”LIITE I

Tärkkelyspitoisuuden ja tärkkelyksen hajoamistuotteiden, glukoosi mukaan luettuna, entsymaattinen määritys elintarvikkeissa käyttäen suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC)

1. Soveltamisala

Tässä menetelmässä selostetaan tärkkelyspitoisuuden ja tärkkelyksen hajoamistuotteiden pitoisuuden, glukoosi mukaan luettuna, määritys ihmisravinnoksi tarkoitetuissa elintarvikkeissa, jäljempänä ’tärkkelys’. Tärkkelyspitoisuus lasketaan glukoosista, joka määritetään kvantitatiivisesti käyttäen suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC), kun tärkkelys ja sen hajoamistuotteet on entsymaattisesti muunnettu glukoosiksi.

2. Glukoosin kokonaispitoisuuden ja tärkkelyksenä ilmaistun glukoosin kokonaispitoisuuden määrittely

Glukoosin kokonaispitoisuus tarkoittaa arvoa Z, siten kuin se lasketaan tämän liitteen 7.2.1 kohdassa. Se edustaa tärkkelyksen ja kaikkien sen hajoamistuotteiden, glukoosi mukaan luettuna, pitoisuutta.

Asetuksen (EY) N:o 1460/96 liitteessä III määritelty tärkkelys-/glukoosipitoisuus lasketaan tämän asetuksen 2 artiklan 1 kohdassa esitetyn mukaisesti glukoosin kokonaispitoisuuden Z perusteella.

Komission asetuksen (EY) N:o 1043/2005 (1) liitteessä IV olevassa sarakkeessa 3 määritelty tärkkelys- (tai dekstriini-)pitoisuus lasketaan komission asetuksen (EY) N:o 904/2008 (2) 2 artiklan 2.1 kohdassa esitetyn mukaisesti glukoosin kokonaispitoisuuden Z perusteella.

Tämän liitteen 1 kohdassa tarkoitettu tärkkelyspitoisuus tarkoittaa arvoa E, siten kuin se lasketaan tämän liitteen 7.2.2. kohdassa. Se ilmaistaan massaprosentteina (%, m/m). Se vastaa glukoosin kokonaispitoisuutta Z tärkkelyksenä ilmaistuna. Arvo E ei vaikuta edellä mainittuihin laskelmiin.

3. Periaate

Näytteet homogenoidaan ja suspendoidaan veteen. Näytteessä oleva tärkkelys ja sen hajoamistuotteet muunnetaan entsymaattisesti glukoosiksi kahdessa vaiheessa:

1. Tärkkelys ja sen hajoamistuotteet muunnetaan osittain liukoisiksi glukoosiketjuiksi käyttäen lämpöstabiilia alfa-amylaasia 90 °C:ssa. Jotta muunnos olisi tehokas, on näytteiden oltava kokonaan liuenneina tai hyvin pieniä kiinteitä hiukkasia sisältävänä lietteenä.

2. Liukoiset glukoosiketjut muunnetaan glukoosiksi käyttäen amyloglukosidaasia 60 °C:ssa.

Tuotteet, joiden proteiini- tai rasvapitoisuus on suuri, selkeytetään ja suodatetaan.

Sokerien määritys tehdään HPLC:llä.

Koska sakkaroosi voi osittain invertoitua entsymaattisen käsittelyn aikana, vapaat sokerit määritetään myös HPLC:llä korjatun glukoosipitoisuuden laskemiseksi.

4. Reagenssit ja muut tarvikkeet

Käytetään analyyttistä laatua olevia reagensseja ja demineralisoitua vettä.

4.1 Glukoosi, väh. 99 %.

4.2 Fruktoosi, väh. 99 %.

4.3 Sakkaroosi, väh. 99 %.

4.4 Maltoosimonohydraatti, väh. 99 %.

4.5 Laktoosimonohydraatti, väh. 99 %.

4.6 Lämpöstabiilin alfa-amylaasin (1,4-alfa-D-glukaaniglukanohydrolaasi) liuos, jonka aktiivisuus on noin 31 000 U/ml (1 U vapauttaa 1,0 milligramman maltoosia tärkkelyksestä 3 minuutissa pH:n ollessa 6.9 ja lämpötilan 20 °C). Tämä entsyymi voi sisältää vain vähäisen määrän epäpuhtauksia (esim. glukoosia tai sakkaroosia) ja muita häiritseviä entsyymejä. Säilytyslämpötila on noin 4 °C. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muista lähteistä saatuja alfa-amylaasivalmisteita, jos ne tuottavat vastaavan entsyymiaktiivisuuden omaavan lopullisen liuoksen.

4.7 Jauheena oleva Aspergillus nigeristä saatu amyloglukosidaasi (1,4-alfa-D-glukaaniglukohydrolaasi), jonka aktiivisuus on noin 120 U/mg tai noin 70 U/mg (1 U vapauttaa 1 mikromoolin glukoosia tärkkelyksestä minuutissa pH:n ollessa 4.8 ja lämpötilan 60 °C). Tämä entsyymi voi sisältää vain vähäisen määrän epäpuhtauksia (esim. glukoosia tai sakkaroosia) ja muita häiritseviä entsyymejä (esim. invertaasia). Säilytyslämpötila on noin 4 °C. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muista lähteistä saatuja alfa-amylaasivalmisteita, jos ne tuottavat vastaavan entsyymiaktiivisuuden omaavan lopullisen liuoksen.

4.8 Sinkkiasetaattidihydraatti, p.a.

4.9 Kaliumheksasyanoferraatti(II), (K4[Fe(CN)]6.3H2O), extra pure –laatua.

4.10 Vedetön natriumasetaatti, analyysilaatua.

4.11 Jääetikka, 96 % (v/v).

4.12 Natriumasetaattipuskuri (0,2 mol/l). Punnitaan dekanterilasiin 16,4 g natriumasetaattia (4.10 kohta). Liuotetaan veteen ja huuhdellaan 1 000 ml:n mittapulloon. Laimennetaan merkkiin vedellä ja säädetään pH arvoon 4.7 etikkahapolla (käytetään pH-mittaria (5.7 kohta)). Liuos on käyttökelpoinen enintään 6 kk säilytettynä 4 °C:ssa.

4.13 Amyloglukosidaasiliuos. Valmistetaan liuos amyloglukosidaasijauheesta (4.7 kohta) käyttäen natriumasetaattipuskuria (4.12 kohta). Entsyymiaktiivisuuden on oltava riittävä ja näytteessä olevaa tärkkelyspitoisuutta vastaava (esimerkiksi noin 600 U/ml:n aktiivisuus saadaan, kun 0,5 g amyloglukosidaasijauhetta, jonka aktiivisuus on 120 U/mg (4.7 kohta), liuotetaan 100 ml:an lopputilavuuteen 1 g näytteen tärkkelysmäärää kohti). Valmistetaan välittömästi ennen käyttöä.

4.14 Vertailuliuokset. Valmistetaan sokerien HPLC-analyysissä tavallisesti käytettävät glukoosin, fruktoosin, sakkaroosin, maltoosin ja laktoosin vesiliuokset.

4.15 Selkeytysreagenssi (Carrez I). Liuotetaan 219,5 g sinkkiasetaattia (4.8 kohta) veteen dekanterilasissa. Siirretään huuhtelemalla 1 000 ml:n mittapulloon ja lisätään 30 ml etikkahappoa (4.11 kohta). Sekoitetaan hyvin ja täytetään vedellä merkkiin. Liuos on käyttökelpoinen enintään 6 kuukautta huoneenlämmössä säilytettynä. Myös muita Carrez’n liuosta vastaavia selkeytysliuoksia voidaan käyttää.

4.16 Selkeytysreagenssi (Carrez II). Liuotetaan 106,0 g kaliumheksasyanoferraattia(II) (4.9 kohta) veteen dekanterilasissa. Siirretään huuhtelemalla 1 000 ml:n mittapulloon. Sekoitetaan hyvin ja täytetään vedellä merkkiin. Liuos on käyttökelpoinen enintään 6 kuukautta huoneenlämmössä säilytettynä. Myös muita Carrez’n liuosta vastaavia selkeytysliuoksia voidaan käyttää.

4.17 HPLC:n liikkuva faasi. Valmistetaan sokerien HPLC-analyysissä tavanomaisesti käytetty liikkuva faasi. Jos käytetään aminopropyyli-piihappogeelipylvästä, tavanomainen liikkuva faasi on esim. HPLC-laatuisen veden ja asetonitriilin seos.

5. Välineistö

5.1 Tavanomaisia laboratoriolasiastioita.

5.2 Laskostettuja suodattimia, esim. 185 mm.

5.3 Ruiskusuodattimia, 0,45 μm, vesiliuoksille.

5.4 HPLC-laitteen näytteenkäsittelylaitteeseen sopivia näyteampulleja.

5.5 100 ml:n mittapulloja.

5.6 Muoviruiskuja, 10 ml.

5.7 pH-mittari.

5.8 Analyysivaaka.

5.9 Termostoitu vesihaude, joka voidaan säätää sekä 60 °C:een että 90 °C:een.

5.10 Sokerianalyysiin sopiva HPLC-laitteisto.

6. Suoritus

6.1 Näytteen valmistus erityyppisistä tuotteista

Tuote homogenoidaan.

6.2 Näytteen määrä

Näytteen määrä arvioidaan ilmoitettujen ainesosien määrien ja HPLC-analyysin olosuhteiden (glukoosin vertailuliuoksen pitoisuus) perusteella, ja se saa olla enintään

Punnitaan näyte 0,1 mg:n tarkkuudella.

6.3 Nollakokeen määritys

Nollakoe määritetään tekemällä täydellinen analyysi (6.4 kohdan mukaisesti) ilman näytettä. Nollakoetta käytetään tärkkelyspitoisuuden laskemisessa (7.2 kohta).

6.4 Analyysi

6.4.1 Näytteiden valmistus

Homogenoidaan näyte ravistamalla tai sekoittamalla. Valittu näytemäärä (6.2 kohta) punnitaan mittapulloon (5.5 kohta), johon lisätään noin 70 ml lämmintä vettä.

Kun aine on liuennut tai lietteenä, lisätään 50 mikrolitraa lämpöstabiilia alfa-amylaasia (4.6 kohta) ja kuumennetaan 90 °C:ssa 30 minuuttia vesihauteessa (5.9 kohta). Jäähdytetään mahdollisimman nopeasti 60 asteeseen vesihauteessa ja lisätään 5 ml amyloglukosidaasiliuosta (4.13 kohta). Jos näyte voi vaikuttaa reaktioliuoksen pH-arvoon, pH-arvoa on säädettävä tarvittaessa välille 4.6–4.8. Annetaan reagoida 60 minuuttia 60 °C:ssa. Jäähdytetään näytteet huoneenlämpöisiksi.

6.4.2. Selkeyttäminen

Sellaiset näytteet, joiden proteiini- tai rasvapitoisuus on suuri, on tarpeen selkeyttää lisäämällä 1 ml Carrez I -liuosta (4.15 kohta) näyteliuokseen. Ravistamisen jälkeen lisätään 1 ml Carrez II -liuosta (4.16 kohta). Ravistetaan näytettä uudelleen.

6.4.3. Käsittely HPLC-analyysia varten

Mittapullossa oleva näyte laimennetaan merkkiin vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan laskostetun suodattimen (5.2 kohta) läpi. Näyteuute otetaan talteen.

Uutteet suodatetaan ruiskusuodattimen (5.3 kohta) läpi ruiskulla (5.6 kohta), joka on huuhdeltu uutteella. Suodokset kerätään ampulleihin (5.4 kohta).

6.5 Kromatografia

HPLC suoritetaan sokerianalyysille tavanomaiseen tapaan. Jos HPLC-analyysi osoittaa maltoosijäämiä, tärkkelys ei ole muuntunut kokonaan, minkä seurauksena glukoosin saanto on liian pieni.

7 Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen

7.1 HPLC-tulosten laskeminen

Tärkkelyspitoisuuden laskemiseksi tarvitaan kahden HPLC-analyysin tulokset: näytteessä ennen entsymaattista käsittelyä olevat sokerit (”vapaat sokerit”) ja entsymaattisen käsittelyn jälkeen olevat sokerit (kuten tässä menetelmässä kuvataan). Lisäksi on tehtävä nollakoemääritys, jotta tulos voidaan korjata entsyymeissä olevien sokerien osalta.

HPLC-analyysissä piikin pinta-ala määritetään integroimalla, ja pitoisuus lasketaan vertailuliuosten (4.14 kohta) kanssa tehdyn kalibroinnin avulla. Nollakokeessa oleva glukoosikonsentraatio (g/100 ml) vähennetään entsymaattisen käsittelyn jälkeen mitatusta glukoosikonsentraatiosta (g/100 ml). Lopuksi sokerien pitoisuus (g sokeria/100 g:ssa näytettä) lasketaan käyttäen näytteen punnittua määrää, mistä saadaan tulokseksi:

1) HPLC-analyysistä ennen entsymaattista käsittelyä saadaan vapaiden sokerien pitoisuus (g/100 g): — glukoosi G — fruktoosi F — sakkaroosi S

2) HPLC-analyysistä entsymaattisen käsittelyn jälkeen saadaan sokerien pitoisuus (g/100 g): — glukoosi nollakoekorjauksen jälkeen (Ge cor) — fruktoosi Fe — sakkaroosi Se

7.2 Tärkkelyspitoisuuden laskeminen

7.2.1 Glukoosin kokonaispitoisuuden ”Z” laskeminen

Jos fruktoosin määrä entsymaattisen käsittelyn jälkeen (Fe) on suurempi kuin fruktoosin määrä ennen entsymaattista käsittelyä (F), on näytteessä ollut sakkaroosi osittain muuntunut fruktoosiksi ja glukoosiksi. Tämä tarkoittaa sitä, että on tehtävä korjaus vapautuneen glukoosin (Fe – F) osalta.

Z, lopullinen glukoosipitoisuus korjauksen jälkeen, ilmaistuna g/100 g:

Z = (Ge cor) – (Fe – F)

7.2.2 Tärkkelyksenä ilmaistun glukoosin kokonaispitoisuuden laskeminen

E, ’tärkkelys’ pitoisuus ilmaistuna g/100 g:

E = [(Ge cor) – (Fe – F)] × 0,9

8. Tarkkuus

Tässä kohdassa esitetään menetelmän tarkkuutta koskevan kahdella näytteellä toteutetun laboratorioidenvälisen testin tiedot. Ne kuvaavat tässä liitteessä selostettuun menetelmään kohdistettavia vaatimuksia.

Laboratorioidenvälisen testin tulokset (tiedoksi)

Vuonna 2008 tehtiin monilaboratoriotesti, johon Euroopan tullilaboratoriot osallistuivat.

Tarkkuutta koskevien tietojen arvioinnissa käytettiin teosta ’Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies’, W. Horwitz, (IUPAC technical report), Pure & Appl. Chem., Vol. 67, No2, PP.331-343, 1995.

Jäljempänä oleva taulukko sisältää tarkkuutta koskevat tiedot.