Komission asetus (ETY) N:o 2676/90, annettu 17 päivänä syyskuuta 1990, yhteisön viinianalyysimenetelmistä



Virallinen lehti nro L 272 , 03/10/1990 s. 0001 - 0192

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 34 s. 0005

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 34 s. 0005



KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2676/90, annettu 17 päivänä syyskuuta 1990, yhteisön viinianalyysimenetelmistä EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamis- sopimuksen, ottaa huomioon viinikaupan yhteisestä järjestämisestä 16 päivänä maaliskuuta 1987 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 822/87(1), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1325/90(2), ja erityisesti sen 74 artiklan, sekä katsoo, että asetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklan 1 kohdassa säädetään sellaisten määritysmenetelmien antamisesta, joiden avulla voidaan määrittää mainitun asetuksen 1 artiklassa tarkoitettujen tuotteiden koostumus, ja säännöistä, joiden avulla voidaan tarkastaa, onko näitä tuotteita käsitelty sallittujen enologisten käytäntöjen vastaisesti, jos yhteisö ei ole vielä antanut tiettyjen enologisten käytäntöjen käyttöä luonnehtivien aineiden raja-arvoja ja taulukoita, joiden avulla voidaan verrata määritystuloksia, jäsenvaltiot voivat määrittää nämä rajat, asetuksen (ETY) N:o 822/87 13 artiklan 1 kohdassa säädetään analyyttisesta tutkimuksesta, jolla määritetään vähintään kyseisten tma-laatuviinien mainitun asetuksen liitteessä lueteltujen luonteenomaisten aineiden arvot, kyseisiä tuotteita koskevissa asiakirjoissa olevien tietojen valvonta tekee tarpeelliseksi sellaisten yhdenmukaisten määritysmenetelmien laatimisen, joita käyttämällä varmistetaan tarkkojen ja verrattavissa olevien tulosten saaminen; tämän vuoksi näiden menetelmien on oltava pakollisia kaikissa liiketoimissa ja kaikessa valvonnassa; kaupan rajoitettujen mahdollisuuksien perusteella olisi hyväksyttävä rajoitettu määrä tavanomaisia menetelmiä, joilla voidaan tehdä nopea ja tarpeeksi varma tutkittavien aineiden määritys, mahdollisuuksien mukaan on hyödyllistä omaksua menetelmiä, jotka on hyväksytty yleisesti, kuten vuoden 1954 määritysmenetelmien yhtenäistämistä ja viinien arvioimista koskevan kansainvälisen sopimuksen perusteella kehitetyt menetelmät, jotka kansainvälinen viinivirasto julkaisee teoksessa Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins (kokoelma kansainvälisiä viinien määritysmenetelmiä), komission asetuksella (ETY) N:o 1108/82(3) on annettu viinialalla sovellettavia yhteisön määritysmenetelmiä; tieteen kehityksen vuoksi on osoittautunut tarpeelliseksi korvata tiettyjä menetelmiä sopivammilla menetelmillä, muuttaa menetelmiä ja esittää muita menetelmiä, erityisesti sellaisia, jotka kansainvälinen viinivirasto on jo hyväksynyt; näiden mukautusten suuren lukumäärän ja monimutkaisuuden vuoksi kaikki määritysmenetelmät olisi yhdistettävä uuteen asetukseen ja asetus (ETY) N:o 1108/82 olisi kumottava, asetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklassa tarkoitettuja määritysmenetelmiä käyttämällä saatujen tulosten vertailukelpoisuuden varmistamiseksi olisi viitattava toistettavuuden ja näiden tulosten uusittavuuden osalta kansainvälisen viiniviraston laatimiin määritelmiin, tieteen kehityksen ja virallisten laboratorioiden teknisen välineistön huomioon ottamiseksi ja näiden laboratorioiden työn tehokkuuden ja kannattavuuden parantamiseksi olisi sallittava automatisoitujen määritysmenetelmien käyttö tietyin edellytyksin; on tärkeää täsmentää, että erimielisyyksien esiintyessä automatisoidut menetelmät eivät voi korvata vertailumenetelmiä ja tavanomaisia menetelmiä, taajuusvärähtelyn mittaamiseen perustuvalla automatisoidulla menetelmällä tiheysmittauksessa saatujen tulosten tarkkuus, toistettavuus ja uusittavuus on vähintään sama kuin tämän asetuksen liitteessä olevassa 1 kohdassa esitetyillä menetelmillä saadut tulokset tiheyden ja suhteellisen tiheyden mittauksen osalta; tämän vuoksi on suositeltavaa asetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklan 3 kohdan mukaisesti pitää tätä automatisoitua menetelmää vastaavana kuin tämän asetuksen liitteessä esitettyjä edellä mainittuja menetelmiä, tämän asetuksen liitteen 25 luvun 2.2.3.3.2 kohdassa kuvailtu menettely viinien ja rypälemehujen rikkidioksidin kokonaispitoisuuden määrittämiseksi, kun oletettu kokonaispitoisuus on vähemmän kuin 50 mg/l, johtaa tämän aineen parempaan saantiin kuin asetuksen (ETY) N:o 1108/82 liitteen 13 luvun 13.4 kohdassa kuvailtu menetelmä; tuloksena on määritettyjen tuotteiden korkeampi rik- kidioksidin kokonaispitoisuus, joka voi olla erityisesti tiettyjen rypälemehujen osalta suurempi kuin säädetty enimmäisraja; jo valmiin rypälemehun myyntivaikeuksien välttämiseksi tämän asetuksen voimaan tullessa ja kunnes valmistuksessa siirrytään täydellisempään rikinpoistoon rypälemehusta, jonka käyminen on estetty tai keskeytetty alkoholia lisäämällä, on siirtymäkautena syytä sallia mainitussa asetuksessa kuvaillun menettelyn käyttö edelleen, ja tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat viinin hallintokomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla 1 Tämän asetuksen liitteessä esitetään viinialalla sovellettavat yhteisön määritysmenetelmät, joilla liiketoimissa ja kaikessa valvonnassa - voidaan määrittää asetuksen (ETY) N:o 822/87 1 artiklassa tarkoitettujen tuotteiden koostumus, - voidaan määrittää, onko näitä tuotteita käsitelty sallittujen enologisten käytäntöjen vastaisesti. 2 Vertailumenetelmällä saadut tulokset ovat ensisijaisia sellaisten aineiden osalta, joille vahvistetaan vertailumenetelmät ja tavanomaiset menetelmät. 2 artikla Tätä asetusta sovellettaessa: a) toistettavuus edustaa arvoa, jonka alapuolella on tietyllä todennäköisyydellä kahden yksittäisen, käytetyillä menetelmillä samoissa koeolosuhteissa (sama suorittaja, sama laite, sama laboratorio ja lyhyt aikaväli) saadun tuloksen välisen erotuksen itseisarvo, b) uusittavuus edustaa arvoa, jonka alapuolella on tietyllä todennäköisyydellä kahden yksittäisen eri koeolosuhteissa (eri suorittaja, eri välineistö ja/tai eri laboratorio ja/tai eri aika) saadun tuloksen välisen erotuksen itseisarvo. `Yksittäisellä tuloksella` tarkoitetaan arvoa, joka saadaan käyttämällä yhteen näytteeseen yhden kerran ja täydellisesti standardisoitua koemenetelmää. Jos muuta ei todeta, todennäköisyys on 95 prosenttia. 3 artikla 1 Automatisoidut määritysmenetelmät hyväksytään käytettäväksi laboratorion johtajan vastuulla sillä edellytyksellä, että tulosten tarkkuus, toistettavuus ja uusittavuus vastaavat vähintään liitteessä kuvatuilla määritysmenetelmillä saatuja tuloksia. Jos erimielisyyksiä esiintyy, liitteessä kuvattuja menetelmiä ei voi korvata automatisoiduilla menetelmillä. 2 Taajuusvärähtelyyn perustuvaa automatisoitua menetelmää tiheysmittauksessa pidetään tämän asetuksen liitteessä olevassa 1 kohdassa kuvailtuja menetelmiä vastaavana. 4 artikla Liuoksiin, laimentamiseen tai pesuun tarkoitetulla vedellä tarkoitetaan tislattua tai vähintään vastaavan puhtausasteen omaavaa demineralisoitua vettä. Kaikkien kemikaalien on oltava puhtausasteeltaan analyysilaatua, jollei toisin määrätä. 5 artikla Kumotaan asetus (ETY) N:o 1108/82. Mainitun asetuksen 1 artiklan 4 kohtaa sovelletaan kuitenkin 31 päivään joulukuuta 1990. 6 artikla Tämä asetus tulee voimaan päivänä, jona se julkaistaan Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Sitä sovelletaan 1 päivästä lokakuuta 1990. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 17 päivänä syyskuuta 1990. Komission puolesta Ray MAC SHARRY Komission jäsen (1) EYVL N:o L 84, 27.3.1987, s. 1 (2) EYVL N:o L 132, 23.5.1990, s. 19 (3) EYVL N:o L 133, 14.5.1982, s. 1 LIITE 1 TIHEYS JA SUHTEELLINEN TIHEYS 20 °C:SSA 1 MÄÄRITELMÄT Tiheys on viinin tai rypälemehun tietyn tilavuusyksikön massa 20 °C:ssa. Se ilmoitetaan grammoina millilitrassa ja sen tunnus on ñ20 °C. Suhteellinen tiheys 20 °C:ssa tai tiheys 20 °C/20 °C on desimaalilukuna ilmoitettu tietyn viini- tai rypälemehutilavuuden massan suhde 20 °C:ssa saman vesitilavuuden massaan samassa lämpötilassa. Sen tunnus on d20 °C20 °C. 2 PERIAATE Tiheys ja suhteellinen tiheys 20 °C:ssa mitataan määritettävästä näytteestä: - joko pyknometrillä: vertailumenetelmä, - tai areometrillä tai densimetrillä käyttäen hydrostaattista vaakaa: tavanomaiset menetelmät. Huomautus Hyvin tarkoissa määrityksissä rikkidioksidin vaikutus tiheyteen on korjattava. ñ20 °C = ñ'20 °C - 0,0006 × S jossa >TAULUKON PAIKKA> 3 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN Jos viini tai rypälemehu sisältää huomattavia määriä hiilidioksidia, suurin osa siitä voidaan poistaa ravistelemalla 250 ml viiniä 1 000 ml mittapullossa, tai suodattamalla alipaineessa läpi putken, jossa on 2 g vanua. 4 VERTAILUMENETELMÄ 4.1 Välineistö Tavalliset laboratoriovälineet, ja erityisesti 4.1.1 Vetoisuudeltaan noin 100 ml:n pyrex-lasinen pyknometri(1), jossa on irrallinen hioksellinen lämpömittari, jonka 1/10 asteen välein oleva asteikko on välillä 10 30 °C. Tämän lämpömittarin on oltava hyväksytty (kuvio 1). >VIITTAUS KAAVIOON> Pyknometrissä on 25 mm:n pituinen, sisähalkaisijaltaan enintään 1 mm oleva sivuputki, joka päättyy hiokseen. Tähän sivuputkeen voidaan liittää "keräyspullo", joka koostuu putkesta, jonka toisessa päässä on kartiohios ja toisessa päässä kapea poistoputki. Tätä käytetään paisuntasäiliönä. Laitteen molempien hiosten on oltava hyvin huolellisesti tehtyjä. 4.1.2 Ulkotilavuudeltaan pyknometrin kokoinen taara (vähintään 1 ml:n tarkkuudella), jonka massa on sama kuin nesteellä, jonka tiheys on 1,01 (2,0 % natriumkloridiliuos (m/v)), täytetyn pyknometrin massa. Lämpöeristetty säiliö, joka mukautuu täydellisesti pyknometrin muotoon. 4.1.3 Tasavarsivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 300 g ja tarkkuus 1/10 mg tai yksikuppivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 200 g ja tarkkuus 1/10 mg. 4.2 Pyknometrin kalibrointi Pyknometrin kalibrointi käsittää seuraavien ominaisuuksien määrittämisen: - tyhjän pyknometrin taara, - pyknometrin tilavuus 20 °C:ssa, - vedellä täytetyn pyknometrin massa 20 °C:ssa. 4.2.1 Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessä Taara asetetaan tasavarsivaa'an vasempaan vaakakuppiin ja puhdas kuiva pyknometri, joka on varustettu paisuntasäiliöllä, oikeaan vaakakuppiin. Lisätään punnuksia siihen vaakakuppiin, jossa pyknometri on, ja otetaan paino, kun tasapaino on saavutettu: se on p grammaa. Pyknometri täytetään huolellisesti huoneenlämpöisellä tislatulla vedellä ja lämpömittari asetetaan paikoilleen: pyknometri kuivataan huolellisesti ja se asetetaan lämpöeristettyyn säiliöön. Sekoitetaan kääntelemällä säiliötä, kunnes lämpömittarin osoittama lämpötila ei muutu. Säädetään taso tarkalleen sivuputken reunaan. Kuivataan sivuputki ja asetetaan paisuntasäiliö paikoilleen: luetaan lämpötila t °C:ssa huolellisesti ja korjataan mahdollinen lämpöasteikon epätarkkuus. Punnitaan vedellä täytetty pyknometri ja luetaan paino p' grammoina, kun tasapaino saavutetaan. Laskentakaavat(2): Tyhjän pyknometrin taaraus: tyhjän pyknometrin taara = p + m, jossa >TAULUKON PAIKKA> Tilavuus 20 °C:ssa: V20 °C = (p + m - p') × F1, jossa F1 = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin. V20 °C on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella. Veden massa 20 °C:ssa: M20 °C = V20 °C × 0,998203, jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa. 4.2.2 Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessä Määritetään: - puhtaan ja kuivan pyknometrin massa: P. - vedellä täytetyn pyknometrin massa P1 lämpötilassa t °C 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. - taaran massa: T0. Laskentakaavat(3)Tyhjän pyknometrin taaraus: tyhjän pyknometrin taara: P m, jossa >TAULUKON PAIKKA> Tilavuus 20 °C:ssa: V20 °C = [P1 (P m)] × F1, jossa F1 = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin. Tilavuus 20 °C:ssa on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella. Veden massa 20 °C:ssa: M20 °C = V20 °C. 0,998203, jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa. 4.3 Mittausmenetelmä(4)4.3.1 Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessä Täytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (3) ja menetellään 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. p" on se paino grammoina, joka vaaditaan tasapainon saavuttamiseksi lämpötilassa t °C. Pyknometrin sisältämän nesteen massa = p + m p". Näennäinen tiheys t °C:ssa: ñt °C = >NUM>p + m p"/ >DEN>V20 °C Tiheys 20 °C:ssa lasketaan jäljempänä olevan korjaustaulukon avulla tutkitun nesteen tyyppi huomioon ottaen: kuiva viini (taulukko II), luonnollinen tai tiivistetty rypälemehu (taulukko III), makea viini (taulukko IV). Viinin tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203. 4.3.2 Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessä(5)Taara punnitaan. Sen massa on T. Lasketaan dT = T1 T0. Tyhjän pyknometrin massa mittaushetkellä = P m + dT. Täytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (3) ja menetellään 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. P2 on sen massa t °C:ssa. Pyknometrin sisältämän nesteen massa t °C:ssa = P2 (P m + dT). Näennäinen tiheys t °C:ssa: ñt °C = >NUM>P2 (P m + dT)/ >DEN>V20 °C Lasketaan tutkitun nesteen tiheys 20 °C:ssa (kuiva viini, luonnollinen tai tiivistetty rypälemehu, makea viini) 4.3.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203. 4.3.3 Tiheysmittausten toistettavuus kuivat ja puolimakeat viinit: r = 0,00010 makeat viinit: r = 0,00018. 4.3.4 Tiheysmittausten uusittavuus kuivat ja puolimakeat viinit: R = 0,00037 makeat viinit: R = 0,00045. 5 TAVANOMAISET MENETELMÄT 5.1 Areometria 5.1.1 Välineistö 5.1.1.1 Areometri Areometrien mittojen ja asteikoinnin on oltava ISO:n vaatimusten mukaisia. Niissä on oltava sylinterimäinen paksunnos, poikkileikkaukseltaan pyöreä halkaisijaltaan vähintään 3 mm oleva varsi. Kuivien viinien osalta niiden asteikon on oltava jaettu mittausalueella 0,983 1,003 0,0010 ja 0,0002 millimetrin välein. Jokaista tuhannesosaa osoittavan ja sitä seuraavan vastaavan merkkiviivan välin on oltava vähintään 5 mm. Viinien, joista alkoholi on poistettu, makeiden viinien ja rypälemehun tiheyden mittauksessa käytetään viittä areometria, joiden asteikko on jaettu 1,000 1,030; 1,030 1060; 1,060 1,090; 1,090 1,120; 1,120 1,150. Tiheyden mittaamisessa 20 °C:ssa näiden laitteiden asteikot on jaettava vähintään 0,0010 ja 0,0005 välein siten, että jokaisen tuhannesosaa osoittavan ja sitä seuraavan vastaavan merkkiviivan väli on vähintään 3 mm. Nämä areometrit on asteikoitava siten, että niitä luetaan "meniskin korkeimmasta kohdasta". Asteikossa tai runkoon suljetussa paperiliuskassa on oltava maininta tiheyden 20 °C:ssa tai suhteellisen tiheyden 20 °C:ssa asteikoinnista tai lukemisesta meniskin korkeimmasta kohdasta. Näiden laitteiden on oltava viranomaisten tarkastamia. 5.1.1.2 Tarkastettu lämpömittari, jonka asteikko on jaettu vähintään 0,5 °C:n välein. 5.1.1.3 Sisähalkaisijaltaan 36 mm ja korkeudeltaan 320 mm oleva mittalasi, joka tuetaan pystyasentoon statiivilla. 5.1.2 Suoritus 5.1.2.1 Mittausmenetelmä Mitataan 5.1.1.3 kohdassa tarkoitettuun mittalasiin 250 ml määritystä varten valmistettua näytettä (3) ja sijoitetaan areometri ja lämpömittari nesteeseen. Sekoitetaan lämpötilan tasaamiseksi ja luetaan lämpötila minuutti sekoittamisen jälkeen. Poistetaan lämpömittari ja luetaan areometristä näennäinen tiheys t °C:ssa areometristä minuuttia myöhemmin. Korjataan lämpötilan vaikutus näennäiseen tiheyteen t °C:ssa käyttäen taulukoita, joita on laadittu kuiville viineille (taulukko V), rypälemehuille (taulukko VI) ja sokeria sisältäville viineille (taulukko VII). Tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203. 5.2 Densimetria hydrostaattista vaakaa käyttäen 5.2.1 Välineistö Hydrostaattinen vaaka. Hydrostaattinen vaaka, jonka enimmäiskuormitus on vähintään 100 g ja tarkkuus 0,1 mg. Molempien vaakakuppien alapuolelle ripustetaan Pyrex-lasiset uppokappaleet, joiden tilavuus on vähintään 20 ml. Nämä uppokappaleet ripustetaan paksuudeltaan enintään 0,1 mm olevalla langalla. Oikeanpuoleisen vaakakupin alle ripustettu uppokappale on voitava sijoittaa mittalasiin, jossa on tason osoittava merkki. Tämän mittalasin sisähalkaisijan on oltava vähintään 6 mm suurempi kuin uppokappaleen halkaisijan. Uppokappaleen on mahduttava kokonaan mittalasissa olevan merkin alapuolelle ja mitattavan nesteen pinnan saa rikkoa ainoastaan ripustuslanka. Mittalasissa olevan nesteen lämpötila mitataan lämpömittarilla, jonka asteikko on jaettu 0,2 °C:n välein. Voidaan käyttää myös yksikuppista hydrostaattista vakaa. 5.2.2 Suoritus 5.2.2.1 Hydrostaattisen vaa'ankalibrointi Kun molemmat uppokappaleet ovat ilmassa, vaaka tasapainotetaan sijoittamalla oikeaan vaakakuppiin punnuksia joiden massa on p. Mittalasi täytetään merkkiin asti puhtaalla vedellä, sekoitetaan, annetaan seistä 2 3 minuuttia ja luetaan lämpötila t °C. Tasapainotetaan vaaka uudelleen oikeaan vaakakuppiin sijoitettujen massojen avulla. Tämä merkitään p:llä. Uppokappaleen tilavuus 20 °C:ssa: V20 °C = (ñ' ñ)(F + 0,0012) jossa F = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin. p ja V20 °C ovat uppokappaleen ominaisuuksia. 5.2.2.2 M i t t a u s m e n e t e l m ä Upotetaan oikea uppokappale mittalasiin joka on täytetty merkkiin viinillä (tai rypälemehulla). Luetaan viinin (tai rypälemehun) lämpötila t °C: p" uudelleen tasapainotetaessa tarvittava massa pt °C näennäinen tiheys: ñt °C = >NUM>(p" p)/ >DEN>V + 0,0012 Tämä tiheys korjataan 20 °C:seen käyttäen taulukoita II, III tai IV. 6 ESIMERKKI TIHEYDEN 20 °C JA TIHEYDEN 20 °C/20 °C LASKEMISEKSI (VERTAILUMENETELMÄ) 6.1 Pyknometria tasavarsivaakaa käytettäessä 6.1.1 Pyknometrin parametrit 1 Puhtaan ja kuivan pyknometrin punnitseminen: >TAULUKON PAIKKA> 2 Täynnä vettä olevan pyknometrin punnitseminen t °C:ssa: >TAULUKON PAIKKA> 3 Pyknometrin sisältämän ilman massan laskeminen: >TAULUKON PAIKKA> 4 Huomioon otettavat parametrit: Tyhjän pyknometrin taara p + m: p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 g Tilavuus 20 °C:ssa = (p + m p') × Ft °C F20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698 1,2396) × 1,001900 V20 °C = 104,0275 ml Veden massa 20 °C:ssa = V20 °C × 0,998203 M20 °C = 103,8405 g 6.1.2 Kuivan viinin tiheyden 20 °C ja tiheyden 20 °C/20 °C laskeminen ñ" = 1,2622 17,80 °C:ssa ñ17,80° C = >NUM>105,0698 / >DEN>1,2622;104,0275 ñ17,80 °C = 0,99788 g/ml Taulukon II avulla voidaan laskea ñ20 °C ñt °C:sta käyttäen suhdetta: ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/ >DEN>1 000 Kun t = 17,80 °C ja alkoholipitoisuus 11 til-%, c = 0,54. ñ20 °C = 0,99788 >NUM>0,54/ >DEN>1 000 ñ20 °C = 0,99734 g/ml d20 °C20 °C = >NUM>0,99734/ >DEN>0,998203 = 0,99913 6.2 Pyknometria yksikuppivaakaa käytettäessä 6.2.1 Pyknometrin parametrit 1 Puhtaan ja kuivan pyknometrin punnitseminen: P = 67,7913 g 2 Vedellä täytetyn pyknometrin punnitseminen t °C:ssa: P1 = 169,2715 g 21,65 °C:ssa 3 Pyknometrin sisältämän ilman massan laskeminen: m = 0,0012 (P1 P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g 4 Huomioon otettavat parametrit: Tyhjän pyknometrin taara P m: P m = 67,7913 - 0,1218 P m = 67,6695 g Tilavuus 20 °C:ssa = [P1 (P m)] Ft °C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715 67,6695) × 1,002140 V20 °C = 101,8194 ml Veden massa 20 °C:ssa = V20 °C × 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Taaran massa: T0 T0 = 171,9160 g 6.2.2 Kuivan viinin tiheyden 20 °C ja tiheyden 20 °C/20 °C laskeminen T1 = 171,9178 g dT = 171,9178 171,9160 = 0,0018 g P m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 18 °C:ssa ñ18 °C = >NUM>169,2799 / >DEN>67,6713;101,8194 ñ18 °C = 0,99793 g/ml Taulukon II avulla voidaan laskea ñ20 °C ñt °C:sta käyttäen suhdetta: ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/ >DEN>1 000 Kun t = 18 °C ja alkoholipitoisuus 11 til-%, c = 0,49. ñ20 °C = 0,99793 >NUM>0,49/ >DEN>1 000 ñ20 °C = 0,99744 g/ml d20 °C20 °C = >NUM>0,99744/ >DEN>0,998203 = 0,99923 TAULUKKO I F kertoimet, joilla pyrex-lasisen pykonometrin t°C:ssa sisältämän veden massa 9 on kerrottava, pyknometrin tilavuuden laskemiseksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO II Lämpötilan korjaukset c kuivien viinien ja kuivien viinien, joista alkoholi on poistettu, pyrex-laisella pyknometrillä t°C:ssa mitatum tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO III Lämpötilan korjaukset c lunnollisen ja tiivistetyn rypälemehun pyrex-lasisella pyknometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO IV Lämpötilan korjaukset c vähintään 13 till-% jäännössokeria sisältävien viinien pyrex-lasisella pyknometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa > VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO V Lämpötilan korjaukset c luonnollisen ja tiivistetyn rypälemehun tavallisesta lasista valmistetulla pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO VI Lämpötilan korjaukset c luonnollisen ja tiivistetyn rypälemehun tavallisesta lasista valmistetulla pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> TAULUKKO VII Lämpötilan korjaukset c vähintään 13 till-% jäännössokeria sisältävien viinien tavallisesta lasista valmistetula pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> 2 RYPÄLEMEHUN, TIIVISTETYN RYPÄLEMEHUN JA PUHDISTETUN TIIVISTETYN RYPÄLEMEHUN SOKERIPITOISUUDEN ARVIOINTI REFRAKTOMETRILLÄ 1 PERIAATE Taitekerroin 20 °C:ssa, esitettynä lukuarvona tai sakkaroosin massaprosentteina, annetaan vastaavissa taulukoissa, joista saadaan rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus g/l ja g/kg. 2 VÄLINEISTÖ 2.1 Abbe-refraktometri Käytetyssä refraktometrissä on oltava asteikko, josta näkyy: - joko sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella, - tai taitekertoimet neljällä desimaalilla. Refraktometrissä on oltava lämpömittari, jonka asteikko ulottuu mittausalueelle + 15 25 °C, ja kiertovesijärjestelmä, joka mahdollistaa mittausten tekemisen 20 °C ± 5 °C lämpötilassa. Tämän laitteen käyttöohjeita on noudatettava tarkasti, erityisesti kalibroinnin ja valonlähteen osalta. 3 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN 3.1 Rypälemehut ja tiivistetyt rypälemehut Rypälemehu suodatetaan tarvittaessa kuivan, neljään osaan taitetun harson läpi, ensimmäiset suodostipat hylätään ja määritys tehdään suodatetusta tuotteesta. 3.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut Konsentraation mukaan käytetään joko puhdistettua tiivistettyä rypälemehua tai liuosta, joka saadaan laimentamalla 200 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua 500 g:ksi vedellä; punnitseminen on tehtävä tarkasti. 4 SUORITUS Saatetaan näytteen lämpötila lähelle 20 °C:ta. Asetetaan pieni näyte refraktometrin alemmalle prismalle ja tarkastetaan, että prismojen ollessa tiukasti toisiaan vasten näyte peittää lasipinnan kokonaan. Mittaus tehdään käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti. Luetaan sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella tai taitekerroin neljällä desimaalilla. Samasta valmistetusta näytteestä tehdään vähintään 2 määritystä. Kirjataan lämpötila t °C. 5 LASKEMINEN 5.1 Lämpötilan korjaus 5.1.1 Laitteet, joissa asteikko on sakkaroosin massaprosentteja: lämpötilan korjaamisessa käytetään taulukkoa I. 5.1.2 Laitteet, joissa asteikko on taitekerroin: etsitään t °C:ssa mitattu taitekerroin taulukosta II, josta saadaan (sarake 1) sakkaroosin massaprosentti t °C:ssa. Tämä arvo korjataan lämpötilan suhteen ja ilmoitetaan 20 °C:ssa taulukon I avulla. 5.2 Rypälemehun ja tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus Etsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhdellä desimaalilla. 5.3 Puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus Etsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhdellä desimaalilla. Jos mittaus tehdään laimennetusta puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta, tulos kerrotaan laimennuskertoimella. 5.4 Rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun taitekerroin Etsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan taitekerroin 20 °C:ssa. Tämä taitekerroin esitetään neljällä desimaalilla. >TAULUKON PAIKKA> Lämpötila ei saa poiketa 20 °C:sta yli ± 5 °C:ta. TAULUKKO II Taulukossa esistetään rypälemehun ja tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus (6)grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa, joka on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprossentti 20 °C:ssa tai taitekerroin 20 °C:ssa. Myös tiheys 20 °C:ssa on esitetty. >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> TAULUKKO III Taulukossa esitetään puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus (7) grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa, joka on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa tai taitekerroin 20 °C:ssa. Myös tiheys 20 °C:ssa on esitetty. >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> 3 ALKOHOLIPITOISUUS TILAVUUSPROSENTTEINA 1 MÄÄRITELMÄ Alkoholipitoisuus tilavuusprosentteina on samansuuruinen kuin etanolin määrä litroina 100 litrassa viiniä, kun molemmat mitataan 20 °C:ssa. Sen tunnus on "til-%". Huomautus: Etanolin homologit sekä estereihin sitoutunut etanoli ja etanolin homologit kuuluvat tisleen alkoholipitoisuuteen. 2 PERIAATE 2.1 Kalsiumhydroksidiliuoksella emäksiseksi tehdyn viinin tislaus. Alkoholipitoisuuden määrittäminen tisleestä. 2.2 Vertailumenetelmä: tisleen tiheyden määrittäminen pyknometrillä. 2.3 Tavanomaiset menetelmät 2.3.1 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen areometrisesti 2.3.2 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen densimetrisesti hydrostaattisella vaa'alla 2.3.3 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen refraktometrisesti Huomautus: Alkoholipitoisuus saadaan tisleen tiheydestä käyttäen tämän luvun liitteessä II olevia taulukoita I, II ja III. Ne on laskettu Lakisääteisen mittaustoiminnan kansainvälisen järjestön vuonna 1972 julkaisemassa suosituksessa N:o 22 esitetyn kansainvälisen alkoholipitoisuustaulukon perusteella ja OIV (Yleiskokous 1974) on hyväksynyt taulukon. Taulukossa I esitetään yleinen vesi-etanoliseosten tilavuusprosentteina annetun alkoholipitoisuuden ja tiheyden yhteys eri lämpötiloissa. 3 TISLEEN VALMISTAMINEN 3.1 Välineistö 3.1.1 Tislauslaitteisto, johon kuuluu: - pyöreäpohjainen, hioksellinen tislauskolvi, jonka vetoisuus on 1 litra, - noin 20 cm korkea tislauskolonni tai muu laite roiskumisen estämiseksi, - lämmönlähde: pyrolyysi on estettävä sopivalla laitteella, - jäähdytin, joka päättyy ulosmenoputkeen, joka ohjaa tisleen muutaman millilitran vettä sisältävään mittapulloon. 3.1.2 Vesihöyrytislauslaitteisto, johon kuuluu: 1 vesihöyrykehitin, 2 tislauskolvi, jossa on putki vesihöyryn johtamiseksi, 3 tislauskolonni, 4 jäähdytin. Voidaan käyttää mitä tahansa tislaus- tai vesihöyrytislauslaitteistoa sillä edellytyksellä, että se läpäisee seuraavan kokeen: tislataan 5 kertaa peräkkäin alkoholipitoisuudeltaan 10 til-% oleva vesi-etanoliseos.Viidennen tislauskerran jälkeen tisleen alkoholipitoisuuden on oltava vähintään 9,9 til-%, toisin sanoen tislauksen aikana alkoholipitoisuus ei saa laskea yli 0,02 til-%:lla. 3.2 Reagenssit 3.2.1 2 M kalsiumhydroksidisuspensio Kaadetaan varovasti 1 l kuumaa vettä (60 70 °C) 120 g:n sammuttamattoman kalkin (CaO) päälle. 3.3 Näytteen valmistaminen Nuorista viineistä ja kuohuviineistä poistetaan aluksi suurin osa niiden sisältämästä hiilidioksidista ravistelemalla 250 300 ml viiniä 500 ml mittapullossa. 3.4 Suoritus Mittapulloon mitataan 200 ml viiniä. Viinin lämpötila kirjataan. Näyte kaadetaan tislaus- tai vesihöyrytislauslaitteiston kolviin. Mittapullo huuhdellaan neljä kertaa 5 ml vettä ja tämä vesi lisätään tislauskolviin. Lisätään 10 ml kalsiumhydroksidia (3.2.1) ja muutama palanen inerttiä huokoista ainetta (hohkakiveä). Tisle kerätään 200 ml:n mittapulloon, jota käytettiin viinin mittaamiseen. Tavallisessa tislauksessa tislettä otetaan noin 3/4 alkuperäisestä tilavuudesta ja vesihöyrytislauksessa 198 199 ml. Täytetään 200 ml:ksi tislatulla vedellä lämpötilassa, joka ei poikkea alkuperäisestä lämpötilasta yli ± 2 °C. Sekoitetaan varovasti pyöreällä liikkeellä. Huomautus: Jos viini sisältää erityisen paljon ammoniumioneja, tisle on mahdollisesti tislattava uudelleen edellä kuvatuissa koeolosuhteissa siten, että kalsiumhydroksidisuspensio korvataan 1 ml:lla 10 %:n (v/v) rikkihappoa. 4 VERTAILUMENETELMÄ Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen pyknometrillä. 4.1 Välineistö 4.1.1 Käytetään "Tiheys"-luvussa kuvattua kalibroitua pyknometriä. 4.2 Suoritus Määritetään tisleen (3.4) näennäinen tiheys t °C:ssa 1 luvussa "Tiheys" olevan 4.3.1 ja 4.3.2 kohdan mukaisesti. Tämä tiheys on ñt. 4.3 Tulosten ilmoittaminen 4.3.1 Laskentamenetelmä Alkoholipitoisuus 20 °C:ssa löytyy taulukosta I. Taulukon vaakasuoralta riviltä, joka vastaa lämpötilaa T (ilmoitettu kokonaislukuna) välittömästi t °C:n alapuolella, etsitään pienin mahdollinen ñt:n ylittävä tiheys. Tämän tiheyden alapuolella taulukossa annettua erotusta käytetään tiheyden ñ laskemisessa lämpötilassa T. Lämpötila T riviltä etsitään pienin mahdollinen ñ:n ylittävä tiheys ñ' ja lasketaan näiden kahden tiheyden ñ ja ñ' erotus. Tämä erotus jaetaan tiheyden ñ' oikealla puolella ilmoitetulla erotuksella. Osamäärästä saadaan alkoholipitoisuuden desimaaliosa ja tämän pitoisuuden kokonaislukuosa annetaan sen sarakkeen yläosassa, jossa tiheys ñ' on. Alkoholipitoisuuden laskemisesta annetaan esimerkki tämän luvun liitteessä I. Huomautus: Tämä lämpötilakorjaus on sisällytetty tietokoneohjelmaan ja se voidaan mahdollisesti tehdä automaattisesti. 4.3.2 Toistettavuus (r) r = 0,10 til-% 4.3.3 Uusittavuus (R) R = 0,19 til-% 5 TAVANOMAISET MENETELMÄT 5.1 Areometria 5.1.1 Välineistö 5.1.1.1 A l k o h o l o m e t r i Alkoholometrin on täytettävä OIML:n kansainvälisessä suosituksessa N:o 44 "Alkoholometrit ja areometrit" määriteltyihin luokkiin I tai II kuuluvien laitteiden erityisvaatimukset. 5.1.1.2 Lämpömittari, jonka asteikko on asteen ja 0,1 °C:n välein alueella 0 40 °C ja jonka mittaustarkkuus on tarkastusten mukaan 1/20 astetta. 5.1.1.3 Sisähalkaisijaltaan 36 mm ja korkeudeltaan 320 mm oleva mittalasi, joka on tuettu pystyasentoon statiivilla. 5.1.2 Suoritus Kaadetaan tisle (3.4) mittalasiin. Varmistetaan, että mittalasi on pystysuorassa asennossa. Ravistellaan mittalasia lämpömittarin, alkoholometrin ja tisleen lämpötilan tasaamiseksi, ja luetaan lämpötila minuutti tämän jälkeen. Poistetaan lämpömittari ja annetaan seistä 1 minuutin ajan. Tämän jälkeen luetaan näennäinen alkoholipitoisuus. Lukema otetaan vähintään kolme kertaa käyttäen apuna suurennuslasia. Lämpötilan vaikutus t °C:ssa mitattuun näennäiseen alkoholipitoisuuteen korjataan taulukon II avulla. Nesteen lämpötila saa poiketa vain hieman ympäristön lämpötilasta (korkeintaan 5 °C). 5.2 Densimetria hydrostaattista vaakaa käyttäen 5.2.1 Välineistö Käytetään hydrostaattista vaakaa "Tiheys"-luvussa kuvatulla tavalla. 5.2.2 Suoritus Määritetään tisleen näennäinen tiheys t °C:ssa I luvussa "Tiheys" olevan 5.2.2 kohdan mukaisesti. 5.2.3 Tulosten ilmoittaminen Alkoholipitoisuus 20 °C:ssa saadaan 4.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla taulukkoa I käyttäen, jos uppokappale on pyrex-lasinen, tai taulukkoa III käyttäen, jos uppokappale on tavallisesta lasista. 5.3 Refraktometria 5.3.1 Välineistö 5.3.1.1 Refraktometri, jolla voidaan mitata alueella 1,330-1,346 olevat taitekertoimet. Laitetyypin mukaan mittaus voidaan tehdä: - joko 20 °C:ssa sopivalla välineellä, - tai ympäristön lämpötilassa t °C, välineellä, jossa on lämpömittari, jolla lämpötila voidaan määrittää vähintään 0,05 °C:n tarkkuudella. Lämpötilan korjaustaulukko toimitetaan laitteen mukana. 5.3.2 Suoritus Taitekertoimen mittaus tehdään viinitisleestä (3.4) seuraten käytettyä laitetyyppiä koskevia ohjeita. 5.3.3 Tulosten ilmoittaminen Taulukosta IV saadaan taitekerrointa vastaava alkoholipitoisuus 20 °C:ssa. Huomautus: Taulukossa IV annetaan puhtaiden vesi-etanoliseosten ja viinitisleen taitekerrointen välinen vastaavuus. Taulukossa otetaan huomioon viinitisleen epäpuhtaudet (pääasiassa korkeammat alkoholit). Metanoli vähentää taitekerrointa ja tämän vuoksi myös alkoholipitoisuutta. 6 ESIMERKKI VIININ ALKOHOLIPITOISUUDEN LASKEMISESTA 6.1 Pyknometria tasavarsivaakaa käytettäessä 6.1.1 Pyknometrin parametrit on määritetty ja laskettu I luvussa "Tiheys ja suhteellinen tiheys" (6.1.1 kohta) kuvatulla tavalla. 6.1.2 Tisleellä täytetyn pyknometrin punnitseminen >TAULUKON PAIKKA> p + m p" = tisleen massa t °C:ssa 105,0698 2,8074 = 102,2624 g Näennäistiheys t °C:ssa: >TAULUKON PAIKKA> 6.1.3 Alkoholipitoisuuden laskeminen >TAULUKON PAIKKA> 6.2 Pyknometria yksikuppista vaakaa käytettäessä 6.2.1 Pyknometrin parametrit on määritetty ja laskettu I luvun "Tiheys ja suhteellinen tiheys" 6.2.1 kohdassa. 6.2.2 Tisleellä täytetyn pyknometrin punnitseminen >TAULUKON PAIKKA> 6.2.3 Alkoholipitoisuuden laskeminen >TAULUKON PAIKKA> YHTÄLÖ ALKOHOLIPITOISUUSTAULUKOIDEN LASKEMISEKSI ETYYLIALKOHOLI-VESISEOKSILLE Etyylialkoholi-vesiseoksen tiheys "ñ" kilogrammoina kuutiometrissä (kg/m3) lämpötilassa t °C saadaan lasketuksi seuraavasta yhtälöstä, joka on - massaprosenttina annetun alkoholipitoisuuden ñ suhteellisen osuuden funktio, jolloin ñ on desimaaliluku(8), - Celsiusasteina (IPTS -68) ilmoitetun lämpötilan t funktio, - ja jonka numeeriset kertoimet ilmoitetaan jäljempänä. Yhtälö pätee lämpötila-alueella 20 - + 40 °C. ñ = A1 + Ók = 212 Ak pk - 1 + Ók = 16 Bk(t - 20 °C)k + Ói = 1n Ók = 1m Ci,k pk(t - 20 °C)in = 5 m1 = 11 m2 = 10 m3 = 9 m4 = 4 m5 = 2 >TAULUKON PAIKKA> TAULUKKO I >KAAVION ALKU> KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSA Taulukko vesi-alkoholiseoksen näennäisille tiheyksille - pyrex-lasinen pyknometri Tiheys t °C:ssa, ilman noste korjattu >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> TAULUKKO II >KAAVION ALKU> KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSA Taulukko lämpötilan vaikutuksen näennäiseen alkoholipitoisuuteen korjaamiseksi Näennäiseen alkoholipitoisuuteen t °C:ssa (tavallisesta lasista valmistettu alkoholometri) lisätään tai siitä vähennetään annettu korjausluku >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> TAULUKKO III >KAAVION ALKU> KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSA Taulukko vesi-alkoholiseosten näennäisille tiheyksile - tavallisesta lasista valmistetut laitteet Tiheys t °C:ssa, ilman noste korjattu >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> TAULUKKO IV >KAAVION ALKU> Taulukko puhtaiden vesi-alkoholiseosten ja tisleiden taitekerrointoimille 20 °C:ssa ja vastaaville alkoholipitoisuuksille 20 °C:ssa >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> 4. KOKONAISUUTOS Kokonaiskuiva-aine 1 MÄÄRITELMÄ Kokonaisuutos tai kokonaiskuiva-aine sisältää kaikki aineet, jotka eivät haihdu määritellyissä fysikaalisissa olosuhteissa. Näiden fysikaalisten olosuhteiden on oltava sellaiset, että uutoksen muodostavat aineet muuttuvat mahdollisimman vähän. Sokeriton uutos on kokonaisuutoksen ja kokonaissokeripitoisuuden välinen erotus. Vähennetty uutos on kokonaisuutoksen ja 1 g/l ylittävän kokonaissokeripitoisuuden, 1 g/l ylittävän kaliumsulfaattipitoisuuden, mahdollisen mannitolin sekä muiden viiniin mahdollisesti lisättyjen kemikaalien välinen erotus. Jäännösuutos on sokeriton uutos, josta on vähennetty kiinteät hapot, ilmoitettuna viinihappona. Uutos ilmoitetaan grammoina litrassa ja se on määritettävä 0,5 g:n tarkkuudella. 2 PERIAATE Ainoa menetelmä: densimetrillä mittaaminen. Kokonaisuutos lasketaan epäsuorasti rypälemehun tiheydestä ja alkoholittoman viinin tiheydestä. Uutos ilmoitetaan sakkaroosin määränä, joka veteen liuotettuna ja yhdeksi litraksi täytettynä antaa saman tiheyden kuin rypälemehu tai alkoholiton viini. Tämä määrä saadaan taulukosta I. 3 SUORITUS "Alkoholittoman viinin" suhteellinen tiheys d2020 (dr) saadaan yhtälöstä: >TAULUKON PAIKKA> dr voidaan myös laskea viinin tiheydestä ñv ja vesi-etanoliseoksen tiheydestä ña 20 °C:ssa yhtälöllä: dr = 1,0018(ñv ña) + 1,000, jossa kerroin 1,0018 lähenee käytännössä 1:tä, kun ñv on alle 1,05, mikä on yleisin tapaus. 4 TULOSTEN ILMOITTAMINEN Käytetään taulukossa I olevia alkoholittoman viinin tiheyttä dr2020 ja rypälemehun tiheyttä d2020 kokonaisuutoksen laskemiseksi grammoina litrassa. Kokonaisuutos ilmoitetaan grammoina litrassa yhdellä desimaalilla. TAULUKKO I >KAAVION ALKU> Kokonaisuutoksen laskemiseksi (grammoina litrassa) >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> 5 PELKISTÄVÄT SOKERIT 1 MÄÄRITELMÄ Pelkistävillä sokereilla tarkoitetaan kaikkia sokereita, jotka osoittavat ketonista tai aldehydistä toimintaa ja joiden määritys perustuu niiden kykyyn pelkistää kuparisuolaa emäksisessä liuoksessa. 2 PERIAATE 2.1 Kirkastaminen 2.1.1 Vertailumenetelmä: neutraloitu ja alkoholiton viini valutetaan asetaattimuodossa anioninvaihtokolonnin läpi, jossa anionit vaihtuvat asetaatti-ioneihin, ja tämän jälkeen se kirkastetaan neutraalilla lyijyasetaatilla. 2.1.2 Tavanomainen menetelmä: viini käsitellään toisella seuraavista reagensseista: 2.1.2.1 Neutraali lyijyasetaatti 2.1.2.2 Sinkki(II)heksasyanoferraatti 2.2 Määritys 2.2.1 Ainoa menetelmä: tietyn määrän emäksistä kuparisuolaliuosta annetaan reagoida kirkastetun viinin tai rypälemehun kanssa ja määritetään kupari-ionien ylijäämä jodometrisesti. 3 KIRKASTAMINEN Määritettävän sokeripitoisuuden liuoksessa on oltava välillä 0,5 5 g/l. Kuivaa viiniä ei saa laimentaa kirkastamisen aikana; makea viini on laimennettava kirkastamisen aikana sokeripitoisuuden saattamiseksi mainittujen raja-arvojen välille seuraavan taulukon mukaisesti. >TAULUKON PAIKKA> 3.1 Vertailumenetelmä 3.1.1 Reagenssit 3.1.1.1 Kloorivetyhappoliuos (HCl), 1 M 3.1.1.2 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 1 M 3.1.1.3 Etikkahappoliuos (CH3COOH), 4 M 3.1.1.4 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 2 M 3.1.1.5 Anioninvaihtohartsi [Dowex 3 (20 50 mesh) tai vastaava hartsi]. Anioninvaihtokolonnin valmistaminen. Asetetaan byretin pohjalle pieni lasivillatuppo ja 15 ml anioninvaihtohartsia (3.1.1.5). Ennen käyttöönottoa hartsi on regeneroitava täydellisesti käsittelemällä se kaksi kertaa peräkkäin 1 M kloorivetyhappo- (3.1.1.1) ja natriumhydroksidiliuoksilla (3.1.1.2). Kun hartsi on huuhdottu 50 ml:lla tislattua vettä, se siirretään dekantterilasiin, lisätään 50 ml 1 M etikkahappoliuosta (3.1.1.3) ja sekoitetaan 5 minuutin ajan. Täytetään byretti uudelleen ja valutetaan 100 ml 4 M etikkahappoliuosta (3.1.1.3) kolonnin läpi. (On suositeltavaa pitää varastossa hartsia 4 M etikkahappoliuoksella täytetyssä pullossa.) Pestään kolonnia tislatulla vedellä, kunnes eluaatti on muuttunut neutraaliksi. Hartsin regenerointi. Valutetaan 150 ml 2 M natriumhydroksidiliuosta hartsin läpi happojen ja useimpien hartsiin tarttuneiden väriaineiden poistamiseksi. Huuhdotaan 100 ml:lla vettä, kaadetaan 100 ml 4 M etikkahappoliuosta hartsin läpi. Pestään kolonnia, kunnes eluaatti on neutraali. 3.1.1.6 Neutraali lyijyasetaattiliuos (lähes kyllästetty): Neutraali lyijyasetaatti Pb (CH3COO)2 3 H2O 250 g Täytetään 500 ml:ksi hyvin kuumalla vedellä Ravistellaan, kunnes lyijyasetaatti liukenee. 3.1.1.7 Kalsiumkarbonaatti CaCO3 3.1.2 Suoritus 3.1.2.1 K u i v a t v i i n i t Kaadetaan 50 ml viiniä dekantterilasiin, jonka halkaisija on noin 10 12 cm, ja lisätään 1/2 (n 0,5) ml 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.1.2) (n = 0,1 M natriumhydroksidiliuostilavuus, joka kuluu, kun kokonaishapot määritetään 10 lista viiniä.) Haihdutetaan kiehuvassa vesihauteessa kuumassa ilmavirrassa, kunnes nestettä on jäljellä noin 20 ml. Valutetaan 3 ml tätä nestettä asetaattimuodossa olevan anioninvaihtokolonnin (3.1.1.5) läpi joka toinen minuutti. Kerätään eluaatti 100 ml:n mittapulloon. Pestään dekantterilasi ja kolonni kuusi kertaa 10 ml:lla tislattua vettä, lisätään sekoittaen 2,5 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta (3.1.1.6) ja 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.1.1.7), ravistetaan useita kertoja ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan. 1 ml tätä suodosta vastaa 0,5 ml:aa viiniä. 3.1.2.2 R y p ä l e m e h u t, m i s t e l l e t, m a k e a t j a p u o l i m a k e a t v i i n i t Seuraavat laimennokset ovat ohjeellisia. 1) Rypälemehut ja mistellet Valmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte. 2) Makeat tislausta varten väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on välillä 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta. 3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997 1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä. Valutetaan edellä mainittu määrä viiniä tai rypälemehua 3 ml:n erissä asetaattimuodossa olevan anioninvaihtokolonnin läpi joka toinen minuutti. Kerätään eluaatti 100 ml:n mittapulloon, huuhdellaan kolonnia vedellä, kunnes saadaan noin 90 ml eluaattia. Lisätään 0,5 g kalsiumkarbonaattia ja 1 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta. Sekoitetaan ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia aina välillä sekoittaen. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan. Tapauksen mukaan: 1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistelleä, 2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä, 3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä. 3.2 Tavanomaiset menetelmät 3.2.1 Kirkastaminen neutraalilla lyijyasetaatilla 3.2.1.1 R e a g e n s s i t Neutraali lyijyasetaattiliuos (lähes kyllästetty) (katso 3.1.1.6). Kalsiumkarbonaatti 3.2.1.2 S u o r i t u s 3.2.1.2.1 Kuivat viinit Kaadetaan 50 ml viiniä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 1/2 (n-0,5) ml 1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.1.2); n on 0,1 M natriumhydroksidiliuostilavuus, joka kuluu, kun kokonaishapot määritetään 10 ml:sta viiniä. Lisätään sekoittaen 2,5 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta (3.1.1.6) ja 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.1.1.7), ravistellaan useita kertoja ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan. 1 ml suodosta vastaa 0,5 ml:aa viiniä. 3.2.1.2.2 Rypälemehut, mistellet ja puolimakeat viinit Kaadetaan 100 ml:n mittapulloon määrätty määrä viiniä (tai rypälemehua tai mistelleä) seuraavien ohjeellisten laimennosten mukaisesti: 1) Rypälemehut ja mistellet Valmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte. 2) Makeat väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta. 3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997-1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä. Lisätään 0,5 g kalsiumkarbonaattia, noin 60 ml vettä ja 0,5 tai 1 tai 2 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta. Sekoitetaan ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia aina välillä sekoittaen. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan. Tapauksen mukaan: 1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistelleä, 2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä, 3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä. 3.2.2 Kirkastaminen sinkki(II)heksasyanoferraatilla Tätä kirkastamismenetelmää saa käyttää ainoastaan valkoviiniin, heikosti värillisiin makeisiin viineihin ja rypälemehuihin. 3.2.2.1 R e a g e n s s i t 3.2.2.1.1 Liuos I: Kalium(II)heksasyanoferraattiliuos >TAULUKON PAIKKA> 3.2.2.1.2 Liuos II: Sinkkisulfaattiliuos >TAULUKON PAIKKA> 3.2.2.2 S u o r i t u s Kaadetaan 100 ml:n mittapulloon määrätty määrä viiniä (tai rypälemehua tai mistelleä) seuraavien ohjeellisten laimennosten mukaisesti: 1) Rypälemehut ja mistellet Valmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte. 2) Makeat tislausta varten väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta. 3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997 1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä. 4) Kuivat viinit Otetaan 50 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä. Lisätään 5 ml kalium(II)heksasyanoferraattiliuosta I (3.2.2.1.1) ja 5 ml sinkkisulfaattiliuosta II (3.2.2.1.2). Sekoitetaan. Täytetään merkkiin vedellä. Odotetaan 10 minuuttia. Suodatetaan. Tapauksen mukaan: 1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistellea, 2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä, 3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä. 4) 1 ml suodosta vastaa 0,50 ml:aa kuivaa viiniä. 4 MÄÄRITYS 4.1 Reagenssit 4.1.1 Emäksinen kuparisuolaliuos >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan kuparisulfaatti 100 ml:aan vettä, sitruunahappo 300 ml:aan vettä ja natriumkarbonaatti 300 400 ml:aan lämmintä vettä. Sekoitetaan sitruunahappo- ja natriumkarbonaattiliuokset. Lisätään kuparisulfaattiliuos ja täytetään yhdeksi litraksi. 4.1.2 30 % kaliumjodidiliuos >TAULUKON PAIKKA> Säilytetään värillisessä lasipullossa. 4.1.3 25 % rikkihappo >TAULUKON PAIKKA> Happo kaadetaan varovasti veteen, annetaan jäähtyä ja täytetään 100 ml:ksi. 4.1.4 5 g/l tärkkelysliuos Sekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vettä. Kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen ja annetaan kiehua noin 10 minuuttia. Lisätään 200 g natriumkloridia (NaCl). Täytetään yhdeksi litraksi jäähtymisen jälkeen. - Natriumtiosulfaattiliuos, 0,1 M - Inverttisokeriliuos, 5 g/l: käytetään määritysmenetelmän tarkastamiseen. Mitataan 200 ml:n mittapulloon seuraavat aineet >TAULUKON PAIKKA> Pidetään mittapulloa 60 °C:ssa vesihauteessa, kunnes liuoksen lämpötila on 50 °C ja pidetään tämä lämpötila 15 minuutin ajan. Annetaan pullon jäähtyä 30 minuuttia itsekseen ja tämän jälkeen jäähdytetään kylmässä vesihauteessa. Siirretään liuos 1 l:n mittapulloon. Täytetään litraksi. Tämä liuos säilyy käyttökelpoisena yhden kuukauden ajan. Käyttöön otettaessa neutraloidaan määritettävä näyte (tämä liuos on noin 0,06 M happo) natriumhydroksidiliuoksella. 4.2 Suoritus Mitataan 300 ml:n mittapulloon 25 ml emäksistä kuparisuolaliuosta, 15 ml vettä ja 10 ml kirkastettua liuosta, joka saa sisältää enintään 60 mg inverttisokeria. Lisätään muutamia hohkakivirakeita. Yhdistetään pystyjäähdyttimeen ja kuumennetaan kiehumispisteeseen 2 minuutin kuluessa. Annetaan kiehua tarkalleen 10 minuuttia. Jäähdytetään välittömästi kylmässä juoksevassa vedessä. Kun liuos on jäähtynyt täysin, lisätään 10 ml 30-prosenttista kaliumjodidiliuosta (4.1.2), 25 ml 25-prosenttista rikkihappoa (4.1.3) ja 2 ml tärkkelysliuosta (4.1.4). Titrataan 0,1 M natriumtiosulfaattiliuoksella (4.1.5). n = käytetty millilitramäärä. Tehdään myös sokeakoe, jossa 10 ml sokeriliuosta korvataan 10 ml:lla tislattua vettä. n' = titraukseen käytetty tiosulfaatin määrä. 4.3 Tulosten ilmoittaminen 4.3.1 Laskutoimitukset Määritettävän näytteen sisältämä sokerimäärä, inverttisokerina ilmoitettuna, annetaan jäljempänä olevassa taulukossa käytetyn tiosulfaatin n' n millilitramäärän funktiona. Viinin sokeripitoisuus inverttisokeria grammoina litrassa on ilmoitettava yhdellä desimaalilla ottaen huomioon kirkastamisen aikana suoritetut laimennukset ja määritettävän näytteen tilavuus. 4.3.2 Toistettavuus >TAULUKON PAIKKA> 4.3.3 Uusittavuus >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 6 SAKKAROOSI 1 PERIAATE I Kvalitatiivinen koemenetelmä ohutlevykromatografialla. Sakkaroosi erotetaan muista sokereista selluloosalla päällystetyllä levyllä ja täplä kehitetään urea-kloorivetyhapporeagenssilla 105 °C:ssa lämpökaapissa. II Koe- ja määritysmenetelmä suuren erotuskyvyn nestekromatografialla. Sakkaroosi erotetaan sidostetulla alkyyliamiinisilikakolonnilla, ja määritetään refraktometrillä. Tulos suhteutetaan samoissa koeolosuhteissa määritettyyn ulkoisena standardina käytettyyn aineeseen. Huomautukset: Rypälemehun tai viinin aitous voidaan tarkistaa deuterium NMR-menetelmällä, joka on kuvattu rypälemehujen, puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen ja viinien väkevöinnin osoittamiseksi. Sakkaroosin toteamiseksi ja määrittämiseksi voidaan käyttää myös 42 luvun f kohdassa kuvattua kaasukromatografiaa. 2 KVALITATIIVINEN MENETELMÄ OHUTLEVYKROMATOGRAFIALLA 2.1 Laitteet 2.1.1 Selluloosalla päällystettyjä kromatografialevyjä 2.1.2 Kromatografiakammio 2.1.3 Mikroruisku tai mikropipetti 2.1.4 Lämpökaappi, joka voidaan säätää 105 °C ± 2 °C:seen 2.2 Reagenssit 2.2.1 Aktiivihiili värin poistoon 2.2.2 Liikkuva faasi: dikloorimetaani - jääetikka (ñ20 = 1,05 g/ml) - etanoli - metanoli - vesi (50:25:9:6:10). 2.2.3 Kehitin >TAULUKON PAIKKA> 2.2.4 Vertailuliuos >TAULUKON PAIKKA> 2.3 Suoritus 2.3.1 Näytteen valmistaminen Jos rypälemehun tai viinin väri on voimakas, väri poistetaan aktiivihiilikäsittelyllä. Kun kyseessä on puhdistettu tiivistetty rypälemehu käytetään liuosta, jonka sokeripitoisuus on 25 % (m/m) (25°Brix) ja joka on valmistettu luvussa "pH:n määrittäminen" olevassa 4.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla, ja laimennetaan mittapullossa 25 ml liuosta vedellä 100 ml:ksi. 2.3.2 Kromatografointi Annostellaan 2,5 cm:n etäisyydelle levyn alareunasta: - 10 ìl näytettä, - 10 ìl vertailuliuosta. Asetetaan levy liikkuvan faasin höyryllä kyllästettyyn kromatografiakammioon ja annetaan nesteen nousta 1 cm:n etäisyydelle yläreunasta. Nostetaan levy pois ja kuivataan se lämpimässä ilmavirrassa. Toistetaan ajo kaksi kertaa ja kuivataan levy molemmilla kerroilla. Sumutetaan levylle tasaisesti 15 ml kehitintä ja pidetään sitä 105 °C:ssa lämpökaapissa 5 minuuttia. 2.4 Tulokset Sakkaroosi ja fruktoosi näkyvät tummansinisinä täplinä valkoisella taustalla; glukoosin täplä on heikosti vihertävä. 3 KOE- JA MÄÄRITYSMENETELMÄ SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRA-FIALLA Kromatografiset olosuhteet ovat ohjeellisia. 3.1 Laitteet 3.1.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jossa on: 1) 10 ìl injektointiluuppi, 2) detektori, differentiaalinen refraktometri tai interferometri-refraktometri, 3) sidostettu alkyyliamiinisilikakolonni (pituus 25 mm ja sisähalkaisija 4 mm), 4) samalla faasilla täytetty esikolonni, 5) valmius esikolonnin ja kolonnin eristämiseksi ja lämpötilan pysyttämiseksi (30 °C), 6) piirturi ja mahdollisesti integraattori, 7) liikkuvan faasin virtausnopeus: 1 ml/min. 3.1.2 Kalvosuodatuslaitteisto (0,45 ìm) 3.2 Reagenssit 3.2.1 Kahdesti tislattu vesi 3.2.2 Asetonitriili (CH3CN), HPLC-laatu 3.2.3 Liikkuva faasi: asetonitriili vesi, suodatettu kalvon (0,45 ìm) läpi, (80 20 v/v). Liikkuvasta faasista on poistettava kaasu ennen sen käyttöä. 3.2.4 Vertailuliuos: sakkaroosin vesiliuos 1,2 g/l. Suodatetaan kalvon (0,45 ìm) läpi. 3.3 Suoritus 3.3.1 Näytteen valmistaminen - Viinit ja rypälemehut. Suodatetaan kalvon (0,45 ìm) läpi. - Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut. Käytetään liuosta, joka on valmistettu laimentamalla puhdistettu tiivistetty rypälemehu 40 %:ksi (m/v) luvussa "Kokonaishappopitoisuus" olevassa 5.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla ja suodatettu kalvon (0,45 ìm) läpi. 3.3.2 Kromatografinen määrittäminen Injektoidaan kromatografiin vuorotellen 10 ìl vertailuliuosta ja 10 ìl 3.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla valmistettua näytettä. Toistetaan injektoinnit samassa järjestyksessä. Tulostetaan kromatogrammi. Sakkaroosin retentioaika on noin 10 minuuttia. 3.4 Laskutoimitukset Laskutoimituksissa käytetään vertailuliuoksen ja näytteen kahden määrityksen tulosten keskiarvoa. 3.4.1 Viinit ja rypälemehut Lasketaan pitoisuus grammoina litrassa. 3.4.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut C g/l on 40 % (m/v) puhdistetun tiivistetyn rypälemehuliuoksen sakkaroosipitoisuus. Puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sakkaroosipitoisuus grammoina kilogrammassa: 2,5 × C. 3.5 Tulosten ilmoittaminen Viinien, rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen sakkaroosipitoisuus ilmoitetaan grammoina litrassa (viinit ja rypälemehut) ja grammoina kilogrammassa (puhdistetut tiivistetyt rypälemehut) yhdellä desimaalilla. 7 GLUKOOSI JA FRUKTOOSI 1 MÄÄRITELMÄ Glukoosi ja fruktoosi voidaan määrittää erikseen entsymaattisella menetelmällä, jonka ainoa tavoite on glukoosi/fruktoosi -suhteen laskeminen. 2 PERIAATE Glukoosi tuottaa adenosiinitrifosforihapon kanssa (ATP) heksokinaasilla (HK) katalysoidussa entsymaattisessa reaktiossa glukoosi-6-fosfaattia (G6P) ja fruktoosi fruktoosi-6-fosfaattia (F6P). glukoosi + ATP>KAAVION ALKU> HK>KAAVION LOOPU> G6P + ADP fruktoosi + ATP>KAAVION ALKU> HK>KAAVION LOOPU> F6P + ADP Aluksi glukoosi-6-fosfaatti hapetetaan nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatilla (NADP) glukonaatti-6-fosfaatiksi glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi-entsyymin (G6PDH) läsnäollessa. Pelkistyneen nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatin (NADPH) määrä vastaa glukoosi-6-fosfaatin määrää eli glukoosin määrää. G6P + NADP+>KAAVION ALKU> G6PDH>KAAVION LOOPU> Glukonaatti-6-fosfaatti + NADPH + H+ Pelkistynyt nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatti määritetään mittaamalla absorptio 340 nm:ssä. Reaktion päättyessä fruktoosi-6-fosfaatti muutetaan fosfoglukoosi-isomeraasilla (PGI) glukoosi-6-fosfaatiksi. F6P>KAAVION ALKU> PGI>KAAVION LOOPU> G6P lukoosi-6-fosfaatti reagoi jälleen nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatin kanssa ja tuottaa glukonaatti-6-fosfaattia ja pelkistynyttä nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaattia: jälkimmäinen määritetään. 3 LAITTEET - Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaus 340 nm:ssä, jossa NADPH:n absorptio on suurin. Jos kyseessä ovat absoluuttiset mittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADPH:n ekstinktiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiarvot on tarkistettava. Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään spektrofotometriä, josta saadaan epäjatkuva spektri ja jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä. - Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm tai kertakäyttöisiä kyvettejä. - Entsymaattisissa kokeissa käytettäviä pipettejä, 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml. 4 REAGENSSIT 4.1 Liuos 1: puskuriliuos (trietanoliamiini 0,3 M: pH = 7,6; 4 × 10-3M, Mg2+). 150 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 11,2 g trietanoliamiinihydrokloridia ((C2H5)3N × HCl) ja 0,2 g MgSO4 × 7 H2O, lisätään noin 4 ml 5 M natriumhydroksidiliuosta (NaOH) pH:n säätämiseksi arvoon 7,6 ja täytetään 200 ml:ksi. Tätä standardiliuosta voi säilyttää 4 viikkoa + 4 °C:ssa. 4.2 Liuos 2: nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatti-liuos (noin 11,5 × 10-3M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 50 mg dinatrium nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaattia. Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa. 4.3 Liuos 3: adenosiini-5'-trifosfaatti -liuos (noin 81 × 10-3M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 250 mg dinatrium adenosiini-5'-trifosfaattia ja 250 mg natriumvetykarbonaattia NaHCO3. Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa. 4.4 Liuos 4: Heksokinaasi/glukoosi-6-fosfaatti-dehydraasi: sekoitetaan 0,5 ml heksokinaasia (2 mg proteiinia/ml tai 280 U/ml) ja 0,5 ml glukoosi-6-fosfaatti-dehydraasia (1 mg proteiinia/ml). Liuos säilyy yhden vuoden + 4 °C:ssa. 4.5 Liuos 5: Fosfoglukoosi-isomeraasi (2 mg proteiinia/ml tai 700 U/ml). Liuosta käytetään laimentamattomana. Liuos säilyy vuoden + 4 °C:ssa. Huomautus: Kaikkia määrityksessä tarvittavia reagensseja on kaupallisesti saatavilla. 5 SUORITUS 5.1 Näytteen valmistaminen Arvioidun glukoosi + fruktoosimäärän/l mukaan tehdään seuraavat laimennukset: >TAULUKON PAIKKA> 5.2 Määritys Tehdään mittaukset 340 nm:n aallonpituudelle säädetyllä spektrofotometrillä vertailuna ilma (ei kyvetti) tai vesi. Lämpötila 20-25 °C. Annostellaan kahteen 1 cm:n kyvettiin: >TAULUKON PAIKKA> Sekoitetaan ja luetaan liuosten absorbanssi (A1) noin 3 minuutin kuluttua. Käynnistetään reaktio lisäämällä: >TAULUKON PAIKKA> Sekoitetaan; odotetaan 15 minuuttia; luetaan absorbanssi ja tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A2). Lisätään välittömästi: >TAULUKON PAIKKA> Sekoitetaan; luetaan absorbanssi 10 minuutin kuluttua; tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A3). Lasketaan absorbanssin erotukset vertailu- ja määritysliuoksille: A2 A1 vastaa glukoosia, A3 A2 vastaa fruktoosia, Lasketaan absorbanssien erotukset vertailu-(ÄAV) ja määritysliuoksille (ÄAM), jolloin saadaan >TAULUKON PAIKKA> Huomautus: Entsyymiaktiivisuuden loppuunsaattamiseen tarvittava aika voi vaihdella erästä toiseen. Edellä annettu arvo on vain ohjeellinen. On suositeltavaa määrittää aika erikseen jokaiselle erälle. 5.3 Tulosten ilmoittaminen 5.3.1 Laskeminen Konsentraatioiden yleinen laskentakaava on: C = >NUM>V × MP/ >DEN>å × d × v × 1000 Ä A(g/l) jossa >TAULUKON PAIKKA> Saadaan: >TAULUKON PAIKKA> Jos näyte on laimennettu valmistamisen yhteydessä, tulos kerrotaan laimennuskertoimella F. Huomautus: Jos mittaukset on tehty aallonpituuksilla 334 tai 365 nm, saadaan: - mittaus 334 nm:ssä: Ó = 6,2 (mmol-1 × 1 × cm-1) >TAULUKON PAIKKA> - mittaus 365 nm:ssä: Ó = 3,4 (mmol-1 × 1× cm-1) >TAULUKON PAIKKA> 5.3.2 Toistettavuus (r) r = 0,056x1 5.3.3 Uusittavuus (R) >TAULUKON PAIKKA> 8 RYPÄLEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEMEHUJEN, PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEMEHUJEN JA VIININ VÄKEVÖINNIN HAVAITSEMINEN DEUTERIUMIN YDINMAGNEETTISTA RESONANSSIA SOVELTAMALLA 1 MÄÄRITELMÄ Käymisen jälkeen rypälemehussa ollut veden ja sokerien sisältämä deuterium jakautuu uudelleen viinissä molekyyleihin I, II, III ja IV: >TAULUKON PAIKKA> Väkevöinti sokeria lisäämällä (chaptalisation) ennen rypälemehun käymistä vaikuttaa deuteriumin jakautumiseen. Verrattaessa saman alueen luonnollisen vertailuviinin parametrien arvoihin, väkevöinti sokerilla johtaa seuraaviin muutoksiin: >TAULUKON PAIKKA> (D/H)I: isotooppisuhde, joka liittyy molekyyliin I (D/H)II: isotooppisuhde, joka liittyy molekyyliin II (D/H)QW: veden isotooppisuhde viinissä. R = 2(D/H)II/(D/H)I ilmaisee deuteriumin suhteellisen jakautumisen molekyyleissä I ja II: R mitataan suoraan signaalien h-voimakkuudesta ja tällöin R = 3hII/hI. (D/H)I on tunnusomainen erityisesti sokerin yhteyttäneelle kasvilajille ja vähemmässä määrin satopaikan maantieteelliselle sijainnille (fotosynteesin aikana käytetyn veden laatu). (D/H)II kuvaa viinirypäleiden tuotantopaikan ilmasto-oloja (sadeveden luonne ja sääolosuhteet) ja vähemmässä määrin alkuperäisen rypälemehun sokerikonsentraatiota. (D/H)QW kuvaa tuotantopaikan ilmasto-oloja ja alkuperäisen rypälemehun sokeripitoisuutta. 2 PERIAATE Edellä määritellyt parametrit [R, (D/H)I, (D/H)II] määritetään deuteriumin ydinmagneettisella resonanssilla viinistä, tai rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun annetuissa olosuhteissa saaduista käymistuotteista erotetusta etanolista. Määritystä voidaan mahdollisesti täydentää määrittämällä viinistä erotetun veden isotooppisuhde, (D/H)QW ja määrittämällä 13C/12C isotooppisuhde etanolista. Kunnes perustetaan yhteisön tietopankki: - viineistä tuotantovyöhykkeillä otettujen tarkastusnäytteiden mukana on oltava samaa alkuperää olevat (maantieteellinen paikka ja vuosikerta) luonnolliset vertailunäytteet (vähintään kolme); näitä näytteitä otetaan kolme sarjaa. - rypälemehujen, tiivistettyjen rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen vertailunäytteet (vähintään kolme) kerätään samaa alkuperää olevista (maantieteellinen paikka ja vuosikerta) luonnollisista rypälemehuista. Yhteisön tietopankin perustamiseen saakka jäsenvaltiot voivat käyttää väliaikaisesti kansallista tietopankkia omalla alueellaan valmistettujen tuotteiden tarkastuksessa. 3 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN 3.1 Etanolin ja veden erottaminen viinistä Huomautus: Etanolin erottamiseen voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää sillä edellytyksellä, että 98 98,5 % viinin sisältämästä kokonaisalkoholista saadaan yhteen tisleeseen, jonka alkoholipitoisuus on 92 93 massa-% (95 til-%). 3.1.1 Laitteet ja reagenssit - Laitteisto etanolin erottamiseksi (kuva 1), jossa on - tehonsäätimellä varustettu sähköhaude, - 1 litran vetoinen hioksellinen keittopullo, - Cadiot-kolonni, jossa on pyörivä läpivienti (liikkuva osa teflonia), - hioksellisia 125 ml:n erlenmeyerkolveja, - muovitulpallisia 125 ja 60 ml:n pulloja. - Reagensseja veden määrittämiseen Karl Fischerin menetelmällä (esimerkiksi Merck 9241 ja 9243). 3.1.2 Suoritus 3.1.2.1 Määritetään viinin alkoholipitoisuus (tv) vähintään 0,05 til-%:n tarkkuudella. 3.1.2.2 E t a n o l i n e r o t t a m i n e n Mitataan 500 ml:n homogeeninen näyte alkoholipitoisuudeltaan tv olevaa viiniä noin 0,9 vakiopalautussuhteen omaavan tislauslaitteen tislauskolviin. Asetetaan aiemmin taarattu tisleen keräykseen tarkoitettu 125 ml:n hioksellinen erlenmeyerpullo paikoilleen. Kerätään 78,0 78,2 °C:ssa kiehuva neste, eli noin 40 60 ml. Jos lämpötila on yli 78,5 °C, keskeytetään keräys viideksi minuutiksi. Kun lämpötila on palautunut 78 °C:seen, jatketaan tisleen keräystä 78,5 °C:seen saakka ja suoritus toistetaan, kunnes lämpötila keräyksen keskeyttämisen jälkeen suljetussa järjestelmässä ei enää muutu. Täydellinen tislaus kestää noin 5 tuntia. Tällä periaatteella voidaan kerätä 98 98,5 % viinin kokonaisalkoholista tisleeseen, jonka alkoholipitoisuus on 92 93 massa-% (95 til-%). Jäljempänä 4 kohdassa kuvatut NMR-olosuhteet on vahvistettu tälle pitoisuudelle. Kerätty etanoli punnitaan. Tislausjäännöksen 60 ml:n suuruinen homogeeninen näyte säilytetään 60 ml:n mittapullossa ja se edustaa viinissä olevaa vettä. Sen isotooppisuhde määritetään tarvittaessa. Huomautus: Jos käytettävissä on spektrometri, joka on varustettu 10 mm:n näyteputkella (katso kuva 4), 300 ml:n suuruinen homogeeninen viininäyte on riittävä. 3.1.2.3 U u t e t u n a l k o h o l i n a l k o h o l i p i t o i s u u d e n m ä ä r i t t ä m i n e n Noin 0,5 ml:n alkoholinäytteen, jonka massa p on tarkalleen tunnettu, vesipitoisuus, p'g, määritetään Karl Fischerin menetelmällä. >VIITTAUS KAAVIOON> Etanolin alkoholipitoisuus painoprosentteina saadaan kaavasta tDm = >NUM>p - p'/ >DEN>p × 100 3.2 Rypälemehujen, tiivistettyjen rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen fermentointi 3.2.1 Laitteet ja reagenssit - viinihappo, - Bacto Yeast Nitrogen, Base without amino acids DIFCO, - aktiivisia kuivahiivoja (Saccharomyces cerevisiae). Jos veden isotooppisuhde rypälemehussa on tunnettu, hiivat voidaan aktivoida etukäteen uudelleen pienessä määrässä tislaamatonta haaleaa vettä (1 g/50 ml), jotta isotooppisuhde pysyisi lähellä viinin sisältämän veden isotooppisuhdetta. Jos veden isotooppisuhde viinissä ei ole tunnettu, on suositeltavaa siirrostaa suoraan. Käytettävien kuivahiivojen määrä on noin 1 g eli noin 1010 solua/1 l rypälemehua. Vetoisuudeltaan 1,5 l oleva käymisastia, joka on varustettu astian ilmatiiviinä pitävällä osalla ja jolla alkoholihöyryt voidaan tiivistää, sillä etanolia ei saa hävitä käymisen aikana. Sokeri on fermentoitava etanoliksi vähintään 98 %:n saannolla. 3.2.2 Suoritus 3.2.2.1 R y p ä l e m e h u t - Tuoreet rypälemehut Mitataan käymisastiaan 1 l rypälemehua, jonka käymiskykyisten sokerien konsentraatio on ennalta määritetty. Lisätään 1 g etukäteen aktivoitua kuivahiivaa. Asetetaan ilmatiiviyden pitävä osa paikoilleen. Annetaan käydä noin 20 °C:n lämpötilassa, kunnes sokerit ovat käyneet loppuun. Kun käymistuotteen alkoholipitoisuus on määritetty ja sokerien käymisaste alkoholiksi laskettu, käymisliuos sentrifugoidaan ja tislataan etanolin erottamiseksi. - Rypälemehut, joissa käyminen on estetty rikkidioksidia lisäämällä Poistetaan rikki hieman yli 1 l:n (1,2 l) rypälemehumäärästä kuplittamalla typpeä rypälemehun läpi kuumassa vesihauteessa 70-80 °C:ssa palautusjäähdyttimen alla, kunnes kokonaisrikkidioksidipitoisuus on alle 200 mg/l. Veden haihtumisesta aiheutuva rypälemehun väkevöityminen on estettävä käyttämällä tehokasta jäähdytintä. Mitataan käymisastiaan 1 l rypälemehua, josta rikki on poistettu, ja jatketaan suoritusta samalla tavoin kuin tuoreella rypälemehulla. Huomautus: Jos rypälemehun rikittämiseen käytetään natriummetabisulfiittia, rypälemehuun on lisättävä ennen rikin poistamista 0,25 ml väkevää rikkihappoa (ñ20 = 1,84 g/ml) rypälemehulitraan käytettyä metabisulfiittigrammaa kohti. 3.2.2.2 T i i v i s t e t y t r y p ä l e m e h u t Mitataan käymisastiaan V ml tiivistettyä rypälemehua, joka sisältää tunnetun määrän sokeria, noin 170 g. Täytetään tilavuus 1 l:ksi (1 000 - V) ml:lla vettä, jonka isotooppisuhde on sama kuin luonnollisen vertailurypälemehun sisältämän veden isotooppisuhde. Siirrostetaan 3.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Lisätään 3 g Bacto Yeast Nitrogen Base without amino acids DIFCO. Homogenoidaan ja jatketaan suoritusta edellä kuvatulla tavalla. 3.2.2.3 P u h d i s t e t u t t i i v i s t e t y t r y p ä l e m e h u t Edetään 3.2.2.2 kohdassa kuvatulla tavalla täyttämällä tilavuus 1 l:ksi (1 000 - V) ml:lla vettä, jonka isotooppisuhde on sama kuin luonnollisen vertailurypälemehun, johon on liuotettu 3 g viinihappoa, sisältämän veden isotooppisuhde. Huomautus: Säästetään 50 ml:n näyte rypälemehusta tai rypälemehusta, josta rikki on poistettu, tai tiivistetystä rypälemehusta tai puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta, jotta voidaan tarvittaessa erottaa vesi ja määrittää sen isotooppisuhde (D/H)QW. Rypälemehujen sisältämä vesi voidaan erottaa aseotrooppisella tislauksella käyttäen tolueenia. 3.3 Alkoholinäytteen valmistaminen NMR-mittausta varten 3.3.1 Reagenssit N,N-tetrametyyliurea (TMU): käytetään TMU-vertailunäytettä, jonka isotooppisuhde D/H on tunnettu ja tarkistettu. Tämän näytteen voi toimittaa: Directorate-General for Science, Research and Development Community Bureau of References 200 rue de la Loi, B-1049 Brussels Belgia 3.3.2 Suoritus - Halkaisijaltaan 15 mm oleva NMR-näyteputki: Mitataan taarattuun pulloon 7 ml:aa 3.1.2 kohdan mukaisesti saatua alkoholia ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, mA; tämän jälkeen otetaan 3 ml:aa sisäistä standardia (TMU) ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, mst. Homogenoidaan seos ravistelemalla. - Halkaisijaltaan 10 mm oleva NMR-näyteputki: Riittävä määrä on 3,2 ml alkoholia ja 1,3 ml TMU:ta. Spektrometrin ja käytetyn näyteyksikön mukaan (ks. 4 kohta) lisätään riittävä määrä heksafluorobentseeniä kenttätaajuuden stabilointiaineeksi (lock). >TAULUKON PAIKKA> 3.4 Vesinäytteen valmistaminen NMR-mittausta varten isotooppisuhteen määrittämiseksi 3.4.1 Reagenssit N,N-tetrametyyliurea (TMU): ks. 3.3.1. 3.4.2 Suoritus Mitataan taarattuun pulloon 3 ml 3.1.2 tai 3.2 (huomautus) kohdan mukaista vettä; punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, m'E; tämän jälkeen lisätään 4 ml sisäistä standardia (TMU) ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella. Homogenoidaan ravistelemalla. Huomautus: Jos laboratoriossa on massaspektrometri isotooppisuhteen määrittämiseen, tämä määritys voidaan tehdä tällä laitteella NMR-spektrometrin kuormituksen vähentämiseksi. On tarpeen kalibroida TIV-suhde (5.2) jokaiselle tutkitulle viinisarjalle. 4 ALKOHOLIN JA VEDEN (2) H NMR-SPEKTRIEN TULOSTAMINEN Isotooppisten parametrien määrittäminen. 4.1 Laitteet - NMR-spektrometri, joka on varustettu erityisellä "deuterium" näyteyksiköllä, joka on viritetty B°-kentälle (esimerkiksi kun B° = 7,05 T niin V° = 46,05 MHz ja kun B° = 9,4 T niin V° = 61,4 MHz) tyypilliselle taajuudelle V°, ja jossa on protonin irtautuskanava B2 ja kenttä-frekvenssisuhteen stabilointikanava (lock) fluorin frekvenssillä. Spektristä mitattu resoluutio muunnetaan ilman eksponenttikerrointa (toisin sanoen LB = 0) (kuva 2 b) ja ilmoitetaan etanolin metyyli- ja metyleenisignaalien ja TMU:n metyylisignaalin puolileveytenä, ja sen on oltava alle 0,5 Hz. Herkkyyden, joka mitataan eksponenttikertoimella LB = 2 (kuva 2 a), on oltava vähintään 150 95 til-%:ssa (93,5 massa-%) alkoholissa olevan etanolin metyylisignaalille. Näissä koeolosuhteissa signaalin korkeusmittauksen luotettavuusväli, joka on laskettu 97,5 %:n todennäköisyydelle (yksipuolinen koe) ja 10 spektrin toistolle, on 0,35 %. - Automaattinen näytteenvaihtaja (mahdollisesti). - Tietokoneohjelma tulosten käsittelyyn. - Spektrometrin ominaisuuksien mukaan 15 mm:n ja 10 mm:n näyteputkia. 4.2 Spektrometrin kalibrointi ja tarkistus 4.2.1 Asetukset Tehdään valmistajan antamien ohjeiden mukaiset tavalliset homogeenisuuden ja herkkyyden asetukset. 4.2.2 Kalibroinnin tarkastaminen Käytetään vertailuetanoleja, jotka merkitään kirjaimilla C (ruokosokerietanoli), V (viinietanoli) ja B (juurikasetanoli) ja joiden isotooppipitoisuus on erilainen, mutta tarkalleen mitattu. Näillä tarkoitetaan C: ruoko- tai maissisokerialkoholi; V: viinialkoholi ja B: juurikasalkoholi. Yhteisön vertailumittaustoimisto toimittaa nämä näytteet. Määritetään näiden alkoholien isotooppiarvot 4.3 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti ja merkitään ne Cmeas, Vmeas, Bmeas (ks. 5.3). Verrataan näitä vastaaviin vertailuarvoihin ja merkitään alaindekseillä Cst, Bst, Vst (ks. 5.3). >VIITTAUS KAAVIOON> Kuva 2a Viinin sisältämän etanolin ja sisäisen standardin (TMU: N,N-tetrametyyliurea) 2H NMR-spektri >VIITTAUS KAAVIOON> Kuva 2b Vastaavissa olosuhteissa kuin kuva 2 a, mutta ilman eksponenttikerrointa (LB = 0) ajettu etanolin 2H spektri. Jokaisen spektrin keskimäärin 10 toistosta saadun toistettavuuden keskihajonnan on oltava alle 0,01 suhteelle R ja alle 0,3 ppm (D/H)I:lle ja (D/H)II:lle. Eri isotooppiparametrien [R, (D/H)I, (D/H)II] keskiarvojen on oltava vastaavan, yhteisön vertailumittaustoimiston kolmen vertailualkoholin parametreille ilmoittaman toistettavuuden keskihajonnan rajoissa. Jos näin ei ole, on kalibrointi tehtävä uudelleen. 4.3 NMR-spektrien määritysolosuhteet Kaadetaan 3.3 kohdan mukaisesti valmistettu alkoholinäyte (tai 3.4 kohdan mukaisesti valmistettu vesinäyte) 15 tai 10 mm:n putkeen ja asetetaan näyteyksikköön. NMR-spektrien määritysolosuhteet ovat seuraavat: - Näyteputken lämpötilan (esimerkiksi 302 K) on säilyttävä vakiona. - Vähintään 6,8 sekunnin keräämisaika 1 200 Hz:n spektrin leveydellä (16 K muisti), eli noin 20 ppm 61,4 MHz:ssä tai 27 ppm 46,1 MHz:ssä. - Pulssi: 90°. - Keräämisajan asetus: arvon on oltava samaa luokkaa kuin näytepisteiden poimintaväli (dwell time). - neliöllinen ilmaiseminen: säädetään "offset" 01 etanolille signaalien OD ja CHD välillä ja vedelle signaalien HOD ja TMU välillä. - Määritetään irtautus-offset 02 protonispektristä, joka on mitattu saman putken irtautuskäämillä. Hyvä irtautus saavutetaan, kun 02 on CH3- ja CH2- -ryhmien frekvenssi-intervallin keskellä. Käytetään laajakaistaista irtautusmenetelmää. Jokaista spektriä kohti tehdään sellainen määrä NS-summauksia, että saadaan 4.1. kohdassa annettu signaali-kohinasuhde ja tämä NS-summaussarja toistetaan NE = 10 kertaa. NS-arvot riippuvat käytetystä spektrometristä ja näyteyksiköstä (ks. 4 kohta). Voidaan valita esimerkiksi: >TAULUKON PAIKKA> 5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN 5.1 Etanoli Määritetään kaikille 10 spektrille (ks. etanolin NMR-spektri, kuva 2a): - R = 3 >NUM>hII/ >DEN>hI = 3 × >NUM>signaalin II korkeus (CH3CHD OH)/ >DEN>signaalin I korkeus (CH2D CH2OH) - (D/H)I = 1,5866 × TI × >NUM>mst/ >DEN>mA × >NUM>(D/H)st/ >DEN>tmD - (D/H)II = 2,3799 × TII × >NUM>mst/ >DEN>mA × >NUM>(D/H)st/ >DEN>tmD joissa - TI = >NUM>signaalin I korkeus (CH2D CH2OH)/ >DEN>sisäisen standardin (TMU) signaalin korkeus - TII = >NUM>signaalin II korkeus (CH3T CHD OH)/ >DEN>sisäisen standardin (TMU) signaalin korkeus - CH3CHDOH mst ja mA, ks. 3.3.2. - tmD se 3.1.2.3. - (D/H)st = sisäisen standardin (TMU) isotooppisuhde, joka on merkitty yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamaan pulloon. Käytettäessä piikkien korkeuksia niiden pinta-alojen asemasta, mikä on epätarkempaa, piikin puolileveyden on oltava sama kuin pinta-alan. Tämä antaa kohtuullisen hyvän arvion (kuva 2b). 5.2 Vesi Määritettäessä veden isotooppisuhdetta vesi-TMU-seoksesta NMR-menetelmällä käytetään seuraavaa suhdetta: - (D/H)WQ = 0,9306 × TIV × >NUM>m'st/ >DEN>m'E × (D/H)st jossa - TIV = >NUM>Viinistä erotetun veden (HOD) signaalin pinta-ala/ >DEN>Sisäisen standardin (TMU) signaalin pinta-ala - m'st ja m'E ks. 3.4.2. - (D/H)st = sisäisen standardin (TMU) isotooppisuhde, joka on merkitty yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamaan pulloon. 5.3 Jokaiselle isotooppiparametrille lasketaan 10 määrityksen keskiarvo ja luotettavuusväli. Spektrometrin tietokone täydennettynä sopivalla lisäohjelmistolla (esimerkiksi SNIF-NMR) antaa mahdollisuuden suorittaa nämä laskutoimitukset suoraan. Huomautus: Jos spektrometrin asetusten säätämisen jälkeen vertailualkoholien tyypillisille isotoopeille saatujen keskiarvojen (4.2.2) ja yhteisön vertailumittaustoimiston antamien arvojen välillä on järjestelmällinen ero keskihajonnan rajoissa, oikean arvon saamiseksi mille tahansa näytteelle X voidaan tehdä seuraavat korjaukset. Interpolaatio tehdään ottamalla näytteen X arvon ympärillä olevat vertailunäytearvot. (D/H)XmesI on mitattu arvo ja (D/H)XcorrI on korjattu arvo. Tästä saadaan: (D/H)XcorrI = (D/H)Bst + á [(D/H)XmesI - (D/H)BmesI] jossa á = >NUM>(D/H)VstI × (D/H)BstI/ >DEN>(D/H)VmesI × (D/H)BmesI Esimerkki: Yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamat ja määrittämät vertailunäytteet: (D/H)VstI = 102,0 ppm (D/H)BstI = 91,95 ppm Laboratorion mittaamat vertailunäytteet: (D/H)VmesI = 102,8 ppm (D/H)BmesI = 93,0 ppm Epävarma korjaamaton näyte: (D/H)XmesI = 100,2 ppm Lasketaan á = 1,0255 ja (D/H)XcorrI = 99,3 ppm 6 TULOSTEN TULKITSEMINEN Verrataan epävarman näytteen suhteelle R saatua arvoa RX vertailuviineille saatuihin suhteisiin. Jos RX eroaa vertailuviineille saadusta keskiarvosta RT enemmän kuin kaksi kertaa keskihajonta, voidaan epäillä väärentämistä. 6.1 Juurikassokerilla, ruokosokerilla tai maissiglukoosilla väkevöinti 6.1.1 Viinit RX on suurempi kuin RT: oletetaan, että on lisätty juurikassokeria. RX on pienempi kuin RT: oletetaan, että on lisätty ruokosokeria tai maissisokeria. On huomattava, että (D/H)XIIja (D/H)QXWkasvavat. Tutkitaan (D/H)XI. Oletetaan, että - on lisätty juurikassokeria: epävarman näytteen (D/H)XI on enemmän kuin keskihajonnan verran pienempi kuin (D/H)TI vertailunäytteille saatu keskiarvo. - on lisätty ruokosokeria tai maissisokeria: (D/H)XI on enemmän kuin keskihajonnan verran suurempi kuin (D/H)TI. - Väkevöinnin E laskeminen, ilmaistuna etanolin til-%:na. - Juurikassokerin lisääminen: E til - % = tv >NUM>(D/H)TI - (D/H)XI/ >DEN>(D/H)TI - (D/H)BI (D/H)BI - isotooppisuhde sijaintipaikan I juurikassokerista valmistetussa alkoholissa: (D/H)BI = 92,5(9). tv = määritetyn viinin (X) alkoholipitoisuus - Ruoko- tai maissisokerin lisääminen: E til - % = tv >NUM>(D/H)XI - (D/H)TI/ >DEN>(D/H)CI - (D/H)TI (D/H)CI - isotooppisuhde sijaintipaikan I ruokosokerista tai juurikassokerista valmistetussa alkoholissa: (D/H)CI = 110,5(10). tv = määritetyn viinin (X) alkoholipitoisuus. 6.1.2 Rypälemehut, tiivistetyt rypälemehut ja puhdistetut tiivistetyt rypälemehut Tutkitaan rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun käymistuotteesta (3.2) 3.1 kohdan mukaisesti erotetun alkoholin isotooppiparametrien arvot noudattaen kohdan 6 "Tulosten tulkitseminen" 6.1.1 alakohdassa annettuja ohjeita ja verrataan niitä luonnollisten vertailurypälemehujen käymistuotteista erotettuun alkoholiin. Väkevyys, E til-%, ilmaisee käyneeseen tuotteeseen lisätyn alkoholin tilavuuden. Kun tunnetaan ennen käymistä mahdollisesti tehty laimentaminen (tiivistetyt rypälemehut ja puhdistetut tiivistetyt rypälemehut) ja oletetaan, että 16,83 g sokeria tuottaa 1 til-% alkoholia, voidaan laskea yhteen litraan rypälemehua, tiivistettyä rypälemehua tai puhdistettua tiivistettyä rypälemehua lisätyn sokerin massamäärä. 6.2 Juurikassokeri-, ruokosokeri- ja maissiglukoosiseoksella väkevöinti Isotooppisuhteet (D/H)I ja R muuttuvat vähemmän kuin tehtäessä väkevöinti yhdellä sokerilla. (D/H)II kasvaa, kuten myös (D/H)OWW. Nämä lisäykset voidaan varmentaa määrittämällä etanolin 13C/12C suhde massaspektrometrillä: tässä tapauksessa suhde on korkeampi. 9 TUHKAPITOISUUS 1 MÄÄRITELMÄ Tuhkalla tarkoitetaan kaikkia viinin haihdutusjäännöksen hehkuttamisen jälkeen jäljelle jääneitä tuotteita. Hehkuttaminen on tehtävä siten, että kaikki kationit (lukuun ottamatta ammoniumia) muuttuvat karbonaateiksi tai muiksi vedettömiksi mineraalisuoloiksi. 2 PERIAATE Hehkutetaan viiniuutetta 500 550 °C:een lämpötilassa, kunnes orgaaninen aines on palanut täydellisesti. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Vesihaude, 100 °C. 3.2 Tarkkuudeltaan 0,1 mg oleva vaaka. 3.3 Sähkölevy tai infrapunahaihdutin. 3.4 Sähköuuni, jonka lämpötilaa voidaan säätää. 3.5 Eksikkaattori. 3.6 Laakeapohjainen platinamalja, jonka halkaisija on 70 mm ja korkeus 25 mm. 4 SUORITUS Pipetoidaan 20 ml viiniä taarattuun platinamaljaan (P0g). Haihdutetaan 100 °C:ssa vesihauteessa, kuumennetaan jäännöstä 200 °C:n sähkölevyllä tai infrapunahaihduttimen alla hiiltymiseen asti. Kun höyryä ei enää synny, sijoitetaan malja sähköuuniin, jota pidetään 525 °C ± 25 °C:ssa. 15 minuutin kuluttua hiiltymisestä otetaan malja uunista, lisätään 5 ml tislattua vettä. Haihdutetaan tämän jälkeen vesihauteessa tai infrapunahaihduttimessa ja kuumennetaan uudelleen noin 10 minuutin ajan 525 °C:ssa. Jos hiiltyneiden hiukkasten palaminen ei ole täydellinen, toistetaan hiiltyneiden hiukkasten pesu, veden haihduttaminen ja hehkuttaminen. Kun kyseessä ovat hyvin sokeripitoiset viinit, on tarkoituksenmukaista lisätä uutteeseen muutama tippa puhdasta kasvisöljyä ennen ensimmäistä hehkuttamista sisällön liiallisen kuohumisen estämiseksi. Eksikkaattorissa jäähdyttämisen jälkeen malja punnitaan, P1 g. Näytettä (20 ml) vastaavan tuhkan paino on p = (P1 - P0) g. 5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN Laskentamenetelmä Tuhkan paino ilmoitettuna grammoina litrassa kahdella desimaalilla on: P = 50 × p 10 TUHKAN EMÄKSISYYS 1 MÄÄRITELMÄ Tuhkan emäksisyydellä tarkoitetaan ammoniumia lukuun ottamatta sellaisten kationien summaa, jotka ovat liittyneet viinin orgaanisiin happoihin. 2 PERIAATE Tuhka liuotetaan tunnettuun määrään kuumaa happoliuosta; ylijäämä määritetään titraamalla käyttäen metyylioranssia indikaattorina. 3 REAGENSSIT JA LAITTEET 3.1 0,05 M rikkihappoliuos (H2SO4) 3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH) 3.3 Metyylioranssiliuos, 0,1 g metyylioranssia/100 ml tislattua vettä 3.4 Vesihaude, 100 °C. 4 SUORITUS Lisätään platinamaljaan, joka sisältää 20 ml:sta viiniä saadun tuhkan, 10 ml 0,05 M rikkihappoliuosta (3.1); asetetaan 100 °C:seen vesihauteeseen noin 15 minuutiksi murskaten jäännös lasipuikolla liukenemisen edistämiseksi. Tämän jälkeen lisätään kaksi tippaa metyylioranssiliuosta ja titrataan rikkihappoylijäämää 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2), kunnes indikaattorin väri muuttuu keltaiseksi. 5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN Laskentamenetelmä Tuhkan emäksisyys ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa yhdellä desimaalilla on: A = 5 (10 - n) n = titrauksessa kuluneen 0,1 M natriumhydroksidin määrä millilitroina. 11 KLORIDIT 1 PERIAATE Kloridit määritetään suoraan viinistä potentiometrisesti käyttäen Ag/AgCl-elektrodia. 2 VÄLINEISTÖ 2.1 Millivolttiasteikolla varustettu pH-mittari, jonka asteikko on jaettu vähintään 2 mV:n välein. 2.2 Magneettisekoittaja. 2.3 Ag/AgCl-elektrodi, jossa elektrolyyttinä on kyllästetty kaliumnitraattiliuos. 2.4 Mikrobyretti, jonka asteikko on jaettu 1/100 ml:n välein. 2.5 Sekuntikello. 3 REAGENSSIT 3.1 Kloridistandardiliuos: liuotetaan tislattuun veteen 2,1027 g kaliumkloridia, KCl (max. 0,005 % Br), jota on kuivattu ennen käyttöä eksikkaattorissa usean päivän ajan; täytetään yhdeksi litraksi; 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg Cl-:a. 3.2 Hopeanitraattititrausliuos: 4,7912 g analyysilaatua olevaa hopeanitraattia, AgNO3, liuotetaan 10 % (v/v) alkoholiliuokseen ja täytetään yhdeksi litraksi; 1 ml tätä liuosta vastaa 1 mg Cl-:a. 3.3 Typpihappo, puhtaus vähintään 65 % (ñ20 = 1,40 g/ml). 4 SUORITUS 4.1 Mitataan 5,0 ml kloridistandardiliuosta 150 ml:n vetoiseen magneettisekoittajaan asetettuun lieriönmuotoiseen astiaan, laimennetaan noin 100 ml:ksi tislatulla vedellä ja hapotetaan 1,0 ml:lla vähintään 65 % typpihappoa. Kun elektrodi on upotettu liuokseen, titrataan lisäämällä mikrobyretillä hopeanitraattititrausliuosta sekoittaen kohtuullisesti. Aloitetaan lisäämällä 1,00 ml neljää ensimmäistä ml:aa kohti ja luetaan vastaavat millivolttiarvot. Tämän jälkeen lisätään 2 ml 0,20 ml:n erissä. Jatketaan lisäämistä 1 ml:n erissä, kunnes on lisätty yhteensä 10 ml. Jokaisen lisäyksen jälkeen odotetaan noin 30 sekuntia ennen vastaavien millivolttien lukemista. Siirretään saadut arvot millimetripaperille siten, että ne vastaavat titrausliuoksen millilitroja ja määritetään ekvivalenttipisteen potentiaali saadun käyrän yksittäisen pisteen perusteella. 4.2 150 ml:n lieriömäiseen astiaan mitataan 5 ml kloridistandardiliuosta sekä 95 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa. Upotetaan elektrodi liuokseen ja titrataan sekoittaen, kunnes saavutetaan ekvivalenttipisteen potentiaali. Tämä määritys toistetaan, kunnes saavutetaan tulosten hyvä yhdenmukaisuus. Tämä tarkistus on tehtävä ennen kloridien mittaussarjan tekemistä näytteestä. 4.3 Mitataan 50 ml määritettävää viiniä 150 ml:n lieriömäiseen astiaan. Lisätään 50 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa ja titrataan 4.2 kohdan mukaisesti. 5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN 5.1 Laskutoimitukset Jos n edustaa hopeanitraattititrausliuoksen millilitramäärää, tutkitun liuoksen kloriittipitoisuus on: >TAULUKON PAIKKA> 5.2 Toistettavuus (r) >TAULUKON PAIKKA> 5.3 Uusittavuus (R) >TAULUKON PAIKKA> 6 Huomautus: Erittäin tarkat määritykset Käytetään hopeanitraattiliuoksella koeliuoksen määrityksessä saatua titrauskäyrää. a) Mitataan 50 ml määritettävää viiniä 150 ml:n lieriömäiseen astiaan. Lisätään 50 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa. Titrataan hopeanitraattiliuoksella 0,5 ml:n lisäyksin ja luetaan vastaavat millivolttipotentiaalit. Johdetaan tästä ensimmäisestä titrauksesta tarvittavan hopeanitraattiliuoksen likimääräinen tilavuus. b) Toistetaan määritys samoissa koeolosuhteissa. Aluksi lisätään titrausliuosta 0,5 ml kerrallaan, kunnes lisätty tilavuus on 1,5 2 ml pienempi kuin a alakohdassa määritetty tilavuus. Tämän jälkeen lisätään 0,2 ml kerrallaan; jatketaan likimääräisesti määritetyn ekvivalenttipisteen jälkeen liuoksen lisäämistä symmetrisesti, aluksi 0,2 ml:n ja sitten 0,5 ml:n erissä. Määrityksen päätepiste ja käytetyn hopeanitraattiliuoksen tarkka tilavuus saadaan: - joko piirtämällä käyrä ja määrittämällä ekvivalenttipiste, - tai seuraavalla yhtälöllä: V = V' + Ä Vi >NUM>ÄÄ E1/ >DEN>ÄÄ E1 + ÄÄ E2 jossa >TAULUKON PAIKKA> Esimerkki: >TAULUKON PAIKKA> Tässä esimerkissä titrauksen päätepiste on 1,6 ja 1,8 ml:n välillä: tällä välillä esiintyy potentiaalin suurin muutos (ÄE = 44 mV). Käytetyn hopeanitraattititrausliuoksen tilavuus kloridin määrittämiseksi näytteestä on: V = 1,6 + 0,2 >NUM>22/ >DEN>22 + 10 = 1,74 ml. 12 SULFAATIT 1 PERIAATE 1.1 Vertailumenetelmä Saostetaan bariumsulfaattina ja punnitaan. Samoissa koeolosuhteissa saostunut bariumfosfaatti poistetaan pesemällä sakka kloorivetyhapolla. Jos rypälemehu tai viini sisältää runsaasti rikkidioksidia, on suositeltavaa poistaa rikki ilmatiiviissä astiassa keittämällä. 1.2 Nopea koemenetelmä Viinit luokitellaan moniin laatuluokkiin käyttäen ns. rajamenetelmää, joka perustuu bariumsulfaatin saostamiseen bariumionititrausliuoksella. 2 VERTAILUMENETELMÄ 2.1 Reagenssit 2.1.1 2 M kloorivetyhappoliuos. 2.1.2 Bariumkloridiliuos, BaCl2, 2 H2O, 200 g/l. 2.2 Suoritus 2.2.1 Yleinen suoritus Mitataan 50 ml:n sentrifugiputkeen 40 ml määritettävää näytettä; lisätään 2 ml 2 M kloorivetyhappoa ja 2 ml 200 g/l bariumkloridiliuosta; sekoitetaan lasipuikolla; huuhdotaan lasipuikko pienellä määrällä tislattua vettä ja annetaan seistä viisi minuuttia. Sentrifugoidaan 5 minuutin ajan ja dekantoidaan supernatantti varovasti. Tämän jälkeen pestään bariumsulfaattisakka seuraavasti: lisätään 10 ml 2 M kloorivetyhappoa, suspendoidaan sakka ja sentrifugoidaan 5 minuutin ajan. Erotetaan supernatantti varovasti. Toistetaan sakan pesu kaksi kertaa samoissa koeolosuhteissa aina 15 ml:lla tislattua vettä. Siirretään sakka kvantitatiivisesti tislatulla vedellä huuhtoen taarattuun platinamaljaan ja haihdutetaan kuivaksi 100 °C:ssa vesihauteessa. Kuivattu sakka hehkutetaan nopeasti liekillä useita kertoja, kunnes saadaan valkea jäännös. Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja punnitaan. Saadun bariumsulfaatin massa milligrammoina on m. 2.2.2 Erityinen suoritus: rikitetyt rypälemehut ja viinit, joiden rikkidioksidipitoisuus on korkea Aluksi poistetaan rikkidioksidi. Mitataan 500 ml:n erlenmeyerkolviin, joka on varustettu tiputussuppilolla ja päästöputkella, 25 ml vettä ja 1 ml puhdasta kloorivetyhappoa (ñ20 = 1,15 1,18 g/ml). Kiehautetaan tämä liuos ilman poistamiseksi ja lisätään 100 ml viiniä tiputussuppilon kautta koko ajan kiehuttaen. Annetaan kiehua, kunnes kolvin sisältämä nestetilavuus on vähentynyt 75 ml:aan ja siirretään kvantitatiivisesti jäähdyttämisen jälkeen 100 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin vedellä. Määritetään sulfaattipitoisuus 40 ml:n näytteestä 2.2.1 kohdan mukaisesti. 2.3 Tulosten ilmoittaminen 2.3.1 Laskutoimitukset Sulfaattipitoisuus, ilmoitettuna milligrammoina kaliumsulfaattia, K2SO4, litrassa, on: 18,67 × m Rypälemehun tai viinin sulfaattipitoisuus ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina kaliumsulfaattia litrassa. 2.3.2 Toistettavuus >TAULUKON PAIKKA> 2.3.3 Uusittavuus >TAULUKON PAIKKA> 3 NOPEA KOEMENETELMÄ 3.1 Reagenssit 3.1.1 Bariumkloridititrausliuos Liuotetaan 2,804 g bariumkloridia, BaCl2, 2H2O, ja 10 ml kloorivetyhappoa (ñ20 = 1,15 1,18 g/ml) sellaiseen vesimäärään, että saadaan 1 l liuosta. 1 ml tätä liuosta saostaa 2 mg kaliumsulfaattia vastaavan määrän sulfaatti-ioneja. 3.1.2 Rikkihappo (ñ20 = 1,84 g/ml) suhteessa 1/10 (m/v) laimennettu liuos. 3.2 Suoritus Mitataan kolmeen koeputkeen 10 ml rypälemehua tai viiniä; lisätään koeputkeen n:o 1 3,5 ml, koeputkeen n:o 2 5 ml ja koeputkeen n:o 3 10 ml bariumkloridiliuosta. Ravistellaan ja kuumennetaan kiehumispisteeseen; annetaan seisoa 1 2 tuntia. Jokaisen koeputken sisältämä neste dekantoidaan, suodatetaan ja jaetaan kahteen osaan. Toiseen osaan lisätään muutama tippa laimennettua rikkihappoliuosta ja toiseen lisätään muutama tippa bariumkloridiliuosta. Tutkitaan kaikki koeputket ja pannaan merkille, onko liuos kirkasta vai sameaa. Tämän tulkitseminen esitetään seuraavassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> 13. KOKONAISHAPPOPITOISUUS 1 MÄÄRITELMÄ Kokonaishappopitoisuudella tarkoitetaan titrattavien happojen yhteismäärää, kun pH säädetään arvoon 7 emäksisellä titrausliuoksella. Hiilidioksidi ei kuulu kokonaishappopitoisuuteen. 2 PERIAATE Potentiometrinen titraus tai titraus indikaattori bromtymolisininen ja vertaaminen päätepisteen värimalliin. 3 REAGENSSIT 3.1 Standardiliuos pH 7,0: Monokaliumfosfaatti KH2PO4: 107,3 g 1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH): 500 ml Täytetään vedellä 1 000 ml:ksi. Voidaan käyttää myös kaupallisesti saatavissa olevia vertailupuskuriliuoksia. 3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH). 3.3 4 g/ml bromtymolisininen indikaattoriliuos. >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ja lisätään: >TAULUKON PAIKKA> 4 VÄLINEISTÖ 4.1 Vesivakuumipumppu. 4.2 500 ml:n vakuumipullo. 4.3 Potentiometri, jonka asteikko on jaettu pH-yksiköihin ja elektrodeja. Lasielektrodia on säilytettävä tislatussa vedessä. Kalomeli/kyllästetty kaliumkloridi-elektrodia on säilytettävä kyllästetyssä kaliumkloridiliuoksessa. Useimmiten käytetään yhdistettyä elektrodia, jota säilytetään tislatussa vedessä. 4.4 Vetoisuudeltaan 50 ml olevia mittalaseja (viinit) ja vetoisuudeltaan 100 ml olevia mittalaseja (puhdistetut tiivistetyt rypälemehut). 5 SUORITUS 5.1 Näytteen valmistaminen 5.1.1 Viinit Poistetaan hiilidioksidi. Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon, ravistellaan ja samanaikaisesti poistetaan ilma käyttäen vesivakuumipumppua. Ravistelun on kestettävä 1 2 minuuttia. 5.1.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut Mitataan tarkalleen 200 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua 500 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin vedellä. Homogenoidaan. 5.2 Potentiometrinen titraus 5.2.1 pH-mittarin kalibrointi Valmistajan ohjeita noudattaen kalibroidaan pH-mittari 20 °C:ssa puskuriliuoksella, jonka pH-arvo 20 °C:ssa on 7. 5.2.2 Mittausmenetelmä Mitataan mittalasiin (4.4) 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä 10 ml, kun kyseessä on viini, ja 50 ml, kun kyseessä on puhdistettu tiivistetty rypälemehu. Lisätään noin 10 ml tislattua vettä ja byretillä 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes pH-arvo 20 °C:ssa on 7. Emäksisen nesteen lisääminen on tehtävä hitaasti ja liuosta on sekoitettava koko ajan. Lisätyn 0,1 M NaOH:n millilitramäärä on n. 5.3 Indikaattorititraus (bromtymolisininen) 5.3.1 Esikoe: värimallin määrittäminen Mitataan mittalasiin (4.4) 25 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (3.3) ja 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, joka on valmistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes väri muuttuu sinivihreäksi. Lisätään 5 ml puskuriliuosta (3.1), jonka pH-arvo on 7. 5.3.2 Määritys Mitataan mittalasiin (4.4) 30 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (3.3) ja 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, joka on valmistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes värinmuutos on samanlainen kuin esikokeessa (5.3.1) saatu väri. Lisätyn 0,1 M natriumhydroksidin millilitramäärä on n. 6 TULOSTEN ILMOITTAMINEN 6.1 Laskentamenetelmä 6.1.1 Viinit Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa on: A = 10n Tulos annetaan yhdellä desimaalilla. Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna grammoina viinihappoa litrassa on: A' = 0,075 × A Tulos annetaan yhdellä desimaalilla. 6.1.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut - Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa puhdistettua tiivistettyä rypälemehua: a = 5 × n - Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa kokonaissokereita: A = >NUM>500 ×/ >DEN>n;P P = kokonaissokerien pitoisuus %:eina (m/m). Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla. 6.2 Titrauksen toistettavuus (r) indikaattorilla >TAULUKON PAIKKA> valko-, rosee- ja punaviineille. 6.3 Titrauksen (5.3) uusittavuus (R) indikaattorilla Valko- ja roseeviineille: >TAULUKON PAIKKA> Punaviineille: >TAULUKON PAIKKA> 14 HAIHTUVAT HAPOT 1 MÄÄRITELMÄ Haihtuvat hapot muodostuvat etikkahappoihin kuuluvista hapoista, joita on viinissä sekä vapaina happoina että suoloina. 2 MENETELMÄ Erotetaan haihtuvat hapot viinistä vesihöyrytislauksella ja titrataan tisleestä. Viinistä poistetaan aluksi hiilidioksidi. Näissä koeolosuhteissa tislattava vapaa rikkidioksidi ja sitoutunut rikkidioksidi on vähennettävä tisleen happopitoisuudesta. Mahdollisesti viiniin lisätyn sorbiinihapon pitoisuus on myös vähennettävä. Huomautus: Joissain maissa viinit stabiloidaan ennen määritystä salisyylihapolla, jota löytyy tisleestä. Se on määritettävä ja vähennettävä happopitoisuudesta. Määritysmenetelmä selostetaan tämän luvun 7 kohdassa. 3 REAGENSSIT 3.1 Kiteinen viinihappo (C4H6O6). 3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH). 3.3 1 % fenoliftaleiiniliuos 96 til-% neutraalissa alkoholissa. 3.4 Kloorivetyhappo (ñ20 = 1,18 1,19 g/ml) laimennettu suhteessa 1/4 (v/v). 3.5 0,005 M jodiliuos (I2). 3.6 Kiteinen kaliumjodidi (KI). 3.7 5 g/l tärkkelysliuos: Sekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vettä. Kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen ja annetaan kiehua noin 10 minuuttia; lisätään 200 g natriumkloridia. Täytetään 1 litraksi jäähtymisen jälkeen. 3.8 Kyllästetty natriumboraattiliuos (Na2B4O7, 10H2O), eli noin 55 g/l 20 °C:ssa. 4 VÄLINEISTÖ 4.1 Vesihöyrytislauslaitteisto, johon kuuluu: 1) vesihöyrykehitin: vesihöyryn on oltava hiilidioksidivapaata, 2) tislauskolvi, jossa on putki vesihöyryn johtamiseksi, 3) tislauskolonni, 4) jäähdytin. Tämän laitteen on läpäistävä seuraavat kolme koetta: a) Mitataan tislauskolviin 20 ml keitettyä vettä; kerätään 250 ml tislettä ja lisätään 0,1 ml 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2) ja 2 tippaa fenoliftaleiiniliuosta (3.3); vaaleanpunaisen värin on pysyttävä muuttumattomana vähintään 10 sekunnin ajan (hiilidioksidista vapaa vesihöyry). b) Mitataan tislauskolviin 20 ml 0,1 M etikkahappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä. Titrataan 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2). Käytetyn tilavuuden on oltava vähintään 19,9 ml. (Tislattu etikkahappo ≥ 99,5 %). c) Mitataan tislauskolviin 20 ml 1 M maitohappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä ja titrataan happo 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2). Kulutettu tilavuus saa olla enintään 1,0 ml (tislattu maitohappo ≤ 0,5 %). Mikä tahansa laite tai menetelmä, joka läpäisee nämä kokeet, katsotaan viralliseksi kansainväliseksi laitteeksi tai menetelmäksi. 4.2 Vesivakuumipumppu. 4.3 Vakuumipullo. 5 SUORITUS 5.1 Näytteen valmistaminen hiilidioksidin poistaminen. Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon; koko ajan ravistellen imetään ilma pullosta vesivakuumipumpulla. Ravistelun on kestettävä 1 2 minuuttia. 5.2 Vesihöyrytislaus Mitataan tislauskolviin 20 ml viiniä, josta hiilidioksidi on poistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään noin 0,5 g viinihappoa (3.1). Kerätään vähintään 250 ml tislettä. 5.3 Titraus Titrataan 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2) käyttäen indikaattorina kahta tippaa fenoliftaleiiniliuosta (3.3), käytetty tilavuus on n ml. Lisätään 4 tippaa suhteessa 1/4 laimennettua kloorivetyhappoa (3.4), 2 ml tärkkelysliuosta (3.7) ja muutamia kaliumjodikiteitä (3.6). Titrataan vapaa rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (3.5). Käytetty tilavuus on n' ml. Lisätään kyllästettyä natriumboraattiliuosta (3.8), kunnes vaaleanpunainen väri ilmestyy uudelleen. Titrataan sitoutunut rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (3.5). Käytetty tilavuus on n" ml. 6 TULOSTEN ILMOITTAMINEN 6.1 Laskentamenetelmä Haihtuvat hapot ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa yhdellä desimaalilla ovat: A = 5 (n 0,1 n' 0,05 n") Haihtuvat hapot ilmoitettuna grammoina etikkahappoa litrassa kahdella desimaalilla ovat: 0,300 (n 0,1 n' 0,05 n") 6.2 Toistettavuus (r) >TAULUKON PAIKKA> 6.3 Uusittavuus (R) >TAULUKON PAIKKA> 6.4 Viini, johon on lisätty sorbiinihappoa Koska 250 ml:n tisleeseen saadaan vesihöyrytislauksella 96 % sorbiinihaposta, se on vähennettävä haihtuvista hapoista. Tiedetään, että 100 mg sorbiinihappoa vastaa 0,89 milliekvivalenttia, tai 0,053 g etikkahappoa, ja tunnetaan sorbiinihappopitoisuus, joka on määritetty muilla menetelmillä. 7 SALISYYLIHAPON MÄÄRITTÄMINEN HAIHTUVIA HAPPOJA SISÄLTÄVÄSTÄ TISLEESTÄ 7.1 Periaate Haihtuvien happojen määrittämisen ja rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen, salisyylihappo osoitetaan happamaksi tehdystä liuoksesta rauta(III)suolalla, joka antaa violetin värin. Haihtuvia happoja sisältävään tisleeseen tislautuva salisyylihappo määritetään toisesta tisleestä, jonka tilavuus on sama kuin tisleen, josta haihtuvat hapot on määritetty. Salisyylihappo määritetään tästä tisleestä kolorimetrisellä vertailumenetelmällä. Se on vähennettävä haihtuvat hapot sisältävän tisleen happopitoisuudesta. 7.2 Reagenssit 7.2.1 Kloorivetyhappo (HCl) (ñ20 = 1,18-1,19 g/ml). 7.2.2 0,1 M natriumtiosulfaatti (Na2S2O3, 5H2O). 7.2.3 10 % (m/v) rauta(III)ammoniumsulfaattiliuos [Fe2(SO4)3.(NH4)2SO4 × 24H2O] 7.2.4 0,01 M natriumsalisylaattiliuos. Liuos sisältää 1,60 g/l natriumsalisylaattia (NaC7 H5O3). 7.3 Suoritus 7.3.1 Salisyylihapon tunnistaminen haihtuvia happoja sisältävästä tisleestä Välittömästi haihtuvien happojen määrittämisen ja vapaan ja sitoutuneen rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen lisätään pulloon 0,5 ml kloorivetyhappoa (7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumtiosulfaattiliuosta (7.2.2) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3). Jos salisyylihappoa esiintyy, ilmaantuu violetti väri. 7.3.2 Salisyylihapon määrittäminen Tehdään mainittuun keräyspulloon merkki tisleen tilavuuden kohdalle. Tyhjennetään ja huuhdotaan pullo. Otetaan viinistä uusi 20 ml:n näyte, joka tislataan vesihöyrytislauksella ja kerätään tislettä keräyspullossa olevaan merkkiin asti. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3). Pullon sisältö värjäytyy violetiksi, jos salisyylihappoa esiintyy. Kaadetaan samanlaiseen pulloon tislattua vettä edellisessä pullossa olevan tisleen tasolle. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3). Lisätään byretillä 0,01 M natriumsalisylaattiliuosta (7.2.4), kunnes saadaan saman intensiteetin omaava violetti väri kuin viinitisleen sisältämässä pullossa. Käytetty millilitramäärä on n'". 7.4 Haihtuvien happojen pitoisuuden korjaaminen Vähennetään tilavuus 0,1 × n'" 0,1 M natriumhydroksidiliuoksen n ml tilavuudesta, joka kului, kun haihtuvat hapot titrattiin tisleestä. 15. KIINTEÄT HAPOT 1 PERIAATE Kiinteät hapot määritetään kokonaishappojen pitoisuuden ja haihtuvien happojen pitoisuuden erotuksesta. 2 TULOSTEN ILMOITTAMINEN Kiinteät hapot ilmoitetaan: - milliekvivalentteina litrassa, - grammoina viinihappoa litrassa. 16. VIINIHAPPO 1 PERIAATE 1.1 Vertailumenetelmä Viinihappo saostetaan kalsiumtartraattina ja määritetään gravimetrisesti. Tätä määritystä voidaan täydentää volumetrisellä vertailumenetelmällä. Saostamisolosuhteet: pH, käytetty kokonaistilavuus, saostamisioneiden konsentraatio ovat sellaisia, että raseemisen kalsiumtartraatin saostuminen on täydellinen, kun taas kalsiumD( )tartraatti pysyy liuoksessa. Kun viiniin on lisätty mesoviinihappoa, joka aiheuttaa kalsiumtartraatin epätäydellisen saostumisen, se on hydrolysoitava ennen määritystä. 1.2 Tavanomainen menetelmä Anioninvaihtokolonnissa erotettu viinihappo määritetään eluaatista kolorimetrisesti mittaamalla vanadiinihapolla saatu punainen väri. Tämä eluaatti sisältää myös maito- ja omenahappoja, jotka eivät häiritse määritystä. 2 VERTAILUMENETELMÄ 2.1 Gravimetrinen menetelmä 2.1.1 Reagenssit 2.1.1.1 Kalsiumasetaattiliuos, joka sisältää kalsiumia 10 g/l: >TAULUKON PAIKKA> 2.1.1.2 Kiteytetty kalsiumtartraatti: CaC4O6H4.4H2O: itataan 400 ml:n dekantterilasiin 20 ml L(+)viinihappoliuosta (5 g/l), 20 ml ammoniumD( )tartraattiliuosta (6,126 g/l) ja 6 ml kalsiumasetaattiliuosta, joka sisältää kalsiumia 10 g/l (2.1.1.1). Annetaan saostua kahden tunnin ajan. Kootaan sakka huokoisuudeltaan 4 olevaan lasisintteriin ja pestään se kolmeen kertaan noin 30 ml:lla tislattua vettä. Kuivataan lämpökaapissa 70 °C:n lämpötilassa, kunnes paino pysyy vakiona. Käyttäen mainittuja reagenssimääriä saadaan noin 340 mg kiteistä raseemista kalsiumtartraattia. Säilytetään tulpalla suljetussa pullossa. 2.1.1.3 Saostusliuos (pH 4,75): >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan D( )viinihappo ja lisätään ammoniumhydroksidi; säädetään tilavuus noin 900 ml:ksi; lisätään 8,8 ml kalsiumasetaattiliuosta (2.1.1.1) ja sekoittamisen jälkeen säädetään pH etikkahapolla arvoon 4,75. Täytetään yhdeksi litraksi. Koska raseemista kalsiumtartraattia liukenee niukasti tähän liuokseen, siihen on lisättävä 5 mg raseemista kalsiumtartraattia litrassa, ravistellaan 12 tunnin ajan ja suodatetaan. 2.1.2 Suoritus 2.1.2.1 Viinit, joihin ei ole lisätty mesoviinihappoa Mitataan 600 ml:n dekantterilasiin 500 ml saostusliuosta ja 10 ml viiniä. Sekoitetaan ja aloitetaan saostaminen hieromalla lasin pintaa lasipuikolla. Annetaan saostua 12 tunnin ajan (yön yli). Suodatetaan liuos ja sakka puhtaan vakuumipullon päälle asetetun taaratun huokoisuudeltaan 4 olevan lasisintterin läpi. Huuhdotaan saostusastia suodoksella sen varmistamiseksi, että koko sakka on saatu kerätyksi. Kuivataan lämpökaapissa 70 °C:n lämpötilassa, kunnes paino pysyy vakiona. Punnitaan: p on kiteytyneen, neljä vesimolekyyliä sisältävän kalsiumtartraatin CaC4O6H4 paino. 2.1.2.2 Viinit, joihin on lisätty mesoviinihappoa Määritettäessä viinejä, joihin on lisätty mesoviinihappoa tai joihin epäillään lisätyn mesoviinihappoa, tämä happo hydrolysoidaan seuraavissa olosuhteissa. Mitataan 50 ml:n keittopulloon 10 ml viiniä ja 0,4 ml puhdasta etikkahappoa (CH3COOH, ñ20 = 1,05 g/ml). Yhdistetään pystyjäähdytin pulloon ja kuumennetaan kiehuvaksi 30 minuutissa. Jäähtymisen jälkeen siirretään neste 600 ml:n dekantterilasiin; huuhdotaan pullo 2 kertaa 5 ml:lla vettä ja jatketaan suoritusta edellä k