KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 1864/90, annettu 29 päivänä kesäkuuta 1990, öljysiementen näytteiden otosta ja esikäsittelystä sekä määritysmenetelmistä annetun asetuksen (ETY) N:o 1470/68 muuttamisesta



Virallinen lehti nro L 170 , 03/07/1990 s. 0027 - 0034

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 33 s. 0023

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 33 s. 0023



KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 1864/90, annettu 29 päivänä kesäkuuta 1990, öljysiementen näytteiden otosta ja esikäsittelystä sekä määritysmenetelmistä annetun asetuksen (ETY) N:o 1470/68 muuttamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä syyskuuta 1966 annetun asetuksen N:o 136/66/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 2902/89(2), ja erityisesti sen 24 a artiklan, sekä katsoo, että rapsin ja rypsin nimitys "00-lajike" on riippuvainen niiden glukosinolaattipitoisuudesta; olisi säädettävä tämän pitoisuuden määrittämiseksi parhaiten soveltuvasta menetelmästä, komission asetuksessa (ETY) N:o 1470/68(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 2435/86(4), on määritelty yhteisölle yhteinen menetelmä rapsin siementen glukosinolaattipitoisuuden määrittämiseksi; sen jälkeen on kehitetty ja kokeiltu parempi määritysmenetelmä; yhteisön yhteistä glukosinolaattipitoisuuden määritysmenetelmää olisi muutettava, ja tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat rasvojen hallintokomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla Korvataan asetuksen (ETY) N:o 1470/68 liite VIII tämän asetuksen liitteellä. 2 artikla Tämä asetus tulee voimaan päivänä, jona se julkaistaan Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Sitä sovelletaan 1 päivästä heinäkuuta 1990 alkaen. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 29 päivänä kesäkuuta 1990. Komission puolesta Ray MAC SHARRY Komission jäsen (1) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66 (2) EYVL N:o L 280, 29.9.1989, s. 2 (3) EYVL N:o L 239, 28.9.1968, s. 2 (4) EYVL N:o L 210, 1.8.1986, s. 55 LIITE "LIITE VIII ÖLJYSIEMENET - GLUKOSINOLAATTIEN MÄÄRITYS Suuren erotuskyvyn nestekromatografia 1 SOVELTAMISALA Tässä liitteessä kuvaillaan Brassica-lajin öljysiemenissä olevien eri glukosinolaattien määritysmenetelmä, erityisesti rapsia varten, suuren erotuskyvyn nestekromatografian avulla. Tämä menetelmä ei mittaa glukosinolaatteja, joilla on substituentteja glukoosimolekyylissä, mutta näitä yhdisteitä esiintyy harvoin kaupallisessa rapsissa. 2 VIITTEET Määritettävät näytteet on esikäsiteltävä tähän asetukseen liittyvien liitteiden mukaisesti. Erityisesti seuraavat liitteet ovat tärkeitä: liite II: Sopimusnäytteiden esikäsittely määritettäviksi näytteiksi, liite III: Kosteuspitoisuuden ja haihtuvien aineiden määritys 3 PERIAATE Glukosinolaattien uutto metanoliliuoksessa, sitten puhdistus ja entsymaattinen sulfaattien poisto ioninvaihtohartseilla. Määritys suuren erotuskyvyn nestekromatografialla käänteisfaasista eluutiogradientin avulla ja UV-detektointi. 4 REAGENSSIT JA KEMIALLISET AINEET Kaikkien reagenssien on oltava sopivaa reagenssilaatua ja käytettävän veden on oltava tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa. 4.1 Metanoli, 70 % (V/V) vesiliuos 4.2 Natriumasetaatti, 0,02 mol/l liuos, pH 4,0 4.3 Natriumasetaatti, 0,2 mol/l liuos 4.4 Imidatsoliasetaatti, 6 mol/l liuos Liuotetaan 204 g imidatsolia 113 ml:aan muurahaishappoa 500 ml mittapullossa. Täytetään 500 ml:ksi vedellä. 4.5 Sisäinen standardi Käytetään sinigriiniä (allyyliglukosinolaatti, kaliumsuolan monohydraatti, MW = 415,49), jonka puhtaus on tarkistettava 4.5.3 kohdan mukaisesti. 4.5.1 Sinigriiniliuos, 5 mmol/l Liuotetaan 207,7 mg allyyliglukosinolaattia, kaliumsuolan monohydraattia, veteen 100 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin. 4.5.2 Sinigriiniliuos, 20 mmol/l Liuotetaan 831,0 mg allyyliglukosinolaattia, kaliumsuolan monohydraattia, veteen 100 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin. Varastoidaan nämä liuokset jääkaappiin noin 4 °C lämpötilaan, jos varastointi on lyhytaikainen (esimerkiksi yksi viikko) tai pakastimeen - 18 °C:seen pidemmiksi ajoiksi. 4.5.3 Sinigriinin puhtauden tarkistaminen Käytetään yhtä tai useampaa kolmesta seuraavasta testistä: - tämän menetelmän mukaisen HPLC-määrityksen ei tarvitse antaa kuin yksi pääpiikki, - koskemattoman sinigriinin määrityksen HPLC:lla ("ionipari" -tekniikka) ei tarvitse antaa kuin yksi pääpiikki, - sinigriinin, josta on sulfaatit poistettu ja joka on silyloitu, määrityksen kaasukromatografialla ei tarvitse antaa kuin yksi pääpiikki. Näissä testeissä pääpiikin on vastattava vähintään 98 %:sesti piikkien kokonaispinta-alaa. Vahvistettava myrosinaasilla (tioglukosidiglukohydrolaasi EC 3.2.3.1) tapahtuvan hydrolyysin jälkeen vapautuvan glukoosimäärän määrityksellä. Määritetään glukoosi entymaattisesti käyttäen kaupallisesti saatavaa testipakkausta. On otettava huomioon kaikki esiintyvä vapaa glukoosi, joka määritetään ilman myrosinaasin lisäämistä. Glukoosin määritetyn molaarisen pitoisuuden on vastattava vähintään 98 %:sesti testatun sinigriiniliuoksen molaarista pitoisuutta. 4.5.4 Vaihtoehtoinen sisäinen standardi: glukotropaeoliini Tietyissä Brassica-lajin siemenissä tai samanlaisten lajien siemenissä (viljellyt tai itsestään levinnet) sinigriini voi esiintyä luonnollisessa muodossaan. Kun sinigriini esiintyy luonnollisessa muodossaan, on käytettävä toista sisäistä standardia, glukotropaeoliinia (bentsyyliglukosinolaatti, kaliumsuola, MW = 447,52), mutta tämä on joskus vaikea erottaa muista vähemmistönä esiintyvistä luonnollisista glukosinolaateista. Glukotropaeoliinia käytetään samalla tavoin (liuokset 5 ja 20 mol/l) kuin sinigriiniä, sen jälkeen kun sen puhtaus on tarkistettu 4.5.3 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti, ja kun on varmistettu, että sen vastekerroin vastaa sinigriiniin verrattuna 7.2 kohdassa annettua. 4.6 Liikkuvat faasit 4.6.1 Eluentti A: vesi (HPLC-laatua). 4.6.2 Eluentti B: asetonitriili (HPLC-laatua), 20 % (V/V) liuos vedessä (HPLC-laatua). Pitoisuutta voidaan muuttaa käytettyjen kolonnien mukaisesti. 4.7 Ioninvaihtohartsi 4.7.1 DEAE Sepharose CI-6B suspensiona, myydään käyttövalmiina 4.7.2 DEAE Sephadex A25 -suspensio valmistettuna seuraavalla tavalla: Sekoitetaan 10 g hartsia ylimäärään 2 mol/l etikkahappoa. Annetaan laskeutua. Lisätään 2 mol/l etikkahappoa, kunnes suspension tilavuus on kaksinkertainen laskeutuneeseen geeliin verrattuna. 4.8 Sulfataasi, Helix pomatia tyyppiä H1 (EC 3.1.6.1) ennalta puhdistettuna ja jäljempänä kuvailun menettelyn mukaisesti tarkistettuna, tämän jälkeen laimennettuna. 4.8.1 Ioninvaihtokolonnien valmistelu Leikataan viisi Pasteurpipettiä (5.9) 7 cm kaulan yläpuolelta ja asetetaan lasivillainen tulppa (5.8) kaulaan. Asetetaan pipetit pystysuoraan asentoon telineeseen ja laitetaan jokaiseen näistä DEAE Sepharose C1-6B -ioninvaihtohartsin suspensiota (4.7.1) siten, että veden valuttua pois saadaan tilavuudeksi 500 ìl hartsia. Kaadetaan 1 ml 6 mol/l imidatsoliformaattiliuosta (4.4) kuhunkin pipettiin ja huuhdellaan kaksi kertaa 1 ml:lla vettä. 4.8.2 Sulfataasin puhdistus Punnitaan 0,1 mg tarkkuudella 25 mg Helix pomatia tyyppiä H1, liuotetaan se 2,5 ml:aan vettä ja siirretään 500 ìl saatua liuosta kuhunkin regeneroituun kolonniin (4.8.1). Pestään jokainen kolonni 1,5 ml:lla vettä ja poistetaan ulos virtaava neste. Lisätään sitten 1,5 ml 0,2 mol/l natriumasetaattiliuosta (4.3), otetaan talteen ja yhdistetään näiden viiden kolonnin eluaatit koeputkeen. Väkevöidään eluaatit suodattamalla Millipore PTGC 11K25 suodattimella, kunnes saadaan noin 100 ìl jäännös (sulfataasia, jonka moolimassa on yli 5 000 ei ole poistettu). Lisätään 2,5 ml vettä ja väkevöidään uudelleen suodattamalla, kunnes saadaan noin 100 ìl jäännös. Laimennetaan 2,5 ml:ksi vedellä ja varastoidaan näin puhdistettu sulfataasi pakastimeen - 18 °C:seen (pieninä määrinä, jotta voidaan sulattaa tarvittava määrä välitöntä käyttöä varten). 4.8.3 Sulfataasin aktiivisuuden tarkistaminen 4.8.3.1 Sinigriiniliuoksen, 0,15 mmol/l, valmistus puskuroituna pH-arvoon 5,8 Valmistetaan peräkkäin seuraavat liuokset: a) kaadetaan 1 ml etikkahappoa 500 ml:n pulloon ja täytetään merkkiin vedellä, b) kaadetaan 1 ml etyleenidiamiinia 500 ml:n pulloon ja täytetään merkkiin vedellä, c) sekoitetaan 73 ml liuosta (a) ja 40 ml liuosta (b); d) säädetään pH:ksi 5,8 liuoksilla (a) tai (b). Kaadetaan 3 ml 5 mmol/l sinigriiniliuosta (4.5.1) 100 ml:n pulloon ja täytetään sisältö merkkiin liuoksella (c). 4.8.3.2 Aktiivisuuden tarkistus Yksi aktiivisuusyksikkö ilmaistaan yhden mikromoolin sinigriiniä, josta sulfaatit on poistettu, tuotantona minuutissa 30 °C:ssa pH:n ollessa 5,8. Testiä varten kaadetaan 2 ml puskuroitua sinigriiniliuosta (4.8.3.1) vertailu- ja mittauskennoihin spektrometriin (5.3), jonka aallonpituudeksi on säädetty 228 nm kennojen lämpötilan ollessa 30 °C. Aikahetkellä t = 0 laitetaan 50 ìl puhdistettua sulfataasia (4.8.2) mittauskennoon ja käynnistetään piirturi. Pysäytetään piirturi, kun absorbanssi lakkaa vaihtelemasta (Ae), lasketaan tangentti pisteessä t = 0 ja mitataan sen gradientti Ä A/Ä t. Sulfataasin aktiivisuus ilmaistuna aktiivisuusyksikköinä sulfataasiliuoksen millimetriä kohden on yhtäsuuri kuin: >NUM>Ä A/>DEN>Ä t× >NUM>V/>DEN>Ä E× >NUM>1 000/>DEN>50× 106 kaavassa: >TAULUKON PAIKKA> Ä E = >NUM>Ä Ae/>DEN>e × c kaavassa: >TAULUKON PAIKKA> Sinigriinin sulfaatinpoiston saanto tasapainopisteessä on 0,95. Lasketaan Ä E, jonka on oltava suuruusluokkaa 1 500 l. mol-1. cm-1. Sulfataasin aktiivisuus voidaan laskea myös seuraavan yksinkertaistetun kaavan avulla: Aktiivisuus = >NUM>Ä A D × 5,7/ >DEN>Ä t × Ä Ae Puhdistetun sulfataasiliuoksen (4.8.2) löydetyn aktiivisuuden on oltava suurempi kuin 0,5 ìmol/min.ml. 4.8.4 Laimentaminen Siirretään pipetin avulla 1 ml puhdistettua sulfataasia (4.8.2) 10 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin vedellä ja sekoitetaan. Jaetaan liuos pieniin määriin ja varastoidaan - 18 °C:ssa. 5 VÄLINEISTÖ Tavanomainen laboratoriolaitteisto ja erityisesti: 5.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jolla eluutiogradientin saaminen on mahdollista ja kolonnin lämpötila voidaan säätää 30 °C:seen, liitettynä UV-detektoriin, jolla voidaan mitata aallonpituudella 229 nm. 5.2 Kolonni HPLC-kromatografiaa varten, tyyppiä C18 tai C8, ja jonka hiukkaskoko on enintään 5 ìm, eli esimerkiksi: >TAULUKON PAIKKA> Valitun kolonnin suorituskyky on tarkastettava säännöllisesti, mieluiten rapsin vertailunäytteen avulla (suositellaan desulfoglukosinolaatteja, jotka on mieluiten saatu yhteisön vertailumittaustoimiston näytteistä). Erityisesti kolonni ei saa hajottaa 4-hydroksiglukobrassikiinia, joka on tärkeä, mutta suhteellisen pysymätön glukosinolaatti. Uusia kolonneja on käytettävä ennakkoon ennen kuin on mahdollista saada uusittavia tuloksia. 5.3 Kaksoissädespektrometri, jolla on mahdollista työskennellä ultraviolettialueella ja, jos mahdollista, 30 °C:seen säädetyssä lämpötilassa, varustettuna kvartsikennoilla ja jos mahdollista, piirturijärjestelmällä. 5.4 Pieni jauhin, esimerkiksi kahvimylly. 5.5 Sentrifugi, 6 ml:n putkille tarkoitettu, jolla on mahdollista saavuttaa 5 000 g:n keskipakoiskiihtyvyys. 5.6 Vesihaude tai kuumennusyksikkö, säädettävissä 75 °C:seen. 5.7 Polypropeeniputkia, tilavuus 6 ml. 5.8 Lasivillaa. 5.9 Pasteurpipettejä, pituus 150 mm. 6 MENETTELY 6.1 Koenäytteen esikäsittely Esikäsitellään laboratorionäyte liitteen II mukaisesti ja jauhetaan mikrojauhimella (5.4) 20 sekunnin ajan. Sekoitetaan jauho ja jauhetaan uudelleen viiden sekunnin ajan. Jos siementen kosteuspitoisuus on suurempi kuin 10 % (m/m), kuivataan ne ennalta 45 °C:n ilmavirrassa. Huomautus: Jos määritetään käsiteltyjä siemeniä, pestään ne dikloorimetaanilla ennen jauhamista. 6.2 Kosteuden ja haihtuvien aineiden pitoisuusmääritys Määritetään kosteuden ja haihtuvien aineiden pitoisuus koenäytteestä liitteen III mukaisesti. 6.3 Näyte Otetaan kaksi putkea (5.7) ja laitetaan kumpaankin 200 mg määritettävää öljysiemennäytettä, punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella. 6.4 Glukosinolaattien uutto Asetetaan putket vesihauteeseen tai kuumennusyksikköön (5.6), joka on säädetty 75 °C:seen, yhdeksi minuutiksi. Lisätään 2 ml kiehuvaa 70 % metanoliliuosta (4.1) minkä jälkeen lisätään välittömästi: - ensimmäiseen putkeen A, 200 ìl 5 mmol/l sinigriiniliuosta, - toiseen putkeen B, 200 ìl 20 mmol/l sinigriiniliuosta (4.5.2). Pidetään kuumassa 75 °C:seen säädetyssä vesihauteessa 10 minuuttia säännöllisesti ravistellen. Sekoitetaan kummankin putken sisältö ja sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 5 000 g kolmen minuutin ajan. Siirretään kumpikin kelluva jae toiseen putkeen (5.7). Lisätään 2 ml kiehuvaa 70 % metanoliliuosta (4.1) kumpaankin pohjasakkaan ja kuumennetaan uudelleen 75 °C:seen säädetyssä vesihauteessa 10 minuuttia säännöllisesti ravistellen. Sentrifugoidaan kolmen minuutin ajan ja lisätään kelluva jae alkuperäiseen. Säädetään tilavuudeksi noin 5 ml veden avulla ja sekoitetaan. Uutetta voidaan varastoida kuusi viikkoa pimeässä, - 18 °C:seen säädetyssä pakastimessa. 6.5 Ioninvaihtokolonnien valmistelu Valitaan haluttu määrä pasteurpipettejä (5.9), eli pipetti näytettä kohden, siten että jätetään 1,2 ml tilavuus kaulan yläpuolelle ja laitetaan lasivillatulppa (5.8) kaulaan. Asetetaan pipetit pystysuoraan asentoon telineeseen. Kaadetaan 0,5 ml hyvin sekoitettua DEAE Sephadex A 25 suspensiota (4.7.2) jokaiseen kolonniin, annetaan laskeutua ja valua. Huuhdellaan kolonnit 2 ml:lla 6 mol/l imidatsoliformiaattia (4.4), sitten kaksi kertaa 1 ml:lla vettä. 6.6 Puhdistus ja sulfaattien poisto Kaadetaan 1 ml uutetta (6.4) valmistettuun kolonniin (6.5) hartsipintaan koskematta ja annetaan valua. Lisätään kaksi kertaa 1 ml 0,02 mol/l natriumasetaattipuskuria, jonka pH on 4,0 (4.2) ja annetaan valua kummallakin kerralla. Kaadetaan 75 ìl laimennettua ja puhdistettua sulfataasiliuosta (4.8.4). Annetaan seistä yön yli huoneenlämmössä. Eluoidaan saadut desulfoglukosinolaatit kahteen kertaan 1 ml:lla vettä (HPLC-laatua) antaen valua kummankin lisäyksen välillä. Kerätään eluaatti putkeen. Sekoitetaan eluaatti hyvin ja varastoidaan pimeässä - 18 °C:seen säädetyssä pakastimessa, jos sitä ei tarvita välittömästi kromatografiaa varten. 6.7 Vertailunäyte Tarvittaessa (ks. 7.3) suoritetaan vertailukoe samoissa olosuhteissa täsmälleen samasta koenäytteestä, mutta jättäen sinigriinin sisäinen standardiliuos pois siten, että kaikki koenäytteessä mahdollisesti esiintyvä sinigriini voidaan havaita ja sen määrä määrittää. 6.8 Kromatografia 6.8.1 Laitteiston säätäminen Liikkuvan faasin virtausnopeus: riippuu kolonnin luonteesta (ks. 6.8.2) Kolonnin lämpötila: 30 °C Detektioaallonpituus: 229 nm 6.8.2 Koe ja eluutiogradientti Ottaen huomioon laitteiston käyttöohjeet injektoidaan enintään 50 ìl 6.6 kohdassa saatua desulfoglukosinolaattiliuosta. Käytetyn kolonnin mukaisesti erilaiset gradientit voivat soveltua. - Spherisorb RP18 5 ìm -kolonni (150 mm × 4,6 mm): - 100 % eluentti A (4.6.1) + 0 % eluentti B (4.6.2) yhdessä minuutissa, - lineaarinen eluutiogradientti 20 minuutissa, kunnes saadaan 0 % eluentti A ja 100 % eluentti B, - lineaarinen eluutiogradientti 5 minuutissa, kunnes saadaan 100 % eluentti A ja 0 % eluentti B, - 100 % eluentti A ja 0 % eluentti B 5 minuutissa tasapainon saavuttamiseksi. - Lichrospher RP8 5 ìm -kolonni (125 mm × 4,0 mm): - 100 % eluentti A 2 minuutissa 30 sekunnissa, - lineaarinen eluutiogradientti 18 minuutissa, kunnes 0 % eluentti A + 100 % eluentti B, - 100 % eluentti B 5 minuutissa, - lineaarinen eluutiogradientti kahdessa minuutissa 0 %:sta eluenttia A + 100 %:sta eluenttia B, kunnes saadaan 100 % eluenttia A ja 0 % eluenttia B, - tasapainottuminen 5 minuutissa. Huomautus: Gradienttien profiilia voidaan muuttaa käytettyjen kolonnien mukaisesti optimaalisten erottumisten saavuttamiseksi. 6.8.3 Kromatogrammien tarkastelu Otetaan huomioon vain glukosinolaattipiikit, joiden pinta-ala on suurempi kuin 1 % piikkien kokonaispinta-alasta. Eluutiopiikkien järjestys C18-tyyppisellä kolonnilla ja 6.8.2 kohdassa annetulla eluutiogradientilla on yleensä seuraava: >VIITTAUS KAAVIOON> 7 TULOSTEN ILMAISEMINEN 7.1 Kunkin glukosinolaattipitoisuuden laskeminen Kunkin glukosinolaatin pitoisuus mikromooleina grammaa kuivattuja kokonaisia siemeniä kohden ilmaistuna on yhtä suuri kuin: >NUM>desulfoglukosinolaattipiikin pinta-ala/>DEN>desulfosinigriinipiikin pinta-ala× >NUM>6.4 kohdassa putkeen lisätyn sisäien standardin määrä (ìmooleina)/>DEN>siemenuutenäytteen paino × desulfoglukosinolaatin vastekerroin (7.2) × >NUM>100/>DEN>100 - H jossa: H on koenäytteessä (6.2) olevan veden ja haihtuvien aineiden pitoisuus (paino) prosentteina ilmaistuna. Tietyissä tapauksissa tulosten ilmaiseminen vaaditaan määrätyllä kosteustasolla (tällä hetkellä 9 %). Tällaisissa tapauksissa kuivalle aineelle saatu tulos kerrotaan tekijällä >NUM>(100 - kosteus)/>DEN>100 7.2 Vastekertoimet Vastekertoimien arvot on määritetty kokeellisesti; tämä arvo on vahvistettu yhteisellä sopimuksella eri laboratorioiden kesken, jotka ovat osallistuneet menetelmän laatimiseen ja voi olla tarpeen suorittaa sen virallinen tarkistus hyvissä ajoin. >TAULUKON PAIKKA> 7.3 Glukosinolaattien kokonaispitoisuus Glukosinolaattien kokonaispitoisuus mikromooleina grammaa näytteen kuiva-ainetta kohden ilmaistuna on yhtä suuri kuin kaikkien glukosinolaattien summa, vastaavien piikkien pinta-alat, jotka ovat suuremmat kuin 1 % piikkien pinta-alojen summasta. Sisäisten standardien käyttö kahdella pitoisuudella (4.5.1 ja 4.5.2) mahdollistaa sen, että voidaan ottaa huomioon näytteen sisältämän alkuperäisen sinigriinin tai sinigriinin kanssa samanaikaisesti eluoituvan tuntemattoman yhdisteen esiintyminen. - Jos kahden toistokokeen glukosinolaattien kokonaispitoisuuksien tulosten välinen ero täyttää toistettavuuden edellytykset (8.2), sisäisessä standardissa ei ole epäpuhtautta. Tulos on kahden määrityksen aritmeettinen keskiarvo. - Jos tulosten välinen ero ei täytä toistettavuuden edellytyksiä (8.2), toistetaan määritys kahdella muulla koenäytteellä ja suoritetaan vertailukoe (6.7) jättäen sisäinen standardiliuos pois. Epäpuhtauden pinta-ala vähennetään sisäisen standardin pinta-alasta, joka antaa 7.1 kohdassa annetussa kaavassa käytetyn sisäisen standardin todellisen pinta-alan. Tulos on näiden kahden uuden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo. 8 TOISTOTARKKUUS JA TARKKUUS 8.1 Toistotarkkuus (toistettavuus ja uusittavuus) Kansainvälinen laboratorioiden välinen vuonna 1988 järjestetty tutkimus, johon osallistui kaksitoista laboratoriota, joista jokainen suoritti kaksi määritystä neljästä rapsinäytteestä, antaa taulukossa 1 esitetyt arvot toistettavuudelle ja uusittavuudelle. Tulokset arvioitiin standardin ISO 5725 mukaisesti (Tilastollinen soveltaminen - koemenetelmien tarkkuus - laboratorioiden välisten kokeiden avulla standardisoitu koemenetelmän määrittely). >TAULUKON PAIKKA> 8.1.1 Toistettavuus Edellä esitettyjen tulosten (8.1) mukaisesti kahden välittömästi peräkkäin suoritetun, saman henkilön samalla laitteistolla samasta koenäytteestä suoritetun määrityksen arvojen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 2 mikromoolia/g pitoisuuksien ollessa pienemmät kuin 20 mikromoolia/g ja 4 mikromoolia/g pitoisuuksien ollessa 20-35 mikromoolia/g. 8.1.2 Uusittavuus Edellä esitettyjen tulosten (8.1) mukaisesti kahden laboratorion, jotka käyttävät tämänhetkistä määritysmenetelmää saman laboratorionäytteen määritykseen, saaman lopputuloksen arvojen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 4 mikromoolia/g pitoisuuksien ollessa pienemmät kuin 20 mikromoolia/g ja 8 mikromoolia/g pitoisuuksien ollessa 20-35 mikromoolia/g. 8.2 Tarkkuus Menetelmän virheetön noudattaminen tarkastetaan suorittamalla toistuvia mittauksia vertailuaineilla, joiden glukosinolaattien kokonaispitoisuus on varmistettu ja jotka kattavat kyseeseen tulevan pitoisuusalueen. Sopivia pitoisuudeltaan varmistettuja vertailuaineita on saatavana Euroopan yhteisöjen komission yhteisön vertailumittaustoimistolta (BCR). Menettelytapa saatujen laboratoriotulosten ja pitoisuudeltaan varmistettujen vertailuaineiden vertailemiseksi kuvaillaan vertailuaineen mukana seuraavan selosteen kappaleessa "instruction for use". 9 KOESELOSTE Koeselosteessa on ilmoitettava käytetty menetelmä ja saatu tulos. On mainittava myös kaikki kansainvälisessä standardissa määrittelemättömät tai valinnaisina pidetyt toiminnot, sekä kaikki tiedot, joilla on mahdollisesti vaikutusta tulokseen. Koeselosteen on annettava kaikki tarvittavat tiedot näytteen täydelliseksi tunnistamiseksi."