Komission päätös,

tehty 21 päivänä helmikuuta 2002,

neuvoston direktiivin 90/426/ETY liitteen D muuttamisesta afrikkalaisen hevosruton diagnostisten testien osalta

(tiedoksiannettu numerolla K(2002) 556)

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

(2002/160/EY)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista elävien hevoseläinten liikkuvuuden ja kolmansista maista tapahtuvan tuonnin osalta 26 päivänä kesäkuuta 1990 annetun neuvoston direktiivin 90/426/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 2001/298/ETY(2), ja erityisesti sen 23 artiklan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1) Direktiivin 90/426/ETY liitteessä D kuvataan afrikkalaisen hevosruton diagnosoimiseksi tehtävää komplementinsitoutumistestiä.

(2) Algetessa Espanjassa sijaitseva yhteisön vertailulaboratorio isännöi EU:n jäsenvaltioiden kansallisten afrikkalaisesta hevosrutosta vastaavien vertailulaboratorioiden vuosikokousta vuoden 2000 marraskuussa. Kyseisen kokouksen aikana esitettiin tieteellistä näyttöä siitä, että direktiivin 90/426/ETY liitteessä D kuvatulla komplementinsitoutumistestillä on vakavia rajoitteita erityisesti sen vuoksi, että testin avulla vasta-aineet osoitetaan ainoastaan hiljattain tapahtuneen tartunnan tai tehdyn rokotuksen jälkeen. Lisäksi testi on käytännössä korvattu nykyaikaisilla ELISA-testeillä melkein kaikissa yhteisön laboratorioissa ja myös merkittävimmissä vientimaissa.

(3) Diagnostisten testien ja rokotteiden standardeja käsittelevässä Kansainvälisen eläintautiviraston (OIE) käsikirjassa Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines(3) kuvataan afrikkalaisen hevosruton vasta-aineiden osoittamisessa käytetyt kansainvälisesti hyväksytyt laboratoriotestit. Viimeisimmässä painoksessa mainitaan kuitenkin ainoastaan yksi saatavilla olevista ELISA-testeistä.

(4) Tämän vuoksi on aiheellista muuttaa direktiivin 90/426/ETY liitettä D tekniikan kehityksen ja kansainvälisesti hyväksyttyjen standardien ottamiseksi huomioon.

(5) Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset,

ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:

1 artikla

Korvataan direktiivin 90/426/ETY liite D tämän päätöksen liitteellä.

2 artikla

Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 21 päivänä helmikuuta 2002.

Komission puolesta

David Byrne

Komission jäsen

(1) EYVL L 224, 18.8.1990, s. 42.

(2) EYVL L 102, 12.4.2001, s. 63.

(3) Luku 2.1.11, neljäs painos 2000.

LIITE

"LIITE D

AFRIKKALAINEN HEVOSRUTTO

DIAGNOSOINTI

Jäljempänä kuvattujen ELISA-testien (entsyymi-immunologiset määritykset) reagensseja saa afrikkalaisen hevosruton Euroopan yhteisöjen vertailulaboratoriosta tai taudista vastaavista Kansainvälisen eläintautiviraston (OIE) vertailulaboratorioista.

1. KILPAILEVA (KOMPETITIIVINEN) ELISA-TESTI AFRIKKALAISEN HEVOSRUTON VIRUKSEN (AHRV) VASTA-AINEIDEN OSOITTAMISEKSI (PAKOLLINEN TESTI)

Kilpailevaa ELISA-testiä käytetään spesifisten AHRV-vasta-aineiden osoittamiseksi hevoseläinten seerumista. Laajaspektrinen, polykloonaalinen marsussa tehty anti-AHRV-immuuniseerumi (jäljempänä "marsussa tehty antiseerumi") on seroryhmäspesifinen, ja sillä pystytään osoittamaan kaikki afrikkalaisen hevosruton viruksen serotyypit.

Testin periaate on, että AHRV-antigeenin ja marsussa tehdyn antiseerumin reaktio keskeytetään näyteseerumilla. Näyteseerumissa olevat AHRV-vasta-aineet kilpailevat marsussa tehdyn antiseerumin vasta-aineiden kanssa, mikä heikentää odotettua värimuutosta (sen jälkeen kun on lisätty entsyymimerkittyä anti-marsuvasta-ainetta ja substraattia). Seerumit voidaan testata yhtenä 1:5 laimennoksena (spot-testimenetelmä), tai ne voidaan titrata (seerumin titrausmenetelmä) kunnes saadaan positiivisen reaktion laimennuspäätepiste. Positiivisena pidetään yli 50 %:n inhibitioarvoja.

Jäljempänä kuvattua testimenettelyä käytetään Pirbrightissa Yhdistyneessä kuningaskunnassa sijaitsevassa afrikkalaisen hevosruton alueellisessa vertailulaboratoriossa.

1.1 Testimenetelmä

1.1.1 Levyjen valmistus

1.1.1.1 ELISA-levyt pinnoitetaan infektoiduista soluviljelmistä uutetulla AHRV-antigeenilla ja laimennetaan karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6). ELISA-levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa.

1.1.1.2 Levyt pestään kolmeen kertaan huuhtelemalla fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka pH on 7,2-7,4, ja kuopat tyhjennetään ja kuivataan imupaperiin taputtamalla.

1.1.2 Kontrollikuopat

1.1.2.1 Positiiviset kontrolliseerumit titrataan 1:2 laimennossarjalla (1:5-1:640), estopuskurissa (PBS + 0,05 % (v/v) Tween-20 + 5,0 % (w/v) rasvaton maitojauhe (Cadbury's MarvelTM) + 1 % (v/v) täysikasvuisen naudan seerumi) kuopparivillä 1, niin että lopputilavuudeksi tulee 50 μl/kuoppa.

1.1.2.2 Lisätään 50 μl 1:5 laimennettua negatiivista kontrolliseerumia (10 μl seerumia + 40 μl estopuskuria) kuoppiin A ja B rivissä 2.

1.1.2.3 Lisätään 100 μl/kuoppa estopuskuria kuoppiin C ja D rivissä 2 (NOLLAKOE).

1.1.2.4 Lisätään 50 μl estopuskuria kuoppiin E, F, G ja H rivissä 2 (marsukontrolli).

1.1.3 Spot-testimenetelmä

1.1.3.1 Jokaista testiseerumia lisätään laimennoksena 1:5 (10 μl seerumia + 40 μl estopuskuria) estopuskurissa kahteen rinnakkaiskuoppaan riveillä 3-12.

tai

1.1.4 Seerumin titrausmenetelmä

1.1.4.1 Kustakin testinäytteestä valmistetaan 1:2 laimennossarja (1:5-1:640) estopuskurissa poikki levyn kahdeksaan kuoppaan käyttäen yhtä kuoppariviä (riveille 3-12).

jonka jälkeen

1.1.5 Lisätään 50 μl estopuskurilla esilaimennettua marsussa tehtyä antiseerumia ELISA-levyn kaikkiin kuoppiin nollakoekuoppaa lukuun ottamatta (kaikkien kuoppien lopputilavuus on nyt 100 μl).

1.1.5.1 Inkuboidaan vaakatasossa pyörivässä ravistelijassa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

1.1.5.2 Levyt pestään kolmeen kertaan ja kuivataan imupaperiin taputtamalla kuten aikaisemmin.

1.1.5.3 Lisätään 50 μl estopuskurissa esilaimennettua kanissa tehtyä antimarsu-piparjuuriperoksidaasi(HRP)-konjugaattia jokaiseen kuoppaan.

1.1.5.4 Inkuboidaan vaakatasossa pyörivässä ravistelijassa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

1.1.5.5 Levyt pestään kolmeen kertaan ja kuivataan imupaperilla kuten aikaisemmin.

1.1.6 Kromogeeni

Valmistetaan kromogeeni eli OPD-liuos (OPD = ortofenyleenidiamiini) valmistajan ohjeiden mukaan (0,4 mg/ml steriilissä tislatussa vedessä) juuri ennen käyttöä. Lisätään substraatti (vetyperoksidi = H2O2) 0,05 %:n (v/v) loppupitoisuuden saavuttamiseksi (1:2000 30-prosenttisessa H2O2-liuoksessa). Lisätään 50 μl OPD-liosta jokaiseen kuoppaan, ja levyt jätetään 10 minuutiksi huoneenlämpöön. Reaktio pysäytetään lisäämällä 1 M rikkihappoa (H2SO4 ) (50 μl/kuoppa).

1.1.7 Lukema

Levyt luetaan spektrofotometrissä aallonpituudella 492 nm.

1.2 Tulosten laskeminen

1.2.1 Tietokoneohjelmiston avulla tulostetaan OD-arvot (optinen tiheys) ja inhibitioprosentti (PI) testi- ja kontrolliseerumeille vertaamalla tuloksia neljän marsukontrollikuopan keskiarvoihin. OD- ja PI-arvoja käytetään arvioitaessa, onko testitulos hyväksyttävissä rajoissa. Neljän marsukontrollikuopan yläraja-arvot (UCL) ja alaraja-arvot (LCL) ovat välillä 1,4-0,4 OD. Inhibitioprosenttiin 50 perustuvan positiivisen kontrollin viimeisen positiivisen laimennoksen pitäisi olla 1:240 (vaihteluvälillä 1:120-1:480). Kaikki ne levyt, jotka eivät täytä edellä olevia perusteita, on hylättävä. Jos positiivisen kontrolliseerumin pitoisuus on kuitenkin yli 1:480 ja testinäytteet ovat edelleen negatiiviset, negatiiviset testinäytteet voidaan kuitenkin hyväksyä.

Negatiivista kontrolliseerumia sisältävien rinnakkaiskuoppien PI-arvojen olisi oltava välillä + 25 % ja - 25 %, ja rinnakkaisten nollakoekuoppien PI-arvojen välillä + 95 ja + 105 %. Näiden rajojen ulkopuolella olevat arvot eivät välttämättä merkitse sitä, ettei lukemaa voisi hyväksyä, mutta viittaavat siihen, että on kehittymässä taustaväri.

1.2.2 Testiseerumin diagnostinen raja-arvo on 50 % (PI 50 %). Näytteet, joiden PI-arvot ovat yli 50 %, ovat POSITIIVISIA. Näytteet, joiden PI-arvot ovat alle 50 %, ovat NEGATIIVISIA.

Rinnakkaiskuoppien raja-arvot ylittäviä tai alittavia näytteitä pidetään epäilyttävinä. Tällaiset näytteet voidaan testata uudelleen spot-testillä ja titraamalla. Positiiviset näytteet voidaan titrata, jolloin selviää näytteen positiivisuuden taso.

Spot-testin kaavio

>TAULUKON PAIKKA>

Neg. kontr.= negatiivinen kontrolli

Pos. kontr.= positiivinen kontrolli

M-kontr.= marsukontrolli.

Seerumititraation malli

>TAULUKON PAIKKA>

Neg. kontr.= negatiivinen kontrolli

Pos. kontr.= positiivinen kontrolli

M-kontr.= marsukontrolli.

2. EPÄSUORA ELISA-TESTI AFRIKKALAISEN HEVOSRUTON VIRUKSEN (AHRV) VASTA-AINEIDEN OSOITTAMISEKSI (PAKOLLINEN TESTI)

Jäljempänä kuvattu testi on diagnostisten testien ja rokotteiden standardeja käsittelevän OIE:n käsikirjan (neljäs painos, 2000) 2.1.11 luvun mukainen.

Rekombinantti-VP7-proteiinia on käytetty antigeeninä AHR-viruksen vasta-aineen osoittamiseksi. Antigeenia käytettäessä testin herkkyys ja spesifisyys ovat korkeita. Muita etuja ovat antigeenin stabiilius ja vaarattomuus (ei infektiivinen).

2.1 Testimenetelmä:

2.1.1 Kiinteä faasi:

2.1.1.1 ELISA-levyt pinnoitetaan karbonaatti/bikarbonaattipuskurilla (pH 9,6) laimennetulla rekombinantti-AHRV-4 VP7:llä. Levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa.

2.1.1.2 Levyt pestään tislatulla vedellä, jossa on 0,01 %:a (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos), viiteen kertaan. Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

2.1.1.3 Levyille annostellaan estoliuosta (PBS + 5 % (w/v) rasvatonta maitoa (kuivattu rasvaton maito Nestlé Dry Skim MilkTM)), 200 μl/kuoppa, annetaan olla 1 tunti 37 °C:ssa.

2.1.1.4 Estoliuos poistetaan, ja levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan pois.

2.1.2 Testinäytteet:

2.1.2.1 Testattavat seeruminäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrolliseerumit laimennetaan suhteessa 1:25 PBS:n + 5 % (w/v) rasvattoman maidon + 0,05 % (v/v) Tween 20:n liuoksella, ja pipetoidaan 100 μl kuoppaa kohti. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Titrausta varten tehdään 1:2 laimennosten sarja alkaen laimennussuhteesta 1:25 (100 μl/kuoppa), yksi levyrivi seerumia kohti, ja sama toistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

2.1.2.2 Levyt pestään kuten vaiheessa 2.1.1.2.

2.1.3 Konjugaatti:

2.1.3.1 Pipetoidaan 100 μl/kuoppa piparjuuriperoksidaasi(HRP)-konjugoitua hevosen gammaglobuliinia vastaan tehtyä antiseerumia, joka on esilaimennettu puskuriin (PBS + 5 % maito + 0,05 % Tween 20), pH 7,2. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

2.1.3.2 Levyt pestään kuten vaiheessa 2.1.1.2.

2.1.4 Kromogeeni/substraatti:

2.1.4.1 Lisätään 200 μl/kuoppa kromogeeni/substraattiliuosta [10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyyli-aminobentsaldehydi) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyyli-2-bentso-tiatsoliinihydratsonihydrokloridi) + 5 μl H2O2].

Värimuutos pysäytetään lisäämällä 50 μl 3 N H2SO4:ää noin 5-10 minuutin jälkeen (ennen kuin negatiivinen kontrolli alkaa värjäytyä).

Muita kromogeeneja, kuten ABTS (2,2'-atsino-bis-[3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]), TMB (tetrametyylibentsidini) tai OPD (ortofenyleenidiamiini), voidaan myös käyttää.

2.1.4.2 Levyt luetaan aallonpituudella 600 nm (tai 620 nm).

2.2 Tulosten tulkinta:

2.2.1 Raja-arvo lasketaan lisäämällä 0,6 negatiivisen kontrollin arvoon. (0,6 on 30 negatiivisen seerumin ryhmällä saatu vakiopoikkeama.)

2.2.2 Raja-arvon alittavan absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään negatiivisina.

2.2.3 Raja-arvon + 0,15 ylittävän absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään positiivisina.

2.2.4 Testinäytteitä, joiden absorbanssi on edellä mainittujen välillä, pidetään epäilyttävinä, ja jotain muuta menetelmää on käytettävä tuloksen vahvistamiseksi.

3. ESTO-ELISA-TESTI AFRIKKALAISEN HEVOSRUTON VIRUKSEN (AHRV) VASTA-AINEIDEN OSITTAMISEKSI (PAKOLLINEN TESTI)

Esto-ELISA-testiä käytetään spesifisten AHRV-vasta-aineiden osoittamiseksi taudille alttiiden lajien seerumista. VP7 on AHRV:n tärkein antigeeninen virusproteiini. Se on konservoitunut ja todettavissa kaikissa 9 AHRV:n serotyypissä. Koska testissä käytetty monoklooninen vasta-aine (MAb) toteaa myös VP7-antigeenin, testi on hyvin herkkä ja spesifinen. Lisäksi rekombinantti-VP7-antigeeni on täysin vaaraton ja tämän vuoksi hyvin turvallinen.

Kokeen periaate on, että rekombinantti-VP7:n, joka on ELISA-levyyn sitoutunut antigeeni, ja VP7:lle spesifisen konjugoidun MAb:n reaktio keskeytetään. Testiseerumeissa oleva vasta-aine estää antigeenin ja MAb:n välisen reaktion, mikä heikentää syntyvää väriä.

Jäljempänä kuvattua testiä käytetään Algetessa Espanjassa sijaitsevassa afrikkalaisen hevosruton Euroopan yhteisön vertailulaboratoriossa.

3.1 Testimenetelmä:

3.1.1 ELISA-levyt

3.1.1.1 ELISA-levyt pinnoitetaan karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6) laimennetulla rekombinantti-AHRV-4 VP7:llä, ja niitä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa.

3.1.1.2 Levyt pestään viidesti PBS:lla, jossa on 0,05 %:a (v/v) Tween-20:tä (PBST).

3.1.1.3 Levyt stabiloidaan stabilointiliuoksella, jotta niitä voidaan säilyttää 4 °C:ssa aktiivisuuden katoamatta, sekä kuivataan imupaperiin taputtamalla.

3.1.2 Testinäytteet ja kontrollit

3.1.2.1

>TAULUKON PAIKKA>

3.1.2.2

>TAULUKON PAIKKA>

3.1.3 Konjugaatti

Lisätään esilaimennettua HRP-konjugoitua MAb:a (VP7:lle spesifinen monoklooninen vasta-aine) 50 μl/kuoppa kuhunkin kuoppaan ja sekoitetaan varovasti tasakoosteisuuden varmistamiseksi. Inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 °C:ssa.

3.1.4 Levyt pestään viidesti PBST-liuoksella ja kuivataan imupaperiin taputtamalla kuten aikaisemmin.

3.1.5 Kromogeeni/substraatti

Lisätään kromogeeni/substraattiliuosta [1 ml ABTS (2,2'-atsino-bis-[3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]) (5 mg/ml) + 9 ml substraatti-puskuria (0,1 M fosfaattisitraattipuskuria, jonka pH on 4 ja jossa on 0,03 % H2O2)] 100 μl/kuoppa ja inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämmössä. Värimuutos pysäytetään lisäämällä 2 % (w/v) SDS:ää (natriumdodekyylisulfaatti) (100 μl/kuoppa).

3.1.6 Lukema

Levyt luetaan aallonpituudella 405 nm ELISA-lukulaitteessa.

3.2 Tulosten tulkinta

3.2.1 Määrityksen validointi

Testi on hyväksyttävä, jos negatiivisen kontrollin (NK) optinen tiheys (OD) on yli 1,0 ja positiivisen kontrollin (PK) OD on alle 0,2.

3.2.2 Raja-arvon laskeminen

Positiivinen raja-arvo=

>VIITTAUS KAAVIOON>

Negatiivinen raja-arvo=

>VIITTAUS KAAVIOON>

NK on negatiivisen kontrollin OD ja PK on positiivisen kontrollin OD.

3.2.3 Tulosten tulkinta

Näytteitä, joiden OD on alhaisempi kuin positiivinen raja-arvo, on pidettävä AHRV-vasta-ainepositiivisina.

Näytteitä, joiden OD on korkeampi kuin negatiivinen raja-arvo, on pidettävä AHRV-vasta-ainenegatiivisina.

Näytteitä, joiden OD on näiden kahden arvon välillä, olisi pidettävä epäilyttävinä, ja eläimistä olisi otettava uudet näytteet 2-3 viikon kuluttua."