FI Euroopan unionin virallinen lehti L 220/1

KOMISSION ASETUS (EY) N:o 761/2009,

annettu 23 päivänä heinäkuuta 2009,

testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (1) ja erityisesti sen 13 artiklan 3 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1) Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään aineiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle.

(2) On tarpeen muuttaa asetusta (EY) N:o 440/2008 tiettyjen testimenetelmien muuttamiseksi ja useiden OECD:n hyväksymien uusien testimenetelmien sisällyttämiseksi siihen. Sidosryhmiä on kuultu asiasta. Muutoksilla mukautetaan kyseessä olevia menetelmiä tieteen ja tekniikan kehitykseen.

(3) Höyrynpainetta koskevia säännöksiä olisi muutettava uuden effuusiomenetelmän sisällyttämiseksi.

(4) On tarpeen sisällyttää asetukseen uusi kuitujen halkaisijan pituuspainotetun geometrisen keskiarvon laskentamenetelmä.

(5) Asetusta (EY) N:o 440/2008 on syytä muuttaa ihoärsytystä koskevan uuden in vitro -menetelmän sisällyttämiseksi ensisijaisena vaihtoehtona, jotta koetarkoituksiin käytettävien eläinten määrää voitaisiin vähentää kokeisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelua koskevien jäsenvaltioiden lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 24 päivänä marraskuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/609/ETY (3) mukaisesti. OECD:ssä keskustellaan luonnoksesta ihoärsytystä koskevaksi in vitro -menetelmäksi, mutta tässä poikkeustapauksessa on asianmukaista sisällyttää menetelmä B 46 tähän asetukseen. Menetelmä B 46 olisi ajantasaistettava heti kun se on mahdollista OECD:n päästyä asiassa ratkaisuun tai kun uudelleentarkastelun oikeuttavia lisätietoja on saatavilla.

(6) Levän inhibitiokokeita koskevia säännöksiä on muutettava uusien lajien sisällyttämiseksi sekä kemikaalien vaarallisuuden arviointia ja luokitusta koskevien vaatimusten täyttämiseksi.

(7) On tarpeen lisätä pintavedessä tapahtuvan aerobisen mineralisaation mittaamista koskeva uusi menetelmä eli biohajoavuuden simulointitesti sekä Lemna-sukuun kuuluvien lajien myrkyllisyyden arvioimista koskeva uusi menetelmä eli kasvunestymistesti.

(8) Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava.

(9) Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

1) Muutetaan A kohta seuraavasti: a) korvataan luku A.4 tämän asetuksen liitteessä I olevalla luvulla A.4; b) lisätään tämän asetuksen liitteessä II oleva luku A.22.

2) Muutetaan B kohta seuraavasti: Lisätään tämän asetuksen liitteessä III oleva luku B.46.

3) Muutetaan C osa seuraavasti: a) korvataan luku C.3 tämän asetuksen liitteessä IV olevalla luvulla C.3; b) lisätään tämän asetuksen liitteessä V ja VI olevat luvut C.25 ja C.26.

2 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 23 päivänä heinäkuuta 2009. Komission puolesta Stavros DIMAS Komission jäsen

(1) EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2) EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1.

(3) EYVL L 358, 18.12.1986, s. 1.

LIITE I A.4. HÖYRYNPAINE 1. MENETELMÄ Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 104 (2004). 1.1 JOHDANTO Tämä testimenetelmän A.4 (1) tarkistettu versio sisältää yhden uuden menetelmän. Kyseessä on effuusiomenetelmä: isoterminen termogravimetria, joka on kehitetty sellaisia aineita varten, joiden höyrynpaine on hyvin alhainen (arvoon 10–10 saakka). Koska uusia menetelmiä tarvitaan erityisesti sellaisten aineiden höyrynpaineen määrittämiseksi, joiden höyrynpaine on alhainen, muita tähän testimenetelmän kuuluvia menetelmiä arvioidaan uudelleen sen perusteella, voidaanko niitä käyttää muillakin määritysalueilla. Termodynaamisen tasapainon vallitessa puhtaan aineen höyrynpaine vaihtelee ainoastaan lämpötilan funktiona. Perusperiaatteita käsitellään kirjallisuuslähteissä (2)(3). Mitään yksittäistä mittausmenetelmää ei voida käyttää koko höyrynpainealueella arvoa 10–10 pienemmistä arvoista arvoon 105 Pa. Tähän testimenetelmään kuuluu kahdeksan höyrynpaineen mittausmenetelmää, joita voidaan käyttää eri höyrynpainealueilla. Eri menetelmiä verrataan niiden soveltuvuuden ja mittausalueen suhteen taulukossa 1. Menetelmiä voidaan käyttää ainoastaan sellaisten yhdisteiden tutkimiseen, jotka eivät hajoa testiolosuhteissa. Jos kokeellisia menetelmiä ei voida käyttää teknisistä syistä, höyrynpaine voidaan myös arvioida. Sopivaa arviointimenetelmää kuvataan tämän testimenetelmän lisäyksessä. 1.2 MÄÄRITELMÄT JA YKSIKÖT Määritelmän mukaan aineen höyrynpaine on kiinteään tai nestemäiseen aineeseen ylhäältä kohdistuva kyllästyspaine. Paineen SI-yksikkö on pascal (Pa), jota tulee käyttää tässä yhteydessä. Aiemmin käytetyt yksiköt ja niiden muuntokertoimet ovat seuraavat: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 ilmakehä = 1,013 × 105 Pa 1 baari (bar) = 105 Pa Lämpötilan SI-yksikkö on kelvin (K). Celsius-asteet muunnetaan kelvineiksi seuraavan kaavan avulla: T = t + 273,15 jossa T on kelvineinä ilmaistu termodynaaminen lämpötila ja t on lämpötila Celsius-asteina. Taulukko 1 Mittausmenetelmä Aineet Arvioitu toistettavuus Arvioitu uusittavuus Suositeltu alue Kiinteät Nestemäiset Dynaaminen menetelmä Alhainen sulamispiste Kyllä Enintään 25 % 1–5 % Enintään 25 % 1–5 % 103 Pa – 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa – 105 Pa Staattinen menetelmä Kyllä Kyllä 5–10 % 5–10 % 10 Pa – 105 Pa 10–2 Pa – 105 Pa (1) Isoteniskooppimenetelmä Kyllä Kyllä 5–10 % 5–10 % 102 Pa – 105 Pa Effuusiomenetelmä: höyrynpainevaaka Kyllä Kyllä 5–20 % Enintään 50 % 10–3 – 1 Pa Effuusiomenetelmä: Knudsen-kenno Kyllä Kyllä 10–30 % — 10–10 – 1 P Effuusiomenetelmä: isoterminen termogravimetria Kyllä Kyllä 5–30 % Enintään 50 % 10–10 – 1 Pa Kaasunkyllästysmenetelmä Kyllä Kyllä 10–30 % Enintään 50 % 10–10 – 103 Pa Pyörivä roottori -menetelmä Kyllä Kyllä 10–20 % — 10–4 –0,5 Pa 1.3 TESTIN PERIAATE Höyrynpaine määritetään yleensä eri lämpötiloissa. Rajoitetulla lämpötila-alueella puhtaan aineen höyrynpaineen logaritmi on Clausiuksen ja Clapeyronin yksinkertaistetun yhtälön mukaan suoraan verrannollinen lämpötilan käänteisarvoon: jossa p = höyrynpaine (Pa) ΔHv = höyrystymislämpö (J mol–1) R = yleinen kaasuvakio (8,314 J mol–1 K–1) T = lämpötila (K). 1.4 VERTAILUAINEET Vertailuaineita ei tarvitse käyttää. Niitä käytetään lähinnä silloin, kun menetelmän toimivuutta tarkistetaan ajoittain tai kun eri menetelmillä saatuja tuloksia verrataan toisiinsa. 1.5 MENETELMIEN KUVAUS 1.5.1 Dynaaminen menetelmä (Cottrellin menetelmä) 1.5.1.1 Periaate Höyrynpaine määritetään mittaamalla aineen kiehumispiste useissa ennalta määrätyissä paineissa suunnilleen alueella 103–105 Pa. Menetelmää suositellaan myös kiehumispisteen määritykseen, jossa sitä voidaan käyttää lämpötilaan 600 K saakka. Nesteiden kiehumispisteet ovat noin 0,1 °C suurempia 3–4 cm:n syvyydellä kuin pinnassa, mikä johtuu nestepatsaan hydrostaattisesta paineesta. Cottrellin menetelmässä (4) lämpömittari viedään nestepinnan yläpuolella olevaan höyryyn ja kiehuvaa nestettä pumpataan jatkuvasti lämpömittarin nupin yli. Nuppia peittää ohut nestekerros, joka on tasapainossa höyryn kanssa ilmakehän paineessa. Lämpömittari osoittaa siis todellisen kiehumispisteen ilman ylikuumennuksesta tai hydrostaattisesta paineesta johtuvia virheitä. Kuva 1 esittää Cottrellin alun perin käyttämää pumppua. Kiehuva neste on putkessa A. Putken pohjaan kiinnitetty platinalanka B tasoittaa kiehumista. Sivuputki C johtaa lauhduttimeen, ja vaippa D estää kylmää lauhdetta pääsemästä lämpömittarille E. Kun putkessa A oleva neste kiehuu, suppiloon jääneet kuplat ja neste huuhtovat pumpun F molempien haarojen kautta lämpömittarin nuppia. Kuva 1 Kuva 2 Cottrellin pumppu (4) A: Termopari B: Tyhjiön puskuritilavuus C: Painemittari D: Tyhjiö E: Mittauspiste F: Lämmitysvastus, noin 150 W 1.5.1.2 Laite Kuva 2 esittää hyvin tarkkaa, Cottrellin periaatteen mukaista laitetta. Laitteessa on putki, jonka alaosassa on kiehuntaosa, keskiosassa jäähdytin ja yläosassa ulostulo ja laippa. Cottrellin pumppu sijoitetaan kiehuntaosaan, jota kuumennetaan sähköpatruunalla. Lämpötila mitataan vaipallisella termoparilla tai vastuslämpömittarilla, joka viedään laitteen yläosassa olevan laipan kautta sisään. Ulostulo kytketään paineensäätöjärjestelmään, jossa on tyhjiöpumppu, puskuritilavuus, paineensäädin paineensäätöön tarvittavan typen johtamiseksi laitteeseen ja manometri. 1.5.1.3 Menettely Näyte pannaan putken kiehuntaosaan. Jos näyte ei ole jauheena, mahdolliset ongelmat voidaan yrittää ratkaista kuumentamalla jäähdytysvaippaa. Laite suljetaan laipan kohdalta, ja näytteelle tehdään kaasunpoisto. Menetelmä ei sovellu vaahtoavien aineiden mittaukseen. Tämän jälkeen asetetaan alin haluttu paine ja aloitetaan kuumennus. Lämpöanturi kytketään samalla rekisteröintilaitteeseen. Järjestelmässä vallitsee tasapaino, kun vakiopaineessa mitattu kiehumislämpötila pysyy vakiona. Kiehumisen aikana on erityisesti vältettävä näytteen ”poukkoilua”. Lisäksi jäähdyttimellä on tapahduttava täydellinen tiivistyminen. Jos höyrynpaineen määritys tehdään kiinteälle aineelle, jonka sulamispiste on alhainen, on varottava lauhduttimen tukkeutumista. Tasapainopisteen kirjaamisen jälkeen asetetaan uusi, suurempi paine. Mittauksia jatketaan 105 Pa:n paineeseen asti (yhteensä 5–10 mittausta). Tulokset tarkistetaan toistamalla mittaukset laskevassa painejärjestyksessä. 1.5.2 Staattinen menetelmä 1.5.2.1 Periaate Staattisessa menetelmässä (5) mitataan tiettyä lämpötilaa vastaava höyrynpaine termodynaamisen tasapainon vallitessa. Menetelmä soveltuu kiinteiden ja nestemäisten yksi- tai monikomponenttiaineiden tutkimiseen alueella 10–105 Pa ja huolellisuutta noudattaen myös alueella 1–10 Pa. 1.5.2.2 Laite Laitteessa on vakiolämpöinen haude (tarkkuus ±0,2 K), näyteastia, joka on liitetty tyhjiölinjaan, sekä manometri ja paineensäätöjärjestelmä. Näytekammio (kuva 3 a) on liitetty venttiilin välityksellä tyhjiölinjaan ja differentiaalimanometriin (sopivaa painemittarinestettä sisältävään U-putkeen), joka toimii nollaosoittimena. Differentiaalimanometrissa voidaan painealueen ja näytteen kemiallisen käyttäytymisen perusteella käyttää elohopeaa, silikoneja tai ftalaatteja. Elohopean käyttöä on kuitenkin vältettävä ympäristösyistä, jos se on mahdollista. Näyte ei saa mainittavassa määrin liueta U-putken nesteeseen tai reagoida sen kanssa. U-putken sijasta voidaan käyttää painemittaria (kuva 3 b). Manometrissa voidaan käyttää elohopeaa normaalista ilmanpaineesta 102 Pa:iin asti sekä silikoninesteitä ja ftalaatteja painealueella 10–102 Pa. Käytössä on myös muuntyyppisiä painemittareita alle 102 Pa:n mittauksia varten, ja kuumakalvomanometreja voidaan käyttää jopa alle 10–1 Pa:n paineessa. Lämpötila mitataan näyteastian ulkopuolelta tai astian sisältä. 1.5.2.3 Menettely Kuvan 3 a laitetta käytettäessä U-putki täytetään valitulla nesteellä, jolle on tehtävä kaasunpoisto korkeassa lämpötilassa ennen mittauksia. Näytettä pannaan laitteeseen ja sille tehdään kaasunpoisto alennetussa lämpötilassa. Jos näyte on monikomponenttinen, lämpötilan on oltava niin alhainen, ettei aineen koostumus muutu. Tasapaino voidaan saavuttaa nopeammin sekoittamalla näytettä. Näyte voidaan jäähdyttää nestemäisellä typellä tai hiilihappojäällä, mutta silloin on varottava ilmankosteuden tai pumppunesteen lauhtumista. Näyteastian venttiili avataan ja ilma poistetaan ylläpitämällä imua usean minuutin ajan. Ilmanpoisto toistetaan tarvittaessa useita kertoja. Kuva 3 a Kuva 3 b Kun näytettä kuumennetaan venttiilin ollessa suljettu, höyrynpaine kasvaa, mikä vaikuttaa U-putken nestepatsaan tasapainoon. Tämä kompensoidaan päästämällä typpeä tai ilmaa laitteeseen, kunnes paine-eron osoitin palaa nollaan. Tähän vaadittava paine voidaan lukea manometrista tai tarkemmasta mittauslaitteesta. Paine vastaa näytteen höyrynpainetta kyseisessä mittauslämpötilassa. Käytettäessä kuvan 3 b laitetta höyrynpaineen lukema saadaan suoraan. Höyrynpaine määritetään sopivin lämpötilavälein (yhteensä 5–10 mittausta) haluttuun maksimilämpötilaan asti. Alhaisen lämpötilan mittaukset on toistettava tarkistuksen vuoksi. Jos toistomittauksista saadut tulokset eivät ole yhteneviä lämpötilan noston aikana saatujen tulosten kanssa, syy voi olla jokin seuraavista: i) Näyte sisältää vielä ilmaa (esimerkiksi aineet, joiden viskositeetti on suuri) tai alhaisessa lämpötilassa kiehuvaa ainetta, joka vapautuu kuumentamisen aikana. ii) Näytteessä tapahtuu kemiallinen reaktio (esimerkiksi hajoaminen tai polymerisoituminen) mitattavalla lämpötila-alueella. 1.5.3 Isoteniskooppimenetelmä 1.5.3.1 Periaate Isoteniskooppimenetelmä (6) rakentuu staattisen menetelmän periaatteelle. Menetelmässä näyte pannaan isoteniskoopin laajennukseen, jota pidetään vakiolämpötilassa. Laajennus on liitetty manometriin ja tyhjiöpumppuun. Epäpuhtaudet, jotka ovat haihtuvampia kuin näyte, poistetaan tekemällä kaasunpoisto alennetussa paineessa. Näytteen höyrynpaine valituissa lämpötiloissa saatetaan tasapainoon inertin kaasun tunnetun paineen kanssa. Isoteniskooppi kehitettiin mittaamaan tiettyjen nestemäisten hiilivetyjen höyrynpainetta, mutta se soveltuu myös kiinteiden aineiden tutkimiseen. Menetelmä ei yleensä sovellu monikomponenttijärjestelmien tutkimiseen. Haihtumattomia epäpuhtauksia sisältävistä näytteistä saaduissa tuloksissa on vain pieniä virheitä. Suositeltava mittausalue on 102–105 Pa. 1.5.3.2 Laite Kuvassa 4 on esimerkki mittauslaitteesta. Täydellinen kuvaus esitetään testimenetelmässä ASTM D 2879-86 (6). 1.5.3.3 Menettely Nestemäiset näytteet toimivat samalla differentiaalimanometrin nesteenä. Isoteniskooppiin lisätään nestettä niin paljon, että sen laajennus ja manometrin lyhyempi jalka täyttyvät. Isoteniskooppi liitetään tyhjiöjärjestelmään ja siitä poistetaan ilma, minkä jälkeen se täytetään typellä. Tämä toistetaan kaksi kertaa hapenjäännösten poistamiseksi. Täytetty isoteniskooppi asetetaan vaaka-asentoon siten, että näyte leviää ohueksi kerrokseksi laajennuksessa ja manometrissa. Järjestelmän paine lasketaan arvoon 133 Pa ja näytettä kuumennetaan varovasti, kunnes se alkaa kiehua (näytteeseen liuenneiden kaasujen poisto). Isoteniskoopin asentoa muutetaan niin, että näyte palaa laajennukseen ja täyttää manometrin lyhyemmän jalan. Paine pidetään 133 Pa:ssa. Laajennuksen nokkaa kuumennetaan pienen liekin avulla, kunnes näytteestä vapautuu niin paljon höyryä, että näytettä työntyy laajennuksen yläosasta ja manometrin varresta isoteniskoopin manometriosaan, jolloin muodostuu höyrytäytteinen tila, jossa ei ole typpeä. Tämän jälkeen isoteniskooppi asetetaan hauteeseen, jonka lämpötila on vakio, ja typen painetta säädetään, kunnes se on sama kuin näytteen paine. Tässä tilanteessa typen ja näytteen höyrynpaine on sama. Kuva 4 Kiinteiden aineiden tutkimiseen käytetään silikoninesteiden tai ftalaattien kaltaisia manometrinesteitä. Manometrinesteen valinta riippuu kulloisestakin paine- ja lämpötila-alueesta. Manometrineste, jolle on tehty kaasunpoisto, lisätään isoteniskoopin pidemmän varren pullistumaan. Näyte pannaan laajennukseen, ja sille tehdään kaasunpoisto korkeassa lämpötilassa, minkä jälkeen isoteniskooppia kallistetaan, kunnes manometrineste virtaa U-putkeen. 1.5.4 Effuusiomenetelmä: höyrynpainevaaka (7) 1.5.4.1 Periaate Tutkittavasta aineesta otetaan näyte, jota kuumennetaan pienessä uunissa kelloastiassa, josta on poistettu ilma. Uuni on peitetty kannella, jossa on pieniä aukkoja, joiden halkaisijat tunnetaan. Höyry, joka vapautuu näytteestä yhden tällaisen aukon kautta, johdetaan samassa kelloastiassa olevan erittäin herkän vaa’an vaakakuppiin. Joissakin koejärjestelyissä vaakakupin ympärillä on jäähdytyslaatikko, joka johtaa lämmön ulkopuolelle. Vaakakuppi jäähdytetään säteilyn avulla, jotta vapautuva höyry tiivistyisi kupin pinnalle. Höyryvirran momentti toimii vaakaan kohdistuvana voimana. Höyrynpaine voidaan määrittää kahdella tavalla: suoraan vaakakuppiin kohdistuvasta voimasta tai haihtumisnopeudesta Hertzin ja Knudsenin yhtälön (2) avulla: jossa: G = haihtumisnopeus (kg s–1 m–2) M = moolimassa (g mol–1) T = lämpötila (K) R = yleinen kaasuvakio (J mol–1 K–1) p = höyrynpaine (Pa) Suositeltava mittausalue on 10–3–1 Pa. 1.5.4.2 Laite Kuva 5 havainnollistaa laitteen yleistä periaatetta. Kuva 5 A: Aluslevy F: Jäähdytyslaatikko ja kylmätanko B: Kiertokäämimittari G: Haihdutusuuni C: Kelloastia H: Dewar-astia, jossa on nestemäistä typpeä D: Vaaka ja vaakakuppi I: Näytteen lämpötilan mittaus E: Tyhjiömittari J: Näyte 1.5.5 Effuusiomenetelmä: Knudsen-kenno 1.5.5.1 Periaate Menetelmä perustuu Knudsen-kennosta (8) aikayksikköä kohti virtaavan, höyrymäisen näytteen massan mittaamiseen. Virtaus tapahtuu mikroaukon läpi ultratyhjiössä. Ulos virtaavan höyryn massa saadaan joko määrittämällä kennon painohäviö tai tiivistämällä höyry alhaisessa lämpötilassa, minkä jälkeen höyrystyneen aineen määrä voidaan määrittää kromatografian avulla. Höyrynpaine lasketaan Hertzin ja Knudsenin yhtälön avulla (ks. kohta 1.5.4.1) käyttämällä korjauskertoimia, jotka riippuvat laitteen parametreista (9). Suositeltava mittausalue on 10–10–1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2 Laite Kuva 6 havainnollistaa laitteen yleistä periaatetta. Kuva 6 1: Tyhjiöliitäntä 7: Kierrekansi 2: Suojatasku platinavastuslämpömittaria tai lämpötilan mittausta ja säätöä varten 8: Siipimutterit 3: Tyhjiösäiliön kansi 9: Pultit 4: O-rengas 10: Effuusiokennot (ruostumatonta terästä) 5: Tyhjiösäiliö (alumiinia) 11: Lämpöpatruuna 6: Effuusiokennojen asetus- ja poistolaite 1.5.6 Effuusiomenetelmä: isoterminen termogravimetria 1.5.6.1 Periaate Menetelmässä määritetään näytteen kiihdytetyt haihtumisnopeudet korkeissa lämpötiloissa ja ympäröivässä paineessa termogravimetrian avulla (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Haihtumisnopeudet vT saadaan käsittelemällä valittua ainetta hitaasti virtaavalla inertillä kaasulla ja rekisteröimällä painohäviö tietyissä isotermisissä lämpötiloissa T (kelvineinä) tiettyjen ajanjaksojen kuluessa. Höyrynpaineet pT lasketaan vT-arvoista höyrynpaineen logaritmin ja haihtumisnopeuden logaritmin lineaarisen suhteen perusteella. Tarvittaessa voidaan tehdä ekstrapolointi lämpötiloihin 20 ja 25 °C tekemällä regressioanalyysi logaritmista pT lämpötilan käänteisarvon 1/T suhteen. Menetelmällä voidaan tutkia aineita, joiden höyrynpaine voi olla niinkin alhainen kuin 10–10 Pa (10–12 mbar). Tutkittavien aineiden puhtauden on oltava niin lähellä 100:aa prosenttia kuin mahdollista, jotta mitattuja painohäviöitä ei tulkittaisi väärin. 1.5.6.2 Laite Kuva 7 havainnollistaa koejärjestelyn yleistä periaatetta. Kuva 7 Lämpötilaohjatussa kammiossa olevaan mikrovaakaan ripustetun näytelevyn yli virtaa kuiva typpikaasu, joka kantaa näytteen höyrystyneet molekyylit mukanaan. Tultuaan ulos kammiosta kaasuvirta puhdistuu sorptioyksikössä. 1.5.6.3 Menettely Näyte levitetään karhennetun lasilevyn pintaan tasaiseksi kerrokseksi. Jos näyte on kiinteä, se liuotetaan sopivalla liuottimella ja liuosta levitetään tasaisesti näytelevylle, joka kuivataan inertissä ympäristössä. Näin käsitelty levy ripustetaan mittausta varten termogravimetriseen analysaattoriin, ja sen painohäviötä mitataan jatkuvasti ajan funktiona. Haihtumisnopeus vT tietyssä lämpötilassa lasketaan näytelevyn painohäviöstä Δm seuraavalla kaavalla: jossa F on levitetyn näytteen pinta-ala (yleensä näytelevyn pinta-ala) ja t on painohäviön Δm vaatima aika. Höyrynpaine pT lasketaan haihtumisnopeuden vT funktiona seuraavan kaavan mukaan: Log pT = C + D log vT jossa C ja D ovat koejärjestelykohtaisia vakioita, jotka riippuvat mittauskammion halkaisijasta ja kaasun virtausnopeudesta. Vakiot on määritettävä kerran mittaamalla sarja yhdisteitä, joiden höyrynpaineet tiedetään, ja tekemällä regressio, jossa log vT riippuu log pT:stä (11)(21)(22). Höyrynpaineen pT ja kelvineinä ilmaistun lämpötilan T välinen suhde on seuraava: Log pT = A + B 1/T jossa A ja B ovat vakioita, jotka on saatu muuttujien log pT ja 1/T välisestä regressiosta. Yhtälön avulla voidaan laskea mitä tahansa lämpötilaa vastaava höyrynpaine käyttämällä ekstrapolointia. 1.5.7 Kaasunkyllästysmenetelmä (23) 1.5.7.1 Periaate Inerttiä kaasua johdetaan huoneenlämpötilassa tietyllä virtausnopeudella näytteen läpi tai yli siten, että näytteen höyry ehtii kyllästää kaasun. Kaasufaasin kyllästyminen on ratkaisevan tärkeää. Kaasun kuljettama aine kerätään talteen, yleensä sorbentin avulla, ja sen määrä mitataan. Höyryn keräämisen ja sitä seuraavan analyysin sijasta kuljetettu ainemäärä voidaan määrittää myös suora-analyysin (esimerkiksi kromatografian) avulla. Höyrynpaine lasketaan olettaen, että ideaalikaasulaki on voimassa ja että kaasuseoksen kokonaispaine on yhtä kuin seoksessa olevien kaasujen paineiden summa. Näytteen osapaine eli höyrynpaine lasketaan kaasujen tunnetun kokonaistilavuuden ja kuljetetun aineen painon avulla. Kaasunkyllästysmenetelmä soveltuu kiinteiden ja nestemäisten aineiden tutkimiseen. Sillä voidaan mitata höyrynpaineita arvoon 10–10 Pa saakka (10)(11)(12)(13)(14). Menetelmä on kaikkein luotettavin mitattaessa alle 103 Pa:n höyrynpaineita. Tätä suuremmilla arvoilla höyrynpaineet arvioidaan yleensä liian suuriksi, todennäköisesti aerosolien muodostumisen vuoksi. Koska höyrynpaineen mittaukset tehdään huoneenlämpötilassa, ei ole tarpeen ekstrapoloida korkeampia lämpötiloja koskevia tietoja. Tällaista ekstrapolointia vältetään, koska se voi aiheuttaa vakavia virheitä. 1.5.7.2 Laite Menetelmässä käytetään säiliötä, jonka lämpötila on vakio. Kuvan 8 piirros esittää säiliötä, joka sisältää kolme kiinteän näytteen ja kolme nestemäisen näytteen pidintä. Niiden avulla kiinteästä tai nestemäisestä näytteestä voidaan tehdä kolme analyysiä. Lämpötila säädetään ±0,5 °C:n tarkkuudella tai tarkemmin. Kuva 8 Inerttinä kantokaasuna käytetään yleensä typpeä, mutta joskus voidaan tarvita muutakin kaasua (24). Kantokaasun on oltava kuiva. Kaasuvirta jaetaan kuudeksi osavirraksi, joita säädetään neulaventtiileillä (aukot noin 0,79 mm) ja jotka johdetaan säiliöön kupariputkien kautta (sisähalkaisija 3,8 mm). Lämpötilatasoituksen jälkeen kaasu virtaa näytteen ja sorbenttiloukun läpi ja sen jälkeen ulos säiliöstä. Kiinteä näyte pannaan lasiputkeen, jonka sisähalkaisija on 5 mm ja jossa on näytteen molemmin puolin lasivillatulpat (ks. kuva 9). Kuva 10 esittää nestemäisen näytteen pidintä ja sorbenttijärjestelmää. Nesteiden höyrynpaineiden mittauksissa parhaiten toistettavissa oleva menetelmä on valaa nestettä lasihelmien tai inertin sorbentin, kuten piidioksidin päälle ja täyttää näytteenpidin näillä helmillä. Vaihtoehtona on antaa kantokaasun kulkea karkean fritin kautta ja kuplia nestemäistä näytettä sisältävän kolonnin läpi. Kuva 9 Kuva 10 Sorbenttijärjestelmässä on etummainen ja takimmainen sorptio-osa. Hyvin alhaisilla höyrypaineilla sorbentti pidättää vain pieniä ainemääriä, jolloin adsorboituminen lasivillaan sekä näytteen ja sorbentin välisen lasiputken seiniin voi olla vakava ongelma. Toinen tehokas tapa kerätä höyrystynyt materiaali talteen on käyttää loukkuja, jotka jäähdytetään hiilihappojäällä. Ne eivät aiheuta kyllästymiskolonniin kohdistuvaa vastapainetta, ja niihin jääneen ainemäärän kerääminen on helppoa. 1.5.7.3 Menettely Ulos virtaavan kantokaasun virtausnopeus mitataan huoneenlämpötilassa. Virtausnopeus tarkistetaan useita kertoja kokeen aikana, jotta kantokaasun kokonaistilavuudesta saadaan luotettava arvo. Jatkuva mittaus massavirtausmittarin avulla on suositeltavaa. Kaasufaasin kyllästyminen voi vaatia huomattavan pitkän kontaktiajan, minkä vuoksi kaasun virtausnopeuden on oltava suhteellisen pieni (25). Kokeen lopussa sorbenttijärjestelmän molemmat osat analysoidaan erikseen. Niissä olevat aineet desorboidaan lisäämällä liuotinta. Näin saadut liuokset analysoidaan kvantitatiivisesti, jotta voidaan määrittää kummastakin osasta desorboituneen ainemäärän paino. Analyysimenetelmän (kuten myös sorbentin ja desorboivan liuottimen) valinta riippuu näytteen ominaisuuksista. Desorption tehokkuus määritetään ruiskuttamalla tunnettu määrä näytettä sorbenttiin, desorboimalla se ja analysoimalla näin saatu määrä. On tärkeää, että desorption tehokkuus tarkistetaan käyttämällä pitoisuutta, joka on sama tai lähes sama kuin näytteen pitoisuus koeolosuhteissa. Kantokaasun kyllästyminen tutkittavalla aineella varmistetaan käyttämällä kolmea eri kaasunvirtausnopeutta. Kaasun oletetaan olevan kyllästynyt, jos laskettu höyrynpaine ei muutu eri virtausnopeuksilla. Höyrynpaine lasketaan seuraavan kaavan avulla: jossa p = höyrynpaine (Pa) W = haihdutetun näytteen massa (g) V = kyllästetyn kaasun tilavuus (m3) R = yleinen kaasuvakio (8,314 J mol–1 K–1) T = lämpötila (K) M = näytteen moolimassa (g mol–1). Mitatut tilavuudet on korjattava virtausmittarin ja kyllästimen välisten paine- ja lämpötilaerojen suhteen. 1.5.8 Pyörivä roottori 1.5.8.1 Periaate Menetelmässä käytetään pyörivään roottoriin perustuvaa viskositeettimittaria, jossa mittauselementtinä on pieni teräspallo, joka leijuu magneettikentässä ja pyörii pyörivien kenttien vaikutuksesta (26)(27)(28). Pallon pyörimisnopeus saadaan anturikelojen avulla. Kun pallo on saavuttanut tietyn pyörimisnopeuden (yleensä noin 400 kierrosta sekunnissa), magnetointi lopetetaan, jolloin pyöriminen hidastuu kaasukitkan vaikutuksesta. Pyörimisnopeuden pienenemiset mitataan ajan funktiona. Höyrynpaine voidaan päätellä määrittämällä teräspallon nopeuden pieneneminen paineen vaikutuksesta. Suositeltava mittausalue on 10–4–0,5 Pa. 1.5.8.2 Laite Laitteen periaatepiirros on kuvassa 11. Mittapää on suljettu vakiolämpöiseen tilaan (säätötarkkuus 0,1 °C). Näytesäiliö asetetaan erilliseen koteloon (säätötarkkuus jälleen 0,1 °C), ja järjestelmän kaikkia muita osia pidetään lämmitettyinä tiivistymisen estämiseksi. Koko laite on liitetty tyhjiöjärjestelmään. Kuva 11 2. TIEDOT JA NIIDEN RAPORTOIMINEN 2.1 TIEDOT Kaikissa edellä kuvatuissa menetelmissä höyrynpaine määritetään vähintään kahdessa lämpötilassa. Lämpötila-alueella 0–50 °C suositellaan vähintään kolmea mittausta, jotta höyrynpainekäyrän lineaarisuus voitaisiin tarkistaa. Käytettäessä effuusiomenetelmää (Knudsen-kennoa tai isotermistä termogravimetriaa) tai kaasunkyllästysmenetelmää mittausten lämpötila-alueeksi suositetaan alueen 0–50 °C sijasta aluetta 120–150 °C. 2.2 TESTIRAPORTTI Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: — käytetty menetelmä, — aineen tarkka spesifikaatio (tunnistustiedot ja epäpuhtaudet) ja mahdolliset esipuhdistukset, — vähintään kaksi höyrynpaine- ja lämpötila-arvoa – ja mieluiten kolme tai enemmän – alueelta 0–50 °C (tai 120–150 °C), — lämpötila-arvoista ainakin yhden on oltava 25 °C tai vähemmän, jos se on valitussa menetelmässä teknisesti mahdollista, — kaikki lähtöarvot, — käyrä, joka kuvaa log p:n ja lämpötilan käänteisarvon 1/T välistä riippuvuutta, — arvio höyrynpaineesta 20 tai 25 °C:n lämpötilassa. Jos aineessa tapahtuu muutoksia (olomuodon muutos, hajoaminen), on lisäksi ilmoitettava: — muutoksen luonne, — lämpötila, jossa muutos tapahtui ilmakehän paineessa, — höyrynpaine 10 °C ja 20 °C muutoslämpötilan alapuolella sekä 10 °C ja 20 °C tämän lämpötilan yläpuolella (ellei kyseessä ole muutos kiinteästä olomuodosta kaasuksi). Raportissa on esitettävä myös kaikki sellaiset tiedot ja huomautukset, joilla on merkitystä tulosten tulkinnan kannalta, erityisesti epäpuhtauksien ja aineen fysikaalisen olomuodon osalta. 3. KIRJALLISUUS (1) Euroopan yhteisöjen virallinen lehti L 383 A, s. 26–47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, Lontoo. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20–048 AFNOR (syyskuu 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method. (6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, kahdestoista laitos (2000). (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28. (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974), 393–400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796. (1993). s. 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC. (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Käytettäessä kapasitanssimanometriä. Lisäys Arviointimenetelmä JOHDANTO Höyrynpaineen arvioituja arvoja voidaan käyttää, kun halutaan: — päättää, mikä kokeellisista menetelmistä on sopiva, — saada arvio tai raja-arvo tapauksissa, joissa kokeellista menetelmää ei voida käyttää teknisistä syistä. ARVIOINTIMENETELMÄ Nesteiden ja kiinteiden aineiden höyrynpaine voidaan arvioida muunnetun Watson-korrelaation (a) avulla. Ainoa tarvittava kokeellinen tieto on normaali kiehumispiste. Menetelmää voidaan käyttää painealueella 105–10–5 Pa. Tarkemmat tiedot menetelmästä esitetään kirjassa ”Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Ks. myös OECD Environmental Monograph No.67 (c). LASKENTA Höyrynpaine lasketaan seuraavasti: jossa T = kyseinen lämpötila Tb = normaali kiehumispiste Pvp = höyrynpaine lämpötilassa T ΔHvb = höyrystymislämpö ΔZb = puristuvuustekijä (arvioitu arvo 0,97) m = empiirinen kerroin, joka vaihtelee fysikaalisen olomuodon mukaan kyseisessä lämpötilassa. Lisäksi jossa KF on empiirinen vakio, jolla otetaan huomioon aineen polaarisuus. Viitteessä (b) on lueteltu KF-vakiot useille sekoitetyypeille. Usein on saatavana tietoja kiehumispisteestä alennetussa paineessa. Tällöin höyrynpaine voidaan viitteen (b) mukaan laskea seuraavasti: jossa T1 on kiehumispiste alennetussa paineessa P1. RAPORTTI Arviointimenetelmää käytettäessä raportissa on esitettävä yksityiskohtaiset selvitykset laskennasta. KIRJALLISUUS (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

LIITE II A.22. KUITUJEN HALKAISIJAN PITUUSPAINOTETTU GEOMETRINEN KESKIARVO 1. MENETELMÄ 1.1 JOHDANTO Tässä testiohjeessa kuvataan menettely, jolla voidaan mitata bulkkimateriaalien tai -tuotteiden sisältämien keinotekoisten mineraalikuitujen halkaisijan pituuspainotettu geometrinen keskiarvo (LWGMD, Length Weighted Geometric Mean Diameter). Koska populaation LWGMD on 95 prosentin todennäköisyydellä 95 prosentin luottamustasojen välillä (LWGMD ±2 x keskivirhe), kirjattu arvo (testin tulos) on näytteen alempi 95 prosentin luottamustaso (ts. LWGMD miinus kaksi keskivirhettä). Menetelmän perustana on tarkistettu versio (kesäkuu 1994) HSE:n (Health and Safety Executive, UK) teknisestä menetelmästä, josta sovittiin ECFIA:n (European Ceramic Fibres Industry Association) ja HSE:n välisessä kokouksessa Chesterissä 26.9.1993 ja joka kehitettiin toista laboratorioiden välistä koetta varten sekä kyseisen kokeen tulosten perusteella (1, 2). Kyseisellä mittausmenetelmällä voidaan määrittää kuidun halkaisija bulkkimateriaaleissa tai -tuotteissa, jotka sisältävät keinotekoisia mineraalikuituja, esimerkiksi tulenkestäviä keraamisia kuituja, keinotekoisia lasikuituja ja yksikide- tai monikidekuituja. Pituuspainotuksella kompensoidaan vaikutusta, jonka pitkien kuitujen särkymisellä (näytteenoton tai käsittelyn yhteydessä) on halkaisijoiden kokojakaumaan. Keinotekoisten mineraalikuitujen kokojakaumaa määritettäessä käytetään geometrisia tilastomuuttujia (geometrista keskiarvoa), koska näiden halkaisijoiden kokojakaumat ovat yleensä lähellä logaritmista normaalijakaumaa. Kaikkien kuitujen pituuden ja halkaisijan mittaaminen on pitkällistä ja aikaavievää, mutta jos vain ne kuidut mitataan, jotka koskettavat äärettömän ohutta viivaa pyyhkäisyelektronimikroskoopin tarkastelukentässä, määrätyn kuidun valinnan todennäköisyys on suhteessa kyseisen kuidun pituuteen. Koska pituus on tätä kautta otettu huomioon pituuspainotetuissa mittauksissa, ainoa tarvittava mittaus on halkaisijan mittaus, jotta voidaan määrittää LWGMD miinus kaksi keskivirhettä. 1.2 MÄÄRITELMÄT Hiukkanen: kappale, jonka pituus-leveyssuhde on alle 3:1 Kuitu: kappale, jonka pituus-leveyssuhde (muotosuhde) on vähintään 3:1. 1.3 SOVELTAMISALA JA RAJOITUKSET Menetelmä on suunniteltu määrittämään halkaisijoiden kokojakaumat, kun keskihalkaisija on välillä 0,5 μm – 6 μm. Tätä suurempia halkaisijoita voidaan mitata käyttämällä pienempiä pyyhkäisyelektronimikroskoopin suurennuksia, mutta menetelmän tarkkuus vähenee siirryttäessä pienempiin halkaisijoihin. Jos keskihalkaisija on alle 0,5 μm, suositellaan läpäisyelektronimikroskoopin käyttöä. 1.4 TESTIMENETELMÄN PERIAATE Kuituhuovasta tai irtonaisesta bulkkikuidusta otetaan useita edustavia kairausnäytteitä. Näytteiden pituutta lyhennetään murskaamalla, ja edustava näyte dispergoidaan veteen. Näytteestä otetaan osanäytteet, jotka suodatetaan polykarbonaattisuodattimen läpi (huokoskoko 0,2 μm) ja preparoidaan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla tehtävää tutkimusta varten. Kuitujen halkaisijat mitataan vähintään suurennuksella 10 000 x (1) käyttäen viivan leikkauspistettä käyttävää menetelmää, jotta keskihalkaisija voidaan estimoida harhattomasti. Alempi 95 prosentin luottamustaso määritetään (yksipuolisen testin perusteella), jotta saadaan estimaatti materiaalin kuitujen halkaisijan geometrisen keskiarvon alimmasta arvosta. 1.5 TESTIMENETELMÄN KUVAUS 1.5.1 Turvallisuus ja varotoimet Fyysinen altistus ilmassa leijuville kuiduille on minimoitava ja kuivien kuitujen käsittelyssä on käytettävä veto- tai hansikaskaappia. Fyysistä altistusta on seurattava määrävälein, jotta voidaan määrittää turvamenetelmien tehokkuus. Keinotekoisia mieneraalikuituja käsiteltäessä on käytettävä kertakäyttöhansikkaita ihoärsytyksen ehkäisemiseksi ja ristikontaminaation estämiseksi. 1.5.2 Laitteet — Puristin ja puristusmuotit (paine 10 MPa) — polykarbonaattisuodattimet, joiden halkaisija on 25 mm ja joissa on kapillaarihuokoset (huokoskoko 0,2 μm) — selluloosaesterisuodatin (huokoskoko 5 μm) varasuodattimena — lasinen suodatuslaite (tai kertakäyttösuodatinjärjestelmä), joka soveltuu halkaisijaltaan 25 mm:n kokosille suodattimille (esim. Milliporen lasinen mikroanalyysijärjestelmä, tyyppi XX10 025 00) — vastatislattu vesi, joka on suodatettu (huokoskoko 0,2 μm) mikro-organismien poistamiseksi — päällystyslaite (kulta tai kulta/palladium) — pyyhkäisyelektronimikroskooppi, jonka erotuskyky 10 nm ja suurennus 10 000 x — spaattelit, skalpelli (tyyppi 24), pinsetit, pyyhkäisyelektronimikroskoopin putket, hiililiima tai -teippi, kolloidinen hopea — ultraäänisondi tai ultraäänihaude — kairauslaite tai korkkipora kairausnäytteiden ottamiseksi kuituhuovasta. 1.5.3 Testimenettely 1.5.3.1 Näytteenotto Kuituhuovasta tai -levystä otetaan näytteet 25 mm:n kairalla tai korkkiporalla. Näytteet pitäisi ottaa tasaisin välimatkoin, jos huopa on lyhyt, tai sattumanvaraisesti valituilta alueilta, jos huopa on pitkä. Samoja välineitä voidaan käyttää sattumanvaraisten näytteiden ottamiseksi irrallisesta kuidusta. Näytteitä on mahdollisuuksien mukaan otettava kuusi siten, että otetaan huomioon bulkkimateriaalin spatiaalinen vaihtelu. Kaikki kuusi kairausnäytettä murskataan halkaisijaltaan 50:mm kokoisessa puristusmuotissa paineella 10 Mpa. Materiaali sekoitetaan spaattelilla ja puristetaan uudelleen paineella 10 MPa. Sen jälkeen materiaali poistetaan puristusmuotista ja varastoidaan sinetöityyn lasipulloon. 1.5.3.2 Näytteiden preparointi Orgaaninen sideaine voidaan tarvittaessa poistaa panemalla kuitu uuniin (lämpötila 450 °C) noin tunniksi. Näytteestä muodostetaan kartio, joka ositetaan neljään osaan (tämä olisi tehtävä vetokaapin sisällä). Pieni määrä < 0,5 g) näytettä lisätään spaattelilla 100 ml:aan vastatislattua vettä, joka on suodatettu kalvosuodattimen läpi (huokoskoko 0,2 μm) (myös muulla tavalla valmistettua ultrapuhdasta vettä voidaan käyttää, jos sen voidaan osoittaa olevan tarkoitukseen sopivaa). Näyte dispergoidaan kokonaan ultraäänisondilla, jota käytetään 100 W:n teholla ja sellaisella säädöllä, että syntyy kavitaatiota. (Jos sondia ei ole käytettävissä, käytetään seuraavaa menetelmää: ravistellaan ja käännellään ylösalaisin 30 sekunnin ajan, pannaan viideksi minuutiksi ultraäänihauteeseen ja ravistellaan ja käännellään ylösalaisin uudelleen 30 sekunnin ajan.) Välittömästi näytteen dispergoinnin jälkeen siitä otetaan osanäytteet (esim. kolme näytettä, 3, 6 ja 10 ml) käyttämällä leveäsuista pipettiä (kapasiteetti 2–5 ml). Kukin osanäyte suodatetaan polykarbonaattivakuumisuodattimella (huokoskoko 0,2 μm), jonka yhteydessä on MEC-varmistussuodatin (huokoskoko 5 µm), käyttämällä 25 mm:n lasista suodatinsuppiloa, jossa on sylinterimäinen säiliö. Suppiloon pannaan noin 5 ml suodatettua tislattua vettä, ja osanäyte pipetoidaan hitaasti veteen pitäen pipetin päätä meniskuksen alla. Pipetti ja säiliö huuhdellaan perusteellisesti pipetoinnin jälkeen, koska ohuet kuidut jäävät usein pintoihin. Suodatin poistetaan varovasti ja erotetaan varmistussuodattimesta ennen sen asettamista kuivumaan. Suodatinkalvolla olevasta saostumasta leikataan neljäsosa tai puolet skalpellilla (tyyppi 24) käyttämällä edestakaista liikettä. Leike kiinnitetään varovasti pyyhkäisyelektronimikroskoopin näytealustalle hiiliteipillä tai -liimalla. Kolloidihopeaa aplikoidaan vähintään kolmeen paikkaan, jotta sähkökontakti olisi parempi suodattimen ja näytealustan reunoilla. Kun liima tai kolloidinen hopea on kuivunut, kerroksen pinta päällystetään kullalla tai kulta-palladiumseoksella (paksuus noin 50 nm). 1.5.3.3 Pyyhkäisyelektronimikroskoopin kalibrointi ja käyttö 1.5.3.3.1 Kalibrointi Pyyhkäisyelektronimikroskoopin kalibrointi on tarkistettava vähintään kerran viikossa (mieluiten kerran päivässä) käyttämällä sertifioitua kalibraattoria. Kalibrointi on tarkistettava sertifioituihin standardiarvoihin nähden, ja jos mitattu arvo ei ole ±2 % sertifioidusta arvosta, kalibrointia on säädettävä ja se on tarkistettava uudelleen. Pyyhkäisyelekronimikroskoopin erotuskyvyn on oltava vähintään sellainen, että sillä pystytään erottamaan 0,2 µm:n halkaisija (aito näytematriisi), kun suurennus on 2 000 x. 1.5.3.3.2 Käyttö Pyyhkäisyelektronimikroskooppia pitäisi käyttää suurennuksella 10 000 x olosuhteissa (2), jotka mahdollistavat hyvän erotuskyvyn hitailla pyyhkäisynopeuksilla (esim. 5 sekuntia/pyyhkäisy). Vaikka eri pyyhkäiselektronimikroskooppien käyttövaatimukset voivat vaihdella, parhaan näkyvyyden ja erotuskyvyn aikaansaamiseksi atomipainoltaan suhteellisen kevyillä materiaaleilla olisi käytettävä kiihdytysjännitettä 5–10 keV sekä pientä pyyhkäisypisteen kokoa ja lyhyttä työskentelyetäisyyttä. Suoritettaessa lineaarista pyyhkäisyä pitäisi käyttää 0o:n kallistuskulmaa uudelleenfokusoinnin minimoimiseksi, tai jos pyyhkäisyelektronimikroskoopissa on eusentrinen objektipöytä, tulisi käyttää eusentristä työskentelyetäisyyttä. Pienempää suurennusta voidaan käyttää, jos materiaali sisältää ainostaan suuria kuituja (halkaisija > 5 μm). 1.5.3.4 Koon määritys 1.5.3.4.1 Tutkimus pienillä suurennuksilla näytteen arvioimiseksi Näyte arvioidaan aluksi pienillä suurennuksilla. Tällöin tarkistetaan, onko näytteessä suurien kuitujen rykelmiä, ja arvioidaan kuitujen tiheys. Jos kuidut esiintyvät paljon rykelminä, suositellaan uuden näytteen ottamista. Tilastotulosten luotettavuuden takaamiseksi on mitattava riittävästi kuituja. Suuri kuitujen tiheys voi näyttää tämän vuoksi tarpeelliselta, koska tyhjien kenttien tutkimimen on aikaavievää eikä tue analyysiä. Jos suodatin on kuitenkin ylikuormattu, on vaikea mitata kaikkia mitattavissa olevia kuituja, ja koska suuret kuidut voivat peittää näkyvistä pienemmät kuidut, pienemmät kuidut voivat jäädä mittaamatta. LWGMD-arvon yliarvioiminen voi johtua kuitujen tiheyksistä, jotka ovat yli 150 kuitua yhtä lineaarisen pyyhkäisyn millimetriä kohti. Toisaalta pienet tiheydet pidentävät analyysiin tarvittavaa aikaa. Siksi on usein kustannustehokkaampaa preparoida näyte, jossa kuitujen tiheys on lähempänä optimia, kuin jatkaa mittauksia tiheyden ollessa pieni. Optimitiheys on sellainen, että yhtä näkökenttää kohti on keskimäärin yksi tai kaksi mitattavissa olevaa kuitua suurennuksella 5 000 x. Optimitiheys riippuu kuitenkin kuitujen koosta (halkaisijasta), joten tutkijan on harkittava, onko kuitujen tiheys optimaalinen vai ei. 1.5.3.4.2 Kuitujen halkaisijan pituuspainotus Vain ne kuidut lasketaan, jotka koskettavat (äärettömän) ohutta viivaa (tai leikkaavat sen) pyyhkäisyelektronimikroskoopin näkökentässä. Tätä varten näkökentän keskustan yli vedetään vaakasuora (tai pystysuora) viiva. Vaihtoehtoisesti näkökentän keskelle asetetaan yksi piste ja käynnistetään jatkuva pyyhkäisy yhteen suuntaan suodattimen yli. Jokainen kuitu, jonka muotosuhde on yli 3:1 ja joka koskettaa tätä pistettä tai leikkaa sen, mitataan ja kirjataan. 1.5.3.4.3 Kuitujen koon määritys Suositellaan, että vähintään 300 kuitua mitataan. Kukin kuitu mitataan vain kerran kohdassa, jossa se leikkaa kentässä olevan viivan tai pisteen (tai leikkauskohtaa lähellä olevassa kohdassa, jos kuidun reunat peittyvät näkyvistä). Jos kuidun poikkileikkaukset eivät ole kauttaaltaan samat, on käytettävä mittausta, joka edustaa kuidun keskiarvoa. Reuna on määriteltävä huolellisesti ja mitattava lyhyin välimatka kuidun reunojen välillä. Mittaukset voidaan tehdä suoraan tai (valo)kuvista. Käytettäväksi suositellaan puoliautomaattisia mittausjärjestelmiä, jotka lataavat tiedot suoraan laskentataulukkoon, koska ne säästävät aikaa, eliminoivat kopiointivirheiden mahdollisuuden, ja laskenta voidaan automatisoida. On tarkistettava pienellä suurennuksella, että pitkien kuitujen päät eivät kierry takaisin mittauskenttään ja että ne mitataan vain kerran. 2. TULOKSET 2.1 TULOSTEN KÄSITTELY Kuitujen halkaisijat eivät tavallisesti edusta normaalijakaumaa. Logaritmimuunnoksen avulla on kuitenkin mahdollista saada jakauma, joka on lähellä normaalijakaumaa. Lasketaan n kuitujen halkaisijan (D) luonnollisten logaritmien (lnD) aritmeettinen keskiarvo (keskiarvo lnD) ja keskihajonta (SDlnD). (1) (2) Keskihajonta jaetaan mittausten lukumäärän (n) neliöjuurella keskivirheen (SElnD) määrittämiseksi. (3) Vähennetään keskiarvosta 2 x keskivirhe ja määritetään tämän arvon (keskiarvo miinus 2 x keskivirhe) eksponenttiarvo, mikä antaa geometrisen keskiarvon miinus 2 x geometrinen keskivirhe. (4) 3. RAPORTOINTI TESTISELOSTE Testiselosteessa on annettava ainakin seuraavat tiedot: — arvo LWGMD miinus 2 x keskivirhe — mahdolliset poikkeamiset testimenettelystä (erityisesti ne, joilla voi olla vaikutusta tulosten tarkkuuteen tai luotettavuuteen) perusteluineen. 4. KIRJALLISUUSVIITTEET 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Suurennus on tarkoitettu 3 µm:n kuiduille; 6 µm:n kuiduille voi soveltua paremmin suurennus 5 000 ×. (2) 3 μm:n kuitujen osalta ks. edellinen alaviite.

LIITE III B.46 REKONSTRUOITUA IHMISORVASKESIMALLIA KÄYTTÄVÄ IN VITRO -IHOÄRSYTTÄVYYSTESTI 1. MENETELMÄ 1.1 JOHDANTO Ihoärsytyksellä tarkoitetaan korjautuvan ihovaurion syntymistä enintään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen [kuten on määritelty Yhdistyneiden Kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures)] (1). Tässä testimenetelmässä vahvistetaan in vitro -menettely, jota tietovaatimuksista riippuen voidaan käyttää luotettavasti yksittäisenä korvaavana testinä aikaisempaan näyttöön perustuvassa testausstrategiassa aineiden aiheuttaman ihoärsytyksen määrittämiseen (2). Ihoärsyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten käyttöä (ks. menetelmä B.4) (3). Eläinten hyvinvointiin liittyvien näkökohtien osalta voidaan todeta, että menetelmällä B.4 ihosyövyttävyys ja ihoärsyttävyys voidaan määritellä soveltamalla vaiheittaista testausstrategiaa käyttäen in vitro ja ex vivo -menetelmiä, joita käyttämällä vältetään eläimille aiheutuva kipu ja kärsimys. Kolme validoitua in vitro -testimenetelmää tai -testausohjetta, eli B.40, B.40bis ja TG 435 (4, 5, 6) ovat hyödyllisiä B.4:n vaiheittaisen testausstrategia syövyttävyysosiossa. Tämä testimenetelmä perustuu rekonstruoituun ihmisorvaskesimalliin, jonka kokonaissuunnittelu (ihmisestä peräisin olevan orvaskeden keratinosyyttien käyttäminen solujen lähteenä ja edustava kudos- ja soluarkkitehtuuri) jäljittelee läheisesti ihmisihon ylemmän kerroksen eli epidermiksen biokemiallisia ja fysiologisia ominaisuuksia. Tässä testimenetelmässä esiteltävällä menettelyllä ärsyttävien aineiden aiheuttamat vaarat voidaan tunnistaa YK:n GHS-luokan 2 mukaisesti. Tähän testimenetelmään sisältyy myös sarja suoritusvaatimuksia, joilla voidaan arvioida samanlaisia ja muunnettuja rekonstruoituun ihmisorvasketeen perustuvia testimenetelmiä (7). Kahden in vitro -testimenetelmän (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), joissa käytetään rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia ja jotka ovat kaupallisesti saatavilla nimillä EpiSkin™ ja EpiDerm™, osalta on saatu päätökseen validointia edeltävää vaihetta, optimointia ja validointia koskevat tutkimukset. Nämä perustuvat riskilausekkeeseen R.38. Tiettyjä GHS-järjestelmän tarkoituksiin tehtävien laskelmien on käsitelty kirjallisuuslähteessä 25. Menetelmiä, joiden suorituskyky on vastaava kuin EpiSkin™-menetelmän (validoitu vertailumenetelmä 1), suositellaan käytettäväksi erillisenä kanin in vivo -testin korvaavana testimenetelmänä luokiteltaessa GHS-luokkaan 2 kuuluvia ärsytystä aiheuttavia kemikaaleja. Menetelmiä, joiden suorituskyky on vastaava kuin EpiDerm™-menetelmän (validoitu vertailumenetelmä 2), suositellaan käytettäväksi ainoastaan seulontatestimenetelmänä tai osana vaiheittaista aikaisempaan näyttöön perustuvaa testausstrategiaa luokiteltaessa GHS-luokkaan 2 kuuluvia ärsytystä aiheuttavia aineita. Ennen kuin ehdotettua ihoärsyttävyyttä selvittävää rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia käyttävää in vitro -testiä voidaan käyttää sääntelytarkoituksiin, olisi sen luotettavuus, merkittävyys (tarkkuus) ja ehdotetun käytön rajoitukset määritettävä, jotta voidaan varmistaa, että sitä voidaan verrata validoituun vertailumenetelmään 1 tässä testimenetelmässä (liite) vahvistettujen suoritusvaatimusten mukaisesti. Kaksi muuta rekonstruoitua ihmisorvaskettä käyttävää in vitro -testimenetelmää on validoitu tämän testimenetelmän vaatimusten mukaisesti. Niillä on saatu vastaavia tuloksia kuin validoidulla vertailumenetelmällä 1 (18). Nämä ovat muutettu EpiDerm™ -testimenetelmä (muutettu vertailumenetelmä 2) ja SkinEthic RHE™ -testimenetelmä (ns. me-too-menetelmä 1). 1.2 MÄÄRITELMÄT Tässä testimenetelmässä sovelletaan seuraavia määritelmiä: Tarkkuus: testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Se on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osa-alueista. Tarkkuutta ja vastaavuutta käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta. Erän kontrolliaine: vertailuaine, jolla saadaan kudoksen solujen elinkyvyn keskimääräinen taso. Solujen elinkyky: muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonaisaktiivisuutta esim. solujen mitokondrioiden dehydrogenaasien kykyä pelkistää väriaine MTT (3–(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrasoliumbromidi, tiatsolyylisininen), joka mittaussuureesta ja testimenetelmästä riippuen korreloi solujen kokonaismäärään ja/tai elinkykyyn. ET50 : altistusaika, joka tarvitaan, jotta solujen elinkyky vähenee 50 % applikoitaessa merkkiainetta tietyssä, määrätyssä pitoisuudessa, ks. myös IC50. Väärien negatiivisten tulosten osuus: Niiden positiivisten aineiden osuus, jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti negatiivisiksi. Se on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattoreista. Väärien positiivisten tulosten osuus: Niiden negatiivisten aineiden (muut kuin tehoaineet) osuus, jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti positiivisiksi. Se on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattoreista. Rajoittamaton annos: Iholle applikoidun testiaineen määrä, joka ylittää määrän, joka tarvitaan ihopinnan peittämiseksi kokonaisuudessaan ja tasaisesti. GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals; kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja merkintäjärjestelmä): Tässä järjestelmässä luokitellaan aineet ja seokset fysikaalisten, terveyteen ja ympäristöön liittyvien vaarojen standardityyppien ja -tasojen mukaisesti ja niille osoitetaan vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedotteet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien kielteisistä vaikutuksista ihmisten ja ympäristön suojelemiseksi (esimerkiksi työnantajille, työntekijöille, kuljettajille, kuluttajille ja pelastushenkilöstölle) (1) ja pantu täytäntöön EU:ssa asetuksella (EY) N:o 1272/2008. IC50 : Pitoisuus, jossa merkkiaine alentaa solujen elinkykyä 50 prosentilla (IC50) sovitun altistusajan jälkeen, ks. myös ET50. Suoritusvaatimukset: Validoituihin vertailumenetelmiin perustuvat standardit, jotka toimivat perustana arvioitaessa ehdotetun mekaanisesti ja toiminnallisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Siihen sisältyvät I) testimenetelmän oleelliset osat; vähimmäisluettelo vertailuaineista, jotka on valittu niiden aineiden joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailumenetelmän hyväksyttävää suorituskykyä; ja III) verrattavissa olevat tarkkuuden ja luotettavuuden tasot, jotka perustuvat siihen validoidusta vertailumenetelmästä saatuihin tuloksiin, jotka ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailuaineiden vähimmäisluettelon avulla. Luotettavuus: Laajuus, jolla testimenetelmä on toistettavissa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa ajan myötä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioidaan laskemalla toistettavuus samassa laboratoriossa ja eri laboratorioissa. Herkkyys: Niiden positiivisten/aktiivisten aineiden osuus, jotka on luokiteltu testissä oikein. Sillä mitataan luokiteltuja tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. On tärkeää ottaa herkkyys huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä. Spesifisyys: Niiden negatiivisten/muiden kuin aktiivisten aineiden osuus, jotka on luokiteltu testissä oikein. Sillä mitataan luokiteltuja tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. On tärkeää ottaa spesifisyys huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä. Ihoärsyttävyys: Palautuvan ihovaurion ilmaantuminen enintään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen. Ihoärsytys on paikallisesti esiintyvä, ei-immunogeeninen reaktio, joka kehittyy pian stimulaation jälkeen (24). Sen tärkeimmät ominaispiirteet ovat sen palautuvuus, johon liittyy tulehdusreaktioita, ja useimmat tulehdusreaktioon liittyvät ärsyttävyyden kliiniset ominaispiirteet (eryteema, ödeema, kutina ja kipu). 1.3 SOVELTAMISALA JA RAJOITUKSET Tähän testimenetelmään kuuluvan rekonstruoitua ihmisorvaskettä koskevan testin rajoitus on, että siinä luokitellaan aineet ihoärsytystä aiheuttaviksi ainoastaan YK:n GHS-luokan 2 mukaisesti. Koska aineiden luokittelu vaihtoehtoiseen YK:n GHS-luokkaan 3 ei ole mahdollista, jäljelle jääviä aineita ei luokitella lainkaan. Sääntelytarpeista ja mahdollisten uusien tulostapahtumien lisäämisestä me-too-kokeiden parantamisesta tai uusien kehittämisestä riippuen tätä testimenetelmää voidaan joutua tarkistamaan. Tällä testimenetelmällä voidaan tunnistaa ärsytystä aiheuttavien yhdestä ainesosasta koostuvien aineiden aiheuttamat vaarat (19), mutta se ei tarjoa riittävästi tietoa ihon syöpymisestä. Sillä ei voida testata kaasuja ja aerosoleja, eikä seoksia ole vielä arvioitu validointitutkimuksessa. 1.4 TESTIN PERIAATE Testiainetta applikoidaan paikallisesti kolmiulotteiseen rekonstruoituun ihmisorvaskesimalliin, joka koostuu ihmisestä saaduista tavallisista orvaskeden keratinosyyteistä, jotka on viljelty ihmisen orvaskeden monikerroksiseksi, täysin erilaistuneitten solujen malliksi. Se koostuu järjestyneistä ja selkeistä tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksista ja monikerroksisesta marraskedestä, joka sisältää solujenvälisiä lapellaarisia lipidikerroksia, jotka ovat järjestäytyneet samanlaisiin kuvioihin, kuin in vivo -kokeissa muodostuneet kuviot. Rekonstruoitua ihmisorvaskettä koskevan mallimäärityksen periaate perustuu oletukseen, jonka mukaan syövyttäviä aineita ovat ne, jotka pystyvät läpäisemään marraskeden diffundoitumalla ja ovat myrkyllisiä soluille alla olevissa kerroksissa. Solujen elinkyvyn mittaus perustuu siihen, että dehydrogenaasi muuntaa väriaine MTT:n [[3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrasoliumbromidi, tiatsolyylisininen, Einecs-nro 206-069-5, CAS-nro 298-93-1] siniseksi formatsaanisuolaksi, joka mitataan määrällisesti, kun se on uutettu kudoksista (20). Ärsytystä aiheuttavat aineet tunnistetaan niiden kyvystä alentaa solun elinkykyä määriteltyjen kynnysarvojen (esim. ≤ 50 % YK:n GHS-luokka 2:n ärsyttävät aineet) alle. Sellaisia aineita, joiden yhteydessä solujen elinkyky on yli määritellyn kynnysarvon (esim. > 50 %, ei luokitusta), ei luokitella. Rekonstruoitua ihmisorvaskettä voidaan käyttää esimerkkimenetelmänä testattaessa kiinteitä aineita, nesteitä, puolikiinteitä aineita tai vahamaisia aineita. Nesteet voivat olla vesiliukoisia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Kiinteät aineet olisi mahdollisuuksien mukaan testattava hienona jauheena. Rekonstruoidun ihmisorvaskeden esimerkkimenetelmän validoinnissa käytettiin 58 tarkkaan valittua ainetta, jotka edustavat monia eri kemiallisia luokkia, joten on odotettavissa, että testiä sovelletaan yleisesti eri kemiallisissa luokissa (16). Validointiin kuuluu 13 GHS-luokkaan 2 kuuluvaa ärsyttävää ainetta. Olisi otettava huomioon, että syövyttämättömiä happoja, emäksiä, suoloja ja muita epäorgaanisia aineita ei sisällytetty validointiin. Tiettyjä tunnettuja orgaanisten ärsyttävien aineiden luokkia, kuten vetyperoksideja, fenoleita ja pinta-aktiivisia aineita ei myöskään sisällytetty validointiin tai ne sisällytettiin vain rajoitetusti. 1.5 PÄTEVYYDEN OSOITUS Ennen kuin laboratoriot ryhtyvät käyttämään tämän testimenetelmän mukaista validoitua menetelmää, ne voivat osoittaa teknisen pätevyytensä taulukossa 1 suositeltujen 10 aineen avulla. Tässä testimenetelmässä YK:n GHS:n vaihtoehtoista luokkaa 3 ei pidetä luokkana. Sellaisten tämän testimenetelmän mukaisesti kehitettyjen uusien ja samantyyppisten (me-too) testimenetelmien, jotka vastaavat rakenteellisesti ja toiminnallisesti validoituja vertailumenetelmiä tai muunnettuja validoituja menetelmiä, vertailukelpoinen luotettavuus ja tarkkuus olisi osoitettava tämän testimenetelmän liitteessä vahvistettujen suorituskykyvaatimusten mukaisesti ennen kuin niitä käytetään säännösten nojalla tehtäviin testeihin. Taulukko 1 Pätevyyden osoittamisessa käytettävät aineet, jotka ovat myös liitteessä lueteltuja vertailuaineita Aine CAS-numero In vivo -tulos Fysikaalinen olomuoto GHS-luokka naftaleenietikkahappo 86-87-3 0 kiinteä ei luokitusta isopropanoli 67-63-0 0,3 neste ei luokitusta metyylistearaatti 112-61-8 1 kiinteä ei luokitusta heptyylibutyraatti 5870-93-9 1,7 neste valinnainen luokka 3 heksyylisalisylaatti 6259-76-3 2 neste valinnainen luokka 3 syklameenialdehydi 103-95-7 2,3 neste luokka 2 1-bromiheksaani 111-25-1 2,7 neste luokka 2 butyylimetakrylaatti 97-88-1 3 neste luokka 2 1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini 5271-27-2 3,3 kiinteä luokka 2 heptanaali 111-71-7 4 neste luokka 2 1.6 MENETELMÄN KUVAUS Seuraavassa esitellään rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia käyttävän ihoärsyttävyystestin osat ja menettelyt. Rekonstruoitu ihmisorvaskesimalli voidaan valmistaa tai hankkia kaupallisesti (esim. EpiSkin™, EpiDerm™ ja SkinEthic RHE™). EpiSkin™-, EpiDerm™- ja SkinEthic RHE™- standarditestimenetelmät ovat verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu (21, 22, 23). Testauksessa olisi noudatettava seuraavaa: 1.6.1 Rekonstruoidun ihmisorvaskesimallin osat 1.6.1.1 Mallin yleiset ehdot Epiteelin valmistamiseen on käytettävä normaaleja ihmisen keratinosyyttejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä olisi oltava useita kerroksia ja tarvittava lipidiprofiili, jotta se voi tarjota toimivan esteen ja kykenee torjumaan solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) tai Triton X-100:n, nopean läpäisyn. Läpäisyn estokykyä voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa merkkiaine vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC50) vahvistetun altistusajan jälkeen, tai määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 prosentilla (ET50) applikoitaessa tietyn ja vahvistetun pitoista merkkiainetta. Mallin on oltava sellainen, että marraskeden ympärillä olevan materiaalin pääsy elävään kudokseen estyy, koska se heikentäisi mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. Ihomallissa ei saa olla kontaminaatiota (esim. bakteerit, virukset, mykoplasmat tai sieni-itiöt). 1.6.1.2 Mallin toimintaa koskevat ehdot 1.6.1.2.1 Solujen elinkyky Elinkyvyn määrityksessä suositellaan käytettäväksi MTT:tä (20). Negatiivisella kontrollilla käsitellystä kudoksesta uutetun (liuotetun) väriaineen optisen tiheyden (OD) on oltava ainakin 20 kertaa suurempi kuin pelkän uuttamisliuottimen OD-arvo. Olisi dokumentoitava, että negatiivisella kontrollilla käsitellyn kudoksen on oltava stabiili viljelyssä (solujen elinkykyä koskevien mittaustulosten on oltava samanlaisia) koko testiin liittyvän altistusajan. 1.6.1.2.2 Läpäisyn esto Marraskeden ja sen rasvakoostumuksen olisi oltava riittävä estämään solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten SDS:n tai Triton X-100:n nopea läpäisy, kuten on arvioitu IC50:llä tai ET50:llä. 1.6.1.2.3 Morfologia Asianmukaisen pätevyyden omaavan henkilöstön olisi suoritettava rekonstruoidun ihon/orvaskeden histologinen tutkimus, jolla osoitetaan, että rekonstruktiolla on vastaava rakenne kuin ihmisiholla/ihmisorvaskedellä (myös monikerroksinen marraskesi). 1.6.1.2.4 Uusittavuus Tiettyä mallia käyttävän menetelmän tulokset olisi voitava uusia ajan myötä mieluiten asianmukaisella erän kontrolliaineella (vertailuaineella) (ks. liite). 1.6.1.2.5 Mallin laatukontrollit Kunkin orvaskesimallierän olisi täytettävä määritellyt tuotannon vapauttamisperusteet, joiden joukosta elinkykyisyyttä (kohta 1.6.2.1), ja läpäisyn estoa (kohta 1.6.1.2.2) koskevat perusteet ovat merkityksellisimmät. Ihomallin tuottajan (tai sisäistä mallia käytettäessä tarkastajan) olisi annettava IC50:n tai ET50:n hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo). Laboratorion olisi kudokset saatuaan todennettava niiden läpäisynesto-ominaisuudet. Ainoastaan hyväksytyillä kudoksilla saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi ärsytyksen vaikutuksista. Validoitujen vertailumenetelmien hyväksyttävyyden vaihteluvälit annetaan esimerkkinä jäljempänä. Taulukko 2 Esimerkkejä laatukontrollin eränvapauttamisperusteista Alempi hyväksyttävyysraja Hyväksyttävyyden keskiarvo Ylempi hyväksyttävyysraja Validoitu vertailumenetelmä 1 (18 tunnin käsittely SDS:llä IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validoitu vertailumenetelmä 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 tuntia ET50 = 6,7 tuntia ET50 = 8,7 tuntia 1.6.1.3 Testi- ja kontrolliaineen applikoiminen Kussakin käsittelyssä ja kontrollissa on käytettävä riittävä määrä kudosnäytteitä (vähintään kolme näytettä käsittelyä kohden). Sekä nestemäisiä että kiinteitä aineita käytettäessä olisi applikoitava riittävä määrä testiainetta tasaisesti ihon pinnalle kuitenkin niin, ettei käytetä rajoittamatonta annosta (ks. kohta 1.2 Määritelmät). Olisi siis käytettävä vähintään 25 μL/cm2 tai 25 mg/cm2. Kiinteitä aineita käytettäessä olisi orvaskeden pinta kostutettava ionisoimattomalla tai tislatulla vedellä ennen aineen applikointa, jotta ihoon saadaan hyvä kosketus. Kiinteät aineet olisi mahdollisuuksien mukaan testattava hienona jauheena. Altistuksen jälkeen testiaine pestään huolellisesti ihon pinnalta sopivalla vesiliukoisella puskuriliuoksella tai 0,9 % NaCl:lla. Rekonstruoidusta ihmisorvaskesimallista riippuen altistusaika voi olla 15–60 minuuttia ja inkubaatiolämpötila 20–37 °C. Yksityiskohtaiset tiedot ovat kolmea menetelmää koskevissa vakiomenettelyissä (21, 22 ja 23). Kussakin tutkimuksessa olisi käytettävä rinnakkaisia negatiivisia ja positiivisia kontrolleja osoittamaan, että kudoksen elinkyky (negatiivinen kontrolli), läpäisyn esto ja kudoksen herkkyys testin jälkeen (positiivinen kontrolli) ovat määritellyn aikaisemman hyväksyttävyysvälin sisällä. Positiivisena kontrolliaineena suositellaan käytettäväksi 5 prosenttista vesiliukoista SDS:ää. Suositeltavat negatiiviset kontrollit ovat vesi tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (OSB). 1.6.1.4 Solujen elinkykymittaukset Testimenettelyn tärkein osa on se, että elinkykymittauksia ei suoriteta heti testiaineille altistumisen jälkeen, vaan vasta, kun kudokset on käsittelyn jälkeen huuhdeltu ja kun ne ovat olleet riittävän pitkän inkubaatioajan tuoreessa elatusaineessa. Inkubaatioaika mahdollistaa palautumisen heikoista ihoärsytysvaikutuksista ja selkeiden sytotoksisten vaikutusten esilletulon. Testin optimointivaiheen aikana (9, 10, 11, 12 ja 13) on osoittautunut optimaaliseksi 42 tunnin käsittelyn jälkeinen inkubaatioaika, jota onkin näin ollen käytetty vertailutestimenetelmien validoinnissa. MTT:n konversiotesti on määrällinen validoitu menetelmä, jota olisi käytettävä solun elinkyvyn mittaamiseen. Se on yhdenmukainen kolmiulotteisen kudosrakenteen käytön kanssa. Ihonäyte pannaan 3 tunniksi MTT-liuokseen, jonka pitoisuus on sopiva (esim. 0,3–1 mg/ml). Saostunut sininen formatsaani uutetaan kudoksesta liuottimella (esim. isopropanoli tai hapan isopropanoli), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo 570 nm:ssä, ±30 nm. Testiaineen optiset ominaisuudet tai sen kemiallinen reaktio MTT:n kanssa voivat aiheuttaa sen, että testissä saadaan väärä arvio elinkyvystä (koska testiaine voi estää tai muuttaa värin muodostumisen tai vaihtoehtoisesti aiheuttaa sen). Näin voi tapahtua, jos erityistä testiainetta ei poisteta iholta kokonaisuudessaan huuhtelemalla, tai jos se imeytyy orvasketeen. Jos testiaine reagoi suoraan MTT:n kanssa, se on luonnostaan värillinen, tai jos se värjäytyy kudoksen käsittelyn aikana, on käytettävä lisäkontrolleja, jotta voidaan havaita ja korjata testiaineen vaikutus solujen elinkyvyn mittaukseen. Yksityiskohtainen kuvaus MTT:n suoran pelkistyksen testaamisesta on validoituja vertailumenetelmiä koskevassa testimenetelmässä (21, 22 ja 23). Näistä häiriöistä johtuva ei-spesifinen väri saa olla enintään 30 prosenttia negatiivisesta kontrollista (jolloin voidaan vielä tehdä korjauksia). Jos ei-spesifinen väri on > 30 %, testiaine on sopimaton testiin. 1.6.1.5 Testin hyväksyttävyysperusteet Kussakin hyväksyttyjä eriä (ks. kohta 1.6.1.2.5) käyttävässä testissä olisi negatiivisella kontrollilla käsiteltyjen kudosten OD:n oltava vastaava kuin kudoksilla, joille on suoritettu kaikki kuljetus- ja vastaanottovaiheet sekä ärsyttävyystestiprotokollat. Kontrollien OD-arvot eivät saisi olla alhaisemmat kuin vahvistetut aikaisemmat alemmat rajat. Vastaavasti positiivisella kontrollilla eli 5 prosenttisella vesiliukoisella SDS:llä, käsiteltyjen kudosten olisi ilmennettävä kudosten jäljellä olevaa herkkyyttä ja niiden kykyä reagoida ärsytystä aiheuttavaan aineeseen kussakin yksittäisessä testissä (esim. elinkyky ≤ 40 % validoidussa vertailumenetelmässä 1 ja ≤ 20 % validoidussa vertailumenetelmässä 2). Olisi määriteltävä tähän liittyvät ja asianmukaiset poikkeamat kudosnäytteiden välillä (esimerkiksi vakiopoikkeamien olisi oltava ≤ 18 %). 2. MITTAUSTULOKSET 2.1 MITTAUSTULOKSET Kunkin testin osalta olisi esitettävä taulukkomuodossa yksittäisiä rinnakkaisia testinäytteitä koskevat mittaustulokset (esimerkiksi kunkin testiaineen OD-arvot ja solujen elinkyvyn laskettua prosentuaalista osuutta koskevat tiedot, mukaan luettuna luokittelu), ja tarvittaessa myös mittaustulokset toistetuista kokeista. Lisäksi olisi esitettävä kunkin kokeen keskiarvo ± keskihajonta. Kunkin testatun aineen osalta olisi esitettävä havaittu vuorovaikutus MTT-reagenssin ja värillisten testiaineiden kanssa. 2.2 TULOSTEN TULKINTA Negatiivisen kontrollin OD-arvon katsotaan testissä edustavan 100-prosenttista solujen elinkykyä. Kullekin testinäytteelle saaduista OD-arvoista voidaan laskea solujen elinkyky prosentteina negatiivisesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen elinkyvyn raja-arvo, jolla erotetaan ärsyttävät testiaineet luokittelemattomista testiaineista, ja tulosten arviointiin ja ärsyttävien aineiden tunnistamiseen käytettävät tilastomenetelmät, olisi määriteltävä selvästi ja dokumentoitava, ja niiden on osoitettava olevan soveltuvia. Validoituihin vertailumenetelmiin liittyvät ärsytyksen ennusteen raja-arvot on esitetty jäljempänä. Testiaineen katsotaan aiheuttavan ihoärsytystä YK:n GHS-luokan 2 mukaisesti: i) jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on alhaisempi tai yhtä suuri kuin (≤) 50 %. Testiaineella ei katsota olevan luokitusta: ii) jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on suurempi kuin (>) 50 %. 3. RAPORTOINTI 3.1 TESTIRAPORTTI Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testi- ja kontrolliaineet: — kemiallinen nimi/kemialliset nimet, kuten IUPAC- tai CAS-nimi sekä CAS-numero, jos se tiedetään, — aineen puhtaus ja koostumus (painoprosentteina), — tutkimuksen suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (kuten fysikaalinen olomuoto, stabiilius ja haihtuvuus, pH ja vesiliukoisuus, jos se tiedetään), — tarvittaessa testi- tai kontrolliaineiden käsittely ennen testiä (esim. lämmittäminen tai jauhaminen), — varastointiolosuhteet. Käytetyn ihomallin ja testisuunnitelman perustelut. Testiolosuhteet: — käytetty solujärjestelmä, — solujen elinkykymäärityksessä käytetyn mittauslaitteen ja kaistanpäästösuotimen (esim. spektrofotometri) kalibrointiedot, — täydelliset tiedot käytetyn spesifisen ihomallin tueksi (mm. mallin suorituskyky). Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä: i) solujen elinkyky ii) läpäisyn esto iii) morfologia iv) uusittavuus ja ennustettavuus v) mallin laatukontrollit — tiedot käytetystä testimenettelystä, — testissä käytetyt annokset, altistuksen kesto ja käsittelyn jälkeinen inkubaatioaika, — kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista, — viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin. Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä: i) laatukontrollitietojen hyväksyttävyys verrattuna aikaisempia eriä koskeviin tietoihin; ii) positiivisten ja negatiivisten kontrollien hyväksyttävyys verrattuna positiivisten ja negatiivisten kontrollien keskiarvoihin ja vaihteluväleihin, — käytettyjen arviointitietojen kuvaus, mukaan luettuina ennustettavuusmallin raja-arvojen valinnan perusteet. Tulokset: — yksittäisistä testinäytteistä saadut tulokset taulukkomuodossa, — kuvaus muista havaituista vaikutuksista. Tulosten tarkastelu. Päätelmät. 4. LÄHDELUETTELO 1. United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Saatavilla internetosoitteessa: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Saatavilla internetosoitteessa: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Testimenetelmä B.4. AKUUTTI TOKSISUUS: IHOÄRSYTTÄVYYS/-SYÖVYTTÄVYYS. 4. Testimenetelmä B.40. IN VITRO -IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHON SÄHKÖVASTUSMÄÄRITYSTESTI (TER) 5. Testimenetelmä B.40a. IN VITRO -IHOSYÖVYTTÄVYYS: IHMISIHOMALLITESTI 6. OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Hyväksytty 19. heinäkuuta 2006. Saatavilla internetosoitteessa: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, s. 57–93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, s. 765–770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, s. 107–114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, s. 351–367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, s. 329–249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, s. 109–129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, s. 559–601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 s. + liitteet. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, s. 603–619. 17. J. Cotovio, M.–H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy -Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, s. 351–358. 18. ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5. marraskuuta 2008. 19. EC (2006). Kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annettu Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006. Euroopan unionin virallinen lehti L 396, s. 1, 30.12.2006. OPOCE, Luxembourg. 20. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, s. 55–63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (Tammikuu 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (Lokakuu 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lammintausta, K, Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, s 7–18 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13. marraskuuta, 2008. Lisäys Ehdotetun rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia käyttävän in vitro -ihoärsytystestin suorituskykyominaisuuksien arviointi JOHDANTO Tämän testimentelmän nojalla käytettäväksi ehdotettavat menettelyt olisi arvioitava niin luotettavuuden ja tarkkuuden määrittämiseksi käyttämällä aineita, jotka kuvastavat koko Draizen ihoärsytyksen pisteytysasteikkoa. Kun ehdotettu menettely arvioidaan käyttämällä 20 suositeltua vertailuainetta (taulukko 2), sen luotettavuus- ja tarkkuusarvojen olisi oltava vastaavat kuin validoidulla vertailumenetelmällä 1 (taulukko 3) saadut arvot (1). Jäljempänä II ja III kohdassa annetaan tarkkuus- ja luotettavuusarvot, jotka olisi saavutettava. Näihin on sisällytetty asiaan vaikuttaviin kemiallisiin luokkiin kuuluvat luokittelemattomat ja luokitellut (YK:n GHS-luokka 2) aineet, jotta ehdotetun testimenetelmän luotettavuus- ja suorituskykyarvoja (herkkyys, spesifisyys, väärät negatiiviset ja positiiviset arvot sekä tarkkuus) voidaan verrata validoidulla vertailumenetelmä 1:llä saatuihin arvoihin. Testimentelmän luotettavuus sekä sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-luokkaan 2 kuuluvat ärsytystä aiheuttavat aineet olisi määritettävä ennen se käyttämistä uusien aineiden testaamiseen. SUORITUSVAATIMUKSET Suoritusvaatimuksiin kuuluu kolme seuraavaa osatekijää: I) Testimenetelmän oleelliset osat, II) Vertailuaineet ja III) Määritellyt tarkkuus- ja luotettavuusarvot (2). Nämä suoritusvaatimukset perustuvat ECVAMin ihoärsytystä validointitutkimuksen suorittamisen jälkeen määriteltyihin suoritusvaatimuksiin (3). I) Testimenetelmän oleelliset osat Mallin yleiset ehdot Epiteelin valmistamiseen on käytettävä normaaleja ihmisen keratinosyyttejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä olisi oltava useita kerroksia ja tarvittava lipidiprofiili, jotta se voi tarjota toimivan esteen ja kykenee torjumaan solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten SDS:n tai Triton X-100:n, nopean läpäisyn. Läpäisyn estokykyä voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa merkkiaine vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC50) vahvistetun altistusajan jälkeen, tai määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 prosentilla (ET50) applikoitaessa tietyn ja vahvistetun pitoista merkkiainetta. Mallin on oltava sellainen, että marraskeden ympärillä olevan materiaalin pääsy elävään kudokseen estyy, koska se heikentäisi mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. Ihomallissa ei saa olla kontaminaatiota (esim. bakteerit, virukset, mykoplasmat tai sieni-itiöt). Mallin toimintaa koskevat ehdot Solujen elinkyky Elinkyvyn määrityksessä suositellaan käytettäväksi MTT:tä (4). Negatiivisella kontrollilla käsitellystä kudoksesta uutetun (liuotetun) väriaineen optisen tiheyden (OD) on oltava ainakin 20 kertaa suurempi kuin uuttamisliuottimen OD-arvo. Olisi dokumentoitava, että negatiivisella kontrollilla käsitellyn kudoksen on oltava stabiili viljelyssä (solujen elinkykyä koskevien mittaustulosten on oltava samanlaisia) koko testiin liittyvän altistusajan. Läpäisyn esto Marraskeden ja sen rasvakoostumuksen olisi oltava riittävä estämään solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten SDS:n tai Triton X-100:n nopea läpäisy, kuten on arvioitu IC50:llä tai ET50:llä. Morfologia Asianmukaisen pätevyyden omaavan henkilöstön olisi suoritettava rekonstruoidun ihon/orvaskeden histologinen tutkimus, jolla osoitetaan, että rekonstruktiolla on vastaava rakenne kuin ihmisiholla/ihmisorvaskedellä (myös monikerroksinen marraskesi). Uusittavuus Tiettyä mallia käyttävän menetelmän tulokset olisi voitava uusia ajan myötä mieluiten asianmukaisella erän kontrolliaineella (vertailuaineella) (ks. määritelmät kohdassa 1.2). Mallin laatukontrollit Kunkin orvaskesimallierän olisi täytettävä määritellyt tuotannon vapauttamisperusteet, joiden joukosta elinkykyisyyttä ja läpäisyn estoa koskevat perusteet ovat merkityksellisimmät. Ihomallin tuottajan (tai sisäistä mallia käytettäessä tarkastajan) olisi annettava IC50:n tai ET50:n hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo). Laboratorion olisi kudokset saatuaan todennettava niiden läpäisynesto-ominaisuudet. Ainoastaan hyväksytyillä kudoksilla saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi ärsytyksen vaikutuksista. Validoitujen vertailumenetelmien hyväksyttävyyden vaihteluvälit annetaan esimerkkinä jäljempänä. Taulukko 1 Esimerkkejä laatukontrollin eränvapauttamisperusteista Alempi hyväksyttävyysraja Hyväksyttävyyden keskiarvo Ylempi hyväksyttävyysraja Validoitu vertailumenetelmä 1 (18 tunnin käsittely SDS:llä) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validoitu vertailumenetelmä 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 tuntia ET50 = 6,7 tuntia ET50 = 8,7 tuntia II) Vertailuaineet Vertailuaineita käytetään määrittämään, onko ehdotetun uuden rekonstruoitua ihmisorvaskettä käyttävän in vitro -testimenetelmän, jonka luotettavuuden ja tarkkuuden on osoitettu olevan rakenteellisesti ja toiminnallisesti riittävässä määrin validoituja vertailumenetelmiä vastaava, tai validoidun vertailumenetelmän vähäistä muutosta edustava suorituskyky vastaava kuin validoidun vertailumenetelmän 1 (1). Taulukossa 20 lueteltuihin vertailuaineisiin kuuluu muihin asiaa koskeviin kemiallisiin luokkiin sekä YK:n GHS-luokkaan 2 kuuluvia aineita. Tässä luettelossa on 10 YK:n GHS-luokkaan 2 kuuluvaa ainetta, 3 YK:n GHS:n vaihtoehtoiseen luokkaan 3 kuuluvaa ainetta ja 7 luokittelematonta ainetta. Tässä testimenetelmässä YK:n GHS:n vaihtoehtoista luokkaa 3 ei pidetä luokkana. Vertailuaineet ovat niiden aineiden vähimmäismäärä, joita olisi käytettävä arvioitaessa ehdotetun rekonstruoitua ihmisorvaskettä käyttävän testimenetelmän tarkkuutta ja luotettavuutta ihoärsytyksen havaitsemisessa. Jos lueteltuja aineita ei ole saatavissa, olisi käytettävä muita aineita, joista on riittävästi in vivo -vertailutietoja. Vertailuaineiden vähimmäisluetteloon voidaan haluttaessa lisätä muihin kemiallisiin luokkiin kuuluvia aineita, joista on riittävästi in vivo -vertailutietoja ehdotetun testimenetelmän tarkkuuden lisäarviointeja varten. Taulukko 2 Rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia käyttävien ihoärsytystestien tarkkuus- ja luotettavuusrajojen määrittämisessä käytettävät vertailuaineet Aine (1) CAS-nro EINECS-nro Fysikaalinen olomuoto In vivo -tulos GHS- in vitro -luokitus GHS- in vivo -luokitus 1-bromi-4-klooributaani 6940-78-9 230-089-3 neste 0 luokka 2 ei luokitusta dietyyliftalaatti 84-66-2 201-550-6 neste 0 ei luokitusta ei luokitusta naftaleenietikkahappo 86-87-3 201-705-8 kiinteä 0 ei luokitusta ei luokitusta allyylifenoksiasetaatti 7493-74-5 231-335-2 neste 0,3 ei luokitusta ei luokitusta isopropanoli 67-63-0 200-661-7 neste 0,3 ei luokitusta ei luokitusta 4-(metyylitio)-bentsaldehydi 3446-89-7 222-365-7 neste 1 luokka 2 ei luokitusta metyylistearaatti 112-61-8 203-990-4 kiinteä 1 ei luokitusta ei luokitusta heptyylibutyraatti 5870-93-9 227-526-5 neste 1,7 ei luokitusta Valinnainen luokka 3 heksyylisalisylaatti 6259-76-3 228-408-6 neste 2 ei luokitusta Valinnainen luokka 3 tri-isobutyylifosfaatti 126-71-6 204-798-3 neste 2 luokka 2 Valinnainen luokka 3 1-dekanoli 112-30-1 203-956-9 neste 2,3 luokka 2 luokka 2 syklameenialdehydi 103-95-7 203-161-7 neste 2,3 luokka 2 luokka 2 1-bromiheksaani 111-25-1 203-850-2 neste 2,7 luokka 2 luokka 2 2-kloorimetyyli-2,5-dimetyyli-4-metoksipyridiinihydrokloridi 86604-75-3 434-680-9 kiinteä 2,7 luokka 2 luokka 2 a-terpineoli 98-55-5 202-680-6 neste 2,7 luokka 2 luokka 2 di-n-propyylidisulfidi 629-19-6 211-079-8 neste 3 ei luokitusta luokka 2 butyylimetakrylaatti 97-88-1 202-615-1 neste 3 luokka 2 luokka 2 bentseenitioli, 5-(1,1-dimetyylietyyli)-2-metyyli 7340-90-1 438-520-9 neste 3,3 luokka 2 luokka 2 1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini 5271-27-2 431-180-2 kiinteä 3,3 luokka 2 luokka 2 heptanaali 111-71-7 203-898-4 neste 4 luokka 2 luokka 2 Taulukossa 2 luetellut aineet ovat edustava otos niistä 58 aineesta, joita käytettiin ECVAMin kansainvälisessä ihoärsytyksen validointitutkimuksessa (1). Ne valittiin seuraavilla perusteilla: — aineet ovat kaupallisesti saatavilla, — ne edustavat koko Draizen ärsyttävyyspisteytysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään), — niiden kemiallinen rakenne on tarkkaan määritetty, — niillä tehdyt testit ovat uusittavissa ja ennustettavissa, validoidun menetelmän tapaan, ECVAMin validointitutkimuksen mukaisesti, — niiden kemiallinen toimivuus on sama kuin validointiprosessissa käytettyjen kemikaalien, — niillä ei ole erittäin toksisia ominaisuuksia (esim. karsinogeenisiä tai lisääntymisjärjestelmälle myrkyllisiä ominaisuuksia) eivätkä niiden loppukäsittelykustannukset saa olla niin suuret, että ne estäisivät menetelmän käytön. III) Määritellyt tarkkuus- ja luotettavuusarvot Ehdotetun testimenetelmän suorituskyvyn (herkkyys, spesifisyys, väärät negatiiviset tai positiiviset arvot ja tarkkuus) pitäisi olla vastaavat kuin vertailumenetelmän 1 (taulukko 3) arvot, eli herkkyyden olisi oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 80 % ja spesifisyys olisi oltava yhtä suuri tai suurempi (≥) kuin 70 %, ja tarkkuuden olisi oltava yhtä suuri tai suurempi (≥) kuin 75 %. Suorituskyvyn laskemisessa olisi käytettävä kaikkia 20 aineen luokituksia, jotka on saatu osallistuvissa laboratorioissa tehdyissä testeissä. Kaikki aineet olisi luokiteltava kussakin laboratoriossa eri testikerroilla (vähintään kolme testikertaa) saatujen elinkykyä osoittavien arvojen keskiarvojen mukaisesti. Taulukko 3 Validoidun vertailumenetelmän 1 (2) suorituskyky Testimenetelmä Aineiden lukumäärä Herkkyys Spesifisyys Väärien negatiivisten tulosten osuus Väärien positiivisten tulosten osuus Tarkkuus Validoitu vertailumenetelmä 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Validoitu vertailumenetelmä 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Ehdotetun testimenetelmän luotettavuuden pitäisi olla vastaava kuin validoidun vertailumenetelmän luotettavuus. Laboratorionsisäinen uusittavuus Laboratorionsisäisen vaihtelun arvioinnin olisi osoitettava, että yhdessä laboratoriossa 20 vertailuaineella suoritetuilla yksittäisillä ja erillisillä testikierroksilla saatujen luokitusten (luokka 2 tai ei luokitusta) vastaavuus on yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 90 %. Laboratorioiden välinen uusittavuus Laboratorioiden välinen uusittavuus ei ole oleellista, jos ehdotettua testimenetelmää käytetään vain yhdessä laboratoriossa. Jotta menetelmiä voitaisiin siirtää laboratorioiden välillä, olisi mieluiten kolmen eri laboratorion välillä 20 vertailuaineella suoritetuilla yksittäisillä ja erillisillä testikierroksilla saatujen luokitusten (luokka 2 tai ei luokitusta) vastaavuus oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 80 %. LÄHDELUETTELO 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, s. 559–601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Saatavilla kohdassa Download Study Documents verkkosivulla http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Linkkiä kokeiltu 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, s. 55–63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, s. 603–619. (1) Nämä 20 vertailuainetta ovat edustava otos niistä 58 aineesta, joita käytettiin alun perin vertailumenetelmän 1 (EpiSkin™) validoinnissa. Täydellinen luettelo testiaineista ja niiden valinnassa käytetyistä perusteista on saatavilla (5). (2) Taulukossa 3 annetaan validoidun referenssimenetelmän 1 suorituskyky, eli arvio siitä, missä määrin menetelmällä pystytään tunnistamaan oikein ärsytystä aiheuttavat aineet (YK:n GHS-luokka 2) 58 vertailuaineen joukosta ja luokittelemattomat aineet (ei luokitusta ja vaihtoehtoinen luokka 3) 20 vertailuaineen joukosta (taulukko 2). (3) EpiSkin™ (4) Validointiin kuuluu 13 GHS-luokkaan 2 kuuluvaa ärsyttävää ainetta. (5) Validointiin kuuluu 45 GHS-luokkaan 3 kuuluvaa ärsyttävää ainetta tai ainetta, joilla ei ole GHS-luokitusta.

LIITE IV C.3. MAKEAN VEDEN LEVIEN JA SYANOBAKTEERIEN KASVUNESTYMISTESTI 1. MENETELMÄ Tämä menetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 201, 2006 (1). 1.1 JOHDANTO Testimenetelmiä tarkistetaan ja päivitetään säännöllisesti tieteen kehityksen perusteella. Testimenetelmää C.2 oli tarkistettava, jotta siihen olisi voitu lisätä uusia lajeja ja jotta olisi voitu täyttää vaaranarviointia ja kemikaalien luokitusta koskevat vaatimukset. Tarkistus perustuu laajaan käytännön kokemukseen, tieteen kehitykseen leviin kohdistuvien myrkyllisyystutkimusten alalla sekä testimenetelmän aiemman version laajaan käyttöön sääntelyssä. 1.2 MÄÄRITELMÄT Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä ja lyhenteitä: Biomassa: Populaatiossa olevan elävän materiaalin kuivapaino ilmaistuna tiettyä tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Yleensä ”biomassa” määritellään massaksi, mutta tässä testissä sillä tarkoitetaan massaa tilavuutta kohden. Tässä testissä biomassaa mitataan usein myös epäsuorasti esimerkiksi solumäärien ja fluoresenssin avulla, minkä vuoksi ”biomassa”-termi käsittää myös nämä korvaavat menetelmät. Variaatiokerroin: Parametrin vaihtelua ilmaiseva dimensioton suure, joka määritellään keskihajonnan ja keskiarvon suhteeksi. Se voidaan ilmaista myös prosenttiarvona. Rinnakkaisten kontrolliviljelmien keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaatiokerroin lasketaan seuraavasti: 1. Keskimääräisen spesifisen kasvunopeuden variaatiokerroin lasketaan (prosentteina) kunkin rinnakkaisviljelmän päivittäisistä tai jaksoittaisista kasvunopeuksista. 2. Lasketaan kaikkien kohdassa 1 laskettujen arvojen keskiarvo, jotta saadaan rinnakkaisten kontrolliviljelmien päivittäisen tai jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden keskimääräinen variaatiokerroin. ECx: Testiviljelyaineeseen liuenneen testiaineen pitoisuus, jossa testattavan eliön kasvu vähenee x prosenttia (esimerkiksi 50 prosenttia) määrätyn altistusajan kuluessa (altistusaika on mainittava erikseen, jos se poikkeaa testin kokonaiskestosta tai normaalista kestosta). Jotta kasvunopeudesta ja tuotoksesta johdetut EC-arvot erottuisivat selvästi toisistaan, edellisestä käytetään symbolia ”ErC” ja jälkimmäisestä symbolia ”EyC”. Viljelyaine: Täydellinen synteettinen ravinneliuos, jossa testilevät kasvavat, kun ne altistetaan testiaineelle. Yleensä testiaine on liuennut testiviljelyaineeseen. Kasvunopeus (keskimääräinen spesifinen kasvunopeus): Biomassan logaritminen kasvu altistuksen aikana. Pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC): Pienin testattu pitoisuus, jossa aineella havaitaan olevan tietyn altistusajan kuluessa tilastollisesti merkittävä kasvua vähentävä vaikutus verrattuna kontrolliin (kun p < 0,05). Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on oltava vähintään yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu. Pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC): Lähin LOEC-pitoisuutta pienempi testipitoisuus. Vastemuuttuja: Muuttuja, jonka avulla arvioidaan myrkyllisyyttä. Vastemuuttuja johdetaan erilaisia laskentamenetelmiä käyttämällä mistä tahansa mitatusta muuttujasta, joka kuvaa biomassaa. Tässä menetelmässä kasvunopeudet ja tuotos ovat vastemuuttujia, jotka on johdettu mittaamalla biomassaa suoraan tai käyttämällä edellä mainittuja korvaavia menetelmiä. Spesifinen kasvunopeus: Vastemuuttuja, joka määritellään havainnoitavan parametrin (tässä testimenetelmässä biomassan) luonnollisten logaritmien erotuksen ja vastaavan ajanjakson väliseksi suhteeksi. Tuotos: Altistusajan lopussa mitattu biomassaa ilmaisevan mittausmuuttujan arvo, josta on vähennetty altistusajan alussa mitattu saman mittausmuuttujan arvo. 1.3 TESTIN SOVELTAMISALA Tätä testimenetelmää voidaan parhaiten soveltaa vesiliukoisiin aineisiin, jotka todennäköisesti pysyvät veteen liuenneina testiolosuhteissa. Testattaessa aineita, jotka ovat haihtuvia, voimakkaasti adsorboivia, värillisiä tai huonosti veteen liukenevia, tai aineita, jotka voivat vaikuttaa testiviljelyaineessa olevien ravinteiden tai kivennäisaineiden saantiin, voi olla tarpeen tehdä tiettyjä mukautuksia tässä kuvattuun menetelmään (esimerkiksi suljettu järjestelmä ja koeastioiden erityisvalmistelu). Kirjallisuusviitteissä (2), (3) ja (4) annetaan ohjeita joistakin sopivista mukautuksista. 1.4 TESTIN PERIAATE Testin tavoitteena on määrittää testattavan aineen vaikutukset makean veden viherlevien ja/tai syanobakteereiden kasvuun. Eksponentiaalisesti kasvavat koe-eliöt altistetaan testiaineelle panosviljelmissä yleensä 72 tunnin ajan. Vaikka testi on suhteellisen lyhyt, sillä voidaan arvioida useaan sukupolveen kohdistuvia vaikutuksia. Järjestelmän vasteena on kasvun väheneminen sarjassa leväviljelmiä (testiyksiköitä), jotka on altistettu testiaineen eri pitoisuuksille. Vastetta arvioidaan altistuspitoisuuden funktiona vertaamalla sitä rinnakkaisten, altistumattomien kontrolliviljelmien keskimääräiseen kasvuun. Jotta järjestelmän vaste myrkkyvaikutuksiin ilmenisi kokonaan (optimaalinen herkkyys), viljelmien kasvua ei rajoiteta vaan niiden annetaan kasvaa eksponentiaalisesti olosuhteissa, joissa on riittävästi ravinteita ja valonsaanti on jatkuvaa, kunnes spesifisen kasvunopeuden pieneneminen on mitattavissa. Kasvua ja kasvun estymistä kvantifioidaan mittaamalla leväbiomassa ajan funktiona. Leväbiomassa määritetään kuivapainona tilavuutta kohden, esimerkiksi milligrammoina levää yhtä litraa testiliuosta kohden. Kuivapainoa on kuitenkin vaikea mitata, minkä vuoksi käytetään korvaavia parametreja. Useimmin käytettyjä ovat solumäärät. Muita korvaavia parametreja ovat muun muassa solutilavuus, fluoresenssi ja optinen tiheys. Mitatun korvaavan parametrin ja biomassan välinen muuntokerroin on tunnettava. Testin loppupisteenä on kasvun estyminen, joka ilmenee biomassan logaritmisesta kasvusta (keskimääräisestä spesifisestä kasvunopeudesta) altistusaikana. Testiliuossarjassa mitattujen keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien avulla määritetään pitoisuus, jossa kasvunopeus vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan ErCx-arvona (esimerkiksi ErC50). Käytettäessä tätä menetelmää EU:n sääntelykehyksessä pitäisi tulokset laskea keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien perusteella jäljempänä 2.2 kohdassa selostetuista syistä. Toinen testimenetelmässä käytetty vastemuuttuja on tuotos, jota voidaan tarvita joissakin maissa erityisten sääntelyvaatimusten täyttämiseksi. Tuotoksella tarkoitetaan altistusajan lopussa mitatun biomassan ja altistusajan alussa mitatun biomassan erotusta. Testiliuossarjassa mitatun tuotoksen avulla määritetään pitoisuus, jossa tuotos vähenee ennalta määrätyn prosenttimäärän x verran (esimerkiksi 50 prosenttia). Kyseinen pitoisuus ilmoitetaan EyCx-arvona (esimerkiksi EyC50). Tilastollisesti voidaan määrittää myös pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) sekä pitoisuus, joka ei aiheuta havaittavaa vaikutusta (NOEC). 1.5 TESTIAINETTA KOSKEVAT TIEDOT Testiainetta koskevia tietoja, joista voi olla hyötyä päätettäessä testiolosuhteista, ovat rakennekaava, puhtaus, stabiilius valossa, stabiilius testiolosuhteissa, valonabsorbointiominaisuudet, pKa ja muuntumistutkimusten tulokset, mukaan luettuna biohajoavuus vedessä. Testiaineen vesiliukoisuus, oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin (Pow) ja höyrynpaine on tunnettava, ja testiliuoksissa olevan testiaineen kvantifioimiseen tarvitaan validoitu menetelmä, jonka saantoteho ja havaitsemisraja tunnetaan. 1.6 VERTAILUAINE Testimenetelmä voidaan tarkistaa testaamalla vertailuaine (-aineet), kuten 3,5-dikloorifenoli, jota on käytetty kansainvälisessä yhteistutkimuksessa (4). Viherleviä viljeltäessä vertailuaineena voidaan käyttää myös kaliumdikromaattia. Vertailuaine olisi hyvä testata vähintään kahdesti vuodessa. 1.7 TESTIN VALIDITEETTI Jotta testi olisi validi, sen on täytettävä seuraavat vaatimukset: — Biomassan on täytynyt kasvaa kontrolliviljelmissä eksponentiaalisesti vähintään 16-kertaiseksi 72 tunnin testijakson aikana. Tämä vastaa spesifistä kasvunopeutta 0,92 päivää kohden. Useimmin käytetyillä lajeilla kasvunopeus on yleensä huomattavasti suurempi (ks. lisäys 1). Tämä vaatimus ei välttämättä täyty käytettäessä lajeja, jotka kasvavat hitaammin kuin lisäyksessä 1 luetellut lajit. Siinä tapauksessa testijaksoa on pidennettävä, jotta kontrolliviljelmissä saavutettaisiin vähintään 16-kertainen kasvu, ja kasvun on oltava eksponentiaalista koko testijakson ajan. Testijaksoa voidaan lyhentää 48 tuntiin saakka rajoittamattoman eksponentiaalisen kasvun ylläpitämiseksi koko testin ajan, jos kasvukerroin on vähintään 16. — Kontrolliviljelmien jaksoittaisten spesifisten kasvunopeuksien (72 tunnin testeissä päivät 0–1, 1–2 ja 2–3) keskimääräinen variaatiokerroin (ks. ”Variaatiokerroin” kohdassa 1.2) saa olla enintään 35 prosenttia. Jaksoittaisen spesifisen kasvunopeuden laskemista käsitellään jäljempänä kohdassa 2.2.1. Tämä vaatimus koskee rinnakkaisia kontrolliviljelmiä varten laskettujen variaatiokertoimien keskiarvoa. — Rinnakkaisten kontrolliviljelmien keskimääräisten spesifisten kasvunopeuksien variaatiokerroin saa olla koko testijakson aikana enintään 7 prosenttia, jos testeissä käytetään lajeja Pseudokirchneriella subcapitata ja Desmodesmus subspicatus. Käytettäessä muita, harvemmin testattuja lajeja tämä arvo saa olla enintään 10 prosenttia. 1.8 MENETELMÄN KUVAUS 1.8.1 Välineet Koeastioiden ja muiden välineiden, jotka joutuvat kosketuksiin test