LIITE I

Asetuksen 3, 4, 5 ja 7 artiklan mukaisesti suoritettavia testejä koskeva järjestelmä

1. MAINITUN KASVINTUHOOJAN ESIINTYMISTÄ KOSKEVAT YLEISET PERIAATTEET

1.1 Mainitun kasvintuhoojan esiintymistä epäillään, jos asianomaiselle kasville tai vesinäytteille tehdyn ensimmäisen havaitsemistestin tulos on positiivinen.

1.2 Mainitun kasvintuhoojan esiintyminen vahvistetaan seuraavissa tapauksissa: a) ensimmäinen tai toinen havaitsemistesti perustuu selektiiviseen eristämiseen, jonka tuloksena saadaan morfologialtaan tyypillisiä pesäkkeitä, ja kahden pesäkkeille tehdyn tunnistustestin tulos on positiivinen; b) ensimmäinen ja toinen testi ovat muita kuin selektiiviseen eristämiseen perustuvia testejä, ja kahden pesäkkeille tehdyn tunnistustestin tulos on positiivinen, kun näytteelle on ensin tehty selektiivinen eristäminen, jonka tuloksena saadaan morfologialtaan tyypillisiä pesäkkeitä. Toisen kahdesta tunnistustestistä on oltava 2.2 kohdan e, f ja g alakohdassa tarkoitettu testi.

2. TESTIT

2.1 Havaitsemistestit

Havaitsemistestien on oltava sellaisia, että ne osoittavat johdonmukaisesti vähintään 104 solua oireettomista näytteistä saadun uudelleen suspendoidun sakan yhtä millilitraa kohden.

Toisen havaitsemistestin on perustuttava erilaisiin biologisiin periaatteisiin tai eri nukleotidialueisiin kuin ensimmäinen havaitsemistesti.

Havaitsemistestit ovat seuraavat:

a) immunofluoresenssitestit, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

b) mainitun kasvintuhoojan eristäminen osittain valikoivalle kasvualustalle (mSMSA), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

c) tavanomainen PCR-testi käyttäen Pastrik et al. (2002) (1) -alukkeita, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

d) reaaliaikaiset TaqMan®-PCR-testit käyttäen seuraavia alukkeita ja koettimia: i) Weller et al. (2000) (2), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (käyttäen Wellerin et al. (2000) kuvaamasta alkuperäisestä koettimesta muunnettua TaqMan®-koetinta), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (ns. NYtor-testi), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iv) Massart et al. (2014) (5), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

e) silmukkavälitteinen isoterminen monistus (LAMP-testi) käyttäen Lenarčič et al. (2014) (6) -alukkeita (ainoastaan oireiselle kasviaineistolle), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan.

2.2 Tunnistustestit

Tunnistustestit ovat seuraavat:

a) immunofluoresenssitestit, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

b) tavanomaiset PCR-testit käyttäen Pastrik et al. (2002) -alukkeita, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa yksityiskohtaisesti kuvataan;

c) reaaliaikaiset TaqMan®-PCR-testit käyttäen seuraavia alukkeita ja koettimia: i) Weller et al. (2000), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; ii) Vreeburg et al. (2016) (käyttäen Wellerin et al. (2000) kuvaamasta alkuperäisestä koettimesta muunnettua TaqMan®-koetinta), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa yksityiskohtaisesti kuvataan; iii) Vreeburg et al. (2018) (ns. NYtor-testi), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iv) Massart et al. (2014), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

d) silmukkavälitteinen isoterminen monistus (LAMP-testi) käyttäen Lenarčič et al. (2014) -alukkeita, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

e) fylotyyppispesifinen monimonistus käyttäen tavanomaista PCR-testiä (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

f) DNA-viivakoodaus (Wicker et al. (2007) (9)), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

g) MALDI-TOF-massaspektrometria (van de Bilt et al. (2018) (10)), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan.

3. VUOKAAVIOT MENETTELYISTÄ

Vuokaavio nro 1: Diagnoosimenettely mainitun kasvintuhoojan esiintymisen toteamiseksi asianomaisesta kasvista otetuissa näytteissä.

a Ensimmäinen tai toinen havaitsemistesti voi olla eristämiseen perustuva. Jos epäillään mainitun kasvintuhoojan esiintymistä kasvualustassa, pesäkkeet on puhdistettava puhdasviljelmien aikaansaamiseksi. Puhdasviljelmille on suoritettava kaksi tunnistustestiä.

b Toisen näistä kahdesta tunnistustestistä on oltava 2.2 kohdan e, f ja g alakohdassa tarkoitettu testi. Kasvintuhoojan esiintyminen voidaan vahvistaa vain, jos kummankin tunnistustestin tulos on positiivinen.

c Kolmannen havaitsemistestin on perustuttava erilaisiin biologisiin periaatteisiin tai eri nukleotidialueisiin.

Vuokaavio nro 2: Diagnoosimenettely mainitun kasvintuhoojan esiintymisen toteamiseksi vesinäytteissä.

a Toisen näistä kahdesta tunnistustestistä on oltava 2.2 kohdan e, f ja g alakohdassa tarkoitettu testi. Kasvintuhoojan esiintyminen voidaan vahvistaa vain, jos kummankin tunnistustestin tulos on positiivinen.

4. NÄYTTEIDEN VALMISTELU

4.1 Näytteet oireettomista mukuloista

Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti mukuloiden napapää käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

4.2 Näytteet oireettomista asianomaisista kasveista

Piilevien tartuntojen havaitsemiseksi on käytettävä kokoomanäytteitä varrenpalasista tai lehtiruodeista. Menettelyä voidaan soveltaa näytteeseen, joka sisältää enintään 200 varrenpalasta tai 200 lehtiruotia, jotka ovat peräisin eri kasveista. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti varren- tai lehtiruodinpalaset desinfioidaan ja käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

4.3 Näytteet asianomaisten kasvien oireisesta aineistosta

Perunan mukulan johtosolukkorenkaasta tai nuutuneelta vaikuttavien asianomaisten kasvien varren johtojänteistä irrotetaan aseptisesti paloja solukosta. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan yksityiskohtaisesti asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti nämä solukonpalat käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

4.4 Näytteet pinta- tai kierrätysvedestä (mukaan lukien perunanjalostuksessa syntyvät jätevedet ja muut jätevedet)

Pääasiallinen testimenetelmä mainitun kasvintuhoojan havaitsemiseksi pintavedestä, kierrätysjärjestelmien vedestä ja jätevesistä (perunanjalostusteollisuus) otetuissa näytteissä on selektiivinen eristäminen. Asianmukainen laboratoriomenettely vesinäytteiden käsittelemiseksi kuvataan kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002), ”Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control”, European Journal of Plant Pathology 108, s. 831–842.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000), ”Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay”, Applied and Environmental Microbiology, 66, s. 2853–2858 (https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000).

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016), ”Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing”, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, s. 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), ”Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin 48, s. 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), ”Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology 138, s. 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014), ”Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum”, PLoS ONE 9(4), e96027 (https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027).

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997), ”A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum)”, Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, s. 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005), ”How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex” (toim. Allen C, Hayward AC & Prior P), s. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (Yhdysvallat).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007), ”Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential”, Applied and Environmental Microbiology 73, s. 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018), ”Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum”, European Journal of Plant Pathology (https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5).