3.

Lisätään seuraavat luvut: ”B.49. IN VITRO -MIKROTUMATESTI NISÄKÄSSOLUILLA JOHDANTO 1. In vitro -mikrotumamääritysmenetelmä (MNvit) on genotoksisuustesti, jolla määritetään interfaasisolujen sytoplasman mikrotumat. Mikrotumat voivat olla peräisin asentrisista kromosomin osista (joista puuttuu sentromeeri) tai kokonaisista kromosomeista, jotka eivät pysty vetäytymään kohti napoja solunjakautumisen anafaasivaiheessa. Määritysmenetelmässä osoitetaan klastogeenisten ja aneugeenisten kemikaalien (aineiden ja seosten) (1) (2) aktiivisuus soluissa, joissa on tapahtunut solun jakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Testi voidaan suorittaa niin, että aktiinin polymerisaation inhibiittoria sytokalasiini B:tä (sytoB) käytetään tai ei käytetä. Kun sytoB:tä lisätään ennen tavoiteltua mitoosia, mikrotumafrekvenssi voidaan määrittää ja analysoida valikoivasti soluissa, joissa on tapahtunut yksi mitoosi, koska tällaiset solut ovat kaksitumaisia (3) (4). Tässä testimenetelmässä testisuunnitelmia voidaan soveltaa myös ilman sytokineesin inhibitointia edellyttäen, että analysoitavassa solupopulaatiossa on todistetusti tapahtunut mitoosi. 2. Mikrotumien muodostumista aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamiseksi toteutettavan MNvit-määritysmenetelmän lisäksi kromosomivaurioiden ja mikrotuman muodostumisen mekanismeista voidaan saada tietoa myös käyttämällä sytokineesin inhibiittoria, kinetokorien immunokemiallista merkkausta tai sentromeeri-/telomeerikoettimilla suoritettavaa hybridisaatiota (fluoresenssi- in situ -hybridisaatio (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Merkkaus- ja hybridisaatiomenetelmiä voidaan käyttää, kun mikrotumien muodostuminen on kiihtynyt ja tutkija haluaa määrittää, johtuuko kiihtyminen klastogeenisista ja/tai aneugeenisista tapahtumista. 3. Mikrotumat edustavat vauriota, jotka ovat välittyneet tytärsoluihin. Sen sijaan metafaasivaiheen soluissa esiintyvät kromosomipoikkeavuudet eivät ehkä välity seuraaviin vaiheisiin. Koska interfaasisolujen mikrotumat voidaan havaita suhteellisen objektiivisesti, laboratorion henkilökunnan on vain määritettävä, ovatko solut jakautuneet ja kuinka monessa solussa on mikrotuma. Näin ollen preparaatit voidaan laskea suhteellisen nopeasti ja analysointi voidaan automatisoida. Tämän takia kussakin käsittelyssä voidaan laskea satojen solujen sijaan tuhansia soluja, mikä lisää määritysmenetelmän tehokkuutta. Koska mikrotumia voi syntyä hitaasti liikkuvista (’lagging’) kromosomeista, menetelmällä voidaan havaita aneuploidisia tekijöitä, joita on vaikea tutkia perinteisillä kromosomipoikkeavuustesteillä, kuten OECD:n testiohjeella 473 (tämän liitteen B.10 luku) (17). MNvit-määritysmenetelmällä ei kuitenkaan voida eritellä polyploidisia kemikaaleja ja klastogeenisia kemikaaleja ilman erityistekniikoita, kuten 2 kohdassa tarkoitettua FISH-tekniikkaa. 4. MNvit-määritysmenetelmä on in vitro -menetelmä, jossa tavallisesti käytetään viljeltyjä ihmis- tai jyrsijäsoluja. Sillä voidaan kattavasti tutkia in vitro kromosomivaurioiden mahdollisuutta, koska sillä voidaan havaita sekä aneugeenit että klastogeenit. 5. MNvit-määritysmenetelmässä voidaan käyttää luotettavasti ja tehokkaasti useita eri solutyyppejä joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Erilaisten jyrsijäsolulinjojen (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja ihmisestä saatujen lymfosyyttien käytön soveltuvuudesta MNvit-määritysmenetelmään on saatu kattavia todisteita (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Näitä ovat etenkin Société Française de Toxicologie Génétique -järjestön (SFTG) koordinoimat kansainväliset validointitutkimukset (18) (19) (20) (21) (22) sekä genotoksisuuden testausta käsittelevän kansainvälisen työryhmän (International Workshop on Genotoxicity Testing) selvitykset (4) (16). Saatavilla olevat tiedot on myös arvioitu uudelleen Euroopan komission alaisen Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskuksen (ECVAM) tekemässä todistusnäytön jälkivalidointitutkimuksessa, ja ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC) on vahvistanut testimenetelmän tieteellisesti päteväksi (32) (33) (34). Menetelmässä kuvataan ihmisen lymfoblasti-TK6-solulinjan (35), HepG2-solujen (36) (37) ja syyrianhamsterialkion primaarisolujen (38) käyttöä, vaikka niitä ei ole käytetty validointitutkimuksissa. MÄÄRITELMÄT 6. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. JOHDANTO 7. In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisten aineiden testaamiseen. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita. On myös vältettävä olosuhteita, joissa väärät positiiviset tulokset eivät heijasta luontaista mutageenisuutta, vaan voivat johtua esimerkiksi pH-arvon tai osmolaliteetin huomattavasta muutoksesta tai sytotoksisuuden korkeasta tasosta (39) (40) (41). Jos testikemikaali aiheuttaa viljelyaineen pH-arvon muuttumisen lisäämishetkellä, pH-arvoa on mukautettava mielellään siten, että kantaliuosta puskuroidaan niin, että kaikkien testinäytteiden, myös kaikkien kontrollinäytteiden, tilavuus pysyy muuttumattomana. 8. Mikrotumien muodostumisen analysoimiseksi on tärkeää, että sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä viljelmissä on tapahtunut mitoosi. Eniten tietoja mikrotumien laskemiseksi saadaan soluista, joissa on tapahtunut yksi mitoosi testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. TESTIN PERIAATE 9. Ihmis- tai nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testiaineelle sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä. Kaikissa testeissä käytetään samanaikaisesti myös liuotinta/kantaja-ainekontrollia ja positiivisia kontrollikemikaaleja. 10. Testiaineelle altistamisen aikana tai sen jälkeen soluja kasvatetaan riittävän kauan, jotta kromosomi- tai sukkulavauriot voivat johtaa mikrotuman muodostumiseen inferfaasisoluissa. Jotta aneuploidia muodostuisi, testiaineen olisi yleensä oltava läsnä mitoosin aikana. Kerätyt ja värjätyt interfaasisolut analysoidaan mikrotumien havaitsemiseksi. Mikrotumat on laskettava pääasiassa vain niissä soluissa, joissa mitoosi on päättynyt testiaineelle altistamisen aikana tai altistamisen jälkeisessä vaiheessa, jos testissä käytetään sitä. Sytokineesin inhibiittorilla käsitellyistä viljelmistä lasketaan vain kaksitumaiset solut. Jos sytokineesin inhibiittoria ei ole käytetty, on tärkeä osoittaa, että analysoiduissa soluissa on todennäköisesti tapahtunut solunjakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Kaikkien menetelmissä on tärkeä osoittaa, että solut ovat lisääntyneet sekä kontrolliviljelmässä että käsitellyissä viljelmissä, ja testiaineen aiheuttamaa sytotoksisuutta tai sytostaasia on arvioitava niissä viljelmissä (tai rinnakkaisviljelmissä), joiden mikrotumat lasketaan. MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS Testin valmistelu 11. Testeissä voidaan käyttää viljeltyjä ihmisen perifeerisen veren primaarisia lymfosyyttejä (5) (19) (42) (43) ja erilaisten jyrsijäsolulinjojen (esimerkiksi CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) soluja (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Muiden solulinjojen ja -tyyppien käyttö on perusteltava esittäen tiedot niiden todistetusta suorituskyvystä määritysmenetelmässä Hyväksyttävyysperusteet -kohdan mukaisesti. Koska mikrotumien esiintymistaajuus vaikuttaa taustana määritysmenetelmän herkkyyteen, menetelmässä olisi käytettävä solutyyppejä, joissa mikrotumien muodostumisen taustataajuus on alhainen ja tasainen. 12. Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on kerättävä nuorilta (noin 18–35-vuotiaat), terveiltä, tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistuneen äskettäin genotoksisille kemikaaleille tai säteilylle. Jos soluja kerätään useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien määrä on ilmoitettava. Mikrotumataajuus kasvaa iän myötä, ja ilmiö on yleisempi naisilla kuin miehillä (44). Tämä on otettava huomioon valittaessa luovuttajien soluja, jos ne on tarkoitus yhdistää. Elatusaineet ja viljelyolosuhteet 13. Soluviljelmiä on viljeltävä sopivissa elatusaineissa ja inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, CO2-pitoisuus, lämpötila ja kosteus). Pysyvistä solulinjoista ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei ole mykoplasmakontaminaatiota. Viljelmiä ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käytetyissä viljelyolosuhteissa on tunnettava. Jos menetelmänä käytetään sytokineesin estämistä, sytokineesin inhibiittorin pitoisuus on optimoitava tiettyä solutyyppiä varten, ja on osoitettava, että sillä saadaan aikaan riittävä määrä kaksitumaisia soluja pisteytystä varten. Soluviljelmien valmistelu 14. Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, kylvetään elatusaineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät eivät saavuta konfluenttisuutta yhden solun vahvuisessa kerroksessa eivätkä kasvatusviljelmät ole liian tiheitä ennen solujen keräämisajankohtaa, ja inkuboidaan 37 °C:ssa. 15. Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään mitogeenin (esimerkiksi fytohemagglutiniini, PHA) kanssa ennen testiaineelle ja sytoB:lle altistamista. Metabolinen aktivaatio 16. Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (45) (46) tai fenobarbitonin ja β-naftoflavonin yhdistelmällä (46) (47) (48) (49) käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen (50) ja pysyvistä orgaanisista yhdisteistä annetun asetuksen (EY) N:o 850/2004 (66) säännösten kanssa, ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254:n (46) (47) (48) (49). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa testiväliaineessa on 1–10 % (v/v). Metabolisen aktivaatiojärjestelmän kunto voi riippua testattavan kemikaalin luokasta, ja joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä S9-jakeen pitoisuutta. 17. Jos käytössä on spesifisiä ihmisen tai jyrsijöiden aktivoivia entsyymejä ilmentäviä geenitekniikalla tuotettuja solulinjoja, ei eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää välttämättä tarvita, ja näitä soluja voidaan myös käyttää testisoluina. Tällaisissa tapauksissa käytettyjen solulinjojen valinta on perusteltava tieteellisesti, esimerkiksi ilmoittamalla sekaoksidaasin merkitys testiaineen (51) metabolialle ja niiden reagoivuus tunnettuihin klastogeeneihin ja aneugeeneihin (katso erillinen Hyväksyttävyysperusteet-kohta). On mahdollista, että ilmentyvä(t) sekaoksidaasi(t) ei(vät) pysty metaboloimaan testiainetta; tässä tapauksessa negatiiviset tulokset eivät osoita, että testiaineella ei voida indusoida mikrotumia. Testiaineen valmistelu 18. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (52) (53). Testiaine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. Testiolosuhteet Liuottimet/kantaja-aineet 19. Liuotin/kantaja-aine ei saisi reagoida testiaineen kanssa tai vaikuttaa solujen elinkykyyn tai S9:n aktiivisuuteen käytetyssä pitoisuudessa. Jos testissä käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita (esimerkiksi vettä, soluviljelmän elatusainetta tai dimetyylisulfoksidia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testiaine sopivat yhteen ja että ne eivät ole genotoksisia. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. SytoB:n käyttö sytokineesin inhibiittorina 20. Yhtenä MNvit-määritysmenetelmän tärkeimpänä näkökohtana on varmistaa, että lasketuissa soluissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai käsittelyä seuraavalla inkubaatiojaksolla, jos sitä on käytetty. Sytokineesin inhibiittorina käytetään yleisimmin sytoB:tä, koska se estää aktiinin muodostumisen ja näin ollen estää tytärsolujen erkaantumisen mitoosin jälkeen, mikä johtaa kaksitumaisten solujen muodostumiseen (5) (54) (55). Tämän ansiosta mikrotumien laskeminen voidaan rajoittaa soluihin, joissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Testiaineen vaikutus solujen proliferaation kinetiikkaan voidaan mitata samanaikaisesti. Ihmisen lymfosyyttejä käytettäessä sytokineesin inhibiittorina on käytettävä sytoB:tä, koska solusyklin kesto vaihtelee eri viljelmien ja luovuttajien välillä ja koska kaikki lymfosyytit eivät reagoi PHA:han. Solulinjojen testauksessa on käytetty myös muita menetelmiä sen määrittämiseksi, ovatko laskettavat solut jakautuneet; näitä menetelmiä tarkastellaan jäljempänä (katso 26 kohta). 21. Laboratorion on määritettävä sopiva sytoB:n pitoisuus erikseen kullekin solutyypille, jotta liuottimella/kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliviljelmien kaksitumaisten solujen määrä voidaan optimoida. Yleensä sytoB:n sopiva pitoisuus on 3–6 μg/ml. Solujen proliferaation ja sytotoksisuuden mittaaminen ja altistuspitoisuuksien valitseminen 22. Päätettäessä suurimmasta testattavasta pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta, saostumista väliaineeseen tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (39) (40) (41). 23. Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että käsitellyissä soluissa on tapahtunut mitoosi määritysmenettelyn aikana ja että käsittelyissä on käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (katso 29 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä metabolisen aktivaation avulla ja ilman sitä soluissa, joissa metabolinen aktivaatio on tarpeen, tarkastelemalla solumäärän suhteellista lisääntymistä tai populaation suhteellista kaksinkertaistumista (katso kaavat lisäyksessä 2), paitsi jos käytetään sytoB:tä. Jos sytoB:tä käytetään, sytotoksisuus voidaan määrittää käyttämällä replikaatioindeksiä (RI) (katso kaava lisäyksessä 2). 24. Kun viljelmät käsitellään sytoB:llä ja viljelmän yksitumaisten, kaksitumaisten ja monitumaisten solujen suhteellinen osuus määritetään, käsittelyn täsmällinen vaikutus solujen proliferaatioon ja solun sytotoksiseen tai sytostaattiseen toimintaan voidaan määrittää kvantitatiivisesti (5). Lisäksi varmistetaan, että laskennassa huomioon otetaan vain solut, jotka ovat jakautuneet käsittelyn aikana tai sen jälkeen. 25. SytoB:llä tehtävissä tutkimuksissa sytostaasi/sytotoksisuus voidaan kvantifioida sytokineesin eston jälkeisestä proliferaatioindeksistä (5) (26) (56) tai se voidaan johtaa RI:stä, joka on määritetty vähintään 500 solulle viljelmää kohti (katso kaavat lisäyksessä 2). Kun solujen proliferaatiota arvioidaan sytoB:n avulla, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä tarkastelemalla vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Sytotoksisuus voidaan arvioida muun muassa näiden tulosten avulla vertailemalla käsiteltyjen viljelmien ja kontrolliviljelmien arvoja. Myös muiden sytotoksisuuden merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa. 26. Ilman sytoB:tä tehtävissä tutkimuksissa on osoitettava, että viljelmässä lasketut solut ovat jakautuneet testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Muussa tapauksessa tutkimuksesta voidaan saada vääriä negatiivisia tuloksia. Menetelmiä, joilla varmistetaan, että jakautuneet solut tulevat lasketuiksi, ovat muun muassa bromodeoksiuridiinin (BrdU) inkorporoituminen ja sen osoittaminen myöhemmin jakautuneiden solujen tunnistamiseksi (57), kloonien muodostuminen, kun pysyvien solulinjojen soluja käsitellään ja lasketaan in situ mikroskooppilevyllä (proliferaatioindeksi (PI)) (25) (26) (27) (28), tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen tai solumäärän suhteellisen lisääntymisen määrittäminen tai muu soveltuvaksi osoitettu menetelmä (16) (56) (58) (59) (katso kaavat lisäyksessä 2). Myös muiden sytotoksisuuden tai sytostaasin merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa. 27. Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa testipitoisuutta on arvioitava. Jotta tämä olisi mahdollista, kokeessa voidaan käyttää useampia, toisistaan vain hieman poikkeavia pitoisuuksia. Mikrotumien muodostuminen voidaan arvioida niissä pitoisuuksissa, joiden sytotoksisuus on asianmukaisella vaihteluvälillä. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa alustava sytotoksisuustesti, jolla rajataan lopullisen testin vaihteluväliä. 28. Suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 %. Sitä korkeammilla tasoilla kromosomit voivat vaurioitua sytotoksisuuden sekundaarivaikutuksena (60). Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli 55 ± 5 prosentin sytotoksisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan. 29. Jos sytotoksisuutta tai saostumista ei esiinny, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 0,01 M, 5 mg/ml tai 5 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin. Analysoitavaksi valittujen pitoisuuksien on pääsääntöisesti erottava toisistaan enintään 10-kertaisesti. Jos testiaineen pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, testiaineiden pitoisuudet voivat tarvittaessa olla lähempänä toisiaan, jotta myös keskitason ja vähäisen toksisuustason viljelmät pisteytetään. 30. Jos liukoisuus on rajoittava tekijä, suurimman pitoisuuden – jos sitä ei ole rajoitettu sytotoksisuuden takia – on oltava se pienin pitoisuus, jossa viljelmissä esiintyy mahdollisimman vähäistä saostumista; saostuminen ei kuitenkaan saa vaikuttaa laskemiseen. Saostumisen arvioinnissa on käytettävä esimerkiksi valomikroskooppia, jotta voidaan havaita viljelyn aikana esiintyvä tai (käsittelyn loppuun mennessä) muodostuva saostuma. Kontrollit 31. Jokaisessa kokeessa on käytettävä samanaikaisia positiivisia kontrolleja ja liuotin-/kantaja-ainekontrolleja metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä. 32. Positiivisia kontrolliaineita tarvitaan, jotta voidaan osoittaa käytettyjen solujen – ja testisuunnitelman – kyky tunnistaa klastogeenejä ja aneugeenejä sekä vahvistaa S9-preparaatin metabolointikyky. Positiivisina kontrollikemikaaleina on käytettävä tunnettuja mikrotumien indusoijia pitoisuuksina, joiden voidaan odottaa aiheuttavan vähäisen mutta toistettavissa olevan lisääntymisen taustaan verrattuna ja osoittaa koejärjestelmän herkkyyden. Positiivisen kontrollikemikaalin pitoisuudet on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. 33. Soluviljelmän metabolointikyky ja klastogeenien osoituskyky on osoitettava käyttämällä metabolista aktivaatiota edellyttävää klastogeenia (esimerkiksi syklofosfamidi tai bentso[a]pyreeni). Muita positiivisia kontrollikemikaaleja voidaan käyttää, jos käyttö perustellaan. Koska tietyt metabolista aktivaatiota edellyttävät positiiviset kontrollikemikaalit voivat tietyissä käsittelyolosuhteissa tai tietyissä solulinjoissa aktivoitua ilman eksogeenista metabolista aktivaatiota, metabolisen aktivaation tarve ja S9-preparaatin toiminta on testattava valitussa solulinjassa ja valituissa pitoisuuksissa. 34. Tähän mennessä ei ole havaittu, että yhdenkään aneugeenin genotoksinen toiminta edellyttäisi metabolista aktivaatiota (16). Nykyisin aneugeenisen toiminnan hyväksyttyjä positiivisia kontrollikemikaaleja ovat esimerkiksi kolkisiini ja vinblastiini. Myös muiden kemikaalien käyttö on sallittu, jos ne indusoivat mikrotumia yksinomaan tai pääasiassa aneugeenisen toiminnan välityksellä. Jotta ei tarvittaisi kahta positiivista kontrollikemikaalia erikseen klastogeenisuutta ja aneugeenisuutta varten (ilman metabolista aktivaatiota), aneugeenisuuden kontrollikemikaalia voidaan käyttää positiivisena kontrollikemikaalina ilman S9-jaetta ja käytetyn metabolisen aktivaatiojärjestelmän riittävyys voidaan testata klastogeenisuuden kontrollikemikaalilla. Sekä klastogeenisuuden että aneugeenisuuden positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä soluissa, joissa ei tarvita S9-jaetta. Ehdotetut positiiviset kontrollikemikaalit esitetään lisäyksessä 3. 35. Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä voidaan harkita, mikäli sopivia kemikaaleja on saatavilla. Positiivisia kontrollikemikaaleja on käytettävä vain, jos ne soveltuvat kyseiselle solutyypille ja kyseisiin aktivaatio-olosuhteisiin. 36. Solujen jokaisena keräämisajankohtana on otettava näytteet myös liuottimella/kantaja-aineella käsitellyistä kontrolleista. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä negatiivisia kontrolleja (ei liuotinta/kantaja-ainetta), paitsi jos julkaistut tai laboratorion aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole käytetyissä pitoisuuksissa genotoksisia tai muita haitallisia vaikutuksia. TESTIMENETTELY Käsittelyaikataulu 37. Jotta aneugeenin tai klastogeenin toiminta tietyssä solusyklin vaiheessa voidaan mahdollisimman todennäköisesti osoittaa, on tärkeää, että testiaineella käsitellään riittävä määrä soluja niiden kaikissa solusyklin vaiheissa. Solulinjojen ja primääristen soluviljelmien käsittelyaikataulu voi näin ollen poiketa jonkin verran lymfosyyttien käsittelyaikataulusta, sillä niiden solusyklin käynnistyminen edellyttää mitogeenista stimulaatiota. Niitä tarkastellaan 41–43 kohdassa (16). 38. Teorian ja julkaistujen tietojen perusteella (18) useimmat aneugeenit ja klastogeenit voidaan osoittaa S9-jakeen kanssa ja ilman S9-jaetta toteutettavalla 3–6 tuntia kestävällä lyhyellä käsittelyjaksolla, jonka jälkeen testiaine poistetaan ja viljelmän annetaan kasvaa 1,5–2,0 solusyklin ajan (6). Solut kerätään noin 1,5–2,0 normaalin (eli käsittelemättömän) solusyklin kuluttua joko käsittelyn aloittamisen jälkeen tai sen lopussa (katso taulukko 1). Näytteenotto- tai palautumisaikoja voidaan pidentää, jos tiedetään tai oletetaan, että testiaine vaikuttaa solusyklin kestoon (esimerkiksi kun testataan nukleosidianalogeja). 39. Koska S9-preparaatiot voivat olla toksisia viljellyille nisäkässoluille, pidennettyä 1,5–2,0 normaalin solusyklin altistusta käytetään vain ilman S9-jaetta. Pidennetyssä käsittelyssä soluja voidaan käsitellä testikemikaalilla joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Näin voidaan ottaa huomioon testiaineen ja sytoB:n mahdollinen vuorovaikutus. 40. Solujen ehdotetut käsittelyaikataulut esitetään taulukossa 1. Näitä yleisiä käsittelyaikatauluja voidaan mukauttaa testiaineen stabiiliuden tai reaktiivisuuden tai käytettävien solujen erityisten kasvuominaisuuksien mukaisesti. Kaikki käsittelyt on käynnistettävä ja saatava päätökseen, kun solut kasvavat eksponentiaalisesti. Aikataulut esitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä olevissa 41–47 kohdassa. Taulukko 1 Solujen käsittely- ja keräämisajankohdat MNvit-määritysmenetelmässä Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat, jotka on käsitelty sytoB:llä + S9 Käsitellään 3–6 tuntia S9:n kanssa; poistetaan S9 ja käsittelyväliaine; lisätään uusi väliaine ja sytoB; kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. – S9 Lyhyt altistus Käsitellään 3–6 tuntia; poistetaan käsittelyväliaine; lisätään uusi väliaine ja sytoB; kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. – S9 Pidennetty altistus Vaihtoehto A: Käsitellään 1,5–2 normaalin solusyklin ajan sytoB:n kanssa; kerätään altistusjakson päättyessä. Vaihtoehto B: Käsitellään 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan; poistetaan testiaine; lisätään uusi väliaine ja sytoB; kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. Solulinjat, joita ei ole käsitelty sytoB:n kanssa (Samat käsittelyaikataulut, mutta sytoB:tä ei lisätä) Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat sytoB:n kanssa 41. Tehokkain menetelmä lymfosyyteille on aloittaa testiaineelle altistaminen 44–48 tunnin kuluttua PHA-stimulaatiosta, kun syklin synkronoitumista ei enää havaita (5). Solut käsitellään ensin testiaineella 3–6 tunnin ajan sekä S9:n läsnä ollessa että ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja lisätään uutta väliainetta, joka sisältää sytoB:tä, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. 42. Jos näistä lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen kauemmin kestävälle käsittelylle ilman S9:ää. On olemassa kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa. Stimuloiduille lymfosyyteille voi kuitenkin olla parempi käyttää vaihtoehtoa A, joilla eksponentiaalinen kasvu voi hidastua 96 tunnin kuluttua stimulaatiosta. Soluviljelmät eivät myöskään saa olla konfluentteja vaihtoehdon B viimeiseen näytteenottoajankohtaan mennessä. — Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä. — Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen. 43. Primaarisoluja ja solulinjoja on käsiteltävä samalla tavalla kuin lymfosyyttejä, mutta niitä ei tarvitse stimuloida PHA:lla 44–48 tunnin ajan. Kun kyseessä ovat muut solut kuin lymfosyytit, niitä on altistettava niin, että tutkimuksen päättymisajankohtana solut ovat edelleen kasvun logaritmisessa vaiheessa. Solulinjat ilman sytoB:tä 44. Soluja on käsiteltävä 3–6 tunnin ajan S9:n läsnä ollessa ja ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. 45. Jos molemmista lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen pidennetylle käsittelylle (ilman S9:ää). Käytettävissä on kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa: — Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä. — Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen. 46. Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois. Nämä solut on kerättävä huolellisesti viljelmien huuhtelun yhteydessä ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa mikrotumia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa. Viljelmien määrä 47. Testiaineen jokaista pitoisuutta sekä kantaja-aine-/liuotinkontrollia ja negatiivista kontrollia varten on käytettävä kaksi rinnakkaisviljelmää. Mikäli laboratorion aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja, yhden viljelmän käyttö voi olla hyväksyttävää. Yhtä viljelmää käytettäessä suositellaan, että pitoisuuksia analysoidaan tavallista suurempi määrä. Solujen kerääminen ja objektilasien preparointi 48. Jokainen viljelmä kerätään ja käsitellään erikseen. Solujen preparointiin voidaan käyttää hypotonista käsittelyä, mutta tämä vaihe ei ole tarpeen, jos solut levittäytyvät lasille riittävästi. Objektilasien preparoinnissa voidaan käyttää erilaisia tekniikoita edellyttäen, että pisteytystä varten saadaan korkealaatuisia solupreparaatteja. Solulima on säilytettävä mikrotumien osoittamista ja (sytokineesin estämiseen perustuvassa menetelmässä) kaksitumaisten solujen luotettavaa tunnistamista varten. 49. Objektilasit voidaan värjätä erilaisilla menetelmillä, kuten Giemsa-menetelmällä tai fluorisoivilla DNA-spesifisillä väriaineilla (59). DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (61) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (62)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Mikrotumien sisällön (kromosomin/kromosomifragmentin) selvittämisessä voidaan käyttää anti-kinetokorivasta-aineita, FISH-tekniikkaa yhdessä pansentromeeri-DNA-koettimien kanssa tai in situ -merkkausta pansentromeerispesifisillä alukkeilla yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen kanssa, jos mikrotumien muodostumisesta halutaan saada mekanistista tietoa (15) (16). Muita klastogeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetelmät on osoitettu tehokkaiksi. Analyysi 50. Kaikki objektilasit, myös positiivisia ja negatiivisia kontrolleja sisältävät, on koodattava ennen mikroskooppitutkimusta. Koodattuja näytteitä voidaan analysoida myös validoidulla, automaattisella virtaussytometria- tai kuva-analyysijärjestelmällä. 51. SytoB-käsiteltyjen viljelmien mikrotumien määrä on analysoitava vähintään 2 000 kaksitumaisessa solussa kutakin pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos käytetään yhtä erillistä viljelmää, viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 kaksitumaista solua pitoisuutta kohti. Jos kussakin pitoisuudessa laskettavissa on huomattavasti vähemmän kuin 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti (tai 2 000 solua, jos käytetään yhtä viljelmää) ja jos mikrotumien määrä ei havaintojen mukaan ole kasvanut merkittävästi, testi on toistettava useammilla soluilla tai vähätoksisemmilla pitoisuuksilla sen mukaisesti, kumpi vaihtoehto soveltuu tarkoitukseen paremmin. On varmistettava, että muodoltaan epäsäännöllisiä kaksitumaisia soluja tai soluja, joiden kaksi tumaa poikkeaa kooltaan huomattavasti toisistaan, ei lasketa; kaksitumaisia soluja ei myöskään saa sekoittaa huonosti levittyneisiin monitumaisiin soluihin. Useampia kuin kaksi päätumaa sisältävistä soluista ei pitäisi analysoida mikrotumia, koska mikrotumien määrä voi olla tällaisissa soluissa suurempi (63) (64). Yksitumaisten solujen laskeminen hyväksytään, jos testiaineen on osoitettu häiritsevän sytoB:n aktiivisuutta. 52. Solulinjoissa, joilla tehdään määritys ilman sytoB-käsittelyä, mikrotumat olisi pisteytettävä vähintään 2 000 solussa pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos yhtä pitoisuutta kohti käytetään vain yhtä viljelmää, kyseisestä viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 solua. 53. Kun sytoB:tä käytetään, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä solujen proliferaation arvioimiseksi (katso lisäys 2) käyttämällä vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Kun käsittely tehdään ilman sytoB:tä, on tärkeää esittää todisteet siitä, että laskettavat solut ovat proliferoituneet (ks. 24–27 kohta). Hyväksyttävyysperusteet 54. Tässä kuvatun MNvit-määritysmenetelmän käyttöä ehdottavan laboratorion on osoitettava valmiutensa osoittaa luotettavasti ja täsmällisesti kemikaalit, jotka tunnetusti toimivat aneugeenisesti ja klastogeenisesti metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä, sekä tunnetut negatiiviset kemikaalit. Tässä on käytettävä lisäyksessä 3 lueteltuja vertailukemikaaleja. Laboratorio voi osoittaa valmiutensa käyttää tätä testimenetelmää asianmukaisesti esittämällä todisteet siitä, että mikrotumien muodostumisen pisteytykseen käytetyissä soluissa on tapahtunut yksi tuman jakautuminen, jos testi tehdään ilman sytoB:tä. 55. Vertailukemikaaleina käytettäväksi suositellaan lisäyksessä 3 lueteltuja kemikaaleja. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan käyttää, jos niiden vaikutus tunnetaan, jos ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos ne on osoitettu merkityksellisiksi MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien suhteen. Perusteluna voidaan esittää muun muassa validointitutkimusta, jossa testiaineen kemikaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella on käytetty useita eri aineita tai vähäisempää ainemäärää. 56. Liuotin-/kantaja-ainekontrollien ja käsittelemättömien viljelmien olisi annettava tulokseksi toistettavasti vähäinen ja yhdenmukainen mikrotumien määrä (yleensä 5–25 mikrotumaa tuhatta solua kohti 11 kohdassa mainittujen solutyyppien osalta). Muiden solutyyppien tuotosten vaihteluvälit voivat olla erilaisia, ja ne on määritettävä, kun solutyyppejä validoidaan MNvit-määritysmenetelmässä käyttämistä varten. Kontrollien vaihteluvälit on määritettävä pitkältä ajalta negatiivisista kontrolleista, liuotinkontrolleista ja positiivisista kontrolleista saatujen tietojen perusteella. Näitä arvoja olisi käytettävä arvioitaessa, ovatko samanaikaiset negatiiviset tai positiiviset kontrollit asianmukaisia. 57. Jos määritysmenetelmän tutkimussuunnitelmaan ehdotetaan pieniä muutoksia (esimerkiksi automaattisten pisteytystekniikoiden käyttämistä manuaalisten laskentatekniikoiden asemesta tai uuden solutyypin käyttämistä), muutoksen vaikutus on osoitettava, ennen kuin tutkimussuunnitelman muutos voidaan hyväksyä. Vaikutuksen osoittamisella tarkoitetaan, että on muun muassa osoitettava, että kromosomin katkeamisen, liittymän tai häviämän tärkeimmät mekanismit voidaan osoittaa ja että testattavan yksittäisen aineen luokalle tai monille erilaisille aineille voidaan saada asianmukaiset positiiviset ja negatiiviset tulokset. MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN Tulosten käsittely 58. Jos käytetään sytokineesin inhibiittoritekniikkaa, mikrotumien indusoitumisen arvioinnissa käytetään vain sellaisia kaksitumaisia soluja, joissa esiintyy mikrotumia (riippumatta mikrotumien määrästä solua kohti). Yksi, kaksi tai monta mikrotumaa omaavien solujen määrän laskemisella voidaan saada hyödyllistä tietoa, mutta se ei ole pakollista. 59. Kaikille käsitellyille viljelmille ja liuotin-/kantajakontrolleille olisi tehtävä samanaikaisesti sytotoksisuus- ja/tai sytostaasimääritykset (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on laskettava kaikille käsitellyille viljelmille ja kontrolliviljelmille määrittämällä solusyklin viivästyminen, kun käytetään sytokineesin estomenetelmää. Jos sytoB:tä ei käytetä, on määritettävä populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen, solumäärän suhteellisen lisääntyminen tai PI (katso lisäys 2). 60. Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa. 61. MNvit-määritysmenetelmässä kemikaalit voivat aiheuttaa mikrotumien muodostumista indusoimalla kromosomien katkeamista, niiden häviämistä tai molempia. Antikinetokorivasta-aineilla, sentromeerispesifisillä in situ -koettimilla tai muilla menetelmillä voidaan yrittää määrittää, johtuuko mikrotumien indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta. Tulosten arviointi ja tulkinta 62. Selviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia ei tarvitse vahvistaa täydentävillä testeillä. Epäselviä tuloksia voidaan selventää analysoimalla vielä tuhat solua kaikista viljelmistä, jotta vältetään satunnaisuuden vääristyminen. Jos tulosta ei saada selville tällä tavalla, viljelmille on tehtävä uusia testejä. Niissä olisi harkittava tutkimusparametrien muuttamista tapauksesta riippuen laajemmin tai suppeammin. Tutkimusparametreja, joita voitaisiin muuttaa, ovat muun muassa testipitoisuuksien erot, viljelmien käsittelyajankohta ja solujen keräämisajankohta ja/tai metabolisen aktivaation olosuhteet. 63. Positiivinen tulos voidaan päätellä useiden perusteiden avulla. Näitä ovat esimerkiksi mikrotumallisten solujen määrän pitoisuuteen sidottu kasvu tai tilastollisesti merkittävä kasvu. Aluksi on tarkasteltava tulosten biologista merkityksellisyyttä. Sen arvioimiseksi voidaan tarkastella sitä, ovatko havaitut arvot aiemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella. Testitulosten arvioinnissa voidaan käyttää asianmukaisia tilastollisia menetelmiä (65). Tilastollisen testauksen tuloksia on kuitenkin arvioitava suhteessa annos-vastesuhteeseen. Myös uusittavuus ja aiemmat tulokset on otettava huomioon. 64. Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin tapauksissa mittaustulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä testiaineen aktiivisuudesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. 65. MNvit-määritysmenetelmässä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testiaine indusoi kromosomien katkeamista tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiaine ei käytetyissä testiolosuhteissa indusoi kromosomien katkeamista ja/tai liittymää tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa. Testiraportti 66. Testiraportissa on annettava vähintään seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorituksen kannalta: Testikemikaali — tunnistetiedot sekä CAS-numero ja EC-numero — fysikaalinen olomuoto ja puhtaus — tutkimuksen tekemisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset ominaisuudet — testikemikaalin reagointi liuottimen/kantaja-aineen tai solujen kasvatusväliaineen kanssa Liuotin/kantaja-aine — liuottimen/kantaja-aineen valintaperusteet — testiaineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa Solut — käytettyjen solujen tyyppi ja alkuperä — käytetyn solutyypin soveltuvuus — mahdollinen mykoplasmakontaminaatio — tiedot solusyklin kestosta, jakautumisaika tai proliferaatioindeksi — lymfosyyttien osalta verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja tarvittaessa määrä — lymfosyyttien osalta tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai eristettyjä lymfosyyttejä — tarvittaessa siirrostusten lukumäärä — tarvittaessa soluviljelymenetelmät — kromosomien modaalinen lukumäärä — tavallinen (negatiivisen kontrollin) solusyklin kesto Testiolosuhteet — mahdollinen sytokineesin inhibiittori (esimerkiksi sytoB), sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto — pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä — väliaineen koostumus ja tarvittaessa CO2-pitoisuus — testiaineen pitoisuudet — lisätyn kantaja-aineen ja testiaineen pitoisuus (ja/tai tilavuus) — inkubaatiolämpötila ja -aika — käsittelyn kesto — käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta — tarvittaessa solutiheys inokuloitaessa — metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hyväksyttävyysperusteet — positiiviset kontrollikemikaalit ja negatiiviset kontrollit — objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat — mikrotumien tunnistusperusteet — analysoitujen solujen määrät — sytotoksisuuden mittausmenetelmät — muut sytotoksisuuteen liittyvät tiedot — tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet — käytetyt tilastoanalyysimenetelmät — tarvittaessa menetelmät sen määrittämiseksi, sisältävätkö mikrotumat kokonaisia kromosomeja vai kromosomifragmentteja, esimerkiksi kinetokorivasta-aineen käyttö Tulokset — käytetyt sytotoksisuuden määritysmenetelmät, esimerkiksi sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI (sytokineesin estoon perustuva menetelmä); solumäärän suhteellinen lisääntyminen, populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen tai PI (muu kuin sytokineesin estoon perustuva menetelmä); tarvittaessa muut havainnot, esimerkiksi solujen konfluenssi, apoptoosi, nekroosi, metafaasien määrä ja kaksitumaisten solujen määrä — saostumisen merkit — tiedot käsittelyväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty — analysoitavaksi hyväksyttävien solujen määritelmä — yksi-, kaksi- ja monitumaisten solujen osuudet, jos sytokineesin estoon perustuvaa menetelmää on käytetty — mikrotumallisten solujen määrä kussakin käsitellyssä viljelmässä ja kontrolliviljelmässä ja tiedot solujen mahdollisesta kaksitumaisuudesta tai monitumaisuudesta — pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista — samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten kontrollikemikaalien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet) — aikaisemmat tiedot negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrollikemikaaleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat sekä luottamusväli (esimerkiksi 95 prosenttia) — tilastoanalyysi; mahdolliset p-arvot Tulosten tarkastelu Päätelmät LÄHDELUETTELO (1) Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res. 392, s. 1–4. (2) Parry, J. M. ja Sors, A. (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Res. 287, s. 3–15. (3) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios. 43, s. 233–246. (4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environ. Mol. Mutagen. 35, s. 167–172. (5) Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols 2(5), s. 1084–1104. (6) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Res. 161, s. 193–198. (7) Eastmond, D. A. ja Tucker, J. D. (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environ. Mol. Mutagen. 13, s. 34–43. (8) Eastmond, D. A. ja Pinkel, D. (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes. Mutation Res. 234, s. 9–20. (9) Miller, B. M., Zitzelsberger, H. F., Weier, H. U. ja Adler, I. D. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis 6, s. 297–302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F. ja Natarajan, A. T. (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis 8, s. 329–334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. ja Lo Jacono, F. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Res. 319, s. 205–213. (12) Norppa, H., Renzi, L. ja Lindholm, C. (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis 8, s. 519–525. (13) Eastmond, D. A, Rupa, D. S. ja Hasegawa, L. S. (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Res. 322, s. 9–20. (14) Marshall, R. R., Murphy, M., Kirkland, D. J. ja Bentley, K. S. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Res. 372, s. 233–245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. ja Crebelli, R. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Res. 372, s. 211–219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res. 540, s. 153–163. (17) OECD (1997). In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa www.oecd.org/env/testguidelines (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M. J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. ja Marzin, D. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Res. 607, s. 13–36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L. C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Res. 607, s. 37–60. (20) Aardema, M. J., Snyder, R. D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R. J., Gibson, D. P., Soelter, S., Curry, P. T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Res. 607, s. 61–87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Res. 607, s. 88–124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Res. 607, s. 125–152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A. A. ja Locher, F. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 187–208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. ja Lorge, E. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 45–59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. ja Madle, S. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung. Mutation Res. 410, s. 81–116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. ja Madle, S. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Res. 439, s. 183–190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S. Y., Kasper, P. ja Müller, L. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Res. 445, s. 55–71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H. G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. ja Madle, S. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Res. 468, s. 137–163. (29) Garriott, M. L., Phelps, J. B. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 517, s. 123–134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. ja Sofuni, T. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis 14, s. 569–580. (31) Elhajouji, A. ja Lorge, E. (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Res. 607, s. 1–152. (32) ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC:in 25. kokous, 16.–17. marraskuuta 2006. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm (33) ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J. ja Vanparys P. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis 23, s. 271–283. (35) Zhang, L. S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. ja Sofuni, T. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Res. 347, s. 105–115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. ja Knasmeuller, S. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis 17, s. 257–260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W. W., Hoelzl, C., Bichler, J. ja Majer, B. J. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicol. 198, s. 315–328. (38) Gibson, D. P., Brauninger, R., Shaffi, H. S., Kerckaert, G. A., LeBoeuf, R. A., Isfort, R. J. ja Aardema, M. J. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Res. 392, s. 61–70. (39) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. ja Myhr, B. C. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res. 257, s. 147–205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Res. 268, s. 297–305. (41) Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen. 8, s. 789–886. (42) Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Res. 147, s. 29–36. (43) Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Res. 392, s. 11–18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y. P., Ceppi, M., Chang, W. P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M. P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L. R., Fucic, A., Lima, O. G., Hrelia, P., Krishnaja, A. P., Lee, T. K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W. U., Odagiri, Y., Scarffi, M. R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. ja Zijno, A. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environ. Mol. Mutagen. 37, s. 31–45. (45) Maron, D. M. ja Ames, B. N. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res. 113, s. 173–215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C. R. ja Zeiger, E. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. J. Environ. Pathol. Toxicol. 4, s. 55–65. (47) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis 7, s. 175–177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. ja Sugimura, T. (1976). A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, teoksessa: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. ja Philpot, R. M. (ed.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85–88. (49) Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. ja Galloway, S. M. (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environ. Mol. Mutagen. 28, s. 51–59. (50) UNEP (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopimus. Yhdistyneiden kansakuntien ympäristöohjelma (UNEP). Saatavilla osoitteessa http://www.pops.int/ (51) Doherty, A. T., Ellard, S., Parry, E. M. ja Parry, J. M. (1996). An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells. Mutagenesis 11, s. 247–274. (52) Krahn, D. F., Barsky, F. C. ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, teoksessa: Tice, R. R., Costa, D. L. ja Schaich, K. M. (ed.), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103. (53) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environ. Mutagenesis 5, s. 795–801. (54) Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Res. 285, s. 35–44. (55) Phelps, J. B., Garriott, M. L. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 521, s. 103–112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. ja Wakata, A. (2004). Corrigendum to ’Report from the in vitro micronucleus assay working group’. Mutation Res. 564, s. 97–100. (57) Pincu, M., Bass, D. ja Norman, A. (1984). An improved micronuclear assay in lymphocytes. Mutation Res. 139, s. 61–65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. ja Kirkland, D. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Res. 655, s. 1–3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. ja Marcos, R. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 341, s. 169–184. (60) Galloway, S. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environ. Molec. Mutagenesis 35, s. 191–201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241–247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. ja Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120, s. 269–275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test. Mutation Res. 120, s. 241–247. (64) Fenech, M., Chang, W. P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. ja Zeiger, E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 534, s. 65–75. (65) Hoffman, W. P., Garriott, M. L. ja Lee, C. (2003). In vitro micronucleus test, teoksessa: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2. painos. S. Chow (toim.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, s. 463–467. (66) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 850/2004, annettu 29 päivänä huhtikuuta 2004, pysyvistä orgaanisista yhdisteistä sekä direktiivin 79/117/ETY muuttamisesta. EUVL L 229, 30.4.2004, s. 5. Lisäys 1 Määritelmät Aneugeeni: aine tai prosessi, joka vuorovaikutuksessa solun mitoottisen ja meioottisen jakautumissyklin vaiheiden kanssa johtaa solujen tai organismien aneuploidiaan. Aneuploidia: yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuitenkaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä. Apoptoosi: ohjelmoitunut solukuolema, jossa tietyt vaiheet johtavat solujen hajoamiseen solukalvon ympäröimiksi rakkuloiksi, jotka myöhemmin häviävät fagosytoosin tai puhkeamisen seurauksena. Solujen proliferaatio: solujen määrän kasvaminen solujen mitoottisen jakautumisen seurauksena. Sentromeeri: kromosomin DNA:n alue, jossa kromatidit liittyvät yhteen ja johon molemmat kinetokorit kiinnittyvät rinnakkain. Klastogeeni: aine tai prosessi, joka aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia solu- tai organismipopulaatioissa. Sytokineesi: solun jakautuminen välittömästi mitoosin jälkeen, jolloin muodostuu kaksi yksitumaista tytärsolua. Sytokineesin eston proliferaatioindeksi: toisen jakautumisvaiheen solujen osuus käsitellyssä populaatiossa käsittelemättömään kontrollipopulaatioon verrattuna (katso kaava lisäyksessä 2). Sytostaasi: solujen kasvun estäminen (katso kaava lisäyksessä 2). Sytotoksisuus: solurakenteeseen kohdistuvat haitalliset vaikutukset tai toiminta, joka johtaa solukuolemaan. Genotoksinen: yleinen nimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, muun muassa katkeamiselle, adduktien uudelleenjärjestäytymiselle, mutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin. Interfaasisolut: solut, jotka eivät ole mitoosivaiheessa. Kinetokori: proteiinia sisältävä rakenne, joka rakentuu kromosomin sentromeerin kohdalle, johon tumasukkulat kiinnittyvät solun jakautumisen aikana ja jonka ansiosta tytärkromosomit voivat liikkua kohti tytärsolujen napoja. Mikrotumat: pienet tumat, jotka eivät ole solujen varsinaisia tumia vaan esiintyvät niiden lisäksi ja jotka muodostuvat hitaasti liikkuvista kromosomifragmenteista tai kokonaisista kromosomeista mitoosin tai meioosin telofaasin aikana. Mitoosi: solutuman jakautuminen, joka jaotellaan yleensä profaasiin, prometafaasiin, metafaasiin, anafaasiin ja telofaasiin. Mitoosi-indeksi: suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa. Mutageeninen: aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäsparirakenteessa tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet). Nondisjunktio: häiriö, jossa kromatidiparit eivät erkaannu toisistaan ja jakaudu oikein kehittyviin tytärsoluihin, minkä takia tytärsolujen kromosomimäärä poikkeaa tavallisesta. Polyploidia: solujen tai organismien kromosomien lukumäärää koskeva poikkeavuus, joka koskee yksittäisen kromosomin tai kromosomien (aneuploidia) sijaan koko kromosomistoa. Proliferaatioindeksi (PI): sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2). Solumäärän suhteellinen lisääntyminen: sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2). Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen: sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2). Replikaatioindeksi (RI): altistus- ja palautumisjakson aikana päättyneiden solunjakautumissyklien osuus käsitellyssä viljelmässä verrattuna käsittelemättömään kontrolliviljelmään (katso kaava lisäyksessä 2). Testikemikaali (testiaine): aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä. Lisäys 2 Kaavat sytotoksisuuden määritystä varten 1. Kun sytoB:tä käytetään, sytotoksisuuden arvioinnin on perustuttava sytokineesin eston proliferaatioindeksiin (SEPI) tai replikaatioindeksiin (RI) (16) (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi ilmaisee solusyklien keskimääräistä määrää solua kohti sytoB:lle altistamisen aikana, ja sitä voidaan käyttää solujen proliferaation laskemiseen. RI ilmaisee tumien suhteellista määrää käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolliviljelmiin, ja sitä voidaan käyttää sytostaasiasteen (sytostaasi-%) laskemiseen seuraavasti: sytostaasi-% = 100 – 100{(SEPIT – 1) ÷ (SEPIC – 1)} ja: T = testikemikaalilla käsitelty viljelmä C = kantaja-ainekontrolliviljelmä jossa: Näin ollen, jos SEPI = 1 (kaikki solut ovat yksitumaisia), sytostaasi on 100 %. Sytostaasi = 100 – RI T = käsitellyt viljelmät C = kontrolliviljelmät 2. Näin ollen, jos RI = 53 %, kontrolliviljelmässä kaksitumaisiksi ja monitumaisiksi soluiksi jakaantuneiden solujen määrään verrattuna vain 53 % soluista jakaantui käsitellyssä viljelmässä, eli sytostaasi on 47 %. 3. Kun sytoB:tä ei käytetä, sytotoksisuus on arvioitava solumäärän suhteellisen lisääntymisen (SMSL) tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen (PSK) perusteella (58), koska molemmissa otetaan huomioon jakaantuneen solupopulaation osuus. jossa: populaation kaksinkertaistuminen = [log (solumäärä käsittelyn jälkeen ÷ alkuperäinen solumäärä)] ÷ log 2 4. Näin ollen, jos SMSL tai PSK = 53 %, sytotoksisuus/sytostaasi = 47 %. 5. Sytotoksisuutta voidaan arvioida proliferaatioindeksin (PI) avulla laskemalla 1 solusta (kl1), 2 solusta (kl2), 3 tai 4 solusta (kl4) ja 5–8 solusta (kl8) muodostuneiden kloonien määrä seuraavasti 6. Proliferaatioindeksiä on käytetty sytotoksisuuden tärkeänä ja luotettavana parametrina myös ilman sytoB:tä in situ viljellyille solulinjoille (25) (26) (27) (28). Lisäys 3 Suorituskyvyn arviointiin suositeltavat vertailukemikaalit (16) Luokka Kemikaali CAS-numero EC-numero 1. Klastogeenit, jotka ovat aktiivisia ilman metabolista aktivaatiota Sytosiiniarabinosidi 147-94-4 205-705-9 Mitomysiini C 50-07-7 200-008-6 2. Klastogeenit, jotka edellyttävät metabolista aktivaatiota Bentso(a)pyreeni 50-32-8 200-028-5 Syklofosfamidi 50-18-0 200-015-4 3. Aneugeenit Kolkisiini 64-86-8 200-598-5 Vinblastiini 143-67-9 205-606-0 4. Negatiiviset aineet Di(2-etyyliheksyyli)ftalaatti 117-81-7 204-211-0 Nalidiksiinihappo 389-08-2 206-864-7 Pyreeni 129-00-0 204-927-3 Natriumkloridi 7647-14-5 231-598-3 B.50. IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ: DA JOHDANTO 1. Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiiren ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvän työn arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: DA -menetelmä (jonka on kehittänyt Daicel Chemical Industries, Ltd) on LLNA-menetelmän mukautus, jossa ei käytetä radioaktiivisia merkkiaineita, vaan jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään bioluminesenssin avulla määritettävän adenosiinitrifosfaattipitoisuuden (ATP-pitoisuuden) avulla. Kansainvälinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: DA -testimenetelmän, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistäviä ja muunlaisia kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12) (13). Tässä selostettu testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (14). Käytettäessä LLNA-menetelmää (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahta muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvaa muunnosta eli LLNA: DA -menetelmää (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) voidaan testeihin käytettävien eläinten määrää vähentää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (14) tarkoitettuihin marsutesteihin verrattuna. 2. Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: DA -menetelmässä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) 0. MÄÄRITELMÄT 3. Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. JOHDANTO JA RAJOITUKSET 4. LLNA: DA -menetelmä on LLNA-menetelmän muunnos, jolla voidaan tunnistaa mahdollisia ihoa herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: DA -menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testiaineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisia kemikaaleja koskevat toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA: DA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA: DA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä. 5. LLNA: DA on in vivo -menetelmä, joten sillä ei lopeteta koe-eläinten käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14). LLNA: DA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä), koska toisin kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: DA -menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. Vaikka LLNA: DA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edistyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (14), siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (16) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (14)). Suositellaan, että LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) sovelletaan myös LLNA: DA -menetelmään (10). LLNA: DA -menetelmä ei välttämättä sovellu ATP-pitoisuuksiin vaikuttavien, esimerkiksi ATP-inhibiittoreina toimivien aineiden tai sellaisten aineiden testaukseen, jotka vaikuttavat solun sisäisen ATP:n täsmälliseen määrittämiseen (esimerkiksi ATP:tä hajottavat entsyymit, solun ulkopuolinen ATP imusolmukkeessa). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta aineet on testattava LLNA: DA -menetelmällä, elleivät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA: DA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) välillä 1,8–2,5 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 44 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,8 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: DA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kolme niistä 12 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,8–2,5 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia. TESTIMENETELMÄN PERIAATE 6. LLNA: DA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota pelkästään kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8, jotta testiaine olisi syytä arvioida tarkemmin mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä määritysmenetelmässä kuvatut menettelyt perustuvat ATP-pitoisuuden mittaamiseen bioluminesenssin avulla (sen tiedetään korreloivan elävien solujen määrää) (17), millä määritetään solujen proliferaation lisääntyminen dreneeraavissa korvalehden imusolmukkeissa (18) (19). Bioluminesenssimenetelmässä lusiferaasientsyymi katalysoi valon muodostusta (luminesenssia) ATP:sta ja lusiferiinista. Reaktio tapahtuu seuraavan kaavan mukaisesti: ATP + Lusiferiini + O 2 Oksilusiferiini + AMP + PPi + CO 2 + Valo ATP ATP Luciferin lusiferiini O2 O2 Luciferase lusiferaasi Oxyluciferin oksilusiferiini AMP AMP PPi PPi CO2 CO2 Light valo Emittoituneen valon valovoima on suoraan verrannollinen ATP-pitoisuuteen, ja se mitataan luminometrillä. Lusiferiini-lusiferaasi-määritysmenetelmä on herkkä ATP-pitoisuuden määritysmenetelmä, jota käytetään erilaisissa käyttökohteissa (20). MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS Eläinlajin valinta 7. Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: DA -määritysmenetelmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/J-kannalla, joten sen käyttöä suositellaan (12) (13). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: DA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja. Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta 8. Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (21), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Eläinten valmistelu 9. Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita. Annosteluliuosten valmistelu 10. Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana, tai ne voidaan laimentaa ennen annostelua. Liukenemattomat kemikaalit, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytetyt kemikaalit, on uutettava erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. Luotettavuuden tarkistus 11. Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien avulla. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen. Vasteen on oltava aineelle tyypillinen. Samanaikaisesti on käytettävä positiivista kontrollikemikaalia, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetelmän käyttöön. Sen avulla voidaan myös arvioida laboratorioidenvälistä ja laboratorionsisäistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Jotkut sääntelyviranomaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutkimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA: DA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään aina näytteiden kanssa samanaikaisesti, jotta ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka aiheutuvat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä vain silloin tällöin (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: DA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8. Positiivisen kontrollikemikaalin annospitoisuus on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 10 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit. 12. Vaikka positiivisen kontrolliryhmän samanaikaista käyttöä suositellaan, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus ajoittain (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: DA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: DA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa), joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA DA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson (alle yhden vuoden) aikana. 13. Samanaikaista positiivista kontrolliryhmää olisi käytettävä aina, kun LLNA: DA -menettelyjä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu). Tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi määritystietoja positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi. 14. Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua, jos samanaikaista positiivista kontrollia ei testata ajoittain tehtyjen positiivisten kontrollitestien välillä. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen kanssa samanaikaisesti tai vain ajoittain. Olisi myös harkittava pienemmän eläinmäärän käyttämistä testiaineen kanssa samanaikaisesti tehtävää positiivista kontrolliryhmää varten, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (22). 15. Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit olisi mieluiten testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), voi joidenkin säännösten mukaan olla tarpeen testata aine myös muussa kuin vakiokantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa (23)). Jos positiivista kontrollikemikaalia testataan samanaikaisesti eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia varten käytettävä erillistä kantaja-ainekontrollia. 16. Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia aineita voidaan myös vertailuaineita käyttää osoittamaan, että testimenetelmällä voidaan osoittaa asianmukaisesti tämäntyyppisten aineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet: — samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä — tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet — sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä — sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä. TESTIMENETTELY Koe-eläinten määrä ja annostasot 17. Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään samanaikaisesti määritettävää negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella. 18. Annostaso ja kantaja-aine on valittava lähteissä (2) ja (24) esitettyjen suositusten perusteella. Annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) sekä rakennetta ja fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia koskevat tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (24) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä esitesti (katso 21–24 kohta). 19. Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen konsentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisimman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää. 20. Yksittäisiä hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja verrata tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (22). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä koskevien tietojen säännöllisellä keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella. Testiä edeltävä kartoitus 21. Jos ei ole tietoja, joiden perusteella päätetään suurin testattava annos (katso 18 kohta), on LLNA: DA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso selvitettävä ennen päätestiä. Siten saadaan apua enimmäisannoksen valintaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen on vastattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta. 22. Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 8). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta), päivänä 7 (24 tuntia ennen lopettamista) ja päivänä 8. Päivänä 8 korvan paksuus voidaan määrittää myös mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA: DA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä. Taulukko 1 Eryteemapisteytys Havainto Pisteet Ei eryteemaa 0 Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) 1 Selkeästi erottuva eryteema 2 Keskivakava–vakava eryteema 3 Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen 4 23. Paitsi korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua (26) (27), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden lisääntymistä kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi LLNA-menetelmässä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tilastollisesti merkittävää paksuuntumista voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuuntuminen on alle 25 prosenttia, mutta sen ei katsota liittyvän spesifisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (31) (32) (33) (34). 24. Seuraavat kliiniset havainnot voivat kokonaisvaltaisessa arvioinnissa olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA. DA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 8 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (36). Varsinaisen tutkimuksen aikataulu 25. Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava: — Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 1-prosenttista natriumlauryylisulfaattivesiliuosta (NLS) NLS-liuokseen upotetulla siveltimellä niin että kunkin korvan takaosa peittyy neljällä tai viidellä sivellyksellä. Yhden tunnin kuluttua NLS-käsittelystä kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (samanaikaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta. — Päivät 2, 3 ja 7: Toistetaan päivänä 1 suoritettu 1-prosenttisella NLS-vesiliuoksella tehty alustava käsittely ja testiaineen annostelu. — Päivät 4, 5 ja 6: Ei käsittelyä. — Päivä 8: Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Noin 24–30 tunnin kuluttua päivänä 7 tehdyn annostelun aloittamisesta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja poistamiseen liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (22). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa edelleen sisällyttämällä tutkimussuunnitelmaan täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla). Solususpensioiden valmistus 26. Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan yksisolususpensio asettamalla imusolmukkeet kahden objektilasin väliin ja painamalla niitä kevyesti imusolmukkeiden murskaamiseksi. Tämän jälkeen varmistetaan, että kudos on levinnyt objektilaseille ohuesti, ja objektilasit irrotetaan toisistaan varovasti. Molemmilla objektilaseilla oleva kudos suspendoidaan PBS-liuokseen niin, että kumpaakin objektilasia pidetään kallistettuna petrimaljan yläpuolella ja huuhdellaan PBS-liuoksella samalla, kun kudosta raaputetaan objektilasista soluraaputtimella. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Molemmat objektilasit on huuhdeltava yhteensä 1 ml:lla PBS-liuosta. Imusolmukeparien soluista petrimaljaan valmistettu suspensio homogenoidaan kevyesti soluraaputtimella. Tämän jälkeen imusolmukeparien soluista valmistetusta suspensiosta otetaan 20 μl:n mittausnäyte mikropipetillä niin, ettei näytteeseen tule mukaan silmämääräisesti havaittavaa kalvoa. Suspensio sekoitetaan 1,98 ml:aan PBS-liuosta, jolloin saadaan 2 ml:n näyte. Tämän jälkeen valmistetaan toinen 2 ml:n näyte samalla menettelyllä niin, että kustakin eläimestä saadaan kaksi näytettä. Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien ATP-pitoisuuden mittaaminen) 27. Imusolmukkeiden ATP-pitoisuuden kasvua mitataan lusiferiini/lusiferaasi-menetelmällä käyttämällä ATP-määrityskittiä, jolla mitataan bioluminesenssia suhteellisina valoyksikköinä (Relative Luminescence Unit, RLU). Määritys tehdään aikana, joka ulottuu imusolmukkeiden eläimestä irrottamisesta ATP-pitoisuuden mittaamiseen. Sen on oltava kunkin eläimen osalta sama noin 30 minuutin tarkkuudella, sillä ATP-pitoisuuden katsotaan laskevan vähitellen sen jälkeen, kun eläin on kuollut (12). Näin ollen menettely, joka käynnistyy korvalehden imusolmukkeiden irrottamisesta ja päättyy ATP-mittaukseen, olisi saatava päätökseen 20 minuutin sisällä etukäteen määritettyyn määräaikaan mennessä, joka on sama kaikille eläimille. ATP:n luminesenssi on mitattava kustakin 2 ml:n näytteestä. Kullakin eläimellä tehdään siis yhteensä kaksi ATP-mittausta. Tämän jälkeen määritetään ATP:n keskimääräinen luminesenssi, jota käytetään myöhemmin tehtävissä laskelmissa (katso 30 kohta). HAVAINNOT Kliiniset havainnot 28. Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (36). Ruumiinpainot 29. Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä. TULOSTEN LASKEMINEN 30. Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista RLU-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-ainekontrollin vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1. 31. Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,8 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 1,8–2,5) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös annos-vastesuhteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (2) (3) (37). 32. Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,8–2,5, käyttäjät voivat tulosten positiivisuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annos-vastesuhdetta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta tai liian voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4). 33. Kun tietoja kerätään erikseen kustakin hiirestä, tietojen perusteella voidaan analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen olemassaoloa ja sen voimakkuutta. Tilastoanalyysissä voidaan muun muassa arvioida annos-vastesuhdetta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samaan aikaan tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamsin testiä, joilla arvioidaan annos-vasteen suuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Joka tapauksessa tutkijan on mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä. MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN Mittaustulokset 34. Mittaustulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset RLU-arvot, ryhmän eläinkohtaisten RLU-arvojen keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. Testiraportti 35. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testi- ja kontrollikemikaalit — tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero), — fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus), — jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet. Liuotin/kantaja-aine — tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus), — perustelut kantaja-aineen valinnalle. Koe-eläimet — CBA-hiirten alkuperä, — eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa, — eläinten määrä ja ikä, — eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen. Testiolosuhteet — ATP-määrityskitin alkuperä, eränumero ja valmistajan laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot, — tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta, — perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulokset, jos sellainen on tehty), — käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä, — tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä), — tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista, — toksisuuden määritysmenetelmät, — tulosten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet, — tiedot tutkimussuunnitelmasta poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimuksen suunnitteluun ja tuloksiin. Luotettavuuden tarkistus — yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta, — testauslaboratorion samanaikaisesti ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset, — jos mukana ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän yksittäisen positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tarvitse tehdä joka kerta. Tulokset — kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe), — toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kullekin eläinyksilölle, — eläinten lopettamisen ja ATP-mittauksen ajankohta kunkin eläimen osalta, — taulukko yksittäisten hiirten RLU-arvoista ja SI-arvoista kunkin käsitellyn annosryhmän osalta, — kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen RLU-arvon keskimääräinen virhetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle, — laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläintenvälinen vaihtelu sekä testiaineella että kontrolliaineella käsitellyissä ryhmissä, — annos-vastesuhde, — tarvittaessa tilastoanalyysit. Tulosten pohdinta — tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoanalyysit sekä johtopäätös siitä, voidaanko testiainetta pitää ihoherkistystä aiheuttavana. LÄHDELUETTELO (1) OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines (2) Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002. (3) Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997. (4) Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–333. (5) Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59. (6) ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf (7) Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 258–273. (8) Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, a. 274–286. (9) Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 249–257. (10) ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries