6)

Lisätään C.31–C.46 luvut seuraavasti: ” C.31. MAAKASVITESTI: ITÄVYYDEN JA ALKUKASVUN TESTAUS JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 208 (2006). Testimenetelmiä tarkastellaan säännöllisesti uudelleen tieteen kehityksen ja sääntelyyn sovellettavuuden perusteella. Tällä päivitetyllä testimenetelmällä arvioidaan kemikaalien mahdollisia vaikutuksia itävyyteen ja alkukasvuun. Tässä muodossa testi ei kata kroonisia vaikutuksia tai lisääntymiselle aiheutuvia vaikutuksia (eli vaikutuksia siementen ja kukkien muodostukselle tai hedelmien kypsymiselle). Altistusolosuhteet sekä testattavan kemikaalin ominaisuudet on otettava huomioon, jotta käytettävät testimenetelmät ovat asianmukaisia (esimerkiksi metalleja/metalliyhdisteitä testattaessa on otettava huomioon pH-arvon ja siihen liittyvien vastaioneiden vaikutukset) (1). Tämä testimenetelmä ei koske kasveja, jotka altistuvat kemikaalihöyryille. Testimenetelmää voidaan soveltaa yleisten kemikaalien, torjunta-aineiden ja kasvinsuojeluaineiden (eli biosidien) testaamiseen. Testimenetelmä on kehitetty olemassaolevien menetelmien pohjalta (2), (3), (4), (5), (6), (7). Huomioon on otettu myös muuta kasvien testaamisen kannalta olennaista lähdekirjallisuutta (8), (9), (10). Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 2. Testillä arvioidaan maaperässä (tai muussa sopivassa kasvualustana toimivassa maa-aineksessa) olevan testikemikaalin aiheuttaman altistuksen vaikutuksia korkeampien kasvien itävyyteen ja varhaiseen kasvuun. Siemenet tuodaan kosketuksiin testikemikaalilla käsitellyn maa-aineksen kanssa ja vaikutuksia arvioidaan yleensä 14–21 vuorokauden kuluttua siitä, kun kontrolliryhmän siemenistä on itänyt 50 prosenttia. Mitatut loppupisteet ovat itävyyden silmämääräinen arviointi, versojen kuivapaino (vaihtoehtoisesti versojen tuorepaino) ja joissakin tapauksissa versojen korkeus sekä näkyvien haittavaikutusten arviointi kasvin eri osissa. Mittauksia ja havaintoja verrataan käsittelemättömistä kontrollikasveista tehtyihin. 3. Odotetun altistusreitin mukaan testikemikaali joko viedään maaperän (tai mahdollisesti kasvualustana toimivan keinomaan) sisään tai sitä levitetään maan pinnalle sen mukaan, kumpi edustaa todenmukaisemmin mahdollista altistumisreittiä kemikaalille. Maaperän sisään vieminen tehdään käsittelemällä ritsosfääriin kuulumatonta maa-ainesta. Kemikaalin lisäämisen jälkeen maa-aines siirretään ruukkuihin, minkä jälkeen tutkittavan kasvilajin siemenet kylvetään maa-ainekseen. Pintalevitys tehdään ruukuissa olevalle maa-ainekselle, johon siemenet on jo kylvetty. Testiyksiköt (kontrollit ja käsitellyt maa-ainekset sekä siemenet) sijoitetaan tämän jälkeen sopiviin, kasvien itämistä/kasvua tukeviin olosuhteisiin. 4. Testi voidaan tehdä halutun tarkoituksen mukaan annosvastekäyrän määrittämiseksi tai raja-annostestinä käyttämällä vain yhtä pitoisuutta/tasoa. Jos yhdellä pitoisuudella/tasolla tehdyn testin tulokset ylittävät tietyn myrkyllisyystason (esimerkiksi kun havaitaan yli x prosentin vaikutuksia), tehdään pitoisuusalueen määritystesti, jonka avulla määritellään myrkyllisyyden ylä- ja alarajat, minkä jälkeen laaditaan annosvastekäyrä toistamalla testi usealla pitoisuudella/tasolla. Sopivalla tilastollisella analyysilla saadaan vaikuttava pitoisuus (effective concentration) ECx tai vaikuttava käyttömäärä (effective application rate) ERx (esimerkiksi EC25, ER25, EC50, ER50) yhdelle tai useammalle herkimmälle tutkittavalle parametrille. Testissä voidaan lisäksi laskea pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia (NOEC) sekä pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC). TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA 5. Seuraavien tietojen avulla voidaan tunnistaa kemikaalin odotettavissa oleva altistusreitti ja helpottaa koejärjestelyn suunnittelua: rakennekaava, puhtaus, vesiliukoisuus, liukoisuus orgaanisiin liuottimiin, 1-oktanoli/vesi-jakaantumiskerroin, maaperän sorptiokäyttäytyminen, höyrynpaine, kemiallinen stabiilisuus vedessä ja valossa sekä biohajoavuus. TESTIN VALIDITEETTI 6. Jotta testi olisi luotettava, kontrollin on täytettävä seuraavat kriteerit: — itävyys on vähintään 70 prosenttia; — taimissa ei ole näkyviä fytotoksisia vaikutuksia (esimerkiksi kloroosia, nekroosia, kuihtumista, lehtien ja versojen epämuodostumia) ja kasveissa ilmenee vain kyseiselle lajille tavanomaista kasvussa ja morfologiassa tapahtuvaa vaihtelua; — itäneiden kontrollitaimien keskimääräinen eloonjääneisyys on vähintään 90 prosenttia koko tutkimuksen ajan; — yksittäisen lajin ympäristöolosuhteet ovat identtiset ja kasvualustassa on yhtä paljon samasta lähteestä peräisin olevaa maa-ainesta, tukiainetta tai substraattia. VERTAILUKEMIKAALI 7. Vertailukemikaalin säännöllisin väliajoin tapahtuvalla testaamisella voidaan todeta, että testin toimivuus, tiettyjen testikasvien vaste tai testiolosuhteet eivät ole merkittävästi muuttuneet ajan myötä. Vaihtoehtoisesti testijärjestelmän toimivuutta tietyissä laboratoriossa voidaan arvioida mittaamalla kontrollien historiallista biomassaa tai kasvua, mikä toimii myös laboratorion sisäisenä laadunvalvontatoimenpiteenä. MENETELMÄN KUVAUS Luonnollinen maaperä – Keinotekoinen substraatti 8. Kasveja voidaan kasvattaa ruukuissa, joissa käytetään hiekkapitoista hiesua, savista hiekkaa tai hiekkapitoista savimultaa, joka sisältää enintään 1,5 prosenttia orgaanista hiiltä (noin kolme prosenttia orgaanista ainesta). Kaupallisesti myytävää kukkamultaa tai synteettistä maaperäseosta voidaan myös käyttää, kunhan se sisältää enintään 1,5 prosenttia orgaanista hiiltä. Savimaata ei käytetä, jos tiedossa on, että testikemikaalin affiniteetti saveen on suuri. Peltomaa homogenisoidaan ja karkeat hiukkaset poistetaan seulomalla 2 mm:n raekokoon. Valmiista lopullisesta maaperästä ilmoitetaan tyyppi ja rakenne, orgaanisen hiilen pitoisuus prosentteina, pH-arvo sekä suolapitoisuus sähkönjohtavuutena. Maaperä luokitellaan tavanmukaisen luokittelujärjestelmän mukaan (11). Maaperä voidaan pastöroida tai lämpökäsitellä maaperän patogeenien vaikutuksen vähentämiseksi. 9. Luonnollinen maaperä saattaa vaikeuttaa tulosten tulkintaa ja lisätä vaihtelua fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien sekä mikrobipopulaatioiden vaihtelevuuden vuoksi. Nämä muuttujat puolestaan muuttavat vedenpidätyskykyä, kemikaalien sitomiskykyä, tuulettumista sekä ravinne- ja hivenainepitoisuutta. Näiden fysikaalisten ominaisuuksien vaihtelun lisäksi vaihtelua on myös kemiallisissa ominaisuuksissa, kuten pH-arvossa ja hapetus-pelkistyspotentiaalissa, mikä saattaa vaikuttaa testikemikaalin biologiseen hyötyosuuteen (12), (13), (14). 10. Keinotekoisia substraatteja ei yleensä käytetä kasvinsuojeluaineiden testaamisessa, mutta niitä voidaan käyttää yleisten kemikaalien testaamisessa tai silloin, kun halutaan pitää luonnollisen maaperän käytöstä aiheutuva vaihtelu mahdollisimman pienenä ja lisätä testitulosten vertailukelpoisuutta. Käytettyjen substraattien on oltava inerttiä materiaalia, joiden vuorovaikutus testikemikaalin, kantoaineena toimivan liuottimen tai molempien kanssa on mahdollisimman pieni. Happopesty kvartsihiekka, mineraalivilla ja lasihelmet (halkaisijaltaan esimerkiksi 0,35–0,85 mm) on todettu riittävän inerteiksi materiaaleiksi, jotka absorboivat testikemikaalia mahdollisimman vähän (15), millä varmistetaan, että kemikaalia on mahdollisimman paljon taimen saatavana juuriston kautta. Käyttötarkoitukseen soveltumattomia substraatteja ovat vermikuliitti, perliitti ja muut erittäin imukykyiset materiaalit. Kasvin kasvuaan varten tarvitsemia ravinteita on oltava saatavilla, jotta kasvit eivät kärsi ravinteiden puutostiloista. Ravinteiden saantia on mahdollisuuksien mukaan arvioitava kontrollikasvien kemiallisella analyysilla tai silmämääräisellä arvioinnilla. Testilajien valintakriteerit 11. Valittavien lajien olisi oltava keskenään riittävän erilaisia esimerkiksi levinneisyyden, yleisyyden, lajikohtaisten elinkaaren ominaisuuksien, luontaisen levinneisyysalueen sekä kasvikunnan taksonomisen monimuotoisuuden näkökulmasta, jotta vasteissa olisi vaihtelua (8), (10), (16), (17), (18), (19), (20). Valinnassa olisi otettava huomioon mahdollisten testilajien seuraavat ominaisuudet: — lajilla on yhdenmukaisia siemeniä, joita on helposti saatavilla tavanomaisista, luotettavista siemenlähteistä ja joiden itävyys on johdonmukaista, luotettavaa ja tasaista, ja alkukasvu on yhdenmukaista; — kasvi soveltuu laboratoriokokeisiin ja antaa luotettavia ja toistettavia tuloksia samassa testilaitoksessa sekä eri testilaitosten kesken; — testattavan lajin herkkyys vastaa johdonmukaisesti kemikaalille alttiina olevassa ympäristössä tavattujen lajien vastetta; — lajeja on käytetty aiemmissa myrkyllisyyskokeissa ja niiden käyttö esimerkiksi torjunta-aineiden biologisissa testeissä, raskasmetallien seulonnassa, suolapitoisuus- tai mineraalirasituskokeissa tai allelopatiatutkimuksissa osoittaa herkkyyttä monille erilaisille stressitekijöille; — lajit sopivat testimenetelmän edellyttämiin kasvuolosuhteisiin; — lajit täyttävät testin validiteettikriteerit. Eräitä eniten käytettyjä testilajeja on lueteltu lisäyksessä 2 ja mahdollisia ravintokasveihin kuulumattomia lajeja lisäyksessä 3. 12. Testattavien lajien määrä riippuu sovellettavista sääntelyvaatimuksista, minkä vuoksi määrään ei oteta kantaa tämän testimenetelmän yhteydessä. Testikemikaalin lisääminen 13. Kemikaalia lisätään sopivaan kantaja-aineeseen (esimerkiksi vesi, asetoni, etanoli, polyeteeniglykoli, arabikumi tai hiekka). Testattavaksi sopivat myös seokset (kaupallisesti saatavat tuotteet tai valmisteet), jotka sisältävät aktiivisia ainesosia ja erilaisia apuaineita. Maa-aineksen / keinotekoisen substraatin sisään vieminen 14. Vesiliukoiset tai veteen suspendoituneet kemikaalit voidaan lisätä veteen, minkä jälkeen liuos sekoitetaan maa-ainekseen sopivalla sekoituslaitteella. Tämäntyyppinen testaaminen voi olla tarpeen, jos altistuminen kemikaalille tapahtuu maaperän tai maaperän huokosveden kautta ja tutkittavana seikkana on imeytyminen juuriin. Testikemikaalia lisäämällä ei pidä ylittää maa-aineksen vedenpidätyskykyä. Lisätyn veden määrän on oltava sama kaikille testipitoisuuksille, mutta sitä on rajoitettava, jotta maaperän sidosaineet eivät paakkuunnu. 15. Heikosti veteen liukenevat kemikaalit liuotetaan sopivaan haihtuvaan liuottimeen (esimerkiksi asetoniin tai etanoliin) ja sekoitetaan hiekkaan. Liuotin voidaan tämän jälkeen poistaa hiekasta ilmavirralla, kun hiekkaa samalla sekoitetaan jatkuvasti. Käsitelty hiekka sekoitetaan testissä käytettävään maa-ainekseen. Toiseen kontrolliin lisätään vain hiekkaa ja liuotinta. Kaikkiin käsittelytasoihin sekä toiseen kontrolliin lisätään yhtä paljon hiekkaa, johon liuotin on sekoitettu ja josta se on poistettu. Kiinteät, liukenemattomat testikemikaalit sekoitetaan kuivaan maa-ainekseen sopivalla sekoituslaitteella. Tämän jälkeen maa-aines lisätään ruukkuihin ja siemenet kylvetään välittömästi. 16. Jos maa-aineksen sijasta käytetään keinotekoista substraattia, vesiliukoiset kemikaalit voidaan liuottaa ravinneliuokseen juuri ennen testin aloittamista. Kemikaalit, jotka eivät liukene veteen, mutta jotka voidaan suspendoida veteen kantoaineena toimivan liuottimen avulla, lisätään kantoaineen kanssa ravinneliuokseen. Veteen liukenemattomat kemikaalit, joille ei ole olemassa myrkytöntä vesiliukoista kantoainetta, liuotetaan sopivaan haihtuvaan liuottimeen. Liuos sekoitetaan hiekkaan tai lasihelmiin, sijoitetaan pyörivään tyhjiölaitteeseen ja haihdutetaan, jolloin hiekka tai helmet saavat tasaisen kemikaalipäällysteen. Punnittu määrä helmiä otetaan erilleen samaa orgaanista liuotinta käyttäen ja kemikaalin määrä analysoidaan ennen kylvöastioiden täyttämistä. Pintalevitys 17. Kasvinsuojeluaineille testikemikaalin lisäysmenetelmänä käytetään usein maa-aineksen pinnan ruiskuttamista testiliuoksella. Kaikkien testissä käytettävien välineiden, mukaan lukien testikemikaalin valmistus- ja annosteluvälineet, on oltava malliltaan ja kapasiteetiltaan sellaisia, että näitä välineitä hyödyntävät testit voidaan tehdä täsmällisesti ja peittävyys on toistettavissa. Peittävyyden on oltava sama kaikilla maa-ainespinnoilla. Kemikaalien mahdollista adsorboitumista välineisiin tai reagoimista niiden kanssa (esimerkiksi käytettäessä muoviputkia ja lipofiilisiä kemikaaleja tai teräsosia ja alkuaineita) olisi vältettävä huolellisesti. Testikemikaalia ruiskutetaan maa-aineksen pinnalle simuloiden tavanomaisia levitystapoja ruiskusäiliötä käyttämällä. Ruiskutettavan määrän on yleensä oltava tavanomaisen maatalouskäytännön tasolla, ja määrät (esimerkiksi veden määrä) kirjataan muistiin. Suutin valitaan siten, että peittävyys on sama kautta koko maa-aineksen pinnan. Liuottimia ja kantoaineita käytettäessä perustetaan toinen kontrollikasvien ryhmä, jolle annetaan vain liuotinta/kantoainetta. Tämä ei kuitenkaan ole tarpeen silloin, kun testataan kasvinsuojeluaineita valmisteina. Testikemikaalin pitoisuuden/tason toteaminen 18. Käytetyt pitoisuudet/tasot on vahvistettava tarkoitukseen sopivalla analyyttisella todentamismenetelmällä. Kun käytetään liukoisia kemikaaleja, kaikki testipitoisuudet/-tasot voidaan todentaa analysoimalla pitoisuudeltaan suurin testissä käytettävä liuos sekä dokumentoimalla sen laimentaminen ja käyttämällä kemikaalin lisäämisessä kalibroituja välineitä (esimerkiksi kalibroituja analyysilaseja sekä kalibroituja ruiskutusvälineitä). Liukenemattomia kemikaaleja käytettäessä seosmateriaalin todentaminen tehdään ilmoittamalla maa-ainekseen lisätyn testikemikaalin paino. Mahdollista homogeenisuuden osoittamista varten voidaan tarvita maa-aineksen analyysi. MENETTELY Testijärjestely 19. Saman kasvilajin siemenet kylvetään ruukkuihin. Ruukkua kohti kylvettävien siementen lukumäärä riippuu lajista, ruukun koosta ja testin kestosta. Yhdessä ruukussa olevien kasvien määrän olisi tarjottava riittävät kasvuolosuhteet siten, ettei ruukku käy liian ahtaaksi testin kuluessa. Kasvien enimmäistiheys on noin 3–10 siementä 100 cm2:ä kohti siementen koon mukaan. Viidentoista senttimetrin ruukkuun suositellaan esimerkiksi yhtä tai kahta maissin, soijapavun, tomaatin, kurkun tai sokerijuurikkaan tainta, kolmea rapsin tai herneen tainta tai 5–10:tä pientä siementä, kuten sipulin tai vehnän siementä. Siementen ja rinnakkaisnäyteruukkujen lukumäärän (yksi rinnakkaisnäyte tarkoittaa yhtä ruukkua, eikä samassa ruukussa olevia kasveja siis lasketa rinnakkaisnäytteiksi) olisi oltava riittävä optimaalista tilastollista analyysia varten (21). On syytä huomata, että vaihtelu on suurempaa testilajeilla, joista kylvetään muutama suuri siemen ruukkua kohti (rinnakkaisnäyte), kuin lajeilla, joita voidaan kylvää suurempi määrä pieniä siemeniä ruukkua kohti. Vaihtelua saadaan vähennettyä kylvämällä jokaiseen ruukkuun yhtä monta siementä. 20. Kontrolliryhmien avulla varmistetaan, että havaitut vaikutukset ovat yhteydessä vain testikemikaalille tapahtuvaan altistukseen tai johtuvat siitä. Asianmukainen kontrolliryhmä on joka suhteessa identtinen testiryhmän kanssa testikemikaalille altistusta lukuun ottamatta. Kaikkien samassa testissä käytettävien testikasvien, mukaan lukien kontrollit, on oltava peräisin samasta lähteestä. Tulosten vääristymisen välttämiseksi testi- ja kontrolliruukut on määriteltävä satunnaisesti. 21. Hyönteismyrkyllä tai sienitautien torjunta-aineella käsiteltyjen siementen (eli peitattujen siementen) käyttöä on vältettävä. Eräiden maiden sääntelyviranomaiset kuitenkin sallivat tiettyjen muiden kuin systeemisten kosketusvaikutteisten sienitautien torjunta-aineiden (esimerkiksi kaptaanin ja tiraamin) käytön (22). Jos on syytä epäillä siementen välityksellä kulkeutuvia patogeenejä, siemenet voidaan upottaa lyhyeksi aikaa 5-prosenttiseen hypokloriittiliuokseen, minkä jälkeen ne huuhdellaan huolellisesti juoksevassa vedessä ja kuivataan. Jälkikäsittely muilla kasvinsuojeluaineilla on kielletty. Testiolosuhteet 22. Testiolosuhteiden on oltava mahdollisimman lähellä testattavien lajien ja lajikkeiden normaalisti edellyttämiä kasvuolosuhteita (esimerkkejä testiolosuhteista on lisäyksessä 4). Itäviä kasveja olisi hoidettava hyvän puutarhanhoidon käytäntöjen mukaisesti ympäristöolosuhteiltaan säädeltävissä kasvatuskammioissa, fytotroneissa tai kasvihuoneissa. Kasvatustiloja käytettäessä näihin käytäntöihin kuuluu yleensä ainakin seuraavien valvonta ja riittävän säännöllinen kirjaaminen (esimerkiksi päivittäin): lämpötila, kosteus, hiilidioksidipitoisuus, valo (voimakkuus, aallonpituus, fotosynteesille suotuisa aallonpituusalue), valoisa aika sekä kastelutapa. Näin varmistetaan kasvien hyvä kasvu, jota voidaan arvioida valittuja lajeja edustavien kontrollikasvien avulla. Kasvihuoneiden lämpötilaa säädellään tuuletus-, lämmitys- ja/tai jäähdytysjärjestelmän avulla. Kasvihuoneessa tapahtuvaa testaamista varten suositellaan yleisesti seuraavanlaisia olosuhteita: — lämpötila: 22 °C ± 10 °C; — kosteus: 70 % ± 25 %; — valoisa aika: vähintään 16 tuntia valoa; — valovoima: 350 ± 50 μE/m2/s. Lisävalaistusta saatetaan tarvita, jos valovoima laskee alle 200 μE/m2/s:iin ja aallonpituus alle 400–700 nm:iin, paitsi eräillä lajeilla, jotka tarvitsevat vähemmän valoa. Ympäristöolosuhteita valvotaan ja ne kirjataan muistiin tutkimuksen ajan. Kasvatusruukkujen on oltava lasitettuja tai muuta kuin huokoista muovia, ja ruukun alle tulee lautanen. Ruukkujen sijaintia voidaan muuttaa määräajoin, jotta kasvien kasvussa ilmenevä vaihtelu jää mahdollisimman pieneksi (sillä kasvatustiloissa vallitsevissa testiolosuhteissa on eroja). Ruukkujen on oltava niin suuria, että normaali kasvu on mahdollista. 23. Kasvien elinvoiman ylläpitämiseksi maa-ainekseen voidaan tarvittaessa lisätä ravinteita. Lisäravinteiden tarpeesta ja ajoituksesta päätetään kontrollikasveja tarkkailemalla. Suositeltavaa on kastella testiruukut pohjan kautta (esimerkiksi lasikuituisen kastelulangan avulla). Aluksi ruukkuja voidaan kuitenkin kastella päältä, jotta siementen itäminen nopeutuu. Jos testikemikaalia on levitetty maa-aineksen pintaan, kasteluvesi helpottaa kemikaalin tunkeutumista maa-ainekseen. 24. Valittujen kasvuolosuhteiden olisi oltava testattavalle lajille ja tutkittavalle testikemikaalille sopivat. Kontrollikasvit ja käsitellyt kasvit pidetään samoissa ympäristöolosuhteissa, mutta eri tavoin käsiteltyjen kasvien välinen ristialtistus sekä kontrollikasvien altistuminen testikemikaalille (esimerkiksi haihtuvia kemikaaleja käytettäessä) on estettävä riittävin toimenpitein. Testaaminen yhdellä pitoisuudella/tasolla 25. Yhdellä pitoisuudella tai tasolla testaamiseen (altistuskoe/raja-annostesti) sopivan kemikaalin pitoisuuden/tason määrittämisessä on otettava huomioon useita tekijöitä. Yleisiä kemikaaleja testattaessa näitä ovat esimerkiksi kemikaalin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet. Kasvinsuojeluaineita testattaessa on otettava huomioon testikemikaalin fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ja käyttötapa, suurin pitoisuus tai käyttötaso, käyttökertojen määrä kasvukautta kohti ja/tai testikemikaalin pysyvyys. Kun halutaan selvittää, onko yleisellä kemikaalilla fytotoksisia ominaisuuksia, saattaa olla tarpeen tehdä testi enimmäistasolla 1 000 mg yhdessä kilogrammassa kuivaa maa-ainesta. Pitoisuusalueen määritystesti 26. Tarvittaessa voidaan tehdä pitoisuusalueen määritystesti, joka auttaa selvittämään lopullisessa annosvastetutkimuksessa testattavat pitoisuudet/tasot. Pitoisuusalueen määritystestissä käytetään kaukana toisistaan olevia pitoisuuksia (esimerkiksi 0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg yhdessä kilogrammassa kuivaa maa-ainesta). Kasvinsuojeluaineiden pitoisuudet/tasot voivat perustua suositeltuun tai suurimpaan pitoisuuteen tai käyttötasoon ja olla esimerkiksi 1/100, 1/10 ja 1/1 suositellusta tai suurimmasta pitoisuudesta tai käyttötasosta. Testaaminen useammalla pitoisuudella/tasolla 27. Testillä, jossa käytetään useita pitoisuuksia/tasoja, todetaan sääntelyviranomaisten edellyttämällä tavalla annosvastesuhde ja määritetään ECx- tai ERx-arvo itävyydelle, biomassalle ja/tai silmämääräisesti havaittaville vaikutuksille verrattuna kontrolleihin, joita ei ole altistettu testikemikaalille. 28. Pitoisuuksien tai tasojen lukumäärän ja välimatkojen on oltava riittäviä luotettavan annosvastesuhteen määrittämiseen ja regressioyhtälön muodostamiseen sekä ECx- ja ERx-arvojen arviointiin. Valittujen pitoisuuksien/tasojen on katettava määritettävät ECx- tai ERx-arvot. Jos esimerkiksi halutaan saada selville EC50-arvo, on suotavaa tehdä testi tasoilla, jotka tuottavat 20–80 prosentin vaikutuksen. Tuloksen saamiseksi suositellaan käytettävän vähintään viittä geometrisessa sarjassa olevaa pitoisuutta/tasoa, joiden etäisyyden määrittävä kerroin on enintään kolme, sekä käsittelemätöntä kontrollia. Rinnakkaisnäytteiden määrän kaikissa käsittely- ja kontrolliryhmissä on oltava vähintään neljä, ja siemeniä on oltava ainakin 20 kappaletta. Tietyille kasveille, joiden itävyys on heikko tai kasvutavassa esiintyy paljon vaihtelua, voidaan tarvita enemmän rinnakkaisnäytteitä, jotta testin tilastollinen voima paranee. Rinnakkaisnäytteiden määrää voidaan vähentää, jos testipitoisuuksia/tasoja on enemmän. NOEC-arvon arvioinnissa riittävä tilastollinen voima saattaa edellyttää useampia rinnakkaisnäytteitä (23). Havainnot 29. Tarkkailujakson aikana eli 14–21 päivän kuluessa siitä, kun 50 prosenttia kontrollikasveista (tarvittaessa myös liuotinkontrolleista) on itänyt, kasveja tarkkaillaan säännöllisesti (vähintään viikoittain, mutta mieluiten päivittäin) itämisen, silmämääräisesti havaittavan fytotoksisuuden sekä kuolleisuuden havaitsemiseksi. Testin lopussa kirjataan muistiin mitattu itävyysprosentti, elossa olevien kasvien biomassa sekä kasvin eri osissa näkyvät haittavaikutukset, joita ovat esimerkiksi poikkeamat itäneiden taimien ulkonäössä, kloroosi, värimuutokset, kuolleisuus sekä vaikutukset kasvin kehitykseen. Lopullinen biomassa voidaan mitata elossa olevien kasvien versojen lopullisesta keskimääräisestä kuivapainosta keräämällä versot maan pintaa myöten ja kuivaamalla ne vakiopainoon 60 asteen lämpötilassa. Vaihtoehtoisesti lopullinen biomassa voidaan mitata versojen tuorepainosta. Toinen päätepiste on esimerkiksi versojen korkeus, jos sääntelyviranomaiset tätä edellyttävät. Havaittavien toksisten vasteiden arvioinnissa käytetään yhtenäistä silmämääräisten vaurioiden pisteytysjärjestelmää. Esimerkkejä kvalitatiivisten ja kvantitatiivisten silmämääräisten luokitusten tekemisestä on lähdeteoksissa (23), (24). TIEDOT JA RAPORTOINTI Tilastoanalyysi Yhden pitoisuuden/tason testi 30. Kutakin kasvilajia koskevat tiedot analysoidaan sopivalla tilastollisella menetelmällä (21). Kasvilajista ilmoitetaan vaikutuksen taso testipitoisuudella/-tasolla tai se, että tiettyä vaikutusta ei tapahtunut testipitoisuudella/-tasolla (esimerkiksi < x prosentin vaikutus havaittiin y-pitoisuudella tai tasolla). Usean pitoisuuden/tason testi 31. Annosvastesuhde määritetään regressioyhtälöllä. Tässä voidaan käyttää erilaisia malleja: esimerkiksi ECx:n tai ERx:n (esim. EC25, ER25, EC50, ER50) sekä ERx:n itävyyden luottamusvälien arviointiin dikotomisena tietona sopivat esimerkiksi logitti-, probitti- tai Weibull-menetelmät, Spearmanin ja Kärberin menetelmä tai viritetty Spearmanin ja Kärberin menetelmä. Taimien kasvun (painon ja pituuden) jatkuvina loppupisteinä ECx:ää tai ERx:ää ja sen luottamusvälejä voidaan arvioida sopivalla regressioanalyysilla (esimerkiksi Bruce-Versteegin epälineaarinen regressioanalyysi (25)). R2:n pitäisi herkimmille lajeille olla mahdollisuuksien mukaan 0,7 tai enemmän ja käytettyjen testipitoisuuksien/-tasojen käsittää 20 %:n ja 80 %:n vaikutukset. NOEC-arvoa arvioitaessa kiinnitetään huomiota ennen kaikkea testin voimaan, ja testien valintaperusteena on tiedon hajonta (21), (26). Testiraportti 32. Testiraportista käyvät ilmi tutkimusten tulokset, minkä lisäksi siinä kuvataan yksityiskohtaisesti testiolosuhteet, pohditaan tuloksia huolellisesti, analysoidaan tiedot ja tehdään johtopäätöksiä analyysin pohjalta. Tulokset esitetään myös taulukkomuotoisena yhteenvetona ja tiivistelmänä. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testikemikaali: — kemikaalin tunnistetiedot, testatun kemikaalin testin kannalta olennaiset ominaisuudet (esimerkiksi log Pow, vesiliukoisuus ja höyrynpaine sekä tietoa kulkeutumisesta ja käyttäytymisestä ympäristössä, jos näitä on saatavilla); — kuvaus testiliuoksen valmistuksesta sekä testipitoisuuksien vahvistamisesta 18 kohdassa mainitulla tavalla. Testilajit: — testiorganismin tiedot: laji/lajike, kasvisuku, tieteellinen nimi ja yleisnimi, siementen lähde ja historia mahdollisimman tarkasti (siis esimerkiksi toimittajan nimi, prosentuaalinen itävyys, siementen kokoluokka, eränumero, siementen vuosiluku tai kasvukausi, jolloin ne on kerätty, itävyysluokituksen päiväys ja elinkelpoisuus); — testattujen yksi- ja kaksisirkkaisten lajien lukumäärä; — perustelut lajien valinnalle; — kuvaus siementen varastoinnista, käsittelystä ja hoidosta. Testiolosuhteet: — testauslaitos (esimerkiksi kasvatuskaappi, fytotroni tai kasvihuone); — testijärjestelmän kuvaus (esimerkiksi ruukkujen mitat ja materiaali sekä maa-aineksen määrä); — maa-aineksen ominaisuudet (maa-aineksen rakenne tai tyyppi: maa-aineshiukkasten jakautuminen ja luokitus, fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, mukaan lukien orgaanisen aineksen osuus, orgaanisen hiilen osuus ja pH-arvo); — maa-aineksen tai substraatin (esimerkiksi maa-aineksen, keinomaan, hiekan tai muun) valmistelutoimet ennen testiä; — ravinneliuoksen kuvaus, jos sellaista on käytetty; — testikemikaalin käyttö: applikointimenetelmän kuvaus, käytettyjen välineiden kuvaus, altistustasot ja -määrät, mukaan lukien kemikaalien todentaminen, kalibrointimenetelmän kuvaus sekä kuvaus ympäristöolosuhteista applikoinnin aikana; — kasvuolosuhteet: valon voimakkuus (esimerkiksi fotosynteesille suotuisa aallonpituusalue (PAR)), valoisa aika, enimmäis- ja vähimmäislämpötilat, kasteluaikataulu ja -menetelmä, lannoittaminen; — yhteen ruukkuun kylvettyjen siementen lukumäärä, kasvien lukumäärä annosta kohti, rinnakkaisnäytteiden (ruukkujen) määrä altistustasoa kohti; — kontrollien tyyppi ja lukumäärä (negatiiviset ja/tai positiiviset kontrollit, mahdollinen liuotinkontrolli); — testin kesto. Tulokset: — taulukko kaikista loppupisteistä kunkin rinnakkaisnäytteen osalta, testipitoisuus/-taso ja laji; — itäneiden siementen lukumäärä ja prosenttiosuus kontrolleihin verrattuna; — biomassaa koskevat mittaukset: kasvien versojen kuivapaino tai tuorepaino prosenttiosuutena kontrolleista; — kasvien versojen pituus prosenttiosuutena kontrolleista, jos mitattu; — silmämääräisten vaurioiden prosenttiosuus sekä kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen kuvaus testikemikaalin aiheuttamista silmämääräisistä vaurioista (kloroosi, nekroosi, kuihtuminen, lehtien ja versojen epämuodostumat tai tieto siitä, että mitään vaikutuksia ei ollut) kontrollikasveihin verrattuna; — kuvaus silmämääräisten vaurioiden arvioinnissa käytetystä asteikosta, jos silmämääräistä arviointia käytetään; — yksittäisen tason tutkimuksista ilmoitetaan vaurioiden prosenttiosuus; — ECx- tai ERx-arvot (esimerkiksi EC50, ER50, EC25, ER25) sekä niiden luottamusvälit. Regressioanalyysia käytettäessä ilmoitetaan regressioyhtälön keskivirhe sekä yksittäisten parametrien (esimerkiksi kaltevuuden tai vakiotermin) estimoinnin keskivirhe; — NOEC- ja LOEC-arvot, jos ne on laskettu; — kuvaus tilastollisista menetelmistä ja käytetyistä olettamuksista; — edellä mainittujen tietojen sekä testattujen lajien annosvastesuhteen esitys graafisessa muodossa. Lisäksi ilmoitetaan poikkeukset tässä testimenetelmässä kuvatuista menettelyistä ja kaikki testin aikana ilmenneet epätavallisuudet. LÄHDEKIRJALLISUUS (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189–193. (2) International Organisation of Standards (ISO). (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards (ISO). (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. Teoksessa: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, s. 163–206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571–575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247–250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161–1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349–369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255–271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155–271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532–2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1–63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386–389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. Teoksessa: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15–23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485–1492. (26) Tämän liitteen luku C.33. Lisääntymistesti lieroilla (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Lisäys 1 Määritelmät Tehoaine tai aktiivinen ainesosa : Aine, joka on suunniteltu tuottamaan tietyn biologisen vaikutuksen (esimerkiksi hyönteisten rajoitttaminen, kasvitautien hallinta, rikkakasvien hallinta käsittelyalueella). Kutsutaan myös teknistä laatua olevaksi tehoaineeksi tai aktiiviseksi aineeksi. Kemikaali : aine tai seos. Kasvinsuojeluaine tai torjunta-aine : aine, jonka tiettyä biologista aktiivisuutta käytetään tarkoituksellisesti suojelemaan kasveja tuholaisilta (esimerkiksi sienitaudeilta, hyönteisiltä ja kilpailijakasveilta). ECx, x prosenttia vaikutuspitoisuudesta tai ERx, x prosenttia vaikutustasosta : pitoisuus tai taso, joka saa aikaan x prosentin suuruisen epätoivottavan muutoksen testin loppupisteessä kontrolliin verrattuna (esimerkiksi 25 tai 50 prosentin vähenemä itävyydessä, versojen painossa tai jäljelle jääneiden kasvien määrässä taikka samansuuruinen silmämääräisten vaurioiden lisääntyminen on EC25/ER25 tai EC50/ER50). Itäminen : itutupen tai sirkkalehtien ilmestyminen maanpinnalle. Valmiste : Kaupallisesti valmistettu tuote, joka sisältää tehoainetta (vaikuttavaa ainesosaa). Kutsutaan myös lopulliseksi valmisteeksi (8) tai tyypilliseksi loppukäyttötuotteeksi. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus) : Testikemikaalin pienin pitoisuus, jolla vaikutus havaitaan. Tässä testissä LOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella on tilastollisesti merkittävä vaikutus (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna ja se on suurempi kuin NOEC-arvo. Muut kuin kohdekasvit : Kasvit, jotka eivät ole kohteena olevalla alueella. Kasvinsuojeluaineiden yhteydessä tällä tarkoitetaan yleensä käsittelyalueen ulkopuolella olevia kasveja. NOEC (No Observed Effect Concentration, pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia) : Testikemikaalin suurin pitoisuus, josta ei ole havaittavaa vaikutusta. Tässä testissä NOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella ei ole tilastollisesti merkittävää vaikutusta (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna. Fytotoksisuus : haitalliset poikkeamat (mitatut ja silmämääräisesti arvioidut) kasvien normaalista ulkonäöstä ja kasvusta tietyn kemikaalin vuoksi. Rinnakkaisnäyte : Kokeellinen yksikkö, joka edustaa kontrolliryhmää ja/tai käsittelyryhmää. Tässä tutkimuksessa rinnakkaisnäyte on yksi ruukku. Silmämääräinen arviointi : silmämääräisten vaurioiden arviointi kasvin asennosta, elinvoimasta, epämuodostumista, kloroosista, nekroosista ja yleisestä ulkonäöstä tehtyjen havaintojen perusteella kontrolliin verrattuna. Testikemikaali : tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Lisäys 2 Luettelo kasvikokeissa historiallisesti käytetyistä lajeista Heimo Laji Yleisnimet KAKSISIRKKAISET Sarjakukkaiskasvit Daucus carota Porkkana Mykerökukkaiskasvit Helianthus annuus Auringonkukka Mykerökukkaiskasvit Lactuca sativa Salaatti Ristikukkaiskasvit Sinapis alba Keltasinappi Ristikukkaiskasvit Brassica campestris var. chinensis Kiinankaali Ristikukkaiskasvit Brassica napus Rapsi Ristikukkaiskasvit Brassica oleracea var. capitata Keräkaali Ristikukkaiskasvit Brassica rapa Nauris Ristikukkaiskasvit Lepidium sativum Vihanneskrassi Ristikukkaiskasvit Raphanus sativus Retiisi Savikkakasvit Beta vulgaris Sokerijuurikas Kurkkukasvit Cucumis sativus Kurkku Hernekasvit Glycine max (G. soja) Soija Hernekasvit Phaseolus aureus Mungopapu Hernekasvit Phaseolus vulgaris Tarhapapu Hernekasvit Pisum sativum Herne Hernekasvit Trigonella foenum-graecum Sarviapila Hernekasvit Lotus corniculatus Keltamaite Hernekasvit Trifolium pratense Puna-apila Hernekasvit Trifolium incarnatum Rehuvirna Pellavakasvit Linum usitatissimum Pellava Tatarkasvit Fagopyrum esculentum Tattari Koisokasvit Solanum lycopersicon Tomaatti YKSISIRKKAISET Liljakasvit Allium cepa Sipuli Heinäkasvit Avena sativa Kaura Heinäkasvit Hordeum vulgare Ohra Heinäkasvit Lolium perenne Englanninraiheinä Heinäkasvit Oryza sativa Riisi Heinäkasvit Secale cereale Ruis Heinäkasvit Sorghum bicolor Jyvädurra Heinäkasvit Triticum aestivum Vehnä Heinäkasvit Zea mays Maissi Lisäys 3 Luettelo mahdollisista ravintokasveihin kuulumattomista lajeista OECD:n mahdolliset lajit kasvien myrkyllisyyskokeita varten Huomautus: Seuraavassa taulukossa on tietoa 52:sta ravintokasveihin kuulumattomasta lajista (kutakin kohtaa koskevat kirjallisuusviitteet ilmoitetaan sulkeissa). Mainitut itävyysprosentit on saatu julkaistusta kirjallisuudesta, ja ne on tarkoitettu vain yleisohjeeksi. Yksittäiset kokemukset voivat vaihdella esimerkiksi siementen alkuperän ja muiden tekijöiden mukaan. HEIMO Lajin tieteellinen nimi (suomenkielinen yleisnimi) Elinaika (9) ja kasvupaikka Siemenpaino (mg) Itämistä tai kasvua varten tarvittava valoisa aika (10) Kylvösyvyys (mm) (11) Itämiseen kuluva aika (vuorokausina) (12) Erikoiskäsittelyt (13) Myrkyllisyyskoe (14) Siementen toimittajat (15) Muut kirjallisuusviitteet (16) SARJAKUKKAISKASVIT Torilis japónica (Punakatko) Y, K, kulutukselle alttiit alueet, pensasaidat, laidunmaat (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) V = P (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) kylmästratifiointi (7, 14, 18, 19), saattavat vaatia kypsymistä (19), pimeys estää itämisen (1, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5) JÄLKEEN (5) MYKERÖKUKKAISKASVIT Bellis perennis (Tuhatkauno) Ρ niityt, nurmet, viljelysmaat 0,09–0,17 (4, 19) V = P (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) säteily ei vaikuta itävyyteen (18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (4, 14) JÄLKEEN (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Ruiskaunokki) Y pellot, pientareet, avoimet kasvupaikat (16) 4,1–4,9 (4, 14) V = P (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) ei erikoiskäsittelyitä (2, 4) JÄLKEEN (2, 4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (Mustakaunokki) Ρ pellot, pientareet, avoimet kasvupaikat (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) saattavat vaatia kypsymistä (18, 19), pimeys estää itämisen (19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 26) JÄLKEEN (5, 22, 26) A Inula helenium (Isohirvenjuuri) Ρ kosteat, kulutukselle alttiit paikat (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) ei erikoiskäsittelyitä (4) JÄLKEEN (4) A, F Leontodon hispidus (Kesämaitiainen) Ρ pellot, pientareet, kulutukselle alttiit alueet (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) pimeys estää itämisen (17, 18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 23) JÄLKEEN (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Kesäpäivänhattu) K, Ρ, kulutukselle alttiit alueet (16) 0,3 (4, 14) V = P (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) ei erikoiskäsittelyitä (4, 14, 33) JÄLKEEN (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Kanadanpiisku) Ρ laidunmaat, avoimet paikat (16) 0,06–0,08 (4, 14) V = P (11) 0 (4) 14–21 (11) sekoitetaan yhtä suureen määrään hiekkaa ja liotetaan gibberelliinihapossa (pitoisuus 500 ppm) 24 h ajan (11), ei erikoiskäsittelyitä (4) JÄLKEEN (4) E, F Xanthium pensylvanicum (Sappiruoho) Y pellot, avoimet kasvupaikat (16) 25–61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) pimeys saattaa estää itämisen (1), liotetaan lämpimässä vedessä 12 h ajan (29) ENNEN JA JÄLKEEN (31) A Xanthium spinosum (Piikkisappiruoho) Y avoimet kasvupaikat (16) 200 (14) V = P (14) V > P (6) 10 (6) karheuttaminen (14), ei erikoiskäsittelyitä (6) ENNEN JA JÄLKEEN (6) A Xanthium strumarium (Karheasappiruoho) Y pellot, avoimet kasvupaikat (16) 67,4 (14) V = P (14) 10–20 (6, 21) ei erikoiskäsittelyitä (6, 14, 21) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 21, 28, 31) A RISTIKUKKAISKASVIT Cardamine pratensis (Luhtalitukka) Ρ pellot, pientareet, nurmet (16, 19) 0,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) pimeys estää itämisen (18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22) JÄLKEEN (5, 22) F KOHOKKIKASVIT Lychnis flos-cuculi (Käenkukka) Ρ (16) 0,21 (14) V = P (14) < 14 (100 %) (14, 25) saattavat vaatia kypsymistä (18), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 15, 22–26) JÄLKEEN (5, 15, 22–26) F SAVIKKAKASVIT Chenopodium album (Jauhosavikka) Y pellonreunat, kulutukselle alttiit alueet (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) V = P (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) käsittelyt eroavat siementen värin mukaan (19), lepotilassa kuivavarastoinnin aikana (19), pimeys estää itämisen (1, 18, 19), kylmästratifiointi (18), ei erikoiskäsittelyitä (14, 34) ENNEN JA JÄLKEEN (28, 31, 34) A 32 KLUSIAKASVIT Hypericum perforatum (Mäkikuisma) Ρ pellot, viljelysmaat, avoimet kasvupaikat (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) V = P (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) pimeys estää itämisen (1, 18, 19) ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 15, 25, 27) JÄLKEEN (5, 15, 25, 27) A, E, F KIERTOKASVIT Ipomoea hederacea (Liuskaelämänlanka) Y pientareet, avoimet kasvupaikat, viljapellot (16) 28,2 (14) V > P (6, 10) 10-20. (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) säteily ei vaikuta itävyyteen (1) ei erikoiskäsittelyitä (6, 21) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 12, 21, 28) A SARAKASVIT Cyperus rotundus (–) Ρ viljelysmaat, laidunmaat, pientareet (16, 30) 0,2 (14) V = P (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) pimeys estää itämisen (1) ei erikoiskäsittelyitä (6, 10, 14) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 28, 31) K 7 HERNEKASVIT Lotus corniculatus Keltamaite Ρ niityt, pientareet, avoimet kasvupaikat (16, 19) 1–1,67 (14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) karheuttaminen (14, 19) säteily ei vaikuta itävyyteen (18, 19), ei erikoiskäsittelyitä (23, 25) JÄLKEEN (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Soijasenna) Y tuoreet metsät (16) 23–28 (9) V = P (14) V > P (9) 10–20 (6, 9) siemeniä liotetaan vedessä 24 h (9) karheuttaminen (14), siementen elinkelpoisuus riippuu väristä (1), ei erikoiskäsittelyitä (6) JÄLKEEN (6, 9) A Sesbania exaltata (–) Y vesijättömaat (16) 11–13 (9, 14) V > P (9) 10–20 (9, 21) siemeniä liotetaan vedessä 24 h (9) säteily ei vaikuta itävyyteen (1), ei erikoiskäsittelyitä (21) ENNEN JA JÄLKEEN (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (Puna-apila) Ρ pellot, pientareet, viljelysmaat (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) karheuttaminen (14, 18) saattavat vaatia kypsymistä (19), säteily ei vaikuta itävyyteen (1, 19), ei erikoiskäsittelyitä (5) JÄLKEEN (5) A, E, F HUULIKUKKAISKASVIT Leonurus cardiaca (Nukula) Ρ avoimet paikat (16) 0,75–1,0 (4, 14) V = P (14) 0 (4) ei erikoiskäsittelyitä (4, 14) JÄLKEEN (4) F Mentha spicata (Viherminttu) Ρ kosteikot (16) 2,21 (4) 0 (4) ei erikoiskäsittelyitä (4) JÄLKEEN (4) F Nepeta cataria (Aitokissanminttu) Ρ kulutukselle alttiit alueet (16) 0,54 (4, 14) V = P (14) 0 (4) ei erikoiskäsittelyitä (2, 4, 14) JÄLKEEN (2, 4) F Prunella vulgaris (Niittyhumala) Ρ peltomaat, niityt, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) V = P (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) pimeys estää itämisen (18, 19) suuret siemenet itävät paremmin (1), ei erikoiskäsittelyitä (4, 14, 22) JÄLKEEN (4, 22) A, F Stachys officinalis (Rohtopähkämö) Ρ niityt, pellonpientareet (19) 14–18 (14, 19) V = P (14) 7 (50 %) (19) ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22) JÄLKEEN (5, 22) F MALVAKASVIT Abutilón theophrasti (–) Y pellot, avoimet kasvupaikat (16) 8,8 (14) V = P (14) 10-20. (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) karheuttaminen (14) ei erikoiskäsittelyitä (5, 10, 21) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Otasiida) Y pellot, pientareet (16, 19) 3,8 (14) V = P (14) 10–20 (6, 21) karheuttaminen (14) säteily ei vaikuta itävyyteen (1), ei erikoiskäsittelyitä (6, 21) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 21, 28, 31) A, F UNIKKOKASVIT Papaver rhoeas (Silkkiunikko) Y pellot, viljelysmaat, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) V = P (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) kylmästratifiointi ja karheuttaminen (1, 19, 32) ei erikoiskäsittelyitä (4, 14, 29) JÄLKEEN (4) A, D, E, F, G HEINÄKASVIT Agrostis tenuis (Nurmirölli) nurmikot, laidunmaat (16) 0,07 (14) V > P (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) pimeys estää itämisen (1, 17–19), ei erikoiskäsittelyitä (10) JÄLKEEN (10) A, E Alopecurus myosuroides (Rikkapuntarpää) Y pellot, avoimet kasvupaikat (16) 0,9–1,6 (29, 34) V = P (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) karheuttaminen (14), KNO3-käsittely 101 mg/l (14), lämpöstratifiointi (1), pimeys estää itämisen (1), ei erikoiskäsittelyitä (34) ENNEN JA JÄLKEEN (28, 34) A 32 Avena fatua (Hukkakaura) Y viljelysmaat, avoimet kasvupaikat (16) 7–37,5 (14, 30) V = P (14) V > P (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) karheuttaminen (7, 32), pimeys estää itämisen (1) kylmästratifiointi (1, 18), ei erikoiskäsittelyitä (6, 10, 14) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Kattokattara) Y pellot, pientareet, viljelysmaat (16) 0,45–2,28 (14, 29) V = P (14) 3 (29) kypsymiskausi (1, 7, 32), valo estää itämisen (1), ei erikoiskäsittelyitä (14) ENNEN JA JÄLKEEN (28, 31) A Cynosurus cristatus (Otasukapää) P pellot, pientareet, avoimet kasvupaikat (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) V = P (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) säteily ei vaikuta itävyyteen (19), ei erikoiskäsittelyitä (14, 29) JÄLKEEN (5) A Digitaria sanguinalis (Rikkaverihirssi) Y pellot, nurmet, avoimet kasvupaikat (16) 0,52–0,6 (14, 30) V = P (14) 10–20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) karheuttaminen, kylmästratifiointi ja kypsyminen (1, 7, 14, 32), KNO3-käsittely 101 mg/l (14), pimeys estää itämisen (1), ei erikoiskäsittelyitä (21) ENNEN JA JÄLKEEN (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Rikkakananhirssi) Y (16) 1,5 (14) V = P (14) V > P (3) 10–20 (7, 21) karheuttaminen (7, 23), säteily ei vaikuta itävyyteen (1), ei erikoiskäsittelyitä (3, 14, 21) ENNEN JA JÄLKEEN (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Kanadanvehnä) P rannat, kulutukselle alttiit paikat (16) 4–5 (14, 30) V = P (11) 1 (11) 14–28 (11) ei erikoiskäsittelyitä (2, 11) JÄLKEEN (2) C, D, E Festuca pratensis (Nurminata) P pellot, kosteikot (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) V = P (14) V > P (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) ei erikoiskäsittelyitä (10, 19) JÄLKEEN (10) A 7 Hordeum pusillum (–) Y laidunmaat, pientareet, avoimet kasvupaikat (16) 3,28 (14) lämpöstratifiointi (1), säteily ei vaikuta itävyyteen (1) ENNEN (31) 7 Phieum pratense (Timotei) P laidunmaat, viljelysmaat, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 0,45 (14, 19) V > P (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) pimeys estää itämisen (19), säteily ei vaikuta itävyyteen (17), ei erikoiskäsittelyitä (10, 14, 17, 19) JÄLKEEN (10) A, E TATARKASVIT Polygonum convolvulus (Kiertotatar) Y avoimet kasvupaikat, pientareet (16) 5–8 (4, 14, 29) V = P (20) 0–2 (4, 29) kylmästratifiointi 4–8 viikon ajan (1, 2, 4, 20, 29), säteily ei vaikuta itävyyteen (1) ENNEN JA JÄLKEEN (1, 2, 20, 28, 31) A 32 Polygonum lapathifolium (Ukontatar) Y tuore maaperä (16) 1,8–2,5 (14) V > P (6) 5 (94 %) (18) säteily ei vaikuta itävyyteen (1), pimeys estää itämisen (18), kylmästratifiointi (1), ei erikoiskäsittelyitä (5) ENNEN JA JÄLKEEN (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (–) Y pellot, avoimet kasvupaikat (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) kylmästratifiointi 4 viikon ajan 0–5 °C:ssa (1, 29), pimeys estää itämisen (1) ENNEN (31) A, E Polygonum periscaria (Keiholehti) Y kulutukselle alttiit alueet, viljelysmaat (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) V > P (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) karheuttaminen, kylmästratifiointi, GA-käsittely (14), kylmästratifiointi, kypsyminen (17–19), pimeys estää itämisen (19), ei erikoiskäsittelyitä (13) JÄLKEEN (13) A 32 Rumex crispus (Poimuhierakka) P viljelysmaat, pientareet, avoimet alueet (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) V = P (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) pimeys estää itämisen (18, 19), saattavat vaatia kypsymistä (18), ei erikoiskäsittelyitä (4, 14, 33) JÄLKEEN (4, 33) A, E 32 ESIKKOKASVIT Anagallis arvensis (Peltopunka) Y peltomaat, avoimet alueet, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) V = P (14) 1 (50 %) (19) kylmästratifiointi, GA-käsittely (1, 14, 18, 19, 32), itäminen edellyttää valoa (1), ei erikoiskäsittelyitä (2, 4) JÄLKEEN (2, 4) A, F LEINIKKIKASVIT Ranunculus acris (Niittyleinikki) Ρ viljelysmaat, pientareet, avoimet alueet (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) V = P (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22, 24–26) JÄLKEEN (5, 22, 24–26) 32 RUUSUKASVIT Geum urbanum (Kyläkellukka) Ρ pensasaidat, kosteikot (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) pimeys estää itämisen (18, 19), lämpöstratifiointi (1), ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22, 25, 26) JÄLKEEN (5, 22, 25, 26) A MATARAKASVIT Galium aparine (Kierumatara) Y peltomaat, kosteikot, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 7–9 (14, 19) V = P (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) kylmästratifiointi (1, 18, 19), säteily ei vaikuta itävyyteen (18, 19), valo estää itämisen (1), ei erikoiskäsittelyitä (6, 14) ENNEN JA JÄLKEEN (6, 28) A 32 Galium mollugo (Saksanmatara) Ρ aidanvierustat, avoimet paikat (8) 7 (29) V = P (14) 2 (29) ei erikoiskäsittelyitä (5, 14, 22, 24, 26, 29) JÄLKEEN (5, 22, 24, 26) A NAAMAKUKKAISKASVIT Digitalis purpurea (Rohtosormustinkukka) K, Ρ pensasaidat, avoimet paikat (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) V = P (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) pimeys estää itämisen (1, 17–19), ei erikoiskäsittelyitä (4, 22–26) JÄLKEEN (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (Persiantädyke) Y peltomaat, avoimet alueet, kulutukselle alttiit paikat (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) V = P (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) pimeys estää itämisen (18, 19), kylmästratifiointi (18), ei erikoiskäsittelyitä (14) ENNEN JA JÄLKEEN (28) A 32 Mainitut siementen toimittajat Toimittajan tunniste Toimittajan tiedot A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA +1 (727) 344-4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA +1 (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA +1 (303) 431-7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA +1 (800) 873-3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA +1 (800) 274-7333 www.thompson-morgan.com KIRJALLISUUSVIITTEET (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271–285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349–369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669–677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. Teoksessa: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. s. 197–208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481–486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. s. 151–156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Henkilökohtainen keskustelu. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769–776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189–1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21–28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555–558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017–1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453–459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227–232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71–86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223–235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25–42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283–293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369–388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. s. 1021–1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161–1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Henkilökohtainen keskustelu. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711–718. Lisäys 4 Esimerkkejä eräille ravintokasvilajeille sopivista kasvuolosuhteista Seuraavat olosuhteet on todettu sopiviksi kymmenelle ravintokasvilajille, ja niitä voidaan käyttää ohjeena myös eräille toisille lajeille kasvatuskaapeissa tehtävissä testeissä: Hiilidioksidipitoisuus: 350 ± 50 ppm; Suhteellinen kosteus: 70 ± 5 % valoisana aikana ja 90 ± 5 % pimeänä aikana; Lämpötila: 25 ± 3 °C päivällä, 20 ± 3 °C yöllä; Valojaksot: 16 h valoa / 8 h pimeyttä, kun oletetaan, että keskimääräinen aallonpituus on 400–700 nm; Valo: luminanssi 350 ± 50 μE/m2/s kuvun huipulta mitattuna. Ravintokasvilajit ovat: — tomaatti (Solanum lycopersicon); — kurkku (Cucumis sativus); — salaatti (Lactuca sativa); — soijapapu (Glycine max); — kaali (Brassica oleracea var. capitata); — porkkana (Daucus carota); — kaura (Avena sativa); — englanninraiheinä (Lolium perenne); — maissi (Zea mays); — sipuli (Allium cepa). C.32. LISÄÄNTYMISTESTI ÄNKYRIMADOILLA JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 220 (2004). Menetelmä on tarkoitettu käytettäväksi arvioitaessa maaperässä olevien kemikaalien vaikutuksia änkyrimadon (Enchytraeus albidus Henle 1873) lisääntymiskykyyn. Menetelmä perustuu pääasiallisesti Saksan Umweltbundesamtin kehittämään (1), kansainvälisessä yhteistutkimuksessa käytettyyn menetelmään (2). Huomioon on otettu myös muita menetelmiä, joilla kemikaalien myrkyllisyyttä änkyrimadoille ja lieroille on testattu (3), (4), (5), (6), (7), (8). ALUSTAVAT HUOMIOT 2. Maaperässä elävät Enchytraeus-suvun änkyrimadot ovat ekologisesti merkittäviä lajeja ympäristömyrkyllisyyden testaukseen. Änkyrimatoja tavataan usein maa-aineksessa, jossa on myös lieroja, mutta silti niitä saattaa olla runsaasti sellaisessakin maaperässä, jossa lieroja ei ole. Änkyrimatoja voidaan käyttää laboratoriokokeissa, osittaisissa kenttätutkimuksissa ja kokonaan kentällä tehtävissä tutkimuksissa. Käytännön näkökulmasta monet Enchytraeus-suvun lajit ovat helppoja käsitellä ja kasvattaa, ja niiden generaatioaika on huomattavasti lyhyempi kuin lieroilla. Änkyrimadoilla tehtävän lisääntymistestin kesto onkin vain 4–6 viikkoa, kun lieroilla (Eisenia fetida) se on 8 viikkoa. 3. Perustietoa änkyrimatojen ekologiasta ja ekotoksikologiasta maaympäristössä on lähteissä (9), (10), (11), (12). TESTIN PERIAATE 4. Täysikasvuiset änkyrimadot altistetaan keinomaahan sekoitetun testikemikaalin eri pitoisuuksille. Testin kulku voidaan jakaa kahteen vaiheeseen: (a) pitoisuusalueen määritystesti (jos tietoa ei ole saatavilla riittävästi), jossa pääasiallinen tutkittava ominaisuus on kuolleisuus kahden viikon altistuksen jälkeen, sekä (b) varsinainen lisääntymistesti, jossa arvioidaan emoeläinten tuottamien poikasten kokonaismäärä ja emoeläinten eloonjääminen. Varsinaisen testin kesto on kuusi viikkoa. Ensimmäisen kolmen viikon jälkeen täysikasvuiset madot otetaan talteen ja niiden morfologiset muutokset kirjataan ylös. Seuraavan kolmen viikon jälkeen lasketaan täysikasvuisten tuottamista munakoteloista kuoriutuneiden jälkeläisten lukumäärä. Testikemikaalille altistuneiden eläinten lisääntymiskykyä verrataan kontrollieläinten vastaavaan tulokseen, jotta voidaan määrittää i) pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia (no observed effect concentration, NOEC) ja/tai ii) ECx (esimerkiksi EC10 ja EC50) käyttämällä regressiomallia, jonka avulla arvioidaan pitoisuus, joka vähentää lisääntymiskykyä x prosenttia. Testipitoisuudet on valittava siten, että ECx-arvo on kyseisellä pitoisuusalueella (esimerkiksi EC10, EC50), jotta ECx saadaan interpoloimalla eikä ekstrapoloimalla. TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA 5. Testikemikaalista pitäisi olla käytettävissä seuraavat tiedot: vesiliukoisuus, log Kow, maa-vesi-jakaantumiskerroin (ks. esimerkiksi tämän liitteen luku C.18 tai C.19) sekä höyrynpaine. Lisätiedot testikemikaalin kulkeutumisesta maaperässä, kuten fotolyysi- ja hydrolyysinopeudet, ovat myös suotavia. 6. Tätä testimenetelmää voidaan käyttää vesiliukoisten tai veteen liukenemattomien kemikaalien yhteydessä. Testikemikaalia käytetään kummassakin tapauksessa kuitenkin eri tavalla. Testimenetelmää ei voida soveltaa haihtuviin kemikaaleihin, eli sellaisiin, joiden osalta Henryn vakio tai ilma-vesi-jakaantumiskerroin on suurempi kuin yksi, tai sellaisiin kemikaaleihin, joiden höyrynpaine on suurempi kuin 0,0133 Pa 25 °C:ssa. TESTIN VALIDITEETTI 7. Jotta testi olisi luotettava, kontrollien on täytettävä seuraavat kriteerit: — täysikasvuisten kuolleisuus pitoisuusalueen määrityskokeen lopussa ja lisääntymistestin ensimmäisen kolmen viikon jälkeen saa olla enintään 20 prosenttia — jos testin alussa jokaisessa astiassa on esimerkiksi 10 täysikasvuista, testin lopussa on oltava tuotettuna vähintään 25 poikasta astiaa kohti — poikasten keskimäärän variaatiokerroin saa olla enintään 50 prosenttia lisääntymistestin lopussa. Jos testi ei täytä näitä luotettavuuskriteerejä, se on keskeytettävä, ellei testin jatkamiselle ole perusteluita. Perustelut on kirjattava testiraporttiin. VERTAILUKEMIKAALI 8. Vertailukemikaali joko testataan säännöllisin väliajoin tai se otetaan mukaan jokaiseen testiin, jotta voidaan todeta, että testiorganismien vaste ei ole muuttunut merkittävästi ajan kuluessa. Sopiva vertailukemikaali on karbendatsiimi, jonka on osoitettu vaikuttavan änkyrimatojen eloonjäämiseen ja lisääntymiseen (13), (14). Myös muita kemikaaleja, joiden myrkyllisyystiedot tunnetaan hyvin, voidaan käyttää. Yhteistutkimuksessa käytettiin karbendatsiimivalmistetta, joka tunnetaan kauppanimellä Derosal™. Sen tuottaja on AgrEvo Company (Frankfurt, Saksa), ja se sisältää tehoainetta 360 g/l (32,18 %) (2). Yhteistutkimuksessa todettu lisääntymistä koskeva EC50-arvo oli välillä 1,2 ± 0,8 mg tehoainetta yhtä kuivamassakiloa kohti (2). Jos testisarjaan sisältyy positiivinen myrkyllinen standardi, käytetään yhtä pitoisuutta, jolloin rinnakkaisnäytteitä on oltava yhtä monta kuin kontrolleja. Karbendatsiimille suositeltava pitoisuus on 1,2 mg tehoainetta yhtä kuivamassakiloa kohti (testattuna nestemäisenä valmisteena). TESTIN KUVAUS Välineet 9. Testiastioiden on oltava lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia. Sopivia ovat lasipurkit, joiden tilavuus on esimerkiksi 0,20–0,25 litraa ja halkaisija ≈ 6 cm. Astioissa on oltava läpinäkyvät kannet (esimerkiksi lasia tai polyetyleeniä), jotka on suunniteltu vähentämään veden haihtumista, mutta jotka päästävät kaasun vaihtumaan maaperän ja ympäröivän ilmakehän välillä. Kansien on oltava läpinäkyviä valonläpäisevyyden vuoksi. 10. Testissä tarvitaan myös vakiolaboratoriolaitteisto, erityisesti seuraavat: — kuivauskaappi — stereomikroskooppi — pH-mittari ja fotometri — sopivia tarkkoja vaakoja — asianmukaiset lämpötilan valvontalaitteet — asianmukaiset ilmankosteuden valvontalaitteet (eivät välttämättömiä, jos altistusastiat on peitetty kansilla) — inkubaattori tai pieni tila, jossa on ilmastointilaite — pinsettejä, koukkuja tai silmukoita — laakea vati. Keinomaan valmistus 11. Tässä testissä käytetään keinomaata (5), (7), jonka lopullinen koostumus on seuraava (kuivapainojen perusteella, kun ainekset on kuivattu vakiopainoon 105 °C:ssa): — 10 prosenttia rahkaturvetta, joka on ilmakuivattu ja jauhettu hienoksi (hiukkaskoko 2 ± 1 mm on hyväksyttävä); suositeltavaa on tarkistaa tuoreesta turve-erästä valmistetun maa-aineksen soveltuvuus matojen kasvatukseen ennen sen käyttämistä kokeessa — 20 prosenttia kaoliinisavea (kaoliniitin osuus mieluiten yli 30 prosenttia) — noin 0,3–1,0 prosenttia kalsiumkarbonaattia (CaCO3, jauhemainen, analyyttinen laatu), jotta maan pH-arvoksi saadaan 6,0 ± 0,5; lisättävän kalsiumkarbonaatin määrään saattaa vaikuttaa etenkin turpeen laatu/tyyppi — noin 70 prosenttia ilmakuivattua teollisuushiekkaa (tarvittavan CaCO3-määrän mukaan), ensisijaisesti hienoa hiekkaa, jonka hiukkasista yli puolet on kooltaan 50–200 mikronia. On suositeltavaa todeta keinomaan soveltuvuus matojen kasvatukseen ja testin hyväksyttävyyskriteerien täyttyminen ennen kuin maata käytetään varsinaisessa testissä. Erityisen suositeltavaa on tehdä tällainen tarkistus sen varmistamiseksi, että testin onnistuminen ei vaarannu, jos keinomaan orgaanisen hiilen pitoisuutta vähennetään. Tämä tehdään esimerkiksi vähentämällä turvepitoisuutta 4–5 prosenttiin ja lisäämällä vastaavasti hiekan määrää. Kun orgaanisen hiilen pitoisuus pienenee, testikemikaalin adsorboituminen maahan (orgaaniseen hiileen) saattaa heikentyä ja testikemikaalin saatavuus madoille nousta. On osoitettu, että Enchytraeus albidus täyttää lisääntymiskriteerit, kun luonnonmaan orgaanisen hiilen pitoisuus on edellä mainittua matalampi, esimerkiksi 2,7 prosenttia (15). Kokemuksen, joka tosin on rajallinen, mukaan sama saadaan aikaan keinomaassa käyttämällä 5 prosenttia turvetta. Huomautus: Kun luonnollista maaperää käytetään myöhemmissä testeissä (esimerkiksi korkeamman tason testeissä), on maa-aineksen soveltuvuus ja testin hyväksyttävyyskriteerien täyttyminen osoitettava jälleen. 12. Maan kuivat ainesosat sekoitetaan perusteellisesti (esimerkiksi suurella laboratoriosekoittimella). Tämä tehdään vähintään viikko ennen testin alkua. Sekoitettu maa-aines varastoidaan kahden vuorokauden ajaksi, jotta sen happamuus tasapainottuu/vakautuu. pH-arvon määrittämisessä käytetään seosta, jossa on yksi osa maa-ainesta ja viisi osaa 1 M:n kaliumkloridiliuosta (KCl) tai 0,01 M:n kalsiumkloridiliuosta (CaCl2) (ks. (16) ja lisäys 3). Jos maa-aines on vaadittua vaihteluväliä happamampaa (ks. 11 kohta), happamuutta voidaan säätää lisäämällä tarvittava määrä CaCO3:a. Jos maa-aines on liian emäksistä, happamuutta voidaan säätää lisäämällä 11 kohdassa mainittua seosta, mutta jättämällä pois CaCO3. 13. Keinomaan enimmäisvedenpidätyskyky (WHC) määritetään lisäyksessä 2 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Yhdestä kahteen vuorokautta ennen testin aloittamista kuiva keinomaa esikostutetaan lisäämällä deionisoitua vettä noin puoleen lopullisesta vesipitoisuudesta eli 40–60 prosenttiin enimmäisvedenpidätyskyvystä. Testin alussa esikostutettu maa-aines jaetaan osioihin, jotka vastaavat testissä käytettävien testipitoisuuksien (ja tarvittaessa vertailukemikaalien) sekä kontrollien lukumäärää. Kosteuspitoisuus säädetään 40–60 prosenttiin enimmäisvedenpidätyskyvystä lisäämällä testikemikaalia liuoksena ja/tai lisäämällä tislattua tai deionisoitua vettä (ks. 19–21 kohdat). Kosteuspitoisuus todetaan testin alussa ja lopussa (kuivaamalla vakiopainoon 105 asteen lämpötilassa), ja sen on oltava matojen eloonjäämisen kannalta ihanteellisella alueella. Maa-aineksen kosteuspitoisuus voidaan tarkistaa likimääräisesti puristamalla maa-ainesta varovasti kädessä. Sormien välistä pitäisi tihkua pieniä vesipisaroita, jos kosteuspitoisuus on oikea. Koe-eläinten valinta ja valmistelu 14. Suositeltava testilaji on Enchytraeus albidus Henle 1837 (änkyrimato), joka kuuluu heimoon Enchytraeidae (lahko Oligochaeta, pääjakso Annelida). E. albidus on eräs suurimpia änkyrimatolajeja, ja tavattujen yksilöiden pituus on ollut jopa 35 mm (17), (18). E. albidus on levinnyt kaikkialle maailmaan, ja sitä tavataan merellisistä, makean veden ja kuivan maan luontotyypeistä useimmiten lahoavasta orgaanisesta aineksesta (merilevästä, kompostimullasta) ja joskus harvoin myös niityiltä (9). Sen laaja ekologinen toleranssi sekä eräät morfologiset vaihtelut saattavat osoittaa, että lajista on olemassa eri alalajeja. 15. E. albidus -lajin yksilöitä myydään kalanruoaksi. On tarkistettava, ettei viljelmä ole kontaminoitunut jollakin, yleensä pienemmällä lajilla (1), (19). Jos kontaminaatiota ilmenee, kaikki madot on pestävä vedellä petrimaljassa. Tämän jälkeen E. albidus -lajin suurikokoiset täysikasvuiset yksilöt erotetaan uuden viljelmän aloittamista varten, ja kaikki muut yksilöt heitetään pois. E. albidus -lajia voidaan kasvattaa helposti monenlaisissa orgaanisissa materiaaleissa (ks. lisäys 4). E. albidus -lajin elinkaari on lyhyt, sillä täysikasvuisuus saavutetaan 33 vuorokauden (lämpötilassa 18 °C) ja 74 vuorokauden (lämpötilassa 12 °C) välillä (1). Testissä käytetään ainoastaan viljelmiä, joita on pidetty laboratoriossa ongelmitta vähintään viiden viikon (yhden sukupolven) ajan. 16. Sopivia ovat myös muut Enchytraeus-suvun lajit, esimerkiksi E. buchholzi Vejdovsky 1879 tai E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (ks. lisäys 5). Jos käytetään muita Enchytraeus-lajeja, ne on tunnistettava selvästi ja lajin valintaperusteet on raportoitava. 17. Testissä käytettävät eläimet ovat täysikasvuisia matoja. Niillä on oltava munia (valkoisia pisteitä) clitellumin alueella, ja niiden on oltava suunnilleen samankokoisia (noin 1 cm pitkiä). Kasvatusviljelmää ei tarvitse synkronisoida. 18. Jos änkyrimatoja ei kasvateta samassa maa-ainestyypissä ja olosuhteissa (ruokinta mukaan luettuna), joissa varsinainen testi tehdään, matoja on totutettava uuteen ympäristöön vähintään 24 tunnin, mutta enintään kolmen vuorokauden ajan. Totutettavaksi otetaan ensin suurempi määrä täysikasvuisia kuin testin tekemiseen tarvitaan, jotta vahingoittuneet tai muuten soveltumattomat yksilöt voidaan tarvittaessa hylätä. Totutusjakson lopussa testiin valitaan vain munia sisältäviä matoja, joiden käytöksessä ei ilmene mitään epätavallista (ne eivät esimerkiksi pyri pois maa-aineksesta). Madot otetaan varovasti erilleen terävillä pinseteillä, koukuilla tai silmukoilla ja laitetaan petrimaljaan, jossa on vähän raikasta vettä. Tarkoitukseen sopivinta on tämän liitteen luvussa C.20 Lisääntymistesti vesikirpulla (Daphnia magna) esitetty synteettinen vesi, sillä deionisoitu tai demineralisoitu vesi tai hanavesi saattaa olla madoille haitallista. Madot tutkitaan stereomikroskoopin alla, ja munia sisältämättömät yksilöt hävitetään. Viljelmiin mahdollisesti joutuneet punkit tai hyppyhäntäiset on poistettava huolellisesti ja hävitettävä. Terveet madot, joita ei käytetä testiin, palautetaan kantaviljelmään. Testipitoisuuksien valmistelu Vesiliukoinen testikemikaali 19. Testikemikaalista ja deionisoidusta vedestä valmistetaan sellainen määrä liuosta, joka riittää yhden testipitoisuuden kaikkiin neljään rinnakkaisnäytteeseen. Suositeltavaa on käyttää vettä riittävästi, jotta saavutetaan tarvittava kosteuspitoisuus, eli 40–60 prosenttia enimmäisvedenpidätyskyvystä (ks. 13 kohta). Kukin testikemikaaliliuos sekoitetaan perinpohjaisesti yhteen erään esikostutettua maata, ennen kuin se laitetaan testiastiaan. Veteen liukenematon testikemikaali 20. Jos käytettävä kemikaali ei ole vesiliukoista, mutta liukenee orgaaniseen liuottimeen, se voidaan liuottaa pienimpään mahdolliseen määrään sopivaa kantoainetta (esimerkiksi asetonia). Ainoastaan haihtuvia liuottimia saa käyttää. Kantoaine sekoitetaan pieneen määrään (esimerkiksi 2,5 g) hienoa kvartsihiekkaa tai ruiskutetaan sen päälle. Kantoaine poistetaan haihduttamalla hiekkaa vetokaapissa vähintään tunnin ajan. Kvartsihiekan ja testikemikaalin seos lisätään esikostutettuun maahan ja sekoitetaan huolellisesti sopivaan määrään deionisoitua vettä, jotta saadaan tarvittava kosteuspitoisuus. Lopullinen seos siirretään testiastioihin. 21. Jos kemikaali liukenee heikosti veteen ja orgaanisiin liuottimiin, haluttu testipitoisuus saadaan sekoittamalla testikemikaaliin 2,5 grammaa vastaava määrä hienoksi jauhettua kvartsihiekkaa testiastiaa kohden. Kvartsihiekan ja testikemikaalin seos lisätään esikostutettuun maahan ja sekoitetaan huolellisesti sopivaan määrään deionisoitua vettä, jotta saadaan tarvittava kosteuspitoisuus. Lopullinen seos jaetaan testiastioihin. Menettely toistetaan jokaisen testipitoisuuden yhteydessä, ja myös asianmukainen kontrolli valmistellaan. 22. Testattavan kemikaalin pitoisuus saa normaalisti olla enintään 1 000 mg/kg maa-aineksen kuivaan massaan nähden. Toisinaan testin tarkoitus voi kuitenkin edellyttää suuremmilla pitoisuuksilla testaamista. TESTIEN SUORITTAMINEN Testi- ja kontrolliryhmät 23. Jokaisesta testipitoisuudesta laitetaan testiastiaan 20 gramman kuivapainoa vastaava määrä testattavaa maa-ainesta (ks. 19–21 kohdat). Lisäksi valmistellaan kontrollit, joihin ei lisätä testikemikaalia. Jokaiseen astiaan lisätään ruokaa 29 kohdassa kuvatulla tavalla. Kuhunkin testiastiaan sijoitetaan satunnaisesti kymmenen matoa. Madot siirretään varovasti testiastiaan ja asetetaan maa-aineksen pinnalle käyttäen esimerkiksi teräväkärkisiä pinsettejä, koukkuja tai silmukoita. Testipitoisuuksien rinnakkaisnäytteiden ja kontrollien lukumäärä määräytyy käytettävän testijärjestelyn mukaan (ks. 34 kohta). Testiastiat sijoitetaan testi-inkubaattoriin satunnaisesti, ja astioiden paikkoja muutetaan satunnaisesti viikoittain. 24. Jos testikemikaalin applikoinnissa käytetään kantoainetta, koesarjojen lisäksi tulee tehdä yksi kontrollisarja, joka sisältää pelkästään kvartsihiekkaa, johon liuotinta on sekoitettu tai ruiskutettu. Liuottimen tai dispergointiaineen pitoisuuden olisi oltava sama kuin testikemikaalia sisältävissä testiastioissa. Lisäksi tehdään yksi ylimääräisen annoksen kvartsihiekkaa (2,5 g astiaa kohti) sisältävä kontrollisarja niille kemikaaleille, jotka on annosteltava 21 kohdassa kuvattujen menettelyjen mukaisesti. Testiolosuhteet 25. Testauslämpötila on 20 °C ± 2 °C. Matoja estetään poistumasta maa-aineksesta toteuttamalla testi valoisaa ja pimeää aikaa säätelemällä (mieluiten 16 tuntia valoisaa ja 8 tuntia pimeää). Testiastioiden alueella tulisi olla 400–800 luksin valaistus. 26. Maa-aineksen kosteuden tarkistamiseksi astiat punnitaan testin alussa ja sen jälkeen kerran viikossa. Jos astian paino on pienentynyt, astiaan lisätään riittävästi deionisoitua vettä. Veden häviämistä voidaan vähentää säilyttämällä testi-inkubaattorin ilmankosteus korkeana (> 80 prosenttia). 27. Kosteuspitoisuus ja pH-arvo on mitattava sekä pitoisuusalueen määritystestin että varsinaisen testin alussa ja lopussa. Mittaukset on tehtävä kontrolleista ja käsitellyistä maa-ainesnäytteistä (kaikki pitoisuudet), jotka on valmistettu samalla tavalla kuin koeviljelmät ja joita on ylläpidetty samoin, mutta joissa ei ole matoja. Näihin maa-ainesnäytteisiin lisätään ruokaa vain testin alussa mikrobien toiminnan helpottamiseksi. Ruokaa lisätään yhtä paljon kuin testiviljelmiin. Testin aikana näihin astioihin ei ole tarpeen enää lisätä ruokaa. Ruokinta 28. Käytettävä ruoka on sellaista, jota änkyrimatopopulaatio voi käyttää ravinnokseen. Ruokintaan sopivaksi on todettu kaurahiutaleet, jotka suositellaan käsiteltäväksi autoklaavissa ennen käyttöä mikrobikontaminaation estämiseksi; myös kuumentamista voidaan käyttää. 29. Ensimmäinen ruokinta tapahtuu sekoittamalla 50 mg jauhettuja kaurahiutaleita kussakin astiassa olevaan maa-ainekseen ennen matojen lisäämistä. Tämän jälkeen ruokaa annetaan viikoittain päivään 21 saakka. Päivänä 28 ruokintaa ei tehdä, sillä täysikasvuiset yksilöt on tässä vaiheessa poistettu, ja poikaset tarvitsevat tämän ajankohdan jälkeen melko vähän lisäruokaa. Testin aikana ruokinta tapahtuu sijoittamalla 25 mg jauhettuja kaurahiutaleita maa-aineksen pinnalle niin varovasti, että madot eivät vahingoitu. Sienten kasvun estämiseksi kaurahiutaleet peitetään pienellä määrällä maa-ainesta. Jos kaikkea ruokaa ei syödä, annosta pienennetään. Testijärjestely pitoisuusalueen määritystestiä varten 30. Tarvittaessa pitoisuusalueen määritystesti toteutetaan esimerkiksi siten, että siinä on viisi testikemikaalipitoisuutta (0,1, 1,0, 10, 100 ja 1 000 mg/kg maa-aineksen kuivapainoon nähden). Jokaisesta käsittelystä riittää yksi rinnakkaisnäyte ja kontrolli. 31. Pitoisuusalueen määritystestin kesto on kaksi viikkoa. Testin lopussa arvioidaan matojen kuolleisuus. Mato kirjataan kuolleeksi, jos se ei reagoi etupäähän annettuun mekaaniseen ärsytykseen. Kuolleisuuden lisäksi voidaan kerätä muita tietoja, joista saattaa olla apua varsinaisessa testissä käytettävien pitoisuusalueiden valinnassa. Siksi on syytä kirjata muistiin muutokset täysikasvuisten yksilöiden käyttäytymisessä (esimerkiksi kyvyttömyys kaivautua maa-ainekseen tai makaaminen liikkumatta testiastian lasiseinämää vasten) ja morfologiassa (esimerkiksi avohaavat) sekä mahdollisten poikasten esiintyminen. Viimeksi mainittu voidaan todeta lisäyksessä 6 kuvattua värjäysmenetelmää käyttämällä. 32. LC50-arvo voidaan todeta likimääräisesti laskemalla kuolleisuusdatan geometrinen keskiarvo. Kun pitoisuuden vaihteluväliä valitaan varsinaista testiä varten, lisääntymiselle aiheutuvat vaikutukset arvioidaan enintään 10-kertaisesti LC50-arvoa pienemmiksi. Tämä suhde on kuitenkin empiirinen, eikä välttämättä päde yksittäistapauksissa. Muista pitoisuusalueen määritystestissä tehdyistä havainnoista, kuten poikasten esiintymisestä, voi olla apua varsinaisessa testissä käytettävän testikemikaalin pitoisuusalueen tarkemmassa määrittämisessä. 33. LC50-arvon tarkkaa määrittämistä varten suositellaan, että testissä käytetään vähintään neljää rinnakkaisnäytettä jokaisesta testikemikaalin pitoisuudesta sekä riittävää määrää eri pitoisuuksia, jotta kyseisillä pitoisuuksilla saadaan aikaan vähintään neljä tilastollisesti merkittävää, toisistaan poikkeavaa keskimääräistä vastetta. Jos käytössä on kontrolleja, käytetään vastaavaa määrää pitoisuuksia ja rinnakkaisnäytteitä. Testijärjestely varsinaista lisääntymistestiä varten 34. Yhteistutkimuksen johdosta tehtyjen suositusten perusteella esitetään kolmea mahdollista testijärjestelyä (2): — NOEC-arvoa määritettäessä testataan vähintään viisi pitoisuutta geometrisessa sarjassa. Jokaista testipitoisuutta kohti suositellaan neljää rinnakkaisnäytettä ja kahdeksaa kontrollia. Pitoisuudet on porrastettava kertoimella, joka saa olla enintään 1,8. — ECx-arvoa määritettäessä (esimerkiksi EC10, EC50) testataan vähintään viisi pitoisuutta, ja pitoisuudet on valittava siten, että ECx-arvo on kyseisellä pitoisuusalueella, jotta ECx saadaan interpoloimalla eikä ekstrapoloimalla. Jokaista testipitoisuutta kohti suositellaan vähintään neljää rinnakkaisnäytettä ja neljää kontrollirinnakkaisnäytettä. Porrastuskerroin voi vaihdella ja olla enintään 1,8 odotetulla vaikutusalueella sekä yli 1,8 tätä suuremmilla ja pienemmillä pitoisuuksilla. — Yhdistetty lähestymistapa mahdollistaa sekä NOEC-arvon että ECx-arvon määrittämisen. Tällöin käytetään kahdeksaa käsittelypitoisuutta geometrisessa sarjassa. Jokaista käsittelyä kohti suositellaan neljää rinnakkaisnäytettä ja kahdeksaa kontrollia. Pitoisuudet on porrastettava kertoimella, joka saa olla enintään 1,8. 35. Käytettävien täysikasvuisten matojen määrä astiaa kohti on 10 (ks. 23 kohta). Ruokaa lisätään testiastioihin testin alussa ja tämän jälkeen kerran viikossa (ks. 29 kohta). Viimeisen kerran ruokaa lisätään päivänä 21. Päivänä 21 maa-ainesnäytteet tutkitaan varovasti käsin ja elävät täysikasvuiset madot todetaan ja lasketaan. Samalla kirjataan muistiin muutokset niiden käyttäytymisessä (esimerkiksi kyvyttömyys kaivautua maa-ainekseen tai makaaminen liikkumatta testiastian lasiseinämää vasten) ja morfologiassa (esimerkiksi avohaavat). Tämän jälkeen kaikki täysikasvuiset poistetaan testiastioista ja testimaa-aineksesta. Jos testimaa-ainekseen on tuotettu munakoteloita, kotelot sisältävää maa-ainesta inkuboidaan vielä kolme viikkoa samoissa testiolosuhteissa, mutta ruokinta tehdään vain päivänä 35 (jolloin kuhunkin astiaan annostellaan 25 mg jauhettuja kaurahiutaleita). 36. Kuuden viikon kuluttua vastakuoriutuneet madot lasketaan. Suositeltava menetelmä on rose bengal -värjäykseen (ks. lisäys 6) perustuva, mutta myös muut märkäerottamiseen (ei lämpöerottamiseen) perustuvat tekniikat ja kelluttaminen (ks. lisäys 6) on todettu sopiviksi (4), (10), (11), (20). Rose bengal -värjäystä suositellaan siksi, että suspendoituneiden savihiukkasten aikaansaama sameus voi haitata märkäerottamista maa-ainessubstraatista. Raja-annostesti 37. Jos pitoisuusalueen määritystestissä ei havaita vaikutuksia suurimmalla pitoisuudella (esimerkiksi 1 000 mg/kg), lisääntymistesti voidaan toteuttaa raja-annostestinä testipitoisuudella 1 000 mg/kg, millä voidaan osoittaa, että NOEC-arvo lisääntymiselle on tätä pitoisuutta suurempi. Testin yhteenveto ja aikataulu 38. Testin vaiheet voidaan tiivistää seuraavasti: Aika Pitoisuusalueen määritystesti Varsinainen testi Päivä –7 tai aiemmin — Keinomaan valmistus (kuivien ainesosien sekoitus) — Keinomaan valmistus (kuivien ainesosien sekoitus) Päivä –5 — Keinomaan pH-arvon tarkistaminen — Maan enimmäisvedenpidätyskyvyn mittaus — Keinomaan pH-arvon tarkistaminen — Maan enimmäisvedenpidätyskyvyn mittaus Päivät –5… –3 — Matojen lajittelu totuttelua varten — Matojen lajittelu totuttelua varten Päivät –3… 0 — Matojen annetaan tottua vähintään 24 tunnin ajan — Matojen annetaan tottua vähintään 24 tunnin ajan Päivä –1 — Keinomaan esikostuttaminen ja jakaminen eriin — Keinomaan esikostuttaminen ja jakaminen eriin Päivä 0 — Kantaliuosten valmistaminen — Testikemikaalin applikointi — Testisubstraatin punnitseminen testiastioihin — Ruoan annostelu — Matojen siirtäminen astiaan — Maa-aineksen pH-arvon ja kosteuspitoisuuden mittaaminen — Kantaliuosten valmistaminen — Testikemikaalin applikointi — Testisubstraatin punnitseminen testiastioihin — Ruoan annostelu — Matojen siirtäminen astiaan — Maa-aineksen pH-arvon ja kosteuspitoisuuden mittaaminen Päivä 7 — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Ruokinta Päivä 14 — Täysikasvuisten yksilöiden kuolleisuuden toteaminen — Poikasten lukumäärän arviointi — Maa-aineksen pH-arvon ja kosteuspitoisuuden mittaaminen — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Ruokinta Päivä 21 — Täysikasvuisten käyttäytymisen tarkkaileminen — Täyskasvuisten poistaminen — Täysikasvuisten yksilöiden kuolleisuuden toteaminen — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Ruokinta Päivä 28 — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Ei ruokintaa Päivä 35 — Maa-aineksen kosteuspitoisuuden tarkistaminen — Ruokinta Päivä 42 — Poikasten laskenta — Maa-aineksen pH-arvon ja kosteuspitoisuuden mittaaminen TIEDOT JA RAPORTOINTI Tulosten käsittely 39. Lisäyksessä 7 olevaa yhteenvetoa lukuun ottamatta tähän testimenetelmään ei kuulu tarkoin määriteltyä tilastollista menetelmää testitulosten analysointia varten. 40. Pitoisuusalueen määritystestin keskeinen tutkittava ominaisuus on kuolleisuus. Muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi kyvyttömyys kaivautua maa-ainekseen tai makaaminen liikkumatta testiastian lasiseinämää vasten) ja morfologiassa (esimerkiksi avohaavat) sekä mahdollisten poikasten esiintyminen on kuitenkin myös syytä kirjata muistiin. LC50-arvo määritetään normaalisti tilastollista koestusta (21) tai logistista regressiota käyttämällä. Tapauksissa, joihin tämä analyysimenetelmä ei sovellu (esimerkiksi silloin, kun osittaista kuolleisuutta havaitaan alle kolmessa pitoisuudessa), voidaan kuitenkin käyttää muita menetelmiä. Näitä ovat esimerkiksi liukuva keskiarvo (22), viritetty Spearmanin ja Kärberin menetelmä (23) tai yksinkertainen interpolointi (esimerkiksi LC0:n ja LC100:n geometrinen keskiarvo laskettuna LC0:n neliöjuuresta kerrottuna LC100:lla). 41. Varsinaisessa testissä tutkittava ominaisuus on hedelmällisyys eli tuotettujen poikasten lukumäärä. Pitoisuusalueen määritystestin tavoin kaikki muut merkit kemikaalin vaarallisuudesta on kuitenkin kirjattava loppuraporttiin. Tilastollinen analyysi edellyttää, että lisääntymisestä lasketaan aritmeettinen keskiarvo ja keskihajonta kutakin käsittelyä ja kontrollia kohti. 42. Varianssianalyysiä tehtäessä keskihajonta s ja vapausaste df voidaan korvata yhdistetyllä varianssianalyysistä saadulla varianssiestimaatilla ja sen vapausasteilla sillä ehdolla, että varianssi ei ole riippuvainen pitoisuudesta. Tässä tapauksessa käytetään kontrollin ja käsittelyiden yksinkertaisia variansseja. Kaupalliset tilasto-ohjelmistot laskevat nämä arvot yleensä käyttämällä astiakohtaisia tuloksia rinnakkaisnäytteinä. Jos negatiivisista kontrolleista ja liuotinkontrolleista saadun datan yhdistäminen vaikuttaa järkevämmältä kuin testaaminen johonkin niistä verraten, ne on testattava, jotta voidaan todeta, etteivät ne eroa toisistaan merkittävästi (sopivista testeistä ks. 45 kohta ja lisäys 7). 43. Muut tilastolliset testit ja interferenssi riippuvat siitä, ovatko rinnakkaisnäytteiden arvot normaalijakaumalla ja varianssiin nähden homogeenisia. NOEC-estimointi 44. Huomiota kiinnitetään ennen kaikkea testien voimaan. Kun halutaan arvioida, noudattaako data suurin piirtein normaalijakaumaa, hyödynnetään esimerkiksi aiemmista yhteistutkimuksista saatua tietoa tai muuta historiallista tietoa. Kriittisempi on varianssin homogeenisuus (homoskedastisuus). Kokemuksen perusteella varianssi usein kasvaa keskiarvon noustessa, ja tässä tilanteessa datan muuntaminen saattaa johtaa homoskedastisuuteen. Muunnosten täytyy kuitenkin perustua historiallisesta tiedosta saatuun kokemukseen tutkittavana olevan datan asemasta. Jos data on homogeenista, tehdään useita t-testejä, esimerkiksi Watsonin-Williamsin testi (α = 0,05, yksisuuntainen) (24), (25) tai joissakin tapauksissa Dunnettin testi (26), (27). On syytä huomata, että jos rinnakkaisnäytteitä ei ole yhtä paljon, taulukon t-arvoja on korjattava Dunnettin ja Williamsin esittämillä tavoilla. Suuren variaation vuoksi vasteet eivät aina kasva tai pienene säännönmukaisesti ja monotonisuudesta poiketaan voimakkaasti, jolloin Dunnettin testi sopii tarkoitukseen paremmin. Jos homoskedastisuudessa on poikkeamia, voi olla tarpeen tutkia tarkemmin mahdollisia vaikutuksia variansseihin, jotta saadaan selville, voiko t-testejä käyttää testien voimasta tinkimättä (28). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää moninkertaista U-testiä, esimerkiksi Bonferroni-U-testiä Holmin mukaan (29). Jos datassa ilmenee heteroskedastisuutta, mutta se vastaa muutoin taustalla olevaa monotonista annosvastetta, voidaan käyttää myös muuta parametritonta testiä, esimerkiksi Jonckheere-Terprstran testiä (30), (31) tai Shirleyn testiä (32), (33). Viimeksi mainitut ovat yleensä suositeltavampia kuin t-testit, joissa varianssit ovat heterogeenisiä. (Ks. myös lisäyksen 7 kaavio.) 45. Jos raja-arvotesti on tehty ja parametritestimenetelmien edellytykset (yleensä homogeenisuus) täyttyvät, voidaan käyttää parittaista Studentin t-testiä tai muussa tapauksessa Mann-Whitneyn U-testimenetelmää (29). ECx-pitoisuuden arviointi 46. Kaikkia ECx-arvoja laskettaessa käsittelykohtaisia keskiarvoja käytetään regressioanalyysissa (lineaarisessa tai epälineaarisessa) sen jälkeen, kun on muodostettu sopiva annosvastefunktio. Kun matojen kasvu on jatkuva vaste, ECx-arvot voidaan estimoida sopivalla regressioanalyysillä (35). Sopivia funktioita dikotomisia tietoja varten (kuolleisuus/eloonjääminen ja tuotettujen jälkeläisten määrä) ovat tavanomaiset S-funktio, logistinen funktio tai Weibullin funktio, jotka sisältävät 2–4 parametria, joista osalla voidaan mallintaa myös hormeettisia vasteita. Jos annosvastefunktio on sovitettu lineaarisella regressioanalyysilla, merkitsevä r2 (determinaatiokerroin) ja/tai kaltevuus on etsittävä regressioanalyysilla, minkä jälkeen ECx arvioidaan käyttämällä kontrollikeskiarvon x prosenttia vastaavaa arvoa regressioanalyysilla muodostetussa yhtälössä. Seuraavaksi 95 prosentin luottamusvälit lasketaan Fiellerin mukaan (teoksessa Finney (21)) tai jollakin muulla sopivalla, nykyaikaisella menetelmällä. 47. Vaihtoehtoisesti vaste voidaan mallintaa prosentti- tai muuna osuutena malliparametrista, joka tulkitaan kontrollin keskimääräiseksi vasteeksi. Tällöin normaali (logistinen, Weibullin) s-käyrä voidaan sovittaa helposti tuloksiin hyödyntämällä probitti-regressiomenetelmää (21). Painotusfunktiota on mukautettava metrisiin vasteisiin Christensenin esimerkin mukaan (36). Jos hormeesia on havaittu, probittianalyysin sijasta on käytettävä neliparametrista logistista tai Weibullin funktiota, joka sovitetaan epälineaarisella regressiomenetelmällä (36). Jos dataan ei saada sovitettua sopivaa annosvastefunktiota, voidaan ECx:n ja sen luottamusvälien estimoinnissa käyttää jotain muuta menetelmää, kuten Thompsonin liukuvaa keskiarvoa (22) tai viritettyä Spearman ja Kärberin menetelmää (23). TESTIRAPORTTI 48. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testikemikaali: — fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi vesiliukoisuus, höyrynpaine) — testikemikaalin IUPAC-nimikkeistön mukaiset tunnistetiedot, CAS-numero, erä, rakennekaava ja puhtaus — näytteen viimeinen käyttöpäivä. Testilajit: — käytetyt koe-eläimet: lajit, tieteellinen nimi, organismien lähde ja kasvatusolosuhteet. Testiolosuhteet: — keinomaan ainesosat ja valmistustapa — testikemikaalin applikointitapa — kuvaus testiolosuhteista, mukaan lukien lämpötila, kosteuspitoisuus ja pH-arvo — täydellinen kuvaus testijärjestelystä ja käytetyistä menettelyistä. Testitulokset: — täysikasvuisten matojen kuolleisuus kahden viikon kuluttua sekä poikasten määrä pitoisuusalueen määritystestin lopussa — täysikasvuisten matojen kuolleisuus kolmen viikon altistumisen jälkeen sekä täydelliset tiedot poikasista varsinaisen testin lopussa — kaikki testiorganismeissa havaitut fyysiset tai patologiset oireet sekä käyttäytymisen muutokset — LC50-arvo, NOEC-arvo ja/tai ECx (esimerkiksi EC50, EC10) lisääntymisen osalta, jos jotain näistä voidaan soveltaa luottamusvälien puitteissa, sekä käyrä sen laskennassa käytetystä sovitetusta mallista kaikki tiedot ja havainnot, jotka helpottavat tulosten tulkintaa. Lisäksi ilmoitetaan poikkeukset tässä testimenetelmässä kuvatuista menettelyistä ja kaikki testin aikana ilmenneet epätavallisuudet. LÄHDEKIRJALLISUUS (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 s. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results. Teoksessa: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. s. 497–508. Elsevier, Amsterdam. (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 s. (5) Tämän liitteen luku C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla. (6) International Organisation for Standardization (ISO) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) International Organisation for Standardization (ISO) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). Teoksessa: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73–94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217–232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246–249. (11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2–29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79–96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. Teoksessa: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59–81. (16) International Organisation for Standardization (ISO) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1–13. (18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1–160. (19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300–305. (21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19–76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714–719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103–117. (25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096–1121. (27) Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482–491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355–361. (29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65–70. (30) Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. (31) Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327–333. (32) Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144–151. (33) Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183–186. (34) Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213–221. (36) Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25–32. Lisäys 1 Määritelmät Tässä testimenetelmässä sovelletaan seuraavia määritelmiä: Kemikaali: Aine tai seos. ECx (Effect concentration for x % effect = vaikuttava pitoisuus, joka aiheuttaa x prosenttia muutoksia): Pitoisuus, joka aiheuttaa x prosentin suuruisen vaikutuksen testiorganismeihin tietyn altistusjakson aikana kontrolliin verrattuna. Tässä testissä kaikki vaikuttavat pitoisuudet ilmaistaan testikemikaalin massana testimaa-aineksen kuivamassaa kohti. LC0 (ei tappava pitoisuus) Testikemikaalin pitoisuus, joka ei aiheuta lainkaan altistuneiden testiorganismien kuolleisuutta tietyn ajanjakson aikana. Tässä testissä LC0 ilmaistaan testikemikaalin massana testimaa-aineksen kuivamassaa kohti. LC50 (mediaani tappava pitoisuus): Testikemikaalin pitoisuus, joka aiheuttaa 50 prosentin kuolleisuuden altistuneissa testiorganismeissa tietyn ajanjakson aikana. Tässä testissä LC50 ilmaistaan testikemikaalin massana testimaa-aineksen kuivamassaa kohti. LC100 (täysin tappava pitoisuus): Testikemikaalin pitoisuus, joka aiheuttaa 100 prosentin kuolleisuuden altistuneissa testiorganismeissa tietyn ajanjakson aikana. Tässä testissä LC100 ilmaistaan testikemikaalin massana testimaa-aineksen kuivamassaa kohti. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration, pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus): Testikemikaalin pienin pitoisuus, jolla on tilastollisesti merkittävä vaikutus (p < 0,05). Tässä testissä LOEC ilmaistaan testikemikaalin massana testimaa-aineksen kuivamassaa kohti. Kaikilla LOEC-pitoisuuden ylittävillä testipitoisuuksilla vaikutuksen olisi normaalisti oltava kontrollista tilastollisesti poikkeava. Kaikki poikkeamat edellä mainitusta LOEC-pitoisuuden määrittämisessä on perusteltava testiraportissa. NOEC (pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia): LOEC-arvoa välittömästi seuraava testikemikaalin korkein pitoisuus, josta ei ole havaittavaa vaikutusta. Tässä testissä NOEC-arvoa vastaavalla pitoisuudella ei ole tilastollisesti merkittävää vaikutusta (p < 0,05) tietyn altistusajan kuluessa kontrolliin verrattuna. Lisääntymiskyky: testijakson kuluessa tuotettujen poikasten keskimäärä täysikasvuisten matojen määrään verrattuna. Testikemikaali on tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Lisäys 2 Enimmäisvedenpidätyskyvyn määrittäminen Keinomaan vedenpidätyskyvyn määrittäminen Seuraava standardin ISO DIS 11268-2 liitteessä C kuvattu menetelmä on todettu tarkoituksenmukaiseksi. Kerää tietty määrä (esimerkiksi viisi grammaa) testimaa-ainessubstraattia sopivalla välineellä (kierrekairalla tms.). Aseta kierrekairaputken pohjalle pala suodatinpaperia, täytä vedellä ja laita putki sitten telineessä vesiastiaan. Putki upotetaan veteen vähitellen, kunnes vedenpinta on maanäytteen yläpuolella. Sen jälkeen näytettä pidetään vedessä noin kolme tuntia. Kaikkea maa-aineksen kapillaareihin imeytynyttä vettä ei pystytä pidättämään, minkä vuoksi maanäytettä valutetaan kahden tunnin ajan asettamalla putki hyvin märkään kerrokseen hienojakoista kvartsihiekkaa, joka on laitettu suljettuun astiaan (kuivumisen estämiseksi). Sen jälkeen näyte punnitaan ja kuivataan pysyvään massaan 105 °C:ssa. Vedenpidätyskyky (WHC) lasketaan seuraavasti: jossa: S = vesikyllästetty substraatti + putken massa + suodatinpaperin massa T = taara (putken massa + suodatinpaperin massa) D = substraatin kuivamassa. VIITTEET: International Organisation for Standardization (ISO) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. Lisäys 3 Maan pH:n määrittäminen Seuraava menetelmä, jolla määritetään maanäytteen pH-arvo, perustuu maan laatua koskevassa standardissa ISO 10390: Soil Quality – Determination of pH olevaan kuvaukseen. Tietyn määrän maata annetaan kuivua huoneenlämmössä vähintään 12 tunnin ajan. Sen jälkeen maasta valmistetaan suspensio (joka sisältää vähintään viisi grammaa maata), jonka tilavuus on viisinkertainen joko analyyttista laatua olevaan 1 M:n kaliumkloridiliuoksen (KCl) tilavuuteen tai a