Komission direktiivi 92/95/ETY, annettu 9 päivänä marraskuuta 1992, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten annetun seitsemännen direktiivin 76/372/ETY liitteen muuttamisesta



Virallinen lehti nro L 327 , 13/11/1992 s. 0054 - 0062

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 45 s. 0182

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 45 s. 0182



KOMISSION DIREKTIIVI 92/95/ETY, annettu 9 päivänä marraskuuta 1992, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten annetun seitsemännen direktiivin 76/372/ETY liitteen muuttamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin 70/373/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna Espanjan ja Portugalin liittymisasiakirjalla, ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että aflatoksiini B1:n määrityksessä käytettävistä menetelmistä säädetään yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 1 päivänä maaliskuuta 1976 annetussa komission seitsemännessä direktiivissä 76/372/ETY(2), sellaisena kuin se on muutettuna direktiivillä 81/680/ETY(3), nämä menetelmät olisi mukautettava tieteen ja tekniikan tietämyksen kehitykseen; olisi erityisesti oltava menetelmä, jolla voidaan tarkastaa hyvin alhaiset aflatoksiinipitoisuudet, jotka on vahvistettu haitallisten aineiden ja tuotteiden suurimmista sallituista pitoisuuksista rehuissa 17 päivänä joulukuuta 1973 annetussa neuvoston direktiivissä 74/63/ETY(4), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 91/132/ETY(5), lisäksi olisi oltava menetelmä aflatoksiini B1:n määrittämiseksi häiritsevien aineiden, kuten sitrushedelmämassan, vaikuttaessa, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Muutetaan direktiivin 76/372/ETY liite tämän direktiivin liitteen mukaisesti. 2 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä lokakuuta 1993. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin, tai niitä virallisesti julkaistaessa niihin on liitettävä viittaus tähän direktiiviin. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään. 3 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 9 päivänä marraskuuta 1992 Komission puolesta Ray MAC SHARRY Komission jäsen (1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2 (2) EYVL N:o L 102, 15.4.1976, s. 8 (3) EYVL N:o L 246, 29.8.1981, s. 32 (4) EYVL N:o L 38, 11.2.1974, s. 31 (5) EYVL N:o L 66, 13.3.1991, s. 16 LIITE I. Korvataan A osassa "Yksisuuntainen ohutlevykromatografinen menetelmä" 1 kohta "Tarkoitus ja soveltamisala" seuraavasti: "1 Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää raaka-aineiden ja suoraan käytettävien rehujen aflatoksiini B1-pitoisuus. Tätä menetelmää ei voida soveltaa sitrushedelmämassaa sisältäviin näytteisiin. Määrityksen alaraja on 0,01 mg/kg (10 ppb). Jos häiritsevät aineet haittaavat määritystä, se on aloitettava alusta käyttäen B menetelmää (suuren erotuskyvyn nestekromatografia)." II. Korvataan B osa "Kaksisuuntainen ohutlevykromatografinen menetelmä" seuraavasti: "B. AFLATOKSIINI B1:N MÄÄRITYS: SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFINEN MENETELMÄ 1 Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää aflatoksiini B1-pitoisuus rehuissa, mukaan lukien sitrushedelmämassaa sisältävät rehut. Määrityksen alaraja on 0,001 mg/kg (1 ppb). 2 Periaate Näyte uutetaan kloroformilla. Uute suodatetaan ja tästä otetaan erä, joka puhdistetaan ensin Florisil-patruunalla ja tämän jälkeen C18-patruunalla. Lopullinen erotus ja määritys suoritetaan suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC) käyttäen C18-käänteisfaasikolonnia ja tämän jälkeen kolonnin jälkeisten jodijohdannaisten valmistus mahdollistaa toteamisen fluoresenssilla. Huomautus: Mykotoksiinit ovat erittäin myrkyllisiä aineita. Niiden käsittely on suoritettava vetokaapissa. Erityisiin varotoimiin on ryhdyttävä niiden ollessa kuivassa muodossa, sillä ne ovat sähköstaattisia ja niillä on taipumus tämän vuoksi levitä työpinnoille. 3 Reagenssit 3.1 Kloroformi, stabiloitu 0,5 1,0 % (w/w) etanolilla. Ks. 10.2. huomautus. 3.2 Metanoli, HPLC-laatua, 3.6 seoksen valmistamiseen. 3.3 Asetoni. 3.4 Asetonitriili, HPLC-laatua. 3.5 Eluointiliuottimet: Valmistetaan käyttöä edeltävänä päivänä tai poistetaan ilma ultraäänikammiossa. 3.5.1 Asetoni (3.3)/vesi -seos, 98 + 2 (v + v). 3.5.2 Vesi/metanoli -seos (3.2), 80 + 20 (v + v). 3.5.3 Vesi/asetoni -seos (3.3), 85 + 15 (v + v). 3.6 Liikkuva faasi HPLC:a varten. Liikkuva faasi koostuu vedestä, metanolista (3.2) ja asetonitriilistä (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v). HUOMAUTUS: Liikkuvan faasin koostumusta voidaan muuttaa käytetyn HPLC-kolonnin erityisominaisuuksien mukaisesti. 3.7 Kylläinen jodiliuos. Lisätään 2 g jodia 400 ml:aan vettä. Sekoitetaan vähintään 90 minuuttia ja suodatetaan kalvosuodattimen (4.15) läpi. Kylläinen liuos on suojattava valolta valohajoamisen estämiseksi. 3.8 Hapolla pesty Celite 545 tai vastaava tuote. 3.9 Florisil-patruuna (Waters SEP-PAK tai vastaava tuote). 3.10 C18-patruuna (Waters SEP-PAK tai vastaava tuote). 3.11 Inertti kaasu, esim. typpi. 3.12 Aflatoksiini B1 -standardiliuos kloroformissa, pitoisuus 10 ìg/ml. Liuoksen pitoisuus tarkistetaan seuraavasti: määritetään liuoksen absorptiospektri välillä 330 370 nm spektrofotometriä (4.23) käyttäen. Mitataan absorbanssi (A) 363 nm:ä lähellä olevan enimmäisabsorption kohdalta. Lasketaan liuoksen aflatoksiini B1 -pitoisuus mikrogrammoina millilitrassa liuosta kaavalla: pitoisuus (ìg/ml) = >NUM>312 × A × 1000/ >DEN>22300 =13,991 × A 3.1.2.1 Aflatoksiini B1:n standardikantaliuos kloroformissa. Siirretään kvantitatiivisesti 2,5 ml aflatoksiini B1 -standardiliuosta (3.12) 50 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti kloroformilla (3.1) Tämä liuos säilytetään alumiinifolioon käärityssä hyvin suljetussa pullossa viileässä (4 °C) ja pimeässä. 3.13 Aflatoksiini B1:n HPLC-standardiliuokset. HUOMAUTUS: Näiden liuosten valmistamiseen on käytettävä hapolla pestyjä lasiastioita (ks. 4 kohta, välineistö). 3.13.1 Standardiliuos 4 ng/ml. Annetaan standardikantaliuosta (3.12.1) sisältävän mittapullon lämmetä alumiinifolioon käärittynä huoneenlämpöiseksi (muutaman tunnin ajan). Siirretään 400 ìl standardikantaliuosta (200 ng aflatoksiini B1:tä) 50 ml:n mittapulloon ja haihdutetaan liuos kuivaksi inertissä kaasuvirrassa (3.11). Liuotetaan saatu jäännös noin 20 ml:aan vesi/asetoni -seosta (3.5.3), täytetään pullon merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella ja sekoitetaan hyvin. 3.13.2 Standardiliuos 3 ng/ml. Siirretään kvantitatiivisesti 7,5 ml standardiliuosta (3.13.1) 10 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3) ja sekoitetaan hyvin. 3.13.3 Standardiliuos 2 ng/ml. Siirretään kvantitatiivisesti 25 ml standardiliuosta (3.13.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3) ja sekoitetaan hyvin. Tätä liuosta käytetään myös standardiliuoksena HPLC-ajon (5.5) injektointien toistoihin. 3.13.4 Standardiliuos 1 ng/ml. Siirretään kvantitatiivisesti 2,5 ml standardiliuosta (3.13.1) 10 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti vesi/asetoni -seoksella (3.5.3) ja sekoitetaan hyvin. 3.14 Ampulli, joka sisältää 1 ml:n seosta, joka koostuu kloroformissa olevista aflatoksiineista B1, B2, G1 ja G2, joiden pitoisuudet ovat vastaavasti noin 1, 0,5, 1 ja 0,5 ìg/ml. 3.14.1 Kromatografisen erottumisen koeliuos. Siirretään ampullin (3.14) sisältö lasitulpalla varustettuun koeputkeen tai pieneen kierrekorkilliseen pulloon. Siirretään 40 ìl tätä liuosta lasitulpalliseen koeputkeen (happopesty) (4.22). Haihdutetaan kloroformi inertissä kaasuvirrassa (3.11) ja liuotetaan uudelleen 10 ml:aan vesi/asetoni -seosta (3.5.3). 3.15 Varmistuskokeen (6) reagenssit. 3.15.1 Kylläinen natriumkloridiliuos. 3.15.2 Vedetön, rakeinen natriumsulfaatti. 4 Välineistö Varoitus:Hapolla pesemätön lasitavara voi aiheuttaa hävikkiä vesipitoisissa aflatoksiiniliuoksissa. On huolehdittava erityisesti uuden lasitavaran ja kertakäyttöisen lasitavaran, kuten automaattisen injektorin pullojen ja Pasteur-pipettien käsittelystä. Tämän vuoksi vesipitoisten aflatoksiini B1-liuosten kanssa kosketukseen joutuvat lasitavarat on upotettava laimeaan happoon (esimerkiksi rikkihappo, 2 mol/l) usean tunnin ajaksi ja huuhdeltava tämän jälkeen hyvin tislatulla vedellä kaiken jäljellä olevan hapon poistamiseksi (esimerkiksi kolme kertaa, tarkastus pH-paperilla). Tämä käsittely on käytännössä suoritettava pyöreäpohjaiselle keittopullolle (4.4), mittapulloille, mittalaseille, pulloille tai putkille, joita käytetään standardiliuoksia ja lopullisia uutteita varten (erityisesti automaattisen injektorin pulloille), ja Pasteur-pipeteille, jos niitä käytetään standardiliuosten tai uutteiden siirtoon. 4.1 Jauhatus-sekoituslaite. 4.2 Seula, jonka silmäkoko on 1,0 mm (ISO R 565). 4.3 Mekaaninen ravistelija. 4.4 Pyöröhaihdutin ja 150 250 ml:n pyöreäpohjaisia keittopulloja. 4.5 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jonka injektorissa on 250 ìl:n injektioon soveltuva silmukka. Silmukan osittainen tai täydellinen täyttö on selitetty valmistajan toimittamissa ohjeissa. 4.6 HPLC-kolonni, joka on täytetty 3 ìm:n tai 5 ìm:n C18-hiukkasilla. 4.7 Pulssiton pumppu kolonnin jälkeisen jodireagenssin annosteluun. 4.8 Ruostumattomasta teräksestä valmistettu T-yhde (1/16" × 0,75 mm), jossa ei ole kuollutta tilavuutta. 4.9 Reaktiokierukka, teflonia tai ruostumatonta terästä. Kooltaan 3 000 × 0,5 mm - 5 000 × 0,5 mm olevia kierukoita voidaan käyttää 5 ìm:n tai 3 ìm:n HPLC-kolonnien kanssa. 4.10 Termostaattisesti säädeltävä 60 °C:seen säädetty vesihaude, jonka lämpötilan säädettävyys on vähintään 0,1 °C. 4.11 Fluoresenssidetektori, jossa eksitaatioaallonpituutena on 365 nm ja emissioaallopituutena 435 nm (suodatinlaitteissa emissioaallonpituus > 400 nm). Vähintään 0,05 ng aflatoksiini B1:tä on oltava mahdollista havaita. Läpivirtauskyvettiin muodostuvien ilmakuplien poistamiseksi on suositeltavaa muodostaa tietty vastapaine (esimerkiksi käyttäen paineensäädintä tai teflonista tai ruostumattomasta teräksestä valmistettua detektorin ulostuloaukkoon yhdistettyä kierukkaa). 4.12 Piirturi. 4.13 Elektroninen integraattori (vaihtoehtoinen laite). 4.14 Halkaisijaltaan 24 cm oleva laskostettu suodatinpaperi, Macherey-Nagel 617 1/4 tai vastaava. 4.15 Huokoisuudeltaan 0,45 ìm oleva kalvosuodatin, Millipore HAWP 04700 tai vastaava. 4.16 Vetoisuudeltaan 500 ml oleva tulpallinen erlenmeyerkolvi. 4.17 Luer-liittimellä varustettu lasikolonni (sisähalkaisija noin 1 cm, pituus noin 30 cm). 4.18 Kloroformia kestävä Luer-liittimellä varustettu hana (esim. Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 tai vastaava). 4.19 Vetoisuudeltaan 10 ml oleva kemikaaleja kestävä Luer-liittimellä varustettu ruisku. 4.20 Vetoisuudeltaan 250 ìl oleva HPLC-injektointiin sopiva ruisku (ks. 4.5). 4.21 Vetoisuudeltaan 100 ìl oleva mikroruisku standardiliuosten valmistamiseen (tarkastetaan punnitsemalla, että tarkkuus on 2 %:n rajoissa). 4.22 Tulpalla ja 10 ml:n asteikolla varustettuja koeputkia. 4.23 Spektrofotometri, jota voidaan käyttää absorptiospektrin UV-alueella. 4.24 Varmistuskokeeseen (6) tarvittava välineistö. 4.24.1 Hapolla huuhdeltu 100 ml:n erotussuppilo, jossa teflonhana. 4.24.2 Lämpöblokki, 40 50 °C. 5 Menettely 5.1 Näytteen esikäsittely Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee seulan (4.2.). 5.2 Näytteenotto Punnitaan 50,0 g tällä tavoin esikäsiteltyä näytettä erlenmeyerkolviin (4.16). 5.3 Uutto Lisätään näytteeseen (5.2) 25 g Celiteä (3.8), 250 ml kloroformia (3.1) ja 25 ml vettä. Suljetaan pullo ja ravistellaan 30 minuuttia mekaanisella ravistelijalla (4.3). Suodatetaan laskostetun suodatinpaperin (4.14) läpi. Kerätään 50 ml suodosta. Tarvittaessa otetaan suodoksesta osanäyte, joka laimennetaan 50 ml:ksi kloroformilla siten, että aflatoksiini B1 -pitoisuus ei ylitä 4 ng/ml. 5.4 Puhdistus (toimenpiteet on tehtävä ilman merkittäviä keskeytyksiä) Varoitus: - laboratorio, jossa määritykset suoritetaan, on suojattava päivänvalolta. Tämä voidaan toteuttaa käyttäen: 1) ikkunoissa UV-säteilyä absorboivaa kalvoa sekä himmentämällä valoa (ei suoraa auringonvaloa); 2) verhoja tai pimennyskaihtimia sekä keinovaloa (fluoresoivat loisteputket ovat hyväksyttäviä); - Aflatoksiinia sisältävät liuokset on suojattava valolta mahdollisimman hyvin (ne on säilytettävä pimeässä ja peitettävä alumiinifoliolla). 5.4.1 Florisil SEP-PAK -puhdistus 5.4.1.1 Kolonni-patruuna-yhdistelmän esikäsittely Liitetään hana (4.18) Florisil-patruunan (3.9) lyhyempään liitososaan (ks. kuva 1). Pestään patruuna ja poistetaan ilma käyttäen 10 ml kloroformia (3.1) josta 8 ml painetaan nopeasti ruiskulla (4.19) hanan kautta patruunan läpi. Patruunan pidempi liitososa kiinnitetään lasikolonniin (4.17) ja jäljellä oleva 2 ml:n erä kloroformia johdetaan patruunan läpi kolonniin. Suljetaan hana. Poistetaan ruisku. 5.4.1.2 Puhdistus Kohdassa 5.3. kerätty suodos johdetaan kolonni-patruuna -yhdistelmään ja annetaan imeytyä painovoiman avulla. Huuhdellaan 5 ml:lla kloroformia (3.1) ja tämän jälkeen 20 ml:lla metanolia (3.2). Heitetään eluaatit pois. Näiden toimenpiteiden aikana on huolehdittava siitä, että kolonni -patruuna -yhdistelmä ei pääse kuivumaan. Aflatoksiini B1 eluoidaan 40 ml:lla asetoni/vesi -seosta (3.5.1) ja koko eluaatti kerätään talteen pyöröhaihduttajan (4.4) pyöreäpohjaiseen keittopulloon. Väkevöidään eluaatti pyöröhaihduttajassa 40 50 °C:n lämpötilassa kunnes asetonia ei enää tislaudu. (Huomautus: Tässä vaiheessa nestettä jää pulloon noin 0,5 ml. Kokemus on osoittanut, että lisähaihdutus ei ole haitaksi ja että jos nestettä jää 0,5 ml, asetonia ei ole enää merkittäviä määriä jäljellä. Asetonijäämät voivat aiheuttaa aflatoksiini B1:n hävikkiä C18-patruunalla). Lisätään 1 ml metanolia (3.2), ravistellaan pulloa aflatoksiini B1:n liuottamiseksi, lisätään 4 ml vettä ja sekoitetaan. Irrotetaan patruuna ja heitetään se pois. Huuhdellaan lasikolonni vedellä ja säästetään se C18-puhdistusta varten. 5.4.2 C18-SEP-PAK -puhdistus 5.4.2.1. Kolonni-patruuna-yhdistelmän esikäsittely. Liitetään hana (4.18) C18-patruunan lyhyempään liitososaan (3.10) (ks. kuva 1). Huuhdellaan patruuna ja poistetaan ilma painaen 10 ml metanolia (3.2) nopeasti ruiskulla (4.19) hanan kautta patruunaan (patruunassa olevat ilmakuplat näkyvät vaaleina laikkuina harmahtavaa taustaa vasten). Otetaan 10 ml vettä ja injektoidaan 8 ml:n erä patruunan läpi (siirryttäessä metanolista veteen on vältettävä ilman pääsyä patruunaan). Patruunan pidempi liitososa kiinnitetään lasikolonniin (4.17) ja jäljellä oleva 2 ml vettä johdetaan patruunan läpi kolonniin. Suljetaan hana. Poistetaan ruisku. 5.4.2.2 Puhdistus Siirretään kohdassa 5.4.1.2. kerätty uute kvantitatiivisesti kolonniin (4.17), huuhdellaan pullo kaksi kertaa 5 ml:lla vesi/metanoli -seosta (3.5.2) ja annetaan sen imeytyä painovoiman avulla. Näiden toimenpiteiden aikana on huolehdittava siitä, että kolonni-patruuna -yhdistelmä ei pääse kuivumaan. (Jos patruunan viereiseen kavennukseen kehittyy ilmakuplia, virtaus on pysäytettävä ja lasikolonnin yläosaa on naputeltava kevyesti ilmakuplien poistamiseksi. Tämän jälkeen jatketaan suoritusta). Eluoidaan 25 ml:lla vesi/metanoli -seosta. Heitetään eluaatit pois. Aflatoksiini B1 eluoidaan 50 ml:lla vesi/asetoni -seosta (3.5.3) ja koko eluaatti kerätään talteen 50 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan: tällä tavoin saatu koeliuos käytetään kromatografiaan (5.5). Varoitus: Lopullisen uutteen suodatus ennen injektointia HPLC:in ei yleensä ole tarpeen. Jos tämä katsotaan tarpeelliseksi, on vältettävä selluloosasuodattimia, koska ne voivat johtaa aflatoksiini B1:n hävikkiin. Teflonsuodattimet ovat hyväksyttäviä. 5.5 Suuren erotuskyvyn nestekromatografia (Laitteiston kokoonpano esitetään kuvassa 2). Laitteiden käyttökuntoon saattamiselle ja stabiloitumiselle on varattava riittävästi aikaa. Huomautus 1 Liikkuvan faasin ja kolonnin jälkeisen reagenssin virtausnopeudet ovat vain ohjeellisia. Niitä voidaan muuttaa HPLC-kolonnin erityisominaisuuksien mukaisesti. Huomautus 2 Aflatoksiini B1:n vaste riippuu lämpötilasta. Tämän vuoksi on tehtävä ryömintää korjaava kompensointi (ks. kuva 3). Injektoimalla määrätty määrä standardiliuosta (3.13.3) säännöllisin välein (esimerkiksi joka kolmas injektio) näiden referenssistandardien väliset aflatoksiini B1:n piikkien arvot voidaan korjata käyttäen vasteiden keskiarvoa. Peräkkäisten standardiliuosten välisten erojen on oltava hyvin pieniä ( 400 nm). Säädetään detektorin herkkyys siten, että piirturin poikkeamaksi saadaan noin 80 % täydestä asteikosta 1 ng:lla aflatoksiini B1:tä. 5.5.4 Injektori Kaikkia liuoksia injektoidaan 250 ìl injektorin valmistajan ohjeiden mukaisesti. 5.5.5 Kromatografisen erottumisen tarkistus Injektoidaan kromatografisen erottumisen koeliuos (3.14.1). Piikkien välisten käännepisteiden korkeuden on oltava alle 5 % viereisten piikkien korkeuksien summasta. 5.5.6 Järjestelmän stabiilisuuden tarkistus Ennen kutakin määrityssarjaa injektoidaan referenssistandardia (3.13.3) useita kertoja kunnes piikkien pinta-alat eivät muutu (Huomautus: Kahden peräkkäisen injektion aflatoksiini B1 -piikit eivät saa poiketa toisistaan yli 6 %). Suoritusta jatketaan välittömästi lineaarisuuden tarkistuksella (5.5.7). 5.5.7 Lineaarisuuden tarkistus Injektoidaan aflatoksiini B1 -standardiliuoksia (3.13.1 3.13.4). Käytetään joka kolmantena injektiona referenssistandardia (3.13.3) vasteissa esiintyvän ryöminnän korjaamiseksi (Huomautus: Referenssistandardien piikkien vasteet eivät saa poiketa toisistaan yli 10 %:a 90 minuutin aikana). Ryömintä korjataan 7 kohdassa esitetyn kaavan mukaisesti. Kalibrointikäyrän on oltava lineaarinen ja kuljettava origon kautta Y-estimaatin kaksinkertaisen keskivirheen rajoissa. Havaitut arvot eivät saa poiketa yli 3 %:a nimellisarvoista. Jos nämä edellytykset täyttyvät, suoritusta jatketaan keskeytyksettä. Jos näin ei ole, on selvitettävä ongelman syy ja tehtävä tarpeelliset korjaukset ennen suorituksen jatkamista. 5.5.8 Näyteuutteiden injektio Injektoidaan puhdistetut uutteet (5.4.2.2.). Joka toisen näyteuuteinjektion jälkeen injektoidaan uudelleen referenssistandardia (3.13.3) käyttäen seuraavaa jaksotusta: referenssistandardi, uute, uute, referenssistandardi, uute, uute, referenssistandardi jne. 6 Varmistuskoe 6.1 Uutteen (5.4.2.2) jatkokäsittely Lisätään 5 ml natriumkloridiliuosta (3.15.1) 5.4.2.2. kohdassa saatuun lopulliseen uutteeseen. Uutetaan erotussuppilossa (4.24.1) kolme kertaa minuutin ajan käyttäen 2 ml kloroformia (3.1). Suodatetaan saatu kloroformiuute noin 1 g:n suuruisen natriumsulfaatti (3.15.2) -kerroksen läpi 10 ml:n koeputkeen. Tähän voidaan käyttää pientä halkaisijaltaan 4 cm olevaa suppiloa, jonka kaulaan on asetettu lasivillatuppo ja tämän päälle noin 1 g natriumsulfaattia (3.15.2). Natriumsulfaattikerros pestään muutamalla millilitralla kloroformia ja pesunesteet kerätään samaan koeputkeen. Kloroformiuute haihdutetaan kuivaksi samassa koeputkessa käyttäen lämpöblokkia (4.24.2) ja jäännös liuotetaan uudelleen 1 ml:aan kloroformia. 6.2 Johdannaisen valmistaminen ja ohutlevykromatografia Ks. neuvoston direktiivi 76/372/ETY, liite, A menetelmä, 5.6.2. kohta. 7 Tulosten laskeminen Näytteessä olevan aflatoksiini B1:n pitoisuus lasketaan käyttäen kaavaa: aflatoksiini B1:n pitoisuus (ìg/kg) = >NUM>m × Vuute/ >DEN>Vm × M × >NUM>Vs/ >DEN>Vk jossa: m = näytteen alfatoksiini B1:n piikkiä vastaava aflatoksiini B1:n määrä nanogrammoina laskettuna seuraavasti: m = >NUM>P(näyte)/ >DEN>P(st1) + P(st2) × 2r(st) >TAULUKON PAIKKA> Jos määritys suoritetaan tämän ohjeen mukaisesti, kaava supistuu muotoon: aflatoksiini B1:n pitoisuus (ìg/kg) = 20 x m. 7.1 Laskutoimitukset voidaan suorittaa myös käyttäen piikkien korkeuksia. 8 Toistettavuus Ks. 10.1 kohta. 9 Uusittavuus Ks. 10.1 kohta. 10 Huomautukset 10.1 Toistotarkkuus Kansainvälisellä tasolla rehuseoksista suoritetussa yhteistutkimuksessa(1) saatiin seuraavat taulukossa 1 esitetyt toistettavuus- ja uusittavuustulokset. Tässä käytetty ilmaisu toistettavuus (r) määritellään suurimmaksi lukusuhteeksi, joka ei ole merkitsevä 95 % todennäköisyydellä verrattaessa samasta näytteestä samassa laboratoriossa ja samanlaisissa koeolosuhteissa saatua kahta tulosta toisiinsa. Ilmaisu uusittavuus (R) määritellään samoin verrattaessa kahdessa eri laboratoriossa saatuja tuloksia. Standardin ISO 3534 1977 2.35 kohdan(2) ja komission päätöksen 89/610/ETY(3) mukaisesti r ja R esitetään taulukossa 1 myös variaatiokertoimina. >TAULUKON PAIKKA> 10.2 Kloroformin (3.1) stabilointi Florisil-patruunan adsorption erityisominaisuuksia voidaan muuttaa, jos käytetään muita stabilointiaineita kuin etanolia. Tämä on varmistettava 10.3 kohdan mukaiseksi, jos kuvattua kloroformia ei ole saatavissa. 10.3 Tarkkuus Menetelmän oikea soveltaminen on varmistettava suorittamalla kaksoismittaukset varmistetuilla referenssiaineilla. Jos niitä ei ole saatavissa, menetelmän toimivuus on varmistettava takaisinsaantokokeilla, joissa nollanäytteisiin on lisätty tutkittavaa yhdistettä. Keskiarvon ja todellisen arvon välinen poikkeama, ilmoitettuna prosentteina todellisesta arvosta, ei saa olla rajojen -20 % ja + 10 % ulkopuolella. >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> (1) Van Egmond, H. P., Heisterkamp, S. H. ja Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17 29 (2) ISO 3534 1977 (3) EYVL N:o L 351, 2.12.1989, s. 39 "