KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOPÄÄTÖS (EU) 2016/1840,

annettu 14 päivänä lokakuuta 2016,

neuvoston direktiivin 2009/156/EY liitteen IV muuttamisesta afrikkalaisen hevosruton diagnosoinnin osalta

(tiedoksiannettu numerolla C(2016) 6509)

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon eläinten terveyttä koskevista vaatimuksista elävien hevoseläinten siirtämisen ja kolmansista maista tapahtuvan tuonnin osalta 30 päivänä marraskuuta 2009 annetun neuvoston direktiivin 2009/156/EY (1) ja erityisesti sen 20 artiklan

sekä katsoo seuraavaa:

Raportissa huomautetaan myös, että nukleiinihappojen tunnistus käänteiskopiointiin perustuvilla polymeraasiketjureaktiomenetelmillä (RT-PCR) tarjoaa etuja serologisiin diagnoosimenetelmiin verrattuna, sillä niiden avulla tauti voidaan havaita tartunnan varhaisvaiheessa. Lisäksi useimmat Euroopan unionin jäsenvaltioiden kansalliset vertailulaboratoriot käyttävät reaaliaikaisia RT-PCR-menetelmiä muiden muassa afrikkalaisen hevosruton testaamiseen, ja vuosina 2009–2014 tehdyissä vuosittaisissa pätevyyttä koskevissa testeissä ne ovat osoittautuneet tarkoitukseensa soveltuviksi. Raportista käy myös ilmi, että Euroopan unionin ulkopuolella on joukko OIE:n vertailulaboratorioita ja muita laboratorioita, joissa on afrikkalaisen hevosruton erityisasiantuntemusta ja jotka ovat ottaneet käyttöön ainakin yhden reaaliaikaisen RT-PCR-menetelmän afrikkalaisen hevosruton genomin havaitsemiseksi.

Kaikki käytettävissä olevat reaaliaikaiset RT-PCR-menetelmät ovat riittävän herkkiä afrikkalaisen hevosruton genomin havaitsemiseksi, mutta laboratorioissa käytetään yleisimmin menetelmää, joka kuvaillaan julkaisussa Agüeron et al. (2008) (4) . Menetelmä, joka kuvaillaan julkaisussa Guthrie et al. (2013) (5) , oli erityisesti tarkoitettu sen varmistamiseen, että afrikkalaisen hevosruton riskialueilta tulevat hevoset voidaan kuljettaa turvallisesti OIE:n maaeläinten terveyttä koskevan säännöstön (6) mukaisen vähimmäiskaranteeniajan jälkeen.

Sen vuoksi direktiivin 2009/156/EY liitettä IV olisi muutettava poistamalla siitä kompetitiivinen ELISA-testi ja päivittämällä epäsuoraa ELISA-testiä ja esto-ELISA-testiä koskevat menettelyt OIE:n kokouksen toukokuussa 2012 hyväksymään versioon (7) perustuvan OIE:n maaeläinten diagnostisia testejä ja rokotteita käsittelevän käsikirjan (vuoden 2016 laitos) 2.5.1 luvun mukaisesti. Samalla liitteeseen olisi sisällytettävä julkaisuissa Agüero et al. (2008) ja Guthrie et al. (2013) kuvaillut reaaliaikaiset RT-PCR menetelmät, jotta nämä taudinaiheuttajien tunnistamiseen tarkoitetut testit olisivat käytettävissä ennen siirtämistä tapahtuvaa testausta varten.

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN:

1 artikla

Korvataan direktiivin 2009/156/EY liite IV tämän päätöksen liitteellä.

2 artikla

Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

(1) EUVL L 192, 23.7.2010, s. 1.

(2) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf

(3) Neuvoston direktiivi 92/35/ETY, annettu 29 päivänä huhtikuuta 1992, afrikkalaisen hevosruton valvontasäännöistä ja torjuntatoimenpiteistä (EYVL L 157, 10.6.1992, s. 19).

(4) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(5) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–35

(6) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf

(7) Ks. alaviite 2.

LIITE

”LIITE IV AFRIKKALAINEN HEVOSRUTTO DIAGNOSOINTI A OSA Serologiset testit Jäljempänä kuvailtu serologinen menetelmä muodostuu entsyymi-immunologisista määrityksistä (ELISA), jotka perustuvat OIE:n maaeläinten diagnostisia testejä ja rokotteita käsittelevän käsikirjan vuoden 2016 laitoksen, sellaisena kuin sen on hyväksynyt OIE:n kokous toukokuussa 2012, 2.5.1 luvun B jakson 2 kohtaan. Virusproteiini VP7 on merkittävä afrikkalaisen hevosruton viruksen (AHRV) immunodominantti antigeeni, joka on konservoitunut ja todettavissa kaikissa yhdeksässä AHRV:n serotyypissä. AHRV:n rekombinantit VP7-proteiinit ovat osoittautuneet stabiileiksi ja vaarattomiksi ja soveltuvat käytettäviksi antigeeneinä ELISA-menettelyissä AHRV:n vasta-aineiden määrityksessä, ja ne tarjoavat korkean herkkyyden ja spesifisyyden (Laviada et al., 1992b (1); Maree ja Paweska, 2005). Epäsuora ELISA ja esto-ELISA ovat ne kaksi AHR-VP7-testiä, jotka soveltuvat afrikkalaisen hevosruton (AHR) serologiseen diagnosointiin. 1. Epäsuora ELISA-testi afrikkalaisen hevosruton viruksen (AHRV) vasta-aineiden osoittamiseksi Tässä menetelmässä käytettävä konjugaatti on piparjuuriperoksidaasikonjugoitu hevosen gammaglobuliinia vastaan tehty antiseerumi, joka reagoi hevosten, muulien ja aasien seerumin kanssa. Julkaisussa Maree & Paweska (2005) (2) kuvaillussa menetelmässä käytetään konjugaattina proteiinia G, joka reagoi myös seepran seerumin kanssa. Espanjassa sijaitseva laitos Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) voi toimittaa antigeeniä 4–6 kuukauden kuluessa pyynnöstä. 1.1 Testimenettely 1.1.1 Kiinteä faasi 1.1.1.1 ELISA-levyt pinnoitetaan karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6) laimennetulla AHRV-4:n rekombinantilla VP7:llä. Levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. 1.1.1.2 Levyt pestään viidesti tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 1.1.1.3 Levyille annostellaan liuosta, jossa on fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,2, ja 5 % (w/v) rasvatonta maitoa (kuivattu rasvaton maito Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/kuoppa, ja annetaan olla 1 tunti lämpötilassa 37 °C. 1.1.1.4 Estoliuos poistetaan, ja levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan pois. 1.1.2 Testinäytteet 1.1.2.1 Testattavat seeruminäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrolliseerumit laimennetaan suhteessa 1:25 liuoksella, jonka koostumus on PBS + 5 % (w/v) rasvatonta maitoa + 0,05 % (v/v) Tween 20:tä, ja pipetoidaan 100 μl kuoppaa kohti. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Titrausta varten tehdään kaksoislaimennosten sarja alkaen laimennussuhteesta 1:25 (100 μl/kuoppa), yksi seerumi levyriviä kohti, ja sama toistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. 1.1.2.2 Levyt pestään viidesti tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 1.1.3 Konjugaatti 1.1.3.1 Lsätään 100 μl/kuoppa piparjuuriperoksidaasi(HRP)-konjugoitua hevosen gammaglobuliinia vastaan tehtyä antiseerumia, joka on esilaimennettu (PBS + 5 % maito + 0,05 % Tween 20, pH 7,2). Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. 1.1.3.2 Levyt pestään viiteen kertaan tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 1.1.4 Kromogeeni/substraatti 1.1.4.1 Lisätään 200 μl/kuoppa kromogeeni-substraattiliuosta [10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyyli-aminobentsaldehydi) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyyli-2-bentso-tiatsoliinihydratsonihydrokloridi) + 5 μl H2O2]. Värimuutos pysäytetään lisäämällä 50 μl 3 N H2SO4:ää noin 5–10 minuutin jälkeen (ennen kuin negatiivinen kontrolli alkaa värjäytyä). Muita kromogeeneja, kuten ABTS (2,2′-atsino-bis-[3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]), TMB (tetrametyylibentsidiini) tai OPD (ortofenyleenidiamiini), voidaan myös käyttää. 1.1.4.2 Levyt luetaan aallonpituudella 600 nm (tai 620 nm). 1.2 Tulosten tulkinta 1.2.1 Raja-arvo lasketaan lisäämällä negatiivisen kontrollin arvoon 0,06. (0,06 on 30 negatiivisen seerumin ryhmällä saatu vakiopoikkeama.) 1.2.2 Raja-arvon alittavan absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään negatiivisina. 1.2.3 Raja-arvon +0,15 ylittävän absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään positiivisina. 1.2.4 Testinäytteitä, joiden absorbanssi on edellä mainittujen välillä, pidetään epävarmoina, ja jotain muuta menetelmää on käytettävä tuloksen vahvistamiseksi. 2. Esto-ELISA-testi afrikkalaisen hevosruton viruksen (AHRV) vasta-aineiden osoittamiseksi Kompetitiivista esto-ELISA-testiä käytetään spesifisten AHRV-vasta-aineiden osoittamiseksi kaikkien hevoseläinten (hevosten, aasien, seeprojen ja niiden risteymien) seerumista. Sen avulla voidaan välttää epäsuoraa ELISAa käytettäessä toisinaan esiintyvä spesifisyysongelma. Kokeen periaate on, että ELISA-levyyn sitoutuneen rekombinantin VP7-proteiinin ja ARH-VP7:lle spesifisen konjugoidun monoklonaalisen vasta-aineen (Mab) reaktio estetään. Testiseerumeissa oleva vasta-aine estää antigeenin ja monoklonaalisen vasta-aineen välisen reaktion, mikä heikentää syntyvää väriä. Koska testissä käytetty monoklonaalinen vasta-aine toteaa myös VP7-antigeenin, testi on hyvin herkkä ja spesifinen. Kompetitiivinen esto-ELISA on kaupallisesti saatavilla. 2.1 Testimenettely 2.1.1 Kiinteä faasi 2.1.1.1 ELISA-levyt pinnoitetaan 50–100 ng:llä karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6) laimennettua AHRV-4:n rekombinanttia VP7:ää. Levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. 2.1.1.2 Levyt pestään kolmesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 2.1.2 Testinäytteet ja kontrollit 2.1.2.1 Testattavat seeruminäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrolliseerumit laimennetaan suhteessa 1:5 laimenteella, joka sisältää 0,35 M NaCl:a, 0,05 % (v/v) Tween 20:tä ja 0,1 % Kathonia, siten, että lopputilavuus on 100 μl/kuoppa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Titrausta varten valmistetaan testiseerumeista kaksoislaimennosten sarja (1:10–1:280) kahdeksaan kuoppaan (100 μl/kuoppa), yksi seerumi levyriviä kohti, ja sama toistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. 2.1.2.2 Levyt pestään viidesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 2.1.3 Konjugaatti 2.1.3.1 Lisätään piparjuuriperoksidaasikonjugoitua VP7:n monoklonaalista vasta-ainetta 100 μl/kuoppa. Tämä monoklonaalinen vasta-aine on edeltä käsin laimennettu suhteessa 1/5 000–1/15 000 liuoksessa, joka sisältää suhteessa 1:1 ainetta StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) ja tislattua vettä. Inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. 2.1.3.2 Levyt pestään viidesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois. 2.1.4 Kromogeeni/substraatti Lisätään kromogeeni-substraattiliuosta [1 ml ABTS (2,2′-atsino-bis-[3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]) (5 mg/ml) + 9 ml substraatti-puskuria (0,1 M fosfaattisitraattipuskuria, jonka pH on 4 ja jossa on 0,03 % H2O2:ta)] 100 μl kuoppaa kohden ja inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämmössä. Värimuutos pysäytetään lisäämällä 2 % (w/v) SDS:ää (natriumdodekyylisulfaatti) 100 μl kuoppaa kohden. 2.1.5 Lukema Levyt luetaan aallonpituudella 405 nm ELISA-lukulaitteessa. 2.2 Tulosten tulkinta 2.2.1 Kunkin näytteen estoprosentti (BP) määritetään käyttämällä seuraavaa kaavaa, jossa Abs tarkoittaa vasta-aineita: 2.2.2 Näytteitä, joiden estoprosentti on suurempi kuin 50, on pidettävä AHRV-vasta-ainepositiivisina. 2.2.3 Näytteitä, joiden estoprosentti on pienempi kuin 45, on pidettävä AHRV-vasta-ainenegatiivisina. 2.2.4 Näytteitä, joiden estoprosentti on 45–50, on pidettävä epävarmoina, ja ne on testattava uudestaan. Jos tulos on edelleen epävarma, kyseiset eläimet on testattava uudelleen uusilla näytteillä, jotka otetaan aikaisintaan kahden viikon kuluttua epävarmoiksi todettujen näytteiden ottamisesta. B OSA Taudinaiheuttajan tunnistaminen Reaaliaikainen käänteiskopiointipolymeraasiketjureaktio (rRT-PCR) Nukleiinihappoihin perustuvilla taudinaiheuttajien tunnistustesteillä on voitava havaita AHRV:n kaikkien yhdeksän serotyypin vertailukannat. Jäljempänä 2.1 kohdassa kuvailtu menetelmä perustuu OIE:n maaeläinten diagnostisia testejä ja rokotteita käsittelevän käsikirjan vuoden 2016 laitoksen, sellaisena kuin sen on hyväksynyt OIE:n kokous toukokuussa 2012, 2.5.1 luvun B jakson 1.2 kohtaan. Kaikkien RT-PCR-tunnistusmenetelmien, joita käytetään veri- tai pernanäytteiden testaamiseen direktiivin 2009/156/EY soveltamisen yhteydessä, on oltava sensitiivisyydeltään vähintään 2 kohdassa kuvailtuja menetelmiä vastaavia. Serotyypien 1–9 virusten inaktivoituja vertailukantoja on saatavilla Euroopan unionin vertailulaboratoriosta tai Algetessa Espanjassa sijaitsevasta OIE:n afrikkalaisen hevosruton vertailulaboratoriosta. 1. Virus-RNA:n erottaminen Hyvän reaktion varmistamiseksi on välttämätöntä erottaa näytteestä korkealaatuinen AHRV-RNA. Nukleiinihappojen erottaminen kliinisistä näytteistä voidaan tehdä erilaisilla laitoksen omilla tai kaupallisesti saatavilla olevilla menetelmillä. Kaupallisissa diagnostiikkasarjoissa käytetään erilaisia tapoja RNA:n eristämiseksi. Useimmat niistä perustuvat johonkin seuraavista menettelyistä: — nukleiinihappojen fenoli-kloroformiuutto — nukleiinihappojen absorbointi suodatinjärjestelmään — nukleiinihappojen absorbointi magneettihelmijärjestelmään. Seuraavassa annetaan esimerkki ei-kaupallisesta RNA-erotusmenetelmästä: 1.1 Homogenoidaan 1 g kudosnäytettä 1 ml:ssä denaturointiliuosta (4 M guanidiinitiosyanaattia, 25 mM natriumsitraattia, 0,1 M 2-merkaptoetanolia, 0,5 % sarkosyyliä). 1.2 Sentrifugoinnin jälkeen supernatanttiin lisätään seuraavat: 1 μg hiiva-RNA:ta; 0,1 ml natriumasetaattia, 2 M, pH 4; 1 ml fenolia; 0,2 ml kloroformi-isoamyylialkoholiseosta (49/1). 1.3 Suspensiota ravistetaan voimakkaasti ja jäähdytetään jäissä 15 minuutin ajan. 1.4 Sentrifugoinnin jälkeen vesifaasissa oleva RNA uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudelleen steriiliin veteen. 2. Reaaliaikainen RT-PCR-menettely 2.1 Ryhmäspesifinen reaaliaikainen RT-PCR (Agüero et al., 2008) (3) Ryhmäspesifinen reaaliaikainen RT-PCR kohdistuu AHRV:n VP7:ään, ja sen avulla voidaan havaita kaikki tunnetut nykyisin liikkeessä olevat AHRV:n serotyypit ja kannat. Sitä on käytetty erittäin hyvin tuloksin osallistuvissa Euroopan unionin jäsenvaltioiden vertailulaboratorioissa pätevyyttä koskevissa testeissä, joita Euroopan unionin vertailulaboratorio on järjestänyt vuosittain vuosina 2009–2015. OIE:n vertailulaboratorioverkoston puitteissa vuonna 2015 järjestetyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa tämä menetelmä arvioitiin erittäin hyväksi. Aluke- ja koetinjaksot AHRV-lajien virusten havaitsemista varten: — Etualuke 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′ — Taka-aluke 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′ — MGB-TaqMan-koetin 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′ 2.1.1 Alukeliuos laimennetaan työskentelykonsentraatioon 8 μM (”8 μM:n aluketyöliuos”) ja koetin työskentelykonsentraatioon 50 μM (”50 μM:n koetintyöliuos”). Suunnitellaan testilevyn malli ja ladataan se reaaliaikaisen PCR-testauksen laiteohjelmistoon. Tätä mallia oppaana käyttäen lisätään 2,5 μl kutakin 8 μM:n aluketyöliuosta kuhunkin kuoppaan, joissa on RNA-näytteitä ja positiivisia ja/tai negatiivisia kontrolleja (alukkeen lopullinen konsentraatio on 1 μM 20 μl:ssa RT-PCR-seosta). Levy säilytetään jäissä. 2.1.2 Etu- ja taka-alukkeisiin sekoitetaan 2 μl eristettyä RNA:ta (testinäytteet ja positiivinen kontrolli) tai 2 μl RNase-vapaata vettä (negatiivinen kontrolli). Seos denaturoidaan kuumentamalla se lämpötilaan 95 °C viiden minuutin ajaksi, minkä jälkeen sitä jäähdytetään nopeasti jäissä vähintään viiden minuutin ajan. 2.1.3 Valmistajan ohjeiden mukaisesti valmistetaan testattavaa näytemäärää vastaava soveltuva määrä reaaliaikaisessa yksivaiheisessa RT-PCR-menettelyssä tarvittavaa mastermix-seosta. Lisätään 0,1 μl 50 μM:n koetintyöliuosta kuhunkin kuoppaan, joissa on RNA-näytteitä (koettimen lopullinen konsentraatio on 0,25 μM kussakin RNA-näytteitä sisältävässä kuopassa). Lisätään 13 μl reaaliaikaisen yksivaiheisen RT-PCR-menetelmän mastermix-seosta PCR-levyn kuhunkin kuoppaan, joissa on denaturoituja alukkeita ja RNA:ta. 2.1.4 Levy asetetaan reaaliaikalämpöblokkiin, joka on ohjelmoitu käänteiskopiointia ja cDNA-amplifikaatio/fluoresenssidetektiota varten. Amplifikaatio-olosuhteet ovat seuraavat: ensimmäinen käänteiskopiointivaihe lämpötilassa 48 °C 25 minuutin ajan, sitten 10 minuuttia lämpötilassa 95 °C (”kuumakäynnistys”) ja 40 kappaletta 15 sekunnin syklejä lämpötilassa 95 °C, 35 sekuntia lämpötilassa 55 °C ja 30 sekuntia lämpötilassa 72 °C (tai 40 sykliä 2 sekunnin ajan lämpötilassa 97 °C ja 30 sekunnin ajan lämpötilassa 55 °C, jos käytetään nopeat reaktiot sallivia reagentteja ja lämpöblokkia). Fluoresenssitiedot saadaan 55 °C:n vaiheen lopussa. 2.1.5 Jos saadaan epätyypilliset amplifikaatiokäyrät, määritys katsotaan pätemättömäksi, ja se on uusittava. Näyte katsotaan positiiviseksi, jos Ct-arvo (syklimäärä, jolla reaktiossa tuotettu fluoresenssi ylittää fluoresenssikynnyksen) on pienempi tai yhtä suuri kuin määritelty Ct-kynnys (35) 40 PCR-syklin aikana (Ct ≤ 35). Näyte katsotaan epävarmaksi, jos Ct-arvo on suurempi kuin määritelty Ct-kynnys (35) 40 PCR-syklin aikana (Ct ≥ 35). Näyte katsotaan negatiiviseksi, jos saadaan horisontaalinen amplifikaatiokäyrä, joka ei ylitä kynnyslinjaa 40 PCR-syklin aikana. 2.2 Ryhmäspesifinen reaaliaikainen RT-PCR (Guthrie et al., 2013) (4) Reaaliaikainen RT-PCR-menetelmä, jossa käytetään fluoresenssiresonanssienergiansiirtoon (FRET) perustuvia koettimia AHRV:n nukleiinihappojen havaitsemiseen. Kyseinen AHRV:n RT-PCR-määritys on suunniteltu käyttäen useista nykyisin liikkeessä olevista AHRV:n luonnonkannoista saatuja jaksoja (Quan et al., 2010 (5)). Siinä käytetään myös omaa synteettistä ulkoista kontrollimääritystä määrityskomponenttien asianmukaisen toiminnan varmistamiseksi. Diagnostiikkasarjoja yksivaiheista reaaliaikaista PCR-menetelmää varten on kaupallisesti saatavilla. Jäljempänä esitetään joitakin julkaisussa Guthrie et al. (2013) kuvailtuja perusvaiheita, joita voidaan mukauttaa paikallisten tai tapauskohtaisten vaatimusten sekä käytettävien diagnostiikkasarjojen ja välineiden mukaisesti. Aluke- ja koetinjaksot AHRV-lajien virusten havaitsemista varten: — Etualuke 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′ — Taka-aluke 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′ — MGB-TaqMan-koetin 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′ 2.2.1 Valmistetaan aluke- ja koetinseosten perusliuokset 25 × -konsentraatiolla (etu- ja taka-alukkeet 5 μΜ ja koetin 3 μΜ). Suunnitellaan testilevyn malli ja ladataan se reaaliaikaisen PCR-testauksen laiteohjelmistoon. Tätä mallia oppaana käyttäen lisätään levyn asianmukaisiin kuoppiin mallin mukaisesti 5 μl RNA-näytteitä, mukaan luettuina testinäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrollit. 2.2.2 RNA denaturoidaan kuumentamalla se lämpötilaan 95 °C viiden minuutin ajaksi, minkä jälkeen sitä jäähdytetään nopeasti jäissä vähintään kolmen minuutin ajan. 2.2.3 Valmistajan ohjeiden mukaisesti valmistetaan testattavaa näytemäärää vastaava soveltuva määrä reaaliaikaisessa yksivaiheisessa RT-PCR-menettelyssä tarvittavaa mastermix-seosta. Mastermix-seokseen lisätään 1 μl aluke-koetinseoksen 25 ×-perusliuosta (2.2.1 kohdasta), jolloin kunkin kuopan lopulliseksi konsentraatioksi saadaan kunkin alukkeen osalta 200 nM ja koettimen osalta 120 nM. Lisätään 20 μl mastermix-seosta PCR-levyn kuhunkin kuoppaan, joissa on denaturoitua RNA:ta. 2.2.4 Levy asetetaan reaaliaikalämpöblokkiin, joka on ohjelmoitu käänteiskopiointia ja cDNA-amplifikaatio/fluoresenssidetektiota varten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Amplifikaatio-olosuhteet voivat olla esimerkiksi seuraavat: ensimmäinen käänteiskopiointivaihe lämpötilassa 48 °C 10 minuutin ajan, sitten 10 minuuttia lämpötilassa 95 °C ja 40 15 sekunnin sykliä lämpötilassa 95 °C ja 45 sekuntia lämpötilassa 60 °C. 2.2.5 Näytteiden katsotaan olevan positiivisia, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ylittää kynnyksen 0,1 kaikissa rinnakkaisnäytteissä 36 PCR-syklin aikana. Näytteiden katsotaan olevan epävarmoja, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ylittää kynnyksen 0,1 jossakin rinnakkaisnäytteessä PCR-syklien 36 ja 40 välillä. Näytteiden katsotaan olevan negatiivisia, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ei ylittänyt kynnystä 0,1 missään rinnakkaisnäytteessä 40 PCR-syklin aikana ja jos synteettisen ulkoisen kontrollimäärityksen normalisoitu fluoresenssi ylitti kynnyksen 0,1 33 PCR-syklin aikana.”

(1) Laviada M.D., Roy P. and Sanchez-Vizcaino J.M. (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. Julkaisussa: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.

(2) Maree S. and Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.

(3) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(4) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–5.

(5) Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.