91/180/ETY: Komission päätös, tehty 14 päivänä helmikuuta 1991, tietyistä raakamaidon ja lämpökäsitellyn maidon analyysi- ja testausmenetelmistä



Virallinen lehti nro L 093 , 13/04/1991 s. 0001 - 0048

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 37 s. 0012

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 37 s. 0012



KOMISSION PÄÄTÖS, tehty 14 päivänä helmikuuta 1991, tietyistä raakamaidon ja lämpökäsitellyn maidon analyysi- ja testausmenetelmistä (91/180/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön sisäiseen lämpökäsitellyn maidon kauppaan vaikuttavista terveydellisistä ja eläinten terveyteen liittyvistä ongelmista 5 päivänä elokuuta 1985 annetun neuvoston direktiivin 85/397/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 89/662/ETY(2), ja erityisesti sen 10 artiklan 2 kohdan, sekä katsoo, että direktiivin 85/397/ETY 10 artiklan 2 kohdan mukaan komissio antaa analyysi- ja testausmenetelmät raakamaitoon ja lämpökäsiteltyyn maitoon liittyvien vaatimusten noudattamisen tarkastamiseksi, raakamaidon osalta on tarpeen määrätä erityisesti menetelmistä, joilla määritetään pesäkeluku, solupitoisuus, jäätymispiste ja antibioottien esiintyminen, pastöroidun maidon osalta on tarpeen määrätä erityisesti menetelmistä, joilla määritetään patogeenit, koliryhmän bakteerien määrä, pesäkeluku, fosfataasin ja peroksidaasin aktiivisuus, antibiootit ja jäätymispiste, steriloidun maidon ja iskukuumennetun maidon osalta (ultrakorkea lämpötila) on tarpeen määrätä erityisesti menetelmistä, joilla voidaan määrittää pesäkeluku ja antibiootit, on teknisistä syistä asianmukaista ensimmäiseksi määrätä analyysin ja testauksen vertailumenetelmistä tiettyjen vaatimusten noudattamisen varmistamiseksi; on erityisesti välttämätöntä jatkaa niiden olosuhteiden tutkimista, joissa rutiini-, analyysi- ja testausmenetelmiä on sovellettava; ennen tämän tutkimuksen tulosten saamista on toimivaltaisten viranomaisten vastuulla käyttää asianmukaisia rutiinimenetelmiä direktiivissä 85/397/ETY säädettyjen vaatimusten noudattamisen varmistamiseksi, analyysin ja testauksen vertailumenetelmiin sisältyy käytettävien analyysimenetelmien esittäminen ja täsmällisyyskriteereistä määrääminen tulosten yhdenmukaisen tulkinnan varmistamiseksi, ja tässä päätöksessä määrätyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset, ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN: 1 artikla Raakamaidon analyysin ja testauksen vertailumenetelmät ovat seuraavat: - jäätymispisteen määrittäminen, - mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 30 °C:ssa, - somaattisten solujen laskeminen, - antibioottien ja sulfonamidien toteaminen. 2 artikla Pastöroidun maidon analyysin ja testauksen vertailumenetelmät ovat seuraavat: - jäätymispisteen määrittäminen, - fosfataasiaktiivisuuden määrittäminen, - peroksidaasiaktiivisuuden määrittäminen, - mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 30 °C:ssa, - mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 21 °C:ssa, - koliryhmän bakteerien määrittäminen - pesäkemäärä 30 °C:ssa, - antibioottien ja sulfonamidien toteaminen, - patogeenisten mikro-organismien toteaminen. 3 artikla Iskukuumennetun maidon ja steriloidun maidon analyysin ja testauksen vertailumenetelmät ovat seuraavat: - mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 30 °C:ssa, - jäätymispisteen määrittäminen, - antibioottien ja sulfonamidien toteaminen. 4 artikla Analyysin ja testauksen vertailumenetelmät ja sovellettavat täsmällisyyskriteerit on otettava käyttöön ja näytteiden ottaminen on suoritettava liitteessä I vahvistettuja määräyksiä noudattaen. 5 artikla Edellä 1, 2 ja 3 artiklassa tarkoitetut analyysin ja testauksen vertailumenetelmät esitetään liitteessä II. 6 artikla Tätä päätöstä tarkastellaan 31 päivään joulukuuta 1992 mennessä uudelleen tieteellisen ja teknisen tietämyksen kehityksen huomioon ottamiseksi. 7 artikla Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 14 päivänä helmikuuta 1991. Komission puolesta Ray MAC SHARRY Komission jäsen (1) EYVL N:o L 226, 24.8.1985, s. 13 (2) EYVL N:o L 395, 30.12.1989, s. 13 LIITE I SISÄLTÖ Sivu I Yleiset määräykset ... 4 II Näytteenotto raakamaidosta ja lämpökäsitellystä maidosta ... 6 I YLEISET MÄÄRÄYKSET 1 Johdanto Tässä esitetään reagensseja, laitteita, tulosten ilmoittamista, täsmällisyyttä ja analyysiraportteja koskevat yleiset säännökset. Jäsenvaltioiden toimivaltaisten viranomaisten ja näytteenotosta ja maidon testauksesta huolehtivien laboratorioiden on noudatettava yleisiä määräyksiä. 2 Reagenssit 2.1 Vesi 2.1.1 Jollei toisin määrätä, on aina kun mainitaan vettä käytettävän liuottamiseen, laimentamiseen tai huuhtelemiseen, käytettävä tislattua vettä, deionisoitua vettä tai vähintään yhtä puhdasta demineralisoitua vettä. Mikrobiologisia analyysejä varten vedessä ei saa olla sellaisia aineita, jotka saattaisivat vaikuttaa mikro-organismien kasvuun testioloissa. 2.1.2 "Liuottamisella" tai "laimentamisella" ilman tarkempaa selitystä, tarkoitetaan "veteen liuottamista" tai "vedellä laimentamista". 2.2 Kemikaalit Kaikkien käytettävien kemikaalien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua, jollei toisin määrätä. 3 Laitteet 3.1 Laiteluettelot Eri vertailumenetelmissä annetuissa laiteluetteloissa on mainittu vain erikoiskäyttöön tarkoitetut laitteet tai teknisiltä ominaisuuksiltaan tietynlaiset laitteet. 3.2 Analyysivaaka `Analyysivaa'alla` tarkoitetaan vaakaa, jolla pystytään punnitsemaan 0,1 mg:n tarkkuudella. 4 Tulosten ilmoittaminen 4.1 Tulokset Jollei toisin määrätä, analyysiraportissa esitettyjen tulosten olisi oltava kahdessa kyseistä menetelmää varten annetun toistettavuuskriteerin (5.1 kohta) täyttävässä testissä saadun arvon matemaattinen keskiarvo. Jos toistettavuuskriteeri ei täyty, testi on toistettava tai tulos julistettava mitättömäksi. 4.2 Prosenttiosuuden laskeminen Jollei toisin määrätä, tulos lasketaan prosenttiosuutena näytteen painosta. 5 Täsmällisyyskriteerit: toistettavuus ja uusittavuus 5.1 Kutakin menetelmää varten annetut täsmällisyyskriteerit määritellään seuraavasti: 5.1.1 Toistettavuus (r) on arvo, jonka alapuolella kahden erillisen samalla menetelmällä samanlaisella testimateriaalilla samoissa oloissa (sama testaaja, samat laitteet, sama laboratorio, ja lyhyt väliaika) saadun testituloksen absoluuttinen erotus on. 5.1.2 Uusittavuus (R) on arvo, jonka alapuolella kahden erillisen samalla menetelmällä samanlaisilla testimateriaalilla eri oloissa (eri testaajat, eri laitteet, eri laboratorio, ja/tai eri ajankohta) saadun testituloksen absoluuttinen erotus on. 5.1.3 Jollei toisin määrätä, kutakin menetelmää koskevassa kohdassa määrätyt toistettavuus- ja uusittavuuskriteerit edustavat 95 %:n luotettavuustasovälejä, jotka on määritelty ISO 5725-standardissa, toinen painos 1986. Ne on laskettu tunnettujen kollaboratiivisten tutkimusten tuloksista, joita on käytetty menetelmän arvioinnissa. Joissakin menetelmissä ei kuitenkaan ole suoritettu kollaboratiivisia tutkimuksia. Siinä tapauksessa toistettavuus- ja uusittavuusarvot on arvioitu. 5.1.4 Edellä 5.1.3 kohdassa tarkoitetut kollaboratiiviset kokeet ja tutkimukset olisi suunniteltava ja toteutettava kansainvälisten ohjeiden mukaisesti. 6 Analyysiraportti Analyysiraportissa on ilmoitettava käytetty analyysimenetelmä ja saadut tulokset. Siinä on lisäksi ilmoitettava mahdolliset menetelmien yksityiskohdat, joita ei ole kuvattu analyysimenetelmässä tai jotka ovat valinnaisia, sekä mahdolliset muut seikat, jotka ovat saattaneet vaikuttaa saatuihin tuloksiin. Analyysiraportissa annetaan kaikki näytteen täydelliseen tunnistamiseen tarvittavat tiedot. II NÄYTTEENOTTO RAAKAMAIDOSTA JA LÄMPÖKÄSITELLYSTÄ MAIDOSTA 1 Tarkoitus ja käyttöalue Tässä kuvataan vertailumenetelmä raakamaidon ja lämpökäsitellyn maidon näytteenotolle. Näytteenottomenetelmät ja näytteiden kuljetus- ja säilytysmenetelmät soveltuvat tuottajien luovuttamaan raakamaitoon sekä säilytys- ja kuljetussäiliöissä olevaan raakamaitoon ja lämpökäsiteltyyn maitoon. Jäljempänä 2, 4.4, 5 ja 6 kohdassa annetut menetelmät soveltuvat näytteenottoon suoraan kulutukseen tarkoitetusta lämpökäsitellystä maidosta. 2 Yleistä Ammattitaitoinen henkilö, joka on saanut asianmukaisen koulutuksen ennen näytteenottoon ryhtymistä, suorittaa näytteenoton tonkissa, säiliöissä jne. olevasta maidosta. Toimivaltaiset viranomaiset tai testauslaboratorio antavat, jos ne katsovat sen tarpeelliseksi, näytteenottohenkilöstölle opastusta näytteenottotekniikoissa sen varmistamiseksi, että näyte on koko erää edustava ja yhdenmukainen sen kanssa. Toimivaltaiset viranomaiset tai testauslaboratorio antavat, jos ne katsovat sen tarpeelliseksi, näytteenottohenkilöstölle opastusta näytteen merkitsemisessä näytteen yksiselitteisen tunnistettavuuden varmistamiseksi. 3 Näytteenottolaitteet 3.1 Yleistä Näytteenottolaitteiden on oltava ruostumatonta terästä tai muuta riittävän lujaa sopivaa ainetta ja rakenteeltaan aiottuun tarkoitukseen sopivia (sekoittaminen, näytteenotto jne.). Nesteiden sekoittamiseen astioissa tarkoitettujen hämmentimien ja sekoitinten pinta-alan on oltava riittävän suuri, jotta ne saavat aikaan tuotteen riittävän sekoittumisen ilman että alkaa kehittyä eltaantunutta makua. Näytteenottokauhoissa on oltava kestävä, riittävän pitkä varsi, jotta astiasta voidaan ottaa näyte mistä tahansa syvyydestä. Näytteenottokauhan tilavuuden on oltava vähintään 50 ml. Näyteastioiden ja sulkijoiden olisi oltava lasia, sopivaa metallia tai muovia. Materiaalit, joista näytteenottolaitteet (mukaan lukien astiat ja sulkijat) on valmistettu, eivät saa aiheuttaa näytteessä mitään muutosta, joka saattaisi vaikuttaa tutkimuksen tuloksiin. Näytteenottolaitteiden ja näyteastioiden kaikkien pintojen on oltava puhtaat, kuivat ja sileät, niissä ei saa olla halkeamia, ja kulmien on oltava pyöristetyt. 3.2 Näytteenottolaitteet mikrobiologisia analyysejä varten Näytteenottolaitteiden, mukaan lukien astiat, on 3.1 kohdassa annettujen määräysten lisäksi oltava steriilejä. Jos samoja näytteenottolaitteita käytetään peräkkäisiin näytteenottoihin, ne on puhdistettava ja steriloitava jokaisen näytteenoton jälkeen testauslaboratorion tai toimivaltaisen viranomaisen määräämien ohjeiden tai vaatimusten mukaisesti siten, että peräkkäisten analyysien tulosten luotettavuus voidaan taata. 4 Näytteenottotekniikka 4.1 Yleistä Riippumatta siitä, mitä analyysejä aiotaan suorittaa, maito on ennen näytteenottoa sekoitettava huolellisesti joko manuaalisesti tai mekaanisesti. Näyte otetaan välittömästi sekoittamisen jälkeen, kun maito on vielä liikkeessä. Kun säiliössä olevasta maidosta otetaan samanaikaisesti useita näytteitä eri testejä varten, mikrobiologiseen tutkimukseen tarkoitettu näyte otetaan ensimmäisenä. Näytteen tilavuuden on oltava testivaatimusten mukainen. Käytettävien näyteastioiden on oltava tilavuudeltaan sellaisia, että ne tulevat lähes täyteen näytteestä siten, että niiden sisältö voidaan sekoittaa kunnolla ennen testausta, mutta vältetään kirnuuntuminen kuljetuksen aikana. 4.2 Manuaalinen näytteenotto 4.2.1 Näytteenotto maitoämpäreistä ja -tonkista Jotta saataisiin nopeasti aikaan toivottu liike, hämmennintä liikutellaan ylös ja alas ämpärissä tai tonkassa, ja samalla varmistetaan, että maito sekoittuu kunnolla ja ettei tonkan kaulaan tartu kermaa. Koko erää edustava näyte otetaan 4.2.4 kohdan mukaisesti. 4.2.2 Näytteenotto jäähdytetyistä tilatankeista tai -säiliöistä Maitoa sekoitetaan mekaanisesti tai manuaalisesti, kunnes se on riittävän homogeenista. Jos maidon tilavuus on sellainen, ettei mekaaninen sekoitin voi sekoittaa maitoa, sekoittaminen suoritetaan manuaalisesti. 4.2.3 Näytteenotto punnitusastiasta On tärkeää, että punnitusastiaan kaadettua maitoa sekoitetaan riittävästi. Saattaa olla tarpeen käyttää manuaalista tai mekaanista lisäsekoitusta rasvan tasaisen jakaantumisen varmistamiseksi. Kun sen erän tilavuus, josta näyte otetaan, ylittää punnitusastian tilavuuden, otetaan koko erää edustava näyte 4.2.4 kohdan mukaisesti. 4.2.4 Näytteenotto jaetusta erästä Jos maitomäärä, josta näyte on otettava, on jaettu useampaan kuin yhteen säiliöön, otetaan kustakin säiliöstä edustava määrä maitoa ja kirjaa se maitomäärä, johon kukin näyte liittyy. Jollei kustakin säiliöstä otettuja näytteitä aiota testata erikseen, sekoitetaan näistä edustavista näytteistä keskenään sellaiset osuudet määrinä, jotka ovat suhteessa niiden säiliöiden maitomäärään, joista kukin näyte otettiin. Näistä yhdistetyistä tasasuhteisista määristä otetaan näyte (näytteet) sekoittamisen jälkeen. 4.2.5 Näytteenotto suurista astioista - säilytys-, rautatiekuljetus- ja maantiekuljetussäiliöt 4.2.5.1 Maitoa sekoitetaan sopivalla menetelmällä ennen näytteenottoa. Suurten astioiden tai säilytys-, rautatiekuljetus- tai maantiekuljetussäiliöiden sisällön sekoittamiseen suositellaan mekaanista sekoittamista (4.2.5.2 kohta). Sekoittamisen määrän on oltava suhteessa siihen aikaan, jonka maito on ollut paikallaan. Tietyissä olosuhteissa käytettävän sekoitusmenetelmän tehokkuuden on osoitettava olevan riittävä aiotun analyysin tarkoituksiin; sekoitustehokkuuden kriteerit vaikuttavat erityisesti joko erien eri osista tai säiliön tyhjennysaukosta aika ajoin tyhjennyksen aikana otetuista näytteistä saatujen analyysitulosten väliseen samankaltaisuuteen. Maidon sekoittamismenetelmää pidetään tehokkaana, jos kahden näissä oloissa otetun näytteen rasvapitoisuuden ero on vähemmän kuin 0,1 %. Suuressa astiassa, jonka tyhjennysaukko on pohjassa, saattaa olla tyhjennyskohdassa pieni määrä maitoa, joka ei edusta koko sisältöä sekoittamisenkaan jälkeen. Siksi näytteet olisi mieluummin otettava tarkastusaukon kautta. Jos näytteet otetaan tyhjennysaukosta, juoksutetaan pois riittävästi maitoa sen varmistamiseksi, että näytteet edustavat koko määrää. 4.2.5.2 Suurten astioiden tai säilytys-, rautatiekuljetus- tai maantiekuljetussäiliöiden sisällön sekoittaminen voidaan suorittaa: - mekaanisella sekoittimella, joka on sisäänrakennettu säiliöihin ja käy sähkömoottorilla, - potkurisekoittimella tai sekoittimella, joka käy sähkömoottorilla ja joka sijoitetaan tarkastusaukkoon siten, että sekoitin on maidossa, - kun kyseessä on rautatie- tai maantiekuljetussäiliövaunut, kierrättämällä maitoa vaunun tyhjennyspumppuihin kiinnitetyn ja tarkastusaukosta sisään viedyn siirtoletkun kautta, - puhtaalla suodatetulla paineilmalla. Tässä tapauksessa olisi käytettävä pienintä mahdollista ilmanpainetta ja ilman tilavuutta eltaantuneen maun kehittymisen estämiseksi. 4.3 Automaattinen tai puoliautomaattinen näytteenotto Automaattisia tai puoliautomaattisia näytteenottolaitteita, jotka on tarkoitettu näytteenottoon tuottajien luovuttamasta raakamaidosta, voidaan käyttää testauslaboratorion tai muun toimivaltaisen viranomaisen antamien ohjeiden mukaisesti. Tällaisille laitteille on tehtävä asianmukaiset testit ennen niiden käyttöä ja säännöllisin väliajoin niiden ollessa käytössä vastaavan viranomaisen määräämällä tavalla. Näytteenottomenetelmien sopivuus on varmistettava, jotta voitaisiin osoittaa: - vähimmäistilavuus kerättyä maitoa, joka on sovelias näytteiden ottamiseen, - siirtymämäärä (joka liittyy näytteen vähimmäistilavuuteen), - kyky antaa edustava näyte erästä kunnollisen sekoittamisen jälkeen. Kun käytetään automaattisia tai puoliautomaattisia näytteenottolaitteita, vastaava toimivaltainen kansallinen viranomainen voi määrätä: - pienimmän maitomäärän, josta näytteet on otettava, - näytteen vähimmäistilavuuden, - suurimman siirtymän, - mitä analyysejä voidaan suorittaa tai mihin varotoimiin on ryhdyttävä. 4.4 Näytteenotto suoraan kulutukseen tarkoitetusta vähittäismyyntipakkauksissa olevasta lämpökäsitellystä maidosta Näytteeksi otetaan suoraan kulutukseen tarkoitetusta vähittäismyyntipakkauksissa olevasta lämpökäsitellystä maidosta kokonainen suljettu pakkaus. Jos mahdollista, näytteet on otettava pakkauskoneelta tai kylmävarastosta maidonjalostamossa mahdollisimman pian jalostuksen jälkeen (pastöroidun maidon osalta samana päivänä kuin jalostus tapahtuu). Näytteitä otetaan kunkintyyppisestä lämpökäsitellystä maidosta (pastöroitu, iskukuumennettu ja steriloitu maito) määrinä, jotka vastaavat tehtäviä tutkimuksia ja ovat testauslaboratorion tai muun toimivaltaisen viranomaisen antamien ohjeiden mukaisia. 5 Näytteiden tunnistaminen Näyte merkitään tunnistuskoodilla siten, että se voidaan tunnistaa helposti käyttäen testauslaboratorion tai toimivaltaisen viranomaisen näytteen tunnistamista varten antamia ohjeita (ks. 2 kohta). 6 Näytteiden kuljetus ja säilytys Toimivaltaisten kansallisten viranomaisten suostumuksella testauslaboratorio valmistelee kuljetus- ja säilytysolosuhteita sekä näytteenoton ja analyysin välistä aikaa koskevat ohjeet maitotyypin ja käytettävän analyysimenetelmän mukaisesti. Ohjeissa on määrättävä, että: - kuljetuksen ja säilytyksen aikana on huolehdittava siitä, että estetään maidon altistuminen saastuttaville hajuille ja suoralle auringonvalolle. Jos astia, jossa näytteet ovat, on läpinäkyvä, sitä on säilytettävä pimeässä, - mikrobiologista analyysiä varten otetut raakamaitonäytteet on kuljetettava ja niitä on säilytettävä 0 °C-4 °C:ssa. Näytteenoton ja analyysin välisen ajan on oltava mahdollisimman lyhyt, eikä missään tapauksessa yli 36 tuntia. Toimivaltainen viranomainen voi hyväksyä 0 °C-6 °C:n säilytyslämpötilan, jos näytteenoton ja analyysin välinen aika ei ole yli 24 tuntia, - mikrobiologista analyysiä varten pastöroidusta maidosta otetut näytteet on kuljetettava ja niitä on säilytettävä 0 °C-4 °C:ssa. Näytteenoton ja analyysin välisen ajan on oltava mahdollisimman lyhyt, eikä missään tapauksessa yli 24 tuntia, - mikrobiologista analyysiä varten muusta maidosta kuin raakamaidosta ja pastöroidusta maidosta otettuja näytteitä on säilytettävä laboratoriossa jäähdytettyinä, ja näytteenoton ja analyysin välisen ajan on oltava mahdollisimman lyhyt. Erityiset joitakin analyysejä varten tarvittavat varotoimenpiteet esitetään eri menetelmiä koskevien määräysten yhteydessä. LIITE II SISÄLTÖ Sivu I Jäätymispisteen määrittäminen 1 ... 10 II Fosfataasiaktiivisuuden määrittäminen ... 16 III Peroksidaasiaktiivisuuden määrittäminen ... 19 IV Mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 30 °C:ssa ... 20 V Mikro-organismien määrittäminen - pesäkelaskentamenetelmä 21 °C:ssa ... 25 VI Koliryhmän bakteerien määrittäminen - pesäkemäärä 30 °C:ssa ... 29 VII Somaattisten solujen laskeminen ... 33 VIII Antibioottien ja sulfonamidien toteaminen ... 39 IX Patogeenisten mikro-organismien toteaminen ... 48 I JÄÄTYMISPISTEEN MÄÄRITTÄMINEN 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä raakamaidon, pastöroidun maidon, iskukuumennetun ja steriloidun täysmaidon, osittain kuoritun maidon ja kuoritun maidon jäätymispisteen määrittämiseksi käyttäen laitetta (termistorikryoskooppi), jossa sähköjäähdytys jäähdyttää termostaattisäätöisen hauteen ja termistorianturi korvaa elohopealämpömittarin. Saatavilla on kahdenlaisia laitteita. Ensimmäinen laite etsii maksimin jäätymispisteen jäätymiskäyrän "tasanteelta", kun taas toinen on kaupallisista syistä asetettu lukemaan jäätymispiste määrättyyn aikaan jäätymisen alkamisen jälkeen. Koska jäätymiskäyrät saattavat vaihdella eri maidoilla sekä maidon ja kalibroinnissa käytettävien standardiliuosten välillä, tämä vertailumenetelmä vaatii tasanteen etsivien laitteiden käyttöä. Määräaikaislaitteita voidaan käyttää rutiiniseulontamittauksissa. Jäätymispistettä voidaan käyttää maidossa olevan ylimääräisen veden osuuden arvioinnissa, edellyttäen että näytteen happoisuus ei ylitä 0,18 g maitohappoa 100 ml:aa kohti (ks. 7.4 kohta). 2 Määritelmä Maidon jäätymispiste: Kuvatun menetelmän mukaisesti mitattu ja celsiusasteina (°C) ilmoitettu arvo. 3 Periaate Maitonäyte alijäähdytetään sopivaan lämpötilaan laitteesta riippuen, ja kiteytyminen saadaan aikaan mekaanisella värähtelyllä, joka saa lämpötilan nousemaan nopeasti tasanteelle, joka vastaa näytteen jäätymistä. Laite kalibroidaan säätämällä se antamaan oikeat lukemat kahdesta standardiliuoksesta käyttäen samaa menetelmää kuin maitonäytteiden kohdalla. Tällöin tasanne ilmoittaa maidon jäätymispisteen celsiusasteina. 4 Laitteet ja välineet Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 4.1 Kryoskooppi Kryoskooppi muodostuu termostaattisäätöisestä jäähdytyshauteesta, termistorianturista (puolijohderesistanssilämpömittari), johon on liitetty virtapiiri ja galvanometri tai "lukemanäyttö", näytteen sekoittimesta ja laitteesta jäätymisen alulle panemista varten, sekä näyteputkista. 4.1.1 Jäähdytyshaude Voidaan käyttää kahdentyyppistä jäähdytyshaudetta. 4.1.1.1 Upotustyyppi Hyvin eristetty haude, jossa on sopivaa jäähdytysnestettä, jota sekoitetaan siten, että lämpötilaero hauteen eri osissa on enintään 0,2 °C. Nesteen lämpötila ei saa vaihdella enempää kuin ± 0,5 °C valmistajan ilmoittamasta nimellisarvosta. On tärkeää, että jäähdytyshauteessa oleva neste pysyy vakiotasolla. Jäähdytysnesteen on peitettävä koko näyteputken tilavuusmerkin alapuolella oleva pinta. 4.1.1.2 Kiertotyyppi Näyteputken ympärillä kierrätetään jatkuvana virtana sopivaa jäähdytysnestettä. Nesteen lämpötila ei saa vaihdella enempää kuin ± 0,5 °C valmistajan ilmoittamasta nimellisarvosta. Sopiva jäähdytysneste on 33 % (v/v) etaani-1,2-diolin (eteeniglykoli) vesiliuos. 4.1.2 Termistori ja siihen liittyvä virtapiiri Termistorin on oltava lasianturityyppiä, halkaisija enintään 1,80 ± 0,2 mm ja johdon halkaisija enintään 0,31 mm. Termistorin aikavakion on oltava alle kaksi sekuntia ja â:n arvon (ks. huomautus) on oltava korkea. Käyttöjännitteen, sähkövirran ja lämpöhäviövakion olisi oltava sellaisia, että termistorin lämpötila ei kohoa yli 0,0005 °C ympäristönsä lämpötilan yläpuolelle -0,512 °C:ssa. Vastuksen suurimman poikkeaman on oltava ± 5 %. Kun anturi on toiminta-asennossa kryoskoopissa, lasihelmen kärjen on oltava näyteputken keskiakselilla ja pisteessä, joka sijaitsee 44,6 ± 0,1 mm putken yläpään alapuolella (ks. kuva sivulla 15). Varusteisiin on kuuluttava keskittämislaite, jonka avulla käyttäjä pystyy asettamaan anturin tähän asentoon. Huomautus â määrittelee termistorin vastus-lämpötila-ominaisuudet seuraavan kaavan mukaisesti: - >NUM>dR >DEN>dT × >NUM>1 >DEN>R = >NUM>â >DEN>T² jossa: >TAULUKON PAIKKA> - >NUM>dR >DEN>dT × >NUM>1 >DEN>R on lämpötilakerroin. >TAULUKON PAIKKA> 4.1.3 Mittaus- ja näyttölaitteet 4.1.3.1 Mittausperiaate Käytettävän laitteen on toimittava sillä periaatteella, että se etsii ensimmäisen "tasanteen" jäätymiskäyrästä. Tasanne on se osa käyrää, jossa lämpötila pysyy vakiona ± 0,002 °C sisällä vähintään 20 sekunnin ajan. 4.1.3.2 Manuaalinen käyttö Termistorin resistanssin on oltava tasapainotettu Wheatstonen sillan tai vastaavan laitteen avulla käyttäen korkealaatuisia vastuksia, joiden poikkeama on enintään ± 10 % ja joiden lämpötilakerroin ei ylitä 2 × 10-5 °C. Säätö(tasaus-)vastus saa poiketa lineaarisuudesta koko alueellaan enintään 0,3 % huippuarvostaan. Vastusten säätämisen kalibroinnissa tulee olla mahdollista. Mitta-asteikon on oltava jaotettu vähintään 0,001 °C:n tarkkuudella. 4.1.3.3 Automaattikäyttö Näyttölaitteen on annettava vähintään 0,001 °C:n erottelu alueella 0-1 °C. Näyttölaitteen ja siihen kytketyn virtapiirin vakauden on oltava sellainen, että peräkkäiset saman lämpötilan lukemat eivät vaihtele enempää kuin 0,001 °C. Virtapiirin lineaarisuuden on oltava sellainen, ettei yli ± 0,001 °C:n suuruista virhettä esiinny alueella -0,400 °C-0,600 °C, kun laitetta käytetään oikein. 4.1.4 Sekoitin Näytteen sekoittamiseen käytetään maitoon reagoimatonta metallilankaa, jonka halkaisija on 1-1,5 mm. Sekoituslangan amplitudi on säädettävä, ja sekoituslanka on asennettava pystysuoraan siten, että sen alempi pää on samassa tasossa kuin termistorianturin kärki. Noin 1,5 mm:n poikkeama tämän sijainnin ylä- tai alapuolelle sallitaan. Sekoituslangan on värähdeltävä sivusuunnassa valmistajan ilmoittamalla riittävällä amplitudilla (vähintään ± 1,5 mm) sen varmistamiseksi, että lämpötila näytteessä pysyy yhtenäisenä määrityksen ajan. Sekoitin ei saa missään vaiheessa normaalin sekoituksen aikana osua termistorianturiin tai putken seinään. 4.1.5 Laite jäätymisen alulle panemista varten Tämä voi olla mikä tahansa laite, joka toimiessaan alullepanee välittömästi näytteen jäätymisen, ja lämpötilan nousun kohti jäätymispistettä. Sekoitinta voidaan käyttää tähän tarkoitukseen; yksi tapa on lisätä värähtelyn amplitudia yhden tai kahden sekunnin ajaksi, jolloin sekoituslanka osuu putken seinään. 4.1.6 Näyteputket Näyteputkien (ks. kuva 1) on oltava lasia ja 50,8 ± 0,1 mm pitkiä, ulkoläpimitaltaan 16,0 ± 0,1 mm ja sisäläpimitaltaan 13,5 ± 0,1 mm. Seinän paksuus koko putkessa ei saa vaihdella enempää kuin 0,1 mm. Putkissa tulisi olla tilavuusmerkki 29,8 mm putken reunan alapuolella (21 mm putken pohjan yläpuolella) osoittamassa näytteen tilavuutta 2,5 ± 0,1 ml. 4.1.7 Sähkönsyöttö Käyttöjännitteen on oltava stabiloitu, joko itse laitteessa tai ulkoisesti siten, että vaihtelu ei ole yli ± 1 % nimellisarvosta, kun verkkosyöttö vaihtelee ±T6 %:lla. 4.2 Analyysivaaka 4.3 Mittapulloja, tilavuus 1 000 ml, luokka A. 4.4 Kuivauskaappi, joka on hyvin ilmastoitu ja joka pystyy ylläpitämään 130 ± 1 °C:n lämpötilan tai Sähköuuni, joka on ilmastoitu ja joka pystyy ylläpitämään 300 ± 25 °C:n lämpötilan 4.5 Eksikkaattori 5 Reagenssit 5.1 Vesi, tislattu boorisilikaattilasilaitteessa, keitetty ja jäähdytetty 20 ± 2 °C:sen pullossa, jossa on hiilidioksidiabsorptioputki. 5.2 Natriumkloridi, analyysilaatua, hienoksi jauhettu, kuivattu viiden tunnin ajan 300 ± 25 °C:ssa sähköuunissa tai vaihtoehtoisesti kuivattu kuivauskaapissa 130 ± 1 °C:ssa vähintään 24 tunnin ajan ja jäähdytetty huoneenlämpöiseksi tehokkaassa eksikkaattorissa. 5.3 Standardiliuosten valmistaminen Punnitaan sopiva määrä (ks. taulukko 1) kuivaa natriumkloridia (5.2 kohta) punnitusastiassa. Liuotetaan tislattuun veteen (5.1 kohta), siirretään kvantitatiivisesti 1 000 ml:n mittapulloon ja laimennetaan merkkiin asti 20 ± 2 °C vedellä. Säilytetään enintään kahden kuukauden ajan noin 5 °C:ssa hyvin suljetuissa polyeteenipulloissa, joiden tilavuus on enintään 250 ml. >TAULUKON PAIKKA> Pullo käännetään varovasti ylösalaisin ja sitä pyöritetään useita kertoja sen sisällön sekoittamiseksi huolellisesti ennen standardiliuoksen käyttöä. Standardiliuosta ei saa koskaan ravistaa rajusti, ettei liuokseen sekoitu ilmaa. Standardiliuoksesta otetaan näytteet kaatamalla liuosta puhtaaseen kuivaan astiaan, ts. pipettiä ei saa koskaan käyttää tähän tarkoitukseen. Liuoksia ei saa käyttää pulloista, jotka ovat alle neljänneksen täynnä liuosta, ja ellei niissä ole säilöntäaineena fungisidiä (esimerkiksi tiomersaaliliuosta, 10 g/l), niitä ei tule käyttää yli kaksi kuukautta vanhoina. 6 Termistorikryoskoopin kalibrointi Kryoskoopin on oltava siten asetettu, ettei ympäröivän ilman lämpötila poikkea yli 1 °C lämpötilasta, jossa kalibrointi tapahtuu. Kryoskooppi ei saa olla alttiina auringonvalolle tai vedolle eikä yli 26-27 °C:n huoneenlämpötilalle. Varmistetaan, että kryoskooppi on hyvässä toimintakunnossa valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja että se on kytketty päälle vähintään 12 tuntia ennen kalibrointia. Anturin asento, sekoituslangan värähtelyn amplitudi ja jäähdytysnesteiden lämpötila tarkistetaan. Valitaan kaksi standardiliuosta (ks. edellä oleva taulukko 1), joiden väliin testattavien maitonäytteiden jäätymispisteiden oletetut arvot jäävät. Näiden kahden liuoksen jäätymispisteiden ero ei mielellään saisi olla alle - 0,100 °C. (Joissakin nykyisin saatavilla olevissa kryoskooppimalleissa termistoriin liittyvä virtapiiri on suunniteltu tasapainotettavaksi tiettyyn jäätymispisteen arvoon laitteen mittausalueella. Näissä tapauksissa tämän jäätymispisteen omaavan standardiliuoksen käyttö yhtenä kalibrointiliuoksista helpottaa kalibrointia, ja valmistajan on ilmoitettava tämä arvo.) Pipetoidaan 2,5 ± 0,1 ml yhtä standardia puhtaaseen kuivaan näyteputkeen, ja mitataan kryoskoopilla. Huomautus Kalibroinnissa käytettävien näyteputkien on oltava samanlaisesta lasista valmistettuja ja ne on pestävä ja huuhdeltava demineralisoidulla vedellä samaan aikaan kuin maitonäytteiden testaukseen käytettävät putket. Standardiliuosten lämpötilojen on oltava samat kuin maitonäytteiden lämpötilat. Kalibrointisäätimistä säädetään valmistajan ohjeiden mukaisesti kryoskoopin lukema samaksi kuin standardiliuoksen jäätymispiste. Menettely toistetaan toisella standardiliuoksella ja tällä tavoin jatketaan, kunnes kunkin liuoksen peräkkäiset lukemat antavat kunkin liuoksen jäätymispisteen oikean arvon ilman että kalibrointisäätimiä tarvitsee säätää. Kryoskooppi on tämän jälkeen käyttövalmis ja se osoittaa maitonäytteen jäätymispisteen suoraan ilman korjaamista. 7 Testinäytteen valmistaminen 7.1 Näytteitä säilytetään, jos se on välttämätöntä, 0-5 °C:n lämpötilassa. 7.2 Näytteestä poistetaan kaikki näkyvät vieraat esineet tai kiinteä voirasva suodattamalla se tarvittaessa puhtaaseen, kuivaan astiaan, ja sitä sekoitetaan kevyesti. Jos suodatinta käytetään, sen on oltava maitoon reagoimaton ja tehokas, kun sitä käytetään laboratoriolämpötilassa. 7.3 Maito voidaan testata kun se on säilytyslämpötilassaan (0-5 °C) tai sen voidaan antaa lämmetä laboratoriolämpötilaan välittömästi ennen testin aloittamista. On kuitenkin välttämätöntä, että standardiliuokset ja maitonäytteet ovat samassa lämpötilassa mittauksia tehtäessä. 7.4 Määritetään maidon titrattava happoisuus mahdollisimman tarkasti samaan aikaan jäätymispistetestin kanssa. Näytteitä, joiden happoisuus on yli 0,18 g maitohappoa 100 ml maitoa kohti, ei voida tutkia. 7.5 Iskukuumennetun ja steriloidun maidon on annettava seistä ennen tutkimusta vähintään 20 minuutin ajan avoimessa astiassa. 8 Menettely 8.1 Esitarkistukset Tarkistetaan, että jäähdytysnesteen taso ja lämpötila ovat valmistajan ohjeiden mukaisia ja että termistorianturi on tyhjässä näyteputkessa tarkalleen näytteen sijaintikohdassa. Virta kytketään kryoskooppiin ja varmistetaan, että jäähdytysneste sekoittuu tai kiertää asianmukaisesti. Kun kryoskooppi on ollut kytkettynä vähintään 12 tuntia, tarkistetaan jäähdytysnesteen lämpötila sekä sekoittimen sijainti ja värähtelyn amplitudi. 8.2 Rutiinikalibrointitarkastus Ennen kutakin määrityssarjaa mitataan natriumkloridistandardiliuoksen jäätymispiste (esim. liuos, jonka jäätymispiste on - 0,512 °C), kunnes kaksi peräkkäistä määritystä eivät eroa enempää kuin 0,001 °C. Jos näiden arvojen keskiarvo eroaa standardiliuoksen jäätymispisteestä enemmän kuin 0,002 °C, kryoskooppi kalibroidaan uudelleen 6 kohdassa esitetyllä tavalla. Jos kryoskooppi on jatkuvassa käytössä, rutiinikalibrointitarkastus suoritetaan vähintään kerran tunnissa. Valmistajan ohjeet on otettava huomioon. 8.3 Maidon jäätymispisteen mittaaminen Pulloa käännetään varovasti ylösalaisin ja sitä pyöritetään useita kertoja sen sisällön sekoittamiseksi. Näytettä ei saa koskaan ravistaa niin rajusti, että liuokseen sekoittuu ilmaa. Pipetoidaan 2,5 ± 0,1 ml maitoa puhtaaseen, kuivaan näyteputkeen ja ylimääräinen maito poistetaan pipetillä. Varmistetaan, että anturi ja sekoituslanka ovat puhtaita ja kuivia pyyhkimällä ne tarvittaessa pehmeällä, puhtaalla ja nukattomalla kankaalla alhaalta ylöspäin. Näyteputki laitetaan kalibroituun kryoskooppiin valmistajan ohjeiden mukaan. Maito jäähtyy ja jäätyminen alkaa 0,1 °C:n tarkkuudella valmistajan ilmoittamassa lämpötilassa. (Joissakin automaattisissa laitteissa tämä lämpötila voidaan nähdä digitaalinäytössä; manuaalisilla laitteilla saavutetaan tarvittava täsmällisyys varmistamalla, että jäätyminen alkaa, kun galvanometrin osoitin tai hiusviiva on asianmukaisen merkin kohdalla). Jos jäätyminen jostakin syystä alkaa ennen määrättyä lämpötila-aluetta tai sen jälkeen, koe keskeytetään ja uusitaan toisella osalla maitonäytettä. Jos toinenkin näyte jäätyy ennen määrättyä lämpötilaa, lämmitetään uusi osa näytettä 45 °C:n lämpötilaan, jossa sitä pidetään viiden minuutin ajan, jotta kiteytynyt rasva sulaa. Näyte jäähdytetään uudelleen mittauslämpötilaan ja mitataan välittömästi. Maidon lämpötila kohoaa jäätymisen alkamisen jälkeen nopeasti lukemaan, joka pysyy käytännöllisesti katsoen muuttumattomana jonkin aikaa, ennen kuin se laskee uudelleen. Jäätymispiste on korkein tänä aikana saavutettu lämpötila, ja tämä arvo kirjataan. Huomautus Aika, jonka lämpötila pysyy muuttumattomana, samoin kuin jäätymisen alkamisen ja korkeimman lämpötilan saavuttamisen välinen aika, eroavat eri näytteiden kohdalla ja ovat huomattavasti lyhyempiä veden ja standardinatriumkloridiliuoksen kuin maidon kohdalla. On olennaisen tärkeää, että juuri korkein lämpötila kirjataan. Kun mittaus on tyydyttävästi suoritettu, näyteputki poistetaan, termistorianturi ja sekoitin huuhdellaan vedellä ja kuivataan pehmeällä, puhtaalla ja nukattomalla kankaalla alhaalta ylöspäin, minkä jälkeen tehdään rinnakkaismääritys toisella osalla maitonäytettä. Jos saatujen jäätymispisteiden ero on suurempi kuin toistettavuuden arvo (0,004 °C), suoritetaan uusi rinnakkaismääritys toisella osalla näytettä. Edellyttäen, että nämä kaksi määritystä ovat samoja 0,004 °C:n tarkkuudella, arvot on kirjattava ja käytettävä lopullisen tuloksen laskemiseen. 8.4 Anturin jäähdyttäminen Käytön jälkeen näytekammioon asetetaan tyhjä näyteputki ja toimintapäätä lasketaan alemmaksi anturin pitämiseksi viileänä. (Eräissä kryoskooppimalleissa tämä ei ehkä ole mahdollista; tällaisissa tapauksissa on tärkeää varmistaa, että anturi on jäähtynyt riittävästi ennen mittausten tekemistä, esimerkiksi tekemällä useita koemäärityksiä, kunnes saadaan vakiolukemia). 9 Tulosten ilmoittaminen 9.1 Laskeminen Jos kalibroinnin todetaan rutiinikalibrointi-tarkastuksen jälkeen olevan kunnossa, lasketaan saatujen hyväksyttävien rinnakkaistulosten keskiarvo kolmen desimaalin tarkkuudella. Jos kahden hyväksyttävän rinnakkaistuloksen summa on pariton luku, keskiarvo on pyöristettävä lähimpään parilliseen arvoon kuten seuraavassa esimerkissä on esitetty: >TAULUKON PAIKKA> 9.2 Täsmällisyys 9.2.1 Toistettavuus (r): 0,004 °C. 9.2.2 Uusittavuus (R): 0,006 °C. >VIITTAUS KAAVIOON> II FOSFATAASIAKTIIVISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä fosfataasiaktiivisuuden määrittämiseksi pastöroidusta maidosta. 2 Määritelmä 2.1 Fosfataasiaktiivisuus on aktiivisen alkalisen fosfataasin määrä tuotteessa ilmoitettuna fenolin määränä mikrogrammoina, jonka 1 ml pastöroitua maitoa vapauttaa menetelmässä mainituissa oloissa. 2.2 Maidon, jonka fosfataasiaktiivisuus on alle 4 ìg/ml, katsotaan olevan fosfataasinegatiivista. 3 Periaate Fosfataasiaktiivisuus arvioidaan näytteeseen lisätyn dinatriumfenyylifosfaatin vapauttaman fenolin määrästä. Vapautunut fenoli reagoi dibromokinonkloori-imidin kanssa ja tuottaa dibromi-indofenolia (väriltään sinertävää), joka mitataan kolorimetrisesti 610 nm:ksi. Verrataan näytteeseen, josta on tuhottu fosfataasientsyymi. 4 Reagenssit 4.1 Bariumboraattihydroksidipuskuri 4.1.1 Liuotetaan 50,0 g bariumhydroksidia [Ba(OH)2.8H2O] veteen ja täytetään tilavuuteen 1 000 ml. 4.1.2 Liuotetaan 22,0 g boorihappoa (H3BO3) veteen ja täytetään tilavuuteen 1 000 ml. 4.1.3 Lämmitetään 500 ml kumpaakin liuosta 50 °C:seen, liuokset sekoitetaan keskenään, sekoitetaan, jäähdytetään nopeasti noin 20 °C:seen, säädetään pH tarvittaessa siten, että se on 10,6 ± 0,1 lisäämällä liuosta 4.1.1 tai 4.1.2. Suodatetaan. Liuos säilytetään tiiviisti suljetussa asiassa. 4.1.4 Liuos laimennetaan ennen käyttöä samalla tilavuudella vettä. 4.2 Värinkehityspuskuri Liuotetaan 6,0 g natriummetaboraattia (NaBO2) tai 12,6 g (NaBO2.4H2O):ta ja 20,0 g natriumkloridia (NaCl) veteen ja täytetään tilavuuteen 1 000 ml. 4.3 Värilaimennuspuskuri Laimennetaan 10 ml värinkehityspuskuria (4.2 kohta) vedellä 100 ml:ksi. 4.4 Puskurisubstraatti Liuotetaan 0,1 g vedetöntä, fenolitonta dinatriumfenyylifosfaattia 100 ml:aan puskuria (4.1.3 kohta) tai 0,5 g dinatriumfenyylifosfaattia 4,5 ml:aan värinkehityspuskuria (4.2 kohta), lisätään kaksi tippaa BQC-liuosta (4.6 kohta) ja annetaan seistä huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Uutetaan näin muodostunut väri 2,5 ml:lla butanoli-1:tä ja annetaan seistä, kunnes butanoli-1 on erottunut. Butanoli-1 erotetaan ja heitetään pois. Uutto toistetaan tarvittaessa. Liuosta voidaan säilyttää jääkaapissa muutamia vuorokausia; väri kehitetään ja uutetaan uudelleen ennen käyttöä. Puskurisubstraatti valmistetaan välittömästi ennen käyttöä laimentamalla 1 ml tätä liuosta bariumboraattihydroksidipuskurilla (4.1.3 kohta) 100 ml tilavuuteen. 4.5 Sinkki-kupari-saostusaine Liuotetaan 3,0 g sinkkisulfaattia (ZnSO4,7H2O) ja 0,6 g kupari(II)sulfaattia (CuSO4, 5H2O) veteen ja täytetään tilavuuteen 100 ml. 4.6 2,6-dibromokinonkloori-imidiliuos (BQC-liuos) Liuotetaan 40 ± 1 mg 2,6-dibromikinonkloori-imidiä (BQC) (C6H2Br2ClNO6) 10 ml:aan 96 % (v/v) etanolia. Säilytetään tummassa pullossa jääkaapissa. Liuos on hylättävä, jos ilmenee värimuutoksia tai jos liuos on vanhempaa kuin kuukauden ikäistä. 4.7 Kupari(II)sulfaattiliuos Liuotetaan 0,05 g kupari(II)sulfaattia (CuSO4.5H2O) veteen ja täytetään tilavuuteen 100 ml. 4.8 Fenolistandardiliuokset 4.8.1 Punnitaan 200 ± 2 mg puhdasta, vedetöntä fenolia, siirretään 100 ml:n mittapulloon, lisätään vettä, sekoitetaan ja laimennetaan merkkiin asti. Tämä kantaliuos säilyy jääkaapissa muuttumattomana useiden kuukausien ajan. 4.8.2 Laimennetaan 10 ml kantaliuosta vedellä 100 ml:ksi ja sekoitetaan. 1 ml sisältää 200 ìg fenolia. 5 Laitteet ja välineet Huomautuksia: a) Kaikki välineet, tulpat ja näytteenottotyövälineet on puhdistettava huolellisesti. Niiden huuhtelemista juuri keitetyllä tislatulla vedellä tai höyryttämistä suositellaan. b) Tietyntyyppiset muoviset tulpat saattavat aiheuttaa fenolikontaminaatiota, eikä niiden käyttö ole sallittua. Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 5.1 Analyysivaaka 5.2 Vesihaude, joka pysyy 37 ± 1 °C:ssa. 5.3 Spektrofotometri, joka soveltuu aallonpituudella 610 nm oleviin lukemiin. 5.4 Koeputkia, 16 tai 18 mm × 150 mm, mielellään asteikko 5 ja 10 ml. 5.5 Pipettejä 5.6 Sopivan kokoisia lasisuppiloita, halkaisija esimerkiksi 5 cm. 5.7 Poimutettuja suodattimia, joiden halkaisija on vähintään 9 cm keskinopeaa suodatusta varten. 5.8 Mittapulloja standardiliuosten valmistukseen. 6 Menettely Huomautuksia: a) Suoran auringonvalon vaikutusta määrityksen aikana on vältettävä. b) Sylki- tai hikikontaminaatio voi antaa vääriä positiivisia tuloksia ja sitä on vältettävä. Tässä suhteessa on kiinnitettävä erityisesti huomiota pipetointimenetelmään. 6.1 Testinäytteen valmistaminen 6.1.1 Analyysi suoritetaan heti näytteenoton jälkeen. Muutoin näyte säilytetään jääkaapissa enintään kahden vuorokauden ajan. 6.2 Näyte Pipetoidaan kahteen koeputkeen (5.4 kohta) 1 ml testinäytettä käyttäen toista koeputkea vertailunäytteenä. 6.3 Määritys 6.3.1 Vertailunäytettä kuumennetaan kahden minuutin ajan kiehuvassa vedessä; koeputki ja keittolasi peitetään alumiinifoliolla sen varmistamiseksi, että koko putki kuumenee. Jäähdytetään nopeasti huoneenlämpötilaan. 6.3.2 Tästä lähtien vertailunäytettä ja testinäytettä käsitellään samalla tavalla. Lisätään 10 ml puskurisubstraattia (4.4 kohta) ja sekoitetaan. 6.3.3 Näytteitä inkuboidaan välittömästi vesihauteessa (5.2 kohta) 60 minuutin ajan sekoittaen niitä silloin tällöin (vähintään neljä kertaa). 6.3.4 Kuumennetaan kiehuvassa vedessä kahden minuutin ajan samalla tavoin kuin 6.3.1 kohdassa. Jäähdytetään nopeasti huoneenlämpötilaan. 6.3.5 Lisätään 1 ml sinkki-kupari-saostusainetta (4.5 kohta) molempiin putkiin ja sekoitetaan huolellisesti. 6.3.6 Suodatetaan kuivan suodatinpaperin läpi, hylätään ensimmäiset 2 ml, suodatetaan tarvittaessa uudestaan, kunnes suodos on täysin kirkasta, ja kerätään 5 ml suodosta koeputkeen. 6.3.7 Lisätään 5 ml värinkehityspuskuria (4.2 kohta). 6.3.8 Lisätään 0,1 ml BQC-liuosta (4.6 kohta), sekoitetaan ja annetaan värin kehittyä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. 6.3.9 Mitataan näytteen absorbanssi vertailunäytettä vasten spektrofotometrissä (5.3 kohta) aallonpituudella 610 nm. 6.3.10 Määritys toistetaan sopivalla näytteen laimennoksella, jos 6.3.9 kohdan mukaisesti mitattu absorbanssi ylittää 6.44 kohdan mukaisesti mitatun 20 ìg fenolia putkea kohti sisältävän standardin absorbanssin. Tämä laimennos valmistetaan sekoittamalla yksi tilavuus testinäytettä sopivaan tilavuuteen samaa näytettä, joka on kuumennettu varovasti kiehuvaksi fosfataasin inaktivoimiseksi. 6.4 Kalibrointikäyrän valmistaminen 6.4.1 Valmistetaan sopiva sarja laimennettuja standardiliuoksia fenolistandardiliuoksesta (4.82 kohta), jotka sisältävät 0 (vertailuliuos), 2, 5, 10 ja 20 ìg fenolia millilitraa kohti, ja pipetoidaan vastaavasti 1 ml vettä tai 1 ml neljää fenolistandardilaimennosta kuhunkin viiteen koeputkeen. 6.4.2 Kuhunkin koeputkeen lisätään 1 ml kupari(II)sulfaattiliuosta (4.7 kohta), 5 ml värilaimennuspuskuria (4.3 kohta), 3 ml vettä ja 0,1 ml BQC-liuosta (4.6 kohta); sekoitetaan. 6.4.3 Annetaan värin kehittyä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. 6.4.4 Mitataan absorbanssi vertailunäytettä vasten spektrofotometrissä aallonpituudella 610 nm (5.3 kohta). 6.4.5 Lasketaan kutakin fenolimäärää (6.4.1 kohta) kohti saaduista absorbanssiarvoista (6.4.4 kohta) regressiosuora pienimmän neliösumman menetelmällä. 7 Tulosten ilmoittaminen 7.1 Laskeminen ja kaava 7.1.1 Lasketaan absorbanssilukemasta (6.3.9 kohta) fenolin määrä saatua regressiosuoraa (6.45 kohta) käyttäen. 7.1.2 Laske fosfataasiaktiivisuus ilmaistuna mikrogrammoina fenolia millilitrassa pastöroitua maitoa seuraavan kaavan mukaan: Fosfataasiaktiivisuus = 2,4 × A × D jossa >TAULUKON PAIKKA> Kerroin 2,4 on laimennuskerroin ( >NUM>5 >DEN>12 1 ml:n testinäytteestä) - Ks. 6.2 kohta yhdessä 6.3.2, 6.3.5 ja 6.3.6 kohdan kanssa. 7.2 Täsmällisyys 7.2.1 Toistettavuus (r): 2 ìg fenolia/ml. 7.2.2 Uusittavuus (R): 3 (alustava) ìg fenolia/ml. 7.2.3 Jos laimentaminen on suoritettu 6.3.10 kohdan mukaisesti, 7.2.1 ja 7.2.2 kohdassa mainittu raja-arvo koskee laimennetulla näytteellä saatuja tuloksia. III PEROKSIDAASIAKTIIVISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä peroksidaasientsyymin toteamista varten maidon pastöroinnin valvomiseksi. 2 Määritelmä Peroksidaasipositiivinen reaktio: Jos maito on pastöroitu riittävästi, sinistä väriä ilmenee 30 sekunnin kuluessa sekoittamisesta. Peroksidaasinegatiivinen reaktio: Väriä ei ilmene 30 sekunnin kuluessa sekoittamisesta. 3 Periaate Peroksidaasientsyymi hajottaa vetyperoksidia. Vapautunut atomimuodossa oleva happi hapettaa värittömän 1,4-fenyylidiamiinin purppuranpunaiseksi indofenoliksi (Storch-testi). Värinvoimakkuus on verrannollinen entsyymin pitoisuuteen. 4 Reagenssit 4.1 1,4-fenyylidiamiiniliuos Liuotetaan 2 g 1,4-fenyylidiamiinia (C6H8N2) lämpimään (50 °C) veteen ja täytetään 100 ml tilavuuteen. Liuosta säilytetään tummanruskeassa lasitulpalla varustetussa pullossa, viileässä ja pimeässä paikassa. Valmistuksen jälkeen 1,4-fenyylidiamiiniliuos muodostaa sakkaa yhdessä tai kahdessa vuorokaudessa, jolloin se on hylättävä. 4.2 Vetyperoksidiliuos Mitataan 9 ml 30-prosenttista vetyperoksidia veteen ja täytetään vedellä 100 ml tilavuuteen. Lisätään 1 ml väkevää rikkihappoa yhtä liuoslitraa kohti liuoksen stabiloimiseksi. Vetyperoksidiliuos säilyy muuttumattomana yhden kuukauden ajan, jos sitä säilytetään viileässä, pimeässä paikassa pullossa, jonka lasitulppa estää kosketuksen orgaanisten yhdisteiden kanssa. 5 Menettely 5.1 Annostellaan 5 ml maitonäytettä puhtaaseen koeputkeen, jossa on sopiva sulkija. 5.2 Lisätään 5 ml 1,4-fenyylidiamiiniliuosta (4.1 kohta). 5.3 Lisätään 2 tippaa vetyperoksidiliuosta (4.2 kohta). 5.4 Värinmuodostumista seurataan 30 sekunnin ajan sekoittamisen jälkeen. Jos sinistä väriä ilmenee myöhemmin kuin 30 sekuntia reagenssien lisäämisen jälkeen, reaktio on epäspesifinen. IV MIKRO-ORGANISMIEN MÄÄRITTÄMINEN - PESÄKELASKENTAMENETELMÄ 30 °C:SSA 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä mikro-organismien pesäkeluvun määrittämiseksi 30 °C:ssa. Menetelmää voidaan käyttää tutkittaessa raakamaitoa ja pastöroitua maitoa sekä iskukuumennettua ja steriloitua maitoa, joka on esi-inkuboitu 30 °C:ssa 15 päivän ajan. 2 Määritelmä "Mikro-organismeilla" tarkoitetaan organismeja, jotka muodostavat laskettavia pesäkkeitä, kun niitä inkuboidaan kuvatuissa olosuhteissa aerobisesti. 3 Periaate Määrätty tilavuus maitonäytettä sekoitetaan elatusaineen kanssa petrimaljoissa ja inkuboidaan 30 °C:ssa 72 tunnin ajan. Pesäkkeet lasketaan ja mikro-organismien määrä 1 ml:ssa raakamaitoa tai pastöroitua maitoa tai 0,1 ml:ssa esi-inkuboitua iskukuumennettua tai steriloitua maitoa lasketaan. 4 Laitteet ja välineet Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 4.1 Laitteet 4.1.1 Kuumailmakaappi, joka pystyy toimimaan 170-175 °C:ssa. 4.1.2 Autoklaavi, joka pystyy toimimaan 121 ± 1 °C:ssa. 4.1.3 Viljelykaappi, jonka lämpötila on joka kohdassa 30 ± 1 °C. 4.1.4 pH-mittari, jossa on lämpötilakompensointi, tarkkuus ± 0,1 pH-yksikköä. 4.1.5 Vesihaude, joka pystyy toimimaan 45 ± 1 °C:ssa. 4.1.6 Suurennuslasi, 2-4-kertainen suurennus. 4.1.7 Suurennuslasi, 8-10-kertainen suurennus. 4.1.8 Käsilaskuri. 4.1.9 Sekoitin, jolla pystytään sekoittamaan 1 ml maitonäytettä tai kymmenkertaista laimennosta 9 ml:aan laimennusliuosta, ja joka toimii koeputken sisällön epäkeskisen pyörittämisen periaatteella. 4.2 Välineet 4.2.1 Koeputkia, joissa on sopivat sulkijat ja jotka ovat riittävän tilavia, mukaan lukien riittävä ilmatila sekoittamista varten, 10 ml:lle esilaimennosta tai seuraavia kymmenkertaisia laimennoksia. 4.2.2 Pulloja, joiden tilavuus on 150-250 ml tai putkia, tilavuus noin 20 ml, elatusainetta varten. 4.2.3 Pipettejä (puuvillavanulla suljettuja), jotka ovat lasia tai steriiliä synteettistä materiaalia, joiden kärki on ehjä, joiden nimellistilavuus on 1 ml ja joissa on halkaisijaltaan 1,75-3 mm valumisaukko. 4.2.4 Petrimaljoja, jotka ovat kirkasta väritöntä lasia tai steriiliä synteettistä ainetta, pohjan sisäläpimitta noin 90-100 mm. Sisäsyvyyden tulisi olla vähintään 10 mm. Pohjassa ei saa olla epätasaisuuksia, jotka haittaavat pesäkkeiden laskemista. 4.2.5 Välineiden steriloiminen: Välineet steriloidaan jommallakummalla seuraavista menetelmistä: a) kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta) 170-175 °C:ssa vähintään tunnin ajan, b) autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa vähintään 20 minuutin ajan. Autoklaavissa on pidettävä huolta siitä, että riittävä höyryn tunkeutuminen varmistetaan - esim. astioita ei suljeta tiukasti, jos niissä steriloidaan välineitä, ja pullot suljetaan löyhästi. Autoklaavissa steriloidut välineet on kuivattava höyryn poistamiseksi. Pipetit on steriloitava kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta). 5 Elatusaine - maidon pesäkelaskenta agar-kasvatusalustalla 5.1 Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Rasvattomassa maitojauheessa ei saa olla estoaineita, mikä on varmistettava vertailevilla kokeilla käyttämällä rasvatonta maitojauhetta, jonka tiedetään olevan vapaata estoaineista. Valmistaminen: Aineet suspendoidaan ja liuotetaan veteen seuraavassa järjestyksessä: hiivauute, tryptoni, glukoosi ja lopuksi rasvaton maitojauhe. Suspension lämmittäminen auttaa liukenemista. Lisätään agar ja kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen kunnes agar on liuennut kokonaan, tai höyrytetään noin 30 minuutin ajan. Suodatetaan tarvittaessa suodatinpaperin läpi. Tarkistetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta). Säädetään pH tarvittaessa siten, että se on steriloinnin jälkeen 6,9 ± 0,1 25 °C:ssa käyttäen natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta (vähintään 0,1 mol/l). 5.2 Elatusaineen annostelu, sterilointi ja säilytys Elatusaine (5.1 kohta) annostellaan 100-150 ml:n määrinä pulloihin tai 12-15 ml:n määrinä putkiin (4.2.2 kohta). Pullot ja putket suljetaan. Steriloidaan autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Tarkistetaan elatusaineen pH. Jos elatusainetta ei aiota käyttää välittömästi, sitä säilytetään pimeässä 1-5 °C:n lämpötilassa enintään kuukauden ajan valmistuksesta. 5.3 Kaupallinen kuivattu elatusaine Elatusaine (5.1 kohta) voidaan valmistaa kaupallisesta kuivatusta elatusaineesta. Noudatetaan valmistajan ohjeita, mutta lisätään rasvaton maitojauhe ennen liuottamista, jollei se sisälly kaupalliseen valmisteeseen. Säädetään pH siten, että se on 6,9 ± 0,1 25 °C:ssa, kuten 5.1 kohdassa esitetään; elatusaine annostellaan, steriloidaan ja säilytetään kuten 5.2 kohdassa kuvataan. 6 Laimennusliuokset 6.1 Peptoni/suolaliuos Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Valmistusaineet liuotetaan veteen, lämmitetään tarvittaessa. Tarkistetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta) ja säädetään tarvittaessa siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,0 ± 0,1 25 °C:ssa käyttäen natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta (vähintään 0,1 mol/l). 6.2 Laimennusliuoksen annostelu, sterilointi ja säilytys Laimennusliuos (6.1 kohta) annostellaan koeputkiin (4.2.1 kohta) sellaisina määrinä, että jokaisessa putkessa on steriloinnin jälkeen 9,0 ± 0,2 ml laimennusliuosta. Putket suljetaan tulpalla. Steriloidaan autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Laimennusliuoksen pH tarkistetaan. Jos laimennusliuosta ei aiota käyttää välittömästi, sitä säilytetään pimeässä 1-5 °C:n lämpötilassa enintään kuukauden ajan valmistuksesta. 6.3 Kaupalliset kuivatut laimennusliuokset Laimennusliuos (6.1 kohta) voidaan valmistaa kaupallisista kuivatuista tableteista tai jauheista. Valmistajan ohjeita on noudatettava. Säädetään pH kuten 6.1 kohdassa kuvataan, laimennusliuokset annostellaan, steriloidaan ja säilytetään kuten 6.2 kohdassa esitetään. 7 Menettely 7.1 Elatusaineen sulattaminen Sulatetaan nopeasti tarvittava määrä elatusainetta ennen mikrobiologisen tutkimuksen alkua ja jäähdytetään 45 ± 1 °C:seen vesihauteessa (4.1.5 kohta). 7.2 Maitonäytteen valmistaminen Näyte sekoitetaan huolellisesti, jotta mikro-organismit jakaantuvat niin tasaisesti kuin mahdollista, kääntämällä maitonäyteastia nopeasti ylösalaisin 25 kertaa. Vaahdon muodostumista olisi vältettävä tai vaahdon olisi annettava hajota. Sekoittamisen ja testierän ottamisen välinen aika ei saisi ylittää kolmea minuuttia. 7.3 Esilaimennoksen valmistaminen (10-1) (raakamaito ja pastöroitu maito) Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml (7.2 kohta) raakamaitonäytettä tai näytettä pastöroidusta maidosta 9 ml:aan laimennusliuosta (6.1 kohta) välttäen kosketusta pipetin ja laimennusliuoksen välillä. Laimennusliuoksen lämpötilan olisi oltava suunnilleen sama kuin maitonäytteen lämpötila. Tätä esilaimennosta sekoitetaan huolellisesti sekoittimella (4.1.9 kohta) 5-10 sekunnin ajan. Näin saadaan 10-1 esilaimennos. 7.4 Seuraavien kymmenkertaisten laimennosten valmistaminen (raakamaito ja pastöroitu maito) Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml esilaimennosta (7.3 kohta) 9 ml:aan laimennusliuosta (6.1 kohta) 7.3 kohdan ohjeita noudattaen. Näin saadaan 10-2 laimennos. Näitä toimenpiteitä toistetaan seuraavien kymmenkertaisten laimennosten aikaansaamiseksi, kunnes oletetaan, että on saavutettu sopiva määrä mikro-organismeja (8.1.1 kohta). 7.5 Siirrostus petrimaljoille 7.5.1 Raakamaito: Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml näytettä ja/tai sopivaa kymmenkertaista laimennosta maljaan (4.2.4 kohta). Vähintään kahta laimennosta on tutkittava. Valmistetaan yksi malja kummastakin sopivaksi arvioidusta laimennoksesta (8.1.1 kohta). 7.5.2 Pastöroitu maito: Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml näytettä ja/tai sopivaa kymmenkertaista laimennosta maljaan (4.2.4 kohta). Vähintään kahta laimennosta on tutkittava. Valmistetaan kaksi maljaa kummastakin sopivaksi arvioidusta laimennoksesta (8.1.1 kohta). 7.5.3 Iskukuumennettu ja steriloitu maito (tutkitaan 15 vuorokauden inkuboinnin 30 °C:ssa jälkeen - direktiivin liitteessä A olevan VII luvun 5 kohta): Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 0,1 ml näytettä (7.2 kohta) maljaan (4.2.4 kohta). Valmistetaan kaksi maljaa. 7.6 Valaminen Kaadetaan noin 15-18 ml elatusainetta (7.1 kohta) kuhunkin siirrostettuun maljaan. Sekoitetaan välittömästi kaatamisen jälkeen liikuttamalla petrimaljaa riittävästi, jotta pesäkkeet olisivat tasaisesti jakaantuneina inkuboinnin jälkeen. Aika maitonäytteen valmistamisen päättymisestä siihen, kun kunkin maitotyypin mukainen koe-erä tai laimennos sekoitetaan elatusaineen kanssa, ei saa ylittää 15 minuuttia. Annetaan jähmettyä puhtaalla, viileällä vaakasuoralla pinnalla. 7.7 Petrimaljojen inkubointi Maljat siirretään viljelykaappiin (4.1.3 kohta). Maljoja inkuboidaan ylösalaisin käännettyinä. Enintään kuusi maljaa saa asettaa päällekkäin. Maljapinojen tulisi olla erillään toisistaan ja viljelykaapin seinistä ja katosta. Inkuboidaan 30 ± 1 °C:ssa 72 ± 2 tuntia. 7.8 Pesäkkeiden laskenta Pesäkkeet lasketaan sellaisista petrimaljoista, joissa kasvaa enintään 300 pesäkettä. Maljat tutkitaan himmennetyssä valossa. Laskemisen helpottamiseksi voidaan käyttää sopivaa suurennuslasia (4.1.6 kohta) ja/tai käsilaskuria (4.1.8 kohta). On vältettävä sekoittamasta muita saostuneita hiukkasia kooltaan neulankärjen kokoisiin pesäkkeisiin. Epävarmoissa tapauksissa viljelmää on tarkasteltava äärimmäisen huolellisesti käyttäen tarvittaessa voimakkaammin suurentavaa suurennuslasia (4.1.7 kohta) pesäkkeiden erottamiseksi vieraasta aineesta. Leviäviä pesäkkeitä pidetään yksittäisinä pesäkkeinä. Jos alle neljäsosa maljasta on leviävien pesäkkeiden peitossa, lasketaan maljan puhtaassa osassa olevat pesäkkeet ja vastaava määrä koko maljaa kohti. Jos yli yksi neljäsosa maljasta on leviävien pesäkkeiden peitossa, malja hylätään. 8 Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen 8.1 Raakamaito ja pastöroitu maito 8.1.1 Käytetään niiden maljojen lukemia, joissa kasvaa 10 - 300 pesäkettä (ks. 8.1.3 ja 8.1.4 kohta). 8.1.2 Mikro-organismien määrä 1 ml:ssa raakamaitoa tai pastöroitua maitoa saadaan seuraavasta kaavasta: >NUM>Ó C >DEN>(n1 + 0,1 n2) d jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulos ilmoitetaan kahden merkitsevän numeron tarkkuudella. Kun pyöristettävä numero on viisi, pyöristetään siten, että sen vasemmalla puolella olevasta numerosta tulee parillinen. Esimerkki (pastöroitu maito): Laimennos 10-2: 278 ja 290 pesäkettä Laimennos 10-3: 33 ja 28 pesäkettä Määrä/ml = >NUM>278 + 290 + 33 + 28 >DEN>(2 + 0,1 × 2) 10-2 = >NUM>629 >DEN>0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 104. 8.1.3 Jos saadaan vain alle 10 olevia lukemia, mikro-organismien määrä millilitraa kohti ilmoitetaan seuraavasti: "alle 10 × d per ml", kun "d" on alimman laimennuskertoimen käänteisluku. 8.1.4 Jos saadaan vain 300 pesäkettä ylittäviä lukemia, mutta laskeminen on mahdollista, lasketaan arvioitu lukema ja kerrotaan se laimennuskertoimen käänteisluvulla. Tulos ilmoitetaan seuraavasti: "mikro-organismien arvioitu määrä millilitraa kohti". 8.2 Iskukuumennettu ja steriloitu maito Yli 10 pesäkkeen pesäkeluvun 0,1 ml:ssa ei katsota täyttävän direktiivin 85/397/ETY vaatimuksia. 9 Täsmällisyys Kansainvälisesti hyväksytyistä kollaboratiivisista tutkimuksista ei ole vielä saatavilla tuloksia. V MIKRO-ORGANISMIEN MÄÄRITTÄMINEN - PESÄKELASKENTAMENETELMÄ 21 °C:SSA 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä mikro-organismien pesäkeluvun määrittämiseksi pastöroidusta maidosta 21 °C:ssa, kun sitä on ensin inkuboitu 6 °C:ssa viiden vuorokauden ajan sellaisten psykrotrofisten mikro-organismien pastöroidussa maidossa aiheuttaman kontaminaation asteen määrittämiseksi, jotka pystyvät lisääntymään maidossa 6 °C:ssa. 2 Määritelmä `Mikro-organismeilla` tarkoitetaan organismeja, jotka muodostavat laskettavia pesäkkeitä, kun niitä inkuboidaan kuvatuissa olosuhteissa aerobisesti. 3 Periaate Pastöroitua maitoa inkuboidaan 6 °C:ssa viiden vuorokauden ajan. Määrätty tilavuus esi-inkuboitua maitonäytettä sekoitetaan elatusaineen kanssa petrimaljoissa ja inkuboidaan 21 °C:ssa 25 tunnin ajan. Lasketaan pesäkkeet ja mikro-organismien määrä 1 ml:ssa pastöroitua maitoa. 4 Laitteet ja välineet Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 4.1 Laitteet 4.1.1 Kuumailmakaappi, joka pystyy toimimaan 170-175 °C:ssa. 4.1.2 Autoklaavi, joka pystyy toimimaan 121 ± 1 °C:ssa. 4.1.3 Viljelykaapit, joiden lämpötila on joka kohdassa a) 6 ± 0,2 °C b) 21 ± 1 °C 4.1.4 pH-mittari, jossa on lämpötilakompensointi, tarkkuus ± 0,1 pH-yksikköä. 4.1.5 Vesihaude, joka pystyy toimimaan 45 ± 1 °C:ssa. 4.1.6 Suurennuslasi, 2-4-kertainen suurennus. 4.1.7 Suurennuslasi, 8-10-kertainen suurennus. 4.1.8 Käsilaskuri. 4.1.9 Sekoitin, jolla pystytään sekoittamaan 1 ml maitonäytettä tai kymmenkertaista laimennosta 9 ml:aan laimennusliuosta, ja joka toimii koeputken sisällön epäkeskisen pyörittämisen periaatteella. 4.2 Välineet 4.2.1 Koeputkia, joissa on sopivat sulkijat ja jotka ovat riittävän tilavia, mukaan lukien riittävä ilmatila sekoittamista varten, 10 ml:lle esilaimennosta tai seuraavia kymmenkertaisia laimennoksia. 4.2.2 Pulloja, joiden tilavuus on 150-250 ml tai putkia, tilavuus noin 20 ml, elatusainetta varten. 4.2.3 Pipettejä (puuvillavanulla suljettuja), jotka ovat lasia tai steriiliä synteettistä materiaalia, joiden kärki on ehjä, joiden nimellistilavuus on 1 ml ja joissa on halkaisijaltaan 1,75-3 mm valumisaukko. 4.2.4 Petrimaljoja, jotka ovat kirkasta väritöntä lasia tai steriiliä synteettistä ainetta, pohjan sisäläpimitta noin 90-100 mm. Sisäsyvyyden tulisi olla vähintään 10 mm. Pohjassa ei saa olla epätasaisuuksia, jotka haittaavat pesäkkeiden laskemista. 4.2.5 Välineiden steriloiminen: Välineet steriloidaan jommallakummalla seuraavista menetelmistä: a) kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta) 170-175 °C:ssa vähintään tunnin ajan, b) autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa vähintään 20 minuutin ajan. Autoklaavissa on pidettävä huolta siitä, että riittävä höyryn tunkeutuminen varmistetaan, esim. astioita ei suljeta tiukasti, jos niissä steriloidaan välineitä, ja pullot suljetaan löyhästi. Autoklaavissa steriloidut välineet on kuivattava höyryn poistamiseksi. Pipetit on steriloitava kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta). 5 Elatusaine - maidon pesäkelaskenta agar-kasvatusalustalla 5.1 Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Rasvattomassa maitojauheessa ei saa olla estäviä aineita, mikä on varmistettava vertailevilla kokeilla käyttämällä rasvatonta maitojauhetta, jonka tiedetään olevan vapaata estoaineista. Valmistaminen: Aineet suspendoidaan ja liuotetaan veteen seuraavassa järjestyksessä: hiivauute, tryptoni, glukoosi ja lopuksi rasvaton maitojauhe. Suspension lämmittäminen auttaa liukenemista. Lisätään agar ja kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen kunnes agar on liuennut kokonaan, tai höyrytetään noin 30 minuutin ajan. Suodatetaan tarvittaessa suodatinpaperin läpi. Tarkastetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta). Säädetään pH tarvittaessa siten, että se on steriloinnin jälkeen 6,9 ± 0,1 25 °C:ssa käyttäen natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta (vähintään 0,1 mol/l). 5.2 Elatusaineen annostelu, sterilointi ja säilytys Elatusainetta (5.1 kohta) annostellaan 100-150 ml:n määrinä pulloihin tai 12-15 ml:n määrinä putkiin (4.2.2 kohta). Pullot ja putket suljetaan. Steriloidaan autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Tarkastetaan elatusaineen pH. Jos elatusainetta ei aiota käyttää välittömästi, sitä säilytetään pimeässä 1-5 °C:n lämpötilassa enintään kuukauden ajan valmistuksesta. 5.3 Kaupallinen kuivattu elatusaine Elatusaine (5.1 kohta) voidaan valmistaa kaupallisesta kuivatusta elatusaineesta. Noudatetaan valmistajan ohjeita, mutta lisätään rasvaton maitojauhe ennen liuottamista, jollei se sisälly kaupalliseen valmisteeseen. Säädetään pH siten, että se on 6,9 ± 0,1 25 °C:ssa, kuten 5.1 kohdassa kuvataan; elatusaine annostellaan, steriloidaan ja säilytetään kuten 5.2 kohdassa kuvataan. 6 Laimennusliuokset 6.1 Peptoni/suolaliuos Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Valmistusaineet liuotetaan veteen, lämmitetään tarvittaessa. Tarkistetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta) ja säädetään tarvittaessa siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,0 ± 0,1 25 °C:ssa käyttäen natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta (vähintään 0,1 mol/l). 6.2 Laimennusliuoksen annostelu, sterilointi ja säilytys Laimennusliuos (6.1 kohta) annostellaan koeputkiin (4.2.1 kohta) sellaisina määrinä, että jokaisessa putkessa on steriloinnin jälkeen 9,0 ± 0,2 ml laimennusliuosta. Putket suljetaan tulpalla. Steriloidaan autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Laimennusliuoksen pH tarkistetaan. Jos laimennusliuosta ei aiota käyttää välittömästi, sitä säilytetään pimeässä 1-5 °C:n lämpötilassa enintään kuukauden ajan valmistuksesta. 6.3 Kaupalliset kuivatut laimennusliuokset Laimennusliuos (6.1 kohta) voidaan valmistaa kaupallisista kuivatuista tableteista tai jauheista. Valmistajan ohjeita on noudatettava. Säädetään pH kuten 6.1 kohdassa kuvataan, laimennusliuokset annostellaan, steriloidaan ja säilytetään kuten 6.2 kohdassa kuvataan. 7 Menettely 7.1 Elatusaineen sulattaminen Sulatetaan nopeasti tarvittava määrä elatusainetta ennen mikrobiologisen tutkimuksen alkua ja jäähdytetään 45 ± 1 °C:seen vesihauteessa (4.1.5 kohta). 7.2 Maitonäytteen valmistaminen 7.2.1 Inkuboidaan avaamatonta pakkausta pastöroitua maitoa, tai jos se on mahdotonta, edustavaa näytettä, vähintään 100 ml, 120 ± 2 tunnin ajan 6 ± 0,5 °C:ssa viljelykaapissa (4.1.3 kohdan a alakohta). 7.2.2 Näyte sekoitetaan inkuboinnin jälkeen huolellisesti, jotta mikro-organismit jakaantuvat niin tasaisesti kuin mahdollista, kääntämällä maitonäyteastia nopeasti ylösalaisin 25 kertaa. Vaahdon muodostumista olisi vältettävä tai vaahdon olisi annettava hajota. Sekoittamisen ja testierän ottamisen välinen aika ei saisi ylittää kolmea minuuttia. 7.3 Esilaimennoksen valmistaminen (10-1) Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml näytteestä (7.2.2 kohta) 9 ml:aan laimennusliuosta (6.1 kohta) välttäen kosketusta pipetin ja laimennusliuoksen välillä. Laimennusliuoksen lämpötilan olisi oltava suunnilleen sama kuin maitonäytteen lämpötila. Tätä esilaimennosta sekoitetaan huolellisesti sekoittimella (4.1.9 kohta) 5-10 sekunnin ajan. Näin saadaan 10-1 esilaimennos. 7.4 Seuraavien kymmenkertaisten laimennosten valmistaminen Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml esilaimennoksesta (7.3 kohta) 9 ml:aan laimennusliuosta (6.1 kohta) 7.3 kohdan ohjeita noudattaen. Näin saadaan 10-2 laimennos. Näitä toimenpiteitä toistetaan seuraavien kymmenkertaisten laimennosten aikaansaamiseksi, kunnes oletetaan, että on saavutettu sopiva määrä mikro-organismeja (8.1 kohta). 7.5 Siirrostus petrimaljoille Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 1 ml näytettä tai sopivaa kymmenkertaista laimennosta maljaan (4.2.4 kohta). Vähintään kahta laimennosta on tutkittava. Valmistetaan kaksi maljaa kustakin sopivaksi arvioidusta laimennoksesta (8.1.1 kohta). 7.6 Valaminen Kaadetaan noin 15-18 ml elatusainetta (7.1 kohta) kuhunkin siirrostettuun maljaan. Sekoitetaan välittömästi liikuttamalla petrimaljaa riittävästi, jotta pesäkkeet olisivat tasaisesti jakaantuneina inkuboinnin jälkeen. Aika maitonäytteen valmistamisen päättymisestä siihen, kun laimennos sekoitetaan elatusaineen kanssa, ei saa ylittää 15 minuuttia. Maljojen annetaan seistä puhtaalla, viileällä vaakasuoralla pinnalla. 7.7 Petrimaljojen inkubointi Maljat siirretään viljelykaappiin (4.1.3 kohdan b alakohta). Maljoja inkuboidaan ylösalaisin käännettyinä. Enintään kuusi maljaa saa asettaa päällekkäin. Maljapinojen tulisi olla erillään toisistaan ja viljelykaapin seinistä ja katosta. Inkuboidaan 21 ± 1 °C:ssa 25 tuntia. 7.8 Pesäkkeiden laskenta Pesäkkeet lasketaan sellaisista petrimaljoista, joissa kasvaa enintään 300 pesäkettä. Maljat tutkitaan himmennetyssä valossa. Laskemisen helpottamiseksi voidaan käyttää suurennuslasia (4.1.6 kohta) ja/tai käsilaskuria (4.1.8 kohta). On vältettävä sekoittamasta muita saostuneita hiukkasia kooltaan neulankärjen kokoisiin pesäkkeisiin. Epävarmoissa tapauksissa viljelmää on tarkasteltava äärimmäisen huolellisesti käyttäen tarvittaessa voimakkaammin suurentavaa suurennuslasia (4.1.7 kohta) pesäkkeiden erottamiseksi vieraasta aineesta. Leviäviä pesäkkeitä pidetään yksittäisinä pesäkkeinä. Jos alle neljäsosa maljasta on leviävien pesäkkeiden peitossa, lasketaan maljan puhtaassa osassa olevat pesäkkeet ja vastaava määrä koko maljaa kohti. Jos yli yksi neljäsosa maljasta on leviävien pesäkkeiden peitossa, malja hylätään. 8 Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen 8.1 Käytetään niiden maljojen lukemia, joissa kasvaa 10-300 pesäkettä (ks. 8.3 ja 8.4 kohta). 8.2 Mikro-organismien määrä 1 ml pastöroitua maitoa kohti saadaan seuraavasta kaavasta: >NUM>Ó C >DEN>(n1 + 0,1 n2) d jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulos ilmoitetaan kahden merkitsevän numeron tarkkuudella. Kun pyöristettävä numero on viisi, pyöristetään siten, että sen vasemmalla puolella olevasta numerosta tulee parillinen. Esimerkki: Laimennos 10-2: 278 ja 290 pesäkettä Laimennos 10-3: 33 ja 28 pesäkettä Määrä/ml = >NUM>278 + 290 + 33 + 28 >DEN>(2 + 0,1 × 2) 10-2 = >NUM>629 >DEN>0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 104. 8.3 Jos saadaan vain alle 10 olevia lukemia, mikro-organismien määrä millilitraa kohti ilmoitetaan seuraavasti: "alle 10 × d per ml", kun "d" on alimman laimennuskertoimen käänteisluku. 8.4 Jos saadaan vain yli 300 olevia lukemia, mutta laskeminen on mahdollista, lasketaan arvioitu lukema ja kerrotaan se laimennuskertoimen käänteisluvulla. Tulos ilmoitetaan seuraavasti: "mikro-organismien arvioitu määrä millilitraa kohti". 9 Täsmällisyys Kansainvälisesti hyväksytyistä kollaboratiivisista tutkimuksista ei ole vielä saatavilla tuloksia. VI KOLIRYHMÄN BAKTEERIEN MÄÄRITTÄMINEN - PESÄKEMÄÄRÄ 30 °C:SSA 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä koliryhmän bakteerien määrittämiseksi pastöroidusta maidosta pesäkelaskentatekniikalla 30 °C:ssa. 2 Määritelmä `Koliryhmän bakteereilla` tarkoitetaan bakteereita, jotka muodostavat 30 °C:ssa tyypillisiä ja epätyypillisiä pesäkkeitä, jotka käyttävät kuvatuissa oloissa laktoosia muodostaen kaasua. 3 Periaate Määrätty tilavuus maitonäytettä sekoitetaan elatusaineen kanssa petrimaljoissa ja inkuboidaan 30 °C:ssa 24 tuntia. Tyypilliset pesäkkeet lasketaan ja tarvittaessa varmistetaan epätyypilliset pesäkkeet testaamalla niiden kyky käyttää laktoosia. Sen jälkeen lasketaan koliryhmän bakteerien määrä 1 ml:ssa pastöroitua maitoa. 4 Laitteet ja välineet Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 4.1. Laitteet 4.1.1 Kuumailmakaappi, joka pystyy toimimaan 170-175 °C:ssa. 4.1.2 Autoklaavi, joka pystyy toimimaan 121 ± 1 °C:ssa. 4.1.3 Viljelykaappi, joka pystyy toimimaan 30 ± 1 °C:ssa. 4.1.4 pH-mittari, jossa on lämpötilakompensointi, tarkkuus ± 0,1 pH-yksikköä. 4.1.5 Vesihaude, joka pystyy toimimaan 45 ± 1 °C:ssa. 4.1.6 Platinairidiumista tai nikkelikromista valmistettu siirrostuslanka. 4.2 Välineet 4.2.1 Koeputkia, joissa on sopivat sulkijat ja joiden tilavuus on noin 20 ml, varmistusalustaa varten (5.2 kohta), ja sopivan kokoisia Durham-putkia käytettäviksi koeputkien kanssa. 4.2.2 Pulloja, joiden tilavuus on 150-250 ml, kiinteää valikoivaa alustaa varten (5.1 kohta). 4.2.3 Pipettejä (puuvillavanulla suljettuja), jotka ovat lasia tai steriiliä synteettistä materiaalia, joiden kärki on ehjä, joiden nimellistilavuus on 1-10 ml ja joissa on halkaisijaltaan 1,75-3 mm valumisaukko. 4.2.4 Petrimaljoja, jotka ovat kirkasta väritöntä lasia tai steriiliä synteettistä ainetta ja joiden pohjan sisäläpimitta on noin 90-100 mm. Sisäsyvyyden tulisi olla vähintään 10 mm. Pohjassa ei saa olla epätasaisuuksia, jotka haittaavat pesäkkeiden laskemista. 4.2.5 Välineiden steriloiminen: Välineet steriloidaan jommallakummalla seuraavista menetelmistä: a) kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta) 170-175 °C:ssa vähintään tunnin ajan, b) autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa vähintään 20 minuutin ajan. Autoklaavissa on pidettävä huolta siitä, että riittävä höyryn tunkeutuminen varmistetaan, esim. astioita ei suljeta tiiviisti, jos niissä steriloidaan välineitä, ja pullot suljetaan löyhästi. Autoklaavissa steriloidut välineet on kuivattava höyryn poistamiseksi. Pipetit on steriloitava kuumailmakaapissa (4.1.1 kohta). 5 Elatusaineet 5.1 Violetti-puna-sappi-laktoosiagar (VRBL-agar). Kiinteä valikoiva alusta. Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Suspendoidaan ja liuotetaan aineet veteen ja annetaan seistä usean minuutin ajan. Sekoitetaan voimakkaasti. Tarkistetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta) ja säädetään pH tarvittaessa natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta käyttäen (vähintään 0,1 mol/l) siten, että se on keittämisen jälkeen 7,4 ± 0,1 25 °C:ssa. Kuumennetaan nopeasti kiehuvaksi välillä sekoittaen ja annostellaan välittömästi 100-150 ml:n määrinä steriileihin pulloihin (4.2.2 kohta). Elatusaine jäähdytetään vesihauteessa (4.1.5 kohta) 45 ± 1 °C:sen. Elatusaineen steriiliys on tarkistettava käyttöajankohtana (ks. 6.4 kohta). Elatusaine on käytettävä kolmen tunnin kuluessa sen valmistamisesta. 5.2 Briljanttivihreä-laktoosisappiliemi. Varmistusalusta. Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Aineet liuotetaan veteen keittämällä. Tarkistetaan pH pH-mittarilla (4.1.4 kohta) ja säädetään pH tarvittaessa natriumhydroksidi- tai suolahappoliuosta käyttäen (vähintään 0,1 mol/l) siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,2 ± 0,1 25 °C:ssa. Elatusaine annostellaan 10 ml:n määrinä koeputkiin (4.2.1 kohta), joissa on Durham-putket (4.2.1 kohta). Putket suljetaan. Steriloidaan autoklaavissa (4.1.2 kohta) 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Durham-putkissa ei saa olla ilmakuplia steriloinnin jälkeen. Tarkistetaan elatusaineen pH. Jos elatusainetta ei aiota käyttää välittömästi, sitä säilytetään pimeässä 0-5 °C:n lämpötilassa enintään kuukauden ajan valmistuksesta. 5.3 Kaupalliset kuivatut elatusaineet Elatusaineet (5.1 ja 5.2 kohta) voidaan valmistaa kaupallisista kuivatuista elatusaineista. Valmistajan ohjeita on noudatettava. Säädetään pH; elatusaineet annostellaan ja keitetään tai steriloidaan ja säilytettään 5.1 ja 5.2 kohdassa kuvatulla tavalla. 6 Suoritus 6.1 Elatusaine Käytetään 5.1 kohdassa kuvattua elatusainetta (VRBL-agar). 6.2 Maitonäytteen valmistaminen Maitonäyte sekoitetaan huolellisesti kääntämällä näyteastia nopeasti ylösalaisin 25 kertaa, jotta mikro-organismit jakaantuvat mahdollisimman tasaisesti. Vaahdon muodostumista olisi vältettävä tai vaahdon olisi annettava hajota. Sekoittamisen ja koe-erän ottamisen välinen aika ei saisi olla yli kolme minuuttia. 6.3 Siirrostus petrimaljoihin Siirrostetaan steriilillä pipetillä (4.2.3 kohta) 3 ml maitonäytettä (6.2 kohta), 1 ml kuhunkin kolmeen maljaan (4.2.4 kohta). 6.4 Valaminen Kaadetaan noin 12 ml VRBL-agaria (6.1 kohta) kuhunkin viljeltyyn maljaan. Sekoitetaan välittömästi kaatamisen jälkeen liikuttamalla petrimaljaa riittävästi, jotta pesäkkeet olisivat tasaisesti jakaantuneina inkuboinnin jälkeen. Aika maitonäytteen valmistamisen päättymisestä koe-erän sekoittamiseen elatusaineen kanssa saa olla enintään 15 minuuttia. Steriiliyden varmistamiseksi valmistetaan vertailunäyte viljelemättömään maljaan käyttäen 12 ml VRBL-agaria, jota käytettiin viljellyissä maljoissa. Annetaan seistä puhtaalla, viileällä vaakasuoralla pinnalla, kunnes viljelyalusta on jähmettynyt. Kun alusta on jähmettynyt täydellisesti, kaadetaan vähintään 4 ml VRBL-agaria (6.1 kohta) viljellyn alustan pinnalle. Annetaan jähmettyä. 6.5 Petrimaljojen inkubointi Maljat siirretään viljelykaappiin (4.1.3 kohta). Niitä inkuboidaan ylösalaisin käännettyinä. Enintään kuusi maljaa saa asettaa päällekkäin. Maljapinojen tulisi olla erillään toisistaan ja viljelykaapin seinistä ja katosta. Inkuboidaan 30 ± 1 °C:ssa 24 ± 2 tuntia. 6.6 Pesäkkeiden laskenta 6.6.1 Pesäkkeet lasketaan sellaisista petrimaljoista, joissa kasvaa enintään 150 pesäkettä. Lasketaan halkaisijaltaan vähintään 0,5 mm:n suuruiset tummanpunaisiksi värjäytyneet pesäkkeet, joiden ympärillä on tai ei ole saostumaa ja jotka ovat koliryhmän bakteereille tyypillisiä pesäkkeitä. 6.6.2 Jos kaikki tai osa pesäkkeistä on ulkonäöltään epätyypillisiä (esim. eroavat värin tai koon tai saostuman muodostumisen suhteen tyypillisistä pesäkkeistä), suoritetaan varmistuskoe (6.7 kohta). 6.7 Varmistuskoe Suoritetaan 6.6.2 kohdassa annettujen tuntomerkkien perusteella varmistuskoe sopivalle määrälle (esim. 3-5) epätyypillisiä pesäkkeitä siirrostamalla niitä siirrostuslankaa käyttäen (4.1.6 kohta) koeputkiin, joissa on briljanttivihreä-laktoosisappilientä (5.2 kohta). Putkia inkuboimaan 30 ± 1 °C:ssa 24 ± 2 tuntia. Pesäkkeet, jotka saavat aikaan kaasun muodostumista Durham-putkissa, katsotaan koliryhmään kuuluviksi. 7 Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen 7.1 Laskenta tehdään sellaisista maljoista (ks. 7.4 kohta), joissa kasvaa enintään 150 pesäkettä. 7.2 Jos varmistuskoe suoritetaan, lasketaan koliryhmän bakteerien pesäkkeiden määrä varmistettujen koliryhmän bakteerien pesäkkeiden määrästä. 7.3 Koliryhmän bakteerien määrä 1 ml pastöroitua maitoa kohti saadaan seuraavasta kaavasta: >NUM>Ó C >DEN>n jossa: >TAULUKON PAIKKA> Laskeminen tapahtuu kahden merkitsevän numeron tarkkuudella, kun pesäkkeitä on yli 100. Kun pyöristettävä luku päättyy numeroon viisi, pyöristetään siten, että seuraavana vasemmalla olevasta luvusta tulee parillinen. Jos saadaan vain yli 150 olevia lukemia, tulos ilmoitetaan seuraavasti: "koliryhmän bakteerien arvioitu määrä 1 ml:aa kohti". 8 Täsmällisyys Kansainvälisesti hyväksytyistä kollaboratiivisista tutkimuksista ei ole vielä saatavilla tuloksia. VII SOMAATTISTEN SOLUJEN LASKEMINEN Tässä esitetään kaksi vertailumenetelmää somaattisten solujen laskemiseksi: A. Mikroskooppimenetelmä B. Fluoro-optoelektroninen menetelmä A. Mikroskooppimenetelmä 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä somaattisten solujen laskemiselle raakamaidosta. Tässä esitetään maitonäytteessä olevien solujen "todellisen" määrän laskentamenetelmä fluoro-optoelektronisen menetelmän tarkkuuden kalibroimiseksi ja tarkistamiseksi (ks. B.1 kohta). 2 Määritelmä Tässä menetelmässä somaattiset solut ovat niitä soluja, esim. leukosyyttejä ja epiteelin soluja, joiden tumat voidaan värjätä selvästi metyleenisinellä. 3 Periaate Levitetään 0,01 ml maitoa 1 cm²:n alalle objektilasille. Kalvo kuivataan ja värjätään. Laskeminen suoritetaan mikroskooppia käyttäen. Määrätyltä alueelta laskettujen somaattisten solujen lukumäärä kerrotaan työskentelyvakiolla, jotta saataisiin solujen määrä/ml. 4 Reagenssit On käytettävä analyysilaatua olevia kemikaaleja. Väriliuos Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Varoitus Koska tetrakloorietaani on myrkyllistä, sen käsittelyn on tapahduttava vetokaapissa. Valmistaminen: Etanoli ja 1,1,1-trikloorietaani tai tetrakloorietaani sekoitetaan pullossa ja kuumennetaan vesihauteessa 60-70 °C:seen. Lisätään metyleenisini, sekoitetaan huolellisesti, jäähdytetään jääkaapissa 4 °C:seen 12-24 tunnin ajan ja lisätään jääetikka. Suodatetaan käyttäen suodatinta, jonka huokoskoko on enintään 10-12 mikronia ja väriliuos säilytetään ilmatiiviissä pullossa. Jos muodostuu hiukkasia tai sakkaa, suodatetaan uudelleen ennen käyttöä. 5 Laitteet ja välineet 5.1 Mikroskooppi, suurennus × 500-x 1 000. 5.2 Mikroruisku, 0,01 ml:n annostelutarkkuus ± 2 % tai parempi. 5.3 Objektilasi, jossa on kalvoa varten kaiverrettu 20 mm × 5 mm alue, tai standardiobjektilasi ja 20 mm × 5 mm:n kaavain kalvoa varten. 5.4 Vaakasuora lämpölevy, (30-50 °C) objektilasien kuivaamista varten. 5.5 Puhallin (hiustenkuivaaja) kalvon kuivaamista varten. 5.6 Vesihaude, jonka toiminta-alue on 30-40 °C:ssa maitonäytteen lämmittämiseksi. 5.7 Objektimikrometri, 0,01 mm:n asteikolla. 6 Menettely 6.1 Maitonäyte Maitonäyte on tutkittava kuuden tunnin kuluessa näytteenotosta. Näytteen lämpötila ei saa säilytyksen aikana ylittää 6 °C. Jäätymistä on vältettävä. 6.2 Näytteen valmistaminen laboratoriossa Näyte kuumennetaan vesihauteessa (5.6 kohta) 30-40 °C:seen ja sekoitetaan sitten huolellisesti. Jäähdytetään siihen lämpötilaan, jossa mikroruisku (5.2 kohta) on kalibroitu, esim. 20 °C. 6.3 Objektilasien esikäsittely Objektilasit (5.3 kohta) puhdistetaan esimerkiksi etanolilla, kuivataan pölyttömällä paperilla, liekitetään ja jäähdytetään. Säilytetään laatikossa pölyltä suojattuna. 6.4 Kalvon valmistaminen Mikroruiskulla (5.2 kohta) otetaan 0,01 ml maitoa edellä esitetyn mukaisesti valmistetusta näytteestä. Mikroruiskun maitoa koskettanut ulkopinta puhdistetaan huolellisesti. Ruiskun sisältö tyhjennetään objektilasille (5.3 kohta), jolle on ensin rajattu suorakaiteen muotoinen alue (20 × 5 mm). Sen jälkeen näyte levitetään mahdollisimman tasaisesti tälle alueelle. Kalvo asetetaan kuivumaan lämpölevylle (5.4 kohta), kunnes se on täysin kuiva. Kustakin maitonäytteestä on valmistettava ja tutkittava vähintään kaksi kalvoa. 6.5 Kalvojen värjääminen Kalvot upotetaan väriliuokseen (4 kohta) 10 minuutiksi. Kuivataan, täydentäen kuivausta tarvittaessa puhaltimella (5.5 kohta). Kalvot upotetaan veteen, kunnes kaikki ylimääräinen väri on huuhtoutunut pois. Kuivataan uudelleen ja säilytetään pölyltä suojattuna. 6.6 Mikroskoopin näkökentän kalibrointi Mikroskoopin näkökentän läpimitta määritetään objektimikrometriä (5.7 kohta) käyttäen valitun suurennuksen mukaan (× 500-× 1 000). 7 Laskeminen 7.1 Solujen laskeminen Käytetään mikroskooppia (5.1 kohta). Solujen sijasta lasketaan vain solujen tumat, jotka ovat selvästi tunnistettavissa, ja joista vähintään puolet on näkyvissä mikroskoopin näkökentässä. Lasketaan kalvon keskikolmanneksessa olevat kaistaleet ja kentät, on vältettävä laskemasta kaistaleita tai kenttiä, jotka on valittu yksinomaan kalvon reuna-alueilta. Kalvojen huolellinen valmistelu, ja siten tulosten luotettavuus, on tarkastettava vähintään kerran kuukaudessa laskemalla kalvon eri osia. Laskeminen voidaan myös suorittaa laskemalla mikroskoopin näkökenttiä siten, että kaikki kalvon osat ovat yhtäläisesti edustettuina. 7.2 Laskettavien solujen vähimmäismäärä Koska somaattisten solujen mikroskooppista laskemista voidaan käyttää myös automaattisten ja mekaanisten laskentamenetelmien standardointiin, samanlaisten näytteiden lukemien variaatiokerroin ei saa olla korkeampi kuin elektronisten laitteiden variaatiokerroin. 400 000-600 000 solua/ml sisältävän maitonäytteen variaatiokerroin ei saisi olla yli 5 %. Kustakin näytteestä laskettavien somaattisten solujen määrän on Poissonin jakauman ominaisuuksien mukaan oltava vähintään 400, jotta se täyttäisi tämän toistettavuuden. Poissonin jakaumassa oletetaan M = V = s², jossa >TAULUKON PAIKKA> ja s on standardipoikkeama. Variaatiokerroin on: >VIITTAUS KAAVIOON> M (keskiarvo) osoittaa laskettujen hiukkasten (solujen) määrän (eli 400, kun CV = 5 %). 7.3 Työskentelyvakion laskeminen Työskentelyvakio lasketaan 7.3.1 tai 7.3.2 kohdan mukaisesti käyttäen 0,01 ml maitoa. 7.3.1 Kalvolla olevien kaistaleiden laskeminen Laskettavien kaistaleiden pituus on 5 mm, eli sama kuin kalvon leveys. Kaistaleen leveys vastaa mikroskoopin näkökentän läpimittaa määritettynä objektimikrometriä käyttäen (5.7 kohta). Työskentelyvakio = >NUM>20 × 100 >DEN>d × b jossa: >TAULUKON PAIKKA> 7.3.2 Kalvon keskikolmanneksessa olevien mikroskoopin näkökenttien laskeminen tai ristikon avulla laskeminen: >VIITTAUS KAAVIOON> jossa: >TAULUKON PAIKKA> 7.4 Solupitoisuuden laskeminen Laskettujen somaattisten solujen määrä (7.1 ja 7.2 kohta) kerrotaan työskentelyvakiolla (7.3 kohta), jotta saataisiin solujen määrä/ml maitoa. 7.5 Täsmällisyys Toistettavuuden variaatiokerroin (ks. 7.2 kohta) saa olla enintään 5 %. Kansainvälisesti hyväksytyistä kollaboratiivisista tutkimuksista ei ole vielä saatavilla tuloksia. B. Fluoro-optoelektroninen menetelmä 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään vertailumenetelmä, jota voidaan asianmukaisen kalibroinnin jälkeen (ks. A.1 kohta) käyttää somaattisten solujen laskemiseen raakamaidosta, johon joko on tai ei ole lisätty kemiallisia säilöntäaineita. 2 Määritelmä Tässä menetelmässä somaattisilla soluilla tarkoitetaan hiukkasia, joilla on vähimmäisfluoresenssivoimakkuus somaattisten solujen tumassa olevan DNA:n värjäytymisen vuoksi. 3 Periaate Osa näytteestä (esimerkiksi 0,2 ml) sekoitetaan huolellisesti puskuriliuoksen ja fluoresoivan liuoksen kanssa. Osa tästä seoksesta siirretään sitten ohuena kalvona pyörivälle levylle, joka toimii objektitasona. Kukin solu tuottaa sähköpulssin, joka vahvistetaan ja rekisteröidään. Somaattisten solujen määrä kirjoitetaan tuhansina millilitraa kohti. 4 Reagenssit On käytettävä analyysilaatua olevia kemikaaleja, jollei toisin määrätä. Veden on oltava joko tislattua tai deionisoitua tai yhtä puhdasta vettä. 4.1 Puskuriliuos Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Eri aineosat sekoitetaan. Säilytetään ilmatiivisti enintään seitsemän vuorokauden ajan. 4.2 Fluoresoiva liuos (kantaliuos) Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Etidiumbromidi liuotetaan veteen. Säilytetään ilmatiiviissä pullossa valolta suojattuna enintään kaksi kuukautta. 4.3 Fluoresoiva liuos (käyttöliuos) 20 ml kantaliuosta (4.2 kohta) sekoitetaan puskuriliuokseen (4.1 kohta) tilavuuteen 1 000 ml. Käyttöliuosta saa käyttää enintään seitsemän vuorokauden ajan. 4.4 Puhdistusliuos Koostumus: >TAULUKON PAIKKA> Valmistaminen: Eri aineosat sekoitetaan. Saa säilyttää enintään 30 vuorokautta. 5 Laitteet ja välineet 5.1 Laskijalaite, joka toimii fluoresenssioptisella periaatteella. Huomautus Laite on kalibroitava ennen käyttöä. Siten määritetään laskettavien hiukkasten tilavuuden ja laskentarajan välinen suhde. Laitteiden kalibrointi suoritetaan valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen näytteitä, joiden solupitoisuus on määritetty mikroskooppimenetelmällä (A). 5.2 Vesihaude, jossa on kiertovirtaus ja jonka toiminta-alue on 40 ± 1 °C. 5.3 Koeputki, jossa on sopiva suljin, noin 15 ml. 6 Maitonäyte 6.1 Näytettä on säilytettävä alhaisessa lämpötilassa koeputkessa (5.3 kohta). Jos näyte ei sisällä kemiallisia säilöntäaineita, laskentaa ei saa suorittaa ensimmäisten 24 tunnin kuluessa lypsämisestä, koska lukemat ovat liian pieniä. Säilytyslämpötila ei saa olla yli 6 °C. 6.2 Säilöntäaineiden lisääminen Kemiallinen säilöntä on suoritettava 24 tunnin kuluessa. Säilöntäaineet on lisättävä mahdollisimman pian näytteenoton jälkeen. 6.2.1 Näytteen kemiallinen säilöntä tapahtuu lisäämällä yhtä seuraavista säilöntäaineista: - ortoboorihappo: ortoboorihapon loppuväkevyys näytteessä saa olla enintään >NUM>0,6 g >DEN>100 ml . Näin säilöttyä näytettä voidaan säilyttää edelleen enintään 24 tuntia 6-12 °C:ssa, - kaliumdikromaatti: kaliumdikromaatin loppuväkevyys saa olla enintään >NUM>0,2 g >DEN>100 ml . Näin säilöttyjä näytteitä voidaan säilyttää edelleen enintään 72 tuntia 6-12 °C:ssa, - natriumatsidi: näyte voidaan säilöä natriumatsidilla >NUM>0,024 mg >DEN>100 ml :n loppuväkevyyteen, edellyttäen että näyte jäähdytetään 6-12 °C:seen välittömästi näytteenoton jälkeen ja lasketaan 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, - bronopol: näyte voidaan säilöä bronopolilla >NUM>0,05 mg >DEN>100 ml :n loppuväkevyyteen, edellyttäen, että näyte jäähdytetään 6-12 °C:seen välittömästi näytteenoton jälkeen ja lasketaan 72 tunnin kuluessa näytteenotosta. 6.2.2 Jo ortoboorihapolla säilöttyä näytettä voidaan edelleen säilyttää enintään 48 tuntia lisäämällä siihen kaliumdikromaattia. Huomautus Kaliumdikromaatilla säilöttyjen näytteiden osalta on noudatettava jätevesipäästöjä koskevia paikallisia määräyksiä. 7 Menettely 7.1 Näytteen esikäsittely Tutkittavaa maitoa on säilytettävä lypsämisen jälkeen vähintään 24 tunnin ajan noin 2-6 °C:ssa. Näytteiden laskeminen lypsypäivänä ei ole suositeltavaa ilman esikäsittelyä, koska tulokset saattavat olla liian matalat. Jos laskeminen kuitenkin on välttämätöntä, näyte on esikäsiteltävä vähintään kolmen tunnin ajan kaliumdikromaatilla (ks. 6.2.1 kohta). 7.2 Valmistus Esikäsitelty näyte (7.1 kohta) tai vähintään yhden vuorokauden ikäinen käsittelemätön näyte kuumennetaan vesihauteessa (5.2 kohta) noin 40 °C:seen. Näytettä säilytetään sen jälkeen huoneenlämmössä laskemishetkeen saakka. 7.3 Solujen laskeminen Laskeminen suoritetaan käyttäen laskentalaitetta (5.1 kohta) 15 minuutin kuluessa kuumennuksen päättymisestä (ks. 7.2 kohta). Näytettä on sekoitettava huolellisesti välittömästi ennen laskemista, jotta somaattiset solut jakautuvat mahdollisimman tasaisesti. Näytteen jatkolaimennuksen ja lisämuokkauksen on tapahduttava automaattisesti laitteessa. 8 Täsmällisyys Toistettavuus- (r) ja uusittavuuslukuja (R) kansainvälisesti hyväksytyistä kollaboratiivisista tutkimuksista ei ole saatavilla. Kansallisella tasolla saatavien tietojen perusteella voidaan esittää seuraavat arviot: Solupitoisuuden taso 400 000-500 000/ml - toistettavuuden standardipoikkeama: sr = 20 000 solua/ml (vastaa 5-4 %:n variaatiokerrointa) - uusittavuuden standardipoikkeama: sR = 40 000 solua/ml (vastaa 10-8 %:n variaatiokerrointa) 9 Tarkkuuden valvonta Tarkkuutta valvotaan käyttäen näytteitä, joiden solupitoisuus on määritetty mikroskooppisesti kansallisessa vertailulaboratoriossa. VIII ANTIBIOOTTIEN JA SULFONAMIDIEN TOTEAMINEN TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tässä esitetään vertailumenetelmä antibioottien ja sulfonamidien toteamiseksi raakamaidosta ja lämpökäsitellystä maidosta. Vertailumenetelmään sisältyy: A. Kvalitatiivinen menetelmä Tällä seulontamenetelmällä valikoidaan maitonäytteet, jotka sisältävät antibiootteja ja sulfonamideja. Esitetty menetelmä on yksi niistä menetelmistä, joiden periaatteena on käyttää testiorganismina Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATCC 10149:ää. Menetelmä on valittu edustamaan kaikkia tällaisia testejä. B. Menetelmä penisilliinin esiintymisen varmistamiseksi ja tunnistamiseksi Tätä menetelmää on käytettävä kvalitatiivisen menetelmän A tulosten varmistamiseksi, penisilliinin tunnistamiseksi ja sen pitoisuuden määrittämiseksi. A. Kvalitatiivinen menetelmä 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään menetelmä antibioottien ja sulfonamidien kvalitatiiviseksi toteamiseksi raakamaidosta ja lämpökäsitellystä maidosta, kun niiden pitoisuus ylittää taulukossa ilmoitetut rajat: >TAULUKON PAIKKA> 2 Määritelmä Maito sisältää antibiootteja tai sulfonamideja, kun elatusaineen väri ei ole muuttunut (ks. 7.1 kohta). 3 Periaate Maitonäyte laitetaan yhdessä ravinteiden kanssa agargeeliin, joka sisältää pH-indikaattorin ja Bacillus stearothermophilus var. calidolactis -itiöitä (ks. 5.41 kohta), bakteerikanta ATCC 10149, jolla on hyvä yleisherkkyys ja joka on erityisen herkkä penisilliinille. Organismin normaali kasvu ja hapontuotanto inkubaation seurauksena saavat pH-indikaattorin värin muuttumaan purppuranpunaisesta keltaiseksi. Jos maidossa on aineita, jotka estävät testiorganismin kasvua, pH-indikaattori pysyy väriltään purppuranpunaisena. 4 Laitteet ja välineet Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 4.1 Laitteet 4.1.1 Viljelykaappi, joka pystyy ylläpitämään 64 ± 1 °C:n lämpötilan 4.1.2 Vesihaude, joka pystyy toimimaan 64 ± 1 °C:ssa 4.1.3 Teline koeputkille tai ampulleille 4.1.4 Kertakäyttöinen injektioruisku, 0,1 ml:n näytteenottoon ja annosteluun sopivat kertakäyttöiset kärjet 4.1.5 Pinsetit 4.1.6 Kuumailmakaappi, joka pystyy toimimaan 170-175 °C:ssa 4.1.7 Autoklaavi, joka pystyy toimimaan 121 ± 1 °C:ssa 4.1.8 pH-mittari. 4.2 Välineet 4.2.1 Näytepulloja, joissa on sopivat sulkimet. Huomautus Joistakin kumitulpista saattaa jäädä estoaineita pullon kaulaan. 4.2.2 Petrimaljoja, jotka ovat kirkasta väritöntä lasia tai steriiliä synteettistä ainetta ja joiden pohja on tasainen, sisäläpimitta vähintään noin 140 mm. 4.2.3 Pulloja, joiden tilavuus on 250 ml. 4.2.4 Pipettejä (puuvillavanulla suljettuja), jotka ovat lasia tai steriiliä synteettistä materiaalia ja joiden nimellistilavuus on 1 ml ja 10 ml. 4.2.5 Lasisia spaatteleita 4.2.6 Koeputkia tai ampulleja, sisäläpimitta noin 8 mm, joissa on tulpat tai sulkijat. 4.2.7 Välineiden steriloiminen Välineet olisi steriloitava jommallakummalla seuraavista menetelmistä: a) kuumailmakaapissa 170-175 °C:ssa vähintään tunnin ajan (4.1.6 kohta), b) autoklaavissa 121 ± 1 °C:ssa vähintään 20 minuutin ajan (4.1.7 kohta). Autoklaavissa olisi pidettävä huolta siitä, että riittävä höyryn tunkeutuminen varmistetaan - esim. astioita ei suljeta tiukasti, jos niissä steriloidaan välineitä, ja pullot suljetaan löyhästi. Autoklaavissa steriloidut välineet on kuivattava höyryn poistamiseksi. Pipetit on steriloitava kuumailmakaapissa. 5 Elatusaineet, liuokset, testiorganismi Elatusaineen aineosien on oltava bakteriologisiin analyyseihin soveltuvia. Käytettävän veden on oltava tislattua tai vähintään yhtä puhdasta demineralisoitua vettä. Siinä ei saa olla aineita, jotka estävät testiorganismin kasvua. 5.1 Elatusaineet 5.1.1 Ravintoagar Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistus Aineosat liuotetaan veteen. Kuumennetaan kiehuvaksi välillä sekoittaen. Säädetään pH siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,4 ± 0,1-25 °C:ssa. Annostellaan 10 ml:n määrinä koeputkiin tai 100 ml:n määrinä pulloihin, kallistetaan kaltevan pinnan aikaansaamiseksi. Steriloidaan 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. 5.1.2 Agar-elatusaine Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistus Aineosat liuotetaan trimetopriimiä tai tetroksopriimiä lukuun ottamatta veteen. Kuumennetaan kiehuvaksi välillä sekoittaen. Lisätään trimetopriimi tai tetroksopriimi ja steriloidaan 121 ± 1 °C:ssa 15 minuutin ajan. Säädetään pH siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,0 ± 0,125 °C:ssa. 5.1.3 Trimetopriimi- tai tetroksopriimiliuos Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistus Trimetopriimi tai tetroksopriimi liuotetaan etanoliin (5 tai 30 ml) ja laimennetaan vedellä. 5.1.4 Ravinne Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistus Ravinteet ja indikaattori liuotetaan veteen tarvittaessa kuumentamalla, steriloidaan suodattamalla. Ravinnetta on kaupallisesti saatavissa tabletteina. 5.2 Penisilliinistandardiliuokset 5.2.1 Valmistetaan 60 ìg/ml:n penisilliiniliuos = (100 k.y./ml) liuottamalla kiteistä natrium- tai kaliumbentsyylipenisilliiniä steriiliin tislattuun veteen sopivassa sulkimella varustetussa steriilissä pullossa. 5.2.2 Valmistetaan penisilliinikäyttöliuos laimentamalla 1,25 ml penisilliiniliuosta (5.2.1 kohta) steriilillä tislatulla vedellä tilavuuteen 1 000 ml. Tämä käyttöliuos sisältää 0,075 ìg penisilliiniä ml:aa kohti (= 0,125 k.y./ml). 5.2.3 Valmistetaan 75 ml penisilliinistandardiliuosta, joka sisältää 0,004 ìg/mg penisilliiniä ml:aa kohti (= 0,0067 k.y./ml) lisäämällä 4 ml penisilliinikäyttöliuosta (5.2.2 kohta) 71 ml:aan maitoa, jossa ei ole estoaineita (5.3 kohta) ja sekoittamalla. 5.2.4 Edellä 5.2.1-5.2.3 kohdassa mainitut penisilliiniliuokset on valmistettava sinä päivänä, jona testi suoritetaan. 5.3 Maito, jossa ei ole estoaineita Valmista vertailunäytteeksi maitoa, jossa ei ole estoaineita, sekoittamalla aiemmin testattua ja estoaineettomaksi todettua rasvatonta maitojauhetta (10 % m/t) steriiliin tislattuun veteen. Vaihtoehtoisesti voidaan jakaa riittävä määrä testattua ja estoaineettomaksi todettua irtomaitoa pulloihin, kuumentaa tunnin ajan 100 °C:ssa ja säilyttää sen jälkeen jääkaapissa 0-6 °C:ssa enintään viikon ajan. 5.4 Testiorganismi 5.4.1 Bacillus stearothermophilus var. calidolactus -kantaa ATCC 10149 käytetään testiorganismina. Kanta ATCC 10149 on identtinen C 953:n kanssa. 5.4.2 Testiviljelmästä valmistetaan kantaviljelmä kannan ylläpitämiseksi. Säilytys tapahtuu kaltevalla ravintoagaralustalla (5.1.1 kohta). Sille siirrostetaan silmukalla testiviljelmää, ja sitä inkuboidaan aerobisesti 48 tunnin ajan 63 ± 1 °C:ssa. Koeputki suljetaan inkuboinnin jälkeen tiiviisti steriilillä kumitulpalla. Näin saatua kantaviljelmää voidaan säilyttää useita kuukausia jääkaapissa 5 °C:ssa. 5.5 Testiviljelmä (itiösuspensio) 5.5.1 Kaadetaan 20 ml sulatettua ravintoagaria (5.1.1 kohta) aseptisesti steriiliin petrimaljaan (4.2.2 kohta) ja jäähdytetään huoneenlämpötilaan. 5.5.2 Steriilillä pipetillä (4.2.4 kohta) siirretään 5 ml steriiliä tislattua vettä koeputkeen, jossa on kantaviljelmää (5.4.2 kohta) ja itiöt huuhdellaan irti kaltevalta agaralustalta steriiliä silmukkaa käyttäen. Itiösuspensiota säilytetään 5 °C:ssa ja se on käytettävä 36 tunnin kuluessa. 5.5.3 Steriilillä pipetillä (4.2.4 kohta) siirretään 0,5 ml itiösuspensiota (5.5.2 kohta) viljelymaljaan (5.1.1 kohta) ja siirrostettava suspensio levitetään huolellisesti koko pinnalle taivutetulla lasisauvalla. Inkuboidaan 63 ± 1 °C:ssa (4.1.1 kohta) 16-18 tunnin ajan. Kun käytetään kantaviljelmää (5.4.2 kohta) tai viljelmää, joka on yli 36 tuntia vanhaa, jatkoviljely olisi suoritettava vähintään kahdesti siten, että jatkoviljelyjen väliaika on enintään 36 tuntia. 5.5.4 Steriilillä pipetillä (4.2.4 kohta) siirretään 10 ml tislattua vettä viljelymaljaan (5.5.3 kohta) ja itiöt kerätään lasisauvalla pinnalta suspensioon. Itiösuspensio siirretään pulloon (4.2.3 kohta), jossa on 250 ml steriiliä tislattua vettä. Pullo suljetaan ja ravistetaan huolellisesti. Viljelmiä, joita ei aiota jatkoviljellä välittömästi, on säilytettävä jääkaapissa 0-6 °C:ssa. 5.5.5 Trimetopriimivapaaseen agar-elatusaineeseen (5.1.2 kohta) siirrostetun itiösuspension elävien bakteerien määrän on oltava 5-10 miljoonaa millilitrassa 16-18 tunnin inkuboinnin jälkeen 63 ± 1 °C:ssa. Itiösuspension on oltava tasaisesti sameaa, ja jos siinä on hiutaleita tai sakkaa, se on korvattava uudella kantaviljelmästä (5.4.2 kohta) valmistetulla suspensiolla. 5.6 Koeputkien/ampullien valmistaminen 5.6.1 Agar-elatusaine (5.1.2 kohta) sulatetaan ja jäähdytetään 55 °C:seen. 5.6.2 Lisätään yksi osa uutta itiösuspensiota (5.5.4 kohta) viiteen osaan agar-elatusainetta (5.6.1 kohta) koeputkessa tai pullossa, sekoitetaan huolellisesti. 5.6.3 Steriiliin koeputkeen tai ampulliin (4.2.6 kohta) siirretään 0,3 ml siirrostettua elatusainetta (5.6.2 kohta), jonka on laskettu muodostavan 5 mm paksu kerros, suljetaan sulkimella tai tulpalla tai sulattamalla ampullin kärki. Elatusaineen annetaan jähmettyä, minkä jälkeen koeputket/ampullit pidetään pystyasennossa vähintään 12 tunnin ajan. 5.6.4 Koeputkia/ampulleja voidaan käyttää samana päivänä, mutta niitä voidaan myös säilyttää useita kuukausia 0-6 °C:ssa, edellyttäen että ne jäähdytetään välittömästi valmistuksen jälkeen ja säilytetään. 6 Menettely 6.1 Näytteet olisi analysoitava mahdollisimman pian, mielellään 24 tunnin kuluessa näytteenotosta; sillä välin niitä on säilytettävä 0-5 °C:ssa. Jos näytteitä ei ole mahdollista analysoida 24 tunnin kuluessa, niitä on säilytettävä pakastimessa (-30-15 °C), jotta penisilliinin aktiivisuus säilyisi mahdollisimman hyvin. 6.2 Kukin koeputki/ampulli (5.6 kohta) merkitään selvästi ja pysyvästi. Tulppa tai suljin poistetaan. Tarvittava määrä koeputkia/ampulleja tutkittavia näytteitä ja vertailunäytteitä (5.2 ja 5.3 kohta) varten asetetaan sopivaan telineeseen (4.1.3 kohta). 6.3 Kuhunkin koeputkeen/ampulliin lisätään 50 mikrolitraa ravinnetta (5.1.4 kohta). 6.4 Maitonäyte sekoitetaan huolellisesti ja siitä siirretään ruiskulla (4.1.4 kohta) 0,1 ml vastaavaan merkittyyn koeputkeen/ampulliin. Kuhunkin siirrettävään näytteeseen on käytettävä puhdasta kertakäyttöistä kärkeä. 6.5 Edellä 6.4 kohdassa kuvatulla tavalla valmistetaan kaksi vertailunäytettä käyttäen penisilliinistandardi-liuosta, joka sisältää 0,004 ìg/ml (= 0,0067 k.y./ml) penisilliiniä. 6.6 Edellä 6.4 kohdassa kuvatulla tavalla valmistetaan kaksi vertailunäytettä käyttäen sellaisesta maidosta otettua vertailunäytettä, jossa ei ole estoaineita (5.3 kohta). 6.7 Koeputket/ampullit suljetaan ja teline, jossa koeputket/ampullit ovat, asetetaan vesihauteeseen 63 ± 1 °C:seen (4.1.2 kohta) vähintään 2½-2¾ tunnin ajaksi. 6.8 Teline otetaan pois vesihauteesta. 6.9 Agar-elatusaineen väri tutkitaan (ks. 7 kohta) 7 Tulosten tulkinta 7.1 Elatusaineen värjäytyminen purppuranpunaiseksi jossain maitonäytettä tai penisilliinistandardiliuosta sisältävässä koeputkessa/ampullissa osoittaa kyseisessä näytteessä esiintyvän antibiootteja tai sulfonamideja sen määrän tai lähes sen määrän, joka on annettu sivulla 39 olevan taulukon sarakkeessa "positiivinen". Elatusaine on kyllin herkkää, jos penisilliinistandardiliuosta (6.5 kohta) sisältävien koeputkien/ampullien väri pysyy purppuranpunaisena. 7.2 Testielatusaineen värjäytyminen vain osittain tai jonkin maitonäytettä sisältävän koeputken/ampullin epätasainen värjäytyminen osoittaa näytteessä esiintyvän estoaineita sivulla 39 olevassa taulukossa annettujen määrien välillä. 7.3 Testielatusaineen värjäytyminen keltaiseksi jossakin maitonäytettä tai estoaineista puhdasta vertailunäytettä sisältävässä koeputkessa/ampullissa osoittaa, ettei testiorganismin kasvua estäviä aineita esiinny. 7.4 Jos kaikki testatut koeputket/ampullit, mukaan lukien negatiivinen vertailunäyte, ovat värjäytyneet purppuranpunaisiksi, koeputkissa/ampulleissa ei ole elinvoimaisia itiöitä ja näytteet on analysoitava uudelleen äskettäin valmistetuilla testiaineilla. 8 Tulosten varmistaminen 8.1 Varmistetaan kaikkien niiden näytteiden tulokset, joiden reaktiot ovat 7.1 ja 7.2 kohdassa kuvattujen kaltaisia "menetelmä B":n mukaisesti. Jos maitonäytteiden säilyttäminen ennen varmistusta on välttämätöntä, ne on pakastettava antibioottien hajoamisen estämiseksi. B. Menetelmä penisilliinien varmistamiseksi ja pitoisuuden määrittämiseksi 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tässä esitetään varmistamiskoe penisilliineille tai muille antibiooteille sekä menetelmä penisilliinipitoisuuden määrittämiseksi maitonäytteissä, joiden reaktio on positiivinen (A.7.1 kohta) tai epävarma (A.7.2 kohta). Eri antibioottien herkkyys menetelmässä Ks. A jakson 1 kohta. 2 Määritelmä 2.1 Maitonäyte sisältää antibiootteja mukaan lukien sulfonamidit, kun kuvatulla menetelmällä analysoidussa näytteessä muodostuu vähintään 2 mm:n kirkas estovyöhyke kiekon ympärille. 2.2 Jos näytteessä, joka sisältää antibiootteja mukaan lukien sulfonamidi (2.1 kohta) ja johon on lisätty penisillinaasia (beeta-laktamaasia), ei ole kirkasta vyöhykettä tai siinä on läpimitaltaan pienempi kirkas vyöhyke kuin ilman penisillinaasia, estoaine on joko penisilliiniä tai sekä penisilliiniä että toista antibioottia mukaan lukien sulfonamidit. 2.3 Jos penisillinaasi ei inaktivoi vyöhykettä (2.2 kohta), maitonäytteessä oleva estoaine ei ole penisilliiniä, mutta se voi olla muuta jäämää (ks. direktiivin 85/397/ETY liitteessä A olevan VI luvun A jakson 1 kohdan f alakohta ja 2 kohdan b alakohta). Penisillinaasi ei inaktivoi tai inaktivoi vain osittain joitakin puolisynteettisiä penisilliinejä, esimerkiksi natriumkloksasilliiniä, tai kyseiset penisilliinit ovat resistenttejä eikä niitä siksi voida tunnistaa penisilliineiksi (ks. 7.3 kohta). 3 Periaate Analysoitavalla maidolla kyllästetty imupaperikiekko laitetaan Bacillus stearothermophilus var. calidolactiksella siirrostetun agar-elatusaineen pinnalle. Inkubaation aiheuttama mikro-organismin normaali kasvu tekee agarista sameaa. Estoaineiden esiintyminen maidossa näkyy kirkkaana vyöhykkeenä kiekon ympärillä. Kirkkaan vyöhykkeen koko riippuu muun muassa maidossa olevan estoaineen pitoisuudesta ja tyypistä. 4 Laitteet ja välineet 4.1 Laitteet 4.1.1 Ks. A jakson 4.1 kohta. 4.1.2 Vesihaude, joka pystyy toimimaan 80 ± 1 °C:ssa. 4.2 Välineet Ks. A jakson 4.2 kohta. 4.3 Paperikiekkoja, joissa ei ole estoaineita, joiden läpimitta on 9-13 mm, joihin pystytään imeyttämään noin 130 mg maitoa (säilytetään mieluiten eksikkaattorissa). 5 Elatusaineet, standardiliuokset, penisillinaasiliuos, reagenssit, testiorganismi jne. Elatusaineiden aineosien on oltava bakteriologisiin analyyseihin sopivia. Käytettävän veden on oltava tislattua tai vähintään yhtä puhdasta demineralisoitua vettä, eikä siinä saa olla testiorganismin kasvua estäviä aineita. 5.1 Elatusaineet 5.1.1 Ravintoagar (A jakson 5.1.1 kohta) 5.1.2 Testielatusaine estoaineiden toteamiseksi Koostumus >TAULUKON PAIKKA> Valmistus Kiinteät aineosat liuotetaan kokonaan veteen kuumentamalla ja sekoittamalla ennen kuin trimetopriimi- tai tetroksopriimiliuos lisätään. Trimetopriimi- tai tetroksopriimiliuoksen lisäämisen jälkeen säädetään pH siten, että se on steriloinnin jälkeen 8,0 ± 0,1 25 °C:ssa. Elatusaine steriloidaan 121 ± 1 °C:ssa 15 minuu