Komission asetus (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä



Virallinen lehti nro L 248 , 05/09/1991 s. 0001 - 0083

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 38 s. 0174

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 38 s. 0174



KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä syyskuuta 1966 annetun neuvoston asetuksen 136/66/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 3577/90(2), ja erityisesti sen 35 a artiklan, sekä katsoo, että asetuksen 136/66/ETY liitteessä määrätään kussakin jäsenvaltiossa sekä yhteisön maiden välisessä ja kolmansien maiden kanssa käytävässä kaupassa kaupan pidettävän puristetun oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn nimityksistä ja määritelmistä, eri öljytyyppien erottamiseksi toisistaan kunkin tyypin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja neitsytöljyn aistinvaraiset ominaisuudet on syytä määritellä kyseisten tuotteiden puhtauden ja laadun takaamiseksi, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden voimassa olevien tätä koskevien säännösten soveltamista, eri öljytyyppien ominaisuuksien esiintyminen olisi määritettävä yhtenäisesti kaikkialla yhteisössä; tätä varten on syytä vahvistaa yhteisön menetelmät kemiallista määritystä ja aistinvaraista arviointia varten; siirtymäkauden aikana olisi kuitenkin sallittava jäsenvaltioissa sovellettavien muiden määritysmenetelmien käyttö ottaen kuitenkin huomioon, että jos tulokset ovat erilaisia, yhteisellä menetelmällä saadut tulokset ovat ratkaisevia, oliiviöljyn fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien sekä määritysmenetelmien määritteleminen johtaa yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän lisähuomautusten mukauttamiseen, neitsytöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointimenetelmään kuuluu valituista ja koulutetuista maistajista koostuvien raatien muodostaminen; tämän vuoksi olisi säädettävä tällaisen järjestelyn luomiseen tarvittavasta määräajasta; ottaen huomioon joidenkin jäsenvaltioiden vaikeudet maistajien raadin muodostamisessa olisi sallittava muiden jäsenvaltioiden raatien käyttö, oliivijätteiden tuontiin sovellettavan tuontimaksujärjestelmän moitteettoman toiminnan varmistamiseksi olisi säädettävä yhtenäisestä menetelmästä näiden tuotteiden öljypitoisuuden määrittämiseksi, on suotavaa säätää ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakatun öljyn myyntiä koskevasta määräajasta, jottei kaupalle aiheutuisi haittaa, on syytä kumota komission asetus (ETY) N:o 1058/77(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1858/88(4), ja rasvojen hallintokomitea ei ole antanut lausuntoa puheenjohtajansa asettamassa määräajassa, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla 1 Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 1, 2 ja 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevissa 1 a, 1 b ja 1 c kohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä. 2 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 d kohdassa tarkoitettuna oliivilamppuöljynä. 3 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna puhdistettuna oliiviöljynä. 4 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna oliiviöljynä. 5 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettuna raakana uutettuna oliiviöljynä. 6 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettuna puhdistettuna uutettuna oliiviöljynä. 7 Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 9 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna uutettuna oliiviöljynä. 2 artikla 1 Niiden öljyjen, joista määrätään liitteessä I, ominaisuudet määritetään seuraavia määritysmenetelmiä noudattaen: - oleiinihappoprosentteina ilmaistavien vapaiden rasvahappojen määrittäminen liitteen II menetelmällä, - peroksidiluvun määrittäminen liitteen III menetelmällä, - alifaattisten alkoholien määrittäminen liitteen IV menetelmällä, - sterolipitoisuuden määrittäminen liitteen V menetelmällä, - erytrodiolin ja uvaolin määrittäminen liitteen VI menetelmällä, - triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen määrittäminen liitteen VII menetelmällä, - trilinoleiinipitoisuuden määrittäminen liitteen VIII menetelmällä, - spektrofotometrinen määritys liitteen IX menetelmällä, - rasvahappokoostumuksen määrittäminen liitteiden X A ja X B menetelmällä, - haihtuvien halogeeniliuottimien määrittäminen liitteen XI menetelmällä, - neitsytoliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien arviointi liitteen XII menetelmällä 2 kohdan mukaisesti sovellettuna, - öljyn puhdistuksen toteaminen liitteen XIII menetelmällä. 2 Aistinvaraiset ominaisuudet arvioi maistaja, tarvittaessa asiantuntijoiden avustamana, liitteen XII lomakkeessa esitettyä maistamismenettelyä noudattaen. Kun arvio on ristiriidassa tuotteen nimityksen kanssa, maistajan on annettava näyte maistajien raadin tutkittavaksi liitteen XII määräysten mukaisesti. Maistajien raadin on tehtävä mahdolliset uusintamääritykset näiden määräysten mukaisesti. Kun aistinvaraiset ominaisuudet arvioidaan interventiojärjestelmään liittyvien toimien toteuttamisen aikana, maistajien raati tekee tämän arvion liitteen XII mukaisesti. 3 artikla Edellä 2 artiklassa säädettyjen määritysmenetelmien käyttöönotto ei estä jäsenvaltioita käyttämästä muita kokeiltuja ja tieteellisesti päteviä menetelmiä 31 päivään lokakuuta 1992, jos tästä ei aiheudu haittaa sellaisten tuotteiden liikkuvuudelle, jotka on yhteisön menetelmin todettu voimassa olevien säännösten mukaisiksi. Ennen tällaisten muiden menetelmien käyttöä jäsenvaltioiden on ilmoitettava niistä komissiolle. Kun jollakin näistä muista menetelmistä saadaan eri tulos kuin yhteisön menetelmällä, viimeksi mainitulla menetelmällä saatua tulosta pidetään ratkaisevana. 4 artikla 1 Jäsenvaltioiden on muodostettava valittujen ja koulutettujen maistajien raateja aistinvaraisten ominaisuuksien arvioimiseksi liitteessä XII esitetyn menettelyn sääntöjä noudattaen. 2 Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin muodostamisessa alueelleen, se voi käyttää toisessa jäsenvaltiossa toimivaa raatia. 5 artikla Yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän 2, 3 ja 4 lisähuomautus korvataan vastaavasti tämän asetuksen liitteessä XIV olevilla 2, 3 ja 4 lisähuomautuksella. 6 artikla 1 Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdistetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvien jätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti. 2 Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn painoprosenttina kuiva-aineesta. 7 artikla Muiden kuin liitteessä XI tarkoitettujen haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä. 8 artikla 1 Jäsenvaltioiden on ilmoitettava komissiolle tämän asetuksen soveltamiseksi toteutetut toimenpiteet. 2 Kunkin vuosipuoliskon alussa jäsenvaltioiden on toimitettava komissiolle tiedoksi yhteenveto edellisen vuosipuoliskon aikana tehtyjen määritysten tuloksista. Rasvojen hallintokomitea tutkii nämä tulokset asetuksen N:o 136/66/ETY 39 artiklassa säädettyä menettelyä noudattaen. 9 artikla Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77. 10 artikla 1 Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteen XII menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön 1 päivästä tammikuuta 1992, interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta. 2 Tämä asetus ei koske ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyä tai uutettua oliiviöljyä. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 11 päivänä heinäkuuta 1991. Komission puolesta Ray MAC SHARRY Komission jäsen (1) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66 (2) EYVL N:o L 353, 17.12.1990, s. 23 (3) EYVL N:o L 128, 24.5.1977, s. 6 (4) EYVL N:o L 166, 1.7.1988, s. 10 LIITTEET Yhteenveto Sivu Liite I Oliiviöljyn ominaisuudet 177 Liite II Vapaiden rasvahappojen määrittäminen 179 Liite III Peroksidiluvun määrittäminen 181 Liite IV Alifaattisten alkoholien pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä 183 Liite V Sterolien rakenteen ja pitoisuuden määrittäminen kapillaarikaasukromatografisella menetelmällä 188 Liite VI Erytrodioli- ja uvaolipitoisuuden määrittäminen 195 Liite VII Triglyseridin 2-asemassa olevien tyydyttyneiden rasvahappojen määrittäminen 197 Liite VIII Trilinoleiinipitoisuuden määrittäminen 201 Liite IX Spektrofotometrinen määritys 205 Liite X A Rasvahappojen metyyliestereiden määrittäminen kaasukromatografisella menetelmällä 208 Liite X B Rasvahappojen metyyliestereiden valmistaminen 215 Liite XI Haihtuvien halogeeniliuottimien pitoisuuden määrittäminen oliiviöljystä 219 Liite XII Neitsytoliiviöljyn aistinvarainen arviointi 220 Liite XIII Öljyn puhdistuksen toteaminen 245 Liite XIV Yhdistetyn nimikkeistön 15 ryhmän lisähuomautukset 2, 3 ja 4 247 Liite XV Oliivijätteen öljypitoisuus 249 Liite XVI Jodiluvun määrittäminen 251 LIITE I OLIIVIÖLJYN OMINAISUUDET >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> LIITE II VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS Vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyistä. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus ilmaistaan tavanomaisesti laskettuna happamuutena. 1.1 Periaate Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella. 1.2 Reagenssit Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta. 1.2.1 Dietyylieetteri ja 95-prosenttinen etanoli (V/V), yhtä suuret tilavuusosat kumpaakin. Huom.: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen. Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (1.2.3) 100 ml:aan, neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2), Huom.: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propanolilla. 1.2.2 Kaliumhydroksidi titrattuna etanoliliuoksena, c(KOH) noin 0,1 mol/l tai tarvittaessa c(KOH) noin 0,5 mol/l. Kaliumhydroksidin etanoliliuoksen tarkka väkevyys on tunnettava ja tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipulloon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista. Huom.: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos voidaan valmistaa seuraavasti. Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia, johon on lisätty 8 g kaliumhydroksidia ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas neste, joka on kaliumkarbonaattisakan yläpuolella. Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään 4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia ja seoksen annetaan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan sakan yläpuolinen neste ja liuotetaan siihen tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Liuos on käyttövalmis. 1.2.3 Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V) tai, jos rasva on kovin tummaa, alkalisini, 20 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V). 1.3 Välineistö Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti: 1.3.1 Analyysivaaka 1.3.2 Erlenmeyerpullo, 250 ml 1.3.3 Byretti, 10 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml. 1.4 Suoritus 1.4.1 Näytteen esikäsittely määritystä varten Määritys tehdään suodatetusta näytteestä. Jos veden ja epäpuhtauksien kokonaispitoisuus on pienempi kuin 1 %, voidaan määritys tehdä näytteestä sellaisenaan. 1.4.2 Näytteenotto Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon mukaan: >TAULUKON PAIKKA> Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (1.3.2). 1.4.3 Määritys Näyte (1.4.2) liuotetaan 50 150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieetteri/etanoli-seosta (1.2.1). Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2) (ks. Huom. 2), kunnes indikaattorin väri muuttuu (fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan). Huom. 1 Titrattu kaliumhydroksidin etanoliliuos (1.2.2) voidaan korvata kalium- tai natriumhydroksidin vesiliuoksella, jos lisätty vesi ei aiheuta faasien erottumista. Huom. 2 Jos 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuosta tarvitaan enemmän kuin 10 ml, käytetään 0,5 mol/l liuosta. Huom. 3 Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (1.2.1) lisätään tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta. 1.5 Happamuus: ilmaistuna oleiinihappoprosentteina Happamuus painoprosentteina ilmaistuna on: V × c × >NUM>M/>DEN>1 000 × >NUM>100/>DEN>m =>NUM>V × c × M/>DEN>10 × m jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo. LIITE III PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS Tämä standardi kuvaa rasvojen ja öljyjen peroksidiluvun määritysmenetelmää. 2 SOVELTAMISALA Tämä standardi soveltuu eläin-ja kasvirasvojen sekä -öljyjen tutkimiseen. 3 MÄÄRITELMÄ Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa. 4 PERIAATE Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kaliumjodidilla. Vapautuva jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella. 5 VÄLINEISTÖ Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään hapettavia tai pelkistäviä aineita. Huom.: Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata. 5.1 Punnituslasi, 3 ml. 5.2 Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiilidioksidilla). 5.3 Byretti, 25 tai 50 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,1 ml. 6 REAGENSSIT 6.1 Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla. 6.2 Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla. 6.3 Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaatteja. 6.4 Natriumtiosulfaatin vesiliuos, 0,01 tai 0,002 N, normalisoitu huolellisesti juuri ennen käyttöä. 6.5 Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä valmistettu tuore liuos. 7 NÄYTE Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla. 8 SUORITUS Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa (5.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan taulukon mukaan: >TAULUKON PAIKKA> Avataan pullo (5.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään 10 ml kloroformia (6.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään 15 ml etikkahappoa (6.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (6.3). Suljetaan pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi minuuttia pimeässä 15-25 °C:n lämpötilassa. Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (6.4) (jos oletettu peroksidiluku on alle 12, käytetään 0,002 N liuosta ja jos se on yli 12, käytetään 0,01 N liuosta) voimakkaasti sekoittaen ja indikaattorina käytetään tärkkelysliuosta (6.5). Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä. Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml 0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (6.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja ne on vaihdettava. 9 TULOSTEN ESITTÄMINEN Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti, saadaan kaavasta: PV = >NUM>V × T × 1 000/>DEN>m jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo. LIITE IV ALIFAATTISTEN ALKOHOLIEN PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ 1 TARKOITUS Tällä menetelmällä voidaan määrittää alifaattisten alkoholien määrä öljyissä ja rasvoissa. 2 PERIAATE Rasva tai öljy, johon on lisätty 1-eikosanolia sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton osa uutetaan etyylieetterillä. Alkoholifraktio erotetaan saippuoitumattomasta uutteesta kromatografian avulla emäksisellä silikageelilevyllä; silikageelistä saadut alkoholit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografian avulla. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiotut lasiliitännät sekä palautusjäähdytin. 3.2 Erotussuppilo, 500 ml. 3.3 Pulloja, 250 ml. 3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka lasilevyjen koko on 20 × 20 cm. 3.5 UV-valo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm. 3.6 Mikroruiskuja, 100 ìl ja 500 ìl. 3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15-40 mm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiöimusuodatusta varten sekä koirashios >NUM>12/>DEN>21. 3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on suodatinsuppiloon (3.7) sopiva naarashios >NUM>12/>DEN>21. 3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on ilmatiivis tulppa ja kartiomainen pohja. 3.10 Kaasukromatografi, jota voi käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon liittyy virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat: 3.10.1 Termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin ± 1 °C:n tarkkuudella; 3.10.2 Höyrystämisyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämisosa on persilanoitua lasia; 3.10.3 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin; 3.10.4 Integraattori-piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen kanssa ja jonka vasteaika on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. 3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20-30 m ja sisähalkaisija 0,25-0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä SE-52 tai SE-54 tai vastaavalla, siten että nestekerroksen paksuus on 0,10-0,30 ìm. 3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula kaasukromatografiaa varten, 10 ìl. 4 REAGENSSIT 4.1 Kaliumhydroksidi, noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia (vähintään 85-prosenttista) liuotetaan samalla jäähdyttäen 200 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuos säilytetään tiiviisti suljetuissa tummissa lasipulloissa. 4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua. 4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua. 4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, ilman fluoresenssi-indikaattoria, paksuudeltaan 0,25 mm (voidaan ostaa käyttövalmiina). 4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: 13 g kaliumhydroksidia liuotetaan 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin että liuosta on 1 litra. 4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten. (Ks. 5.2.2). 4.7 Asetoni, kromatografiaa varten. (Ks. 5.2.2). 4.8 Heksaani, kromatografiaa varten. (Ks. 5.2.2). 4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten. (Ks. 5.2.2). 4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua. 4.11 Vertailuliuos ohutkerroskromatografiaa varten: 5-prosenttinen C20 C28 -alkoholien kloroformiliuos. 4.12 2,7-dikloorifluoreseiinin 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N alkoholiliuosta. 4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten. 4.14 Heksametyylidisilatsaani. 4.15 Trimetyylikloorisilaani. 4.16 Alifaattisten C20 C28 -alkoholien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan puhtaiden alkoholien seoksista juuri ennen käyttöä. 4.17 0,1-prosenttinen (m/V) 1-eikosanolin kloroformiliuos (sisäinen standardi). 4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. 4.19 Apukaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. 5 MENETTELY 5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely 5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 ml:n mikroruiskulla sellainen tilavuusmäärä 0,1-prosenttista 1-eikosanolin kloroformiliuosta (4.17), jonka sisältämä 1-eikosanolin määrä on suunnilleen 10 % määritystä varten otettavan näytteen alifaattisten alkoholien määrästä. Esimerkiksi, jos näytettä on 5 g ja se on oliiviöljyä tai siemenöljyä, lisätään 250 ìl 0,1-prosenttista 1-eikosanoliliuosta, ja jos se on uutettua oliiviöljyä, lisätään 1 500 ml liuosta. Haihdutetaan liuos kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivaa, suodatettua näytettä samaan pulloon. 5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, palautusjäähdytin käynnistetään ja liuosta kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuutin ajan ja lisätään sitten 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen läpi. Sen jälkeen palautusjäähdytin irrotetaan ja pullo jäähdytetään noin 30 °C:n lämpötilaan. 5.1.3 Pullon sisältö siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon käyttämällä huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekuntia ja annetaan seistä niin että kerrokset erottuvat (Huom. 1). Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa kuten edellä, käyttäen molemmilla kerroilla 60 70 ml etyylieetteriä. Huom. 1 Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia tai metanolia suihkeena. 5.1.4 Eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tislatulla vedellä (50 ml kerrallaan), kunnes pesuvesi on neutraalia. Pesuvesi heitetään pois, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja suodatetaan etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä. 5.1.5 Eetteriä haihdutetaan, kunnes sitä on hyvin vähän jäljellä, ja kuivataan heikossa alipaineessa tai typpivirrassa; lopuksi kuivataan lämpökaapissa 100 °C:ssa noin 15 min, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. 5.2 Alkoholifraktioiden erottaminen 5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: silikageelilevyt (4.4) upotetaan kokonaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) 10 sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua vetokaapissa kahden tunnin ajan ja lopuksi yhden tunnin ajan lämpökaapissa 100 °C:ssa. Levyt otetaan lämpökaapista ja säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen asti (näin käsitellyt levyt on käytettävä kahden viikon kuluessa). Huom. 2 Kun käytetään emäksisiä silikageelilevyjä alkoholifraktion erottamiseen, saippuoitumattomia aineita ei tarvitse käsitellä alumiinilla. Täten kaikki happamat yhdisteet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Tällöin saadaan sekä alifaattisten alkoholien vyöhyke että terpeenisten alkoholien vyöhyke, jotka molemmat erottuvat selvästi sterolivyöhykkeestä. 5.2.2 Bentseenin ja asetonin seos, 95:5 (V/V), kaadetaan kehitysastiaan niin että sitä on noin 1 cm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää heksaanin ja etyylieetterin seosta tilavuussuhteessa 65:35. Astia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan olla vähintään puoli tuntia suljettuna, jotta neste ja höyry saavuttavat tasapainon. Suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen, voidaan kiinnittää astian sisäseinään. Näin kehitysaika lyhenee noin kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 3 Seos on vaihdettava uuteen jokaista määritystä varten, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. 5.2.3 Saippuoitumattomasta osasta (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen kloroformiliuos ja 0,3 ml liuosta levitetään mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana käyttäen 100 ml:n mikroruiskua, noin 2 cm:n päähän lasilevyn alareunasta. Asetetaan yhdelle levyn reunoista 2 3 ml alifaattisten alkoholien vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle, jotta alifaattisten alkoholien vyöhyke olisi helppo tunnistaa kehittämisen jälkeen. 5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan mukaisesti. Ympäristön lämpötilan on oltava 15 20 °C. Astia suljetaan kannella välittömästi, minkä jälkeen näytteen annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai levy jätetään joksikin aikaa vetokaappiin. 5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloori-fluoreseiiniliuosta. Alifaattisten alkoholien vyöhyke erottuu ultraviolettivalossa tarkasteltuna vertailuliuostäplään verrattaessa; alifaattisten alkoholien vyöhykkeen ja välittömästi sen yläpuolella olevan, terpeenialkoholeja vastaavan vyöhykkeen muodostaman kokonaisuuden ympärille piirretään viiva mustalla kynällä. Huom. 4 Koska terpeenialkoholien vyöhyke sisältää näissä koeolosuhteissa huomattavan määrän alifaattisia alkoholeja, molemmat vyöhykkeet on kerättävä talteen yhdessä. 5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä. Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4 5 ml ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen minuuttia 105 °C:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. Koeputkessa oleva jäännös sisältää alkoholifraktion. 5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistelu 5.3.1 Koeputkessa olevaan alkoholifraktioon lisätään silylointireagenssi niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom. 6); mainittu reagenssi on seos, jossa on tilavuussuhteessa 9:3:1 pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania (Huom. 5); seosta tarvitaan 50 ml jokaista alifaattisten alkoholien milligrammaa kohti. Huom 5 Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. 5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla ja sitä ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes alifaattiset alkoholit ovat täysin liuenneet. Putken annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sen jälkeen sitä sentrifugoidaan muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten. Huom. 6 Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava. 5.4 Kaasukromatografinen määritys 5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu 5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että kolonnin alkupää kiinnitetään höyrystimeen, joka on liitetty virtauksenjakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus, jne.) 5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 7). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö, jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 7 Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2 Käyttöolosuhteiden valinta 5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat: - kolonnin lämpötila: alussa isotermi säädetään 180 °C:seen kahdeksaksi minuutiksi ja ohjelmoidaan nousemaan sen jälkeen 5 °C minuutissa, kunnes saavutetaan 260 °C:n lämpötila, joka pidetään yllä seuraavat 15 minuuttia, - höyrystimen lämpötila: 280 °C, - detektorin lämpötila: 290 °C, - kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20 35 cm/s, vedylle 30 50 cm/s, - jakosuhde: 1:50 1:100, - laitteiston herkkyys: 4 16 kertaa vähimmäisvaimennus, - rekisteröintiherkkyys: 1 2 mV täydestä asteikosta - paperin nopeus: 30 60 cm/h, - injektoidun aineen määrä: 0,5 1 ìl trimetyylisilyylieetteriliuosta (TMSE). Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan aikaan kromatogrammeja, jotka täyttävät seuraavat vaatimukset: - C26-alkoholin retentioaika on 18 ± 5 minuuttia, - C22-alkoholin piikki on 80 ± 20 % täydestä asteikosta oliiviöljylle ja 40 ± 20 % täydestä asteikosta siemenöljylle. 5.4.2.2 Näiden ehtojen täyttymisen tarkistamiseksi injektoidaan useaan kertaan standardi TMSE alkoholiseosta, ja käyttöolosuhteita säädetään niin, että saadaan parhaat mahdolliset tulokset. 5.4.2.3 Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että saadaan oikeat arvot huomioon otettaville piikeille. 5.4.3 Määritys 5.4.3.1 Imetään 10 ìl:n mikroruiskuun 1 ìl heksaania, sitten 0,5 ìl ilmaa ja tämän jälkeen 0,5 ìl 1 ìl näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja 1 2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti. 5.4.3.2 Piirturi pidetään käynnissä, kunnes näytteessä olevien alifaattisten alkoholien TMSE on eluoitunut täydellisesti. Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen. 5.4.4 Piikkien tunnistaminen Yksittäiset piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla alifaattisten alkoholien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa. Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn alkoholifraktion kromatogrammia. 5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi 5.4.5.1 1-eikosanolin ja C22 C28 alifaattisten alkoholien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla. 5.4.5.2 Lasketaan kunkin alifaattisen alkoholin pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasti: x-alcoholi = >NUM>Ax 7 ms 7 100/>DEN>As 7 m jossa: >TAULUKON PAIKKA> 6 TULOSTEN ESITTÄMINEN Ilmoitetaan yksittäisten alifaattisten alkoholien pitoisuudet milligrammoina 100 g:ssa öljyä tai rasvaa sekä pitoisuuksien summa alifaattisten alkoholien yhteenlaskettuna määränä. LISÄYS Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita varten ja injektoidaan 1 3 ml metaania (tai propaania) sekä mitataan aika, jonka kuluessa kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM). Lineaarinopeus (cm/s) saadaan kaavasta L/tM, missä L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on mitattu aika. >VIITTAUS KAAVIOON> LIITE V STEROLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ 1 TARKOITUS Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien määrät ja niiden kokonaismäärä rasvoissa ja öljyissä. 2 PERIAATE Rasva tai öljy, johon on lisätty a-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines uutetaan etyylieetterillä. Sterolifraktio erotetaan saippuoitumattomasta uutteesta ohutkerroskromatografialla käyttäen emäksistä silikageelilevyä. Silikageelistä saadut sterolit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografialla. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Pullo, 250 ml, jossa on hiokset ja palautusjäähdytin. 3.2 Erotussuppilo, 500 ml. 3.3 Pulloja, 250 ml. 3.4 Ohutkerroskromatografialaitteisto, jonka levyjen koko on 20 × 20 cm. 3.5 Ultraviolettivalo, jonka aallonpituus on 366 tai 254 nm. 3.6 Mikroruiskuja, 100 ìl ja 500 ìl 3.7 Lasisintterisuodatinsuppilo, jonka huokoskoko on G 3 (15 40 ìm), halkaisija noin 2 cm ja korkeus noin 5 cm ja jossa on liitäntä tyhjiösuodatusta varten sekä koirashios >NUM>12/>DEN>21. 3.8 Tyhjiöimupullo, 50 ml, jossa on naarashios >NUM>12/>DEN>21, joka sopii suodatinsuppiloon (3.7). 3.9 Koeputki, 10 ml, jossa on kartiomainen pohja ja ilmatiivis tulppa. 3.10 Kaasukromatografi, johon sopii kapillaarikolonni ja johon kuuluu virtauksenjakojärjestelmä, jonka osat ovat: 3.10.1 Termostaattisäätöinen kolonniuuni, joka säilyttää halutun lämpötilan noin ± 1 °C:n tarkkuudella; 3.10.2 Höyrystämisyksikkö, jonka lämpötilaa voi säätää ja jonka höyrystämisosa on persilanoitua lasia; 3.10.3 Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin; 3.10.4 Integraattori-piirturi, joka sopii käytettäväksi muuntajavahvistimen kanssa. 3.11 Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 20 30 m ja sisähalkaisija 0,25 0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nesteellä SE-52 tai SE-54 tai vastaavalla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10 0,30 mm. 3.12 Mikroruisku, jossa on karkaistu neula, kaasukromatografiaa varten, 10 ìl. 4 REAGENSSIT 4.1 Kaliumhydroksidin noin 2 N etanoliliuos: 130 g kaliumhydroksidia (vähintään 85-prosenttista) liuotetaan 200 ml:aan tislattua vettä samalla jäähdyttäen ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. Liuosta säilytetään tiiviisti suljetuissa, tummasta lasista valmistetuissa pulloissa (etanoli 95 % V/V). 4.2 Etyylieetteri, analyysilaatua. 4.3 Vedetön natriumsulfaatti, analyysilaatua. 4.4 Silikageelillä päällystetyt lasilevyt, paksuudeltaan 0,25 mm, ilman fluoresenssi-indikaattoria (voidaan ostaa käyttövalmiina). 4.5 Kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuos: liuotetaan 13 g kaliumhydroksidia 20 ml:aan tislattua vettä ja lisätään etanolia niin, että liuosta on yksi litra. 4.6 Bentseeni, kromatografiaa varten (5.2.2). 4.7 Asetoni, kromatografiaa varten (5.2.2). 4.8 Heksaani, kromatografiaa varten (5.2.2). 4.9 Etyylieetteri, kromatografiaa varten (5.2.2). 4.10 Puhdas kloroformi, analyysilaatua (5.2.2). 4.11 Ohutkerroskromatografian vertailuliuos: 5-prosenttinen kolesterolin tai fytosterolin kloroformiliuos. 4.12 2,7-dikloorifluoreseiini, 0,2-prosenttinen etanoliliuos. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä muutama tippa kaliumhydroksidin 2 N alkoholiliuosta. 4.13 Vedetön pyridiini, kromatografiaa varten. 4.14 Heksametyylidisilatsaani. 4.15 Trimetyylikloorisilaani. 4.16 Sterolien trimetyylisilyylieettereiden standardiliuokset. Ne valmistetaan vasta käyttöhetkellä steroleista, jotka saadaan niitä sisältävistä öljyistä. 4.17 á-kolestanoli 0,2-prosenttisena (m/V) kloroformiliuoksena (sisäinen standardi). 4.18 Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. 4.19 Apukaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua. 5 MENETTELY 5.1 Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely 5.1.1 250 ml:n pulloon lisätään 500 ml:n mikroruiskulla sellainen tilavuusmäärä 0,2-prosenttista á-kolestanolin kloroformiliuosta (4.17) jonka sisältämä á-kolestanolin määrä on noin 10 % sterolin määrästä siinä osanäytteessä, joka on pullossa määritettävänä. Esimerkiksi 5 gramman oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 ìl 0,2-prosenttista á-kolestanoliliuosta, ja jos näytteenä on siemenöljyä tai uutettua oliiviöljyä, lisätään 1 500 ìl á-kolestanolia. Haihdutetaan kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivattua, suodatettua näytettä samaan pulloon. Eläin-tai kasvirasvat ja -öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia, voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on sama kuin kolestanolin. Jos käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa käytetään sisäistä standardia ja toisella ei. 5.1.2 Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, käynnistetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia, sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 °C:n lämpötilaan. 5.1.3 Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon käyttäen huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekunnin ajan ja annetaan seistä niin, että kerrokset erottuvat (Huom. 1). Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttäen 60 70 ml etyylieetteriä kummallakin kerralla. Huom. 1 Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia tai metanolia suihkeena. 5.1.4 Kaikki eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tislatulla vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesi on neutraalia. Kun pesuvesi on poistettu, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin läpi etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä. 5.1.5 Eetteriä haihdutetaan niin, että sitä on ainoastaan muutama millilitra, jäännös kuivataan sitten pienessä alipaineessa tai typpivirrassa ja lopuksi kuivataan lämpökaapissa, jonka lämpötila on 100 °C, noin 15 minuutin ajan, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. 5.2 Sterolifraktion erottaminen 5.2.1 Emäksisten levyjen valmistelu: upotetaan silikageelilevyt (4.4) kokonaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) kymmeneksi sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja lopuksi yksi tunti 100 °C:ssa lämpökaapissa. Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt on käytettävä 15 päivän kuluessa). Huom. 2 Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikageelilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu selvästi alifaattisten ja terpeenisten alkoholien vyöhykkeestä. 5.2.2 Bentseeni-asetoniseosta (95:5, V/V) kaadetaan kehitysastiaan niin, että sitä on noin 1 cm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää heksaani-etyylieetteriseosta (65:35, V/V). Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 3 Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. 5.2.3 Saippuoitumattomista aineista (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen kloroformiliuos, jota levitetään 0,3 ml kromatografialevylle (5.2.1) mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana 100 ml:n mikroruiskulla noin 2 cm:n päähän levyn reunasta. Asetetaan 2 3 ml sterolien vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle levyn reunaan niin että sterolivyöhyke voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen. 5.2.4 Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan ohjeiden mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15 20 °C. Astian kansi suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siirtynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai panemalla levy joksikin aikaa vetokaappiin. 5.2.5 Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Sterolivyöhyke voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa siitä, että se on samassa kohdassa kuin vertailuliuoksen vyöhyke. Vyöhykkeen ääriviivat merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten. 5.2.6 Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml kuumaa kloroformia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon (3.8) tyhjiöllä. Suppiloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä, ja suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4 5 ml ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen minuuttia 105 °C:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. Koeputkessa oleva jäännös sisältää sterolifraktion. 5.3 Trimetyylisilyylieettereiden valmistus 5.3.1 Koeputkessa olevaan sterolifraktioon lisätään silylointireagenssia, jossa on pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania tilavuussuhteessa 9:3:1 (Huom. 4), 50 ml jokaista koeputkessa olevaa sterolimilligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom. 5). Huom. 4 Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. 5.3.2 Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes sterolit ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten. Huom. 5 Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava. 5.4 Kaasukromatografinen määritys 5.4.1 Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu 5.4.1.1 Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että kolonnin alkupää kiinnitetään höyrystimeen, joka on liitetty virtauksenjakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus, jne.) 5.4.1.2 Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 6). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö, jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 6 Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2 Toimintaolosuhteiden valinta 5.4.2.1 Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat: - kolonnin lämpötila: 260 ± 5 °C, - höyrystimen lämpötila: 280 °C, - detektorin lämpötila: 290 °C, - kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20 35 cm/s ja vedylle 30 50 cm/s, - jakosuhde: 1:50 1:100, - laitteiston herkkyys: 4 16 kertaa vähimmäisvaimennus, - rekisteröintiherkkyys: 1 2 mV täydestä asteikosta, - paperin nopeus: 30 60 cm/h, - injektoidun aineen määrä: 0,5 1 ml TMSE-liuosta. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset täyttävä kromatogrammi: - ß-sitosterolin retentioajan on oltava 20 ± 5 minuuttia, - kampesterolin piikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %) 15 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin 20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta, - kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos piikki TRR 1,02:ssa pystytään mittaamaan kohtisuoraan. 5.4.3 Määritys 5.4.3.1 Imetään 10 ml:n mikroruiskuun 1 ml heksaania, sitten 0,5 ml ilmaa ja tämän jälkeen 0,5 ml 1 ml näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektiopesään ja 1 2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti. 5.4.3.2 Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien sterolien TMSE on kokonaan eluoitunut. Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 kohdan vaatimusten mukainen. 5.4.4 Piikkien tunnistaminen Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaamalla sterolien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa. Sterolit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli, 24-metyleenikolesteroli, kampestroli, kampestanoli, stigmasteroli, Ä7-kampesteroli, Ä5,23-stigmastadienoli, klerosteroli, ß-sitosteroli, sitostanoli, Ä5-avenasteroli, Ä5,24-stigmastadienoli, Ä7-sigmastenoli, Ä7-avenasteroli. Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulukossa 1. Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja. 5.4.5 Kvantitatiivinen arviointi 5.4.5.1 Lasketaan á-kolestanolin ja sterolien piikkien pinta-alat integraattorin avulla. Sellaisten aineiden piikit, jotka eivät esiinny taulukossa 1, jätetään huomiotta. á-kolestanolin vastekerroin on 1. 5.4.5.2 Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasta kaavasta: x-steroli = >NUM>Ax 7 ms 7 100/>DEN>As 7 m jossa: >TAULUKON PAIKKA> 6 TULOSTEN ESITTÄMINEN 6.1 Ilmoitetaan yksittäisten sterolien pitoisuus milligrammoina 100 g:ssa rasvaa tai öljyä ja niiden pitoisuuksien summa, "kokonaissterolimäärä". 6.2 Lasketaan yksittäisen sterolin prosenttiosuus sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien sterolipiikkien yhteenlasketusta pinta-alasta. x-sterolin prosenttiosuus = >NUM>Ax/>DEN>ÓA. 100 Jossa: >TAULUKON PAIKKA> LISÄYS Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi, injektoidaan 1 3 ml metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM). Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on mitattu aika sekunteina. >TAULUKON PAIKKA> >KAAVION ALKU> Kuva 1 Raakaoliiviöljyn sterolifraktion Kaasukromatogrammi >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> Kuva 2 Puhdistetun oliiviöljyn sterolifraktion kaasukromatogrammi >KAAVION LOOPU> >VIITTAUS KAAVIOON> LIITE VI ERYTRODIOLI- JA UVAOLIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN JOHDANTO Erytrodioli, jolla yleensä tarkoitetaan dioleja erytrodioli ja uvaoli yhdessä, on joillekin rasvoille ja öljyille tyypillinen saippuoitumattoman osan aine. Sen pitoisuus on selvästi kohonnut uutetussa oliiviöljyssä; puristetussa oliiviöljyssä ja rypälesiemenöljyssä sitä on vähän, joten sen esiintyminen voi olla merkki siitä, että joukkoon on lisätty uutettua oliiviöljyä. 1 TARKOITUS Tällä menetelmällä voidaan määrittää rasvan tai öljyn erytrodiolipitoisuus. 2 PERIAATE Rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella. Saippuoitumaton osa uutetaan etyylieetterillä ja puhdistetaan johtamalla se alumiinioksidikolonnin läpi, minkä jälkeen saippuoitumattomat aineet erotetaan silikageelilevyillä ohutkerroskromatografialla. Tällöin steroli- ja erytrodiolifraktiovyöhykkeet erottuvat. Levyltä saadut sterolit ja erytrodioli muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kaasukromatografialla. Tulos ilmoitetaan erytrodiolin prosenttiosuutena erytrodiolin ja sterolien seoksesta. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Sama kuin liitteessä V (Sterolien määritys). 4 REAGENSSIT 4.1 Samat kuin liitteessä V (Sterolien määritys). 4.2 Vertailuliuoksena erytrodiolin 0,5-prosenttinen kloroformiliuos. 5 SUORITUS 5.1 Saippuoitumattoman osan esikäsittely. Kuten liitteessä V olevassa 5.1.2 kohdassa. 5.2 Erytrodiolin ja sterolien erottaminen. 5.2.1 Ks. menettely liitteessä V olevassa 5.2.1 kohdassa. 5.2.2 Ks. sama menettely liitteessä V olevassa 5.2.2 kohdassa. 5.2.3 Valmistetaan saippuoitumattomasta aineksesta 5-prosenttinen kloroformiliuos. Levitetään 0,3 ml liuosta mahdollisimman ohueksi ja tasaiseksi viivaksi 0,1 ml:n mikroruiskulla noin 1,5 cm:n päähän levyn alareunasta. Asetetaan muutama mikrolitra erytrodioli- ja kolesteroliliuosta vertailua varten levyn reunaan. 5.2.4 Asetetaan levy kehitysastiaan, joka on esikäsitelty kuten 5.2.1 kohdassa. Ympäristön lämpötilan on oltava noin 20 °C. Astia suljetaan heti kannella ja annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa. 5.2.5 Levylle suihkutetaan tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta. Kun levyä tarkastellaan ultraviolettivalossa, sterolin ja erytrodiolin vyöhykkeet voidaan tunnistaa kohdistamalla ne vertailuliuoksen vyöhykkeisiin. Vyöhykkeet merkitään pisteellä, joka on juuri fluoresenssialueen reunojen ulkopuolella. 5.2.6 Silikageeli raaputetaan levystä irti metallilastalla merkityn alueen kohdalta. Irrotettu aines pannaan 50 ml:n pulloon. Lisätään 15 ml kuumaa kloroformia, ravistetaan hyvin ja suodatetaan suppilon läpi, jossa on huokoinen suodatin, johon silikageeli jää. Pestään kolme kertaa kuumalla kloroformilla (noin 10 ml kerralla) ja kerätään suodos 100 ml:n pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sitä on 4 5 ml, siirretään se punnittuun, kartiomaisella pohjalla varustettuun 10 ml:n sentrifugiputkeen, kuivatetaan typpivirrassa miedolla lämmöllä ja punnitaan. 5.3 Trimetyylisilyylieetterien valmistus Kuten liitteessä V olevassa 5.3 kohdassa. 5.4 Kaasukromatografinen määritys Kuten liitteessä V olevassa 5.4 kohdassa. Kaasukromatografisen määrityksen olosuhteiden on oltava sellaiset, että ne täyttävät sterolien määritysvaatimukset ja että lisäksi erytrodiolin ja uvaolin TMSE:t erottuvat. Kun näyte on injektoitu, rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevat sterolit, erytrodioli ja uvaoli ovat kokonaan eluoituneet. Tämän jälkeen tunnistetaan piikit (erytrodiolin ja uvaolin retentioajat ovat noin 1,45 ja 1,55 suhteessa ß-sitosteroliin) ja piikkien pinta-alat lasketaan kuten steroleille. 6 TULOSTEN ESITTÄMINEN Erytrodioli % = >NUM>A1 + A2/>DEN>A1 + A2 + ÓAsterolit × 100 Jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella. LIITE VII TRIGLYSERIDIN 2-ASEMASSA OLEVIEN TYYDYTTYNEIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS Tämä standardi kuvaa menetelmän, jolla määritetään sellaiset rasvojen ja öljyjen rasvahapot, jotka ovat esteröityneet glyserolin 2-hiileen (keskimmäinen). 2 SOVELTAMISALA Tätä menetelmää voidaan käyttää tutkittaessa öljyjä tai rasvoja, joiden sulamispiste on alle 45 °C, mikä johtuu haimalipaasin vaikutuksen erityispiirteistä. Tämä menetelmä ei sovellu varauksetta sellaisten rasvojen tai öljyjen määritykseen, joiden rasvahapot sisältävät runsaasti enintään 12 hiiliatomia sisältäviä rasvahappoja (kookosöljy ja palmunydinöljy, voirasva), voimakkaasti tyydyttymättömien rasvahappojen määritykseen (kaksoissidoksia on enemmän kuin neljä) tai rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät vähintään 20 hiiliatomia (kalojen ja merieläinten öljyt), eikä sellaisten rasvahappojen määritykseen, jotka sisältävät muita happipitoisia ryhmiä kuin happoryhmän. 3 PERIAATE Rasva tai öljy neutraloidaan tarvittaessa liuottimessa. Rasva tai öljy puhdistetaan johtamalla se alumiinioksidikolonnin läpi. Triglyseridit hydrolysoidaan osittain haimalipaasin avulla määräajassa. Muodostuneet monoglyseridit erotetaan ohutkerroskromatografialla ja esteröidään metanolilla. Syntyneet metyyliesterit määritetään kaasunestekromatografialla. 4 VÄLINEISTÖ 4.1 Pullo, 100 ml. 4.2 Pullo, 25 ml, jossa hios. 4.3 Ilmajäähdytin, 1 m:n pituinen, sopii 4.2 kohdassa mainittuun pulloon. 4.4 Erlenmeyerpullo, 250 ml. 4.5 Dekantterilasi, 50 ml. 4.6 Erotussuppilo, 500 ml. 4.7 Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 13 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla. 4.8 Sentrifugiputki, 10 ml, jossa hiottu lasitulppa. 4.9 Byretti, 5 ml, jakoväli 0,05 ml. 4.10 Injektioruisku, 1 ml, jossa ohut neula. 4.11 Mikroruisku, josta saadaan 3 4 ml:n pisaroita. 4.12 Levitin ohutkerroskromatografiaa varten. 4.13 Lasilevyjä (20 × 20 cm) ohutkerroskromatografiaa varten. 4.14 Lasinen kehitysastia, johon 20 × 20 cm:n levyt mahtuvat ja jossa on hiottu lasikansi, ohutkerroskromatografiaa varten. 4.15 Sumutin ohutkerroskromatografiaa varten. 4.16 Uuni, jonka lämpötila on säädetty 103 ± 2 °C:seen. 4.17 Termostaatti, jota voidaan säätää 30 45 °C:seen ja jonka tarkkuus on 0,5 °C. 4.18 Kiertohaihdutin. 4.19 Sähkökäyttöinen värisevä ravistin, joka pystyy sekoittamaan voimakkaasti sentrifugiputkea. 4.20 Ultraviolettivalo levyjen tarkastelua varten. Lipaasin aktiivisuuden mittaamiseksi: 4.21 pH-mittari. 4.22 Spiraalisekoitin. 4.23 Byretti, 5 ml. 4.24 Sekuntikello. Lipaasin mahdollista valmistusta varten: 4.25 Laboratoriosekoitin, joka soveltuu heterogeenisten aineiden dispergointiin ja sekoittamiseen. 5 REAGENSSIT 5.1 n-heksaani tai sen puuttuessa petrolieetteri (kiehumispiste 30 50 °C), kromatografista laatua. 5.2 2-propanoli (tai etanoli), 95 % (V/V), analyysilaatua. 5.3 2-propanoli (tai etanoli), 1:1 vesiliuos. 5.4 Dietyylieetteri, joka ei sisällä peroksideja. 5.5 Asetoni. 5.6 Muurahaishappo, vähintään 98 % (m/m). 5.7 Kehitysliuos: n-heksaania (5.1), dietyylieetteriä (5.4) ja muurahaishappoa (5.6) suhteessa 70:30:1 (V/V/V). 5.8 Alumiinioksidi, aktivoitu, kromatografiaa varten, neutraalia, Brockmann I-laatua. 5.9 Piidioksidijauhe, jossa sidosaine, ohutkerroskromatografiaan soveltuvaa laatua. 5.10 Haimalipaasi, sopivaa laatua (Huomautukset 1 ja 2). 5.11 Natriumhydroksidi, 120 g/l vesiliuos. 5.12 Suolahappo, 6 N vesiliuos. 5.13 Kalsiumkloridi (CaCl2), 220 g/l vesiliuos. 5.14 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 1 g/l vesiliuos. 5.15 Puskuriliuos: lisätään suolahappoa (5.12) tri-hydroksimetyyliaminometaanin 1 M vesiliuokseen, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä). 5.16 Fenoliftaleiiniliuos (10 g/l) 95 % (V/V) etanolissa. 5.17 2,7-dikloorifluoreseiiniliuos (2 g/l) 95 % (V/V) etanolissa, joka tehdään lievästi emäksiseksi lisäämällä yksi tippa 1 N natriumhydroksidiliuosta 100 ml:aa kohti. Lipaasin aktiivisuuden määrittämiseksi: 5.18 Neutraloitua öljyä. 5.19 Natriumhydroksidi, 0,1 N vesiliuos. 5.20 Natriumkolaatti (entsymaattista laatua), 200 g/l vesiliuos. 5.21 Arabikumi, 100 g/l vesiliuos. 6 NÄYTTEEN ESIKÄSITTELY Jos näytteen happamuus on alle 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä, näyte puhdistetaan alumiinioksidilla suoraan 6.2. kohdan mukaan. Jos happamuus on yli 3 % liitteen II mukaisesti määritettynä, näyte neutraloidaan ensin emäksellä liuottimen kanssa 6.1. kohdan mukaisesti ja puhdistetaan sitten alumiinioksidilla 6.2. kohdan mukaisesti. 6.1 Emäksellä neutraloiminen liuottimen kanssa Pannaan erotussuppiloon (4.6) noin 10 g käsittelemätöntä öljyä ja lisätään 100 ml heksaania (5.1), 50 ml 2-propanolia (5.2), muutama tippa fenoliftaleiiniliuosta (5.16) ja sellainen määrä natriumhydroksidiliuosta (5.11), joka vastaa öljyn vapaata happamuutta lisättynä 0,3 %:lla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan, lisätään 50 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä. Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraloidun öljyn heksaaniliuos pestään useilla peräkkäisillä 2-propanolin liuoserillä (5.3) käyttäen 25 30 ml kerralla, kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri katoaa. Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä käyttäen kiertohaihdutinta (4.18), kuivatetaan öljy tyhjiössä 30 40 °C:n lämpötilassa puhtaan typpivirran avulla, kunnes heksaani on kokonaan haihtunut. 6.2 Puhdistaminen alumiinioksidilla Valmistetaan suspensio, jossa on 15 g aktivoitua alumiinioksidia (5.8) ja 50 ml heksaania (5.1) ja kaadetaan se koko ajan sekoittaen kromatografiakolonniin (4.7). Alumiinioksidin annetaan laskeutua tasaiseksi kerrokseksi ja liuottimen annetaan valua niin, että sitä on noin 1 2 mm absorboimisaineen yläpuolella. Pylvääseen kaadetaan varovasti liuos, jossa on 5 g öljyä ja 25 ml heksaania (5.1). Kolonnista valuva neste kerätään pyöreäpohjaiseen pulloon (4.1). 7 KROMATOGRAFIALEVYJEN ESIKÄSITTELY Lasilevyt (4.13) puhdistetaan huolellisesti etanolilla, petrolieetterillä ja asetonilla, jotta pinta olisi täysin rasvaton. Punnitaan 30 g piidioksidijauhetta (5.9) erlenmeyerpulloon (4.4). Lisätään 60 ml tislattua vettä. Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Siirretään suspensio välittömästi levittimeen (4.12) ja levitetään puhtaille levyille noin 0,25 mm paksu kerros. Levyjä kuivatetaan ilmassa 15 minuuttia ja sitten lämpökaapissa (4.16) 103 ± 2 °C:ssa tunnin ajan. Levyt jäähdytetään eksikkaattorissa huoneenlämpöisiksi ennen käyttöä. Käyttövalmiita levyjä on myös kaupallisesti saatavana. 8 SUORITUS 8.1 Hydrolyysi haimalipaasin avulla Punnitaan noin 0,1 g valmista näytettä sentrifugiputkeen (4.8). Jos näyte on kiinteää rasvaa, se liuotetaan 0,2 ml:aan heksaania, jota tarvittaessa lämmitetään hieman. Putkeen lisätään 20 ml lipaasia (5.10) ja 2 ml puskuriliuosta (5.15). Ravistetaan hyvin, mutta varovaisesti, ja lisätään sitten 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (5.14) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta (5.13). Putki suljetaan hiotulla tulpalla, ravistetaan varovasti niin, että tulppa ei pääse kastumaan ja asetetaan putki heti termostaattiin (4.17), jonka lämpötila on 40 ± 0,5 °C. Ravistetaan käsin tasan yhden minuutin ajan. Putki otetaan termostaatista ja sitä ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravistimella (4.19) tasan kaksi minuuttia. Jäähdytetään välittömästi juoksevalla vedellä; lisätään 1 ml suolahappoa (5.12) ja 1 ml dietyylieetteriä (5.4). Suljetaan tulpalla ja ravistetaan voimakkaasti sähkökäyttöisellä ravistimella. Annetaan seistä ja poistetaan orgaaninen kerros ruiskulla (4.10) sentrifugoinnin jälkeen, jos se on tarpeen. 8.2 Monoglyseridien erottaminen ohutkerroskromatografialla Uute asetetaan kromatografialevylle mikroruiskun (4.11) avulla mahdollisimman ohuena ja tasaisena kerroksena noin 1,5 cm:n päähän levyn alareunasta, niin kapeana viivana kuin mahdollista. Levy asetetaan kehitysastiaan (4.14), joka on hyvin kyllästetty, ja annetaan kehittyä kehitysliuoksessa (5.7) noin 20 °C:ssa, kunnes rintama on noussut noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy kuivatetaan ilmassa kehitysastian lämpötilassa ja sille suihkutetaan 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (5.17). Monoglyseridivyöhyke tunnistetaan (Rf noin 0,035) ultraviolettivalossa (4.20). 8.3 Monoglyseridien määrittäminen kaasunestekromatografialla Raaputetaan lastalla irti vyöhyke, joka erottui 8.2 kohdassa (välttäen ottamasta mukaan ainesta, joka on jäänyt lähtöviivalle), ja kerätään se metylointipulloon (4.2). Raaputettua piidioksidia käsitellään suoraan menetelmällä, joka on kuvattu liitteessä X B olevassa 4.1 kohdassa siten, että monoglyseridit muuttuvat metyyliestereiksi; tämän jälkeen esterit tutkitaan kaasukromatografialla liitteessä X A kuvatulla tavalla. 9 TULOSTEN ESITTÄMINEN Lasketaan 2-asemassa olevien rasvahappojen määrä yhden desimaalin tarkkuudella (Huom. 3). 10 HUOMAUTUKSIA Huom. 1 Lipaasin aktiivisuuden tarkistaminen. Valmistetaan öljyemulsio sekoittamalla 165 ml arabikumiliuosta (5.21), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä (5.18) ravistaen sopivalla sekoittimella. Mitataan 10 ml tätä emulsiota dekantterilasiin (4.5), lisätään 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (5.20) ja lopuksi 20 ml tislattua vettä. Lasi asetetaan termostaattiin, jonka lämpötila on 37 ± 0,5 °C (Huom. 4). Upotetaan pH-mittarin (4.21) elektrodit nesteeseen ja spiraalisekoitin (4.22) käynnistetään. Sen jälkeen lisätään natriumhydroksidiliuosta (5.19) tipoittain byretin (4.23) avulla, kunnes pH on 8,5. Lisätään sopiva määrä lipaasivesisuspensiota (ks. jäljempänä). Heti kun pH on 8,3, sekuntikello (4.24) käynnistetään ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen (5.19) tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Emäsliuoksen kulutus luetaan joka minuutti. Havainnot kirjataan graafisesti koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena pitäisi olla suora. Edellä mainittu lipaasisuspensio on 1:1 000 (m/m) suspensio vedessä. Jokaista koetta varten olisi käytettävä sellainen määrä tätä suspensiota, että emäsliuosta kuluu noin 1 ml 4 5 minuutissa. Tavallisesti tarvitaan noin 1 5 mg jauhetta. Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa. Näin saadaan käytetyn jauheen aktiivisuus A, lipaasiyksikköinä mg:aa kohti, kaavasta: A = >NUM>V × 10/>DEN>m jossa: V = natriumhydroksidiliuoksen (5.19) kulutus minuutissa suoralta laskettuna m = jauhenäytteen massa milligrammoina. Huom. 2 Lipaasin valmistus. Lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä, voidaan ostaa valmiina. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti: Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen, poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan sekoittimella (4.25) 4 6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä. Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, jota on säilytettävä jääkaapissa. Huom. 3 Kaikissa tapauksissa on suositeltavaa, että samasta näytteestä määritetään aina rasvahappojen kokonaismäärä, koska tulosten tulkintaa helpottaa, kun 2-asemassa olevien happojen määrää voidaan verrata rasvahappojen kokonaismäärään. Huom. 4 Kun käytetään nestemäistä öljyä, hydrolyysin lämpötilaksi säädetään 37 °C. Kun tutkitaan näytettä, se säädetään kuitenkin 40 °C:seen, jotta voitaisiin tutkia kaikkia rasvoja, joiden sulamispiste on enintään 45 °C. LIITE VIII TRILINOLEIINIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN 1 TARKOITUS Nestemäisten kasviöljyjen triglyseridien koostumuksen määritys niiden ekvivalenttisen hiililuvun mukaan suuren erotuskyvyn nestekromatografialla. Tämä standardi kuvaa menetelmän, jolla voidaan erottaa ja määrittää kvantitatiivisesti triglyseridit kasviöljyistä niiden moolimassan ja tyydyttymättömyysasteen muodossa niiden ekvivalenttisen hiililuvun funktiona (ks. huom. 1). 2 SOVELTAMISALA Tämä standardi soveltuu kaikkien pitkäketjuisten rasvahappojen triglyseridejä sisältävien kasviöljyjen määrittämiseen. Menetelmä sopii erityisen hyvin käytettäväksi, kun on löydettävä pieniä määriä puoliksi kuivuvia öljyjä (joissa on paljon linolihappoa) kasviöljyistä, joissa oleiinihappo (öljyhappo) on hallitseva tyydyttymätön rasvahappo (kuten oliiviöljyssä). 3 PERIAATE Triglyseridit erotetaan ekvivalenttisen hiililuvun perusteella suuren erotuskyvyn nestekromatografian (käänteisfaasin) avulla ja kromatogrammeja tulkitsemalla. 4 VÄLINEISTÖ 4.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteisto, jonka kolonnin lämpötilaa voidaan säätää. 4.2 Ruisku 10 ml:n injektioihin. 4.3 Detektori: differentiaalirefraktometri, jolla voidaan määrittää taitekerroin 10-4 yksikön tarkkuudella. 4.4 Kolonni: putki ruostumatonta terästä, pituus 250 mm, sisähalkaisija 4,5 mm, jossa täytteenä halkaisijaltaan 5 mm:n piidioksidihiukkasia, joissa on 22 23 % hiiltä oktadekyylisilaanin muodossa (Huom. 2). 4.5 Piirturi ja/tai integraattori. 5 REAGENSSIT Reagenssien on oltava analyysipuhtaita ja eluointiliuottimien kaasuttomia (niitä voidaan käyttää useita kertoja ilman että se vaikuttaa erottumiseen). 5.1 Kloroformi. 5.2 Asetoni. 5.3 Asetonitriili. 5.4 Eluointiliuotin: asetonitriili + asetoni (aloitetaan sekoitussuhteella 50:50, suhdetta muutetaan halutun erottumisen aikaansaamiseksi). 5.5 Liuotin: asetoni tai asetonin ja kloroformin seos (1:1). 5.6 Vertailutriglyseridit: joko valmiina saatavat triglyseridit, kuten tripalmitiini, trioleiini, jne. (retentioajat voidaan tällöin määrittää graafisesti ekvivalenttisen hiililuvun mukaan), tai käytetään soijaöljystä saatua vertailukromatogrammia (ks. huom. 3 ja 4 ja kuvat 1 ja 2). 6 NÄYTTEIDEN VALMISTELU Näytteestä valmistetaan 5-prosenttinen liuos punnitsemalla 0,5 ± 0,001 g näytettä 10 ml:n mittapulloon ja lisäämällä liuotinta (5.5) niin, että liuosta on 10 ml. 7 SUORITUS 7.1 Kromatografialaitteisto asetetaan käyttökuntoon. Ruiskutetaan eluointiliuotinta (5.4) 1,5 ml/mm laitteiston puhdistamiseksi. Odotetaan, kunnes piirturin antama perusviiva on suora. Injektoidaan 10 ìl 6 kohdan mukaisesti valmisteltua näytettä. 8 TULOSTEN LASKEMINEN JA ESITTÄMINEN Käytetään sisäisen normalisoinnin menetelmää, toisin sanoin oletetaan, että eri triglyseridien piikkien pinta-alojen summa on 100 %. Lasketaan jokaisen triglyseridin suhteellinen osuus yhden desimaalin tarkkuudella kaavasta: Triglyseridi % = >NUM>piikin pinta-ala/>DEN>piikkien yhteenlaskettu pinta-ala × 100 Huom.1 Eluoitumisjärjestys voidaan määrittää laskemalla ekvivalenttinen hiililuku, joka usein määritellään kaavalla ECN = CN 2n, jossa CN on hiililuku ja n on kaksoissidosten määrä. Laskelmaa voidaan tarkentaa ottamalla huomioon kaksoissidosten alkuperä. Jos n°, nl ja nln ovat oleiinihapon, linolihapon ja linoleenihapon kaksoissidosten määrät, ekvivalenttinen hiililuku voidaan laskea kaavasta: ECN = CN d°no dlnl dlnnln, jossa olevat kertoimet d°, dl ja dln voidaan laskea vertailutriglyseridien avulla. Tässä menetelmässä käytetyissä olosuhteissa kaavasta tulee suunnilleen seuraava: ECN = CN - [2,60 n°] - [2,35 nl] - [2,17 nln] Huom. 2 Esimerkiksi: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art 50333; Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377 tai vastaava. Huom. 3 On myös mahdollista laskea erotuskyky trioleiinin suhteen usean vertailuglyseridin avulla, á = RT'/RT' oleiini käyttämällä korjattua retentioaikaa RT' = RT - RTliuotin. Log á:n kuvaajasta f:n funktiona (f on kaksoissidosten lukumäärä) voidaan määrittää kaikkien vertailutriglyseridien sisältämien rasvahappojen triglyseridien retentioindeksit (ks. kuva 2). Huom. 4 Kolonnin on oltava niin tehokas, että trilinoleiinin piikki (LLL) erottuu selvästi niiden triglyseridien piikeistä, joiden retentioajat ovat lähes samat. Kuva 1 Soijaöljynäytteen kromatogrammi >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> Kuva 2 log á:n muuttuminen f:n funktiona (f = kaksoissidosten lukumäärä) >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> LIITE IX SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS JOHDANTO Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta, sen säilymisestä ja muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet. Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni- ja trieenijärjestelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona (ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen rasvaliuoksen 1 cm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (nimitetään myös "ekstinktiokertoimeksi"). 1 TARKOITUS Tällä menetelmällä voidaan tutkia rasvoja spektrofotometrisesti ultraviolettivalossa. 2 PERIAATE Rasva liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen ekstinktio mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta. Yksittäiset ekstinktiot lasketaan spektrofotometrin lukemista. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Spektrofotometri, joka mittaa ekstinktion ultraviolettivalossa aallonpituuksilla 220 360 nm, yhden nanometrin tarkkuudella. 3.2 Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 1 cm. Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä. 3.3 Mittapulloja, 25 ml. 3.4 Kromatografiakolonni, joka on 450 mm pitkä ja jonka halkaisija on 35 mm ja jonka poistoputken halkaisija on noin 10 mm. 4 REAGENSSIT 4.1 Iso-oktaani (2,2,4-trimetyylipentaani), spektrofotometristä laatua: verrattuna tislattuun veteen sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 60 % aallonpituudella 220 nm ja vähintään 95 % aallonpituudella 250 nm, tai - sykloheksaani, spektrofotometristä laatua: tislattuun veteen verrattuna sen läpäisysuhteen on oltava vähintään 40 % 220 nm:ssä ja vähintään 95 % 250 nm:ssä, tai - jokin muu sopiva liuotin, johon rasva liukenee täydellisesti (esim. etanoli risiiniöljyä varten). 4.2 Emäksistä alumiinioksidia kromatografiakolonnia varten; esikäsittely ja tarkistus kuvataan lisäyksessä 1. 4.3 n-heksaani, kromatografiaa varten. 5 MENETTELY 5.1 Näytteen tulee olla täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Öljyt, jotka ovat huoneenlämmössä nestemäisiä, suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa, kiinteät rasvat homogenoidaan ja suodatetaan lämpötilassa, joka ei saa olla yli 10 °C korkeampi kuin niiden sulamispiste. 5.2 Punnitaan noin 0,25 g näytettä, joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi. 5.3 Kyvetti täytetään saadulla liuoksella ja ekstinktiot mitataan sopivalla aallonpituudella 232 276 nm; käytetty liuotin toimii vertailuliuoksena. Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1 0,8; jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan. 5.4 Kun on tarpeen määrittää ominaisekstinktio alumiinioksidilla tapahtuvan puhdistamisen jälkeen, toimitaan seuraavasti: kromatografiakolonniin pannaan 30 g emäksistä alumiinioksidia heksaaniin suspendoituna, adsorbentin annetaan laskeutua ja ylimääräinen heksaani poistetaan niin, että sitä on noin 1 cm alumiinioksidin päällä. Liuotetaan 10 g rasvaa homogenoituna ja suodatettuna 5.1 kohdan mukaisesti 100 ml:aan heksaania ja kaadetaan liuos kolonniin. Eluaatti kerätään talteen ja liuotin haihdutetaan tyhjiössä alle 25 °C:ssa. Näin saatu rasva käsitellään välittömästi 5.2 kohdan mukaisesti. 6 TULOSTEN ESITTÄMINEN 6.1 Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta: Kë = >NUM>Eë/>DEN>c 7 s jossa: >TAULUKON PAIKKA> Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella. 6.2 Oliiviöljyn spektrofotometrinen määritys ETY:n virallisissa asetuksissa tarkoitetun virallisen menetelmän mukaan vaatii ominaisekstinktion määrittämisen iso-oktaaniliuoksessa aallonpituuksilla 232 ja 270 nm ja ÄK:n laskemisen kaavasta: ÄK =Km - >NUM>Km - 4 + Km + 4/>DEN>2 jossa Km on ominaisekstinktio aallonpituudella m, maksimaalisen absorption aallonpituuden ollessa noin 270 nm. LISÄYS I Alumiinioksidin esikäsittely ja sen aktiivisuuden tarkistus A.1.1 Alumiinioksidin esikäsittely Etukäteen 380 400 °C uunissa kolmen tunnin ajan kuivattu alumiinioksidi asetetaan ilmatiiviiseen astiaan. Tislattua vettä lisätään suhteessa 5 ml/100 g alumiinioksidia, astia suljetaan välittömästi, sitä ravistetaan useita kertoja ja annetaan sitten seistä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä. A.1.2 Alumiinioksidin aktiivisuuden tarkistaminen Esikäsitellään kromatografiakolonni 30 g:lla alumiinioksidia. Seurataan 5.4 kohdan ohjeita ja johdetaan kolonnin läpi seos, jossa on: - 95 % neitsytoliiviöljyä, jonka ominaisekstinktio on alle 0,18 aallonpituudella 268 nm, - 5 % maapähkinäöljyä, joka on käsitelty valkaisumaalla sen puhdistuksen aikana ja jonka ominaisekstinktio on vähintään 4 aallonpituudella 268 nm. Seos johdetaan kolonnin läpi ja jos sen ominaisekstinktio on yli 0,11 aallonpituudella 268 nm, alumiinioksidi on kelvollista; muutoin sen hydrataatioastetta on lisättävä. LISÄYS II Spektrofotometrin kalibrointi A.2 Laitteisto tulee tarkistaa säännöllisesti (vähintään puolen vuoden välein), sekä aallonpituuksien vastaavuuden että lukematarkkuuden suhteen. A.2.1 Aallonpituuslukema voidaan tarkistaa joko elohopeahöyrylampulla tai sopivien suodattimien avulla. A.2.2 Valokennon ja valomonistimen antamat lukemat voidaan tarkistaa seuraavasti: punnitaan 0,2 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella. Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä. LIITE X A RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ 1 SOVELTAMISALA Tämä menetelmä antaa yleisohjeita kaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää liitteessä X B kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliestereiden seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti. Menetelmä ei sovellu polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen. 2 REAGENSSIT 2.1 Kantajakaasu Inertti kaasu (typpi, helium, argon, vety, jne.), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg. Huom. 1 Vety, jota voidaan käyttää kantajakaasuna ainoastaan kapillaarikolonneissa, kaksinkertaistaa määritysnopeuden, mutta sen käyttö on vaarallista. Turvalaitteita on kuitenkin saatavana. 2.2 Apukaasut 2.2.1 Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia. 2.2.2 Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia. 2.3 Vertailustandardi Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliestereitä, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva. Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä. 3 VÄLINEISTÖ Tässä annetut ohjeet koskevat tavallista kaasukromatografista laitteistoa, joko täytetyllä kolonnilla tai kapillaarikolonnilla varustettua, sekä liekki-ionisaatiodetektoria. Muutkin laitteistot, jotka ovat yhtä tehokkaita ja joiden erotuskyky on 4.1.2. kohdan mukainen, ovat sopivia. 3.1 Kaasukromatografi Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat. 3.1.1 Injektiojärjestelmä Käytetään injektiojärjestelmää, joka sopii: a) täytettyyn kolonniin, jonka kuollut tilavuus on mahdollisimman pieni (tässä tapauksessa injektiojärjestelmää tulee voida kuumentaa 20 50 °C kolonnia korkeampaan lämpötilaan); tai b) kapillaarikolonniin, jolloin sen on oltava erityisesti tähän käyttöön suunniteltu. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori. Huom. 2 Jos näytteessä on ainoastaan sellaisia rasvahappoja, joissa on vähintään 16 hiiliatomia, voidaan käyttää liikkuvaa neulainjektoria. 3.1.2 Uuni Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 1 °C:n tarkkuudella, jos kyse on täytetystä kolonnista, ja 0,1 °C:n tarkkuudella, jos kyse on kapillaarikolonnista. Viimeksimainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea. Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia. 3.1.3 Täytetty kolonni 3.1.3.1 Kolonni on valmistettu aineesta, joka ei reagoi tutkittavien aineiden kanssa (esim. lasi tai ruostumaton teräs); kolonnin mitat ovat seuraavat: a) pituus: 1 3 m. Pitkäketjuisten rasvahappojen (> C20) tutkimiseen käytetään suhteellisen lyhyttä kolonnia. Tutkittaessa happoja, joissa on 4 6 hiiliatomia, suositeltava kolonnin pituus on 2 m; b) sisähalkaisija: 2 4 mm. Huom. 3 Jos tutkittavana on monityydyttymättömiä happoja, joissa on enemmän kuin kolme kaksoissidosta, ne saattavat hajota kolonnissa, joka on ruostumatonta terästä. Huom. 4 Voidaan myös käyttää järjestelmää, jossa on täytetty kaksoiskolonni. 3.1.3.2 Täyte, joka koostuu seuraavista aineista: a) tukiaine: happopestyä ja silanoitua piimaata tai muuta sopivaa, inerttiä tukiainetta, jonka raekokojakauma on kapea (25 mm:n vaihtelu 125 ja 200 mm:n välillä) niin, että keskimääräinen raekoko on suhteessa kolonnin pituuteen ja sisähalkaisijaan; b) stationäärifaasi: polyesterityyppinen polaarinen neste (esim. dietyleeniglykolipolysukkinaatti, butaanidiolipolysukkinaatti, etyleeniglykolipolyadipaatti jne.), syanosilikonit tai jokin muu neste, joka saa aikaan kromatografisen erottumisen (ks. kohta 4). Stationäärifaasin osuuden on oltava 5 20 % (m/m) täytteestä. Joissakin erotteluissa voidaan käyttää polaaritonta stationäärifaasia. 3.1.3.3 Kolonnin valmistelu Kun kolonni on irrotettu detektorista, uuni kuumennetaan vähitellen 185 °C:seen ja inerttikaasua johdetaan 20 60 ml minuutissa juuri täytetyn kolonnin läpi, vähintään 16 tunnin ajan tässä lämpötilassa ja sitten vielä kaksi tuntia 195 °C:ssa. 3.1.4 Kapillaarikolonni 3.1.4.1 Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,2 0,8 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Useimmissa tapauksissa riittävä pituus on 25 m. 3.1.4.2 Stationäärifaasi, pääasiassa polyglykolityyppiä [poly(etyleeniglykoli) 20 000], polyesterityyppiä (butaanidiolipolysukkinaatti) tai polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit). Kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat myös sopivia. Huom. 5 On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista. Päällysteen on oltava ohut, 0,1 0,2 mm. 3.1.4.3 Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm). Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa. Huom. 6 Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa. 3.1.5 Detektori, joka kestää korkeampaa lämpötilaa kuin kolonni. 3.2 Ruisku Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 ml ja jakovälin 0,1 ml. 3.3 Piirturi Kun piirturin käyrää käytetään määritettävän seoksen koostumuksen laskemiseen, tarvitaan elektroninen, erittäin tarkka piirturi, joka sopii yhteen muun laitteiston kanssa. Piirturilla on oltava seuraavat ominaisuudet: a) vasteaika alle 1,5 s, mieluummin 1 s (vasteaika on aika, joka kuluu, kun piirturin kärki siirtyy nollasta 90 %:iin, kun yhtäkkiä annetaan 100 %:n signaali); b) paperin leveys vähintään 20 cm; c) paperin nopeutta on voitava säätää 0,4:stä 2,5 cm:iin minuutissa. 3.4 Integraattori tai laskin (valinnainen) Elektronisen integraattorin tai laskimen avulla tulos voidaan laskea nopeasti ja tarkasti. Sen on annettava lineaarinen vaste riittävällä herkkyydellä ja perusviivan poikkeaman korjauksen tulee olla riittävä. 4 SUORITUS Toimenpiteet alakohdissa 4.1 4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kaasukromatografista laitetta, jossa on lämmönjohtokyvyn ilmaisin (katarometri). Koeolosuhteita on tällöin muutettava 6 kohdan mukaan. 4.1 Koeolosuhteet 4.1.1 Ihanteellisten koeolosuhteiden valinta 4.1.1.1 Täytetty kolonni Seuraavat muuttujat on otettava huomioon olosuhteita valittaessa: a) kolonnin pituus ja halkaisija; b) stationäärifaasin ominaisuudet ja määrä; c) kolonnin lämpötila; d) kantajakaasuvirta; e) tarvittava erotuskyky; f) näytteen määrä, joka on valittava siten, että detektori ja elektrometri yhdessä antavat lineaarisen vasteen; g) määrityksen kesto. Taulukoissa 1 ja 2 annetut arvot johtavat yleensä haluttuihin tuloksiin, eli vähintään 2 000 teoreettista pohjaa yhtä kolonnimetriä kohti metyylistearaatilla, kun se eluoidaan noin 15 minuutissa. Injektorin lämpötilan tulisi olla noin 200 °C ja detektorin lämpötilan tulisi olla vähintään yhtä suuri kuin kolonnin, jos laitteisto antaa siihen mahdollisuuden. Liekki-ionisaatiodetektoriin johdetun vedyn virtausnopeuden suhde kantajakaasun nopeuteen on yleensä 1:2 1:1 kolonnin halkaisijan mukaan. Hapen virtaus on noin 5 10 kertaa suurempi kuin vedyn. >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> 4.1.1.2 Kapillaarikolonni Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Tämän vuoksi toimintaolosuhteet on valittava tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) muuttamalla sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti. 4.1.2 Teoreettisten pohjien määrän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittäminen (ks. kuva 1) Määritys tehdään metyylistearaatin ja metyylioleaatin seoksesta, jossa on suunnilleen yhtä paljon molempia (esim. kaakaovoin metyyliestereistä). Näytteen määrä, kolonnin lämpötila ja kantajakaasun virtaus valitaan niin, että mahdollisimman suuri osa metyylistearaatin piikistä piirtyy noin 15 minuuttia liuottimen piikin jälkeen ja että metyylistearaattipiikki täyttää noin kolme neljännestä koko asteikosta. Teoreettisten pohjien määrä n lasketaan kaavasta: n = 16 [ >NUM>dr1/>DEN>W1]²ja erotuskyky R kaavasta: R = >NUM>2Ä/>DEN>W1 + W2 jossa: dr1 on retentioetäisyys millimetreinä, alkaen kromatogrammin alusta metyylistearaattipiikin huippuun; W1 ja W2 ovat metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien leveydet millimetreinä, mitattuina kohdista, joissa piikkikäyrän käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat perusviivan; Ä metyylistearaatin ja metyylioleaatin piikkien huippujen väli millimetreinä. Kuva 1 Kromatogrammi teoreettisten pohjien lukumäärän (tehokkuuden) ja erotuskyvyn määrittämisehsi >VIITTAUS KAAVIOON> >KAAVION ALKU> >KAAVION LOOPU> Koeolosuhteet on valittava siten, että saadaan vähintään 2 000 teoreettista pohjaa kolonnimetriä kohti metyylistearaatille ja että erotuskyky on vähintään 1,25. 4.2 Näytteenotto Injektoidaan ruiskulla (3.2) kolonniin 0,1 2 ml metyyliesterien liuosta, joka on valmistettu liitteessä X B esitetyn menetelmän mukaan. Jos estereissä ei ole liuottimia, valmistetaan noin 100 mg/ml:n liuos heptaaniin (kaasukromatografista laatua) ja injektoidaan 0,1 1 ml tätä liuosta. Jos määritetään aineosia, joita on vähän, näytteen määrää voidaan suurentaa (enintään kymmenkertaiseksi). 4.3 Määritys Koeolosuhteiden tulee yleensä olla kohdan 4.1.1 mukaiset. Alhaisempien kolonnilämpötilojen käyttö on kuitenkin mahdollista, kun määritetään rasvahappoja, joissa on alle 12 hiiliatomia, tai voidaan käyttää korkeampia lämpötiloja, jos rasvahapoissa on yli 20 hiiliatomia. Näissä tapauksissa voidaan käyttää lämpötilan ohjelmointia. Esimerkiksi jos näytteessä on rasvahappojen metyyliestereitä, joissa on alle 12 hiiliatomia, näyte voidaan injektoida 100 °C:ssa (tai 50 60 °C:ssa, jos mukana on voihappoa) ja ohjelmoida lämpötila nousemaan 4 8 °C/min, kunnes saavutetaan optimilämpötila. Joissakin tapauksissa menetelmät voidaan yhdistää. Ohjelmoidun lämmityksen jälkeen eluointia jatketaan vakiolämpötilassa, kunnes kaikki aineosat ovat eluoituneet. Jos laitteen lämpötilaa ei voida ohjelmoida, käytetään kahta lämpötilaa, jotka ovat 100 195 °C. On suositeltavaa tehdä määritys tarvittaessa kahdessa polaarisuudeltaan erilaisessa faasissa, jotta varmistutaan siitä, että mukana ei ole toisen piikin alle jääviä piikkejä, esimerkiksi jos näytteessä on yhtä aikaa C18:3 ja C20:0 tai C18:3 ja C18:2 konjugoituneina. 4.4 Vertailukromatogrammin ja -kuvaajan valmistaminen Määritetään vertailustandardiseos (2.3) käyttäen samoja koeolosuhteita kuin näytettä määritettäessä, ja mitataan rasvahappojen retentioajat tai -etäisyydet. Puolilogaritmipaperille piirretään jokaista tyydyttymättömyysastetta varten kuvaaja, jossa on retentioajan tai -etäisyyden logaritmi hiiliatomien määrän funktiona; suoraketjuisten ja tyydyttymättömyysasteeltaan samojen estereiden kuvaajien tulisi olla suoria vakiolämpötilassa. Suorien tulisi olla suunnilleen yhdensuuntaiset. On vältettävä olosuhteita, joissa piikki jää toisen alle, ts. erotuskyky ei riitä erottamaan kahta aineosaa. 5 TULOSTEN ESITTÄMINEN 5.1 Kvalitatiivinen määritys Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan 4.4 alakohdassa mainittujen käyrien avulla, tarvittaessa interpoloimalla. 5.2 Kvantitatiivinen määritys 5.2.1 Koostumuksen määrittäminen Joitakin poikkeuksia lukuun ottamatta voidaan käyttää sisäisen normalisoinnin menetelmää, jossa oletetaan että kromatogrammi kuvaa näytteen kaikkia aineosia, eli että piikkien yhteenlaskettu pinta-ala vastaa aineosia sataprosenttisesti (täydellinen eluoituminen). Jos laitteistoon kuuluu integraattori, käytetään sen antamia tuloksia. Muussa tapauksessa jokaisen piikin pinta-ala lasketaan kertomalla sen korkeus leveydellä piikin puolivälistä mitattuna ja ottaen huomioon piirturissa mahdollisesti käytetyt vaimennukset. 5.2.2 Laskentamenetelmät 5.2.2.1 Yleinen tapaus Lasketaan tietyssä aineosassa olevien metyyliesterien pitoisuus massaprosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla: >NUM>Ai/>DEN>ÓA × 100 jossa: Ai on aineen i piikin pinta-ala; ÓA on kaikkien piikkien yhteenlaskettu pinta-ala. Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella. Huom. 7 Tässä yleisessä tapauksessa laskun tuloksen katsotaan perustuvan siihen, että suhteelliset pinta-alat vastaavat massojen prosentuaalisia suhteita. Tapauksissa, joissa näin ei voida olettaa, menetellään 5.2.2.2 alakohdan mukaan. 5.2.2.2 Korjauskertoimien käyttö Tapauksissa, joissa rasvahapossa esimerkiksi on vähemmän kuin kahdeksan hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, taikka kun käytetään lämmön johtumiseen perustuvaa detektoria tai kun tulosten on oltava mahdollisimman tarkkoja, on käytettävä korjauskertoimia muutettaessa piikkien pinta-alojen prosenttiosuuksia aineosien massaprosenteiksi. Korjauskertoimet määritetään kromatogrammista, joka saadaan tarkoin tunnettujen metyyliestereiden vertailuseoksesta samoissa olosuhteissa, joissa näyte määritettiin. Vertailuseoksen aineen i prosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta: >NUM>mi/>DEN>Óm × 100 jossa: mi on vertailuseoksen aineen i massa; Sm on vertailuseoksen eri aineosien massojen summa. Lasketaan aineen i prosentuaalinen pinta-alaosuus vertailuseoksen (4.4) kromatogrammista: >NUM>Ai/>DEN>ÓA × 100 jossa: Ai on aineen i piikin pinta-ala; ÓA on kaikkien piikkien pinta-alojen summa. Korjauskerroin saadaan kaavasta: Ki = >NUM>mi × ÓA/>DEN>Ai × Óm Yleensä korjauskertoimet ilmoitetaan suhteessa KC16:een; tällöin suhteelliset kertoimet ovat: K'i = >NUM>Ki/>DEN>KC16 Näytteen jokaisen aineen i määrä prosenttiosuutena metyyliestereiden massasta on: >NUM>K'i × Ai/>DEN>Ó (K'i × Ai) × 100 Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 5.2.2.3 Sisäisen standardin käyttö Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahappojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahappoja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa. Aineen i prosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna saadaan kaavasta: >NUM>ms × K'i × Ai/>DEN>m × K's × As × 100 jossa: Ai on aineen i piikin pinta-ala; As on sisäisen standardin piikin pinta-ala; K'i on aineen i korjauskerroin (suhteessa KC16:een); K's on sisäisen standardin korjauskerroin (suhteessa KC16:een); m on näytteen massa milligrammoina; ms on sisäisen standardin massa milligrammoina. Tulos annetaan yhden desimaalin tarkkuudella. 6 ERIKOISTAPAUS - KATAROMETRIDETEKTORIN KÄYTTÖ (PERUSTUU LÄMMÖNJOHTOKYVYN MUUTOKSIIN) Rasvahappojen metyyliestereiden seoksen kvantitatiiviseen ja kvalitatiiviseen määritykseen voidaan käyttää myös kaasukromatografia, jonka detektorin toiminta perustuu lämmönjohtokyvyn muutoksiin (katarometri). Sellaista käytettäessä on 3 ja 4 kohdassa kuvattuja olosuhteita muutettava taulukossa 3 esitetyllä tavalla. Kvantitatiivista määritystä varten käytetään 5.2.2.2 kohdan mukaisia korjauskertoimia. >TAULUKON PAIKKA> 7 KOESELOSTE Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät, käytetty kaasukromatografinen menetelmä sekä saadut tulokset. Siinä on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei määrätä tässä kansainvälisessä standardissa, tai joita pidetään valinnaisina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin. Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseen tunnistamiseen. LIITE X B RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMINEN ASETUKSEN (ETY) N:o 72/77 LIITTEESSÄ VI OLEVASSA I JA II KOHDASSA TAI TÄSSÄ KUVATULLA VAIHTOEHTOISELLA MENETELMÄLLÄ JOHDANTO Menetelmän valinta riippuu rasvahappokoostumuksesta, tutkittavan rasvan tai öljyn happamuudesta sekä suoritettavasta kaasukromatografisesta määrityksestä. Täsmennyksiä: - rasvoille ja öljyille, joiden rasvahapoissa on vähemmän kuin 12 hiiliatomia, soveltuvat ainoastaan menetelmät, joissa käytetään ilmatiiviisti suljettua pulloa tai dimetyylisulfaattia, - rasvoille ja öljyille, joiden happamuus on yli 3 %, soveltuvat ainoastaan menetelmät, joissa käytetään metanolia, suolahappoa tai dimetyylisulfaattia, - trans-isomeerien kaasukromatografisiin määrityksiin soveltuvat ainoastaan menetelmät, joissa käytetään natriummetylaattia tai dimetyylisulfaattia, - kun valmistetaan metyyliestereitä pienistä määristä rasvoja tai öljyjä, jotka on eroteltu ohutkerroskromatografialla, on käytettävä metanoli-heksaani-rikkihappomenetelmää. Saippuoitumattomat osat voidaan jättää huomiotta, ellei niitä ole yli 3 %; muussa tapauksessa metyyliesterit on valmistettava rasvahapoista. 1 TARKOITUS Seuraavassa kuvataan viisi menetelmää rasvojen ja öljyjen metyyliestereiden valmistamiseksi: a) natriummetylaatilla; b) suljetussa pullossa natriummetylaatilla; c) suljetussa pullossa vetykloridin metanoliliuoksella; d) dimetyylisulfaatilla; e) metanolilla, heksaanilla ja rikkihapolla. Menetelmä A 2 PERIAATE Määritettävää rasvaa tai öljyä kuumennetaan metanolissa ja natriummetylaatissa käyttäen palautusjäähdytintä. Saadut metyyliesterit uutetaan etyylieetterillä. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 100 ml:n pullo ja palautusjäähdytin, jonka päähän on liitetty natronkalkkiputki; lasihiokset. 3.2 50 ml:n mittakoeputkia. 3.3 5 ml:n mittapipetti, jakoväli 0,1 ml. 3.4 250 ml:n erotussuppiloita. 3.5 200 ml:n pullo. 4 REAGENSSIT 4.1 Vedetön metanoli. 4.2 Natriummetylaatin noin 1-prosenttinen metanoliliuos; valmistetaan liuottamalla 0,34 g metallista natriumia 100 ml:aan vedetöntä metanolia. 4.3 Etyylieetteri. 4.4 10-prosenttinen natriumkloridiliuos. 4.5 40 60 °C:n lämpöistä petrolieetteriä. 5 SUORITUS 5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan 2 g 100 ml:n pulloon. Lisätään 35 ml metanolia, asennetaan jäähdytin ja keitetään muutama minuutti käyttäen palautusjäähdytintä. 5.2 Lämmittäminen lopetetaan, jäähdytin poistetaan ja lisätään nopeasti 3,5 ml natriummetylaattiliuosta; asennetaan jäähdytin taas paikalleen ja keitetään palautusjäähdytintä käyttäen vähintään kolme tuntia. Metylaatio on täydellinen, kun kaikki rasva on sulanut liuokseen ja reaktioseos on aivan kirkas huoneenlämmössä. 5.3 Jäähdytetään ja kaadetaan seos 250 ml:n erotussuppiloon, lisätään 35 40 ml etyylieetteriä, 100 ml vettä ja 5 6 ml 10-prosenttista natriumkloridiliuosta. Ravistetaan ja annetaan kerrosten erottua; siirretään vesifaasi toiseen erotussuppiloon ja uutetaan uudelleen 25 ml:lla etyylieetteriä. Eetteriuutteet yhdistetään ja lisätään 50 ml petrolieetteriä, jonka lämpötila on 40 60 °C; vesi erottuu ja voidaan poistaa. Eetterifaasi pestään kolme kertaa 10 15 ml:n vesierillä, kuivataan natriumsulfaatilla, suodatetaan paperin läpi ja kerätään suodos 200 ml:n pulloon. Liuotin haihdutetaan pois vesihauteessa puhtaassa typpivirrassa. Menetelmä B 2 PERIAATE Määritettävä rasva tai öljy käsitellään suljetussa pullossa natriummetylaatin metanoliliuoksessa 85 90 °C:ssa. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Vahvaseinäinen lasipullo, tilavuus noin 5 ml (korkeus 40 45 mm, halkaisija 14 16 mm). 3.2 1 ml:n mittapipetti, jakoväli 0,1 ml. 4 REAGENSSIT 4.1 Natriummetylaatin noin 1,5-prosenttinen metanoliliuos. Valmistetaan liuottamalla 0,50 g metallista natriumia 100 ml:aan vedetöntä metanolia. 5 SUORITUS 5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan 2 g lasipulloon. Lisätään 0,3 g (noin 0,4 ml) natriummetylaattiliuosta, minkä jälkeen pullo suljetaan sulattamalla se liekissä. 5.2 Pulloa kuumennetaan vesihauteessa pinnan alla kaksi tuntia 85 90 °C:ssa ja ravistetaan silloin tällöin; esteröityminen on täydellinen, kun pullon sisältö on kirkas sen jälkeen kun glyseriini ja reagenssien jäännökset ovat laskeutuneet. 5.3 Jäähdytetään huoneenlämmössä. Pullo avataan vasta, kun metyyliestereitä aiotaan käyttää. Niitä ei tarvitse käsitellä muulla tavoin ennen kaasukromatografialaitteistoon saattamista. Menetelmä C 2 PERIAATE Määritettävä rasva tai öljy käsitellään suljetussa pullossa metanolilla ja suolahapolla 100 °C:ssa. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Vahvaseinäinen lasipullo, jonka tilavuus on noin 5 ml (korkeus 40 45 mm, halkaisija 14 16 mm). 3.2 1 ml:n ja 2 ml:n mittapipetit. 4 REAGENSSIT 4.1 Vetykloridin 2-prosenttinen metanoliliuos. Valmistetaan vetykloridikaasusta ja vedettömästä metanolista (Huom. 1). 4.2 Heksaania kaasukromatografiaa varten. 5 SUORITUS 5.1 Ennalta natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä punnitaan 0,2 g lasipulloon ja lisätään 2 ml vetykloridin metanoliliuosta. Pullo suljetaan liekillä. 5.2 Pulloa kuumennetaan vesihauteessa pinnan alla 40 minuuttia 100 °C:ssa. 5.3 Pullo jäähdytetään juoksevalla vedellä, avataan, lisätään 2 ml tislattua vettä ja 1 ml heksaania. Sentrifugoidaan ja poistetaan heksaanifaasi, joka on valmis käytettäväksi. Menetelmä D 2 PERIAATE Määritettävä rasva tai öljy saippuoidaan kaliumhydroksidin metanoliliuoksella ja käsitellään sitten dimetyylisulfaatilla. Kun lisätään suolahappoa, muodostuneet metyyliesterit erottuvat heti. Kun niitä käsitellään alumiinioksidilla sen jälkeen, saadaan erittäin puhtaita metyyliestereitä. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Vahvaseinäinen lasinen koeputki, tilavuus noin 20 ml, hiottu lasitulppa >NUM>10/>DEN>19 ja varmuussalpa. 3.2 Viisipalloisia palautusjäähdyttimiä, >NUM>10/ >DEN>19 hiosliitäntä. 3.3 Lasisuodattimia, joissa sintrattu levy, G 2 -kokoa, halkaisija 20 mm. 3.4 Kartiopohjaisia lasisia koeputkia, tilavuus noin 10 ml. 3.5 1 ml:n ja 5 ml:n ruiskut. 4 REAGENSSIT 4.1 Kaliumhydroksidin 10-prosenttinen metanoliliuos kaasukromatografiaa varten. 4.2 Vihreän bromokresoli-indikaattorin 0,05-prosenttinen metanoliliuos. 4.3 Dimetyylisulfaatti (15 °C:ssa d = 1,335). 4.4 Väkevää suolahappoa (d = 1,19), laimennettu 1:1 kaasukromatografiaan tarkoitetulla metanolilla. 4.5 Brockmannin standardoitua alumiinioksidia adsorptiokromatografiaa varten. 5 SUORITUS 5.1 Natriumsulfaatilla kuivattua ja suodatettua rasvaa tai öljyä mitataan 2,2 ml 20 ml:n koeputkeen. Lisätään 5 ml kaliumhydroksidiliuosta ja pari kvartsikiveä kiehumisen hillitsemiseksi. Asennetaan palautusjäähdytin ja kuumennetaan pienellä liekillä viisi minuuttia ravistellen; saippuoituminen on täydellinen, kun liuos on kirkas. Jäähdytetään lopuksi juoksevalla vedellä ja irrotetaan jäähdytin. 5.2 Lisätään kaksi tippaa indikaattoria ja hitaasti, käyttäen ruiskua, 1 ml dimetyylisulfaattia. Koeputki suljetaan ilmatiiviisti ja ravistetaan 2 3 minuuttia upottaen usein putken pohja kiehuvaan vesihauteeseen; reaktio on täydellinen, kun indikaattorin väri muuttuu sinisestä keltaiseksi. Koeputki jäähdytetään lopuksi juoksevalla vedellä, avataan ja lisätään 5 ml suolahapon metanoliliuosta. 5.3 Ravistellaan muutama sekunti, minkä jälkeen putkea pidetään kaltevassa asennossa ja koputetaan sitä kevyesti. Tällöin metyyliesterit nousevat helpommin pintaan öljymäiseksi kerrokseksi (Huom. A). Metyyliesterit imetään ruiskulla, pannaan alaspäin suippenevaan koeputkeen, lisätään alumiinioksidia noin >NUM>1/ >DEN>4 metyyliesterien tilavuudesta, ravistetaan ja suodatetaan paperin läpi. Huom. A Jos metyyliesterit eivät erotu itsestään, koeputkeen lisätään 5 ml vettä ja ravistetaan. Menetelmä E 2 PERIAATE Määritettävää rasvaa tai öljyä kuumennetaan palautusjäähdyttimellä varustetussa koeputkessa metanolin, heksaanin ja rikkihapon kanssa. Syntyneet metyyliesterit uutetaan petrolieetterillä. 3 VÄLINEISTÖ 3.1 Tilavuudeltaan noin 20 ml:n koeputki, varustettuna noin 1 m:n pituisella ilmapalautusjäähdyttimellä, jossa on lasihiokset. 3.2 Mittapipetti, 5 ml. 3.3 Erotussuppilo, 50 ml. 3.4 Mittalaseja, 10 ml ja 25 ml. 3.5 Kartiopohjainen koeputki, 15 ml. 4 REAGENSSIT 4.1 Metylointireagenssi: vedettömän metanolin, heksaanin ja väkevän rikkihapon (d = 1,84) seos 75:25:1 (v/v/v). 4.2 Petrolieetteri, lämpötila 40 60 °C. 4.3 Vedetön natriumsulfaatti. 5 SUORITUS 5.1 Levyltä raaputettu aines pannaan 20 ml:n koeputkeen ja lisätään 5 ml metylointireagenssia. 5.2 Palautusjäähdytin asennetaan paikoilleen ja koeputkea kuumennetaan 30 minuuttia kiehuvassa vesihauteessa (Huom. 2). 5.3 Seos siirretään 50 ml:n erotussuppiloon käyttäen 10 ml tislattua vettä ja 10 ml petrolieetteriä. Ravistetaan voimakkaasti, annetaan faasien erottua, poistetaan vesikerros ja pestään eetterikerros kahdesti 20 ml:lla tislattua vettä. Erotussuppiloon lisätään pieni määrä vedetöntä natriumsulfaattia, ravistetaan, annetaan laskeutua muutama minuutti ja suodatetaan. Suodos kerätään 15 ml:n kartiopohjaiseen koeputkeen. Liuotin haihdutetaan vesihauteessa typpivirrassa. Huom. 1 Pieniä määriä vetykloridikaasua voidaan helposti valmistaa laboratoriossa lisäämällä kaupalliseen suolahappoon (r = 1,18) muutama tippa väkevää rikkihappoa (r = 1,84). Vapautuva kaasu on helppo kuivata johtamalla se kuplina väkevän rikkihapon läpi. Metanoli absorboi vet