Kahdeksas komission direktiivi 78/633/ETY, annettu 15 päivänä kesäkuuta 1978, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten



Virallinen lehti nro L 206 , 29/07/1978 s. 0043 - 0055

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 10 s. 0071

Kreikank. erityispainos: Luku 03 Nide 22 s. 0067

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 10 s. 0071

Espanjank. erityispainos: Luku 03 Nide 14 s. 0230

Portugalink. erityispainos: Luku 03 Nide 14 s. 0230



KAHDEKSAS KOMISSION DIREKTIIVI, annettu 15 päivänä kesäkuuta 1978, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten (78/633/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin 70/373/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna liittymisasiakirjalla, ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että edellä mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorittamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sen todentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten rehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi, useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY(2), 18 päivänä marraskuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/393/ETY(3), 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla komission direktiivillä 72/199/ETY(4), 5 päivänä joulukuuta 1972 annetulla komission direktiivillä 73/46/ETY(5), 25 päivänä maaliskuuta 1974 annetulla komission direktiivillä 74/203/ETY(6), 20 päivänä joulukuuta 1974 annetulla komission direktiivillä 75/84/ETY(7) ja 1 päivänä maaliskuuta 1976 annetulla komission direktiivillä 76/372/ETY(8); työ on tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä kahdeksas ryhmä menetelmiä, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla 1. Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät sinkkibasitrasiinin, flavofosfolipolin, raudan, kuparin, mangaanin ja sinkin pitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä esitettyjen menetelmien mukaisesti. 2. Tämän direktiivin liitteessä esitettyihin menetelmiin on sovellettava ensimmäisen komission direktiivin 71/250/ETY liitteessä olevan 1 osan (Johdanto) yleisiä määräyksiä, lukuun ottamatta näytteen esikäsittelyä koskevia määräyksiä. 2 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä tammikuuta 1979. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 3 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 15 päivänä kesäkuuta 1978. Komission puolesta Finn GUNDELACH Varapuheenjohtaja (1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2 (2) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13 (3) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7 (4) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6 (5) EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21 (6) EYVL N:o L 108, 22.4.1974, s. 7 (7) EYVL N:o L 32, 5.2.1975, s. 26 (8) EYVL N:o L 102, 15.4.1976, s. 8 LIITE 1. SINKKIBASITRASIININ MÄÄRITYS DIFFUUSIOLLA AGAR-ALUSTASSA 1 TARKOITUS JA KÄYTTÖALUE Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen, konsentraattien ja esiseosten sinkkibasitrasiinipitoisuus. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg (5 miljoonasosaa)(1*). Menetelmää ei voida soveltaa, jos seoksessa on häiritseviä aineita, erityisesti jos kyseessä on suuria määriä kuparia tai askorbiinihappoa. 2 PERIAATE Näyte uutetaan metanoli/vesi/kloorivetyhappo-seoksella, jonka pH on 2. Uutteen pH säädetään arvoon 6,5 ja tämä väkevöidään (tarvittaessa) ja laimennetaan. Sen antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla sinkkibasitriinin diffuusio agar-alustassa, johon on ympätty Micrococcus luteusta (flavusta). Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, jotka mikro-organismi muodostaa. Näiden vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä antibioottikonsentraatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin. 3 MIKRO-ORGANISMI: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240 3.1 Kantaviljelmän kasvatus Micrococcus luteus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalustasta (4.1) valmistettuja agar-vinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia 30 37 °C:ssa, säilytetään jääkaapissa noin 4 °C:ssa ja siirrostetaan uudestaan joka toinen viikko. 3.2 Bakteerisuspension valmistus(2a) Äskettäin valmistetusta agar-vinopinnasta (3.1) kasvusto huuhdellaan 2 3 ml:lla natriumkloridiliuosta (4.3). Suspensio siirrostetaan Roux-pulloon, jossa on 250 ml kasvatusliuosta (4.1) ja inkuboidaan 18 20 tuntia 30 37 °C:ssa. Kasvusto huuhdellaan 25 ml:aan natriumkloridiliuosta (4.3) ja homogenoidaan. Suspensio laimennetaan suhteessa 1/10 natriumkloridiliuokseen (4.3). Suspension valon transmission on oltava noin 75 % mitattuna 650 nm:ssa 1 cm:n kyvetissä natriumkloridiliuosta (4.3) vastaan. 4 KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT 4.1 Kasvatusalusta(3b) >TAULUKON PAIKKA> 4.2 Määritysalusta(4b)>TAULUKON PAIKKA> 4.3 0,8 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 8 g natriumkloridia veteen (analyysilaatua) ja laimennetaan 1 000 ml:ksi; steriloidaan. 4.4 Metanoli/vesi/kloorivetyhappo seos (analyysilaatua) (d: 1,18 1,19): 80/17,5/2,5 (v/v/v). 4.5 Fosfaattipuskuriliuos, pH 6,5: >TAULUKON PAIKKA> 4.6 Kloorivetyhappo analyysilaatua, d: 1,18 1,19 4.7 Kloorivetyhappo analyysilaatua 0,1 N 4.8 1 N natriumhydroksidiliuos analyysilaatua. 4.9 Noin 0,04 % (w/v) natriumsulfidiliuos 4.10 0,04 % (w/v) bromikresolipunaliuos: liuotetaan 0,1 g bromikresolipunaa 18,5 ml:aan 0,01 N natriumhydroksidiliuosta. Tilavuus säädetään 250 ml:ksi vedellä ja sekoitetaan. 5 STANDARDILIUOKSET Punnitaan sellainen määrä sinkkibasitrasiinistandardia (4.10), joka vastaa 1 050 k.y.:ä (annetun aktiivisuuden mukaan). Lisätään 5 ml 0,1 N kloorivetyhappoa (4.7) ja annetaan seistä 15 minuuttia. Lisätään 30 ml vettä, pH säädetään arvoon 4,5 fosfaattipuskurilla (4.5) (noin 4 ml), tilavuus säädetään 50 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan (1 ml = 21 k.y.). Tästä liuoksesta valmistetaan peräkkäisillä laimennuksilla fosfaattipuskuriin pH 6,5 (4.5) seuraavat liuokset: >TAULUKON PAIKKA> 6 UUTTEEN JA MÄÄRITYSLIUOSTEN VALMISTUS 6.1 Uutto 6.1.1 Esiseokset, konsentraatit ja kivennäisrehut Punnitaan 2,0 - 5,0 g näytettä ja lisätään 30 ml seosta (4.4) ja ravistellaan lyhyen aikaa. Tarkistetaan, että pH-arvo on noin 2. Ravistellaan 10 minuuttia, lisätään 30 ml fosfaattipuskuria pH 6,5 (4.5), ravistellaan 15 minuuttia. Laimennetaan fosfaattipuskurilla (4.5), jotta oletetuksi sinkkibasitrasiinipitoisuudeksi saataisiin 0,42 k.y./ml (= U8). 6.1.2 Valkuaiskonsentraatit Punnitaan 10 g näytettä ja lisätään 50 ml seosta (4.4) ja ravistellaan lyhyen aikaa. Tarkistetaan, että pH-arvo on noin 2. Ravistellaan 10 minuuttia, lisätään 50 ml fosfaattipuskuria pH 6,5 (4.5), ravistellaan 15 minuuttia. Laimennetaan fosfaattipuskurilla (4.5), jotta oletetuksi sinkkibasitrasiinipitoisuudeksi saataisiin 0,42 k.y./ml (= U8). 6.1.3 Muut rehut Punnitaan 10 g näytettä (20 g, jos oletettu sinkkibasitrasiinipitoisuus on 5 mg/kg). Lisätään liuos, jossa on 25 ml seosta (4.4) ja homogenoidaan 10 minuuttia. Lisätään 25 ml fosfaattipuskuria pH 6,5 (4.5), ravistellaan 15 minuuttia ja sentrifugoidaan. Otetaan 20 ml supernatanttia ja säädetään sen pH arvoon 6,5 1 N natriumhydroksidiliuoksella käyttäen bromikresolipunaliuosta (4.8) indikaattorina. Haihdutetaan noin 4 ml:ksi pyöröhaihduttajassa lämpötilassa, joka ei ylitä 35 °C. Laimennetaan vedellä siten, että oletetuksi sinkkibasitrasiinipitoisuudeksi saadaan 0,42 k.y./ml (= U8). 6.2 Määritysliuokset U8 -liuoksesta valmistetaan liuokset U4 (oletettu pitoisuus: 0,21 k.y./ml), U2 (oletettu pitoisuus: 0,105 k.y./ml) ja U1 (oletettu pitoisuus: 0,0525 k.y./ml) peräkkäin laimentaen (1 + 1) fosfaattipuskurilla (4.5). 7 MENETTELY 7.1 Siirrostus määritysalustaan Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 °C:ssa määritysalustaan (4.2). Alustasta (4.2) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet, joilla määritetään eri sinkkibasitrasiinikonsentraatioissa suurimmat ja kirkkaimmat inhibitiovyöhykkeet antava bakteerisuspensiomäärä. 7.2 Maljojen valmistus Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskonsentraatiota (S8, S4, S2, S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8, U4, U2, U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agar-alustaan voidaan tehdä ainakin 8 reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10 - 13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus 20 mm. Maljoille kaadetaan sellainen määrä 7.1 kohdan mukaisesti siirrostettua alustaa (4.2), joka muodostaa noin 2 mm paksun kerroksen (50 ml 200 mm:n läpimittaisiin maljoihin). Jäähdytetään vaakasuoralla alustalla, alustaan tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen välillä 0,10 0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten, että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhykkeestä. 7.3 Inkubointi Maljoja inkuboidaan 16 - 18 tuntia n. 30 °C:ssa. 8 LASKEMINEN Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardiliuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti. Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL) osalta määritetään käyttäen kaavaa: a) SL = >NUM>7 S1 + 4 S2 + S4 2 S8 >DEN>10 Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH) osalta määritetään käyttäen kaavaa: b) SL = >NUM>7 S8 + 4 S4 + S2 2 S1 >DEN>10 Parhaimman sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän pitoisuuden (UL) ja uutteen suurimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla edellä olevissa kaavoissa S1, S2, S4 ja S8 U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla. Lasketut SL- ja SH-arvot samalle kuvaajapaperille ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH- arvot ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi uutteen osalta. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset. Käytännössä suorien voidaan katsoa olevan yhdensuuntaisia, jos arvot (SH - SL) ja (UH - UL) eivät poikkea keskiarvostaan yli 10 %. Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1 ja S1 tai U8 ja S8 voidaan hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi: a') SL = >NUM>5 S1 + 2 S2 S4 >DEN>6 tai >NUM>5 S2 + 2 S4 S8 >DEN>6 b') SH = >NUM>5 S4 + 2 S2 S1 >DEN>6 tai >NUM>5 S8 + 2 S4 S2 >DEN>6 ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa. Kun suorien katsotaan olevan yhdensuuntaiset, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista: Neljän pitoisuuden osalta c) log A = >NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 S1 S2 S4 S8) × 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 U1 U2 S1 S2 Kolmen pitoisuuden osalta d) log A = >NUM>(U1 + U2 + U4 S1 S2 S4) × 0,401 >DEN>U4 + S4 + U1 S1 tai d') log A = >NUM>(U2 + U4 + U8 S2 S4 S8) × 0,401 >DEN>U8 + S8 U2 S2 Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus X suhteellinen aktiivisuus Kun suoria ei pidetä yhdensuuntaisina, määritys toistetaan. Jos yhdensuuntaisuutta ei saada vieläkään aikaan, on suhteellisen aktiviteetin logaritmi (log. A) laskettava c kaavalla. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada tuotua vaaditulle alueelle, on mikä tahansa saatu tulos katsottava likimääräiseksi ja tämä on mainittava määritysselosteessa. Tulokset ilmoitetaan milligrammoina sinkkibasitrasiinia rehukiloa kohden. 9 TOISTETTAVUUS Samasta näytteestä suoritetun kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää: 20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 5 25 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; 5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 25 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta. 2. FLAVOFOSFOLIPOLIN MÄÄRITYS DIFFUUSIOLLA AGAR-ALUSTASSA 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen, konsentraattien ja esiseosten flavofosfolipolipitoisuus. Määrityksen alaraja on 1 mg/kg (1 miljoonasosa). 2 PERIAATE Näyte refluksoidaan laimealla metanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen uute puhdistetaan tarvittaessa ioninvaihtohartseilla ja laimennetaan. Antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla flavofosfolipolin diffuusio agar-alustalla, johon on ympätty Staphylococcus aureusta. Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, jotka mikro-organismi muodostaa. Vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä antibioottikonsentraatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin. 3 MIKRO-ORGANISMI: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P 3.1 Kantaviljelmän kasvatus Staphylococcus aureus ympätään putkiin, jotka sisältävät kasvatusalustasta (4.1) valmistettuja agar-vinopintoja. Inkuboidaan 24 tuntia 37 °C:ssa, säilytetään jääkaapissa noin 4 °C:ssa ja siirrostetaan uudelleen kuukausittain. 3.2 Bakteerisuspension valmistus(5a)Otetaan kaksi kantaviljelmää (3.1) sisältävää putkea ja siirrostetaan ne uudelleen viikottain. Inkuboidaan 24 tuntia 37 °C:ssa ja säilytetään jääkaapissa noin 4 °C:ssa. Nämä kasvustot siirrostetaan 24 tuntia ennen määritystä kahdesta putkesta neljään putkeen, jotka sisältävät kasvatusalustasta (4.1) valmistettuja agar-vinopintoja. Inkuboidaan 16 - 18 tuntia 37 °C:ssa. Kasvustosta valmistetaan suspensio natriumkloridiliuokseen (4.3). Suspension valon transmission on oltava noin 40 % mitattuna 578 nm:ssa 1 cm:n kyvetissä natriumkloridiliuosta (4.3) vastaan. 4 KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT 4.1 Kasvatusalusta(6a)>TAULUKON PAIKKA> 4.2 Määritysalusta 4.2.1 Pohjakerros(7b)>TAULUKON PAIKKA> 4.2.2 Siirrostuskerros Kasvatusalustaan (4.1) lisätään 2,0 g silikonipitoista vaahdonestoemulsiota(8c)4.3 0,4 % (w/v) natriumkloridiliuos: liuotetaan 4 g natriumkloridia (analyysilaatua) veteen, laimennetaan 1 000 ml:ksi ja steriloidaan. 4.4 Metanoli, puhdas. 4.5 50 % (v/v) metanoli: 500 ml metanolia (4.4) laimennetaan 500 ml:lla vettä. 4.6 80 % (v/v) metanoli: 800 ml metanolia (4.4) laimennetaan 200 ml:lla vettä. 4.7 Tris(hydroksimetyyli)aminometaani, analyysilaatua. 4.8 1,5 % (w/v) metanolipitoinen kaliumkloridiliuos: liuotetaan 1,5 g kaliumkloridia analyysilaatua 20 ml:aan vettä, täytetään 100 ml:ksi metanolilla (4.4). 4.9 Kationinvaihtaja: Dowex 50 W × 8, 20 50 mesh, Na-muoto (Servan tuoteluettelo n:o 41600) tai tätä vastaava. 4.10 Anioninvaihtaja: Dowex 1x2, 50 100 mesh, Cl-muoto (Servan tuoteluettelo n:o 41010) tai tätä vastaava. Ennen käyttöä pidetään 12 14 tuntia 80 % metanolissa (4.6). 4.11 Lasivillaa. 4.12 pH-indikaattoripaperia (pH 6,6 8,1). 4.13 Askorbiinihappo. 4.14 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava flavofosfolipoli. 5 VÄLINEISTÖ 5.1 Lasisia kromatografiapylväitä, sisähalkaisija 9 mm, pituus 150 200 mm, joiden alapään kavennetussa osassa on hana ja yläpäässä on hios (tiputussuppiloon liittämistä varten (5.2)). 5.2 250 ml:n tiputussuppilo, jossa on hana ja hios. 5.3 250 ml:n hioksellinen erlenmeyerkolvi 5.4 Hioksellinen palautusjäähdytin. 6 STANDARDILIUOKSET Liuotetaan tarkkaan punnittu määrä standardiyhdistettä (4.14) 50 % metanoliin (4.5.) ja laimennetaan kantaliuokseksi, joka sisältää 100 µg flavofosfolipolia millilitraa kohti. Tämä liuos säilyy 4 °C:ssa tulpallisissa pulloissa korkeintaan kaksi kuukautta. Kantaliuoksesta valmistetaan peräkkäin laimentaen 50 % metanoliin (4.5.) seuraavat liuokset: >TAULUKON PAIKKA> 7 UUTTEEN VALMISTUS 7.1 Uutto 7.1.1 Konsentraatit, esiseokset ja mineraalirehut Punnitaan 2 5 g näytettä ja lisätään noin 150 mg askorbiinihappoa (4.13). Sekoitetaan erlenmayerpullossa (5.3) 150 ml:aan 50 %:sta metanolia (4.5) ja säädetään pH alueelle 8,1 8,2 noin 400 mg:lla tris(hydroksimetyyli)aminometaania (4.7). Tarkistetaan pH indikaattoripaperilla (4.12). Annetaan seistä 15 minuuttia, säädetään pH uudelleen alueelle 8,1 8,2 tris(hydroksimetyyli)aminometaanilla (4.7) ja refluksoidaan 10 minuuttia (4.5) koko ajan sekoittaen. Annetaan jäähtyä, sentrifugoidaan ja uute dekantoidaan. 7.1.2 Muut rehut Punnitaan 5,0 30,0 g näytettä, joka sisältää vähintään 30 µg flavofosfolipolia. Sekoitetaan erlenmeyerkolvissa (5.3) 150 ml:aan 50 % metanolia (4.5) ja säädetään pH alueelle 8,1 8,2 noin 400 mg:lla tris(hydroksimetyyli)aminometaania (4.7). Tarkistetaan pH indikaattoripaperilla (4.12). Annetaan seistä 15 minuuttia, säädetään pH uudelleen alueelle 8,1 8,2 noin 400 mg:lla tris(hydroksimetyyli)aminometaania (4.7) ja refluksoidaan 10 minuuttia (4.5) koko ajan sekoittaen. Annetaan jäähtyä, sentrifugoidaan ja uute dekantoidaan. 7.2 Puhdistus (tämä vaihe voidaan jättää pois konsentraatteja, esiseoksia ja mineraalirehuja määritettäessä) Sekoitetaan 110 ml uutetta ja 11 g kationinvaihtajaa (4.9), refluksoidaan yhden minuutin ajan (5.4) koko ajan sekoittaen. Kationinvaihtaja erotetaan sentrifugoimalla tai suodattamalla. Sekoitetaan 100 ml uutetta ja 150 ml metanolia (4.4) ja annetaan seistä 12 15 tuntia 4 °C:ssa. Hahtuvamainen massa suodatetaan kylmänä. Lasipylvään (5.1) alapäähän asetetaan lasivillatuppo (4.11), pylvääseen kaadetaan 5 ml anioninvaihtajaa (4.10) ja pylväs pestään 100 ml:lla 80 %:sta metanolia (4.6). Pylvääseen siirretään suppilon (5.2) avulla ainakin 100 ml:n suuruinen erä suodosta, jonka oletetaan sisältävän 16 µg flavofosfolipolia (200 ml 30 g:n suuruiseen rehunäytteeseen, jonka pitoisuus on 1 mg/kg). Suodos laimennetaan tarvittaessa ennen pylvääseen viemistä 80 % metanolilla (4.6), jotta oletetuksi flavofosfolipolipitoisuudeksi saataisiin 16 µg/100 ml. Virtausnopeuden tulee olla noin 2 ml/minuutti. Eluoitunut liuos heitetään pois. Tämän jälkeen pylväs pestään 50 ml:lla 80 % metanolia (4.6.) ja eluoitunut liuos heitetään pois. Flavofosfolipoli eluoidaan metanolipitoisella kaliumkloridiliuoksella (4.8). Virtausnopeuden tulee olla noin 2 ml/minuutti. Kerätään 50 ml eluaattia asteikolliseen pulloon, lisätään 30 ml vettä ja homogenoidaan. Tämän liuoksen flavofosfolipolipitoisuuden olisi oltava 0,2 µg/ml (= U8). 7.3 Määritysliuokset Tarvittaessa (erityisesti silloin, kun puhdistusvaihe on jätetty pois), laimennetaan 7.1.1 kohdassa saatu uute 50 % metanolilla (4.5) siten, että oletetuksi flavofosfolipolipitoisuudeksi saadaan 0,2 µg/ml (=U8). Valmistetaan U8-liuoksesta liuokset U4 (oletettu pitoisuus: 0,1 µg/ml), U2 (oletettu pitoisuus: 0,05 µg/ml) ja U1 (oletettu pitoisuus: 0,025 µg/ml) peräkkäin laimentaen (1 + 1) 50 % metanolilla (4.5). 8 MENETTELY 8.1 Siirrostus määritysalustaan Bakteerisuspensio (3.2) siirrostetaan noin 50 °C määritysalustaan (4.2.2). Määritysalustasta (4.2.2) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet. Määritetään se bakteerisuspensiomäärä, jolla saadaan suurimmat ja kirkkaimmat inhibitiovyöhykkeet eri flavofosfolipolikonsentraatioilla (noin 30 ml/l). 8.2 Maljojen valmistus Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljä standardiliuoskonsentraatiota (S8, S4, S2, S1) ja neljä määritysliuoskonsentraatiota (U8, U4, U2, U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agar-alustaan voidaan tehdä ainakin kahdeksan reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10 13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus 20 mm. Maljoille kaadetaan sellainen määrä kasvatusalustaa (4.2.1), että se muodostaa noin 1,5 mm paksun kerroksen (45 ml 200 mm:n läpimittaiseen maljaan). Maljat jäähdytetään vaakasuoralla alustalla ja tämän päälle lisätään sellainen määrä 8.1 kohdan mukaisesti siirrostettua kasvatusalustaa (4.2.2), että se muodostaa 1 mm:n paksuinen kerroksen (30 ml 200 mm:n läpimittaiseen maljaan). Jäähdytetään vaakasuoralla alustalla, tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10 0,15 ml reikää kohden). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten, että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhykkeestä. 8.3 Inkubointi Maljoja inkuboidaan 16 18 tuntia 28 30 °C:ssa. 9 LASKEMINEN Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin pitoisuutta vastaavien mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardiliuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti. Parhainta sovitusta edustava piste matalimman standardipitoisuuden (SL) osalta määritetään käyttäen kaavaa: a) SL = >NUM>7 S1 + 4 S2 + S4 2 S8 >DEN>10 Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH) osalta määritetään käyttäen kaavaa: b) SH = >NUM>7 S8 + 4 S4 + S2 2 S1 >DEN>10 Parhaan sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän pitoisuuden (UL) ja uutteen korkeimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla yllä olevissa kaavoissa S1, S2, S4 ja S8 U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla. Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen mukaisen suoran muodostamiseksi standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH- arvot ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi uutteen osalta. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset. Käytännössä suorien voidaan katsoa olevan yhdensuuntaisia, jos arvot (SH SL) ja (UH UL) eivät eroa keskiarvostaan yli 10 %. Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1 ja S1 tai U8 ja S8 voidaan hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi: a') SL = >NUM>5 S1 + 2 S2 S4 >DEN>6 tai >NUM>5 S2 + 2 S4 S8 >DEN>6 b') SH = >NUM>5 S4 + 2 S2 S1 >DEN>6 tai >NUM>5 S8 + 2 S4 S2 >DEN>6 ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa. Kun suorien katsotaan olevan yhdensuuntaiset, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista: Neljän pitoisuuden osalta c) log A = >NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 S1 S2 S4 S8) × 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 U1 U2 S1 S2 Kolmen pitoisuuden osalta d) log A = >NUM>(U1 + U2 + U4 S1 S2 S4) × 0,401 >DEN>U4 + S4 + U1 S1 tai d') log A = >NUM>(U2 + U4 + U8 S2 S4 S8) × 0,401 >DEN>U8 + S8 U2 S2 Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus. Kun suoria ei pidetä yhdensuuntaisina, määritys toistetaan. Jos yhdensuuntaisuutta ei vieläkään saada aikaan, lasketaan suhteellisen aktiivisuuden logaritmi (log A) c kaavan avulla. Saatua tulosta on pidettävä likimääräisenä ja tämä on mainittava määritysselosteessa. 10 TOISTETTAVUUS Samasta näytteestä suoritetun kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää: 0,5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 1 2 mg/kg olevien flavofosfolipolipitoisuuksien osalta; 25 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 2 10 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; 20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10 25 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; 5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna välillä 25 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta. 3. RAUTA-, KUPARI-, MANGAANI- JA SINKKIHIVENAINEIDEN MÄÄRITYS 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuista rauta-, kupari-, mangaani- ja sinkkihivenaineet. Määrityksen alarajat ovat: >TAULUKON PAIKKA> 2 PERIAATE Näytteestä tehdään liuos kloorivetyhappoon sen jälkeen, kun siinä mahdollisesti esiintyvät orgaaniset aineet on hävitetty. Alkuaineet rauta, kupari, mangaani ja sinkki määritetään sopivan laimennuksen jälkeen atomiabsorbtiospektrometrisesti. 3 REAGENSSIT Alustavat huomautukset Reagenssien ja analyysiliuosten valmistuksessa käytetään määritettävistä kationeista vapaata vettä, joka on saatu joko tislaamalla se kaksi kertaa borosilikaattilasista tai kvartsista valmistetussa tislauslaitteessa tai käsittelemällä se kaksi kertaa ioninvaihtohartsilla. Reagenssien on oltava vähintään analyyttistä puhtausastetta (analyysilaatua). Reagenssien sisältämien määritettävien alkuaineiden pitoisuudet on tarkistettava sokeakokeella. Tarvittaessa reagensseille on suoritettava lisäpuhdistus. Seuraavassa kuvattujen standardiliuosten tilalla voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia standardiliuoksia, jos ne ovat takuulaatua ja ne on tarkistettu ennen käyttöä. 3.1 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19. 3.2 6 N kloorivetyhappo, analyysilaatua. 3.3 0,5 N kloorivetyhappo, analyysilaatua. 3.4 38 40 % (v/v) fluorivetyhappo, jonka rautapitoisuus on alle 1 mg Fe/l ja haihdutusjäännös alle 10 mg (sulfaattina)/litra. 3.5 Rikkihappo, analyysilaatua, tiheys 1,84. 3.6 Vetyperoksidi, analyysilaatua noin 100 tilavuusosaa happea (30 % (w/v). 3.7 Rautastandardiliuos (1 000 µg Fe/ml), joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 1 g rautalankaa analyysilaatua 200 ml:aan 6 N kloorivetyhappoa (3.2), lisätään 16 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.7.1 Rautakäyttöstandardiliuos (100 µg Fe/ml), joka on valmistettu laimentamalla standardiliuos (3.7) suhteessa 1 + 9 vedellä. 3.8 Kuparistandardiliuos (1 000 µg Cu/ml), joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 1 g jauhemaista kuparia analyysilaatua 25 ml:aan 6 N kloorivetyhappoa (3.2), lisätään 5 ml vetyperoksidia (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.8.1 Kuparikäyttöstandardiliuos (10 µg Cu/ml), joka on valmistettu laimentamalla standardiliuos (3.8) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimentamalla saatu liuos suhteessa 1 + 9 vedellä. 3.9 Mangaanistandardiliuos (1 000 µg Mn/ml), joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 1 g jauhemaista mangaania analyysilaatua 25 ml:aan 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.9.1 Mangaanikäyttöstandardiliuos (10 µg Mn/ml), joka on valmistettu laimentamalla standardiliuos (3.9) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimentamalla saatu liuos suhteessa 1 + 9 vedellä. 3.10 Sinkkistandardiliuos (1 000 µg Zn/ml), joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 1 g nauhamaisessa tai lehtimäisessä muodossa olevaa sinkkiä analyysilaatua 25 ml:aan 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.10.1 Sinkkikäyttöstandardiliuos (10 µg Zn/ml), joka on valmistettu laimentamalla standardiliuos (3.10) suhteessa 1 + 9 vedellä ja laimentamalla saatu liuos suhteessa 1 + 9 vedellä. 3.11 Lantaanikloridiliuos, joka on valmistettu seuraavasti: liuotetaan 12 g lantaanioksidia 150 ml:aan vettä, lisätään 100 ml 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja täytetään yhdeksi litraksi vedellä. 4 VÄLINEISTÖ 4.1 Muhveliuuni, jossa on lämpötilan säätölaitteella ja piirturi. 4.2 Lasitavaroiden on oltava kestävää borosilikaattityyppiä. On suositeltavaa käyttää välineitä, jotka on erityisesti tarkoitettu hivenaineiden määrityksiin. 4.3 Platinaupokas tai vaihtoehtoisesti kvartsiupokas. 4.4 Atomiabsorbtiospektrofotometri, joka herkkyys ja tarkkuus täyttää menetelmän vaatimukset vaaditulla alueella. 5 MENETTELY 5.1 Orgaanista ainetta sisältävät näytteet 5.1.1 Polttaminen tuhkaksi ja analyysiin tarvittavan liuoksen valmistus(9*)i) Punnitaan 5 10 g näytettä 0,2 mg:n tarkkuudella kvartsi- tai platinaupokkaaseen (4.3) (ks. huomautus b, kuivataan kuivauskaapissa 105 °C:ssa ja pannaan upokas kylmään muhveliuuniin (4.1). Uuni suljetaan (katso c huomautus) ja lämpötila nostetaan vähitellen 450 475 °C:een noin 90 minuutin aikana. Lämpötila pidetään tässä 4 16 tuntia (esimerkiksi yön yli) hiilipitoisen materiaalin poistamiseksi ja uuni avataan ja sen annetaan jäähtyä (ks. huomautus d). Kostutetaan tuhka vedellä ja siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Upokas pestään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1) ja liuos lisätään hitaasti ja varovasti dekantterilasiin (tällöin voi esiintyä voimakas reaktio, joka johtuu CO2:n muodostumisesta). Kloorivetyhappo (3.1) lisätään pisaroittain samalla sekoittaen kunnes kupliminen on kokonaan lakannut. Haihdutetaan kuivaksi ajoittain lasisauvalla sekoittaen. Jäännökseen lisätään 15 ml 6 N kloorivetyhappoa (3.2) ja noin 120 ml vettä. Sekoitetaan lasisauvalla, joka jätetään dekantterilasiin, ja dekantterilasi peitetään kellonlasilla. Kuumennetaan varovasti kiehumispisteeseen ja pidetään kiehumispisteessä kunnes enempää tuhkaa ei havaita liukenevan. Suodatetaan tuhkavapaalla suodatinpaperilla ja suodos kerätään talteen 250 ml:n mittapulloon. Dekantterilasi pestään ja suodatetaan 5 ml:lla kuumaa 6 N kloorivetyhappoa (3.2) sekä kaksi kertaa kiehuvalla vedellä. Mittapullo täytetään merkkiin vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 N). ii) Jos suodatinpaperissa oleva jäännös on ulkonäöltään mustaa (hiiltä), se viedään takaisin uuniin ja poltetaan uudelleen tuhkaksi 450 475 °C:ssa. Tämä poltto kestää vain muutaman tunnin (noin 3 5 tuntia) ja on suoritettu loppuun silloin, kun tuhka on ulkonäöltään valkeaa tai lähes valkeaa. Jäännös liuotetaan noin 2 ml:aan kloorivetyhappoa (3.1), haihdutetaan kuivaksi ja lisätään 5 ml 6 N kloorivetyhappoa (3.2). Kuumennetaan, suodatetaan mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 N). Huomautukset: a) Hivenaineita määritettäessä on tärkeää pitää jatkuvasti mielessä erityisesti sinkistä, kuparista ja raudasta aiheutuvat saastumisriskit. Tästä syystä näytteiden valmistuksessa käytetyt välineet eivät saa sisältää näitä metalleja. Yleisen saastumisriskin vähentämiseksi olisi työskenneltävä pölyttömässä tilassa ja käytettävä huolellisesti puhdistettuja välineitä ja lasitavaroita. Sinkin määritys on erityisen herkkää saastumiselle, joka aiheutuu erityisesti lasitavaroista, reagensseista, pölystä jne. b) Tuhkaksi poltettavan näytteen paino lasketaan rehun likimääräisestä hivenainepitoisuudesta käytetyn spektrofotometrin herkkyyteen suhteutettuna. Tiettyjen pieniä hivenainemääriä sisältävien rehujen määritys on ehkä aloitettava 10 20 g:n näytteellä ja valmistaa lopullista liuosta vain 100 ml. c) Tuhkaksi poltto on suoritettava suljetussa uunissa ilmaa tai happea lisäämättä. d) Pyrometrin osoittama lämpötila ei saa olla yli 475 °C. 5.1.2 Spektrofotometrinen määritys 5.1.2.1 Standardiliuosten valmistus Kutakin määritettävää alkuainetta varten valmistetaan 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.1.10 kohdassa mainituista käyttöstandardiliuoksista sarja standardiliuoksia siten, että kunkin standardiliuoksen HCl-pitoisuus on noin 0,5 N. Raudan, mangaanin ja sinkin lantaanikloridikonsentraatio vastaa 0,1 % (w/v) La. Valittujen hivenainekonsentraatioiden on oltava käytetyn spektrofotometrin herkkyysalueella. Seuraavissa taulukoissa annetaan esimerkinomaisesti erilaisia standardiliuoskoostumuksia; käytetyn spektrofotometrin tyypistä ja herkkyydestä riippuen voi kuitenkin olla tarpeen valita muita pitoisuuksia. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 5.1.2.2 Liuoksen valmistus määritystä varten Kuparin määritystä varten voidaan 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta käyttää yleensä suoraan. Tarvittaessa sen pitoisuus tuodaan standardiliuosten alueelle, tästä otettu erä voidaan pipetoida 100 ml:n mittapulloon ja täyttää merkkiin 0,5 N kloorivetyhapolla (3.3). Raudan, mangaanin ja sinkin määritystä varten pipetoidaan erä 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta 100 ml:n mittapulloon, lisätään 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään merkkiin 0,5 N kloorivetyhapolla (3.3.) (ks. myös 8 kohta Huomautus). 5.1.2.3 Sokeakoe Sokeakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä. Standardiliuosta "0" ei saa käyttää sokeakokeena. 5.1.2.4 Atomiabsorptiomittaus Standardiliuosten ja määritettävän liuoksen atomiabsorptio mitataan hapettavalla ilma-asetyleeniliekillä seuraavilla aallonpituuksilla: >TAULUKON PAIKKA> Kukin mittaus suoritetaan neljä kertaa. 5.2 Kivennäisrehut Jos näyte ei sisällä orgaanista ainetta, ei ole tarpeen polttaa sitä tuhkaksi. Suoritusta jatketaan 5.1.1 i kohdan toisesta kappaleesta. Haihdutus fluorivetyhapolla voidaan jättää pois. 6 TULOSTEN LASKEMINEN Määritettävässä liuoksessa oleva hivenainepitoisuus lasketaan kalibrointikäyrältä ja tulos ilmoitetaan milligrammoina hivenainetta kilogrammassa näytettä (miljoonasosia). 7 TOISTETTAVUUS Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää: - 5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, korkeintaan 50 mg/kg olevien hivenainepitoisuuksien osalta; - 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 50 100 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; - 10 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 100 200 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; - 5 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 200 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta. 8 HUOMAUTUS Suuret fosfaattimäärät voivat häiritä raudan, mangaanin ja sinkin määritystä. Tällainen häiriö on korjattava lantaanikloridiliuosta (3.11) lisäämällä. Jos näytteen painosuhde on kuitenkin >NUM>Ca + Mg >DEN>P > 2, voidaan lantaanikloridiliuoksen (3.11) lisäys määritettävään liuokseen ja standardiliuoksiin jättää pois. (1*) 1 mg rehulaatuluokkaa olevaa sinkkibasitrasiinia vastaa 42 kansainvälistä yksikköä (k.y.). (2a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että on voitu osoittaa, että niillä saadaan aikaan samanlaisia bakteerisuspensioita. (3b) Voidaan käyttää mitä tahansa koostumukseltaan vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset. (4a) Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niillä saadaan aikaan samanlaisia bakteerisuspensioita. (5a) Voidaan käyttää mitä tahansa koostumukseltaan vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa kasvatusalustaa, esim. Oxford Antibiotic Medium (CM 327), johon on lisätty agaria Oxoid N:o 3 (L 13). (6b) Voidaan käyttää mitä tahansa koostumukseltaan vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa kasvatusalustaa, esim. Oxford Antibiotic Medium 2 (CM 335), johon on lisätty agaria Oxoid N:o 3 (L 13). (7c) Esim. Wacker Chemic GmbH, München, SE 2. (8*) Vihreisiin rehuihin (tuoreisiin tai kuivattuihin) oletetaan sisältyvän suuria määriä kasvissilikonia, joka saattaa sitoa mikromineraaleja, ja joka on siksi poistettava, sellaisten rehujen tarkastuksessa on siksi sovellettava seuraavaa muutettua menettelyä. Menetellään 5.1.1 i kohdassa esitetyllä tavalla aina suodattamisvaiheeseen asti. Pestään suodatinpaperi, jossa on liukenemattomat jäämät kahteen kertaan kiehuvalla vedellä ja siirretään ne platinaupokkaaseen (4.3). Poltetaan tuhkaksi muhveliuunissa (4.1) alle 550 C° lämpötilassa kunnes kaikki hiilipitoinen aines on hävinnyt kokonaan. Annetaan jäähtyä, lisätään muutama tippa vettä ja sen jälkeen 10 15 ml fluorivetyhappoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi. Lisätään viisi tippaa rikkihappoa (3.5) ja kuumennetaan kunnes valkoinen savu on haihtunut. Lisätään viisi tippaa suolahappoa 6 N (3.2) ja noin 30 ml vettä, kuumennetaan ja suodatetaan liuos 250 ml:n vetoiseen mittapulloon ja täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-pitoisuus on noin 0,5 N). Sen jälkeen jatketaan menettelyä 5.1.3 kohdasta alkaen.