LIITE I

Asetuksen 3, 4, 5, 7 ja 8 artiklan mukaisesti suoritettavia testejä koskeva järjestelmä

1. MAINITUN KASVINTUHOOJAN ESIINTYMISTÄ KOSKEVAT YLEISET PERIAATTEET

1.1 Mainitun kasvintuhoojan esiintymistä epäillään, jos asianomaiselle kasville tehdyn ensimmäisen havaitsemistestin tulos on positiivinen. Oireisen kasviaineiston tapauksessa ensimmäisenä havaitsemistestinä voidaan käyttää selektiivistä eristämistä.

1.2 Mainitun kasvintuhoojan esiintyminen vahvistetaan asianomaisten kasvien oireisten näytteiden perusteella seuraavissa tapauksissa: a) jos ensimmäinen havaitsemistesti perustuu selektiiviseen eristämiseen, jonka tuloksena saadaan morfologialtaan tyypillisiä pesäkkeitä: kahden tunnistustestin tulos on positiivinen; b) jos ensimmäinen havaitsemistesti on muu kuin selektiiviseen eristämiseen perustuva testi: i) kahden tunnistustestin tulos on positiivinen, kun näytteelle on ensin tehty selektiivinen eristäminen; ii) toinen havaitsemistesti on muu kuin selektiiviseen eristämiseen perustuva testi, ja sen tulos on positiivinen.

1.3 Mainitun kasvintuhoojan esiintyminen vahvistetaan asianomaisten kasvien oireettomien näytteiden perusteella seuraavissa tapauksissa: a) joko ensimmäisenä tai toisena havaitsemistestinä käytetään molekyylitestiä (eli DNA:han perustuvaa testiä) (reaaliaikainen TaqMan®-PCR-testi tai tavanomainen PCR-testi), ja jälkimmäisen havaitsemistestin tulos on positiivinen; b) jos näytteet on otettu sellaisessa jäsenvaltiossa tai sellaisella jäsenvaltion alueella, jossa/jolla mainittua kasvintuhoojaa ei tiedetä esiintyvän tai jos näytteet ovat peräisin toisesta jäsenvaltiosta: a alakohdan mukaisesti tehdyn toisen havaitsemistestin tulos on positiivinen ja kahden tunnistustestin tulos on positiivinen, kun näytteelle on ensin tehty selektiivinen eristäminen.

2. TESTIT

2.1 Havaitsemistestit

Havaitsemistestien on oltava sellaisia, että ne osoittavat johdonmukaisesti vähintään 104 solua uudelleen suspendoidun sakan yhtä millilitraa kohden.

Toisen havaitsemistestin on perustuttava erilaisiin biologisiin periaatteisiin tai eri nukleotidialueisiin kuin ensimmäinen havaitsemistesti.

Havaitsemistestit ovat seuraavat:

a) immunofluoresenssitestit, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

b) FISH-testi (van Beuningen et al. (1995) (1), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

c) eristäminen siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan. Jompikumpi seuraavista vaihtoehdoista on toteutettava: i) eristäminen suoraan osittain valikoivalle (tai ei-valikoivalle) kasvualustalle, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; ii) biomäärityksellä tehty rikastus, ja sen jälkeen eristäminen siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

d) tavanomainen PCR-testi käyttäen Pastrik (2000) (2) -alukkeita, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

e) reaaliaikaiset TaqMan®-PCR-testit käyttäen seuraavia alukkeita ja koettimia: i) Schaad et al. (1999) (3), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (ns. NYtor-testi), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iii) Gudmestad et al. (2009) mukautettuna Vreeburgin et al. (2018)4 mukaisesti, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iv) Massart et al. (2014) (5), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

2.2 Tunnistustestit

Tunnistustestit ovat seuraavat:

a) immunofluoresenssitesti, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

b) tavanomainen PCR-testi (Pastrik (2000)), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

c) reaaliaikaiset TaqMan®-PCR-testit käyttäen seuraavia alukkeita ja koettimia: i) Schaad et al. (1999), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; ii) Vreeburg et al. (2018) (ns. NYtor-testi), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iii) Gudmestad et al. (2009) mukautettuna Vreeburgin et al. (2018) mukaisesti, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan; iv) Massart et al. (2014), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

d) DNA-viivakoodaus, siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan;

e) MALDI-TOF-massaspektrometria (Zaluga et al. (2011) (6), siten kuin kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan.

3. VUOKAAVIOT MENETTELYISTÄ

Vuokaavio nro 1: Diagnoosimenettely mainitun kasvintuhoojan esiintymisen toteamiseksi asianomaisesta kasvista otetuissa oireisissa näytteissä.

a Ensimmäinen tai toinen havaitsemistesti voi olla eristämiseen perustuva. Jos epäillään mainitun kasvintuhoojan esiintymistä kasvualustassa, pesäkkeet on puhdistettava puhdasviljelmien aikaansaamiseksi. Puhdasviljelmille on suoritettava kaksi tunnistustestiä. Kasvintuhoojan esiintyminen voidaan vahvistaa vain, jos kummankin tunnistustestin tulos on positiivinen.

b Kolmannen havaitsemistestin on perustuttava erilaisiin biologisiin periaatteisiin tai eri nukleotidialueisiin.

Vuokaavio nro 2: Diagnoosimenettely mainitun kasvintuhoojan esiintymisen toteamiseksi asianomaisesta kasvista otetuissa oireettomissa näytteissä.

a Eristämistä ei käytetä.

b Kolmannen havaitsemistestin on perustuttava erilaisiin biologisiin periaatteisiin tai eri nukleotidialueisiin. Eristämistä ei käytetä.

c 1.3 kohdan b alakohdassa tarkoitettujen näytteiden osalta mainitun kasvintuhoojan esiintymisen vahvistaminen toisen positiivisen havaitsemistestin jälkeen edellyttää mainitun kasvintuhoojan eristämistä kyseisestä näytteestä ja sen jälkeen kahta tunnistustestiä, joiden tulos on positiivinen.

4. NÄYTTEIDEN VALMISTELU

4.1 Näytteet oireettomista mukuloista

Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti mukuloiden napapää käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

4.2 Näytteet muusta oireettomasta kasviaineistosta kuin mukuloista

Piilevien tartuntojen havaitsemiseksi on käytettävä kokoomanäytteitä varrenpalasista. Menettelyä voidaan soveltaa näytteeseen, joka sisältää enintään 200 eri kasveista peräisin olevaa varrenpalasta. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti varrenpalaset desinfioidaan ja käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

4.3 Näytteet oireisesta asianomaisesta kasvista

Mukulan johtosolukkorenkaasta tai nuutuneelta vaikuttavien asianomaisten kasvien varren johtojänteistä irrotetaan aseptisesti paloja solukosta. Kansainvälisissä diagnostisissa standardeissa kuvataan yksityiskohtaisesti asianmukainen laboratoriomenettely, jonka mukaisesti nämä solukonpalat käsitellään sellaisen uutteen saamiseksi, josta mainitun kasvintuhoojan esiintyminen voidaan havaita.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995), ”Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe”, Züchtungs Forschung 1, s. 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000), ”Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA”, European Journal of Plant Pathology, 106, s. 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999), ”Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system”, Plant Disease 83, s. 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), ”Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin 48, s. 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), ”Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology 138, s. 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011), ”GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter”, Systematic and applied microbiology 34, s. 400–7. 10,1016/j.syapm.2011.05.001.