Komission direktiivi 2000/45/EY, annettu 6 päivänä heinäkuuta 2000, yhteisön analyysimenetelmistä rehun A-vitamiinin, E-vitamiinin ja tryptofaanin määrittämiseksi (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)



Virallinen lehti nro L 174 , 13/07/2000 s. 0032 - 0050



Komission direktiivi 2000/45/EY, annettu 6 päivänä heinäkuuta 2000, yhteisön analyysimenetelmistä rehun A-vitamiinin, E-vitamiinin ja tryptofaanin määrittämiseksi (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin 70/373/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna Itävallan, Suomen ja Ruotsin liittymisasiakirjalla(2), ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo seuraavaa: (1) Direktiivissä 70/373/ETY säädetään, että rehun laadusta ja koostumuksesta annettujen lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten noudattamisen valvomiseksi tehtävissä virallisissa tarkastuksissa on käytettävä yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä. (2) Rehujen lisäaineista 23 päivänä marraskuuta 1970 annetussa neuvoston direktiivissä 70/524/ETY(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission asetuksella (EY) N:o 2439/1999(4), säädetään, että A- ja E-vitamiinipitoisuudet on merkittävä pakkauksiin, jos näitä aineita on lisätty esiseoksiin ja rehuihin. (3) Rehuseosten pitämisestä kaupan 2 päivänä huhtikuuta 1979 annetussa neuvoston direktiivissä 79/373/ETY(5), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 2000/16/EY(6), ja erityisravinnoksi tarkoitetuista rehuista 13 päivänä syyskuuta 1993 annetussa neuvoston direktiivissä 93/74/ETY(7), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 96/25/EY(8), säädetään aminohappojen ilmoittamisesta rehujen päällysmerkinnöissä. (4) Kyseisten aineiden valvomiseksi olisi vahvistettava yhteisön menetelmät. (5) Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on säädettävä, että määritettäessä A-vitamiini-, E-vitamiini- ja tryptofaanipitoisuuksia rehuissa ja esiseoksissa virallisia tarkastuksia varten on käytettävä tämän direktiivin liitteessä esitettyä menetelmää. 2 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 31 päivänä elokuuta 2000. Jäsenvaltioiden on ilmoitettava niistä välittömästi komissiolle. Niiden on sovellettava näitä toimenpiteitä 1 päivästä syyskuuta 2000. Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään. 3 artikla Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. 4 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 6 päivänä heinäkuuta 2000. Komission puolesta David Byrne Komission jäsen (1) EYVL L 170, 3.8.1970, s. 2. (2) EYVL C 241, 29.8.1994, s. 1. (3) EYVL L 270, 14.12.1970, s. 1. (4) EYVL L 297, 18.11.1999, s. 8. (5) EYVL L 86, 6.4.1979, s. 30. (6) EYVL L 105, 3.5.2000, s. 36. (7) EYVL L 237, 22.9.1993, s. 23. (8) EYVL L 125, 23.5.1996, s. 35. LIITE A OSA A-VITAMIININ MÄÄRITYS 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tämän määritysmenetelmän avulla voidaan määrittää A-vitamiini (retinoli) rehuseoksista ja esiseoksista. A-vitamiini käsittää all-trans-retinyylialkoholin ja sen cis-isomeerit, jotka saadaan määritetyiksi tällä menetelmällä. A-vitamiinpitoisuus ilmoitetaan kansainvälisinä yksikköinä (ky) kilogrammaa kohti. Yksi ky vastaa 0,300 μg:n all-trans-A-vitamiinialkoholin tai 0,344 μg:n all-trans-A-vitamiiniasetaatin tai 0,550 μg:n all-trans-A-vitamiinipalmitaatin aktiivisuutta. Määritysraja on 2000 ky A-vitamiinia/kg. 2 Periaate Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella, ja A-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, ja haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. A-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) UV- tai fluoresenssidetektoria käyttäen. Kromatografiset ajo-olosuhteet valitaan siten, että all-trans-A-vitamiinialkoholi ja sen cis-isomeerit eivät erotu toisistaan. 3 Reagenssit 3.1 Etanoli, σ = 96 % 3.2 Petrolieetteri, kiehumisväli 40-60 °C 3.3 Metanoli 3.4 Kaliumhydroksidiliuos, β = 50 g/100 ml 3.5 Natriumaskorbaattiliuos, β = 10 g/100 ml (ks. 7.7 huomautukset) 3.6 Natriumsulfidi, Na2S · x H2O (x = 7-9) 3.6.1 Natriumsulfidiliuos, c = 0,5 mol/l glyserolissa, β = 120 g/l (kun x = 9) (ks. 7.8 huomautukset) 3.7 Fenolftaleiiniliuos, β = 2 g/100 ml etanolissa (3.1) 3.8 2-Propanoli 3.9 HPLC-ajoliuos: metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v). Tarkka suhde määräytyy käytetyn kolonnin ominaisuuksien perusteella. 3.10 Typpi, happivapaa 3.11 All-trans-A-vitamiiniasetaatti, analyysilaatua, jonka aktiivisuus on varmennettu, esim. 2,80 x 106 ky/g. 3.11.1 All-trans-A-vitamiiniasetaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 milligramman tarkkuudella 50 mg A-vitamiiniasetaattia (3.11) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan 2-propanoliin (3.8) ja täytetään merkkiin samalla liuottimella. Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiinipitoisuus on 1400 ky/ml. Tarkka pitoisuus määritetään 5.6.3.1 kohdan mukaisesti. 3.12 All-trans-A-vitamiinipalmitaatti, analyysilaatua, jonka aktiivisuus on varmennettu, esim. 1,80 x 106 ky/g. 3.12.1 All-trans-A-vitamiinipalmitaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 milligramman tarkkuudella 80 mg A-vitamiinipalmitaattia (3.12) 100 ml:n mittapulloon. Liuotetaan 2-propanoliin (3.8) ja täytetään merkkiin samalla liuottimella. Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiini-pitoisuus on 1400 ky/ml. Tarkka pitoisuus määritetään 5.6.3.2 kohdan mukaisesti. 3.13 2,6-Di-tert-butyyli-4-metyylifenoli (BHT) (ks. huomautukset 7.5). 4 Välineistö 4.1 Vakuumipyöröhaihdutin 4.2 Ruskeat lasiastiat 4.2.1 Tasapohjaisia tai pyöreäpohjaisia keittokolveja, 500 ml, joissa on lasihios. 4.2.2 Mittapulloja, joissa on lasihiostulpat, kapeakaulaisia, 10, 25, 100 ja 500 ml. 4.2.3 Erotussuppiloita, kartiomaisia, 1000 ml, joissa on lasihiostulpat. 4.2.4 Kartiopohjaisia kolveja, 250 ml, joissa on lasihios. 4.3 Allihn jäähdyttäjä, vaipan pituus 300 mm, jossa on lasihios ja liitin kaasunsyöttöputkelle. 4.4 Laskostettua suodatinpaperia suodatukseen, halkaisija 185 mm (esim. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2). 4.5 HPLC-laitteisto, jossa injektori. 4.5.1 Nestekromatografiakolonni, 250 mm x 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava (suorituskykyvaatimus: vain yksi piikki kaikille retinoli-isomeereille ko. HPLC-ajo-olosuhteilla). 4.5.2 Vaihtuva-aallonpituuksinen UV- tai fluoresenssi-detektori. 4.6 Spektrofotometri ja 10 mm:n kvartsikyvetit. 4.7 Vesihaude, jossa on magneettisekoitin. 4.8 Uuttolaitteisto, jossa on (ks. kuva 1): 4.8.1 Lasisylinteri, tilavuus 1 l, jossa on lasihioskaula ja tulppa. 4.8.2 Lasihiosliitin, jossa on sivuputki ja keskeltä läpi menevä liikuteltava putki. Liikuteltavassa putkessa on oltava U:n muotoinen alapää ja toisessa päässä nokka, niin että sylinterissä oleva ylempi nestekerros voidaan siirtää erotussuppiloon. 5 Suoritus Huom. A-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet olisi suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin). 5.1 Näytteen valmistus Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan. Vältettävä näytteen lämpenemistä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia A-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi. 5.2 Saippuointi A-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella 2-25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.13), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdyttäjä (4.3) kolviin, ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttäjän läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdyttäjä huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolein sisältö jäähdytetään huoneen lämpötilaan. 5.3 Uutto Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen pitäisi olla noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia. 5.3.1 Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen Kun kerrokset ovat erottuneet (kts. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2). Yhdistetyt uutokset pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen, 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uutos suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huuhdotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin. 5.3.2 Uutto uuttolaitteella (4.8) Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon. Yhdistetyt petrolieetteriuutokset pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten ko. kohdassa kerrottu. 5.4 Näyteliuoksen valmistus HPLC-ajoja varten Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n kartiopohjaiseen kolviin (4.2.4). Haihdutetaan liuotin lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa. Vesihauteen lämpötila saa olla enintään 40 °C. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.10) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.10) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10-100 ml) metanolia (3.3) (A-vitamiinipitoisuuden olisi oltava välillä 5-30 ky/ml). 5.5 Määritys HPLC:llä A-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan UV-detektorilla (325 nm) tai fluoresenssi-detektorilla (eksitaatio: 325 nm, emissio: 475 nm) (4.5.2). Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan HPLC-ajoliuoksella (3.9). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo. HPLC-ajo-olosuhteet Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset. >TAULUKON PAIKKA> 5.6 Kalibrointi 5.6.1 Käyttöstandardiliuosten valmistus Pipetoidaan 20 ml A-vitamiiniasetaatin kantaliuosta (3.11.1) tai 20 ml A-vitamiinipalmitaatin kantaliuosta (3.12.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin 4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2, mutta ilman BHT-lisäystä. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä (3.2). Haihdutetaan 100 ml tätä uutosta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.10) ja jäännös liuotetaan 10,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 560 ky/ml A-vitamiinia. Tarkka pitoisuus on määritettävä kohdan 5.6.3.3 mukaisesti. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä. Pipetoidaan 2,0 ml tätä käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Tämän laimennetun käyttöstandardiliuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. 5.6.2 Kalibrointiliuosten valmistus ja kalibrointikäyrä. Pipetoidaan 1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 ml laimennettua käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,8, 5,6, 14,0 ja 28,0 ky/ml A-vitamiinia. Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja, ottaen huomioon UV-pitoisuustarkistustulokset (5.6.3.3). 5.6.3 Standardiliuosten UV-standardisointi 5.6.3.1 A-vitamiiniasetaattikantaliuos Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiiniasetaattikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiiniasetaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300-400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325-327 nm. A-vitamiinipitoisuuden laskeminen: >PIC FILE= "L_2000174FI.003601.EPS"> 5.6.3.2 A-vitamiinipalmitaattikantaliuos Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiinipalmitaattikantaliuosta (3.12.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiinipalmitaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300 nm-400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325-327 nm. A-vitamiinipitoisuuden laskeminen: >PIC FILE= "L_2000174FI.003602.EPS"> 5.6.3.3 A-vitamiinin käyttöstandardiliuos Pipetoidaan 3,0 ml laimentamatonta A-vitamiinin käyttöstandardiliuosta, joka on valmistettu kohdan 5.6.1 mukaisesti, 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Pipetoidaan 5,0 ml tätä liuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300-400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325-327 nm. A-vitamiinipitoisuuden laskeminen: >PIC FILE= "L_2000174FI.003603.EPS"> 6 Tulosten laskeminen Näyteliuoksen A-vitamiinipitoisuus (ky/ml) lasketaan näyteliuoksen A-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.2) avulla. Näytteen A-vitamiinipitoisuus w (ky/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla: >PIC FILE= "L_2000174FI.003701.EPS"> jossa β= näyteliuoksen (5.4) A-vitamiinipitoisuus (ky/ml) V1= näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml) V2= kohdassa 5.4 otetun näyteliuoksen tilavuus (ml) m= punnittu näytemäärä (g) 7 Huomautuksia 7.1 Jos näytteiden A-vitamiinipitoisuus on alhainen, voi olla hyödyllistä yhdistää kahden saippuointierän petrolieetteriuutokset (punnittu määrä: 25 g) yhdeksi näyteliuokseksi HPLC-määritystä varten. 7.2 Analyysiä varten otetussa näytemäärässä ei saisi olla yli 2 g rasvaa. 7.3 Jos faasit eivät erotu, lisätään noin 10 ml etanolia (3.1) emulsion hajottamiseksi. 7.4 Kun on kyseessä kalanmaksaöljy ja muut puhtaat rasvat, saippuointiajan olisi oltava 45-60 minuuttia. 7.5 Hydrokinonia voi käyttää BHT:n sijasta. 7.6 Käytettäessä normaalifaasikolonnia retinoli-isomeerit voivat erottua toisistaan. 7.7 Natriumaskorbaattiliuoksen voi korvata noin 150 mg:lla askorbiinihappoa. 7.8 Natriumsulfidiliuoksen voi korvata noin 50 mg:lla EDTA:a. 8 Toistettavuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta. 9 Laboratorioiden välisen vertailun tulokset(1) >TAULUKON PAIKKA> Kuva 1: Uuttolaitteisto (4.8) >PIC FILE= "L_2000174FI.003801.EPS"> B OSA E-VITAMIININ MÄÄRITYS 1 Tarkoitus ja soveltamisala Tämän määritysmenetelmän avulla voidaan määrittää E-vitamiini rehuseoksista ja esiseoksista. E-vitamiinipitoisuus ilmoitetaan mg/kg DL-α-tokoferoliasetaattia. 1 mg DL-α-tokoferoliasetaattia vastaa 0,91 mg:aa DL-α-tokoferolia (E-vitamiinia). Määritysraja on 2 mg E-vitamiinia/kg. 2 Periaate Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella ja E-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. E-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) fluoresenssi- tai UV-detektoria käyttäen. 3 Reagenssit 3.1 Etanoli, σ = 96 % 3.2 Petrolieetteri, kiehumisväli 40-60 °C. 3.3 Metanoli 3.4 Kaliumhydroksidiliuos, β = 50 g/100 ml 3.5 Natriumaskorbaattiliuos, β = 10 g/100 ml (ks. 7.7 huomautukset) 3.6 Natriumsulfidi, Na2S · x H2O (x = 7-9) 3.6.1 Natriumsulfidiliuos, c = 0,5 mol/1 glyserolissa, β = 120 g/l (kun x = 9) (ks. 7.8 huomautukset) 3.7 Fenolftaleiiniliuos, β = 2 g/100 ml etanolissa (3.1) 3.8 HPLC-ajoliuos: metanolin (3.3) ja veden seos, esim. 980 + 20 (v + v). Tarkka suhde määräytyy käytetyn kolonnin ominaisuuksien perusteella. 3.9 Typpi, happivapaa 3.10 DL-α-tokoferoliasetaatti, analyysilaatua, varmennettu aktiivisuus 3.10.1 DL-α-tokoferoliasetaatin kantaliuos: Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 100 mg DL-α-tokoferoliasetaattia (3.10) 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan etanoliin (3.1) ja täytetään merkkiin etanolilla. 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg DL-α-tokoferoliasetaattia. (UV-tarkistus, ks. 5.6.1.3; stabilointi, ks. 7.4, huomautukset) 3.11 DL-α-tokoferoli, analyysilaatua, varmennettu aktiivisuus 3.11.1 Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 100 mg DL-α-tokoferolia (3.10) 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan etanoliin (3.1) ja täytetään merkkiin etanolilla. 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg DL-α-tokoferolia. (UV-tarkistus, ks. 5.6.2.3; stabilointi, ks. 7.4 huomautukset) 3.12 2,6-Di-tert-butyyli-4-metyylifenoli (BHT) (ks. huomautukset 7.5) 4 Välineistö 4.1 Vakuumipyöröhaihdutin 4.2 Ruskeat lasiastiat 4.2.1 Tasapohjaisia tai pyöreäpohjaisia keittokolveja, 500 ml, joissa on lasihios 4.2.2 Mittapulloja, joissa on lasihiostulpat, kapeakaulaisia, 10, 25, 100 ja 500 ml. 4.2.3 Erotussuppiloita, kartiomaisia, 1000 ml, joissa on lasihiostulpat. 4.2.4 Kartiopohjaisia kolveja, 250 ml, joissa on lasihios. 4.3 Allihn-jäähdyttäjä, vaipan pituus 300 mm, jossa on lasihios ja liitin kaasunsyöttöputkelle. 4.4 Laskostettua suodatinpaperia suodatukseen, halkaisija 185 mm (esim. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2). 4.5 HPLC-laitteisto, jossa injektori. 4.5.1 Nestekromatografiakolonni, 250 mm x 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 tai 10 μm, tai vastaava. 4.5.2 Vaihtuva-aallonpituuksinen fluoresenssi- tai UV- detektori. 4.6 Spektrofotometri ja 10 mm:n kvartsikyvetit. 4.7 Vesihaude, jossa on magneettisekoitin. 4.8 Uuttolaitteisto, jossa on (ks. kuva 1): 4.8.1 Lasisylinteri, 1 l, jossa on lasihioskaula ja tulppa. 4.8.2 Lasihiosliitin, jossa on sivuputki ja keskeltä läpi menevä liikuteltava putki. Liikuteltavassa putkessa on oltava U:n muotoinen alapää ja toisessa päässä nokka, niin että sylinterissä oleva ylempi nestekerros voidaan siirtää erotussuppiloon. 5 Suoritus Huom. E-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet olisi suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin). 5.1 Näytteen valmistus Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan. Vältettävä näytteen lämpenemistä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia E-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi. 5.2 Saippuointi E-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella 2-25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.12), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdyttäjä (4.3) kolviin ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttäjän läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdyttäjä huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolein sisältö jäähdytetään huoneenlämpötilaan. 5.3 Uutto Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen pitäisi olla noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia. 5.3.1 Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2). Yhdistetyt uutokset pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uutos suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huudotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin. 5.3.2 Uutto uuttolaitteella (4.8) Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon. Yhdistetyt petrolieetteriuutokset pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten ko. kohdassa kerrottu. 5.4 Näyteliuoksen valmistus HPLC-ajoja varten Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n kartiopohjaiseen kolviin (4.2.4). Liuotin haihdutetaan lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa. Vesihauteen lämpötila saa olla korkeintaan 40 °C. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.9) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.9) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10-100 ml) metanolia (3.3) (DL-α-tokoferolipitoisuuden olisi oltava välillä 5-30 μg/ml). 5.5 Määritys HPLC:IIä E-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan fluoresenssi-detektorilla (eksitaatio: 295 nm, emissio: 330 nm) tai UV-detektorilla (292 nm) (4.5.2). Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan HPLC-ajoliuoksella (3.8). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo. HPLC-ajo-olosuhteet Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset. >TAULUKON PAIKKA> 5.6 Kalibrointi (DL-α-tokoferoliasetaatti tai DL-α-tokoferoli) 5.6.1 DL-α-tokoferoliasetaattistandardi 5.6.1.1 Käyttöstandardiliuoksen valmistus Pipetoidaan 25 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaiiuosta (3.10.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä. Haihdutetaan 25 ml tätä uutosta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.9) ja jäännös liuotetaan 25,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 45,5 g/ml DL-α-tokoferolia, mikä vastaa 50 g/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä. 5.6.1.2 Kalibrointiliuosten valmistus ja kalibrointikäyrä Pipetoidaan 1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,5, 5,0, 10,0 ja 25,0 g/ml DL-α-tokoferoliasetaattia, ts. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolia. Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja. 5.6.1.3 DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuoksen (3.10.1) UV-standardisointi Laimennetaan 5,0 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuosta (3.10.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250-320 nm. Absorptiomaksimin pitäisi olla aallonpituudella 284 nm: >PIC FILE= "L_2000174FI.004201.EPS"> Tällä laimennuksella pitäisi saada ekstinktioarvo 0,84-0,88. 5.6.2 DL-α-tokoferolistandardi 5.6.2.1 Käyttöstandardiliuoksen valmistus Pipetoidaan 2 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon, liuotetaan metanoliin (3.3) ja täytetään merkkiin metanolilla. Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 40 μg/ml DL-α-tokoferolia, joka vastaa 44,0 μg/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä. 5.6.2.2 Kalibrointiliuosten valmistus ja kalibrointikäyrä Pipetoidaan 1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml kantastandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,0, 4,0, 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-atokoferolia, ts. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoliasetaattia. Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja. 5.6.2.3 DL-α-tokoferolikantaliuoksen (3.11.1) UV-standardisointi Laimennetaan 2,0 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250-320 nm. Absorptiomaksimin pitäisi olla aallonpituudella 292 nm: >PIC FILE= "L_2000174FI.004202.EPS"> Tällä laimennuksella pitäisi saada ekstinktioarvo 0,6. 6 Tulosten laskeminen Näyteliuoksen E-vitamiinipitoisuus μg/ml (laskettuna α-tokoferoliasetaattina) määritetään näyteliuoksen E-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.1.2 tai 5.6.2.2) avulla. Näytteen E-vitamiinipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla: >PIC FILE= "L_2000174FI.004203.EPS"> jossa ß= näyteliuoksen (5.4) E-vitamiinipitoisuus (μg/ml) V1= näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml) V2= kohdassa 5.4 otetun näyteliuoksen tilavuus (ml) m= punnittu näytemäärä (g) 7 Huomautuksia 7.1 Jos näytteiden E-vitamiinipitoisuus on alhainen, voi olla hyödyllistä yhdistää kahden saippuointierän petrolieetteriuutokset (punnittu määrä: 25 g) yhdeksi näyteliuokseksi HPLC-määritystä varten. 7.2 Analyysiä varten otetussa näytemäärässä ei saisi olla yli 2 g rasvaa. 7.3 Jos faasit eivät erotu, lisätään noin 10 ml etanolia (3.1) emulsion hajottamiseksi. 7.4 Sen jälkeen, kun DL-α-tokoferoliasetaattiliuoksen pitoisuus on määritetty 5.6.1.3 kohdan mukaisesti tai DL-α-tokoferoliliuoksen pitoisuus 5.6.2.3 kohdan mukaisesti spektrofotometrisesti, lisätään noin 10 mg BHT:tä (3.12) liuokseen (3.10.1 tai 3.10.2). Liuos säilytetään jääkaapissa (enintään 4 viikkoa). 7.5 Hydrokinonia voi käyttää BHT:n sijasta. 7.6 Käytettäessä normaalifaasikolonnia α-, β-, χ- ja δ-tokoferolit voivat erottua toisistaan. 7.7 Natriumaskorbaattiliuoksen voi korvata noin 150 mg:lla askorbiinihappoa. 7.8 Natriumsulfidiliuoksen voi korvata noin 50 mg:lla EDTA:a. 8 Toistettavuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta. 9 Laboratorioiden välisen vertailun tulokset(2) >TAULUKON PAIKKA> Kuva 1: Uuttolaitteisto (4.8) >PIC FILE= "L_2000174FI.004401.EPS"> C OSA TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS 1 Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmän avulla määritetään rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan. 2 Periaate Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella ja kuumennetaan 110 °C:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi. Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa. Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutoksessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssi-detektoria. 3 Reagenssit 3.1 Veden tulee olla kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 ìS/cm). 3.2 Standardiaine: tryptofaani (puhtaus/pitoisuus >= 99 %), kuivattu tyhjiässä fosforipentoksidin päällä. 3.3 Sisäinen standardiaine: a-metyylitryptofaani (puhtaus/pitoisuus >= 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä. 3.4 Bariumhydroksidioktahydraatti (on varottava, ettei Ba(OH)2 · 8 H2O joudu paljon kosketuksiin ilman kanssa; tällöin muodostuisi BaCO3:a, joka voi häiritä määritystä) (ks. huomautus 9.3). 3.5 Natriumhydroksidi 3.6 Ortofosforihappo, w = 85 % 3.7 Suolahappo, ρ20 1,19 g/ml 3.8 Metanoli, HPLC-laatua 3.9 Petrolieetteri, kiehumisväli 40-60 °C 3.10 Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1). 3.11 Suolahappo, c = 6 mol/l: Mitataan 492 ml suolahappoa (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.12 Suolahappo, c = 1 mol/l: Mitataan 82 ml suolahappoa (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.13 Suolahappo, c = 0,1 mol/1: Mitataan 8,2 ml suolahappoa (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.14 Ortofosforihappo, c = 0,5 mol/l: Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1). 3.15 Väkevä tryptofaaniliuos (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) suolahappoon (3.13) ja täytetään merkkiin suolahapolla (3.13). Säilyy - 18 °C:ssa enintään 4 viikkoa. 3.16 Väkevä sisäisen standardin liuos, c = 2,50 mol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) suolahappoon (3.13) ja täytetään merkkiin suolahapolla (3.13). Säilyy - 18 °C:ssa enintään 4 viikkoa. 3.17 Tryptofaanin ja sisäisen standardin kalibrointistandardiliuos: Mitataan 2,00 ml väkevää tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml väkevää sisäisen standardin (α-metyylitryptofaani) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10-30 %). Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä. Liuosta on suojeltava suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana. 3.18 Etikkahappo 3.19 1,1,1-Trikloori-2-metyyli-2-propanoli 3.20 Etanoliamiini > 98 % 3.21 Valmistetaan liuos, jossa on 1 g 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) 100 ml:ssa metanolia (3.8). 3.22 HPLC-ajoliuos: 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.21) (1 g/100 ml). pH säädetään arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1000 ml:ksi vedellä (3.1). 4 Välineistö 4.1 HPLC-laitteisto, jossa on spektrofluorimetri-detektori 4.2 Nestekromatografiakolonni, 125 mm x 4 mm, C18, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava 4.3 pH-mittari 4.4 Polypropyleenipullo, tilavuus 125 ml, jossa on leveä kaula ja kierretulppa 4.5 Kalvosuodatin 0,45 μm 4.6 Autoklaavi, 110 (+- 2) °C; 1,4 (+- 0,1) bar 4.7 Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin 4.8 Vortex-sekoitin 5 Suoritus 5.1 Näytteiden valmistus Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joilla on suuri kosteuspitoisuus, on ilmakuivattava korkeintaan 50 °C:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joilla on suuri rasvapitoisuus, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista. 5.2 Vapaan tryptofaanin määritys (uutoksesta) Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1-5 g) kohdan (5.1) mukaan valmistettua näytettä pyöreäpohjaiseen kolviin. Lisätään 100,0 ml suolahappoa, c = 0,1 mol/l (3.13) ja 5,00 ml väkevää sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekanterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa, c = 0,5 mol/l (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla, c = 1,0 mol/l (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10-30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiavaihetta varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)). Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen kuin injektoidaan HPLC-kolonniin. Siirrytään kromatografiavaiheeseen (kohta 5.4). Standardiliuos ja uutokset suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutoksia voi säilyttää 5 °C:ssa enintään 3 päivää. 5.3 Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista) Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1-1 g kohdan (5.1) mukaan valmistettua näytettä polypropyleenipulloon (4.4). Punnitussa näytemäärässä pitäisi typpipitoisuuden olla noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pannaan tulppa ja suljetaan pullo löyhästi. Pullo pannaan kiehuvaan autoklaaviin (4.6) ja annetaan olla höyryllä 30-60 minuuttia. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (+- 2) °C:ssa 20 tuntia. Lämpötila on laskettava juuri alle 100 °C:een ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2 · 8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml väkevää sisäistä standardiliuosta (α-metyylitryptofaani, 3.16). Jäähdytetään pullot vesi jäähauteella 15 minuuttia. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa, c = 0,5 mol/l (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä, c = 6 mol/l (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä, c = 1 mol/l (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10-30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiavaihetta varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista. Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen (kohta 5.4). Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 °C:ssa enintään 3 päivää. 5.4 HPLC-määritys Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2): >TAULUKON PAIKKA> 6 Tulosten laskeminen >PIC FILE= "L_2000174FI.004701.EPS"> A= sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17) B= tryptofaanin piikin pinta-ala, uutos (5.2) tai hydrolysaatti (5.3) C= kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn väkevän tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml) D= kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn väkevän tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50) E= uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) väkevän sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml F= sisäisen standardin piikin pinta-ala, uutos (5.2) tai hydrolysaatti (5.3) G= tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17) H= kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn väkevän sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (2 ml) W= näytteen paino g (korjattuna alkuperäiseen painoon, jos näytettä on kuivattu ja/tai jos siitä on poistettu rasva) MW= tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23) 7 Toistettavuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta. 8 Laboratorioiden välisen vertailun tulokset Järjestettiin EY-vertailu (4. vertailututkimus), jossa 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset esitetty seuraavassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> Järjestettiin myös toinen EY-vertailu (3. vertailututkimus), jossa 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset esitetty seuraavassa taulukossa. >TAULUKON PAIKKA> Vielä järjestettiin EY-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. >TAULUKON PAIKKA> 9 Huomautuksia 9.1 Seuraavilla erityisillä kromatografiaolosuhteilla voidaan erottaa paremmin tryptofaani ja α-metyylitryptofaani. >TAULUKON PAIKKA> 9.2 Kromatografia vaihtelee HPLC-laitetyypin ja käytetyn kolonnin täytemateriaalin mukaan. Valitun järjestelmän pitää pystyä erottamaan tryptofaanin piikki ja sisäisen standardin piikki pohjaviivalle asti: Lisäksi on tärkeää, että hajoamistuotteet eroavat hyvin tryptofaanista ja sisäisestä standardista. Hydrolysaatteja on ajettava ilman sisäistä standardia, jotta voidaan tarkistaa pohjaviiva sisäisen standardin kohdalla epäpuhtauksien suhteen. On tärkeää, että ajoaika on riittävän pitkä, jotta kaikki hajoamistuotteet eluoituvat. Myöhään eluoituvat piikit saattavat muuten häiritä myöhempiä kromatografia-ajoja. Kromatografiajärjestelmän vasteen pitäisi olla lineaarinen toiminta-alueella. Lineaarinen vaste pitäisi mitata sisäisen standardin vakiopitoisuudella (normaalilla pitoisuudella) ja erilaisilla tryptofaanipitoisuuksilla. On tärkeää, että sekä tryptofaanin että sisäisen standardin piikkien koot ovat HPLC-fluoresenssijärjestelmän lineaarisella alueella. Jos joko tryptofaanin ja/tai sisäisen standardin piikki on liian pieni tai liian suuri (piikit ovat liian pienet tai suuret), analyysi pitäisi toistaa käyttäen erilaista näytemäärää ja/tai muuttaen lopputilavuutta. 9.3 Bariumhydroksidi Bariumhydroksidi tulee vanhetessaan vaikealiukoisemmaksi. HPLC-määritystä varten tehty liuos voi sen vuoksi olla samea, minkä vuoksi voidaan saada alhaisia tryptofaanituloksia. (1) Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä. (2) Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä.