97/647/EY: Komission päätös, tehty 9 päivänä syyskuuta 1997, väliaikaisen testimenetelmän yksityiskohtaisesta esittämisestä Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajan määrittämiseksi, toteamiseksi ja tunnistamiseksi perunoissa



Virallinen lehti nro L 273 , 06/10/1997 s. 0001 - 0025



KOMISSION PÄÄTÖS, tehty 9 päivänä syyskuuta 1997, väliaikaisen testimenetelmän yksityiskohtaisesta esittämisestä Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajan määrittämiseksi, toteamiseksi ja tunnistamiseksi perunoissa (97/647/EY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon kasvien tai kasvituotteiden haitallisten organismien jäsenvaltioihin kulkeutumisen estämiseen liittyvistä suojatoimenpiteistä 21 päivänä joulukuuta 1976 annetun neuvoston direktiivin 77/93/ETY (1), sellaisena kun se on muutettuna direktiivillä 97/14/EY (2), ja erityisesti sen 15 artiklan 3 kohdan, sekä katsoo, että luvan antamisesta jäsenvaltioille toteuttaa väliaikaisesti Alankomaiden kuningaskuntaa koskevia lisätoimenpiteitä Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajan leviämisen estämiseksi 24 päivänä marraskuuta 1995 tehdyn komission päätöksen 95/506/EY (3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna päätöksellä 96/599/EY (4), ja erityisesti sen 1 artiklan 2 kohdan a ja bb alakohdassa määrätään, että kun perunat testataan virallisesti tai saatetaan virallisesti valvotun testin alaisiksi, jäsenvaltioiden on Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajan osalta käytettävä Euroopan ja Välimeren maiden kasvinsuojelujärjestön (EPPO) (5) vahvistamaa karanteenimenettelyä N:o 26 tai jotakin muuta direktiivin 77/93/ETY 16 a artiklassa hyväksyttyä menettelyä, Euroopan yhteisöjen komission pysyvän kasvinsuojelukomitean yhteyteen perustama bakteeriperäisiä kasvitauteja käsittelevä tilapäinen asiantuntijakomitea on määritellyt yksityiskohtaisesti väliaikaisen testimenetelmän, jossa otetaan huomioon EPPO:n karanteenimenettelyn N:o 26 julkaisemisen jälkeen kehitetyt parannetut toteamis- ja testausmenettelyt; kyseinen testimenetelmä on väliaikainen, sillä lisätutkimuksia on odotettavissa erityisesti yksittäisten testien herkkyyden ja spesifisyyden osalta, ja niiden tavoitteena on valita ja yhdenmukaistaa parhaat mahdolliset käytettävissä olevat testit niiden sisällyttämiseksi päivitettyyn testimenetelmään, ja tässä päätöksessä määrätty väliaikainen testimenetelmä on pysyvän kasvinsuojelukomitean lausunnon mukainen, ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN. 1 artikla Päätöksen 95/506/EY, sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna, 1 artiklan 2 kohdan a alakohdan bb alakohtaa sovellettaessa Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajaa koskeva, Euroopan ja Välimeren maiden kasvinsuojelujärjestön (EPPO) vahvistama karanteenimenettely N:o 26 on korvattava Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith -taudinaiheuttajan määrittämisen, toteamisen ja tunnistamisen osalta tämän päätöksen liitteessä esitetyllä väliaikaisella testimenetelmällä. 2 artikla Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 9 päivänä syyskuuta 1997. Komission puolesta Franz FISCHLER Komission jäsen (1) EYVL L 26, 31.1.1977, s. 20. (2) EYVL L 87, 2.4.1997, s. 17. (3) EYVL L 291, 6.12.1995, s. 48. (4) EYVL L 265, 18.10.1996, s. 18. (5) EPPO-yleiskertomus n:o 20, 255-262 (1990). LIITE VÄLIAIKAINEN TESTIMENETELMÄ PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI, TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI TESTIMENETELMÄN SOVELTAMISALA Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat: i) tumman rengasmädän määritystä perunan kasveista ja mukuloista, ii) Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista otetuista näytteistä, iii) Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan tunnistamista. Liitteessä esitetään yksityiskohtaisesti testiaineistojen, so. kasvualustojen, puskurien, liuosten, reagenssien valmistelu. SISÄLTÖ I jakso Testimenetelmän soveltaminen . 4 1. Tumman rengasmädän määritys perunan kasveista ja mukuloista . 4 2. Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnistaminen perunan mukuloista otetuista näytteistä . 6 II jakso Tumman rengasmädän määritys perunan kasveista ja mukuloista . 8 1. Perunan tumman rengasmädän oireet . 8 2. Nopea seulontakoe (kokeet) . 8 3. Eristämismenettely . 9 4. Varmistuskoe (kokeet) . 9 III jakso Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnistaminen perunan mukuloista otetuista näytteistä . 12 1. Näytteen esikäsittely koetta varten . 12 2. Immunofluoresenssi (IF) -testi . 13 3. Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) -testi . 15 4. Polymeraasiketjureaktio (PCRTM) -testi . 15 5. Laimennussarja valikoivalle alustalle . 17 6. Biotesti . 18 7. Rikastustestit . 18 8. Patogeenisyystesti . 18 Liite 1 Ravintoalusta Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten . 19 Liite 2 Aineistot näytteen esikäsittelyä varten . 20 Liite 3 Aineistot IF-testiä varten . 21 Liite 4 Kontaminaatioasteen määritys IF-testillä . 22 Liite 5 Aineistot ELISA-testiä varten . 23 Liite 6 Aineistot PCR-testiä varten . 24 Liite 7 Aineistot valikoivalle alustalle tehtävää laimennussarjaa ja rikastustestiä varten . 24 Viitteet . 25 I JAKSO TESTIMENETELMÄN SOVELTAMINEN 1. Tumman rengasmädän määritys perunan kasveista ja mukuloista Testausmenettely on tarkoitettu kasveille ja mukuloille, joiden oireet ovat tyypillisiä tumman rengasmädän oireita tai antavat aihetta epäillä tätä tautia. Siihen kuuluu nopea seulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johto(jänne)solukosta määritysalustalle ja - jos tulos on positiivinen - viljelmän tunnistaminen Pseudomonas solanacearum - kasvintuhoojaksi. Etenemiskaavio >VIITTAUS KAAVIOON> Etenemiskaavion viittaukset >KAAVION ALKU> (1) Oireiden kuvaus esitetään II jakson 1 kohdassa. (2) Nopealla seulontakokeella voidaan tehdä alustava taudinmääritys. Tarkoituksenmukaiset testit ovat: - Johtosolukon valutustesti (II jakso, 2 kohta) - Testi poly-ß-hydroksibutyraattirakeille (II jakso, 2 kohta) - IF-testi (III jakso, 2 kohta) - ELISA-testi (III jakso, 3 kohta) - PCR-testi (III jakso, 4 kohta) (3) Vaikka taudinaiheuttajan eristäminen tyypillisten oireiden perusteella laimennussarjalla on yksinkertaista, viljely voi epäonnistua, jos tartunta on edennyt pitkälle. Taudin saastuttamissa solukoissa elävät saprofyyttiset bakteerit voivat ohittaa kasvussa taudinaiheuttajan tai estää taudinaiheuttajan kasvua eristysalustalla. Jos eristyskokeen tulos on negatiivinen, mutta taudin oireet tyypilliset, eristäminen on toistettava mieluiten valikoivalla laimennussarjalla. (4) Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan puhtaan viljelmän tunnistaminen luotettavasti on mahdollista vähintään yhden II jakson 4.1 kohdassa luetellun testin ja patogeenisyystestin avulla (II jakson 4.3 kohta). Biovarin ja rodun määrittäminen on vapaaehtoista, mutta sitä suositellaan kaikissa uusissa tapauksissa. >KAAVION LOOPU> 2. Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan toteaminen ja tunnistaminen perunan mukuloista otetuista näytteistä Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan mukuloissa yhden tai mieluummin useamman seulontakokeen avulla; positiivinen koetulos varmistetaan eristämällä taudinaiheuttaja, minkä jälkeen tyypillisten pesäkkeiden eristämistä seuraa puhtaan viljelmän tunnistaminen Pseudomonas solanacearum. Etenemiskaavio >VIITTAUS KAAVIOON> Etenemiskaavion viittaukset >KAAVION ALKU> (1) Näytekoko Standardi näytekoko on 200 mukulaa. Menetelmä soveltuu myös käytettäväksi alle 200 mukulan näytteille. (2) Seulontakoe (-kokeet) Yksi ainoa testi ei ehkä ole riittävän herkkä tai luotettava Pseudomonas solanacearum -bakteerin toteamiseksi näytteestä. Sen vuoksi suositellaan useampaa kuin yhtä testiä. Näiden testien olisi mahdollisuuksien mukaan oltava metodiikaltaan erilaisia. (3) Immunofluoresenssi (IF) -testi IF-testi (epäsuora menetelmä) on hyvin tunnettu seulontakoe. Tämä on etu verrattuna muihin kokeisiin, joita ei ole vielä täysin kehitetty tai validoitu. Testiä käytetään moniin muihinkin lakisääteisiin bakteeritutkimuksiin, esim. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tutkimuksiin. Testin herkkyys on 103-104 solua/l ML perunauutetta tämän menetelmän mukaisilla parametreillä. Antiseerumin laatu on kriitinen tekijä koetulosten luotettavuuden kannalta. Ainoastaan sellainen antiseerumi, jonka tiiteri on korkea (vähintään 2 000 käsittelemättömän antiseerumin osalta), on kelvollista, ja kaikki kokeet on tehtävä antiseerumitiitterillä tai tiitteriä pienemmällä yhdellä laimennoksella. Epäsuora menetelmä on parempi. Suoraa menetelmää voidaan soveltaa, jos koe on herkkyysasteeltaan ja spesifisyydeltään epäsuoraa menetelmää vastaava. IF-testin etuna on se, että reaktion spesifisyydestä tietoa antavaa solujen värjäytymisen morfologiaa ja fluoresenssin voimakkuutta voidaan tulkita subjektiivisesti. Ristireaktiot solumorfologialtaan Pseudomonas solanacearum -bakteerin kaltaisten maassa tai perunan solukoissa olevien serologisesti saman sukuisten bakteerien kanssa ovat tavallisia. IF -testiä voidaan käyttää ainoana seulontakokeena, vaikka tapauksissa, joissa epäillään ristireaktioita, olisi tehtävä toinen sellainen IF-testi, jossa käytetään eri alkuperää olevaa antiseerumia, tai vaihtoehtoinen seulontakoe. (4) Valikoiva laimennussarja Kyseinen koe on herkkä ja valikoiva testi Pseudomonas solanacearum -bakteerin toteamiseksi, jos käytetään muunnettua SMSA-alustaa ja tätä menetelmää varten määriteltyä testausmetodiikkaa. Tulos saadaan 3-6 päivää näytteen valmistuksen jälkeen. Taudinaiheuttaja saadaan eristettyä suoraan viljelmäksi ja se on helppo tunnistaa. Jotta testistä saataisiin täysi hyöty, testissä käytettävät mukuloiden pienet napapäät on käsiteltävä huolellisesti, jotta voidaan eliminoida toissijaiset bakteerit, jotka ovat alustalla Pseudomonas solanacearum -bakteerin kilpailijoita ja voivat estää taudinaiheuttajan kehittymisen. Jotkut kannat voivat kasvaa heikosti, koska alustan aineosat vaikuttavat myös valikoivasti kohdeorganismiin. Pseudomonas solanacearum -bakteerin erottamiseen muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista tarvitaan myös huolellisuutta. Valikoivaa laimennussarjaa voidaan käyttä ainoana seulontakokeena, vaikkakin kun saadaan negatiivinen testitulos ja kun epäillään muiden bakteerien estävän Pseudomonas solanacearum -bakteerin kasvua alustalla, olisi tehtävä toinen seulontakoe. Tällaisissa tapauksissa IF-testi on sopivin koe. (5) ELISA-testi ELISA-testi ei yleensä ole yhtä herkkä kuin IF-testi 104-105 solua perunauutteen yhtä millilitraa kohden). Tämä testi on halpa ja nopea, mutta antaa yleensä herkemmin vääriä positiivisia (ristireaktiot) tuloksia ja vääriä negatiivisia (fenolimolekyylien estävä vaikutus perunauutteessa) tuloksia. Antiseerumin spesifisyyttä koskevat vaatimukset ovat erittäin korkeat. ELISA-testiä ei voida käyttää ainoana seulontakokeena. (6) PCR-testi PCR-testillä on mahdollista suorittaa toteaminen erittäin suurella herkkyydellä. Vaikka näytteestä kasvi- tai mukulauutteen aineosat estävät helposti koetta, jolloin saadaan väärä negatiivinen tulos. Jotkut perunalajikkeet sisältävät toisia enemmän inhibiittoreita. Sen vuoksi on tarpeen poistaa nämä inhibiittorit. Inhibiittoreita voidaan torjua laimentamalla, mutta Pseudomonas solanacearum -populaatiot laimenevat samalla. On noudatettava suurta huolellisuutta kaikissa näytevaiheissa ja testin valmistelussa sellaisen saastunnan estämiseksi, joka voisi aiheutta vääriä positiivisia tuloksia. Tämän vuoksi suoraa PCR-testiä ei voida käyttää ainoana seulontakokeena. (7) Rikastustesti Perunauutenäytteiden inkubointi puolivalikoivassa liuoksessa, kuten muunnetussa SMSA-liuoksessa, tekee mahdolliseksi Pseudomonas solanacearum -bakteerin lisääntymisen. Ehkä vielä tärkeämpää on se, että se laimentaa myös ELISA- ja PCR-testille mahdolliset inhibiitorit. Näin Pseudomonas solanacearum -bakteeri voidaan havaita rikastusliuoksessa IF-, ELISA- ja PCR-testillä. Suoraa laimennussarjaa ei suositella tehtäväksi rikastusliuoksista. Näitä rikastusmenetelmiä ei ole perusteellisesti kokeiltu ja testattu. Ne on mainittu tässä, koska niihin sisältyy lupaavia mahdollisuuksia. Niitä ei kuitenkaan voida käyttää ainoina toteamismenetelminä, koska niistä on suhteellisen vähän kokemusta. (8) Biotesti Biotesti voidaan tehdä tomaatilla tai munakoisolla. Testi edellyttää optimaalisia menetelmässä tarkennettuja inkubointiolosuhteita. Pseudomonas solanacearum -bakteerin inhibiittorit SMSA-alustalla eivät todennäköisesti häiritse testiä. (9) Varmistuskoe (-kokeet) Pseudomonas solanacearum -bakteerin puhdas viljelmä voidaan tunnistaa luotettavasti vähintään yhden II jakson 4.1. kohdassa luetellun testin ja patogeenisyystestin (II jakson 4.3. kohta) avulla. Biovarin ja rodun määritys on vapaaehtoista, mutta sitä suositellaan kaikissa uusissa tapauksissa. >KAAVION LOOPU> II JAKSO TUMMAN RENGASMÄDÄN MÄÄRITYS PERUNAN KASVEISTA JA MUKULOISTA 1. Tumman rengasmädän oireet Perunakasvi. Tartunnan varhaisessa vaiheessa lehdet nuutuvat kasvin tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutuminen jää nopeasti pysyväksi ja kasvi kuolee. Nuutuneiden kasvien varsien johtosolukko voi poikkileikkauksesta tarkasteltuna muuttua ruskeaksi ja maitomaista mätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä saadaan helposti ulos pusertamalla. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuista valuu limaa. Perunan mukula. Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnityskohdan läheltä. Tartunnan varhainen vaihe ilmenee lasimaisena värityksenä keltaisesta vaaleanruskeaan johtosolukkorenkaassa, josta muutaman minuutin kuluttua pursuaa joko itsestään tai peukaloilla kevyesti kuoresta leikkauspinnan läheltä painettaessa vaaleankeltaista mätää. Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi ja nekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartunta leviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, mistä on seurauksena punaruskeita hieman painuneita kuoren vioittumia, joista vuotaa bakteerimätää, johon maahiukkasia kiinnittyy. 2. Nopea seulontakoe (kokeet) Nopeilla seulontakokeilla voidaan tehdä alustava taudinmääritys. Käytetään yhtä tai useampaa seuraavista kokeista: Valutuskoe Pseudomonas solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuneissa perunanvarsissa voidaan arvioida seuraavalla yksinkertaisella ennakoivalla kokeella: Varsi leikataan juuri maanpinnan yläpuolelta. Leikattu pinta asetetaan dekantterilasiin, jossa on vettä. Pian tämän jälkeen bakteerilimaa alkaa itsestään valua johtosolukkokimpuista. Mikään muu johtosolukkoja perunakasveissa tartuttava bakteeri ei aiheuta tällaista ilmiötä. Poly-ß-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen PHB-rakeet Pseudomonas solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näkyviin värjäämällä niilinsinisellä A tai sudaninmustalla B. Valmistetaan preparaatti joko limasta taikka suspendoidusta solukosta mikroskooppilevylle tai preparaatti 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (liite 1). Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit biovarin 2 tai rodun 3 kannasta. Annetaan kuivua. Kuljetetaan levyn pohja useita kertoja nopeasti liekin läpi kunnes preparaatti on kiinnittynyt. Niilinsinisellä tehtävä testi 1. Peitetään kiinnittynyt preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan 55 °C:ssa. 2. Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. 3. Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella. Inkuboidaan 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa. 4. Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Pyyhitään kuivaksi paperipyyhkeellä. 5. Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelevy. 6. Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljyimmersio-objektiivilla 1 000-kertaisella suurennoksella. Tarkastellaan PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen Pseudomonas solanacearum -bakteerille. Sudaninmustalla tehtävä testi 1. Peitetään kiinnittynyt preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa. 2. Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. 3. Upotetaan preparaatti nopeasti ksyloliin. Pyyhitään kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus! Ksyloli on haitallinen tuote. Työskennellään vetokaapissa. 4. Peitetään preparaatti 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus! Safraniini on haitallinen tuote. Työskennellään vetokaapissa. 5. Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Pyyhitään kuivaksi paperipyyhkeellä. Asetetaan peitelevy päälle. 6. Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyssä 1 000-kertaisella suurennoksella. Pseudomonas solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi. Solunseinämä värjäytyy vaaleanpunaiseksi. Muut testit Muut soveltuvat seulontatestit ovat IF-testi (jakso III.2.), ELISA-testi (jakso III.3.) ja PCR-testi (jakso III.4.). 3. Eristämismenettely 3.1. Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaatipuskuriin. Jätetään 5-10 minuutiksi työpöydälle. 3.2. Valmistetaan suspensiosta vähintään kaksi kymmenkertaista laimennosta, >NUM>1/>DEN>10 ja >NUM>1/>DEN>100 tai useampia, jos se on tarpeellista. 3.3. Siirretään vakiomäärä suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA ja SPA liite 1) ja/tai Kelman's tetrazolium -alustalle (liite 1) ja/tai valikoivalle SMSA-alustalle (liite 7) ja levitetään tarkoituksenmukaisella laimennussarjatekniikalla. Tarvittaessa valmistetaan sarja erillisiä maljoja, joissa on laimennettua solususpensioviljelmää Pseudomonas solanacearum -bakteerikannan rodun 3 biovaria 2 positiivisena kontrollina. 3.4. Inkuboidaan maljoja 3 päivän ajan 28 °C:ssa. Inkubointia voidaan jatkaa 6 päivään jos kasvu on hidasta, mutta SMSA-alustalla olevat pesäkkeet voivat muuttua ei-tyypillisiksi ja kuolla. Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset Pseudomonas solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät helmenvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein tyypillisesti kierteisiä. Kelman's Tetrazolium -alustalla Pseudomonas solanacearum -lajin virulenttien isolaattien tyypilliset pesäkkeet ovat kermamaisia, litteitä, epäsäännöllisiä ja juoksevia ja niiden keskellä on verenpunaisia kierteitä. Avirulenttien Pseudomonas solanacearum -isolaattien pesäkkeet ovat tummanpunaisia. SMSA-alustalla tyypilliset elinvoimaiset Pseudomonas solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät maidonvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, joiden keskiosan väri on verenpunainen. Avirulentit Pseudomonas solanacearum -bakteerin muodot kehittävät vähemmän juoksevia pesäkkeitä, joiden väri SMSA-alustalla vaihtelee täysin vaaleanpunaisesta punaiseen. 3.5. Puhdistetaan pesäkkeet, joiden morfologia on luonteenomainen, jatkoviljelmällä tavanomaisella ravintoalustalla. Vältetään säännöllistä jatkoviljelyä, joka voi johtaa elinvoimaisuuden vähenemiseen. 4. Varmistuskoe (kokeet) 4.1. Pseudomonas solanacearum -bakteerin tunnistaminen Pseudomonas solanacearum -bakteerin puhdasviljelmät tunnistetaan vähintään yhdellä seuraavista menetelmistä: Ravinto- ja entsymaattiset testit Huom. Mukaan on valikoitu testejä, joilla on ratkaiseva merkitys lajin ja biovarin määrittelemisessä. Seuraavat Pseudomonas solanacearum -bakteerin fenotyyppiset ominaisuudet joko esiintyvät tai puuttuvat: >TAULUKON PAIKKA> ravintoliuokset ja menetelmät, ks. Lelliott & Stead (1987). IF-testi Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio, jossa on 106 solua millilitraa kohden. Valmistetaan sarja antiseerumin kaksinkertaisia laimennoksia. Sovelletaan IF-menettelyä (III jakson 2. kohta). Viljelmän IF-tiitterin on vastattava positiivisen kontrollin tiitteriä. ELISA-testi Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio, jossa on > 106 solua millilitraa kohden. Sovelletaan ELISA-menettelyä (III jakson 3. kohta). Viljelmän ELISA-arvon on vastattava positiivisen kontrollin arvoa. PCR-testi Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio, jossa on 106 solua millilitraa kohden. Sovelletaan PCR-menettelyä (III jakson 4. kohta). Viljelmän PCR tuotteen on vastattava määrältään ja restriktio entsyymianalyysi (REA) -kuvioltaan positiivista kontrollia. Fluoresoiva in-situ hybridisaatio (FISH) Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta suspensio, jossa on 106 solua millilitraa kohden. Sovelletaan FISH-menettelyä (van Beuningen et al, 1995) sekä OLI-1 PCR aluketta (Sea et al., 1993). Viljelmässä on ilmettävä samat reaktiot kuin positiivisessa kontrollissa. Proteiiniprofilointi Denaturoidut kokonaiset soluproteiinit erotetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) (Stead, 1992a). Rasvahappoprofilointi (FAP) Kasvatetaan viljelmää ja positiivista kontrollikantaa 48 tunnin ajan 28 °C:ssa tryptikaasisoija-agarilla ja sovelletaan FAP-menettelyä (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead 1992b). Viljelmän profiilin on oltava sama kuin positiivisella kontrollilla. Tarkasti määritellyissä olosuhteissa luonteenomaiset rasvahapot ovat 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH. 4.2. Kantojen määrittäminen Kannan määrittäminen on vapaaehtoista, mutta suositeltavaa kaikissa uusissa tapauksissa. Biovarin määrittäminen Pseudomonas solanacearum -bakteerin biovarit erotetaan kolmen heksoosialkoholin ja kolmen sokerin käyttö- ja hapettamiskyvyn perusteella (Hayward, 1964 ja 1994): >TAULUKON PAIKKA> Lisäkokeet jakavat biovarin 2 alafenotyyppeihin (Hayward, 1994): >TAULUKON PAIKKA> Rodun määrittäminen Rotu (Buddenhagen et al., 1962) määritetään patogeenisyystestin perusteella tomaatti- tai munakoisokasveista ja tupakkakasveista ja yliherkkyysreaktiotestillä (HR) tupakan lehdistä (Lozano Ja Sequeira, 1970): >TAULUKON PAIKKA> Rodun määrittäminen tupakan hypersensitiivisyysreaktion perustumalla patogeenisyystillä ei ole täysin luotettavaa, ja rotu voidaan sen sijaan määrittää biovarin ja eristetyn bakteerin isäntäkasvin perusteella. Viljelmä voidaan lisäksi kuvata seuraavilla menetelmillä: Genomien sormenjäljet Pseudomonas solanacearum -kompleksin rotujen molekulaarinen erottaminen voi tapahtua: RFLP-analyysillä (Cook et al., 1989) Toistuvan järjestyksen PCR:llä (REP-, ERIC- & BOX-PCR [Louws et al., 1995; Smith et al., 1995]). 4.3. Patogeenisyystesti Tämä testi on tarkoitettu varmistamaan Pseudomonas solanacearum bakteeriksi tunnistettujen viljelmien virulenssi. Valmistetaan viljelmästä ja positiivisesta kontrollikannasta inokulaatti, jossa on 106, solua millilitraa kohden. Inokuloidaan 5-10 kolmelehtiasteella olevaa tomaatti- tai munakoisokasvia (III jakson 6. kohta). Inkuboidaan kahden viikon ajan 22 °C - 28 °C:ssa korkeassa suhteellisessa kosteudessa kastellen päivittäin. Tarkkaillaan nuutumisoireita, equinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua. Eristetään kasveista, joissa näkyy oireita: - Poistetaan kudosta varresta 2 cm inokulointikohdan yläpuolelta. - Pienennetään ja suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuria. Viljellään maljassa, inkuboidaan ja tutkitaan tyypilliset Pseudomonas solanacearum -pesäkkeet. III JAKSO PSEUDOMONAS SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMINEN JA TUNNISTAMINEN PERUNAN MUKULOISTA OTETUISTA NÄYTTEISTÄ Huom. Standardinäytekoko on 200 mukulaa. Menetelmä soveltuu myös käytettäväksi alle 200 mukulan näytteille. 1. Näytteen valmistaminen koetta varten Huom. Kyseisessä menettelyssä saatavaa perunauutetta voidaan käyttää myös Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen. Vapaavalintaiset esikäsittelyt, jos ne arvioidaan tarpeellisiksi: i) Inkuboidaan näytettä 25-30 °C:ssa kahden viikon ajan piilevien Pseudomonas solanacearum -populaatioiden lisääntymisen edistämiseksi. ii) Pestään mukulat juoksevalla vedellä tarkoituksenmukaisilla desinfiointi- ja puhdistusaineilla. Ilmakuivataan mukulat. 1.1. Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveitsellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat ensin näkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale (halkaisija 3-5 mm) johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä. Yritetään pitää muun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä. Toistetaan 1 kohdan mukaiset toimet näytteen jokaisen mukulan kohdalla. Vaihdetaan leikkausveitsen terää tai vihannesveistä näytteiden välillä. Huom. Mukuloiden silmämääräinen tarkastelu (II jakson 1 kohta) voidaan tehdä tässä vaiheessa. Laitetaan sivuun jokainen mukula, jossa on oireita, ja testataan yksittäin (II jakso). 1.2. Kerätään solukkokappaleet suljettuun astiaan. Solukkokappaleet olisi mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitä voidaan varastoida korkeintaan 24 tunnin ajan tai 4 °C:ssa korkeintaan 72 tunnin ajan. 1.3. Käsitellään solukkokappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: i) Siirretään solukkokappaleet sopivaan säiliöön. Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria (liite 2) peittämään kappaleet. Jauhetaan kappaleet hienoksi Waring Blenderissä tai Ultra Thurraxissa kunnes ne ovat juuri homogenoituneet. Vältetään liiallista homogenointia. Annetaan massan liota 15-30 minuuttia. ii) Siirretään solukkokappaleet sopivaan säiliöön. Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria peittämään kappaleet. Asetetaan säiliö tasoravistimeen. Inkuboidaan 50-100 rpm:n kierrosnopeudella neljän tunnin ajan 20-22 °C:ssa tai 16-24 tunnin ajan 4 °C:ssa. iii) Siirretään solukkokappaleet vahvaan kertakäyttöiseen maseraatiopussiin (esim. Stomacher-pussi, jonka mitat ovat 105 mm × 150 mm, säteilysteriili). Murskataan solukkokappaleet varovasti sopivalla työkalulla, esim. vasaralla, kunnes ne ovat juuri homogenoituneet. Lisätään riittävä määrä liotuspuskuria peittämään murskatut kappaleet. Annetaan massan seistä 15-30 minuuttia. 1.4. Uutetaan bakteerit käsitellyistä solukkokappaleista jollakin seuraavista menettelyistä: i) Dekantoidaan liuos varovasti sentrifugiputkeen jättäen jäännökset säiliöön tai pussiin. Vaihtoehto: Jos dekantoitu liuos on sameaa: sentrifugoidaan enintään 180 xg 10 minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa. Sentrifugoidaan dekantoitua liuosta tai ensimmäisestä sentrifugoinnista saatua supernatanttia 7 000 xg 15 minuutin ajan tai 10 000 xg 10 minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa. Poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta. ii) Suodatetaan liuos sellaisen suodatusjärjestelmän läpi, jonka huokoskoko on 40-100 µm. Tehostetaan suodatusta tyhjiöpumpulla. Kootaan suodos sentrifugiputkeen. Pestään suodatin liuotuspuskurilla. Sentrifugoidaan suodosta 7 000 xg 15 minuutin ajan tai 10 000 xg 10 minuutin ajan alle 10 °C:n lämpötilassa. Poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta. 1.5. Suspendoidaan sakka uudelleen 1 ml:aan sakkapuskuria (liite 2). Jaetaan kahteen yhtä suureen osaan ja siirretään kumpikin osa pieneen koeputkeen. Käytetään toinen koeputkista testaukseen. Säilytetään loput tästä uutteesta 4 °C:n lämpötilassa testauksen ajan. Lisätään 10-25 % (v/v) steriiliä glyserolia toiseen koeputkeen. Sekoitetaan (Vortex). Varastoidaan - 18 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai - 70 °C:n lämpötilaan (kuukausiksi). 2. Immunofluoresenssitesti (IF) Käytetään Pseudomonas solanacearum -bakteerin, mieluiten rodun 3 biovaria 2, antiseerumia. Määritetään tiitteri suspensiosta, jossa on 106 solua millilitraa kohden Pseudomonas solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta sopivalla fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugaatin (FITC) laimennoksella valmistajan suositusten mukaisesti. Käsittelemättömän antiseerumin IF-tiitterin olisi oltava vähintään 1: 2 000. Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10 halkaisijaltaan vähintään 6 mm:n syvennystä. Käytetään FITC-konjugaattikontrollia ja fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen (PBS) kontrollia kullakin testilevyllä. Testi olisi toistettava PBS-kontrollin kanssa, jos FITC-kontrollissa havaitaan yksikin positiivinen solu. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt suspensiosta, jossa on 106 solua millilitraa kohden, Pseudomonas solanacearum -bakteerikannan rodun biovarin. Sisällytetään yksi levy kuhunkin testisarjaan. 2.1. Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä: i) Sakat, jossa on suhteellisen vähän tärkkelystä: Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen - lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuvassa 1 on esitetty. ii) Muut sakat: Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia, eli >NUM>1/>DEN>10,>NUM>1/>DEN>100 ja >NUM>1/>DEN>1 000 uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen - lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuvassa 2 on esitetty. 2.2. Annetaan pisaroiden kuivua. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko kuumentamalla, liekittämällä tai 95 % etanolilla. 2.3. IF-menettely i) Testilevyn valmistaminen 1 kohdan i alakohdan mukaisesti: Valmistetaan sarja kaksinkertaisia antiseerumin laimennoksia IF-puskuriin (liite 3): ¼ tiitteriä ( >NUM>T/>DEN>4), ½ tiitteriä (>NUM>T/>DEN>2), tiitteri (T) ja tiitteri kaksinkertaisena (2T). ii) Testilevyn valmistaminen 1 kohdan ii alakohdan mukaisesti: Valmistetaan työskentelylaimennos (WD) antiseerumista IF-puskuriin. Työskentelylaimennos on antiseerumin laimennos, jonka spesifisyys on optimaalinen, ja se on tavallisesti puolet tiitteristä. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 2.3.1. Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset antiseerumin laimennokse(i)lla. Pipetoidaan PBS:ää PBS- ja FITC-syvennyksiin. Syvennyksiin pipetoidun antiseerumin määrän on vastattava levitetyn uutteen määrää. 2.3.2. Inkuboidaan kannen alla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. 2.3.3. Ravistetaan antiseerumipisarat pois levyltä ja huuhdellaan levyt varovasti IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan Tween-IF-puskurissa ja sen jälkeen 5 minuutin ajan IF-puskurissa (liite 3). Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä. 2.3.4. Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset ja FITC-syvennys FITC-konjugaatin laimennoksella, jota on käytetty tiitterin määrittämiseen. Syvennyksiin pipetoidun konjugaatin määrän on vastattava pipetoidun antiseerumin määrää. 2.3.5. Inkuboidaan kannen alla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. 2.3.6. Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten edellä (2.3.3). Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä. 2.3.7. Pipetoidaan 5-10 µl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (liite 3) kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelevy. 2.4. IF-testin lukeminen Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljyimmersio-objektiivin 500-1 000-kertaisella suurennoksella. Tutkitaan syvennyksiä tarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukon kehää. Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti fluorisoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. Huom. Testi on uusittava, jos värjäytyminen ei ole täydellistä. Tutkitaan testilevyt. Tarkastellaan ensin fluoresoivien solujen puuttumista FITC-kontrollisyvennyksissä. Fluoresoivat solut FITC-kontrollissa osoittavat konjugaatin epäspesifistä sitoutumista, autofluorisaatiota tai kontaminaatiota. Huom. Toistetaan testi, jos tällaista ilmenee. Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen Pseudomonas solanacearum -bakteerille. Fluoresenssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassa antiseerumilaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on kirjavaa tai epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon, paitsi, jos tällaisia soluja on paljon. (Kts. IF-testin tulosten tulkinta). IF-testin tulosten tulkinta: i) Jos näytteestä ei löydy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, IF-testin tulos on negatiivinen. ii) Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, solujen keskimääräinen lukumäärä määritetään mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan solujen lukumäärä (N) uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (liite 4). IF-testin herkkyys on noin 10³ solua/ml uudelleen suspensoitua sakkaa: - jos näytteissä on N > 10³ solua millilitraa kohden, IF-testin tulos on positiivinen, - jos näytteissä on N > 10³ solua millilitraa kohden, IF-testin tulosta voidaan pitää positiivisena. iii) Jos näytteessä on paljon (< 105 solua millilitraa kohden) epätäydellisesti tai heikosti fluoresoivia soluja antiseerumin tiitterillä, näyte tulisi testata uudelleen: - joko toisella, biologisesti erilaisella testillä tai - toisella IF-testillä, jossa käytetään eri antiseerumia tai sakasta tehtyä kymmenkertaista laimennossarjaa. 3. ELISA-testi (Robinson-Smith et al., 1995) Käytetään Pseudomonas solanacearum -bakteerin, mieluiten rodun 3 biovaria 2, antiseerumia. Määritetään tiitteri suspensiosta, jossa on 106 solua millilitraa kohden, Pseudomonas solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta. NUNC Polysorb -mikrotiitterilevyjen käyttöä suositellaan. Testiin sisällytetään negatiivinen perunauutekontrolli ja fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen (PBS) kontrolli. Positiivisena kontrollina käytetään suspensiota, jossa on 106 solua millilitraa kohden, Pseudomonas solanacearum -bakteerikannan rodun biovaria. Testataan kuten näyte (näytteet), mutta pidetään selvästi erillään mikrotiitterilevyllä olevista näytteistä. 3.1. Pipetoidaan 100-200 µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneen putkeen. Kuumennetaan neljän minuutin ajan 100 °C:n lämpötilassa. Siirretään putki jäihin. 3.2. Lisätään yhtä suuri määrä väkevyydeltään kaksinkertaista karbonaattikiinnityspuskuria (liite 5). Sekoitetaan (Vortex). 3.3. Lisätään 100 µl kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotiitterilevyn syvennykseen. Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa tai yön yli 4 °C:n lämpötilassa. 3.4. Kaadetaan uutteet syvennyksistä. Pestään syvennykset kolmeen kertaan PBS-Tweenillä (liite 5) niin, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään viideksi minuutiksi. 3.5. Valmistetaan sopiva laimennos Pseudomonas solanacearum -bakteerin antiseerumista estopuskuriin (blocking buffer) (liite 5). Lisätään 100 µl antiseerumin laimennosta syvennyksiin. Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. 3.6. Kaadetaan antiseerumi syvennyksistä. Pestään syvennykset kuten edellä (3.4.). 3.7. Valmistetaan sopiva laimennos emäksistä fosfataasikonjugaattia estopuskuriin (blocking buffer). Lisätään 100 µl konjugaatin laimennosta syvennyksiin. Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. 3.8. Kaadetaan konjugaatti syvennyksistä. Pestään syvennykset kuten edellä (3.4. ja 3.6.). 3.9. Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos (liite 5). Lisätään 100 µl syvennyksiin. Inkuboidaan 30 minuutista yhteen tuntiin pimeässä laboratoriolämpötilassa. 3.10. Mitataan absorbanssi 409 nm:ssä. ELISA-testin tulkinta ELISA-testi on negatiivinen, jos näytteen optinen tiheys (O.D.) on < 2 × negatiivisen kontrollin optinen tiheys. ELISA-testi on positiivinen jos näytteen optinen tiheys (O.D.) on > 2 × negatiivisen kontrollin optinen tiheys. 4. PCR-testi (Seal et al., 1993) Huom. Kaikissa näytteen esikäsittelyvaiheissa ja muissa PCR:ään liittyvissä käsittelyissä on käytettävä suodattimella varustetun pipetin kärkiä. Valmistetaan suspensio, jossa on 106 solua millilitraa kohden, Pseudomonas solanacearum -bakteerikannan rodun 3 biovaria 2, positiiviseksi kontrolliksi. Testataan kuten näyte (näytteet). 4.1. Pipetoidaan 100 µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneen putkeen. Vaihtoehtoisesti siirretään 90 µl uudelleen suspendoitua sakkaa pieneen putkeen, jossa on 10 µl 0,5 M NaOH:ta. Sekoitetaan kääntelemällä putkea useita kertoja. 4.2. Kuumennetaan neljän minuutin ajan 100 °C:n lämpötilassa. Siirretään putki välittömästi jäihin. 4.3. Valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset, esim. >NUM>1/>DEN>10 ja >NUM>1/>DEN>100, steriiliin tislattuun tai ultrapuhtaaseen veteen (UPW). 4.4. Valmistetaan PCR-reaktioseos (liite 6) steriiliin putkeen lisäämällä seuraavat aineosat seuraavassa järjestyksessä: >TAULUKON PAIKKA> Lisäreaktioihin: Lasketaan kunkin aineosan määrä vaaditulle lukumäärälle reaktioita. Sekoitetaan aineosat ja siirretään 45 µl - 48 µl seosta steriileihin PCR-putkiin. Pidetään putket, joissa on PCR-reaktioseosta, jäissä. 25 µl:n reaktiotilavuuteen: Pienennetään aineosien määriä vastaavasti. 4.5. PCR:n monistaminen 4.5.1. Vapaaehtoista! Sentrifugoidaan (pulse centrifuge) putket keitetyn näytteen ja positiivisen kontrollin kanssa. Lisätään täsmennetyssä järjestyksessä 2-5 µl näytettä (näytteitä), vesikontrollia ja positiivista kontrollia putkiin, joissa on PCR-reaktioseosta. Asetetaan putket DNA-lämpösyklilaitteen (DNA thermal cycler) lämpöblokkiin. 4.5.2. Ajetaan seuraava ohjelma: 1 sykli: i) 2 minuuttia 96 °C:n lämpötilassa: templaatin (DNA-näytteen) denaturointi 50 sykliä: ii) 20 sekuntia 94 °C:n lämpötilassa: denaturointi iii) 20 sekuntia 68 °C:n lämpötilassa: alukkeiden (primers) pariutuminen iv) 30 sekuntia 72 °C:n lämpötilassa: kopioiden lisääminen 1 sykli: v) 10 minuuttia 72 °C:n lämpötilassa: lisääminen edelleen 1 sykli: vi) pidetään 4 °C:n lämpötilassa Huom. Nämä parametrit koskevat Perkin Elmer 9600:ta. Muut lämpösyklilaitteet voivat vaatia mineraaliöljykerroksen PCR-reaktioputkiin ja/tai vaiheiden ii), iii) ja iv) keston muuttamisen monistamisohjelmassa. 4.5.3. Poistetaan putket lämpösyklilaitteesta. Analysoidaan PCR-tuote. Jos tätä ei tehdä välittömästi, putket varastoidaan 4 °C:n lämpötilaan samana päivänä käytettäväksi tai -18 °C:n lämpötilaan pidemmäksi aikaa varastoitavaksi. 4.6. PCR-tuotteen määrittäminen PCR-fragmentit todetaan agaroosigeelielektroforeesilla ja etidiumbromidivärjäyksellä. 4.6.1. Valmistetaan tarkoituksenmukainen agaroosigeeli kuumentamalla varovasti kiehumapisteeseen agaroosia trisasetaattielektroforeesipuskurissa (TAE). 4.6.2. Jäähdytetään sulanut agaroosi 50-60 °C:seen, kaadetaan elektroforeesiyksikön muottiin ja lisätään kampa. Annetaan geelin jähmettyä. 4.6.3. Poistetaan kampa. Peitetään geeli TAE:lla niin, että se juuri ja juuri peittyy (2-3 mm) puskurilla. 4.6.4. Pipetoidaan 3 µl latauspuskuria (loading buffer) parafilmille. Lisätään 12 µl PCR-tuotetta joko näytteistä, positiivisesta kontrollista tai vesikontrollista ja sekoitetaan imemällä kevyesti pipetinkärjestä ennen täyttämistä. Annettuja määriä voidaan muuttaa agaroosigeelisyvennysten tilavuuden mukaan. 4.6.5. Täytetään geelisyvennykset varovasti. Laitetaan vertailuksi sopiva DNA-markkeri vähintään yhteen syvennykseen. 4.6.6. Kytketään virtalähde ja virta elektroforeesilaitteeseen. Ajetaan geeliä 5-8 V/cm kunnes seurantaindikaattorin rintama on 1 cm:n päässä geelin reunasta. 4.6.7. Kytketään virta pois virtalähteestä. Irrotetaan johdot elektroforeesiyksiköstä. Poistetaan geeli varovasti. Liotetaan sitä etidiumbromidiliuoksessa 30-45 minuutin ajan. Huom. Käytetään kertakäyttökäsineitä aina, kun käsitellään etidiumbromidia, joka on voimakas mutageeni! 4.6.8. Poistetaan väriä tislatussa vedessä 10-15 minuutin ajan. 4.6.9. Saatetaan moniste(tut)ttu DNA-fragmentti(it) näkyviin UV-läpivalaisulla. Pseudomonas solanacearum -bakteerin PCR-tuote OLI-1- ja Y-2-alukeyhdistelmällä tuotettuna on 288 bp:n pituinen. Tutkitaan DNA-markkeriin ja positiiviseen kontrolliin verrattuna. Huom. Vesikontrollin on oltava aina negatiivinen; jos se on positiivinen, testi toistetaan. 4.6.10. Valokuvataan geeli, jos tiedon tallentamista vaaditaan. 4.6.11. Varmistetaan monistetun fragmentin autenttisuus restriktioentsyymianalyysillä (REA). 4.7. Restriktioentsyymianalyysi (REA) 4.7.1. Siirretään 8,5 µl PCR-tuotetta (4.5.3.) uuteen pieneen putkeen. Lisätään 1 µl 10x entsyymipuskuria ja 0,5 µl rajoittavaa entsyymiä Avall. 4.7.2. Sekoitetaan imemällä kevyesti pipetinkärjellä. Jos pisaroita jää pullon seinämiin, sentrifugoidaan (pulse spin) mikrosentrifugilla. Inkuboidaan yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. 4.7.3. Määritetään pilkottu PCR-fragmentti agaroosigeelielektroforeesilla kuten edellä (4.6.). PCR-testin tulosten tulkinta PCR-testi on negatiivinen, jos tyypillistä 288 bp -fragmenttia ei todeta ja fragmentti todetaan Pseudomonas solanacearum -kannan positiivisesta kontrollista. PCR-testi on positiivinen, jos tyypillinen 288 bp -fragmentti todetaan ja monistetun fragmentin REA-määrityksestä saadaan sama tulos kuin Pseudomonas solanacearum -kannan positiivisen kontrollin määrityksestä. 5. Laimennussarja valikoivalle alustalle (Elphinstone et al., 1996) 5.1. Koe tehdään sopivalla laimennussarjatekniikalla, esim.: i) Valmistetaan vähintään kaksi kymmenkertaista laimennosta, >NUM>1/>DEN>10 ja >NUM>1/>DEN>100, uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (50-100 µl) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta muunnetulle valikoivalle SMSA-alustalle (liite 7) ja levitetään lasisauvalla koko alustan pinnalle. Tehdään myös, mikäli katsotaan tarpeelliseksi, viiden kohdan sivelyviljely 10-µl:n silmukallisella uudelleen suspendoitua sakkaa. Silmukka liekitetään sivelyjen välillä. ii) Siirretään mitattu vakiomäärä (50-100 µl) uudelleen suspendoitua sakkaa muunnetulle valikoivalle SMSA-alustalle ja levitetään lasisauvalla koko alustan pinnalle. Sivellään sauvaa liekittämättä sitä kahdella tai useammalla muunnetulla SMSA-levyllä. 5.2. Levitetään samalla laimennussarjatekniikalla Pseudomonas solanacearum -bakteerikannan rodun 3 biovaria 2 positiiviseksi kontrolliksi tehtyä suspensiota, jossa on 106 solua millilitraa kohden, sarjalle erillisiä muunnettuja SMSA-alustoja. 5.3. Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tulosten tulkitseminen aloitetaan kolme päivää myöhemmin. Jos tulos on negatiivinen, inkuboidaan edelleen kuuteen päivään asti. Pseudomonas solanacearum -bakteerin elinvoimaiset isolaatit kehittävät maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisen muotoisia ja juoksevia pesäkkeitä, joiden keskustat ovat selvästi väriltään punaisesta purppuraan ja sisältä juovikkaita tai kierteisiä kuten kuvassa 1 osoitetaan. 5.4. Puhdistetaan pesäkkeet, joiden morfologia on tyypillinen, jatkoviljelyllä tavallisella ravintoalustalla (liite 1). 5.5. Tunnistetaan puhtaat viljelmät (II jakson 4.1. kohta) ja varmistetaan positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3. kohta). Laimennussarjatestin tulosten tulkinta Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole eristetty kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään Pseudomonas solanacearum -bakteerille tyypillistä pesäkettä ei ole eristetty edellyttäen, että ei epäillä muiden bakteerien pesäkkeiden estävää vaikutusta ja että Pseudomonas solanacearum -bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista. Laimennussarjatesti on positiivinen, jos Pseudomonas solanacearum -bakteerille tyypillisiä pesäkkeitä eristetään. 6. Biotesti (Janse, 1988) 6.1. Käytetään 10 todellisella kolmilehtiasteella olevaa testikasvia kutakin näytettä kohden. Testikasveja ei kastella 24 tuntiin ennen inokulointia. 6.2. Jaetaan 100 µl uudelleen suspendoitua sakkaa testikasvien kesken. Inokuloidaan varteen sirkkalehtien väliin ja yhteen tai useampaan muuhun paikkaan. 6.3. Inokuloidaan samalla tekniikalla 10 siementainta suspensiolla, jossa on 106 solua/m virulenttia Pseudomonas solanacearumin biovar 2/rotu 3 -kantaa (positiivinen kontrolli) ja sakkapuskuri (negatiivinen kontrolli). Kasvit, joita käytetään positiivisena kontrollina, pidetään erillään muista kasveista ristikontaminaation estämiseksi. 6.4. Kasvatetaan testitaimia edelleen neljä viikkoa 22 °C - 28 °C:ssa korkeassa suhteellisessa kosteudessa kastellen päivittäin. Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua. 6.5. Eristetään tartunnan saaneista kasveista (II jakso). Tunnistetaan puhtaat viljelmät, joiden morfologia on tyypillinen (II jakson 4.1. kohta) ja varmistetaan positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3. kohta). 6.6. Tutkitaan tartunnan puuttumista niissä testikasveissa, jotka eivät osoita minkäänlaisia tartunnan merkkejä. Poistetaan kustakin testikasvista 1 cm:n pala vartta 2 cm inokulointikohdan yläpuolelta. Homogenoidaan solukot maseraatiopuskurissa. Tehdään laimennussarja valikoivalle alustalle (III jakson 5. kohta). Jos tulos on positiivinen, tunnistetaan puhtaat viljelmät, joiden morfologia on tyypillinen (II jakson 4.1. kohta) ja varmistetaan positiiviset viljelmät patogeenisyystestillä (II jakson 4.3. kohta). Biotestin tulosten tulkinta Biotesti on negatiivinen, jos testikasveissa ei ole Pseudomonas solanacearum -bakteerin aiheuttamaa tartuntaa ja että Pseudomonas solanacearum -bakteeri todetaan positiivisesta kontrollista. Biotesti on positiivinen, jos testikasveissa on Pseudomonas solanacearum -bakteerin aiheuttama tartunta. 7. Rikastustesti (Elphinstone et al., 1996) 7.1. Siirretään 100 µl uudelleen suspendoitua sakkaa 3 ml:aan muunnettua SMSA-liuosta (liite 7). 7.2. Inkuboidaan 48 tunnin ajan, ei missään tapauksessa yli 72:ta tuntia, 28 °C:n lämpötilassa siten, että putken korkki on löysästi kiinni ilmanvaihdon turvaamiseksi. 7.3. Kiinnitetään korkki tiiviisti ja sekoitetaan Vortexilla. Jaetaan määräosiin IF-testiä (tämän jakson 2. kohta), ELISA-testiä (tämän jakson 3. kohta) ja/tai PCR-testiä (tämän jakson 4. kohta) varten. 8. Patogeenisyystesti II jakson 4.3. kohta. Liite 1 Ravintoalusta Pseudomonas solanacearum -kasvintuhoojan viljelyä varten Ravinneagar (NA) >TAULUKON PAIKKA> Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin. Liuotetaan ainesosat. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille. Hiiva-peptoni-glukoosiagar (YPGA) >TAULUKON PAIKKA> Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin. Liuotetaan ainesosat. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille. Sakkaroosipeptoniagar (SPA) >TAULUKON PAIKKA> Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin. Liuotetaan ainesosat. Säädetään tarvittaessa pH:ksi 7,2-7,4. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään 50 °C:seen. Kaadetaan maljoille. Kelmanin tetrasolium-malusta >TAULUKON PAIKKA> Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin. Liuotetaan ainesosat. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään 50 °C:seen. Lisätään suodatinsteriloitua trifenyylitetratsoliumkloridin (Sigma) vesiliuosta, jotta loppupitoisuudeksi saadaan 50 mg/l. Kaadetaan maljoille. Liite 2 Aineistot näytteen käsittelyä varten Maserointipuskuri: 50 mM fosfaattipuskuri, pH 7,0 Tätä puskuria käytetään solukon pehmentämiseen. >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Suositellaan lisättäväksi 5 % polyvinylpyrolidine-40 000 MWT (PVP-40):tä suoraa PCR-testiä suoritettaessa, jotta uutteessa olevien aromaattisen molekyylien monistumista estävä vaikutus vähenisi. Homogenoitaessa pehmitettäviä perunasolukoita Waring Blenderissä tai Ultra Thurraxissa suositellaan lisättäväksi dispergointiainetta, vaahdonestoainetta tai antioksidanttia. >TAULUKON PAIKKA> Autoklavoidaan erillään. Säädetään haluttuun väkevyyteen. Sakkapuskuri: 10 mM fosfaattipuskuri, pH 7,2 Tätä puskuria käytetään perunan tyvistä saadun uutteen uudelleen suspendointiin ja laimentamiseen. >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Liite 3 Aineistot IF-testiä varten IF-puskuri: 10 mM fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2 Tätä puskuria käytetään antiseerumin laimentamiseen. >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Otetaan soveltuvaksi katsottu määräosa. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. IF-puskuri-Tween Tätä puskuria käytetään levyjen pesuun. Lisätään 0,1 % Tween 20:tä IF-puskuriin. 0,1 M fosfaattipuskuroitu glyseroli, pH 7,6 Tätä puskuria käytetään petausliuoksena IF-levyillä fluoresenssin tehostamiseksi. >TAULUKON PAIKKA> Liite 4 Kontaminaatioasteen määritys IF-testillä Moniaukkoisen levyn yhden aukon pinta-ala (S): = >NUM>ð D²>DEN>4 >TAULUKON PAIKKA> (1) Näkökentän pinta-ala (s): = >NUM>ð d²>DEN>4 >TAULUKON PAIKKA> (2) Lasketaan kentän halkaisija (d) suoraan mittaamalla tai soveltaen seuraavia kaavoja: s = >NUM>ð i² >DEN>G² K² × 4 (3) >TAULUKON PAIKKA> (2):sta saadaan: d = √>NUM>4 s>DEN>ð (4) (3):sta saadaan: d = √>NUM>4 × >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 >DEN>ð = >NUM>i>DEN>GK Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kenttää kohden (c). Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä aukkoa kohden (C). C = c >NUM>S>DEN>s Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä konsentroidun uutteen millilitraa kohti (N): N = C × >NUM>1 000 >DEN>y× F >TAULUKON PAIKKA> Liite 5 Aineistot ELISA-testiä varten Väkevyydeltään kaksinkertainen karbonaattikiinnityspuskuri, pH 9,6 >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Natriumsulfiittia voidaan lisätä antioksidanttina siten, että sen lopulliseksi pitoisuudeksi tulee 0,2 %, jos uute sisältää paljon aromaattisia molekyylejä. 10 × fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,4 >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Jaetaan sopivaksi katsottaviin osiin. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Fosfaattipuskuroitu suolaliuos - Tween (PBS-T) >TAULUKON PAIKKA> Estopuskuri (valmistettava juuri ennen käyttöä) >TAULUKON PAIKKA> Emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, pH 9,8 >TAULUKON PAIKKA> Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi 9,8 väkevällä HCI:llä. Täytetään 1 l:ksi tislatulla vedellä. Lisätään 0,2 g MgCl2:ta. Liuotetaan 2 × 5 mg fosfataasisubstraattitablettia (Sigma) 15 ml liuosta kohden. Liite 6 Aineistot PCR-testiä varten Oligonukleotidialukejakso >TAULUKON PAIKKA> Aineistoa varten: katso Seal ym. (1993). Liite 7 Aineistot valikoivaa laimennussarjaa varten ja rikastustesti (testejä) Valikoiva SMSA-alusta (Engelbrecht 1994, sellaisena kuin se on Elphinstonen ym. muuttamana 1996) Kasvualusta >TAULUKON PAIKKA> Valmistetaan puolen litran tilavuus alustaa yhden litran pulloihin. Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH. Säädetään, tarvittaessa, pH:ksi 6,5 ennen autoklavoimista. Pseudomonas solanacearum kasvaa heikosti, jos alustan pH on yli 7,0. Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään 50 °C:seen. Lisätään seuraavat ainesosat (kaikki Sigmalta), jotta saadaan määrätyt lopulliset pitoisuudet: >TAULUKON PAIKKA> Liuotetaan ainesosat 70-prosenttiseen etanoliin, jotta valmistetun alustan määrätilavuudelle saadaan annetut pitoisuudet. Jotkut ainesosat, erityisesti polymiksiini-B ja kloramfenikoli, vaativat hieman lämmitystä ja ravistelua. SMSA-ravintoliuos (Elphinstone ym., 1996) Valmistetaan samalla tavoin kuin valikoiva SMSA-alusta, mutta ilman agaria. Jaetaan 3 ml:n määräosiin 30 ml:n vetoisiin kertakäyttöisiin Universal-putkiin. Viitteet Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121. Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142. Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277. Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135. Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351. Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345. Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 693-695. Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 ss. Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536. Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838. Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034. Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. pickettii and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594. Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268. Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111. Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295. Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269.