Komission asetus (EY) N:o 1459/98, annettu 8 päivänä heinäkuuta 1998, voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuuden määrittämisen vertailumenetelmästä



Virallinen lehti nro L 193 , 09/07/1998 s. 0016 - 0019



KOMISSION ASETUS (EY) N:o 1459/98, annettu 8 päivänä heinäkuuta 1998, voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuuden määrittämisen vertailumenetelmästä EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjestelystä 27 päivänä kesäkuuta 1968 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 804/68 (1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 1587/96 (2), ja erityisesti sen 6 artiklan 6 kohdan ja 12 artiklan 3 kohdan, sekä katsoo, että voin myynnistä alennettuun hintaan sekä konditoriatuotteiden, jäätelöiden ja muiden elintarvikkeiden valmistukseen tarkoitetulle kermalle, voille ja voiöljylle myönnettävästä tuesta 15 päivänä joulukuuta 1997 annetussa komission asetuksessa (EY) N:o 2571/97 (3) säädetään merkkiaineiden lisäämisestä kermaan, voihin ja voiöljyyn tietyissä olosuhteissa sen varmistamiseksi, että kyseisiä tuotteita käytetään lopputuotteisiin oikealla tavalla, järjestelmän moitteettoman toiminnan ja siihen osallistuvien toimijoiden yhtäläisen kohtelun varmistamiseksi on aiheellista ottaa käyttöön asetuksessa (EY) N:o 2571/97 säädettyjen merkkiaineiden määrittämistä koskevat yhteiset menetelmät, tällaisen vertailumenetelmien vahvistaminen samanaikaisesti kaikille merkkiaineille on vaikeaa; voiöljyn, voin ja kerman vanilliinipitoisuuden määrittämisessä sovellettavan vertailumenetelmän vahvistaminen on kehitysaskel tähän suuntaan, ja tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat maito- ja maitotuotealan hallintokomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla Liitteessä kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voiöljyn, voin ja kerman vanilliinipitoisuutta asetuksen (EY) N:o 2571/97 mukaisesti. Voiöljy, voi ja kerma on merkitty asetuksen (EY) N:o 2571/97 mukaisesti, jos saadut tulokset vastaavat liitteen 8 kohdan vaatimuksia. 2 artikla Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Sitä sovelletaan 1 päivästä syyskuuta 1998. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 8 päivänä heinäkuuta 1998. Komission puolesta Franz FISCHLER Komission jäsen (1) EYVL L 148, 28.6.1968, s. 13 (2) EYVL L 206, 16.8.1996, s. 21 (3) EYVL L 350, 20.12.1997, s. 3 LIITE Voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuuden määrittäminen HPLC-menetelmällä 1. Tarkoitus ja soveltamisala Tässä kuvataan menetelmä vanilliinin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voiöljystä, voista tai kermasta. Sitä voidaan soveltaa asetuksen (EY) N:o 2571/97 mukaisesti otettuihin näytteisiin. 2. Periaate Tietynsuuruinen näyte uutetaan isopropanoli/etanoli/asetonitriili -seoksella (1:1:2). Pääosa rasvasta saostetaan jäähdyttämällä -15 °C - -20 °C:een välillä, minkä jälkeen näyte sentrifugoidaan. Laimennetaan vedellä, minkä jälkeen määritetään vanilliinipitoisuus HPLC-menetelmällä. 3. Välineet Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat: 3.1 Pakastin, lämpötilansäätö välillä -15 °C - -20 °C 3.2 2 ml:n kertakäyttöruiskuja 3.3 Kalvosuodattimia, huokoskoko 0,45 ìm, joka kestää 5 % uuttoliuosta (4.4) sisältävää liuosta. 3.4 Nestekromatografi, johon kuuluu pumppu (virtaus 1,0 ml/min), injektiolaite (tilavuus 20 ìl, käsikäyttöinen tai automaattinen), UV-detektori (aallonpituus 306 nm, 0,01 AU täysi asteikko), piirturi tai integraattori ja 25 °C:een termostoitu kolonni. 3.5 HPLC-kolonni (pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,6 mm) pakattu LiChrosper RP 18:lla (Merck, 5 ìm) tai vastaavalla 3.6 Esikolonni (pituus noin 20 mm, sisähalkaisija 3 mm) kuivapakattu Perisorb RP 18:lla (30-40 ìm) tai vastaavalla. 4. Reagenssit Kaikkien käytettävien reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa. 4.1 Isopropanoli 4.2 Etanoli 96 % (v/v) 4.3 Asetonitriili 4.4 Uuttoliuos Sekoitetaan isopropanoli (4.1), etanoli (4.2) ja asetonitriili (4.3) suhteessa 1:1:2 (V/V). 4.5 Vanilliini (4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydi) 4.5.1 Vanilliinin kantaliuos (=500 ìg/ml) Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 50 mg (CM mg) vanilliinia (4.5) 100 ml:n mittapulloon, lisätään 25 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. 4.5.2 Vanilliinin standardiliuos (=10 ìg/ml). Pipetoidaan 5 ml vanilliinin kantaliuosta (4.5.1) 250 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. 4.6 Metanoli, HPLC-laatu 4.7 Jääetikka 4.8 Vesi, HPLC-laatu 4.9 HPLC-liikkuva faasi Sekoitetaan 300 ml metanolia (4.6), noin 500 ml vettä (4.8) ja 20 ml etikkahappoa (4.7) 1 000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä (4.8). Suodatetaan 0,45 ìm:n suodattimen läpi. 5. Menettely 5.1 Testinäytteen valmistelu 5.1.1 Voi Lämmitetään näytettä kunnes se alkaa sulaa. Varotaan lämpötilan kohoamista paikallisesti yli 40 °C:een. Kun näyte on tarpeeksi juokseva, homogenoidaan ravistamalla. Sekoitetaan voita 15 sekunnin ajan ennen näytteen ottamista. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g (SM g) voita 100 ml:n mittapulloon. 5.1.2 Voiöljy Juuri ennen näytteenottoa pidetään voiöljyä sisältävää astiaa 40-50 °C:ssa lämpökaapissa kunnes öljy on sulanut täysin. Sekoitetaan näyte pyörivällä liikkeellä tai sekoittamalla välttäen liian voimakkaasta sekoittamisesta aiheutuvia ilmakuplia. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 4 g (SM g) voiöljyä 100 ml:n mittapulloon. 5.1.3 Kerma Lämmitetään näyte vesihauteessa tai lämpökaapissa 35-40 °C lämpötilassa. Sekoitetaan tasaiseksi pyörivällä liikkeellä tai sekoittamalla. Jäähdytetään näyte nopeasti 20 ± 2 °C:seen. Jollei näyte ole homogeeninen, toistetaan sama menettely. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 10 g (SM g) kermaa 100 ml:n mittapulloon. 5.2 Testiliuoksen valmistus Lisätään noin 75 ml uuttoliuosta (4.4) testiannokseen (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3), sekoitetaan tai ravistellaan voimakkaasti noin 15 minuutin ajan ja täytetään merkkiin uuttoliuoksella (4.4). Siirretään noin 10 ml tätä uutetta tulpalla varustettuun koeputkeen. Sijoitetaan koeputki pakastimeen (3.1) noin 30 minuutiksi. Sentrifugoidaan kylmää uutetta 5 minuuttia noin 2 000 kierrosta minuutissa ja dekantoidaan viipymättä. Annetaan dekantoidun liuoksen jäähtyä huoneenlämpöiseksi. Pipetoidaan 5 ml dekantoitunutta liuosta 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan osa siitä kalvosuodattimen läpi (3.3). Suodos on valmis HPLC-määritykseen. 5.3 Kalibrointi Pipetoidaan 5 ml vanilliinin standardiliuosta (4.5.2) 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 5 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. Tämä liuos sisältää 0,5 ìg/ml vanilliinia. 5.4 Määrittäminen HPLC-menetelmällä Annetaan kromatografialaitteen stabiloitua noin 30 minuutin ajan. Injisoidaan standardiliuos (5.3). Toistetaan kunnes kahden perättäisen injektoinnin piikin pinta-alan tai korkeuden välinen ero on alle 2 %. Edellä kuvatuissa olosuhteissa vanilliinin retentioaika on noin 9 minuuttia. Analysoidaan standardiliuos (5.3) kahdesti injisoimalla 20 ìl. Injisoidaan 20 ìl testiliuosta (5.2). Määritetään saadun vanilliinipiikin pinta-ala tai korkeus. Toistetaan standardiliuoksen (5.3) kaksoismääritys, kun testinäytettä on injisoitu 10 kertaa (5.2). 6. Tulosten laskeminen Lasketaan vanilliinipiikkien keskimääräinen piikin pinta-ala (tai korkeus) (AC) kaksoismäärityksistä molempien testiliuossarjojen alussa ja lopussa (yhteensä 4 pinta-alaa). Lasketaan vastekerroin (R): R = >NUM>AC/ >DEN>CM jossa CM on vanilliinin massa milligrammoina (4.5.1). Tekstinäytteen vanilliinipitoisuus (C, mg/kg) saadaan seuraavalla kaavalla: C = >NUM>AS × 20 × 0,96 >DEN>SM × R jossa: AS = testinäytteen vanilliinipiikin pinta-ala SM = testinäytteen massa grammoina (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3) 20 = kerroin, jolla otetaan huomioon standardi- ja testinäytteiden laimennokset 0,96 = korjauskerroin testinäytteen ensimmäisen laimennoksen rasvapitoisuudelle Huomautus: Piikin pinta-alan sijasta voidaan käyttää piikin korkeuksia (ks. 8.3) 7. Menetelmän tarkkuus 7.1 Toistettavuus (r) Kahden mahdollisimman lyhyellä aikavälillä saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta tekemän määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 16 mg/kg. 7.2. Uusittavuus (R) Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testianeistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 27 mg/kg. 8. Toleranssirajat 8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä homogeenisuuden tarkistamiseksi. 8.2 Vaniljasta tai synteettisestä vanilliinista saatu merkkiaine. 8.2.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydin lisäysmäärä on 250 grammaa tonnia kohden. 8.2.2 Otettaessa 95 %:n todennäköisyystason kriittinen ero (CrD95) huomioon, kustakin kolmesta homogeenisuuden tarkistamista varten otetusta näytteestä tehtyjen rinnakkaismääritysten näytekohtainen keskiarvo ei saa olla alle 236,0 mg/kg. 8.2.3 Edellä 8.2.2 kohdassa annetun perusteen lisäksi alhaisinta tuotteen analyysistä saatua tulosta käytetään merkkiaineen tasaisen jakautumisen tarkastamiseksi. Tähän päästään vertaamalla seuraaviin raja-arvoihin: - 221,5 mg/kg (95 % pienimmästä lisäysmäärästä, kun yksittäisen näytteen CrD95 otettu huomioon); - 159,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisäysmäärästä, kun yksittäisen näytteen CrD95 otettu huomioon). Alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta käytetään interpoloinnissa välillä 221,5 mg/kg ja 159,0 mg/kg. 8.3 Vaniljakodista tai näiden kokonaisuutteista saatu merkkiaine. 8.3.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydin lisäysmäärä on 100 grammaa tonnia kohden. 8.3.2 Otettaessa 95 %:n todennäköisyystason kriittinen ero (CrD95) huomioon, kustakin kolmesta homogeenisuuden tarkistamista varten otetusta näytteestä tehtyjen rinnakkaismääritysten näytekohtainen keskiarvo ei saa olla alle 86,0 mg/kg. 8.3.3 Edellä 8.3.2 kohdassa annetun perusteen lisäksi alhaisinta tuotteen analyysistä saatua tulosta käytetään merkkiaineen tasaisen jakautumisen tarkastamiseksi. Tähän päästään vertaamalla seuraaviin raja-arvoihin: - 79,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisäysmäärästä, kun yksittäisen näytteen CrD95 otettu huomioon); - 54,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisäysmäärästä, kun yksittäisen näytteen CrD95 otettu huomioon). Alhaisimman tuloksen antaneen näytteen merkkiainepitoisuutta käytetään interpoloinnissa välillä 79,0 mg/kg ja 54,0 mg/kg. 9. Huomautukset 9.1 Toistettavuus r on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta samoissa olosuhteissa (sama laitteisto, sama laboratorio ja lyhyt aikaväli) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muuta mainita, todennäköisyys on 95 %. 9.2 Uusittavuus R on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta eri olosuhteissa (eri suorittaja, eri laitteisto, eri laboratorio ja/tai eri ajankohta) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muita tietoja ole, todennäköisyys on 95 %. 9.3 Lisätyn vanilliinin takaisinsaanto tasolla 250 mg/kg voiöljyä vaihtelee välillä 97,0-103,8. Todettu keskimääräinen pitoisuus oli 99,9 % ja sen standardipoikkeama 2,7 %. 9.4 Standardiliuos sisältää 5 % uuttoliuosta, joka kompensoi testinäytteiden 5 %:n uuttoliuospitoisuudesta aiheutuvaa piikkien laajenemista. Tämän ansiosta kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa piikkien korkeuden avulla. 9.5 Analyysi perustuu lineaariseen kalibrointikäyrään, jonka leikkauspiste on nollassa. Lineaarisuus tulisi tarkastaa käyttäen standardiliuoksen (4.5.2) sopivia laimennoksia ensimmäistä analyysiä suoritettaessa ja sen jälkeen säännöllisin väliajoin sekä aina, kun HPLC-laitteistoon on tehty muutoksia tai sitä on korjattu.