LIITE II

TUTKIMUSMENETELMÄ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI, TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMISALA

Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat

i) tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumistaudin määritystä perunasta ja tomaatista ja eräistä muista isäntäkasveista;

ii) Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista, perunoista, tomaateista ja muista isäntäkasveista, vedestä ja maaperästä otetuista näytteistä;

iii) Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) -kasvintuhoojan tunnistamista.

SISÄLTÖ

Sivu Yleiset periaatteet 40 I JAKSO: Tutkimusmenetelmän soveltaminen 40 1. Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (R. solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita 40 2. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä 43 3. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista. 46 II JAKSO: Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita 48 1. Oireet 48 2. Pikaseulontatestit 48 3. Eristämismenettely 49 4. R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit 49 III JAKSO: 1. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä 49 1.1 Näytteiden valmistelu 49 1.2 Testaus 51 2. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista kasveista. 51 2.1 Näytteiden valmistelu 51 2.2 Testaus 52 IV JAKSO: 1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä 53 2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä 55 2.1 Näytteiden valmistelu 55 2.2 Testaus 55 V JAKSO: 1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä 56 2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä 58 2.1 Näytteen valmistus 58 2.2 Testaus 58 VI JAKSO: Optimoidut protokollat R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi 58 A) Määritys- ja toteamistestit 58 1. Valutuskoe 58 2. Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen 58 3. Serologiset agglutinaatiokokeet 59 4. Eristäminen selektiivisellä alustalla 60 4.1 Valikoiva maljaus 60 4.2 Rikastusmenettely 60 5. Immunofluoresenssitesti (IF-testi) 61 6. Polymeraasiketjureaktiotesti (PCR-testi) 64 6.1 DNA:n puhdistusmenetelmät 65 a) Pastrikin menetelmä (2000) 65 b) Muut menetelmät 65 6.2 PCR-testi 66 6.3. PCR-tuotteen määrittäminen 66 7. Fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH-testi) 67 8. Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-testi) 69 a) Epäsuora ELISA-testi 69 b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA 70 9. Biologinen määritys 71 B) Tunnistustestit 72 1. Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit 72 2. IF-testi 72 3. ELISA-testi 73 4. PCR-testi 73 5. FISH-testi 73 6. Rasvahappoprofilointi (FAP) 73 7. Kantojen määrittämismenetelmät 73 7.1 Biovarin määrittäminen 73 7.2 Genomien sormenjäljet 74 7.3 PCR-menetelmät 74 C) Varmistustesti 74 Lisäys 1 Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot 76 Lisäys 2 Ravintoalusta R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten 77 Lisäys 3 A) Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit 79 B) Kontrollien valmistaminen 80 Lisäys 4 Puskuriliuokset testimenettelyihin 82 Lisäys 5 Kontaminaatioasteen määritys IF- ja FISH-testeillä 85 Lisäys 6 Validoidut PCR-menettelyt ja reagenssit 86 Lisäys 7 Validoidut reagenssit FISH-testiä varten 91 Lisäys 8 Tomaatin ja munakoison viljelyolosuhteet 93 Viitteet 94

YLEISET PERIAATTEET

Lisäyksissä esitetään optimaaliset testausprotokollat eri menetelmien ja validoitujen reagenssien osalta sekä testi- ja kontrollimateriaalien valmistusta koskevat tiedot. Lisäyksessä 1 on luettelo niistä laboratorioista, jotka olivat mukana testausprotokollien optimoinnissa ja validoinnissa.

Koska menettelyt liittyvät karanteenin alaisten organismien toteamiseen ja niissä käytetään R. solanacearum -kasvintuhoojan elinkykyisiä viljelmiä kontrollimateriaaleina, menettelyt on ehdottomasti toteutettava sopivissa karanteenioloissa siten, että käytössä on riittävät jätteenhävitysmahdollisuudet ja toiminta tapahtuu kasvikaranteenista vastaavien viranomaisten myöntämän luvan mukaisissa olosuhteissa.

Testausparametreilla on varmistettava R. solanacearum -kasvintuhoojan määrien johdonmukainen ja toistettavissa oleva toteaminen valituilla menetelmillä asetetuilla kynnysarvoilla.

Positiivisten kontrollinäytteiden huolellinen valmistaminen on ehdottoman tärkeää.

Vaadittujen kynnysarvojen mukainen testaus edellyttää myös laitteiden asianmukaisia asetuksia sekä niiden asianmukaista huoltoa ja vakaamista, reagenssien huolellista käsittelyä ja säilyttämistä sekä kaikkien sellaisten toimenpiteiden toteuttamista, joilla ehkäistään näytteiden välinen kontaminaatio, esim. positiivisten kontrollinäytteiden pitämistä erillään testinäytteistä. Laadunvalvontastandardeja on sovellettava hallinnollisten ja muiden virheiden välttämiseksi, erityisesti pakkausmerkintöjen ja dokumentaation osalta.

Direktiivin 98/57/EY 4 artiklan 2 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen tarkoittaa positiivista tulosta näytteelle jäljempänä olevissa vuokaavioissa esitetyissä määritys- tai seulontatesteissä. Jos ensimmäisen seulontatestin (IF- tai PCR/FISH-testi, selektiivinen eristäminen) tulos on positiivinen, se on vahvistettava toisella seulontatestillä, joka perustuu muihin biologisiin periaatteisiin.

Jos ensimmäisestä seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, näytteen epäillään olevan bakteerin saastuttama ja sille on tehtävä toinen seulontatesti. Jos toisesta seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, epäilys varmistuu (epäilty esiintyminen) ja tutkimusmenetelmän mukaista testausta on jatkettava. Jos toisesta seulontatestistä saadaan negatiivinen tulos, näytteen katsotaan olevan puhdas R. solanacearum -bakteerista.

Direktiivin 98/57/EY 5 artiklan 1 kohdassa tarkoitettu varmistettu esiintyminen tarkoittaa puhtaan R. solanacearum -viljelmän eristämistä ja tunnistamista siten, että sen patogeenisyys on varmistettu.

I JAKSO

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMINEN

1. Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (Ralstonia solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

Testimenetelmä on tarkoitettu perunan mukuloille, joiden oireet ovat tyypillisiä tummalle rengasmädälle tai johtosolukon lakastumistaudille taikka antavat aihetta epäillä näitä tauteja. Siihen kuuluu pikaseulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johtosolukosta (selektiiviselle) alustalle ja, jos tulos on positiivinen, viljelmän tunnistaminen Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojaksi.

2. Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

Periaate

Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan mukuloissa. Jos erilaisiin biologisiin periaatteisiin perustuvista vähintään kahdesta seulontakokeesta saadaan positiivinen tutkimustulos, 3 sitä täydennetään eristämällä taudinaiheuttaja. Jos eristyskokeen tuloksena saadaan tyypillisiä pesäkkeitä, vuorossa on puhtaan viljelmän varmistaminen R. solanacearum -kasvintuhoojaksi. Positiivinen tulos ainoastaan yhdestä seulontatestistä ei riitä pitämään näytettä epäilyttävänä.

Seulonta- ja eristystesteillä on saatava toteamisrajaksi 103–104 solua perunauutteen yhtä millilitraa kohden; ne sisältyvät positiivisina kontrollivälineinä kuhunkin testisarjaan.

3. Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

II JAKSO

YKSITYISKOHTAISET MENETELMÄT RALSTONIA SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI PERUNAN MUKULOISTA JA PERUNASTA, TOMAATISTA TAI MUUSTA ISÄNTÄKASVISTA, JOSSA ON TUMMAN RENGASMÄDÄN TAI BAKTEERILAKASTUMISTAUDIN OIREITA

1. Oireet (ks. www-sivusto osoitteessa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1 Oireet perunassa

Perunakasvi. Tartunnan varhaisvaihe pellolla voidaan tunnistaa lehdistä, jotka nuutuvat kasvin tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutumisen alkuvaiheessa lehdet pysyvät vihreinä, mutta myöhemmin ne kellastuvat ja niihin kehittyy ruskea nekroosi. Myös epinastiaa esiintyy. Yhden verson tai koko kasvin nuutuminen jää nopeasti pysyväksi ja johtaa kasvin kollapsiin ja kuolemaan. Nuutuneiden kasvien varsien johtosolukko muuttuu poikkileikkauksesta tarkasteltuna tavallisesti ruskeaksi, ja maitomaista bakteerimätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä voidaan pusertaa ulos. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuista valuu limaa.

Perunan mukula. Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnityskohdan läheltä tai poikkisuuntaan kiinnityskohdan yli. Tartunnan varhaisvaihe ilmenee lasimaisena, keltaisesta vaaleanruskeaan vaihtelevana värityksenä johtosolukkorenkaassa, josta muutaman minuutin kuluttua pursuaa itsestään vaaleankeltaista bakteerimätää. Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi ja nekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartunta leviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, ja näistä vuotaa bakteerimätää, johon kiinnittyy maahiukkasia. Kuoreen voi tulla punaruskeita hieman painuneita vioittumia, kun sisäiset johtosolukot painuvat kasaan. Taudin myöhemmissä vaiheissa esiintyy yleisesti sekundaarista sieni- ja bakteerimätää.

1.2 Oireet tomaatissa

Tomaattikasvi. Ensimmäinen näkyvä oire on nuorimpien lehtien velttous. Taudinaiheuttajalle suotuisissa ympäristöolosuhteissa (maaperän lämpötila noin 25 °C, kyllästyskosteus) on seurauksena muutaman päivän kuluessa epinastia ja kasvin yhden puolen tai koko kasvin nuutuminen, mikä johtaa koko kasvin kollapsiin. Vähemmän suotuisissa olosuhteissa (maaperän lämpötila alle 21 °C) nuutumista esiintyy vähemmän, mutta varteen saattaa kehittyä suuri määrä versojuuria. Varressa voidaan havaita varren alaosasta lähteviä vettyneitä juovia, jotka ovat osoitus johtojärjestelmän nekroosista. Jos varsi leikataan poikittaissuunnassa, varren värittyneistä ruskeista johtosolukoista tihkuu valkoista tai kellertävää bakteerimätää.

1.3 Oireet muissa isäntäkasveissa

Solanum dulcamara- ja S. nigrum -kasvit. Luonnonoloissa nuutumista esiintyy äärimmäisen harvoin näissä isäntinä toimivissa rikkakasveissa, ellei maaperän lämpötila ylitä 25 °C tai elleivät inokulaattitasot ole äärimmäisen korkeita (esim. S. nigrum, joka kasvaa saastuneiden peruna- tai tomaattikasvien vierellä). Jos nuutumista esiintyy, oireet vastaavat tomaatin yhteydessä kuvattuja oireita. Nuutumattomissa S. dulcamara -kasveissa, joiden varret ja juuret kasvavat vedessä, voi ilmetä johtosolukon sisäistä vaaleanruskeaa värinmuutosta varren alaosan tai varren vedenalaisen osan poikkileikkauksessa. Vaikka nuutumisoireita ei olisikaan, bakteereja voi tihkua johtosolukosta tai ne voivat muodostaa limanauhoja, jos leikattu varsi asetetaan pystysuoraan veteen.

2. Pikaseulontatestit

Pikaseulontatestit helpottavat alustavaa taudinmääritystä, mutta ne eivät ole välttämättömiä. Käytetään yhtä tai useampaa seuraavista validoiduista testeistä:

2.1 Valutuskoe

(Ks. VI jakson A kohdan 1 alakohta)

2.2 Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

Tyypilliset PHB-rakeet R. solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näkyviin värjäämällä saastuneesta solukosta otetusta bakteerimädästä lämpökäsittelyllä kiinnitetyt preparaatit niilinsinisellä A tai sudaninmustalla (ks. VI jakson A kohdan 2 alakohta).

2.3 Serologiset agglutinaatiokokeet

(Ks. VI jakson A kohdan 3 alakohta)

2.4 Muut testit

Muita soveltuvia pikaseulontatestejä ovat IF-testi (ks. VI jakson A kohdan 5 alakohta), FISH-testi (ks. VI jakson A kohdan 7 alakohta), ELISA-testit (ks. VI jakson A kohdan 8 alakohta) ja PCR-testit (ks. VI jakson A kohdan 6 alakohta).

3. Eristämismenettely

a) Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai perunan tai tomaatin tai muun nuutuvan isäntäkasvin varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuriin (lisäys 4). Jätetään liuos 5–10 minuutiksi.

b) Valmistetaan suspensiosta kymmenkertaisten laimennosten sarja.

c) Siirretään 50–100 µl suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA tai SPA; ks. lisäys 2) ja/tai Kelmanin tetratsoliumalustalle (lisäys 2) ja/tai validoidulle selektiiviselle alustalle (esim. SMSA; ks. lisäys 2). Levitetään tai sivellään maljalle tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa käyttäen. Tarvittaessa valmistetaan erillisiä maljoja, joissa on laimennettua R. solanacearum biovaria 2 -solususpensioviljelmää positiivisena kontrollina.

d) Inkuboidaan maljoja 2–6 päivän ajan 28 °C:ssa. — Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset R. solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät kermanvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein keskeltä tyypillisesti kierteisiä. Tautia aiheuttamattomat R. solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan kermanvalkoisia pesäkkeitä, jotka eivät ole juoksevia. — Kelmanin tetratsolium- ja SMSA-alustalla kierteet ovat väriltään verenpunaisia. Tautia aiheuttamattomat Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan syvänpunaisia pesäkkeitä, jotka eivät juoksevia.

4. R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit

Testit, joilla vahvistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien tunnistus, esitetään VI jakson B kohdassa.

III JAKSO

1. Yksityiskohtaiset menetelmät Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

1.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus:

— Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Laajempi näytteenotto edellyttää useampia testejä tämänkokoisille näytteille. Jos näytteessä on enemmän kuin 200 mukulaa, tulokset saattavat jäädä saamatta tai niitä on vaikea tulkita. Menettelyä voidaan kuitenkin hyvin käyttää alle 200 mukulan näytteisiin, jos 200:aa mukulaa ei ole käytettävissä.

— Kaikkien jäljempänä kuvattujen toteamismenetelmien validointi perustuu 200 mukulan suuruisen näytteen testaamiseen.

— Jäljempänä kuvattua perunauutetta voidaan käyttää myös perunan vaaleaa rengasmätää aiheuttavan Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen.

Näytteiden valmistamista edeltävät vapaavalintaiset esikäsittelyt:

a) Inkuboidaan näytteitä 25–30 °C:ssa enintään 2 viikon ajan ennen testausta mahdollisten R. solanacearum -populaatioiden lisääntymisen helpottamiseksi.

b) Pestään mukulat. Kunkin näytteen jälkeen käytetään tarkoituksenmukaisia desinfiointiaineita (tehtäessä PCR-testi on käytettävä klooriyhdisteitä patogeenisen DNA:n poistamiseksi) ja puhdistusaineita. Ilmakuivataan mukulat. Pesumenettelystä on erityistä hyötyä (vaikkakaan sitä ei vaadita), jos näytteissä on paljon ylimääräistä multaa ja jos PCR-testi tai suora eristysmenettely toteutetaan.

1.1.1 Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveitsellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat näkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä ja yritetään pitää muun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Huomautus: Laitetaan sivuun jokainen (pilaantunut) mukula, jossa on tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, ja testataan yksittäin.

Jos napapään irrottamisen aikana havaitaan tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, mukula olisi tutkittava silmämääräisesti ja lohkaistava läheltä napapäätä. Lohkaistuja mukuloita, joissa on epäilyttäviä oireita, olisi säilytettävä vähintään 2 vuorokautta huoneenlämmössä korkkiutumisen mahdollistamiseksi, minkä jälkeen mukula säilytetään jäähdytettynä (4–10 °C:ssa) asianmukaisissa karanteenioloissa. Kaikki mukulat (myös ne, joissa on epäilyttäviä oireita) olisi säilytettävä liitteen III mukaisesti.

1.1.2 Kerätään napapääkappaleet käyttämättömiin kertakäyttöisiin säilytysastioihin, jotka voidaan sulkea ja/tai sinetöidä (jos astioita käytetään uudelleen, ne olisi puhdistettava perusteellisesti ja desinfioitava klooriyhdisteillä). Kappaleet olisi mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitä voidaan säilyttää astiassa – lisäämättä puskuriliuosta – jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

Käsitellään napapääkappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

a) peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai

b) homogenoidaan kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) joko sekoittimella (esim. Waring tai Ultra Turrax) tai murskaamalla suljetussa kertakäyttöisessä liotepussissa (esim. luja Stomacher- tai Bioreba-polyeteenipussi, jonka mitat ovat 150 mm × 250 mm, säteilysteriili) käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex).

Huomautus: Näytteiden ristikontaminaation riski on suuri silloin, kun näytteet homogenoidaan sekoittimella. On ryhdyttävä varotoimiin roiskumisen tai läikkymisen välttämiseksi uuttamisprosessin aikana. On varmistettava, että jokaista näytettä varten käytetään vasta steriloituja sekoittimen lapoja ja astioita. Jos aiotaan tehdä PCR-testi, on vältettävä DNA:n siirtyminen astioihin tai jauhamislaitteisiin. Tehtäessä PCR-testi on suositeltavaa suorittaa murskaaminen kertakäyttöisissä pusseissa ja käyttää kertakäyttöisiä putkia.

1.1.3 Dekantoidaan supernatantti. Jos liuos on liian sameaa, sitä kirkastetaan joko hitaasti sentrifugoiden (enintään 180 g kymmenen minuutin ajan 4–10 °C:n lämpötilassa) tai suodatetaan liuos (40–100 µm:n huokoskoon vakuumisuodatusjärjestelmällä) ja pestään suodatin vielä uuttopuskurilla (~10 ml).

1.1.4 Konsentroidaan bakteerifraktio sentrifugoimalla 7 000 g 15 minuutin ajan (tai 10 000 g 10 minuutin ajan) 4–10 °C:n lämpötilassa ja poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.

1.1.5 Suspendoidaan sakka uudelleen 1,5 ml:aan sakkapuskuria (lisäys 4). Käytetään 500 µl:aa R. solanacearum -bakteerin testaamiseksi, 500 µl:aa Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin testaamiseksi ja 500 µl:aa vertailutarkoituksiin. Lisätään 10–25 % (v/v) steriiliä glyserolia 500 µl:aan vertailuarvona olevaan määräosaan ja jäljellä olevaan testimääräosaan, sekoitetaan ja varastoidaan –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukausiksi). Säilytetään testimääräosat 4–10 °C:ssa testauksen ajan.

Toistuva jäädytys ja sulatus ei ole suositeltavaa.

Jos uutetta joudutaan kuljettamaan, toimitus on tehtävä kylmälaukussa 24–48 tunnin kuluessa.

1.1.6 Saastunnan välttämiseksi on ehdottoman tärkeää käsitellä näytteet ja R. solanacearum -positiiviset vertailu-, kontrolli- ja valvontanäytteet toisistaan erillään. Tämä koskee sekä immunofluoresenssitestiä että kaikkia muitakin testejä.

1.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

2. Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

2.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus: Piilevien R. solanacearum -kantojen toteamiseksi on suositeltavaa käyttää kokoomanäytteitä. Menettelyä voidaan vaivatta käyttää jopa 200:n varresta otetun osan muodostamiin kokoomanäytteisiin. Jos tehdään tutkimuksia, niiden olisi perustuttava tilastollisesti edustavaan otokseen tutkittavana olevasta kasvipopulaatiosta.

2.1.1 Kerätään 1–2 cm:n kokoiset varren palaset suljettavaan steriiliin astiaan seuraavien näytteenottomenetelmien mukaisesti:

Tomaatin taimet taimitarhalla: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta.

Pellolla tai kasvihuoneessa kasvatetut tomaattikasvit: Puhtaalla ja desinfioidulla veitsellä poistetaan kustakin kasvista alin sivuverso leikkaamalla juuri verson ja kasvin päävarren liitoskohdan yläpuolelta. Poistetaan alin 1 cm:n osa kustakin sivuversosta.

Muut isäntäkasvit: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä tai oksasaksilla 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta. Jos kyseessä on S. dulcamara tai muu vedessä kasvava isäntäkasvi, poistetaan 1–2 cm:n osia vedenalaisesta varresta tai rönsystä, jossa on vesijuuria.

Kun näytteitä otetaan jostakin tietystä paikasta, on suositeltavaa testata tilastollisesti edustava näyte, jossa on vähintään 10 potentiaalista isäntärikkakasvia kustakin näytteenottopaikasta. Taudinaiheuttaja voidaan luotettavimmin havaita loppukeväästä, kesällä ja syksyllä, vaikka luonnossa voidaankin havaita tartuntoja läpi vuoden vesistöissä kasvavissa monivuotisissa Solanum dulcamara -kasveissa. Tunnettuja isäntäkasveja ovat ylivuotiset perunakasvit, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ja muut Solanaceae-heimon jäsenet. Muita isäntäkasveja ovat Pelargonium spp. ja Portulaca oleracea. Muita eurooppalaisia rikkakasvilajikkeita, joiden juurissa ja/tai ritsosfäärissä (juurten ympäristössä) voidaan tietyissä ympäristöoloissa tavata R. solanacearum biovarin 2 rodun 3 populaatioita, ovat Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ja Urtica dioica.

Huomautus: Kasveja voidaan tässä vaiheessa tarkastella silmämääräisesti sisäisten oireiden varalta (johtosolukon värjäytyminen tai bakteerimätä. Laitetaan sivuun kaikki varren osat, joissa on oireita, ja testataan erikseen (ks. II jakso).

2.1.2 Desinfioidaan varren osat pikaisesti 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan välittömästi paperipyyhkeeseen taputtamalla. Käsitellään tämän jälkeen varren palaset yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

a) peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai

b) käsitellään välittömästi jauhamalla palaset lujassa pussissa (esim. Stomacher tai Bioreba) siten, että siinä on sopiva määrä uuttopuskuria (lisäys 4), käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Jos tämä ei ole mahdollista, varastoidaan varren palaset jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

2.1.3 Dekantoidaan supernatantti, kun seos on saanut seistä 15 minuuttia.

2.1.4 Uutteen kirkastaminen lisää tai bakteerifraktion konsentrointi ei yleensä ole tarpeen mutta voidaan tehdä suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla, kuten III jakson 1.1.3–1.1.5 kohdassa kuvataan.

2.1.5 Jaetaan laimentamaton tai konsentroitu näyteuute kahteen yhtä suureen osaan. Pidetään toista osaa 4–10 °C:n lämpötilassa testauksen ajan ja varastoidaan toinen puolisko 10–25 %:ssa (v/v) steriilissä glyserolissa –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukaudeksi), mikäli lisätestaus on tarpeen.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

IV JAKSO

1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

Periaate

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi pintavesinäytteistä, ja sitä voidaan soveltaa myös perunanjalostuksessa syntyvien tai muiden jätevesien näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että odotettu havaitsemisherkkyys vaihtelee substraatin mukaisesti. Eristystestin herkkyyteen vaikuttavat kilpailevien saprofyyttisten bakteerien populaatiot, jotka ovat yleensä huomattavasti suurempia perunanjalostuksen jätevesissä ja muissa jätevesissä kuin pintavedessä. Vaikka jäljempänä kuvattavalla menettelyllä odotetaan havaittavan niinkin pieniä pitoisuuksia kuin 103 solua litraa kohden, havaitsemisherkkyys on todennäköisesti merkittävästi pienempi, kun kyseessä ovat perunanjalostuksen jätevedet tai muut jätevedet. Tämän vuoksi suositellaan, että jätevedet testataan mahdollisten puhdistuskäsittelyiden (esim. sedimentointi tai suodatus) jälkeen, jolloin saprofyyttisten bakteereiden populaatiot ovat pienempiä. Testimenettelyn herkkyyteen liittyvät rajoitukset on pidettävä mielessä, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta. Vaikka tätä menettelyä on onnistuneesti käytetty tutkimustyössä, jolla on pyritty määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen pintavedessä, menettelyn rajoitukset on tunnettava, jos sitä käytetään vastaaviin tutkimuksiin, jotka koskevat perunanjalostuksessa syntyviä jätevesiä tai muita jätevesiä.

2.1 Näytteiden valmistelu

Huomautus:

— R. solanacearum havaitaan pintavedestä luotettavimmin loppukeväästä, kesällä tai syksyllä, kun veden lämpötila on yli 15 °C.

— Toistamalla näytteenotto määritetyistä näytteenottopaikoista eri aikoina edellä kuvatun kauden aikana voidaan vähentää ilmastollisten vaihteluiden vaikutuksia ja näin parantaa havaitsemisluotettavuutta.

— Runsaiden sateiden ja vesistön maantieteellisen muodon vaikutus on otettava huomioon, jotta voidaan välttää laajan laimentumisen vaikutukset, jotka voisivat kätkeä taudinaiheuttajan esiintymisen.

— Pintavesinäytteitä otetaan isäntäkasvien läheisyydestä, jos näitä kasveja esiintyy.

2.1.1 Vesinäytteet kerätään valikoiduista näytteenottopaikoista täyttämällä kertakäyttöiset steriilit putket tai pullot yli 30 cm syvyydessä ja enintään 2 m etäisyydellä rannasta, jos mahdollista. Jalostus- ja jätevesinäytteet kerätään jäteveden laskupaikalta. Suositeltava näytekoko on enintään 500 ml näytteenottopaikkaa kohden. Jos halutaan käyttää pienempiä näytteitä, on suositeltavaa ottaa näytteitä vähintään kolmesti kustakin näytteenottopaikasta ja siten, että kukin näyte koostuu kahdesta samanlaisesta vähintään 30 ml:n osanäytteestä. Intensiivistä tutkimustyötä varten valitaan vähintään 3 näytteenottopaikkaa 3 vesistökilometriä kohden ja varmistetaan, että myös vesistöön laskevista sivujoista ja -puroista otetaan näytteet.

2.1.2 Näytteet kuljetetaan pimeässä ja viileässä (4–10 °C) ja testataan 24 tunnin kuluessa.

2.1.3 Bakteerifraktio voidaan tarvittaessa konsentroida jollakin seuraavista menetelmistä:

a) Sentrifugoidaan 30–50 ml:n osanäytteitä 10 000 g:ssa 10 minuutin ajan (tai 7 000 g:ssa 15 minuutin ajan) mieluiten 4–10 °C:ssa, poistetaan supernatantti ja suspendoidaan pelletti uudelleen 1 ml:aan pellettipuskuria (lisäys 4).

b) Kalvosuodatus (vähimmäishuokoskoko 0,45 µm), minkä jälkeen pestään suodatin 5–10 ml:ssa pellettipuskuria ja säilytetään pesuliuos. Tämä menetelmä soveltuu suurille vesimäärille, jotka sisältävät vähäisiä määriä saprofyyttejä.

Konsentrointia ei yleensä suositella perunan jalostuksessa syntyvän jäteveden tai muun jäteveden näytteille, koska kilpailevien saprofyyttisten bakteereiden populaatioiden kasvu estää Ralstonia solanacearum -bakteerien havaitsemisen.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

V JAKSO

1. Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

2. Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

Periaatteet

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi maaperänäytteissä, mutta sitä voidaan soveltaa myös perunan jalostuksessa syntyvän kiinteän jätteen tai viemärilietteen näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että nämä menetelmät eivät ole riittävän herkkiä sen takaamiseksi, että sillä havaittaisiin pienet ja/tai epätasaisesti jakautuneet Ralstonia solanacearum -populaatiot, joita voi esiintyä näistä substraateista saaduissa luonnollisesti saastuneissa näytteissä.

Tämän testimenettelyn herkkyyden asettamat rajoitukset olisi otettava huomioon, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta sekä silloin kun menettelyä käytetään tutkimuksissa, joilla pyritään määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen maaperässä tai lietteessä. Luotettavin testi taudinaiheuttajan toteamiseksi maaperästä on se, että istutetaan taudille altis kasvi ja seurataan, saako se tartunnan. Tälläkään menetelmällä ei tosin havaita alhaisia saastumistasoja.

2.1 Näytteiden valmistelu

2.1.1 Näytteenotto peltomaasta tehdään sukkulamatojen varalta tehtävässä näytteenotossa käytettävien yleisten periaatteiden mukaisesti. Kerätään 0,5–1 kg maata näytettä kohden 10–20 cm syvyydeltä siten, että näytteenottopaikkoja on 60 jokaista 0,3 ha kohden (tai ruudukosta, joka on 7 × 7 m). Jos taudinaiheuttajaa epäillään esiintyvän, keruupisteiden määrä nostetaan 120:een 0,3 ha kohden. Näytteet säilytettään 12–15 °C:ssa ennen testausta. Näytteet perunoiden jalostuksen jätelietteestä ja viemärilietteestä otetaan keräämällä yhteensä 1 kg paikoista, jotka edustavat tutkittavan lietteen kokonaismäärää. Näytteet sekoitetaan hyvin ennen testaamista.

2.1.2 Hajotetaan maaperästä tai lietteestä otetut 10–25 g:n osanäytteet tasoravistimella (250 rpm) 60–150 ml:aan uuttopuskuria (lisäys 4) enintään 2 tunnin ajan. Dispersiota voidaan tarvittaessa auttaa lisäämällä 0,02 % steriiliä Tween-20:tä ja 10–20 g steriiliä soraa.

2.1.3 Suspensio pidetään 4 °C:ssa testauksen aikana.

2.2 Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

VI JAKSO

OPTIMOIDUT PROTOKOLLAT R. SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

A) Määritys- ja toteamistestit

1. Valutuskoe

R. solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuvissa perunan, tomaatin tai muun isäntäkasvin varsissa voidaan osoittaa seuraavan yksinkertaisen ennakoivan testin avulla: Leikataan varsi aivan maanpinnan yläpuolelta. Suspendoidaan leikkuupinta putkelliseen puhdasta vettä. Seurataan, alkaako leikatuista johtosolukimpuista muutaman minuutin kuluttua spontaanisti valua bakteerilimarihmoja.

2. Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

1. Valmistetaan mikroskooppilevylle preparaatti saastuneesta solukosta saadusta bakteerimädästä tai 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (lisäys 2).

2. Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kannasta ja negatiivinen kontrollipreparaatti tunnetusti PHB-negatiivisesta lajista, jos tämä katsotaan hyödylliseksi.

3. Annetaan kuivua ja kuljetetaan kunkin levyn pohjaa nopeasti liekin yllä preparaattien kiinnittämiseksi.

4. Värjätään preparaatti joko niilinsinisellä tai sudaninmustalla ja tutkitaan sitä mikroskoopilla seuraavasti:

Niilinsinisellä tehtävä testi

a) Peitetään kukin preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuuttia 55 °C:ssa.

b) Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

c) Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella ja annetaan inkuboitua 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

d) Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

e) Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelasi.

f) Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 600–1 000-kertaisella suurennoksella.

g) Seurataan, esiintyykö PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille.

Sudaninmustalla tehtävä testi

a) Peitetään kukin preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

b) Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

c) Kastetaan levyt pikaisesti ksyloliin. Taputellaan kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus: Ksyloli on haitallinen aine. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

d) Peitetään levyt 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus: Safraniini on haitallinen tuote. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

e) Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Kuivataan paperipyyhkeellä ja asetetaan peitelasi.

f) Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyimmersio-objektiivin 1 000-kertaisella suurennoksella.

g) R. solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi ja soluseinät vaaleanpunaisiksi.

3. Serologiset agglutinaatiokokeet

Bakteerimädässä tai oireilevassa kudoksessa olevien R. solanacearum -solujen agglutinaatio voidaan havaita parhaiten käyttämällä validoituja vasta-aineita (ks. lisäys 3), jotka on leimattu soveltuvilla värimarkkereilla, kuten punaisilla Staphylococcus aureus -soluilla tai värillisillä lateksihiukkasilla. Jos käytetään kaupallista testisarjaa (ks. lisäys 3), on noudatettava valmistajan ohjeita. Muussa tapauksessa toimitaan seuraavan menettelyn mukaisesti:

a) Sekoitetaan leimatun vasta-aineen suspensiota ja bakteerimätää pisaroina (noin 5 µl kumpaakin) monisyvennyslevyjen syvennyksissä.

b) Valmistetaan positiivinen ja negatiivinen kontrolli käyttämällä R. solanacearum biovarin 2 suspensiota ja heterologista kantaa.

c) Positiivissa näytteissä voidaan havaita agglutinaatio, kun niitä on kevyesti sekoitettu 15 sekunnin ajan.

4. Eristäminen selektiivisellä alustalla

4.1 Valikoiva maljaus

Huomautus: Ennen kuin tätä menetelmää käytetään ensimmäisen kerran, on suoritettava alustavia testejä, jolla varmistetaan, että aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104/ml) voidaan todeta. Testi on voitava toistaa.

Käytetään asiamukaisesti validoitua selektiivistä alustaa, esim. SMSA:ta (sellaisena kuin se muutettuna Elphinstone et al., 1996; ks. lisäys 2).

R. solanacearum -bakteerin erottaminen muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista edellyttää huolellisuutta. R. solanacearum -pesäkkeet voivat lisäksi olla morfologialtaan epätyypillisiä, jos alustalla on liian suuri populaatio tai jos myös antagonistisia bakteereita esiintyy. Jos epäillään kilpailua tai antagonismia, näyte olisi testattava uudestaan eri testiä käyttäen.

Tämän menetelmän tunnistamisherkkyys on suurin, kun käytetään vasta valmistettuja näyteuutteita. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää myös silloin, kun uutteita on säilytetty glyserolissa –68––86 °C:ssa.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset suspensiosta, jossa on 106 PMY/ml R. solanacearum -bakteerin virulenttia biovari 2 -kantaa (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit on valmistettava täysin erillään testinäytteistä.

Ennen kuin vasta valmistettua selektiivisen alustan erää käytetään rutiininäytteiden testaamiseen, olisi testattava sen soveltuvuus taudinaiheuttajan kasvattamiseen.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

4.1.1 Käytetään tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa, jolla pyritään varmistamaan, että mahdolliset taustalla olevat saprofyyttiset pesäkkeitä muodostavat populaatiot laimentuvat pois. Levitetään levyä kohden 50–100 µl näyteuutetta ja kutakin laimennosta.

4.1.2 Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tarkastellaan levyjä 48 tunnin kuluttua ja tämän jälkeen päivittäin kuuden päivän ajan. Tyypilliset R. solanacearum -pesäkkeet SMSA-alustalla ovat maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisiä ja juoksevia, ja kolmen päivän inkubaation jälkeen niiden keskustaan kehittyy vaaleanpunaisesta verenpunaiseen vaihtelevaa väritystä, johon liittyy sisäinen raidoitus tai kierteet. (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Huomautus: Tällä alustalla muodostuu joskus epätyypillisiä R. solanacearum -pesäkkeitä. Nämä voivat olla pieniä, pyöreitä, täysin punaisia ja ei-juoksevia tai ainoastaan osittain juoksevia. Tämän vuoksi niitä on vaikeaa erottaa saprofyyttisista pesäkkeitä muodostavista bakteereista.

4.1.3 Puhdistetaan oletetut R. solanacearum -pesäkkeet sen jälkeen, kun ne on sivelty tai laimennettu tavanomaiselle ravintoalustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi (ks. lisäys 2).

4.1.4 Viljelmiä säilytetään lyhyen aikaa steriilissä vedessä (pH 6–8, klooriton) huoneenlämmössä ja pimeässä tai pidemmän aikaa soveltuvassa kylmäsuojaavassa alustassa –68––86 °C:ssa tai ne lyofilisoidaan.

4.1.5 Tunnistetaan oletetut viljelmät (ks. VI jakson B kohta) ja tehdään patogeenisyystesti (ks. VI jakson C kohta).

Laimennussarjatestin tulosten tulkinta

Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole havaittu kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään R. solanacearum -bakteerille tyypillistä pesäkettä ei löydetä edellyttäen, että ei epäillä muiden bakteerien kilpailevaa tai estävää vaikutusta ja että R. solanacearum -bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista.

Laimennussarjatesti on positiivinen, jos oletettuja R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä eristetään.

4.2 Rikastusmenettely

Käytetään validoitua rikastusalustaa kuten muutettua Wilbrinkin lientä (ks. lisäys 2).

Tällä menettelyllä voidaan valikoivasti kasvattaa R. solanacearum -populaatioita näyteuutteissa ja lisätä toteamisherkkyyttä. Menettely laimentaa myös tehokkaasti PCR-reaktion inhibiittoreita (1:100). On kuitenkin huomattava, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi epäonnistua saprofyyttisten organismien kilpailun tai estovaikutuksen vuoksi, sillä nämä rikastuvat usein samanaikaisesti. R. solanacearum -bakteerin eristäminen rikastetuista liemiviljelmistä voi tämän vuoksi olla vaikeaa. Koska serologisesti samankaltaisten saprofyyttien populaatiot voivat kasvaa, suositellaan spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämistä polyklonaalisten vasta-aineiden sijaan, kun käytetään ELISA-testiä.

4.2.1 Rikastus-PCR:ää varten siirretään 100 µl näyteuutetta 10 ml:aan rikastuslientä (lisäys 2), joka on aiemmin jaettu DNA-vapaisiin putkiin tai pulloihin. Rikastus-ELISAa varten näyteuutteen suhde liemeen voi olla suurempi (esim. 100 µl 1,0 ml:ssa rikastuslientä).

4.2.2 Inkuboidaan 72 tuntia 27–30 °C:ssa ravisteltavassa viljelmässä tai staattisessa viljelmässä siten, että korkit ovat löysällä ilmanvaihdon turvaamiseksi.

4.2.3 Sekoitetaan hyvin ennen ELISA- tai PCR-testeihin käyttämistä.

4.2.4 Rikastuslientä käytetään edellä mainituissa testeissä samoin kuin näytteitäkin.

Huomautus: Jos epäillään, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi estyä tiettyjen kilpailevien saprofyyttisten bakteerien suurten populaatioiden vuoksi, parempia tuloksia voidaan saada rikastamalla näyteuutteita ennen sentrifugointia tai muuta konsentrointivaihetta.

5. Immunofluoresenssitesti (IF)

Periaate

IF-testin käyttö pääasiallisena seulontatestinä on suositeltavaa, koska se on todistetusti riittävän herkkä vaadittavien kynnysarvojen saavuttamiseksi.

Kun IF-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, toisena seulontatestinä on tehtävä eristämistesti, PCR- tai FISH-testi. Jos IF-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen analyysin suorittamiseksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatuja soluja, 105–106/ml, sopivalla fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugaatilla (FITC) valmistajan suositusten mukaisesti. Validoidun polyklonaalisen antiseerumin IF-titterin olisi oltava vähintään 1:2 000. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa (tai -laimennoksissa).

Testi olisi tehtävä vasta valmistetuista näyteuutteista. Testi voidaan tarvittaessa tehdä uutteista, joita on säilytetty –68––86 °C:ssa glyserolissa. Glyseroli voidaan poistaa näytteestä lisäämällä 1 ml sakkapuskuria (lisäys 4), sentrifugoimalla uudelleen 15 minuutin ajan 7 000 g:ssä ja suspendoimalla uudelleen yhtä suureen määrään puskuriliuosta. Tämä ei ole useinkaan välttämätöntä erityisesti, jos näytteet kiinnitetään levyihin liekittämällä.

Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään, ja vaihtoehtoisesti puskuriliuokseen.

Luonnollisesti saastunutta solukkoa (joka on säilytetty lyofilisoimalla tai pakastamalla–16––24 °C:ssa) olisi mahdollisuuksien mukaan käytettävä vertailua varten samalla levyllä.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen määräosia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10 halkaisijaltaan vähintään 6 mm:n syvennystä.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

5.1 Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä:

i) Pelletit, joissa on suhteellisen vähän tärkkelystä: Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) suhteessa 1:100 laimennettua, uudelleen suspendoitua sakkaa ensimmäiseen syvennykseen. Pipetoidaan samanlainen määrä laimentamatonta sakkaa (1:1) rivin muihin syvennyksiin. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 1 on esitetty.

ii) Muut pelletit: Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia (1:10, 1:100) uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 2 on esitetty.

5.2 Annetaan pisaroiden kuivua huoneenlämmössä tai lämmittämällä 40–45 °C:n lämpötilaan. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko kuumentamalla (15 minuuttia 60 °C:n lämpötilassa), liekittämällä tai 95 % etanolilla tai vasta-aineiden toimittajien nimenomaisten ohjeiden mukaisesti.

Kiinnitettyjä levyjä voidaan tarvittaessa säilyttää jäädytettyinä kuivatusainetta sisältävässä laatikossa mahdollisimman lyhyen aikaa (enintään 3 kuukautta) ennen lisätestejä.

5.3 IF-menettely

i) Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan mukaisesti: Valmistetaan kaksinkertaisten laimennosten sarja. Ensimmäisen syvennyksen olisi oltava 1/2 titteriä (T/2), ja muiden 1/4 titteriä (T/4), 1/2 titteriä (T/2), titteri (T) ja titteri kaksinkertaisena (2T).

ii) Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan mukaisesti: Valmistetaan työskentelylaimennos vasta-aineesta IF-puskuriin. Työskentelylaimennos vaikuttaa spesifisyyteen.

Kaavio 1. Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan ja 5.3 alakohdan i alakohdan mukaisesti

Laimennokset uudelleen suspendoidusta sakasta 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Uudelleen suspendoidun sakan laimennos (T = titteri) T/2 T/4 T/2 T 2T  Antiseerumin/vasta-aineen kaksinkertaiset laimennokset Näyte 1 1 2 3 4 5 Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 6 7 8 9 10





Kaavio 2. Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan ja 5.3 alakohdan ii alakohdan mukaisesti

Työskentelylaimennos antiseerumista/vasta-aineesta 1/1 1/10 1/100 Tyhjä Tyhjä  Uudelleen suspendoidun sakan kymmenkertainen laimennos näyte 1 1 2 3 4 5 Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 6 7 8 9 10

5.3.1 Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset kokonaisuudessaan vasta-aineen laimennoksella tai laimennoksilla. Syvennyksiin lisättävän vasta-aineen tilavuuden on vastattava vähintään levitetyn uutteen tilavuutta.

Seuraava menettely olisi toteutettava, jos vasta-aineiden toimittajilta ei ole saatu nimenomaisia ohjeita:

5.3.2 Inkuboidaan levyjä kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).

5.3.3 Ravistetaan pisarat pois kaikilta levyiltä ja huuhdellaan levyt varovasti IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan IF-puskuri-Tweenillä (lisäys 4) ja sen jälkeen IF-puskurissa. Vältetään roiskeita tai pisaroiden kulkeutumista, joista saattaa olla seurauksena ristikontaminaatio. Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.

5.3.4 Järjestetään levyt kostean paperin päälle. Täytetään testisyvennykset FITC-konjugaatin laimennoksella, jota on käytetty titterin määrittämiseen. Syvennyksiin lisätyn konjugaatin määrän on vastattava lisätyn vasta-aineen määrää.

5.3.5 Inkuboidaan levyt kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).

5.3.6 Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten edellä (5.3.3 alakohta).

Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.

5.3.7 Pipetoidaan 5–10 µl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (lisäys 4) tai vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa haalistumiselta suojaavaa peittausainetta kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelasi.

5.4 IF-testin lukeminen

5.4.1 Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 500–1 000-kertaisella suurennoksella. Tarkastellaan objektikenttää laidasta laitaan pystysuoraan ja vaakasuoraan ja kiertämällä ulkoreunaa pitkin. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja, tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.

Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä määritellyllä vasta-ainetitterillä tai työskentelylaimennoksella. IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) on uusittava, jos värjäytyminen ei ole täydellistä.

5.4.2 Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassa vasta-ainelaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.

Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin kontaminaation vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.

5.4.3 Immunofluoresenssitestien spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa esiintyy todennäköisesti morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita.

5.4.4 Tarkastellaan ainoastaan fluoresoivia soluja, joilla on tyypillinen koko ja morfologia vasta-ainetitterissä tai -työskentelylaimennoksessa, kuten 5.3 alakohdassa kuvattiin.

5.4.5 IF-testin tulosten tulkinta:

i) Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 5). IF-testin tulos on positiivinen, jos näytteissä on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden. Näytettä pidetään mahdollisesti saastuneena, ja lisätestaus on tarpeen.

ii) IF-testin tulos on negatiivinen, jos näytteissä on vähemmän kuin 5 × 103 solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, ja näytettä pidetään negatiivisena. Lisätestausta ei vaadita.

6. PCR-testi

Periaatteet

Kun PCR-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristys- tai IF-testi. Kun PCR-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Tätä menetelmää on suositeltavaa käyttää pääasiallisena seulontatestinä ainoastaan, jos käytettävissä on sen tekemiseen vaadittavaa erityisasiantuntemusta.

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut (103–104/ml). Testi on voitava toistaa. Optimointikokeet saattavat olla tarpeen herkkyyden ja spesifisyyden maksimoimiseksi kaikissa laboratorioissa.

Käytetään validoituja PCR-reagensseja ja -testausprotokollia (ks. lisäys 6). Olisi mielellään valittava menetelmä, johon kuuluu sisäinen kontrolli.

On toteutettava tarkoituksenmukaisia varotoimia, jotta vältetään näytteen kontaminaatio kohde-DNA:lla. PCR-testi olisi annettava kokeneiden teknikoiden tehtäväksi erikoistuneissa molekyylibiologian laboratorioissa, jotta minimoidaan näytteen mahdollinen kontaminaatio kohde-DNA:lla.

Negatiivisia kontrolleja (DNA:n uuttamis- ja PCR-menettelyjen osalta) olisi aina käsiteltävä menettelyn viimeisenä näytteenä, jotta voitaisiin osoittaa selvästi, onko DNA:n siirtymistä tapahtunut.

PCR-testiin olisi sisällytettävä seuraavat negatiiviset kontrollit:

— näyteuute, joka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin suhteen negatiiviseksi,

— puskurikontrollit, joita käytetään bakteerin ja DNA:n uuttamiseksi näytteestä,

— PCR-reaktioseos.

Testissä olisi käytettävä seuraavia positiivisia kontrolleja:

— uudelleen suspendoitujen sakkojen määräosat, joihin R. solanacearum -bakteeri on lisätty (valmistus ks. lisäyksen 3 B kohta),

— vesisuspensio R. solanacearum -bakteerin virulentista isolaatista (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäyksen 3 B kohta) saaduista soluista, 106 solua/ml,

— jos mahdollista, PCR-testissä käytetään myös positiivisista kontrollinäytteistä saatua DNA:ta.

Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit valmistetaan erillään testinäytteistä.

Näyteuutteiden olisi oltava mahdollisimman puhtaita mullasta. Joissakin tapauksissa saattaisi siksi olla suositeltavaa valmistaa uutteet pestyistä perunoista, mikäli aiotaan käyttää PCR-testausprotokollia.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

6.1 DNA:n puhdistusmenetelmät

Käytetään edellä kuvattuja negatiivisia ja positiivisia kontrollinäytteitä (ks. lisäys 3).

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kohde-DNA:n eristämiseksi kompleksisista näytealustoista on käytettävissä useita eri menetelmiä, joilla voidaan poistaa PCR:n ja muiden entsyymireaktioiden inhibiittorit ja konsentroida kohde-DNA näyteuutteessa. Seuraava menetelmä on optimoitu käytettäväksi lisäyksessä 6 kuvatuilla validoiduilla PCR-menetelmillä.

a) Pastrikin menetelmä (2000)

1) Pipetoidaan 220 µl lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml:n eppendorfputkeen.

2) Lisätään 100 µl näyteuutetta ja asetetaan kuumentimelle tai vesihauteeseen 95 °C:ssa 10 minuutin ajaksi.

3) Siirretään putki jäihin 5 minuutiksi.

4) Lisätään 80 µl lysotsyymikantaliuosta (50 mg lysotsyymia/ml 10 mM Tris HCl:ssa, pH 8,0) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuutin ajan.

5) Lisätään 220 µl Easy DNA® -liuosta A (Invitrogen), sekoitetaan hyvin vorteksoimalla ja inkuboidaan 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.

6) Lisätään 100 µl Easy DNA® -liuosta B (Invitrogen), vorteksoidaan voimakkaasti, kunnes sakka valuu putkessa vapaasti ja näyte on kauttaaltaan yhtäläisen viskoosi.

7) Lisätään 500 µl kloroformia ja vorteksoidaan, kunnes viskositeetti vähenee ja seos on homogeeninen.

8) Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa faasien erottamiseksi ja interfaasin muodostamiseksi.

9) Siirretään yläfaasi puhtaaseen eppendorfputkeen.

10) Lisätään 1 ml 100 % etanolia (-20 °C), vorteksoidaan pikaisesti ja inkuboidaan jäissä 10 minuutin ajan.

11) Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa ja poistetaan etanoli pelletistä.

12) Lisätään 500 µl 80 % etanolia (-20 °C) ja sekoitetaan kääntelemällä putkea.

13) Sentrifugoidaan 15 000 g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, säästetään pelletti ja poistetaan etanoli.

14) Annetaan pelletin kuivua ilmassa tai DNA Speed Vac -laitteessa.

15) Suspendoidaan pelletti uudelleen 100 µl:aan steriiliä ultrapuhdasta vettä ja jätetään seisomaan huoneenlämpöön vähintään 20 minuutin ajaksi.

16) Varastoidaan -20 °C:ssa, kunnes näytettä tarvitaan PCR-testissä.

17) Erotetaan mahdollinen valkea sakka sentrifugoimalla, ja PCR-määritykseen käytetään 5 µl DNA:ta sisältävää liuosta.

b) Muut menetelmät

Muita DNA:n uuttamismenetelmiä (esim. Qiagen Dneasy Plant Kit) voidaan käyttää, jos niiden on osoitettu olevan yhtä tehokkaita DNA:n puhdistamisessa kontrollinäytteistä, jotka sisältävät 103–104 taudinaiheuttajasolua/ml.

6.2 PCR-testi

6.2.1 Valmistetaan PCR-testin testi- ja kontrollitemplaatit validoitujen testausprotokollien mukaisesti (VI jakson A kohdan 6 alakohta). Valmistetaan yksi kymmenkertainen laimennos DNA-näyteuutetta (1:10 ultrapuhtaaseen veteen).

6.2.2 Valmistetaan tarkoituksenmukainen PCR-reaktioseos julkaistujen testausprotokollien mukaisesti (lisäys 6) kontaminaatiolta vapaassa ympäristössä. Jos mahdollista, on suositeltavaa käyttää moninkertaisista PCR-protokollaa, johon sisältyy myös sisäinen PCR-kontrolli.

6.2.3 Lisätään 2–5 µl DNA-uutetta 25 µl:aan PCR-reaktioseosta steriileihin PCR-putkiin PCR-protokollien mukaisesti (ks. lisäys 6).

6.2.4 Otetaan ainoastaan PCR-reaktioseosta sisältävä negatiivinen kontrollinäyte ja lisätään näytteen sijasta ultrapuhdasta vettä samasta lähteestä, jota käytettiin PCR-seoksessa.

6.2.5 Asetetaan putket samaan lämpösyklilaitteeseen, jota käytettiin esitestauksessa, ja ajetaan asianmukaisesti optimoitu PCR-ohjelma (lisäys 6).

6.3 PCR-tuotteen määrittäminen

6.3.1 Erotetaan PCR-amplikonit agaroosigeelielektroforeesilla. Lisätään vähintään 12 µl monistettua DNA-reaktioseosta jokaisesta näytteestä ja sekoitetaan se 3 µl:aan latauspuskuria (lisäys 6) 2,0 % (w/v) agaroosigeelissä trisasetaattielektroforeesipuskurissa (TAE) (lisäys 6) ajaen geeliä 5–8 V/cm. Käytetään tarkoituksenmukaista DNA-markkeria, ’esim. 100 emäsparia.’

6.3.2 Saatetaan DNA-fragmentit näkyviin värjäämällä näyte etidiumbromidiliuoksessa (0,5 mg/l) 30–60 minuutin ajan huolehtien asianmukaisista varotoimista tämän mutageenin käsittelyssä.

6.3.3 Tarkastellaan värjäytynyttä geeliä UV-läpivalaisulla (λ = 302 nm) odotetunkokoisten monistettujen PCR-tuotteiden (lisäys 6) löytämiseksi ja dokumentoidaan tiedot.

6.3.4 Kaikkien uusien löydösten/tapausten osalta varmistetaan PCR-amplikonin autenttisuus tekemällä restriktioentsyymianalyysi jäljellä olevan monistetun DNA:n näytteelle inkuboimalla optimilämpötilassa ja -ajassa tarkoituksenmukaisella entsyymillä ja puskurilla (ks. lisäys 6). Määritetään pilkotut fragmentit agaroosigeelielektrofereesillä kuten edellä ja tarkkaillaan tyypillistä restriktiofragmenttikuviota UV-läpivalaisulla etidiumbromidivärjäyksen jälkeen ja verrataan pilkkoutumattomiin ja pilkottuihin positiivisiin kontrolleihin.

PCR-testin tulosten tulkinta

PCR-testin tulos on negatiivinen, jos odotetunkokoista R. solanacearum -spesifistä PCR-amplikonia ei todeta kyseisestä näytteestä, mutta se todetaan kaikista positiivisista kontrollinäytteistä (kun on kyse moninkertaisista PCR-tuotteista, joilla on kasveille spesifiset sisäiset kontrollialukkeet: toinen odotetunkokoinen PCR-tuote on monistettava kyseisellä näytteellä).

PCR-testin tulos on positiivinen, jos odotetunkokoinen R. solanacearum -spesifinen PCR-amplikoni ja odotettu restriktioreaktio (jos sellaista vaaditaan) todetaan edellyttäen, että sitä ei ole monistettu mistään negatiivisesta kontrollinäytteestä. Positiivisen tuloksen luotettava varmistus voidaan saada myös toistamalla testi toisilla PCR-alukkeilla (lisäys 6).

Huomautus: PCR:n inhibitiota voidaan epäillä, jos odotettu amplikoni saadaan positiivisesta kontrollinäytteestä, joka sisältää R. solanacearum -bakteeria vedessä, mutta negatiiviset tulokset saadaan positiivisista kontrolleista, jotka sisältävät R. solanacearum -bakteeria perunauutteessa. Moninkertaisten reaktioiden määritykseen perustuvissa PCR-testausprotokollissa, joissa on mukana sisäinen PCR-kontrolli, reaktion inhibitio näyttää olevan kyseessä silloin, jos ei saada kumpaakaan näistä kahdesta amplikonista.

Saastuntaa voidaan epäillä, jos odotettua amplikonia ei saada yhdestä tai useammasta negatiivisesta kontrollista.

7. FISH-testi

Periaate

Kun FISH-testiä käytetään ensimmäisenä seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristystesti tai IF-testi. Kun FISH-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Huomautus: Käytetään validoituja R. solanacearum -spesifisiä oligokoettimia (lisäys 7). Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan toistettavasti todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut vähintään pitoisuudella 103–104/ml.

Menettely voidaan tarvittaessa kuitenkin tehdä näyteuutteille, joita on säilytetty glyserolissa –16––24 °C:ssa tai –68––86 °C:ssa.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan suspensioita, jotka sisältävät 105–106 solua/ml R. solanacearum -bakteerin biovaria 2 (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäys 3) 0,01 M fosfaattipuskurissa (PB) 3–5 vuorokauden viljelmästä. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään.

FITC-leimatun eubakteriaalisen oligokoettimen käyttö toimii kontrollina hybridisaatioprosessissa, sillä se värjää kaikki näytteessä olevat eubakteerit.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

7.1 Perunauutteen fiksointi

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Wullings et al., (1998):

7.1.1 Valmistetaan kiinniteliuos (ks. lisäys 7).

7.1.2 Pipetoidaan 100 µl kustakin näyteuutteesta eppendorfputkeen ja sentrifugoidaan 7 minuuttia 7 000 g:ssä.

7.1.3 Poistetaan supernatantti ja liuotetaan sakka 200 µl:aan kiinniteliuosta, joka on valmistettu < 24 tuntia aiemmin. Sekoitetaan vorteksilla ja inkuboidaan tunnin ajan jääkaapissa.

7.1.4 Sentrifugoidaan 7 minuutin ajan 7 000 g:ssä, poistetaan supernatantti ja suspensoidaan pelletti uudelleen 75 µl:aan 0,01 M fosfaattipuskuria (ks. lisäys 7).

7.1.5 Tiputetaan 16 µl kiinnitettyjä suspensioita kuvassa 7,1 esitetylle puhtaalle monitestilevylle. Laitetaan kullekin levylle 2 laimentamatonta eri näytettä ja käytetään 10 µl 1/100-laimennoksen (0,01 M:ssa fosfaattipuskuria) tekemiseksi. Jäljellä oleva näyteliuos (49 µl) voidaan varastoida -20 °C:ssa, kun siihen on lisätty 1 tilavuus 96-prosenttista etanolia. Jos FISH-testi on toistettava, poistetaan etanoli sentrifugoimalla ja lisätään sama määrä 0,01 M fosfaattipuskuria (sekoitetaan vorteksilla).

Kuvio 7.1 FISH-levy

Näyte 1 Nollakoe Nollakoe Nollakoe Näyte 2 syvennys 1 syvennys 2 syvennys 3 syvennys 4 syvennys 5 Näyte 1 Nollakoe Nollakoe Nollakoe Näyte 2 syvennys 6 syvennys 7 syvennys 8 syvennys 9 syvennys 10 Peitelasi 1 Peitelasi 2

7.1.6 Ilmakuivataan levyt (tai kuivataan ne levynkuivaajalla 37 °C:ssa) ja kiinnitetään ne liekittämällä.

Tässä vaiheessa menettely voidaan keskeyttää, ja hydridisaatiota voidaan jatkaa seuraavana päivänä. Levyt olisi säilytettävä pölyltä suojassa ja kuivassa paikassa huoneenlämmössä.

7.2 Hybridisaatio

7.2.1 Poistetaan soluista vesi vaiheittain 50-, 80- ja 96-prosenttisessa etanolissa minuutin ajan kussakin. Ilmakuivataan levyt levynpidikkeessä.

7.2.2 Valmistellaan kostea inkubaatiokammio peittämällä ilmatiiviin laatikon pohja paperi- tai suodatinpaperilla, joka on kastettu 1X hybmixiin (lisäys 7). Esi-inkuboidaan laatikko hybridisaatiouunissa 45 °C:ssa vähintään 10 minuutin ajan.

7.2.3 Asetetaan 10 μl hybridisaatioliuosta (lisäys 7) kunkin levyn 8 syvennykseen (syvennykset 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10; ks. kuva 7.1) siten, että kaksi keskimmäistä syvennystä (3 ja 8) jäävät tyhjiksi.

7.2.4 Asetetaan peitelasit (24 × 24 mm) ensimmäiseen ja neljään viimeiseen syvennykseen siten, että väliin ei jää ilmaa. Laitetaan levyt esilämmitettyyn kosteaan kammioon ja hybridisoidaan 5 tuntia pimeässä uunissa 45 °C:ssä.

7.2.5 Valmistetaan 3 dekanterilasia, joiden koostumus on seuraava: 1 l Milli Q (molekyylisuodattimilla puhdistettua) -vettä, 1 l 1X hybmix (334 ml 3X hybmix ja 666 ml Milli Q -vettä) ja 1 l 1/8X hybmix (42 ml 3X hybmix ja 958 ml Milli Q -vettä). Esi-inkuboidaan kukin vesihauteessa 45 °C:ssa.

7.2.6 Poistetaan peitelasit levyiltä ja asetetaan levyt levytelineeseen.

7.2.7 Pestään ylimääräinen koetin inkuboimalla 15 minuutin ajan dekanterilasissa, jossa on 1X hybmix, 45 °C:ssa.

7.2.8 Siirretään levyteline 1/8X hybmix -pesuliuokseen ja inkuboidaan vielä 15 minuutin ajan.

7.2.9 Kastetaan levyt pikaisesti Milli Q -veteen ja asetetaan ne suodatinpaperille. Poistetaan liiallinen kosteus peittämällä pinta kevyesti suodatinpaperilla. Pipetoidaan 5–10 μl haalistumiselta suojaavaa peittausainetta (esim. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, tai vastaavaa) jokaiseen syvennykseen ja asetetaan iso peitelasi (24 × 60 mm) koko levyn päälle.

7.3 FISH-testin lukeminen

7.3.1 Tutkitaan levyt välittömästi mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, öljyimmersio-objektiivin 630–1 000-kertaisella suurennoksella. FITC:iin sopivilla suodattimilla näytteen eubakteerisolut (mukaan luettuina useimmat gramnegatiiviset solut) fluoresoivat vihreinä. Kun käytetään tetrametyylirodamiini-5-isotiosyanaatille tarkoitettua suodatinta, Cy3-värjätyt R. solanacearum -bakteerin solut näkyvät fluoresoivan punaisina. Verrataan solujen morfologiaa positiivisten kontrollien morfologiaan. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) on toistettava, jos värjäytyminen on poikkeavaa. Tutkitaan syvennyksiä tarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukon kehää. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.

7.3.2 Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava vähintään positiivisen kontrollikannan fluoresenssin intensiteettiä. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.

7.3.3 Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin saastumisen vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.

7.3.4 FISH-testin spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa saattaa esiintyä morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita, vaikkakin huomattavasti harvemmin kuin IF-testissä.

7.3.5 Ainoastaan ne fluoresoivat solut, jotka ovat kooltaan ja morfologialtaan tyypillisiä, on otettava huomioon.

7.3.6 FISH-testin tulosten tulkinta

i) FISH-testistä saadaan validit tulokset, jos FITC-suodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan vihreitä fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen, ja jos rodamiinisuodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja kaikissa positiivissa kontrolleissa muttei yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa. Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4). Näytteitä, joissa on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään mahdollisesti saastuneina. Lisätestaus on tarpeen. Näytteitä, joissa on vähemmän kuin 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään negatiivisina.

ii) FISH-testin tulos on negatiivinen, jos rodamiinisuodatinta käyttäen ei havaita kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen edellyttäen, että tyypillisiä kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja havaitaan positiivisissa kontrollivalmisteissa silloin, kun käytetään rodamiinisuodatinta.

8. ELISA-testi

Periaate

ELISA-testiä voidaan käyttää ainoastaan valinnaisena testin IF-, PCR- tai FISH-testin lisäksi, koska testin herkkyys on verrattain alhainen. Kun käytetään DAS ELISA -testiä, rikastus ja monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ovat pakollisia (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Näytteiden rikastus ennen ELISA-testin käyttöä voi olla hyödyllistä testin herkkyyden parantamiseksi, mutta se voi epäonnistua näytteessä olevien muiden organismien kilpailun vuoksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatua solua, ja kun käytetään sopivia sekundaareja vasta-ainekonjugaatteja valmistajan suositusten mukaisesti. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä kaupallisesti saatavilla olevaa titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa.

Määritetään vasta-aineiden titteri suspensiossa, jossa on millilitraa kohden 105–106 solua R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta.

Negatiiviksi kontrolleiksi otetaan näyteuute, joka on aiemmin testattu negatiiviseksi R. solanacearum -bakteerin osalta, sekä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) oleva bakteeri, joka ei reagoi ristiin.

Positiivisena kontrollina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi ja joihin on sekoitettu millilitraa kohden 103–104 R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäyksen 2 A ja B kohta). Tulosten vertailemiseksi kullakin levyllä käytetään standardiliuosta, jossa on millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -solua fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. On varmistettava, että positiiviset kontrollit on tarkoin erotettu testattavista näytteistä mikrotitterilevyllä.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kaksi ELISA-protokollaa on validoitu.

a) Epäsuora ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

1) Käytetään 100–200 µl näyteuutteen osia. (Kuumentaminen 100 °C:ssa 4 minuutin ajan vesihauteessa tai kuumentimella voi joissakin tapauksissa vähentää ei-spesifisiä tuloksia.)

2) Lisätään sama tilavuusmäärä väkevyydeltään kaksinkertaista kiinnityspuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan vorteksilla.

3) Lisätään 100 µl:aa kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotitterilevyn syvennykseen (esim. Nunc-Polysorp tai vastaava). Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa.

4) Kaadetaan uutteet pois syvennyksistä. Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4) siten, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään 5 minuutiksi.

5) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin vasta-aineista estopuskuriin (lisäys 4). Validoiduista kaupallisista vasta-aineista käytetään suositeltuja laimennoksia (yleensä kaksinkertainen konsentraatio titteriin verrattuna).

6) Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

7) Kaadetaan vasta-aineliuos syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

8) Valmistetaan sopiva laimennos sekundaarista vasta-aine-emäsfosfataasikonjugaattia estopuskuriin. Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

9) Kaadetaan konjugaattivasta-aine syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

10) Lisätään 100 µl emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (lisäys 4) kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

b) DASI ELISA

1) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin polyklonaalisista immunoglobuliinivasta-aineista kiinnityspuskuriin, pH 9,6 (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan 37 °C:ssa 4–5 tunnin ajan tai 4 °C:ssa 16 tunnin ajan.

2) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4). Lisätään 190 µl näyteuutetta vähintään kahteen syvennykseen. Lisätään myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit kahteen syvennykseen kullakin levyllä. Inkuboidaan 16 tunnin ajan 4 °C:ssa.

3) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

4) Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerille spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (lisäys 4), joka sisältää myös 0,5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), ja lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

5) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

6) Valmistetaan sopiva laimennus hiiren vasta-aineimmunoglobuliineja konjugoituna emäksiseen fosfataasiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

7) Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

8) Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, jossa on 1 mg p-nitrofenyylifosfaattia substraattipuskurin millilitraa kohden (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

ELISA-testitulosten tulkinta

ELISA-testi on negatiivinen, jos kahden näytteen keskimääräinen optinen tiheys (OD) on < 2 × negatiivisen kontrollinäytesyvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien positiivisten kontrollien OD on suurempi kuin 1,0 (kun kontrolleja on inkuboitu 90 minuutin ajan substraatin kanssa) ja enemmän kuin kaksinkertainen negatiivista näyteuutteista saatuun OD:hen verrattuna.

ELISA-testi on positiivinen, jos kahden näytesyvennyksen keskimääräinen OD on > 2 × negatiivisen näyteuutteen syvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien negatiivisten kontrollisyvennysten OD on < 2 × positiivisten kontrollisyvennysten OD.

Negatiivinen ELISA-tulos positiivisissa kontrollisyvennyksissä osoittaa, että testiä ei ole tehty oikein tai se on inhiboitunut. Positiiviset ELISA-tulokset negatiivisissa kontrollisyvennyksissä ilmaiset, että testissä on tapahtunut ristikontaminaatiota tai epäspesifistä vasta-aineen sitoutumista.

9. Biologinen määritys

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104) (valmistus ks. lisäys 3). Testi on voitava toistaa.

Suurinta todentamisherkkyyttä voidaan odottaa, kun käytetään vasta valmistettua näyteuutetta optimaalisissa kasvuolosuhteissa. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää menestyksekkäästi myös sellaisiin uutteisiin, joita on varastoitu glyserolissa -68–-86 °C:ssa.

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Janse (1988):

9.1 Testikasveina käytetään 10 kasvia, jotka ovat taudille altista kolmilehtiasteella olevaa tomaattilajiketta (esim. Moneymaker tai lajike, jonka alttiuden testilaboratorio on määrittänyt vastaavaksi). Viljelyn yksityiskohdista tarkemmin ks. lisäys 8. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää munakoisoja (esim. lajike Black Beauty tai lajikkeet, joiden alttius on vastaava). Käytetään ainoastaan kasveja, jotka ovat kaksi- tai kolmilehtilehtiasteella ja enintään todellisen kolmannen lehden täyteen puhkeamiseen asti. Munakoison oireiden on osoitettu olevan lievempiä ja kehittyvän hitaammin. Tämän vuoksi suositellaan mahdollisuuksien mukaan tomaatin taimien käyttöä.

Jaetaan 100 µl näyteuutetta testikasvien kesken.

9.2.1 Inokulointi injektoimalla

Inokulointi tehdään ruiskulla, joka on varustettu hypodermisellä neulalla (vähintään 23G), kasvin varsiin juuri sirkkalehtien yläpuolelle. Näyte jaetaan testikasvien kesken.

9.2.2 Inokulointi viiltämällä

Pidellään kasvia kahden sormen välissä ja tiputetaan pipetillä pisara (noin 5–10 µl) suspendoitua sakkaa varren päälle sirkkalehtien ja ensimmäisen kasvulehden väliin.

Tehdään steriilillä leikkausveitsellä sakan pisarasta lähtien vinosti poikittainen noin 1 cm:n viilto, jonka syvyys on noin kaksi kolmannesta varren paksuudesta.

Suljetaan viilto steriilillä vaseliinilla ruiskua käyttäen.

9.3 Inokuloidaan samalla tekniikalla viisi taimea positiivisena kontrollina vesisuspensiolla, jossa on 105–106 solua/ml virulenttia R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kantaa (positiivinen kontrolli) 48 tunnin viljelmästä, ja negatiivisena kontrollina sakkapuskurilla (lisäys 4). Kasvit, joita käytetään positiivisena ja negatiivisena kontrollina, pidetään erillään muista kasveista ristikontaminaation estämiseksi.

9.4 Kasvatetaan testikasveja karanteenioloissa enintään 4 viikon ajan 25–30 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuihtuminen vedenpuutteen vuoksi. Saastunnan välttämiseksi inkuboidaan positiiviset ja negatiiviset kontrollikasvit selkeästi toisistaan erotettuihin penkkeihin kasvihuoneessa tai kasvatuskammioissa tai, jos tilaa on rajoitetusti, huolehditaan siitä, että käsittelyt tehdään tiukasti toisistaan erillään. Jos eri näytteisiin kuuluvat kasvit on inkuboitava lähellä toisiaan, ne on eroteltava asianmukaisilla suojilla. Lannoitettaessa, kasteltaessa tai tutkimuksia ja muita toimenpiteitä tehtäessä on huolellisesti vältettävä ristikontaminaatio. Kasvihuoneisiin ja kasvatuskammioihin ei ehdottomasti saa päästä mitään hyönteistuholaisia, sillä ne saattavat siirtää bakteeria näytteestä toiseen.

Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua.

9.5 Tartunnan saaneista kasveista eristetään (II jakson 3 kohta) ja tunnistetaan oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).

9.6 Jos 3 viikon jälkeen ei havaita oireita, tehdään IF-, PCR- tai eristystesti kokoomanäytteelle, jossa on kustakin testikasvista 1 cm:n mittaisia varren palasia, jotka on otettu inokulointipaikan yläpuolelta. Jos testi on positiivinen, tehdään laimennussarja (alakohta 4.1).

9.7 Tunnistetaan mahdolliset oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).

Biologisen määrityksen tulosten tulkinta

Biologisesta määrityksestä saadaan validit tulokset, jos positiivisen kontrollin kasveissa näkyy tyypillisiä oireita, bakteerit voidaan eristää uudelleen näistä kasveista ja negatiivisista kontrolleista ei löydy oireita.

Biologisen määrityksen tulos on negatiivinen, jos testikasveissa ei ole R. solanacearum -bakteerin aiheuttamaa tartuntaa ja R. solanacearum -bakteeri todetaan positiivisista kontrolleista.

Biologisen määrityksen tulos on positiivinen, jos testikasveissa on R. solanacearum -bakteerin aiheuttama tartunta.

B) TUNNISTUSTESTIT

Tunnistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien puhtaat viljelmät käyttäen ainakin kahta seuraavista eri biologisiin periaatteisiin perustuvista testeistä.

Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).

1. Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit

Määritetään seuraavat fenotyyppiset ominaisuudet, jotka yleisesti joko esiintyvät R. solanacearum -bakteerissa tai puuttuvat siitä. Käytetään seuraavissa lähteissä kuvattuja menetelmiä: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990) ja Schaad (2001).

Testi Tavoiteltavat tulokset Fluoresoivan pigmentin muodostus – Poly-β-hydroksibutyraatti-inkluusiot + Hapettumis-/käymistesti (O/F) O+/F– Katalaasi aktiivisuus + Kovacin oksidaasitesti + Nitraatin pelkistyminen + Sitraatin käyttö + Kasvu 40 °C:ssa – Kasvu 1-prosenttisessa NaCl:ssa + Kasvu 2-prosenttisessa NaCl:ssa – Arginiinidihydrolaasin aktiivisuus – Gelatiinin nesteytyminen – Tärkkelyksen hydrolyysi – Eskuliinin hydrolyysi – Levaanin tuotanto –

2. IF-testi

2.1 Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) IF-puskuriin (lisäys 4).

2.2 Valmistetaan kaksinkertaisia laimennoksia tarkoituksenmukaisesta antiseerumista (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 Sovelletaan IF-menettelyä (VI jakson A kohdan 5 alakohta).

2.4 IF-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmän IF-titteri vastaa positiivisen kontrollin titteriä.

3. ELISA-testi

Huomautus: Jos tehdään ainoastaan kaksi tunnistustestiä, ei tämän menetelmän lisäksi käytetä muuta serologista testiä.

3.1 Valmistetaan suspensio (noin 108 solua/ml) 1X PBS -puskuriin (lisäys 4).

3.2 Toteutetaan soveltuva ELISA-menettely R. solanacearum -taudinaiheuttajalle spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella.

3.3 Positiivinen ELISA-testitulos saadaan, jos viljelmästä saatu ELISA-tulos on vähintään puolet positiivisen kontrollin tuloksesta.

4. PCR-testi

4.1 Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) molekyylisuodattimilla puhdistettuun veteen.

4.2 Kuumennetaan 100 µl solususpensiota suljetuissa putkissa kuumentimessa tai kiehuvassa vesihauteessa 100 °C:ssa 4 minuutin ajan. Näytteet voidaan varastoida -16–-24 °C:ssa, kunnes niitä tarvitaan.

4.3 Sovelletaan tarkoituksenmukaisia PCR-menettelyjä R. solanacearum -spesifisten amplikonien monistamiseksi (esim. Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4 R. solanacearum -bakteerin positiivinen tunnistus toteutuu, jos PCR-amplikonit ovat samankokoisia kuin positiivisen kontrollikannan amplikonit ja niillä esiintyy samaa restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa.

5. FISH-testi

5.1 Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) ultrapuhtaaseen veteen.

5.2 Käytetään FISH-menettelyä (VI jakson A kohdan 7 alakohta) vähintään kahdella R. solanacearum -spesifisellä oligokoettimella (lisäys 7).

5.3 FISH-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmästä ja positiivisesta kontrollista saadaan samat reaktiot.

6. Rasvahappoprofilointi (FAP)

6.1 Kasvatetaan viljelmä tryptikaasi-soija-agarissa (Oxoid) 48 tunnin ajan 28 °C:ssa.

6.2 Tehdään tarkoituksenmukainen FAP-testi (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 FAP-testistä saadaan positiivinen tulos, jos oletetun viljelmän profiili on identtinen positiivisen kontrollin profiilin kanssa. Tyypillisten rasvahappojen esiintyminen on seuraava: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH, ja 16:0 3OH:n puuttuminen on erittäin vahva osoitus Ralstonia sp:stä.

7. Kantojen määrittämismenetelmät

Kannan määritystä jollakin seuraavista menetelmistä suositellaan kaikissa uusissa R. solanacearum -bakteerin eristämistapauksissa.

Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).

7.1 Biovarin määrittäminen

R. solanacearum -bakteerin biovarit erotetaan kolmen disakkaridin ja kolmen heksoosialkoholin käyttö- ja/tai hapetuskyvyn perusteella (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biovaritestin kasvualustat kuvataan lisäyksessä 2. Testi voidaan tehdä inokuloimalla kasvualusta pistämällä siihen R. solanacearum -bakteerin isolaattien puhdasta viljelmää ja inkuboimalla 28 °C:ssa. Jos kasvualustat laitetaan steriileihin 96-syvennyksen soluviljelmälevyihin (200 µl/syvennys), 72 tunnin kuluessa voidaan havaita värinmuutos oliivinvihreästä keltaiseksi, mikä osoittaa positiivisen testituloksen.

Biovari 1 2 3 4 5 Käyttö: Maltoosi – + + – + Laktoosi – + + – + D (+) sellobioosi – + + – + Mannitoli – – + + + Sorbitoli – – + + – Dulsitoli – – + + –

Lisätesteillä biovari 2 jaetaan alafenotyyppeihin.

Biovari 2A (esiintyy maailmanlaajuisesti) Biovari 2A (esiintyy Chilessä ja Kolumbiassa) Biovari 2T (esiintyy tropiikissa) Trehaloosin käyttö – + + Meso-inositolin käyttö + – + D-riboosin käyttö – – + Pektolyyttinen aktiivisuus (1) vähäinen vähäinen suuri

7.2 Genomien sormenjäljet

R. solanacearum -kompleksin kantojen molekulaarinen erottaminen voi tapahtua useilla menetelmillä. Näitä ovat

7.2.1 RFLP-analyysi (Restriction fragment length polymorphism analysis) (Cook et al., 1989).

7.2.2 Toistuvan järjestyksen PCR, jossa käytetään REP-, ERIC- ja BOX-alukkeita (primers) (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3 AFLP-analyysi (Amplified fragment length polymorphism) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3 PCR-menetelmät

Spesifisiä PCR-alukkeita (primers) (Pastrik et al., 2002; ks. lisäys 6) voidaan käyttää alunperin RFLP-analyysilla (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA -sekvensoinnilla (Taghavi et al., 1996) R. solanacearum -bakteerin luokkaan 1 (biovarit 3, 4 ja 5) sekä luokkaan 2 (biovarit 1, 2A ja 2T) kuuluvien kantojen erottamiseksi.

C) VARMISTUSTESTI

Patogeenisyystesti on tehtävä R. solanacearum -bakteerin määrityksen lopulliseksi varmistamiseksi ja R. solanacearum -bakteeriksi tunnistettujen viljelmien virulenssin arvioimiseksi.

1) Valmistetaan inokulaatti (noin 106 solua/ml) testattavan isolaatin 24–48 tunnin viljelmästä ja R. solanacearum -bakteerin asianmukaisesta positiivisesta kontrollikannasta (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäys 3).

2) Inokuloidaan 5–10 taudille altista tomaatin tai munakoison taimea niiden kolmilehtiasteella (ks. VI jakson A kohdan 9 alakohta).

3) Inkuboidaan enintään 2 viikon ajan 25–28 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuivuusstressi. Puhtailla viljelmillä pitäisi 14 päivän kuluessa saavuttaa tyypillinen kasvin nuutuminen. Jos oireita ei ole tämän ajan kuluessa ilmaantunut, ei voida vakuuttua siitä, että olisi kyse R. solanacearum -bakteerin patogeenisen muodon kasvustosta.

4) Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja hidastunutta kasvua.