KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOPÄÄTÖS (EU) 2015/1554,

annettu 11 päivänä syyskuuta 2015,

direktiivin 2006/88/EY soveltamissäännöistä seurantaa ja diagnostisia menetelmiä koskevien vaatimusten osalta

(tiedoksiannettu numerolla C(2015) 6188)

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon vesiviljelyeläimiin ja niistä saataviin tuotteisiin sovellettavista eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista sekä vesieläinten tiettyjen tautien ehkäisemisestä ja torjunnasta 24 päivänä lokakuuta 2006 annetun neuvoston direktiivin 2006/88/EY (1) ja erityisesti sen 49 artiklan 3 kohdan, 50 artiklan 4 kohdan, 57 artiklan b alakohdan ja 61 artiklan 3 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

Direktiivissä 2006/88/EY säädetään ennaltaehkäisevistä vähimmäistoimenpiteistä, joiden tarkoituksena on direktiivin liitteessä IV lueteltujen tautien, jäljempänä ’luetellut taudit’, seuranta ja varhainen havaitseminen vesieläimissä, sekä torjuntatoimenpiteistä, joita on sovellettava, kun kyseessä on lueteltujen tautien taudinpurkaus tai epäily siitä. Lisäksi direktiivissä säädetään vaatimuksista, jotka koskevat taudista vapaan aseman saavuttamista jäsenvaltioiden tai niiden vyöhykkeiden tai lokeroiden osalta.

Lueteltujen tautien hävittämisen ja taudista vapaan aseman saavuttamisen jäsenvaltion, vyöhykkeen tai lokeron osalta on perustuttava samoihin periaatteisiin ja noudatettava samaa tieteellistä lähestymistapaa kaikkialla unionissa. Tästä syystä on tarpeen vahvistaa unionin tasolla erityiset vaatimukset, jotka koskevat hävittämis- ja seurantajärjestelmiä sekä näytteenottoa ja diagnostisia menetelmiä, joita jäsenvaltiot käyttävät taudista vapaan aseman saavuttamiseksi koko jäsenvaltion tai sen jonkin vyöhykkeen tai lokeron osalta.

Luetellun taudin epäillyn tai vahvistetun esiintymisen tapauksessa tehtävien laboratoriotutkimusten olisi oltava samat unionin tasolla, ja niissä olisi noudatettava samoja tieteellisiä standardeja ja protokollia. Direktiivin 2006/88/EY mukaisesti on tarpeen vahvistaa erityiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt, joita jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten tätä tarkoitusta varten nimeämien hyväksyttyjen laboratorioiden on käytettävä.

Tältä osin vesieläinsäännöstössä mainitaan monien lueteltujen tautien osalta useita laboratoriotutkimuksissa käytettäviä testejä ja menettelyjä. Lueteltuja tauteja koskevan diagnostisen työn tieteellisen perustan yhtenäistämiseksi unionin tasolla on suoritettava valinta OIE:n suosittelemien diagnostisten tutkimusten ja menettelyjen joukosta ja täsmennettävä, mitkä testit olisi määrättävä pakollisiksi laboratoriotutkimuksessa seurantaohjelmia toteutettaessa ja luetellun taudin epäilyn poissulkemiseksi tai sen esiintymisen vahvistamiseksi. Koska tietyissä tapauksissa saatavilla on tarpeen olla myös vaihtoehtoisia menetelmiä ja menettelyjä, olisi esitettävä kuvauksia ja tieteellisistä perusteita sille, milloin ja miten vaihtoehtoisia menetelmiä voidaan käyttää. Tämä on erityisesti tarpeen yksityiskohtaisempien diagnostisten menetelmien osalta.

Jotta voidaan tuottaa tarkkoja ja toistettavissa olevia diagnostisia tuloksia, on tärkeää, että käytettävät yksityiskohtaiset menettelyt ja protokollat on validoitu direktiivin 2006/88/EY liitteessä VI olevassa I osassa tarkoitettujen asiaa koskevien laatuvaatimusten mukaisesti. Useiden tässä päätöksessä säädettyjen diagnostisten menetelmien osalta kaupallisten testikittien käyttäminen on välttämätön osa diagnostisia protokollia, ja Euroopan vertailulaboratoriot (EURL) ovat validoineet kyseiset testikitit akkreditoiduilla testeillä asianomaisten tautien torjumiseksi. Oikeusvarmuuden vuoksi tässä päätöksessä olisi viitattava kyseisten validoitujen testikittien kaupallisiin nimiin.

Joidenkin jäsenvaltioiden voi olla vaikea saavuttaa yhdestä tai useammasta luetellusta taudista vapaa asema koko jäsenvaltion tai sen jonkin vyöhykkeen tai lokeron osalta. Tällaisessa tilanteessa asianomainen jäsenvaltio ei ehkä halua saada tai palauttaa taudista vapaata asemaa kyseisten luetteloitujen tautien osalta. Vähimmäistorjuntatoimenpiteiden, joita on sovellettava, kun asianomainen jäsenvaltio ei halua saada tai palauttaa taudista vapaata asemaa, olisi oltava samat unionin tasolla ja niissä olisi noudatettava samoja perusteita. Direktiivin 2006/88/EY mukaisesti on siksi tarpeen vahvistaa kyseisten lueteltujen tautien rajoittamista koskevat yksityiskohtaiset säännöt ja vähimmäisvaatimukset rajoittavien toimenpiteiden poistamiseksi.

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:

1 artikla

Kohde

Tässä päätöksessä vahvistetaan säännöt, jotka koskevat seuraavia:

seuranta, puskurivyöhykkeet, näytteenotto ja diagnostiset menetelmät, joita jäsenvaltioiden on käytettävä sen mukaan, mikä on tautitilanne jäsenvaltioissa tai niiden vyöhykkeillä tai lokeroissa direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltujen muiden kuin eksoottisten vesieläinten tautien osalta, jäljempänä ’luetellut taudit’;

2 artikla

Määritelmät

Tässä päätöksessä tarkoitetaan

3 artikla

Hävittämis- ja seurantaohjelmia koskevat vähimmäisvaatimukset

Jäsenvaltioiden on varmistettava, että liitteessä I vahvistettuja seuranta- ja hävittämisohjelmia, puskurivyöhykkeitä, näytteenottoa ja diagnostisia menetelmiä koskevia sääntöjä ja liitteessä II vahvistettuja erityisiä menetelmiä ja yksityiskohtaisia menettelyjä noudatetaan, kun taudista vapaa asema myönnetään, peruutetaan tai palautetaan jäsenvaltiolle tai sen vyöhykkeelle tai lokerolle yhden tai useamman luetellun taudin osalta.

4 artikla

Diagnostisia menetelmiä ja erityisiä menettelyjä koskevat vähimmäisvaatimukset

Jäsenvaltioiden on varmistettava, että liitteessä I vahvistettuja torjuntamenetelmiä ja liitteessä II vahvistettuja erityisiä diagnostisia menetelmiä ja yksityiskohtaisia menettelyjä noudatetaan, kun suoritetaan laboratoriotutkimuksia luetellun taudin esiintymisen varmistamiseksi tai poissulkemiseksi.

5 artikla

Vähimmäistorjuntatoimenpiteet lueteltujen tautien rajoittamiseksi ja vähimmäisvaatimukset rajoittavien toimenpiteiden poistamiseksi jäsenvaltioissa, vyöhykkeillä tai lokeroissa, joita ei ole julistettu vapaiksi luetelluista taudeista

Jäsenvaltioiden on varmistettava, että liitteessä I vahvistettuja vähimmäistorjuntatoimenpiteitä ja rajoittavien toimenpiteiden poistamista koskevia vähimmäisvaatimuksia noudatetaan, kun suoritetaan torjuntatoimenpiteitä ja poistetaan rajoittavia toimenpiteitä yhden tai useamman luetellun taudin osalta jäsenvaltiossa tai sen vyöhykkeellä tai lokerossa, jota ei ole julistettu kyseisistä luetelluista taudeista vapaaksi.

6 artikla

Kumoaminen

Kumotaan päätökset 2001/183/EY, 2002/878/EY ja 2003/466/EY.

7 artikla

Soveltamispäivä

Tätä päätöstä sovelletaan 1 päivästä huhtikuuta 2016.

8 artikla

Osoitus

Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

(1) EUVL L 328, 24.11.2006, s. 14.

(2) Komission päätös 2001/183/EY, tehty 22 päivänä helmikuuta 2001, näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja varmistamiseksi ja päätöksen 92/532/ETY kumoamisesta (EYVL L 67, 9.3.2001, s. 65).

(3) Komission päätös 2003/466/EY, tehty 13 päivänä kesäkuuta 2003, vyöhykejaon ja virallisen valvonnan perusteista epäiltäessä lohen tarttuvaa anemiaa (ISA-tautia) tai sen esiintymisen varmistuttua (EUVL L 156, 25.6.2003, s. 61).

(4) Komission päätös 2002/878/EY, tehty 6 päivänä marraskuuta 2002, näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä nilviäistautien bonamioosi (Bonamia ostreae) ja marteilioosi (Marteilia refringens) havaitsemiseksi ja niiden esiintymisen varmistamiseksi (EYVL L 305, 7.11.2002, s. 57).

(10) Näytteitä on otettava sellaisesta määrästä kaloja, jolla varmistetaan, että KH-virus osoitetaan 95 %: n varmuudella, jos oletettu esiintyvyys on 5 %.

(8) Näytteitä on otettava sellaisesta määrästä kaloja, jolla varmistetaan, että VHS- tai IHN-virus osoitetaan 95 %:n varmuudella, jos oletettu esiintyvyys on 10 %.

(7) Näytteet on kerättävä aikaisintaan kolme viikkoa sen jälkeen, kun kalat on siirretty makeasta vedestä suolaiseen.

(6) Näytteitä on otettava sellaisesta määrästä kaloja, jolla varmistetaan, että VHS- tai IHN-virus osoitetaan 95 %:n varmuudella, jos oletettu esiintyvyys on 10 %.

(4) Näytteet on kerättävä aikaisintaan kolme viikkoa sen jälkeen, kun kalat on siirretty makeasta vedestä suolaiseen.

(3) Näytteitä on otettava sellaisesta määrästä kaloja, jolla varmistetaan, että VHS- tai IHN-virus osoitetaan 95 %:n varmuudella, jos oletettu esiintyvyys on 5 %.

(1) Näytteet on kerättävä aikaisintaan kolme viikkoa sen jälkeen, kun kalat on siirretty makeasta vedestä suolaiseen.

äyriäisten valkopilkkutaudin esiintyminen katsotaan vahvistetuksi, kun tässä liitteessä II olevassa 6 osassa vahvistettujen yksityiskohtaisten diagnostisten menetelmien ja menettelyjen mukaisesti suoritettu kaksivaiheisen PCR-menetelmä, jonka jälkeen suoritetaan sekvensointi, on positiivinen äyriäisten valkopilkkutautivirusten suhteen ja kun valituissa isännissä on äyriäisten valkopilkkutaudin patognomonisia merkkejä.

viralliseen tutkimukseen on kuuluttava vähintään yksi terveystarkastus ja yksi 10 äyriäisen näytteenotto, kun havaitaan valkopilkkutaudin kuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä, tai vähintään 150 äyriäisen, kun ei havaita kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä. Näytteet on testattava II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä. (kaksivaiheinen PCR);

Kun äyriäisten valkopilkkutautitartunta on vahvistettava tai tällaisen tartunnan epäily on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavia tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyjä:

istuttaminen on tehty vasta, kun kaikki äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti;

kaikkiin äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja kaikkiin muihin tyhjinä pidettyihin tai perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteina olleisiin viljelylaitoksiin on istutettu äyriäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta;

I.2.2.1 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen äyriäisten valkopilkkutautiviruksen hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

Kyseisten näytteenottopaikat on tarkastettava kiertävällä otannalla siten, että näytteet otetaan vuosittain 50 prosentissa näytteenottopaikkoja. Näytteenotto on suoritettava jaksossa II olevan taulukon 6.B mukaisesti. Näytteet on valittava, valmistettava ja tutkittava II jaksossa vahvistettujen diagnostisten ja näytteenottomenetelmien mukaisesti, ja laboratoriotutkimusten tulosten on oltava negatiivisia äyriäisten valkopilkkutaudin taudinaiheuttajan esiintymisen suhteen.

Jäsenvaltioissa, vyöhykkeillä tai lokeroissa, joissa viljelylaitosten lukumäärä on rajoitettu eikä näiden viljelylaitosten kohdennettu seuranta tuota riittävästi epidemiologisia tietoja, taudista vapaan aseman säilyttämistä koskeviin seurantaohjelmiin on sisällyttävä I.1 kohdassa vahvistettujen vaatimusten mukaisesti valitut näytteenottopaikat.

äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamaan viljelylaitokseen on istutettu äyriäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta.

äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttama viljelylaitos on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitäminen on kestänyt vähintään kuusi viikkoa;

Mantereella sijaitseva lokero, joka käsittää yhden ainoan viljelylaitoksen, jossa on luokan I terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta ja jonka terveystilanne kyseisen luetellun taudin osalta ei riipu ympäröivistä luonnonvesistä direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 3 kohdan mukaisesti ja jonka luokan I terveystilanne on peruutettu kyseisen direktiivin 53 artiklan 3 kohdan mukaisesti, voi saada luokan I terveystilanteen takaisin välittömästi sen jälkeen, kun toimivaltainen viranomainen on vahvistanut, että seuraavat edellytykset täyttyvät:

Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu ja desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

kaikki äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamaksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennettävä, puhdistettava, desinfioitava ja pidettävä tyhjillään. Tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa. Kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, niitä on pidettävä samanaikaisesti tyhjillään vähintään neljä viikkoa. Tätä kohtaa on sovellettava myös uusiin viljelylaitoksiin, jotka julistetaan virallisesti tartunnan saastuttamiksi hävittämisohjelman täytäntöönpanon aikana.

yksi terveystarkastus; niissä viljelylaitoksissa, joissa i alakohdassa tarkoitetut testit ovat tuottaneet negatiiviset tulokset, terveystarkastusten tekemistä on jatkettava kerran kuukaudessa sinä aikana, jona veden lämpötila on todennäköisesti vuoden korkeimmillaan, kunnes suoja-alue peruutetaan I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti.

suoja-alueen ulkopuolelle on perustettava seuranta-alue, jonka on vastattava:

meri- ja rannikkoalueilla: säteeltään yhden vuorovesikantaman tai vähintään 5 kilometrin mittaisen ympyrän sisään jäävää aluetta – sen mukaan, kumpi on suurempi –, jonka keskipisteenä on äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamaksi virallisesti julistettu viljelylaitos, taikka tätä vastaavaa aluetta, joka on määritetty asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta; tai

äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava:

direktiivin 2006/88/EY V luvussa olevassa 4 jaksossa vahvistettuja vähimmäistorjuntatoimenpiteitä on sovellettu käytännössä ja äyriäisten valkopilkkutaudin saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten läheisyyteen on perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava hävittämisohjelma:

sinne on istutettu äyriäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta.

se on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa;

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on direktiivin 2006/88/EY liitteessä III olevassa B osassa tarkoitettu luokan III terveystilanne äyriäisten valkopilkkutaudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikki viljelylaitokset, joissa pidetään kyseisen direktiivin liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, noudattavat kyseisen direktiivin liitteessä V vahvistettuja asiaa koskevia vaatimuksia ja kaikissa kyseisissä viljelylaitoksissa ja, kun direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevassa I osassa olevan 2 kohdan toisessa kohdassa niin vaaditaan, kyseisen kohdan mukaisesti valituissa luonnonvaraisten populaatioiden näytteenottopaikoissa on toteutettu seuraava kaksivuotinen ohjelma, joka käsittää terveystarkastuksia ja näytteiden keruun testausta varten.

jos joukossa on heikkoja tai kuolemaisillaan olevia äyriäisiä, on valittava ensisijaisesti tällaisia äyriäisiä. Jos tällaisia äyriäisiä ei ole, näytteeseen on valittava valitun taudille alttiin lajin eri ikäkohortteihin kuuluvia äyriäisiä, eli nuoria ja aikuisia, ja niiden on oltava suhteellisesti edustettuina näytteessä.

joki- ja järvialueilla on valittava yksi tai useampia seuraavista lajeista: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes tai Orconectes limosus. Jos näitä lajeja ei ole, näytteen on edustettava muita Decapoda-lahkoon kuuluvia taudille alttiita lajeja. Koska taudille alttiiden isäntälajien määrä on suuri, isäntälajit voidaan valita Decapoda-lahkon suvuista tai heimoista, joissa alttius on osoitettu luonnollisesti tai kokeellisesti;

meri- ja suistoalueilla on valittava yksi tai useampia seuraavista lajeista: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus tai Penaeus-suvun katkarapuja eli Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Jos näitä lajeja ei ole, näytteen on edustettava muita Decapoda-lahkoon kuuluvia taudille alttiita lajeja. Koska taudille alttiiden isäntälajien määrä on suuri, isäntälajit voidaan valita Decapoda-lahkon suvuista tai heimoista, joissa alttius on osoitettu luonnollisesti tai kokeellisesti;

Kun luonnonvaraisten populaatioiden kohdennettua seurantaa edellytetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan I osan 2 kohdan toisen kohdan mukaisesti, näytteenottokohtien lukumäärä ja maantieteellinen jakauma on määritettävä siten, että kattavuus on kohtuullinen jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa. Näytteenottopaikkojen on myös edustettava erilaisia ekosysteemejä, kuten meriä, suistoja, jokia ja järviä, joissa on taudille alttiita luonnonvaraisia populaatioita.

jos tuotantoyksiköissä on heikkoja tai kuolemaisillaan olevia äyriäisiä, on valittava ensisijaisesti tällaisia äyriäisiä. Jos tällaisia äyriäisiä ei ole, näytteeseen on valittava valittuun taudille alttiiseen lajiin ja eri kokokohortteihin kuuluvia äyriäisiä, eli nuoria ja aikuisia, ja niiden on oltava suhteellisesti edustettuina näytteessä;

Näytteenotto äyriäisistä laboratoriotutkimusta varten on suoritettava, kun veden lämpötila on todennäköisesti vuoden korkeimmillaan. Tätä veden lämpötilaa koskevaa vaatimusta sovelletaan myös terveystarkastuksiin silloin, kun ne ovat toteutettavissa ja tarkoituksenmukaisia.

Viralliseen tarkastukseen on sisällyttävä vähintään yksi näytteenotto, johon kerätään 30 taudille alttiiseen lajiin kuuluvaa nilviäisiä, jos epäilys perustuu kuolleisuusraporttiin, tai jos ei perustu, 150 taudille alttiiseen lajiin kuuluvaa nilviäistä, nilviäisten bonamioosin tarttumiskauden alkamisen jälkeen. Jos tarttumisaika ei ole tiedossa, näytteenotto on aloitettava talvella tai alkukeväästä; Näytteet on testattava käyttämällä i alakohdassa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä liitteessä II olevan 5 osan I jaksossa vahvistettujen yksityiskohtaisten diagnostisten menetelmien ja menettelyjen mukaisesti.

Kun nilviäisten bonamioosin epäily on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavaa tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyä:

Diagnostisten menetelmien, joita käytetään taudista vapaan aseman saavuttamiseksi tai säilyttämiseksi nilviäisten bonamioosin osalta liitteessä II olevassa 5 osassa vahvistettujen yksityiskohtaisten diagnostisten menetelmien ja menettelyjen mukaisesti, on oltava histopatologinen tutkimus, kudosnäytteet tai PCR-menetelmä. Sovellettaessa näitä diagnostisia menetelmiä on noudatettava liitteessä II olevassa 5 osassa vahvistettuja vastaavia yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä.

nilviäisten bonamioosin esiintymistä ei ole vahvistettu a, b ja c alakohdassa tarkoitettujen toimenpiteiden loppuun saattamisen jälkeisten kahden vuoden aikana ja tämän ajanjakson aikana epäilyt on suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen menettelyjen mukaisesti.

istuttaminen on tehty vasta sen jälkeen, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset tai nilviäisten viljelyalueet on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti.

kaikkiin nilviäisten bonamioosin saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja nilviäisten viljelyalueille ja kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla tyhjinä pidettyihin tai a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteena olleisiin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille on istutettu nilviäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne nilviäisten bonamioosin osalta.

I.2.2 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, asianomaisiin viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen nilviäisten bonamioosin hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

kaikkiin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille, jotka on virallisesti julistettu tartunnan saastuttamiksi, ja kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla sijaitseviin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille, joita on pidetty tyhjillään, on istutettava nilviäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne nilviäisten bonamioosin osalta. Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2 kohdan c alakohdan mukaisesti;

Kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset tai nilviäisten viljelyalueet on tyhjennetty, niitä on pidettävä samanaikaisesti tyhjillään vähintään neljä viikkoa.

kaikki nilviäisten bonamioosin saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset ja nilviäisten viljelyalueet on tyhjennettävä, pidettävä tyhjillään ja, jos mahdollista, puhdistettava ja desinfioitava. Tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi kuukautta.

kaikissa viljelylaitoksissa ja nilviäisten viljelyalueilla, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja suoja-alueella ja joita ei ole virallisesti julistettu nilviäisten bonamioosin saastuttamiksi, on tehtävä virallinen tutkimus, joka käsittää vähintään näytteiden keruun 150:n taudille alttiiseen lajiin kuuluvan nilviäisen testaamiseksi nilviäisten bonamioosin tarttumisajan alkamisen jälkeen. Jos tarttumisaika ei ole tiedossa, näytteenotto on aloitettava talvella tai alkukeväästä;

suoja-alueen ulkopuolelle on perustettava seuranta-alue, jonka on vastattava suoja-aluetta ympäröivää, asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta määritettyä aluetta;

nilviäisten bonamioosin saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen tai nilviäisten viljelyalueen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta määritettyä aluetta;

direktiivin 2006/88/EY V luvussa olevassa 3 jaksossa vahvistettuja toimenpiteitä on sovellettu käytännössä ja nilviäisten bonamioosin saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten tai nilviäisten viljelyalueiden läheisyyteen on erityisesti perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne nilviäisten bonamioosin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa tai nilviäisten viljelyalueilla, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava hävittämisohjelma:

kun näytteeseen otetaan Ostrea edulis -simpukoita, jotka ovat peräisin jäsenvaltiosta, vyöhykkeeltä tai lokerosta, jossa on luokan I terveystilanne, ne on oltava tuotu kyseiseen viljelylaitokseen tai nilviäisten viljelyalueelle viimeistään välittömästi seurantaohjelman toteuttamisajankohtaa edeltävänä syksynä.

jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan III terveystilanne nilviäisten bonamioosin osalta, voi saavuttaa taas luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava seurantaohjelma, joka käsittää terveystarkastuksia ja näytteenoton testausta varten.

otettaessa näytteitä nilviäisten viljelyalueelta, näytteeseen on sisällytettävä nilviäisiä riittävästä määrästä näytteenottopisteitä. Tärkeimmät näiden näytteenottopaikkojen valinnassa huomioon otettavat tekijät ovat aiemmat näytteenottopaikat, joissa nilviäisten bonamioosia havaittiin, eläintiheys, vesien virtaukset, taudille alttiit lajit, tartunnanlevittäjälajit, veden syvyys ja hoitokäytännöt. Viljelyalueella tai sen vieressä sijaitsevat luonnolliset esiintymät on otettava mukaan näytteenottoon.

jos tuotantoyksikössä on heikkoja, kuori auki olevia tai äskettäin kuolleita mutta ei vielä hajoamistilassa olevia nilviäisiä, on valittava ensisijaisesti tällaisia nilviäisiä. Jos tällaisia nilviäisiä ei ole, valittujen nilviäisten joukossa on oltava vanhimpia terveitä nilviäisiä;

Jos tuotantoyksikössä on Ostrea edulis -lajia, vain tämän lajin ostereita kerätään näytteeseen. Jos Ostrea edulis -lajia ei ole, näytteen on edustettava kaikkia muita viljelyssä olevia taudille alttiita lajeja;

Terveystarkastukset ja tarvittaessa näytteenotto tuotantoyksiköistä on suoritettava sellaisena aikana vuodesta, jolloin nilviäisten bonamioosin esiintyvyyden kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa tiedetään olevan korkeimmillaan. Jos tätä tietoa ei ole saatavilla, näytteenotto on suoritettava talvella tai alkukeväästä.

Kun nilviäisten marteilioosin tartuntaepäily on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavaa tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyä:

nilviäisten marteilioosin esiintymistä ei ole vahvistettu a, b ja c alakohdassa tarkoitettujen toimenpiteiden loppuun saattamisen jälkeisten kahden vuoden aikana ja epäilyt on tämän ajanjakson aikana suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen menettelyjen mukaisesti.

istuttaminen on tehty vasta sen jälkeen, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset tai nilviäisten viljelyalueet on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti.

kaikkiin nilviäisten bonamioosin saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja nilviäisten viljelyalueille ja kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla tyhjinä pidettyihin tai a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteena olleisiin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille on istutettu nilviäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne nilviäisten marteilioosin osalta.

I.2.2 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, asianomaisiin viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen nilviäisten marteilioosin hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2 kohdan c alakohdan mukaisesti;

kaikkiin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille, jotka on virallisesti julistettu tartunnan saastuttamiksi, ja kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla sijaitseviin viljelylaitoksiin tai nilviäisten viljelyalueille, joita on pidetty tyhjillään, on istutettava nilviäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne nilviäisten marteilioosin osalta.

Kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset ja nilviäisten viljelyalueet on tyhjennetty, niitä on pidettävä samanaikaisesti tyhjillään vähintään neljä viikkoa.

neljätoista kuukautta, kun kyseessä ovat viljelylaitokset ja nilviäisten viljelyalueet, joilla on rajoittamattomat yhteydet ympäröiviin vesiin, jos taudille alttiiseen lajiin kuuluvia tartunnan saaneita nilviäisiä ja taudille alttiiseen lajiin kuuluvia nilviäisiä, joilla on epidemiologinen yhteys tartunnan saastuttamaan viljelylaitokseen tai nilviäisten viljelyalueeseen, ei ole kerätty tai poistettu ennen sellaista ajanjaksoa vuodesta, jona nilviäisten marteilioosin esiintymisen tiedetään olevan korkeimmillaan tai jos tätä tietoa ei ole, kun taudille alttiiseen lajiin kuuluvia nilviäisiä ei ole kerätty tai poistettu ennen ajanjaksoa, jona veden lämpötila ylittää 17 °C;

kaksi kuukautta, kun kyseessä ovat viljelylaitokset ja nilviäisten viljelyalueet, joilla on rajoittamattomat yhteydet ympäröiviin vesiin, jos taudille alttiiseen lajiin kuuluvat tartunnan saaneet nilviäiset ja taudille alttiiseen lajiin kuuluvat nilviäiset, joilla on epidemiologinen yhteys tartunnan saastuttamaan viljelylaitokseen tai nilviäisten viljelyalueeseen, on kerätty tai poistettu ennen sellaista ajanjaksoa vuodesta, jona nilviäisten marteilioosin esiintymisen tiedetään olevan korkeimmillaan, tai jos kyseinen ajanjakso ei ole tiedossa, ennen ajanjaksoa, jona veden lämpötila ylittää 17 °C;

kaikissa viljelylaitoksissa ja nilviäisten viljelyalueilla, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja suoja-alueella ja joita ei ole virallisesti julistettu nilviäisten marteilioosin saastuttamiksi, on tehtävä virallinen tutkimus, joka käsittää vähintään näytteiden keruun 150 nilviäisen testaamiseksi nilviäisten marteilioosin tarttumisajan alkamisen jälkeen. Jos tarttumisaika ei ole tiedossa, näytteenotto on aloitettava sen jälkeen, kun veden lämpötila ylittää 17 °C;

suoja-alueen ulkopuolelle on perustettava seuranta-alue, jonka on vastattava suoja-aluetta ympäröivää, asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta määritettyä aluetta;

nilviäisten marteilioosin saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen tai nilviäisten viljelyalueen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta määritettyä aluetta;

direktiivin 2006/88/EY V luvussa olevassa 3 jaksossa vahvistettuja toimenpiteitä on sovellettu käytännössä ja nilviäisten marteilioosin saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten tai nilviäisten viljelyalueiden läheisyyteen on erityisesti perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne nilviäisten marteilioosin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa tai nilviäisten viljelyalueilla, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava hävittämisohjelma:

kun näytteeseen sisällytetään Ostrea edulis-, Mytilus edulis- tai Mytilus galloprovincialis -nilviäisiä, jotka ovat peräisin jäsenvaltiosta, vyöhykkeeltä tai lokerosta, jossa on luokan I terveystilanne, ne on oltava tuotu kyseiseen viljelylaitokseen tai nilviäisten viljelyalueelle viimeistään välittömästi seurantaohjelman toteuttamisajankohtaa edeltävänä keväänä.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan III terveystilanne nilviäisten marteilioosin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa tai nilviäisten viljelyalueilla, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava seurantaohjelma, joka käsittää terveystarkastuksia ja näytteiden keräämisen testausta varten.

otettaessa näytteitä nilviäisten viljelyalueelta, näytteeseen on sisällytettävä nilviäisiä riittävästä määrästä näytteenottopisteitä niin, että kaikki nilviäisten viljelyalueen osat ovat suhteellisesti edustettuina näytteessä. Tärkeimmät näiden näytteenottopaikkojen valinnassa huomioon otettavat tekijät ovat aiemmat näytteenottopaikat, joissa nilviäisten marteilioosia havaittiin, eläintiheys, vesien virtaukset, taudille alttiit lajit, tartunnanlevittäjälajit, veden syvyys ja hoitokäytännöt. Luonnolliset esiintymät on otettava mukaan näytteenottoon.

jos tuotantoyksiköissä on heikkoja, kuori auki olevia tai äskettäin kuolleita mutta ei vielä hajoamistilassa olevia nilviäisiä, on valittava ensisijaisesti tällaisia nilviäisiä. Jos tällaisia nilviäisiä ei ole, valittujen nilviäisten joukossa on oltava vanhimpia terveitä nilviäisiä;

jos tuotantoyksiköissä tai tuotantoalueella on Ostrea spp.- ja Mytilus spp. -sukujen lajeja, näytteessä on oltava yhtä monta näytettä kummastakin suvusta. Jos laitoksessa on ainoastaan toisen suvun lajeja, kyseisestä suvusta on otettava näytteet. Jos laitoksessa ei ole Ostrea spp.- eikä Mytilus spp. -suvun lajeja, näytteen on edustettava kaikkia muita tuotantoyksiköissä tai tuotantoalueella olevia taudille alttiita lajeja;

Terveystarkastukset ja tarvittaessa näytteenotto laboratoriotutkimuksia varten on suoritettava sellaisena aikana vuodesta, jolloin loisen esiintyvyyden kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa tiedetään olevan korkeimmillaan. Jos tällaista tietoa ei ole saatavilla, näytteenotto on suoritettava heti sen jälkeen, kun veden lämpötila on ylittänyt 17 °C.

jos havaitaan ISA-taudinkuvaan sopivia kliinisiä, suuria patologisia muutoksia tai histopatologisia löydöksiä, löydökset on vahvistettava osoittamalla virus kahdella diagnostisella menetelmällä, joilla on erilaiset osoittamisperiaatteet, kuten RT-qPCR ja IHC, liitteessä II olevan 3 osan mukaisesti.

jos RT-qPCR antaa ISA-viruksen HPRΔ-kannan suhteen positiivisen tuloksen, ennen direktiivin 2006/88/EY 28 artiklassa säädettyjen ensivaiheen torjuntatoimenpiteiden täytäntöönpanoa on testattava lisää näytteitä. Epäilty ISA-tautitartunta on vahvistettava seuraavien kriteerien mukaisesti käyttämällä liitteessä II olevassa 3 osassa vahvistettuja yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä:

virallinen tutkimus, johon sisältyy vähintään yksi terveystarkastusta ja yksi 10:n kuolemaisillaan olevan kalan näytteenotto, kun havaitaan ISA-taudinkuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä. Jos ei havaita ISA-taudinkuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä, terveystarkastuksen jälkeen näytteet on kerättävä kohdennetusti vähintään 30:stä kuolemaisillaan olevasta kalasta tai tehtävä uudet post mortem -tarkastukset normaalikuntoisille kaloille I.1 kohdan mukaisesti. Näytteet on testattava b alakohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

Kun ISA-tautiepäily on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavaa tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyä:

ISA-viruksen HPRΔ-kannan esiintymistä ei ole vahvistettu a, b ja c alakohdassa tarkoitettujen toimenpiteiden loppuun saattamisen jälkeisten kahden vuoden aikana ja tämän ajanjakson aikaiset epäilyt on suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen menettelyjen mukaisesti.

tällainen istuttaminen on tehty vasta sen jälkeen, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti.

kaikkiin tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja kaikkiin muihin tyhjinä pidettyihin tai perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteina olleisiin viljelylaitoksiin on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne ISA-taudin osalta;

I.2.2.1 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen ISA-viruksen hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

Kun määritetään terveystarkastusten tiheys lokeroille, joissa on luokan I terveystilanne ISA-taudin osalta, jotka sijaitsevat mantereella sijaitsevilla alueilla ja joiden terveystilanne ISA-taudin osalta on riippuvainen sellaisten ympäröivien luonnonvesien terveystilanteesta, joissa pidetään merilohta (Salmo salar), ISA-tartunnan riskiä on pidettävä korkeana.

sinne on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne ISA-taudin osalta.

se on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa;

Mantereella sijaitseva lokero, joka käsittää yhden ainoan viljelylaitoksen, jossa on luokan I terveystilanne ISA-taudin osalta ja jonka terveystilanne ei riipu ympäröivistä luonnonvesistä direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 3 kohdan mukaisesti ja jonka luokan I terveystilanne on peruutettu kyseisen direktiivin 53 artiklan 3 kohdan mukaisesti, voi saada sen takaisin välittömästi sen jälkeen, kun toimivaltainen viranomainen on vahvistanut, että se täyttää seuraavat edellytykset:

Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu ja desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

kaikkiin HPRΔ-ISA-virustartunnan tai vahvistetun ISA-taudin saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla sijaitseviin viljelylaitoksiin, joita on pidetty tyhjillään, on istutettava kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne ISA-taudin osalta.

kaikki HPRΔ-ISA-virustartunnan tai vahvistetun ISA-taudin saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennettävä, puhdistettava, desinfioitava ja pidettävä tyhjillään vähintään kolme kuukautta. Suoja- ja seuranta-alueet voidaan lopettaa, kun kaikki suoja-alueella sijaitsevat viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu ja desinfioitu ja niitä on pidetty samanaikaisesti tyhjillään vähintään kuuden viikon ajan.

yksi terveystarkastus; viljelylaitoksissa, joissa i alakohdassa tarkoitettujen testien tulos on ollut negatiivinen, terveystarkastusten tekemistä on jatkettava kerran kuukaudessa, kunnes suoja-alue peruutetaan I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

suoja-alueen ulkopuolelle on perustettava seuranta-alue, jonka on vastattava:

rannikkoalueilla: säteeltään yhden vuorovesikantaman tai vähintään 5 kilometrin mittaisen ympyrän sisään jäävää aluetta – sen mukaan, kumpi on suurempi –, jonka keskipisteenä on ISA-tartunnan saastuttamaksi virallisesti julistettu viljelylaitos, taikka tätä vastaavaa aluetta, joka on määritetty asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta;

ISA-taudin saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava:

direktiivin 2006/88/EY V luvussa olevassa 3 jaksossa vahvistettuja vähimmäistorjuntatoimenpiteitä on sovellettu käytännössä ja HPRΔ-ISA-virustartunnan tai vahvistetun ISA-taudin saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten läheisyyteen on erityisesti perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne ISA-taudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu seuraavien a–e kohtien mukainen hävittämisohjelma:

jos seurantaohjelman täytäntöönpanon aikana kyseiseen seurantaohjelmaan kuuluvassa viljelylaitoksessa vahvistetaan ISA-tartunta ja sen vuoksi viljelylaitoksen luokan II terveystilanne on peruutettu, I.2.2 kohdan mukainen hävittämisohjelma on oltava toteutettu.

kyseisen kahden vuoden pituisen ajanjakson aikana II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä suoritettujen kaikille näytteille tehtyjen kokeiden tulosten on oltava ollut negatiivisia HPRΔ-ISA-viruskannan suhteen ja kaikki ISA-tautiepäilyt on oltava suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on direktiivin 2006/88/EY liitteessä III olevassa B osassa tarkoitettu luokan III terveystilanne ISA-taudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikki viljelylaitokset, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, noudattavat kyseisen direktiivin liitteessä V vahvistettuja asiaa koskevia vaatimuksia ja kaikissa kyseisissä viljelylaitoksissa ja, kun sen liitteessä V olevassa I osassa olevan 2 kohdan toisessa kohdassa niin vaaditaan, kyseisen osan mukaisesti valituissa luonnonvaraisten populaatioiden näytteenottopaikoissa on toteutettu seuraava seurantaohjelma:

jos merilohi on yksi taudille alttiista lajeista laitoksessa, näytteet merilohesta ovat ensisijaisia. Jos kalanviljelylaitoksessa ei ole merilohia, on otettava näytteet muista taudille alttiista lajeista;

on valittava ainoastaan kuolemaisillaan olevia tai äskettäin kuolleita mutta ei vielä hajoamistilassa olevia kaloja; ensisijaisesti on valittava kaloja, joissa on merkkejä anemiasta, verenvuotoa tai muita verenkiertohäiriöihin viittaavia kliinisiä merkkejä;

Kaikille tuotantoyksiköille, kuten lammikoille, altaille ja verkkoaltaille, on tehtävä terveystarkastus kuolleiden, heikkojen tai poikkeavasti käyttäytyvien kalojen havaitsemiseksi. Erityistä huomiota on kiinnitettävä poistovesipisteeseen, jonne heikoilla kaloilla on taipumus kerääntyä veden virtauksen vuoksi.

Kun luonnonvaraisten populaatioiden kohdennettua seurantaa edellytetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan I osan 2 kohdan toisen kohdan mukaisesti, näytteenottokohtien lukumäärä ja maantieteellinen jakauma on määritettävä siten, että kattavuus on kohtuullinen jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa. Näytteenottopaikkojen on myös edustettava erilaisia ekosysteemejä, joissa on taudille alttiita luonnonvaraisia populaatioita.

viralliseen tutkimukseen on kuuluttava vähintään yksi terveystarkastus ja yksi 10 kalan näytteenotto, kun havaitaan KHV-taudinkuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä, tai vähintään 30 kalan, kun ei havaita kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä. Näytteet on testattava käyttämällä b alakohdassa vahvistettua diagnostista menetelmää liitteessä II olevan 2 osan II kohdassa vahvistettujen yksityiskohtaisten diagnostisten menetelmien ja menettelyjen mukaisesti;

Kun KHV-tautiepäily on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavaa tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyä:

istuttaminen on tehty vasta, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti.

kaikkiin tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja kaikkiin muihin tyhjinä pidettyihin tai perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteina olleisiin viljelylaitoksiin on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne KHV-taudin osalta;

I.2.2.1 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, asianomaisiin viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen KH-viruksen hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

Kyseisten näytteenottopaikat on tarkastettava kiertävällä otannalla siten, että näytteet otetaan vuosittain 50 prosentissa näytteenottopaikkoja. Näytteenotto on suoritettava III jaksossa olevan taulukon 2.C mukaisesti. Näytteet on valittava, valmistettava ja tutkittava II jaksossa kuvatulla tavalla, ja laboratoriotutkimusten tulosten on oltava negatiivisia KHV-taudinaiheuttajan esiintymisen suhteen.

Jäsenvaltioissa, vyöhykkeillä tai lokeroissa, joissa viljelylaitosten lukumäärä on rajoitettu eikä näiden viljelylaitosten kohdennettu seuranta tuota riittävästi epidemiologisia tietoja, taudista vapaan aseman säilyttämistä koskeviin seurantaohjelmiin on sisällyttävä I.1 kohdassa vahvistettujen vaatimusten mukaisesti valitut näytteenottopaikat.

Sellaisten luokan I lokerojen terveystarkastusten tarkastustiheyden, jotka sijaitsevat mantereella sijaitsevilla alueilla ja käsittävät yhden tai useampia viljelylaitoksia, joiden terveystilanne KHV-taudin osalta on riippuvainen kyseisen luetellun taudin terveystilanteesta ympäröivissä luonnonvesissä direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 2 kohdan mukaisesti, on oltava kyseisessä taulukossa 2.C korkealle riskitasolle asetetun lukumäärän mukainen.

laitokseen on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne KHV-taudin osalta, tai lokeroista, joissa on hyväksytty KHV-taudin seurantaohjelma (luokan II terveystilanne).

se on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitäminen on kestänyt vähintään kuusi viikkoa;

Mantereella sijaitseva lokero, joka käsittää yhden ainoan viljelylaitoksen, jossa on luokan I terveystilanne KVH-taudin osalta ja jonka terveystilanne KHV-taudin osalta ei riipu ympäröivistä luonnonvesistä direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 3 kohdan mukaisesti ja jonka luokan I terveystilanne on peruutettu kyseisen direktiivin 53 artiklan 3 kohdan mukaisesti, voi saada takaisin luokan I terveystilanteen välittömästi sen jälkeen, kun toimivaltainen viranomainen on vahvistanut, että se täyttää seuraavat edellytykset:

Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki KHV-tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu ja desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

kaikki KHV-tartunnan saastuttamaksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennettävä, puhdistettava, desinfioitava ja pidettävä tyhjillään. Tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa. Kun kaikki samalla suoja-alueella sijaitsevat tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, niitä on pidettävä samanaikaisesti tyhjillään vähintään kolme viikkoa. Tätä kohtaa sovelletaan myös uusiin viljelylaitoksiin, jotka julistetaan virallisesti tartunnan saastuttamiksi hävittämisohjelman täytäntöönpanon aikana.

yksi terveystarkastus; viljelylaitoksissa, joissa on saatu negatiiviset tulokset III.2 kohdassa tarkoitetuissa testeissä, terveystarkastusten tekemistä on jatkettava kerran kuukaudessa sinä aikana, jolloin veden lämpötila on todennäköisesti > 15 °C, kunnes suoja-alue peruutetaan I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

suoja-alueen ulkopuolelle on perustettava seuranta-alue, jonka on vastattava perustettua suoja-aluetta ympäröivää laajennettua aluetta;

KHV-tartunnan saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava KHV-tartunnan saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen koko vesistöaluetta; toimivaltainen viranomainen voi rajoittaa alueen koskemaan vain osia vesistöalueesta edellyttäen, että KHV-tartunnan leviämisen ehkäisy ei vaarannu;

direktiivin 2006/88/EY V luvussa olevassa 4 jaksossa vahvistettuja vähimmäistorjuntatoimenpiteitä on sovellettu käytännössä ja KHV-tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten läheisyyteen on perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne KHV-taudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisen luetellun taudin osalta, kun kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu vähintään seuraava hävittämisohjelma:

sinne on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne KHV-taudin osalta.

se on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa;

Kyseisen neljän vuoden pituisen ajanjakson aikana II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä suoritettujen kaikille näytteille tehtyjen kokeiden tulosten on oltava ollut negatiivisia KHV-taudin suhteen ja kaikki KHV-tautiepäilyt on oltava suljettu pois III.2 kohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

Kyseisen kahden vuoden pituisen ajanjakson aikana II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä suoritettujen kaikille näytteille tehtyjen kokeiden tulosten on oltava ollut negatiivisia KHV-taudin suhteen ja kaikki KHV-tautiepäilyt on oltava suljettu pois III.2 kohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan III terveystilanne KHV-taudin osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen, kun kaikki viljelylaitokset, joissa pidetään kyseisen direktiivin liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, noudattavat kyseisen direktiivin liitteessä V vahvistettuja vaatimuksia ja kaikissa kyseisissä viljelylaitoksissa ja, jos kyseisen liitteen I osassa olevan 2 kohdan toisessa alakohdassa niin vaaditaan, kyseisen osan mukaisesti valituissa luonnonvaraisten populaatioiden näytteenottopaikoissa on toteutettu jokin seuraavista seurantaohjelmista:

jos joukossa on heikkokuntoisia, poikkeavasti käyttäytyviä tai äskettäin kuolleita mutta ei vielä hajoamistilassa olevia kaloja, on ensisijaisesti valittava tällaisia kaloja;

Cyprinus carpio -lajia ja sen hybridejä, kuten Cyprinus carpio × Carassius auratus, on kerättävä kun niitä on viljelylaitoksessa.

Kun viljelylaitoksissa tai luonnonvaraisille populaatioille on tehtävä terveystarkastuksia tai näytteenottoja useammin kuin kerran vuodessa, terveystarkastusten tai näytteiden keruiden välisen ajan on oltava mahdollisimman pitkä sen kauden aikana vuodesta, jolloin veden lämpötila on todennäköisesti korkeimmillaan ylittämättä kuitenkaan 28 °C.

Aina kun mahdollista on otettava näytteet kaloista, joita on pidetty pitkään virukselle otollisessa lämpötilassa, eli kaksi–kolme viikkoa 15–26 °C:n lämpötilassa. Seuraava menettelytapa voidaan kuitenkin hyväksyä:

Kohdennetun seurannan on perustuttava taudille alttiita lajeja käsittävien kohteiden säännölliseen seurantaan. Kohteita on seurattava, kun veden lämpötila saavuttaa tason, joka on otollinen taudin kehittymiselle (> 15 °C), ja aikaisintaan kaksi viikkoa siitä, kun kyseinen lämpötila on saavutettu. Kaikista kohteesta löydetyistä sairaista tai poikkeavasti käyttäytyvistä kaloista on otettava näytteet ja ne on testattava.

Kun luonnonvaraisten populaatioiden kohdennettua seurantaa edellytetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan I osan 2 kohdan toisen kohdan mukaisesti, näytteenottokohtien lukumäärä ja maantieteellinen jakauma on määritettävä siten, että kattavuus on kohtuullinen jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa. Näytteenottopaikkojen on myös edustettava erilaisia ekosysteemejä, kuten jokia ja järviä, joissa on taudille alttiita luonnonvaraisia populaatioita.

epäilyksenalaisessa viljelylaitoksessa on tehtävä vähintään yksi terveystarkastus ja yksi 10 kalan näytteenotto, kun havaitaan joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien taudinkuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä, tai vähintään 30 kalan, kun ei havaita kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä. Näytteet on testattava käyttämällä yhtä tai useampaa i ja ii alakohdassa vahvistettua diagnostista menetelmää liitteessä II olevan 1 osan II jaksossa vahvistettujen yksityiskohtaisten diagnostisten menetelmien ja menettelyjen mukaisesti:

Kun joko VHS- tai IHN-tautiepäily tai molemmat on vahvistettava tai suljettava pois direktiivin 2006/88/EY 28 artiklan mukaisesti, on noudatettava seuraavia tarkastus-, näytteenotto- ja testausmenettelyjä:

Jos näyte koostuu pikkukaloista, kokonaiset kalat, joiden pituus on alle 4 cm, voidaan leikata steriileillä saksilla tai skalpellilla pieniksi palasiksi sen jälkeen, kun suolen aukon takana oleva osa ruumiista on poistettu. Jos näyte koostuu kokonaisista 4–6 cm:n pituisista kaloista, on otettava talteen sisälmykset, munuaiset mukaan lukien.

istuttaminen on tehty vasta sen jälkeen, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään tai niihin on sovellettu vaihtoehtoisia toimenpiteitä a alakohdan mukaisesti.

kaikkiin tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistettuihin viljelylaitoksiin ja kaikkiin muihin tyhjinä pidettyihin tai perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla a alakohdan mukaisesti vaihtoehtoisten toimenpiteiden kohteina olleisiin viljelylaitoksiin on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I, II tai III terveystilanne joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta;

I.2.2.1 kohdan a, b ja c alakohdassa vahvistetut vaatimukset täyttyvät. Jos tyhjillään pitäminen ei ole teknisesti mahdollista, asianomaisiin viljelylaitoksiin on sovellettava vaihtoehtoista toimenpidettä, joka antaa lähes vastaavan takeen joko VHS- tai IHN-viruksen tai molempien hävittämisestä viljelylaitoksen alueelta;

Kun määritetään terveystarkastusten tiheys lokeroille, joissa on luokan I terveystilanne joko VHS- tai IHN-taudin osalta ja jotka sijaitsevat mantereella sijaitsevilla alueilla ja joiden terveystilanne VHS- tai IHN-taudin osalta on riippuvainen ympäröivien luonnonvesien vesieläinpopulaatioiden terveystilanteesta, direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 2 kohdan mukaisesti, joko VHS- tai IHN-tartunnan tai molempien riskiä on pidettävä korkeana.

Kun luokan I terveystilanteen säilyttämiseksi edellytetään kohdennettua seurantaa direktiivin 2006/88/EY 52 artiklan mukaisesti, kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään kyseisen direktiivin liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja asianomaisessa jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on tehtävä terveystarkastus ja kaloista on otettava näytteet tämän osan II jaksossa olevan taulukon 1.C mukaisesti ottaen huomioon joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien kyseisten lueteltujen tautien tartuntariskin taso viljelylaitoksessa.

joko VHS- tai IHN-tartunnan tai molempien saastuttamaksi virallisesti vahvistettuun viljelylaitokseen on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta.

joko VHS- tai IHN-tartunnan tai molempien saastuttamaksi virallisesti vahvistettu viljelylaitos on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa;

Mantereella sijaitseva lokero, joka käsittää yhden ainoan joko VHS- tai IHN-taudista tai molemmista kyseisistä luetelluista taudeista aiemmin vapaaksi julistetun viljelylaitoksen, jonka terveystilanne kyseisten lueteltujen tautien osalta ei riipu ympäröivistä luonnonvesistä direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan II osan 3 kohdan mukaisesti ja jonka luokan I terveystilanne on peruutettu kyseisen direktiivin 53 artiklan 3 kohdan mukaisesti, voi saada luokan I terveystilanteen takaisin välittömästi sen jälkeen, kun toimivaltainen viranomainen on vahvistanut, että seuraavat edellytykset täyttyvät:

Istuttaminen on tehtävä vasta, kun kaikki tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, puhdistettu ja desinfioitu ja pidetty tyhjillään I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

kaikkiin joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien kyseisten lueteltujen tautien virallisesti saastuttamiksi julistettuihin viljelylaitoksiin ja c alakohdassa tarkoitettuihin kaikkiin muihin perustetuilla suoja- ja seuranta-alueilla tyhjinä pidettyihin viljelylaitoksiin on istutettava kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joiden terveystilanne on taudista vapaa (luokka I) joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta.

kaikki joko VHS- tai IHN-tartunnan tai molempien saastuttamaksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennettävä, puhdistettava, desinfioitava ja pidettävä tyhjillään. Tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa. Kun kaikki samalla suoja-alueella sijaitsevat tartunnan saastuttamiksi virallisesti julistetut viljelylaitokset on tyhjennetty, niitä on pidettävä samanaikaisesti tyhjillään vähintään kolme viikkoa. Tätä kohtaa sovelletaan myös uusiin viljelylaitoksiin, jotka julistetaan virallisesti tartunnan saastuttamiksi hävittämisohjelman täytäntöönpanon aikana.

yksi terveystarkastus: viljelylaitoksissa, joissa on saatu negatiiviset tulokset i alakohdassa tarkoitetuissa testeissä, terveystarkastusten tekemistä on jatkettava kerran kuukaudessa sinä aikana, jolloin veden lämpötila on alle 14 °C, paitsi silloin, kun kalalammikot tai verkkoaltaat ovat jään peitossa, kunnes suoja-alue peruutetaan I.2.2.1 kohdan c alakohdan mukaisesti;

toimivaltaisen viranomaisen on perustettava suoja-alueen ulkopuolelle seuranta-alue, jonka on vastattava:

rannikkoalueilla: säteeltään yhden vuorovesikantaman tai vähintään viiden kilometrin mittaisen ympyrän sisään jäävää aluetta, jonka keskipisteenä on joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien saastuttamaksi virallisesti julistettu viljelylaitos, taikka tätä vastaavaa aluetta, joka on määritetty asianmukaisten hydrodynaamisten tai epidemiologisten tietojen pohjalta;

joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien kyseisten lueteltujen tautien saastuttamaksi virallisesti julistetun viljelylaitoksen välittömään läheisyyteen on perustettava suoja-alue, jonka on vastattava:

direktiivin 2006/88/EY V luvun 4 jaksossa säädettyjä vähimmäistorjuntatoimenpiteitä on oltava sovellettu käytännössä ja joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien kyseisten lueteltujen tautien saastuttamiksi virallisesti julistettujen viljelylaitosten läheisyyteen on oltava perustettu kyseisen direktiivin 32 artiklan b alakohdassa tarkoitettu rajoitusalue, johon kuuluu suoja-alue ja seuranta-alue.

Jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisten lueteltujen tautien osalta edellyttäen, että kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, on toteutettu a–e alakohdan mukainen hävittämisohjelma:

sinne on istutettu kaloja, jotka ovat peräisin jäsenvaltioista, vyöhykkeiltä tai lokeroista, joissa on luokan I terveystilanne joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta.

se on tyhjennetty, puhdistettu, desinfioitu ja pidetty tyhjillään; tyhjillään pitämisen keston on oltava vähintään kuusi viikkoa;

Kyseisen neljän vuoden pituisen ajanjakson aikana II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä suoritettujen kaikille näytteille tehtyjen kokeiden tulosten on oltava ollut negatiivisia joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien suhteen ja kaikki VHS- tai IHN-taudin tai molempien epäilyt on oltava suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

Kyseisen kahden vuoden pituisen ajanjakson aikana II.2 kohdassa vahvistetuilla diagnostisilla menetelmillä suoritettujen kaikille näytteille tehtyjen kokeiden tulosten on oltava ollut negatiivisia joko VHS- tai IHN-taudin tai molempien suhteen ja kaikki VHS- tai IHN-taudin tai molempien epäilyt on oltava suljettu pois II.3 kohdassa vahvistettujen diagnostisten menetelmien mukaisesti;

jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on direktiivin 2006/88/EY liitteessä III olevassa B osassa tarkoitettu luokan III terveystilanne VHS- tai IHN-taudin tai molempien osalta, voi saavuttaa luokan I terveystilanteen kyseisten lueteltujen tautien osalta edellyttäen, että kaikissa viljelylaitoksissa, joissa pidetään kyseisen direktiivin liitteessä IV olevassa II osassa lueteltuja taudeille alttiita lajeja kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa, noudattavat kyseisen direktiivin liitteessä V vahvistettuja vaatimuksia ja kaikissa kyseisissä viljelylaitoksissa ja, kun sen liitteessä V olevassa I osassa olevan 2 kohdan toisessa kohdassa niin vaaditaan, kyseisen osan mukaisesti valituissa luonnonvaraisten populaatioiden näytteenottopaikoissa on toteutettu jokin seuraavista seurantaohjelmista:

jos joukossa on heikkokuntoisia, poikkeavasti käyttäytyviä tai äskettäin kuolleita mutta ei vielä hajoamistilassa olevia kaloja, on ensisijaisesti valittava tällaisia kaloja; jos kalantuotannossa käytetään useampaa kuin yhtä vedensaantilähdettä, näytteessä on oltava kaikkia vedensaantilähteitä edustavia kaloja;

jos laitoksessa on kirjolohia, vain tämän lajin kaloja kerätään näytteenottoon, paitsi jos laitoksessa on muita taudille alttiita lajeja, joissa näkyy tyypillisiä VHS- tai IHN-taudin oireita; jos laitoksessa ei ole kirjolohia, näytteen on edustettava kaikkia muita taudille alttiita lajeja, joita laitoksessa on;

kaikille tuotantoyksiköille, kuten lammikoille, altaille ja verkkoaltaille, on tehtävä terveystarkastus kuolleiden, heikkojen tai poikkeavasti käyttäytyvien kalojen havaitsemiseksi. Erityistä huomiota on kiinnitettävä poistovesipisteeseen, jonne heikoilla kaloilla on taipumus kerääntyä veden virtauksen vuoksi;

kun luonnonvaraisten populaatioiden kohdennettua seurantaa edellytetään direktiivin 2006/88/EY liitteessä V olevan I osan 2 kohdan toisen kohdan mukaisesti, näytteenottokohtien lukumäärä ja maantieteellinen jakauma on määritettävä siten, että kattavuus on kohtuullinen kyseisessä jäsenvaltiossa, vyöhykkeellä tai lokerossa. Näytteenottopaikkojen on edustettava erilaisia ekosysteemejä, joissa taudille alttiit luonnonvaraiset populaatiot sijaitsevat;

terveystarkastukset ja tarvittaessa näytteenotto on suoritettava sellaiseen aikaan vuodesta, jolloin veden lämpötila on alle 14 °C tai todennäköisesti alhaisimmillaan;

direktiivin 2006/88/EY 39 artiklassa säädetyt rajoittavat toimenpiteet, jotka on toteutettava, kun luetellun taudin esiintyminen on vahvistettu, ja toimenpiteet, jotka on toteutettava, kun jäsenvaltio, vyöhyke tai lokero, jossa on luokan V terveystilanne, haluaa saavuttaa luokan III terveystilanteen.

LIITE II

YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT

I Johdanto

Tässä liitteessä vahvistetaan yksityiskohtaiset menettelyt, jotka koskevat diagnostisia menetelmiä, joita käytetään tämän päätöksen liitteessä I vahvistettuihin hävittämis- ja seurantaohjelmiin kuuluvassa laboratoriotutkimuksessa ja direktiivin 2006/88/EY liitteessä IV olevan II osan luetteloon sisältyvien seuraavien muiden kuin eksoottisten tautien, jäljempänä ’luetellut taudit’, epäillyn esiintymisen vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi kyseisen direktiivin 57 artiklan b alakohdan mukaisesti.

1. Virusperäinen verenvuotoseptikemia (VHS-tauti) 1 osa 2. Tarttuva vertamuodostavan kudoksen kuolio (IHN) 1 osa 3. Koikarpin herpesvirus (KHV-tauti) 2 osa 4. Tarttuva lohen anemia (ISA-tauti) 3 osa 5. Nilviäisten marteilioosi (Marteilia refringens -loisen aiheuttama tartunta) 4 osa 6. Nilviäisten bonamioosi (Bonamia ostreae -loisen aiheuttama tartunta) 5 osa 7. Äyriäisten valkopilkkutauti 6 osa

II Määritelmät

Tässä liitteessä ’kuljetuselatusaineella’ tarkoitetaan soluviljelyelatusainetta, jossa on 10 % vasikan seerumia ja 200 ky penisilliiniä, 200 μg streptomysiiniä ja 200 μg kanamysiiniä millilitrassa tai muita teholtaan tutkittuja antibiootteja.

1 OSA

YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT IHN- JA VHS-TAUTIEN SEURANTAA JA NIIDEN ESIINTYMISEN VAHVISTAMISTA VARTEN

I Diagnostiset menetelmät ja menettelyt IHN- ja VHS-tautien seurantaa varten

Kun suoritetaan näytteenotto ja laboratoriotutkimuksia, joiden tarkoituksena on saavuttaa tai säilyttää taudista vapaa asema IHN- tai VHS-taudin osalta liitteessä I olevan 1 osan I jakson mukaisesti ja joissa käytetään kyseisen liitteen 1 osan II.1 ja II.2 kohdassa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava seuraavissa I.1–I.6 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä.

I.1 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu ja lähettäminen

I.1.1 Kudokset virologista tutkimusta varten soluviljelmissä

Ennen lähettämistä tai laboratorioon siirtämistä tutkittavat elinten kappaleet on irrotettavaan kalasta steriilien dissektiovälineiden avulla ja asetettava kuljetuselatusainetta sisältäviin steriileihin muoviputkiin.

Soluviljelyssä ja RT-qPCR-menetelmällä tehtävään virologiseen tutkimukseen soveltuva kala-aineksen määrä riippuu kalan koosta. Näin ollen kokonainen ruskuaispussipoikanen (ruumiin pituus < 4 cm), sisälmykset munuaiset mukaan lukien (4 < ruumiin pituus < 6 cm) tai suuremmista kaloista munuaiset, perna, sydän ja/tai aivot ja emokalojen ovariaalineste kutuhetkellä ovat kudoksia, joista on otettava näyte.

Enintään 10 kalan ovariaali- tai siemennestettä tai elinten kappaleita voidaan kerätä yhteisnäytteeksi yhteen steriiliin muoviputkeen, joka sisältää vähintään 4 ml kuljetuselatusainetta. Kudoksen painon on oltava vähintään 0,5 grammaa (g) kussakin näytteessä.

Virologinen tutkimus soluviljelmissä on aloitettava mahdollisimman pian ja viimeistään 48 tuntia näytteiden keruusta. Poikkeustapauksissa virologinen tutkimus voidaan aloittaa viimeistään 72 tuntia aineksen keruusta, edellyttäen, että tutkittava aines on suojattu kuljetuselatusaineella ja että kuljetuksen aikana noudatetaan lämpötilavaatimuksia.

I.1.2 Näytteet käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktioanalyysia varten (RT-PCR tai RT-qPCR)

Näytteet on otettava kaloista I.1.1 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti käyttämällä steriiliä välinettä ja siirrettävä kuljetuselatusainetta sisältävään steriiliin muoviputkeen. Yhteen putkeen voidaan kerätä yhteisnäytteeksi 10 kalan kudosta. Jos inokulaatin määrä on pieni, voidaan kuitenkin käyttää enintään viidestä kalasta saatua kudosta. Vaihtoehtoisesti näytteet voidaan yhdistää RNA-stabilointireagensseihin, kuten reagenssiin, jossa on 0,2 g kudosta/ml, valmistajan suosituksen mukaisesti, vaikka jokainen kala on käsiteltävä erikseen eikä niitä saa yhdistää näytteissä eristämiseen käytettävän aineksen vähäisen määrän vuoksi.

Myös kokonaisia kaloja voi lähettää laboratorioon.

I.2 Kaloista otettujen näytteiden lähettäminen

Putket, jotka sisältävät kuljetuselatusaineessa olevia kalakudoksia soluviljelyä tai RT-PCR/RT-qPCR-analyysiä varten, on asetettava eristettyihin säiliöihin, esim. paksuseinäisiin polystyreenilaatikoihin, joihin lisätään riittävä määrä jäätä tai vaihtoehtoista jäähdytysainetta, jolla on samanlainen jäähdyttävä vaikutus, näytteiden jäähdytyksen varmistamiseksi laboratorioon kuljettamisen aikana. Näytteiden jäätymistä on kuitenkin vältettävä. Näytteen lämpötila kuljetuksen aikana ei saa koskaan ylittää 10 °C:ta, ja kuljetuslaatikossa on oltava jäätä vielä vastaanottopaikassa tai yhden tai useamman kylmävaraajan on vielä oltava osittain tai kokonaan jäätynyt.

Kokonaisia kaloja voidaan lähettää laboratorioon, jos ensimmäisessä kohdassa tarkoitetut lämpötilavaatimukset voidaan täyttää kuljetuksen aikana. Kokonaiset kalat on käärittävä imukykyiseen paperiin, ja ne on lopuksi lähetettävä muovipussissa. Myös eläviä kaloja voi lähettää.

I.3 Diagnostisen lisäaineiston kerääminen

Diagnostisen laboratorion luvalla myös muita kalojen kudoksia voidaan kerätä ja valmistella lisätutkimuksia varten.

I.4 Näytteiden valmistelu soluviljelytutkimusta ja RT-qPCR-menetelmää varten

I.4.1 Jäädyttäminen poikkeustapauksissa

Jos näytteitä on käytännön ongelmien vuoksi mahdotonta käsitellä 48 tunnin kuluessa kalojen kudosaineksen keräämisestä, kudosnäytteet voidaan jäädyttää kuljetuselatusaineessa – 20 °C:seen ja suorittaa virologinen tutkimus 14 päivän kuluessa. Kalakudoksen saa kuitenkin jäädyttää ja sulattaa vain kerran ennen tutkimusta. Jokaisen kalakudosnäytteen jäädyttämisen syistä on pidettävä kirjaa.

I.4.2 Elinten homogenointi

Putkissa olevat kalakudokset on homogenoitava täydellisesti laboratoriossa joko stomacher-homogenisaattorin, sekoittimen tai huhmaren ja steriiliä hiekkaa sisältävän morttelin avulla ja sen jälkeen suspendoitava alkuperäiseen kuljetuselatusaineeseen.

Jos näyte koostuu alle 4 cm pitkästä kokonaisesta kalasta, se on leikattava steriileillä saksilla tai skalpellilla pieniksi palasiksi sen jälkeen, kun suolen aukon takana oleva osa ruumiista on poistettu. Jos näyte koostuu 4–6 cm pitkästä kokonaisesta kalasta, on kerättävä sisälmykset, munuaiset mukaan lukien. Jos näyte koostuu yli 6 cm pitkästä kokonaisesta kalasta, kudosnäytteet on kerättävä I.1 kohdan mukaisesti. Kudosnäytteet on leikattava steriileillä saksilla tai skalpellilla pieniksi palasiksi tämän kohdan ensimmäisessä kohdassa kuvatun mukaisesti ja suspendoitava kuljetuselatusaineeseen.

Kudosaineen ja kuljetuselatusaineen lopullinen suhde on säädettävä laboratoriossa suhteeseen 1:10.

I.4.3 Homogenaatin sentrifugointi

Homogenaatti on sentrifugoitava jäähdyttävässä sentrifugissa 2–5 °C:ssa kierrosnopeudella 2 000–4 000 × g 15 minuutin ajan, ja supernatantti on kerättävä talteen, ja sitä voidaan käsitellä joko neljä tuntia 15 °C:ssa tai yön yli 4–8 °C:ssa antibiooteilla. Jos näyte on lähetetty elatusaineessa, supernatantin käsittely antibiooteilla voidaan jättää pois.

Jos esiintyy käytännön ongelmia (esimerkiksi inkubaattori menee rikki tai soluviljelyn kanssa on ongelmia), joiden takia on mahdotonta inokuloida soluja 48 tunnin kuluessa kalojen kudosaineksen keräämisestä, supernatantti voidaan jäädyttää – 80 °C:seen ja virologinen tutkimus voidaan suorittaa 14 päivän kuluessa.

Jos talteen kerätty supernatantti varastoidaan – 80 °C:seen 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, se voidaan käyttää uudelleen vain kerran virologista tutkimusta varten.

Ennen inokulaatiota soluihin supernatantti on sekoitettava tilavuudeltaan yhtä suureen määrään tarpeen mukaan laimennettua antiseerumiseosta, joka koostuu kotoperäisinä esiintyvien kalojen tarttuvan haimakuoliotaudin (IPN) virusserotyyppien vasta-aineista, ja inkuboitava tällaisena vähintään tunti 15 °C:ssa tai enintään 18 tuntia 4 °C:ssa. Antiseerumin titterin on oltava vähintään 1/2 000 50-prosenttisessa plakkineutralisaatiokokeessa.

Käsittelemällä kaikki inokulaatit IPN-viruksen antiseerumilla pyritään estämään IPN-viruksen aiheuttaman sytopaattisen vaikutuksen (CPE) kehittyminen inokuloiduissa soluviljelmissä. Tämä lyhentää virologisten tutkimusten kestoa sekä vähentää sellaisten tapausten lukumäärää, joissa sytopaattisen vaikutuksen ilmeneminen olisi katsottava VHS- tai IHN-viruksen mahdolliseksi indikaatioksi.

Jos näytteet ovat lähtöisin IPN-vapaiksi katsotuista tuotantoyksiköistä, inokulaatteja ei tarvitse käsitellä IPN-viruksen antiseerumilla.

I.4.4 Näytteiden valmistaminen RT-PCR- ja RT-qPCR -menetelmiin perustuvia seurantaohjelmia varten

Jos näytteet on kerätty kuljetuselatusaineeseen, on suoritettava I.4.2 ja I.4.3 kohdassa vahvistettu menettely. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti on kerättävä ja RNA uutettava. Jos heti sentrifugoinnin jälkeen ei ole tarkoitus suorittaa jatkotutkimuksia, näytteet on välittömästi jäädytettävä enintään – 20 °C:n lämpötilassa.

RNA-stabilointireagenssissa säilytettyjen kalakudosten analyysia varten jatkotoimet eri lämpötiloissa varastoiduille näytteille on suoritettava seuraavissa määräajoissa:

37 °C:ssa säilytetyt näytteet: yksi päivä;

25 °C:ssa säilytetyt näytteet: yksi viikko;

4 °C:ssa säilytetyt näytteet: yksi kuukausi;

– 20 °C:ssa säilytetyt näytteet: rajoittamaton

RNA-stabilointireagenssiin yhdistetyt yhteisnäytteet on käsiteltävä kuten RNA-stabilointireagenssissa olevat yksittäiset näytteet. RNA-stabilointireagenssiin yhdistettyjen näytteiden osalta näytteen määrä ei saa ylittää määrää, jota valmistaja suosittelee eristämiseen RNA-kitin avulla, kuten RNeasy Mini kits (Qiagen) tai vastaava. Jos suurempia näytteitä yhdistetään yhteisnäytteeksi, eristämiskiteissä tai -menetelmissä on otettava yhdistäminen huomioon.

RNA-stabilointireagensseihin kerättyjä näytteitä ei saa käyttää soluviljelyyn.

I.4.5 Näytteiden yhdistäminen RT-qPCR-menetelmää varten

Koska annetut RT-qPCR-protokollat ovat yhtä herkkiä tai herkempiä kuin soluviljelymenetelmät, PCR-menetelmää varten voi olla hyväksyttävää käyttää enintään 10 kalan yhdistettyjen elinten homogenoidusta kalakudosaineesta saatua supernatanttia soluviljelyelatusaineessa. Koska PCR-menetelmää varten käytetyn inokulaatin määrä on paljon pienempi verrattuna soluviljelyyn, kaikki kalakudokset on homogenoitava huolellisesti ennen aineksen kokoamista eristämistä varten.

Samaa periaatetta on sovellettava myös, jos näytteet kerätään RNA-stabilointireagensseihin. Tällöin on kuitenkin usein vaikea kerätä edustavaa ainesta jopa 10 kalasta yhteen putkeen, joten kalojen määrä yhteisnäytettä kohti on näin ollen vähennettävä 2–5:een.

I.5 Virologinen tutkimus soluviljelmillä

I.5.1 Soluviljelmät ja elatusaineet

Bluegill fry -solulinjaa 2 (BF-2, isoaurinkoahvenen poikaset) tai Rainbow trout gonad -solulinjaa 2 (RTG-2, kirjolohen sukurauhaset) ja joko Epithelioma papulosum cyprini -soluja (EPC) tai Fathead minnow -soluja (FHM, paksupäämutu) on kasvatettava 20–30 °C:ssa sopivassa elatusaineessa, esimerkiksi Eaglen MEM-elatusaineessa tai sen muunnelmissa, johon on lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja antibiootteja standardipitoisuuksina.

Kun soluja viljellään suljetuissa pulloissa, elatusaine on puskuroitava bikarbonaatilla. Avoimissa yksiköissä kasvatettavissa soluviljelmissä käytettävä elatusaine voidaan puskuroida tris(hydroksimetyyli)aminometaani-suolahapolla (Tris-HCl) (23 mM) ja natriumbikarbonaatilla (6 mM). pH:n on oltava 7,6 ± 0,2.

Inokulaatiossa kalakudoksen kanssa käytettävien soluviljelmien on mahdollisuuksien mukaan oltava tuoreita, tavallisesti yhden vuorokauden ikäisiä yksikerroksisia soluviljelmiä; 4–48 tunnin ikäiset viljelmät voidaan hyväksyä. Solujen on kasvettava aktiivisesti inokulaatiossa.

I.5.2 Soluviljelmien inokulaatio

Soluviljelmiin on inokuloitava antibioottikäsiteltyä elinsuspensiota kahtena laimennuksena eli primaarilaimennuksena ja lisäksi sen 1:10 laimennoksena, joka on tulosta kudosaineksen lopullisesta laimennuksesta soluviljelyelatusaineeseen suhteessa 1:100 ja 1:1 000 homologisen interferenssin estämiseksi. Vähintään kaksi solulinjaa on inokuloitava I.5.1 kohdan mukaisesti. Inokulaatin koon ja soluviljelyelatusaineen tilavuuden suhteen on oltava noin 1:10.

Kutakin laimennosta ja solulinjaa kohti käytettävän solualueen on oltava vähintään noin 2 cm2, joka vastaa yhtä kuoppaa 24-kuoppaisessa soluviljelyastiassa. Soluviljelyalustoja on käytettävä aina kun se on mahdollista.

I.5.3 Soluviljelmien inkubaatio

Inokuloituja soluviljelmiä on inkuboitava 15 °C:ssa 7–10 päivää. Jos soluviljelmän elatusaineen väri muuttuu punaisesta keltaiseksi osoittaen elatusaineen happamoitumista, pH-arvoa on säädettävä steriilin bikarbonaattiliuoksen tai vastaavien aineiden avulla solun virusinfektioherkkyyden varmistamiseksi.

Jäädytetyt VHS- ja IHN-virusten kantaliuos on soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi titrattava vähintään kuuden kuukauden välein tai jos epäillään solujen herkkyyden vähentyneen. Edellä III jaksossa vahvistettua menettelyä on käytettävä, jos mahdollista.

I.5.4 Mikroskopointi

Inokuloidut soluviljelmät on tarkastettava säännöllisesti (vähintään 3 kertaa viikossa) sytopaattisen vaikutuksen ilmenemisen havaitsemiseksi 40–150-kertaisella suurennuksella. Jos havaitaan selvää sytopaattista vaikutusta, viruksen tunnistamismenetelmät on aloitettava välittömästi I.6 kohdan mukaisesti.

I.5.5 Jatkoviljely

Jos sytopaattista vaikutusta ei ole kehittynyt 7–10 päivän primaarisen inkubaation jälkeen, tuoreille soluviljelmille on suoritettava jatkoviljely, jossa käytetään vastaavaa solualuetta kuin primaariviljelmässä.

Kaikista primaariviljelmän muodostavista viljelmistä tai kuopista lähtöisin olevat elatusaineen (supernatantti) osanäytteet on ryhmiteltävä solulinjan mukaan 7–10 päivää inokulaation jälkeen. Ryhmitelmät on inokuloitava tämän jälkeen homologisiin soluviljelmiin laimentamattomina ja laimennettuina suhteessa 1:10 (tuloksena supernatantin lopulliset laimennokset suhteessa 1:10 ja 1:100), kuten I.5.2 kohdassa esitetään. Vaihtoehtoisesti 10 prosentin osanäytteet primaariviljelmän muodostavasta elatusaineesta on inokuloitava suoraan tuoretta soluviljelmää sisältävään kuoppaan (kuopasta kuoppaan -jatkoviljely). Inokulointia voi edeltää kaikkien laimennosten esi-inkubointi IPN-viruksen antiseerumin kanssa sopivana laimennuksena, kuten I.4.3 kohdassa esitetään.

Tämän jälkeen inokuloituja viljelmiä inkuboidaan 7–10 päivän ajan 15 °C:ssa tarkkailun alaisena siten kuin I.5.4 osassa esitetään.

Jos myrkyllistä sytopaattista vaikutusta ilmenee kolmen ensimmäisen päivän sisällä inkubaatiosta, jatkoviljely voidaan suorittaa tässä vaiheessa, mutta soluja on tällöin inkuboitava seitsemän päivän ajan ja jatkoviljeltävä uudelleen seitsemän uuden inkubaatiopäivän ajan. Siinä tapauksessa, että myrkyllinen sytopaattinen vaikutus kehittyy kolmen päivän jälkeen, solut on vaihdettava kerran ja inkubaatiota jatkettava, kunnes 14 vuorokautta on kulunut ensimmäisestä inokulaatiosta. Seitsemänä viimeisenä inkubaatiopäivänä ei saa ilmetä myrkyllisyyttä.

Jos bakteerikontaminaatiota tapahtuu antibioottikäsittelystä huolimatta, jatkoviljelyä ennen on suoritettava sentrifugaatio (2 000–4 000 × g, 15–30 minuuttia 2–5 °C:ssa) ja/tai supernatantin suodattaminen 0,45 μm:n kalvolla (jolla on heikko proteiineja sitova ominaisuus) tai molemmat. Tämän lisäksi jatkoviljelyssä on noudatettava samoja menettelyjä kuin myrkyllisen sytopaattisen vaikutuksen osalta kuvataan tämän kohdan neljännessä alakohdassa.

Jos sytopaattista vaikutusta ei ilmene, testiä voidaan pitää negatiivisena.

I.6 Viruksen tunnistaminen

Jos soluviljelmässä on havaittu sytopaattisen vaikutuksen kehittymistä, elatusaine (supernatantti) on kerättävä talteen ja tutkittava yhdellä tai useammalla seuraavista menetelmistä: entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys (ELISA), immunofluoresenssi (IF), neutralointi, RT-PCR tai RT-qPCR. Jos virusta ei pystytä varmuudella tunnistamaan näissä testeissä viikon kuluessa, supernatantti on toimitettava direktiivin 2006/88/EY liitteessä VI tarkoitettuun kansalliseen vertailulaboratorioon tai EU:n kalatauteja tutkivaan vertailulaboratorioon välitöntä tunnistusta varten.

I.6.1 ELISA

Virusisolaatin tunnistamiseksi on suoritettava DAS-ELISA. Microwell-levyt on peitettävä 50 μl/kuoppa (0,9 pg) tutkittua laatua olevasta kanin antiseerumista IHN- tai VSH-viruksia vastaan saaduilla proteiini A:lla puhdistetuilla immunoglobuliineilla (Ig) laimennettuna karbonaattipuskurilla (pH 9,6), jossa on 15 mM natriumatsidia, ja inkuboitava 18 tuntia – 2 viikkoa 4 °C:ssa.

Laimennuslevyllä kukin näyte, jossa on 1 % Triton X-100:aa, ja positiivikontrollit on laimennettava puskuriliuoksella (eli fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) 4-kertaiseksi laimennossarjaksi: laimentamaton, 1:4, 1:16, 1:64. ELISA-levyt on pestävä PBS:ssä, joka sisältää 0,05 % Tween-20:ta (PBS-T), ja 50 μl kutakin laimennosta on siirrettävä laimennuslevyltä pestylle ja päällystetylle ELISA-levylle.

Sitten ELISA-levyt on inkuboitava 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sen jälkeen levyt on pestävä ja inkuboitava 30 minuutin ajan 37 °C:ssa spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (eli VHS-viruksen tunnistamista varten MAb IP5B11 ja IHN-viruksen tunnistamista varten Hyb 136–3). ELISA-levylle on siirrettävä 50μl piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugoituja kanin anti-hiiri-vasta-aineita, jotka on laimennettu suhteessa 1:1 000 PBS-T-BSA:ssa.

Uuden pesun jälkeen on kehitettävä reaktioita lisäämällä o-fenyleenidiamiinia (OPD) 50 μl/kuoppa. ELISA-levyt on inkuboitava 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä ja reaktio pysäytettävä lisäämällä 0,5 M H2SO4 100 μl/kuoppa.

Absorbanssia on seurattava aallonpituudella 492 ja 620 nm ELISA-lukijassa. Näytteet on merkittävä positiivisiksi tai negatiivisiksi sen jälkeen, kun testin tuloksia on verrattu positiivi- ja negatiivikontrollien absorbanssiarvoihin. Negatiivisina pidetään yleensä näytteitä, joiden yhteenlaskettu absorbanssi (A) on < 0,5 laimentamattomassa aineksessa, epäilyttävinä pidetään näytteitä, joiden A-arvot ovat 0,5–1,0, ja positiivisina pidetään näytteitä, joiden A-arvot ovat > 1,0.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja ELISA-versioita.

I.6.2 Immunofluoresenssi (IF)

Lueteltujen patogeenien, VHS- ja IHN-virusten, tunnistaminen on suoritettava infektoimalla soluja ”Black” 96-kuoppalevyillä, tavanomaisilla 24-kuoppalevyillä tai 24-kuoppalevyjen peitelaseilla. Kun VHS- tai IHN-virus tai molemmat on tunnistettu infektoimalla soluja peitelaseilla, on sovellettava seuraavaa menettelyä:

a) peitelaseille on istutettava soluja tiheydellä, joka johtaa 60–90-prosenttiseen peittoon 24 tunnin viljelyn jälkeen. EPC-soluja on mahdollisuuksien mukaan käytettävä tähän tarkoitukseen, koska ne kiinnittyvät voimakkaasti lasipintoihin, mutta myös muita solulinjoja voidaan käyttää (esim. BF-2, RTG-2 tai FHM). 150 μl soluviljelmien supernatanttia on inokuloitava kahtena eri laimennoksena (1:10 ja 1:1 000) duplikaattina yhden vuorokauden ikäisiin yksikerroksisiin soluviljelmiin ja inkuboitava 15 °C:ssa 24 tunnin ajan;

b) sen jälkeen soluviljelyelatusaine on poistettava ja tartutettujen solujen yksikerroksiset viljelmät on kiinnitettävä 0,5 ml:llä jääkylmää vesipitoista asetoniliuosta (80 % vol:vol). Kiinnityksen on tapahduttava vetokaapissa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen asetoniliuos on poistettava ja peitelasit on ilmakuivattava vähintään 30 minuutin ajan. Tässä vaiheessa levyt on käsiteltävä välittömästi tai säilytettävä – 20 °C:ssa jatkokäyttöä varten;

c) spesifit monoklonaaliset vasta-aineet (VHS-viruksen tunnistamista varten Mab IP5B11 ja IHN-viruksen tunnistamista varten Hyb 136–3) on laimennettava 0,01 M:iin PBST:tä, pH 7,2, monoklonaalisten vasta-aineiden toimittajan suosittamalla laimennuksella; Kiinnitettyyn yksikerrosviljelmään on lisättävä 50–100 μl/kuoppa, ja levyt on inkuboitava yhden tunnin ajan 37 °C:ssa kosteassa tilassa;

d) peitelasit on pestävä varovasti kolmeen kertaan puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), jossa on 0,05 prosenttia Tween-20:tä (PBS-T), ja puskuriliuos on oltava täysin poistettu viimeisen huuhtelun jälkeen. Tämän jälkeen soluja on inkuboitava tunnin ajan 37 °C:ssa käyttämällä primaarisena vasta-aineena fluoreseiini-isotiosyanaatti- (FITC) tai tetrametyylirodamiini-5-(ja -6-) isotiosyanaatti (TRITC) -konjugoituja hiiren immunoglobuliinin vasta-aineita, jotka on laimennettu toimittajan ohjeiden mukaan, pestävä uudelleen PBS-T:ssä ja kuivattava. Värjäytyneet viljelmät on kiinnitettävä lasilevyille käyttämällä glyserolisuolaliuosta, ja niitä on tarkasteltava tulevan ultraviolettisäteilyn (UV) alla. On käytettävä 10 × tai 12 × -okulaaria ja × 25 tai × 40 -objektiivilinssejä, joiden vastaavat numeeriset aukot ovat > 0,7 ja > 1,3.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja IF-menetelmiä soluviljelyn, kiinnityksen ja vertailulaatua olevien vasta-aineiden osalta.

I.6.3 Neutralisaatio

Talteen kerätystä supernatantista on poistettava solut sentrifugoinnilla (kierrosnopeus 2 000–4 000 × g) tai 0,45 μm:n kalvosuodattimella, jolla on heikko proteiineja sitova ominaisuus, ja supernatantti on laimennettava suhteessa 1:100 ja 1:10 000 soluviljelyelatusaineessa.

Supernatantin vähintään kahden laimennoksen osanäytteet on sekoitettava, ja niitä on inkuboitava erikseen 60 minuutin ajan 15 °C:ssa yhdessä seuraavien reagenssien samansuuruisten osien kanssa:

a) seerumi, joka sisältää VHS-viruksen ryhmäspesifistä vasta-ainetta 1:50-laimennoksena (vol:vol);

b) seerumi, joka sisältää IHN-viruksen ryhmäspesifistä vasta-ainetta 1:50-laimennoksena (vol:vol);

c) IPN-viruksen kotoperäisten serotyyppien antiseerumiseosta 1:50-laimennoksena (vol:vol);

d) pelkkää elatusainetta (positiivikontrolli).

Kustakin viruksen supernatantti-seerumi-seoksesta on inokuloitava vähintään kaksi soluviljelmää 50 μl:lla kukin ja sitten inkuboitava 15 °C:ssa. Sytopaattisen vaikutuksen kehittyminen on tarkastettava I.5.4 kohdassa kuvatulla tavalla.

VHS-viruskannat ja -isolaatit, jotka eivät reagoi neutralisaatiokokeissa, on tunnistettava IF:n tai ELISA:n avulla.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja neutralisaatiotestejä.

I.6.4 RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1 Virus-RNA:n valmistelu

Kaikki RNA:han liittyvä työ on suoritettava jäähauteessa käsineet kädessä.

RNA on eristettävä käyttämällä fenolikloroformimenetelmää tai affiniteettipuhdistamalla RNA spin-kolonneilla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaupallisia RNA-eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia RNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi jäljempänä esitettyjen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.

RNA on suspendoitava uudelleen tislattuun RNase-vapaaseen veteen (eli 0,1-prosenttisella dietyyli-pyrokarbonaatilla käsiteltyyn veteen) tai soveltuvaan eluointipuskuriin.

I.6.4.2 RT-PCR

IHN-viruksen osoittamiseksi on käytettävä seuraavia alukkeita:

Etualuke 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

Taka-aluke 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

On käytettävä seuraavia syklejä (yksivaiheinen RT-PCR): 1 sykli: 50 °C 30 minuuttia; 1 sykli: 95 °C 2 minuuttia; 30 sykliä: 95 °C 30 sekuntia, 50 °C 30 sekuntia, 72 °C 60 sekuntia; 1 sykli: 72 °C 7 minuuttia ja liotus 4 °C:ssa.

VHS-viruksen osoittamiseksi on käytettävä seuraavia alukkeita:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

On käytettävä seuraavia syklejä (yksivaiheinen RT-PCR): 50 °C 30 minuuttia, 95 °C 15 minuuttia, 35 sykliä 94 °C 30 sekuntia, 55 °C 30 sekuntia ja 68 °C 60 sekuntia. Tämän jälkeen reaktiota on pidettävä vähintään 68 ƒC:n lämpötilassa 7 minuutin ajan.

RT-PCR-reaktioiden määrä ja spesifisyys on arvioitava geelielektroforeesilla 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, jossa on etidiumbromidia, ja todettava käyttämällä UV-läpivalaisua. IHN-viruksen osalta voidaan havaita 693 emäsparin PCR-amplikoni. VHS-viruksen osalta sen on oltava kooltaan 505 emäsparia.

PCR:n tulokset saattavat vaihdella suoritusolosuhteiden mukaan, joten lämpötilaprotokollat saatetaan joutua optimoimaan käytössä olevan lämpöblokin mukaan. Lisäksi voi ilmetä vääriä positiivisia tuloksia alukkeen väärän kiinnittymisen tai laboratorion saastumisen vuoksi. Siksi on varmuuden vuoksi otettava mukaan asianmukaiset positiivi- ja negatiivikontrollit sekä sekvenssiamplikonit. VHS-virusalukkeiden osalta on oltava erityisen varovainen käytettäessä BF-2-soluja, sillä alukkeet voivat reagoida solulinjan DNA/RNA:n kanssa ja antaa samansuuruisia vääriä positiivisia tuloksia. Kun testataan supernatanttia BF-2-soluista, mahdolliset monistetut PCR-fragmentit on sekvensoitava.

I.6.4.3 RT-qPCR VHS-virusmääritystä varten

VHS-virusmääritystä varten on suoritettava monistus käyttämällä seuraavia alukkeita ja koettimia:

Etualuke: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

Taka-aluke: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

ja koetin: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Yksivaiheinen RT-qPCR:

Negatiiviset templaattikontrollit ja positiivikontrollit on sisällytettävä kuhunkin levyajoon. Ajo-olosuhteet: 50 °C 30 minuuttia, 95 °C 15 minuuttia, 40 sykliä 94 °C 15 sekuntia, 60 °C 40 sekuntia ja 72 °C 20 sekuntia; mukautettava tarvittaessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja RT-PCR- tai RT-qPCR-versioita.

I.6.4.4 RT-qPCR IHN-virusmääritystä varten

IHN-viruksen osalta on suoritettava monistus käyttämällä seuraavia alukkeita ja koetinta:

Etualuke: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Taka-aluke: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

ja koetin: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Kaksivaiheinen RT-qPCR:

Koska seuraava määritys riippuu kaksivaiheisesta monistuksesta, on noudatettava erityistä varovaisuutta käsiteltäessä putkia yhdestä reaktiosta toiseen saastumisen ehkäisemiseksi.

Ajo-olosuhteet (RT-vaiheen jälkeen): 50 °C 2 minuuttia, 95 °C 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 °C 15 sekuntia ja 60 °C 1 minuutti; mukautettava tarvittaessa.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja RT-PCR- tai RT-qPCR-versioita.

II Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt VHS- tai IHN- tai molempien epäilyn vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi epäillyissä taudinpurkauksissa

Kun IHN- tai VHS-taudin tai molempien esiintymisen vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti edellytetään laboratoriotutkimusta, jossa käytetään liitteessä I olevan 1 osan II.3 kohdassa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava seuraavia yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä:

a) tavanomainen viruseristys ja sen jälkeen virusneutralisaatio, viruksen immunokemiallinen tai molekulaarinen tunnistaminen,

b) viruksen osoittaminen RT-PCR- tai RT-qPCR-menetelmällä;

c) muut diagnostiset menetelmät, kuten IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1 Tavanomainen viruseristys ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen

II.1.1 Näytteiden valinta

Tutkimusta varten on valittava vähintään 10 kalaa, joissa ilmenee tyypillisiä IHN- tai VHS-taudin merkkejä.

II.1.2 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu ja lähettäminen

Valmistelussa ja lähettämisessä tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.2 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.1.3 Diagnostisen lisäaineiston kerääminen

Diagnostisen lisämateriaalin keräämisessä tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.3 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.1.4 Näytteiden valmistelu soluviljelytutkimusta varten

Näytteiden valmistelussa soluviljelytutkimusta varten tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.4 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.1.5 Soluviljelmien virologinen tutkimus

Virologisessa tutkimuksessa tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.5 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.1.6 Viruksen tunnistaminen

Viruksen tunnistamisessa tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.6 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.2 Viruksen osoittaminen RT-qPCR-menetelmällä

II.2.1 Näytteiden valinta

Näytteiden valinnassa tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.1.2 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.2.2 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu ja lähettäminen

Näytteiden valmistelussa ja lähettämisessä viruksen osoittamiseksi RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.2 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.2.3 Diagnostisen lisäaineiston kerääminen

Diagnostisen lisäaineiston keräämisessä viruksen osoittamiseksi RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.3 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.2.4 Näytteiden valmistelu RT-qPCR-menetelmää varten

Näytteiden valmistelussa viruksen osoittamiseksi RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.6.4.1 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.2.5 RT-qPCR

Viruksen osoittamisessa RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.6.4.1, I.6.4.3 ja I.6.4.4 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.

II.3 Muut diagnostiset menetelmät

I.4.3 kohdassa kuvatulla tavalla valmistetulle supernatantille voidaan tehdä I.6.1 kohdan mukaisesti ELISA, I.6.2 kohdan mukaisesti epäsuora fluoresenssivasta-ainetesti (IFAT) tai I.6.4 kohdan mukaisesti RT-PCR-menetelmä. Kudosaines voidaan tutkia muilla diagnostisilla menetelmillä, kuten jäähdytettyjen kantojen IFAT-testi tai formaliinilla kiinnitetyn kudosaineksen immunohistokemia. Kyseisiä nopeita menetelmiä on täydennettävä virologisella tutkimuksella II kohdan joko a tai b alakohdan mukaisesti 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, jos

a) on saatu negatiivinen tulos; tai

b) ensimmäistä IHN- tai VHS-tapausta edustavasta aineksesta on saatu positiivinen tulos.

III Titraatiomenettely soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi

Kun suoritetaan I.5.3 kohdassa tarkoitettu titraatio soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi, on noudatettava tämän kohdan seuraavissa kohdissa vahvistettuja menettelyjä.

On käytettävä ainakin kahta VHS-virusisolaattia ja yhtä IHN-virusisolaattia. Isolaattien on edustettava tärkeimpiä Euroopan unionissa esiintyviä virusryhmiä, esimerkiksi VHS-viruksen osalta on mukana oltava yksi kirjolohen patogeeninen isolaatti makeasta vedestä ja yksi piikkikampelan patogeeninen isolaatti merivedestä ja IHN-viruksen osalta yksi kirjolohen patogeeninen kanta Euroopan unionista. On käytettävä jäsenvaltioista peräisin olevia hyvin määriteltyjä isolaatteja. Viruksia, jotka ovat peräisin vain muutaman kerran siirrostetuista viljelmistä, on viljeltävä solusviljelypulloissa, joissa on BF-2- tai RTG-2-soluja VHS-virusmääritystä varten tai EPC- tai FHM-soluja IHN-virusmääritystä varten. Soluviljelyelatusaineessa on oltava vähintään 10 % seerumia. Inokulaatiossa on käytettävä alhaista infektiokerrointa (< 1).

Kun sytopaattinen vaikutus on täysin kehittynyt, virus otetaan talteen sentrifugoimalla soluviljelmien supernatanttia kierrosnopeudella 2 000 × g 15 minuutin ajan, minkä jälkeen neste steriloidaan 0,45 μm:n kalvosuodattimella ja jaetaan etiketillä varustettuihin kryoputkiin. Virus on säilytettävä – 80 °C:ssa.

Viikon kuluttua jäädyttämisestä kolme rinnakkaisnäytepulloa on sulatettava kylmässä vedessä, ja virusnäytteet on titrattava vastaavilla solulinjoillaan. Vähintään 6 kuukauden välein tai aina, kun epäillään solulinjan herkkyyden vähentyneen, kukin virusisolaatti on sulatettava ja titrattava.

Titraatiomenettelyt on kuvattava yksityiskohtaisesti, ja joka kerran on noudatettava samaa menettelyä.

Jos titrauksessa määritetään loppupistelaimennos, määritykseen on otettava vähintään 6 rinnakkaisnäytettä kustakin laimennusvaiheesta. Tittereitä on verrattava aiemmin saatuihin tittereihin. Jos jollekin kyseisiin kolmeen virusisolaattiin kuuluvista isolaateista saadaan titteri, joka laskee 2 log-kertaluvun verran tai enemmän kuin alkuperäinen titteri, kyseistä solulinjaa ei saa enää käyttää seurantatarkoituksiin.

Jos laboratoriossa pidetään erilaisia solulinjoja, kukin linja on tutkittava erikseen.

Kirjanpito on säilytettävä vähintään 10 vuotta.

2 OSA

YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT KHV-TAUDIN SEURANTAA JA SEN ESIINTYMISEN VAHVISTAMISTA VARTEN

I Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt KHV-taudin esiintymisen vahvistamiseksi tai sen epäilyn poissulkemiseksi

Kun KHV-taudin esiintymisen vahvistamiseksi tai sen epäilyn poissulkemiseksi direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti edellytetään laboratoriotutkimusta, jossa käytetään liitteessä I olevan 2 osan III jaksossa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava tämän osan I.1–I.2 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä:

I.1 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu

Diagnostisia tarkoituksia varten testauksessa tavanomaisilla PCR- tai qPCR-reaktioon perustuvilla menetelmillä voidaan käyttää kaloja (lähetettyinä elävinä tai tapettuina ja erikseen pakattuina aseptisiin sinetöityihin säiliöihin) tai vaihtoehtoisesti jäädytettyjä elimiä tai elinten kappaleita, jotka on säilötty absoluuttiseen etanoliin tai virusperäiseen kuljetuselatusaineeseen (käsiteltävä 48 tunnin kuluessa keräämisestä).

KH-viruksen osoittamiseksi on kerättävä kidukset ja munuaiset; erilliseen lisänäytteeseen voidaan sisällyttää lisäksi perna, aivot ja suolet. Akuuteissa tapauksissa voidaan yhdistää enintään viiden kalan kudosainesta.

Lisäksi ei-tappavia näytteitä, kuten verta, kiduspyyhkäisynäytteitä, kidusbiopsiaa tai limakalvon kaavintanäytteitä, voidaan käyttää tietyissä tapauksissa (eli hyvin arvokkaita kaloja voidaan käyttää, jos epäillään KH-viruksen esiintymistä).

I.1.1 DNA:n eristäminen

DNA on eristettävä standardimenettelyjen mukaisesti.

Kaupallisesti saatavilla olevia DNA:n eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia DNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi I.2 kohdassa tarkoitettujen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.

I.2 Taudinaiheuttajien osoittaminen ja tunnistamisen polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvilla menetelmillä

I.2.1 qPCR-menetelmä KH-viruksen osoittamista varten

KV-viruksen osoittamiseksi qPCR-menetelmällä on käytettävä seuraavaa qPCR-määritystä:

Etualuke (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Taka-aluke (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

ja koetin (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Ajo-olosuhteet: yksi sykli 95 °C 15 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 94 °C 15 sekuntia ja 60 °C 60 minuuttia. Negatiiviset templaattikontrollit ja positiivikontrollit on sisällytettävä kuhunkin levyajoon. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja qPCR-versioita.

I.2.2 Tavanomainen PCR KH-viruksen osoittamiseksi

On käytettävä tässä kohdassa kuvattua KH-viruksen tymidiinikinaasi (TK) -geeniin kohdistuvaa määritystä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita PCR-määrityksiä, jolla on osoitettu olevan vastaava herkkyys ja spesifisyys.

Etualuke (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

Taka-aluke (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Ajo-olosuhteet: yksi sykli 95 °C 5 minuuttia ja sen jälkeen 35 sykliä 95 °C 30 sekuntia, 52 °C 30 sekuntia, 72 °C yksi minuutti ja yksi sykli 72 °C 10 minuuttia. Tuotteen koon olisi oltava 409 bp.

PCR:n tulokset saattavat vaihdella suoritusolosuhteiden mukaan, joten lämpötilaprotokollat saatetaan joutua optimoimaan käytössä olevan lämpöblokin mukaan. Lisäksi voi ilmetä vääriä positiivisia tuloksia alukkeen väärän kiinnittymisen tai laboratorion saastumisen vuoksi. Negatiiviset templaatt