Yhdeksäs komission direktiivi 81/715/ETY, annettu 31 päivänä heinäkuuta 1981, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten



Virallinen lehti nro L 257 , 10/09/1981 s. 0038 - 0046

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 13 s. 0233

Espanjank. erityispainos: Luku 03 Nide 23 s. 0070

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 13 s. 0233

Portugalink. erityispainos: Luku 03 Nide 23 s. 0070



YHDEKSÄS KOMISSION DIREKTIIVI, annettu 31 päivänä heinäkuuta 1981, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten (81/715/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin 70/373/ETY (), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna Kreikan liittymisasiakirjalla, ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorittamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmää käyttäen sen todentamiseksi, että lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten rehujen laatua ja koostumusta koskevat vaatimukset tulevat täytetyksi, useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu komission direktiiveillä 71/250/ETY (), 71/393/ETY (), 72/199/ETY (), 73/46/ETY (), 74/203/ETY (), 75/84/ETY (), 76/372/ETY () ja 78/633/ETY (), sellaisina kuin ne ovat viimeksi muutettuina 30 päivänä heinäkuuta 1981 annetulla direktiivillä; työ on tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä yhdeksäs ryhmä menetelmiä, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät avoparsiini- ja monensiininatriumpitoisuusmääritykset suoritetaan liitteessä esitettyjen menetelmien mukaisesti. 2 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä joulukuuta 1981. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 3 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 31 päivänä heinäkuuta 1981. Komission puolesta Puheenjohtaja Gaston THORN ()()()()()()()()() () EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2 () EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13 () EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7 () EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6 () EYVL N:o L 83, 30.3.1973, s. 21 () EYVL N:o L 108, 22.4.1974, s. 7 () EYVL N:o L 32, 5.2.1975, s. 26 () EYVL N:o L 102, 15.4.1976, s. 8 () EYVL N:o L 206, 29.7.1978, s. 43 LIITE 1. AVOPARSIININ MÄÄRITYS DIFFUUSIOLLA AGARALUSTASSA 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen ja rehuseosten avoparsiinipitoisuus. Määrityksen alaraja on 2 mg/kg (2 miljoonasosaa). Polyeetteriantibiootit saattavat häiritä määritystä. 2. PERIAATE Näyte uutetaan asetoni/vesi/hydrokloorihapposeoksella. Uutteen antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla avoparsiinin diffuusio agaralustalla, johon on siirrostettu Bacillus subtilista. Diffuusio mitataan mikro-organismin muodostamina inhibitiovyöhykkeinä. Vyöhykkeiden läpimitta on käytetyissä antibioottikonsentraatioissa suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin. 3. MIKRO-ORGANISMI: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1 Kantaviljelmän kasvatus Bacillus subtilista siirrostetaan kasvatusalustasta (4.1) valmistettuja agarvinopintoja sisältäviin putkiin ja inkuboidaan yön yli 30 oC:ssa. Säilytetään jääkaapissa noin 4 oC:ssa. Siirrostus uusitaan kuukausittain. 3.2 Itiösuspension valmistus () Tuoreelta kasvatetulta agarvinopinnalta (3.1) huuhdotaan kasvusto 2 P3 ml:lla steriiliä vettä. Suspensio ympätään 300 ml:aan kasvatusliuosta (4.1), joka on steriilissä Roux-pullossa ja inkuboidaan 3 P5 päivää 30 oC:ssa. Suoritetaan itiöiden mikroskooppinen tarkastus, kasvusto huuhdotaan 15 ml:aan etanolia ja homogenisoidaan. Suspensiota voidaan säilyttää ainakin 5 kk noin 4 oC:ssa. 4. KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT 4.1 Kasvatusalustat () Peptoni 6,0 g Tryptoni 4,0 g Hiivauute 3,0 g Lihauute 1,5 g Glukoosi 1,0 g Agar 15,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5 (steriloinnin jälkeen). 4.2 20 % (v/v) etanoli: laimennetaan 200 ml etanolia 800 ml:aan vettä. 4.3 Hydrokloorihappo, tiheys 1,18 P1,19. () Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niistä on voitu osoittaa saatavan samanlaisia itiösuspensioita. () Voidaan käyttää mitä tahansa vastaavan koostumuksen omaavaa kaupallista kasvatusliuosta, jolla saadaan vastaavat tulokset. 4.4 Natriumhydroksidi, 2 M liuos. 4.5 0,1 M fosfaattipuskuriliuos: Kaliumdivetyfosfaatti, KH2PO4: 13,6 g. Vesi, täytetään 1 000 ml:ksi. pH säädetään arvoon 4,5. 4.6 Asetoni/vesi/hydrokloorihappo (4.3) -seos: 65/32,5/2,5 (v/v/v). 4.7 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava avoparsiinisulfaatti. 5. STANDARDILIUOKSET Liuotetaan tarkoin punnittu, noin 10 mg:n määrä standardiyhdistettä (4.7) fosfaattipuskuriin (4.5) ja laimennetaan tällä puskurilla sellaisen kantaliuoksen valmistamiseksi, joka sisältää avoparsiinia 100 ìg millilitrassa. Liuos säilyy tulpalla varustetussa pullossa 4 oC:ssa säilytettynä 7 päivää. 5.1 Esiseoksille Tästä kantaliuoksesta valmistetaan seuraavat liuokset puskurilla (4.5) peräkkäin laimentaen: S8 4,0 ìg/ml S4 2,0 ìg/ml S2 1,0 ìg/ml S1 0,5 ìg/ml 5.2 Rehuille Kantaliuoksesta valmistetaan seuraavat liuokset puskurilla (4.5) peräkkäin laimentaen: S8 2,0 ìg/ml S4 1,0 ìg/ml S2 0,5 ìg/ml S1 0,25 ìg/ml 6. UUTTEEN JA MÄÄRITYSLIUOSTEN VALMISTUS 6.1 Esiseokset Punnitaan 10 mg:n tarkkuudella sellainen määrä näytettä, joka sisältää 10 P100 mg avoparsiinia. Tämä siirretään 100 ml:n asteikolla varustettuun pulloon, lisätään 60 ml seosta (4.6) ja ravistellaan 15 minuutin ajan mekaanisella ravistelijalla. pH tarkistetaan ja se säädetään tarvittaessa arvoon 2 hydrokloorihapolla (4.3). Pullo täytetään merkkiin asti seoksella (4.6) ja homogenoidaan. Suodatetaan erä tästä seoksesta sopivan suodatinpaperin (esim. Whatman n:o 1) läpi, ja ensimmäiset 5 ml suodoksesta heitetään pois. Tästä otetaan erä ja pH säädetään arvoon 4,5 natriumhydroksidiliuoksella (4.4). Tämä liuos laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.5) siten että oletetuksi avoparsiinikonsentraatioksi saadaan 4 ìg/ml (= U8). Tästä liuoksesta valmistetaan liuokset U4 (odotettu pitoisuus: 2 ìg/ml), U2 (odotettu pitoisuus: 1 ìg/ml) ja U1 (odotettu pitoisuus: 0,5 ìg/ml) puskurilla (4.5) suoritetuilla peräkkäisillä laimennuksilla (1 + 1). 6.2 Rehut Punnitaan 50 g näytettä, lisätään 100 ml seosta (4.6) ja ravistellaan 100 ml:ssa seosta (4.6) 30 minuutin ajan mekaanisella ravistelijalla. Uute kirkastetaan sentrifugoimalla (käyttäen tulpalla varustettuja sentrifugiputkia), kirkastetusta uutteesta otetaan erä (katso jäljempänä oleva taulukko) ja pH säädetään arvoon 4,5 natriumhydroksidiliuoksella (4.4). Tämä erä laimennetaan fosfaattipuskuriliuoksella (4.5), jotta siitä saadaan U8 (ks. jäljempänä oleva taulukko). Tästä liuoksesta valmistetaan liuokset U4 (odotettu pitoisuus: 1 mikrogramma/ml), U2 (odotettu pitoisuus: 0,5 ìg/ml) ja U1 (odotettu pitoisuus: 0,25 ìg/ml) fosfaattipuskuriliuoksella (4.5) suoritetuilla peräkkäisillä laimennuksilla (1 + 1). >TAULUKON PAIKKA> 7. MENETTELY 7.1 Siirostus määritysalustaan Itiösuspensiota (3.2) siirrostetaan noin 50 P60 oC:ssa määritysalustaan (4.1). Alustasta (4.1) valmistetuilla maljoilla tehdään esikokeet, joilla määritetään se itiösuspensiomäärä, jolla eri avoparsiinikonsentraatioita käyttäen saadaan suurimmat ja kirkkaimmat inhibitiovyöhykkeet. 7.2 Maljojen valmistus Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskonsentraatiota (S8, S4, S2, S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8, U4, U2, U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä ainakin kahdeksan reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10 P13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle on asetettu alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus 20 mm. Maljoille kaadetaan sellainen määrä 7.1 kohdassa kuvatulla tavalla siirrostettua alustaa (4.1), joka muodostaa noin 2 mm paksun kerroksen (kun maljat ovat 60 ml:n vetoisia ja läpimitaltaan 200 mm). Jäähdytetään vaakasuoralla alustalla, tehdään reiät ja niihin pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10 P0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten, että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhykkeestä. 7.3 Inkubointi Maljoja inkuboidaan 16 P18 tuntia 30 oC:ssa. 8. LASKEMINEN Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin pitoisuutta vastaavista mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään sekä standardiliuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti. Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL) osalta määritetään käyttäen kaavaa: (a) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 P 2 S8 10 Parhainta sovitusta edustava piste suurimman standardipitoisuuden (SH) osalta määritetään käyttäen kaavaa: (b) SH = 7 S8 + 4 S4 + S2 P 2 S1 10 "Parhaan sovituksen" omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän pitoisuuden (UL) ja uutteen suurimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla yllä olevissa kaavoissa S1, S2, S4 ja S8 U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla. Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH- arvot ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset. Käytännössä suoria voidaan pitää yhdensuuntaisina, jos arvot (SH-SL) ja (UH-UL) eivät eroa keskiarvostaan yli 10 %. Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1 ja S1 tai U8 ja S8 voidaan hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi: (a') SL = 5 S1 + 2 S2 P S4 6 tai 5 S2 + 2 S4 P S8 6 (b') SH = 5 S4 + 2 S2 P S1 6 tai 5 S8 + 2 S4 P S2 6 ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa. Kun suoria pidetään yhdensuuntaisina, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista: Neljän pitoisuuden osalta (c) log A = (U1 + U2 + U4 + U8 P S1 P S2 P S4 P S8) × 0,602 U4 + U8 + S4 + S8 P U1 P U2 P S1 P S2 Kolmen pitoisuuden osalta (d) log A = (U1 + U2 + U4 P S1 P S2 P S4) × 0,401 U4 + S4 P U1 P S1 tai (d') log A = (U2 + U4 + U8 P S2 P S4 P S8) × 0,401 U8 + S8 P U2 P S2 Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus. Jos suhteellisen aktiivisuuden havaitaan olevan alueen 0,5 P2,0 ulkopuolella, määritys suoritetaan uudelleen siten, että uutteen konsentraatiot säädetään sopiviksi tai, jos tämä ei ole mahdollista, standardiliuosten konsentraatiot säädetään sopiviksi. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada tuotua vaaditulle alueelle, on mitä tahansa saatua tulosta pidettävä likimääräisenä ja tämä on mainittava määritysselosteessa. Jos yhdensuuntaisuutta ei vieläkään saada aikaan, määritystä ei voida pitää hyväksyttävänä. 9. TOISTETTAVUUS Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää: P 2 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 2 mg/kg P10 mg/kg olevien avoparsiinipitoisuuksien osalta; P 20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10 P25 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; P 5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, pitoisuuksien osalta, välillä 25 P50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; P 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta. 2. MONENSIININATRIUMIN MÄÄRITYS DIFFUUSIOLLA AGARALUSTASSA 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmällä on mahdollista määrittää rehujen ja rehuseosten monensiininatriumpitoisuus. Määrityksen alaraja on 10 mg/kg (10 miljoonasosaa) (). 2. PERIAATE Näyte uutetaan 90 % metanolilla. Uutetta käsitellään näytteen monensiininatriumpitoisuuden mukaisesti. Antibioottinen aktiivisuus määritetään mittaamalla monensiininatriumin diffuusio agaralustalla, johon on siirrostettu Basillus subtilista. Diffuusio mitataan inhibitiovyöhykkeinä, jotka mikro-organismi muodostaa. Vyöhykkeiden läpimitta on käytetyillä antibioottikonsentraatioalueilla suoraan verrannollinen antibioottikonsentraation logaritmiin. Natriumionit vähentävät määritysjärjestelmän herkkyyttä. 3. MIKRO-ORGANISMI: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1 Kantaviljelmän kasvatus Bacillus subtilista siirrostetaan kasvatusalustasta (4.1) valmistettuja vinopintoja sisältäviin putkiin ja inkuboidaan yön yli 30 oC:ssa. Viljelmä säilytetään jääkaapissa noin 4 oC:ssa. Siirrostus uusitaan kuukausittain. 3.2 Itiösuspension valmistus () Äskettäin valmistetulta agarvinopinnalta (3.1) huuhdellaan kasvusto 2 P3 ml:lla steriiliä vettä. Suspensio siirrostetaan 300 ml:aan kasvatusliuosta (4.1), joka on steriilissä Roux-pullossa, ja tätä inkuboidaan 3 P5 päivää 30 oC:ssa. Suoritetaan itiöiden mikroskooppinen tarkastus, kasvusto otetaan talteen 15 ml:aan 20 % etanolia (4.3) ja homogenoidaan. Suspensiota voidaan säilyttää ainakin viisi kuukautta noin 4 oC:ssa. 4. KASVATUSALUSTAT JA REAGENSSIT 4.1 Kasvatusalusta () Tryptoni 10,0 g Hiivauute 3,0 g Lihauute 1,5 g Glukoosi 1,0 g Agar (laadun mukaan) 10,0 P20,0 g Vesi 1 000 ml pH 6,5 (steriloinnin jälkeen). 4.2 Määritysalusta Glukoosi 10,0 g Hiivauute 2,5 g Dikaliumvetyfosfaatti, K2HPO4 0,69 g Kaliumdivetyfosfaatti, KH2PO4 0,45 g Agar (laadun mukaan) 10,0 P20,0 g Vesi 1 000 ml pH 6 (steriloinnin jälkeen) () 1 mg monensiininatriumia vastaa 1 000 UK-yksikköä. () Voidaan käyttää muita menetelmiä edellyttäen, että niistä on voitu osoittaa saatavan samanlaisia itiösuspensioita. () Voidaan käyttää mitä tahansa saman koostumuksen omaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa kasvatusalustaa, jolla saadaan vastaavat tulokset. 4.3 20 % (v/v) etanoli: Laimennetaan 200 ml etanolia 800 ml:aan vettä. 4.4 Metanoli, vedetön. 4.5 90 % (v/v) metanoli: laimennetaan 900 ml metanolia (4.4) 100 ml:aan vettä. 4.6 50 % (v/v) metanoli: laimennetaan 500 ml metanolia (4.4) 500 ml:lla vettä. 4.7 Aluminiumoksidi, rakeistettua (alcoa F, 20 mesh; aktivoitu alumiinioksidi UG1: F. Lancaster & Co., tai tätä vastaava). 4.8 Standardiyhdiste: tunnetun aktiivisuuden omaava monensiininatrium (sadaan erityisesti laitoksesta International Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB). 5. VÄLINEISTÖ 5.1 Pyöröhaihduttaja, varustettuna 250 ml:n pyöreäpohjaisella pullolla. 5.2 Kromatografiaan tarkoitettuja lasiputkia, sisäläpimitta: 25 mm, pituus 400 mm, avoimen pään läpimitta 2 mm. 5.3 Kromatografiaan tarkoitettuja lasiputkia, sisäläpimitta: 11 mm, pituus 300 mm, avoimen pään läpimitta 2 mm. 6. STANDARDILIUOKSET Liuotetaan tarkkaan punnittu määrä standardiyhdistettä (4.8) metanoliin (4.4) ja laimennetaan kantaliuokseksi, joka sisältää monensiininatriumia 800 ìg/ml. Tulpalla suljetuissa pulloissa 4 oC:ssa säilytettynä tämä liuos säilyy kaksi viikkoa. Tästä kantaliuoksesta valmistetaan 50 % metanoliin (4.6) peräkkäin laimentaen: S8 8,0 ìg/ml S4 4,0 ìg/ml S2 2,0 ìg/ml S1 1,0 ìg/ml 7. UUTTEEN VALMISTUS 7.1 Uutto 7.1.1 Esiseokset Näytettä punnitaan 2 g, lisätään 100 ml 90 % metanolia (4.5), homogenoidaan ja sentrifugoidaan muutaman minuutin ajan. Supernatantti laimennetaan 50 % metanolilla (4.6) siten, että odotetuksi monensiininatriumpitoisuudeksi saadaan 8 ìg/ml (= U8). 7.1.2 Vähintään 50 mg/kg monensiininatriumia sisältävät rehut Näytettä punnitaan 10 P20 g, lisätään 100 ml 90 % metanolia (4.5), homogenoidaan 15 minuuttia ja annetaan laskeutua. Lasiputken (5.2) kapeaan päähän asetetaan puuvillatulppa ja lisätään varovasti taputellen aluminiumoksidia (4.7), kunnes pylvään korkeudeksi saadaan 75 P80 mm. Uute dekantoidaan aluminiumoksidipylvääseen ja suodos otetaan talteen. 30 ml suodosta laimennetaan 50 ml:ksi vedellä. Tämän jälkeen suoritetaan laimennokset 50 % metanolilla (4.6) siten, että odotetuksi monensiininatriumpitoisuudeksi saadaan 8 ìg/ml (= U8). 7.1.3 Alle 50 mg/kg (korkeintaan 10 mg/kg rajaan asti) monensiininatriumia sisältävät rehut Näytettä punnitaan 10 P20 g, lisätään 100 ml 90 % metanolia (4.5) ja homogenoidaan 15 minuutin ajan. Sentrifugoidaan, kunnes saadaan, kirkas liuos. Kun näyte sisältää 20 mg/kg monensiininatriumia, otetaan 40 ml supernatanttia. Kun näyte sisältää 10 mg/kg monensiininatriumia, otetaan 80 ml supernatanttia. Haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä pyöröhaihduttajalla (5.1) korkeintaan 40 oC:ssa. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan 90 % metanolia (4.5). Lasiputken (5.3) kapeaan päähän asetetaan puuvillatulppa ja lisätään varovasti taputellen aluminiumoksidia (4.7), kunnes pylvään korkeudeksi saadaan 75 P80 mm. Jäännöksen metanolipitoinen liuos dekantoidaan aluminiumoksidipylvääseen ja suodos otetaan talteen. Pylväs pestään 10 ml:lla 90 % metanolia (4.5) ja pesuliuokset yhdistetään suodokseen. Liuos haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä pyöröhaihduttajalla (5.1) korkeintaan 40 oC:ssa. Jäännös liuotetaan 10 ml:aan vedetöntä metanolia (4.4) ja täytetään 20 ml:ksi vedellä. Liuos sentrifugoidaan ainakin nopeudella 4 000 kierr./min. vähintään 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen laimennukset tehdään 50 % metanoliin (4.6) siten, että odotetuksi monensiininatriumpitoisuudeksi saadaan 8 ìg/ml (= U8). 7.2 Määritysliuokset Valmistetaan U8-liuoksesta liuokset U4 (odotettu pitoisuus: 4 ìg/ml), U2 (odotettu pitoisuus: 2 ìg/ml) ja U1 (odotettu pitoisuus: 1 ìg/ml) peräkkäin laimentaen (1 + 1) 50 % metanolilla (4.6). 8. MENETTELY 8.1 Siirrostus määritysalustaan Itiösuspensiota (3.2) siirrostetaan noin 50 P60 oC:ssä määritysalustaan (4.2). Määritysalustasta (4.2) valmistetuilla maljoilla tehdyillä esikokeilla määritetään se itiösuspensiomäärä, jolla eri monensiininatriumkonsentraatioita käyttäen saadaan suurimmat ja kirkkaimmat inhibitiovyöhykkeet. 8.2 Maljojen valmistus Diffuusio agarissa suoritetaan maljoilla käyttäen neljää standardiliuoskonsentraatiota (S8, S4, S2, S1) ja neljää määritysliuoskonsentraatiota (U8, U4, U2, U1). On välttämätöntä, että kuhunkin maljaan lisätään nämä neljä uute- ja standardikonsentraatiota. Maljojen tulee olla riittävän suuret, jotta agaralustaan voidaan tehdä ainakin 8 reikää, jotka ovat läpimitaltaan 10 P13 mm ja joiden keskustat ovat vähintään 30 mm:n päässä toisistaan. Voidaan käyttää lasilevyjä, joiden päälle asetetaan alumiini- tai muovisylinteri, jonka läpimitta on 200 mm ja korkeus 20 mm. Maljoille kaadetaan sellainen määrä 8.1 kohdassa esitetyllä tavalla siirrostettua alustaa (4.2), joka muodostaa noin 2 mm paksun kerroksen (kun malja on 60 ml:n vetoinen ja läpimitaltaan 200 mm). Jäähdytetään vaakasuoralla alustalla, tehdään reiät ja pipetoidaan tarkalleen mitatut tilavuudet määritys- ja standardiliuoksia (läpimitasta riippuen 0,10 P0,15 ml/reikä). Kutakin pitoisuutta käytetään ainakin neljä kertaa siten, että kussakin määrityksessä suoritetaan arviointi 32 inhibitiovyöhykkeestä. 8.3 Inkubointi Maljoja inkuboidaan noin 18 tuntia 35 P37 oC:ssa. 9. LASKEMINEN Inhibitiovyöhykkeiden läpimitta mitataan 0,1 mm:n tarkkuudella. Kutakin pitoisuutta vastaavista mittausten keskiarvoista piirretään puolilogaritmipaperille kuvaaja, joka esittää konsentraatioiden logaritmia inhibitiovyöhykkeiden läpimittojen suhteen. Piirretään kuvaaja, jossa on sekä standardiliuoksen että uutteen osalta parhainta sovitusta edustavat suorat esimerkiksi seuraavasti. Parhainta sovitusta edustava piste pienimmän standardipitoisuuden (SL) osalta määritetään käyttäen kaavaa: (a) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 P 2 S8 10 Parhainta sovitusta edustava piste korkeimman standardipitoisuuden (SH) osalta määritetään käyttäen kaavaa: (b) SH = 7 S8 + 4 S4 + S2 P 2 S1 10 Parhaan sovituksen omaavat pisteet lasketaan samoin uutteen pienimmän pitoisuuden (UL) ja uutteen suurimman pitoisuuden (UH) osalta korvaamalla edellä olevissa kaavoissa S1, S2, S4 ja S8 U1:lla, U2:lla, U4:lla ja U8:lla. Lasketut SL- ja SH-arvot merkitään samalle kuvaajapaperille ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi standardiliuoksen osalta. Samoin merkitään UL- ja UH- arvot ja ne yhdistetään parhaimman sovituksen omaavan suoran muodostamiseksi uutteen osalta. Jos häiritseviä tekijöitä ei esiinny, pitäisi suorien olla yhdensuuntaiset. Käytännössä suoria voidaan pitää yhdensuuntaisina, jos arvot (SH-SL) ja (UH-UL) eivät poikkea keskiarvostaan yli 10 %. Jos suorat eivät ole yhdensuuntaiset, joko U1 ja S1 tai U8 ja S8 voidaan hylätä ja SL, SH, UL ja UH laskea käyttäen vaihtoehtoisia kaavoja vaihtoehtoisten parhaimman sovituksen omaavien suorien muodostamiseksi: (a') SL = 5 S1 + 2 S2 P S4 6 tai 5 S2 + 2 S4 P S8 6 (b') SH = 5 S4 + 2 S2 P S1 6 tai 5 S8 + 2 S4 P S2 6 ja käyttäen samoja kaavoja UL:n ja UH:n tapauksissa. Yhdensuuntaisuuden on oltava samojen periaatteiden mukainen. Tulosten laskeminen kolmen pitoisuuden perusteella on mainittava määritysselosteessa. Kun suoria pidetään yhdensuuntaisina, suhteellisen aktiivisuuden logaritmi (log A) lasketaan jollakin seuraavista kaavoista: Neljän pitoisuuden osalta (c) log A = (U1 + U2 + U4 + U8 P S1 P S2 P S4 P S8) × 0,602 U4 + U8 + S4 + S8 P U1 P U2 P S1 P S2 Kolmen pitoisuuden osalta (d) log A = (U1 + U2 + U4 P S1 P S2 P S4) × 0,401 U4 + S4 P U1 P S1 tai (d') log A = (U2 + U4 + U8 P S2 P S4 P S8) × 0,401 U8 + S8 P U2 P S2 Todellinen aktiivisuus = oletettu aktiivisuus × suhteellinen aktiivisuus. Jos suhteellisen aktiivisuuden havaitaan olevan alueen 0,5 P2,0 ulkopuolella, määritys suoritetaan uudelleen siten, että uutteen konsentraatiot säädetään sopiviksi tai, jos tämä ei ole mahdollista, standardiliuosten konsentraatiot säädetään sopiviksi. Kun suhteellista aktiivisuutta ei saada tuotua vaaditulle alueelle, on mikä tahansa saatu tulos katsottava likimääräiseksi ja tämä on mainittava määritysselosteessa. Kun suoria ei pidetä yhdensuuntaisina, määritys toistetaan. Jos yhdensuuntaisuutta ei vieläkään saada aikaan, määritystä ei voida pitää hyväksyttävänä. 10. TOISTETTAVUUS Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden määrityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää: P 20 %, suurimpaan arvoon verrattuna, välillä 10 P25 mg/kg olevien monensiininatriumpitoisuuksien osalta; P 5 mg/kg, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, välillä 25 P50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta; P 10 %, suurimpaan arvoon verrattuna, yli 50 mg/kg olevien pitoisuuksien osalta.