VIINISSÄ (OIV-AS-2-09-MOUO18) – II TYYPIN MENETELMÄ

(p.m.)

[Tämän määritysmenetelmän kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaus julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin kokoelman Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa. Siihen asti viitteellinen kuvaus on komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteessä olevassa 43 jaksossa.]

5 FOLIN-CIOCALTEU-LUKU (OIV-AS-2-10-INDFOL) – IV TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄ

Folin-Ciocalteu-luku on jäljempänä kuvatulla menetelmällä saatu tulos.

2. PERIAATE

Viinin sisältämät fenoliset yhdisteet hapetetaan Folin-Ciocalteu-reagenssilla. Reagenssi koostuu fosfovolframihapon (H3PW12O40) ja fosfomolybdeenihapon (H3PMo12O40) seoksesta, joka fenolien hapettuessa pelkistyy sinisiksi volframi- (W8O23) ja molybdeenioksideiksi (Mo8O23).

Sinisen värin absorptio on korkeimmillaan noin 750 nm:ssä. Se on verrannollinen fenolisten yhdisteiden kokonaiskonsentraatioon.

3. REAGENSSIT

Reagenssien on oltava analyysilaatua. Käytetyn veden on oltava tislattua vettä tai vastaavan puhtausasteen vettä.

3.1. Folin-Ciocalteu-reagenssi

Tätä reagenssia on kaupallisesti saatavissa suoraan käytettävässä muodossa. Se voidaan valmistaa seuraavasti: Liuotetaan 100 g natriumvolframaattia (Na2WO4·2H2O) ja 25 g natriummolybdaattia (Na2MoO4·2H2O) 700 ml:aan tislattua vettä. Lisätään 50 ml 85 % fosforihappoa (ρ20 = 1,71 g/ml) ja 100 ml väkevää kloorivetyhappoa (ρ20 = 1,19 g/ml). Kuumennetaan kiehuvaksi ja keitetään 10 tuntia palautusjäähdyttimellä varustetussa kolvissa. Tämän jälkeen lisätään 150 g litiumsulfaattia (Li2SO4 H2O), muutama bromitippa ja keitetään uudelleen 15 minuutin ajan. Jäähdytetään ja täytetään yhdeksi litraksi tislatulla vedellä.

3.2. Vedetön natriumkarbonaatti (Na2CO3), 20 % (m/v) -liuos.

4. VÄLINEISTÖ

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti:

4.1. 100 ml:n mittapulloja.

4.2. Spektrofotometri, jota voidaan käyttää 750 nm:ssä.

5. SUORITUS

5.1. Punaviinit

Mitataan 100 ml:n (kohta 4.1) mittapulloon seuraavassa järjestyksessä:

1 ml suhteessa 1/5 laimennettua viiniä

50 ml tislattua vettä

5 ml Folin-Ciocalteu-reagenssia (3.1)

20 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.2).

Täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä.

Homogenoidaan ravistelemalla. Odotetaan 30 minuuttia reaktion tasoittumista. Mitataan absorbanssi 750 nm:ssä 1 cm:n valotiellä. Vertailunäytteessä käytetään viinin sijasta tislattua vettä.

Jos absorbanssi ei ole lähellä lukemaa 0,3, on viinin laimennusta muutettava.

5.2. Valkoviinit

Tehdään määritys samalla tavalla 1 ml:sta laimentamatonta viiniä.

5.3. Puhdistetut tiivistetyt rypäleen puristemehut

5.3.1. Näytteen valmistaminen

Käytetään liuosta, jonka sokeripitoisuus on 25 % (m/m) (25 °C Brix) ja joka on valmistettu luvun ”pH” kohdassa 4.1.2 kuvatulla tavalla.

5.3.2. Mittaus

Määritys tehdään samalla tavoin kuin punaviineille (kohta 5.1) 5 ml:sta kohdan 5.3.1 mukaisesti valmistettua näytettä. Mitataan näytteen absorbanssi sekä vertailunäytteen absorbanssi. Vertailunäyte valmistetaan 5 ml:sta 25 % (m/m) inverttisokeriliuosta.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

6.1. Laskentamenetelmä

Tulos ilmoitetaan lukuna, joka saadaan kertomalla absorbanssi 100:lla, jos kyseessä ovat suhteessa 1/5 laimennetut punaviinit (tai käytettyä laimennusta vastaavalla kertoimella), ja 20:llä, jos kyseessä ovat valkoviinit. Kun kyseessä ovat puhdistetut tiivistetyt rypäleen puristemehut, absorbanssi kerrotaan 16:lla.

6.2. Toistettavuus

Saman henkilön kahden samanaikaisesti tai nopeasti peräkkäin tekemän määrityksen välinen ero ei saa olla yli 1.

Tulosten hyvä toistettavuus saavutetaan käyttämällä erittäin puhtaita välineitä (mittapullot ja spektrofotometrin kyvetit).

6 GLUKOOSI JA FRUKTOOSI (OIV-AS-311-02-GLUFRU) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄ

Glukoosi ja fruktoosi voidaan määrittää erikseen entsymaattisella menetelmällä. Tällöin on tarkoituksena laskea glukoosin suhde fruktoosiin.

2. PERIAATE

Heksokinaasin (HK) katalysoimassa entsymaattisessa reaktiossa, jossa on mukana adenosiinitrifosfaattia (ATP), glukoosi fosforyloituu glukoosi-6-fosfaatiksi (G6P) ja fruktoosi fruktoosi-6-fosfaatiksi (F6P).

glukoosi + ATP←→G6P + ADP

fruktoosi + ATP←→F6P + ADP

Aluksi glukoosi-6-fosfaatti hapettuu nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADP) vaikutuksesta glukonaatti-6-fosfaatiksi glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasientsyymin (G6PDH) läsnäollessa. Pelkistyneen nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADPH) määrä vastaa glukoosi-6-fosfaatin määrää eli glukoosin määrää.

G6P + NADP+←→Glukonaatti-6-fosfaatti + NADPH + H+

Pelkistynyt nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti määritetään mittaamalla sen absorbanssi 340 nm:ssä.

Reaktion päättyessä fruktoosi-6-fosfaatti muutetaan fosfoglukoosi-isomeraasilla (PGI) glukoosi-6-fosfaatiksi:

F6P←→G6P

Glukoosi-6-fosfaatti reagoi jälleen nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin kanssa ja tuottaa glukonaatti-6-fosfaattia ja pelkistynyttä nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaattia; jälkimmäinen mitataan.

3. VÄLINEISTÖ

— Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaus 340 nm:ssä, jossa NADPH:n absorbanssi on suurimmillaan. Koska kyseessä ovat absoluuttiset mittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADPH:n ekstinktiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiasteikot on tarkistettava. Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään spektrofotometriä, jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä.

— Lasikyvettejä, joiden valotien pituus on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.

— Entsymaattisissa kokeissa käytettäviä pipettejä, 0,02–0,05–0,1–0,2 ml.

4. REAGENSSIT

4.1. Liuos 1: puskuriliuos (trietanoliamiini 0,3 M: pH = 7,6; Mg2+, 4 × 10–3 M): 150 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 11,2 g trietanoliamiinihydrokloridia (C2H5)3N HCl) ja 0,2 mg SO4 7 H2O, lisätään noin 4 ml 5 M natriumhydroksidiliuosta (NaOH) pH:n säätämiseksi arvoon 7,6 ja täytetään 200 ml:ksi.

Puskuriliuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa.

4.2. Liuos 2: nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti-liuos (noin 11,5 × 10-3 M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 50 mg dinatriumnikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaattia.

Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa.

4.3. Liuos 3: adenosiini-5'-trifosfaatti -liuos (noin 81 × 10–3 M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 250 mg dinatrium adenosiini-5'-trifosfaattia ja 250 mg natriumvetykarbonaattia NaHCO3.

Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa.

4.4. Liuos 4: Heksokinaasi/glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi: sekoitetaan 0,5 ml heksokinaasia (2 mg proteiinia/ml tai 280 U/ml) ja 0,5 ml glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasia (1 mg proteiinia/ml).

Liuos säilyy vuoden + 4 °C:ssa.

4.5. Liuos 5: Fosfoglukoosi-isomeraasi (2 mg proteiinia/ml tai 700 U/ml). Liuosta käytetään laimentamattomana.

Liuos säilyy vuoden + 4 °C:ssa.

Huomautus:

Kaikki tähän määritykseen tarvittavat reagenssit ovat kaupallisesti saatavilla.

5. SUORITUS

5.1. Näytteen valmistus

Arvioidun glukoosi + fruktoosimäärän/l mukaan tehdään seuraavat laimennukset:

Mittaus 340 ja 334 nm:ssä Mittaus 365 nm:ssä Laimennus vedellä Laimennuskerroin F 0,4 g/l asti 0,8 g/l asti — — 4,0 g/l asti 8,0 g/l asti 1 + 9 10 10,0 g/l asti 20,0 g/l asti 1 + 24 25 20,0 g/l asti 40,0 g/l asti 1 + 49 50 40,0 g/l asti 80,0 g/l asti 1 + 99 100 yli 40,0 g/l yli 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Määritys

Tehdään mittaukset 340 nm:n aallonpituudelle säädetyllä spektrofotometrillä, vertailuna ilma (ei kyvettiä valotiessä) tai vesi.

Lämpötila 20–25 °C.

Annostellaan kahteen 1 cm:n valotien kyvettiin:

Kontrolli Näyte Liuos 1 (4.1) (saatettu 20 °C:een) 2,50 ml 2,50 ml Liuos 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Liuos 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Määritettävä näyte 0,20 ml Tislattu vesi 0,20 ml

Sekoitetaan ja luetaan liuosten absorbanssi (A1) noin 3 minuutin kuluttua. Käynnistetään reaktio lisäämällä:

Liuos 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Sekoitetaan ja odotetaan 15 minuuttia. Luetaan absorbanssi ja tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A2).

Lisätään välittömästi:

Liuos 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Sekoitetaan. Luetaan absorbanssi 10 minuutin kuluttua ja tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A2).

Lasketaan absorbanssin erotukset vertailu- ja näyteliuoksille:

A2 — A1 vastaa glukoosia,

A3 — A2 vastaa fruktoosia.

Lasketaan absorbanssien erotukset vertailu-(ΔAT) ja näyteliuoksille (ΔAD), jolloin saadaan

glukoosille: ΔAG = ΔAD – ΔAT

fruktoosille: ΔAF = ΔAD – ΔAT

Huomautus:

Entsyymiaktiivisuuden loppuun saattamiseksi tarvittava aika voi vaihdella eri erien kohdalla. Suositeltu aika on vain ohjeellinen. Suositellaan, että vaikutusaika määritetään kullekin näyte-erälle.

5.3. Tulosten ilmoittaminen

5.3.1. Laskeminen

Konsentraatioiden yleinen laskukaava on:

C= V × PM/(ε × d × v × 1 000) × ΔA (g/l) jossa

V= koeliuoksen tilavuus (ml)

v= näytteen tilavuus (ml)

PM= määritettävän aineen molekyylimassa

d= kyvetin valotie (cm)

ε= NADPH:n absorptiokerroin 340 nm:ssä = 6,3 mmol–1 × l × cm–1

V= glukoosin määrityksessä 2,92 ml

V= fruktoosin määrityksessä 2,94 ml

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Saadaan:

glukoosille: C g/l = 0,417 × Δ AG

fruktoosille: C g/l = 0,420 × Δ AF

Jos näyte on laimennettu valmistamisen yhteydessä, tulos kerrotaan laimennuskertoimella F.

Huomautus:

Jos mittaukset on tehty aallonpituuksilla 334 tai 365 nm, saadaan:

— mittaus 334 nm:ssä: Σ = 6,2 mmol–1 × 1 × cm–1 glukoosille: C g/l = 0,425 × ΔAG fruktoosille: C g/l = 0,428 × ΔAF

— mittaus 365 nm:ssä: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1) glukoosille: C g/l = 0,773 × ΔAG fruktoosille: C g/l = 0,778 × ΔAF

5.3.2. Toistettavuus r

r= 0,056 xi

5.3.3. Uusittavuus R

R= 0,12 + 0,076·xi

xi= glukoosi- tai fruktoosipitoisuus grammoina litrassa.

7 SOKERIEN (SAKKAROOSI) MÄÄRITYS HPLC-KROMATOGRAFIALLA (OIV-AS-311-03-SUCRES) – II TYYPIN MENETELMÄ

(p.m.)

[Tämän määritysmenetelmän kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaus julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin kokoelman Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa. Siihen asti viitteellinen kuvaus on komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteessä olevassa 6 jakson 3 kohdassa.]

8 RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN JA VIININ VÄKEVÖINNIN HAVAITSEMINEN DEUTERIUMIN YDINMAGNEETTISTA RESONANSSIA SOVELTAMALLA (OIV-AS-311-05-ENRRMN) – I TYYPIN MENETELMÄ

(p.m.)

[Tämän määritysmenetelmän kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaus julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV:n yleiskokous on hyväksynyt lopullisen tekstin. Siihen asti viitteellinen kuvaus on komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteessä olevassa 8 jaksossa.]

9 ALKOHOLIPITOISUUS TILAVUUSPROSENTTEINA (OIV-AS-312-01-TALVOL) – I TYYPIN MENETELMÄ

(p.m.)

[Näiden määritysmenetelmien kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaukset julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin kokoelman Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa. Siihen asti viitteelliset kuvaukset on komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteessä olevassa 3 jaksossa.]

10 VIINIETANOLIN TAI RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN JA PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEEN PURISTEMEHUJEN KÄYMISESTÄ SAADUN ETANOLIN 13C- JA 12C-ISOTOOPPIEN SUHTEEN MÄÄRITYS MASSASPEKTROMETRILLÄ (OIV-AS-312-06-ETHANO) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. SOVELLUSALA

Menetelmällä voidaan mitata 13C- ja 12C-isotooppien suhde viinietanolissa ja viinirypäletuotteiden (rypäleen puristemehujen, tiivistettyjen rypäleen puristemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypäleen puristemehujen) käymisestä saadussa etanolissa.

2. VIITESTANDARDIT

ISO: 5725:1994 ”Mittausmenetelmien virheettömyys (oikeellisuus ja tarkkuus): perusmenetelmä standardimittausmenetelmän toistettavuuden ja uusittavuuden määrittämiseksi”. V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (belemniitti) (RPDB = 0,0112372). OIV:n menetelmä AS-311-O5-ENRRMN ”Rypäleen puristemehujen, tiivistettyjen rypäleen puristemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypäleen puristemehujen ja viinien rikastamisen määritys käyttäen hyväksi deuteriumin ydinmagneettista resonanssia (SNIF-NMR)”.

3. TERMIT JA MÄÄRITELMÄT

13C/12C : Hiilen 13C- ja 12C-isotooppien suhde näytteessä δ13C : Hiili-13-isotoopin eli 13C:n pitoisuus ilmaistuna promilleina (‰) SNIF-NMR : Isotooppien fraktiointi ydinmagneettisen resonanssin avulla V-PDB : Vienna-Pee-Dee Belemnite (belemniitti). PDB on ensisijainen vertailuaine mitattaessa hiili-13-pitoisuuden luonnollisia vaihteluja. Se koostuu Yhdysvaltojen Etelä-Carolinan osavaltiossa sijaitsevan Pee Dee -joen varrella sijaitsevasta esiintymästä löytyvien liitukaudelta peräisin olevien belemniitti-nimisten nilviäisten fossiilien sisältämästä kalsiumkarbonaatista. Sen 13C- ja 12C-isotooppien suhde eli RPDB = 0,0112372. PDB-varannot ovat loppuneet jo aikaa sitten, mutta se on säilyttänyt asemansa ensisijaisena vertailuaineena mitattaessa hiili-13-pitoisuuden luonnollisia vaihteluja, ja sen avulla kalibroidaan Wienissä Itävallassa sijaitsevan Kansainvälisen atomienergiajärjestön (IAEA:n) käyttämät vertailuaineet. Luonnossa esiintyvän hiili-13-isotoopin pitoisuudet ilmoitetaan tavallisesti suhteessa V-PDB:n vastaavaan arvoon. m/z : Massan ja varauksen suhde.

4. PERIAATE

Kasvit sitovat yhteyttämisessä hiilidioksidia kahden erilaisen aineenvaihduntamekanismin avulla. Ne ovat C3-sykli (Calvinin kierto) ja C4-sykli (Hatch-Slack-prosessi). Näissä kahdessa yhteyttämisprosessissa isotoopit jakautuvat eri tavalla. C4-prosessia käyttävien kasvien tuotteissa, kuten sokereissa ja käymistietä valmistetussa alkoholissa esiintyy enemmän hiili-13-isotooppia kuin vastaavissa C3-prosessia käyttävien kasvien tuotteissa. Useimmat kasvit, mukaan luettuina viiniköynnökset ja sokerijuurikkaat, käyttävät C3-prosessia. Sokeriruoko ja maissi käyttävät C4-prosessia. Mittaamalla hiili-13-isotoopin pitoisuus voidaan osoittaa ja arvioida rypäletuotteisiin (kuten rypäleen puristemehuihin ja viineihin) lisätyt C4-prosessista (sokeriruo'osta tai maissi-isoglukoosista) peräisin olevat sokerit. Hiili-13-isotoopin pitoisuudesta sekä SNIF-NMR-mittauksista saatavien tietojen avulla voidaan määrittää, paljonko tuotteisiin on lisätty C3- ja C4-kasveista peräisin olevia sokeri- tai alkoholiseoksia.

Hiili-13-isotoopin pitoisuus määritetään hiilidioksidista, joka syntyy näytteen täydellisessä palamisessa. Massaspektrometrin kolmeen eri ilmaisimeen tulevien ionivirtojen avulla määritetään käytännössä esiintyvien isotopomeerien suhteellinen määrä. Ne ovat massaluvuiltaan 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 et 12C17O16O) ja 46 (12C16O18O) edustaen isotooppien 18O, 17O, 16O, 13C ja 12C erilaisia mahdollisia yhdistelmiä. Isotopomeerien 13C17O16O ja 12C17O2 vaikutusta ei tarvitse ottaa huomioon, koska niiden määrät ovat niin pieniä. Massan ja varauksen suhdetta m/z = 45 vastaavan ionivirran arvo korjataan ottaen huomioon 12C17O16O-isopotomeerin vaikutus, joka lasketaan massan ja varauksen suhteelle m/z = 46 mitatun virranvoimakkuuden mukaisesti ottaen huomioon isotooppien 18O ja 17O suhteellinen yleisyys (Craigin korjaus). Vertaamalla tuloksia näytteeseen, joka on kalibroitu kansainvälisen V-PDB-vertailunäytteen avulla, voidaan hiili-13-isotoopin pitoisuus laskea ja ilmaista suhteellisella δ13C-asteikolla.

5. REAGENSSIT

Aineet ja tarvikkeet määräytyvät laboratorion käyttämän välineistön (6) mukaan. Yleensä käytetyt järjestelmät ovat periaatteeltaan alkuaineanalysaattoreita. Nämä järjestelmät voidaan varustaa niin, että näytteet voidaan tuoda niihin suljetuissa metallikapseleissa tai ruiskuttaa nestemäisinä septumin läpi injektioneulaa käyttäen.

Käytettävän laitteen mukaan voidaan käyttää seuraavia vertailuaineita, reagensseja ja tarvikkeita:

— vertailuaineet

— IAEA:sta saatavat: Nimi Aine δ13 C-lukema verrattuna V-PDB:hen (9) — IAEA-CH-6 sakkaroosi -10,4 ‰ — IAEA-CH-7 polyeteeni -31,8 ‰ — NBS22 öljy -29,7 ‰ — USGS24 grafiitti -16,1 ‰

— Aineet, joita toimittaa Geelissä Belgiassa sijaitseva vertailuaineiden ja mittausten tutkimuslaitos IRMM: Nimi Aine δ13C-lukema verrattuna V-PDB:hen (9) — CRM/BCR 656 viinialkoholi -26,93 ‰ — CRM/BCR 657 glukoosi -10,75 ‰ — CRM/BCR 660 vesi-alkoholiseos (12 tilavuus-%) -26,72 ‰

— Mittauksissa käytettävä standardinäyte, jonka 13C/12C-suhde tunnetaan ja joka on kalibroitu kansainvälisten vertailuaineiden avulla.

— Seuraavassa on suuntaa-antava luettelo jatkuvaa virtausta käyttävissä järjestelmissä käytettävistä tarvikkeista: — analyysipuhdas helium (CAS 07440-59-7), — analyysipuhdas happi (CAS 07782-44-7), — analyysipuhdas hiilidioksidi käytettäväksi toissijaisena vertailuaineena hiili-13-isotoopin pitoisuudelle (CAS 00124-38-9), — hapetusreagenssi näytteenpolttojärjestelmän uuniin, esimerkiksi alkuaineanalyysiin tarkoitettu kupari(II)oksidi (CAS 1317-38-0), — kuivausaine palamisessa syntyvän veden poistamiseen, esimerkiksi alkuaineanalyysiin tarkoitettu vedetön magnesiumperkloraatti kauppanimeltään Anhydrone (CAS 10034-81-8). Tätä ei tarvita laitteissa, jotka on varustettu vedenpoistojärjestelmillä, joissa käytetään kylmäloukkuja tai valikoivasti läpäiseviä kapillaareja.

6. VÄLINEISTÖ JA LAITTEET

6.1. Isotooppisuhdemassaspektrometri (IRMS)

Isotooppisuhde-massaspektrometri (IRMS), joka kykenee määrittämään luonnossa esiintyvän hiilidioksidin suhteellisen 13C-pitoisuuden siten, että sisäinen tarkkuus on suhteellisena arvona (kohta 9) ilmoitettuna 0,05 ‰ tai parempi. Tässä yhteydessä sisäinen tarkkuus määritellään siten, että se on kahden samasta hiilidioksidinäytteestä saadun mittausarvon ero. Isotooppisuhteiden mittaamiseen käytettävä massaspektrometri on yleensä varustettu kolmoisilmaisimella, jotta voidaan samanaikaisesti mitata massan ja varauksen suhteita m/z = 44, 45 ja 46 vastaavat intensiteetit. Isotooppisuhdemassaspektrometrissä on joko oltava kaksi tuloaukkoa näytteille, jotta mitattava näyte ja vertailunäyte voidaan mitata vuorotellen, tai siinä on oltava integroitu järjestelmä, jossa näytteet poltetaan kvantitatiivisesti ja hiilidioksidi erotetaan muista palamistuotteista ennen massaspektrometrimittausta.

6.2. Polttovälineistö

Polttovälineistö, jonka on kyettävä muuttamaan etanoli hiilidioksidiksi kvantitatiivisesti ja poistamaan kaikki muut palamistuotteet, kuten vesi, ilman että tapahtuu mitään isotooppien fraktioitumista. Välineistö voi olla joko jatkuvaan virtaukseen perustuva, massaspektrometriin integroitu laite (kohta 6.2.1) tai erillinen polttojärjestelmä (kohta 6.2.2). Välineistön on mahdollistettava vähintään kohdassa 11 mainittu tarkkuus.

6.2.1. Jatkuvaa virtausta käyttävät järjestelmät

Näissä laitteissa on joko alkuaineanalysaattori tai kaasukromatografi liitettynä online-periaatteella toimivaan polttojärjestelmään.

Järjestelmissä, joissa näyte tuodaan mitattavaksi metallikapselissa, tarvitaan seuraavat laboratoriovälineet:

— kalibroitu mikroruisku tai -pipetti, jossa on asianmukainen kärki,

— vaaka, jonka tarkkuus on 1 μg tai parempi,

— pinsetit kapselointia varten,

— tinakapseleita nestemäisiä näytteitä varten,

— tinakapseleita kiinteitä näytteitä varten.

Huomaa:

Jotta etanolinäytteiden haihtumisvaara olisi vähäisempi, kapseleihin voidaan laittaa absorboivaa materiaalia (kuten Chromosorb W 45–60 mesh). Absorbtioaine mitataan ensin ilman näytettä sen varmistamiseksi, ettei se sisällä merkittäviä määriä hiiltä, mikä saattaisi vaikuttaa tuloksiin.

Käytettäessä alkuaineanalysaattoria, jossa on nestemäisen näytteen ruiskutuslaite, tai kun käytössä on näytteenpolttokromatografiajärjestelmä, tarvitaan seuraavat laboratoriovälineet:

— injektioruisku nesteitä varten,

— pulloja, joissa on kaasutiiviit sulkimet ja inertit septumit.

Luetteloissa mainitut laboratoriovälineet ovat esimerkkejä, ja ne voidaan korvata muilla vastaavantasoisilla välineillä laboratoriossa käytettävän polttomenetelmän ja massaspektrometrilaitteen mukaan.

6.2.2. Erillinen näytteenvalmistusjärjestelmä

Analysoitavien näytteiden polttamisessa syntyneet hiilidioksidinäytteet sekä vertailunäyte kerätään pulloihin, jotka asetetaan isotooppianalyysiin tarkoitetun spektrometrin molempiin sisääntuloaukkoihin. Useita erilaisia kirjallisuudessa kuvattuja polttovälineistöjä voidaan käyttää:

— suljettu polttojärjestelmä, jossa kiertää happea,

— helium- ja happivirtauksella varustettu alkuaineanalysaattori,

— lasiampulli, jossa on hapettimena kupari(II)oksidia.

7. NÄYTTEIDEN VALMISTUS MÄÄRITYSTÄ VARTEN

Etanoli on uutettava viinistä ennen isotooppitestiä. Se tehdään tislaamalla viini SNIF-NMR-menetelmän RMN-FINS (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN) kohdassa 3.1 kuvatulla tavalla.

Rypäleen puristemehujen, tiivistettyjen rypäleen puristemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypäleen puristemehujen sisältämät sokerit on ensin käytettävä alkoholiksi SNIF-NMR-menetelmän (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN) kohdassa 3.2 kuvatulla tavalla.

8. SUORITUS

Kaikki valmisteluvaiheet on tehtävä ilman, että alkoholia haihtuisi merkittäviä määriä, mikä saattaisi muuttaa näytteen isotooppikoostumusta.

Seuraavassa kuvataan menetelmää, jota yleensä käytetään etanolinäytteiden polttamiseen kaupallisesti saatavien automaattisten polttojärjestelmien avulla. Hiilidioksidin valmistamiseksi isotooppianalyysia varten voidaan käyttää myös muita menetelmiä, jos voidaan varmistaa, että kaikki etanoli muuttuu hiilidioksidiksi ilman, että sitä häviää haihtumalla.

Koejärjestely alkuaineanalysaattoria käyttäen:

a) Näytteiden kapselointi: — käytä puhtaita kapseleita, pinsettejä ja valmistelualustaa, — tartu pinseteillä oikean kokoiseen kapseliin, — lisää kapseliin oikea määrä nestettä mikropipetin avulla, — Huom: Tarvitaan 3,84 mg absoluuttista etanolia tai 4,17 mg tislettä, jonka alkoholipitoisuus on 92 painoprosenttia, jotta saadaan 2 mg hiiltä. Vaadittava tislemäärä on laskettava tällä perusteella ottaen huomioon massaspektrometrin herkkyyden edellyttämä hiilimäärä. — sulje kapseli pinsettien avulla, — jokainen kapseli on suljettava tiiviisti, ja huonosti suljetut kapselit on hylättävä ja korvattava uudella, — jokaisesta näytteestä on valmistettava kaksi kapselia, — aseta kapselit oikeaan paikkaan alkuaineanalysaattorin automaattisen näytteensyöttölaiteen pitimeen; jokaisessa kapselissa on oltava sarjanumero tunnistamista varten, — mittaa käytettävät vertailunäytteet järjestelmällisesti näytesarjan alussa ja lopussa, — liitä säännöllisesti näytesarjoihin mukaan vertailunäytteitä.

b) Alkuaineanalyysi- ja massaspektrometrilaitteiden tarkastus ja säätö — säädä alkuaineanalysaattoreiden uunien lämpötila sekä heliumin ja hapen virtaus niin, että näytteen palaminen tapahtuu parhaalla mahdollisella tavalla, — tarkasta, ettei alkuaineanalyysi- ja massaspektrometrijärjestelmässä ole vuotoja (esimerkiksi tarkastamalla ionivirta massan ja varauksen suhteelle m/z = 28, mikä vastaa typpimolekyyliä), — säädä massaspektrometri mittaamaan ionivirtoja, joissa massan ja varauksen suhde m/z = 44, 45 ja 46, — tarkasta järjestelmän toiminta käyttäen tunnettuja näytteitä ennen kuin mittaat varsinaisia koenäytteitä.

c) Mittaussarjan tekeminen Alkuaineanalysaattorin (tai kromatografin) automaattiseen näytteensyöttölaitteeseen asetetut näytteet menevät kukin vuorollaan mitattavaksi. Kunkin näytteen palamisesta syntyvä hiilidioksidi eluoidaan massaspektrometriin, joka mittaa ionivirrat. Laitteistoon liitetty tietokone kirjaa ionivirrat ja laskee δ-arvon kullekin näytteelle (kohta 9).

9. LASKENTAMENETELMÄ

Mittausmenetelmän tarkoituksena on mitata 13C- ja 12C-isotooppien suhdetta etanolissa, joka on peräisin viinistä tai muista käyneistä rypäletuotteista. 13C- ja 12C-isotooppien suhde voidaan ilmaista ilmoittamalla sen poikkeama käytettävästä vertailunäytteestä. Hiili-13-isotoopin pitoisuuden poikkeama (δ13C) lasketaan poikkeaman tuhannesosina (δ/1 000) vertaamalla mitattavasta näytteestä saatuja tuloksia tuloksiin, jotka on saatu käyttäen vertailunäytettä, joka on sitä ennen kalibroitu ensisijaisen kansainvälisen vertailunäytteen (V-PDB) avulla. δ13C-arvot verrattuna vertailunäytteeseen ilmaistaan seuraavasti:

δ13Cech/ref ‰ = 1 000 × (Rech-Rref)/Rref

jossa Rech on mitattavan näytteen 13C- ja 12C-isotooppien suhde ja Rref vastaava arvo vertailunäytteenä käytetylle hiilidioksidille.

δ13C C-arvot verrattuna V-PDB-vertailumateriaaliin ilmaistaan seuraavasti:

δ13Cech/V-PDB ‰ = δ13Cech/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cech/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

jossa δ13Cref/V-PDB on etukäteen määritetty käytetyn vertailunäytteen isotooppisuhteen poikkeama V-PDB:n vastaavasta arvosta.

Pientä laitteista johtuvaa vaihtelua saattaa ilmetä tehtäessä on line -mittauksia. Tässä tapauksessa näytteille mitatut δ13C-arvot on korjattava käytetyn vertailunäytteen mitatun δ13C -arvon ja todellisen arvon välisen eron perusteella. Vertailunäytteen todellinen δ13C -arvo tiedetään, koska se on aiemmin kalibroitu käyttäen jotain kansainvälistä vertailuainetta. Kahden vertailumateriaalista tehdyn mittauksen välisen vaihtelun, ja niin ollen myös näytteistä saatuihin tuloksiin tehtävien korjausten, oletetaan olevan lineaarisia. Vertailumateriaali on mitattava kaikkien mittaussarjojen alussa ja lopussa. Näin kullekin näytteelle voidaan sen jälkeen laskea korjaus lineaarista interpolaatiota käyttäen.

10. LAADUNVARMISTUS JA -VALVONTA

Tarkista, ettei käytettävälle vertailuaineelle mitattu 13C-arvo poikkea sallitusta enempää kuin 0,5 ‰. Muussa tapauksessa spektrometrilaitteen asetukset on tarkistettava ja tarvittaessa korjattava.

Tarkista, että näytteestä valmistettujen kahden peräkkäin mitatun mittausnäytteen arvojen välinen ero on pienempi kuin 0,3 ‰. Kunkin näytteen lopullinen tulos on kahden kapselin arvojen keskiarvo. Jos ero on suurempi kuin 0,3 ‰, mittaus on uusittava.

Menetelmä voidaan tarkistaa käyttäen massan ja varauksen suhdetta m/z = 44 vastaavaa ionivirtaa, joka on verrannollinen alkuaineanalysaattoriin syötettävän hiilen määrään. Vakio-olosuhteissa ionivirran pitäisi olla analysoitaville näytteille lähes vakio. Merkittävä poikkeama saattaa olla merkki etanolin haihtumisesta (esimerkiksi kapselin huonon sulkemisen takia) tai alkuaineanalysaattorin tai massaspektrometrin epävakaudesta.

11. MENETELMÄN SUORITUSKYKY (TARKKUUS)

Alustava laboratorioiden välinen yhteistyötutkimus (kohta 11.1) tehtiin käyttäen tisleitä, joiden alkoholi oli peräisin viinistä, sokeriruo'osta ja sokerijuurikkaasta, sekä käyttäen erilaisia näistä kolmesta lähteestä peräisin olevia alkoholiseoksia. Koska tässä tutkimuksessa ei otettu huomioon tislausvaihetta, käsiteltäväksi otettiin myös muista laboratorioiden välisistä viiniä koskevista vertailututkimuksista saatuja tietoja (kohta 11.2) sekä erityisesti sarja isotooppimittausten laadunseurantakokeita (kohta 11.3). Tulokset osoittavat, että tyydyttävissä oloissa ja erityisesti SNIF-NMR-menetelmää käytettäessä erilaiset tislausmenetelmät eivät aiheuta merkittävää vaihtelua viinietanolin δ13C-arvon määrityksessä. Tarkkuutta kuvaavien viineille saatujen parametrien arvojen todettiin olevan lähes samat kuin tisleitä koskevissa yhteistutkimuksessa (kohta 11.1).

11.1. Tisleitä koskeva yhteistutkimus

Laboratorioidenvälisten testien tekovuosi: 1996 Laboratorioiden lukumäärä: 20 Näytteiden määrä: 6 näytettä kaksoissokkomäärityksenä Analyytti: etanolin δ13C-arvo





Näytteen koodi Viinistä peräisin olevaa alkoholia Sokerijuurikkaasta peräisin olevaa alkoholia Sokeriruo'osta peräisin olevaa alkoholia A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Näytteet A/G B/C D/F E/I H/K J/L Huomattavasti poikkeavien tulosten eliminoinnin jälkeen jäljelle jääneiden laboratorioiden määrä 19 18 17 19 19 19 Tutkimukseen hyväksyttyjen mittaustulosten määrä 38 36 34 38 38 38 Keskimääräinen arvo (δ13C) ‰ -25,32 -26,75 -27,79 -25,26 -26,63 -12,54 Sr 2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Toistettavuuden standardipoikkeama (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Toistettavuusraja r (2,8 × Sr) ‰ 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR 2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Uusittavuuden standardipoikkeama (SR) ‰ 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Uusittavuusraja R (2,8 × SR) ‰ 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Laboratorioidenvälinen tutkimus kahdesta viinistä ja yhdestä alkoholista

Laboratorioidenvälisten testien tekovuosi: 1996 Laboratorioiden lukumäärä: viinien tislaamiseen osallistui 14 laboratoriota, joista 7 myös mittasi viinietanolin δ13C-arvon alkoholinäytteen δ13C-arvon mittaamiseen osallistui 8 laboratoriota Näytteiden määrä: 3 (valkoviini, jonka alkoholipitoisuus oli 9,3 tilavuusprosenttia, valkoviini, jonka alkoholipitoisuus oli 9,6 tilavuusprosenttia, sekä alkoholiliuos, jonka vahvuus oli 93 painoprosenttia). Analyytti: etanolin δ13C-arvo





Näytteet Punaviini Valkoviini Alkoholi Laboratorioiden määrä 7 7 8 Tutkimukseen hyväksyttyjen mittaustulosten määrä 7 7 8 Keskimääräinen mittaustulos (δ 13C) ‰ -26,20 -26,20 -25,08 Uusittavuuden varianssi SR 2 0,0525 0,0740 0,0962 Uusittavuuden standardipoikkeama (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Uusittavuusraja R (2,8 × SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

Tutkimukseen osallistuneet laboratoriot käyttivät erilaisia tislausjärjestelmiä. Yhdessä laboratoriossa kaikille osallistuvien laboratorioiden palauttamille tisleille tehdyt isotooppimääritykset (δ13C-arvojen määritykset) eivät antaneet epäsäännöllisiä tai oleellisesti keskiarvosta poikkeavia tuloksia. Tulosten varianssi (S2 = 0,0059) on sopusoinnussa tisleiden yhteistutkimuksessa (kohta 11.1) saatujen toistettavuuden varianssin Sr 2-arvojen kanssa.

11.3. Isotooppimääritysten laadunseurannan tulokset

Laboratorioiden kykyä viinien ja alkoholien (96 tilavuusprosenttia alkoholia sisältävien tisleiden) isotooppimittauksiin on valvottu kansainvälisellä tasolla säännöllisesti joulukuusta 1994 lähtien. Tulosten avulla osallistuvat laboratoriot voivat tarkistaa analyysiensä laadun. Tilastollisin menetelmin voidaan arvioida tulosten vaihtelut ja näin määrittää varianssi ja uusittavuusraja. Seuraavassa taulukossa on viinien ja tisleiden sisältämän etanolin δ13C-arvojen määrityksessä saatujen tulosten yhteenveto:

Ajankohta Viinit Tisleet Nro SR SR 2 R N SR SR 2 R joulukuu 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 kesäkuu 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 joulukuu 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 maaliskuu 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 kesäkuu 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 syyskuu 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 joulukuu 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 maaliskuu 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 kesäkuu 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 syyskuu 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 joulukuu 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 maaliskuu 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 kesäkuu 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 syyskuu 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 painotettu keskiarvo 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : osallistuneiden laboratorioiden määrä

11.4. Toistettavuus- ja uusittavuusrajat

Edellä olevissa taulukoissa esitettyjen laboratorioiden välisistä tutkimuksista saatujen tulosten perusteella voidaan tälle menetelmälle tislausvaihe mukaan luettuna määrittää seuraavat toistettavuus- ja uusittavuusrajat:

Toistettavuusraja r: 0,24

Uusittavuusraja R: 0,6.

11 KOKONAISHAPPOPITOISUUS (OIV-AS-313-01-ACITOT) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄ

Kokonaishappopitoisuudella tarkoitetaan sellaisten happojen yhteismäärää, jotka voidaan titrata, kun pH säädetään arvoon 7 emäksisellä titrausliuoksella.

Hiilidioksidi ei kuulu kokonaishappopitoisuuteen.

2. MENETELMÄN PERIAATE

Potentiometrinen titraus tai titraus, jossa käytetään bromtymolisinistä päätepisteen indikaattorina ja jossa tulosta verrataan väristandardiin.

3. REAGENSSIT

3.1. Puskuriliuos pH 7,0:

Monokaliumfosfaatti KH2PO4: 107,3 g

Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 1 M: 500 ml

Täytetään vedellä 1 000 ml:ksi.

Voidaan käyttää myös kaupallisia vertailupuskuriliuoksia.

3.2. Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 0,1 M.

3.3. Bromtymolisininen indikaattoriliuos, 4 g/ml.

Bromtymolisininen (C27H28Br2O5S) … 4 g Neutraali etanoli 96 til-% … 200 ml Liuotetaan ja lisätään: vettä, CO2-vapaa … 200 ml natriumhydroksidiliuosta, 1 M kunnes väri muuttuu sinivihreäksi (pH 7) … 7,5 ml Täytetään vedellä … 1 000 ml:ksi

4. VÄLINEISTÖ

4.1. Vesivakuumipumppu.

4.2. 500 ml:n vakuumipullo.

4.3. Potentiometri, jonka asteikko on jaettu pH-yksiköihin, ja elektrodeja. Lasielektrodia on säilytettävä tislatussa vedessä. Kalomeli/kyllästetty kaliumkloridi-elektrodia on säilytettävä kyllästetyssä kaliumkloridiliuoksessa. Useimmiten käytetään yhdistettyä elektrodia, jota säilytetään tislatussa vedessä.

4.4. Mittalaseja, 50 ml viineille ja 100 ml puhdistetuille tiivistetyille rypäleen puristemehuille.

5. SUORITUS

5.1. Näytteen valmistaminen

5.1.1. Viinit

Poistetaan hiilidioksidi. Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon, ravistellaan ja liitetään pullo vesi-imuun, jolloin saadaan ilma poistetuksi. Ravistelun on kestettävä 1–2 minuuttia.

5.1.2. Puhdistetut tiivistetyt rypäleen puristemehut

Mitataan tarkalleen 200 g puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua 500 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin vedellä ja homogenoidaan.

5.2. Potentiometrinen titraus

5.2.1. pH-mittarin kalibrointi

Kalibroidaan pH-mittari valmistajan ohjeita noudattaen 20 °C:ssa puskuriliuoksella, jonka pH-arvo 20 °C:ssa on 7.

5.2.2. Mittausmenetelmä

Mitataan mittalasiin (kohta 4.4) kohdan 5.1 mukaisesti valmistettua näytettä 10 ml, kun kyseessä on viini, ja 50 ml, kun kyseessä on puhdistettu tiivistetty rypäleen puristemehu. Lisätään noin 10 ml tislattua vettä ja byretillä 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (kohta 3.2), kunnes pH-arvo 20 °C:ssa on 7. Emäksisen nesteen lisääminen on tehtävä hitaasti ja liuosta on sekoitettava koko ajan. Lisätyn 0,1 M NaOH:n millilitramäärä on n.

5.3. Indikaattorititraus (bromtymolisininen)

5.3.1. Esikoe: väristandardin määritys

Mitataan mittalasiin (kohta 4.4) 25 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (kohta 3.3) ja näyte eli 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua, joka on valmistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (kohta 3.2), kunnes väri muuttuu sinivihreäksi. Lisätään 5 ml puskuriliuosta (3.1), jonka pH-arvo on 7.

5.3.2. Määritys

Mitataan mittalasiin (kohta 4.4) 30 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (kohta 3.3) ja 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua, joka on valmistettu kohdan 5.1 mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (kohta 3.2), kunnes värinmuutos on samanlainen kuin esikokeessa (kohta 5.3.1) saatu väri. Lisätyn 0,1 M natriumhydroksidin millilitramäärä on n.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

6.1. Laskentamenetelmä

6.1.1. Viinit

Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa on:

A = 10 n

Se ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna grammoina viinihappoa litrassa on:

A′ = 0,075 × A

Se ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

6.1.2. Puhdistetut tiivistetyt rypäleen puristemehut

— Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa puhdistettua tiivistettyä rypäleen puristemehua: a = 5 × n

— Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa kokonaissokereita: — A = 500 × n/P — P = kokonaissokerien pitoisuus prosentteina (m/m).

Se ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

6.2. Indikaattoria käyttäen tehdyn titrauksen toistettavuus r (5.3)

r = 0,9 mek/l r = 0,07 g viinihappoa/l

valko-, rosee- ja punaviineille.

6.3. Indikaattoria käyttäen tehdyn titrauksen (5.3) uusittavuus R

Valko- ja roseeviineille: R = 3,6 mek/l R = 0,3 g viinihappoa/l.

Punaviineille: R = 5,1 mek/l R = 0,4 g viinihappoa/l.

12 HAIHTUVAT HAPOT (OIV-AS-313-02-ACIVOL) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. MÄÄRITELMÄ

Haihtuvat hapot muodostuvat etikkahapposarjaan kuuluvista hapoista, joita on viinissä sekä vapaina happoina että suoloina.

2. MENETELMÄN PERIAATE

Erotetaan haihtuvat hapot viinistä vesihöyrytislauksella, ja titrataan ne tisleestä.

Viinistä poistetaan aluksi hiilidioksidi.

Näissä koeolosuhteissa tislautuva vapaa rikkidioksidi ja sitoutunut rikkidioksidi on vähennettävä tisleen happopitoisuudesta.

Mahdollisesti viiniin lisätyn sorbiinihapon pitoisuus on myös vähennettävä.

Huomautus:

Joissain maissa viinit stabiloidaan ennen määritystä salisyylihapolla, jota löytyy tisleestä. Se on määritettävä ja vähennettävä happopitoisuudesta. Määritysmenetelmä selostetaan tämän luvun 7 kohdassa.

3. REAGENSSIT

3.1. Kiteinen viinihappo (C4H6O6)

3.2. Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 0,1 M

3.3. 1 % fenoliftaleiiniliuos neutraalissa alkoholissa, 96 til-%

3.4. Kloorivetyhappo (ρ20 = 1,18 à 1,19 g/ml) laimennettu suhteessa 1/4 (v/v)

3.5. Jodiliuos (I2), 0,005 M

3.6. Kiteinen kaliumjodidi (KI)

3.7. Tärkkelysliuos, 5 g/l:

Sekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vettä. Kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen ja annetaan kiehua noin 10 minuuttia; lisätään 200 g natriumkloridia. Täytetään 1 litraksi jäähtymisen jälkeen.

3.8. Kyllästetty natriumboraattiliuos (Na2B4O7.10 H2O), eli noin 55 g/l 20 °C:ssa.

4. VÄLINEISTÖ

4.1. Vesihöyrytislauslaitteisto, johon kuuluu:

1) vesihöyrykehitin: vesihöyryn on oltava hiilidioksidivapaata,

2) tislauskolvi, jossa on putki vesihöyryn johtamiseksi,

3) tislauskolonni,

4) jäähdytin.

Tämän laitteen on läpäistävä seuraavat kolme koetta:

a) Mitataan tislauskolviin 20 ml keitettyä vettä; kerätään 250 ml tislettä ja lisätään 0,1 ml 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (kohta 3.2) ja 2 tippaa fenoliftaleiiniliuosta (kohta 3.3); vaaleanpunaisen värin on pysyttävä muuttumattomana vähintään 10 sekunnin ajan (hiilidioksidista vapaa vesihöyry).

b) Mitataan tislauskolviin 20 ml 0,1 M etikkahappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä. Titrataan happo 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (kohta 3.2). Kulutetun tilavuuden on oltava vähintään 19,9 ml (tislattu etikkahappo ≥ 99,5 %).

c) Mitataan tislauskolviin 20 ml 1 M maitohappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä ja titrataan happo 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (kohta 3.2).

Kulutettu tilavuus saa olla enintään 1,0 ml (tislattu maitohappo ≤ 0,5 %).

Mikä tahansa laite tai menetelmä, joka läpäisee nämä kokeet, katsotaan viralliseksi kansainväliseksi laitteeksi tai menetelmäksi.

4.2. Vesi-imu

4.3. Vakuumipullo.

5. SUORITUS

5.1. Näytteen valmistelu: Poistetaan hiilidioksidi.

Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon. Liitetään pullo vesi-imuun, ravistetaan koko ajan. Ravistelun on kestettävä 1–2 minuuttia.

5.2. Vesihöyrytislaus

Mitataan tislauskolviin 20 ml viiniä, josta hiilidioksidi on poistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään noin 0,5 g viinihappoa (kohta 3.1). Kerätään vähintään 250 ml tislettä.

5.3. Titraus

Titrataan 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (kohta 3.2) käyttäen indikaattorina kahta tippaa fenoliftaleiiniliuosta (kohta 3.3), käytetty tilavuus on n ml.

Lisätään 4 tippaa suhteessa 1/4 laimennettua kloorivetyhappoa (3.4), 2 ml tärkkelysliuosta (kohta 3.7) ja muutamia kaliumjodidikiteitä (kohta 3.6). Titrataan vapaa rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (kohta 3.5). Käytetty tilavuus on n’ ml.

Lisätään kyllästettyä natriumboraattiliuosta (kohta 3.8), kunnes vaaleanpunainen väri ilmestyy uudelleen. Titrataan sitoutunut rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (kohta 3.5). Käytetty tilavuus on n’’ ml.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

6.1. Laskentamenetelmä

Haihtuvat hapot ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa yhden desimaalin tarkkuudella ovat:

A = 5 (n – 0,1 n’ – 0,05 n’’)

Haihtuvat hapot ilmoitettuna grammoina etikkahappoa litrassa kahden desimaalin tarkkuudella ovat:

0,300 (n – 0,1 n’ – 0,05 n’’)

6.2. Toistettavuus (r)

r = 0,7 mek/l r = 0,04 etikkahappoa g/l.

6.3. Uusittavuus (R)

R = 1,3 mek/l R = 0,08 etikkahappoa g/l.

6.4. Viini, johon on lisätty sorbiinihappoa

250 ml:n tisleeseen saadaan vesihöyrytislauksella 96 % sorbiinihaposta, ja se on vähennettävä haihtuvista hapoista. 100 mg sorbiinihappoa vastaa 0,89:ää milliekvivalenttihappoa tai 0,053:a grammaa etikkahappoa, ja sorbiinihappopitoisuus tunnetaan.

7. SALISYYLIHAPON MÄÄRITYS HAIHTUVIA HAPPOJA SISÄLTÄVÄSTÄ TISLEESTÄ

7.1. Periaate

Haihtuvien happojen määrityksen ja rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen osoitetaan salisyylihappo happamaksi tehdystä liuoksesta rauta(III)suolalla, joka antaa violetin värin.

Haihtuvia happoja sisältävään tisleeseen tislautuva salisyylihappo määritetään toisesta tisleestä, jonka tilavuus on sama kuin tisleen, josta haihtuvat hapot on määritetty. Salisyylihappo määritetään tästä tisleestä kolorimetrisellä vertailumenetelmällä. Se on vähennettävä haihtuvat hapot sisältävän tisleen happopitoisuudesta.

7.2. Reagenssit

7.2.1. Kloorivetyhappo (HCl) (ρ20 = 1,18 à 1,19 g/ml).

7.2.2. Natriumtiosulfaatti (Na2S2O35 H2O), 0,1 M

7.2.3. Rauta(III)ammoniumsulfaattiliuos [Fe2 (SO4)3, (NH4)2 SO4 × 24 H2O], 10 % (m/v)

7.2.4. Natriumsalisylaattiliuos, 0,01 M. Liuos sisältää 1,60 g/l natriumsalisylaattia (NaC7H5O3).

7.3. Suoritus

7.3.1. Salisyylihapon osoittaminen haihtuvia happoja sisältävästä tisleestä

Välittömästi haihtuvien happojen määrityksen ja vapaan ja sitoutuneen rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen lisätään pulloon 0,5 ml kloorivetyhappoa (kohta 7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumtiosulfaattiliuosta (kohta 7.2.2) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (kohta 7.2.3).

Jos salisyylihappoa esiintyy, ilmaantuu violetti väri.

7.3.2. Salisyylihapon määritys

Tehdään edellä mainittuun keräyspulloon merkki tisleen tilavuuden kohdalle. Tyhjennetään ja huuhdotaan pullo.

Otetaan viinistä uusi 20 ml:n näyte, joka tislataan vesihöyrytislauksella ja kerätään tislettä keräyspullossa olevaan merkkiin asti. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (kohta 7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (kohta 7.2.3). Pullon sisältö värjäytyy violetiksi, jos salisyylihappoa esiintyy.

Kaadetaan samanlaiseen pulloon tislattua vettä edellisessä pullossa olevan tisleen tasolle. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (kohta 7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (kohta 7.2.3). Lisätään byretillä 0,01 M natriumsalisylaattiliuosta (kohta 7.2.4), kunnes saadaan saman intensiteetin omaava violetti väri kuin viinitisleen sisältämässä pullossa.

Käytetty millilitramäärä on n’’’.

7.4. Haihtuvien happojen pitoisuuden korjaaminen

Vähennetään tilavuus 0,1 × n’’’ 0,1 M natriumhydroksidiliuoksen tilavuudesta n ml, joka kului, kun haihtuvat hapot titrattiin tisleestä.

13 SITRUUNAHAPPO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. MENETELMÄN PERIAATE

Sitruunahappo muutetaan sitraattilyaasilla (CL) katalysoidussa reaktiossa oksaaliasetaatiksi ja asetaatiksi:

sitraatti ←→ oksaaliasetaatti + asetaatti

Malaattidehydrogenaasin (MDH) ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) läsnäollessa oksaaliasetaatti ja sen dekarboksylaatiosta muodostuva pyruvaatti pelkistyvät nikotiiniamidiadeniinidinukleotidilla (NADH) L-malaatiksi ja L-laktaatiksi:

oksaaliasetaatti + NADH + H+ ←→ L-malaatti + NAD+

puryvaatti + NADH + H+ ←→ L-laktaatti + NAD+

Näissä reaktioissa NAD+:ksi hapettuneen NADH:n määrä on verrannollinen sitraattimäärään. NADH:n hapettuminen mitataan sen absorbanssin pienenemisestä 340 nm:n aallonpituudella.

2. REAGENSSIT

2.1. Puskuriliuos pH 7,8

(0,51 M glysyyliglysiini; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3M):

Liuotetaan 7,13 g glysyyliglysiiniä noin 70 ml:aan kahdesti tislattua vettä.

Säädetään pH arvoon 7,8 noin 13 ml:lla 5 M natriumhydroksidiliuosta; lisätään 10 ml sinkkikloridiliuosta ZnCl2 (80 mg/100 ml) ja täytetään kahdesti tislatulla vedellä 100 ml:ksi.

Liuos säilyy vähintään 4 viikkoa + 4 °C:ssa.

2.2. Pelkistynyt nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi-liuos (NADH), noin 6 × 10- 3 M: liuotetaan 30 mg NADH:ta ja 60 mg NaHCO3 6 ml:aan kahdesti tislattua vettä.

2.3. Malaattidehydrogenaasi/laktaattidehydrogenaasi-liuos (MDH/LDH), (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Sekoitetaan 0,1 ml MDH:ta (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfaattiliuosta (3,2 M) ja 0,5 ml LDH:ta (5 mg/ml). Tämä suspensio säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.

2.4. Sitraattilyaasi CL (5 mg proteiinia/ml): Liuotetaan 168 mg lyofiilisaattia 1 ml:aan jäävettä. Liuos säilyy vähintään yhden viikon ajan + 4 °C:ssa ja vähintään neljän viikon ajan pakastettuna.

On suositeltavaa varmistaa entsyymin aktiivisuus ennen määritystä.

2.5. Polyvinyylipolypyrrolidoni (PVPP)

Huomautus: Kaikki tähän määritykseen tarvittavat reagenssit ovat kaupallisesti saatavilla.

3. VÄLINEISTÖ

3.1. Spektrofotometri, jolla voidaan mitata aallonpituudella 340 nm (NADH:n absorptiomaksimi).

Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään fotometriä, jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä. Kyseessä ovat absoluuttiset absorbanssimittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADH:n ekstinktiokerrointa), joten laitteen aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen on oltava tarkistettuja.

3.2. Lasikyvettejä, joiden valotie on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.

3.3. Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida 0,02–2 ml:n suuruisia tilavuuksia.

4. NÄYTTEEN VALMISTUS

Sitraatti määritetään tavallisesti suoraan viinistä ilman, että väriaineet poistetaan ennen määritystä tai viini laimennetaan, jos sitruunahappopitoisuus on alle 400 mg/l. Jos näin ei ole, laimennetaan viini siten, että sen sitraattikonsentraatio on välillä 20–400 mg/l (näytteen sitraattimäärä välillä 5–80 μg).

Kun kyseessä on runsaasti fenolisia yhdisteitä sisältävä punaviini, on suositeltavaa käsitellä viini ennen määritystä PVPP:llä:

Suspendoidaan veteen noin 0,2 g PVPP:tä, annetaan seistä 15 minuutin ajan. Suodatetaan laskostetun suodattimen läpi.

50 ml:n erlenmeyerpulloon mitataan 10 ml viiniä, lisätään lastalla suodattimesta otettua kosteaa PVPP:tä. Ravistellaan 2–3 minuuttia. Suodatetaan.

5. SUORITUS

Tehdään absorbanssimittaukset 340 nm:n aallonpituudelle säädetyllä spektrofotometrillä 1 cm:n kyvettejä käyttäen; absorbanssi nollataan ilmaa (ei kyvettiä valotiessä) vastaan. Mitataan 1 cm:n kyvetteihin:

Kontrolli Määritys Liuos 2.1 1,00 ml 1,00 ml Liuos 2.2 0,10 ml 0,10 ml Näyteliuos — 0,20 ml Tislattu vesi 2,00 ml 1,80 ml Liuos 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Sekoitetaan. Noin 5 minuutin kuluttua luetaan vertailu- ja näyteliuosten absorbanssit (A1).

Lisätään:

Liuos 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Sekoitetaan. Odotetaan reaktion päättymistä (noin 5 minuuttia) ja luetaan vertailu- ja näyteliuosten absorbanssit (A2).

Lasketaan vertailu- ja näyteliuosten absorbanssien erotus (A1–A2).

Lasketaan standardiliuoksen absorbanssien erotuksen ja näyteliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:

ΔA = ΔA D – ΔAT

Huomautus: Entsyymiaktiivisuuden loppuun saattamiseksi tarvittava aika voi vaihdella eri erien kohdalla. Suositeltu aika on vain ohjeellinen. Suositellaan, että vaikutusaika määritetään kullekin näyte-erälle.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Sitruunahappopitoisuus ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina litrassa (mg/l).

6.1. Laskentamenetelmä

Konsentraatio milligrammoina litrassa saadaan kaavasta:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

V = koeliuoksen tilavuus millilitroina (tässä 3,14 ml) v = näytteen tilavuus millilitroina (tässä 0,2 ml) PM = määritettävän aineen molekyylimassa (tässä vedetön sitruunahappo = 192,1) d = kyvetin valotie senttimetreinä (tässä 1 cm) ε = NADH:n absorptiokerroin; 340 nm:ssä ε = 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Saadaan:

C = 479 × ΔA

Jos näytettä on laimennettu, tulos kerrotaan laimennuskertoimella.

Huomautus: 334 nm:ssä: C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmol– 1 × l × cm– 1)

365 nm:ssä: C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmol– 1 × l × cm– 1)

6.2. Toistettavuus (r)

Sitruunahappopitoisuus alle 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Sitruunahappopitoisuus yli 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3. Uusittavuus (R)

Sitruunahappopitoisuus alle 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Sitruunahappopitoisuus yli 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14 SORBIINIHAPPO (OIV-AS-313-14-ACISOR) – IV TYYPIN MENETELMÄ

1. MENETELMIEN PERIAATE

1.1. Määritys ultraviolettiabsorptiospektrofotometrillä

Sorbiinihappo (2,4-heksadieenihappo), joka on erotettu vesihöyrytislauslaitteistolla, määritetään viinitisleestä ultraviolettiabsorptiospektrofotometrillä. Aineet, jotka aiheuttavat häiriöitä mitattaessa UV-alueella, poistetaan haihduttamalla kuiviin tisle, joka on tehty lievästi emäksiseksi kalsiumhydroksidiliuoksella. Pitoisuudet, jotka ovat alle 20 mg/l, on varmistettava ohutlevykromatografialla (herkkyys: 1 mg/l).

1.2. Määritys kaasukromatografialla

Etyylieetteriin uutettu sorbiinihappo määritetään kaasukromatografialla sisäisen standardin kanssa.

1.3. Jäämien tunnistus ohutlevykromatografialla

Etyylieetteriin uutettu sorbiinihappo erotetaan ohutlevykromatografialla ja sen konsentraatio arvioidaan semi-kvantitatiivisesti.

2. MÄÄRITYS ULTRAVIOLETTIABSORPTIOSPEKTROFOTOMETRILLÄ

2.1. Reagenssit

2.1.1. Kiteinen viinihappo (C4H6O6)

2.1.2. Kalsiumhydroksidiliuos Ca (OH)2, noin 0,02 M

2.1.3. Sorbiinihappovertailuliuos, 20 mg/l

Liuotetaan 20 mg sorbiinihappoa C6H8O2 noin 2 ml:aan 0,1 M natriumhydroksidiliuosta. Kaadetaan 1 000 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin vedellä. Voidaan myös liuottaa 26,8 mg kaliumsorbaattia C6H7KO2 veteen ja täyttää 1 000 ml:ksi vedellä.

2.2. Välineistö

2.2.1. Vesihöyrytislauslaite (ks. ”Haihtuvat hapot”)

2.2.2. Vesihaude, 100 °C

2.2.3. Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaukset aallonpituudella 256 nm, ja kvartsikyvettejä, joiden valotie on 1 cm.

2.3. Suoritus

2.3.1. Tislaus

Mitataan 10 ml viiniä vesihöyrytislauslaitteen tislauskolviin, lisätään 1–2 g viinihappoa (2.2.1). Kerätään 250 ml tislettä.

2.3.2. Kalibrointikäyrä

Valmistetaan vertailuliuoksesta (kohta 2.3.1) veteen 4 laimennettua vertailuliuosta, joiden pitoisuudet ovat 0,5; 1; 2,5 ja 5 mg viinihappoa litrassa; mitataan spektrofotometrillä niiden absorbanssit tislattua vettä vastaan 256 nm:ssä. Piirretään kuvaaja, joka esittää absorbanssin muutoksen konsentraatioiden funktiona. Kuvaaja on lineaarinen.

2.3.3. Määritys

Mitataan 55 mm halkaisijaltaan olevaan haihdutusmaljaan 5 ml tislettä, lisätään 1 ml kalsiumhydroksidiliuosta (kohta 2.1.2). Haihdutetaan kuivaksi kiehuvassa vesihauteessa.

Liuotetaan jäännös muutamaan millilitraan tislattua vettä, siirretään kvantitatiivisesti 20 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin huuhteluvedellä. Mitataan absorbanssi spektrofotometrillä 256 nm:ssä standardiliuosta vastaan, joka on saatu laimentamalla 1 ml kalsiumhydroksidiliuosta (kohta 2.1.2) 20 ml:lla vettä.

Merkitään mitattu absorbanssiarvo kalibrointikäyrälle ja johdetaan siitä liuoksen sorbiinihappokonsentraatio C.

Huomautus: Käytännössä kuivaksi haihduttaminen voidaan ohittaa. Mitataan absorbanssi tislattua vettä vastaan suoraan tisleestä, joka on laimennettu suhteessa 1/4.

2.4. Tulosten ilmoittaminen

2.4.1. Laskentamenetelmä

Viinin sorbiinihappokonsentraatio ilmoitettuna milligrammoina litrassa on:

100 × C

C = spektrofotometrisesti määritetyn liuoksen sorbiinihappokonsentraatio, ilmoitettuna milligrammoina litrassa.

3. MÄÄRITYS KAASUKROMATOGRAFIALLA

3.1. Reagenssit

3.1.1. Etyylieetteri (C2H5)2O tislataan juuri ennen käyttöä.

3.1.2. Sisäinen standardiliuos: undekaanihappoliuos etanolissa C11H22O2, 95 til-%, pitoisuus 1 g/l.

3.1.3. Rikkihappo H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml), laimennettu vedellä suhteessa 1/3 (v/v).

3.2. Välineistö

3.2.1. Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori ja ruostumattomasta teräksestä valmistettu kolonni (4 m × 1/8 tuuma), joka on käsitelty dimetyylidikloorisilaanilla ja pakattu stationaarifaasilla, Gaschrom Q80 – 100 mesh, johon sidottu dietyleeniglykolisukkinaatin (5 %) ja fosforihapon (1 %) seos (DEGS- H3 PO4) tai dietyleeniglykoliadipaatin (7 %) ja fosforihapon (1 %) seos (DEGA – H3PO4).

Dimetyylidikloorisilaani (DMDCS) -käsittelyssä johdetaan kolonnin läpi liuosta, joka sisältää 2–3 g DMDCS:ia tolueenissa. Pestään kolonni välittömästi metanolilla; johdetaan kolonniin typpivirta ja tämän jälkeen hekseenivirta ja uudelleen typpivirta. Tämän jälkeen kolonni täytetään.

Suoritusolosuhteet:

Uunin lämpötila: 175 °C.

Injektorin ja detektorin lämpötila: 230 °C.

Kantokaasu: typpi (virtausnopeus 20 ml/min).

3.2.2. Mikroruisku, 10 mikrolitraa, mitta-asteikon jakoväli 0,1 mikrolitraa.

Huomautus: Myös muilla kolonneilla voidaan saada aikaan hyvä erottuminen, erityisesti kapillaarikolonnilla (esimerkiksi FFAP).

Jäljempänä kuvattu suoritus annetaan esimerkkinä.

3.3. Suoritus

3.3.1. Näytteen valmistaminen määritystä varten

Kaadetaan noin 40 ml: n hiostulpalliseen lasiseen koeputkeen 20 ml viiniä, lisätään 2 ml sisäistä standardiliuosta (kohta 3.1.2) ja 1 ml laimennettua rikkihappoliuosta (kohta 3.1.3).

Sekoitetaan liuos kääntelemällä koeputkea ylösalaisin, lisätään putkeen 10 ml etyylieetteriä (kohta 3.1.1). Uutetaan sorbiinihappo orgaaniseen faasiin ravistelemalla putkea 5 minuutin ajan. Annetaan erottua.

3.3.2. Vertailuliuoksen valmistaminen

Valitaan viini, jonka eetteriuutteen kromatogrammissa ei esiinny yhtään sorbiinihapon eluoitumista vastaavaa piikkiä; lisätään tähän viiniin sorbiinihappoa 100 mg litrassa. Käsitellään 20 ml näin valmistettua näytettä kohdassa 3.3.1 kuvatulla tavalla.

3.3.3. Kromatografia

Injektoidaan kromatografiin mikroruiskulla vuorotellen 2 μl kohdassa 3.3.2 kuvatulla tavalla saatua eetterifaasia ja 2 μl kohdassa 3.3.1 kuvatulla tavalla saatua eetterifaasia.

Tulostetaan vastaavat kromatogrammit: tarkistetaan sorbiinihapon ja sisäisen standardin retentioaikojen identtisyys. Mitataan piikkien korkeudet tai pinta-alat.

3.4. Tulosten ilmoittaminen

3.4.1. Laskentamenetelmä

Viinin sorbiinihappokonsentraatio, ilmoitettuna milligrammoina litrassa, on:

100 x h/H x l/i

H= sorbiinihapon piikin korkeus vertailuliuoksessa

h= sorbiinihapon piikin korkeus näytteessä

l= sisäisen standardin piikin korkeus vertailuliuoksessa

I= sisäisen standardin piikin korkeus näytteessä.

Huomautus: Sorbiinihappokonsentraatio voidaan määrittää samalla tavoin vastaavien piikkien pinta-aloista.

15 PH (OIV-AS-313-15-PH) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. PERIAATE

Mitataan potentiaaliero kahden tutkittavaan nesteeseen upotetun elektrodin välillä. Toisen elektrodin potentiaali on nesteen pH:n funktio, toisen potentiaali on kiinteä ja tunnettu ja se muodostaa vertailuelektrodin.

2. VÄLINEISTÖ

2.1. pH-mittari, jonka asteikko on kalibroitu pH-yksiköiksi ja jolla voidaan tehdä mittaukset vähintään 0,05 pH-yksikön tarkkuudella.

2.2. Elektrodit:

2.2.1. Lasielektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.

2.2.2. Kalomeli/kyllästetty natriumkloridi -vertailuelektrodi, säilytetään kyllästetyssä kaliumkloridiliuoksessa.

2.2.3. Tai yhdistetty elektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.

3. REAGENSSIT

3.1. Puskuriliuokset:

3.1.1. Kyllästetty kaliumvetytartraattiliuos. Liuos sisältää vähintään 5,7 g/l kaliumvetytartraattia (C4H5KO6) 20 °C:ssa. Tätä liuosta voidaan säilyttää 2 kuukautta lisäämällä siihen 0,1 g tymolia 200 ml:aa kohti.

pH 3,57 20 °C:ssa 3,56 25 °C:ssa 3,55 30 °C:ssa

3.1.2. 0,05 M kaliumvetyftalaattiliuos. Liuos sisältää 10,211 g/l kaliumvetyftalaattia (C8H5KO4) 20 °C:ssa. (Säilyy enintään 2 kuukautta).

pH 3,999 15 °C:ssa 4,003 20 °C:ssa 4,008 25 °C:ssa 4,015 30 °C:ssa

3.1.3. Liuos, joka sisältää:

monokaliumfosfaattia, KH2PO4 … 3,402 g dikaliumfosfaattia, K2HPO4 … 4,354 g Täytetään vedellä … 1 l:ksi

(Säilyy enintään 2 kuukautta).

pH 6,90 15 °C:ssa 6,88 20°C:ssa 6,86 25 °C:ssa 6,85 30 °C:ssa

Huomautus: Voidaan käyttää myös kaupallisia vertailupuskuriliuoksia.

4. SUORITUS

4.1 Näytteen valmistaminen määritystä varten

4.1.1. Rypäleen puristemehu ja viini

Rypäleen puristemehua tai viiniä käytetään sellaisenaan.

4.1.2. Puhdistettu tiivistetty rypäleen puristemehu

Laimennetaan puhdistettu tiivistetty rypäleen puristemehu vedellä, jotta saataisiin kokonaissokerikonsentraatio 25 ± 0,5 % (m/m) (25 °C Brix).

Jos P on puhdistetun tiivistetyn rypäleen puristemehun kokonaissokerin pitoisuus prosentteina (m/m), punnitaan massa, joka vastaa arvoa 2 500/P

ja täytetään 100 g:ksi vedellä. Käytetyn veden johtokyvyn on oltava alle 2 mikrosiemensiä senttimetriä kohti.

4.2 Laitteen säätäminen nollaan

Laitteen säätäminen nollaan tehdään aina ennen mittausta käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.

4.3. pH-mittarin kalibrointi

Kalibrointi tehdään 20 °C:ssa puskuriliuoksilla, joiden pH-arvot 20 °C:ssa ovat 6,88 ja 3,57, laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.

Asteikon kalibrointi tarkistetaan puskuriliuoksella, jonka pH-arvo 20 °C:ssa on 4,00.

4.4. Mittaus

Upotetaan elektrodi näytteeseen, jonka lämpötilan on oltava välillä 20–25 °C ja mahdollisimman lähellä arvoa 20 °C. Luetaan pH-arvo suoraan asteikolta.

Samasta näytteestä tehdään vähintään kaksi määritystä.

Tulokseksi otetaan määritystulosten aritmeettinen keskiarvo.

5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Rypäleen puristemehun, viinin tai 25-prosenttisen (m/m) (25 °C Brix) puhdistetusta tiivistetystä rypäleen puristemehusta valmistetun liuoksen pH-arvo ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

16 L-ASKORBIINIHAPON JA D-ISOASKORBIINIHAPON MÄÄRITYS SAMANAIKAISESTI HPLC-KROMATOGRAFIAN JA UV-DETEKTION AVULLA (OIV-AS-313-22-ACASCO) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. JOHDANTO

Askorbiinihappo on antioksidantti, jota esiintyy luontaisesti monenlaisissa elintarvikkeissa. Rypäleen sisältämä normaali askorbiinihappomäärä vähenee rypäleen puristemehun valmistuksen ja viiniyttämisen aikana. Askorbiinihappoa voidaan lisätä rypäleen puristemehuihin ja viineihin tietyissä rajoissa.

Kuvattu menetelmä on validoitu laboratorioiden välisissä kokeissa, joissa määritettiin viininäytteitä, joihin oli lisätty 30–150 mg/l L-askorbiinihappoa ja 10–100 mg/l D-isoaskorbiinihappoa.

2. KÄYTTÖALUE

Menetelmää käytetään L-askorbiinihapon ja d-isoaskorbiinihapon (erytorbiinihapon) määrittämiseksi viinistä samanaikaisesti HPLC-kromatografian ja UV-detektion avulla silloin kun niiden pitoisuus on 3–150 mg/l.

Jos pitoisuus on yli 150 g/l, näytettä on laimennettava.

3. PERIAATE

Kalvon läpi suodatetut näytteet injektoidaan suoraan HPLC-kromatografilaitteistoon. Analyytit erotetaan käänteisfaasikolonnilla ja mitataan UV-aallonpituudella 266 nm. L-askorbiinihapon ja D-isoaskorbiinihapon tulos lasketaan ulkoisen standardin avulla.

Huomautus: Kolonneja ja käyttöolosuhteita koskeva kuvaus on ohjeellinen; analyytit voidaan erottaa myös muun tyyppisillä kolonneilla.

4. REAGENSSIT JA TUOTTEET

4.1 Reagenssit

4.1.1 n-oktyyli, puhtaus ≥ 99,0 %

4.1.2 Natriumasetaatti x 3 H2O, puhtaus ≥ 99,0 %

4.1.3 Etikkahappo, puhdas 100 %

4.1.4 Fosforihappo, noin 25 %

4.1.5 Oksaalihappo, puhtaus ≥ 99,0 %

4.1.6 Askorbaattioksidaasi

4.1.7 L-askorbiinihappo, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8 D-isoaskorbiinihappo, puhtaus ≥ 99,0 %

4.1.9 Kahdesti tislattu vesi

4.1.10 Metanoli, analyysilaatua, 99,8 %

4.2 Liikkuvan faasin valmistus

4.2.1 Liikkuvan faasin liuokset

Valmistetaan seuraavat liuokset liikkuvaa faasia varten:

4.2.1.1 12,93 g n-oktyyliä 100 ml:ssa metanolia

4.2.1.2 68,05 g natriumasetaattia x 3 H2O 500 ml:ssa kahdesti tislattua vettä

4.2.1.3 12,01 g etikkahappoa 200 ml:ssa kahdesti tislattua vettä

4.2.1.4 Puskuriliuos (pH 5,4): 430 ml natriumasetaattiliuosta (4.2.1.2) ja 70 ml etikkahappoliuosta (4.2.1.3)

4.2.2 Liikkuvan faasin valmistus

Lisätään dekanterilasissa 5 ml n-oktylamiiniliuosta (4.2.1.1) noin 400 ml:aan kahdesti tislattua vettä. Säädetään liuoksen pH:ksi 5,4–5,6 lisäämällä tipoittain 25-prosenttista fosforihappoa (4.1.4). Lisätään 50 ml puskuriliuosta (4.2.1.4) 1 000 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin kahdesti tislatulla vedellä. Liikkuva faasi on ennen käyttöä kalvosuodatettava (regeneroitu selluloosa, 0,2 μm), ja siitä on mahdollisuuksien mukaan poistettava kaasu heliumilla (noin 10 minuutin ajan), jos HLPC-kromatografiajärjestelmä sitä edellyttää.

4.3 Standardiliuoksen valmistaminen

Huomautus:

Kaikki standardiliuokset (kantaliuos 4.3.1. ja työliuokset 4.3.2) on valmistettava päivittäin, ja ne on mieluiten pidettävä jääkaapissa ennen injektointia.

4.3.1 Kantaliuoksen valmistaminen (1 mg/ml)

Valmistetaan 2-prosenttinen oksaalihapon vesiliuos ja poistetaan siitä happi kuplittamalla typpeä liuoksen läpi.

Punnitaan tarkalleen 100 mg L-askorbiinihappoa ja 100 mg D-isoaskorbiinihappoa 100 ml:n mittapulloon ja täytetään 2-prosenttisella oksaalihapon vesiliuoksella.

4.3.2 Työliuosten valmistaminen

Laimennetaan työliuoksia varten kantaliuos (4.3.1) 2-prosenttisella oksaalihapon vesiliuoksella haluttuun konsentraatioon. Suositeltavia ovat konsentraatiot 10–120 mg/l. Esimerkiksi 10 ml:aan 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl ja 1 200μl, jotka vastaavat konsentraatioita 10, 20, 40, 80 ja 120 mg/l.

5. VÄLINEISTÖ

Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat:

5.1 HLPC-pumppu

5.2 Injektiosilmukka, 20 μl

5.3 UV-detektori

6. NÄYTTEET

Viininäytteet suodatetaan ennen injektointia kalvon läpi, jonka huokosten halkaisija 0,2 μm.

Jos pitoisuus on yli 150 g/l, näytettä on laimennettava.

7. SUORITUS

7.1 HLPC-laitteiston käyttöolosuhteet

Injektoidaan kromatografilaitteistoon l20 μl kalvosuodatettua näytettä.

Esikolonni : esim. Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 μm) Kolonni : esim. Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 μm) Injektoitava tilavuus : 20 μl Liikkuva faasi : ks. 4.2.2, isokraattinen Virtausmäärä : 1 ml/min UV-detektori : 266 nm Huuhtelu : vähintään 30 ml kahdesti tislattua vettä, minkä jälkeen 30 ml metanolia ja 30 ml asetonitriiliä.

7.2 Piikkien tunnistaminen/varmentaminen

Piikit tunnistetaan vertaamalla standardiliuosten ja näytteiden retentioaikoja. Kuvattua kromatografialaitteistoa käytettäessä L-askorbiinihapon retentioaika on 7,7 minuuttia ja D-isoaskorbiinihapon 8,3 minuuttia (ks. kuva 1, kromatogrammi A).

Positiivisten tulosten varmentamiseksi näytteet on käsiteltävä pienellä määrällä askorbaattioksidaasia ja mitattava uudelleen (ks. kuva 2, kromatogrammi B).

Koska L-askorbiinihappo ja D-isoaskorbiinihappo hajoavat askorbaattioksidaasin vaikutuksesta, niiden retentioajan kohdalla ei pitäisi näkyä signaalia. Jos havaitaan häiriöpiikkejä, niiden pinta-ala on otettava huomioon analyyttien konsentraatiota laskettaessa.

Huomautus: Askorbaattioksidaasilla käsitellyt näytteet tulisi määrittää sarjan lopussa, ja määrityksen jälkeen olisi ajettava huuhteluliuokset askorbaattioksidaasijäämien poistamiseksi kolonnista. Muutoin askorbaattioksidaasijäämät saattavat muuntaa L-askorbiinihappoa ja D-isoaskorbiinihappoa HPLC-määrityksen aikana ja näin vaikuttaa tulokseen.

8. LASKEMINEN

Piirretään työliuosten perusteella (4.3.2) kalibrointikäyrä. L-askorbiinihapon ja D-isoaskorbiinihapon tulos suhteutetaan ulkoiseen standardiin eli mittaamalla piikkien pinta-alat ja vertaamalla niitä vastaavaan konsentraatioon kalibrointikäyrällä.

Tulosten ilmoittaminen

Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella milligrammoina L-askorbiinihappoa ja D-isoaskorbiinihappoa litrassa (esimerkiksi 51,3 mg/l).

Yli 150 g/l:n pitoisuuksien osalta on otettava huomioon laimennus.

9. LUOTETTAVUUS

Menetelmä on testattu laboratorioiden välisessä kokeessa, jonka järjesti vuonna 1994 Saksan silloinen terveydensuojeluvirasto (Bundesgesundheitsamt). Kokeeseen osallistui 27 laboratoriota. Laboratorioiden välisen kokeen ohjelma oli Saksan elintarvikelain 35 pykälän mukainen, ja OIV antoi sille hyväksynnän siihen asti, kun uusi menetelmä (OENO 6/2000) otettiin käyttöön.

Kokeeseen otettiin neljä eri viiniä (kaksi valkoviiniä ja kaksi punaviiniä), ja kunkin näytteen osalta koe toistettiin viisi kertaa. Koska ei ollut mahdollista valmistaa sellaisia näytteitä, joiden analyytit olisivat riittävän vakaita (eri hajoamisnopeuksia), osallistujille lähetettiin tietyt määrät puhtaita standardeja ja viininäytteitä. Laboratorioita ohjeistettiin siirtämään standardit kvantitatiivisesti viininäytteisiin ja tekemään määritykset välittömästi. L-askorbiinihapon määrät olivat 30–150 mg/l ja D-isoaskorbiinihapon 10–100 mg/l. Määritystulokset esitetään OIV:n julkaisemassa LIITTEESSÄ. Arviointi tehtiin standardin DIN/ISO 5725 (vuoden 1988 versio) mukaisesti.

Toistettavuuden (sr) ja uusittavuuden (sR) standardipoikkeamat vastasivat hyvin L-askorbiinihapon ja D-isoaskorbiinihapon konsentraatioita. Todellinen tarkkuusparametri voidaan laskea seuraavilla kaavoilla:

L-askorbiinihappo sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: L-askorbiinihapon konsentraatio (mg/l)

D-isoaskorbiinihappo sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: D-isoaskorbiinihapon konsentraatio (mg/l)

Esimerkki:

50 mg/l D-isoaskorbiinihappoa sr = 1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/L

10. MUITA MÄÄRITYKSEN OMINAISUUKSIA

10.1 Toteamisraja

L-askorbiinihapon ja D-isoaskorbiinihapon toteamisrajaksi tässä menetelmässä on arvioitu 3 mg/l.

10.2 Oikeellisuus

Keskimääräinen saanto, joka on laskettu neljälle näytteelle tehdyn laboratorioiden välisen kokeen perusteella (ks. OIV:n kokoelmassa julkaistu LIITE), oli

— 100,6 % L-askorbiinihapon osalta

— 103,3 % D-isoaskorbiinihapon osalta.

17 HIILIDIOKSIDI (OIV-AS-314-01-DIOCAR) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. MENETELMÄN PERIAATE

1.1. Hiilihapottomat viinit (CO2-ylipaine ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Tietyntilavuinen viininäyte jäähdytetään lähelle 0 °C ja lisätään sellaiseen määrään konsentraatioltaan tunnettua natriumhydroksidiliuosta, että pH-arvoksi tulee 10–11. Titrataan happoliuoksen kanssa karboanhydraasin läsnäollessa. Hiilidioksidipitoisuus lasketaan pH:n muuttamiseksi arvosta 8,6 (bikarbonaattimuoto) arvoon 4,0 (hiilihappo) tarvittavasta happotilavuudesta. Sokeatitraus tehdään samoissa koeolosuhteissa viinistä, josta hiilihappo on poistettu, jotta voitaisiin ottaa huomioon viinin happojen kuluttama natriumhydroksidiliuoksen tilavuus.

1.2. Helmeilevät viinit ja kuohuviinit

Jäähdytetään määritettävästä viinistä otettu näyte lähelle jäätymispistettä. Otetaan tietty tilavuus viiniä, jota käytetään hiilihapon poistamisen jälkeen sokeanäytteenä. Tehdään pulloon jäänyt viini emäksiseksi kaiken CO2:n sitomiseksi Na2CO3:ksi. Titrataan happoliuoksen kanssa karboanhydraasin läsnäollessa. Hiilidioksidipitoisuus lasketaan pH:n muuttamiseksi arvosta 8,6 (bikarbonaattimuoto) arvoon 4,0 (hiilihappo) tarvittavasta happotilavuudesta. Sokeatitraus tehdään samoissa koeolosuhteissa viinistä, josta hiilihappo on poistettu, jotta voitaisiin ottaa huomioon viinin happojen kuluttama natriumhydroksidiliuoksen tilavuus.

2. MENETELMÄN KUVAUS

2.1. Hiilihapottomat viinit (CO2-ylipaine ≤ 0,5 × 105 P)

2.1.1. Välineistö

2.1.1.1. Magneettisekoittaja

2.1.1.2. pH-mittari

2.1.2. Reagenssit

2.1.2.1. Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 0,1 M

2.1.2.2. Rikkihappoliuos (H2SO4), 0,05 M

2.1.2.3. Karboanhydraasiliuos, 1 g/l.

2.1.3. Suoritus

Jäähdytetään viininäyte sekä näytteenottoon käytettävä 10 ml:n pipetti noin 0 °C:seen.

Mitataan 100 ml:n dekantterilasiin 25 ml natriumhydroksidiliuosta (kohta 2.1.2.1); lisätään 2 tippaa karboanhydraasin vesiliuosta (kohta 2.1.2.3). Lisätään 10 ml viiniä 0 °C:seen jäähdytetyllä pipetillä.

Asetetaan dekantterilasi magneettisekoittajalle, sijoitetaan elektrodi ja magneettisauva liuokseen ja sekoitetaan maltillisesti.

Kun neste on saavuttanut ympäristön lämpötilan, lisätään hitaasti rikkihappoliuosta (kohta 2.1.2.2), kunnes pH-arvo on 8,6.

Lisätään rikkihappoa (kohta 2.1.2.2) edelleen, kunnes pH-arvo on 4,0. pH:n 8,6 ja pH:n 4,0 välillä käytetty tilavuus on n.

Poistetaan hiilidioksidi noin 50 ml:sta viininäytettä ravistelemalla sitä vakuumissa 3 minuutin ajan, lämmittäen pulloa noin 25 °C:n vesihauteessa.

Toistetaan edellä kuvattu suoritus 10 ml:lle viiniä, josta on poistettu hiilihappo; käytetty tilavuus on n'.

2.1.4. Tulosten ilmoittaminen

1 ml 0,05 M rikkihappoliuosta vastaa 4,4:ää milligrammaa hiilidioksidia.

Hiilidioksidin määrä grammoina litrassa viiniä saadaan yhtälöstä:

0,44 (n – n′)

Se ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

Huomautus: Jos viinin hiilidioksidipitoisuus on pieni (CO2 < 1 g/l), ei ole tarpeen lisätä karboanhydraasia katalysoimaan hiilidioksidin hydratoitumista.

2.2. Helmeilevät viinit ja kuohuviinit

2.2.1. Välineistö

2.2.1.1. Magneettisekoittaja

2.2.1.2. pH-mittari

2.2.2. Reagenssit

2.2.2.1. Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 50 % (m/m).

2.2.2.2. Rikkihappoliuos (H2SO4), 0,05 M

2.2.2.3. Karboanhydraasiliuos, 1 g/l

2.2.3. Suoritus

Tehdään pulloon merkki määritettävän viinin täyttökorkeudelle ja jäähdytetään, kunnes jäätyminen alkaa.

Annetaan pullon lämmetä hieman koko ajan ravistellen, kunnes jääkiteet häviävät.

Avataan pullo nopeasti ja otetaan mittalasiin 45–50 ml viiniä sokeatitrausta varten. Tämän näytteen tarkka tilavuus, v ml, luetaan mittalasista sen jälkeen, kun näyte on palautunut ympäristön lämpötilaan.

Heti sokeatitrausnäytteen ottamisen jälkeen lisätään pulloon 20 ml natriumhydroksidiliuosta (kohta 2.2.2.1) niin, että tilavuus on 750 ml.

Odotetaan viinin palautumista ympäristön lämpötilaan.

Mitataan 100 ml:n dekantterilasiin 30 ml keitettyä tislattua vettä ja 2 tippaa karboanhydraasiliuosta (kohta 2.2.2.3). Lisätään 10 ml emäksistä viiniä.

Asetetaan dekantterilasi magneettisekoittajalle, sijoitetaan elektrodi ja magneettisauva liuokseen ja sekoitetaan maltillisesti.

Kun neste on saavuttanut ympäristön lämpötilan, lisätään hitaasti rikkihappoliuosta (kohta 2.2.2.2), kunnes pH-arvo on 8,6.

Lisätään rikkihappoa (kohta 2.2.2.2) edelleen, kunnes pH-arvo on 4,0. pH:n 8,6 ja pH:n 4,0 välillä käytetty tilavuus on n.

Poistetaan hiilidioksidi v ml:sta sokeatitraukseen varattua viiniä ravistelemalla sitä vakuumissa 3 minuutin ajan, lämmittäen pulloa noin 25 °C:n vesihauteessa. Mitataan 10 ml viiniä, josta on poistettu hiilihappo, 30 ml:aan keitettyä tislattua vettä, lisätään 2-3 tippaa natriumhydroksidiliuosta (kohta 2.2.2.1) pH:n saattamiseksi arvoon 10–11. Seurataan edellä kuvattua suoritustapaa. Käytetty 0,05-molaarisen rikkihapon tilavuus on n'.

2.2.4. Tulosten ilmoittaminen

1 ml 0,05 M rikkihappoliuosta vastaa 4,4:ää milligrammaa hiilidioksidia.

Kaadetaan emäksinen viini pullosta ja määritetään yhden ml:n tarkkuudella pullon sisältämän alkuperäisen viinin tilavuus täyttämällä pullo siihen tehtyyn merkkiin asti vedellä. Tämä on V ml.

CO2-määrä grammoina litrassa viiniä saadaan yhtälöstä:

0,44(n – n′) × (V – v + 20)/(V – v)

Se ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

2.3. Teoreettisen ylipaineen laskeminen

Ylipaine 20 °C:ssa, Paph20, ilmoitettuna pascaleina, saadaan yhtälöstä:

Paph20 = Q/(1,951 × 10–5(0,86 - 0,01 A)(1 - 0,00144 S)) - Patm

jossa

Q : CO2-pitoisuus grammoina litrassa viiniä A : viinin alkoholipitoisuus 20 °C:ssa S : viinin sokeripitoisuus grammoina litrassa Patm : ilmanpaine, ilmoitettuna pascaleina.

18 VIININ SISÄLTÄMÄN HIILIDIOKSIDIN MÄÄRITYS MANOMETRISELLÄ MENETELMÄLLÄ (OIV–AS314-04-CO2MAN) – II TYYPIN MENETELMÄ

(p.m.)

[Tämän määritysmenetelmän kuvausta tarkistetaan parhaillaan OIV:ssä. Kuvaus julkaistaan komission tiedonannossa, kun OIV on julkaissut päivitetyn tekstin teoksen Recueil des Méthode Internationales d'analyse vuoden 2010 painoksessa.]

19 HELMEILEVIEN VIINIEN JA KUOHUVIINIEN PAINEEN MITTAUS (OIV-AS-314-02-SURPRES) – I TYYPIN MENETELMÄ

1. PERIAATE

Paine mitataan afrometrillä (paine-eromittari) sen jälkeen kun pullon lämpötila on tasaantunut ja pulloa ravistettu. Paine ilmoitetaan pascaleina (Pa) (I tyypin menetelmä). Samaa menetelmää sovelletaan myös hiilihapotettuihin kuohuviineihin ja hiilihapotettuihin helmeileviin viineihin.

2. VÄLINEISTÖ

Laitetta, jolla voidaan suorittaa paineen mittaus helmeilevää viiniä tai kuohuviiniä sisältävistä pulloista, kutsutaan afrometriksi. Se on eri muotoinen sen mukaan, miten pullo on suljettu (metallinen kapseli, kruunukorkki, korkkiaineesta tai muovista valmistettu korkki).

2.1. Metallisella kapselilla tai kruunukorkilla varustetut pullot

Laitteessa on kolme osaa (kuva 1):

— Yläosassa on manometri, käsin kiristettävä rengas, keskiosan sisällä liikkuva päätön ruuvi ja neula, joka lävistää kapselin tai kruunukorkin. Neulan kyljessä on reikä, josta paine siirtyy manometriin. Kohdassa, jossa laite kiinnittyy kapseliin tai kruunukorkkiin, on tiiviste.

— Keskiosan avulla yläosa ohjautuu oikeaan asentoon. Keskiosa kierretään kiinni alaosaan, jolloin laite pysyy tiukasti pullon suulla.

— Laitteen alaosassa on liitinosa, joka liu’utetaan pullon kaularenkaan alle siten, että laite kiinnittyy tukevasti. Kullekin pullotyypille on oma liitinosansa.

2.2. Korkkiaineesta tai muovista valmistetulla korkilla varustetut pullot

Laitteessa on kaksi osaa (kuva 2):

— Yläosa on muuten samanlainen kuin edellisessä laitteessa, mutta neula on pidempi. Neula on pitkä ontto putki, jonka päässä on piikki korkin lävistämistä varten. Piikki on irrallinen ja se putoaa viiniin korkin läpäistyään.

— Alaosassa on liitin ja alusta, joka asetetaan korkin päälle. Alustassa on neljä ruuvia, joiden avulla laite pysyy korkin päällä.

Molempiin laitteisiin kuuluvia manometrejä koskevat huomautukset:

— Manometri voi olla joko mekaaninen, jolloin siinä on Bourdon-putki, tai digitaalinen, jolloin siinä on pietsosähköinen anturi. Bourdon-putken on oltava ruostumatonta terästä.

— Manometrien asteikot on jaettu pascaleihin (lyhenne Pa). Kuohuviineille on käytännöllisempää käyttää yksikkönä 105 pascalia (105 Pa) tai kilopascalia (kPa).

— Afrometrit jaetaan eri luokkiin. Manometrin luokka riippuu lukeman tarkkuudesta suhteessa koko asteikkoon ilmoitettuna prosentteina (esimerkiksi 1 000 kPa:n manometri, luokka I, tarkoittaa, että suurin käyttöpaine on 1 000 kPa ja lukematarkkuus ± 10 kPa). Luokkaa I suositellaan tarkkoihin mittauksiin.

3. SUORITUS

Mittaus on suoritettava pulloista, joiden lämpötilan on annettu tasaantua vähintään 24 tunnin ajan. Kun kapseli, kruunukorkki tai korkkiaineesta tai muovista valmistettu korkki on lävistetty, pulloa ravistellaan voimakkaasti kunnes paine on asettunut, ja paine mitataan.

3.1. Metalliset kapselit tai kruunukorkit

Laitteen alaosan liitin liu’utetaan pullon kaularenkaan alle. Liitintä kiristetään, kunnes ala- ja keskiosa ovat tiukasti kiinni pullossa. Yläosa kiinnitetään keskiosaan. Jotta kaasua ei häviäisi, kapseli tai kruunukorkki on lävistettävä mahdollisimman nopeasti siten, että tiiviste tulee kosketukseen kapselin tai kruunukorkin kanssa. Pulloa ravistellaan jälleen voimakkaasti, ja mittaustulos luetaan paineen asetuttua.

3.2. Korkkiaineesta tai muovista valmistetut korkit

Piikki kiinnitetään neulaan. Yhdistelmä asetetaan korkin päälle. Ruuvit kiristetään korkkiin. Laitteen yläosaa kierretään (jolloin neula lävistää korkin). Jotta paine voi siirtyä manometriin, piikin on pudottava pulloon. Mittaustulos luetaan sen jälkeen kun pulloa on ravisteltu voimakkaasti ja paine on asettunut. Mittauksen jälkeen piikki poistetaan.

4. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Paine 20 °C:ssa (Paph20) ilmoitetaan pascaleina (Pa) tai kilopascaleina (kPa). Se on ilmoitettava yhtäpitävästi manometrin tarkkuuden kanssa (esimerkiksi: 6,3 × 105 Pa tai 630 kPa, ei 6,33 × 105 Pa tai 633 kPa luokan I manometrille, jossa on 1 000 kPa:n lukema-asteikko).

Jos mittauslämpötila ei ole 20 °C, on tehtävä korjaus kertomalla mitattu paine asianmukaisella kertoimella (ks. taulukko 1).

Taulukko 1

20 °C:ssa olevan helmeilevän viinin tai kuohuviinin paineen Paph20 suhde paineeseen Papht lämpötilassa t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. TULOSTEN VARMISTUS

Menetelmä fyysisten muuttujien määrittämiseksi suoraan (I tyypin eli ensisijainen vertailumenetelmä)

Afrometrien tarkistus

Afrometrit on tarkistettava säännöllisesti (vähintään kerran vuodessa).

Tarkistus tehdään kalibrointilaitteen avulla. Testattavaa manometriä verrataan sellaiseen rinnakkain kytkettyyn ylemmän tason vertailumanometriin, joka on kansallisten mittanormaalien mukainen. Tarkistus tehdään vertaamalla laitteiden ilmoittamia arvoja toisiinsa ensi lisääntyvän, sitten alenevan paineen osalta. Jos arvot ovat erilaiset, tarvittavat korjaukset voidaan tehdä säätöruuvin avulla.

Tällaisia kalibrointilaitteita on kaikissa akkreditoiduissa laboratorioissa ja laitoksissa, ja niitä on saatavilla myös manometrien valmistajilta.

20 VIININ SISÄLTÄMÄN LYSOTSYYMIN MÄÄRITYS HPLC-KROMATOGRAFIAN AVULLA (OIV-AS-315-14) – IV TYYPIN MENETELMÄ

1. Johdanto

Lysotsyymin määrittämiseksi on suositeltavaa käyttää analyysimenetelmää, joka ei perustu entsyymiaktiivisuuteen.

2. Soveltamisala

Tällä menetelmällä voidaan määrittää valko- ja punaviinien sisältämä lysotsyymi (mg proteiinia /l) riippumatta näytematriisin entsyymiaktiivisuudesta (joka voisi estyä osittaisen denaturoitumisen tai kompleksinmuodostuksen ja saostumisen takia.

3. Määritelmä

Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) on analyysimenetelmä, jonka perustana on steerinen, polaarinen tai adsoptiotyyppinen interaktio stationaarifaasin ja analyytin välillä. Näin ollen se ei liity proteiinin tosiasialliseen entsyymiaktiivisuuteen.

4. PERIAATE

Määritys tehdään korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC), johon liittyy spektrofotometridetektori ja spektrofluorimetridetektori. Viininäytteen lysotsyymipitoisuus lasketaan kromatografiapiikin pinta-alan perusteella ulkoista standardia käyttämällä.

5. REAGENSSIT

5.1. Liuottimet ja liuokset

Asetonitriili (CH3CN), HPLC-laatua

Trifluoroetikkahappo (TFA), puhdas

Deionisoitu vesi, HPLC-laatua

Standardiliuos: viinihappo 1g/l, etyylialkoholi 10 % v/v, jonka pH on säädetty arvoon 3,2 neutraalilla kaliumtartraatilla

5.2. Eluentit

A : CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % B : CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3. Vertailuliuokset

1–250 mg/l lysotsyymistandardia liuotettuna näytematriksiliuokseen ravistelemalla taukoamatta vähintään 12 tunnin ajan.

6. VÄLINEET

6.1. HPLC-laite, jossa on pumppujärjestelmä gradienttieluutiota varten.

6.2. Uuni termostoitua kolonnia varten

6.3. Spektrofotometridetektori liitettynä spektrofluorimetridetektoriin

6.4. Injektiosilmukka, 20 μl

6.5. Käänteisfaasipolymeerikolonni, jonka funktionaalisina ryhminä ovat fenyyliryhmät (huokosten halkaisija = 1 000 Å, ekskluusioraja = 1 000 000 Da), esimerkiksi Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP 7,5 cm x 4,6 mm ID.

6.6. Esikolonni, jonka materiaali on sama kuin kolonnin, esimerkiksi Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm x 3,2 mm ID.

7. NÄYTTEEN VALMISTAMINEN

Viininäytteet tehdään happamiksi kloorivetyhapolla (HCl, 10 M), joka on laimennettu suhteessa 1/10, ja suodatetaan 5 minuutin kuluttua kloorivetyhapon lisäämisestä polyamidisuodattimen läpi, jonka huokosten halkaisija on 0,22 μm. Kromatografinen määritys tehdään välittömästi suodatuksen jälkeen.

8. SUORITUSOLOSUHTEET

8.1. Eluentin virtausnopeus: 1 ml/min

8.2. Kolonnin lämpötila: 30 °C

8.3. Spektrofotometrin mittausaallon pituus: 280 nm

8.4. Spektrofluorimetrin mittausaallon pituus: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; vahvistus = 10.

8.5. Eluutiogradientti

Aika (min) Liuos A % Liuos B % Gradientti 0 100 0 isokraattinen 3 100 0 lineaarinen 10 65 35 isokraattinen 15 65 35 lineaarinen 27 40,5 59,5 lineaarinen 29 0 100 isokraattinen 34 0 100 lineaarinen 36 100 0 isokraattinen 40 100 0

8.6. Lysotsyymin keskimääräinen retentioaika: 25,50 minuuttia.

9. LASKEMINEN

Määritetään kolmeen kertaan vertailuliuokset, jotka sisältävät seuraavat konsentraatiot lysotsyymiä: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Jokaisesta kromatogrammista saadut lysotsyymiä vastaavien piikkien pinta-alat esitetään kuvaajassa konsentraatioiden funktiona, jotta saadaan lineaariset regressiokuvaajat, jotka ilmaistaan kaavalla Y = ax+b. Määrityskertoimen r2 on oltava > 0,999.

10. MENETELMÄN OMINAISUUDET

Menetelmän soveltuvuus sen tarkoitukseen on arvioitu tekemällä validointitutkimus, jossa on otettu huomioon lineaarisuus, toteamis- ja määritysrajat sekä menetelmän tarkkuus. Viimeksi mainittu parametri on arvioitu määrittämällä menetelmän tarkkuus ja täsmällisyys.

Lineaa-risuus-alue (mg/l) Suoran kulma-kerroin Määritys-kerroin (r2) Tr (mg/l) Mr (mg/l) Toistettavuus (n=5) RSD % Uusittavuus (n=5) RSD % Std1 Puna2 Valko 3 Std1 UV 5-250 3 786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1-250 52 037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Taulukko 1: Menetelmän ominaisuuksiin liittyvät tiedot: Std1 = standardiliuos; Puna 2 = punaviini; Valko 3 = valkoviini.

10.1. Menetelmän lineaarisuus

Lineaarisen regressioanalyysin tulosten perusteella menetelmä on lineaarinen taulukossa 1 esitettyjen rajojen puitteissa.

10.2. Toteamis- ja määritysrajat

Toteamisraja (Tr) on signaali, joka vastaa todellisella materiaalilla toteutettuun määritykseen liittyvää kromatografin taustakohinaa kerrottuna 3:lla ja määritysraja (Mr) signaali, joka vastaa kyseistä taustakohinaa kerrottuna 10:llä (taulukko 1).

10.3. Menetelmän tarkkuus

Parametreinä ovat toistettavuus ja uusittavuus. Taulukossa 1 esitetään näiden parametrien arvot (prosentteina eri konsentraatioilla toistettujen mittausten standardipoikkeamasta) standardiliuoksen, valkoviinin ja punaviinin osalta.

10.4. Menetelmän täsmällisyys

Saantoprosentti on laskettu standardiliuoksista, jotka sisältävät 5 ja 50 mg/l lysotsyymiä ja joihin on lisätty tietty, seuraavassa taulukossa esitetty määrä lysotsyymiä.

[C] alku-peräinen nimellis-määrä (mg/l) Lisäys (mg/l) [C] teoreettinen (mg/l) [C] todettu (mg/l) Standardi-poikkeama Saanto (%) UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99 FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102 UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1 FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

21 SULFAATIT (OIV-AS-321-05-SULFAT) – II TYYPIN MENETELMÄ

1. MENETELMIEN PERIAATE

1.1. Vertailumenetelmä

Saostetaan bariumsulfaattina ja punnitaan. Samoissa koeolosuhteissa saostunut bariumfosfaatt