LIITE

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

Lisätään B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 ja B.58 luku seuraavasti:

”B.53. HERMOSTONKEHITYKSEEN KOHDISTUVIA MYRKYLLISYYSVAIKUTUKSIA KOSKEVA TUTKIMUS

JOHDANTO

1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 426 (2007); OECD:n lisääntymis- ja kehitystoksisuutta käsittelevä työryhmä käsitteli Kööpenhaminassa kesäkuussa 1995 tarvetta päivittää voimassa olevia OECD:n lisääntymis- ja kehitystoksisuutta koskevia testiohjeita ja laatia uusia ohjeita päätetapahtumille, joita ei vielä ole käsitelty (1). Työryhmä suositteli, että testiohje hermostonkehitykseen kohdistuvasta neurotoksisuudesta laaditaan Yhdysvaltojen ympäristönsuojeluviraston ohjeiden perusteella. Näitä ohjeita on sittemmin tarkistettu (2). Kööpenhaminassa pidettiin kesäkuussa 1996 toinen kuulemiskokous, jossa sihteeristölle annettiin ohjeita hermostonkehitykseen kohdistuvaa neurotoksisuutta koskevien uusien testiohjeiden laadinnasta, mukaan lukien keskeiset näkökohdat, kuten eläinlajin valinta, annostelujakso, testausajankohta, arvioitavat päätetapahtumat ja tuloksien arviointia koskevat kriteerit. Yhdysvaltojen ohjeet neurotoksisuutta koskevasta riskiarvioinnista julkaistiin vuonna 1998 (3). OECD:n asiantuntijakomitean kokous ja International Life Science Institute -organisaation Risk Science Institute -tiedeinstituutin työryhmä kokoontui lokakuussa 2000, ja asiantuntijoiden kuulemiskokous pidettiin Tokiossa vuonna 2005. Näissä kokouksissa käsiteltiin nykyisen testiohjeen tieteellisiä ja teknisiä kysymyksiä, ja kokouksien suositukset (4)(5)(6)(7) otettiin huomioon tämän testimenetelmän kehittämisessä. Lisätiedot tämän testimenetelmän toteutuksesta, tulkinnasta ja terminologiasta sisältyvät lisääntymistoksisuuden testaamista ja arviointia koskevaan OECD:n ohjeasiakirjaan 43 (8) ja neurotoksisuuden testaamista koskevaan ohjeasiakirjaan 20 (9).

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT

2. Useiden kemikaalien tiedetään aiheuttavan ihmisten ja muiden lajien hermostonkehitykselle myrkyllisyysvaikutuksia (10)(11)(12)(13). Hermostonkehitykselle mahdollisesti aiheutuvien myrkyllisyysvaikutusten määrittelyä voidaan tarvita kemikaalin myrkyllisen vaikutusten arviointiin. Tutkimukset hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksia on suunniteltu siten, että niillä tarjotaan tietoja, myös annos-vastesuhteen kuvauksia, sellaisista mahdollisista toiminnallisista ja morfologisista vaikutuksista poikasten kehittyvään hermostojärjestelmään, jotka voivat aiheutua kemikaalille altistumisesta kohdussa ja varhaisessa kehitysvaiheessa.

3. Tutkimus hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista voidaan suorittaa erillisenä tutkimuksena, joka sisällytetään tutkimukseen lisääntymiselle ja/tai täysikasvuisille eläimille aiheutuvista myrkyllisyysvaikutuksista (kuten testimenetelmät B.34 (14), B.35 (15) ja B.43 (16)), tai se voidaan lisätä tutkimukseen syntymää edeltävistä myrkyllisyysvaikutuksista (esim. testimenetelmä B.31 (17)). Jos tutkimus hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista sisällytetään toiseen tutkimukseen, on tärkeää säilyttää kummankin tutkimustyypin yhtenäisyys. Kaikissa testeissä olisi noudatettava voimassa olevaa lainsäädäntöä taikka viranomaisten tai instituutioiden antamia ohjeita koe-eläinten käytöstä tutkimuksissa (kuten 18).

4. Koelaboratorion on otettava huomioon kaikki testikemikaalista saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen suorittamista. Näihin sisältyvät kemikaalin tunnistetiedot ja rakenne, sen fysikokemialliset ominaisuudet, kaikkien muiden kemikaalilla in vivo tai in vitro suoritettujen toksisuuskokeiden tulokset, rakenteellisesti samanlaisten aineiden toksikologiset tiedot ja kemikaalin odotettu käyttötapa. Nämä tiedot ovat välttämättömiä kaikkien asianosaisten vakuuttamiseksi siitä, että kokeella on merkitystä ihmisten terveyden suojelulle ja että sen avulla voidaan valita sopiva aloitusannos.

TESTIN PERIAATE

5. Testikemikaali annostellaan eläimille tiineys- ja imetysaikana. Emoja testataan tiineisiin ja imettäviin naaraisiin aiheutuvien vaikutusten arvioimiseksi ja mahdollisesti vertailutietojen tarjoamiseksi (emot poikasiin verrattuna). Poikaset valitaan poikueista sattumanvaraisesti neurotoksisuuden arviointia varten. Arviointiin sisältyy näkyvien neurologisten ja käytösmuutosten havainnointi, mukaan lukien arviointi fyysisestä kehityksestä, käytöksen kehityksestä, motorisesta aktiviteetista, motorisesta ja aistien toiminnasta sekä oppimisesta ja muistista; myös aivojen painoa ja neuropatologiaa syntymän jälkeisen kehityksen ja kypsän iän aikana arvioidaan.

6. Jos testimenetelmä toteutetaan erillisenä tutkimuksena, myös muita kussakin ryhmässä käytettävissä olevia eläimiä voidaan käyttää tiettyihin hermostoperäisiin käyttäytymisoireisiin liittyviin, neuropatologisiin, neurokemiallisiin tai sähköfysiologisiin tutkimuksiin. Näin voidaan täydentää tässä testimenetelmässä suositelluista tutkimuksista saatuja tietoja (16)(19)(20)(21). Täydentävät tutkimukset voivat olla erityisen hyödyllisiä, kun empiiriset havainnot tai ennakoidut vaikutukset taikka menettely/vaikutustapa osoittavat kemikaalin neurotoksisuuden olevan tietyn tyyppistä. Näitä täydentäviä toimenpiteitä voidaan soveltaa emoihin ja poikasiin. Lisäksi voidaan käyttää ex vivo- tai in vitro -menettelyjä, kunhan ne eivät vaikuta in vivo -menettelyjen yhtenäisyyteen.

TESTIN VALMISTELU

Eläinlajin valinta

7. Suositeltavin testieläinlaji on rotta, mutta muita lajeja voidaan käyttää tarvittaessa. On kuitenkin pantava merkille, että tässä testimenetelmässä määritetyt tiineysajan ja synnytyksen jälkeiset päivät ovat ominaisia yleisesti käytetyille rottakannoille, joten eri lajeja tai epätavallisia kantoja käytettäessä olisi valittava vertailukelpoiset päivät. Toisen lajin käyttöä olisi perusteltava toksikologisilla, farmakokineettisillä ja/tai muilla tiedoilla. Perusteluun olisi sisällyttävä lajispesifisten syntymän jälkeisiin hermostoperäisiin käytösoireisiin liittyvien ja neuropatologisten arviointien saatavuus. Jos aiemmassa testissä ilmeni ongelmia, siinä käytettyä lajia/kantaa olisi harkittava tarkemmin. Eri rottakantojen käyttöön liittyvien tehokkuuskriteerien vuoksi on todistettava, että valitun kannan hedelmällisyys ja vaste on riittävä. Muiden lajien käytön luotettavuutta ja herkkyyttä hermostonkehitykseen kohdistuvien myrkyllisyysvaikutuksien havaitsemiseksi tulee dokumentoida.

Koe-eläinten häkit ja eläinten ruokinta

8. Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 ± 3 °C. Vaikka suhteellisen kosteuden pitäisi olla vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Valaistussyklin suuntaa on myös mahdollista muuttaa ennen parittelua ja tutkimuksen keston ajaksi, jotta toimintaa ja käytöstä koskevia päätetapahtumia voidaan arvioida pimeän aikana (punaisessa valossa), eli silloin kuin eläimet ovat tavanomaisesti aktiivisia (22). Kaikkiin valaistussykliin tehtäviin muutoksiin olisi sisällyttävä riittävä sopeutumisaika, jotta eläimet voivat mukautua uuteen sykliin. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon ja veden tyyppi olisi ilmoitettava ja kummankin epäpuhtaudet olisi analysoitava.

9. Eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai muutaman samaa sukupuolta olevan eläimen ryhmissä. Parituksen tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa häkeissä. Kun parituksen voidaan todeta tapahtuneen tai viimeistään tiineyden 15. päivänä kukin pariutunut naaras siirretään omaan synnytys- tai poikimishäkkiinsä. Häkit on sijoitettava siten, että niiden sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Paritetuille eläimille on annettava synnytyksen lähestyessä asianmukaiset ja etukäteen määritellyt pesäntekoaineet. On tiedossa, että epäasianmukainen käsittely tai tiineyden aikainen stressi voivat johtaa haitallisiin vaikutuksiin, kuten sikiön menetykseen sekä sikiön ja vastasyntyneen kehityksen muutoksiin. Jotta sikiön menettäminen muista kuin altistukseen liittyvistä syistä estettäisiin, tiineiden eläinten tarpeetonta käsittelyä sekä ulkoisten tekijöiden, kuten melun, aiheuttamaa stressiä pitäisi välttää.

Eläinten valmistelu

10. Olisi käytettävä terveitä eläimiä, jotka on totutettu laboratorio-olosuhteisiin ja joita ei ole aiemmin käytetty testeihin, ellei tutkimusta sisällytetä toiseen tutkimukseen (ks. 3 kohta). Koe-eläinten laji, kanta, alkuperä, sukupuoli, paino ja/tai ikä on tunnettava. Kullekin eläimelle olisi annettava oma tunnistenumero ja se olisi merkittävä sillä. Eläinten tulee olla kaikissa testiryhmissä samanpainoisia ja -ikäisiä niin tarkasti kuin on käytännössä mahdollista ja olla tutkittavan lajin ja kannan normaaleissa rajoissa. Kullakin annostasolla tulee käyttää nuoria täysikasvuisia naaraita, jotka eivät ole synnyttäneet. Sisarusten pariutumista tulee välttää, ja tämän varmistamisesta olisi huolehdittava. Tiineyspäivä 0 on se päivä, jolloin vaginan tulpitus ja/tai sperma havaitaan. Riittävä sopeutumisaika (esim. kahdesta kolmeen päivään) pitäisi varmistaa, kun toimittajalta ostetaan eläimiä, joiden tiineyttä valvotaan. Paritetut naaraat olisi jaettava satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmään, ja eläimet olisi jaettava mahdollisuuksien mukaan tasaisesti molempiin ryhmiin (jotta kaikki ryhmät jaetaan tasaisesti, suositellaan satunnaista ositettua menettelyä, kuten sellaista, joka perustuu ruumiinpainoon). Samoin on meneteltävä saman uroksen hedelmöittämien naaraiden kohdalla.

TESTIN SUORITTAMINEN

Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

11. Kussakin testi- ja kontrolliryhmässä pitäisi olla tarpeeksi monta testikemikaalille altistettua tiineenä olevaa naarasta, jotta varmistetaan, että neurotoksisuuden arviointia varten saadaan tuotettua riittävä määrä poikasia. Kutakin annostasoa varten suositellaan 20 poikuetta. Rinnakkaisia ja porrastettuja ryhmiä koskevat annostussuunnitelmat sallitaan, jos kunkin ryhmän poikueiden kokonaismäärät saavutetaan ja rinnakkaiskokeita varten käytetään asianmukaisia tilastollisia malleja.

12. Syntymän jälkeisenä päivänä, jäljempänä ’SJP’, 4 tai sitä ennen (synnytyspäivä on syntymän jälkeinen päivä 0) kunkin poikueen kokoa olisi mukautettava poistamalla ylimääräiset poikaset satunnaisella valinnalla, jotta kaikkien poikueiden koko on sama (23). Poikueen koko ei saisi ylittää käytetyn jyrsijäkannan keskimääräistä poikuekokoa (8–12). Poikueessa olisi oltava — mahdollisimman suuressa määrin — yhtä monta koiras- ja naaraspuolista poikasta. Poikasten valikoiva poistaminen esimerkiksi ruumiinpainon perusteella ei ole tarkoituksenmukaista. Poikueiden yhdenmukaistamisen jälkeen (karsinta) ja ennen toiminnallisten päätetapahtumien testaamista kukin vieroitusta edeltävään tai sitä seuraavaan testiin tarkoitettu poikanen olisi tunnistettava yksilöllisesti käyttäen mitä tahansa inhimillistä keinoa poikasen tunnistamiseksi (esim. 24).

Eläinten jakaminen toiminnallisiin ja käyttäytymistä mittaaviin testeihin, aivojen paino ja neuropatologiset arvioinnit

13. Testimenetelmässä käytetään erilaisia tapoja jakaa kohdussa ja imettämisen aikana altistetut eläimet toiminnallisia ja käyttäytymistä mittaavia testejä, sukukypsyyttä ja aivojen painon määrittelyä sekä neuropatologista arviointia varten (25). Muita hermostoperäisiin käytösoireisiin (kuten sosiaalinen käyttäytyminen), neurokemiaan tai neuropatologiaan liittyviä testejä voidaan lisätä tapauskohtaisesti sillä edellytyksellä, että alkuperäisten vaadittujen testien luotettavuutta ei vaaranneta.

14. Poikaset valitaan kustakin annosryhmästä ja niistä tehdään tutkittavien ominaisuuksien arviointi syntymän jälkeisenä päivänä 4. Poikaset valitaan siten, että kustakin poikueesta valitaan mahdollisuuksien mukaan kumpaakin sukupuolta jokaiseen annosryhmään niin, että ne ovat tasapuolisesti edustettuina kaikissa testeissä. Motorista aktiviteettia koskevassa testissä olisi testattava samaa uros- ja naarasparia kaikissa vieroitusta edeltävissä ikäryhmissä (ks. 35 kohta). Kaikkien muiden testien osalta voidaan valita samoja tai erillisiä uros- ja naaraspareja erilaisiin käyttäytymistä mittaaviin testeihin. Kognitiivisia toimintoja mittaaviin vastavieroitettuja ja täysikasvuisia vertaileviin testeihin voidaan joutua valitsemaan eri poikaset. Näin vältetään se, että ikä ja aikaisempi opetus häiritsevät näitä mittauksia (26)(27). Vieroitusajankohdalla (syntymän jälkeinen päivä 21) poikaset, joita ei ole valittu testeihin, voidaan lopettaa inhimillisellä tavalla. Kaikki poikasten valintaan liittyvät muutokset olisi raportoitava. Tilastollisen mittayksikön pitäisi olla poikue (tai emo), ei poikanen.

15. On erilaisia tapoja valita poikaset vieroitusta edeltäviin ja sitä seuraaviin tutkimuksiin, kognitiivisiin testeihin, patologisiin tutkimuksiin jne. (ks. kuva 1 yleisestä suunnittelusta ja liite 1 valintatapoja koskevista esimerkeistä). Suositellut eläinten vähimmäismäärät kussakin annosryhmässä vieroitusta edeltäviä ja sitä seuraavia tutkimuksia varten ovat seuraavat:

Kliiniset havainnot ja ruumiinpaino Kaikki eläimet Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 20/sukupuoli (1/sukupuoli/poikue) Aivojen paino (fiksaation jälkeen) SJP 11–22 10/sukupuoli (1/poikue) Aivojen paino (ilman fiksaatiota) ~ SJP 70 10/sukupuoli (1/poikue) Neuropatologia (immersio- tai perfuusiofiksaatio) SJP 11–22 10/sukupuoli (1/poikue) Neuropatologia (perfuusiofiksaatio) SJP ~ 70 10/sukupuoli (1/poikue) Sukukypsyys 20/sukupuoli (1/sukupuoli/poikue) Muut kehitykseen liittyvät tuntomerkit (vapaaehtoinen) Kaikki eläimet Käytöksen kehitys 20/sukupuoli (1/sukupuoli/poikue) Motorinen aktiviteetti 20/sukupuoli (1/sukupuoli/poikue) Motorinen ja aistien toiminta 20/sukupuoli (1/sukupuoli/poikue) Oppiminen ja muisti 10/sukupuoli (1) (1/poikue)

Annostasot

16. On käytettävä vähintään kolmea annostasoa ja rinnakkaista kontrolliryhmää. Annostasojen välit määritetään siten, että toksiset vaikutukset saadaan porrastettua. Mikäli testiaineen fysikokemialliset ominaisuudet tai biologiset vaikutukset eivät rajoita korkeimman annostason valintaa, se olisi valittava siten, että emoille aiheutetaan joitain myrkytysoireita (esim. kliinisiä löydöksiä, ruumiinpainon väheneminen (ei yli 10 prosenttia) ja/tai todisteet annostusta rajoittavasta toksisuudesta kohde-elimessä). Korkeinta annostasoa voidaan rajoittaa niin, että se on 1 000 mg/painokilo/vrk. On myös joitain poikkeustapauksia. Esimerkiksi odotettavissa oleva ihmisten altistuminen voi merkitä, että tarvitaan korkeampaa annostasoa. Vaihtoehtoisesti olisi tehtävä esitutkimuksia tai alustavia raja-annostutkimuksia sellaisen suurimman käytettävän annoksen määrittämiseksi, jonka pitäisi aiheuttaa emoille vähiten myrkyllisyysvaikutuksia. Jos testikemikaalin on todettu aiheuttavan sikiönkehitykseen kohdistuvia myrkyllisyysvaikutuksia tavanomaisessa kehitystoksisuutta koskevassa tutkimuksessa tai esitutkimuksessa, suurimman annostason pitäisi olla suurin annos, joka ei aiheuta liikaa myrkyllisiä vaikutuksia poikasissa tai kohdussa taikka vastasyntyneiden kuolemaa tai epämuodostumia, jotka riittäisivät estämään neurotoksisuuden asianmukaisen arvioinnin. Pienimmän annostason tavoitteena pitäisi olla se, että sillä ei aiheuteta mitään emoihin tai kehitykseen kohdistuvia myrkyllisyysvaikutuksia, mukaan lukien neurotoksisuus. Annostasot valitaan asteittain alenevasti. Näin osoitetaan mahdollinen annosvaste ja haitaton vaikutustaso (NOAEL) tai lähellä havaitsemisrajaa olevat annokset, joiden perustella voidaan määrittää vertailukohtana oleva annos. Vähintään kaksinkertaiset ja enintään nelinkertaiset annostasojen välit ovat usein optimaaliset, kun asetetaan alenevat annostasot. Usein on parempi lisätä neljäs annosryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (esimerkiksi yli kymmenkertaisia annosvälejä).

17. Annostasojen valinnassa olisi otettava huomioon kaikki aikaisemmat toksisuustiedot sekä tiedot testikemikaalin tai sen kanssa samantyyppisten materiaalien metaboloitumisesta ja toksikokineettisistä ominaisuuksista. Näillä tiedoilla voidaan myös tukea sen osoittamista, että annostus on valittu oikein. Annosten antamista suoraan poikasille olisi harkittava altistus- ja farmakokineettisten tietojen perusteella (28)(29). Ennen kuin tehdään tutkimuksia suorasta annostuksesta, olisi harkittava huolellisesti etuja ja haittoja (30).

18. Rinnakkaisen kontrolliryhmän pitäisi olla joko plaseboa saava kontrolliryhmä tai kantaja-ainetta saava kontrolliryhmä, mikäli testikemikaalin antamisen yhteydessä käytetään kantaja-ainetta. Kaikille ryhmille annetaan tavanomaisesti tilavuudeltaan sama määrä joko testikemikaalia tai kantaja-ainetta eläimen painon perusteella. Jos annostelun helpottamiseksi käytetään kantaja-ainetta tai muuta lisäainetta, on syytä selvittää: sen vaikutus imeytymiseen, jakautumiseen, metaboloitumiseen tai elimistössä säilymiseen; vaikutukset testikemikaalin kemiallisiin ominaisuuksiin, jotka saattavat muuttaa sen toksisia ominaisuuksia; sekä vaikutukset koe-eläinten ravinnon ja juoman kulutukseen tai ravitsemustilaan. Kantaja-aine ei saisi aiheuttaa vaikutuksia, jotka voivat olla esteenä tutkimuksen tulkinnalle, eikä sillä saisi olla toksisia hermostoperäisiä käyttäytymiseen kohdistuvia vaikutuksia tai vaikutuksia lisääntymiseen tai kehitykseen. Jos käytetään uutta kantaja-ainetta, kantaja-ainetta saavan kontrolliryhmän lisäksi tutkimukseen sisällytetään plaseboa saava kontrolliryhmä. Kontrolliryhmän tai -ryhmien eläimiä tulee käsitellä samalla tavoin kuin koeryhmän eläimiä.

Antotapa

19. Testikemikaalia tai kantaja-ainetta olisi annettava ihmisten altistumiselle asianmukaisinta reittiä. Tämä perustuu koe-eläinten metaboloitumisesta ja jakautumisesta saatavilla olevaan tietoon. Ainetta annetaan tavallisesti suun kautta (esim. letkulla, ravinnon tai juomaveden välityksellä), mutta myös muuta reittiä voidaan käyttää (esim. ihon tai inhalaation kautta). Tämä riippuu ominaisuuksista taikka odotettavissa olevista tai tunnetuista ihmisen altistusreiteistä (lisäohjeita annetaan ohjeasiakirjassa 43 (8)). Valitusta antoreitistä olisi esitettävä perustelu. Testiaine annetaan päivittäin suunnilleen samaan aikaan.

20. Kunkin eläinyksilön annoksen pitäisi yleensä perustua viimeisimpään eläimen ruumiin painon määritykseen. Annoskoon määrittämisessä on kuitenkin toimittava erityisen huolellisesti viimeisen tiineyskolmanneksen aikana. Jos testikemikaalia saaneissa emoissa havaitaan kuitenkin liian suuria myrkyllisyysvaikutuksia, nämä eläimet on lopetettava inhimillisellä tavalla.

21. Testikemikaalia tai kantaja-ainetta olisi annosteltava vähintään päivittäin paritelluille naaraille munasolun kohdun seinämään kiinnittymisestä lähtien (tiineyspäivä 6) koko imetyksen ajan (SJP 21), jotta poikaset altistetaan testikemikaalille syntymää edeltävän ja sen jälkeisen neurologisen kehityksen aikana. Ikää, jolloin annostus aloitetaan sekä annostuksen kestoa ja tiheyttä voidaan mukauttaa, jos on näyttöä, jolla tuetaan ihmisten altistumisen suhteen asianmukaisempaa koejärjestelyä. Annostuksen kestoa olisi mukautettava toisiin lajeihin nähden, jotta altistuminen aivojen kehityksen varhaisessa vaiheessa (joka vastaa ihmisen aivojen syntymää edeltävää ja varhaista syntymän jälkeistä kasvuvaihetta) varmistetaan. Annostelu voidaan aloittaa tiineyden alkamisajankohdasta (tiineyspäivä 0). On kuitenkin kiinnitettävä huomiota siihen mahdollisuuteen, että testikemikaali voi päättää tiineyden, ennen kuin munasolu kiinnittyy kohdun seinämään. Tiineyspäivänä 6 aloitetulla annostuksella vältettäisiin tämä riski, mutta kehitysvaiheita tiineyspäivän 0 ja 6 välillä ei katettaisi. Jos laboratorio hankkii aikaparitettuja eläimiä, ei ole käytännöllistä aloittaa annostusta tiineyspäivänä 0, vaan asianmukainen aloituspäivä on tiineyspäivä 6. Koelaboratorion olisi mukautettava annostusta testiaineen vaikutuksia koskevien asianmukaisten tietojen, aikaisempien kokemusten ja logististen näkökohtien perusteella. Tähän voi sisältyä annostuksen jatkaminen vieroituksen jälkeen. Annostelua ei suoriteta synnytyspäivänä niille eläimille, joiden synnytys on kesken. Yleisesti oletetaan, että poikaset altistuvat äidinmaidon kautta, mutta poikasille suoraan annettavia annoksia olisi harkittava tapauksissa, joissa poikasten jatkuvasta altistuksesta puuttuu näyttöä. Näyttö jatkuvasta altistuksesta voidaan saada esimerkiksi farmakokineettisistä tiedoista, poikasiin kohdistuvasta toksisuudesta tai biomarkkereiden muutoksista (28).

TARKKAILU

Emojen tarkkailu

22. Kaikkien emojen terveydentilaa, sairastuneisuutta ja kuolleisuutta olisi seurattava ainakin kerran päivässä.

23. Käsittelytoimenpide- ja havaintojaksojen aikana olisi tehtävä säännöllisesti yksityiskohtaisempia kliinisiä havaintoja (ainakin kahdesti tiineysajan annosten antamisjaksolla ja kahdesti imetysajan annosten antamisjaksolla) käyttäen ainakin kymmentä emoa annostasoa kohti. Koulutettujen teknikoiden, jotka eivät ole tietoisia eläinten käsittelytiedoista, olisi tarkkailtava eläimiä niiden häkin ulkopuolella. Heidän pitäisi soveltaa standardoituja menettelyitä, joita käytetään eläinten stressin ja tarkkailijan ennakkokäsitysten vähimmäistämiseksi ja tarkkailijoiden välisen luotettavuuden maksimoimiseksi. On suositeltavaa, että havainnot tietyssä tutkimuksessa tekee sama teknikko, kun tämä on mahdollista.

24. Havaitut oireet on kirjattava. Myös havaittujen oireiden voimakkuus on kirjattava mahdollisuuksien mukaan. Kliinisiä havaintoja on tehtävä muun muassa ihon, karvapeitteen, silmien, limakalvojen, mahdollisten eritteiden erityksen sekä autonomisen hermoston toiminnan muutoksista (esimerkiksi kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko, poikkeavuudet hengityksessä ja/tai ilman haukkominen, kaikki virtsaamiseen tai ulostamiseen liittyvät epätavalliset oireet).

25. Myös kaikki kehon asentoon, aktiivisuustasoon (esimerkiksi vakioalueen vähentynyt tai lisääntynyt tutkiminen) ja liikekoordinaatioon liittyvät epätavalliset vasteet on kirjattava. Muutokset käynnissä (esimerkiksi vaappuminen ja ataksia), asennossa (esimerkiksi selän köyristäminen) ja käsittelyyn, paikkaan tai muihin ympäristön ärsykkeisiin liittyvässä reaktiivisuudessa sekä klooniset tai tooniset liikkeet, kouristukset tai vapina, stereotypiat (esimerkiksi ylenmääräinen turkin hoito, epätavalliset pään liikkeet, jatkuva kehän kiertäminen) tai omituinen käytös (esimerkiksi pureminen tai ylenmääräinen nuoleminen, itsensä silpominen, takaperin käveleminen, ääntely) tai aggressiivisuus on kirjattava.

26. Myrkytysoireet olisi kirjattava, mukaan lukien oireiden alkamispäivä, vuorokaudenaika, voimakkuus ja kesto.

27. Eläimet punnitaan tutkimuksen aikana annosteluajankohdalla ainakin viikoittain, synnytyspäivänä tai sen lähellä ja syntymän jälkeisenä päivänä 21 (vieroitus). Emot olisi punnittava letkuruokintatutkimuksia varten ainakin kahdesti viikossa. Annoksia olisi mukautettava kunkin painonmäärityksen ajankohdalla tarpeen mukaan. Ravinnonkulutusta olisi mitattava viikoittain vähintään tiineyden ja imetyksen aikana. Vedenkulutusta olisi mitattava ainakin viikoittain, jos eläin altistuu veden välityksellä.

Poikasten tarkkailu

28. Kaikkien poikasten myrkytysoireita, sairastuneisuutta ja kuolleisuutta seurataan ainakin kerran päivässä.

29. Käsittelytoimenpide- ja havaintojaksojen aikana olisi tehtävä yksityiskohtaisempia kliinisiä havaintoja poikasista. Koulutettujen teknikoiden, jotka eivät ole tietoisia eläinten käsittelytiedoista, olisi tarkkailtava poikasia (ainakin yksi poikanen/sukupuoli/poikue). Heidän pitäisi käyttää standardoituja menettelyitä tarkkailijan ennakkokäsitysten vähimmäistämiseksi ja tarkkailijoiden välisen luotettavuuden enimmäistämiseksi. On suositeltavaa, että havainnot tekee sama teknikko, kun tämä on mahdollista. Vähintään 24 ja 25 kohdassa kuvattuja päätetapahtumia olisi tarkkailtava, kun se on asianmukaista tarkkailtavassa kehitysvaiheessa.

30. Kaikki poikasten myrkytysoireet olisi kirjattava mukaan lukien oireiden alkamispäivä, vuorokaudenaika, voimakkuus ja kesto.

Fyysiset ja kehitystä koskevat tuntomerkit

31. Muutokset vieroitusta edeltävissä kehitystä koskevissa tuntomerkeissä (esim. korvalehden avautuminen, silmien avautuminen, etuhampaan puhkeaminen) korreloivat merkittävästi ruumiinpainon kanssa (30)(31). Ruumiinpaino voi olla fyysisen kehityksen paras indikaattori. Kehitystä koskevien tuntomerkkien määrittäminen on tämän vuoksi suositeltavaa ainoastaan, kun on ennalta näyttöä, että näillä tuloksilla tarjotaan lisätietoja. Näiden parametrien arvioinnin ajoitus esitetään taulukossa 1. Oletetuista vaikutuksista ja ensimmäisten määritysten tuloksista riippuen voi olla suositeltavaa lisätä muita ajankohtia tai tehdä määrityksiä muissa kehitysvaiheissa.

32. Fyysisen kehityksen arvioinnissa on suositeltavaa käyttää syntymän jälkeisen iän sijasta yhdynnän jälkeistä ikää (33). Jos poikasia testataan vieroituspäivänä, on suositeltavaa, että testi tehdään ennen varsinaista vieroitusta, jotta vältetään vieroitukseen liittyvän stressin aiheuttama häiritsevä vaikutus. Lisäksi mitään vieroituksen jälkeistä poikasten testiä ei pitäisi suorittaa vieroituksen jälkeisen kahden päivän aikana.

Taulukko 1

Fyysisten ja kehitystä koskevien tuntomerkkien sekä toiminnallisten ja käyttäytymistä mittaavien tulostapahtumien arvioinnin ajoittaminen (2)

Ikäväli Päätetapahtumat Ennen vieroitusta (3) Kasvuiässä (3) Nuoret täysikasvuiset (3) Fyysiset ja kehitystä koskevat tuntomerkit Ruumiinpaino ja kliiniset havainnot viikoittain (4) vähintään kahden viikon välein vähintään kahden viikon välein Aivojen paino SJP 22 (5) lopettamisen yhteydessä Neuropatologia SJP 22 (5) lopettamisen yhteydessä Sukukypsyys — tarvittaessa — Muut kehitystä koskevat tunnusmerkit (6) tarvittaessa — — Toiminnalliset ja käyttäytymistä mittaavat tulostapahtumat Käytöksen kehitys ainakin kaksi määritystä Motorinen aktiviteetti (mukaan lukien tottuminen) 1–3 kertaa (7) — kerran Motorinen ja aistien toiminta — kerran kerran Oppiminen ja muisti — kerran kerran

33. Elävät poikaset lasketaan ja niiden sukupuoli määritetään esim. silmämääräisesti tai mittaamalla peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys (34)(35). Poikueen kukin poikanen olisi punnittava erikseen syntymähetkellä tai pian sen jälkeen ainakin viikoittain koko imetyksen ajan vähintään kerran kahdessa viikossa sen jälkeen. Kun sukukypsyyttä arvioidaan, eläimen ikä ja ruumiinpaino olisi määriteltävä emättimen avautuessa (36) tai esinahan erotessa terskasta (37) ainakin yhdestä uros- ja naarapuolisesta eläimestä poikuetta kohti.

Käytöksen kehitys

34. Valikoitujen käyttäytymistapojen kehittyminen määritellään ainakin yhden poikasen/sukupuolen/poikueen osalta asianmukaisen ikävälin aikana, ja samoja poikasia käytetään kaikkina testipäivinä kustakin arvioinnin kohteena olevasta käyttäytymistavasta. Mittauspäivät jaetaan tasaisesti kyseiselle ajanjaksolle. Tällä tavoin määritellään kyseisen käyttäytymistavan kehityksen normaalit tai käsittelyyn liittyvät muutokset (38). Seuraavat ovat esimerkkejä käytöstavoista, joiden kehittymistä voitaisiin arvioida: oikaisurefleksi, ylöspäin suuntautuva liike ja motorinen aktiviteetti (38)(39)(40).

Motorinen aktiviteetti

35. Motorista aktiviteettia olisi seurattava (41)(42)(43)(44)(45) vieroitusta edeltävällä ajanjaksolla ja täysikasvuisen iässä. Kun testi suoritetaan vieroituksen aikana, ks. 32 kohta. Testin olisi kestettävä riittävän pitkään, jotta voidaan osoittaa testijakson sisäinen sopeutuminen, kun kyseessä ovat altistamattomat kontrollit. Motorisen aktiviteetin käyttö käytöksen kehityksen arviointia varten on erittäin suositeltavaa. Jos sitä käytetään käytöksen kehityksen testaamiseen, testissä käytetään samoja eläimiä kaikkien vierotusta edeltävien testijaksojen osalta. Testejä pitäisi suorittaa tarpeeksi usein testijakson sisäisen sopeutumiskehityksen arviointia varten (44). Tämä saattaa edellyttää kolmea tai useampaa ajankohtaa vieroituspäivään mennessä ja se mukaan lukien (esim. SJP 13, 17, 21). Samojen eläinten tai saman poikueen eläinten testi olisi suoritettava myös täysikasvuisilla lähellä tutkimuksen päättymisajankohtaa (esim. SJP 60–70). Tutkimuksia lisäpäivinä voidaan suorittaa tarpeen mukaan. Motorista toimintaa olisi valvottava toimintaa mitattavalla automaattilaitteella, jolla voidaan selvittää toiminnan vähentyminen ja lisääntyminen (eli laitteen mittaaman lähtötilanteen ei pitäisi olla niin alhainen, että toiminnan vähentymisen havaitseminen estetään, eikä niin suuri, että estetään toiminnan lisääntymisen havaitseminen). Kutakin laitetta olisi testattava vakiomuotoisilla menettelyillä, jotta toiminnan luotettavuus varmistetaan mahdollisuuksien mukaan laitteiden ja tutkimuspäivien osalta. Testiryhmiä olisi tasapainotettava mahdollisuuksien mukaan laitteisiin nähden. Kukin eläin olisi testattava erikseen. Testiryhmiä olisi tasapainotettava testiajankohtiin nähden, jotta vältetään häiritsemästä toiminnan vuorokausirytmiä. Olisi pyrittävä varmistamaan, että testiolosuhteiden muutokset ovat mahdollisimman vähäiset ja että ne eivät liity järjestelmällisesti käsittelyyn. Muuttujat, jotka voivat vaikuttaa moniin käyttäytymistä, myös motorista aktiviteettia, koskeviin määrityksiin, ovat äänitaso, testihäkin koko ja muoto, lämpötila, suhteellinen kosteus, valaistusolosuhteet, hajut, kotihäkin tai uuden testihäkin käyttö ja ympäristön häiriötekijät.

Motorinen ja aistien toiminta

36. Motorista ja aistien toimintaa olisi tarkasteltava yksityiskohtaisesti ainakin kerran, kun eläin on kasvuiässä ja kerran, kun se on nuori täysikasvuinen eläin (esim. SJP 60–70). Jos testi suoritetaan vieroitusaikana, ks. 32 kohta. Olisi suoritettava riittävä testi, jotta sensorisesta toiminnasta (esim. somatosensorinen, vestibulaarinen) ja motorisesta toiminnasta (esim. voimakkuus, koordinaatio) varmistetaan riittävä määrällinen näytteenotto. Muutamia esimerkkejä motorisesta ja aistien toiminnasta ovat ojentajalihaksen työntövoimarefleksi (46), suoristusrefleksi (47)(48), akustinen säpsähdysvaste (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) ja herätepotentiaalit (55).

Oppimisen ja muistin testaaminen

37. Assosiatiivista oppimista ja muistia koskeva testi olisi suoritettava vieroituksen jälkeen (esim. 25 ± 2 päivää) ja nuorilla täysikasvuisilla eläimillä (SJP 60 ja vanhempi). Kun testi suoritetaan vieroituksen aikana, ks. 32 kohta. Samaa tai eri testiä (testejä) voidaan käyttää näissä kahdessa kehitysvaiheessa. Vastavieroitettujen ja täysikasvuisten rottien oppimista ja muistia koskevien testien valinnan osalta sallitaan jonkin verran joustavuutta. Testit olisi kuitenkin suunniteltava siten, että täytetään kaksi kriteeriä. Ensinnäkin oppimista olisi arvioitava joko usean toistetun oppimista mittaavaan kokeen tai jakson kuluessa tapahtuneena muutoksena tai yhdestä kokeesta muodostuvissa testeissä, kun kyseessä on olosuhde, joka ohjaa oppimisen ei-assosiatiivisia vaikutuksia. Toiseksi testiin (testeihin) pitäisi sisältyä jonkinlainen (lyhytaikaisen tai pitkäaikaisen) muistin mittaaminen alkuperäisen oppimisen (oppimistuloksen) lisäksi, mutta muistin mittaamista ei voida raportoida, jos samasta testistä saadut oppimistuloksen mittaamistoimet puuttuvat. Jos oppimista ja muistia koskeva yksi tai useampi testi osoittaa testikemikaalin vaikutuksen, voidaan harkita täydentäviä testejä, joilla suljetaan pois sensoristen, motivationaalisten ja/tai motoristen valmiuksien muutoksiin perustuvat vaihtoehtoiset tulkinnat. Edellisen kahden kriteerin lisäksi suositellaan, että oppimista ja muistia mittaava testi valitaan sen perusteella, miten sen herkkyys osoitetaan tarkasteltavan kemikaalin luokan perusteella, jos tällaisia tietoja on saatavilla lähteissä. Jos tietoja ei ole, seuraavassa on esimerkkejä testeistä, joita voidaan tehdä edellä mainittujen kriteerien täyttämiseksi: passiivinen välttäminen (43)(56)(57), viivästynyt asettuminen asentoon (delayed-matching-to-position), kun kyseessä ovat täysikasvuiset rotat (58) ja kun kyseessä on imeväisikäinen rotta (59), hajuihin totuttaminen (43)(60), Morrisin vesisokkelo (61)(62)(63), Bielin tai Cincinnatin sokkelo (64)(65), säteittäinen sokkelo (66), T-sokkelo (43) ja aikataululla valvotun käytöksen omaksuminen ja säilyttäminen (26)(67)(68). Täydentäviä testejä kuvataan vastavieroitettuja (26)(27) ja täysikasvuisia rottia (19)(20) koskevissa lähteissä.

Post mortem -tutkimus

38. Emot voidaan lopettaa poikasten vieroituksen jälkeen.

39. Poikasten neuropatologinen arviointi suoritetaan käyttäen kudoksia, jotka ovat peräisin eläimiltä, jotka lopetetaan inhimillisesti syntymän jälkeisenä päivänä 22 tai aikaisemmin syntymän jälkeisenä päivänä 11–22 taikka tutkimuksen loppuvaiheessa. SJP 22:een mennessä lopetettujen poikasten aivokudoksia olisi arvioitava; testin loppuvaiheessa lopetettujen eläinten keskushermoston kudoksia ja ääreishermoston kudoksia olisi arvioitava. SJP 22:een mennessä lopetettujen eläinten näytteet voidaan fiksoida upottamis- tai perfuusiotekniikalla. Tutkimuksen loppuvaiheessa lopetettujen eläinten näytteet olisi fiksoitava perfuusion avulla. Kaikissa kudosnäytteiden fiksointia koskevissa toimenpiteissä eläinten perfuusiosta kudosnäytteiden dissektioon, kudosten käsittelyyn ja objektilasien värjäykseen olisi käytettävä sellaista tasapainottavaa mallia, että jokaiseen erään sisältyy edustavia näytteitä kustakin annosryhmästä. Lisäohjeita neuropatologiasta sisältyy OECD:n ohjeasiakirjaan 20 (9), ks. myös (103).

Kudosnäytteiden käsittely

40. Kaikki ruumiinavauksessa paljain silmin havaittavat poikkeavuudet on kirjattava. Otettujen kudosnäytteiden on katettava kaikki keskeiset hermoston alueet. Kudosnäytteet olisi säilytettävä sopivassa kiinnitysaineessa ja niitä olisi käsiteltävä julkaistujen standardimuotoisten histologisten menettelyjen mukaisesti (69)(70)(71)(103). Parafiinivalun käyttö on hyväksyttävää keskushermoston kudoksien ja ääreishermoston kudoksien osalta, mutta osmiumin käyttö fiksoinnin jälkeen yhdessä epoksivalun kanssa voi olla asianmukaista, kun tarvitaan suurempaa resoluutiota (esim. ääreishermoja varten, kun epäillään perifeeristä neuropatiaa, ja/tai ääreishermojen morfometrista analyysia varten). Morfometrista analyysia varten kerätty aivokudos olisi valettava sopivaan aineeseen kaikilla annostasoilla samaan aikaan. Näin vältetään kutistuneet artefaktit, jotka voivat liittyä pitkäaikaiseen säilytykseen fiksatiivissa (6).

Neuropatologinen tutkimus

41. Kvalitatiivisen tutkimuksen tavoitteena on:

i) täsmentää hermoston alueet, joilla esiintyy todisteita neuropatologisista muutoksista,

ii) täsmentää testiaineelle altistumisesta johtuvien neuropatologisten muutosten tyypit, ja

iii) määrittää neuropatologisten muutosten vakavuus.

Asianmukaisesti koulutettu patologi tutkii kudosnäytteistä otettuja edustavia histologisia leikkeitä mikroskoopilla neuropatologisia muutoksia koskevista todisteista. Kaikille neuropatologisille muutoksille olisi annettava yksilöllinen luokka, joka osoittaa muutoksen vakavuuden. Hekatoksyliini ja eosiiniväri voi olla riittävä inhimillisesti lopetettujen eläinten aivojen leikkeiden arviointia varten syntymän jälkeisenä päivänä 22 tai sitä ennen. Tutkimuksen loppuvaiheessa lopetettujen eläinten keskushermoston ja ääreishermoston kudosten leikkeille suositellaan kuitenkin myeliinivärjäystä (esim. luxol fast blue/cresyl violet) ja hopeavärjäystä (kuten Bielschowskyn tai Bodianin värjäys). Patologin ammatillisen harkinnan ja havaittujen muutosten tyypin perusteella muunlaisia värjäystekniikoita voidaan pitää asianmukaisena tietyntyyppisten muutosten tunnistamiseksi ja kuvaamiseksi (kuten GFAP-värjäys (gliaalinen fibrillaarinen hapan proteiini) tai lektiinihistokemia gliaalisten ja mikrogliaalisten muutosten arvioimiseksi (72), fluoro-jade -liuoksella värjääminen nekroosin havaitsemiseksi (73)(74), tai hermosolujen rappeutumiselle spesifiset hopeavärjäykset (75)).

42. Morfometrinen (kvantitatiivinen) arviointi olisi suoritettava, koska näillä tiedoilla voidaan auttaa havaitsemaan testeihin liittyvä vaikutus ja koska ne ovat hyödyllisiä tulkittaessa testeihin liittyviä aivojen painoa koskevia tai morfologisia muutoksia (76)(77). Hermokudoksesta olisi otettava näyte ja se olisi preparoitava morfometrista arviointia varten. Morfometrisiin arviointeihin voi sisältyä esim. aivojen tiettyjen alueiden lineaarinen tai areaalinen mittaaminen (78). Lineaarisiin tai areaalisiin mittauksiin on käytettävä homologisia leikkeitä, jotka on valittu tarkasti luotettavien mikroskooppisten tuntomerkkien perusteella (6). Stereologiaa voidaan käyttää täsmentämään käsittelyyn liittyvät vaikutukset, jotka kohdistuvat parametreihin, kuten erityisten neuroanatomisten alueiden volyymi tai solumäärä (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Aivot olisi tutkittava, jotta todisteet käsittelyyn liittyvistä neuropatologista muutoksista havaitaan, ja kaikista aivojen tärkeimmistä alueista (kuten hajukäämit, aivokuori, hippokampus, tyvitumakkeet, talamus, hypotalamus, keskiaivot (keskiaivojen katto, keskiaivojen peite ja pikkuaivovarret), aivosilta, ydinjatke, pikkuaivot) olisi otettava riittävät näytteet. Näin varmistetaan perusteellinen tutkimus. On tärkeää, että kaikkien eläinten leikkeet otetaan samasta tasosta. Tutkimuksen lopussa inhimillisesti lopetetuilta täysikasvuisilta eläimiltä olisi otettava näytteeksi selkäytimen ja ääreishermoston edustavat leikkeet. Tarkasteltaviin alueisiin olisi kuuluttava silmä, näköhermo ja verkkokalvo mukaan lukien, selkäydin kaularangan ja lannerangan kohdalta, taka- ja etujuuren hermosäikeet, proksimaalinen lonkkahermo, proksimaalinen säärihermo (polven kohdalta) ja säärihermon puoleiset pohjelihaksen haarat. Selkäytimestä ja ääreishermostosta on tehtävä poikittais- ja pitkittäisleikkeet.

44. Neuropatologisessa arvioinnissa tarkastellaan, onko hermostolle aiheutuneista kehityshäiriöistä viitteitä (6)(85)(86)(87)(88)(89) solumuutoksien (esim. hermosolujen vakuolisaatio, rappeuma, kuolio) ja kudosmuutoksien (esim. glioosi, leukosyyttien infiltraatio, kystien muodostuminen) lisäksi. Tältä osin on tärkeää, että käsittelyyn liittyvät vaikutukset erotetaan normaalista kehityksestä, jonka tiedetään tapahtuvan lopetusajankohtaa vastaavassa kehitysvaiheessa (90). Esimerkkeihin merkittävistä muutoksista, jotka viittaavat kehitysvaurioihin, sisältyvät mutta eivät pelkästään:

— hajukäämien, aivojen tai pikkuaivojen kokonaiskoon tai muodon muutokset

— aivojen eri alueiden suhteellisen koon muutokset, mukaan lukien alueiden koon pienentyminen tai suurentuminen, joka aiheutuu normaalisti tilapäisten solupopulaatioiden menettämisestä tai pysyvyydestä taikka aksonaalisesta kuljetuksesta (esim. pikkuaivojen ulompi jyvässolukerros, aivokurkiainen)

— muutokset solun jakaantumisessa, liikkumisessa ja erilaistumisessa, mitä osoittavat liiallinen apoptoosi tai kuolio, klusterit tai hajallaan olevat populaatiot ektooppisia, disorientoituneita tai epämuodostuneita neuroneja, taikka muutokset aivokuoren rakenteiden eri kerrosten suhteellisessa koossa

— hermosolujen myeliinin kehittymisen muutokset mukaan lukien yleinen koon pienentyminen tai myelinoitujen rakenteiden muuttunut värjäys

— todisteet vesipäästä, erityisesti aivokammion laajentuminen, aivonesteviemärin ahtauma ja aivopuoliskojen ohentuminen.

Neuropatologisten muutosten annosvasteiden suhteen analyysi

45. Seuraavaa asteittaista menetelmää suositellaan kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia neuropatologisia analyysejä varten. Ensinnäkin korkean annostason ryhmästä otettuja leikkeitä verrataan kontrolliryhmän leikkeisiin. Jos korkean annostason eläinten ryhmässä ei havaita neuropatologisia muutoksia, myöhempää analyysiä ei tarvita. Jos korkean annoksen ryhmässä havaitaan neuropatologisia muutoksia, keskisuuren ja pienen annoksen ryhmän eläimet tutkitaan. Jos korkean annoksen ryhmä tulee päätekohtaan kuoleman tai muun häiritsevän toksisuuden vuoksi, korkean annoksen ja keskisuuren annoksen ryhmiä olisi analysoitava neuropatologisista muutoksista. Jos pienemmän annoksen ryhmissä havaitaan neurotoksisuutta, niissä olisi tehtävä neuropatologinen analyysi. Jos käsittelyyn liittyviä neuropatologisia muutoksia havaitaan kvalitatiivisessa tai kvantitatiivisessa tutkimuksessa, esiintyvyyden annosriippuvuus, vaurioiden tai morfometristen muutosten esiintyvyys ja vakavuus määritellään kaikista annosryhmistä peräisin olevien eläinten arvioinnin perusteella. Kaikki alueet aivoissa, joissa havaitaan todisteita neuropatologisista muutoksista, olisi sisällytettävä tähän arviointiin. Jokaisen vauriotyypin osalta kunkin vakavuusasteen määrittelyyn käytetyt ominaispiirteet olisi määriteltävä, ja niissä olisi ilmoitettava yksityiskohdat, joita käytetään kunkin luokan erottamiseen. Kunkin vauriotyypin osalta sen yleisyys ja vakavuusaste olisi kirjattava ja olisi tehtävä tilastollinen analyysi annos-vastesuhteen luonteen arvioimiseksi. Koodattujen objektilasien käyttöä suositellaan (91).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tiedot

46. Tiedot olisi ilmoitettava erikseen ja esitettävä taulukkomuodossa, josta ilmenevät kunkin testiryhmän osalta muutostyypit, emojen ja poikasten määrä sukupuolittain sekä poikueiden määrä kutakin muutosta kohti. Jos poikasten syntymän jälkeinen suora altistaminen on suoritettu, olisi ilmoitettava altistusreitti, kesto ja altistusajankohta.

Tulosten arviointi ja tulkinta

47. Tutkimuksessa hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista tarjotaan tietoja toistuvasta altistumisesta kemikaalille kohdussa ja vastasyntyneen kehitysvaiheessa. Koska tutkimuksessa painotetaan yleisten ja hermostonkehitykseen vaikuttavien myrkyllisyysvaikutusten päätetapahtumia, tutkimustulosten perusteella voidaan jossain määrin erotella toisaalta ne hermoston kehitykseen kohdistuvat vaikutukset, joiden osalta emoilla ei ilmene myrkyllisyysvaikutuksia, sekä toisaalta ne vaikutukset, jotka ilmenevät ainoastaan tasoilla, jotka ovat myrkyllisiä myös emoille. Tutkimussuunnitelman, tilastoanalyysin ja tietojen biologisen merkitsevyyden välisten monimutkaisten yhteyksien vuoksi asiantuntijan on tulkittava asianmukaisesti tietoja hermostonkehitykseen kohdistuvista myrkyllisyysvaikutuksista (107)(109). Testitulosten tulkintaan olisi käytettävä painoarvoanalyysiä (20)(92)(93)(94). Käytöstä koskevia tai morfologisia löydöksiä, jos niitä on, sekä annosvasteita koskevaa näyttöä olisi käsiteltävä. Tähän olisi sisällyttävä tiedot kaikista tutkimuksista, jotka koskevat hermostonkehitykseen vaikuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, mukaan lukien ihmisen epidemiologiset tutkimukset tai tapausselostukset ja eläimillä tehdyt kokeet (esim. toksikokineettiset tiedot, rakenne-aktiivisuustiedot, tiedot muista toksisuustutkimuksista). Tähän sisältyy testikemikaalin annosten välinen suhde ja kaikkien neurotoksisten vaikutusten olemassaolo tai puuttuminen, esiintyvyys ja laajuus kummankin sukupuolen osalta (20)(95).

48. Tietojen arviointiin pitäisi sisältyä pohdinta biologisesta ja tilastollisesta merkittävyydestä. Tilastoanalyysiä olisi pidettävä välineenä, joka ohjaa tietojen tulkintaa sen sijaan, että se määrittää sitä. Tilastollisen merkittävyyden puute ei saisi olla ainoa peruste päätelmälle siitä, että altistusvaikutus puuttuu, ja tilastollinen merkittävyys ei saisi olla ainoa peruste tehdä päätelmä altistusvaikutuksesta. Jotta mahdollisia vääriä negatiivisia havaintoja ei esitettäisi ja negatiivisilla kontrolleilla saatujen tulosten todistamiseen liittyvät hankaluudet vältettäisiin, olisi käsiteltävä käytettävissä olevia positiivisia ja aikaisempia kontrollitutkimuksien tietoja erityisesti, jos mitään altistukseen liittyviä vaikutuksia ei esiinny (102)(106). Väärien positiivisten löydöksien mahdollisuutta olisi pohdittava tietojen kaikkien tilastollisten arvioiden pohjalta (96). Arviointiin pitäisi sisältyä havaittujen neuropatologisten ja käyttäytymiseen liittyvien muutosten välinen mahdollinen suhde.

49. Kaikkia tuloksia olisi analysoitava käyttämällä koesuunnittelun kannalta asianmukaisimpia tilastollisia malleja (108). Parametrisen tai ei-parametrisen analyysin valintaa olisi perusteltava ottaen huomioon esimerkiksi tietojen laatu (onko niitä muunneltu) ja niiden jakelu sekä valitun tilastoanalyysin suhteellinen luotettavuus. Tutkimuksen tarkoituksen ja suunnittelun pitäisi ohjata tilastoanalyysien valintaa tyypin I (väärä positiivinen) ja tyypin II (väärä negatiivinen) virheiden vähimmäistämiseksi (96)(97)(104)(105). Hermostonkehitystä koskevissa tutkimuksissa, joissa käytetään useita poikasia kerrallaan synnyttäviä lajeja, joiden poikueesta testataan useita poikasia, poikue olisi sisällytettävä tilastolliseen malliin. Tarkoitus on välttää lisäämästä tyypin I virheiden määrää (98)(99)(100)(101). Tilastollisen mittayksikön pitäisi olla poikue, ei poikanen. Kokeet olisi suunniteltava siten, että samaan poikueeseen kuuluvia poikasia ei käsitellä erillisten havaintojen tavoin. Kaikkia päätetapahtumia, joita mitataan toistuvasti samalla kohteella, olisi analysoitava käyttämällä tilastollisia malleja, joissa otetaan huomioon, että kyseiset toimenpiteet eivät ole toisistaan riippuvaisia.

Tutkimusseloste

50. Tutkimusselosteessa on annettava seuraavat tiedot:

Testikemikaali:

— fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet

— tunnistetiedot, mukaan lukien lähde

— valmisteen puhtaus ja tunnetut ja/tai oletetut epäpuhtaudet.

Kantaja-aine (tarvittaessa):

— perusteet kantaja-aineen valinnalle, jos se on muu kuin vesi tai fysiologinen keittosuolaliuos.

Koe-eläinlajit:

— käytetty eläinlaji ja kanta sekä perustelu, jos se on muu kuin rotta

— koe-eläinten toimittaja

— eläinten lukumäärä, ikä testin alussa ja sukupuoli

— toimittaja, häkit, ravinto, vesi ja niin edelleen

— kunkin eläimen paino testin alussa.

Testiolosuhteet:

— annostasojen valintaperusteet

— annostelureittiä ja ajankohtaa koskevat valintaperusteet

— selvitys annetuista annoksista, mukaan lukien selonteko kantaja-aineesta sekä annostellun aineen määrästä ja fysikaalisesta olomuodosta

— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmisteesta, saavutetusta pitoisuudesta, stabiiliudesta ja tasalaatuisuudesta

— emojen ja poikasten yksilölliseen tunnistamiseen käytetty menetelmä

— yksityiskohtainen kuvaus satunnaisottoa koskevasta menettelystä (menettelyistä), jota sovelletaan, kun emoja valitaan koeryhmiin, poikasia karsitaan ja ne jaetaan testiryhmiin

— yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin antotavasta

— ravintoon/juomaveteen sekoitetun hengitysteiden altistukseen liittyvän testin testikemikaalin pitoisuuden (ppm) muuntaminen todelliseksi annokseksi (mg/painokilo/vrk) tarvittaessa

— ympäristöolosuhteet

— yksityiskohtaiset tiedot ravinnon ja veden (esim. hanavesi, tislattu vesi) laadusta

— testin alku- ja päättymispäivä.

Havainnointi ja testausmenetelmät:

— yksityiskohtainen kuvaus menettelyistä, joita käytetään standardoimaan havainnot ja menettelyt sekä operatiiviset määritelmät pisteytykseen liittyville havainnoille

— luettelo kaikista käytetyistä testimenettelyistä ja perustelut niiden käytölle

— yksityiskohtaiset tiedot sovelletuista käyttäytymiseen/toimintaan liittyvistä, patologisista, neurokemiallisista ja sähköfysiologisista menettelyistä mukaan lukien yksityiskohtaiset tiedot automaattilaitteista

— laitteiden kalibrointia ja niiden vastaavuuden varmistamista koskevat menetelmät sekä koeryhmien tasapainottaminen testausmenettelyissä

— lyhyt perustelu, jossa selvitetään päätöksiä, joihin liittyy asiantuntija-arvio.

Tulokset (yksittäiset ja yhteenveto, mukaan lukien tarvittaessa keskiarvo ja varianssi):

— eläinten lukumäärä tutkimuksen alussa ja tutkimuksen lopussa

— kutakin testimenetelmää varten käytettyjen eläinten ja poikueiden määrä

— kunkin eläimen tunnistenumero ja poikue, josta se on peräisin

— poikueen koko ja keskimääräinen syntymäpaino sukupuolittain eroteltuna

— ruumiinpainoa ja sen muutoksia koskevat tiedot, mukaan lukien emon ja poikasten ruumiinpaino lopetettaessa

— ravinnon ja tarvittaessa veden kulutus (esim. jos testikemikaalia annostellaan veden kautta)

— toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason perusteella, mukaan lukien toksisuusoireet tai kuolleisuus, ja tarvittaessa kuolinaika ja -syy

— yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste, kesto, oireiden alku, ajankohta ja myöhempi kehitys

— kunkin kehitystä koskevan päätetapahtuman tilanne (paino, sukukypsyys ja käytöksen kehitys) kunakin havainnointiaikana

— yksityiskohtainen kuvaus kaikista hermostoperäisiin käyttäytymisoireisiin liittyvistä, toiminnallisista, neuropatologisista, neurokemiallista tai sähköfysiologisista löydöksistä sukupuolen perusteella, mukaan lukien niiden lisääntyminen ja vähentyminen kontrollitietojen perusteella

— ruumiinavauslöydökset

— aivojen paino

— havainnot hermostollisista oireista tai vaurioista mukaan lukien luonnollisesti esiintyvät sairaudet tai tilat

— kuvat esimerkkilöydöksistä

— morfometriassa käytettyjen leikkeiden homologian arviointiin käytetyt vähän tehoa kuluttavat kuvat

— tiedot absorboitumisesta ja metaboloitumisesta, mukaan lukien täydentävät tiedot erillisestä toksikokineettisestä tutkimuksesta, mikäli saatavissa

— tulosten tilastollinen käsittely, mukaan lukien tietojen analysointiin käytetyt tilastolliset mallit ja tulokset riippumatta siitä, olivatko ne merkittävät

— luettelo tutkimushenkilöstöstä, mukaan lukien ammatillinen koulutus.

Tulosten tarkastelu:

— annos-vaste-tulokset sukupuolen ja ryhmän mukaan

— kaikkien muiden myrkyllisyysvaikutusten suhde testikemikaalin mahdollisesta neurotoksisuudesta tehtyihin johtopäätöksiin sukupuolen ja ryhmän perusteella

— toksikokineettisten tietojen vaikutus päätelmiin

— vaikutukset, jotka ovat samankaltaisia tunnettujen neurotoksisten aineiden kanssa

— testimenettelyn luotettavuutta ja herkkyyttä tukevat tiedot (kuten positiiviset ja aikaisemmat kontrollitiedot)

— mahdolliset suhteet neuropatologisten ja toiminnallisten vaikutusten välillä

— haitaton tai vertailukohtana oleva annos emoille ja poikasille sukupuolen ja ryhmän perusteella.

Päätelmät:

— pohdinta tietojen yleisestä tulkinnasta tulosten perusteella, mukaan lukien johtopäätös siitä, aiheuttiko testikemikaali hermostonkehitykseen vaikuttavia myrkyllisyysvaikutuksia, ja haitattomasta vaikutustasosta.

KIRJALLISUUSVIITTEET

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13–14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Available: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Available: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.

(6) Garman, R.H., Fix, A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93–100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Saatavilla sivustolla: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage=en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Saatavilla sivustolla: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Tämän liitteen B.34 luku ’Myrkkyjen vaikutus lisääntymiskykyyn (yhden sukupolven testi)’.

(15) Tämän liitteen B.35 luku ’Kaksi sukupolvea käsittävä lisääntymiskykyyn kohdistuvien myrkyllisyysvaikutusten tutkimus’.

(16) Tämän liitteen B.43 luku ’Neurotoksisuustutkimus jyrsijöillä’.

(17) Tämän liitteen B.31 luku ’Prenataalisen kehityksen aikaisten myrkyllisyysvaikutusten tutkimus’.

(18) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Available: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Saatavilla: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499–509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110–112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, s. 67–100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, s. 37–82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405–411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661–669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589–591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, s. 287–351

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107–128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, s. 181–211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199–211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: TARGET Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. s. 125–145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237–244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465–479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342–352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122–131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, s. 84–107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365–372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294–298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70–74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274–56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113–126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21–27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165–172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221–228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A ’best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266–287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288–325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326–348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349–381.

Kuva 1

Toimintaan/käyttäytymisoireisiin liittyviä testejä, neuropatologista arviointia ja aivojen painoa koskeva yleinen testausjärjestelmä. Tämä kaavio perustuu 13–15 kohdan kuvaukseen (SJP = syntymän jälkeinen päivä). Eläinten valintaa koskevia esimerkkejä annetaan liitteessä 1

Lisäys 1 1. Esimerkkejä eläinten mahdollisista jakamistavoista kuvataan ja esitetään taulukossa jäljempänä. Näillä esimerkeillä kuvataan sitä, että koe-eläinten valinta eri testimalleihin voidaan toteuttaa eri tavoin. Esimerkki 1 2. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä koskevaan vieroitusta edeltävään testiin. Näistä eläimistä 10 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisesti syntymän jälkeisenä päivänä 22. Aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään histopatologisessa tutkimuksessa. Lisäksi aivojen painoja koskevat tiedot kerätään käyttämällä jäljelle jääneiden 10 uroksen ja 10 naaraan irrotettuja aivoja annostasoa kohti. 3. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään toimintaa/käyttäytymistä koskevaan vieroituksen jälkeiseen testiin (yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen, motorisen aktiviteetin, akustisen säpsähdysvasteen ja kognitiivisen toiminnan testaaminen kasvuikäisten eläinten osalta) ja sukukypsyysiän arviointiin. Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) nukutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (arviolta syntymän jälkeinen päivä 70). Uuden fiksaation in situ jälkeen aivot poistetaan ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa. 4. Nuorten täysikasvuisten eläinten (esim. syntymän jälkeinen päivä 60–70) kognitiivisen toiminnan testaukseen käytetään kolmatta ryhmää, jossa on 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) lopetetaan tutkimuksen päättyessä ja aivot poistetaan ja punnitaan. 5. Jäljelle jääneet 20 eläintä/sukupuoli/ryhmä varataan mahdollisia täydentäviä kokeita varten. Taulukko 1 Poikasten määrä (8) Kokeisiin valittujen poikasten määrä Tutkimus/Testi uros naaras 1 5 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys 10 urosta + 10 naarasta SJP 22 aivojen paino/neuropatologia/morfometria 10 urosta + 10 naarasta SJP 22 aivojen paino 2 6 20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 20 urosta + 20 naarasta Motorinen ja aistien toiminta 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (SJP 25) 10 urosta + 10 naarasta Nuoren täysikasvuisen yksilön aivojen paino/neuropatologia/morfometria ~ SJP 70 3 7 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (nuoret täysikasvuiset eläimet) 10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläinten aivojen paino ~ SJP 70 4 8 — Varalla olevat eläimet poikasten korvaamista tai täydentäviä kokeita varten Esimerkki 2 6. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostasoa (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä koskevaan vieroitusta edeltävään testiin. Näistä eläimistä 10 pentua/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisesti syntymän jälkeisenä päivänä 11. Aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään histopatologisessa tutkimuksessa. 7. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään vieroituksen jälkeisiin testeihin (yksityiskohtaisten kliinisten havaintojen, motorisen aktiviteetin ja sukukypsyysiän sekä motorisen ja aistien toiminnan arviointi). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) nukutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (arviolta syntymän jälkeinen päivä 70). Uuden fiksaation in situ jälkeen aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa. 8. Kasvuikäisten ja nuorten täysikasvuisten kognitiivisen toiminnan testaukseen käytetään 10 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai 1 naaras poikuetta kohti). Eri eläimiä käytetään, kun kognitiivista toimintaa testataan syntymisen jälkeisenä päivänä 23 ja nuorilla täysikasvuisilla eläimillä. Täysikasvuisena testatut 10 eläintä/sukupuoli/annostaso lopetetaan tutkimuksen päätösvaiheessa, niiden aivot poistetaan ja punnitaan. 9. Jäljelle jääneet 20 eläintä/sukupuoli/ryhmä, joita ei valittu kokeisiin, lopetetaan ja poistetaan vieroituksen yhteydessä. Taulukko 2 Poikasten määrä (9) Kokeisiin valittujen poikasten määrä Tutkimus/Testi uros naaras 1 5 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys 10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino/neuropatologia/morfometria 2 6 20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 20 urosta + 20 naarasta Motorinen ja aistien toiminta 10 urosta + 10 naarasta Nuoren täysikasvuisen yksilön aivojen paino/neuropatologia/morfometria ~ SJP 70 3 7 10 urosta + 10 naarasta (10) Oppiminen ja muisti (SJP 23) 3 7 10 urosta + 10 naarasta (10) Oppiminen ja muisti (nuoret täysikasvuiset eläimet) Nuorten täysikasvuisten eläinten aivojen paino 4 8 — Eläimet, jotka lopetetaan ja poistetaan syntymän jälkeisenä päivänä 21. Esimerkki 3 10. Yhtä ryhmää — 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään aivojen painon arviointiin ja neuropatologiseen arviointiin syntymän jälkeisenä päivänä 11. Näistä eläimistä 10 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai 1 naaras poikuetta kohti) lopetetaan inhimillisellä tavalla syntymän jälkeisenä päivänä 11 ja niiden aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään histopatologisessa tutkimuksessa. Lisäksi aivojen painoja koskevat tiedot kerätään käyttämällä jäljelle jääneiden 10 uroksen ja 10 naaraan irrotettuja aivoja annostasoa kohden. 11. Toista ryhmää — 20 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään käytöksen kehitystä (motorista aktiviteettia) koskeviin vieroituksen jälkeisiin kokeisiin (motorinen aktiviteetti ja sukukypsyysiän arviointi) sekä kasvuikäisten eläinten kognitiivisen toiminnan testaukseen. 12. Lisäksi toista ryhmää — 20 pentua/sukupuoli/annostasoa (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti) — käytetään motorista ja aistien toimintaa koskeviin kokeisiin (akustinen säpsähdysvaste) sekä yksityiskohtaisia kliinisiä havaintoja varten. Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) nukutetaan ja fiksoidaan perfuusiotekniikalla tutkimuksen päätösvaiheessa (arviolta syntymän jälkeinen päivä 70). Uuden fiksaation in situ jälkeen aivot poistetaan, punnitaan ja käsitellään neuropatologisessa tutkimuksessa. 13. Kasvuikäisten ja nuorten täysikasvuisten kognitiivisen toiminnan testaukseen käytetään 20 poikasta/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros ja 1 naaras poikuetta kohti). Näistä 10 eläintä/sukupuoli/annostaso (eli 1 uros tai yksi naaras poikuetta kohti) lopetetaan tutkimuksen päättyessä ja niiden aivot poistetaan ja punnitaan. Taulukko 3 Poikasten määrä (11) Kokeisiin valittujen poikasten määrä Tutkimus/Testi uros naaras 1 5 10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino/neuropatologia/morfometria 10 urosta + 10 naarasta SJP 11 aivojen paino 2 6 20 urosta + 20 naarasta Käytöksen kehitys (motorinen aktiviteetti) 20 urosta + 20 naarasta Motorinen aktiviteetti 20 urosta + 20 naarasta Sukukypsyys 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (SJP 27) 3 7 20 urosta + 20 naarasta Akustinen säpsähdysvaste (kasvuikäiset ja nuoret täysikasvuiset eläimet) 20 urosta + 20 naarasta Yksityiskohtaiset kliiniset havainnot 10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläinten aivojen paino/neuropatologia morfometria ~ SJP 70 4 8 20 urosta + 20 naarasta Oppiminen ja muisti (nuoret täysikasvuiset eläimet) 10 urosta + 10 naarasta Nuorten täysikasvuisten eläinten aivojen paino

Lisäys 2 Määritelmät Kemikaali: aine tai seos Testattava kemikaali: mikä tahansa aine tai seos, jota testataan käyttämällä tätä testimenetelmää

B.54. KOHTUUN AIHEUTUVIEN VAIKUTUKSIEN BIOTESTI JYRSIJÖILLÄ: LYHYTAIKAINEN SEULONTATESTI ESTROGEENISISTA OMINAISUUKSISTA

JOHDANTO

1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 440 (2007). OECD aloitti vuonna 1998 korkean prioriteetin toimenpiteet, jotta voimassa olevia ohjeita tarkistetaan ja kehitetään uusia, joilla mahdollisia hormonaalisia haitta-aiheita seulotaan ja testataan (1). Yksi toimenpide oli kehittää testiohje jyrsijöiden kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevalle biotestille. Jyrsijöiden kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevan biotestin osalta toteutettiin kattava validointiohjelma, johon sisältyi yksityiskohtaisten tausta-asiakirjojen kerääminen (2)(3) ja sellaisten laajojen laboratorioiden sisäisten ja niiden välisten tutkimusten teettäminen, joilla osoitettiin biotestin merkitys ja toistettavuus, kun kyseessä on tehokas referenssiestrogeeni, heikot estrogeenireseptorin agonistit, voimakas estrogeenireseptorin antagonisti ja negatiivinen vertailukemikaali (4)(5)(6)(7)(8)(9). Tämä testimenetelmä B.54 on tulos validointiohjelmassa saadusta kokemuksesta ja tuloksista, joita sen perusteella saatiin agonisteista, joilla on estrogeenisia ominaisuuksia.

2. Kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskeva biotesti on lyhytaikainen seulontatesti, joka kehitettiin 1930-luvulla (27)(28) ja jonka asiantuntijaryhmä standardoi ensimmäisen kerran seulontaa varten vuonna 1962 (32)(35). Se perustuu kohdun painon lisääntymiseen tai uterotrofiseen reaktioon (ks. yksityiskohtia varten (29)). Testissä arvioidaan kemikaalin kykyä käynnistää biologista toimintaa, joka on yhdenmukainen luonnollisten estrogeenien (esim. 17ß-estradioli) ominaisuuksia omaavien agonistien tai antagonistien kanssa. Sitä käytetään kuitenkin antagonistin havaitsemiseen paljon harvemmin kuin agonistin havaitsemiseen. Kohtu reagoi estrogeeneihin kahdella tavalla. Ensimmäinen vaste on painonnousu veden imeytymisen vuoksi. Tätä vastetta seuraa kudosten kasvusta aiheutuva painonnousu (30). Kohdun vasteet rotilla ja hiirillä ovat laadullisesti vertailukelpoiset.

3. Tämä biotesti on in vivo -seulontatesti ja sen soveltamista olisi tarkasteltava osana hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskevaa OECD:n käsitekehystä (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (liite 2). Tässä käsitekehyksessä kohtuun aiheutuvia vaikutuksia mittaava biotesti sisältyy tasolle 3 in vivo -testinä, jolla tarjotaan tietoja yhdestä endokriinisesta mekanismista, estrogeenisesta toiminnasta.

4. Kohtuun aiheutuvia vaikutuksia koskevaan biotestiin on tarkoitus sisällyttää in vitro- ja in vivo -testiryhmä, joilla tunnistetaan sisäeritysjärjestelmään mahdollisesti vaikutuksia aiheuttavat kemikaalit. Viime kädessä tehdään ihmisten terveyttä tai ympäristöä koskevat riskinarvioinnit. OECD:n validointiohjelmassa käytetään vahvoja ja heikkoja estrogeenivaikutuksia omaavia agonisteja arvioimaan estrogeenisten kemikaalien tunnistamista koskevan testin tehokkuutta (4)(5)(6)(7)(8). Näin ollen testimenettelyn herkkyys estrogeenivaikutuksia omaaville agonisteille osoitettiin asianmukaisesti samoin kuin laboratorion sisäinen ja niiden välinen toistettavuus.

5. Negatiivisten kemikaalien osalta ainoastaan yksi ’negatiivinen’ vertailukemikaali — joka jo todettiin negatiiviseksi kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevassa testissä sekä in vitro reseptorin sitoutumista koskevassa testissä ja reseptoritestissä — sisällytettiin validointiohjelmaan. Lisäksi on arvioitu muita testituloksia, jotka eivät liity OECD:n validointiohjelmaan, ja niillä tuetaan kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin spesifiyttä estrogeenivaikutuksia omaavien agonistien seulonnan suhteen (16).

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

6. Estrogeenivaikutuksia omaavat agonistit ja antagonistit toimivat ligandeina estrogeenireseptoreille a ja b, ja ne voivat aktivoida tai estää reseptoreiden ohjaaman geenitranskription. Tämä voi mahdollisesti aiheuttaa terveydelle vaaroja, kuten lisääntymis- ja kehitysvaikutuksia. Tästä syystä on arvioitava ja analysoitava nopeasti, voiko kemikaali toimia mahdollisesti estrogeenivaikutuksia omaavana agonistina tai antagonistina. Ligandin sitoutuminen estrogeenireseptoriin tai reportterigeenien transkription aktivointi in vitro tarjoaa tietoja, mutta kyseessä on ainoastaan yksi monista tekijöistä, jotka voivat osoittaa mahdollisen vaaran. Muihin voivat sisältyä metaboloinnin aktivointi ja deaktivointi kehoon siirtymisen yhteydessä, kohdekudoksiin jakautuminen ja poistuminen kehosta riippuen ainakin osittain altistusreitistä ja testattavasta kemikaalista. Tämän vuoksi on seulottava kemikaalin mahdollinen vaikutus in vivo tiettyjen olosuhteiden perusteella, ellei kemikaalin absorptiota, jakautumista, aineenvaihduntaa ja erittymistä koskevilla ominaisuuksilla jo tarjoa asianmukaista tietoa. Kohdun kudokset reagoivat estrogeenistimulaatioon nopealla ja voimakkaalla kasvulla erityisesti niiden laboratoriojyrsijöiden osalta, joiden kiimakierto kestää noin neljä päivää. Jyrsijälajeja, erityisesti rottia, käytetään myös laajasti myrkyllisyystutkimuksissa vaaratekijöiden kuvaamista varten. Tästä syystä jyrsijän kohtu on tarkoituksenmukainen kohde-elin estrogeenivaikutuksia omaavien agonistien ja antagonistien in vivo -seulontaa varten.

7. Tämä testimenetelmä perustuu sellaisiin OECD:n validointitutkimuksessa käytettyihin menettelyihin, joiden on osoitettu olevan luotettavia ja toistettavia laboratorioiden sisäisissä ja niiden välisissä tutkimuksissa (5)(7). Tällä hetkellä on käytössä kaksi menettelyä: täysikasvuista naarasta, jolta on poistettu munasarjat (ovarektomia), koskeva menetelmä, jäljempänä ’ovx-täysikasvuista koskeva menetelmä’, ja keskenkasvuista naarasta, jolta ei ole poistettu munasarjoja, koskeva menetelmä, jäljempänä ’keskenkasvuista eläintä koskeva menetelmä’. OECD:n testin validointiohjelmassa osoitettiin, että molemman menetelmän herkkyys ja toistettavuus vastasivat toisiaan. Kuitenkin keskenkasvuista eläintä, koska sillä on koskematon HPG-akseli (eli hypotalamusta, aivolisäkettä ja sukupuolirauhasia koskeva akseli), koskeva menetelmä on vähemmän spesifinen. Se kattaa kuitenkin laajemman tutkimusalan kuin ovx-eläintä koskevassa tapauksessa, koska se voi reagoida HPG-akseliin vaikuttavien kemikaalien, eikä vain estrogeenireseptorin kanssa. Rotan HPG-akseli on toimintakykyinen noin 15 päivän iässä. Sitä ennen puberteettia ei voida nopeuttaa GnRH:n (gonadoliberiini) kaltaisilla käsittelyillä. Kun naaras tulee puberteetti-ikäiseksi ennen emättimen avautumista, sillä on useita kuukautiskiertoja, jotka eivät johda emättimen avautumiseen tai ovulaatioon, mutta jonkinlaisia hormonaalisia vaihteluita esiintyy. Jos kemikaali stimuloi HPG-akselia suoraan tai epäsuorasti, tästä aiheutuu ennenaikainen puberteetti, varhainen ovulaatio ja nopeutunut emättimen avautuminen. Tätä eivät aiheuta pelkästään HPG-akselilla toimivat kemikaalit. Tietyt ruokavaliot, joilla on muita korkeampi muuntokelpoinen energiataso, edistävät kasvua ja nopeuttavat emättimen avautumista ilman, että niillä on estrogeenivaikutuksia. Tällaisilla kemikaaleilla ei aiheutettaisi uterotrofista reaktiota ovx-täysikasvuisissa eläimissä, sillä niiden HPG-akseli ei toimi.

8. Eläinten hyvinvointiin liittyvistä syistä etusija olisi annettava menetelmälle, jossa käytetään keskenkasvuisia rottia, jossa vältetään eläinten kirurgista esikäsittelyä ja jossa vältetään myös käyttämästä eläimiä, joissa havaitaan näyttöä kiimakiertoon siirtymisestä (ks. 30 kohta).

9. Uterotrofinen vaste ei aiheudu pelkästään estrogeeneistä, eli kemikaalit, jotka ovat muita kuin estrogeenivaikutuksia omaavia agonisteja tai antagonisteja, voivat myös aiheuttaa vasteen. Esimerkiksi suhteellisen suuret annokset progesteronia, testosteronia, tai useita synteettisiä progetiinejä voivat kaikki aiheuttaa vasteen (30). Kaikkia reaktioita voidaan myös analysoida histologisesti emättimen keratinisaation ja sarveistuman osalta (30). Vasteen mahdollisesta alkuperästä riippumatta kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin positiivisen tuloksen vuoksi olisi normaalisti suoritettava lisäselvityksiä. Estrogeenivaikutusta koskeva täydentävä näyttö voidaan saada in vitro -testeistä, kuten estrogeenireseptorin sitoutumistesteistä ja transkription aktivointia koskevista testeistä tai muista in vivo -testeistä, kuten naaraan puberteettia koskevasta testistä.

10. Kun otetaan huomioon, että kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevaa biotestiä voidaan käyttää in vivo -seulontatestinä, sovellettua validointimenetelmää voidaan hyödyntää eläinten hyvinvointiin liittyviä näkökohtia ja vaiheittaista testaamista koskevaa strategiaa varten. Tämän vuoksi pyrittiin validoimaan tarkasti estrogeenivaikutuksen osalta toistettavuus ja herkkyys — moniin kemikaaleihin liittyvä pääasiallinen huolenaihe –, mutta toimia toteutettiin vain vähän testin antiestrogeenivaikutusta koskevan komponentin osalta. Ainoastaan yhtä erittäin aktiivista antiestrogeenia testattiin, koska kemikaalien, joilla on selkeästi antiestrogeeninen profiili (joita ei häiritse vähäinen estrogeenin aktiivisuus), määrä on hyvin rajallinen. Näin ollen tämä testimenetelmä omistettiin estrogeenia koskevalle menettelylle, ja menettely, jossa kuvataan testin antagonista muotoa, sisällytettiin ohjeasiakirjaan (37). Pelkästään antiestrogeenisia kemikaaleja koskevan testin toistettavuus ja herkkyys määritellään selkeämmin myöhemmin sen jälkeen, kun tämä testimenettely on ollut rutiinikäytössä jonkin aikaa ja tällä toimintatavalla on tunnistettu enemmän kemikaaleja.

11. On pantava merkille, että kaikkien eläimiin perustuvien menettelyiden on täytettävä paikalliset eläinten hoitoa koskevat vaatimukset; jäljempänä esitetyt kuvaukset hoidosta ja käsittelystä ovat toimintaa koskevia vähimmäisvaatimuksia, ja ne korvataan paikallisilla säännöksillä, kuten tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetulla Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2010/63/EU (38). OECD antaa lisäohjeita eläinten inhimillisestä kohtelusta (25).

12. Kuten kaikissa testeissä, joissa käytetään eläviä eläimiä, ennen testin aloittamista on tärkeää varmistaa, että tiedot ovat todella tarpeen. Esimerkkinä mainitaan kaksi edellytystä, jolloin tietoja voidaan tarvita:

— korkea altistuspotentiaali (käsitekehyksen taso 1, liite 2) tai osoitukset estrogeenivaikutuksesta (taso 2), jolloin tutkitaan, voivatko tällaiset vaikutukset esiintyä in vivo

— estrogeenivaikutuksia osoittavat vaikutukset tason 4 tai 5 in vivo -testeissä sen perustelemiseksi, että vaikutukset liittyivät estrogeenin mekanismiin, jota ei voida selvittää in vitro -testiä käyttämällä.

13. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät esitetään liitteessä 1.

TESTIN PERIAATE

14. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin herkkyys perustuu eläinkoejärjestelmään, jossa hypotalamusta, aivolisäkettä ja munasarjoja koskeva akseli ei toimi, mikä johtaa estrogeenin alhaiseen endogeeniseen tasoon. Tällä varmistetaan lähtötilanteen alhainen kohdun paino ja maksimimäärä annettavista estrogeeneista aiheutuvia vasteita. Jyrsijöillä tämän edellytyksen täyttävät kaksi estrogeenien kannalta herkkää vaihetta:

i) keskenkasvuiset naaraat vieroituksen jälkeen ja ennen puberteettia, ja

ii) nuoret täysikasvuiset naaraat, joille on suoritettu ovariektomia ja joiden kohdun kudoksille on annettu riittävästi aikaa toipua.

15. Testikemikaali annostellaan päivittäin suun kautta letkulla tai ihonalaisella injektiolla. Testikemikaalin porrastetut annokset annetaan vähintään kahdelle koeryhmälle (ks. ohjeistusta varten 33 kohta). Ryhmää kohden käytetään yksi annostaso. Keskenkasvuista eläintä koskevassa menetelmässä altistusaika on kolme peräkkäistä päivää ja ovx-täysikasvuista koskevassa menetelmässä lyhyin mahdollinen altistusaika on kolme peräkkäistä päivää. Koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus noin 24 tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta. Estrogeenivaikutuksia omaavien agonistien osalta altistettujen eläinryhmien kohdun keskimääräistä painoa verrataan kantaja-ainetta saaneeseen ryhmään tilastollisesti merkittävän lisäyksen arvioimiseksi. Tilastollisesti merkittävä kohdun keskimääräinen painonlisäys testiryhmässä osoittaa positiivisen reaktion tähän biotestiin.

MENETELMÄN KUVAUS

Eläinlajin valinta

16. Testiin voidaan käyttää laboratoriossa yleisesti käytettyjä jyrsijäkantoja. Esimerkiksi validoinnissa käytettiin rottakantoja Sprague-Dawley ja Wistar. Niissä ei pitäisi käyttää kantoja, joiden kohdun tiedetään tai epäillään olevan vähemmän reaktiivinen. Laboratorion tulee osoittaa käytetyn kannan herkkyys siten, kuin tämä määritellään 26 ja 27 kohdassa.

17. Rottia ja hiiriä on käytetty tavallisesti kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevassa biotestissä 1930-luvulta lähtien. OECD:n validointitutkimukset suoritettiin ainoastaan rotilla, koska tulkittiin, että kummankin lajin odotetaan olevan vastaavia ja sen vuoksi yhden lajin pitäisi riittää kansainvälistä validointia varten. Näin säästetään resursseja ja eläimiä. Rotta on laji, joka on valittu useimpiin lisääntymistä ja kehitystä koskeviin toksisuustutkimuksiin. On otettava huomioon, että hiiristä on olemassa aikaisempia tietoja koskeva laaja tietokanta, ja jyrsijöiden kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin testimenetelmän alaa laajennettiin siten, että hiiriä käytettiin testilajina, ja hiiristä suoritettiin validointia varten rajoitettu seurantatutkimus (16). Tällainen vertailuun liittyvä lähestymistapa, jossa käytetään rajallinen määrä testikemikaaleja, johon osallistuu rajallinen määrä laboratorioita ja johon ei sisälly koodattuja testinäytteitä, valittiin, koska alkuperäinen tarkoitus oli resurssien ja eläimien säästäminen. Tämä vertailuun liittyvä validointitutkimus osoittaa nuorten täysikasvuisten hiiren, jolta on poistettu munasolut, kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin osalta, että rotista ja hiiristä saadut tiedot korreloivat laadullisesti ja määrällisesti keskenään. Mikäli kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskeva biotesti tehdään ennen pitkäaikaista tutkimusta, kummassakin kokeessa on käytettävä samaa eläinlajia ja -kantaa. Vertailuun perustuva lähestymistapa rajoittui ovx-täysikasvuisiin hiiriin, ja raportissa ei tarjota tarpeeksi kattavia tietoja keskenkasvuista eläintä koskevan mallin validoimiseksi, joten keskenkasvuisia hiiriä koskevan mallin ei katsota kuuluvan tämän testimenetelmän piiriin.

18. Näin ollen joissain tapauksissa rottien sijasta voidaan käyttää hiiriä. Tämän lajin käyttöä olisi perusteltava toksikologisilla, farmakokineettisillä ja/tai muilla kriteereillä. Hiirten osalta menettelyyn voidaan tarvita muutoksia. Esimerkiksi hiiret kuluttavat ruumiinpainon perusteella enemmän ravintoa kuin rotat, joten ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin pitoisuuden olisi oltava hiirillä alhaisempi kuin rotilla (9)(20)(22).

Koe-eläinten häkit ja ruokinta

19. Kaikkien toimenpiteiden olisi oltava eläinten hoitoa koskevien paikallisten vaatimusten mukaisia. Nämä kuvaukset hoidosta ja käsittelystä ovat vähimmäisvaatimuksia, ja ne korvataan paikallisilla säännöksillä, kuten tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetulla Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 2010/63/EU (38). Koe-eläinhuoneen lämpötilan pitäisi olla 22 °C (se voi vaihdella noin ± 3 °C). Suhteellinen kosteus on vähintään 30 % eikä mielellään ylitä 70:tä % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana. Tavoitteena on 50–60 %:n suhteellinen kosteus. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta. Valaistusta olisi käytettävä jaksossa 12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää.

20. Laboratorioruokintaa ja juomaveden määrää ei saa rajoittaa. Nuoret täysikasvuiset eläimet voidaan pitää häkeissä yksittäin tai korkeintaan kolmen eläimen ryhmissä. Keskenkasvuisten eläinten nuoren iän vuoksi suositellaan muutaman eläimen pitämistä häkissä.

21. Laboratorioruokavalion fytoestrogeenin korkean tason tiedetään lisäävän jyrsijöiden kohdun painoa siinä määrin, että se vaikuttaa kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevaan biotestiin (13)(14)(15). Fytoestrogeenin ja muuntokelpoisen energian korkea taso laboratorioruokavaliossa voi myös johtaa varhaiseen puberteettiin, jos käytetään keskenkasvuisia eläimiä. Fytoestrogeenien esiintyminen johtuu pääasiassa soijan ja sinimailasen sisällyttämisestä laboratorioravintoon, ja fytoestrogeenien pitoisuuden on osoitettu vaihtelevan tavanomaisessa laboratorioravinnossa eläinryhmien välillä (23). Ruumiinpaino on tärkeä muuttuja, ja kulutetun ravinnon määrä on verrannollinen ruumiinpainoon. Tästä syystä samasta ruokavaliosta saatu todellinen fytoestrogeeniannos voi vaihdella lajien ja iän mukaan (9). Keskenkasvuisten naarasrottien ravinnonkulutus ruumiinpainoon nähden voi olla noin kaksi kertaa suurempi kuin nuorten täysikasvuisten naaraiden, joilta on poistettu munasarjat. Nuorten täysikasvuisten hiirten ravinnonkulutus ruumiinpainoon nähden voi olla noin neljä kertaa suurempi kuin nuorten täysikasvuisten naarasrottien, joilta on poistettu munasarjat.

22. Kohtuun kohdistuvia vaikutuksia koskevan biotestin tulokset (9)(17)(18)(19) osoittavat kuitenkin, että rajallinen määrä ravintoon sisältyvää fytoestrogeenia voidaan hyväksyä ja tämä ei vähennä biotestin herkkyyttä. Ohjeena on se, että ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin taso ei saa ylittää Sprague Dawley- ja Wistar-lajien keskenkasvuisten naaraspuolisten rottien osalta 350:tä μg vastaavaa genisteiinin määrää/gramma (6)(9). Tällaisten ruokavalioiden olisi oltava myös tarkoituksenmukaisia, kun testataan nuoria täysikasvuisia rottia, joilta on poistettu munasarjat, koska nuorten täysikasvuisten eläinten ravinnonkulutus ruumiinpainoon nähden on alhaisempi keskenkasvuisiin verrattuna. Jos käytetään täysikasvuisia hiiriä, joilta on poistettu munasarjat, tai fytoestrogeenille herkempiä rottia, on harkittava, että ravintoon sisältyvän fytoestrogeenin tasoa vähennetään vastaavasti (20). Lisäksi erilaisista ruokavalioista johtuvat muuntokelpoiseen energiaan liittyvät erot voivat johtaa puberteetin alun siirtymiseen (21)(22).

23. Ennen tutkimusta edellytetään ruokavalion huolellista valintaa, ja sen fytoestrogeenien tai muuntokelpoisen energian taso ei saa olla korkea (ohjeistusta varten ks. (6)(9)), koska tämä vaikuttaisi tuloksiin häiritsevästi (15)(17)(19)(22)(36). Laboratorion käyttämän testijärjestelmän, siten kuin se määritellään 26 ja 27 kohdassa, moitteettoman suorittamisen varmistaminen on molemman tekijän osalta tärkeää. Hyvän laboratoriokäytännön perusteella on varmistettava, että kunkin tutkimuksen aikana annetun ravintoerän edustava näytteenotto suoritetaan fytoestrogeenisen sisällön mahdollista analyysiä varten (esim. siinä tapauksessa, että kohdun kontrollipaino on korkea suhteessa aiempiin kontrolleihin tai jos vaste referenssiestrogeeniin, 17-alfa-etinyyliestradioliin, ei ole riittävä). Osanäytteitä olisi analysoitava osana tutkimusta tai pakastettuna – 20 °C:een taikka siten, että näytteen hajoaminen ennen analyysiä estetään.

24. Joihinkin koehäkin alustan materiaaleihin voi sisältyä luonnossa esiintyviä estrogeenisia tai antiestrogeenisia kemikaaleja (esim. maissintähkän tiedetään vaikuttavan rottien sykliin ja sillä vaikuttaa olevan antiestrogeenivaikutuksia). Valittuun alusmateriaaliin pitäisi sisältyä mahdollisimman vähän fytoestrogeeneja.

Eläinten valmistelu

25. Koe-eläimet, joilla ei näy merkkejä taudista tai fyysisistä poikkeavuuksista, jaetaan satunnaisotannalla kontrolli- ja koeryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että niiden sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Jokainen eläinyksilö tunnistetaan. Keskenkasvuisia eläimiä olisi mieluiten pidettävä häkissä emojen tai sijaisemojen kanssa, ennen kuin ne vieroitetaan totutusvaiheen aikana. Tutkimusta edeltävän nuorten täysikasvuisten eläinten ja keskenkasvuisten eläinten, jotka toimitetaan emojen tai sijaisemojen kanssa, totutusvaiheen pituuden pitäisi olla noin viisi päivää. Jos keskenkasvuiset eläimet saadaan vastavieroitettuina ja ilman emoja, lyhyempi totutusvaihe voi olla tarpeen, koska annostelun pitäisi alkaa välittömästi vieroituksen jälkeen (ks. 29 kohta).

TESTIN SUORITTAMINEN

Laboratorioiden pätevyyden varmistaminen

26. Laboratorioiden pätevyyden varmistamiseen voidaan käyttää kahta eri vaihtoehtoa:

— Säännöllinen tarkastus, joka perustuu alkuperäiseen lähtötilanteen positiiviseen kontrollitutkimukseen (ks. 27 kohta). Vähintään kuuden kuukauden välein ja aina silloin, kun esiintyy muutos, joka voi vaikuttaa testin suoritukseen (esim. ruokavalion uusi koostumus, dissektiot suorittavaan henkilöstöön liittyvät muutokset, eläinkannan tai toimittajan muuttuminen), testijärjestelmän (elä