Komission asetus (EY) N:o 213/2001, annettu 9 päivänä tammikuuta 2001, asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä maidon ja maitotuotteiden analysoimisen ja laadun arvioimisen osalta sekä asetusten (EY) N:o 2771/1999 ja (EY) N:o 2799/1999 muuttamisesta



Virallinen lehti nro L 037 , 07/02/2001 s. 0001 - 0099



Komission asetus (EY) N:o 213/2001, annettu 9 päivänä tammikuuta 2001, asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä maidon ja maitotuotteiden analysoimisen ja laadun arvioimisen osalta sekä asetusten (EY) N:o 2771/1999 ja (EY) N:o 2799/1999 muuttamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjestelystä 17 päivänä toukokuuta 1999 annetun neuvoston asetuksen (EY) N:o 1255/1999(1) ja erityisesti sen 10 ja 15 artiklan, 26 artiklan 3 kohdan, 29 artiklan 1 kohdan ja 31 artiklan 14 kohdan, sekä katsoo seuraavaa: (1) Komission asetuksissa (ETY) N:o 1216/68, (ETY) N:o 3942/92, (EY) N:o 86/94, (EY) N:o 2721/95, (EY) N:o 1080/96, (EY) N:o 1081/96, (EY) N:o 1082/96, (EY) N:o 1854/96, (EY) N:o 880/98 ja (EY) N:o 1459/98, joiden täydelliset lähdeviitteet esitetään tämän asetuksen liitteessä XXVI, vahvistetaan viite- ja rutiinimenetelmät maidon ja maitotuotteiden analysoimiseksi ja laadun arvioimiseksi samoin kuin mainittujen menetelmien soveltamisala ja soveltamista koskevat säännöt. Selkeyden vuoksi edellä mainitut asetukset olisi muotoiltava uudelleen yhdistämällä ne yhdeksi tekstiksi, jotta alan toimijat saisivat käyttöönsä yhden ainoan kokoelman mainituista menetelmistä ja niiden soveltamista koskevista säännöistä. Samasta syystä olisi muutettava neuvoston asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä voin ja kerman markkinoiden interventiotoimenpiteiden osalta 16 päivänä joulukuuta 1999 annettu komission asetus (EY) N:o 2771/1999(2) ja asetuksen (EY) N:o 1255/1999 soveltamista koskevista yksityiskohtaisista säännöistä eläinten rehuksi tarkoitetun rasvattoman maidon ja rasvattoman maitojauheen tuen ja mainitun rasvattoman maitojauheen myynnin osalta 17 päivänä joulukuuta 1999 annettu komission asetus (EY) N:o 2799/1999(3), jotta tähän asetukseen saataisiin sisällytettyä mainittujen asetusten määritysmenetelmiä koskevat liitteet. (2) Asetuksessa (EY) N:o 1255/1999 säädettyjen järjestelmien yhteydessä maidon ja maitotuotteiden koostumuksesta ja laadullisista ominaisuuksista vahvistetut säännökset on tarkastettava sen varmistamiseksi, että kyseiset säännökset noudattavat näitä vaatimuksia tunnollisesti. (3) Usein edellytetään, että näissä tarkastuksissa käytettävät vertailumenetelmät, joita kansainväliset järjestöt saattavat ajan tasalle säännöllisesti, ovat sellaisten järjestöjen kuin CEN:in, IDF:n, ISO:n ja AOAC Internationalin julkaisemia. Tietyissä tapauksissa on otettu käyttöön yhteisön vertailumenetelmä. Toisissa tapauksissa yhteisön lainsäädännössä ei ole täsmennetty vertailumenetelmää. Vertailumenetelmien soveltamisen yhdenmukaisuuden varmistamiseksi olisi laadittava vuosittain luettelo vertailumenetelmistä ja täsmennettävä, että on käytettävä menetelmää, joka mainitaan kyseisessä luettelossa. (4) Rutiinimenetelmien soveltamista ei pidä kieltää. Tästä syystä niiden käyttöedellytykset olisi täsmennettävä. (5) Analyysien tulosten arviointia koskevan yhdenmukaisen käytännön luomiseksi olisi myös vahvistettava yhteiset menetelmät. Sama koskee kyseisten tuotteiden aistinvaraista arviointia ja kiistanalaisten tulosten uudelleentarkastelua. (6) Tietyille analyyseille ei ole vielä olemassa kansainvälisesti hyväksyttyjä validoituja vertailumenetelmiä. Tästä syystä ei ole saatavilla tietoja eri laboratorioiden analyysien tulosten välisestä vaihtelusta. Näin ollen yhteisössä olisi otettava käyttöön menetelmiä, jotka on validoitu kansainvälisten sääntöjen mukaisesti ja joita sovelletaan vertailumenetelminä. (7) Voin myynnistä alennettuun hintaan sekä konditoriatuotteiden, jäätelöiden ja muiden elintarvikkeiden valmistukseen tarkoitetulle kermalle, voille ja voiöljylle myönnettävästä tuesta 15 päivänä joulukuuta 1997 annetussa komission asetuksessa (EY) N:o 2571/97(4), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 635/2000(5), säädetään merkkiaineiden lisäämisestä kermaan, voihin ja voiöljyyn tietyissä olosuhteissa sen varmistamiseksi, että kyseisiä tuotteita käytetään lopputuotteisiin oikealla tavalla. Järjestelmän moitteettoman toiminnan ja siihen osallistuvien toimijoiden yhtäläisen kohtelun varmistamiseksi olisi mahdollisuuksien mukaan otettava käyttöön tiettyjen merkkiaineiden määrittämistä koskevat yhteiset menetelmät. (8) Voiöljynä suoraan kulutukseen tarkoitetun interventiovoin myynnistä alennettuun hintaan 11 päivänä marraskuuta 1985 annetun komission asetuksen (ETY) N:o 3143/85(6), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 101/1999(7), ja yhteisössä suoraan kulutukseen tarkoitetulle voiöljylle tarjouskilpailulla myönnettävästä tuesta 20 päivänä helmikuuta 1990 annetun komission asetuksen (ETY) N:o 429/90(8), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 124/1999(9) ja asetuksella (EY) N:o 2571/97, mukaisesti voiöljy on merkittävä valvonnanalaisena. Voiöljyn merkitsemistä koskevien vaatimusten tiukka noudattaminen on välttämätöntä petosten estämiseksi. Näin ollen olisi määriteltävä yhteinen menetelmä näiden merkkianeiden toteamiseksi. (9) Uuhen maidosta valmistetun juuston yksityiselle varastoinnille voidaan myöntää tukea asetuksen (EY) N:o 1255/1999 9 artiklan nojalla. Samoille tuotteille voidaan myöntää erityistukea mainitun asetuksen 31 artiklan nojalla. Uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta taikka uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistettuja juustoja voidaan tuoda yhteisöön tietyistä kolmansista maista suosituimmuusjärjestelyjen mukaisesti. Edellä tarkoitettujen säännösten vuoksi on tarpeen varmistaa asianmukaisilla tarkastuksilla, etteivät kyseiset tuotteet sisällä lehmänmaitoa. Näin ollen olisi vahvistettava yhteisön vertailumenetelmä lehmänmaidon toteamiseksi, sanotun kuitenkaan rajoittamatta rutiinimenetelmien käyttöä, jos ne ovat tiettyjen perusteiden mukaisia. (10) Kaseiinin ja kaseinaattien valmistukseen käytettävän rasvattoman maidon tuen myöntämisestä 10 päivänä lokakuuta 1990 annetussa komission asetuksessa (ETY) N:o 2921/90(10), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 2654/1999(11), säädetään, että koliformien esiintyminen on tutkittava. Koliformien toteamiseksi maidossa ja maitotuotteissa käytetty kansainvälisesti hyväksytty vertailumenetelmä on kansainvälisen IDF-standardin 73A:1985 mukainen. Sitä voidaan kuitenkin soveltaa ainoastaan muunnetussa muodossa koliformien toteamiseksi tietyssä tuotemäärässä. Näin ollen olisi vahvistettava edellä mainittuun standardiin perustuva yhteisön vertailumenetelmä koliformien havaitsemiseksi. (11) Tariffi- ja tilastonimikkeistöstä ja yhteisestä tullitariffista 23 päivänä heinäkuuta 1987 annetussa neuvoston asetuksessa (ETY) N:o 2658/87(12), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 254/2000(13), esitellään nimikkeeseen 2309 kuuluvien rehuseosten tullit niiden maitotuotepitoisuuden perusteella. Kyseisten säännösten yhtenäisen soveltamisen varmistamiseksi olisi määriteltävä kaikissa jäsenvaltioissa pakollisesti sovellettava laktoosipitoisuuden määritysmenetelmä. Tähän tarkoitukseen olisi valittava jokin yleisesti tunnettu menetelmä. (12) Asetuksessa (EY) N:o 1255/1999 säädetään, että interventioon tarkoitetun voin ja rasvattoman maitojauheen tai eläinten ruokinnassa käytetyn rasvattoman maitojauheen on vastattava tiettyjä laatuvaatimuksia. Näin ollen olisi vahvistettava vertailumenetelmät mainittujen vaatimusten noudattamisen varmistamiseksi. (13) Joidenkin tällä asetuksella ensimmäistä kertaa käyttöön otettujen menetelmien toteuttaminen edellyttää sopeutumisaikaa. Niiden soveltamista olisi näin ollen lykättävä. (14) Maidon ja maitotuotteiden hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa asettamassa määräajassa, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: I LUKU YLEISET SÄÄNNÖKSET 1 artikla Tarkoitus ja soveltamisala Tässä asetuksessa vahvistetaan asetuksella (EY) N:o 1255/1999 perustetun maidon ja maitotuotteiden yhteisen markkinajärjestelyn mukaisiin järjestelmiin kuuluvien maidon ja maitotuotteiden kemiallisten, fysikaalisten ja mikrobiologisten analyysimenetelmien samoin kuin aistinvaraisen arvioinnin soveltamista koskevat säännöt sekä jotkin näistä menetelmistä. 2 artikla Luettelo menetelmistä 1. Liitteessä I vahvistetaan luettelo 1 artiklassa tarkoitettuihin analyyseihin sovellettavista vertailumenetelmistä. 2. Komissio saattaa mainitun luettelon ajan tasalle vähintään kerran vuodessa asetuksen (EY) N:o 1255/1999 42 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen. 3 artikla Rutiinimenetelmät Rutiinimenetelmiä voidaan käyttää yhteisön lainsäädännössä vaadittuihin analyyseihin, jos ne on huolellisesti kalibroitu ja säännöllisesti tarkastettu vertailumenetelmän mukaisesti. Liitteessä II kuvattuja menetelmiä voidaan soveltaa sellaisten rutiinimenetelmillä saatujen tulosten tarkastamiseen, jotka ovat lähellä kyseisissä asetuksissa täsmennettyjä raja-arvoja. Jos asiasta on erimielisyyttä, vertailumenetelmällä saadut tulokset ovat ratkaisevia. 4 artikla Vertailumenetelmien validointi 1. Vertailumenetelmä on validoitu, jos se vastaa toistettavuutta ja uusittavuutta koskevia vaatimuksia varten ennalta vahvistettuja tarkkuusperusteita. 2. Jos kyseisissä asetuksissa säädettyä vertailumenetelmää ei ole validoitu, jäsenvaltioiden on vahvistettava väliaikaiset uusittavuutta koskevat vaatimukset. Vaatimustenmukaiset raja-arvot asetetaan liitteessä III olevassa b kohdassa määriteltyä menettelyä noudattaen. Jäsenvaltiot voivat kuitenkin käyttää jotain vastaavaa menettelyä kymmenen kuukauden ajan tämän asetuksen voimaantulosta. Raja-arvon noudattaminen tarkastetaan vähintään kerran vuodessa. 3. Jos validoiduilla vertailumenetelmillä tai väliaikaisia tarkkuusarvoja soveltavilla menetelmillä saadut tulokset ylittävät raja-arvon, sovelletaan liitteessä IV kuvattua analyysien tulosten arviointimenettelyä raja-arvon kriittisen eron määrittelemiseksi. 5 artikla Analyysien tulosten hyväksyttävyys 1. Analyysit tehdään liitteessä V olevassa a kohdassa kuvattua sisäistä laadunvalvontamenettelyä tai vastaavaa menettelyä noudattavissa laboratorioissa. Laboratoriossa on oltava saatavilla yksityiskohtainen kuvaus sovellettavasta menettelystä. 2. Laboratoriot vahvistavat tarkkuutta koskevat sisäiset raja-arvonsa kaikkien käytössä olevien menetelmien osalta noudattaen a) liitteessä V olevassa b kohdassa määriteltyä menetelmää tai b) julkaistua validoitua menetelmää, jolle on esitetty toistettavuutta koskeva raja-arvo. Uusittavuutta koskevan raja-arvon noudattaminen on tarkastettava vähintään kerran vuodessa liitteessä III olevassa a kohdassa määriteltyä menetelmää noudattaen. Toista alakohtaa ei sovelleta, jos laboratorio on osallistunut pätevyyskokeeseen vuoden aikana. 3. Analyysin tuloksista tehdyssä laboratoriokertomuksessa on oltava riittävästi tietoja, jotta tuloksia voidaan arvioida liitteiden IV ja VIII mukaisesti. 4. Analyysin tuloksia pidetään hyväksyttävinä, jos ne on saatu 1 kohdassa tarkoitetussa sisäisessä laadunvalvontamenettelyssä kuvattujen hyväksyttävyysperusteiden ja 2 kohdassa tarkoitettujen tarkkuutta koskevien sisäisten raja-arvojen mukaisesti. 6 artikla Aistinvarainen arviointi 1. Voin osalta liitteessä VI olevia menetelmiä sovelletaan arvioijien suorituksen ja tulosten luotettavuuden tarkastukseen. Liitteessä VII kuvattua menetelmään sovelletaan aistinvaraisen arvioinnin vertailumenetelmänä. 2. Maidon ja muiden maitotuotteiden kuin voin osalta jäsenvaltioiden on käytettävä aistinvaraisen arvioinnin vertailumenetelmänä IDF-standardia 99C/1997 tai muita vastaavia menetelmiä, jotka niiden on annettava tiedoksi komissiolle. Liitteessä VI olevia menetelmiä voidaan soveltaa arvioijien suorituksen sekä tulosten luotettavuuden tarkastukseen. 7 artikla Näytteenotto ja analyysien tulosten kiistäminen 1. Yhteisön lainsäädännössä säädettyjen analyysien tekemiseksi on otettava kaksoisnäytteitä. 2. Liitteessä VIII määriteltyä menettelyä sovelletaan, jos toimija ei hyväksy analyysin tuloksia. II LUKU MÄÄRITYSMENETELMÄT 8 artikla Voin vesi-/kuiva-aine-/rasvapitoisuus 1. Liitteessä IX kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin vesipitoisuutta. 2. Liitteessä X kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuutta. 3. Liitteessä XI kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin rasvapitoisuutta. 9 artikla Merkkiaineet 1. Liitteessä XII kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voiöljyn, voin tai kerman vanilliinipitoisuutta. 2. Liitteessä XIII kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voiöljyn tai voin beeta-apo-8'-karoteenihapon etyyliesteripitoisuutta. 3. Liitteessä XIV kuvattua määritysmenetelmää sovelletaan vertailumenetelmänä määritettäessä voin ja voiöljyn stigmasteroli- tai beeta-sitosterolipitoisuutta. 4. Voiöljy, voi tai kerma on merkitty asianmukaisen yhteisön lainsäädännön mukaisesti, jos saadut tulokset vastaavat liitteessä 8 olevan 1, 2 ja 3 kohdan vaatimuksia. 10 artikla Lehmänmaidon kaseiinin toteaminen 1. Liitteessä XV olevaa vertailumenetelmää sovelletaan sen varmistamiseksi, ettei juusto, joka on valmistettu yksinomaan uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta taikka uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista, sisällä lehmänmaidon kaseiinia. Lehmänmaidon kaseiinia katsotaan esiintyvän, jos analysoitavan näytteen lehmänmaidon kaseiinipitoisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin liitteessä XV kuvatun 1 prosenttia lehmänmaitoa sisältävän standardinäytteen pitoisuus. 2. Lehmänmaidon kaseiinin toteamiseksi edellä 1 kohdassa tarkoitetuista juustoista voidaan käyttää rutiinimenetelmiä seuraavin edellytyksin: a) toteamisrajan on oltava enintään 0,5 prosenttia, b) vääriä positiivisia tuloksia ei saa esiintyä, c) lehmänmaidon kaseiinin on oltava havaittavissa vaaditulla herkkyydellä pitkienkin kypsyttämisjaksojen jälkeen, kuten voi tapahtua tavanomaisissa kaupallisissa olosuhteissa. Jos b alakohdassa säädettyä vaatimusta ei voida täyttää, kaikki näytteet, joista on saatu positiivinen tulos, on analysoitava vertailumenetelmää käyttäen. Jos c alakohdassa säädetty vaatimus ei täyty jonkin 1 artiklassa tarkoitetun juuston osalta, kyseinen juusto on analysoitava vertailumenetelmää käyttäen. 11 artikla Koliformien toteaminen 1. Liitteessä XVI kuvattua vertailumenetelmää sovelletaan koliformien havaitsemiseksi voissa, rasvattomassa maitojauheessa, kaseiinissa ja kaseinaateissa. 2. Koliformien havaitsemiseen voidaan käyttää rutiinimenetelmiä, jos saadut tulokset vastaavat mainitussa liitteessä kuvatun vertailumenetelmän avulla saatuja tuloksia. Rutiinimenetelmillä on erityisesti oltava riittävä toteamisraja. Vääriä negatiivisia tuloksia ei saa esiintyä. Jos väärien positiivisten tulosten esiintymistä ei voida estää, kaikki positiiviset tulokset on vahvistettava vertailumenetelmän avulla. 12 artikla Laktoosipitoisuus Yhdistetyn nimikkeistön nimikkeeseen 2309 kuuluvien tuotteiden laktoosipitoisuuden määritysmenetelmä kuvataan liitteessä XVII. 13 artikla Herajuoksutteen toteaminen 1. Liitteessä XVIII kuvataan menetelmä herajuoksutteen toteamiseksi julkiseen varastointiin tarkoitetusta rasvattomasta maitojauheesta. 2. Liitteessä XIX kuvataan menetelmä herajuoksutteen toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta ja rehun esiseoksista. 14 artikla Kirnupiimän toteaminen Liitteessä XX kuvataan menetelmä kirnupiimän toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta. 15 artikla Mikrobien torjunta-aineiden jäämät Liitteessä XXI kuvataan menetelmä antibiootti- ja sulfonamidi-dapsonijäämien toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta. 16 artikla Rasvattoman maitojauheen pitoisuus Liitteessä XXII kuvataan menetelmän rasvattoman maitojauheen pitoisuuden toteamiseksi rehuseoksista. 17 artikla Tärkkelyksen toteaminen Liitteessä XXIII kuvataan menetelmä tärkkelyksen toteamiseksi rasvattomasta maitojauheesta, denaturoidusta maitojauheesta ja rehuseoksista. 18 artikla Happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuus Liitteessä XXIV kuvataan menetelmä happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuuden toteamiseksi eläinten rehusta. 19 artikla Vieraiden rasvojen toteaminen Liitteessä XXV kuvataan menetelmä vieraiden rasvojen määrittämiseksi maitorasvasta. III LUKU LOPPUSÄÄNNÖKSET 20 artikla Asetuksen (EY) N:o 2771/1999 muutokset Muutetaan asetus (EY) N:o 2771/1999 seuraavasti: 1) Korvataan 4 artiklan 1 kohdan ensimmäinen virke seuraavasti: "Toimivaltaisten viranomaisten on tarkastettava voin laatu liitteessä I tarkoitettujen menetelmien ja liitteessä IV olevien yksityiskohtaisten sääntöjen mukaisesti otettujen näytteiden perusteella." 2) Korvataan liitteessä I oleva alaviite 2 seuraavasti: "Ks. asetuksen (EY) N:o 213/2001 liite I (tämä asetus)." 3) Poistetaan liitteet II ja III. 4) Korvataan liitteessä IV olevan 2 kohdan toiseksi viimeisellä rivillä ilmaisu "liitteessä III" ilmaisulla "asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä VII". 21 artikla Asetuksen (EY) N:o 2799/1999 muutokset Muutetaan asetus (EY) N:o 2799/1999 seuraavasti: 1) Korvataan 20 artiklan 1, 2, 3 ja 4 kohta seuraavasti: "1. Esiseosten ja rehuseosten rasvattoman maitojauheen pitoisuus tarkastetaan vähintään kahteen kertaan tehdyllä analyysillä asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XXII kuvatun menetelmän mukaisesti ja sitä täydennetään tämän asetuksen 17 artiklan 3 kohdassa mainituilla tarkastuksilla. Jos tulosten ja näiden tarkistusten välillä ilmenee ristiriitaa, paikalla tehtyjen tarkastusten tulos on ratkaiseva. 2. Herajuoksetteen pitoisuus vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XIX kuvatun menetelmän mukaisesti. 3. Rehuseosten tärkkelyspitoisuus vahvistetaan tämän asetuksen 17 artiklan 3 kohdassa mainituilla tarkastuksilla, joita täydennetään asetuksen (EY) N:o 213/2001 (tämä asetus) liitteessä XXIII kuvatulla määritysmenetelmällä. 4. Happaman kirnupiimäjauheen kosteuspitoisuus määritetään asetuksen (EY) N:o 213/2001 liitteessä XXIV kuvatulla määritysmenetelmällä." 2) Poistetaan liitteet III, IV, V ja VI. 22 artikla Kumoamiset Kumotaan asetukset (ETY) N:o 1216/68, (ETY) N:o 3942/92, (ETY) N:o 86/94, (EY) N:o 2721/95, (EY) N:o 1854/96, (EY) N:o 1080/96, (EY) N:o 1081/96, (EY) N:o 1082/96, (EY) N:o 880/98 ja (ETY) N:o 1459/98. Viittauksia kumottuihin asetuksiin pidetään viittauksina tähän asetukseen. 23 artikla Voimaantulo Tämä asetus tulee voimaan seitsemäntenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteessä III, liitteessä IV olevassa 4 kohdassa sekä liitteissä V, VI ja VIII kuvattuja menetelmiä sovelletaan kuitenkin kahdeksantoista kuukautta tämän asetuksen voimaantulon jälkeen. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 9 päivänä tammikuuta 2001. Komission puolesta Franz Fischler Komission jäsen (1) EYVL L 160, 26.6.1999, s. 48. (2) EYVL L 333, 24.12.1999, s. 11. (3) EYVL L 340, 31.12.1999, s. 3. (4) EYVL L 350, 20.12.1997, s. 3. (5) EYVL L 76, 25.3.2000, s. 9. (6) EYVL L 298, 12.11.1985, s. 9. (7) EYVL L 11, 16.1.1999, s. 14. (8) EYVL L 45, 21.2.1990, s. 8. (9) EYVL L 16, 21.1.1999, s. 19. (10) EYVL L 279, 11.10.1990, s. 22. (11) EYVL L 325, 17.12.1999, s. 10. (12) EYVL L 256, 7.9.1987, s. 1. (13) EYVL L 28, 3.2.2000, s. 16. LIITE I (2 artikla) LUETTELO VERTAILUMENETELMISTÄHuomautukset luetteloon Euroopan unionin vertailumenetelmistä: Huomautus 1: Maitorasvan erottaminen IDF-standardin 6B:1989 mukaisesti (valolta suojaaminen). Huomautus 2: Vertailumenetelmää ei ole vahvistettu. Huomautus 3: Näytteet valmistettava IDF-standardin 122C:1996 tai IDF-standardin 73A:1985 mukaisesti. Huomautus 4: Inkubointi 48 tunnin ajan 55 °C:n lämpötilassa. Pyrittävä välttämään kasvatusalustan kuivuminen. Huomautus 5: SNF-% = kuiva-aine-% - rasva-% Huomautus 6: Voin on vastattava komission asetuksen (EY) N:o 2771/1999 liitteessä V tarkoitettua tuotantojäsenvaltion kansallista laatuluokkaa. Huomautus 7: Komission direktiivi (ETY) N:o 4/84. Huomautus 8: Komission asetus (EY) N:o 1758/94 (EYVL L 183, 19.7.1994, s. 14). Huomautus 9: Komission direktiivi 78/633/ETY. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> LIITE II (3 artikla) RUTIINIMENETELMILLÄ SAATUJEN, ASETUKSISSA TÄSMENNETTYJÄ KOOSTUMUSTA JA LAADULLISIA OMINAISUUKSIA KOSKEVIA RAJA-ARVOJA LÄHELLÄ OLEVIEN TULOSTEN TARKASTAMINEN Jos mo on asetuksessa täsmennetty koostumusta ja laadullisia ominaisuuksia koskeva raja-arvo, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo (L) on >VIITTAUS KAAVIOON> jos RRout/RRef <= 1RRout: Rutiinimenetelmän uusittavuutta koskeva raja-arvo RRef: Vertailumenetelmän uusittavuutta koskeva raja-arvo Jos mo on ylempi raja-arvo ja RRout/RRef > 1, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo saadaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> Jos samoissa olosuhteissa mo on alempi raja-arvo, toimenpidettä edellyttävä raja-arvo saadaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> CrD95: vertailumenetelmän kriittinen ero (ks. liite IV). Jos mo on ylempi raja-arvo, toimenpidettä edellyttävän raja-arvon yläpuolella oleva rutiinimenetelmällä saatu lopullinen tulos on korvattava vertailumenetelmällä saadulla lopullisella tuloksella. Tämän lopullisen tuloksen on perustuttava vähintään yhtä suureen määrään analyysejä/otoksia kuin rutiinimenetelmän lopullisen tuloksen. Jos mo on alempi raja-arvo, on noudatettava samaa menettelyä sellaisen rutiinimenetelmällä saadun lopullisen tuloksen saamiseksi, joka on alempi kuin toimenpidettä edellyttävä raja-arvo. Huomautus Edellä kuvattua menettelyä voidaan soveltaa, jos matriisivaikutuksia ei ole havaittavissa. Matriisivaikutukset voidaan havaita seuraavasti: jokaisen kalibrointiin käytetyn näytteen osalta määritellään vertailumenetelmällä ja rutiinimenetelmällä saadun tuloksen ero (wi). Standardipoikkeamaa, joka saadaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> m: kalibroinnissa käytettyjen näytteiden määrä verrataan vertailumenetelmän ja rutiinimenetelmän standardipoikkeaman toistettavuuden aritmeettisen keskiarvon kanssa >VIITTAUS KAAVIOON> Matriisivaikutus on otettava huomioon, jos >PIC FILE= "L_2001037FI.001502.EPS"> jossa: f= m (f: vapausasteiden lukumäärä) α= virhetodennäköisyys; α = 0,05. Tällöin lisätutkimukset ovat tarpeen ennen toimenpidettä edellyttäen raja-arvon vahvistamista. LIITE III (4 ja 5 artikla) a) Menettely vahvistetun uusittavuutta koskevan raja-arvon noudattamisen määrittämiseksi (kemiallinen määritys) Se ovatko tulokset uusittavuutta koskevan raja-arvon mukaisia tarkastetaan vertaamalla laboratoriotuloksia kokeneen laboratorion(1) tuloksiin, jotka on saatu samanlaisella näytteellä. Kummassakin laboratoriossa tehdään rinnakkaismääritys ja tulokset arvioidaan käyttämällä seuraavaa kaavaa: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: CrD95: kriittinen ero (P = 0,95) >VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 1 saatujen kahden tuloksen aritmeettinen keskiarvo >VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 2 saatujen kahden tuloksen aritmeettinen keskiarvo R: uusittavuutta koskeva raja-arvo: määritellään interpoloimalla r: toistettavuutta koskeva raja-arvo: jos tarkkuus vaihtelee pitoisuuden mukaan. Jos kriittinen ero ylittyy, on tehtävä toinen koe kahden kuukauden kuluessa. Jos tulokset eivät ole uusittavuutta koskevan raja-arvon mukaisia toisessa kokeessa, toimivaltaisten viranomaisten on toteutettava tarvittavat toimenpiteet. b) Menettely uusittavuutta koskevan väliaikaisen raja-arvon saamiseksi (kemiallinen määritys) Uusittavuutta koskeva väliaikainen raja-arvo (Rprov) saadaan seuraavasta yhtälöstä: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: >VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 1 saatujen kahden tuloksen keskiarvo >VIITTAUS KAAVIOON>: laboratoriossa 2 saatujen kahden tuloksen keskiarvo (ks. liitteessä III oleva a kohta) r: toistettavuutta koskeva raja-arvo tai toistettavuutta koskeva väliaikainen raja-arvo. Huomautukset: 1. Rprov:ia voidaan käyttää kriittisten erojen laskemiseen (ks. liite VI). 2. Rprov vahvistetaan 2r:ksi, jos Rprov:in laskettu arvo on pienempi kuin 2r. 3. Jos laskettu arvo on suurempi kuin 3r tai suurempi kuin Horwitzin yhtälöstä(2) johdettu R-arvo kerrottuna kahdella, Rprov on liian korkea eikä sitä voida käyttää kriittisen eron laskemiseen. 4. Rprov on laskettu vähintään kerran vuodessa kahdessa laboratoriossa saatujen tulosten perusteella (ks. liite IV). 5. Kriittisen eron laskemisessa on käytettävä Rprov:in keskiarvoa. Edellä 2 ja 3 kohdassa annettuja sääntöjä sovelletaan Rprov:in keskiarvoon. Uusittavuutta koskeva raja-arvo (R-arvo) saadaan RSDR-arvosta seuraavasti: >VIITTAUS KAAVIOON> (>VIITTAUS KAAVIOON> = saatujen tulosten aritmeettinen keskiarvo) Joitakin laskettuja RSDR-arvoja (esimerkkejä) >TAULUKON PAIKKA> Kun analysoitavan aineen pitoisuus on 1 g/100 g, >VIITTAUS KAAVIOON>. (1) Kokeneen laboratorion on yleensä oltava sellainen laboratorio, joka on osallistunut menestyksellisesti joko testimenetelmän validointiin tai pätevyyskokeeseen. (2) Horwitzin yhtälö: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: RSDR: Uusittavuuden suhteellinen standardipoikkeama C: pitoisuus, ilmaistuna desimaalilukuna (esimerkiksi: 10 g/100 g = 0,1). Viite: Peeler, J.T., Horwitz, W. ja Albert, R. J. Ass. Off. Anal. Chem. 72 (5), 784-806 (1989). LIITE IV (4 artikla) VALIDOIDUILLA MENETELMILLÄ SAATUJEN ANALYYSIEN TULOSTEN ARVIOINTI Jos analyysin tuloksesta käy ilmi, että raja-arvo on ylitetty, lasketaan kahden tai useamman tuloksen aritmeettinen keskiarvo. Menettely on seuraavanlainen: 1. Jos analyysin tulos edustaaa yhtä tulosta, toinen analyysi on tehtävä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosiuhteissa. Jos kahta analyysiä ei voida tehdä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa, on tehtävä uusi rinnakkaismääritys toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa ja käytettävä näitä tuloksia arvioitaessa, ovatko tulokset kriittistä eroa koskevien vaatimusten mukaiset. 2. Lasketaan toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa saatujen tulosten aritmeettisen keskiarvon ja raja-arvon välisen erotuksen absoluuttinen arvo. Kriittistä eroa suurempi erotuksen absoluuttinen arvo merkitsee sitä, että analysoitu näyte ei täytä vaatimuksia. Kriittinen ero määritetään seuraavasta kaavasta: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: >VIITTAUS KAAVIOON>: saatujen tulosten aritmeettinen keskiarvo mo: raja-arvo n: analyysien/näytteiden lukumäärä Jos tarkkuus vaihtelee pitoisuuden mukaan, voi olla tarpeen määrittää r ja R interpoloimalla. Yleensä näytteestä esitetystä lopullisesta tuloksesta on käytävä ilmi, että se on asetettujen raja-arvojen mukainen. Seuraavien raja-arvojen välissä olevia lopullisia tuloksia saa sen vuoksi esiintyä ainoastaan poikkeustapauksissa: - >VIITTAUS KAAVIOON> ja >VIITTAUS KAAVIOON>, jos raja-arvo on enimmäisraja, ja - >VIITTAUS KAAVIOON> ja >VIITTAUS KAAVIOON>, jos raja on vähimmäisraja. Edellä mainituissa rajoissa esiintyviä lopullisia tuloksia hyväksytään ainoastaan, jos niitä ilmenee enintään yksi viidestä analysoitavasta näytteestä erää kohden. Jos analysoidaan vähemmän kuin viisi näytettä erää kohden, hyväksytään yksi mainittuihin rajoihin sijoittuva tulos. Tästä huolimatta on noudatettava sääntöä, jonka mukaan viittä analysoitavaa näytettä kohden saa olla ainoastaan yksi mainittuihin rajoihin sijoittuva tulos, jos tuottaja toimittaa eriä jatkuvasti. 3. Jos lopullinen tulos x lasketaan kaavasta x = y1 +/- y2 (esimerkki: vesi + voin rasvaton kuiva-ainepitoisuus rasvapitoisuuden laskemiseksi), jossa y1 ja y2 ovat yksittäisen analyysin lopullisia tuloksia, lopullisten tulosten (x) toisettavuuden ja uusittavuuden kokonaisrajat (rx ja Rx) lasketaan kaavasta: >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> jossa r1 ja r2 ovat toistettavuutta koskevat raja-arvot ja R1 ja R2 ovat y1:n ja y2:n uusittavuutta koskevat raja-arvot. Lopullista tulosta x verrataan mo-rajaan 1 ja 2 kohdassa täsmennettyjen sääntöjen mukaisesti. Kriittinen ero määritetään seuraavasta kaavasta: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa x on saatujen tulosten (x1) aritmeettinen keskiarvo. 4. Jos lopullinen tulos lasketaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> (esimerkiksi rasvaa juuston kuiva-ainepitoisuudesta) jossa y1 ja y2 ovat yksittäisen analyysin lopullisia tuloksia, toistettavuuden ja uusittavuuden kokonaisrajat (rx ja Rx) lasketaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> μ1: y1:n raja- tai tavoitearvo (esimerkiksi rasva) μ2: y2:n raja- tai tavoitearvo (esimerkiksi kuiva-aine) >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: r1: toistettavuutta koskeva raja-arvo y1 r2: toistettavuutta koskeva raja-arvo y2 >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: R1: uusittavuutta koskeva raja-arvo y1 R2: uusittavuutta koskeva raja-arvo y2 Menetelmiä rx:n ja Rx:n laskemiseksi sovelletaan vain, jos toistettavuutta ja uusittavuutta koskevat suhteelliset raja-arvot (r*1, r*2; R*1; R*2) ovat pienempiä tai yhtä suuria kuin 0,15. Lopullista tulosta x verrataan μx -rajaan 1 ja 2 kohdassa täsmennettyjen sääntöjen mukaisesti. Kriittinen ero määritetään kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> jossa >VIITTAUS KAAVIOON> on aikajärjestyksessä saatujen tulosten (x) aritmeettinen keskiarvo(1). (1) Huomautus: Esimerkiksi jos saadaan tulokset y11, y12, y21 ja y22, on laskettava y11/y21:n ja y12/y22:n aritmeettinen keskiarvo. LIITE V SISÄINEN VALVONTA (5 artikla) a) Sisäinen laadunvalvontamenettely (IQC) (kemiallinen määritys) Valvontamateriaalin määrittely Sisäistä laadunvalvontamenettelyä varten käytetylle aineistolle tehdään samat tai osittain samat määritykset kuin testattavalle aineistolle. Valvontamateriaali voi olla esimerkiksi: - varmennettu vertailumateriaali, - laboratorion oma vertailumateriaali, - eri laboratorioissa tehdyissä kokeissa validoitu materiaali, - materiaali, johon on lisätty määritettävää ainetta. Menettely IQC:n laatimiseksi Laboratorion olisi laadittava sisäinen laadunvalvontamenettelynsä (IQC) IUPAC:n asiakirjassa "Yhdenmukaiset ohjeet sisäisen laadunvalvonnan suorittamiseksi analyyttisissä laboratorioissa" esitetyn menettelyn mukaisesti(1). IQC suoritetaan ottamalla valvontamateriaali mukaan analyyttiseen sarjaan tai määrittämällä testattava näyte rinnakkaismäärityksin. Valvontamateriaalien on vastattava kemialliselta koostumukseltaan testattavia näytteitä, ja niiden on oltava riittävän stabiileja tarkkailujakson ajan. On voitava osoittaa, että ne voidaan jakaa samanlaisiin osiin analyysiä varten ja että analysoitavan aineen pitoisuusalue soveltuu kyseiseen tutkimukseen. Valvontamateriaali on otettava mukaan vähintään kerran kuhunkin analyysisarjaan, ja saatu arvo on merkittävä valvontakorttiin pitkäaikaisten virheiden mittaamiseksi. Laboratorion on lisäksi ajoittain osoitettava, että se täyttää toistettavuuden edellytykset analyysisarjan sisällä. Tämä osoitetaan valvontamateriaalin ja/tai testattavan materiaalin rinnakkaismäärityksellä. Näiden analyysien tuloksia olisi verrattava mahdollisiin julkaistuihin toistettavuutta koskeviin raja-arvoihin ja laboratorion omiin tarkkuustietoihin. Jos käytetään valvontamateriaalia, sarjojen välissä saadut valvontamateriaalia koskevat tulokset merkitään Shewhart-korttiin (ISO 8258 (1991)). Asianmukaiset valvontarajat on myös merkittävä. Toimintarajat asetetaan arvoon >VIITTAUS KAAVIOON>, jossa st on kokonaisstandardipoikkeama, ja varoitusrajat asetetaan arvoon >VIITTAUS KAAVIOON> Kokonaisstandardipoikkeama: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: sb: standardipoikkeama sarjojen välillä sw: standardipoikkeama sarjan sisällä n: määritysten lukumäärä Jos valvontamateriaalia ei käytetä (esimerkiksi jos materiaali ei ole stabiilia), vähintään yhdestä testattavista materiaaleista on tehtävä rinnakkaismääritys jokaisen sarjan sisällä. Sarjan sisällä suoritetuista rinnakkaismäärityksistä saadut absoluuttiset erot (ks. liite III) merkitään korttiin. Kortin keskilinja on 1,128 sw, alempi raja-arvo 0 ja ylempi raja-arvo (toimintaraja) 3,686 sw, jossa sw on standardipoikkeama sarjan sisällä. Valvontamenettelyyn on kuuluttava alhaisen ja korkean pitoisuuden omaavia materiaaleja, kun pitoisuusalue on laaja. Jos testattavien materiaalien pitoisuuserot ovat suuret, laboratorion on osoitettava määritystarkkuuden ja pitoisuuden välinen suhde. Jos tarkkuus on verrannollinen pitoisuuteen, seuraava kontrolli olisi suoritettava suhteellisen tarkkuuden perusteella (toisin sanoen absoluuttinen ero prosentteina keskiarvosta). Analyysijärjestelmä ei ole luotettava, jos jotakin seuraavista tapahtuu: A. graafisen kuvaajan arvo sijoittuu toimintarajojen ulkopuolelle, B. nykyinen arvo ja aikaisempi arvo sijoittuvat varoitusrajojen ulkopuolelle, mutta toimintarajojen sisäpuolelle, C. jos käytetään valvontamateriaaleja, yhdeksän peräkkäistä arvoa sijoittuu keskiarvokuvaajan samalle puolelle. Laboratorion olisi reagoitava tällaisiin tilanteisiin seuraavasti: A. lopettamalla analyysi ja odottamalla vian määritystä ja korjaavaa toimia tilanteen parantamiseksi ja B. hylkäämällä analyysisarjan tulokset ja analysoimalla testattava aineisto uudelleen. b) Laboratorion oman valvontamateriaalin valintamenettely sekä laboratorion omien tarkkuutta koskevien raja-arvojen määritysmenettely (kemiallinen määritys) Tiedot laboratorion analyysien tarkkuudesta saadaan valvontamateriaalien ja/tai testattavien näytteiden toistuvalla analyysillä. Laboratorioiden on määriteltävä jäljempänä esitetyllä tavalla sarjan sisäistä ja sarjojen välistä vaihtelua kuvaavat tarkkuuteen liittyvät muuttujat, joita käytetään laadunvalvontakuvaajan laatimiseksi. Laboratoriot voivat käyttää myös vaihtoehtoisia menettelyjä, jos ne voivat asianmukaisesti osoittaa, että tarkkuutta koskevat tiedot ovat luotettavia. 1. Valvontamateriaalin valinta Jos laboratorio käyttää valvontamateriaalia, on ensin kerättävä tiedot raja-arvojen asettamiseksi. Mahdollisuuksien mukaan on käytettävä varmennettuja vertailumateriaaleja. Valvontamateriaalit on analysoitava toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa samassa sarjassa siten, että mukana on soveltuva varmennettu vertailumateriaali. On tehtävä rinnakkaismäärityksiä ja satunnaismäärityksiä. Jos tämän menettelyn käyttö on mahdotonta, laboratorioiden olisi osallistuttava pätevyyskokeisiin ja vahvistettava yhteisesti hyväksyttyjä keskiarvoja, joita voidaan pitää oikeina keskiarvoina, joihin liittyy huomattavaa epätarkkuutta. Muihin menettelyihin kuuluu todellisten arvojen vahvistaminen valmistamalla tai käyttämällä valvontamateriaaleja, joihin on lisätty määritettävää ainetta. Jos laboratorio tekee säännöllisesti tällaisia analyysejä ja on jo ottanut käyttöön tilastollisen valvonnan, kaikki uudet valvontamateriaalit (joita tarvitaan esimerkiksi varastojen loppumisen vuoksi) on valittava siten, että otetaan huomioon analyysit, joita varten on jo olemassa aiemmin käyttöön otettuihin materiaaleihin perustuva valvontamenettely. 2. Raja-arvojen vahvistaminen Valvontamateriaalin valittuaan laboratorion on vahvistettava tällä materiaalilla analyysisarjan sisäistä ja analyysisarjojen välistä tarkkuutta osoittavat luvut. Vähimmäisvaatimus tarkkuutta kuvaavien tunnuslukujen laatimiseksi analyysisarjan sisällä on, että tehdään 12 rinnakkaismääritystä. Rinnakkaismääritys on tehtävä toistettavuusvaatimukset täyttävissä olosuhteissa, toisin sanoen on sama tekijä, samat reagenssit jne. Valvontamateriaalin rinnakkaismääritys on tehtävä satunnaisesti analyysisarjan sisällä. Kukin rinnakkaismääritys on tehtävä eri päivinä tietyn ajanjakson aikana, jotta voidaan varmistaa riittävä vaihtelu analyysisarjojen välillä. Huomioon on otettava tavanomainen vaihtelu, joka liittyy esimerkiksi reagensseihin, välineiden uudelleenkalibrointiin ja tarvittaessa analyysin tekijöiden vaihtumiseen. Huomautus: Jos käytetään mittaustuloksia, joissa sarjojen välinen vaihtelu ei ole täysin edustava, voidaan analyysi joutua toistamaan tarpeettomasti liian tiukkojen raja-arvojen asettamisen vuoksi. Laboratorion, jossa tarkkuus on liian epämääräinen, voi olla mahdotonta noudattaa vertailumenetelmien raja-arvoja. Näin ollen sen tulos on huonompi kuin muissa vastaavissa laboratorioissa eikä se pysty toimittamaan käyttökelpoisia tietoja aiottua tarkoitusta varten. 2.1 Tarkkuuden määritys analyysisarjan sisällä 2.1.1 Sarjan sisäinen tarkkuus silloin, kun valvontamateriaalia on saatavilla Rinnakkaisarvoille (vähintään 12 rinnakkaismääritystä) olisi tehtävä ensin Cochranin enimmäisvariaatiotesti. Siinä verrataan suurinta rinnakkaismäärityserotuksen neliötä erotusten neliöiden summaan. >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: di= rinnakkaismääritysten välinen ero. Cochranin parametrin arvoa (C) verrataan taulukoituihin arvoihin (ISO 5725 (1994)). Jos arvo on epäilyttävä arvo tai harha-arvo, tulosta on tutkittava selityksen (esimerkiksi tekninen virhe, tietokonevirhe, kokeen yhteydessä sattunut virhe, väärän näytteen analysointi) löytämiseksi. Jos tekninen virhe on sellainen, ettei epäilyttävää tulosta voida korvata, se on hylättävä todellisena harha-arvona. Jos jäljelle jää epäilyttäviä arvoja tai harha-arvoja, joille ei löydy selitystä, epäilyttävät arvot otetaan mukaan oikeina tuloksina ja tilastolliset harha-arvot hylätään. Laboratorion on pyrittävä tekemään uudet määritykset. Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, standardipoikkeama analyysisarjan sisällä (sw) lasketaan seuraavasti: Lasketaan jokaisen rinnakkaismääritystulosparin xi1, xi2 (p kpl) summa >VIITTAUS KAAVIOON> ja erotus >VIITTAUS KAAVIOON> ja nämä lasketaan yhteen, jotta saadaan >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> >VIITTAUS KAAVIOON> Analyysisarjan sisäisen standardipoikkeaman estimaatti on >VIITTAUS KAAVIOON> Tarkkuutta koskeva sisäinen raja-arvo on 2,8 sw. Vertailumenetelmää käytettäessä tarkkuutta koskevaa sisäistä raja-arvoa verrataan julkaistuun toistettavuutta koskevaan raja-arvoon. Laboratorion tulosten on oltava vertailumenetelmällä saatujen tulosten mukaisia. Jos nämä vaatimukset eivät täyty, on asia tutkittava. Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava. 2.1.2 Sarjan sisäinen tarkkuus silloin, kun valvontamateriaalia ei ole saatavilla Laboratorio voi määrittää analyysisarjan sisäisen tarkkuuden edustavista testattavista näytteistä suoritettavilla rinnakkaismäärityksillä (vähintään 12 rinnakkaismääritystä). Jos on mahdotonta käyttää valvontamateriaaleja (esimerkiksi niiden epästabiilisuuden vuoksi), rinnakkaismäärityksistä saatu tieto on kerättävä tällä menetelmällä. Huomautus: Analyysien oletetaan kattavan suhteellisen kapean alueen arvoja, minkä vuoksi kaikkiin näytteisiin voidaan soveltaa yhtä arvoa. Jos tulosten vaihtelualue on laajempi (esimerkiksi kertaluokkaa suurempi) ja tarkkuus riippuu pitoisuudesta, laboratorion on pyrittävä käyttämään suhteellista standardipoikkeamaa. Tuloksille on tehtävä Cochranin testi 2.1.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, standardipoikkeama analyysisarjan sisällä ja laboratorion oma tarkkuutta koskeva raja-arvo saadaan 2.1.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Standardipoikkeamaa analyysisarjan sisällä (sw) voidaan käyttää valvontakorttien laatimiseen (ks. liite II). Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava. 2.2 Analyysisarjojen välisen tarkkuuden määritys Lasketaan jokaisen parin keskiarvo (s1/2) ja tehdään näille arvoille Grubbsin testi (ISO 5725 (1994)). Harha-arvojen tai epäilyttävien arvojen hylkäämis- ja hyväksymisperusteet kuvataan 2.1.1 kohdassa. Laboratorion on pyrittävä löytämään korvaava arvo hylätylle tulokselle. Kun laboratorio on saanut harha-arvot poistetuksi, lasketaan standardipoikkeama (sb) analyysisarjojen välillä. >VIITTAUS KAAVIOON> tai 0, jos merkintä neliöjuuren alla on negatiivinen. Kokonaisstandardipoikkeamaa (st) käytetään n:n määrityksen keskiarvona valvontakorttien laadintaan (ks. liite II). Asetettuja raja-arvoja on pidettävä väliaikaisina, ja ne on tarkistettava. 3. Alustavien raja-arvojen tarkistus Edellä kuvattuja laadunvalvonnassa sovellettavaa raja-arvoja on pidettävä alustavina arvioina. Analyysisarjan sisällä hyväksyttävän tarkkuuden perusteella asetettujen raja-arvojen saattamiseksi ajan tasalle (2.1.2 jakso) on kerättävä lisää rinnakkaismääritysten tuloksia testattavista näytteistä. Tarkistusta edeltävän ajanjakson pituus riippuu analyysitiheydestä. Tiedot olisi tarkistettava esimerkiksi 10 uuden rinnakkaismäärityksen jälkeen. Kaikille kerätyille tuloksille on tämän jälkeen tehtävä Cochranin testi ja uudet raja-arvot on vahvistettava uuden standardipoikkeaman perusteella. Myöhemmin tehtävät valvontarajojen oikeellisuutta koskevat päätökset on tehtävä näiden lisätietojen perusteella. Analyysisarjan sisäistä tarkkuutta varten tehtyjen määritysten tulosten tarkistamistarve riippuu myös analyysitiheydestä. Kun valvontamateriaalin analyysistä (yksi analyysi erää kohti) on saatu 10 uutta datapistettä, on suositeltavaa tarkistaa alussa arvioidut standardipoikkeama ja keskiarvo. Kaikille tuloksille on tehtävä Grubbsin testi, jotta voidaan havaita suuresti poikkeavat arvot. Keskiarvo ja standardipoikkeama on laskettava uudelleen uusien tulosten perusteella. Lisäksi laboratorion olisi käytettävä tässä vaiheessa Cusumin korttia (BS S700: (1984) ja muutos 5480 (1987)) esimerkiksi reagenssien vanhenemiseen liittyvien ongelmien analysoimiseksi. Jokainen yksittäinen tulos, joka poikkeaa Cusumin "V-mask:in" rajoista, on tutkittava. Uudet raja-arvot (keskiarvo ja standardipoikkeama) on tarkastettava säännöllisesti Cusumin menetelmällä. Kaikki viitteet valvontamateriaalin kyseenalaisuudesta on tutkittava huolellisesti. 4. Tarkkuustietojen raportointi Laboratorion on toimitettava kansallisille toimivaltaisille viranomaisille seuraavat tiedot: - käytetty menetelmä, - analyysisarjan sisäinen standardipoikkeama (sw) ja laboratorion omat tarkkuutta koskevat raja-arvot, - analyysisarjojen välinen standardipoikkeama (sb), - kokonaisstandardipoikkeama (sl), - tarkkuustietojen saamiseksi tehtyjen analyysien lukumäärä. (1) M. Thompson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995). LIITE VI (6 artikla) ARVIOIJIEN ARVIOINTI JA AISTINVARAISISSA ANALYYSEISSÄ SAATUJEN TULOSTEN LUOTETTAVUUS Seuraavia menettelyjä sovelletaan käytettäessä pisteytysmenetelmiä (IDF-standardi 99C/1997). a) Toistettavuuksien määrittäminen Arvioijan on arvioitava kahdentoista kuukauden aikana vähintään kymmenen rinnakkaista sokeanäytettä. Tämä tapahtuu tavallisesti useissa eri arviointitilaisuuksissa. Yksittäisiä tuotteen laatuominaisuuksia koskevat tulokset arvioidaan seuraavasta kaavasta: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: w1: toistettavuusindeksi xi1: näytteen xi ensimmäisen arvioinnin pisteet xi2: näytteen xi toisen arvioinnin pisteet n: näytteiden lukumäärä Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. w1 ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko). b) Poikkeamaindeksin määrittäminen Tätä indeksiä käytetään tarkistettaessa, käyttääkö arvioija laadun arvioinnissa samaa asteikkoa kuin ryhmä kokeneita arvioijia. Arvioijan antamia pisteitä verrataan ryhmän antamien pisteiden keskiarvoon. Tulokset arvioidaan seuraavasta kaavasta: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: xi1; xi2: ks. a alakohta >VIITTAUS KAAVIOON>; >VIITTAUS KAAVIOON>: arvioijaryhmän antamien pisteiden keskiarvo näytteen xi ensimmäisessä ja toisessa arvioinnissa. n: näytteiden lukumäärä (vähintään kymmenen näytettä 12 kuukauden aikana). Arvioitavien näytteiden on oltava laadultaan tarpeeksi erilaisia. D1 ei saa olla suurempi kuin 1,5 (viiden pisteen asteikko). Jäsenvaltioiden on ilmoitettava tämän menettelyn soveltamisessa ilmenevistä vaikeuksista. c) Jäsenvaltion eri alueilla ja eri jäsenvaltioissa saatujen tulosten vertailu Vuosittain on järjestettävä mahdollisuuksien mukaan vähintään yksi koe, jonka avulla on mahdollista vertailla arvioijien eri alueilla saamia tuloksia. Jos tuloksissa ilmenee merkittäviä eroavaisuuksia, on toteutettava tarvittavat toimet niiden syiden selvittämiseksi ja vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi. Jäsenvaltiot voivat järjestää kokeita, joiden avulla on mahdollista vertailla oman maan arvioijien ja naapurijäsenvaltioiden arvioijien saamia tuloksia. Jos merkittäviä eroavaisuuksia ilmenee, on tehtävä perusteellinen tutkimus vertailukelpoisiin tuloksiin pääsemiseksi. Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle näiden vertailujen tuloksista. LIITE VII (6 artikla) VOIN AISTINVARAINEN ARVIOINTI 1. Soveltamisala Tässä esitetyn voin aistinvaraisen arviointimenettelyn tarkoituksena on tarjota käyttöön yhtenäinen menetelmä, jota voidaan soveltaa kaikissa jäsenvaltioissa. 2. Määritelmät Aistinvaraisella arvoinnilla tarkoitetaan tuotteen ominaisuuksien tutkimista aistielinten avulla. Raadilla tarkoitetaan valittujen arvioijien ryhmää, jonka jäsenet tekevät työtään arvioinnin aikana itsenäisesti ja vaikuttamatta toinen toisiinsa. Pisteytyksellä tarkoitetaan aistinvaraista arviota, jonka raati ilmaisee numeroasteikolla. Arvioinnissa on käytettävä virhenimikkeistöä. Luokituksella tarkoitetaan pisteytyksen perusteella tehtävää laatuluokitusta. Valvonta-asiakirjoilla tarkoitetaan asiakirjoja, joihin kirjataan kunkin ominaisuuden pistemäärä ja tuotteen lopullinen luokitus. (Valvonta-asiakirjaan voidaan merkitä myös tuotteen kemiallinen koostumus). 3. Arviointihuone 3.1 Järjestelyjen avulla on varmistettava, että ulkoiset tekijät eivät vaikuta arviointihuoneessa oleviin arvioijiin. 3.2 Arviointihuoneessa ei saa olla vieraita hajuja, ja huoneen on oltava helposti siivottavissa. Seinien on oltava vaaleat. 3.3 Arviointihuoneen ja sen valaistuksen on oltava sellaiset, että ne eivät vaikuta pisteytettävien tuotteiden ominaisuuksiin. Huoneessa on oltava asianmukainen lämpötilan säätö. 4. Arvioijien valinta Arvioijan on tunnettava erityyppiset voit, ja hänen on oltava pätevä tekemään aistinvaraista luokitusta. Toimivaltaisen viranomaisen on arvioitava arvioijan pätevyys säännöllisesti (vähintään kerran vuodessa). 5. Raatia koskevat vaatimukset Raadissa on oltava pariton määrä arvioijia, kuitenkin vähintään kolme. Raadin jäsenten enemmistön on oltava toimivaltaisen viranomaisen työntekijöitä tai hyväksyttyjä henkilöitä, jotka eivät ole meijeriteollisuuden palveluksessa. Ennen arviointia on otettava huomioon useita seikkoja, jotta arvioijat pystyisivät suoriutumaan tehtävistään mahdollisimman hyvin: - Arvioijat eivät saa sairastaa tauteja, jotka voivat vaikuttaa heidän tehtäviinsä. Tällaisissa tapauksissa paneeliin osallistuva arvioija on korvattava toisella arvioijalla. - Voidakseen osallistua arviointiin arvioijien on saavuttava paikalle ajoissa ja varmistettava, että heillä on tarpeeksi aikaa arvioinnin suorittamiseen. - Arvioijat eivät saisi käyttää vahvasti tuoksuvia tuotteita (kuten parfyymeja, partavesiä ja deodorantteja) eivätkä syödä vahvasti maustettuja ruokia. - Arvioijat eivät saisi tupakoida, syödä tai juoda muuta kuin vettä arviointia edeltävän 30 minuutin aikana. 6. Kunkin ominaisuuden arviointi 6.1 Aistinvarainen arviointi koskee seuraavaa kolmea ominaisuutta: ulkonäkö, kiinteys ja maitto. Ulkonäöllä tarkoitetaan seuraavia piirteitä: väri, silmin havaittava puhtaus, mahdollinen homekasvu ja irrallinen vesi. Irralisen veden esiintyminen tutkitaan IDF-standardin 112A/1989 mukaisesti. Kiinteydellä tarkoitetaan seuraavia piirteitä: kovuus ja levittyvyys. Voin kiinteyttä voidaan arvioida fysikaalisin menetelmin. Komission on tarkoitus yhtenäistää nämä menetelmät tulevaisuudessa. Maittoon kuuluvat seuraavat piirteet: haju ja maku. Huomattava poikkeama suositellusta lämpötilasta estää kiinteyden ja maiton luotettavan arvioinnin. Lämpötilan merkitys on keskeinen. 6.2 Kukin ominaisuus on arvioitava erikseen aistinvaraisesti. Pisteytyksen on oltava taulukon 1 mukainen. 6.3 Arvioijen voi olla aiheellista ennen varsinaisen arvioinnin alkua pisteyttää yhteisesti yhden tai useamman vertailunäytteen ulkonäkö, kiinteys ja maitto, jotta saavutetaan yhteinäinen arviointikäytäntö. 6.4 Hyväksymisen edellyttämät pistemäärät ovat seuraavat: >TAULUKON PAIKKA> Jos vaadittua pistemäärää ei saavuteta, virhe on kuvattava. Kunkin arvioijan antama pistemäärä on kirjattava valvonta-asiakirjaan erikseen jokaisen ominaisuuden osalta. Tuote hyväksytään tai hylätään enemmistön päätöksen perusteella. Tuloksia, joissa kunkin ominaisuuden pistemäärät poikkeavat toisistaan enemmän kuin yhden pisteen verran, ei saisi esiintyä usein (enintään yhdessä näytteessä 20:stä). Muussa tapauksessa raadin johtajan on tarkistettava raadin pätevyys. 7. Valvonta Raadin johtaja, jonka on oltava toimivaltaisen viranomaisen virkamies, vastaa yleisesti koko menettelystä; hän voi olla raadin jäsen. Hänen on allekirjoitettava kunkin ominaisuuden yksittäiset pistemäärät valvonta-asiakirjaan ja todistettava tuotteen hyväksyminen tai hylkääminen. 8. Näytteenotto ja näytteen valmistelu 8.1 - Puolueellisuuden välttämiseksi on suotavaa säilyttää näytteiden nimettömyys arvioinnin ajan. - Raadin johtajan on tehtävä tämän edellyttämät järjestelyt ennen arvointia ja raadin jäsenten poissaollessa. 8.2 Kun aistinvarainen arviointi tehdään kylmävarastolla, näyte otetaan voikairalla. Jos arviointi tehdään muualla kuin kylmävarastolla, näytettä on otettava vähintään 500 g. 8.3 Arvioinnin ajan voin lämpötilan tulisi olla 10-12 °C. Suuria poikkeamia on vältettävä kaikin keinoin. 9. Nimistö Katso taulukkoa 2. Taulukko 1: Voin pisteytys >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> Taulukko 2: Voin virhenimikkeistö I Ulkonäkö 1. irrallista vettä 2. epätasainen väri, kaksivärinen 3. juovikas 4. kirjava, marmoroitu 5. väriläiskiä 6. öljyn erottumista 7. liikaa värjätty 8. huokoinen 9. rakeinen 10. vieraita aineita 11. hometta 12. liukenematonta suolaa II Kiinteys 14. lyhyt, hauras, mureneva 15. paksu, salvamainen 16. tahmea 17. kova 18. pehmeä III Maitto (haju ja maku) 20. aromiton, mieto 21. epäpuhdas(1) 22. vieras maku, sivumaku, jälkimaku 23. vanhan maku 24. juustomainen 25. hapan 26. hiivan maku 27. a) keitetyn maku b) palaneen maku 28. homeen maku 29. eltaantunut 30. öljyinen, kalan maku 31. talin maku 32. a) hapettuneen maku b) metallin maku 33. rehun maku 34. kitkerä, karvas 35. liian suolainen 36. ummehtunut, mädäntynyt 37. maltaan maku 38. kemikaalin maku (1) Tätä virhenimitystä on käytettävä mahdollisimman harvoin ja ainoastaan, jos virhettä ei voida kuvata tarkemmin. LIITE VIII (7 artikla) MENETTELY, JOTA ON SOVELLETTAVA, KUN KEMIALLISTEN ANALYYSIEN TULOKSET OVAT KIISTANALAISIA 1. Uusi analyysi voidaan suorittaa toimeksiantajan pyynnöstä seitsemän työpäivän kuluessa ensimmäisen analyysin tulosten toimittamisesta, jos tuotteesta on saatavilla sinetöityjä rinnakkaisnäytteitä ja jos ne on asianmukaisesti varastoitu toimivaltaisten viranomaisten tiloihin. 2. Toimivaltainen viranomainen toimittaa nämä näytteet toiseen laboratorioon toimeksiantajan pyynnöstä ja tämän kustannuksella. Viimeksi mainitun laboratorion on oltava virallisten analyysien suorittamiseen hyväksytty laboratorio ja todistetusti pätevä kyseisten analyysien suorittamiseen. Pätevyys on osoitettava todisteilla menestyksellisestä osallistumisesta laboratorioiden välisiin tutkimuksiin, pätevyyskokeisiin tai laboratorioiden välisiin vertailuihin. Tämän toisen laboratorion on käytettävä vertailumenetelmää. Laboratorioissa saatuja tuloksia verrataan seuraavasti: a) Kun molempien laboratorioiden tulokset ovat toistettavuutta ja uusittavuutta koskevien vaatimusten mukaiset Lopullisena tuloksena ilmoitetaan molemmissa laboratorioissa saatujen koetulosten aritmeettinen keskiarvo. Lopullista tulosta arvioidaan ottamalla huomioon kriittinen ero, joka lasketaan seuraavan kaavan avulla: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: >VIITTAUS KAAVIOON>: molemmissa laboratorioissa saatujen kaikkien tulosten aritmeettinen keskiarvo mo: raja-arvo R: uusittavuus r: toistettavuus n1: laboratoriossa 1 saatujen tulosten lukumäärä n2: laboratoriossa 2 saatujen tulosten lukumäärä. Huomautus: Jos lopullinen tulos lasketaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> tai >VIITTAUS KAAVIOON> (ks. liitteessä IV oleva 3 ja 4 kohta), korvataan R2 ja r2 arvoilla R2x ja r2x. b) Kun molempien laboratorioiden tulokset ovat toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset, mutta eivät vastaa uusittavuutta koskevia vaatimuksia Jos ensimmäisen analyysin tulokset vahvistuvat toisessa analyysissä, analysoitu erä hylätään vaatimustenvastaisena. Muussa tapauksessa se hyväksytään. c) Kun ainoastaan toisen laboratorion tulokset ovat toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset Laboratoriossa, jossa toistettavuusvaatimus täyttyy, saatua lopullista tulosta käytetään päätettäessä analysoidun erän hyväksymisestä. d) Kun kummankaan laboratorion tulokset eivät ole toistettavuutta koskevien vaatimusten mukaiset, mutta vastaavat uusittavuutta koskevia vaatimuksia Sovelletaan a alakohtaa. e) Kun kummankaan laboratorion tulokset eivät ole toistettavuutta ia uusittavuutta koskevien vaatimusten mukaiset Analysoitu erä hyväksytään, jos toisessa laboratoriossa saadut tulokset johtavat tällaiseen johtopäätökseen. f) Kun tulokset on saatu käyttämällä validoimattomia menetelmiä Analysoitu erä hyväksytään, jos toisessa laboratoriossa saadut tulokset johtavat tällaiseen johtopäätökseen. 3. Toimivaltainen viranomainen toimittaa toisen analyysin tulokset toimeksiantajalle mahdollisimman pian. Toisesta analyysistä aiheutuvista kustannuksista vastaa toimeksiantaja silloin, kun analysoitu erä hylätään. 4. Jos toimeksiantaja asettaa näytteenottomenettelyn kyseenalaiseksi, on otettava mahdollisuuksien mukaan uudet näytteet viiden työpäivän kuluessa ensimmäisestä näytteenotosta. Jos uusien näytteiden ottaminen ei ole mahdollista, analysoitu erä hyväksytään. LIITE IX (8 artikla) VOIN VESIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN 1. Soveltamisala Seuraavassa esitetään vertailumenetelmänä voin vesipitoisuuden määrittämiseksi. 2. Viite IDF Standard 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling 3. Määritelmä Voin vesipitoisuus: massan pienenemisen määrä, kun tässä standardissa esitetty kuumentamisprosessi on suoritettu loppuun. Ilmaistaan grammoina 100:aa grammaa kohti. 4. Periaate Näytteestä haihdutetaan vesi hohkakiven läsnäollessa 102 °C:n lämpötilassa kuivausuunissa. 5. Laitteet ja tarvikkeet Tavallisia laboratoriotarvikkeita, erityisesti: 5.1 Analyysivaaka, herkkyys 1 mg. 5.2 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta (esimerkiksi vasta kuivattua piihappogeeliä, jossa on vesipitoisuuden merkkiainetta). 5.3 Kuivausuuni, jossa on tuuletus ja lämpötilan säätö ja jonka koko työtilan lämpötila pysyy 102 ± 2 °C:ssa. 5.4 Lasista, posliinista tai syöpymistä kestävästä metallista valmistettuja astioita, joiden korkeus on noin 20 mm ja halkaisija 60-80 mm. 5.5 Rakeista, pestyä hohkakiveä, jonka rakeiden halkaisija on 0,8-10 mm. 6. Näytteenotto Katso IDF 50 C: 1995 7. Suoritus 7.1 Näytteenvalmistus Laboratorionäytettä pannaan suljettavaan lasista tai sopivasta muovista valmistettuun astiaan siten, että astia on puoliksi - kaksi kolmasosalta täysi, lämmitetään, kunnes näyte on niin pehmeää, että se voidaan sekoittaa tasaiseksi (koneella tai käsin). Sekoituslämpötila ei saisi olla korkeampi kuin 35 °C. Näyte jäähdytetään huoneenlämpötilaan. Mahdollisimman pian jäähdytyksen jälkeen astia avataan ja näytettä sekoitetaan vähän aikaa (enintään 10 s) sopivalla esineellä, esimerkiksi lusikalla tai lastalla, ennen punnitsemista. 7.2 Vesipitoisuuden määritys 7.2.1 Astiaan pannaan noin 10 g hohkakiveä (5.4). 7.2.2 Astia kuivataan hohkakiven kanssa uunissa (5.3) a 102 ± 2 °C:n lämpötilassa vähintään 1 tunnin ajan. Huom. Kohdissa 7.2.2, 7.2.5 ja 7.2.7 mainitut kuivausajat lasketaan siitä, kun uunin lämpötila saavuttaa 102 ± 2 °C. 7.2.3 Astia saa jäähtyä eksikkaattorissa (5.2) vaakahuoneen lämpötilaan, ja se punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. 7.2.4 Astiaan punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä. 7.2.5 Astia pannaan uuniin 102 ± 2 °C:n lämpötilaan 3 tunniksi. 7.2.6 Astia saa jäähtyä eksikkaattorissa (5.2) vaakahuoneen lämpötilaan, ja se punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. 7.2.7 Kuivausjakso toistetaan 1 tunti kerrallaan, ja näyte jäähdytetään ja punnitaan kuten kohdassa 7.2.6, kunnes massa ei muutu (muutos on pienempi kuin 1 mg). Jos massa suurenee, otetaan laskutoimitusta varten alhaisin kirjattu massa. 8. Tulosten ilmoittaminen 8.1 Laskumenetelmä ja kaava Lasketaan vesipitoisuus W painoprosentteina seuraavalla kaavalla: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa >TAULUKON PAIKKA> Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 8.2 Toistettavuus Samaan aikaan tai hyvin nopeasti peräkkäin saman työntekijän samoissa olosuhteissa samasta näytemateriaalista tehdyn kahden yksittäisen määrityksen välinen absoluuttinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 %. 8.3 Uusittavuus Kahden eri laboratorioissa työskentelevän työntekijän yksittäiset ja toisistaan riippumattomat tulokset samasta näytemateriaalista eivät saa erota toisistaan enempää kuin 0,3 %. 9. Määritysseloste Määritysselosteessa on mainittava käytetty menetelmä ja saadut tulokset. Siinä on myös mainittava kaikki yksityiskohdat, joita ei mainita tässä kansainvälisessä standardissa tai joita pidetään valinnaisina, sekä tuloksiin mahdollisesti vaikuttaneet yksityiskohdat ja tapahtumat. Määritysselosteessa on esitettävä kaikki tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseksi tunnistamiseksi. LIITE X (8 artikla) VOIN RASVATTOMAN KUIVA-AINEEN MÄÄRITYS 1. Soveltamisala Seuraavassa esitetään vertailumenetelmä voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuuden määrittämiseksi. 2. Viitteet IDF Standard 50 C: 1995 - Milk and milk products - Methods of sampling. 3. Määritelmät Voin rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus: esitetyllä menetelmällä määritettyjen aineiden painoprosentti. Ilmaistaan grammoina 100:aa grammaa kohti. 4. Periaate Tunnetusta määrästä voita haihdutetaan vesi, rasvat uutetaan petrolieetterillä ja jäännös punnitaan. 5. Reagenssi Petrolieetteri, joka kiehuu välillä 30-60 °C. Reagenssista ei saa jäädä enempää kuin 1 mg jäännöstä, kun sitä on haihdutettu 100 ml. 6. Laitteet ja tarvikkeet 6.1 Analyysivaaka, herkkyys 1 mg. 6.2 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta (esimerkiksi vasta kuivattua piihappogeeliä, jossa on vesipitoisuuden merkkiainetta). 6.3 Kuivausuuni, jossa on tuuletus ja lämpötilan säätö ja jonka koko työtilan lämpötila pysyy 102 +- 2 °C:ssa. 6.4 Lasista, posliinista tai syöpymistä kestävästä metallista valmistettuja astioita, joiden korkeus nokkaan on 20 mm ja halkaisija 60-80 mm, ja lasinen sekoitussauva. 6.5 Suodatinupokas, sintterilasia, huokoisten halkaisija 16-40 μm, ja imupullo. 7. Näytteenotto Katso IDF 50 C: 1995 8. Suoritus 8.1 Näytteenvalmistus Laboratorionäytettä pannaan suljettavaan lasista tai sopivasta muovista valmistettuun astiaan siten, että astia on puoliksi - kaksi kolmasosalta täysi, lämmitetään, kunnes näyte on niin pehmeää, että se voidaan sekoittaa tasaiseksi (koneella tai käsin). Sekoituslämpötila ei saisi olla korkeampi kuin 35 °C. Näyte jäähdytetään huoneenlämpötilaan. Mahdollisimman pian jäähdytyksen jälkeen astia avataan ja näytettä sekoitetaan vähän aikaa (enintään 10 s) sopivalla esineellä, esimerkiksi lusikalla tai lastalla. 8.2 Määritys 8.2.1 Kuivataan astiaa, sauvaa (6.4) ja upokasta (6.5) uunissa (6.3) 1 tunti. Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja punnitaan yhdessä (astia, sauva ja upokas) 1 mg:n tarkkuudella (m0). Huomautuksia: - Yleensä jäähdyttämiseen riittää 45 min. - On tärkeää, että kullekin näytteelle käytetään samaa astian, sauvan ja upokkaan yhdistelmää, jos erästä määritetään useampi kuin yksi näyte. 8.2.2 Upokas otetaan pois ja astian ja sauvan yhteispaino kirjataan 1 mg:n tarkkuudella (m1). 8.2.3 Astiaan punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä (8.1) (m2). 8.2.4 Astia (jossa on sauva ja voi) pannaan uuniin 102 +- 2 °C:n lämpötilaan yli yön. 8.2.5 Astia (8.2.3) saa jäähtyä huoneen lämpötilaan. 8.2.6 Astiaan lisätään 15 ml lämmintä (noin 25 °C) petrolieetteriä ja irrotetaan lasisauvalla astiaan tarttunutta saostumaa mahdollisimman pian. Liuotin siirretään upokkaaseen ja sen annetaan suodattua imupulloon. 8.2.7 Vaihe (8.2.6) toistetaan vielä neljä kertaa. Jos astian pinnalla ei näy rasvajälkiä, siirretään neljännessä pesussa kvntitatiivisesti mahdollisimman paljon saostumaan upokkaaseen. Muussa tapauksessa vaihetta 8.2.6 toistetaan, kunnes kaikki rasvajäljet ovat hävinneet. 8.2.8 Saostumaa pestään upokkaassa 25 ml:lla lämmintä petrolieetteriä. 8.2.9 Kuivataan astia, lasisauva ja upokas uunissa 102 +- 2 °C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan. 8.2.10 Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa huoneenlämpötilaan ja punnitaan 1 milligramman tarkkuudella. 8.2.11 Vaiheet 8.2.9 ja 8.2.10 toistetaan, kunnes astian, sauvan ja upokkaan yhteinen massa (m3) ei muutu (muutos ei ole suurempi kuin 1 mg). 9. Tulosten ilmoittaminen 9.1 Rasvattoman kuiva-aineen määritys Lasketaan rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus (SNF) painoprosentteina seuraavalla kaavalla: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa m0 on tyhjän astian, lasisauvan ja upokkaan massa grammoina (8.2.1) m1 on tyhjän astian ja lasisauvan massa grammoina ennen kuivausta (8.2.2) m2 on koenäytteen, astian ja lasisauvan massa grammoina (8.2.3) m3 on astian, lasisauvan ja upokkaan sekä saostuman loppumassa grammoina (8.2.11) Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 9.2 Toistettavuus Samaan aikaan tai hyvin nopeasti peräkkäin saman työntekijän samoissa olosuhteissa samasta näytemateriaalista tehdyn kahden yksittäisen määrityksen välinen absoluuttinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 %. 9.3 Uusittavuus Kahden eri laboratoriossa työskentelevän työntekijän yksittäiset ja toisistaan riippumattomat tulokset samasta näytemateriaalista eivät saa erota toisistaan enempää kuin 0,2 %. 10. Määritysseloste Määritysselosteessa on mainittava käytetty menetelmä ja saadut tulokset. Siinä on myös mainittava kaikki yksityiskohdat, joita ei mainita tässä kansainvälisessä standardissa tai joita pidetään valinnaisina, sekä tuloksiin mahdollisesti vaikuttaneet yksityiskohdat ja tapahtumat. Määritysselosteessa on esitettävä kaikki tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseksi tunnustamiseksi. Huom. >TAULUKON PAIKKA> Voidaan päätellä, että rasvattoman kuiva-aineen luotettavuusarvot sopivat myös maidon rasvattoman kuiva-aineen määrittämiseen. LIITE XI (8 artikla) VOIN RASVAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN Rasvapitoisuus saadaan epäsuorasti määrittämällä vesipitoisuus ja rasvattoman kuiva-aineen pitoisuus liitteiden IX ja X mukaisesti. Rasvan painoprosenttimäärä on >VIITTAUS KAAVIOON> jossa W: veden painoprosentti SNF: rasvattoman kuiva-aineen painoprosentti >TAULUKON PAIKKA> LIITE XII (9 artikla) VOIÖLJYN, VOIN TAI KERMAN VANILLIINIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN HPLC-MENETELMÄLLÄ 1. Tarkoitus ja soveltamisala Tässä kuvataan menetelmä vanilliinin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista, voiöljystä tai kermasta. 2. Periaate Tietynsuuruinen näyte uutetaan isopropanoli/etanoli/asetonitriili -seoksella (1:1:2). Pääosa rasvasta saostetaan jäähdyttämällä - 15 ja - 20 °C:n välillä, minkä jälkeen näyte sentrifugoidaan. Laimennetaan vedellä, minkä jälkeen vanilliinipitoisuus määritetään HPLC-menetelmällä. 3. Välineet Tavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti seuraavat: 3.1 Pakastin, lämpötilansäätö - 15 ja - 20 °C:n välillä. 3.2 2 ml:n kertakäyttöruiskuja. 3.3 Kalvosuodattimia (huokoskoko 0,45 μm), jotka kestävät liuosta, joka sisältää 5 % uuttoliuosta (4.4). 3.4 Nestekromatografi, johon kuuluu pumppu (virtaus 1,0 ml/min), injektiolaite (tilavuus 20 μl, käsikäyttöinen tai automaattinen), UV-detektori (aallonpituus 306 nm, 0,01 AU täysi asteikko), piirturi tai integraattori ja 25 °C:seen termostoitu kolonni. 3.5 Analyyttinen HPLC-kolonni (pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,6 mm), joka on pakattu LiChrosper RP 18:lla (Merck, 5 μm) tai vastaavalla. 3.6 Esikolonni (pituus noin 20 mm, sisähalkaisija 3 mm), joka on kuivapakattu Perisorb RP 18:lla (30-40 μm) tai vastaavalla. 4. Reagenssit Kaikkien käytettävien reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa. 4.1 Isopropanoli 4.2 Etanoli 96 % (v/v) 4.3 Asetonitriili 4.4 Uuttoliuos Sekoitetaan isopropanolia (4.1), etanolia, (4.2) ja asetonitriiliä (4.3) suhteessa 1:1:2 (v/v). 4.5 Vanilliini (4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydi) 4.5.1 Vanilliinin kantaliuos (= 500 μg/ml) Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 50 mg (CM mg) vanilliinia (4.5) 100 ml:n mittapulloon, lisätään 25 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. 4.5.2 Vanilliinin standardiliuos (= 10 μg/ml) Pipetoidaan 5 ml vanilliinin kantaliuosta (4.5.1) 250 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. 4.6 Metanoli, HPLC-laatu 4.7 Jääetikka 4.8 Vesi, HPLC-laatu 4.9 HPLC:n liikkuva faasi Sekoitetaan 300 ml metanolia (4.6), noin 500 ml vettä (4.8) ja 20 ml etikkahappoa (4.7) 1000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä (4.8). Suodatetaan 0,45 μm:n suodattimen läpi (3.3). 5. Suoritus 5.1 Koenäytteen esikäsittely 5.1.1 Voi Lämmitetään näytettä kunnes se alkaa sulaa. Varotaan lämpötilan kohoamista paikallisesti yli 40 °C:n. Kun näyte on tarpeeksi juokseva, homogenoidaan ravistamalla. Sekoitetaan voita 15 sekunnin ajan ennen näytteen ottamista. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g (SM g) voita 100 ml:n mittapulloon. 5.1.2 Voiöljy Juuri ennen näytteenottoa pidetään voiöjyä sisältävää astiaa 40-50 °C:ssa lämpökaapissa kunnes öljy on sulanut täysin. Sekoitetaan näyte pyörivällä liikkeellä tai sekoittamalla välttäen liian voimakkaasta sekoittamisesta aiheutuvia ilmakuplia. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 4 g (SM g) voiöljyä 100 ml:n mittapulloon. 5.1.3 Kerma Lämmitetään näyte vesihauteessa tai lämpökaapissa 35-40 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan tasaiseksi pyörivällä liikkeellä ja tarvittaessa sekoittamalla. Jäähdytetään näyte nopeasti 20 +- 2 °C:seen. Jollei näyte ole homogeeninen, toistetaan sama menettely. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 10 g (SM g) kermaa 100 ml:n mittapulloon. 5.2 Testiliuoksen valmistus Lisätään noin 75 ml uuttoliuosta (4.4) testiannokseen (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3), sekoitetaan tai ravistellaan voimakkaasti noin 15 minuutin ajan ja täytetään merkkiin uuttoliuoksella (4.4). Siirretään noin 10 ml tätä uutetta tulpalla varustettuun koeputkeen. Sijoitetaan koeputki pakastimeen (3.1) noin 30 minuutiksi. Sentrifugoidaan kylmää uutetta 5 minuuttia, noin 2000 kierrosta minuutissa, ja dekantoidaan viipymättä. Annetaan dekantoidun liuoksen jäähtyä huoneenlämpöiseksi. Pipetoidaan 5 ml dekantoitunutta liuosta 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan osa siitä kalvosuodattimen läpi (3.3). Suodos on valmis HPLC-määritykseen. 5.3 Kalibrointi Pipetoidaan 5 ml vanilliinin standardiliuosta (4.5.2) 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 5 ml uuttoliuosta (4.4) ja täytetään merkkiin vedellä. Tämä liuos sisältää 0,5 μg/ml vanilliinia. 5.4 Määrittäminen HPLC-menetelmällä Annetaan kromatografialaitteen stabiloitua noin 30 minuutin ajan. Injisoidaan standardiliuos (5.3). Toistetaan kunnes kahden perättäisen injektoinnin piikkien pinta-alojen tai korkeuksien välinen ero on alle 2 %. Edellä kuvatuissa olosuhteissa vanilliinin retentioaika on noin 9 minuuttia. Analysoidaan standardiliuos (5.3) kahdesti injisoimalla 20 μl. Injisoidaan 20 μl testiliuosta (5.2). Määritetään saadun vanilliinipiikin pinta-ala tai korkeus. Toistetaan standardiliuoksen (5.3) rinnakkaismääritys, kun testinäytettä on injisoitu 10 kertaa (5.2). 6. Tulosten laskeminen Lasketaan vanilliinipiikkien keskimääräinen piikin pinta-ala (tai korkeus) (AC) rinnakkaismäärityksistä molempien testiliuossarjojen alussa ja lopussa (yhteensä 4 pinta-alaa tai korkeutta). Lasketaan vastekerroin (R): >VIITTAUS KAAVIOON> jossa CM on vanilliinin massa milligrammoina (4.5.1). Testinäytteen vanilliinipitoisuus (C, mg/kg) saadaan kaavasta >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: AS= testinäytteen vanilliinipiikin pinta-ala SM= testinäytteen massa grammoina (5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3). Kun vanilliinipitoisuus analysoidaan kermasta, merkkiainepitoisuus on ilmaistava milligrammoina merkkiainetta/kilogrammassa voirasvaa. Tämä saadaan kertomalla C tekijällä 100/f, jossa f on kerman rasvapitoisuus prosentteina (m/m). 20= kerroin, jolla otetaan huomioon standardi- ja testinäytteiden laimennokset 0,96= korjauskerroin testinäytteen ensimmäisen laimennoksen rasvapitoisuudelle Huomautus: Piikkien pinta-alojen sijasta voidaan käyttää piikkien korkeuksia (ks. 8.3 kohta). 7. Menetelmän tarkkuus 7.1 Toistettavuus (r) Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 16 mg/kg. 7.2 Uusittavuus (R) Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 27 mg/kg. 8. Toleranssirajat 8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä homogeenisuuden tarkistamiseksi. 8.2 Vaniljasta tai synteettisestä vanilliinista saatu merkkiaine. 8.2.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 250 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 250 g voirasvatonnia kohden. 8.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (DCr95) otetaan huomioon): - 221,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä) - 159,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 221,0 mg/kg ja 159,0 mg/kg välillä. 8.3 Vaniljakodista tai näiden kokonaisuutteista saatu merkkiaine 8.3.1 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydiä lisätään 100 g voiöljy- tai voitonnia kohden. Kun merkitään kermaa, lisätään 100 g voirasvatonnia kohden. 8.3.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus. Pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (DCr95) otetaan huomioon): - 79,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä) - 54,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 79,0 mg/kg ja 54,0 mg/kg välillä. 9. Huomautuksia 9.1 Toistettavuus r on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta samoissa olosuhteissa (sama laitteisto, sama laboratorio ja lyhyt aikaväli) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muita tietoja ole, todennäköisyys on 95 %. 9.2 Uusittavuus R on arvo, jonka alapuolella samalla menetelmällä samasta testiaineistosta eri olosuhteissa (eri suorittaja, eri laitteisto, eri laboratorio ja/tai eri ajankohta) saadun kahden yksittäisen testituloksen välinen absoluuttinen ero sijaitsee tietyllä todennäköisyydellä; jollei muita tietoja ole, todennäköisyys on 95 %. 9.3 Lisätyn vanilliinin takaisinsaanto tasolla 250 mg/kg voiöljyä vaihtelee välillä 97,0-103,8. Todettu keskimääräinen pitoisuus on ollut testeissä 99,9 % ja sen standardipoikkeama 2,7 %. 9.4 Standardiliuos sisältää 5 % uuttoliuosta, joka kompensoi piikin levenemisen, joka johtuu siitä, että näyteliuoksissa on 5 % uuttoliuosta. Tämän ansiosta kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa piikkien korkeuden avulla. 9.5 Analyysi perustuu lineaariseen kalibrointikäyrään, jonka leikkauspiste on nollassa. Lineaarisuus tulisi tarkastaa käyttäen standardiliuoksen (4.5.2) sopivia laimennoksia ensimmäistä analyysiä suoritettaessa ja sen jälkeen säännöllisin väliajoin sekä aina, kun HPLC-laitteistoon on tehty muutoksia tai sitä on korjattu. LIITE XIII (9 artikla) BEETA-APO-8'-KAROTEENIHAPON ETYYLIESTERIN SPEKTROMETRINEN MÄÄRITYS VOISTA JA VOIÖLJYSTÄ 1. Tarkoitus ja soveltamisala Tässä kuvataan menetelmä beeta-apo-8'-karoteenihapon (apokaroteeniesteri) etyyliesterin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi voista ja voiöljystä. Apokaroteeniesteri on kaikkien sellaisten menetelmässä kuvatuissa olosuhteissa valmistetussa uutteessa esiintyvien aineiden summa, jotka absorboivat valoa aallonpituudella 440 nm. 2. Periaate Voirasva liuotetaan liuotinbensiiniin ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 440 nm. Apokaroteeniesterin pitoisuus määritetään ulkoiseen standardiin vertaamalla. 3. Laitteet 3.1 Mittapipettejä, jakovälit 0,25; 0,50; 0,75 ja 1,0 ml. 3.2 Spektrofotometri, joka sopii käytettäväksi aallonpituudella 440 nm (ja 447-449 nm) ja jonka kyvettien valotie on 1 cm. 3.3 Mittapulloja, 20 ml ja 100 ml. 3.4 Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 0,1 mg. 4. Reagenssit Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. 4.1 Apokaroteeniesterin suspensio (noin 20 %). 4.1.1 Suspension pitoisuus määritetään seuraavasti: Mittapulloon (100 ml) punnitaan noin 400 mg, liuotetaan 20 ml:aan kloroformia (4.4) ja täytetään merkkiin sykloheksaanilla (4.5). Laimennetaan 5 ml tätä liuosta 100 ml:ksi sykloheksaanilla (liuos A). Laimennetaan 5 ml liuosta A 100 ml:ksi sykloheksaanilla. Mitataan absorbanssi aallonpituudella 447-449 nm (mitataan maksimi käyttäen sykloheksaania nollanäytteenä 1 cm:n kyveteillä). >VIITTAUS KAAVIOON> Amax= mittaliuoksen maksimiabsorbanssi A= näytteen paino (g) 2550= liuoksen A (1 %, 1 cm) arvo Suspension puhtaus on P (%). Huomautus: Apokaroteeniesterin suspensio on herkkä ilmalle, lämmölle ja valolle. Sitä voidaan säilyttää viileässä paikassa avaamattomassa, alkuperäisessä pakkauksessaan (typessä) noin 12 kuukautta. Avaamisen jälkeen sisältö on käytettävä nopeasti. 4.1.2 Apokaroteeniesterin standardiliuos, noin 0,2 mg/ml Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 0,100 g apokaroteeniesterin suspensiota (4.1.1) (Wg), liuotetaan liuotinbensiiniin (4.2), siirretään kvantitatiivisesti tilavuudeltaan 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin liuotinbensiinillä. Tämä liuos sisältää (W.P) 10 mg/ml apokaroteeniesteriä. Huomautus: Liuosta on säilytettävä viileässä paikassa valolta suojattuna. Käyttämätön liuos säilyy kuukauden. 4.2 Liuotinbensiini (40-60 °C). 4.3 Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa kahden tunnin ajan. 4.4 Kloroformi 4.5 Sykloheksaani 5. Suoritus 5.1 Koenäytteen esikäsittely 5.1.1 Voiöljy Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa. 5.1.2 Voi Näyte sulatetaan lämpökaapissa noin 45 °C:ssa ja suodatetaan edustava osa noin 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.3) sisältävän suodattimen läpi voimakkaalta luonnon- ja keinovalolta suojatussa ympäristössä pitäen lämpötila 45 °C:ssa. Kerätään sopiva määrä voirasvaa. 5.2 Määritys Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1 g voiöljyä tai voirasvaa (5.1.2), (Mg). Siirretään kvantitatiivisesti 20 ml:n (V ml) mittapulloon liuotinbensiiniä (4.2) käyttäen, täytetään merkkiin ja sekoitetaan huolellisesti. Siirretään määräosa 1 cm:n kyvettiin ja mitataan absorbanssi aallonpituudella 440 nm käyttäen liuotinbensiiniä nollanäytteenä. Liuoksessa esiintyvän apokaroteeniesterin pitoisuus saadaan kalibrointikäyrästä (C μg/ml). 5.3 Kalibrointikäyrä Pipetoidaan 0; 0,25; 0,5; 0,75 ja 1,0 ml apokaroteeniesterin standariliuosta (4.1.2) viiteen 100 ml:n mittapulloon. Laimennetaan ja täytetään merkkiin liuotinbensiinillä (4.2) ja sekoitetaan. Liuosten pitoisuudet vaihtelevat välillä 0-2 μg/ml, ja ne lasketaan tarkasti vertaamalla standardiliuoksen (4.1.2) pitoisuuteen (WP/10 mg/ml). Mitataan absorbanssit aallonpituudella 440 nm käyttäen liuotinbensiiniä (4.2) vertailuarvona. Piirretään absorbanssiarvot y-akselille apokaroteeniesterin pitoisuuden funktiona x-akselilla. 6. Tulosten laskeminen 6.1 Apokaroteeniesterin pitoissu, ilmaistuna yksiköissä mg/kg, saadaan seuraavasti: Voiöljy (C.V)/M Voi: 0,82 (C.V)M jossa: C= apokaroteeniesterin pitoisuus (μg/ml) kalibrointikäyrältä (5.3) luettuna V= koeliuoksen (5.2) määrä (ml) M= näytteen (5.2) massa (g) 0,82= korjauskerroin voin voirasvapitoisuudelle 7. Menetelmän tarkkuus 7.1 Toistettavuus 7.1.1 Voin analyysi Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 1,4 mg/ml. 7.1.2 Voiöljyn analyysi Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 1,6 mg/ml. 7.2 Uusittavuus 7.2.1 Voin analyysi Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 4,7 mg/kg. 7.2.2 Voiöljyn analyysi Kahden eri laboratorioissa eri laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 5,3 mg/kg. 7.3 Teknisten tietojen lähde Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1995 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 11 laboratoriota ja jossa määritettiin 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voin osalta ja 12 merkittyä näytettä (kuusi rinnakkaista sokeanäytettä) voiöljyn osalta. 8. Toleranssirajat 8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein. 8.2 Voi 8.2.1 Kokonaisarvo voille, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 22 mg/kg. 8.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 18,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä) - 13,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 18,0 mg/kg ja 13,0 mg/kg välillä. 8.3 Voiöljy 8.3.1 Kokonaisarvo voiöljylle, tausta-absorbanssi mukaan lukien, on 24 mg/kg. 8.3.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 20,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä) - 14,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 20,0 mg/kg ja 14,0 mg/kg välillä. LIITE XIV (9 artikla) VOIN JA VOIÖLJYN SISÄLTÄMÄN SITOSTEROLIN TAI STIGMASTEROLIN MÄÄRITYS KAASUKROMATOGRAFISESTI KAPILLAARIKOLONNILLA 1. Tarkoitus ja soveltamisala Tässä kuvataan menetelmä voin ja voiöljyn sisältämän sitosterolin tai stigmasterolin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Sitosteroli on (β-sitosterolin ja 22-dihydro-β-sitosterolin summa, kun muita sitosteroleita pidetään merkityksettöminä. 2. Periaate Voi tai voiöljy saippuoidaan kaliumhydroksidin avulla etanoliliuoksessa ja saippuoitumattomat osat uutetaan eetterillä. Sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografisesti kapillaarikolonnin avulla suhteessa sisäiseen standardiin betuliiniin. 3. Välineet 3.1 Saippuoimispullo, 150 ml, varustettuna palautusjäähdyttimellä, jossa on lasihiokset. 3.2 Erotussuppiloita, 500 ml. 3.3 Pulloja, 250 ml. 3.4 Paineentasauspulloja, 250 ml tai sisällöltään vastaavia, tarkoitettu pois heitettävän eetterin keräämiseen. 3.5 Lasikolonni, 350 mm x 20 mm, varustettuna hioslasiliitoksella. 3.6 Vesihaude tai tasalämpöinen mantteli. 3.7 Pieniä reaktiopulloja, 2 ml. 3.8 Kaasukromatografialaitteisto, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon kuuluu: 3.8.1 termostoitu kolonniuuni, joka ylläpitää halutun lämpötilan +- 1 °C:n tarkkuudella; 3.8.2 lämpötilasäätöinen injektori; 3.8.3 liekki-ionisaatiodetektori ja signaalinmuunnin vahvistin; 3.8.4 integraattori-piirturi, jota voidaan käyttää signaalinmuunnin-vahvistimen (3.8.3) kanssa. 3.9 Kvartsilasinen kapillaarikolonni, joka on kokonaan päällystetty BP 1:llä tai vastaavalla aineella tasaisesti 0,25 μm:n paksuudella; kolonnilla on pystyttävä erottamaan lanosterolin ja sitosterolin trimetyylisilyylijohdannaiset. Tähän tarkoitukseen sopii kolonni BP 1 (pituus 12 m ja sisähalkaisija 0,2 mm). 3.10 Mikroruisku, 1 μl, kärki karkaistua terästä, kaasukromatografiaa varten. 4. Reagenssit Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa. 4.1 Etanoli, puhtaus vähintään 95 % 4.2 Kaliumhydroksidi, 60 % liuos, liuotetaan 600 g kaliumhydroksidia (vähintään 85 %) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä 4.3 Betuliini, puhtaus vähintään 99 % 4.3.1 Betuliiniliuoksia dietyylieetterissä (4.4) 4.3.1.1 Sitosterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 1,0 mg/ml. 4.3.1.2 Stigmasterolin määritykseen käytettävän betuliiniliuoksen pitoisuuden on oltava 0,4 mg/ml. 4.4 Dietyylieetteri, analyysilaatua (ei sisällä peroksideja tai jäämiä) 4.5 Natriumsulfaatti, vedetön, rakeina, kuivattu ennalta 102 °C:ssa 2 tunnin ajan 4.6 Silylointireagenssi, esimerkiksi TRI-SIL (Pierce Chemical Co., Cat nro 49001) tai vastaava. (Varoitus: TRI-SIL on syttyvää, myrkyllistä, syövyttävää ja voi olla karsinogeenista. Laboratoriohenkilökunnan on tunnettava hyvin TRI-SIL:iin sovellettavat turvallisuusohjeet ja heidän on noudatettava välttämättömiä varotoimenpiteitä). 4.7 Lanosteroli 4.8 Sitosteroli, puhtaus tunnettu, vähintään 90 % (P) Huomautus 1: Kalibrointiin käytettävien standardiaineiden puhtaus on määritettävä standardimenetelmän avulla. Lähdetään olettamuksesta, että kaikki näytteessä olevat sterolit esiintyvät kromatogrammissa, että piikkien kokonaispinta-ala edustaa 100 %:sti steroleja ja että sterolit antavat saman detektorivasteen. Järjestelmän lineaarisuus on tarkistettava kyseeseen tulevilla pitoisuusalueilla. 4.8.1 Sitosterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,5 mg/ml (W1) sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4). 4.9 Stigmasteroli, puhtaus tunnettu, vähintään 90 % (P). 4.9.1 Stigmasterolin standardiliuos: valmistetaan 0,001 mg/ml:n tarkkuudella liuos, joka sisältää noin 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolia (4.9) dietyylieetterissä (4.4). 4.10 Seos resoluutiotestiä varten: valmistetaan liuos, joka sisältää 0,05 mg/ml lanosterolia (4.7) ja 0,5 mg/ml sitosterolia (4.8) dietyylieetterissä (4.4). 5. Suoritus 5.1 Standardiliuosten valmistus kromatografiaa varten: lisätään sisäinen standardiliuos (4.3.1) sopivaan sterolistandardiliuokseen samanaikaisesti saippuoidun näytteen (5.2.2) kanssa. 5.1.1 Sitosterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml sitosterolin standardiliuosta (4.8.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. 5.1.2 Stigmasterolin kromatografinen standardiliuos: siirretään 1 ml stigmasterolin standardiliuosta (4.9.1) kahteen reaktiopulloon (3.7) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. Lisätään 1 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.2) ja poistetaan eetteri typpivirran avulla. 5.2 Saippuoitumattomien osien valmistus 5.2.1 Sulatetaan voinäyte enintään 35 °C:n lämpötilassa. Sekoitetaan se huolellisesti. Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 1 g voita (W2) tai voiöljyä (W2) 150 ml:n pulloon (3.1). Lisätään 50 ml etanolia (4.1) ja 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (4.2). Liitetään pulloon palautusjäähdytin ja kuumennetaan noin 75 °C:ssa 30 minuuttia. Irrotetaan jäähdytin ja annetaan pullon jäähtyä huoneenlämpötilaan. 5.2.2 Lisätään pulloon 1,0 ml sisäistä standardiliuosta (4.3.1.1, jos määritetään sitosterolia, tai 4.3.1.2, jos määritetään stigmasterolia). Sekoitetaan huolellisesti. Siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2). Huuhdellaan pullo 50 ml:lla vettä ja tämän jälkeen 250 ml:lla dietyylieetteriä (4.4). Erotussuppiloa ravistetaan voimakkaasti 2 minuutin ajan ja annetaan faasien erottua. Poistetaan alempi vesifaasi ja huuhdellaan eetterifaasi ravistellen neljällä peräkkäisellä 100 ml:n määräosalla vettä. Huomautus 2: Emulsion muodostumisen välttämiseksi on välttämätöntä, että kaksi ensimmäistä vesihuuhtelua suoritetaan varoen (10 kertaa käännellen). Kolmannessa huuhtelussa voidaan ravistella voimakkaasti 30 sekuntia. Jos emulsio muodostuu, se voidaan poistaa lisäämällä 5-10 ml etanolia. Jos etanolia lisätään, on välttämätöntä suorittaa vielä kaksi voimakasta vesihuuhtelua. 5.2.3 Kaadetaan kirkas, saippuaton eetterifaasi lasikolonniin (3.5), joka sisältää 30 g vedetöntä natriumsulfaattia (4.5). Kerätään eetteri 250 ml:n pulloon (3.3). Lisätään kiehumakiviä ja haihdutetaan vesihauteessa tai tasalämpöisessä manttelissa lähes kuivaksi huolehtien siitä, että poistettavat liuottimet kerätään talteen. Huomautus 3: Jos näytteiden uutteet haihdutetaan kuivaksi liian korkeassa lämpötilassa, voi tapahtua sterolihäviöitä. 5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus 5.3.1 Siirretään pulloon jäänyt eetteriliuos 2 ml:n reaktiopulloon (3.7) käyttäen apuna 2 ml:aa eetteriä ja poistetaan eetteri typpivirralla. Pestään pullo kahdella ylimääräisellä 2 ml:n määräosalla eetteriä siirtäen ne reaktiopulloon ja poistaen eetteri kummallakin kerralla typellä. 5.3.2 Näyte silyloidaan lisäämällä 1 ml TRI-SILiä (4.6). Suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti aineen liukenemiseksi. Jos liukeneminen on epätäydellistä, lämmitetään 65-70 °C:seen. Annetaan seistä vähintään 5 minuutin ajan ennen injektointia kaasukromatografiin. Standardit silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet. Erotuskyvyn testaamiseen käytettävä seos (4.10) silyloidaan samalla tavoin kuin näytteet. Huomautus 4: Silyloinnin on tapahduttava vedettömissä oloissa. Betuliinin epätäydellinen silyloituminen näkyy betuliinipiikin lähellä olevana toisena piikkinä. Etanolin läsnäolo silyloinnin aikana häiritsee silylointia. Tämä voi olla seurausta riittämättömästä huuhtelusta uuton aikana. Jos tämä ongelma toistuu, uuttovaiheeseen voidaan lisätä viides huuhtelu, joka tapahtuu ravistellen voimakkaasti 30 sekunnin ajan. 5.4 Kaasukromatografinen analyysi 5.4.1 Ajon olosuhteiden valinta Kaasukromatografi ohjelmoidaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ohjeelliset ajon olosuhteet ovat seuraavat: - kolonnin lämpötila: 265 °C - injektorin lämpötila: 280 °C - detektorin lämpötila: 300 °C - kantajakaasun virtausnopeus: 0,6 ml/min - vedyn paine: 84 kPa - ilmanpaine: 155 kPa - jakosuhde: 10/1-50/1; jakosuhde on optimoitava valmistajan ohjeiden mukaisesti ja detektorin vasteen lineaarisuus on sitten validoitava kyseiselle pitoisuusalueelle. Huomautus 5: On erityisen tärkeää, että höyrystymiskammio puhdistetaan säännöllisesti. - injektoitavan aineen määrä: 1 μl TMSE-liuosta. Annetaan järjestelmän tasapainottua, kunnes saadaan riittävän stabiili vaste ennen minkään analyysin aloittamista. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan, jotta saadaan seuraavat edellytykset täyttävät kromatogrammit: - sitosterolin piikin on erotuttava riittävästi lanosterolista. Kuviossa 1 esitetään tyypillisen kromatogrammi, jollainen on saatava erotustestiin käytetystä silyloidusta seoksesta (4.10). - seuraavien steroleiden suhteellisten retentioaikojen olisi oltava suunnilleen: kolesteroli: 1,0 stigmasteroli: 1,3 sitosteroli: 1,5 betuliini: 2,5 - betuliinin retentioajan olisi oltava noin 24 minuuttia. 5.4.2 Analyysin suoritus Injektoidaan 1 μl silyloitua standardiliuosta (stigmasterolia tai sitosterolia) ja säädetään integraattorin kalibrointiparametrit. Injektoidaan uudelleen 1 μl silyloitua standardiliuosta vastekertoimen määrittämiseksi suhteessa betuliiniin. Injektoidaan 1 μl silyloitua näyteliuosta ja mitataan piikkien pinta-ala. Standardit on ajettava aina ennen ja jälkeen näytesarjan. Standardien injektointi voidaan yleensä suorittaa kuuden näytteen sarjan jälkeen. Huomautus 6: Stigmasterolipiikin integroinnin olisi käsitettävä kuviossa 2 b olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa osoitettujen pisteiden välinen alue. Arvioitaessa sitosterolia kokonaisuudessaan sitosterolipiikin integroinnin olisi sisällettävä 22-dihydro-β-sitosterolipiikin (stigmastanoli) pinta-ala, joka eluoituu välittömästi sitosterolin jälkeen (kuvio 3 b). 6. Tulosten laskeminen 6.1 Määritetään kahden standardin steroli- ja betuliinipiikkien pinta-ala jokaisen sarjan alussa ja lopussa ja lasketaan R1: >VIITTAUS KAAVIOON> Määritetään steroli- (stigmasteroli tai sitosteroli) ja betuliinipiikkien pinta-ala näytteestä ja lasketaan R2: >VIITTAUS KAAVIOON> W1= sterolin määrä (mg) 1 ml:ssa standardiliuosta (4.8.1 tai 4.9.1) W2= näytteen paino (g) (5.2.1) P= sterolistandardiliouksen puhtaus (4.8 tai 4.9). >VIITTAUS KAAVIOON> 7. Menetelmän tarkkuus 7.1 Voi 7.1.1 Toistettavuus 7.1.1.1 Stigmasteroli Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 19,3 mg/kg. 7.1.1.2 Sitosteroli Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 23,0 mg/kg. 7.1.2 Uusittavuus 7.1.2.1 Stigmasteroli Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 31,9 mg/kg. 7.1.2.2 Sitosteroli Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 8,7 % suhteessa määritysten keskiarvoon. 7.1.3 Tarkkuutta koskevien tietojen lähde Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1992 suoritetusta kokeesta, johon osallistui 8 laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolin osalta ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolin osalta. 7.2 Voiöljy 7.2.1 Toistettavuus 7.2.1.1 Stigmasteroli Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 10,2 mg/kg. 7.2.1.2 Sitosteroli Saman suorittajan samaa laitteistoa käyttäen samasta testiaineistosta mahdollisimman lähellä toisiaan tekemän kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli 3,6 % suhteessa määritysten keskiarvoon. 7.2.2 Uusittavuus 7.2.2.1 Stigmasteroli Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 25,3 mg/kg. 7.2.2.2 Sitosteroli Kahden määrityksen, jotka suoritetaan eri laboratorioissa eri laitteistoja käyttäen täysin samasta koemateriaalista, tulosten välinen ero ei saa olla yli 8,9 % suhteessa määritysten keskiarvoon. 7.2.3 Tarkkuutta koskevien tietojen lähde Tarkkuutta koskevat tiedot määritettiin vuonna 1991 suoritetusta kokeesta, johon osallistui yhdeksän laboratoriota ja jossa määritettiin kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) stigmasterolin osalta ja kuusi näytettä (kolme rinnakkaista sokeanäytettä) sitosterolin osalta. 8. Toleranssirajat 8.1 Merkitystä tuotteesta on otettava kolme näytettä sen tarkastamiseksi, että tuote on merkitty oikein. 8.2 Voi 8.2.1 Stigmasteroli 8.2.1.1 Stigmasterolin osalta lisätään 150 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 95 %) voitonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 85 %) voitonnia kohden eli 144,5 mg/kg. 8.2.1.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 116,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %) - 118,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %) - 81,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %) - 82,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 116,0 mg/kg ja 81,0 mg/kg välillä tai arvojen 118,0 mg/kg ja 82,0 mg/kg välillä. 8.2.2 Sitosteroli 8.2.2.1 Sitosterolin osalta lisätään 600 g sitosterolia (puhtaus vähintään 90 %) voitonnia kohden eli 540 mg/kg. 8.2.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 486,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %) - 358,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg välillä. 8.3 Voiöljy 8.3.1 Stigmasteroli 8.3.1.1 Stigmasterolin osalta lisätään 150 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 95 %) voiöljytonnia kohden eli 142,5 mg/kg tai 170 g stigmasterolia (puhtaus vähintään 85 %) voiöljytonnia kohden eli 144,5 mg/kg. 8.3.1.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 120,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %) - 122,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %) - 84,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 95 %) - 86,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun stigmasterolin puhtaus on 85 %). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 120,0 mg/kg ja 84,0 mg/kg välillä tai arvojen 122,0 mg/kg ja 86,0 mg/kg välillä. 8.3.2 Sitosteroli 8.3.2.1 Sitosterolin osalta lisätään 600 g sitosterolia (puhtaus vähintään 90 %) voiöljytonnia kohden eli 540 mg/kg. 8.3.2.2 Tuoteanalyysin kolmesta näytteestä saatujen tulosten avulla tarkistetaan lisättyjen merkkiaineiden määrä ja homogeenisuus, ja pienintä näistä arvoista verrataan seuraaviin raja-arvoihin (kun kriittinen ero 95 %:n todennäköisyydellä (CrD95) otetaan huomioon): - 486,0 mg/kg (95 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %) - 358,0 mg/kg (70 % pienimmästä lisättävästä määrästä, kun sitosterolin puhtaus on 90 %). Merkkiaineen pitoisuutta näytteessä, joka antaa pienimmän tuloksen, käytetään interpoloinnissa arvojen 486,0 mg/kg ja 358,0 mg/kg välillä. >PIC FILE= "L_2001037FI.004801.EPS"> >PIC FILE= "L_2001037FI.004901.EPS"> >PIC FILE= "L_2001037FI.005001.EPS"> LIITE XV (10 artikla) VERTAILUMENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN TOTEAMISEKSI UUHEN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI UUHEN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA 1. Tarkoitus Lehmänmaidon ja kaseinaatin toteaminen uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysin jälkeisten γ-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla. 2. Soveltamisala Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa. Se ei sovellu maidon ja juuston toteamiseen, joita on väärennetty lämpökäsittelyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla. 3. Menetelmän periaate 3.1 Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista. 3.2 Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja plasmiinilla (EC.3.4.21.7) pilkkominen. 3.3 Plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys. 3.4 Värjättyjen γ3- ja γ2-kaseiinikuvioiden (todiste lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samasta 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävien vertailustandardien geelistä. 4. Reagenssit On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita. Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa. Huom. Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 x 125 x 0,25 mm. Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään. Isoelektrinen fokusointi 4.1 Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi 4.1.1 Geelin varastoliuos Liuotetaan 4,85 g akryyliamidia 0,15 g N, N'-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS) 48,05 g ureaa 15,00 g glyserolia (87 % w/w) veteen ja täydennetään 100 ml:ksi, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa. Huom. Käytetään mieluummin kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta kuin annettuja painoltaan määrättyjä hermomyrkyllisiä akryyliamideja. Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan. Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 μS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amerblite MB-3 kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 μm:n kalvon läpi. 4.1.2 Geeliliuos Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (ks. 4.1.1). 9,0 ml varastoliuosta 24 mg de β-alaniinia 500 μl amfolyyttiä, pH 3,5-9,5(1) 250 μl amfolyyttiä, pH 5-7(2) 250 μl amfolyyttiä, pH 6-8(3) Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa kahden - kolmen minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä. Huom. Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2). 4.1.3 Katalyyttiliuokset 4.1.3.1 N, N, N', N'-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED) 4.1.3.2 40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER): Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täydennetään 2 ml:ksi. Huom. Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta. 4.2 Kontaktineste Petroli tai parafiiniöljy. 4.3 Anodiliuos Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi. 4.4 Katodiliuos Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä. Näytteen valmistus 4.5 Reagenssit proteiinien eristämiseksi 4.5.1 Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täydennetään 100 ml:ksi vedellä). 4.5.2 Dikloorimetaani. 4.5.3 Asetoni. 4.6 Proteiinia liuottava puskuriliuos Liuotetaan 5,75 g glyserolia (87 % w/w) 24,03 g ureaa 250 mg ditiotreitolia veteen ja täydennetään 50 ml:ksi. Huom: Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko. 4.7 Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla 4.7.1 Ammoniumkarbonaattipuskuri Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8. 4.7.2 Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml. 4.7.3 ε-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten Liuotetaan 2,624 g ε-aminokapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia. 4.8 Standardit 4.8.1 Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta uuhenmaidon ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana komission Mittaus- ja vertailumateriaalien tutkimuslaitoksesta (Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgia. 4.8.2 Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa. Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa nopeudella 2500 g 20 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6-8 °C, poistetaan ylempi rasvak