LIITE I

3 artiklan 2 kohdassa tarkoitetut testimenetelmät mainitun kasvintuhoojan havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi

1. Testaus itiöiden avulla

Havaitsemista ja tunnistamista varten käytetään kesäitiöpesäkkeitä ja lepoitiöitä, jotka saadaan maa-aineksesta seulonnan jälkeen tai suoraan kasviaineistosta.

2. Havaitsemismenetelmät

Mainitun kasvintuhoojan itiöiden erottamiseksi maa-aineksesta on käytettävä jotakin seuraavista menetelmistä:

a) maa-aineksen seulontamenetelmä, kuvaus Pratt (1976) (1);

b) maa-aineksen seulontamenetelmä, kuvaus van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) vyöhykesentrifugointitekniikka suuren kapasiteetin näytteidenkäsittelyyn, kuvaus Wander et al. (2007) (3).

3. Tunnistusmenetelmät

Erottelun jälkeen mainitun kasvintuhoojan itiöt on tunnistettava jollakin seuraavista menetelmistä:

a) morfologinen tunnistus valomikroskoopilla, 100–400-kertainen suurennos;

b) tavanomainen PCR-testi käyttäen Lévesque et al. (2001) (4) ja van den Boogert et al. (2005) (5) -alukkeita;

c) reaaliaikainen PCR-testi käyttäen van Gent-Pelzer et al. (2010) (6) -alukkeita ja -koettimia;

d) reaaliaikainen PCR-testi käyttäen Smith et al. (2014) (7) -alukkeita ja -koettimia;

4. Lepoitiöiden elinkelpoisuus

Lepoitiöiden elinkelpoisuus voidaan määrittää mikroskooppisella tutkimuksella tai biotestillä. Itiöpesäkkeiden elinkelpoisuus voidaan määrittää laktofenoliin tai veteen asetettujen itiöpesäkkeiden mikroskooppisella tutkimuksella (Przetakiewicz 2015) (8). Itiöpesäkkeitä, joiden sisältö on rakeinen ja yhtenäinen tai alkulima on hieman kutistunut, voidaan pitää elinkelpoisina. Jos itiöpesäkkeissä on tapahtunut peruuttamaton plasmolyysi tai jos niissä ei näy sisältöä, niitä pidetään kuolleina.

Vaihtoehtoisesti tai epäselvissä tapauksissa voidaan suorittaa liitteessä IV olevassa 3 kohdassa kuvattu biotesti.

5. Patotyyppien määrittäminen

Patotyyppien määrittämiseen tarvitaan tuoreita kasvaimia.

Testiä varten käytettävä inokulaatti on tuotettava jollakin seuraavista menetelmistä:

a) SASA:n (Science and Advice for Scottish Agriculture) menetelmä, jossa on seuraavat kaksi vaihetta: i) inokulaatin tuottaminen Kasvaimen vanhaa (ruskeaa) kudosta hajotetaan pienemmiksi paloiksi, joita ilmakuivataan huoneenlämmössä, kunnes ne kovettuvat. Kovettunut kudos jauhetaan joko käsin tai koneellisesti. Jauhettu aines kuivaseulotaan siten, että saadaan eroteltua 25–75 μm fraktio, minkä jälkeen tehdään uutto Prattin (1976)1 kloroformimenetelmällä; ii) tuoreiden kasvainten tuottaminen Pieneen muoviseen petrimaljaan laitetaan 10 ml steriiliä tislattua vettä, jonka päälle ripotellaan noin 10 mg uutettuja lepoitiöitä ja jota sen jälkeen inkuboidaan pimeässä ja 20 °C:n lämpötilassa itämiseen asti. Perunan mukuloita, joissa on pieniä noin 1–2 mm:n pituisia ituja, sijoitetaan läpinäkyviin ja kostealla pehmopaperilla vuorattuihin muovirasioihin siten, että näkyvät idut ovat ylöspäin. Itujen ympärille levitetään ruiskulla renkaaksi sulatettua vaseliinia. Vaseliinirenkaassa ei saa olla aukkoja, ja sen on oltava tarpeeksi korkea, ettei itiösuspensio pääse valumaan sen ulkopuolelle. 10 ml itäviä lepoitiöitä laimennetaan 20 ml:ksi steriilillä vedellä, ja niitä pursotetaan vaseliinirenkaiden sisälle käyttämällä pipettiä tai puristuspulloa kunnes itu on täysin itiösuspension peitossa. Tämän jälkeen muovirasioihin laitetaan kannet, ja niitä pidetään neljän päivän ajan 10 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen rasiat avataan, inokulaatit ja vaseliinirenkaat poistetaan ja rasiat siirretään sumuttamalla kostutettuun kasvihuoneeseen 15–18 °C:n lämpötilaan (16 h valoa);

b) Spieckermann & Kothoff (1924) -menetelmä (9);

c) Potoček et al. (1991) -menetelmä (10);

d) Glynne-Lemmerzahl-menetelmä (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble ja Glynne 1970 (13)).

Jotta voidaan määrittää kaikki unionin kannalta merkitykselliset patotyypit (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) ja 38(Nevşehir), on käytettävä erottelevaa tartuntatestiä, jossa on mukana useita asianomaisen kasvin lajikkeita jäljempänä esitetyn taulukon mukaisesti. Tartuntatesti on toteutettava d alakohdassa mainitun käytännön mukaisesti (Glynne-Lemmerzahl-menetelmä).

Perunalajikkeiden selektiivinen herkkyys S. endobioticum -patotyyppien määrittämiseksi

Lajike S. endobioticum -patotyypit 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R ”S”: Altis ”R”: Vastustuskykyinen *: Lajikkeen alttius kyseiselle S. endobioticum -patogeenille on heikko (ei-nekroottisia itiöpesäkeryhmäkeskittymiä esiintyy, mutta niistä ei muodostu kasvaimia).

(1) Pratt MA. (1976), ”A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil”, Annals of Applied Biology 82, s. 21–29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. (2005), ”Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents”, EPPO Bulletin 35, s. 25–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. (2007), ”A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil”, European Journal of Plant Pathology 119, s. 165–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001), ”Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart”, Canadian Journal of Plant Pathology 23, s. 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. (2005), ”Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease”, European Journal of Plant Pathology 113, s. 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. (2010), ”Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants”, European Journal of Plant Pathology 126, s. 129–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. (2014), ”Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil”, Phytopathology 104, s. 422–432.

(8) Przetakiewicz, J. (2015), ”The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland”, American Journal of Potato Research 92, s. 704–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. (1924), ”Testing potatoes for wart resistance”, Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51, s. 114–115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. (1991), ”Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic”, Ochrana Rostlin 27, s. 191–205.

(11) Glynne MD. (1925), ”Infection experiments with wart disease of potatoes”, Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12, s. 34–60.

(12) Lemmerzahl J. (1930), ”A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance”, Züchter 2, s. 288–297.

(13) Noble M, Glynne MD. (1970), ”Wart disease of potatoes”, FAO Plant Protection Bulletin 18, s. 125–135.