Viides komission direktiivi 74/203/ETY annettu 25 päivänä maaliskuuta 1974 yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten



Virallinen lehti nro L 108 , 22/04/1974 s. 0007 - 0024

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 5 s. 0210

Kreikank. erityispainos: Luku 03 Nide 10 s. 0168

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 5 s. 0210

Espanjank. erityispainos: Luku 03 Nide 7 s. 0191

Portugalink. erityispainos: Luku 03 Nide 7 s. 0191



VIIDES KOMISSION DIREKTIIVI annettu 25 päivänä maaliskuuta 1974 yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten (74/203/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin(1), sellaisena kun se on viimeksi muutettuna uusien jäsenvaltioiden Euroopan talousyhteisöön ja Euroopan atomienergiayhteisöön liittymisestä Brysselissä 22 päivänä tammikuuta 1972 allekirjoitettuun sopimukseen(2) liitetyllä asiakirjalla(3), ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että edellä mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorittamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmää käyttäen sen todentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten rehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi, useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetulla komission direktiivillä 71/250/ETY(4), 18 päivänä marraskuuta annetulla komission direktiivillä 71/393/ETY(5), 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla komission direktiivillä 72/199/ETY(6) ja 5 päivänä joulukuuta 1972 annetulla komission direktiivillä 73/46/ETY(7); työ on tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä viides ryhmä menetelmiä, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät tärkkelyksen ja suurimolekyylisten tärkkelyksen pilkkoutumistuotteiden pitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä I esitetyn menetelmän mukaisesti rehuista, jotka sisältävät juurikasleikettä, juurikaspulppaa, kuivattuja juurikkaan varsia tai lehtiä, perupulppaa, kuivahiivaa, runsaasti inuliinia tai tali- ja rasvajätteitä sisältäviä tuotteita. Tämän direktiivin liitteessä I esitettyihin menetelmiin sovelletaan 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetun ensimmäisen komission direktiivin 71/250/ETY liitteessä olevassa I osassa (Johdanto) olevia yleisiä määräyksiä. 2 artikla Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa niiden amprolium-, etopabaatti-, dinitolmidi- (DOT-), nikarbatsiini- ja menadioni- (K3-vitamiini-) pitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä II esitettyjä menetelmiä noudattaen. Tämän direktiivin liitteessä II esitettyihin menetelmiin on sovellettava 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetun ensimmäisen komission direktiivin 71/250/ETY liitteessä olevan 1 osan (Johdanto) yleisiä määräyksiä, lukuun ottamatta näytteen esikäsittelyä koskevia määräyksiä. 3 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä marraskuuta 1974. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 4 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 25 päivänä maaliskuuta 1974. Komission puolesta Puheenjohtaja Francois-Xavier ORTOLI (1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2 (2) EYVL N:o L 73, 27.3.1972, s. 14 (3) EYVL N:o L 73, 27.3.1972, s. 5 (4) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13 (5) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7 (6) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6 (7) EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21 LIITE I TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS pankreatiinimenetelmä 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää tärkkelyksen ja sen suurimolekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa, jotka sisältävät juurikasleikettä, juurikasmassaa, juurikkaan kuivattuja lehtiä tai varsia, perunamassaa, kuivahiivaa, runsaasti inuliinia (esim. juurikasleikkeet ja mukula-artisokkajauho) ja rasvajätteitä sisältäviä tuotteita. Määritys on tehtävä vain silloin, kun näytteen mikroskooppisessa tutkimuksessa on havaittu huomattavia määriä tärkkelystä. 2. Periaate Näytteessä olevat sokerit uutetaan etanolilla. Uutetussa jäännöksessä oleva tärkkelys pelkistetään sokeriksi pankreatiinilla. Muodostuneet sokerit hydrolysoidaan kloorivetyhapolla ja muodostunut glukoosi määritetään Luff-Schoorlin menetelmällä. Näin saadusta glukoosimäärästä saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus kertomalla vakiotekijällä. 3. Reagenssit 3.1 90 % (v/v) etanoli, neutraali fenoliftaleiinilla todettuna. 3.2 Pentan-1-oi (amyylialkoholi), analyysilaatua. 3.3 Tolueeni, analyysilaatua. 3.4 Puskuriliuos: liuotetaan veteen 9,078 g kaliumdivetyfosfaattia KH2PO4 ja 11,876 g dinatriumvetyfosfaattia Na2HPO4 7± 2 H2O. Täytetään litraksi vedellä. 3.5 0,2 N natriumkloridiliuos. 3.6 Carrez-liuos I: liuotetaan veteen 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 7 2 H2O ja 3 g jääetikkaa. Täytetään 100 ml:ksi vedellä. 3.7 Carrez-liuos II: liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4[Fe(CN6)] 7 3H2O. Täytetään 100 ml:ksi vedellä. 3.8 1 N kloorivetyhappo. 3.9 noin 8 N kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,125. 3.10 noin 10 N natriumhydroksidiliuos, tiheys 1,33. 3.11 Indikaattori: 0,1 % (w/v) metyylioranssiliuos. 3.12 Jauhemainen pankreatiini, valmistettu 8 kohdassa esitettyjen ohjeiden mukaan. Säilytetään tulpallisissa pulloissa valolta ja kosteudelta suojattuna. 3.13 Luff-Schoorlin reagenssi: kaadetaan sitruunahappoliuos (3.13.2.) natriumkarbonaattiliuokseen (3.13.3) sekoittaen varovasti lisäyksen aikana. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.13.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (0,1 N Cu, 2 N Na2CO3) normaalisuus tarkistetaan. Liuoksen pH:n tulisi olla noin 9,4. 3.13.1 Kuparisulfaattiliuos: liuotetaan 25 g kuparisulfaattia, analyysilaatua CuSO4 7 5H2O 100 ml:aan vettä. 3.13.2 Sitruunahappoliuos: 50 g sitruunahappoa, analyysilaatua, C6H8O7 7 H2O, liuotetaan 50 ml:aan vettä. 3.13.3 Natriumkarbonaattiliuos: liuotetaan 143,8 g vedetöntä natriumkarbonaattia. analyysilaatua noin 300 ml:aan kuumaa vettä. Annetaan jäähtyä. 3.14 Hohkakivirakeita, jotka on puhdistettu keittämällä niitä kloorivetyhapossa, pesemällä vedellä ja kuivaamalla. 3.15 30 % (w/v) kaliumjodidiliuos. 3.16 noin 6 N rikkihappo, tiheys 1,18. 3.17 0,1 N natriumtiosulfaattiliuos. 3.18 Tärkkelysliuos: 5 g liukoista tärkkelystä liuotettuna 30 ml:aan vettä lisätään 1 litraan kiehuvaa vettä. Keitetään kolme minuuttia, annetaan jäähtyä. Tämän liuoksen pitää olla juuri valmistettua. 4. Välineistö 4.1 Uuttolaite (ks. sivulla 12 oleva kaavio), jossa on: 4.1.1 Leveäkaulainen 500 ml:n erlenmeyerkolvi; 4.1.2 Palautusjäähdytin, joka on liitetty tulpalla erlenmeyerkolviin; 4.1.3 Palautusjäähdyttimen keskellä oleva liikutettava puikko, jonka alapäässä on koukku. Pyykkipoika, jolla koukkua pidetään tukevasti paikallaan. 4.1.4 Metallipidike, joka riippuu puikon koukussa (4.1.3) ja pitää suodatinupokasta (4.1.5) paikallaan. 4.1.5 Suodatinupokas nopeaa suodatusta varten; huokosten suurin koko 90 150 µm (esim. huokoisuus yksi), tilavuus noin 30 ml. 4.1.6 Suodatinpapereita, jotka muodoltaan ja kooltaan sopivat suodatinupokkaaseen (4.1.5). 4.2 Inkubaattori, joka on säädetty 38 °C:n lämpötilaan. 4.3 200 ml:n mittapulloja, joissa on vakiohios ja joihin liitetään palautusjäähdytin. 4.4 100 ml:n mittapulloja, joissa on vakiohios ja joihin liitetään palautusjäähdytin. 5. Menettely 5.1 Näytteen esikäsittely Näyte jauhetaan hienoksi siten, että se kokonaisuudessaan läpäisee 0,5 mm:n seulan (ISO R 565 mukainen seula). 5.2 Uutto Punnitaan milligramman tarkkuudella 2 g näytettä ja siirretään se suodatinupokkaaseen (4.1.5), jonka pohja on ensin peitetty etanolilla (3.1) kostutetulla suodatinpaperilla (4.1.6). Erlenmeyerkolviin (4.1.1) lisätään 55 ml etanolia (3.1) ja muutama rae hohkakiveä (3.14). Suodatinupokas asetetaan metallipidikkeeseen (4.1.4) ja ripustetaan puikon koukkuun (4.1.3). Palautusjäähdytin kiinnitetään erlenmeyerkolviin ja puikko lasketaan siten, että upokkaan pohja koskettaa juuri etanolin pintaa. Puikko kiinnitetään pyykkipojalla tukevasti tälle tasolle. Etanoli kuumennetaan kiehumispisteeseen ja sen annetaan kiehua kolmen tunnin ajan. Annetaan sitten jäähtyä ja puikko (4.1.3) kohotetaan erlenmeyerkolvissa olevan upokkaan nostamiseksi mahdollisimman korkealle. Erlenmeyerkolvin tulppa irrotetaan varovasti ja lisätään 45 ml vettä valuttaen sitä kolvin kylkeä pitkin. Palautusjäähdytin kiinnitetään uudestaan erlenmeyerkolviin ja suodatinupokasta pidetään 10 cm nesteen pinnan yläpuolella. Neste kuumennetaan kiehumispisteeseen ja sen annetaan kiehua kolmen tunnin ajan. Annetaan sitten jäähtyä, erlenmeyerkolvin tulppa irrotetaan ja upokas poistetaan pidikkeestä. 5.3 Sokeroiminen ja hydrolyysi Upokas asetetaan tyhjiöpulloon ja kuivataan imun avulla. Uuttojäännös siirretään huhmareeseen ja jauhetaan hienoksi. Jauhe siirretään kvantitatiivisesti noin 60 ml:lla vettä 200 ml:n hiokselliseen mittapulloon ja lisätään muutama pisara amyylialkoholia (3.2). Pulloon kiinnitetään palautusjäähdytin. Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua yhden tunnin ajan. Annetaan sitten jäähtyä ja palautusjäähdytin irrotetaan. Lisätään 25 ml puskuriliuosta (3.4), 250 mg pankreatiinia (3.12), 2,5 ml natriumkloridiliuosta (3.5) ja 10 tippaa tolueenia (3.3). Ravistellaan 2 minuutin ajan, pullo pannaan inkubaattoriin (4.2) ja pidetään siellä 21 tuntia ravistellen ajoittain. Tämän jälkeen pullon annetaan jäähtyä huoneenlämpöön. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.6) ja ravistellaan minuutin ajan. Tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.7) ja ravistellaan taas minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan. Pipetoidaan 50 ml suodosta 100 ml:n mittapulloon (voidaan myös pipetoida 100 ml suodosta 200 ml:n mittapulloon). Lisätään muutama pisara indikaattoriliuosta (3.11) ja sen jälkeen 8 N kloorivetyhappoa (3.9), kunnes indikaattori muuttuu punaiseksi. Tämän jälkeen lisätään ylimääräinen 6,25 ml 8 N kloorivetyhappoa (3.9) (12,50 ml mikäli suodosta on 100 ml). Pulloon kiinnitetään palautusjäähdytin, liuos kuumennetaan kiehuvaksi ja sen annetaan kiehua tunnin ajan. Annetaan jäähtyä, neutraloidaan 10 N natriumhydroksidiliuoksella (3.10), kunnes indikaattori muuttuu keltaiseksi. Tämän jälkeen liuos tehdään hieman happameksi lisäämällä pieni määrä 1 N kloorivetyhappoa (3.8), pullo täytetään vedellä ja sekoitetaan. Glukoosipitoisuus määritetään Luff-Schoorlin menetelmällä 5.4 kohdan mukaisesti. 5.4 Luff-Schoorlin titraus Pipetoidaan 25 ml Luff-Schoorlin reagenssia (3.13) 300 ml:n erlenmeyerkolviin; lisätään tarkalleen 25 ml 5.3 kohdassa saatua liuosta, tämän ei pitäisi sisältää enempää kuin 60 mg glukoosia. Lisätään kaksi hohkakiviraetta (3.14), kuumennetaan, samalla ravistellen, kiehumispisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä. Asbestiverkon alla on etukäteen sytytetty liekki ja se säädetään sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin. Heti kun tämä on tehty, keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti: Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.15) ja välittömästi tämän jälkeen varovasti (koska tällöin esiintyy huomattavan vaahtoamisen vaara) 25 ml 6 N rikkihappoa (3.16). Tämän jälkeen titrataan 0,1 N natriumtiosulfaattiliuoksella (3.17), kunnes väri muuttuu himmeän keltaiseksi, lisätään muutama pisara tärkkelysindikaattoria (3.18) ja titraus suoritetaan loppuun. Samalla tavalla titrataan tarkkaan mitattu seos, jossa on 25 ml Luff-Schoorlin reagenssia (3.13) ja 25 ml vettä, 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.15) ja 25 ml 6 N rikkihappoa (3.16), lämpötilaa ei kohoteta kiehumispisteeseen. 5.5 Sokeakoe Tehdään sokeakoe 5.3 ja 5.4 kohdan mukaisesti mutta ilman näytettä. 6. Tulosten laskeminen Liitteessä olevan taulukon avulla saadaan näiden kahden titrauksen tulosten (0,1 N natriumtiosulfaatin kuluma millilitroina) erotuksesta glukoosimäärä milligrammoina sekä analysoitavalla näytteellä että sokeakokeella. Näytteen tärkkelyspitoisuus prosentteina saadaan kaavasta: 0,72 (a b), jossa: a = näytettä vastaava glukoosin määrä milligrammoina; b = sokeakoetta (ks. huomautus 7.2) vastaava glukoosin määrä milligrammoina. 7. Huomautukset 7.1 Silloin kun näytteessä esiintyy samanaikaisesti osittain tai täysin dekstriiniksi muunnettua tärkkelystä tai laktoosia, tulos voi olla 0,5 3,0 % todellista suurempi. Näissä tapauksissa todellinen tärkkelysmäärä saadaan seuraavasti: a) Määritetään 5.2 kohdan mukaan saadussa etanoliuutteessa olevien pelkistävien sokerien määrä ja ilmoitetaan tulokset prosentteina glukoosia; b) Määritetään näytteessä olevien vesiliukoisten pelkistävien sokerien määrä ja ilmoitetaan tulokset prosentteina glukoosia; c) Vähennetään a kohdassa saatu tulos b kohdassa saadusta tuloksesta ja kerrotaan erotus luvulla 0,9; d) Vähennetään c kohdassa saatu arvo menetelmää käyttäen saadusta tärkkelyspitoisuudesta ja lasketaan tulokset 6 kohdassa esitetyllä tavalla. 7.2 Glukoosin määrä sokeakokeessa on tavallisesti 0,25 mg. Se ei saa ylittää 0,50 mg:aa. 8. Pankreatiinia koskevat ohjeet Fysikaalinen ulkonäkö: kellanvalkea, amorfinen jauhe. Glukoosipitoisuus: nollakokeen (ks. 5.5 kohta) glukoosimäärä on tavallisesti 0,25 mg. Tulos, joka ylittää 0,50 mg, viittaa siihen, että pankreatiinia ei voi enää käyttää. Jodin kulutuksen tarkistus: suspendoidaan 62,5 mg pankreatiinia noin 50 ml:aan vettä, joka on lämmitetty 25 30 °C:seen. Lisätään 1 ml 0,1 N jodiliuosta. Sekoitetaan 2 minuuttia. Titrataan 0,1 N natriumtiosulfaattiliuoksella tärkkelysindikaattorin läsnä ollessa. Pankreatiinin jodikulutus ei saa ylittää 0,5 ml. Amylolyyttisen aktiivisuuden tarkistus: sekoitetaan keskenään 100 ml tärkkelysliuosta (3.18), 5 ml puskuriliuosta (3.4), 0,5 ml natriumkloridiliuosta (3.5) ja 62,5 mg pankreatiinia. Seos lämmitetään 25 30 °C:seen, sekoitetaan kaksi minuuttia. Lisätään 1 ml 0,1 N jodiliuosta. Sinisen värin täytyy hävitä 15 minuutin kuluessa jodiliuoksen lisäämisestä. >TAULUKON PAIKKA> >VIITTAUS FILMIIN> LIITE II 1. AMPROLIUMIN MÄÄRITYS [1-(4-amino-2-propyyli-5-pyrimidyylimetyyli-2-pikoliinikloridin hydrokloridi] 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää amproliumin pitoisuus rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 40 mg/kg. 2. Periaate Näyte uutetaan laimealla metanolilla. Uute puhdistetaan alumiinioksidipylväällä ja käsitellään 2,7-dihydroksinaftaleenia, kaliumferrisyanidia, kaliumsyanidia ja natriumhydroksidia sisältävällä metanoliliuoksella, jolloin muodostuu purppuranvärinen kompleksi. Amprolium määritetään spektrofotometrisesti 530 nm:ssä. 3. Reagenssit 3.1 Metanoli, analyysilaatua. 3.2 Laimennettu metanoli: sekoitetaan 2 osaa metanolia (3.1) ja 1 osa vettä. 3.3 0,2 % (w/v) kaliumferrisyanidiliuos K3 Fe (CN)6, analyysilaatua. Liuos säilyy muuttumattomana kaksi viikkoa. 3.4 1 % (w/v) kaliumsyanidiliuos, analyysilaatua. Liuos säilyy 2 viikkoa. 3.5 1,125 % (w/v) natriumhydroksidiliuos, analyysilaatua. 3.6 Natriumhydroksidi-metanoli-liuos: laimennetaan 15 ml liuosta (3.5) 200 ml:ksi metanolilla (3.1). 3.7 0,0025 % (w/v) 2,7-dihydroksinaftaleeniliuos: liuotetaan 25 mg 2,7-dihydroksinaftaleenia, analyysilaatua metanoliin (3.1) 1 000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin metanolilla (3.1). 3.8 Värireagenssi: Pannaan 90 ml 2,7-dihydroksinaftaleeniliuosta (3.7) 250 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1), lisätään 5 ml kaliumferrisyanidiliuosta (3.3) ja homogenoidaan. Tämän jälkeen lisätään 5 ml kaliumsyanidiliuosta (3.4), pullo suljetaan tulpalla ja homogenoidaan. Annetaan seistä 30 35 minuuttia, lisätään 100 ml natriumhydroksidi-metanoli-liuosta (3.6), homogenoidaan ja suodatetaan suodatinupokkaan läpi (4.3). Tämä reagenssi käytetään 75 minuutin kuluessa suodattamisesta. 3.9 Pylväskromatografiaan käytettävä alumiinioksidi. Ennen käyttöä sekoitetaan 30 minuutin ajan 100 g alumiinioksidia 500 ml:aan vettä, liete suodatetaan, alumiinioksidi pestään suodattimella kolme kertaa 50 ml:lla metanolia (3.1) imemällä kuiviin joka kerta, annetaan seistä yön yli ja tämän jälkeen kuivataan vakuumissa kaksi tuntia 100 °C:ssa. Siirretään eksikaattoriin jäähtymään. Alumiinioksidin käyttökelpoisuus tarkistetaan tekemällä 5.2 kohdasta lähtien määritys tietyllä määrällä standardiliuosta (3.11). Amproliumin saannon on oltava 100 ± 4 %. 3.10 Standardiyhdiste: puhdas amprolium, joka täyttää seuraavat vaatimukset. Sulamispiste (hajoaa): 248 °C. Molekulaarinen ekstinktiokerroin sekä 265 että 235 nm:ssa tislatussa vedessä 11,0 × 103. 3.11 Standardiliuos: punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 50 mg standardiainetta (3.10). Liuotetaan laimeaan metanoliin (3.2) 500 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin samalla liuottimella ja homogenoidaan. Laimennetaan 10,0 ml edellistä liuosta 50 ml:ksi laimennetulla metanolilla (3.2) ja homogenoidaan. 1 ml tätä liuosta sisältää 20 µg amproliumia. 4. Välineistö 4.1 50, 250 ja 500 ml:n hiostulpallisia erlenmeyerkolveja. 4.2 Sekoitin. 4.3 Suodatinupokas, huokoskoko G3, läpimitta 60 mm. 4.4 Lasisia kromatografiapylväitä (sisäläpimitta 9 mm, pituus 400 500 mm). 4.5 Sentrifugi, johon sopii hiostulpalliset 25 ml:n putket. 4.6 Spektrofotometri, 10 mm:n kyvetit. 5. Menettely 5.1 Uutto ja puhdistus 5.1.1 Rehut ja esiseokset Punnitaan milligramman tarkkuudella 10 g hienoksi jauhettua ja homogenoitua näytettä. Esiseosta punnitaan 3 6 g milligramman tarkkuudella. Analysoitava näyte siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1) ja lisätään tarkalleen 100 ml laimennettua metanolia (3.2). Ravistellaan 60 minuutin ajan ja suodatetaan. Tarvittaessa laimennetaan laimealla metanolilla (3.2), jotta saadaan liuos, joka sisältää 5 15 µg amproliumia millilitrassa. Kromatografiapylvään (4.4) alapäähän asetetaan puuvillatuppo ja tämän päälle pakataan tiiviisti 5 g alumiinioksidia (3.9) ja tämän päälle pipetoidaan 25,0 ml uutetta. Nesteen annetaan valua pylvään läpi, ensimmäiset 5 ml heitetään pois ja seuraavat 12 ml otetaan talteen asteikolliseen koeputkeen. 5.1.2 Konsentraatit Punnitaan milligramman tarkkuudella 0,5 g hienoksi jauhettua ja homogenoitua näytettä 500 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1), lisätään 250 ml laimeaa metanolia (3.2), ravistellaan 60 minuuttia ja suodatetaan. Laimennetaan 5,0 ml:n erä suodosta mittapullossa 200 ml:ksi laimealla metanolilla (3.2). 5.2 Värin kehitys ja absorbanssin mittaus Pipetoidaan 5,0 ml 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa saatua liuosta sentrifugiputkeen A (4.5) ja 5,0 ml laimennettua metanolia (3.2) sentrifugiputkeen B (4.5). Kumpaankin putkeen lisätään 10,0 ml värireagenssia (3.8), putket suljetaan tulpalla, homogenoidaan ja annetaan seistä 18 minuuttia. Tämän jälkeen sentrifugoidaan kolme minuuttia kirkkaan liuoksen aikaansaamiseksi ja liuokset A ja B dekantoidaan 50 ml:n erlenmeyerkolveihin (4.1). Liuoksen A absorbanssi mitataan välittömästi spektrofotometrillä 530 nm:ssa käyttäen liuosta B nollanäytteenä. Amproliumin määrä saadaan standardikäyrältä (5.3). 5.3 Standardikäyrä Kuhunkin sentrifugiputkeen (4.5) pipetoidaan erikseen 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ja 5,0 ml standardiliuosta (3.11). Täytetään ensimmäiset neljä putkea 5,0 ml:ksi laimealla metanolilla (3.2). Kaikkiin viiteen putkeen lisätään 10,0 ml värireagenssia (3.8), putket suljetaan tulpalla, homogenoidaan ja annetaan seistä 18 minuuttia. Tämän jälkeen sentrifugoidaan kolme minuuttia ja liuokset dekantoidaan 50 ml:n erlenmeyerkolveihin (4.1). Liuosten absorbanssi mitataan välittömästi spektrofotometrillä 530 nm:ssä käyttäen nollanäytteenä seosta, jossa on 5 ml laimennettua metanolia (3.2) ja 10 ml värireagenssia (3.8). Standardikäyrä piirretään käyttäen absorbanssiarvoja ordinaattana ja vastaavia milligrammoina annettuja amproliumin määriä abskissana. 6. Tulosten laskeminen 6.1 Rehut ja esiseokset Näytteen amproliumpitoisuus milligrammoina kilogrammaa kohti saadaan kaavasta >NUM>A >DEN>W 7 F 7 20 000 jossa: A = fotometrisellä mittauksella saatu amproliumin määrä milligrammoina W = näytteen punnitus grammoina. F = laimennuskerroin (mahdollisesti kohdassa 5.1.1 tehty laimennus 6.2 Konsentraatit Näytteen amproliumpitoisuus prosentteina saadaan kaavasta >NUM>A >DEN>W 7 F 7 20 000 jossa: A = fotometrisestä mittauksesta saatu amproliumin määrä milligrammoina W = näytteen punnitus grammoina 7. Toistuvuus Samasta näytteestä tehtyjen kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa ylittää: 10 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna alle 100 mg/kg amproliumpitoisuuksilla; 10 %, suhteellisesti ilmoitettuna, pitoisuuksilla 100 5 000 mg/kg; 500 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, pitoisuuksilla 5 000 10 000 mg/kg; 5 %, suhteellisesti ilmoitettuna, yli 10 000 mg/kg pitoisuuksilla. 2. ETOPABAATIN MÄÄRITYS (metyyli-4-asetamido-2-etoksibentsoaatti) 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää etopabaatin pitoisuus rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg. 2. Periaate Näyte uutetaan laimealla metanolilla. Liuos tehdään happameksi ja uutetaan kloroformilla. Kloroformiuute pestään ensin emäksisellä liuoksella ja sitten vedellä. Puhdistettu uute väkevöidään, etopabaatti hydrolysoidaan laimealla kloorivetyhapolla. Näin muodostunut aminojohdannainen diatsotoidaan ja siihen liitetään 2-aminoetyyli-1-naftyyliamiini. Värillinen kompleksi uutetaan butanolilla ja liuoksen absorbanssi mitataan 555 nm:ssä. 3. Reagenssit 3.1 Metanoli, analyysilaatua. 3.2 50 % (v/v) metanoli: sekoitetaan yhtä suuret tilavuudet metanolia (3.1) ja vettä. 3.3 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19. 3.4 Suhteessa 1:10 laimennettu kloorivetyhappo: 10,0 ml kloorivetyhappoa (3.3) laimennetaan 100 ml:ksi vedellä. 3.5 0,3 N kloorivetyhappo: 25 ml kloorivetyhappoa (3.3) laimennetaan 1 000 ml:ksi vedellä. 3.6 Kloroformi, analyysilaatua. 3.7 4 % (w/v) natriumkarbonaattiliuos: 40,0 g vedetöntä natriumkarbonaattia, analyysilaatua liuotetaan veteen 1 000 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä. 3.8 0,2 % (w/v) natriumnitriittiliuos: 100 mg natriumnitriittiä, analyysilaatua liuotetaan veteen 50 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä. Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.9 1,0 % (w/v) ammoniumsulfamaattiliuos: 500 mg ammoniumsulfamaattia, analyysilaatua liuotetaan veteen 50 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä. Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.10 0,2 % (w/v) 2-aminoetyyli-1-naftyyliamiiniliuos: 100 mg 2-aminoetyyli-1-naftyyliamiinia, analyysilaatua liuotetaan veteen 50 ml:n mittapullossa ja täytetään merkkiin vedellä. Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.11 Vedetön natriumkloridi, analyysilaatua. 3.12 n-butanoli, analyysilaatua. 3.13 Standardiyhdiste: puhdas etopabaatti. 3.14 Standardiliuokset: 3.14.1 Etobaattiliuos, pitoisuus 0,040 mg/ml: punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 40 mg standardiyhdistettä (3.13). Liuotetaan metanoliin (3.2) 100 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin samalla liuoksella ja sekoitetaan. Liuos säilyy yhden kuukauden ajan. 3.14.2 Etobaattiliuos, pitoisuus 0,016 mg/20 ml: mittapullossa liuotetaan 5,0 ml 3.14.1 kohdan mukaisesti tehtyä liuosta 250 ml:ksi laimennetulla metanolilla (3.2) ja sekoitetaan hyvin. Valmistetaan ennen käyttöä. 4. Välineistö 4.1 250 ml:n hiostulpallisia erlenmeyerkolveja. 4.2 100 ml:n hiostulpallisia erotussuppiloita. 4.3 Ravistelija. 4.4 Pyöröhaihdutin ja 250 ml:n keittopulloja. 4.5 Vesihaude. 4.6 Sentrifugi ja hiostulpallisia 50 ml:n ja 15 ml:n putkia. 4.7 Ilmajäähdytin 4.8 Spektrofotometri ja 10 mm:n kyvetit. 5. Menettely 5.1 Uutto Punnitaan hienoksi jauhettua ja homogenoitua näytettä milligramman tarkkuudella sellainen määrä, että se sisältää noin 80 µg etopabaattia. Analysoitava näyte siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1) ja lisätään 100,0 ml laimeaa metanolia (3.2). Sekoitetaan, pullo suljetaan tulpalla ja ravistellaan yhden tunnin ajan ravistelijassa (4.3.). Dekantoidaan, suodatetaan ja ensimmäiset millilitrat suodoksesta heitetään pois. 5.2 Puhdistus HUOM. Kaikki tässä kohdassa olevat toimenpiteet on suoritettava nopeasti. Siirretään 20,0 ml kirkasta uutetta 100 ml:n erotussuppiloon (4.2), lisätään 5,0 ml suhteessa 1 : 10 laimennettua kloorivetyhappoa (3.4) ja 20,0 ml kloroformia (3.6), ravistellaan aluksi varovasti ja sen jälkeen voimakkaasti kolmen minuutin ajan. Annetaan seistä, kunnes vyöhykkeet erottuvat ja kloroformifaasi otetaan talteen toiseen 100 ml:n erotussuppiloon (4.2). Uutetaan happopitoinen faasi vielä kaksi kertaa 20,0 ml:lla kloroformia (3.6). Kloroformiuutteet yhdistetään toiseen erotussuppiloon ja happopitoinen faasi heitetään pois. Yhdistettyihin kloroformiliuoksiin lisätään 10 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.7), ravistellaan kolmen minuutin ajan ja annetaan seistä, kunnes faasit erottuvat. Kloroformifaasi otetaan talteen kolmanteen 100 ml:n erotussuppiloon (4.2) ja vesifaasi heitetään pois. Kloroformiliuokseen lisätään 10 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.7), ravistellaan kolmen minuutin ajan ja annetaan seistä, kunnes faasit erottuvat. Kloroformifaasi otetaan talteen neljänteen 100 ml:n erotussuppiloon (4.2), pestään kaksi kertaa peräkkäin 25 ml:lla vettä, erotetaan vesipitoiset faasit ja kerätään kloroformiuutteet kvantitatiivisesti 250 ml:n keittopulloon (4.4). Vesifaasit kootaan yhteen erotussuppiloon; kukin tyhjä suppilo pestään muutamalla millilitralla kloroformia, vesifaasi ravistellaan samalla millilitramäärällä kloroformia, faasien annetaan erottua ja kloroformifaasi siirretään keittopulloon, jossa on talteen otettu kloroformiuute. 5.3 Hydrolyysi Kloroformiuute haihdutetaan noin 2 ml:ksi 50 °C:ssa vesihauteella pyöröhaihduttajan avulla (4.4). Jäännös liuotetaan 2 3 ml:aan metanolia (3.1) ja liuos siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n sentrifugiputkeen (4.6) käyttäen kahta 10 ml:n erää ja yhtä 5 ml:n erää 0,3 N kloorivetyhappoa (3.5). Kiinnitetään ilmajäähdytin (4.7), lisätään muutama lasihelmi, homogenoidaan ja putki pannaan kiehuvaan vesihauteeseen 45 minuutiksi. Tämän jälkeen jäähdytetään juoksevassa kylmässä vedessä. 5.4 Värin kehitys ja absorbanssin mittaus Lisätään 1,0 ml natriumnitriittiliuosta (3.8), sekoitetaan ja annetaan seistä kaksi minuuttia. Lisätään 1,0 ml ammoniumsulfamaattiliuosta (3.9), sekoitetaan ja annetaan seistä kaksi minuuttia. Lisätään 1,0 ml 2-aminoetyyli-1-naftyyliamiiniliuosta (3.10), sekoitetaan ja annetaan seistä 10 minuuttia. Lisätään 5,0 g natriumkloridia (3.11) ja 10,0 ml n-butanolia (3.12), ravistetaan voimakkaasti kunnes natriumkloridi on liuennut täysin. Imetään supernatanttina oleva butanoliliuos pois pipetillä ja siirretään se 15 ml:n sentrifugiputkeen (4.6) ja sentrifugoidaan. Tämän jälkeen mitataan absorbanssi EA spektrofotometrillä ja 555 nm:ssä n-butanoli (3.12) nollanäytteenä. 5.5 Sokeakoe Sokeakoe tehdään samalla tavalla kohdasta 5.2 lähtien käyttäen 20,0 ml laimennettua metanolia (3.2). Mitataan absorbanssi EB 555 nm:ssä n-butanoli (3.12) nollanäytteenä. 5.6 Standardikoe Standardikoe tehdään samalla menettelyllä 5.2 kohdasta alkaen käyttäen 20,0 ml standardiliuosta (3.14.2). Absorbanssi EC mitataan 555 nm:ssä n-butanoli (3.12) nollanäytteenä. 6. Tulosten laskeminen Näytteen etopabaattipitoisuus milligrammoina kilogrammaa kohti saadaan kaavasta >NUM>(EA EB) >DEN>(EC EB) 7 >NUM>80 >DEN>W jossa: EA = näytteestä saadun liuoksen absorbanssi. EB = sokeakokeesta saadun liuoksen absorbanssi. EC = standardikokeesta saadun liuoksen absorbanssi. W = näytteen punnitus grammoina. 7. Toistuvuus Samasta näytteestä tehtyjen kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa ylittää: 20 %, suhteellisesti ilmoitettuna, alle 7,5 mg/kg etopabaattipitoisuuksilla; 1,5 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 7,5 10 mg/kg olevilla etopabaattipitoisuuksilla; 15 %, suhteellisesti ilmoitettuna, yli 10 mg/kg etopabaattipitoisuuksilla. 3. DINITOLMIDIN (DOT) MÄÄRITYS (3,5-dinitro-o-toluamidi) 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää dinitolmidin (DOT) pitoisuus rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Nitrofuraanijohdannaiset voivat häiritä määritystä. Määrityksen alaraja on 40 mg/kg. 2. Periaate Näyte uutetaan asetonitriilillä. Uute puhdistetaan alumiinioksidilla ja suodatetaan. Osa suodoksesta haihdutetaan kuivaksi. Jäännös liuotetaan dimetyyliformamidiin ja käsitellään etyleenidiamiinilla, jolloin muodostuu purppuranpunainen kompleksiyhdiste. Dinitolmidi määritetään spektrofotometrisesti 560 nm:ssä. 3. Reagenssit 3.1 85 % (v/v) asetonitriili: sekoitetaan 850 ml puhdasta asetonitriiliä ja 150 ml vettä. Seos tislataan ja välillä 75 77 °C kiehuva fraktio otetaan talteen. 3.2 Alumiinioksidi pylväskromatografiaa varten. Hehkutetaan 750 °C:ssa vähintään kaksi tuntia, annetaan jäähtyä eksikaattorissa ja säilytetään ruskeassa hiostulpallisessa lasipullossa. Ennen käyttöä alumiinioksidi kostutetaan seuraavasti: ruskeaan lasipulloon pannaan 10 g alumiinioksidia ja 0,7 ml vettä, suljetaan korkilla, kuumennetaan viisi minuuttia kiehuvassa vesihauteessa ravistellen samalla voimakkaasti, annetaan jäähtyä pulloa samalla ravistellen. Alumiinioksidin käyttökelpoisuus tarkistetaan tekemällä 5.1 kohdasta alkaen analyysi tietyllä määrällä standardiliuosta (3.6). Dinitolmidin saannon on oltava 100 ± 2 %. 3.3 95 % (v/v) N,N-dimetyyliformamidi: sekoitetaan 95,0 ml N,N-dimetyyliformamidia, analyysilaatua ja 5,0 ml vettä. 3.4 Diaminoetaani, analyysilaatua, maksimivesimäärä 2,0 %. 3.5 Standardiyhdiste: puhdas 3,5-dinitro-o-toluamidi, joka täyttää seuraavat vaatimukset: sulamispiste: 177 °C; molekulaarinen ekstinktiokerroin 248 nm:ssa asetonitriilissä: 13,1 × 103; molekulaarinen ekstinktiokerroin 266 nm:ssa N,N-dimetyyliformamidissa: 10,1 × 103. 3.6 Standardiliuos: punnitaan milligramman tarkkuudella 40 mg standardiyhdistettä (3.5), liuotetaan asetonitriilillä (3.1) 200 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin samalla liuottimella ja homogenoidaan. Laimennetaan mittapullossa 20,0 ml edellistä liuosta 100 ml:ksi asetonitriilillä (3.1) ja homogenoidaan. 1 ml tätä liuosta sisältää 40 µg dinitolmidia. 4. Välineistö 4.1 250 ml:n hiostulpallinen erlenmeyerkolvi. 4.2 Palautusjäähdytin. 4.3 Suodatinupokas, huokoskoko G 3, läpimitta 60 mm. 4.4 Tyhjiösuodatin (esimerkiksi Witt-laite). 4.5 Vesihaude, joka on säädetty 50 °C:seen. 4.6 Spektrofotometri ja 10 mm:n kyvetit. 5. Menettely 5.1 Uutto ja puhdistus Punnitaan milligramman tarkkuudella 10 g hienoksi jauhettua ja homogenoitua näytettä. Konsentraattia ja esiseosta punnitaan 1 g milligramman tarkkuudella. Analysoitava näyte siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1) ja lisätään 65 ml asetonitriiliä (3.1). Sekoitetaan, kolviin kiinnitetään palautusjäähdytin (4.2) ja kuumennetaan vesihauteella (4.5) 30 minuuttia samalla jatkuvasti ravistellen. Jäähdytetään juoksevassa kylmässä vedessä. Lisätään 20 g alumiinioksidia (3.2), ravistellaan kolmen minuutin ajan ja annetaan sakan laskeutua. 100 ml:n mittapullo asetetaan tyhjiösuodattimeen (4.4), siihen sovitetaan suodatinupokas (4.3) ja liuos suodatetaan imua käyttäen. Tämän jälkeen jäljelle jäävät kiinteät aineet huuhdotaan suodatinupokkaaseen muutamalla millilitralla asetonitriiliä (3.1) ja jäännös imetään kuivaksi. Imu lopetetaan, suodatinkakku suspendoidaan uudelleen muutamalla millilitralla asetonitriiliä (3.1) ja imu aloitetaan uudelleen. Nämä viimeiset toimenpiteet toistetaan, kunnes suodoksen tilavuudeksi saadaan noin 95 ml. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi asetonitriilillä (3.1) ja sekoitetaan. Laimennetaan tarvittaessa asetonitriilillä (3.1), jotta saadaan liuos, joka sisältää 5 15 µg dinitolmidia millilitrassa. 5.2 Värin kehitys ja absorbanssin mittaus Kolmeen 50 ml:n dekantterilasiin A, B ja C pipetoidaan kuhunkin erikseen 4,0 ml 5.1 kohdan mukaisesti saatua liuosta. Lisätään myös 1,0 ml standardiliuosta (3.6) ainoastaan dekantterilasiin C. Nämä kolme dekantterilasia asetetaan vesihauteelle (4.5), joka on hyvällä tuuletuksella varustetussa vetokaapissa, haihdutetaan kuivaksi kuivalla ilmavirralla. Jäähdytetään dekantterilasit huoneen lämpöön. Lisätään 10,0 ml N,N-dimetyyliformamidia (3.3) dekantterilasiin A ja 2,0 ml dekantterilasiin B ja C, annetaan vaikuttaa muutaman minuutin ajan ja sekoitetaan hieman, kunnes jäännös liukenee täysin. Tämän jälkeen lisätään 8,0 ml diaminoetaania (3.4) dekantterilaseihin B ja C, ja homogenoidaan. Tarkalleen 5 minuuttia diaminoetaanin lisäyksen jälkeen näiden kolmen liuoksen absorbanssi mitataan spektrofotometrillä (4.6) 560 nm:ssä käyttäen N,N-dimetyyliformamidia (3.3) nollanäytteenä. 6. Tulosten laskeminen Näytteen dinitolmidipitoisuus milligrammoina kilogrammaa kohti saadaan kaavasta: >NUM>(EB EA) >DEN>(EC EB) 7 >NUM>F >DEN>W 7 1 000 jossa EA = A-liuoksen (nollanäyte) absorbanssi. EB = B-liuoksen (näyte) absorbanssi. EC = C-liuoksen absorbanssi (sisäinen standardi). W = näytteen punnitus grammoina. F = laimennuskerroin (mahdollisesti 5.1 kohdassa tehty laimennos). 7. Toistuvuus Samasta näytteestä suoritettujen kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa ylittää: 10 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna alle 100 mg/kg dinitolmidipitoisuuksilla; 10 %, suhteellisesti ilmoitettuna, välillä 100 5 000 mg/kg olevilla pitoisuuksilla; 500 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 5 000 10 000 mg/kg olevilla pitoisuuksilla ja 5 %, suhteellisesti ilmoitettuna, yli 10 000 mg/kg olevilla pitoisuuksilla. 4. NIKARBATSIINIMÄÄRITYS (4,4'-dinitrokarbanilidin ja 2-hydroksi-4,6 dimetyylipyrimidiinin ekvimolekyylinen seos) 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää nikarbatsiinin pitoisuus rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa, jotka eivät sisällä yli 5 % heinäjauhoa. Nitrofuraanijohdannaiset, asetyleeniheptiini ja karbadoksi voivat häiritä määritystä. Määrityksen alaraja on 20 mg/kg. 2. Periaate Näyte uutetaan N,N-dimetyyliformamidilla. Uute puhdistetaan kromatografisesti alumiinioksidipylväällä; nikarbatsiini eluoidaan etanolilla. Eluaatti käsitellään natriumhydroksidin etanoliliuoksella, jolloin muodostuu keltainen väri. Nikarbatsiini määritetään spektrofotometrisesti 430 nm:ssä. 3. Reagenssit 3.1 N,N-dimetyyliformamidi, analyysilaatua. 3.2 Pylväskromatografiaan käytettävä alumiinioksidi. Hehkutetaan 750 °C:ssa vähintään kaksi tuntia, jäädytetään eksikaattorissa ja säilytetään ruskeassa hiostulpallisessa lasipullossa. Alumiinioksidin käyttökelpoisuus tarkistetaan ennen käyttöä tekemällä kohdasta 5.2 alkaen analyysi tietyllä määrällä standardiliuosta (3.8.3). Nikarbatsiinin saannon on oltava 100 ± 2 %. 3.3 95 % (v/v) etanoli. 3.4 80 % (v/v) etanoli. 3.5 50 % (w/v) natriumhydroksidiliuos. 3.6 1 % (w/v) natriumhydroksidin etanoliliuos: pipetoidaan 1 ml natriumhydroksidia (3.5) 50 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin 80 % (v/v) etanolilla (3.4). Liuos valmistetaan käyttöhetkellä. 3.7 Standardiaine: puhdas nikarbatsiini, molekulaarinen ekstinktiokerroin 362 nm:ssä N,N-dimetyyliformamidissa: 37,8 × 103. 3.8 Standardiliuokset: 3.8.1 Nikarbatsiiniliuos, pitoisuus 1,25 mg/ml: punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 125 mg standardiyhdistettä (3.7). Liuotetaan 75 ml:aan N,N-dimetyyliformamidia (3.1) 100 ml:n mittapullossa varovasti lämmittäen. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin samalla liuottimella ja sekoitetaan. Säilytetään valolta suojattuna. 3.8.2 Nikarbatsiiniliuos, pitoisuus 0,125 mg/ml: Mittapullossa laimennetaan 10,0 ml liuosta (3.8.1) 100 ml:ksi N,N-dimetyyliformamidilla (3.1) ja sekoitetaan. 3.8.3 Nikarbatsiiniliuos, pitoisuus 0,025 mg/ml: Mittapullossa laimennetaan 20,0 ml liuosta (3.8.2) 100 ml:ksi N,N-dimetyyliformamidilla (3.1) ja sekoitetaan. 4. Välineistö 4.1 250 ml:n hiostulpallinen erlenmeyerkolvi. 4.2 Palautusjäähdytin. 4.3 Vesihaude. 4.4 Sentrifugi, johon sopii 120 ml:n sentrifugiputket. 4.5 Kromatografiapylväät (sisähalkaisija 25 mm, pituus 300 mm). 4.6 Spektrofotometri ja 10 mm:n kyvetit. 4.7 Mittabyretti 0,1 ml:n jaotuksella. 5. Menettely 5.1 Uutto Punnitaan milligramman tarkkuudella 10 g hienoksi jauhettua ja homogenoitua näytettä. Konsentraattia ja esiseosta punnitaan 1 g milligramman tarkkuudella. Analysoitava näyte siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin (4.1) ja lisätään tarkalleen 100 ml N,N-dimetyyliformamidia (3.1). Sekoitetaan, kiinnitetään palautusjäähdytin (4.2) ja lämmitetään vesihauteessa (4.3) 15 minuutin ajan ravistellen ajoittain. Jäähdytetään juoksevassa kylmässä vedessä. Supernatanttikerros kaadetaan sentrifugiputkeen (4.4) ja sentrifugoidaan noin kolmen minuutin ajan. Tarvittaessa 25,0 ml supernatanttikerrosta laimennetaan N,N-dimetyyliformamidilla (3.1), jotta saadaan liuos, joka sisältää 2,0 10 µg nikarbatsiinia millilitrassa. 5.2 Kromatografia Kromatografiapylvääseen (4.5) kaadetaan 30 g alumiinioksidilietettä (3.2) N,N-dimetyyliformamidissa. Nestetason annetaan laskea 1 cm:n päähän alumiinioksidikerroksesta ja tämän jälkeen pylvääseen pipetoidaan 25,0 ml 5.1 kohdassa saatua uutetta. Nesteen annetaan juosta pylvään läpi siten, että se ei kuivu ja pylväs pestään kolmella 10 ml:n erällä N,N-dimetyyliformamidia (3.1). Tämän jälkeen eluoidaan 70 ml:lla 95 % (v/v) etanolia (3.3). Eluaatista poistetaan ensimmäiset 10 ml ja loput kerätään talteen ja jaetaan seuraavasti: yksi 5 ml:n erä a); yksi 50 ml:n erä b) mittapulloon; yksi 5 ml:n erä c). Tarkistetaan, että erät a) ja c) eivät muutu keltaiseksi lisättäessä niihin natriumhydroksidin etanoliliuosta (3.6). Erän b) käsittelyä jatketaan kohdan 5.3 mukaisesti. 5.3 Värin kehitys ja absorbanssin mittaus Eluaatin b)-erästä pipetoidaan 20,0 ml kahteen 25 ml:n mittapulloon A ja B. Lisätään A-pulloon 50 ml natriumhydroksidin etanoliliuosta (3.6) ja B-pulloon 5,0 ml 95 % (v/v) etanolia (3.3). Homogenoidaan. Seuraavien viiden minuutin aikana mitataan molempien liuosten absorbanssi 430 nm:ssä, käyttäen nollanäytteenä seosta, jossa on 20,0 ml 95 % (v/v) etanolia (3.3) ja 5,0 ml natriumhydroksidin etanoliliuosta (3.6). Vähennetään B-liuoksen absorbanssilukema vastaavasta A-liuoksen lukemasta. Nikarbatsiinin määrä saadaan standardikäyrän (5.4) avulla. 5.4 Kalibrointi Standardiliuoksesta (3.8.3) otettu 25,0 ml:n erä käsitellään kromatografisesti 5.2 kohdan mukaisesti. Kaadetaan erä b)-eluaatista mittabyrettiin (4.7) ja se jaetaan 25 ml:n mittapulloihin 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ja 10,0 ml:n erinä (nämä erät vastaavat 0,025, 0,050, 0,075, 0,100 ja 0,125 mg nikarbatsiinia). Kuhunkin pulloon lisätään 5,0 ml natriumhydroksidin etanoliliuosta (3.6), täytetään merkkiin 95 % (v/v) etanolilla (3.3) ja homogenoidaan. Seuraavien viiden minuutin aikana liuosten absorbanssi mitataan 430 nm:ssä käyttäen nollanäytteenä seosta, jossa on 20,0 ml 95 % (v/v) etanolia (3.3) ja 5,0 ml natriumhydroksidin etanoliliuosta (3.6). Valmistetaan standardikäyrä käyttäen absorbanssin arvoja ordinaattana ja vastaavia milligrammoina annettuja nikarbatsiinimääriä abskissana. 6. Tulosten laskeminen Näytteen nikarbatsiinipitoisuus milligrammoina kilogrammaa kohti saadaan kaavasta: >NUM>A >DEN>W 7 F 7 10 000 jossa A = fotometrisella mittauksella saatu nikarbatsiinimäärä milligrammoina W = näytteen punnitus grammoina; F = laimennuskerroin (mahdollisesti 5.1. kohdassa tehty laimennus) 7. Toistettavuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla yli: 10 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, alle 100 mg/kg nikarbatsiinipitoisuuksilla; 10 %, suhteellisesti ilmoitettuna, välillä 100 5 000 mg/kg olevilla pitoisuuksilla; 500 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 5 000 10 000 mg/kg olevilla pitoisuuksilla ja 5 %, suhteellisesti ilmoitettuna, yli 10 000 mg/kg pitoisuuksilla. 5. MENADIONIN (K3-VITAMIININ) MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää menadionin (K3-vitamiinin) määrä rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 1 mg/kg. 2. Periaate Näytteet uutetaan laimealla etanolilla. Seos kirkastetaan tanniiniliuoksella ja sentrifugoidaan. Uute käsitellään natriumkarbonaattiliuoksella; vapautunut menadioni uutetaan 1,2-dikloorietaanilla. Dikloorietaaniuute käsitellään menadionipitoisuutensa mukaisesti, joko suoraan tai haihdutuksen jälkeen, etanolisella 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuoksella, joka on tehty happameksi kloorivetyhapolla. Saadusta hydratsonista, joka on käsitelty ylimäärällä ammoniakkia, muodostuu väriltään sinivihreä kompleksi, jonka absorbanssi mitataan 635 nm:ssa. 3. Reagenssit 3.1 96 % (v/v) etanoli. 3.2 Etanoli (3.1), joka on laimennettu 40-%:seksi vedellä. 3.3 10 % (w/v) tanniiniliuos, joka on valmistettu puhdistetusta tanniinijauheesta. 3.4 1,2-dikloorietaani, analyysilaatua. 3.5 10 % (w/v) vedetön natriumkarbonaattiliuos, (natriumkarbonaatti, analyysilaatua). 3.6 37 % (w/v) kloorivetyhappo, tiheys 1,19. 3.7 Absoluuttinen etanoli, analyysilaatua. 3.8 2,4-dinitrofenyylihydratsiinireagenssi: liuotetaan 40 mg 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia, analyysilaatua noin 40 ml:aan kiehuvaa absoluuttista etanolia (3.7), annetaan tämän jäähtyä ja siirretään 50 ml:n mittapulloon. Lisätään 1 ml kloorivetyhappoa (3.6) ja täytetään merkkiin absoluuttisella etanolilla (3.7). Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.9 25 % (w/v) ammoniakki, tiheys 0,91. 3.10 Ammoniakkipitoinen etanoli: sekoitetaan tilavuusosa etanolia (3.7) yhteen tilavuusosaan ammoniakkia (3.9). 3.11 Menadionin standardiliuokset: liuotetaan 1,2-dikloorietaaniin (3.4) 20 mg menadionia (K3-vitamiinia) ja täytetään 200 ml:ksi. Laimennetaan tästä kantaliuoksesta saadut erät 1,2-dikloorietaanilla (3.4) sellaisten liuosten sarjan saamiseksi, joissa menadionipitoisuudet ovat välillä 2 10 µg/ml. Näiden liuosten täytyy olla juuri valmistettuja. 4. Välineistö 4.1 Mekaaninen ravistelija. 4.2 Sentrifugi (3 000 5 000 kierr./min). 4.3 100 ja 250 ml:n hiostulpalliset erotussuppilot. 4.4 Pyöröhaihdutin ja 250 ml:n keittopullot. 4.5 Vesihaude. 4.6 Spektrofotometri ja 10 mm:n kyvetit. 5. Menettely HUOM. Kaikki toimenpiteet on suoritettava suoralta valolta suojattuna käyttäen ruskeasta lasista valmistettuja välineitä. 5.1 Tutkittava näyte Hienonnettua näytettä punnitaan otaksutun menadionimäärän perusteella esimerkiksi: 0,1 5,0 g konsentraatteja ja esiseoksia; 20 30 g rehua. Siirretään punnittu näyte välittömästi 250 ml:n hiostulpalliseen pulloon. 5.2 Uutto Näytteeseen lisätään tarkalleen 96 ml laimeaa etanolia (3.2) ja ravistetaan mekaanisesti 15 minuuttia huoneen lämmössä. Tämän jälkeen lisätään 4,0 ml tanniiniliuosta (3.3), sekoitetaan, siirretään uute sentrifugiputkeen, sentrifugoidaan nopeudella 3 000 5 000 kierr./min. ja dekantoidaan. Pipetoidaan tarkasti 20 40 ml:n erä uutetta 250 ml:n erotussuppiloon, lisätään pipetillä 50 ml 1,2-dikloorietaania (3.4), sekoitetaan ja lisätään pipetillä 20 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.5). Ravistetaan voimakkaasti 30 sekunnin ajan ja tämän jälkeen dikloorietaanifaasi otetaan talteen 100 ml:n erotussuppiloon. Lisätään 20 ml vettä, ravistetaan taas 15 sekunnin ajan, dikloorietaanifaasi otetaan talteen ja loppuosa vedestä poistetaan suodatinpaperiliuskoilla. Konsentraattien ja esiseosten uute laimennetaan 1,2-dikloorietaanilla (3.4.) niin, että menadionipitoisuus on 2 10 µg/ml. Rehujen ollessa kyseessä haihdutetaan erä uutteesta kuivaksi alipaineessa typpiatmosfäärissä vesihauteella 40 °C:ssa. Jäännös liuotetaan nopeasti 1,2-dikloorietaaniin (3.4) niin, että liuoksessa on menadionia 2 10 µg/ml. 5.3 Hydratsonin muodostus Siirretään 2,0 ml 5.2 kohdassa saatua dikloorietaaniuutetta 10 ml:n mittapulloon ja tähän lisätään 3,0 ml 2,4-dinitrofenyylihydratsonireagenssia (3.8) ja pullo suljetaan tiiviisti korkki- tai teflontulpalla haihtumisen estämiseksi ja tätä kuumennetaan 70 °C:ssa vesihauteella. Annetaan jäähtyä, lisätään 3,0 ml ammoniakkipitoista etanolia (3.10), sekoitetaan, täytetään merkkiin absoluuttisella etanolilla (3.7) ja sekoitetaan uudelleen. 5.4 Absorbanssin mittaus Väriltään sinivihreän kompleksin absorbanssi mitataan spektrofotometrillä 635 nm:ssä vertaamalla reagenssinollanäytteeseen, joka on saatu käsittelemällä 2,0 ml 1,2-dikloorietaania (3.4) 5.3 kohdan mukaisesti. Menadionin määrä määritetään kullekin analysoitavalle sarjalle erikseen laadittua standardikäyrää käyttäen. 5.5 Standardikäyrä Käsitellään 2,0 ml menadionistandardiliuoksia (3.11) 5.3 kohdan mukaisesti. Absorbanssi mitataan 5.4 kohdan mukaisesti. Standardikäyrästä laaditaan kuvaaja, jossa optisen tiheyden arvot ovat ordinaattana ja vastaavat mikrogrammoina ilmoitetut menadionimäärät abskissana. 6. Tulosten laskeminen Näytteen menadionipitoisuus lasketaan huomioimalla analysoitavan näytteen paino ja määrityksen kuluessa tehdyt laimennokset. Tulokset ilmoitetaan milligrammoina menadionia kilogrammaa kohti. 7. Toistuvuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla: - 20 %, suhteellisesti ilmoitettuna, alle 10 mg/kg menadionipitoisuuksilla; - 2 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 10 14 mg/kg olevilla pitoisuuksilla; - 15 %, suhteellisesti ilmoitettuna, välillä 14 100 mg/kg olevilla pitoisuuksilla; - 15 mg/kg, absoluuttisesti ilmoitettuna, välillä 100 150 mg/kg olevilla pitoisuuksilla ja - 10 %, suhteellisesti ilmoitettuna, yli 150 mg/kg pitoisuuksilla.