Neuvoston direktiivi 77/312/ETY, annettu 29 päivänä maaliskuuta 1977, väestön biologisesta seulonnasta lyijylle altistumisen varalta



Virallinen lehti nro L 105 , 28/04/1977 s. 0010 - 0017

Suomenk. erityispainos Alue 15 Nide 2 s. 0063

Kreikank. erityispainos: Luku 05 Nide 2 s. 0174

Ruotsink. erityispainos Alue 15 Nide 2 s. 0063

Espanjank. erityispainos: Luku 05 Nide 2 s. 0125

Portugalink. erityispainos: Luku 05 Nide 2 s. 0125



NEUVOSTON DIREKTIIVI, annettu 29 päivänä maaliskuuta 1977, väestön biologisesta seulonnasta lyijylle altistumisen varalta (77/312/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN NEUVOSTO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen ja erityisesti sen 235 artiklan, ottaa huomioon komission ehdotuksen, ottaa huomioon edustajakokouksen lausunnon(1), ottaa huomioon talous- ja sosiaalikomitean lausunnon(2), sekä katsoo, että Euroopan talousyhteisön keskeisiä tehtäviä on edistää koko yhteisössä taloudellisen toiminnan yhtenäistä kehitystä sekä jatkuvaa ja tasapainoista kasvua, johon väistämättä kuuluu ympäristön pilaantumisen ja siitä johtuvien haittojen torjuminen sekä elämisen laadun ja ympäristönsuojelun parantaminen, lyijyn monet eri käyttötavat aiheuttavat tällä hetkellä lyijykuormitusta monille ympäristön alueille, lyijyn monet lähteet ympäristössä vaikeuttavat yksilön kokonaisaltistuksen määrittämistä tämän epäpuhtauden osalta ja tämän vuoksi ihmisten terveyden suojeleminen edellyttää mahdollisimman tarkkaa yksilön seurantaa lyijyn kokonaiskertymän osalta, on suoritettava väestön biologinen seulonta lyijylle altistuksen varalta ja arvioitava seulonnan tulokset uusien ehdotusten laatimiseksi tarvittaessa, olisi suotavaa määritellä kyseisen seulonnan tekniset järjestelyt ja biologiset vertailuarvot, veren lyijypitoisuuden määrittäminen on nykyisin paras keino arvioida yksilön vastikään ympäristössä olevalle lyijylle altistumisen seurauksena saamaa lyijyannosta ja delta-aminolevuliinihappodehydrataasin (ALAD) entsymaattinen aktiivisuus voidaan käyttää osoitus- tai lisätestinä lyijylle altistuksen määrittämiseksi, ja Euroopan yhteisöjen toimintaohjelmassa ympäristöalan toimenpiteiksi(3) määrätään elämisen laadun parantamiseen tähtäävien kansallisten ohjelmien yhteensovittamisesta ja edellytetään ensisijaisia toimia lyijyn osalta, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on toteutettava tarvittavat toimenpiteet yhteisen menettelyn soveltamiseksi biologisessa seulonnassa arvioitaessa väestön altistumista lyijylle työpaikan ulkopuolella. 2 artikla Mainittu yhteinen menettely, jonka soveltamisaika rajoitetaan neljään vuoteen, perustuu veren lyijypitoisuuden mittaamiseen. Osoitus- tai lisätestinä voidaan käyttää myös ALAD:n mittaamista liitteissä II ja III määrättyjä menettelyjä noudattaen. 3 artikla 1. Biologisen seulonnan edellytykset vahvistetaan: - näytteenotto- ja määritysjärjestelyillä, - näytteenottotiheydellä. 2. Verinäytteet otetaan vapaaehtoisilta. 4 artikla Näytteenotto suoritetaan: - vähintään 100 hengen ryhmille yli 0,5 miljoonan asukkaan kaupunkialueilla, - vähintään 100 hengen ryhmille siltä osin, kuin tämä lukumäärä on toteutettavissa, jotka valitaan huomattaville lyijyn aiheuttaman pilaantumisen lähteille altistuneesta väestöstä, - jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten määrittämille riskiryhmille. Jokaisessa jäsenvaltiossa ja jokaisen kampanjan aikana on suoritettava vähintään 50 määritystä miljoonaa asukasta kohti. 5 artikla Edellä 4 artiklassa tarkoitettujen ryhmien näytteenotto on suoritettava vähintään kahtena kampanjana kullakin kohdealueella tutkimusohjelman aikana, kampanjoiden välisen ajan ollessa vähintään 24 kuukautta. Toisessa kampanjassa ei välttämättä tarvitse käyttää samoja näytteenantajia kuin ensimmäisessä. 6 artikla Biologisenseulonnan tulosten arvioimiseksi 8 artiklassa säädettyjen toimien suorittamista varten, käytetään seuraavia veren lyijypitoisuuksia, joissa on otettu huomioon liitteessä I esitetyt annos-vaikutus -suhteet, yhtä aikaa vertailuarvoina: - enintään 20 mikrogrammaa lyijyä 100 millilitraa verta kohti 50 prosentissa tutkitusta väestöryhmästä, - enintään 30 mikrogrammaa lyijyä 100 millilitraa verta kohti 90 prosentissa tutkitusta väestöryhmästä, - enintään 35 mikrogrammaa lyijyä 100 millilitraa verta kohti 98 prosentissa tutkitusta väestöryhmästä. 7 artikla Veren lyijypitoisuuden määrittämiseksi: - jäsenvaltioiden on annettava komissiolle tiedoksi biologiseen seulontaanä osallistuvien laboratorioiden nimet ja käytetyt määritysmenetelmät, - komissio järjestää yhteistoiminnassa jäsenvaltioiden kanssa keskinäistä vertailua koskevia ohjelmia, joihin edellä mainitut laboratoriot osallistuvat, - komissio tarkastelee yhteistoiminnassa jäsenvaltioiden kanssa mainittujen ohjelmien tuloksia määritysmenetelmien vertailtavuuden parantamiseksi. 8 artikla Jos määritysten tulokset osoittavat, että 6 artiklassa tarkoitetut vertailuarvot ovat ylittyneet kerran tai useammin, jäsenvaltioiden on: - tarkastettava tulosten paikkansapitävyys, - jäljitettävä altistuslähteet, jotka aiheuttavat arvojen ylittymisen; tämä toimi koskee myös kaikkia yksilöitä, joiden veren lyijypitoisuus on suurempi kuin 35 mikrogrammaa 100 millilitraa kohti, - toteutettava aiheelliset toimenpiteet toimivaltaisten kansallisten viranomaisten harkinnan mukaan. 9 artikla 1. Jäsenvaltioiden on nimettävä kuuden kuukauden kuluessa tämän direktiivin tiedoksi antamisesta toimivaltainen viranomainen, joka toimittaa komissiolle: - edellä 4 artiklassa tarkoitetun väestön biologiseen seulontaan liittyvät tiedot, joihin sisältyvät määritysmenettelyitä, tutkittuja väestöryhmiä ja näytteenottoalueita koskevat tiedot; mainituissa tiedoissa on annettava takeet tutkittujen henkilöiden täydellisestä nimettömyydestä; komissio laatii yksimielisesti jäsenvaltioiden kanssa tietojen toimittamista koskevat järjestelyt ja toimitusmuodon, - tiedot 6 artiklassa tarkoitettujen vertailuarvojen ylittymisen syistä tai oletetuista aiheuttajista. 2. Toimivaltaisen kansallisen viranomaisen on lisäksi annettava komissiolle tiedoksi 8 artiklan kolmannen luetelmakohdan mukaisesti toteutetut toimenpiteet. 10 artikla Komissio kutsuu vähintään kahdesti vuodessa koolle jäsenvaltioiden hallitusten edustajat, minkä tarkoituksena on erityisesti: - varmistaa biologisen seulonnan ja erityisesti 4 ja 5 artiklan säännösten yhtenäinen toteutus, - huolehtia suoritettujen määritysten vertailtavuudesta, - tarkastella tietoja ja helpottaa biologisesta seulonnasta saatuja tuloksia sekä 8 artiklan mukaisesti toteutettuja toimenpiteitä koskevaa tietojenvaihtoa jäsenvaltioiden välillä. 11 artikla Tämän direktiivin 9 artiklan mukaisesti kerättyjen tietojen perusteella komissio laatii yhteistoiminnassa toimivaltaisten kansallisten viranomaisten kanssa: - yhteenvetona esitetyn vuosikertomuksen ohjelman toteuttamisesta, joka toimitetaan jäsenvaltioille sekä neuvostolle ja edustajakokoukselle, - ohjelman päätyttyä yleiskertomuksen, jota käytetään perustana valmisteltaessa mahdollisia uusia ehdotuksia, joissa otetaan lisäksi huomioon tieteellisen ja teknisen tietämyksen kehitys. 12 artikla Jäsenvaltioiden on toteutettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät toimenpiteet 12 kuukauden kuluessa tämän direktiivin tiedoksiantamisesta ja ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 13 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 29 päivänä maaliskuuta 1977. Neuvoston puolesta Puheenjohtaja T. BENN (1) EYVL N:o C 50, 4.3.1976, s. 9 (2) EYVL N:o C 28, 9.2.1976, s. 31 (3) EYVL N:o C 112, 20.12.1973, s. 3 LIITE I ANNOS VAIKUTUS SUHTEET Biologisen seulonnan tulosten arvioinnissa käytetyt veren lyijypitoisuuden arvot perustuvat lyijyn erilaisia myrkyllisiä vaikutuksia koskevien tieteellisten tietojen analyysiin. Tämän analyysin avulla, jossa otetaan huomioon väestön biologisten arvojen tavanomainen vaihtelu, voidaan näyttää toteen lähes kvantitatiivisia annos vaikutus suhteita. Seuraavia annos vaikutus suhteita käytetään vertailuperustana tämän direktiivin täytäntöönpanemiseksi: ALAD-aktiivisuuden väheneminen punaisissa verisoluissa lyijylle altistumisen seurauksena voidaan sallia väestössä, jos se ei aiheuta häiriöitä verenmuodostuksessa. Alle 15-20 µg/100 ml olevien veren lyijypitoisuuksien osalta arvellaan nykyisin, ettei ALAD-aktiivisuuden väheneminen aiheuta häiriöitä verenmuodostuksessa. Veren punasolujen protoporfyriinien (PPE) lisääntyminen on merkki raudan käytön häiriintymisestä, joka estää hemin synteesin. PPE:n lisääntymistä esiintyy veren lyijypitoisuuksien yhteydessä, jotka ovat suurempia kuin 20-30 µg/100 ml. PPE:n lisääntyminen voi kuitenkin johtua myös muista syistä. Glutationin synteesin häiriintyminen voidaan sallia ainoastaan pienessä väestönosassa ja ainoastaan, jos se on vähäistä eikä aiheuta muita piileviä oireita. Tätä glutationin synteesin häiriintymistä, jota ei voida sallia, ei esiinny veren lyijypitoisuuden ollessa pienempi kuin 30 µg/100 ml. Delta-aminolevuliinihapon virtsaan erittymisen (ALAU) huomattava lisääntyminen on merkki porfyriinien aineenvaihdunnan huomattavasta häiriintymisestä ja näin ollen merkki terveyden heikentymisestä. Tilastollisesti merkittävää ALAU:n lisääntymistä esiintyy ainoastaan veren lyijypitoisuuksien yhteydessä, jotka ovat suurempia kuin 35 µg/100 ml. LIITE II VEREN LYIJYPITOISUUDEN JA ENTSYMAATTISEN AKTIIVISUUDEN VASTAAVUUS Tämän direktiivin 2 artiklan mukaisesti eurooppalaista standardimenetelmää (liite 3) noudattaen mitattu veren lyijypitoisuuden ja ALAD:n entsymaattisen aktiivisuuden vastaavuus on seuraava: Veren lyijypitoisuus (µg/100 ml verta) 35 30 20 ALAD (yksikköä/litra) 20 25 35 Jos mitatut ALAD-arvot ovat huomattavasti yllä olevia raja-arvoja suurempia eri väestönosissa, ei ole tarpeen suorittaa uutta veren lyijypitoisuuksien varmistusmittausta. LIITE III TEKNISET MÄÄRÄYKSET ALAD-AKTIIVISUUDEN MÄÄRITTÄMISEKSI Eurooppalainen standardimenetelmä delta-aminolevuliinihappodehydrataasin aktiivisuuden määrittämiseksi Delta-aminolevuliinihappodehydrataasin aktiivisuuden määrittämiseksi hyväksytyn menetelmän periaate on hyvin tunnettu. Se perustuu entsyymin inkuboimiseen ylimäärässä delta-aminolevuliinihapposubstraattia. Määrätyn ajan kuluttua muodostuva porfobilinogeeni sekoitetaan muunnettuun Ehrlichin reagenssiin ja saatu väri mitataan fotometrin avulla valkoista taustaa vasten. Muodostuneen porfobilinogeenin määrä ilmaisee ALAD:n aktiivisuutta. MENETELMÄ Valon vaikutus Viimeaikaiset kokemukset ovat osoittaneet, että erityisesti porfobilinogeeni on hyvin herkkä valolle. Määritys kokonaisuudessaan olisi suoritettava olosuhteissa, joissa koko laboratorio on suojassa suoralta auringonvalolta (eikä ainoastaan se kohta, jossa määritys suoritetaan). Ensimmäinen vaihe - Verinäytteiden otto ja säilytys ennen määritystä - Otetaan 2 ml:n näyte laskimoverestä muoviruiskulla (lyijystabiloimattomalla) kuivattua hepariinia käyttäen (> 5 mg). - Valmistetaan viipymättä neljä 0,2 ml:n näytettä, jotka jaetaan muoviputkiin (lyijystabiloimattomiin) ja jäähdytetään ne 4 °C:een. Pipetoinnissa käytetään Marbourg-tyyppisiä mittapipettejä. - Jos määritys suoritetaan 3 tunnin kuluessa, näytteiden jäähdyttäminen ei ole tarpeen. - Näytteiden säilytysaika 4 °C:n lämpötilassa on enintään 24 tuntia. - Juuri ennen määritystä kaikki näytteet on laitettava jäävesihauteeseen 10 minuutiksi. Huomautus: Sallittuja muoveja ovat polyeteeni, polystyreeni ja polypropeeni. Määritetty 24 tunnin säilytysaika 4 °C:n lämpötilassa on varovainen arvio. Tämä aika riittää näytteiden kuljettamiseen verinäytteiden ottopaikasta keskuslaboratorioon määritystä varten. Neljästä verinäytteestä kolmea käytetään ALAD:n määrittämiseen ja yhtä vertailukokeena. Toinen vaihe - Hematokriitin määrittäminen Tämä määrittäminen on suoritettava: - yhtä aikaa verinäytteen ottamisen kanssa, - kapillaarimenetelmällä käyttäen kahta näytettä. Suljetaan putken toinen pää ja sentrifugoidaan vähintään 30 000 kierroksen minuuttinopeudella (vähintään 5 minuuttia). Huomautus: Tämä määritys olisi parasta tehdä paikalla, ei kuitenkaan yli 24 tunnin päästä verinäytteen ottamisesta. Jos mahdollista, olisi käytettävä mikrohematokriittisentrifugia. Kolmas vaihe - Hemolyysi - Kolmesta verinäytteestä, jotka on sulatettu käyttäen 1,3 ml:a tislattua vettä (joka on esilämmitetty 37 °C:een), liuotetaan punasoluja 10 minuutin ajan 37 °C ± 0,2 °C:n lämpötilassa. - Lisätään vesi mieluiten 2 ml:n mittapipetillä ja sekoitetaan perusteellisesti. - Näytteitä ei saa enää ravistaa tässä vaiheessa. Huomautus: Hemolyysiin on päätetty käyttää vettä eikä Triton X 100:a. Triton X 100:lla tehdyissä hemolyysikokeissa ALAD:n aktiivisuus hidastuu huomattavasti, mitä ei ole vielä pystytty selittämään ja mikä saattaa olla menetelmästä aiheutunut virheellinen tulos. Neljäs vaihe - ALA-liuoksen lisääminen hemolyysiin - Valmistetaan ALA-liuos. - Liuosta ei pidä valmistaa yli 5 tuntia aikaisemmin. - Lämmitetään liuosta 37 °C:seen vähintään 10 minuutin ajan ennen lisäämistä. - Lisätään 1 ml liuosta hemolysaattiin, mieluiten 1 ml:n mittapipetillä ja sekoitetaan. Huomautus: On sovittu käytettävän pH-arvoa 6,4, sillä kokeet ovat osoittaneet, että tässä pH-arvossa ALAD:n aktiivisuuksien ja tavanomaisen väestön veren lyijypitoisuuden vastaavuussuhde on paras. Ei ole tarpeen tuottaa mahdollisimman suurta aktiivisuutta (joka saadaan aikaan nostamalla pH-arvoa), koska määritettävät aktiivisuudet ovat riittävän suuria. Viides vaihe - Vertailukokeen valmistus - Otetaan 0,2 ml verta, joka on käsitelty kuten ALAD:tä määritettäessä ALA-liuoksen lisäämisvaiheeseen asti; mainitun liuoksen sijasta lisätään ensin 1 ml HgCl2-TCA -liuosta, sitten 1 ml ALA-liuosta, jonka jälkeen toimitaan kuten ALAD:tä määritettäessä (katso jäljempänä). - Edellä mainittuun lisäämiseen käytetään mittapipettejä. Huomautus: Ainoastaan yhtä vertailukoetta verrataan kolmen kokeen sarjaan jokaista verinäytettä kohti. Jos vertailukokeen optinen tiheys on erittäin suuri, operaatio toistetaan sen tarkastamiseksi. Kuudes vaihe - Inkubaatio - 60 minuuttia 37 °C ± 0,2 °C:n lämpötilassa vesihauteessa. - Inkubaatioaika laskettuna ALA-liuoksen lisäämisestä. Huomautus: 60 minuutin inkubaatioaika on valittu ALAD:n aktiivisuuden lisäämiseksi luonnollisella tavalla, jos mikään muu vaihe ei johda aktiivisuuden keinotekoiseen lisääntymiseen. Kokeet ovat osoittaneet, että inkubaatioaika/aktiivisuus -suhde on lineaarinen yli kahden tunnin aikojen osalta. Inkubaatiolämpötila on pidetty 37 °C:ssa käytännöllisistä syistä. Seitsemäs vaihe - PBG-reaktion pysäyttäminen - Lisätään 1 ml HgCl2-TCA-liuosta inkubaatioseokseen, mieluiten 1 ml:n mittapipetillä. Kahdeksas vaihe - Sentrifugointi ja suodatus - 30 000 kierrosta minuutissa. - Suodatetaan, paperina Whatman N:o 54 tai vastaava (haponkestävä). Huomautus: Sentrifugoinnin on kestettävä noin 10 minuuttia. Suodatusvaihe on lisätty, ettei pieniä hiukkasia siirtyisi pipetoinnin yhteydessä kelluvan nesteen pinnalle. Nämä hiukkaset näyttävät aiheuttavan värireaktion Ehrlichin reagenssin kanssa. Useat kokeet ovat osoittaneet, että suodatusvaiheen lisääminen parantaa toistettavuutta. Suodatusvaihe voidaan tarvittaessa korvata toisella sentrifugoinnilla. Yhdeksäs vaihe - Reaktio Ehrlichin reagenssin kanssa - Sekoitetaan 1 ml kelluvaa nestettä ja 1 ml muunnettua Ehrlichin reagenssia mittapipettien avulla. - Sekoitetaan Vortex-tyyppisellä sekoittimella homogeenisuuden varmistamiseksi. - Annetaan reagoida 5 minuutin ajan ennen ekstinktion mittaamista. Huomautus: Homogeenisuuden varmistamiseksi on tärkeää huolehtia siitä, että suodatettu kelluva neste sekoittuu perusteellisesti Ehrlichin reagenssiin. Kymmenes vaihe: Ekstinktion mittaaminen - Kalibroidaan spektrofotometri käyttäen fenolftaleiiniliuosta emäksisessä puskurissa. - Verrataan näytteen ekstinktion mittatulosta vertailukokeeseen 555 nm:ssä 1 cm:n kyvetissä (tai 2 cm:n, jos absorptio on hyvin vähäistä). Yhdestoista vaihe - Entsymaattisen aktiivisuuden laskeminen - Aktiivisuuden laskemisessa käytettävä yhtälö on seuraava: OD korj. × 35 × 2 × 100 × K Hkt % × 60 × 62 = µmol ALA/min/ml RBC = U/ml jossa OD= mitattu ekstinktio 60 = inkubaatioaika 35 = laimennoskerroin 62 = molaarinen ekstinktiokerroin yksikkönä cm2/µmol K = spektrofotometrinen korjauskerroin Huomautus: Ehdotetut yksiköt ovat kansainvälisen biokemian liiton entsyyminimikkeistöä koskevien suositusten mukaiset. LIUOKSET 1. ALA-liuoksen valmistus Liuos A: 1,78 g Na2HPO4 7 2H2O:ta liuotetaan 100 ml:aan tislattua vettä (mieluiten deionisoitua). Liuos B: 1,38 g NaH2PO4 7 1H2O:ta liuotetaan 100 ml:aan tislattua vettä. 29 ml liuosta A + 71 ml liuosta B muodostavat puskurin, jossa on 0,1 M natriumfosfaattia pH-arvossa 6,4. Tätä puskurin ionivahvuutta tarvitaan pH-arvon vaihteluiden ehkäisemiseksi reagoivassa liuoksessa. 167,6 mg ALA-HCl:a liuotetaan liuokseen B (jonka on yhä oltava hapanta); pH mukautetaan 6,4:ksi liuoksen A avulla. Määrä täydennetään 100 ml:ksi puskuriliuoksella, jossa on 0,1 M natriumfosfaattia pH-arvossa 6,4. Tästä valmisteesta saadaan 0,01 M ALA-liuos. 2. HgCl2-TCA -liuos 1,35 g HgCl2:a liuotetaan 100 ml:aan 10-prosenttista trikloorietikkahappoa. 3. Ehrlichin reagenssiliuos Reagenssit: 2,5 g p-dimetyyliaminobentsaldehydi (pDMAB), 0,25 g HgCl2:a liuotettuna 10 ml:aan jääetikkaa, perkloorihappo tiheys 1,7, jääetikka. Valmistus: Liuotetaan pDMAB 50 ml:aan etikkahappoa, lisätään 24,5 ml perkloorihappoa ja 4 ml HgCl2-liuosta. Sekoitetaan, jäähdytetään ja täydennetään määrä 100 ml:ksi jääetikalla mittapullossa(1). Säilytetään tummassa pullossa. Kalibrointi: Jäsenvaltioiden yhdessä nimeämän laboratorion on suoritettava vuosittainen kalibrointi yhteisön tasolla. (1) Jos väri tässä vaiheessa muuttuu ruskeaksi, reagenssi on heitettävä pois.