Toinen komission direktiivi 82/434/ETY, annettu 14 päivänä toukokuuta 1982, kosmeettisten valmisteiden koostumuksen tarkastamisessa tarvittavia analyysimenetelmiä koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön lähentämisestä



Virallinen lehti nro L 185 , 30/06/1982 s. 0001 - 0028

Suomenk. erityispainos Alue 13 Nide 12 s. 0071

Espanjank. erityispainos: Luku 15 Nide 3 s. 0179

Ruotsink. erityispainos Alue 13 Nide 12 s. 0071

Portugalink. erityispainos: Luku 15 Nide 3 s. 0179



TOINEN KOMISSION DIREKTIIVI, annettu 14 päivänä toukokuuta 1982, kosmeettisten valmisteiden koostumuksen tarkastamisessa tarvittavia analyysimenetelmiä koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön lähentämisestä (82/434/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, JOKA ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon kosmeettisia valmisteita koskevan jäsenvaltioiden lainsäädännön lähentämisestä 27 päivänä heinäkuuta 1976 annetun neuvoston direktiivin 76/768/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 79/661/ETY(2), ja erityisesti sen 8 artiklan 1 kohdan, sekä katsoo, että direktiivissä 76/768/ETY säädetään kosmeettisten valmisteiden virallisesta tarkastamisesta, jotta varmistettaisiin, että kosmeettisten valmisteiden koostumusta koskevissa yhteisön säännöksissä asetettuja vaatimuksia noudatetaan, kaikki tarvittavat analyysimenetelmät olisi vahvistettava niin pian kuin mahdollista; ensimmäinen vaihe tämän tavoitteen saavuttamiseksi on jo toteutettu, kun komission direktiivissä 80/1335/ETY(3) säädetään tietyistä menetelmistä, ja toisena vaiheena on menetelmien määrittäminen hapettavien aineiden tunnistamiseksi ja vetyperoksidin määrittämiseksi kosmeettisissa hiustenhoitovalmisteissa, tiettyjen hapettuvien väriaineiden tunnistamiseksi ja semikvantitatiiviseksi määrittämiseksi hiusten värjäysaineissa, nitriitin tunnistamiseksi ja määrittämiseksi, vapaan formaldehydin tunnistamiseksi ja määrittämiseksi, resorsinolin määrittämiseksi shampoissa ja hiusvesissä ja metanolin määrittämiseksi suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat direktiivin 76/768/ETY mukauttamista tekniikan kehitykseen käsittelevän komitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on toteutettava kaikki tarvittavat toimenpiteet sen varmistamiseksi, että kosmeettisten valmisteiden virallisessa tarkastuksessa: - hapettavien aineiden tunnistaminen ja vetyperoksidin määrittäminen hiustenhoitovalmisteissa, - tiettyjen hapettuvien väriaineiden tunnistaminen ja semikvantitatiivinen määrittäminen hiusten värjäysaineissa, - nitriitin tunnistaminen ja määrittäminen, - vapaan formaldehydin tunnistaminen ja määrittäminen, - resorsinolin määrittäminen shampoissa ja hiusvesissä, - metanolin määrittäminen suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin suoritetaan liitteessä selostettujen menetelmien mukaisesti. 2 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 31 päivänä joulukuuta 1983. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 3 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 14 päivänä toukokuuta 1982. Komission puolesta Karl-Heinz NARJES Komission jäsen (1) EYVL N:o L 262, 27.9. 1976, s. 169 (2) EYVL N:o L 192, 31.7.1979, s. 35 (3) EYVL N:o L 383, 31.12.1980, s. 27 LIITE I. HAPETTAVIEN AINEIDEN TUNNISTAMINEN JA VETYPEROKSIDIN MÄÄRITTÄMINEN HIUSTENHOITOVALMISTEISSA TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Vetyperoksidin jodometrinen määrittäminen kosmeettisissa aineissa on mahdollista vain, kun aine ei sisällä muita jodideista jodia muodostavia hapettavia aineita. Tämän vuoksi on ennen vetyperoksidin jodometristä määrittämistä tarpeen löytää ja tunnistaa aineessa mahdollisesti olevat muut hapettavat aineet. Tämä tunnistaminen jakautuu kahteen vaiheeseen: ensimmäinen käsittää persulfaatit, bromaatit ja vetyperoksidin ja toinen bariumperoksidin. A. PERSULFAATTIEN, BROMAATTIEN JA VETYPEROKSIDIN TUNNISTAMINEN 1 PERIAATE Natriumpersulfaatti, kaliumpersulfaatti ja ammoniumpersulfaatti; kaliumbromaatti, natriumbromaatti ja vetyperoksidi - bariumperoksidista tai muualta peräisin oleva - tunnistetaan laskevan paperikromatografian avulla, käyttäen kahta kehiteliuosta. 2 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 2.1 0,5 % (m/v) vesipitoinen vertailuliuos seuraavista yhdisteistä: 2.1.1 Natriumpersulfaatti 2.1.2 Kaliumpersulfaatti 2.1.3 Ammoniumpersulfaatti 2.1.4 Kaliumbromaatti 2.1.5 Natriumbromaatti 2.1.6 Vetyperoksidi 2.2 Kehiteliuos A, 80 % (v/v) etanoli 2.3 Kehiteliuos B, bentseeni - metanoli - 3-metyyli-1-butanoli - vesi (34:38:18:10 tilavuuksina) 2.4 Värjäysliuos A, 10 % (m/v) kaliumjodidin vesiliuos 2.5 Värjäysliuos B, 1 % (m/v) tärkkelyksen vesiliuos 2.6 Värjäysliuos C, 10 % (m/m) suolahappo 2.7 4 N suolahappoliuos 3 LAITTEET JA VARUSTEET 3.1 Kromatografiapaperi (Whatman-paperi N:o 3 ja 4 tai niitä vastaava) 3.2 Mikropipetti, 1 ìl 3.3 Mittapulloja, 100 ml 3.4 Laskostettuja suodattimia 3.5 Laskevan paperikromatografian laitteisto 4 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY 4.1 Vesiliukoiset valmisteet Kustakin näytteestä tehdään kaksi liuosta liuottamalla erikseen 1 g ja 5 g valmistetta 100 ml:aan vettä. Kumpaakin näistä liuoksista käytetään 1 ìl 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian suorittamiseksi. 4.2 Huonosti veteen liukenevat valmisteet 4.2.1 Näytteestä punnitaan 1 g ja 5 g ja dispergoidaan ne 50 ml:aan vettä, täytetään vedellä 100 ml:aan saakka ja sekoitetaan. Kumpikin dispersio suodatetaan laskostetun suodattimen (3.4) läpi ja kumpaakin suodosta käytetään 1 ìl 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian suorittamiseksi. 4.2.2 Valmistetaan taas kaksi dispersiota kustakin näytteestä dispergoimalla 1 g ja 5 g näytettä 50 ml:aan vettä, tehdään happamaksi laimealla suolahapolla (2.7), täytetään vedellä 100 ml:aan saakka ja sekoitetaan. Dispersiot suodatetaan laskostetun suodattimen (3.4) läpi ja kumpaakin suodosta käytetään 1 ìl 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian suorittamiseksi. 4.3 Voiteet Kutakin valmistetta dispergoidaan 5 g ja 20 g 100 ml:aan vettä ja käytetään näitä dispersioita 5 kohdassa kuvatun paperikromatografian suorittamiseksi. 5 MENETTELY 5.1 Sopiva määrä liuosta A (2.2) ja B (2.3) laitetaan kahteen erilliseen kromatografia-astiaan laskevan paperikromatografian suorittamiseksi. Kromatografia-astioita kyllästetään vähintään 24 tuntia liuotinhöyryllä. 5.2 Lisätään 1 ìl yhtä näyteliuosta ja yhtä vertailuliuosta, jotka on valmistettu 4 ja 2.1 kohtien mukaisesti kuhunkin 40 cm pitkän ja 20 cm leveän tai muun sopivan mallisen kromatografiapaperin (3.1) aloituspisteeseen (Whatman N:o 3 tai vastaava) ja annetaan liuoksen haihtua ilmaan. 5.3 Kromatografiapaperi (5.2) laitetaan kromatografia-astiaan, joka on täytetty kehiteliuoksella A (5.1) ja kehitetään, kunnes kehiteliuos on edennyt 35 cm (noin 15 tuntia). 5.4 Toistetaan 5.2 ja 5.3 kohdassa kuvatut toiminnat käyttäen kromatografiapaperia (Whatman N:o 4 tai vastaava) (3.1) ja kehiteliuosta B. Kromatografoidaan, kunnes kehiteliuos on edennyt 35 cm (noin 5 tuntia). 5.5 Kehittämisen jälkeen kromatogrammit poistetaan astiasta ja ne kuivataan ilmassa. 5.6 Täplät kromatogrammissa saadaan näkyviin ruiskuttamalla sitä peräkkäin: 5.6.1 värjäysliuoksella A (2.4) ja heti sen jälkeen värjäysliuoksella B (2.5). Persulfaattitäplät ilmestyvät nyt ensin kromatogrammiin ja niitä seuraavat vetyperoksiditäplät. Täplät merkitään kynällä; 5.6.2 värjäysliuoksella C (2.6) käyttäen kohdan 5.6.1 mukaisesti käsiteltyä kromatogrammia; harmaansiniset täplät kromatogrammissa osoittavat nyt valmisteen sisältämät bromaatit. 5.7 Edellä mainituissa ajo-olosuhteissa kehiteliuoksilla A (2.2) ja B (2.3) ovat vertailuaineiden (2.1) Rf-arvot keskimäärin seuraavat: >TAULUKON PAIKKA> B. BARIUMPEROKSIDIN TUNNISTAMINEN 1 PERIAATE Bariumperoksidi tunnistetaan vetyperoksidin muodostumisesta sen jälkeen, kun näyte (A.4.2) on tehty happamaksi sekä bariumionin läsnäolosta. - Kun persulfaatteja ei ole (A): lisätään laimeaa rikkihappoa annokseen hapanta näyteliuosta (B.4.1), jonka seurauksena muodostuu valkoinen bariumsulfaattisakka. Bariumionien esiintyminen näytteessä (B.4.1) vahvistetaan taas paperikromatografialla kuten jäljempänä 5 kohdassa on kuvattu. - Kun bariumperoksidia ja persulfaatteja esiintyy samanaikaisesti (B.4.2), sulatetaan saostuma (B.4.2) emäkseen; suolahappoon liuottamisen jälkeen bariumionien esiintyminen sulatteen liuoksessa (B.4.2.3) vahvistetaan paperikromatografialla ja/tai bariumsulfaatin saostumisella. 2 REAGENSSIT 2.1 Metanoli 2.2 36 % (m/m) väkevä suolahappo 2.3 6 N suolahappo 2.4 4 N rikkihappo 2.5 Roditsonihapon dinatriumsuola 2.6 Bariumkloridi (BaCl2 2H2O) 2.7 Vedetön natriumkarbonaatti 2.8 1 % (m/v) bariumkloridin vesiliuos 2.9 Kehiteliuos, joka koostuu metanolista, väkevästä suolahaposta (36 %) ja vedestä (80:10:10 tilavuuksina) 2.10 Värjäysliuos, 0,1 % (m/v) roditsonihapon dinatriumsuolan vesiliuos, joka valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3 LAITTEET 3.1 Mikropipetti, 5 ìl 3.2 Platinaupokkaita 3.3 Mittapulloja, 100 ml 3.4 Kromatografiapaperia Schleicher and Schüll 2043 b tai vastaava. Paperi puhdistetaan ajamalla sitä yön yli laskevan kromatografian astiassa (A.3.5), jossa on kehiteliuosta (B.2.9), jonka jälkeen se kuivataan. 3.5 Laskostettua suodatinpaperia 3.6 Tavallinen laite nousevan paperikromatografian suorittamiseksi 4 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY 4.1 Valmisteet, joissa ei ole persulfaatteja 4.1.1 Dispergoidaan 2 g valmistetta 50 ml:aan vettä ja säädetään dispersion pH suolahapolla (B.2.3) suunnilleen arvoon 1. 4.1.2 Siirretään dispersio veden avulla 100 ml:n mittapulloon, täytetään vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan. Tätä dispersiota käytetään kohdassa 5 kuvatun paperikromatografia-analyysin suorittamiseksi ja bariumin tunnistamiseksi sulfaatin saostumisen avulla. 4.2 Valmisteet, joissa on persulfaatteja 4.2.1 Dispergoidaan 2 g valmistetta 100 ml:an vettä ja suodatetaan. 4.2.2 Lisätään kuivattuun saostumaan sen 7-10 kertainen painomäärä natriumkarbonaattia (B.2.7), sekoitetaan ja sulatetaan seosta platinaupokkaassa (B.3.2) puolen tunnin ajan. 4.2.3 Jäähdytetään huonelämpötilaan, liuotetaan sulate 50 ml:an vettä ja suodatetaan (B.3.5). 4.2.4 Liuotetaan jäämä sulatteesta suolahappoon (B.2.3) ja täytetään vedellä 100 ml:an. Tätä liuosta käytetään 5 kohdassa kuvatussa paperikromatografia-analyysissä ja bariumin tunnistamisessa sulfaatin saostumisen avulla. 5 MENETTELY 5.1 Sopiva määrä kehiteliuosta (B.2.9) laitetaan nousevan paperikromatografian astiaan ja kyllästetään astiaa vähintään 15 tunnin ajan. 5.2 Kromatografiapaperille, joka on esikäsitelty B.3.4 kohdan mukaisesti, lisätään 5 ìl kutakin liuosta, jotka on valmistettu B.4.1.2 ja B.4.2.4 kohdan mukaisesti, sekä vertailuliuosta B.2.8 kolmeen aloituspisteeseen. 5.3 Näyte- ja vertailutäplät kuivataan ilmassa. Kehitetään kromatogrammia, kunnes kehiteliuos on noussut 30 cm. 5.4 Kromatogrammi poistetaan astiasta ja kuivataan ilmassa. 5.5 Täplät kromatogrammissa saadaan näkyviin ruiskuttamalla paperia värjäysliuoksella B.2.10. Jos näytteessä on bariumia, kromatogrammille ilmestyy punaisia täpliä, joiden RF-arvo on n. 0,10. C. VETYPEROKSIDIN MÄÄRITTÄMINEN 1 PERIAATE Vetyperoksidin jodometrinen määrittäminen perustuu seuraavaan reaktioon: H2O2 + 2H+ +2I- I2 + 2H2O Tämä reaktio etenee hitaasti, mutta sitä voidaan nopeuttaa lisäämällä ammoniummolybdaattia. Muodostunut jodi määritetään titrimetrisesti natriumtiosulfaatilla ja sen perusteella lasketaan vetyperoksidipitoisuus. 2 MÄÄRITELMÄ Edellä kuvatulla tavalla mitattu vetyperoksidipitoisuus ilmoitetaan prosentteina (% m/m) valmisteen painosta. 3 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 3.1 2 N rikkihappo 3.2 Kaliumjodidi 3.3 Ammoniummolybdaatti 3.4 0,1 N natriumtiosulfaatti 3.5 10 % (m/v) kaliumjodidiliuos, joka on valmistettava välittömästi ennen käyttöä 3.6 20 % (m/v) ammoniummolybdaattiliuos 3.7 1 % (m/v) tärkkelysliuos 4 LAITTEET 4.1 Dekantterilaseja, 100 ml 4.2 Byretti, 50 ml 4.3 Mittapulloja, 250 ml 4.4 Mittalaseja, 25 ja 100 ml 4.5 Täyspipettejä, 10 ml 4.6 Erlenmeyerpulloja, 250 ml 5 MENETTELY 5.1 Punnitaan 100 ml:n dekantterilasiin 10 g (m grammaa) valmistetta, joka sisältää noin 0,6 g vetyperoksidia. Näyte siirretään veden avulla 250 ml:n mittapulloon, täytetään vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan. 5.2 Näyteliuosta (5.1) pipetoidaan 10 ml 250 ml:n erlenmeyerpulloon (4.6) ja lisätään peräkkäin 100 ml 2N rikkihappoa (3.1), 20 ml kaliumjodidiliuosta (3.5) ja kolme tippaa ammoniummolybdaattiliuosta (3.6). 5.3 Muodostunut jodi titrataan välittömästi 0,1 N natriumtiosulfaattiliuoksella (3.4) ja juuri ennen kuin päätepiste on saavutettu lisätään muutama millilitra tärkkelysliuosta indikaattoriksi (3.7). 0,1 N Natrium- tiosulfaatin (3.4) kulutus kirjataan millilitroina (V). 5.4 Edellä 5.2 ja 5.3 kohdassa selostetulla tavalla suoritetaan sokeakoe, jossa 10 ml:n näyteliuos korvataan 10 ml:lla vettä. Kirjataan 0,1 N natriumtiosulfaatin kulutus millilitroina sokeakokeessa (Vo ml). 6 TULOSTEN LASKEMINEN Valmisteen vetyperoksidipitoisuus lasketaan painoprosentteina (% m/m) seuraavan kaavan mukaan: % vetyperoksidia = >NUM>(V - Vo) × 1,7008 × 250 × 100 >DEN>m × 10 × 1000 = >NUM>(V - Vo) × 4,252 >DEN>m jossa: m = analysoidun valmisteen määrä grammoina (5.1), Vo = 0,1 N tiosulfaattiliuoksen kulutus millilitroina sokeatestissä (5.4), V = 0,1 N tiosulfaattiliuoksen kulutus millilitroina näyteliuoksen titrauksessa (5.3). 7 TOISTETTAVUUS(1) Valmisteella, joka sisältää noin 6 % m/m vetyperoksidia ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten eron absoluuttinen arvo saa olla yli 0,2 %. II. TIETTYJEN HAPETTUVIEN VÄRIAINEIDEN TUNNISTAMINEN JA SEMIKVANTITATIIVINEN MÄÄRITTÄMINEN HIUSTEN VÄRJÄYSAINEISSA 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tämä menetelmä sopii seuraavien aineiden tunnistamiseen ja semikvantitatiiviseen määrittämiseen voiteina tai nestemäisessä muodossa olevissa hiustenvärjäysaineissa: >TAULUKON PAIKKA> 2 PERIAATE Hapettuvat väriaineet uutetaan 96 % etanolilla pH-arvossa 10 voiteena tai nestemäisenä olevista värjäysaineista ja tunnistetaan ohutkerroskromatografisesti, joko yksi- tai kaksisuuntaisesti. Näiden aineiden semikvantitatiiviseksi määrittämiseksi näytteiden kromatogrammeja verrataan neljän kehiteliuoksen avulla samanaikaisesti ja mahdollisimman samanlaisissa olosuhteissa valmistettujen vertailuaineiden vastaaviin. 3 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 3.1 Etanoli, vedetön 3.2 Asetoni 3.3 Etanoli, 96 % v/v 3.4 Ammoniakkiliuos, 25 % (d 420 = 0,91) 3.5 L(+)-askorbiinihappo 3.6 Kloroformi 3.7 Sykloheksaani 3.8 Typpi, tekninen laatu 3.9 Tolueeni 3.10 Bentseeni 3.11 n-butanoli 3.12 2-butanoli 3.13 Hypofosforihapoke, 50 % v/v -liuos 3.14 Diatsoreagenssi, joko: - 3-nitro-1-bentseenidiatsoniumklooribentseenisulfonaatti, (stabiloituna suolana), kuten "Red 2 JN - Francolor", - 2-kloro-4-nitro-1-bentseenidiatsoninaftaleenibentsoaatti (stabiloituna suolana), kuten NNCD-reagenssi - viitenumero 74150 FLUKA, tai vastaava. 3.15 Hopeanitraatti 3.16 p-dimetyyliaminobentsaldehydi 3.17 2,5-dimetyylifenoli 3.18 Ferrikloridiheksahydraatti 3.19 Suolahappo, 10 % m/v -liuos 3.20 Vertailuaineet Vertailuaineet ovat samat kuin 1 kohdassa "Tarkoitus ja soveltamisala" mainitut. Mikäli määritetään amiiniyhdisteitä, on vertailuaineen oltava joko hydrokloridi (mono tai di) tai vapaa emäs. 3.21 Vertailuliuokset 0,5 % (m/v) Valmistetaan 0,5 % (m/v) liuos kustakin 3.20 kohdassa mainitusta vertailuaineesta. Punnitaan 50 mg ± 1 mg vertailuainetta 10 ml:n mittapulloon. Lisätään 5 ml 96 % etanolia (3.3) ja 250 mg askorbiinihappoa (3.5). Liuos tehdään alkaliseksi lisäämällä ammoniakkiliuosta (3.4) niin, että pH-arvoksi tulee 10 (tarkastetaan indikaattoripaperilla). Täytetään 96 % etanolilla (3.3) 10 ml:aan ja sekoitetaan. Liuoksia voidaan säilyttää viikon ajan viileässä ja pimeässä paikassa. Tietyissä tapauksissa voi askorbiinihapon ja ammoniakin lisäämisen jälkeen muodostua sakkaa. Sen on silloin annettava laskeutua ennen kokeen jatkamista. 3.22 Kehiteliuokset 3.22.1 Asetoni-kloroformi-tolueeni (35:25:40 tilavuuksina) 3.22.2 Kloroformi-sykloheksaani-absoluuttinen etanoli-25 % ammoniakki (80:10:10:1 tilavuuksina) 3.22.3 Bentseeni-2-butanoli-vesi (50:25:25 tilavuuksina). Ravistetaan hyvin ja käytetään ylempää kerrosta erottumisen jälkeen huoneenlämmössä (20-25 °C). 3.22.4 n-butanoli-kloroformi-reagenssi M (7:70:23 tilavuuksina). Erotetaan huonelämpötilassa (20-25 °C) huolellisesti ja käytetään alempaa kerrosta. Reagenssin M valmistaminen >TAULUKON PAIKKA> Huomautus Ammoniakkia sisältävät kehiteliuokset on ravistettava hyvin välittömästi ennen käyttöä. 3.23 Indikaattoriaineet 3.23.1 Diatsoreagenssi Valitusta reagenssistä (3.14) tehdään 5 %:n (m/v) vesiliuos. Tämä liuos on tehtävä juuri ennen käyttöä. 3.23.2 Ehrlichin reagenssi Liuotetaan 2 g p-dimetyyliaminobentsaldehydiä (3.16) 100 ml:aan 10 %:ista (m/v) suolahapon vesiliuosta (3.19). 3.23.3 2,5-dimetyylifenoli-ferrikloridiheksahydraatti Liuos 1: Liuotetaan 1 g dimetyylifenolia (3.17) 100 ml:aan 96 % etanolia (3.3). Liuos 2: Liuotetaan 4 g ferrikloridiheksahydraattia (3.18) 100 ml:aan 96 % etanolia (3.3). Värjäyksessä näitä liuoksia ruiskutetaan erikseen, ensin liuosta 1, sitten liuosta 2. 3.23.4 Ammoniakkipitoinen hopeanitraatti 25 % ammoniakkia (3.4) lisätään hopeanitraatin (3.15) 5 % (m/v) vesiliuokseen, kunnes sakka juuri liukenee. Tämä reagenssi on valmistettava välittömästi ennen käyttöä. Ei voida säilyttää. 4 LAITTEET 4.1 Tavalliset ohutkerroskromatografiassa tarvittavat laboratoriolaitteet. 4.1.1 Muovinen tai lasinen suojus, joka on suunniteltu sellaiseksi, että kromatografialevy voidaan ympäröidä typellä täplien aplikoimisen ja kuivaamisen aikana. Tämä varotoimenpide on tarpeen, koska tietyt väriaineet ovat herkkiä hapettumaan. 4.1.2 Mikroruisku 10 ìl, jossa 0,2 ìl:n asteikko ja neliöprofiilineula, tai mieluummin 50 ìl:n annostelija asennettuna telineeseen siten, että levyä voidaan pitää typessä. 4.1.3 Silikageeli-ohutkerroslevyjä, käyttövalmiita, paksuus 0,25 mm, mitoiltaan 20 × 20 cm (Macherey and Nagel, Silica G-HR, jotka ovat muovilevyllä, tai vastaavia). 4.2 Sentrifuugi, 4 000 kierrosta/minuutti. 4.3 Sentrifuugiputkia, 10 ml, joissa PTFE-kierrekorkit, tai vastaavat. 5 MENETTELY 5.1 Näytteiden käsittely Ensimmäiset 2-3 cm putkilosta puristetusta voiteesta heitetään pois. Etukäteen typellä käsiteltyyn sentrifuugiputkeen (4.3) laitetaan: 300 mg askorbiinihappoa ja 3 g voidetta tai 3 g homogenisoitua nestettä. Lisätään 25 % ammoniakkia (3.4) tipottain, kunnes pH on 10. Täytetään 10 ml:aan 96 % etanolilla (3.3). Homogenisoidaan typpiatmosfäärissä (3.8), peitetään tulpalla ja sentrifugoidaan nopeudella 4 000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan. Käytetään supernatanttia. 5.2 Kromatografia 5.2.1 Levyjen aplikointi Kromatografialevylle (4.1.3) laitetaan typpiatmosfäärissä (3.8) 1 ìl kutakin yllämainituista vertailuliuoksista lähtöviivalle yhdeksään pisteeseen, jotka ovat noin 1,5 cm:n päässä toisistaan ja noin 1,5 cm päässä levyn reunasta. Vertailuliuostäplät sijoitetaan seuraavasti: >TAULUKON PAIKKA> Sen lisäksi laitetaan pisteisiin 10 ja 11 kumpaankin 2 ìl koeliuosnäytteitä, jotka on saatu 5.1 kohdan mukaisesti. Levyä pidetään typpiatmosfäärissä (3.8), siihen asti kun se kromatografoidaan. 5.2.2 Kehittäminen Levy laitetaan astiaan, joka on aiemmin käsitelty typellä (3.8), kyllästetty yhdellä neljästä liuoksesta (3.22) ja annetaan kehittyä huoneenlämmössä (20-25 °C) pimeässä, kunnes kehiteliuos on noussut noin 15 cm. Levy poistetaan ja kuivataan typpiatmosfäärissä (3.8) huonelämpötilassa. 5.2.3 Värjääminen Levy värjätään välittömästi yhdellä neljästä 3.23 kohdassa esitetystä liuoksesta. 5.2.4 Tunnistaminen Verrataan näytteestä saatua Rf-arvoa ja väriä kromatografoitujen vertailuaineiden vastaaviin. Taulukossa I ovat esimerkkinä Rf-arvot ja värit kullekin aineelle käytetystä liuoksesta ja indikaattorista riippuen. Epävarma tunnistus saadaan joskus varmistettua lisäysmenetelmällä siten, että vastaavaa vertailuaineliuosta lisätään näyteuutteeseen. 5.2.5 Semikvantitatiivinen määrittäminen Verrataan silmämääräisesti kunkin 5.2.4 kohdan mukaisesti tunnistetun aineen täplän värin intensiteettiä sopivaan vertailuaineen pitoisuuteen. Jos yhden tai useamman näytteestä löydetyn aineen pitoisuus on liian suuri, näyteuute laimennetaan ja mittaus toistetaan. >TAULUKON PAIKKA> 6 KAKSISUUNTAINEN OHUTKERROSKROMATOGRAFIATUTKIMUS Tämä kaksisuuntainen kromatografiamenetelmä edellyttää lisäksi seuraavien standardien ja reagenssien käyttöä. 6.1 Vertailuliuokset ja -aineet 6.1.1 ß-naftoli (ß-N) 6.1.2 2-aminofenoli (OAP) 6.1.3 3-aminofenoli (MAP) 6.1.4 4-aminofenoli (PAP) 6.1.5 2-nitro-1,4-fenyleenidiamiini (2-NPPD) 6.1.6 4-nitro-1,2-fenyleenidiamiini (4-NOPD) Kustakin näistä vertailuaineista valmistetaan 0,5 % m/v liuos, kuten 3.21 kohdassa on kuvattu. 6.2 Kehiteliuos 6.2.1 Etyyliasetaatti-sykloheksaani-ammoniakkiliuos, 25 % (65:30:0,5 tilavuuksina) 6.3 Indikaatiomenetelmä Ohutlevykromatografian kehitysastiaan laitetaan lasiastia, johon lisätään noin 2 g jodikiteitä ja säiliö suljetaan sopivalla kannella. 6.4 Kromatografia 6.4.1 Ohutkerroslevyn (4.1.3) absorptiopinnalle vedetään kaksi viivaa kuvion 1 mukaisesti. 6.4.2 Typpiatmosfäärissä (4.1.1) lisätään 1-4 ìl uutetta (5.1) lähtöpisteeseen 1 (kuvio 1), joka on 2 cm:n päässä kummastakin viereisestä sivusta. Uutteen määrä riippuu täplien intensiteetistä kromatogrammeilla (5.2). 6.4.3 Pisteiden 2 ja 3 (kuvio 1) kesken jaetaan 5.2 kohdan mukaisesti tunnistetut tai tunnistetuiksi oletetut hapettuvat väriaineet (pisteiden välinen etäisyys 1,5 cm). Lisätään 2 ìl kutakin vertailuliuosta, paitsi DAP, jota on lisättävä 6 ìl. Operaatio suoritetaan typpiatmosfäärissä (6.4.2). 6.4.4 Toistetaan 6.4.3 kohdan operaatio lähtöpisteissä 4 ja 5 (kuvio 1) ja levyä pidetään typpiatmosfäärissä siihen asti, kunnes se kromatografoidaan (pisteiden välinen etäisyys 1,5 cm). 6.4.5 Kromatografia-astia käsitellään typellä (3.8) ja siihen laitetaan sopiva määrä kehiteliuosta 3.22.2. Levy laitetaan säiliöön (6.4.4) ja sitä kehitetään ensimmäisessä eluointisuunnassa (kuvio 1) pimeässä. Eluoidaan, kunnes liuottimen reuna saavuttaa levyyn merkityn viivan (n. 13 cm). 6.4.6 Levy poistetaan astiasta ja se laitetaan kromatografia-astiaan, jota on etukäteen käsitelty typellä, ja haihdutetaan eluointiliuosta vähintään 60 minuutin ajan. 6.4.7 Mittalasilla laitetaan sopiva määrä eluointiliuosta (6.2) typellä käsiteltyyn (3.8) astiaan, johon laitetaan 90° käännetty levy astiasta (6.4.6) ja kromatografoidaan toisessa suunnassa (myös pimeässä), kunnes liuottimen reuna saavuttaa absorptiopinnalle vedetyn viivan. Levy otetaan pois säiliöstä ja eluointiliuos haihdutetaan ilmassa. 6.4.8 Levy laitetaan 10 minuutiksi kromatografia-astiaan, jossa on jodihöyryä (6.3) ja tulkitaan kaksisuuntainen kromatogrammi käyttäen samanaikaisesti kromatografoitujen vertailuaineiden Rf-arvoja ja värejä (Taulukossa II opastetaan Rf-arvoja ja värejä). Huomaa: Täplien värittymisen maksimoimiseksi tehty kromatogrammi jätetään atmosfääriin tunniksi kehittämisen jälkeen. 6.4.9 Hapettuvien väriaineiden esiintymisen havaitseminen 6.4.8 kohdan mukaisesti voidaan vahvistaa toistamalla 6.4.1-6.4.8 kohdassa kuvatut toiminnot ja lisäämällä lähtöpisteeseen 1 6.4.2 kohdassa tarkoitetun uutteen päälle 1 ìl 6.4.8 kohdassa tunnistettuja vertailuaineita. Jos ylimääräisiä täpliä ei löydy verrattaessa 6.4.8 kohdassa saadun kromatogrammin kanssa, 6.4.8 kohdan kromatogrammin tulkinta on oikein. >TAULUKON PAIKKA> >VIITTAUS KAAVIOON> III. NITRIITIN TUNNISTAMINEN JA MÄÄRITTÄMINEN A. TUNNISTAMINEN 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tämä menetelmä soveltuu nitriitin tunnistamiseen kosmeettisissa valmisteissa, erityisesti voiteissa ja tahnoissa. 2 PERIAATE Nitriitin esiintymisen osoittaa värillisten johdannaisten muodostuminen 2-aminobentsaldehydifenyylihydratsonin kanssa (Nitrin®). 3 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 3.1 Laimea rikkihappo: laimennetaan 2 ml väkevää rikkihappoa (d 420 = 1,84) 11 ml:lla tislattua vettä. 3.2 Laimea suolahappo: laimennetaan 1 ml väkevää suolahappoa (d 420 = 1,19) 11 ml:lla tislattua vettä. 3.3 Metanoli 3.4 2-aminobentsaldehydifenyylihydratsonin (Nitrin® reagenssi) metanoliliuos. Punnitaan 2,0 g Nitriniä® ja siirretään se kvantitatiivisesti 100 ml:n mittapulloon. Lisätään tipoittain 4 ml laimeaa suolahappoa (3.2) ja ravistellaan. Täytetään merkkiin saakka metanolilla ja sekoitetaan, kunnes liuos on täysin kirkas. Liuosta säilytetään ruskeassa lasipullossa (4.3). 4 LAITTEET 4.1 Dekantterilaseja, 50 ml 4.2 Mittapulloja, 100 ml 4.3 Ruskea lasipullo, 125 ml 4.4 Lasilevy, 10 × 10 cm 4.5 Muovilasta 4.6 Suodatinpaperi, 10 × 10 cm 5 MENETTELY 5.1 Osa tutkittavasta näytteestä levitetään tasaisesti lasilevylle (4.4) niin, että se peittää levyn pinnan enintään 1 cm:n paksuudelta. 5.2 Pala suodatinpaperia (4.6) liotetaan tislatussa vedessä. Suodatinpaperi levitetään näytteen päälle ja painetaan näytteeseen muovilastalla (4.5). 5.3 Odotetaan noin minuutti ja lisätään suodatinpaperin keskelle: - kaksi tippaa laimeaa rikkihappoa (3.1), - sen jälkeen kaksi tippaa Nitrin®-liuosta (3.4). 5.4 Viidestä kymmeneen sekunnin kuluttua suodatinpaperi poistetaan ja sitä tutkitaan päivänvaloa vasten. Nitriitin olemassaolon ilmaisee suodatinpaperin värjäytyminen purppuranpunertavaksi. Jos nitriittipitoisuus on pieni, punertavan purppura väri muuttuu keltaiseksi 5-15 sekunnin kuluttua. Tämä värinmuutos tapahtuu vasta yhden tai kahden minuutin kuluttua, jos nitriittiä on suurina määrinä. 6 HUOMAUTUS Punertavan purppuran värin intensiteetti ja aika, joka kuluu, ennen kuin se muuttuu keltaiseksi voi olla osoituksena näytteen nitriittipitoisuudesta. B. MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmässä kuvataan nitriitin määrittämistä kosmeettisissa valmisteissa. 2 MÄÄRITELMÄ Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen nitriittipitoisuus ilmaistaan natriumnitriitin painoprosentteina. 3 PERIAATE Näyte laimennetaan vedellä ja selkeytetään, minkä jälkeen sen sisältämän nitriitin annetaan reagoida sulfaniiliamidin ja N-1-naftyylietyleenidiamiinin kanssa ja saadun värin absorbanssi mitataan 538 nm:ssä. 4 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 4.1 Selkeytysreagenssit: näitä reagensseja ei saa käyttää pitempään kuin viikon valmistamisesta. 4.1.1 Carrez I -reagenssi: Liuotetaan 106 g kaliumsyaaniferraattia (II) K4Fe(CN)6 7 3H2O, tislattuun veteen ja laimennetaan vedellä 1 000 ml:aan. 4.1.2 Carrez II -reagenssi: Liuotetaan 219,5 g sinkkiasetaattia, Zn(CH3COO)2 7 2H2O ja 30 ml jääetikkaa tislattuun veteen ja laimennetaan vedellä 1 000 ml:an. 4.2 Natriumnitriittiliuos: Liuotetaan 0,500 g natriumnitriittiä tislattuun veteen 1 000 ml mittapulloon ja laimennetaan vedellä merkkiin saakka. Laimennetaan 10,0 ml tätä standardiperusliuosta 500 ml:ksi; 1 ml viimeksi mainittua liuosta = 10 ìg NaNO2:ta. 4.3 1N natriumhydroksidiliuos 4.4 0,2 % sulfaniiliamidihydrokloridi -liuos: Liuotetaan 2,0 g sulfaniiliamidia 800 ml:an vettä lämmittäen. Jäähdytetään ja lisätään 100 ml väkevää suolahappoa samalla sekoittaen. Laimennetaan vedellä 1 000 ml:ksi. 4.5 5 N suolahappoliuos 4.6 N-1-naftyylireagenssi: Tämä liuos on valmistettava käyttöpäivänä. Liuotetaan 0,1 g N-1-naftyylietyleenidiamiinidihydrokloridia veteen ja laimennetaan vedellä 100 ml:aan saakka. 5 LAITTEET 5.1 Analyysivaaka 5.2 100, 250, 500 ja 1 000 ml:n mittapullot 5.3 Pallo- tai mittapipettejä 5.4 100 ml:n mittalaseja 5.5 Laskostettuja suodatinpapereita, nitriitittömiä, halkaisija 15 cm 5.6 Vesihaude 5.7 Spektrofotometri, jossa 1 cm:n kyvetit 5.8 pH-mittari 5.9 10 ml:n mikrobyretti 5.10 250 ml:n dekantterilaseja 6 MENETTELY 6.1 Homogenisoitua näytettä punnitaan 0,5 g (m grammaa) 0,1 mg:n tarkkuudella, se siirretään kvantitatiivisesti kuuman tislatun veden avulla 250 ml dekantterilasiin (5.10), joka täytetään noin 150 ml:n tilavuuteen kuumalla tislatulla vedellä. Dekantterilasi (5.10) laitetaan vesihauteeseen (5.6) 80 °C:n lämpötilaan puoleksi tunniksi. Tänä aikana sisältöä ravistellaan ajoittain. 6.2 Jäähdytetään huoneenlämpöiseksi ja lisätään, samalla sekoittaen, ensin 2 ml Carrez I -reagenssia (4.1.1) ja sitten 2 ml Carrez II -reagenssia (4.1.2). 6.3 Lisätään 1N natriumhydroksidiliuosta (4.3) niin että pH-arvoksi tulee 8,3. (Käytetään pH-mittaria (5.8)). Sisältö siirretään kvantitatiivisesti 250 ml mittapulloon (5.2) ja täytetään tislatulla vedellä merkkiin saakka. 6.4 Sisältö sekoitetaan ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi (5.5). 6.5 Pipetoidaan (5.3) sopiva määrä (V ml) kirkasta suodosta, kuitenkin korkeintaan 25 ml, 100 ml mittapulloon (5.2) ja täytetään tislatulla vedellä 60 ml:n tilavuuteen. 6.6 Sekoittamisen jälkeen lisätään 10,0 ml sulfaniiliamidihydrokloridi -liuosta (4.4) ja sen jälkeen 6,0 ml 5 N suolahappoa (4.5). Sekoitetaan ja annetaan seistä viisi minuuttia. Lisätään 2,0 ml N-1-naftyylireagenssia (4.6), sekoitetaan ja annetaan seistä kolme minuuttia. Laimennetaan vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan. 6.7 Suoritetaan sokeakoe toistamalla 6.5 ja 6.6 kohdassa kuvatut toiminnot lisäämättä N-1-naftyylireagenssia (4.6). 6.8 Mitataan (5.7) 6.6 kohdan mukaisesti saadun liuoksen absorbanssi 538 nm:ssä sokealiuosta vastaan (6.7). 6.9 Luetaan standardikäyrältä (6.10) natriumnitriittipitoisuus mikrogrammoina 100 ml:n liuosmäärää kohti (m1 mikrogrammaa), joka vastaa 6.8 kohdassa mitattua absorbanssia. 6.10 Tehdään standardikäyrä pitoisuuksille 0, 20, 40, 60, 80, 100 ìg natriumnitriittiä 100 ml:ssa käyttäen 10 ìg/ml:n natriumnitriittiliuosta (4.2). 7 TULOSTEN LASKEMINEN Näytteen natriumnitriittipitoisuus lasketaan painoprosentteina seuraavan kaavan avulla: % NaNO2 = 20 >NUM>250 >DEN>V × m1 × 10-6 × >NUM>100 >DEN>m = >NUM>m1 >DEN>V × m × 40 jossa: m = analysoitavaksi otettu näytemäärä grammoina (6.1), m1 = kohdan 6.9 mukainen natriumnitriittipitoisuus mikrogrammoina, V = mittauksessa käytetty suodoksen määrä millilitroina (6.5). 8 TOISTETTAVUUS(2) Natriumnitriittipitoisuuden ollessa noin 0,2 % m/m ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten eron absoluuttinen arvo saa olla enempää kuin 0,005 %. IV. VAPAAN FORMALDEHYDIN TUNNISTAMINEN JA MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tässä menetelmässä kuvataan vapaan formaldehydin tunnistaminen ja määrittäminen. Sitä voidaan soveltaa kaikille kosmeettisille valmisteille ja se koostuu kolmesta osasta: 1.1 Tunnistaminen 1.2 Määrittäminen 2,4-pentaanidionin avulla kolorimetrisesti Tämä menetelmä on riittämätön, mikäli formaldehydi on sitoutunut tai polymeroitunut, kuten formaldehydin luovuttajien kohdalla. Jos tulos ylittää suurimman sallitun pitoisuuden, on käytettävä seuraavaa menetelmää. 1.3 Määrittäminen bisulfiitin avulla Tämän menetelmän avulla ei useimmissa sitoutuneissa tai polymeroiduissa yhdisteissä olevaa formaldehydiä oteta huomioon. Kuitenkin tietyt epästabiilit yhdisteet (heksametyleenitetramiini esimerkiksi) havaitaan. Lisäksi alkalisuuden mittaus on vaikeaa puskuriliuoksen läsnäollessa. 2 MÄÄRITELMÄ Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen vapaa formaldehydipitoisuus ilmaistaan painoprosentteina. 3 PERIAATE 3.1 I osa - Tunnistaminen Formaldehydi muuttaa rikkihapon läsnäollessa Schiffin reagenssin vaaleanpunaiseksi tai sinipunaiseksi. 3.2 II osa - Määrittäminen 2,4-pentaanidionin avulla Formaldehydi reagoi 2,4-pentaanidionin kanssa ammoniumasetaatin läsnäollessa muodostaen 3,5-diasetyyli-1,4-dihydrolutidiinia. Tämä uutetaan 1-butanolilla ja uutteen absorbanssi mitataan 410 nm:ssä. 3.3 III osa - Määrittäminen bisulfiitin avulla Formaldehydi reagoi sulfiitin kanssa happamassa liuoksessa 0 °C:n lämpötilassa muodostaen additioyhdisteen. Ylimääräiset protonit titrataan natriumhydroksidilla. Kulutetut protonit muodostavat laskentaperusteen formaldehydin määrän määrittämiselle. Ilman sulfiittia suoritetun sokeakokeen avulla voidaan mitata väliaineen alkalisuus tai happamuus. 4 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 4.1 Jääetikka 4.2 Vedetön ammoniumasetaatti 4.3 1-Butanoli 4.4 Rikkihappo, noin 2N 4.5 Juuri valmistettu 0,1 M natriumsulfiittiliuos 4.6 Schiffin reagenssi Punnitaan 100 mg fuksiinia dekantterilasiin ja liuotetaan 75 ml:aan vettä 80 °C:n lämpötilassa. Jäähdyttämisen jälkeen lisätään 2,5 g natriumsulfiittiheptahydraattia (Na2SO3 7 7H2O) ja 1,5 ml väkevää suolahappoa (d420 = 1,19). Täytetään 100 ml:ksi. (Tämä reagenssi ei kelpaa käytettäväksi pitempään kuin kaksi viikkoa.) 4.7 2,4-pentaanidionireagenssi 1 000 ml:n mittapulloon liuotetaan: 150 g ammoniumasetaattia (4.2), 2 ml 2,4-pentaanidionia (juuri tislattu alennetussa paineessa - sen ei pitäisi absorboida 410 nm:ssä), 3 ml jääetikkaa (4.1). Täytetään vedellä merkkiin saakka (liuoksen pH: noin 6,4) Tämä reagenssi on valmistettava juuri ennen käyttöä. 4.8 Rikkihapon mittaliuos, 0,1N 4.9 Natriumhydroksidin mittaliuos, 0,1N 4.10 Jodiliuos, 0,1N 4.11 Natriumtiosulfaatti, 0,1N 4.12 Formaldehydin perusliuos Kaadetaan 5 g 37-40 % formaldehydiliuosta 1 000 ml:n mittapulloon ja täytetään tislatulla vedellä merkkiin saakka. Määritetään tämän liuoksen pitoisuus seuraavasti: otetaan 10,00 ml; lisätään 25,00 ml 0,1 N jodiliuosta (4.10) ja 10 ml 1 N natriumhydroksidiliuosta. Annetaan seistä viisi minuuttia. Lisätään 11 ml 1 N HCl:ää ja titrataan ylimääräinen 0,1 N jodiliuos (4.10) 0,1 N natriumtiosulfaattiliuoksella (4.11) käyttäen tärkkelysliuosta indikaattorina. 1 ml 0,1 N jodiliuosta (4.10) vastaa 1,5 mg:aa formaldehydiä. 4.13 Formaldehydin vertailuliuos Pipetoidaan 5,00 ml perusliuosta (4.12) 100 ml:n mittapulloon ja täytetään ionivaihdetulla vedellä merkkiin saakka. Pipetoidaan 5,00 ml yllä mainittua liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään ionivaihdetulla vedellä merkkiin saakka. 1 ml tätä liuosta sisältää noin 1 ìg formaldehydiä. Lasketaan tarkka pitoisuus. 4.14 Tymolftaleiiniliuos, 0,1 g/100 ml 50 % etanolia. 4.15 Vertailureagenssiliuos: kuten reagenssi 4.7 mutta ilman 2,4-pentaanidionia. 5 LAITTEET 5.1 Tavalliset laboratoriolaitteet 5.2 Faasinerotussuodatin, Whatman 1 PS (tai vastaava) 5.3 Sentrifuugi 5.4 Spektrofotometri 5.5 1 cm:n kyvettejä 5.6 Potentiometri, jossa piirturi 5.7 Lasi/kalomelielektrodeja (suositellaan käytettäväksi erityisiä matalan lämpötilan elektrodeja). 6 MENETTELY 6.1 Tunnistaminen 6.1.1 Punnitaan 2 g testattavaa näytettä 10 ml:n dekantterilasiin. 6.1.2 Lisätään kaksi tippaa 2N rikkihappoa (4.4) ja 2 ml Schiffin reagenssia (4.6) (tämän reagenssin on oltava käytettäessä täysin väritöntä). Ravistellaan ja jätetään seisomaan viideksi minuutiksi. 6.1.3 Jos havaitaan vaaleanpunainen tai sinipunainen värisävy viiden minuutin kuluessa, on formaldehydiä läsnä yli 0,01 % ja se on määritettävä 6.2 kohdassa esitetyllä menetelmällä ja tarvittaessa 6.3 kohdassa esitetyllä menetelmällä. 6.2 Määrittäminen 2,4-pentaanidionin avulla kolorimetrisesti 6.2.1 Näyteliuos 6.2.1.1 100 ml:n mittapulloon punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella sellainen määrä testattavaa näytettä (m grammaa), että se vastaa noin 150 mikrogrammaa oletettua formaldehydimäärää. 6.2.1.2 Täytetään ionivaihdetulla vedellä merkkiin saakka ja sekoitetaan. 6.2.1.3 50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan: 10,00 ml 6.2.1.2 kohdassa tarkoitettua liuosta, 5,00 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4.7), ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml. 6.2.2 Vertailuliuos Mahdollinen virhe testinäytteessä olevan taustavärin johdosta estetään käyttämällä tätä vertailuliuosta. 50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan: 10,00 ml 6.2.1.2 kohdassa tarkoitettua liuosta, 5,00 ml vertailureagenssiliuosta (4.15), ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml. 6.2.3 Sokealiuos 50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan: 5,00 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4,7), ionivaihdettua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml. 6.2.4 Määrittäminen 6.2.4.1 Edellä 6.2.1.3, 6.2.2 ja 6.2.3 kohdassa tarkoitettuja pulloja ravistellaan ja ne laitetaan vesihauteeseen 60 °C:n lämpötilaan tarkalleen 10 minuutiksi. Annetaan jäähtyä kahden minuutin ajan jäävesihauteessa. 6.2.4.2 Siirretään 50 ml:n erotussuppiloihin, joissa on 10,00 ml 1-butanolia (4.3). Huuhdellaan kukin pullo 3-5 ml:lla vettä, joka lisätään suppiloihin. Seosta ravistellaan voimakkaasti täsmälleen 30 sekunnin ajan. Annetaan erottua. 6.2.4.3 Suodatetaan kyvetteihin faasinerotussuodattimen läpi. Sentrifugointi (5 000 kierrosta minuutissa viiden minuutin ajan) ei ole yhtä käytännöllistä ja kestää kauemmin. 6.2.4.4 Mitataan 6.2.1.3 kohdan näyteliuoksen uutteen absorbanssi A1 410 nm:ssä 6.2.2 kohdan vertailuliuoksen uutetta vastaan. 6.2.4.5 Samalla tavalla mitataan 6.2.3 kohdan sokealiuoksen uute 1-butanolia (A2) vastaan. Huomaa: Kaikki nämä toiminnot on suoritettava 25 minuutin kuluessa siitä kun erlenmeyerpullot on laitettu 60 °C:n vesihauteeseen. 6.2.5 Standardikäyrä 6.2.5.1 50 ml:n erlenmeyerpulloon laitetaan: 5,00 ml standardiliuosta (4.13), 5,00 ml 2,4-pentaanidionireagenssia (4.7), tislattua vettä siten, että lopullinen tilavuus on 30 ml. 6.2.5.2 Jatketaan, kuten 6.2.4.5 kohdassa on selostettu, mitataan absorbanssi 1-butanolia (4.3) vastaan. 6.2.5.3 Toistetaan menettely 10, 15, 20 ja 25 ml:lla standardiliuosta. 6.2.5.4 Nolla-arvon saamiseksi toimitaan 6.2.4.5 kohdan mukaisesti. 6.2.5.5 Standardikäyrä tehdään nolla-arvon (6.2.4.5) vähentämisen jälkeen kustakin 6.2.5.2 ja 6.2.5.3 kohdassa saadusta absorbanssin arvosta. Beerin laki on voimassa formaldehydille 30 ìg:aan asti. 6.3 Määrittäminen bisulfiitilla 6.3.1 Näytteen esikäsittely 6.3.1.1 Koetta varten Punnitaan taarattuun dekantterilasiin lähimmän 0,001 g:n tarkkuudella sellainen määrä koenäytettä (m grammaa), että se vastaa 3-20 mg:n oletettua formaldehydimäärää. 6.3.1.2 Vertailukoetta varten Punnitaan samalla tavoin vertailukoenäytettä (m grammaa). 6.3.2 Määrittäminen 6.3.2.1 Laitetaan 50,00 ml 0,1 M natriumsulfiittia (4.5) 100 ml:n dekantterilasiin ja lisätään 10,00 ml 0,1 N rikkihappoa (4.8). Ravistetaan. 6.3.2.2 Laitetaan dekantterilasi jään ja suolan seokseen lämpötilan pitämiseksi + 2 °C:ssä. Kaadetaan siihen testinäyte 6.3.1.1. 6.3.2.3 Titrataan nopeasti potentiometrillä 0,1 N natriumhydroksidilla (4.9) ravistaen jatkuvasti ja pitäen lämpötila + 2 ja + 4 °C:n välillä (neutraali piste on pH 9:n ja 11:n välillä). Olkoon V1 käytetyn 0,1 N natriumhydroksidin (4.9) tilavuus. 6.3.3 Sokeakoe Titrataan 6.3.2.1 kohdan mukaisesti tehty toinen liuos 6.3.2 kohdassa kuvatuissa olosuhteissa. Olkoon V2 käytetyn 0,1 N natriumhydroksidin (4.9) tilavuus. 6.3.4 Vertailukoe Määritetään koenäytteen m' happamuus tai alkalisuus potentiometrisesti titraamalla 0,1 N natriumhydroksidilla (4.9) tai 0,1 N rikkihapolla (4.8). Olkoon v' käytetyn 0,1 N natriumhydroksidin tai rikkihapon 0,1 N tilavuus. 6.3.5 Huomaa: Annettuja testausolosuhteita on noudatettava tarkasti. Määritys on mahdollista suorittaa tymolftaleiinin (4.14) ollessa indikaattorina. 7. TULOSTEN LASKEMINEN 7.1 Laskenta kolorimetrisessä menetelmässä 7.1.1 Vähennetään A1:stä A2 ja luetaan standardikäyrältä (6.2.5.5) testiliuoksen (6.2.1.3) formaldehydimäärä C mikrogrammoina. 7.1.2 Lasketaan näytteen formaldehydipitoisuus painoprosentteina (% m/m) seuraavan kaavan avulla: formaldehydipitoisuus % = >NUM>C >DEN>10³ × m 7.2 Laskenta bisulfiittititrausmenetelmässä Suhteutetaan vertailutestissä käytetyn 0,1 N natriumhydroksidin (4.9) tai 0,1 N rikkihapon (4.8) tilavuus massaan m: v = >NUM>v' 7 m >DEN>m' Neutraalissa valmisteessa v = 0 7.2.1 Happamassa valmisteessa: formaldehydipitoisuus % = >NUM>0,30 (V2 - V1 + v) >DEN>m 7.2.2 Alkalisessa valmisteessa: formaldehydipitoisuus % = >NUM>0,30 (V2 - V1 - v) >DEN>m 7.3 Huomautus Jos kahden menetelmän tulokset poikkeavat toisistaan, otetaan huomioon vain pienempi arvo. 8 TOISTETTAVUUS(3) Formaldehydipitoisuudelle 0,2 % ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten ero saa olla yli 0,005 % kolorimetrisellä menetelmällä ja 0,05 % bisulfiittimenetelmällä. V. RESORSINOLIN MÄÄRITTÄMINEN SHAMPOISSA JA HIUSVESISSÄ 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tässä menetelmässä kuvataan resorsinolin kaasukromatografinen määritys shampoissa ja hiusvesissä. Menetelmä soveltuu näytteille, joissa pitoisuus on 0,1-2,0 painoprosenttia. 2 MÄÄRITELMÄ Tämän menetelmän mukaisesti määritetty näytteen resorsinolipitoisuus ilmaistaan painoprosentteina. 3 PERIAATE Resorsinoli ja sisäisenä standardina lisätty 3,5-dihydroksitolueeni (5-metyyliresorsinoli) erotetaan näytteestä ohutkerroskromatografisesti. Molemmat yhdisteet eristetään raaputtamalla niiden täplät ohutkerroslevystä ja uuttamalla metanolilla. Sen jälkeen uutetut yhdisteet kuivataan, silyloidaan ja määritetään kaasukromatografisesti. 4 REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua. 4.1 Suolahappo 25 % (m/m) 4.2 Metanoli 4.3 Etanoli 96 % (v/v) 4.4 Valmiita silikageeli-TLC-levyjä (muovi tai alumiini), joissa fluoresoiva indikaattori. Deaktivoidaan seuraavasti: suihkutetaan tavanomaisesti esipinnoitetut silikalevyt vedellä kiiltäviksi. Annetaan suihkutettujen levyjen kuivua ilmassa huonelämpötilassa 1-3 tuntia. Huomaa: Jos levyjä ei deaktivoida, voi resorsinolihäviöitä syntyä irreversiibelin silikalevyyn adsorpoitumisen johdosta. 4.5 Kehiteliuos; asetoni-kloroformi-etikkahappo (20:75:5 tilavuuksina). 4.6 Resorsinolin standardiliuos; liuotetaan 400 mg resorsinolia 100 ml:aan 96 % etanolia (4.3) (1 ml vastaa 4 000 ìg resorsinolia). 4.7 Sisäinen standardiliuos; liuotetaan 400 mg 3,5-dihydroksitolueenia (DHT) 100 ml:aan 96 % etanolia (4.3) (1 ml vastaa 4 000 ìg DHT:tä). 4.8 Standardiseos: sekoitetaan 10 ml liuosta 4.6 ja 10 ml liuosta 4.7 100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin saakka 96 % etanolilla (4.3) ja sekoitetaan (1 ml vastaa 400 ìg resorsinolia ja 400 ìg DHT:tä). 4.9 Silylointiaineet: 4.9.1 N, O-bis-(trimetyylisilyyli)trifluoroasetamidi (BSTFA) 4.9.2 Heksametyylidisilatsaani (HMDS) 4.9.3 Trimetyylikloorisilaani (TMCS) 5 LAITTEET 5.1 Tavanomaiset ohutkerros- ja kaasukromatografiavälineet 5.2 Lasitarvikkeita 6 MENETTELY 6.1 Näytteen esikäsittely 6.1.1 Punnitaan valmistetta tarkasti 150 ml:n dekantterilasiin testattava osa valmistetta (m grammaa), joka sisältää noin 20-50 mg resorsinolia. 6.1.2 Lisätään suolahappoa (4.1), kunnes seos on hapan (tarvitaan noin 2-4 ml), lisätään 10 ml (40 mg DHT) sisäistä standardiliuosta (4.7) ja sekoitetaan. Siirretään etanolin (4.3) avulla 100 ml:n mittapulloon, täytetään etanolilla merkkiin saakka ja sekoitetaan. 6.1.3 Laitetaan 250 ìl liuosta (6.1.2) deaktivoidulle silikalevylle (4.4) noin 8 cm pituiseksi katkeamattomaksi nauhaksi. Nauha on pyrittävä saamaan niin kapeaksi kuin mahdollista. 6.1.4 Laitetaan 250 ìl standardiliuosta (4.8) samalle levylle samalla tavalla (6.1.3). 6.1.5 Lisätään 5 ìl:n täplä kumpaakin liuosta 4.6 ja 4.7 kahteen lähtöviivan pisteeseen yhdisteiden paikallistamisen helpottumiseksi levyn kehittämisen jälkeen. 6.1.6 Levy kehitetään ei-kyllästetyssä astiassa, joka on täytetty kehiteliuoksella 4.5, kunnes liuotin on noussut 12 cm lähtöviivasta; tavallisesti tämä kestää noin 45 minuuttia. Levy kuivataan ilmassa ja paikallistetaan resorsinoli/DHT-vyöhyke lyhytaalto-UV-valossa (254 nm). Näillä kahdella yhdisteellä on suunnilleen samat Rf-arvot. Merkitään nauhat kynällä 2 mm etäisyydellä nauhojen ulkopuolen tummasta reunaviivasta. Poistetaan nämä vyöhykkeet ja kerätään kunkin nauhan adsorbentit 10 ml pulloihin. 6.1.7 Uutetaan adsorbentit, joissa on näyte ja standardiseos, kumpikin seuraavalla tavalla: lisätään 2 ml metanolia (4.2) ja uutetaan tunnin ajan koko ajan sekoittaen. Suodatetaan seos ja toistetaan uuttamista vielä 15 minuutin ajan 2 ml:lla metanolia. 6.1.8 Yhdistetään uutteet ja haihdutetaan liuos kuivattamalla yön yli vakuumieksikaattorissa, joka on täytetty sopivalla kuivausaineella. Ei saa lämmittää. 6.1.9 Silyloidaan jäännökset (6.1.8) joko 6.1.9.1 tai 6.1.9.2 kohdan mukaisesti. 6.1.9.1 Lisätään 200 ìl BSTFA:ta (4.9.1) mikroruiskulla ja jätetään seos suljettuun astiaan 12 tunniksi huonelämpötilaan. 6.1.9.2 Lisätään järjestyksessä 200 ìl HMDS:ää (4.9.2) ja 100 ìl TMCS:ää (4.9.3) mikroruiskulla ja kuumennetaan seosta 30 minuutin ajan 60 °C:n lämpötilassa suljetussa astiassa. Jäähdytetään seos. 6.2 Kaasukromatografia 6.2.1 Kromatografian ajo-olosuhteet Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai parempi, jolloin: R = 2 >NUM>d' R2 - d' R1 >DEN>W1 + W2 jossa: R1 ja R2 = kahden piikin retentioaika minuuteissa, W1 ja W2 = samojen piikkien puolileveydet millimetreinä d' = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa Seuraavat kolonni- ja kaasukromatografian ajo-olosuhteet on havaittu sopiviksi: >TAULUKON PAIKKA> Typen ja ilman virtauksen säädössä seurataan valmistajan antamia ohjeita. 6.2.2 Ruiskutetaan 1-3 ìl 6.1.9 kohdan mukaisesti saatuja liuoksia kaasukromatografiin. Kutakin liuosta (6.1.9) ruiskutetaan viisi kertaa, mitataan piikkien pinta-alat, lasketaan niiden keskiarvo ja lasketaan piikkien pinta-alojen suhde: S = resorsinolin piikin pinta-ala/DHT:n piikin pinta-ala. 7 TULOSTEN LASKEMINEN Resorsinolin pitoisuus näytteessä, ilmaistuna painoprosentteina (% m/m) saadaan seuraavasta kaavasta: % resorsinolia = >NUM>4 >DEN>M × >NUM>S näyte >DEN>S standardiseos jossa: M = näytemäärä grammoina (6.1.1), S näyte = 6.2.2 mukainen näyteliuoksen piikkien pinta-alojen keskiarvojen suhde, S standardiseos = 6.2.2 mukainen standardiseoksen piikkien pinta-alojen keskiarvojen suhde. 8 TOISTETTAVUUS(4) Resorsinolipitoisuudelle noin 0,5 % ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten ero saa ylittää absoluuttista arvoa 0,025 %:a. VI. METANOLIN MÄÄRITTÄMINEN SUHTEESSA ETANOLIIN TAI 2-PROPANOLIIN 1 TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tässä menetelmässä kuvataan kaikenlaisissa kosmeettisissa valmisteissa (mukaan lukien aerosolit) olevan metanolin kaasukromatografinen analyysi. 0-10 %:n suhteelliset tasot voidaan määrittää. 2 MÄÄRITELMÄ Tämän menetelmän mukaisesti määritetty metanolipitoisuus ilmaistaan metanolin painoprosentteina suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin. 3 PERIAATE Määritys suoritetaan kaasukromatografisesti. 4 REAGENSSIT Käytetään reagensseja, jotka ovat analyysilaatua. 4.1 Metanoli 4.2 Absoluuttinen etanoli 4.3 2-Propanoli 4.4 Kloroformi, saatu vapaaksi alkoholeista pesemällä vedellä 5 LAITTEET 5.1 Kaasukromatografi, jossa on: Katarometridetektori aerosolinäytteitä varten, liekki-ionisaatiodetektori muita kuin aerosolinäytteitä varten. 5.2 Mittapulloja, 100 ml 5.3 Pipettejä, 2 ml, 20 ml, 0-1 ml 5.4 Mikroruiskuja 0-100 ìl ja 0-5 ìl ja (vain aerosolinäytteitä varten) erityinen kaasutiivis ruisku, jossa on luistiventtiili, (ks. näytteenottomenetelmä, kuvio 5)(5). 6 MENETTELY 6.1 Näytteen esikäsittely 6.1.1 Aerosolivalmisteiden näytteenotto suoritetaan 22 päivänä joulukuuta 1980(6) annetun komission direktiivin 80/1335/ETY liitteessä olevan kappaleen II mukaisesti, minkä jälkeen näytteet analysoidaan kaasukromatografisesti 6.2.1 kohdassa annettujen ohjeiden mukaisesti. 6.1.2 Muut kuin aerosolivalmisteet, joiden näytteenotto on suoritettu edellä mainitun II kappaleen mukaisesti, laimennetaan vedellä 1-2 %:ksi etanolin tai 2-propanolin suhteen, minkä jälkeen ne analysoidaan kaasukromatografisesti 6.2.2 kohdassa annettujen ohjeiden mukaisesti. 6.2 Kaasukromatografia 6.2.1 Aerosolinäytteiden analysoinnissa käytetään katarometridetektoria. 6.2.1.1 Kolonnin täyte on 10 % Hallcomid M18 Chromosorb WAW 100-200 mesh. 6.2.1.2 Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai suurempi, jolloin: R = 2 >NUM>d' R2 - d' R1 >DEN>W1 + W2 jossa R1 ja R2 = kahden piikin retentioaika minuuteissa, W1 ja W2 = samojen piikkien puolileveydet millimetreinä, d' = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa. 6.2.1.3 Tämä resoluutio voidaan saada seuraavissa ajo-olosuhteissa: >TAULUKON PAIKKA> 6.2.2 Muut kuin aerosolinäytteet: 6.2.2.1 Kolonni täytetään Chromosorb 105:llä tai Porapak QS:llä ja käytetään liekki-ionisaatiodetektoria. 6.2.2.2 Kolonnin erotuskyvyn (R) on oltava joko 1,5 tai suurempi, jolloin: R = 2 >NUM>d' R2 - d' R1) >DEN>W1 + W2 jossa R1 ja R2 = kahden piikin retentioaika minuuteissa, W1 ja W2 = samojen piikkien puolileveydet millimetreinä, d' = piirturin nopeus millimetreinä minuutissa. 6.2.2.3 Tämä resoluutio on saatu seuraavissa ajo-olosuhteissa: >TAULUKON PAIKKA> 7 STANDARDIKÄYRÄ 7.1 Edellä 6.2.1 kohdassa kuvatussa kaasukromatografiassa (Hallcomid M 18 -kolonni) käytetään seuraavia standardiseoksia. Nämä seokset valmistetaan mittaamalla pipeteillä, mutta tarkat määrät todetaan punnitsemalla välittömästi kunkin lisäyksen jälkeen pipetti tai pullo. >TAULUKON PAIKKA> Injektoidaan 2-3 ìl kromatografiin 6.2.1 kohdan ajo-olosuhteita noudattaen. Lasketaan kunkin seoksen piikkien pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). Piirretään standardikäyrä seuraavasti: X-akseli: % metanolia suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin, Y-akseli: piikin pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). 7.2 Edellä 6.2.2 kohdassa kuvatussa kaasukromatografiassa (Porapak QS tai Chromosorb 105) käytetään seuraavia standardiseoksia. Nämä seokset valmistetaan mittaamalla pipeteillä, mutta tarkat määrät todetaan punnitsemalla välittömästi kunkin lisäyksen jälkeen pipetti tai pullo. >TAULUKON PAIKKA> Injektoidaan 2-3 ìl kromatografiin 6.2.2 kohdan olosuhteita noudattaen. Lasketaan kunkin seoksen piikkien pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). Piirretään standardikäyrä seuraavasti: X-akseli: % metanolia suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin, Y-akseli: piikin pinta-alojen suhde (metanoli/etanoli) tai (metanoli/2-propanoli). 7.3 Standardikäyrän on oltava suora viiva. 8. TOISTETTAVUUS(7) Metanolipitoisuudella 5 % suhteessa etanoliin tai 2-propanoliin ei saman näytteen rinnakkaismääritysten tulosten ero saa olla enempää kuin 0,25 %.>VIITTAUS KAAVIOON> (1) Standardin ISO 5725 mukaisesti (2) EYVL N:o L 383, 31.12.1980, s. 27