6)

Korvataan liite VII seuraavasti: ”LIITE VII 2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla. Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C). 2. PERIAATE Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä. 3. VÄLINEISTÖ 3.1 Erlenmeyer-pullo, 25 ml. 3.2 Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml. 3.3 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla. 3.4 Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml. 3.5 Kolveja, 100 ja 250 ml. 3.6 Pyöröhaihduttaja. 3.7 Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa. 3.8 Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten. 3.9 Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C. 3.10 Mittapipettejä, 1 ja 2 ml. 3.11 Injektioruisku, 1 ml. 3.12 Mikroruisku, 100 μl. 3.13 Suppilo, 1 000 ml 3.14 Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella. 3.15 Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin. 3.16 Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori. 3.17. Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. 3.18 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa. 3.19 Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin. 4. REAGENSSIT 4.1 Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä. 4.2 N-heksaani, kromatografialaatua. 4.3 Isopropanoli 4.4 Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V) 4.5 Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.) 4.6 Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V) 4.7 Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta). 4.8 Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %. 4.9 Dietyylieetteri, kromatografialaatua. 4.10 Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V) 4.11 Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos. 4.12 1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa. 4.13 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. 4.14 Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste. 4.15 Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.) 4.16 Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen. 5. MENETTELY 5.1 Näytteen valmistelu 5.1.1 Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti. 5.1.1.1 1 000 ml:n suppiloon (3.13) kaadetaan 50 g öljyä ja 200 ml n-heksaania. Lisätään 100 ml isopropanolia ja 12-prosenttista natriumhydroksidiliuosta (4.11) määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää lisättynä 5 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä. Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös mahdolliset välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään useita kertoja isopropanolin ja tislatun veden liuoksella, 50–60 ml, suhteessa 1:1 (V/V) (4.4), kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt. Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä (käyttäen esim. kiertohaihdutinta) ja siirretään öljy 100 ml:n kolviin (3.5). Kuivataan öljy tyhjiössä, kunnes liuotin on kokonaan haihtunut. Tämän vaiheen jälkeen öljyn happopitoisuuden on oltava alle 0,5 %. 5.1.2 Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.) 5.1.3 Kromatografiakolonnin esikäsittely Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi. Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin. Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella. 5.1.4 Kolonnikromatografia Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä. Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa. Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa). Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla. Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute. (Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania. Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V). Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla. Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen. 5.2 Hydrolyysi haimalipaasin avulla 5.2.1 Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5. 5.2.2 Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä. 5.2.3 Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen. 5.3 Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu 5.3.1 Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3). 5.3.2 Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia. 5.3.3 Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten. 5.4 Kaasukromatografia Käyttöolosuhteet ovat seuraavat: — Injektorin (kolonniin liitetty kylmäinjektori) lämpötila matalampi kuin liuoksen kiehumislämpötila (68 °C), — Detektorin lämpötila: 350 °C, — Kolonnin lämpötila: uunin lämpötila ohjelmoidaan seuraavasti: 60 °C yhden minuutin ajan, lisätään 15 °C minuutissa kunnes lämpötila on 180 °C, minkä jälkeen lisätään 5 °C minuutissa kunnes lämpötila on 340 °C, minkä jälkeen lämpötila pidetään 340 °C:ssa 13 minuutin ajan, — Kantajakaasut: vety tai helium sopivalla lineaarinopeudella kuvassa 1 esitetyn resoluution saavuttamiseksi. C54-triglyseridin retentioajan on oltava 40 ± 5 minuuttia (ks. kuva 2). (Jäljempänä esitetyt käyttöolosuhteet ovat ohjeellisia. Käyttäjän on optimoitava ne halutun resoluution saavuttamiseksi. 2-glyseryylimonopalmitaatin piikin korkeuden on oltava vähintään 10 % piirturin asteikosta.), — Injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl n-heksaaniliuosta (5 ml) (5.3.3.). 5.4.1 Piikkien tunnistaminen Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla. 5.4.2 Kvantitatiivinen arviointi Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla. 6. TULOSTEN ESITTÄMINEN Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti: Glycéril monopalmitate (%): NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa: Ax = glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala ΣA = kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa. Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 7. MÄÄRITYSSELOSTE Määritysselosteessa on oltava: — viittaus tähän menetelmään, — näytteen tunnistamiseksi tarvittavat tiedot, — määrityksen tulos, — poikkeamiset tästä menetelmästä riippumatta siitä, johtuvatko ne asianomaisten päätöksestä vai jostain muusta syystä, — laboratorion tunnistetiedot, määrityspäivä ja määrityksestä vastaavien allekirjoitukset. Kuva 1 Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %). Kuva 2 Kromatogrammi: (A) esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %. Kromatogrammi: B) esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 % 8. SELITYKSIÄ Huom. 1. LIPAASIN VALMISTUS Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti: Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä. Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa. Huomautus 2. LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti: Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella. Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä. Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen. Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3. Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti. Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja. Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti: jossa: A aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg V natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna) N natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus m lipaasinäytteen paino mg:oina. Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.”