19)

Lisätään C osaan luvut seuraavasti: ”C.47 Toksisuustesti kaloilla niiden varhaiskehitysvaiheissa JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 210 (2013). Kalojen varhaiskehitysvaiheissa tehtävien testien avulla on tarkoitus määrittää kemikaalien letaalit ja subletaalit vaikutukset tietyn lajin tietyissä kehitysvaiheissa. Niistä saadaan arvokasta tietoa kemikaalista muille kalalajeille aiheutuvien kroonisten letaalien ja subletaalien vaikutusten estimointia varten. 2. Testiohje nro 210 perustuu Yhdistyneen kuningaskunnan ehdotukseen, josta keskusteltiin Medmenhamissa (Yhdistyneessä kuningaskunnassa) marraskuussa 1988 kokoontuneessa OECD:n asiantuntijakokouksessa. Testiohje on saatettu ajan tasalle vuonna 2013 testin käytöstä saadun kokemuksen ja syyskuussa 2010 järjestetyssä toksisuustestausta kaloilla käsittelevässä OECD:n seminaarissa annettujen suositusten (1) perusteella. TESTIN PERIAATE 3. Varhaiskehitysvaiheissa olevia kaloja altistetaan veteen liuotetun testikemikaalin eri pitoisuuksille. Läpivirtausolosuhteita pidetään parhaimpina, mutta jos niiden järjestäminen ei ole mahdollista, semistaattiset olosuhteet voidaan hyväksyä. Tarkat ohjeet on syytä katsoa vaikeasti testattavien aineiden ja seosten toksisuustestausta vesieliöillä koskevasta ohjeasiakirjasta (2). Testi aloitetaan asettamalla hedelmöityneet mätimunat testiastioihin, ja sitä jatketaan lajikohtaisesti tarvittavan ajan, kunnes kontrollikalat saavuttavat nuoren kalan eli juveniilin elinvaiheen. Letaalit ja subletaalit vaikutukset arvioidaan ja niitä verrataan kontrolliarvioihin, jotta voidaan määrittää pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (LOEC) ja sen avulla edelleen i) pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia (NOEC) ja/tai ii) ECx (esimerkiksi EC10 ja EC20) käyttämällä regressiomallia, jonka avulla estimoidaan x prosentin muutoksen mitattavassa vaikutuksessa aiheuttava pitoisuus. Vaikuttavien pitoisuuksien ja parametrien ilmoittaminen saattaa vaihdella sovellettavan lainsäädännön mukaan. Testipitoisuudet on valittava siten, että ECx-arvo on kyseisellä pitoisuusalueella, jotta ECx saadaan interpoloimalla eikä ekstrapoloimalla (määritelmistä ks. lisäys 1). TESTIKEMIKAALIA KOSKEVIA TIETOJA 4. Testikemikaalilla tarkoitetaan testattavaa ainetta tai seosta. Testikemikaalin vesiliukoisuus (ks. tämän liitteen A.6 luku) ja höyrynpaine (ks. tämän liitteen A.4 luku) on oltava tiedossa, ja kemikaalin kvantifioimiseksi testiliuoksissa on oltava käytettävissä luotettava analyysimenetelmä, jonka oikeellisuus on tiedossa ja raportoitu, ja määritysrajan oltava saatavissa. Vaikka akuuttia toksisuutta koskevan testin (ks. tämän liitteen C.1 tai C.49 luku) tekeminen ei ole välttämätöntä, testin tekeminen mieluiten tähän testiin valitulla lajilla saattaa antaa hyödyllistä tietoa. 5. Jos testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen, seoksen koostumus on luonnehdittava mahdollisimman tarkoin esimerkiksi sen ainesosien kemiallinen koostumuksen, esiintymistiheyden ja (muun muassa edellä mainittujen) ainekohtaisten erityisominaisuuksien avulla. Ennen kuin testimenetelmää käytetään lainsäädännössä edellytettyyn seosten testaukseen, on harkittava, antaako se hyväksyttävät tulokset lainsäädännön tavoitteen kannalta. 6. Hyödyllisiä tietoja ovat muun muassa rakennekaava, aineen puhtaus, stabiilius vedessä ja valossa, pKa, POW ja nopean biohajoavuuden testin tulokset (ks. tämän liitteen C.4 tai C.29 luku). TESTIN VALIDITEETTI 7. Testi on luotettava (validi), jos seuraavat edellytykset täyttyvät: — Liuenneen hapen pitoisuus on > 60 prosenttia ilman kyllästysarvosta koko altistusjakson ajan. — Veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,5 °C testiastioiden välillä tai peräkkäisinä päivinä milloin tahansa testin aikana ja on niissä rajoissa, jotka on määritelty kyseiselle testilajille (lisäys 2). — Testattavien pitoisuuksien mittaaminen on pakollista. — Hedelmöityneiden mätimunien ja kuoriutuneiden poikasten eloonjäämisaste kontrolleissa ja tapauksen mukaan liuotinkontrolleissa on vähintään yhtä suuri kuin lisäyksessä 2 on määritelty. 8. Jos validiteettikriteereistä havaitaan vähäinen poikkeama, sen vaikutuksia testitietojen luotettavuuteen on harkittava ja harkinnan tulokset sisällytettävä raporttiin. Vaikutukset eloonjäämiseen, kuoriutumiseen tai kasvuun liuotinkontrollissa verrattuna negatiiviseen kontrolliin on ilmoitettava ja niistä on keskusteltava testitietojen luotettavuuden kannalta. MENETELMÄN KUVAUS Testiastiat 9. Mitä tahansa lasista, ruostumattomasta teräksestä tai muusta kemiallisesti inertistä materiaalista valmistettua astiaa voi käyttää. Koska silikonin tiedetään pystyvän voimakkaasti absorboimaan lipofiilisiä aineita, silikoniputkia on käytettävä läpivirtaustutkimuksissa mahdollisimman vähän, samoin kuin silikonitiivisteitä kosketuksissa veden kanssa, käyttämällä esimerkiksi yhtenäisrakenteista lasiakvaariota. Astioiden on oltava riittävän suuria, jotta kunnon kasvu kontrollissa on mahdollinen, liuenneen hapen riittävä pitoisuus voidaan pitää yllä (esim. pienillä kalalajeilla tämä saavutetaan käyttämällä 7 litran tankkia) ja 19 kohdassa annettuja mätimäärää koskevia kriteerejä voidaan noudattaa. Suositellaan, että testiastiat sijoitetaan testialueelle satunnaistetusti. Satunnaistettu lohkoasetelma siten, että kussakin käsittelyssä olevia testiastioita on kussakin lohkossa, on parempi kuin täysin satunnaistettu järjestely. Testiastiat on suojattava ei-toivotuilta häiriöiltä. Testijärjestelmää on suotavaa sopeuttaa testikemikaalin pitoisuuksilla riittävän kauan, jotta voidaan osoittaa vakaat altistuspitoisuudet ennen testieliöiden lisäämistä. Lajin valinta 10. Suositeltavat kalalajit luetellaan taulukossa 1. Muitakin lajeja saa käyttää, mutta testimenetelmää on mahdollisesti mukautettava, jotta testiolosuhteet ovat sopivat. Tällaisessa tapauksessa on selostettava syyt lajin ja koemenetelmän valitsemiseen. Siitoskalojen kasvatus 11. Siitoskannan kasvatuksesta tyydyttävissä oloissa annetaan yksityiskohtaiset ohjeet lisäyksessä 3 ja mainituissa viitteissä (3) (4) ja (5). Hedelmöityneiden mätimunien, alkioiden ja toukkien käsittely 12. Aluksi hedelmöityneiden mätimunien, alkioiden ja toukkien altistus voidaan tehdä ison astian sisällä olevissa pienemmissä lasista tai ruostumattomasta teräksestä valmistetuissa astioissa, joiden laidoissa tai päädyissä on verkot, jolloin testiliuos pääsee virtaamaan astian läpi. Pienten astioiden läpi voidaan johtaa pyörteetön virtaus ripustamalla astiat varteen, jota voidaan nostaa ja laskea astiassa siten, että eliöt ovat nestepinnan alla koko ajan. Hedelmöityneitä lohensukuisten kalojen mätimunia voidaan pitää telineissä tai verkoissa, joiden reiät ovat niin suuret, että toukat putoavat niistä läpi kuoriuduttuaan. 13. Jos mätimunien pitämiseksi isossa testiastiassa käytetään telineitä, ritilöitä tai verkkoja, ne on poistettava toukkien kuoriutumisen jälkeen lisäyksessä 3 annettujen ohjeiden mukaisesti. Verkot pitää kuitenkin säilyttää toukkien karkaamisen estämiseksi. Jos toukkia on siirrettävä, niitä ei saa ottaa vedestä ilmaan eikä verkkoja saa käyttää toukkien irrottamiseksi mätimunatelineistä. Siirtoajankohta vaihtelee lajeittain, ja se on kirjattava raporttiin. Siirto ei kuitenkaan ehkä ole aina tarpeen. Vesi 14. Testissä voidaan käyttää mitä tahansa sellaista vettä, jossa testilaji selviytyy ja kasvaa riittävän pitkän ajan (ks. lisäys 4). Veden laadun on oltava vakio koko testin ajan. Sen varmistamiseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa kemikaalia) tai haitallisesti siitoskalakannan vointiin, näytteitä on otettava säännöllisin väliajoin määrityksiä varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO42–), ammoniakki, jäännösklooria sisältävien torjunta-aineiden kokonaismäärä, orgaanisen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoituneet kiinteät aineet on mitattava esimerkiksi puolivuosittain, jos laimennusveden laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laadun tiedetään vaihtelevan, mittaukset on tehtävä useammin; mittaustiheys riippuu vaihtelun määrästä. Lisäyksessä 4 luetellaan joitakin hyväksyttävän laimennusveden ominaisuuksia. Testiliuokset 15. Läpivirtaustesteissä on käytettävä testikemikaalin varastoliuosta jatkuvasti annostelevaa ja laimentavaa järjestelmää (esim. annostelupumppua, laimenninta, kyllästävää järjestelmää) testipitoisuuksien annostelemiseksi testiastioihin. Varastoliuosten ja laimennusveden virtausnopeudet on tarkistettava säännöllisin väliajoin, ja virtausnopeus saa vaihdella enintään 10 prosenttia koko testin aikana. Virtausnopeus, joka on vähintään viisi kertaa testiastian tilavuus 24 tunnissa, on havaittu sopivaksi (3). Jos 19 kohdassa määritettyä mätimäärää noudatetaan, on mahdollista käyttää alhaisempaa virtausnopeutta, esim. kaksi tai kolme kertaa testiastian tilavuus, jotta ravinnon nopea poistuminen voidaan estää. 16. Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan varastoliuoksista laimentamalla. Varastoliuos valmistetaan mieluiten yksinkertaisesti sekoittamalla testattava aine laimennusveteen käyttäen mekaanisia menetelmiä (kuten sekoittamista ja/tai ultraääntä). Saturaatiopylväitä (liukoisuuspylväitä) tai passiivisia annostelumenetelmiä (6) voi käyttää riittävän väkevän varastoliuoksen valmistamiseksi. Liuottimen käyttöä kantoaineena ei suositella. Jos liuotin on kuitenkin tarpeen, rinnalla on käytettävä liuotinkontrollia, ja liuotinpitoisuuden on oltava sama kuin kemikaalilla käsittelyissä. Toisin sanoen liuotintason on mielellään oltava sama kaikilla pitoisuuksilla ja liuotinkontrollissa. Joissakin laimenninjärjestelmissä tämä saattaa olla teknisesti vaikeaa; tällöin liuotinkontrollin liuotinpitoisuuden on vastattava käsittelyryhmän korkeinta liuotinpitoisuutta. Vaikeasti testattavia aineita koskevat ohjeet on syytä katsoa vaikeasti testattavien aineiden ja seosten toksisuustestausta vesieliöillä koskevasta OECD:n ohjeasiakirjasta nro 23 (2). Jos liuotinta käytetään, liuotin valitaan aineen kemiallisten ominaisuuksien perusteella. OECD:n ohjeasiakirjassa nro 23 enimmäispitoisuudeksi suositellaan 100 μl/l. Liuotinpitoisuus on suositeltavaa pitää mahdollisimman alhaisena, jotta vältetään liuottimen mahdollinen vaikutus mitattuihin ominaisuuksiin (7). 17. Semistaattisessa testissä voidaan käyttää kahta eri liuoksenvaihtomenetelmää: joko uudet testiliuokset valmistellaan puhtaisiin astioihin ja eloonjääneet mätimunat ja toukat siirretään varovasti uusiin astioihin tai testieliöt pidetään testiastioissa samalla, kun osa (vähintään kaksi kolmasosaa) testiliuoksesta/kontrollimäärästä vaihdetaan. MENETTELY Altistumisolosuhteet Kesto 18. Testi on aloitettava mahdollisimman pian sen jälkeen, kun mätimunat ovat hedelmöityneet, ja ne on mielellään upotettava testiliuokseen, ennen kuin sukusolujen jakautuminen alkaa, tai mahdollisimman lähellä tätä vaihetta. Testin kesto riippuu käytettävästä lajista. Lisäyksessä 2 annetaan joitakin suosituksia testin kestosta. Täyttö 19. Testin alussa hedelmöityneiden mätimunien määrän on oltava riittävä tilastollista käsittelyä varten. Ne on jaettava satunnaisesti käsittelyryhmiin, ja kutakin pitoisuutta kohden on käytettävä vähintään 80 mätimunaa, jotka on jaettava tasan vähintään neljään rinnakkaiseen testiastiaan. Mätimäärän (biomassa testiliuoksen tilavuusyksikköä kohti) on oltava niin pieni, että liuenneen hapen pitoisuus voidaan muna- ja toukkavaiheen ajan pitää vähintään 60 prosentissa ilman kyllästysarvosta ilman ilmastusta. Suositusten mukaan mätimäärän tuorepaino saa läpivirtaustesteissä olla enintään 0,5 g/l per 24 tuntia ja enintään 5 g/l liuosta minä tahansa ajankohtana (3). Valo ja lämpötila 20. Valoisan ajan ja testiveden lämpötilan on oltava sopivia käytetylle testilajille (ks. lisäys 2). Ruokinta 21. Ravinto ja ruokinta ovat kriittisiä, ja on olennaisen tärkeää, että kussakin elinvaiheessa annetaan oikeaa ravintoa oikeaan aikaan ja riittävästi normaalin kasvun turvaamiseen. Ruokinnan on oltava suunnilleen sama rinnakkaisissa astioissa, ellei sitä mukauteta kuolleisuuden huomioon ottamiseksi. Jätteen kertymisen välttämiseksi ylimääräinen rehu ja ulosteet on tarvittaessa poistettava. Yksityiskohtaiset ruokintajärjestelmät on esitetty lisäyksessä 3, mutta ravinto- ja ruokintajärjestelmiä kehitetään jatkuvasti kokemuksen karttuessa, jotta eloonjääminen ja kasvu voidaan optimoida. Elävä ravinto lisää ympäristön virikkeellisyyttä, joten sitä on käytettävä kuiva- tai pakasteravinnon sijasta tai lisäksi aina, kun se on lajin ja elinvaiheen kannalta asianmukaista. Testipitoisuudet 22. Tavallisesti tarvitaan viisi testikemikaalin pitoisuutta, joiden välinen ero on vakio ja enintään 3,2-kertainen, ja vähintään neljä rinnakkaisastiaa pitoisuutta kohden. Kun valitaan testipitoisuuksien vaihteluvälit, on otettava huomioon akuuteista testeistä mielellään samoilla lajeilla ja/tai pitoisuusalueen määritystestistä mahdollisesti saadut tiedot (1). Testipitoisuuksien vaihteluvälin valinnassa on kuitenkin otettava huomioon kaikki mahdolliset tietolähteet, kuten päättelyarviot kalojen alkioilla tehdyistä akuuttia toksisuutta koskevista testeistä. Raja-annostesti tai jatkettu raja-annostesti, jossa on lopullisessa testissä alle viisi pitoisuutta, voidaan hyväksyä, jos on vahvistettava vain empiirinen NOEC-arvo. Vähemmän kuin viiden pitoisuuden käyttö on perusteltava. Testikemikaalin pitoisuuksia, jotka ovat suurempia kuin 96 tunnin LC50, tai 10 mg/l (näistä alhaisempi arvo), ei tarvitse testata. Kontrollit 23. Testikemikaalin pitoisuussarjan lisäksi on määritettävä laimennusvesikontrolli ja tarvittaessa pelkkää kantoaineena käytettävää liuotinta sisältävä liuotinkontrolli (ks. 16 kohta). Analyyttisten määritysten ja mittausten taajuus 24. Ennen altistusjakson aloittamista on varmistettava, että kemikaalin annostelujärjestelmä toimii asianmukaisesti kaikissa rinnakkaisastioissa (esimerkiksi mittaamalla testipitoisuudet). Tarvittavat analyysimenetelmät on määritettävä, myös asianmukainen kvantifiointiraja (LOQ), ja aineen stabiiliudesta testijärjestelmässä on oltava riittävästi tietoa. Testin aikana testikemikaalin pitoisuudet määritetään säännöllisin väliajoin altistumisen luonnehtimiseksi. Vähintään viisi määritystä tarvitaan. Läpivirtausjärjestelmissä testikemikaali on vähintään kerran viikossa mitattava yhdessä rinnakkaisnäytteessä pitoisuutta kohti, siten että mitattavaa rinnakkaisnäytettä vaihdetaan järjestelmällisesti. Analyyttiset lisämääritykset parantavat usein testituloksen laatua. Näytteet on ehkä suodatettava hiukkasten poistamiseksi (käyttämällä esim. 0,45 μm:n huokoskokoa) tai sentrifugoitava sen varmistamiseksi, että kemikaalin määritys tehdään aidosta liuoksesta. Suodattimet on kyllästettävä ennen käyttöä testikemikaalin adsorption vähentämiseksi. Jos mitatut pitoisuudet eivät pysy 80–120 prosentissa nimellispitoisuudesta, vaikuttavat pitoisuudet on määritettävä ja ilmaistava suhteessa läpivirtaustestien aritmeettiseen keskipitoisuuteen (ks. aritmeettisen keskiarvon laskenta, testimenetelmän C.20 lisäyksessä 6 (8)) ja suhteessa semistaattisten testien mitattujen pitoisuuksien geometriseen keskiarvoon (ks. vaikeasti testattavien aineiden ja seosten toksisuustestausta vesieliöillä koskevan OECD:n ohjeasiakirjan luku 5 (2)). 25. Testin aikana liuennut happi, pH ja lämpötila on mitattava kaikissa testiasioissa vähintään viikoittain ja suolapitoisuus ja kovuus tarvittaessa testin alussa ja lopussa. Lämpötilaa on mielellään seurattava jatkuvasti vähintään yhdessä testiastiassa. Havainnot 26. Alkiokehitysvaihe : Testikemikaalille altistuksen alussa alkiokehitysvaihe on varmistettava mahdollisimman tarkasti. Siinä voidaan käyttää sopivasti säilytettyä ja puhdistettua edustavaa näytettä mätimunista. 27. Kuoriutuminen ja eloonjääminen : Kuoriutumisesta ja eloonjäämisestä on tehtävä havaintoja vähintään kerran päivässä, ja yksilöiden lukumäärät on kirjattava. Jos mätimunissa havaitaan sieniä alkiokehityksen varhaisvaiheessa (eli testin ensimmäisenä tai toisena päivänä), sellaiset mätimunat on laskettava ja poistettava. Kuolleet alkiot, toukat ja juveniilit on poistettava heti, kun ne havaitaan, koska ne voivat hajota nopeasti ja muut kalat saattavat rikkoa ne. Kuolleita yksilöitä poistettaessa on oltava erittäin varovainen, ettei vieressä olevia mätimunia tai toukkia vahingoiteta fyysisesti. Kuolemantapaukset todetaan eri kehitysvaiheissa ja eri lajeilla eri tavoin. Esimerkiksi — hedelmöityneet mätimunat: erityisesti varhaisvaiheissa läpikuultavuus vähenee ja väri muuttuu, mikä johtuu valkuaisaineiden hyytymisestä ja/tai saostumisesta, josta on seurauksena valkoinen väri ja läpinäkymättömyys — alkiot, toukat ja juveniilit: koe-eläimet eivät liiku ja/tai niiden hengitysliikkeet puuttuvat ja/tai sydän ei lyö ja/tai ne eivät reagoi mekaanisiin ärsykkeisiin. 28. Epänormaali ulkonäkö : Sellaisten toukkien tai juveniilien lukumäärä, joiden ruumiinmuodossa havaitaan epänormaaliutta, on kirjattava määräajoin testin kestosta ja kuvatun epänormaaliuden laadun mukaan. On huomattava, että epänormaaleja toukkia ja juveniileja esiintyy luonnollisesti, ja niiden määrä voi joillakin lajeilla olla useita prosentteja kontroll(e)issa. Jos epämuodostumia ja niihin liittyvää epänormaalia käytöstä pidetään niin vakavana, että eliö kärsii huomattavasti ja se on saavuttanut pisteen, jossa toipuminen ei ole mahdollista, eliö voidaan poistaa testistä. Tällaiset eläimet on lopetettava ja lisättävä kuolleisuuslukuihin myöhemmin tehtävässä analyysissa. Useimmilla lajeilla, joita on suositeltu käytettäväksi tässä testimenetelmässä, on rekisteröity normaalia alkiokehitystä (9) (10) (11) (12). 29. Epänormaali käyttäytyminen : Epänormaali käyttäytyminen, esimerkiksi hyperventilaatio, koordinoimaton uinti, epätyypillinen liikkumattomuus ja epätyypillinen syömiskäyttäytyminen, on kirjattava sopivin väliajoin testin aikana (esim. kerran päivässä lämpimän veden lajeilla). Vaikka tällaisia vaikutuksia on vaikea kvantifioida, niiden havainnoiminen voi auttaa kuolleisuusdatan tulkinnassa. 30. Paino : Kaikki eloonjääneet kalat punnitaan testin lopuksi vähintään rinnakkaisastiakohtaisesti (ilmoitetaan astiassa olevien eläinten lukumäärä ja keskipaino eläintä kohden). Tuorepainoa (eläimet kuivataan pinnalta) pidetään parempana, mutta myös kuivapainotiedot saa ilmoittaa (13). 31. Pituus : Testin lopussa mitataan yksilöiden pituus. Kokonaispituus on suositeltava, mutta jos pyrstöevä tai muut evät ovat syöpyneet, voidaan käyttää vakiopituutta. Kussakin testissä on käytettävä samaa menetelmää kaikkiin kaloihin. Yksilön pituus voidaan mitata käyttämällä esimerkiksi työntömittaa, digitaalista kameraa tai kalibroitua okulaarimikrometriä. Tyypilliset vähimmäispituudet on määritelty lisäyksessä 2. TIEDOT JA RAPORTOINTI Tulosten käsittely 32. On suositeltavaa, että kokeen suunnittelu ja tilastollisen testin valinta mahdollistavat riittävän voiman (vähintään 80 prosenttia) havaita biologisesti merkittävät muutokset tutkittavissa ominaisuuksissa, jos on ilmoitettava NOEC. Vaikuttavien pitoisuuksien ja parametrien ilmoittaminen saattaa vaihdella sovellettavan lainsäädännön mukaan. Jos on ilmoitettava ECx, koe on suunniteltava ja regressiomenetelmä valittava siten, että ECx:n estimoinnissa i) ECx:lle ilmoitettu 95 prosentin luottamusväli ei sisällä nollaa eikä ole liian suuri, ii) ennakoidulle keski-ECx:lle ilmoitettu 95 prosentin luottamusväli ei sisällä kontrollikeskiarvoa ja iii) regresssiomalli ei ole merkitsevästi yhteensopimaton tietojen kanssa. Kumpikin menetelmä edellyttää, että jokaisessa tutkittavassa ominaisuudessa, joka on tärkeä havaita tai estimoida, todetaan prosentuaalinen muutos. Koesuunnitelma on mukautettava siten, että se on mahdollista. Jos edellä mainitut ECx:n määrittämistä koskevat edellytykset eivät täyty, on käytettävä NOEC-menetelmää. Ei ole todennäköistä, että sama prosentuaalinen muutos koskisi kaikkia tutkittavia ominaisuuksia. Ei ole myöskään todennäköistä, että voitaisiin suunnitella toteutuskelpoinen testi, joka täyttäisi nämä kriteerit kaikkien tutkittavien ominaisuuksien osalta, joten on tärkeää keskittyä niihin ominaisuuksiin, jotka ovat kussakin testissä tärkeitä, jotta se voidaan suunnitella asianmukaisesti. Lisäyksissä 5 ja 6 on annettu tilastollisia vuokaavioita ja ohjeita kutakin menetelmää varten. Niissä annetaan ohjeita tietojen käsittelyyn ja asianmukaisimman tilastollisen testin tai mallin käytön valintaan. Muitakin tilastomenetelmiä saa käyttää, jos ne ovat tieteellisesti perusteltavissa. 33. Variaatiot on analysoitava kussakin rinnakkaisnäytesarjassa varianssianalyysillä tai kontingenssitaulukkomenetelmillä, ja analyysiin perustuvia asianmukaisia tilastollisia analyysimenetelmiä on käytettävä. Jos halutaan tehdä yhteisvertailu yksittäisten pitoisuuksien ja kontrollien välillä, jatkuvaa vastetta varten suositellaan Jonckheere-Terpstran tai Williamsin vertailutestiä ja sellaisia dikotomisia vasteita varten Cochran-Armitagen vertailutestiä, jotka ovat yhdenmukaisia monotonisen pitoisuus-vastesuhteen kanssa eikä ole näyttöä ylihajonnasta (14). Jos ylihajonnasta on näyttöä, suositellaan käytettäväksi Cochran-Armitagen testin Rao-Scott-muunnosta (15) (16) tai Williamsin tai Dunnettin testiä (arcussinimuunnoksen jälkeen) tai Jonckheere-Terpstran testiä rinnakkaisosuuksiin. Jos tiedot eivät ole yhdenmukaisia monotonisen pitoisuus-vastesuhteen kanssa, Dunnettin tai Dunnin tai Mann-Whitneyn menetelmät saattavat olla hyödyllisiä jatkuvissa vasteissa ja Fisherin tarkka testi dikotomisissa vasteissa (14) (17) (18). Kaikkien tilastomenetelmien tai -mallien käytössä on huolellisesti varmistettava, että kyseisen menetelmän tai mallin edellytykset täyttyvät (esim. astiakohtainen vaihtelu estimoidaan ja otetaan huomioon kokeen suunnittelussa ja testin tai mallin käytössä). Tietojen normaalius on arvioitava, ja lisäyksessä 5 ilmoitetaan, mitä ANOVAn jäännöksille on tehtävä. Lisäyksessä 6 käsitellään tarkemmin regressiomenetelmään liittyviä näkökohtia. Tilastollisen testin edellytysten täyttämiseksi on harkittava muunnoksia. Regressiomallin sovittamisen edellyttämät muunnokset vaativat kuitenkin suurta huolellisuutta, sillä esimerkiksi 25 prosentin muutos muuntelemattomassa vasteessa ei vastaa 25 prosentin muutosta muunnetussa vasteessa. Kaikissa analyyseissa analysoitava yksikkö ja koeyksikkö on testiastia, ei yksittäinen kala, joten sekä hypoteesitestien että regression on vastattava sitä (3) (14) (19) (20). Testiraportti 34. Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot: Testikemikaali: Yhdestä ainesosasta koostuvat aineet: — ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jos niillä on merkitystä — kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS nimi, CAS numero, SMILES tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot siltä osin, kuin se on tarpeen ja käytännössä mahdollista, jne. (tarvittaessa myös orgaanisen hiilen pitoisuus) Useista aineosista koostuvat aineet, koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet ja seokset: — mahdollisimman tarkka luonnehdinta, esim. kemialliset tunnistetiedot (kuten edellä), määrällinen esiintyminen ja ainesosien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jos niillä on merkitystä Testilajit: — tieteellinen nimi, kanta, lähde ja hedelmöityneiden mätimunien keruumenetelmä ja jatkokäsittely Testiolosuhteet: — testauksessa käytetty menetelmä (esim. semistaattinen tai läpivirtausmenetelmä, täyttötapa) — valoisa aika (valoisat aikajaksot) — testisuunnitelman kuvaus (esim. testiastioiden määrä, rinnakkaisnäytteiden määrä, mätimunien määrä rinnakkaisnäytettä kohden, testiastioiden materiaali ja koko (korkeus, leveys, tilavuus), vesimäärä testiastiaa kohden) — varastoliuosten valmistusmenetelmä ja nesteen vaihtojen väli (liuotusapuaine ja sen pitoisuus on ilmoitettava, jos sellaista käytetään) — testikemikaalin annostelumenetelmä (esim. pumput, laimennusjärjestelmät) — menetelmän saantoteho ja nimelliset testipitoisuudet, kvantifiointiraja, mitattujen arvojen keskiarvot ja niiden keskihajonnat testiastioissa, niiden laskemiseen käytetty menetelmä sekä näyttö siitä, että mittaukset koskevat testikemikaalin pitoisuutta aidossa liuoksessa — laimennusveden ominaisuudet: pH, kovuus, lämpötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännösklooripitoisuudet (jos ne on mitattu), orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaismäärä (jos se on mitattu), suspensiossa olevat kiinteät aineet (jos ne on mitattu), testiväliaineen suolapitoisuus (jos se on mitattu) ja mahdolliset muut mittaukset — testiastioissa olevan veden laatu: pH, kovuus, lämpötila ja liuenneen hapen pitoisuus — yksityiskohtaiset tiedot ruokinnasta (esim. rehu(je)n tyyppi, alkuperä, annettu määrä ja antotaajuus) Yksittäin (tai rinnakkaisnäyteperusteella) ja tarvittaessa keskiarvoina ja variaatiokertoimina ilmoitetut seuraavia tutkittavia ominaisuuksia koskevat tulokset: — näyttö siitä, että kontrollit täyttävät yleiset testilajin elinkyvyn hyväksyttävyyttä koskevat vaatimukset (lisäys 2) — kuolleisuustiedot kussakin vaiheessa (alkio, toukka ja juveniili) ja kertyvä kuolleisuus — päivää kuoriutumiseen, kuoriutuneiden toukkien lukumäärä kunakin päivänä ja kuoriutumisen päättyminen — terveiden kalojen lukumäärä testin lopussa — eloonjääneiden eläinten pituus (on ilmoitettava, onko kyseessä vakio- vai kokonaispituus) ja paino — mahdollisten epämuodostumien ilmaantuvuus, kuvaus ja lukumäärä — mahdollisten käyttäytymismuutosten ilmaantuvuus, kuvaus ja lukumäärä — tilastollinen analyysimenetelmä (regressio- tai varianssianalyysi) ja tietojenkäsittelymenetelmä (käytetty tilastollinen testi tai malli) — pitoisuus, josta ei aiheudu vaikutuksia kullekin arvioidulle vasteelle (NOEC) — pienin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus (p = 0,05) kullekin arvioidulle vasteelle (LOEC) — tarvittaessa ECx kullekin arvioidulle vasteelle ja luottamusvälit (esim. 90 tai 95 prosenttia) sekä kaavio sen laskentaan käytetystä sovitetusta mallista, pitoisuus-vastekäyrän kaltevuus, regressiomallin kaava, estimoidut mallimuuttujat ja niiden vakiovirheet. Kaikki poikkeamat testimenetelmästä Tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin Taulukko 1 Kalalajit, joita suositellaan käytettäväksi testissä MAKEAN VEDEN KALAT SUISTO- JA MERIKALAT Oncorhynchus mykiss Kirjolohi Cyprinodon variegatus Loistohammaskarppi Pimephales promelas Rasvapäämutu Menidia sp. Hopeakylki Danio rerio Seeprakala Oryzias latipes Medaka LÄHDEKIRJALLISUUS (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 171, OECD, Pariisi. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD, Pariisi. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88, 26 s. (4) Brauhn, J. L. ja Schoettger, R. A. (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W. A. ja Jones, B. R. (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici ja muut (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593–599. (7) Hutchinson, T. H. ja muut (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69–92. (8) Tässä liitteessä oleva C.20 luku. Lisääntymistesti vesikirpulla (Daphnia magna). (9) Hansen, D. J. ja Parrish, P. R. (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (toim. Mayer, F. L. ja Hamelink, J. L.), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B. ja muut (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. ja muut (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E. W. ja muut (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C. (13) Oris, J. T, Belanger, S. C. ja Bailer, A. J. (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370–376. (14) OECD (2006), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: OECD environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Pariisi. (15) Rao, J. N. K. ja Scott, A. J. (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577–585. (16) Rao, J. N. K. ja Scott, A. J. (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373–1385. (17) Dunnett, C. W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096–1121. (18) Dunnett, C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491. (19) Rand, G. M. ja Petrocelli, S. R. (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J. T., Sullivan, J. H. ja Pearson, J. G. (1980), Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Lisäys 1 MÄÄRITELMÄT ECx (Effect concentration for x % effect): Pitoisuus, joka aiheuttaa x prosentin suuruisen vaikutuksen testiorganismeihin tietyn altistusjakson aikana kontrolliin verrattuna. Esimerkiksi EC50 on pitoisuus, jolla estimoidaan olevan 50 prosentin vaikutus testissä tutkittavaan ominaisuuteen altistuksen kohteeksi joutuneessa populaatiossa määritellyn altistusajan kuluessa. IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): Kansainvälinen puhtaan ja sovelletun kemian liitto. Kemikaali: Aine tai seos. Kokonaispituus: Pituus kuonon kärjestä pyrstöevän pitemmän lohkon kärkeen; mitataan yleensä siten, että lohkot on puristettu keskilinjaa vasten. Kyseessä on suoran viivan mittaus, ruumiin kaarevuutta ei oteta mukaan. (www.fishbase.org) Kuva 1 Kuvaus käytetyistä pituuksista. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration): Pienin testikemikaalin testattu pitoisuus, jolla kemikaalin havaitaan aiheuttavan tilastollisesti merkitsevän vaikutuksen (p < 0,05) verrattuna kontrolliin. Ehtona on myös, että kaikilla LOEC-pitoisuutta suuremmilla testipitoisuuksilla on vähintään yhtä suuri haitallinen vaikutus kuin LOEC-pitoisuudella. Jos nämä kaksi ehtoa eivät täyty, on annettava tyhjentävä selitys siitä, miten LOEC-pitoisuus (ja myös NOEC-pitoisuus) on valittu. Lisäyksissä 5 ja 6 annetaan ohjeita. Lovipituus: Pituus kuonon kärjestä pyrstöevän keskimmäisten ruotojen päähän. Sitä käytetään kaloilla, joilla on vaikea määrittää selkärangan päättymiskohtaa. (www.fishbase.org) NOEC (No Observed Effect Concentration): LOEC:tä pienempi testipitoisuus, jolla ei ole kontrolliin verrattuna tietyllä altistusajanjaksolla tilastollisesti merkitsevää vaikutusta (p < 0,05). SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification): SMILES-järjestelmä. Yksinkertaistettu kemikaalien esitysmuoto. Testikemikaali tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. UVCB (Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials): Koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksi reaktiotuote tai biologinen materiaali. Vakiopituus: Kalan pituus mitattuna kuonon kärjestä viimeisen nikaman takareunaan tai pyrstönikamien keskiosan takareunaan. Yksinkertaistettuna tässä mittauksessa pyrstöevän pituus jää pois. (www.fishbase.org) Lisäys 2 TESTIOLOSUHTEET, TESTIN KESTO JA ELOONJÄÄMISKRITEERIT SUOSITELLUILLE LAJEILLE LAJI TESTAUSOLOSUHTEET TESTIN SUOSITELTAVA KESTO Kontrollikalojen kokonaispituuden tyypillinen vähimmäiskeskiarvo tutkimuksen lopussa (mm) (98) KONTROLLIEN ELOONJÄÄNEISYYS (vähintään) Lämpötila (°C) Suolapitoisuus (0/00) Valoisa aika (t) Kuoriutuneisuus Kuoriutumisen jälkeinen eloonjääneisyys Makea vesi: Oncorhynchus mykiss Kirjolohi 10 ± 1,5 (99) 12–16 (100) kahden viikon kuluttua siitä, kun kontrollit hakevat itse ruokansa (tai 60 vrk kuoriutumisen jälkeen) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Rasvapäämutu 25 ±1,5 16 32 vrk testin alusta (tai 28 vrk kuoriutumisesta) 18 70 % 75 % Danio rerio Seeprakala 26 ±1,5 12–16 (101) 30 vrk kuoriutumisesta 11 70 % 75 % Oryzias latipes Medaka 25 ±2 12–16 (101) 30 vrk kuoriutumisesta 17 80 % 80 % Suisto- ja merikalalajit: Cyprinodon variegatus Loistohammaskarppi 25 ± 1,5 15–35 (102) 12–16 (101) 32 vrk testin alusta (tai 28 vrk kuoriutumisesta) 17 75 % 80 % Menidia sp. Hopeakylki 22–25 15–35 (102) 13 28 vrk 20 80 % 60 % Lisäys 3 SUOSITUSLAJIEN SIITOS- JA TESTIELÄINTEN RUOKINTA- JA KÄSITTELYOHJEET LAJIT RAVINTO (*9) KUORIUTUMISEN JÄLKEINEN SIIRTOAIKA AIKA ENSIMMÄISEEN RUOKINTAAN Siitoskalat Vastakuoriutuneet toukat Juveniilit Tyyppi Tiheys Makea vesi: Oncorhynchus mykiss Kirjolohi Kirjolohen rehu Ei mitään (1) Kirjolohen aloitusrehu BSN 2–4 ruokintaa päivässä 14–16 päivää kuoriutumisen jälkeen tai kun ne alkavat uida (ei olennaista) 19 päivää kuoriutumisen jälkeen tai kun ne alkavat uida Pimephales promelas Rasvapäämutu BSN, hiutalerehu, FBS BSN BSN48, hiutalerehu 2–3 kertaa päivässä Sen jälkeen, kun kuoriutuneisuus on 90 % 2 vrk kuoriutumisesta Danio rerio Seeprakala BSN, hiutalerehu Kaupallinen toukkarehu, alkueläimiä (2), proteiinia (3) BSN48, hiutalerehu BSN kerran päivässä: hiutalerehu kahdesti päivässä Sen jälkeen, kun kuoriutuneisuus on 90 % 2 vrk kuoriutumisesta Oryzias latipes Medaka hiutalerehu BSN, hiutalerehu (tai alkueläimiä tai rataseläimiä) BSN48, hiutalerehu (tai rataseläimiä) BSN kerran päivässä, hiutalerehu kahdesti päivässä tai hiutalerehu ja rataseläimiä kerran päivässä ei sovelleta 6–7 vrk kudusta Suisto- ja merikalalajit: Cyprinodon variegatus Loistohammaskarppi BSN, hiutalerehu FBS BSN BSN48 2-3 ruokintaa päivässä ei sovelleta 1 päivää kuoriutumisen jälkeen tai kun ne alkavat uida Menidia sp. Hopeakylki BSN48, hiutalerehu BSN BSN48 2-3 ruokintaa päivässä ei sovelleta 1 päivää kuoriutumisen jälkeen tai kun ne alkavat uida Lisäys 4 JOITAKIN HYVÄKSYTTÄVÄN LAIMENNUSVEDEN KEMIALLISIA OMINAISUUKSIA Ainesosa Rajapitoisuus Hiukkaset 5 mg/l Orgaanisen hiilen kokonaismäärä 2 mg/l Ionisoitumaton ammoniakki l μg/1 Jäännöskloori l μg/10 Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden kokonaismäärä 50 ng/l Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden ja polykloorattujen bifenyylien kokonaismäärä 50 ng/l Orgaanisen kloorin kokonaismäärä 25 ng/l Alumiini l μg/1 Arseeni l μg/1 Kromi l μg/1 Koboltti l μg/1 Kupari l μg/1 Rauta l μg/1 Lyijy l μg/1 Nikkeli l μg/1 Sinkki l μg/1 Kadmium 100 ng/l Elohopea 100 ng/l Hopea 100 ng/l Lisäys 5 TILASTOLLISIA OHJEITA NOEC-MÄÄRITYKSEEN Yleistä Analyysiyksikkö on rinnakkaistankki. Siten jatkuvissa mittauksissa, kuten koon mittauksessa, on laskettava rinnakkaisnäytteen keskiarvo tai mediaani, ja analyysissa käytetään näitä rinnakkaisarvoja. Testien voima on osoitettava mielellään jokaisen laboratorion aiempia riittäviä tuloksia koskevan tietokannan avulla. Käytettävässä tilastollisessa testissä on jokaista tutkittavaa ominaisuutta varten annettava vaikutuksen suuruus, joka voidaan havaita 75–80 prosentin voimalla. Tämän testausmenetelmän kehittämisajankohtana käytettävissä olevissa tietokannoissa ilmoitetaan mahdollinen voima suositeltavissa tilastomenetelmissä. Yksittäisen laboratorion on osoitettava kykynsä täyttää voimaa koskeva vaatimus joko tekemällä oma voima-analyysi tai osoittamalla, että kunkin vasteen variaatiokerroin ei ylitä testiohjeen laadinnassa käytettyjen variaatiokertoimien 90. prosenttipistettä. Kyseiset variaatiokertoimet esitetään taulukossa 1. Jos käytettävissä ovat ainoastaan rinnakkaisnäytteiden keskiarvot tai mediaanit, rinnakkaisnäytteiden sisäiset variaatiokertoimet voidaan jättää huomiotta. Taulukko 1 Valikoitujen makean veden lajien 90. prosenttipisteen variaatiokertoimet Laji Vaste Rinnakkaisnäytteiden välinen variaatiokerroin Rinnakkaisnäytteiden sisäinen variaatiokerroin Kirjolohi Pituus 17,4 9,8 Paino 10,1 28 Rasvapäämutu Pituus 16,9 13,5 Paino 11,7 38,7 Seeprakala Pituus 43,7 11,7 Paino 11,9 32,8 Lähes kaikissa laboratorioiden toksisuustutkimusten arvioinnissa käytettävissä tilastollisissa testeissä kiinnostuksen kohteena on vertailla käsittelyryhmiä kontrolleihin. Tästä syystä ei ole asianmukaista vaatia merkitsevää ANOVA-F-testiä, ennen kuin käytetään Dunnettin tai Williamsin testiä, taikka merkitsevää Kruskal-Wallisin testiä, ennen kuin käytetään Jonckheere-Terpstran, Mann-Whitneyn tai Dunnin testiä (Hochberg ja Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson ja muut 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Dunnettin testiin on etukäteen määritetty kerrannaisuuskorjaus, jolloin sen väärien positiivisten ja väärien negatiivisten tulosten osuuksiin vaikuttaa haitallisesti F-testin käyttäminen portinvartijana. Vastaavasti Williamsin ja Jonckheere-Terpstran vertailutesteissä, joissa käytetään 0,05:n merkitsevyystasoa jokaisessa vaiheessa, väärien positiivisten tulosten kokonaisosuus pysyy 5 prosentissa, mihin, samoin kuin testien voimaan, vaikuttaa haitallisesti F-testin tai Kruskal-Wallisin testin käyttäminen portinvartijana. Mann-Whitneyn ja Dunnin testejä on korjattava kerrannaisuuden osalta, ja siihen suositellaan Bonferroni-Holmin korjausta. OECD:n julkaisussa (2006) käsitellään hypoteesitestausta ja testien perustana olevien olettamusten todentamista koskevia suosituksia yksityiskohtaisesti, ja siinä on myös laaja kirjallisuusluettelo. Kontrollien käsittely liuottimen yhteydessä Jos käytetään liuotinta, testiin on otettava sekä laimennusvesikontrolli että liuotinkontrolli. Näitä kahta kontrollia on verrattava jokaisen vasteen osalta, ja tulokset on yhdistettävä tilastollista analyysia varten, ellei kontrollien välillä ole merkitsevää eroa. Muutoin NOEC:n määritykseen tai ECx:n estimointiin on käytettävä liuotinkontrollia, eikä vesikontrollia käytetä. Ks. rajoitus validiteettikriteereissä (7 kohta). T-testiä tai Mann-Whitneyn testiä on käytettävä vertaamaan laimennusvesikontrollia ja liuotinkontrollia pituuden, painon, kuoriutuneisuuden, toukkakuolleisuuden tai epänormaalien toukkien osuuden sekä kuoriutumisen ensimmäisen ja viimeisen päivän tai uimaan lähdön osalta 0,05:n merkitsevyystasolla ottamatta käsittelyryhmiä huomioon. Näiden testien tulokset on raportoitava. Kokomittaukset (pituus ja paino) Yksittäisten kalojen pituus- ja painoarvot voivat olla normaali- tai log-normaalijakaumalla. Kummassakin tapauksessa rinnakkaisnäytteiden keskiarvot ovat yleensä normaalijakaumalla keskeisen raja-arvolauseen nojalla, mikä on vahvistettu runsaasti yli 100 ELS-tutkimuksessa kolmella makean veden lajilla. Vaihtoehtoisesti, jos tiedot tai aiemmat tietokannat viittaavat yksittäisten kalojen kokoarvojen log-normaalijakaumaan, voidaan laskea yksittäisten kalojen arvojen rinnakkaisnäytteiden logaritminen keskiarvo, minkä jälkeen analyysitietoja voidaan käyttää rinnakkaisnäytteiden logaritmisen keskiarvon anti-logina. Tietojen yhdenmukaisuus normaalijakauman ja varianssien homogeenisuuden kanssa on arvioitava. Tätä varten on käytettävä ANOVA-mallin jäännöksiä siten, että pitoisuudet ovat ainoa selittävä luokkamuuttuja. Visuaalista määritystä hajontakaavioiden ja pylväsdiagrammien tai lehti-ruoti-kuvioiden avulla voidaan käyttää. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää virallista testiä, kuten Shapiro-Wilkin tai Anderson-Darlingin testiä. Yhdenmukaisuus varianssien homogeenisuuden kanssa voidaan arvioida samasta hajontakaaviosta visuaalisesti tai virallisesti Levenen testillä. Vain parametritesteissä (kuten Williams, Dunnett) on arvioitava normaalius tai varianssien homogeenisuus. Mahdollisiin poikkeaviin havaintoarvoihin ja niiden vaikutukseen analyysissa on kiinnitettävä huomiota. Tukeyn poikkeavien havaintoarvojen testiä ja samojen edellä kuvattujen jäännöskaavioiden visuaalista tarkastelua voidaan käyttää. On muistettava, että havainnot koskevat kokonaisia rinnakkaisnäytteitä, joten poikkeavan havaintoarvon pois jättäminen analyysistä on tehtävä vasta huolellisen harkinnan jälkeen. Tilastolliset testit, joissa hyödynnetään testijärjestelyn ominaispiirteitä ja biologisia odotuksia, ovat alaspäin askeltavia trenditestejä, kuten Williams ja Jonckheere-Terpstra. Testeissä on oletuksena monotoninen pitoisuus-vaste, ja on arvioitava, ovatko tiedot yhdenmukaisia tämän olettaman kanssa. Se voidaan tehdä visuaalisesti rinnakkaisnäytteiden keskiarvojen hajontakaaviosta verrattuna testipitoisuuteen. On avuksi asettaa hajontakaavion päälle paloittain lineaarinen kaavio, jossa yhdistetään rinnakkaisnäytteen näytekoolla painotetut pitoisuuden keskiarvot. Jos paloittainen lineaarinen kaavio poikkeaa suuresti monotonisuudesta, on ehkä tarpeen käyttää muita kuin trenditestejä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää virallisia testejä. Yksinkertainen virallinen testi on laskea pitoisuuskeskiarvojen lineaariset ja kvadraattiset kontrastit. Jos kvadraattinen kontrasti on merkitsevä ja lineaarinen kontrasti ei, se on merkki mahdollisesta monotonisuusongelmasta, jota on arvioitava kaavioista tarkemmin. Jos normaalius tai varianssien homogeenisuus voi olla ongelma, kontrastit voidaan konstruoida sijatunnusmuunnetuista tiedoista. Vaihtoehtoisia menettelyjä, kuten Bartholomewin monotonisuustestiä, voidaan käyttää, mutta ne lisäävät kompleksisuutta. Kuva 2 NOEC-vuokaavio koon mittauksista (pituus ja paino). Paitsi jos tiedot eivät ole yhdenmukaisia näitä testejä koskevien vaatimusten kanssa, NOEC määritetään soveltamalla alaspäin askeltavia Williamsin tai Jonckheere-Terpstran testejä. OECD:n julkaisussa (2006) annetaan näistä menettelyistä yksityiskohtaiset tiedot. Jos tiedot eivät ole yhdenmukaisia alaspäin askeltavien testien vaatimusten kanssa, voidaan käyttää Dunnettin testiä tai Tamhane-Dunnettin testiä (T3), joissa kummassakin on etukäteen määritetyt kerrannaisuuskorjaukset. Näissä testeissä oletuksena on normaalius ja Dunnettin tapauksessa varianssien homogeenisuus. Jos kyseiset edellytykset eivät täyty, voidaan käyttää Dunnin parametritonta testiä. OECD:n julkaisussa (2006) on yksityiskohtaiset tiedot kaikista näistä testeistä. Kuvassa 2 on yleiskatsaus testin valintaan. Mätimunien kuoriutuminen ja toukkien eloonjääminen Tiedot koskevat kuoriutuvien mätimunien tai eloonjäävien toukkien osuuksia yksittäisissä rinnakkaisnäytteissä. Osuuksista on arvioitava ylihajonta, joka on tavallista muttei vallitsevaa tällaisissa mittauksissa. Kuvan 3 vuokaaviossa on ohjeita testin valintaan; yksityiskohtaiset kuvaukset on annettu tekstissä. Kahta testiä käytetään yleisesti. Ne ovat Taronen C(α)-testi (Tarone 1979) ja Khin neliö -testi, joita kumpaakin sovelletaan erikseen jokaiseen testipitoisuuteen. Jos ylihajontaa löydetään yhdessäkin testipitoisuudessa, on käytettävä menetelmiä, joissa se voidaan ottaa huomioon. Kaava 1 Taronen C(α)-testi (Tarone 1979) jossa ̂ on tietyn pitoisuuden keskimääräinen osuus, m on rinnakkaistankkien lukumäärä, nj on kohteiden lukumäärä rinnakkaisnäytteessä j, ja xj on kyseisessä rinnakkaisnäytteessä vasteen antavien eli esim. kuoriutumattomien tai kuolleiden kohteiden lukumäärä. Testiä sovelletaan kuhunkin pitoisuuteen erikseen. Testiä voidaan pitää Khin neliö -testin sovelluksena, mutta rajoitetulla voimalla Taronella tehdyt simulaatiot ovat osoittaneet, että se on tehokkaampi kuin Khin neliö -testi. Kuva 3 NOEC-vuokaavio. Mätimunien kuoriutuminen ja toukkakuolleisuus. Jos ylihajonnasta ei ole merkitsevää näyttöä, voidaan käyttää Cochran-Armitagen vertailutestiä. Tässä testissä rinnakkaisnäytteitä ei oteta huomioon, joten jos ylihajonnasta on näyttöä, suositellaan Cochran-Armitagen testin Rao-Scott-korjausta (RSCA), jossa rinnakkaisnäytteet, rinnakkaisnäytekoot ja ylihajonta otetaan huomioon. Vaihtoehtoisia testejä ovat muun muassa Williamsin ja Jonckheere-Terpstran vertailutestit ja Dunnettin testi, kuten edellä on kuvattu koon mittauksissa. Näitä testejä sovelletaan ylihajonnasta riippumatta, mutta niiden voima on hieman alhaisempi (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao ja Scott 1992, 1999, Fung ja muut 1994, 1996). Ensimmäinen tai viimeinen kuoriutumispäivä tai uimaan lähtö Vaste on kokonaisluku, joka ilmoittaa testipäivän, jona mainitut havainnot on tehty tietyssä rinnakkaistankissa. Arvojen vaihteluväli on yleensä hyvin rajoitettu, ja toisiinsa sidottujen arvojen osuus on usein hyvin suuri. Esimerkiksi sama ensimmäinen kuoriutumispäivä havaitaan kaikissa rinnakkaiskontrolleissa ja ehkä yhdessä tai kahdessa alhaisen testipitoisuuden näytteessä. Parametritestitestit, kuten Williams ja Dunnett, eivät sovellu tällaisten tietojen käsittelyyn. Jonckheere-Terpstran vertailutestillä havaitaan erittäin tehokkaasti testikemikaalin vaikutukset, ellei ole näyttöä vakavasta monotonisuuden puutteesta. Muussa tapauksessa voidaan käyttää Dunnin testiä. Toukkien epämuodostumat Vaste on jollain lailla epänormaaleiksi todettujen toukkien lukumäärä. Vaste on usein hyvin alhainen, ja siihen liittyy joitakin samoja ongelmia kuin ensimmäiseen kuoriutumispäivään, ja toisinaan pitoisuusvaste on epäsäännöllinen. Jos tiedot ainakin pääpiirteittäin noudattavat monotonista pitoisuusmuotoa, testikemikaalin vaikutukset havaitaan erittäin tehokkaasti Jonckheere-Terpstran vertailutestillä. Muussa tapauksessa voidaan käyttää Dunnin testiä. VIITTEET Agresti, A. (2002), Categorical Data Analysis, 2. laitos, Wiley, Hoboken. Dunnett, C. W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of American Statistical Association, 50, 1096–1121. Dunn, O. J. (1964), Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241–252. Dunnett, C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482–491. Fung, K. Y., Krewski, D., Rao, J. N. K., Scott, A. J. (1994), Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639–648. Fung, K. Y, Krewski, D., Smythe, R. T. (1996), A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431–454. Hochberg, Y. ja Tamhane, A. C. (1987), Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J. C. (1996), Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere, A. R. (1954), A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B. J. T. (1992), Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, Lontoo. OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Pariisi. Rao, J. N. K. ja Scott, A. J. (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577–585. Rao, J. N. K. ja Scott, A. J. (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373–1385. Robertson, T., Wright, F. T. ja Dykstra, R. L. (1988), Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R. E. (1979), Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585–590. Williams, D. A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103–117. Williams, D. A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519–531. Williams, D. A. (1975), The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949–952. Williams, D. A. (1977), Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9–14. Lisäys 6 REGRESSIOESTIMAATTEJA KOSKEVIA TILASTOLLISIA OHJEITA Yleistä Mallin sovittamiseen käytettäviä havaintoja ovat rinnakkaisnäytteiden keskiarvot (pituus ja paino) tai rinnakkaisnäytteiden suhteelliset osuudet (mätimunien kuoriutuminen ja toukkakuolleisuus) (OECD 2006). Yleisesti suositellaan painotettua regressiota, jossa painona käytetään rinnakkaisnäytteen näytekokoa. Muut painotusjärjestelmät ovat mahdollisia, kuten painotus ennakoidulla keskivasteella tai sen ja rinnakkaisnäytteen näytekoon yhdistelmällä. Painotusta saman pitoisuuden sisäisen näytteen varianssin käänteisluvulla ei suositella (Bunke ja muut 1999, Seber ja Wild 2003, Motulsky ja Christopoulos 2004, Huet ja muut 2003). Jos vasteita muunnetaan ennen analyysia, on säilytettävä havaintojen riippumattomuus, ja ECx ja sen luottamusrajat on ilmaistava alkuperäisinä mittayksiköinä eikä muunnettuina yksiköinä. Esimerkiksi 20 prosentin muutos pituuden logaritmissa ei vastaa 20 prosentin muutosta pituudessa (Lyles ja muut 2008, Draper ja Smith 1999). Kuvan 4 kaaviossa esitetään yleiskatsaus ECx-estimaatteihin. Yksityiskohdat esitetään jäljempänä. Kuva 4 Vuokaavio – rinnakkaisnäytteiden keskipituuden tai -painon taikka mätimunien kuoriutumisosuuden tai toukkakuolleisuuden ECx-estimointi, ks. tarkemmin jäljempänä. Mätimunien kuoriutumista ja toukkakuolleisuutta koskevia näkökohtia Mätimunien kuoriutumiseen ja toukkakuolleisuuteen on yleensä paras sovittaa alenevaa mallia, ellei soviteta jäljempänä kuvattua probittimallia. On toisin sanoen mallinnettava kuoriutumatta jääneiden mätimunien tai kuolevien toukkien osuutta. Tämä johtuu siitä, että ECx viittaa pitoisuuteen, jossa muutos on x prosenttia kontrollin keskivasteesta. Jos kontrollimunista 5 prosenttia jää kuoriutumatta ja mallinnetaan kuoriutumatta jäämistä, EC20 viittaa pitoisuuteen, jossa muutos on 20 prosenttia kontrollien 5 prosentin kuoriutumatta jäämisestä, jolloin muutos on 0,2 × 0,05 = 0,01. Toisin sanoen kuoriutumatta jääneitä on 1 prosenttiyksikköä eli 6 prosenttia. Näin pientä muutosta ei voida mielekkäästi estimoida käytettävissä olevista tiedoista eikä se ole biologisesti merkitsevä. Jos sen sijaan mallinnetaan niiden mätimunien osuutta, jotka kuoriutuvat, kontrolliosuus on tässä esimerkissä 95 prosenttia, ja 20 prosentin vähennys kontrollin keskiarvosta vastaa muutosta 0,95 × 0,2 = 0,18, joten 95 prosentin kuoriutumismenestys muuttuu 77 prosentiksi (= 95 – 18). Tällöin pitoisuuden vaikutus voidaan estimoida, joten menetelmällä on oletettavasti enemmän arvoa. Kokomittauksissa tämä ei ole ongelma, vaikka haitalliset vaikutukset kokoon tarkoittavat yleensä koon pienenemistä. Kokoa (pituutta tai painoa) ja mätimunien kuoriutumismenestystä tai toukkien eloonjääntiä koskevat mallit Kaikki mallit on kuvattu ja niitä suositellaan OECD:n julkaisussa (2006), Brain-Cousensin hormeettista mallia lukuun ottamatta. Niin sanottuja OECD 2–5 -malleja käsitellään ekotoksisuustestien yhteydessä myös Slobin teoksessa (2002). Mahdollisesti hyödyllisiä malleja on luonnollisesti muitakin. Teoksessa Bunke ja muut (1999) luetellaan useita malleja, joita ei käsitellä tässä, ja muita malleja koskevia viitteitä on runsaasti. Jäljempänä ehdotettuja malleja pidetään erityisen hyvin sopivina ekotoksisuustesteihin, ja niitä käytetään laajalti. 5 testipitoisuutta ja kontrolli — Bruce-Versteeg — Yksinkertainen eksponentiaalinen (OECD 2) — Eksponentiaalinen muotoparametrilla (OECD 3) — Yksinkertainen eksponentiaalinen alarajalla (OECD 4) Vähintään 6 testipitoisuutta ja kontrolli — Eksponentiaalinen muotoparametrilla ja alarajalla (OECD 5) — Michaelis-Menten — Hill Jos hormeesista on visuaalista näyttöä (epätodennäköistä mätimunien onnistuneen kuoriutumisen tai toukkien eloonjäännin yhteydessä, mutta kokohavainnoissa sitä havaitaan toisinaan) — Brain-Cousens hormeettinen; (Brain ja Cousens 1989) Mätimunien kuoriutumisen epäonnistumista ja toukkakuolleisuutta koskevia vaihtoehtoisia malleja — Näitä vasteita koskevat ylenevät mallit voidaan sovittaa probitti- (tai logistisilla) malleilla, ellei ylihajonnasta ole näyttöä ja kontrolli-ilmaantuvuus estimoidaan sovitetussa mallissa. Tämä ei ole parhaana pidetty menetelmä, koska siinä analyysiyksikkönä pidetään yksilöä, ei rinnakkaisnäytettä (Morgan 1992, O'Hara Hines ja Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Yhden ainoan mallin sopivuus — Verrataan havaittua ja ennakoitua prosentuaalista pienenemistä visuaalisesti kussakin testipitoisuudessa (Motulsky ja Christopoulos 2004, Draper ja Smith 1999). — Verrataan regressiokeskineliövirhettä puhtaaseen keskineliövirheeseen käyttämällä F-testiä (Draper ja Smith 1999). — Tarkistetaan, että mallin jokainen tekijä poikkeaa merkitsevästi nollasta (ts. on määritettävä, ovatko mallin kaikki tekijät merkittäviä) (Motulsky ja Christopoulos 2004). — Regressiojäännöskaaviot v. testipitoisuus, mahdollisesti log(pitoisuus)-asteikolla. Kaaviolla ei pitäisi olla kaavaa; pisteiden on oltava satunnaisesti siroteltuna vaakasuoran viivan ympärille nollan korkeudella. — Tietojen normaalius ja varianssien homogeenisuus on arvioitava lisäyksessä 5 esitetyllä tavalla. — Arvioidaan lisäksi regressiomallin jäännösten normaalius käyttämällä samoja menetelmiä kuin lisäyksessä 5 esitetään ANOVA-jäännöksille. Mallien vertailu — Käytetään Akiaken korjattua informaatiokriteeriä (AICc). Pienet AICc-arvot ovat merkki hyvästä sopivuudesta, ja jos AICc(B) – AICc(A) ≥ 10, malli A on lähes varmasti parempi kuin malli B (Motulsky ja Christopoulos (2004). — Verrataan kahta mallia visuaalisesti, jotta nähdään, kuinka hyvin ne täyttävät edellä annetut yhtä ainoaa mallia koskevat kriteerit. — Parsimoniaperiaate on suositeltava; sen mukaan käytetään yksinkertaisinta mallia, joka soveltuu tietoihin kohtuullisen hyvin (Ratkowsky 1993, Lyles ja muut 2008). ECx-estimaatin laatu ECx:n luottamusväli ei saa olla liian suuri. Tilastollista harkintaa tarvitaan sen ratkaisemiseen, kuinka suuri luottamusväli voi olla, jotta ECx on edelleen hyödyllinen. Mätimunien kuoriutumis- ja kokotietoihin sovitetuilla regressiomalleilla tehdyt simulaatiot osoittavat, että ECx:n (x = 10, 20 tai 30) 75 prosentin luottamusväli ulottuu enintään kahteen testipitoisuuteen. Näin saadaan yleisohje siitä, mikä on hyväksyttävää, ja käytännön ohje siitä, mikä on saavutettavissa. Lukuisat kirjoittajat vahvistavat tarpeen ilmoittaa kaikkien parametrien luottamusvälit ja sen, että malliparametrien suuret luottamusvälit ovat merkki malleista, joita ei voida hyväksyä (Ott ja Longnecker 2008, Alvord ja Rossio 1993, Motulsky ja Christopoulos 2004, Lyles ja muut 2008, Seber ja Wild 2003, Bunke ja muut 1999, Environment Canada 2005). ECx:n (tai minkään muun malliparametrin) luottamusväli ei saa sisältää nollaa (Motulsky ja Christopoulos (2004). Tämä on pienintä merkitsevää eroa vastaava regressio, joka mainitaan usein hypoteesitestausmenetelmissä (esim. Wang ja muut 2000). Se vastaa myös keskiarvovasteita LOEC-arvossa, joka ei sisällä kontrollikeskiarvoa. Parametriestimaattien tieteellistä uskottavuutta on pohdittava. Jos esim. y0:n luottamusväli on ± 20 prosenttia, mikään EC10-estimaatti ei ole uskottava. Jos mallissa ennakoidaan 20 prosentin vaikutus pitoisuudella C ja C:n ja sitä pienemmillä pitoisuuksilla havaittu maksimivaikutus on 10 prosenttia, EC20 ei ole uskottava (Motulsky ja Christopoulos 2004, Wang ja muut 2000, Environment Canada 2005). ECx:n määrittäminen ei saa edellyttää ekstrapolointia positiivisten pitoisuuksien vaihteluvälin ulkopuolella (Draper ja Smith 1999, OECD 2006). Yleisohjeena voidaan esimerkiksi pitää, että ECx on enintään 25 prosenttia pienimmän testatun pitoisuuden alapuolella tai suurimman testatun pitoisuuden yläpuolella. VIITTEET Alvord, W. G., Rossio, J. L. (1993), Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155–163. Brain, P. ja Cousens, R. (1989), An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93–96. Bunke, O., Droge, B. ja Polzehl, J. (1999), Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197–240. Collett, D. (2002), Modelling Binary Data, 2. laitos, Chapman and Hall, Lontoo. Collett, D. (2003), Modelling Survival Data in Medical Research, 2. laitos, Chapman and Hall, Lontoo. Draper, N. R. ja Smith, H. (1999), Applied Regression Analysis, 3. laitos. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005), Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46. Huet, S., Bouvier, A., Poursat, M.-A., Jolivet, E. (2003), Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., Poindexter, C., Evans, A., Brown, M. ja Cooper, C. R. (2008), Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials, marraskuu 2008, 29(6): 878–886. Morgan, B. J. T. (1992), Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, Lontoo. Motulsky, H., Christopoulos, A. (2004), Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. ja Lawless, J. F. (1993), Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics nide 49, s. 107–121. OECD (2006), Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Pariisi. Ott, R. L., Longnecker, M. T. (2008), An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, 6. laitos, Brooks-Cole, Belmont, CA. Ratkowsky, D. A. (1993), Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195–199. Seber, G. A. F., Wild, C. J. (2003), Nonlinear Regression, Wiley. Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298–312. Wang, Q., Denton, D. L. ja Shukla, R. (2000), Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, nide 19, s. 113–117, 2000. C.48 Kalojen lyhytaikainen lisääntymistutkimus JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 229 (2012). Oli tarpeen kehittää ja validoida kalatutkimus, jolla pystytään havaitsemaan hormonitoimintaan vaikuttavia kemikaaleja, koska kemikaalien ympäristöpitoisuuksista saattaa aiheutua haittavaikutuksia sekä ihmisille että eläimille kemikaalien ja hormonijärjestelmän välisen vuorovaikutuksen vuoksi. Vuonna 1998 OECD aloitti ensisijaisena toimenpiteenä olemassa olevien ohjeiden uudistamisen ja uusien ohjeiden laatimisen mahdollisten hormonitoimintaa häiritsevien aineiden seulontaa ja testausta varten. Yksi toimenpiteen osa oli laatia testiohjeet kalojen hormonijärjestelmään vaikuttavien kemikaalien seulontaan. Kalojen lyhytaikainen lisääntymistutkimus on hyväksytty laaja-alaisessa validointiohjelmassa. Siihen sisältyi laboratorioiden välisiä tutkimuksia tietyillä kemikaaleilla, ja tutkimusten tavoitteena oli osoittaa määritysmenetelmän tarkkuus ja luotettavuus sellaisten kemikaalien havaitsemisessa, jotka vaikuttavat kalojen lisääntymiseen eri mekanismeilla, mukaan luettuina hormonijärjestelmään kohdistuvat vaikutustavat (1, 2, 3, 4, 5). Kaikki OECD:n testiohjeessa mainitut tutkittavat ominaisuudet on validoitu rasvapäämudulla, ja osa ominaisuuksista on validoitu medakalla (ts. vitellogeniini ja sekundaariset sukupuoliominaisuudet) ja seeprakalalla (vitellogeniini). Validoinnin vertaisarvioi osittain asiantuntijaryhmä, jonka nimittivät testiohjeohjelman kansalliset koordinaattorit (6), ja riippumaton asiantuntijaryhmä Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston toimeksiannosta (29). Määritysmenetelmää ei ole tarkoitettu erityisesti hormonitoimintaa häiritsevien mekanismien tunnistamiseen, sillä koe-eläimillä on ehjä hypotalamus-aivolisäke-sukurauhasakseli (HPG-akseli). Se saattaa reagoida kemikaaleihin, jotka vaikuttavat HPG-akseliin eri pitoisuuksilla. 2. Tässä testimenetelmässä kuvataan in vivo -seulontamenetelmä, jossa sukukypsiä koiraskaloja ja kutevia naaraskaloja pidetään yhdessä ja altistetaan kemikaalille tietyn ajan niiden elinkaaresta (21 päivää). Kahdenkymmenenyhden päivän pituisen altistusjakson lopussa koirailta ja naarailta mitataan kaksi biomarkkeriominaisuutta, joita pidetään indikaattoreina testikemikaalin hormonijärjestelmään kohdistuvasta vaikutuksesta; mitattavat ominaisuudet ovat vitellogeniini ja sekundaariset sukupuoliominaisuudet. Vitellogeniini mitataan rasvapäämudulta, medakalta ja seeprakalalta, kun taas sekundaariset sukupuoliominaisuudet mitataan rasvapäämudulta ja medakalta. Lisäksi määrällistä hedelmällisyyttä seurataan päivittäin koko testin ajan. Myös sukurauhaset säilytetään, ja histopatologia voidaan arvioida testieläinten lisääntymiskunnon arvioimiseksi ja muiden tutkittavien ominaisuuksien todistusarvon lisäämiseksi. 3. Tämä biotesti on lisääntymiskyvyn in vivo -seulontatesti ja sen soveltamista on tarkasteltava osana hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskevaa OECD:n käsitekehystä (OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (30). Tässä käsitekehyksessä kalojen lyhytaikaista lisääntymistutkimusta ehdotetaan tasolla 3 in vivo -tutkimuksena, joka antaa tietoa valikoiduista hormonijärjestelmän mekanismeista/reiteistä. ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET 4. Munimalla lisääntyvien selkärankaisten naaraiden maksa tuottaa yleensä vitellogeniinia (VTG) verenkierrossa olevan endogeenisen estrogeenin avulla. Se on munankeltuaisen proteiinien esiaste, ja kun maksa on tuottanut sitä, se kulkeutuu verenkierrossa munasarjoihin, joissa kehittyvät munasolut ottavat sen sisäänsä ja muokkaavat sitä. Epäkypsien naaras- ja koiraskalojen plasmassa vitellogeniinia on lähes mahdoton havaita, koska niillä ei ole riittävästi estrogeenia verenkierrossaan. Maksa voi kuitenkin syntetisoida ja erittää vitellogeniinia eksogeenisen estrogeenistimulaation avulla. 5. Vitellogeniinin mittauksella voidaan havaita kemikaaleja, joilla on erilaisia estrogeeniin liittyviä vaikutustapoja. Estrogeeniin vaikuttavien kemikaalien havaitseminen on mahdollista mittaamalla vitellogeniinin kehittymistä koiraskaloissa, ja sitä on dokumentoitu runsaasti tieteellisessä vertaisarvioidussa kirjallisuudessa (esimerkiksi (7)). Vitellogeniinin kehittymistä on osoitettu myös aromatisoituville androgeeneille altistumisen jälkeen (8, 9). Naaraskalojen verenkierron estrogeenipitoisuus pienentyy esimerkiksi, kun aromataasia estetään muuntamasta endogeenista androgeenia luonnolliseksi estrogeeniksi, 17β-estradioliksi. Tällöin myös vitellogeniinitaso laskee, ja tätä käytetään aromataasia estäviä ominaisuuksia sisältävien kemikaalien havaitsemiseen (10, 11). Estrogeenin/aromataasin estämisen aiheuttaman vitellogeniinivasteen biologinen merkityksellisyys on osoitettu, ja se on dokumentoitu laajalti. On kuitenkin mahdollista, että vitellogeniinin tuotantoon naarailla voivat vaikuttaa myös yleinen toksisuus ja muuhun kuin hormonijärjestelmään kohdistuvat myrkylliset vaikutustavat (esimerkiksi hepatotoksisuus). 6. Useita mittausmenetelmiä on kehitetty onnistuneesti, ja ne on myös vakioitu rutiinikäyttöön. Esimerkkinä tästä ovat lajikohtaiset entsyymivälitteiset immunosorbenttimääritysmenetelmät (ELISA), joissa vitellogeniinin määrä määritetään immunokemian avulla yksittäisiltä kaloilta otetuista veri- tai maksanäytteistä (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Rasvapäämudun verestä, seeprakalan verestä tai pään/pyrstön homogenaatista sekä medakan maksasta otetaan näytteitä vitellogeniinin mittausta varten. Medakalla verestä ja maksasta mitattujen vitellogeniiniarvojen välinen korrelaatio on hyvä (19). Lisäyksessä 6 on esitetty suositeltavat näytteenottomenetelmät vitellogeniinianalyysia varten. Vitellogeniinin mittaukseen tarkoitettuja testipaketteja on saatavilla laajalti, ja niiden on perustuttava validoituun lajikohtaiseen ELISA-menetelmään. 7. Tiettyjen lajien koiraskaloilla sekundaariset sukupuoliominaisuudet ovat ulkoisesti näkyviä, ja ne ovat kvantifioitavissa ja vastaavat verenkierron endogeenisten androgeenien pitoisuutta rasvapäämudulla ja medakalla mutta eivät seeprakalalla, koska sillä ei ole kvantifioitavia sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia. Naarailla on kyky kehittää koiraan sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia, kun ne altistuvat androgeenisesti vaikuttaville kemikaaleille vedessä. Tieteellisessä kirjallisuudessa on useita tutkimuksia, joissa dokumentoidaan tämäntyyppisestä vasteesta rasvapäämudulla (20) ja medakalla (21). Koiraskalojen sekundaaristen sukupuoliominaisuuksien vähenemisen tulkinnassa on syytä olla varovainen heikon tilastollisen voiman takia, ja sen on perustuttava asiantuntijan arvioon ja näyttöön perustuvaan toimintatapaan. Seeprakalan käyttöön tässä määrityksessä liittyy rajoituksia, koska sillä ei ole kvantifioitavia sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia, jotka reagoivat androgeenisesti vaikuttaviin kemikaaleihin. 8. Rasvapäämudulla eksogeenisen androgeenialtistuksen pääindikaattori on naaraskalan kuonossa sijaitsevien kutukyhmyjen lukumäärä. Medakalla tärkein merkki eksogeenisesta altistumisesta androgeenisesti vaikuttaville kemikaaleille on naaraskalojen sukuelinpapillien lukumäärä. Lisäyksissä 5A ja 5B esitetään suositeltavat menetelmät rasvapäämudun ja medakan sukupuoliominaisuuksien arvioimiseksi. 9. Kahdenkymmenenyhden päivän kalatutkimukseen sisältyy määrällisen mätimunatuotannon arviointi ja sukurauhasten säilyttäminen valinnaista histopatologista tutkimusta varten. Jotkin sääntelyviranomaiset saattavat vaatia tätä lisäominaisuutta tutkittavaksi, jotta testieläinten lisääntymiskuntoa voidaan arvioida täydellisesti, tai tapauksissa, joissa vitellogeniini ja sekundaariset sukupuoliominaisuudet eivät vastaa kemiallista altistusta. Vaikka jotkin tutkittavat ominaisuudet saattavat olla erittäin diagnosoivia (kuten vitellogeniinin indusointi uroksissa ja kyhmyjen muodostuminen naaraissa), kaikkien tutkittavien ominaisuuksien ei ole tarkoitus riidattomasti tunnistaa tiettyjä solunsisäisiä toimintamekanismeja. Pikemminkin kaikki tutkittavat ominaisuudet yhdessä antavat mahdollisuuden päätellä, että hormonijärjestelmään saattaa kohdistua häiriöitä, ja sitä kautta saadaan ohjausta jatkotestauksiin. Vaikka hedelmällisyys ei liity yksinomaan hormonijärjestelmään, se on tärkeä tutkittava ominaisuus, koska sen on osoitettu reagoivan herkästi tunnettuihin hormonijärjestelmään vaikuttaviin kemikaaleihin (5). Jos kemikaali ei vaikuta hedelmällisyyteen ja muihin ominaisuuksiin, voidaan suhtautua luottavaisemmin siihen, että yhdiste ei todennäköisesti vaikuta hormonijärjestelmään. Jos kemikaali kuitenkin vaikuttaa hedelmällisyyteen, se lisää voimakkaasti päättelyn todistusarvoa. Jäljempänä tässä testimenetelmässä annetaan ohjeita tietojen tulkintaa ja testitulosten hyväksymistä varten. 10. Tässä testimenetelmässä käytetyt määritelmät ovat lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 11. Lisääntymistilassa olevat koiras- ja naaraskalat altistetaan testiastioissa yhdessä. Kumpikin sukupuoli voidaan erottaa selvästi aikuisuuden ja lisääntymistilan perusteella, joten kukin tutkittava ominaisuus voidaan analysoida sukupuolikohtaisesti, ja myös sukupuolikohtainen herkkyys eksogeenisille kemikaaleille voidaan selvittää varmasti. Testin päätteeksi sukupuoli vahvistetaan sukurauhasten makroskooppisella tutkimuksella, joka tehdään avaamalla kala saksilla vatsan puolelta. Yhteenveto biologisen testin oleellisista olosuhteista on lisäyksessä 2. Yleensä testi aloitetaan kalalla, joka on otettu kutuikäisestä populaatiosta; vanhoja kaloja ei pidä käyttää. Ohjeita kalan iän ja lisääntymistilan selvittämiseen on kohdassa Kalan valinta. Testi tehdään käyttäen kolmea kemikaalialtistuksen pitoisuutta ja vesikontrollia sekä tarvittaessa liuotinkontrollia. Seeprakalan kanssa käytetään kahta astiaa tai rinnakkaisnäytettä käsittelykertaa kohti (kukin astia sisältää viisi koirasta ja viisi naarasta). Rasvapäämudun kanssa käytetään neljää astiaa tai rinnakkaisnäytettä käsittelykertaa kohti (kukin astia sisältää kaksi koirasta ja neljä naarasta). Tällä tavalla voidaan ottaa huomioon rasvapäämutukoiraan reviirikäyttäytyminen ja samalla säilyttää testin riittävä voima. Medakan kanssa käytetään neljää astiaa tai rinnakkaisnäytettä käsittelykertaa kohti (kukin astia sisältää kolme koirasta ja kolme naarasta). Altistusta jatketaan 21 päivää, ja kaloista otetaan näytteet altistuksen 21. päivänä. Määrällistä hedelmällisyyttä seurataan päivittäin. 12. Kalat lopetetaan humaanilla tavalla 21. päivänä tehtävän näytteenoton yhteydessä. Sekundaariset sukupuoliominaisuudet mitataan rasvapäämudulta ja medakalta (ks. lisäykset 5A ja 5B). Verinäytteet vitellogeniinin määrittämiseksi otetaan seeprakalalta ja rasvapäämudulta; vaihtoehtoisesti seeprakalalta voidaan ottaa pää/pyrstö vitellogeniinin määrittämistä varten (lisäys 6). Medakalta otetaan maksa vitellogeniinianalyysia varten (lisäys 6). Sukurauhaset kiinnitetään joko kokonaisina tai dissekoituina mahdollista histopatologista arviointia varten (22). TESTIN HYVÄKSYTTÄVYYSKRITEERIT 13. Testitulokset ovat hyväksyttäviä, jos seuraavat ehdot täyttyvät: — kuolleisuus vesi- (tai liuotin)kontrolleissa on enintään 10 prosenttia altistusjakson lopussa, — liuenneen hapen pitoisuus on vähintään 60 prosenttia ilman kyllästysarvosta koko altistusjakson ajan, — veden lämpötila testiastioiden välillä vaihtelee enintään ± 1,5 °C milloin tahansa testin aikana ja poikkeaa enintään 2 °C siitä lämpötila-alueesta, joka on määritelty kyseiselle testilajille (lisäys 2), — saatavilla on oltava näyttöä, joka osoittaa, että testikemikaalin pitoisuudet liuoksessa ovat olleet ± 20 prosenttia keskimääräisistä mitatuista arvoista, — on näyttöä siitä, että kalat kutevat aktiivisesti kaikissa rinnakkaisnäytteissä ennen kemiallisen altistuksen aloittamista ja rinnakkaiskontrolleissa koko testin ajan. MENETELMÄN KUVAUS Laitteisto 14. Tavalliset laboratoriolaitteet ja erityisesti seuraavat: a. happi- ja pH-mittarit b. laitteet veden kovuuden ja emäksisyyden mittaamiseen c. asianmukaiset laitteet lämpötilan säätöön ja mieluiten sen jatkuvaan seurantaan d. kemiallisesti inertistä materiaalista valmistettuja tankkeja, jotka ovat riittävän suuria suhteessa suositeltuun kalamäärään ja kalatiheyteen (ks. lisäys 2) e. rasvapäämudun ja seeprakalan kutualusta; tarkemmat tiedot ovat lisäyksessä 4 f. riittävän tarkka vaaka (ts. tarkkuus ± 0,5 mg). Vesi 15. Testissä voidaan käyttää mitä tahansa vettä, jossa testilaji selviytyy ja kasvaa riittävän pitkän ajan. Veden laadun on oltava vakio koko testin ajan. Veden pH:n on oltava 6,5–8,5, mutta se saa kunkin testin aikana vaihdella enintään ± 0,5 pH-yksikköä. Sen varmistamiseksi, ettei laimennusvesi vaikuta liikaa testituloksiin (esimerkiksi kompleksoimalla testattavaa ainetta), näytteitä on otettava säännöllisin väliajoin analyyseja varten. Raskasmetallit (esim. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), tärkeimmät anionit ja kationit (esim. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, and SO4 2–), torjunta-aineet (esim. orgaanista fosforia ja orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden kokonaispitoisuudet), orgaanisiin yhdisteisiin sitoutuneen hiilen kokonaispitoisuus ja suspendoituneet kiinteät aineet on mitattava esimerkiksi kolmen kuukauden välein, jos laimennusveden laatu tiedetään suhteellisen vakioksi. Jos veden laadun on osoitettu pysyvän vakiona ainakin vuoden ajan, määrityksiä voidaan tehdä harvemmin (esimerkiksi kuuden kuukauden välein). Lisäyksessä 3 luetellaan joitakin hyväksyttävän laimennusveden kemiallisia ominaisuuksia. Testiliuokset 16. Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan varastoliuoksista laimentamalla. Varastoliuos valmistetaan mieluiten yksinkertaisesti sekoittamalla testattava aine laimennusveteen käyttäen mekaanisia menetelmiä (kuten sekoittamista tai ultraääntä). Saturaatiopylväitä (liukoisuuspylväitä) voi käyttää riittävän väkevän varastoliuoksen valmistamiseksi. Liuottimen käyttöä kantoaineena ei suositella. Jos liuotin on kuitenkin tarpeen, rinnalla on käytettävä liuotinkontrollia, ja liuotinpitoisuuden on oltava sama kuin kemikaalilla käsittelyissä. Vaikeasti testattavien kemikaalien yhteydessä liuotin voi olla teknisesti paras ratkaisu. Tätä koskevat ohjeet on syytä katsoa vaikeasti testattavien aineiden ja seosten toksisuustestausta vesieliöillä koskevasta OECD:n ohjeasiakirjasta (23). Liuotin valitaan aineen tai seoksen kemiallisten ominaisuuksien perusteella. OECD:n ohjeasiakirjassa enimmäismääräksi suositellaan 100 μl/l, mitä on noudatettava. Hiljattain julkaistussa katsauksessa (24) kuitenkin korostetaan, että ylimääräisiä ongelmia on odotettavissa, jos hormonijärjestelmään kohdistuvia vaikutuksia testattaessa käytetään liuottimia. Sen vuoksi on suositeltavaa, että jos liuotinta tarvitaan, sen pitoisuus on pidettävä mahdollisimman pienenä aina, kun se on teknisesti toteutettavissa (testikemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan). 17. Testissä käytetään läpivirtaustestijärjestelmää. Tällainen järjestelmä annostelee ja laimentaa testiaineen varastoliuosta jatkuvasti (esimerkiksi annostelupumpulla, laimentimella, kyllästävällä järjestelmällä) testipitoisuuksien annostelemiseksi testiastioihin. Varastoliuosten ja laimennusveden virtausnopeudet on tarkistettava säännöllisin väliajoin, mieluiten kerran päivässä, ja virtausnopeus saa vaihdella enintään 10 prosenttia koko testin aikana. Heikkolaatuisia muoviletkuja tai muita sellaisia materiaaleja, jotka saattavat sisältää biologisesti aktiivisia kemikaaleja, ei pidä käyttää. Kun valitaan materiaalia läpivirtausjärjestelmään, testikemikaalin mahdollinen adsorptio tähän materiaaliin on otettava huomioon. Kalojen hoito 18. Testikalat on valittava yhdestä laboratoriopopulaatiosta, mieluiten samasta poikueesta, jota on pidetty vähintään kaksi viikkoa ennen testiä samanlaatuisessa vedessä ja samanlaisissa valaistusolosuhteissa kuin ne, joita käytetään testissä. On tärkeää, että kalamäärä ja kalatiheys (ks. määritelmät lisäyksestä 1) ovat asianmukaiset käytettyjen testilajien kannalta (ks. lisäys 2). 19. Kuolleiden kalojen määrä kirjataan 48 tunnin alkutotuttelun jälkeen, ja sitten noudatetaan seuraavia periaatteita: — jos kuolleisuus on yli 10 prosenttia populaatiosta seitsemässä vuorokaudessa: koko erä hylätään — jos kuolleisuus on 5–10 prosenttia populaatiosta: kaloja totutetaan vielä seitsemän vuorokautta; jos kuolleisuus on yli 5 prosenttia toisen seitsemän vuorokauden ajanjakson aikana, koko erä hylätään — jos kuolleisuus on alle 5 prosenttia populaatiosta seitsemässä vuorokaudessa: erä hyväksytään. 20. Kalat eivät saa saada hoitoa sairauteen totutusjakson, esialtistusjakson tai altistusjakson aikana. Esialtistus ja kalojen valinta 21. Yhdestä kahteen viikkoa kestävä esialtistusjakso on suositeltava, ja siinä eläimet sijoitetaan samanlaisiin astioihin kuin varsinaisessa testissä. Kaloja on ruokittava ad libitum koko hoito- ja altistusjakson ajan. Altistusjakso aloitetaan lisääntymiskypsiin koe-eläimiin kuuluvalla dimorfisella aikuisella kalalla (ts. jonka sekundaariset sukupuoliominaisuudet ovat rasvapäämudulla ja medakalla selvästi näkyvillä), joka kutee aktiivisesti. Rasvapäämutuja koskeva yleinen ohje on, että niiden iän on oltava 20 (± 2) viikkoa, jos niitä on kasvatettu 25 ± 2 °C:n lämpötilassa niiden koko elinkaaren ajan. Lisäksi on tarkkailtava kulloisenkin kalaerän varsinaista lisääntymistilaa. Medakojen iän on oltava 16 (± 2) viikkoa, jos niitä on kasvatettu 25 ± 2 °C:n lämpötilassa niiden koko elinkaaren ajan. Seeprakalojen iän on oltava 16 (± 2) viikkoa, jos niitä on kasvatettu 26 ± 2 °C:n lämpötilassa niiden koko elinkaaren ajan. Mätimunatuotantoa on arvioitava päivittäin esialtistusvaiheen aikana. On suositeltavaa, että kutua havainnoidaan kaikissa rinnakkaistankeissa ennen niiden sisällyttämistä tutkimuksen altistusvaiheeseen. Määrällistä suositusta toivottavasta mätimunatuotannosta ei voida tässä vaiheessa antaa, mutta on suhteellisen yleistä havaita kullakin lajilla keskimääräiseksi kuduksi > 10 mätimunaa/naaras/päivä. On käytettävä mätimunatuotannon tuloksen mukaan satunnaistettua lohkoasetelmaa, jotta rinnakkaisnäytteet voidaan jakaa eri testitasoille ja sitä kautta varmistaa rinnakkaisnäytteiden tasapainoinen jakauma TESTISUUNNITELMA 22. Testissä käytetään kolmea pitoisuutta testikemikaalista, yhtä (vesi)kontrollia ja tarvittaessa yhtä liuotinkontrollia. Tiedot voidaan analysoida käsittely- ja kontrollivasteiden välisten, tilastollisesti merkitsevien erojen määrittämiseksi. Näistä analyyseista saadaan tietoa siitä, onko kemikaalin pidempiaikainen lisätestaus haittavaikutusten osalta (eloonjäämiseen, kehitykseen, kasvuun ja lisääntymiseen) tarpeen sen sijaan, että näitä tietoja käytetään riskinarvioinnissa (25). 23. Kunkin käsittelytason seeprakalakoirailta ja -naarailta (viisi koirasta ja viisi naarasta kummassakin rinnakkaisnäytteessä) sekä kontrollikaloilta otetaan kokeen 21. päivänä näytteet vitellogeniinin mittaamista varten. Kunkin käsittelytason medakakoirailta ja -naarailta ja kontrollikaloilta (kolme koirasta ja kolme naarasta kussakin neljässä rinnakkaisnäytteessä) otetaan kokeen 21. päivänä näytteet vitellogeniinin ja sekundaaristen sukupuoliominaisuuksien mittaamista varten. Rasvapäämutukoirailta ja -naarailta (kaksi koirasta ja neljä naarasta kaikissa neljässä rinnakkaisnäytteessä) ja kontrollikaloilta otetaan kokeen 21. päivänä näytteet vitellogeniinin ja sekundaaristen sukupuoliominaisuuksien mittaamista varten. Hedelmällisyys on arvioitava määrällisesti, ja sukurauhaskudokset on kiinnitettävä joko kokonaisina tai leikeltynä mahdollista histopatologista arviointia varten, mikäli tarpeen. Testipitoisuuksien valinta 24. Tässä testissä suurimmaksi testipitoisuudeksi on valittava annostason määrittämistutkimuksista tai muista toksisuustiedoista saatu suurin siedetty pitoisuus (MTC-arvo), tai 10 mg/l tai enimmäisliukoisuus vedessä sen mukaan, mikä arvo on pienin. MTC-arvo on kemikaalin suurin testauspitoisuus, jonka aiheuttama kuolleisuus on alle 10 prosenttia. Tässä menetelmässä edellytetään, että käytettävissä on empiiristä tietoa välittömästä toksisuudesta tai muita toksisuustietoja, joiden perusteella MTC-arvo voidaan estimoida. MTC-arvon estimointi voi olla epätarkkaa, ja siinä tarvitaan yleensä asiantuntijan näkemystä. 25. Testissä tarvitaan siis kolme testipitoisuutta, siten että pitoisuusvälin vakiokerroin saa olla enintään 10, ja laimennusvesikontrolli (sekä tarvittaessa liuotinkontrolli). Pitoisuusvälin kertoimen vaihteluvälin suositellaan olevan 3,2–10. MENETTELY Kalojen valinta ja punnitus 26. On tärkeää minimoida kalojen painon vaihtelu testin alussa. Lisäyksessä 2 esitetään suositeltava kokovaihtelu tähän testiin suositelluille eri lajeille. Testissä käytetyssä koko kalaerässä koiras- ja naaraskalojen yksilöllisten painojen vaihteluväli testin alussa on mahdollisuuksien mukaan pidettävä ± 20 prosentissa saman sukupuolen painon aritmeettisesta keskiarvosta. Suositellaan, että osa erän kaloista punnitaan ennen testiä keskimääräisen painon estimoimiseksi. Altistumisolosuhteet Kesto 27. Testi kestää esialtistusjakson jälkeen 21 päivää. Suositeltu esialtistusjakso on yhdestä kahteen viikkoa. Ruokinta 28. Kaloja on ruokittava ad libitum sopivalla ravinnolla (lisäys 2) riittävän usein, jotta ne pysyvät hyvässä kunnossa. On varottava, ettei vedessä kasva mikrobeja eikä se samennu. Yleisohje on, että päivittäinen annos voidaan jakaa kahteen tai kolmeen yhtä suureen annokseen, kun ruokintakertoja on useampia päivässä, ja ruokintakertojen välillä on oltava vähintään kolme tuntia aikaa. Suurempi kerta-annos on hyväksyttävää antaa etenkin viikonloppuisin. Kalat on pidettävä ravinnotta 12 tuntia ennen näytteenottoa/ruumiinavausta. 29. Kalojen rehu on tarkastettava mahdollisten kontaminanttien, kuten orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden, polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH-yhdisteiden) ja polykloorattujen bifenyylien (PCB-yhdisteiden) varalta. Runsaasti fytoestrogeeneja sisältävää rehua on vältettävä, koska se heikentää testivastetta tunnetulle estrogeeniagonistille (esim. 17-b-estradiolille). 30. Syömättä jäänyt rehu ja ulosteet on poistettava testiastioista vähintään kaksi kertaa viikossa; kunkin säiliön pohja on puhdistettava huolellisesti esimerkiksi käyttämällä lappoa. Valo ja lämpötila 31. Valoisan ajan ja testiveden lämpötilan on oltava sopivia käytetylle testilajille (ks. lisäys 2). Analyyttisten määritysten ja mittausten taajuus 32. Ennen altistusjakson aloittamista on varmistettava, että kemikaalin annostelujärjestelmä toimii asianmukaisesti. Kaikki analyysimenetelmät on määritettävä, ja kemiallisesta stabiiliudesta testijärjestelmässä on oltava riittävästi tietoa. Testin aikana testikemikaalin pitoisuudet on määritettävä säännöllisesti seuraavasti: laimentimen ja myrkyllisen varastoliuoksen virtausnopeudet on tarkistettava mieluiten päivittäin mutta vähintään kahdesti viikossa, ja ne saavat vaihdella enintään 10 prosenttia koko testin aikana. Varsinaiset testikemikaalin pitoisuudet suositellaan mitattavan kaikista astioista testin alussa ja sen jälkeen viikon välein. 33. Suositellaan, että tulosten perusteina käytetään mitattuja pitoisuuksia. Jos testiaineen pitoisuus pysyy kuitenkin tyydyttävästi ± 20 prosentin sisällä nimellispitoisuudesta koko testin ajan, tulosten perustana voidaan käyttää joko nimellispitoisuuksia tai mitattuja pitoisuuksia. 34. Näytteet on mahdollisesti suodatettava (esim. 0,45 μm:n huokoskoon suotimella) tai sentrifugoitava. Mikäli se on tarpeen, sentrifugointi on suositeltava menetelmä. Jos testiaine ei adsorboidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää. 35. Testin aikana kaikista testiastioista on mitattava liuennut happi, lämpötila ja pH vähintään kerran viikossa. Kokonaiskovuus ja alkalisuus on mitattava kontrolleista ja suurimman pitoisuuden astiasta vähintään kerran viikossa. Lämpötilaa on mielellään seurattava jatkuvasti vähintään yhdessä testiastiassa. Havainnot 36. Monia yleisiä (esimerkiksi eloonjääneisyyttä) ja biologisia vasteita (kuten vitellogeniiniarvot) arvioidaan testin kuluessa tai sen päättyessä. Hedelmällisyyden päivittäinen määrällinen seuranta on tarpeen. Näiden ominaisuuksien mittaamista ja arviointia sekä tulosten käyttökelpoisuutta kuvataan jäljempänä. Eloonjääneisyys 37. Kalat on tutkittava päivittäin testijakson aikana. Kuolleisuus on kirjattava, ja kuolleet kalat on poistettava testiastiasta mahdollisimman pian. Kuolleiden kalojen tilalle ei tule vaihtaa eläviä sen paremmin kontrolli- kuin käsittelyastioihinkaan. Testin aikana kuolleiden kalojen sukupuoli on määritettävä sukurauhasten makroskooppisella tutkimuksella. Käyttäytyminen ja ulkonäkö 38. Kaikenlainen poikkeava käyttäytyminen (kontrolleihin nähden) on kirjattava muistiin. Siitä osoituksena voivat olla yleisen toksisuuden merkit, kuten hyperventilaatio, koordinoimaton uinti, tasapainon menetys sekä epätyypillinen liikkumattomuus tai syöminen. Myös muut ulkoiset poikkeavuudet (kuten verenvuoto tai värimuutokset) on merkittävä muistiin. Tällaisia toksisuuden merkkejä on tulkittava varovasti tietoja analysoitaessa, koska ne voivat viitata pitoisuuksiin, joiden yhteydessä hormonijärjestelmään kohdistuviin vaikutuksiin liittyvät biomarkkerit eivät ole luotettavia. Näistä käyttäytymiseen liittyvistä havainnoista voidaan saada myös hyödyllistä laadullista tietoa kaloilla testausta koskevia mahdollisia tulevia vaatimuksia varten. Esimerkiksi rasvapäämuduilla on havaittu androgeenialtistuksen yhteydessä reviiriin liittyvää aggressiivisuutta normaaleilla koirailla tai maskulinisoituneilla naarailla, kun taas seeprakaloilla estrogeeni- tai antiandrogeenialtistuksen on havaittu vähentävän lajityypillistä parittelu- ja kutemiskäyttäytymistä tai estävän sen keinovalon syttyessä. 39. Koska jotkin ulkonäköön liittyvät seikat (pääasiassa väri) voivat muuttua nopeasti käsittelyn yhteydessä, on tärkeää, että laadulliset havainnot tehdään ennen kuin eläimet poistetaan testijärjestelmästä. Rasvapäämuduista tähän saakka karttunut kokemus viittaa siihen, että jotkin hormonijärjestelmään vaikuttavat kemikaalit voivat aluksi aiheuttaa muutoksia seuraavissa ulkoisissa ominaisuuksissa: kalan väri (vaalea tai tumma), värityksen kuviot (pystysuorien raitojen ilmaantuminen) ja kalan muoto (pään ja rinnan alue). Sen vuoksi kalan fyysisestä ulkonäöstä on tehtävä havaintoja testin kuluessa ja tutkimuksen päättyessä. Hedelmällisyys 40. Kutua koskevat määrälliset päivittäiset havainnot on kirjattava rinnakkaisnäytekohtaisesti. Mätimunatuotanto on kirjattava munien määränä eloonjäänyttä naarasta kohden päivässä rinnakkaisnäytekohtaisesti. Munat poistetaan testiastioista päivittäin. Rasvapäämudulle ja seeprakalalle on asetettava testiastiaan kutualusta, jotta kalat voivat kutea tavanomaisissa olosuhteissa. Lisäyksessä 4 on seeprakalalle (lisäys 4A) ja rasvapäämudulle (lisäys 4B) suositeltavia kutualustoja koskevia lisätietoja. Medaka ei tarvitse kutualustaa. Kalojen humaani lopettaminen 41. Testipäivänä 21 eli altistuksen päättyessä kalat on lopetettava tarkoituksenmukaisella määrällä trikaiinia (trikaiinimetaanisulfonaatti, Metacain MS-222 (CAS 886-86-2), 100–500 mg/l, puskuroitu 300 mg/l:n vahvuisella NaHCO3:lla (natriumbikarbonaatti, CAS 144-55-8), limakalvoärsytyksen vähentämiseksi. Sen jälkeen kaloilta otetaan veri- tai kudosnäytteet vitellogeniinimääritystä varten, kuten vitellogeniinia koskevassa osiossa on selitetty. Sekundaaristen sukupuoliominaisuuksien havainnointi 42. Jotkin hormonijärjestelmään vaikuttavat kemikaalit voivat aiheuttaa muutoksia tietyissä erikoistuneissa sekundaarisissa sukupuoliominaisuuksissa (kutukyhmyjen lukumäärä rasvapäämutukoirailla ja sukuelinpapillien lukumäärä medakakoirailla). Kemikaalit, joilla on tiettyjä vaikutustapoja, voivat erityisesti aiheuttaa sen, että vastakkaisen sukupuolen eläimillä esiintyy sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia. Esimerkiksi androgeenireseptorin agonistit, kuten trenboloni, metyylitestosteroni ja dihydrotestosteroni, voivat aiheuttaa korostuneiden kutukyhmyjen kehittymisen rasvapäämutunaaraille tai sukuelinpapillien kehittymisen medakanaaraille (11, 20, 21). On myös raportoitu, että estrogeenireseptorin antagonistit saattavat vähentää kutukyhmyjen määrää ja pienentää selänpuoleista niskakyhmyä aikuisilla rasvapäämutukoirailla (26, 27). Näistä morfologisista havainnoista voidaan saada myös hyödyllistä laadullista ja määrällistä tietoa kaloilla testausta koskevia mahdollisia tulevia vaatimuksia varten. Rasvapäämudun kutukyhmyjen ja medakan sukuelinpapillien lukumäärä ja koko voidaan määrittää suoraan tai käytännöllisemmin preparoiduilta yksilöiltä. Suositellut menetelmät rasvapäämudun ja medakan sekundaaristen sukupuoliominaisuuksien arvioimiseen on esitetty lisäyksessä 5A ja lisäyksessä 5B. Vitellogeniini (VTG) 43. Verinäyte otetaan pyrstösuonesta heparinisoituun mikrohematokriitti-kapillaariputkeen tai vaihtoehtoisesti sydänpunktiolla, joka tehdään ruiskulla. Kerättävän veren määrä vaihtelee kalan koon mukaan yleensä välillä 5–60 μl rasvapäämutuyksilöä kohti ja välillä 5–15 μl seeprakalayksilöä kohti. Plasma erotetaan verestä sentrifugoimalla, ja sitä säilytetään proteaasin estäjien kanssa – 80 °C:ssa vitellogeniinin analysointiin saakka. Toinen vaihtoehto on se, että vitellogeniinin määrityksen kudoslähteenä käytetään medakan maksaa ja seeprakalan pää-/pyrstöhomogenaattia (lisäys 6). Vitellogeniinin mittauksen on perustuttava validoituun homologiseen ELISA-menetelmään, jossa käytetään homologista vitellogeniinistandardia ja homologisia vasta-aineita. On suositeltavaa käyttää sellaista menetelmää, jolla pystytään havaitsemaan jopa niin alhaisia vitellogeniinitasoja kuin vain muutama ng/ml plasmassa (tai ng/mg kudoksessa), mitä pidetään altistumattomien koiraskalojen taustapitoisuutena. 44. Vitellogeniinianalyysin laatu varmistetaan käyttämällä standardeja, nollakokeita ja vähintään kaksinkertaista analyysia. Jokaisen ELISA-menetelmän yhteydessä on tehtävä matriisivaikutustesti (vaikutus näytteen laimentumiseen), jotta voidaan määrittää näytteen vähimmäislaimennuskerroin. Kuhunkin vitellogeniinianalyysissa käytettävään ELISA-levyyn on sisällytettävä seuraavat laadunvalvontanäytteet: vähintään kuusi kalibrointistandardia, jotka kattavat odotettujen vitellogeniinipitoisuuksien vaihteluvälin, ja vähintään yksi ei-spesifinen sitoutumismääritys -nollakoe (kaksinkertainen analyysi). Näissä nollakokeissa absorbanssin on oltava alle viisi prosenttia kalibrointistandardin enimmäisabsorbanssista. Jokaisesta näytelaimennoksesta analysoidaan vähintään kaksi alikvoottia (kaksi rinnakkaiskuoppaa). Rinnakkaiskuopat, joiden arvot eroavat toisistaan yli 20 prosenttia, on analysoitava uudelleen. 45. Kalibrointikäyrien korrelaatiokertoimen (R2) on oltava yli 0,99. Suuri korrelaatio ei kuitenkaan yksinään riitä takaamaan pitoisuuden asianmukaista ennustamista kaikissa vaihteluväleissä. Sen lisäksi, että korrelaatio kalibrointikäyrään on riittävän suuri, kunkin standardin pitoisuuden on – kalibrointikäyrästä laskettuna oltava 70–120 prosenttia sen nimellispitoisuudesta. Jos nimellispitoisuuksissa on havaittavissa kalibroinnin regressiolinjasta poispäin suuntautuva trendi (esimerkiksi pienemmillä pitoisuuksilla), voi olla tarpeen jakaa kalibrointikäyrä alempaan ja ylempään vaihteluväliin tai käyttää epälineaarista mallia, jotta absorbanssitiedot saadaan sovitettua asianmukaisesti. Jos käyrä jaetaan, kummankin linjan segmentin R2 on oltava > 0,99. 46. Havaitsemisrajaksi (LOD) määritetään pienimmän määritysstandardin pitoisuus, ja määritysrajaksi (LOQ) määritetään pienimmän määritysstandardin pitoisuus kerrottuna pienimmällä laimennuskertoimella. 47. Niinä päivinä, kun tehdään vitellogeniinimäärityksiä, analysoidaan myös rikastusnäyte käyttämällä määritysten välistä vertailuainetta (lisäys 7). Odotuksenmukaisen pitoisuuden ja mitatun pitoisuuden välinen suhde ilmoitetaan kyseisenä päivänä tehtyjen määritysten tulosten mukana. Sukurauhasten histopatologinen arviointi 48. Sääntelyviranomaiset saattavat vaatia sukurauhasten histopatologista tutkimusta kohde-elimen tutkimiseksi HPG-akselilla kemiallisen altistuksen jälkeen. Tätä varten sukurauhaset kiinnitetään joko kokonaisina tai dissekoituina. Jos histopatologiaa vaaditaan, sukurauhasista etsitään erityisesti hormonijärjestelmään liittyviä vasteita, kun testikemikaalin vaikutusta hormonijärjestelmään arvioidaan. Tällaisia diagnostisia vasteita ovat ennen kaikkea testikulaariset munasolut, Lydiginsolun hyperplasia, alentunut ruskuaisen muodostus, lisääntynyt alkusiemensolujen määrä ja perifollikulaarinen hyperplasia. Muilla sukurauhasvaurioilla, kuten munasolujen atresialla, testikulaarisella degeneraatiolla ja kehitysvaihemuutoksilla, voi olla erilaisia syitä. Kalojen sukurauhasten histopatologiaa koskevassa ohjeasiakirjassa ilmoitetaan menettelyt, joita käytetään sukurauhasten dissekointiin, kiinnittämiseen, lohkomiseen ja histopatologiseen arviointiin (22). TIEDOT JA RAPORTOINTI Biomarkkerivasteiden arviointi varianssianalyysilla (ANOVA) 49. Jotta voidaan tunnistaa kemikaalin mahdollinen vaikutus, käsittely- ja kontrolliryhmien vasteita verrataan käyttämällä varianssianalyysia (ANOVA). Jos käytetään liuotinkontrollia, on tehtävä asianmukainen tilastollinen testi laimennusvesi- ja liuotinkontrollien välillä kunkin tutkittavan ominaisuuden osalta. Ohjeita siitä, miten laimennusvesi- ja liuotinkontrolleja koskevia tietoja käsitellään tilastollisessa analyysissa, on OECD:n asiakirjassa 2006c (28). Kaikki tiedot biologisesta vasteesta on analysoitava ja raportoitava kummastakin sukupuolesta erikseen. Jos parametristen menetelmien edellyttämät vaatimukset eivät täyty – epänormaali jakauma (esimerkiksi Shapiro-Wilkin testi) tai heterogeeninen varianssi (Bartlettin testi tai Levenen testi) – on harkittava mittaustulosten muuntamista varianssien homogenisoimiseksi ennen ANOVA-analyysia tai painotetun ANOVAn tekemistä. Monivertailuihin liittyvää Dunnettin testiä (parametrinen) tai Mann-Whitneyn testiä ja Bonferronin korjausta (ei-parametrinen) voidaan käyttää ei-monotonisten annosvasteiden yhteydessä. Muita tilastollisia testejä voidaan käyttää (esimerkiksi Jonckheere-Terpstran testi tai Williamsin testi), jos annosvaste on jotakuinkin monotoninen. Lisäyksessä 8 on tilastollinen vuokaavio, joka on tarkoitettu avuksi, kun päätetään, mikä on tarkoituksenmukaisin tilastollinen testi käytettäväksi. Lisätietoja on myös ekotoksisuustietojen tilastollisessa analyysissa sovellettavia nykyisiä lähestymistapoja koskevassa OECD:n asiakirjassa ”Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data” (28). Testitulosten raportointi 50. Tutkimustietoihin on sisällytettävä seuraavat seikat: Testauslaitos: — vastuuhenkilöstö ja heidän tutkimusta koskevat vastuualueensa — jokaisen laboratorion pätevyys on osoitettava käyttämällä monenlaisia edustavia kemikaaleja Testikemikaali: — testikemikaalin luonnehdinta — fysikaalinen olomuoto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, jos niillä on merkitystä — testipitoisuuksien valmistusmenetelmä ja valmistustiheys — tiedot stabiiliudesta ja biohajoavuudesta Liuotin: — liuottimen luonnehdinta (tyyppi, käytetty pitoisuus) — liuottimen valinnan perustelut (jos muu kuin vesi) Koe-eläimet: — laji ja kanta — toimittaja ja toimittajan tilat — kalan ikä testin alussa ja sen lisääntymis-/kututila — tarkat tiedot eläinten totutusmenetelmästä — kalan paino altistuksen alussa (kalaerän osan punnituksen perusteella) Testiolosuhteet: — käytettävä testimenetelmä (testin tyyppi, kalamäärä, kalatiheys jne.) — varastoliuosten valmistusmenetelmä ja virtausnopeus — nimellistestipitoisuudet, testiliuosten viikoittain mitatut pitoisuudet ja käytetyt analyysimenetelmät, mitattujen arvojen keskiarvot ja keskihajonnat testiastioissa ja todisteet siitä, että mittaukset koskevat testikemikaalin pitoisuuksia todellisessa liuoksessa — laimennusveden ominaisuudet (mukaan luettuina pH, kovuus, alkalisuus, lämpötila, liuenneen hapen pitoisuus, jäännösklooripitoisuudet, orgaanisen hiilen kokonaismäärä, suspendoituneet kiinteät aineet ja muut tehdyt mittaukset) — testiastioissa olevan veden laatu: pH, kovuus, lämpötila ja liuenneen hapen pitoisuus — tarkat tiedot ruokinnasta (esimerkiksi rehu(je)n tyyppi, lähde, annettu määrä ja antotiheys) sekä analyysit merkittävistä kontaminanteista, mikäli saatavilla (esimerkiksi PCB-yhdisteet, PAH-yhdisteet ja orgaanista klooria sisältävät torjunta-aineet) Tulokset — näyttö siitä, että kontrollit täyttävät testin hyväksyttävyyskriteerit — kuolleisuutta koskevat tiedot testipitoisuuksissa ja kontrolleissa — käytetyt tilastolliset analyysitekniikat, aineiston käsittely ja käytettyjen tekniikoiden perustelut — paljain silmin näkyviä morfo-biologisia havaintoja, mukaan luettuina sekundaariset sukupuoliominaisuudet, mätimunatuotantoa ja vitellogeniinia koskevat tiedot — tulokset aineiston analyyseista mieluiten taulukkoina ja graafisessa muodossa — tiedot kalojen mahdollisista epätavallisista reaktioista ja testikemikaalin aiheuttamista mahdollisista näkyvistä vaikutuksista TESTITULOSTEN TULKINTAA JA HYVÄKSYMISTÄ KOSKEVAT OHJEET 51. Tämä kohta sisältää joitakin seikkoja, jotka on otettava huomioon, kun eri tutkittavia ominaisuuksia koskevia testituloksia tulkitaan. Tuloksia on tulkittava varoen, jos testikemikaali vaikuttaa aiheuttavan ilmeistä toksisuutta tai vaikuttavan koe-eläimen yleiskuntoon. 52. Testipitoisuuksien vaihteluvälin asettamisessa on varottava ylittämästä suurinta siedettyä pitoisuutta, jotta aineiston järkevä tulkinta on mahdollista. On tärkeää, että testissä on vähintään yksi käsittely, jossa ei ilmene merkkejä myrkyllisistä vaikutuksista. Sairauden ja myrkyllisten vaikutusten merkit on arvioitava ja raportoitava perinpohjaisesti. On esimerkiksi mahdollista, että naarailla vitellogeniinin tuotantoon voivat vaikuttaa myös yleinen toksisuus ja muuhun kuin hormonijärjestelmään kohdistuvat myrkylliset vaikutustavat (esimerkiksi hepatotoksisuus). Vaikutusten tulkintaa voidaan kuitenkin vahvistaa muilta käsittelytasoilta saaduilla tuloksilla, joita ei voida perustella systeemisellä toksisuudella. 53. Testituloksen hyväksyttävyyden kannalta on otettava huomioon muutamia seikkoja. Perusohje on, että kontrolliryhmien koiraiden ja naaraiden vitellogeniinitasot on eriytettävä ja eroteltava rasvapäämudulla ja seeprakalalla noin kolmeen suuruusluokkaan ja medakalla noin yhteen suuruusluokkaan. Validointiraporteissa (1, 2, 3, 4) on esimerkkejä kontrolli- ja käsittelyryhmistä saatujen arvojen vaihteluvälistä. Kontrolliryhmän koirailla tavatut suuret vitellogeniiniarvot voivat heikentää testin herkkyyttä ja sen kykyä havaita heikkoja estrogeeniagonisteja. Kontrolliryhmän naarailla tavatut pienet vitellogeniiniarvot voivat niin ikään heikentää testin herkkyyttä ja sen kykyä havaita aromataasin estäjiä ja estrogeeniantagonisteja. Nämä ohjeet on laadittu validointitutkimusten perusteella. 54. Mätimunatuotannon määrälliseen määrittämiseen liittyy merkittävää vaihtelua [variaatiokerroin voi vaihdella 20–60 prosenttia], mikä vaikuttaa kykyyn havaita tutkimuksessa alle 70 prosentin merkitsevä vähennys munatuotannossa, kun variaatiokerroin lähenee 50:tä prosenttia tai ylittää sen. Jos variaatiokerroin rajoitetaan tätä alempiin arvoihin (noin 20–30 prosenttiin), tutkimuksessa saavutetaan hyväksyttävä voima (80 prosenttia) havaita 40–50 prosentin vähennys mätimunatuotannossa. Rasvapäämudulla käytetty testisuunnitelma, johon sisällytetään neljä rinnakkaisnäytettä käsittelytasoa kohden, antaa lisää voimaa hedelmällisyysominaisuuden tutkimiseen verrattuna testisuunnitelmaan, jossa on vain kaksi rinnakkaisnäytettä. 55. Jos laboratorio ei ole tehnyt määritystä aikaisemmin tai jos on tehty huomattavia muutoksia (esimerkiksi kalakannan tai toimittajan vaihto), on syytä tehdä tekninen pätevyystutkimus. On suositeltavaa, että siinä käytetään kemikaaleja, joilla on monenlaisia vaikutustapoja tai jotka vaikuttavat lukuisiin testissä tutkittaviin ominaisuuksiin. Käytännössä jokaista laboratoriota kehotetaan keräämään oma kontrollitietokanta koiraita ja naaraita varten sekä käyttämään positiivista kemikaalikontrollia estrogeeniaktiivisuuden osalta (esimerkiksi 17β-estradioli pitoisuudella 100 ng/l tai tunnettu heikko agonisti), jolloin koiraskalojen vitellogeniini lisääntyy, positiivista kemikaalikontrollia aromataasin eston osalta (esimerkiksi fadrotsoli tai prokloratsi pitoisuudella 300 μg/l), jolloin naaraskalojen vitellogeniini vähenee, ja positiivista kemikaalikontrollia androgeeniaktiivisuuden osalta (esimerkiksi 17β-trenboloni pitoisuudella 5 μg/l), jolloin rasvapäämutu- ja medakanaaraille alkaa kehittyä sekundaarisia sukupuoliominaisuuksia. Kaikkia näitä tietoja voidaan verrata validointitutkimuksista (1, 2, 3) saatuihin tietoihin, jotta laboratorion pätevyys saadaan varmistettua. 56. Yleensä vitellogeniinimittauksia pidetään positiivisina, jos koiraiden vitellogeniini lisääntyy tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05), tai jos naaraiden vitellogeniini vähenee tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) ainakin suurimman testatun annoksen yhteydessä kontrolliryhmään verrattuna ja jos merkkejä yleisestä toksisuudesta ei ole. Positiivista tulosta tukee myös se, että annoksen ja vastekäyrän välillä voidaan osoittaa olevan biol