LIITE XX

Menetelmä vahojen, rasvahappojen etyyliestereiden ja rasvahappojen metyyliestereiden pitoisuuksien määrittämiseksi kapillaarikaasukromatografian avulla

1. TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuudet oliiviöljyissä. Vahat ja alkyyliesterit eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän perusteella. Menetelmää suositellaan käytettävän välineenä oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn erottamiseksi toisistaan sekä ekstra-neitsytoliiviöljyn laatuparametrina, jonka avulla voidaan havaita, onko ekstra-neitsytoliiviöljyyn vilpillisesti sekoitettu heikompilaatuisia öljyjä (neitsyt- tai lamppuöljyjä tai eräitä hajuttomiksi tehtyjä öljyjä).

2. PERIAATE

Öljy, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa. Koeolosuhteissa eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triasyyliglyserolien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3. LAITTEISTO

3.1. Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2. Lasikolonni nestekromatografiaa varten, sisähalkaisija 15 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3. Kaasukromatografi, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon kuuluu kolonniin suoraan injektointia varten sellainen järjestelmä, jonka osat ovat:

3.3.1. Termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni

3.3.2. Kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin

3.3.3. Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin

3.3.4. Integroiva piirturi (Huomautus 1), joka sopii käytettäväksi muuntaja-vahvistimen (kohta 3.3.3) kanssa.

Huomautus 1: Voidaan käyttää myös tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot syötetään tietokoneen avulla.

3.3.5. Kvartsilasinen kapillaarikolonni (vahojen sekä metyyli- ja etyyliesterien määrittämiseksi), jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nestefaasilla (Huomautus 2) siten, että nestekerroksen paksuus on tasaisesti 0,10–0,30 μm (Huomautus 2).

Huomautus 2: Soveltuvia kaupallisia nestefaaseja ovat muun muassa SE52, SE54, jne.

3.4. Mikroruisku, 10 μl, jossa on karkaistu neula, jonka avulla näyte voidaan injektoida suoraan kolonniin.

3.5. Sähkökäyttöinen ravistelija.

3.6. Pyöröhaihdutin

3.7. Muhveliuuni

3.8. Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg

3.9. Tavanomaiset laboratorion lasivälineet.

4. REAGENSSIT

4.1. Silikageeli, 60–200 μm mesh. Silikageeli pannaan muhveliuuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenisoimiseksi ja säilytetään eksikkaattorissa vähintään 12 tunnin ajan ennen käyttöä.

4.2. n-heksaani, kromatografialaatua tai jäämien määritykseen soveltuvaa laatua (puhtausaste on tarkistettava).

VAROITUS: Höyryt ovat herkästi syttyviä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Haitallista hengitettynä: voi vahingoittaa hermosoluja. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Tarvittaessa on käytettävä asianmukaisia hengityssuojaimia. Varottava aineen joutumista silmiin tai iholle.

4.3. Etyylieetteri, kromatografialaatua.

VAROITUS: Erittäin helposti syttyvä ja kohtalaisen myrkyllinen. Ärsyttää ihoa. Haitallista hengitettynä. Saattaa aiheuttaa silmävaurioita. Vaikutukset voivat ilmaantua viipeellä. Saattaa muodostua räjähtäviä peroksideja. Höyryt voivat syttyä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Ei saa haihduttaa kuivaksi tai lähes kuivaksi. Veden tai muun sopivan aineen lisäys vähentää peroksidien muodostumista. Ei saa niellä. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta.

4.4. n-heptaani, kromatografialaatua, tai iso-oktaani.

VAROITUS: Syttyvää. Haitallista hengitettynä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta.

4.5. Lauryyliarakidaatin standardiliuos (Huomautus 3), 0,05 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi vahoille).

Huomautus 3: Voidaan käyttää myös palmityylipalmitaattia, myristyylistearaattia tai lauryyliarakidaattia.

4.6. Metyyliheptadekanoaatin standardiliuos, 0,02 % (m/V) heksaanissa (sisäinen standardi metyyli- ja etyyliestereille).

4.7. Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.8. Kantajakaasut: vety tai helium, puhdasta kaasukromatografista laatua.

VAROITUS

Vety. Erittäin helposti syttyvä puristettuna. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä tai sähkölaitteista, joita ei ole valmistettu syttymättömistä materiaaleista. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni aina, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vetyä ei saa siirtää pullosta toiseen. Kaasua ei saa sekoittaa pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää.

Helium. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Se pienentää hengitettävän hapen määrää. Pullo on pidettävä suljettuna. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varastointitiloihin, jotka eivät ole asianmukaisesti tuuletettuja, ei pidä mennä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Ei saa hengittää. Käytetään yksinomaan teknisiin tarkoituksiin.

4.9. Apukaasut:

— Vety, puhdasta kaasukromatografista laatua.

— Paineilma, puhdasta kaasukromatografista laatua.

VAROITUS

Paineilma. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Käytettävä varoen syttyvien aineiden lähistöllä, sillä useimpien paineilman sisältämien orgaanisten yhdisteiden itsesyttymislämpötila on suuressa paineessa huomattavasti alhaisempi. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Älä sekoita kaasua pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Teknisiin tarkoituksiin tarkoitettua paineilmaa ei saa käyttää hengittämiseen tai hengityslaitteissa.

5. MENETTELY

5.1. Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (kohta 4.1) n-heksaaniin (kohta 4.2) ja lisätään kolonniin (kohta 3.2). Annetaan laskeutua itsestään. Autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla, jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Valutetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan analyysivaa’alla (kohta 3.8) tarkasti noin 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (kohta 3.1) ja lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (kohta 4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkki: oliiviöljyyn lisätään lauryyliarakidaattia 0,1 mg ja oliivin puristemassaöljyyn 0,25–0,50 mg, tai oliiviöljyihin (kohta 4.6) 0,05 mg metyyliheptadekanoaattia.

Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin.

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorbentin pinnan yläpuolella. Valutetaan vielä n-heksaani/etyylieetteriseosta (suhde 99:1) ja kerätään 220 ml valumisnopeuden ollessa noin 15 pisaraa 10 sekunnissa. (Tämä jae sisältää metyyli- ja etyyliestereitä ja vahoja). (Huomautus 4) (Huomautus 5).

Huomautus 4: N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.

Huomautus 5: Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti voidaan näyteliuokseen lisätä 100 μl 1-prosenttista Sudan 1 -väriainetta eluutioliuoksessa. Väriaineen retentioaika on vahojen ja triasyyliglyserolien retentioaikojen välissä. Eluointi on keskeytettävä, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa, kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml poistetaan heikon typpivirtauksen avulla. Kerätään metyyli- ja etyyliestereitä sisältävä jae 2–4 ml:lla n-heptaania tai iso-oktaania.

5.2. Kaasukromatografinen analyysi

5.2.1. Esivalmistelut

Kolonni liitetään kaasukromatografiin (kohta 3.3) siten, että injektioportti yhdistetään on-column -järjestelmään ja ulostulo detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toimivuus (kaasusilmukoiden kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän tehokkuus jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin esikäsiteltävä. Kolonnin läpi johdetaan kevyt kaasuvirtaus ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain, kunnes lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een.

Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään 2 tunnin ajan. Sen jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (kohta 3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin säätö jne.). Signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä tarvitaan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen viasta. Positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä esikäsittelystä.

5.2.2. Toimintaolosuhteiden valinta vahoille sekä metyyli- ja etyyliestereille (Huomautus 6)

Kromatografia tehdään yleensä seuraavissa käyttöolosuhteissa:

— Kolonnin lämpötila: 20 °C minuutissa 5 °C minuutissa

aluksi 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

— Detektorin lämpötila: 350 °C

— Injektoidun aineen määrä: 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml)

— Kantajakaasu: helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarisella nopeudella (ks. lisäys A)

— Laitteen herkkyys: siten, että edellä mainitut edellytykset täyttyvät.

Huomautus 6: Koska loppulämpötila on korkea, positiivinen ryömintä sallitaan, mutta se saa olla enintään 10 % huippuarvosta.

Kyseisiä käyttöolosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat ja rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterit saadaan erotettua ja piikkien erotus on riittävä (ks. kuvat 2, 3 ja 4) ja jotta sisäisen lauryyliarakidaattistandardin retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Vahojen edustavimman piikin on oltava yli 60 % huippuarvosta; metyyli- ja etyyliestereiden osalta käytettävän sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin on saavutettava huippuarvo.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että haluttujen piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

5.3. Määritys

10 μl:n mikroruiskuun vedetään 10 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti. Noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat tai stigmastadieenit (riippuen analysoitavasta jakeesta) ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4. Piikkien tunnistus

Piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen, joiden retentioajat tunnetaan, seoksiin. Alkyyliesterit tunnistetaan oliiviöljyjen tärkeimpien rasvahappojen (palmitiini- ja oleiinihappo) metyyli- ja etyyliesterien perusteella.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia. Kuvissa 2 ja 3 on kahden vähittäismyytävän ekstra-neitsytoliiviöljyn kromatogrammit; ensimmäinen metyyli- ja etyyliesterien kanssa ja toinen ilman niitä. Kuvassa 4 on kromatogrammit huippulaatuisesta ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä.

5.5. Vahojen kvantitatiivinen määritys

Sisäisen lauryyliarakidaattistandardin ja C 40 – C 46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Kokonaisvahapitoisuus (mg/kg rasvaa) lasketaan muodostamalla yksittäisten vahojen summa seuraavasti:

jossa:

Ax = kunkin esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna As = sisäisen lauryyliarakidaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna ms = lisätyn sisäisen lauryyliarakidaattistandardin massa milligrammoina m = määritettävän näytteen massa grammoina.

5.5.1. Metyyli- ja etyyliesterien kvantitatiivinen määritys

Sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin, C16- ja C18-rasvahappojen metyyliesterien ja C16- ja C18-rasvahappojen etyyliesterien piikkien pinta-alat määritetään integraattorin avulla.

Lasketaan kunkin alkyyliesterin pitoisuus (mg/kg rasvaa) seuraavasti:

jossa:

Ax = kunkin C16- ja C18-esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna As = sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna ms = lisätyn sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin massa milligrammoina m = määritettävän näytteen massa grammoina.

6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n (Huomautus 7) eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa.

Ilmoitetaan C16–C18-rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterien pitoisuuksien summa ja molempien yhteismäärä.

Tulokset ilmoitetaan mg/kg:n tarkkuudella.

Huomautus 7: Piikkien pinta-aloista määritetään niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, liitteenä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivin puristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.

Ilmoitetaan etyyli- ja metyyliesterien välinen suhde.

Kuva 1

Esimerkki oliiviöljyn vahajakeen kaasukromatogrammista (1)

Kuva 2

Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat neitsytoliiviöljyssä

Kuva 3

Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat ekstra-neitsytoliiviöljyssä

Kuva 4

Kromatogrammit ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä