Komission direktiivi 98/64/EY, annettu 3 päivänä syyskuuta 1998, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen aminohappojen, raakarasvan ja olakvindoksin määritystä varten ja direktiivin 71/393/ETY muuttamisesta (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)



Virallinen lehti nro L 257 , 19/09/1998 s. 0014 - 0028



KOMISSION DIREKTIIVI 98/64/EY, annettu 3 päivänä syyskuuta 1998, yhteisön määritysmenetelmistä rehujen aminohappojen, raakarasvan ja olakvindoksin määritystä varten ja direktiivin 71/393/ETY muuttamisesta (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin 70/373/ETY (1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna Itävallan, Suomen ja Ruotsin liittymisasiakirjalla, ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että direktiivissä 70/373/ETY säädetään, että rehujen virallisessa tarkastuksessa on käytettävä yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä rehujen laatua ja koostumusta koskevissa laeissa, asetuksissa ja hallinnollisissa määräyksissä olevien edellytysten noudattamisen toteamiseksi, rehuseosten pitämisestä kaupan 2 päivänä huhtikuuta 1979 annetussa neuvoston direktiivissä 79/373/ETY (2), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 97/47/EY (3) ja erityisravinnoksi tarkoitetuista rehuista 13 päivänä syyskuuta 1993 annetussa neuvoston direktiivissä 93/74/ETY (4), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 96/25/EY (5), säädetään aminohappojen ja raakarasvan ilmoittamisesta rehujen päällysmerkinnöissä, rehujen lisäaineista 23 päivänä marraskuuta 1970 annetussa neuvoston direktiivissä 70/524/ETY (6), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 98/19/EY (7), säädetään, että olakvindoksipitoisuus on ilmoitettava päällysmerkinnässä, jos tätä ainetta lisätään rehuseoksiin, yhteisön määritysmenetelmästä rehujen virallista tarkastusta varten 18 päivänä marraskuuta 1971 annetussa toisessa komission direktiivissä 71/393/ETY (8), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 84/4/ETY (9), vahvistetaan muun muassa raakarasvojen määritysmenetelmät; on aiheellista muuttaa kuvailtua menetelmää, olisi laadittava yhteisön määritysmenetelmä näiden aineiden tarkastamiseksi, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät aminohappojen, raakarasvan ja olakvindoksin pitoisuudet määritetään tämän direktiivin liitteessä vahvistettujen menetelmien mukaisesti. 2 artikla Korvataan komission direktiivin 71/393/ETY liitteessä oleva 4 osa "Raakarasvan ja -öljyn määritys" tämän direktiivin liitteessä olevalla B osalla. 3 artikla 1. Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin edellyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 31 päivänä joulukuuta 1998. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. Niiden on sovellettava kyseisiä toimenpiteitä 1 päivästä tammikuuta 1999. Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on tehtävä tällainen viittaus, kun ne julkaistaan virallisesti. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään. 2. Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset komissiolle. 4 artikla Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. 5 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 3 päivänä syyskuuta 1998. Komission puolesta Franz FISCHLER Komission jäsen (1) EYVL L 170, 3.8.1970, s. 2 (2) EYVL L 86, 6.4.1979, s. 30 (3) EYVL L 211, 5.8.1997, s. 45 (4) EYVL L 237, 22.9.1993, s. 23 (5) EYVL L 125, 23.5.1996, s. 35 (6) EYVL L 270, 14.12.1970, s. 1 (7) EYVL L 96, 28.3.1998, s. 39 (8) EYVL L 279, 20.12.1971, s. 7 (9) EYVL L 15, 18.1.1984, s. 28 LIITE A OSA AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS 1 Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehujen vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla. Sitä sovelletaan seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini. Menetelmä ei erota toisistaan aminohappojen suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen. 2 Periaate 2.1 Vapaat aminohapot Lisätyt vapaat aminohapot uutetaan laimealla suolahapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriiniderivaattina aallonpituudella 570 nm. 2.2 Kokonaisaminohapot Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut kohdassa 1 mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä. Hapettaminen tapahtuu 0 °C:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan suolahapon (c=6 mol/l) avulla 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriiniderivaattina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm). 3 Reagenssit Veden tulee olla kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokykyNUM>A × E × MW × F >DEN>B × W × 1 000 = g aminohappoa/kg näytettä Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä >NUM>D >DEN>C. >TAULUKON PAIKKA> Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, MW 240,30) käyttäen MW-arvoa 120,15 (= 0,5 × 240,30). Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin MW-arvoa 149,21. Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa MW-arvoa. 6.1 Uutteiden kokonaislaimennoksen määrä (F) vapaiden aminohappojen määrittämistä varten (5.2) lasketaan seuraavasti: F = 100 ml × >NUM>(10 ml + 5ml) >DEN>10 ml × >NUM>Vml >DEN>10 ml V = lopullisen uutteen määrä 7 Menetelmän arviointi Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos). Tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavuuksien poissulkemisen jälkeen on esitetty seuraavassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> 7.1 Toistettavuus Toistettavuus testattujen aminohappojen osalta on ilmaistu muodossa "laboratorion sisäinen standardipoikkeama" ja on esitetty alla olevassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 7.2 Uusittavuus Edellä mainitun vertailun laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 8 Vertailumateriaalin käyttö Menetelmän oikea soveltaminen varmistetaan tekemällä vertailuanalyysi sertifioidulla referenssimateriaalilla, jos sellainen on saatavilla. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa. 9 Huomautuksia 9.1 Aminohappoanalysaattoreiden välisten erojen vuoksi annettuja aminohappojen kalibrointiliuosten (3.27.4 ja 3.27.5) ja hydrolysaattien (5.3.4) lopullisia väkevyyksiä on pidettävä suuntaa antavina. Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta. Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille. 9.2 Kun suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteistoa käytetään hydrolysaattien analysointiin, koeolosuhteet on optimoitava valmistajan suositusten mukaisesti. 9.3 Jos menetelmää sovelletaan rehuihin, jotka sisältävät enemmän kuin yhden prosentin kloridia (tiiviste, kivennäisaineita sisältävät ravinteet tai lisäravinteet), sillä saatetaan saada metioniinille liian pieniä arvoja, ja erityiskäsittely on tarpeen. B OSA RAAKARASVAN JA -ÖLJYN MÄÄRITYS 1 Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä määritetään rehuissa olevan raakarasvan ja -öljyn määrä. Siihen eivät kuulu määritykset öljysiemenistä ja -hedelmistä, jotka on määritelty 22 päivänä syyskuuta 1966 annetussa neuvoston asetuksessa N:o 136/66/ETY. Jäljempänä kuvattavan kahden menettelytavan käyttö riippuu rehun luonteesta ja koostumuksesta sekä määrityksen käyttötarkoituksesta. 1.1 Menettelytapa A - Suoraan uutettavissa oleva raakarasva ja -öljy Tätä menetelmää voidaan käyttää yksittäisiin kasviperäisiin rehuihin lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat menettelytavan B soveltamisalaan. 1.2 Menettelytapa B - Raakarasvan ja -öljyn kokonaismäärä Menetelmää voidaan soveltaa yksittäisiin eläinperäisiin rehuihin sekä kaikkiin rehuseoksiin. Sitä käytetään kaikkiin sellaisiin rehuihin, joista rasvaa ja öljyä ei voida täysin uuttaa ilman sitä edeltävää hydrolysointia, esim. gluteenit, hiiva, perunaproteiinit ja tuotteet, joita on käsitelty muun muassa ekstrudoimalla, kuumentamalla tai hiutaleiksi tekemällä. 1.3 Tulosten tulkinta Aina, kun menettelytapaa B käyttäen saadaan suurempi tulos kuin menettelytapaa A käyttäen, menettelytavalla B saatua tulosta pidetään todellisena arvona. 2 Periaate 2.1 Menettelytapa A Näyte uutetaan petrolieetterillä. Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja punnitaan. 2.2 Menettelytapa B Näyte käsitellään keittämällä sitä suolahapon kanssa. Seos jäähdytetään ja suodatetaan. Jäännös pestään ja kuivataan ja määritystä jatketaan menettelytavan A mukaisesti. 3 Reagenssit 3.1 Petrolieetteri, kiehumisväli: 40-60 °C. Bromiluvun on oltava alle 1 ja haihdutusjäännöksen alle 2 mg/100 ml. 3.2 Natriumsulfaatti, vedetön. 3.3 Suolahappo, 3 M. 3.4 Suodatuksen apuaine, esim. Kieselgur, Hyflo-supercel. 4 Välineistö 4.1 Uuttolaitteisto. Jos käytetään Soxhlet-laitteistoa, refluksointinopeuden on oltava sellainen, että Soxhlet-väliosan täyttyminen liuottimella ja tyhjeneminen siitä tapahtuvat noin 10 kertaa tunnissa. Jos laitteistoon kuuluu suoramallinen väliosa, refluksointinopeuden on oltava noin 10 ml minuutissa. 4.2 Uuttohylsyjä, joissa ei ole petrolieetteriin liukenevaa materiaalia ja joiden huokoisuus täyttää 4.1 kohdassa esitetyt vaatimukset. 4.3 Kuivauskaappi, joko vakuumikaappi, joka on säädetty 75 ± 3 °C:seen tai kiertoilmakaappi, joka on säädetty 100 ± 3 °C:seen. 5 Suoritus 5.1 Menettelytapa A (katso kohta 8.1) Näytettä punnitaan 5 g 1 mg:n tarkkuudella uuttohylsyyn (4.2) ja se peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy asetetaan uuttolaitteeseen (4.1) ja sitä uutetaan kuusi tuntia petrolieetterillä (3.1). Petrolieetteriliuos otetaan talteen kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää hohkakivijyväsiä (1). Liuotin tislataan pois. Pullon ja sen sisältämän jäännöksen annetaan kuivua puolentoista tunnin ajan (4.3). Pullon jäännöksineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että rasvan ja öljyn paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava alle 1 mg). 5.2 Menettelytapa B Näytettä punnitaan 2,5 g 1 mg:n tarkkuudella (ks. 8.2 kohta) 400 ml:n dekantterilasiin tai 300 ml:n erlenmeyeriin ja astiaan lisätään 100 ml 3 M suolahappoa (3.3) ja hohkakivijyväsiä. Dekantterilasi peitetään kellolasilla tai erlenmeyer yhdistetään pystyjäähdyttimeen. Seos saatetaan varovasti kiehuvaksi käyttäen pientä liekkiä tai sähkölevyä ja seoksen annetaan kiehua hiljalleen tunnin ajan. Näytteen tarttumista astian seinämiin tulee välttää. Astian sisällön annetaan jäähtyä ja siihen lisätään suodatuksen apuainetta (3.4) sen verran, ettei rasvaa ja öljyä häviä suodatuksessa. Suodatukseen käytetään kostutettua, rasvatonta, kaksinkertaista suodatinpaperia. Jäännös pestään kylmällä vedellä, kunnes saadaan neutraali suodos. Tarkastetaan, ettei suodos sisällä rasvaa tai öljyä. Jos sitä esiintyy, näyte on ennen hydrolysointia uutettava petrolieetterillä menettelytapaa A käyttäen. Jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi asetetaan kellolasille ja sen annetaan kuivua puolitoista tuntia kuivauskaapissa 100 ± 3 °C:ssa. Kuivan jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi pannaan uuttohylsyyn (4.2) ja peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy pannaan uuttolaitteeseen (4.1) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa esitetyllä tavalla. 6 Tuloksen ilmoittaminen Jäännöksen paino ilmoitetaan prosentteina näytteen painosta. 7 Toistettavuus Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli: - 0,2 %-yksikköä, kun raakarasva- ja öljypitoisuus on alle 5 %, - 4,0 % suuremmasta tuloksesta, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on 5-10 %, - 0,4 % -yksikköä, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on yli 10 %. 8 Huomautuksia 8.1 Runsaasti rasvaa ja öljyä sisätäviä tuotteita, joita on hankala jauhaa tai joista on vaikea saada homogeenista näytettä, käsitellään seuraavasti: Näytettä punnitaan 20 g 1 mg:n tarkkuudella ja siihen sekoitetaan vähintään 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (3.2). Sitä uutetaan petrolieetterillä (3.1) 5.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Saadun uutoksen tilavuus täydennetään 500 ml:ksi petrolieetterillä (3.1) ja se sekoitetaan. Liuosta otetaan 50 ml ja kaadetaan pieneen, kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää hoihkakivijyväsiä (2). Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan viimeisessä kappaleessa kuvatulla tavalla. Liuottimen annetaan haihtua hylsyssä olevasta uuttojäännöksestä, jäännös jauhetaan 1 mm raekokoon ja siirretään takaisin hylsyyn (lisäämättä natriumsulfaattia) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa kuvatulla tavalla. Rasvan ja öljyn pitoisuus prosentteina näytteestä lasketaan seuraavalla kaavalla: (10 a + b) × 5 jossa: a = ensimmäisen uuton jälkeen saadun jäännöksen (määräosa uutoksesta) paino grammoina, b = toisen uuton jälkeen saadun jäännöksen paino grammoina. 8.2 Pieniä rasva- ja öljymääriä sisätävien näytteiden punnitusmäärä voidaan nostaa 5 g:aan. 8.3 Lemmikkieläinten ruokiin, joiden vesipitoisuus on suuri, voi olla tarvetta sekoittaa vedetöntä natriumsulfaattia ennen hydrolysointia ja uuttoa, joka suoritetaan menettelytavassa B kuvatulla tavalla. 8.4 Edellä 5.2 kohdassa voi olla tehokkaampaa käyttää kuumaa vettä kylmän veden sijaan jäännöksen pesemiseksi suodatuksen jälkeen. 8.5 Mainittua 1,5 tunnin kuivatusaikaa saatetaan joutua pidentämään joidenkin rehujen osalta. Liiallista kuivaamista tulisi kuitenkin välttää, sillä se voi johtaa alhaisempiin tuloksiin. Myös mikroaaltouunia voidaan käyttää. 8.6 Ennen hydrolysointia tapahtuvaa menettelytavan A mukaista esiuuttoa ja menettelytavan B mukaista uudelleen uuttoa suositellaan, jos raakarasvan/öljyn pitoisuus on yli 15 %. Tämä riippuu jossakin määrin rehun tai rehuseoksen luonteesta ja siinä olevan rasvan/öljyn laadusta. C OSA OLAKVINDOKSIN MÄÄRITYS (2-[N-2'-(hydroksietyyli)karbamoyyli]-3-metyylikinoksaliini-N1,N4-dioksidi 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tämän menetelmän avulla voidaan määrittää olakvindoksi rehusta. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg. 2 Periaate Näyte uutetaan vesi-metanoliseoksen avulla. Olakvindoksipitoisuus määritetään käänteisfaasin suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen. 3 Reagenssit 3.1 Metanoli. 3.2 Metanoli, HPLC-laatua. 3.3 Vesi, HPLC-laatua. 3.4 Eluentti HPLC:aa varten: Vesi (3.3)-metanoli (3.2)-seos, 900 + 100 (V + V). 3.5 Standardiaine: puhdas olakvindoksi, 2-[N-2'-(hydroksietyyli)karbamoyyli]-3-metyylikinoksaliini-N1,N4-dioksidi, E 851. 3.5.1 Olakvindoksistandardin kantaliuos, 250 ìg/ml: Punnitaan 50 mg olakvindoksia (3.5) 0,1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon ja lisätään noin 190 ml vettä. Asetetaan pullo 20 minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1). Ultraäänikäsittelyn jälkeen saatetaan liuos huoneen lämpötilaan, täytetään merkkiin vedellä ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään jääkaapissa. Kuukausittain valmistetaan uusi liuos. 3.5.2 Olakvindoksistandardin perusliuos, 25 ìg/ml: Pipetoidaan 10,0 ml kantaliuosta (3.5.1) 100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin eluentilla (3.4) ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään jääkaapissa. Kuukausittain valmistetaan uusi liuos. 3.5.3 Kalibrointiliuokset: Pipetoidaan sarjassa 50 ml:n mittapulloihin 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 ja 20,0 ml perusliuosta (3.5.2). Täytetään merkkiin eluentilla (3.4) ja sekoitetaan. Kääritään pullot alumiinifolioon. Nämä liuokset sisältävät vastaavasti 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 ja 10,0 ìg/ml olakvindoksia. Liuokset on valmistettava päivittäin. 4 Välineet 4.1 Ultraäänihaude. 4.2 Mekaaninen ravistelija. 4.3 HPLC-laitteisto, jossa on vaihtuva-aallonpituinen ultraviolettidetektori tai diodirividetektori. 4.3.1 Nestekromatografiakolonni, 250 mm × 4 mm, C18, 10 ìm täyte, tai vastaava. 4.4 Membraanisuodattimia, 0,45 ìm. 5 Menetelmä Huom. Olakvindoksi on valoherkkää. Kaikki toimenpiteet on tehtävä himmennetyssä valaistuksessa tai ruskeita lasiastioita käyttäen. 5.1 Yleistä 5.1.1 Sokeanäyte on analysoitava, jotta varmistetaan, ettei olakvindoksia tai muita häiritseviä aineita esiinny. 5.1.2 Saantokoe suoritetaan analysoimalla sokeanäyte, johon on lisätty näytteessä esiintyvää määrää vastaava määrä olakvindoksia. Lisäyksen saamiseksi tasolle 50 mg/kg pipetoidaan 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.5.1) 250 ml:n erlenmeyerpulloon ja haihdutetaan liuos noin 0,5 ml:ksi. Lisätään 50 g sokeanäytettä, sekoitetaan huolellisesti ja annetaan tasoittua 10 min sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2). Huom. Sokeanäytteen olisi oltava tyypiltään samanlaista kuin näyte, eikä siinä saa esiintyä olakvindoksia. 5.2 Uutto Punnitaan noin 50 g näytettä 0,01 g:n tarkkuudella. Siirretään 1 000 ml:n erlenmeyerpulloon, lisätään 100 ml metanolia (3.1) ja asetetaan pullo 5 minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1). Lisätään 410 ml vettä ja annetaan olla ultraäänihauteessa vielä 15 minuuttia. Otetaan pullo ultraäänihauteesta, ravistellaan 30 minuutin ajan ravistelijassa (4.2) ja suodatetaan taitellun suodatinpaperin läpi. Pipetoidaan 10,0 ml suodosta 20 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin vedellä ja sekoitetaan. Suodatetaan osa membraanisuodattimen (4.4) läpi (ks. kohta 9 Huomautus). Jatketaan HPLC-määrityksellä (5.3). 5.3 HPLC-määritys 5.3.1 Parametrit: Seuraavat olosuhteet annetaan viitteellisinä, muitakin olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä päästään vastaaviin tuloksiin. >TAULUKON PAIKKA> Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja 2,5 ìg/ml olakvindoksia sisältävää kalibrointiliuosta (3.5.3), kunnes piikkien korkeudet ja retentioajat pysyvät vakioina. 5.3.2 Kalibrointikäyrä Jokaista kalibrointiliuosta (3.5.3) injektoidaan useita kertoja. Lasketaan kullekin pitoisuudelle piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja x-akselina ja vastaavia kalibrointiliuosten pitoisuuksia (ìg/ml) y-akselina. 5.3.3 Näyteliuos Injektoidaan useita kertoja näyteliuosta (5.2) sama määrä kuin kalibrointiliuoksia ja lasketaan olakvindoksipiikkien piikin korkeuden (pinta-alan) keskiarvo. 6 Tulosten laskeminen Näyteliuoksen olakvindoksipitoisuus (ìg/ml) lasketaan olakvindoksin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.3.2) avulla. Näytteen olakvindoksipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta: w = >NUM>c × 1 000 >DEN>m jossa: c = näyteliuoksen (5.2) olakvindoksipitoisuus (ìg/ml) m = punnittu näytemäärä (g). 7 Tulosten validointi 7.1 Analyytin tunnistettavuuden varmentaminen Analyytin tunnistettavuus voidaan varmentaa rinnakkaiskromatografialla tai diodirividetektorilla vertaamalla näyteliuoksen (5.2) ja 5,0 ìg/ml olakvindoksia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.5.3) spektrejä. 7.1.1 Rinnakkaiskromatografia Näyteliuokseen (5.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.5.3). Lisätyn olakvindoksimäärän tulisi olla sama kuin näyteliuoksesta analysoitu olakvindoksin määrä. Vain olakvindoksipiikin korkeus saa kasvaa huomioiden sekä lisätty määrä että olakvindoksin näyteliuoksen laimeneminen. Piikin leveyden tulisi olla puolikorkeuden ± 10 prosenttia alkuperäisen näyteliuoksen olakvindoksipiikin leveydestä. 7.1.2 Diodirividetektori Tulokset arvioidaan seuraavien vaatimusten mukaisesti: a) Näytteen ja standardin spektrien maksimiabsorption aallonpituuden, mitattuna kromatogrammin piikin kärjestä, on oltava detektorin erotuskyvyn määräämissä rajoissa. Diodirividetektorille tämä on tyypillisesti ± 2 nm. b) Välillä 220-400 nm, näytteen ja standardin spektrit, kromatogrammin piikin kärjestä mitattuna, eivät saa erota niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10-100 %. Tämä vaatimus täyttyy, kun maksimit ovat samat eikä missään kohdassa spektrien välinen ero ole suurempi kuin 15 % standardianalyytin absorbanssista. c) Välillä 220-400 nm, näyteliuoksen piikin noususta, kärjestä ja laskusta mitatut spektrit eivät saa erota toisistaan niiltä spektrin osilta, joiden suhteellinen absorbanssi on 10-100 %. Tämä vaatimus täyttyy, kun maksimit ovat samat ja kun kaikissa tarkastelluissa pisteissä spektrien välinen poikkeama ei ole suurempi kuin 15 % piikin kärjen spektrin absorbanssista. Jos toinen näistä vaatimuksista ei täyty, analyyttiä esiintymistä ei ole varmennettu. 7.2 Toistettavuus Kun olakvindoksipitoisuus on 10-200 mg/kg, niin näytteen kahden rinnakkaisen määrityksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta rinnakkaistuloksesta. 7.3 Saanto Sokeanäytteen lisäyksen saannon on oltava vähintään 90 %. 8 Laboratorioiden välisen vertailun tulokset EY:n sisäisessä laboratorioiden välisessä menetelmävertailussa 13 laboratoriossa analysoitiin neljä porsaan rehunäytettä, joista yksi oli sokeanäyte. Tulokset olivat seuraavat: >TAULUKON PAIKKA> 9 Huomautus Vaikka menetelmää ei ole validoitu rehuille, joissa on yli 100 mg/kg olakvindoksia, sillä on mahdollista saada tyydyttäviä tuloksia käyttämällä pienempää näytemäärää ja/tai laimentamalla näyteliuosta (5.2), jotta päästäisiin kalibrointikäyrän pitoisuusalueelle (5.3.2). (1) Jos rasvalle tai öljylle tehdään vielä tämän jälkeen sen laatuun liittyviä määräyksiä, hohkakivijyväset korvataan lasihelmillä