93/256/ETY: Komission päätös, tehty 14 päivänä huhtikuuta 1993, vaikutukseltaan hormonaalisten tai tyrostaattisten aineiden jäämien määritysmenetelmistä



Virallinen lehti nro L 118 , 14/05/1993 s. 0064 - 0074

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 49 s. 0190

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 49 s. 0190



KOMISSION PÄÄTÖS, tehty 14 päivänä huhtikuuta 1993, vaikutukseltaan hormonaalisten tai tyrostaattisten aineiden jäämien määritysmenetelmistä (93/256/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon tiettyjen hormonaalista ja kaikkien tyreostaattista vaikutusta omaavien aineiden kieltämisestä annetun direktiivin 81/602/ETY täydentämisestä 16 päivänä heinäkuuta 1985 annetun neuvoston direktiivin 85/358/ETY (), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 88/146/ETY (), ja erityisesti sen 5 artiklan 2 kohdan, sekä katsoo, että terveyttä koskevista ongelmista yhteisön sisäisessä tuoreen lihan kaupassa 26 päivänä kesäkuuta 1964 annetun neuvoston direktiivin 64/433/ETY (), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 92/5/ETY (), 8 artiklan 1 kohdan mukaan sekä terveyttä ja eläinten terveyttä koskevista ongelmista yhteisön sisäisessä lämpökäsitellyn maidon kaupassa 5 päivänä elokuuta 1985 annetun neuvoston direktiivin 85/397/ETY (), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 89/662/ETY (), 11 artiklan 4 kohdan toisen alakohdan mukaan jäämätutkimukset on suoritettava noudattaen tutkittuja ja tieteellisesti tunnustettuja menetelmiä, erityisesti menetelmiä, jotka annetaan yhteisön direktiiveissä tai muissa kansainvälisissä määräyksissä, näytteiden määritysmenetelmien määrittelyssä annetaan noudatettava määritysmenetelmä, säännöt näytteiden ottamisesta ja määritysten suoritusperusteet, annettavien määritysmenetelmien on oltava riittävän herkkiä vaikutukseltaan hormonaalisten tai tyrostaattisten aineiden jäämien havaitsemiseksi, näytteenotto on olennainen osa määritystä; tästä syystä olisi annettava säännöt näytteiden ottamisesta, tätä päätöstä sovellettaessa olisi otettava huomioon elintarvikkeiden tarkastuksessa tarvittavien yhteisön näytteenottomenettelyjen ja analyysimenetelmien käyttöön ottamisesta 20 päivänä joulukuuta 1985 annetun neuvoston direktiivin 85/591/ETY () liitteen 1 kohdassa määrätyt perusteet, selvyyden vuoksi sekä tieteen ja tekniikan tietämyksen kehityksen huomioon ottamiseksi olisi kumottava komission päätös 87/410/ETY (), ja tässä päätöksessä määrätyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset, ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN: 1 artikla Vaikutukseltaan hormonaalisten ja tyrostaattisten aineiden jäämien havaitsemiseksi hyväksytään seuraavat rutiinimääritysmenetelmät: P immunomääritys, P ohutkerroskromatografia, P nestekromatografia, P kaasukromatografia, P massaspektrometria, P spektrometria, sekä mikä tahansa muu menetelmä, joka on kyseiselle menetelmälle liitteessä annettujen perusteiden mukainen. 2 artikla Näytteenotossa on noudatettava seuraavia sääntöjä: 1. näytteen on oltava kooltaan edustava ja riittävän suuri varsinaista määritystä, sen uusintaa ja varmistusta varten; 2. näytteet on merkittävä siten, että ne voidaan tunnistaa kaikissa määrityksen vaiheissa; 3. näytteet on otettava, pakattava, säilytettävä, kuljetettava ja varastoitava siten, että näytteet säilyvät muuttumattomina ja että edellä mainitut toimenpiteet eivät vaikuta tutkimustuloksiin. Mikä tahansa näytteiden luvaton käyttö on estettävä. 3 artikla Vaikutukseltaan hormonaalisten ja tyrostaattisten aineiden jäämien havaitsemiseksi käytettäviin rutiinimääritysmenetelmiin sovellettavat perusteet annetaan liitteessä. 4 artikla Tätä päätöstä on tarkasteltava uudelleen ennen 1 päivää tammikuuta 1996 tieteen ja tekniikan tietämyksen huomioon ottamiseksi. 5 artikla Kumotaan päätös 87/410/ETY. 6 artikla Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 14 päivänä huhtikuuta 1993. Komission puolesta René STEICHEN Komission jäsen () EYVL N:o L 191, 23.7.1985, s. 46 () EYVL N:o L 70, 16.3.1988, s. 16 () EYVL N:o 121, 29.7.1964, s. 2012/64 () EYVL N:o L 57, 2.3.1992, s. 1 () EYVL N:o L 226, 24.8.1985, s. 13 () EYVL N:o L 395, 30.12.1989, s. 13 () EYVL N:o L 372, 31.12.1985, s. 50 () EYVL N:o L 223, 11.8.1987, s. 18 LIITE 1 MÄÄRITELMÄT JA YLEISET VAATIMUKSET 1.1 Määritelmät 1.1.1 Rutiinimääritysmenetelmät Rutiinimääritysmenetelmät ovat määritysmenetelmiä, joita jäsenvaltioissa käytetään teuraseläimissä ja näistä eläimistä saatavissa tuotteissa olevien jäämien kansallisten tarkastussuunnitelmien täytäntöönpanemiseksi neuvoston direktiivin 86/469/ETY () säännösten mukaisesti. Rutiinimenetelmien on oltava toimivien laboratorioiden validoimia ja niiden on vastattava tässä liitteessä annettuja perusteita. Niitä voidaan käyttää seulontaan ja varmistukseen. P Seulontaan käytettävillä menetelmillä (seulontamenetelmät) pyritään havaitsemaan tutkittava aine tai tutkittavien aineiden luokka tietyllä tasolla. Niiden näytteenkäsittelykapasiteetti on suuri ja niillä voidaan tutkia tarkasti suuri määrä näytteitä mahdollisesti positiivisten näytteiden havaitsemiseksi. Niillä pyritään välttämään väärät negatiiviset tulokset. P Varmistukseen käytettävillä menetelmillä (varmistusmenetelmät) on voitava tunnistaa tutkittava aine yksiselitteisesti tietyllä tasolla. Näillä menetelmillä pyritään välttämään väärät positiiviset tulokset ja saavuttamaan väärien negatiivisten tulosten hyväksyttävä alhainen todennäköisyys. 1.1.2 Tutkittava aine Määritettävän näytteen sisältämä aine, joka on havaittava, tunnistettava ja/tai määritettävä. Ilmaisu "tutkittava aine" sisältää myös määrityksen aikana tutkittavasta aineesta muodostetut johdannaiset. Tutkittavan aineen kvantitatiiviset mittaukset voidaan ilmoittaa: P määränä, ilmoitettuna massana (esimerkiksi ìg, ng) tai P pitoisuutena, ilmoitettuna paino-osuutena (esimerkiksi ìg kg P1, ng kg P1), massapitoisuutena (esimerkiksi ìg l P1) tai pitoisuutena (esimerkiksi mol l P1). 1.1.3 Näytteet 1.1.3.1 Laboratorionäyte Laboratorioon lähetettäväksi valmistettu näyte, joka on tarkoitus tutkia tai määrittää. 1.1.3.2 Koenäyte Laboratorionäytteestä valmistettu näyte, josta näyteannokset otetaan. 1.1.3.3 Näyteannos Koenäytteestä (tai laboratorionäytteestä, jos molemmat ovat samat) otettu ainemäärä, josta määritys tai tutkimus tehdään. 1.1.4 Standardiaine Tarkkaan määritelty aine, jonka pitoisuus on ilmoitettu, joka on korkeinta mahdollista puhtausastetta ja johon määritettävää ainetta verrataan. 1.1.5 Vertailumateriaali Kyseessä on materiaali, jonka yksi tai useampi ominaisuus on määritetty validoidulla menetelmällä ja jota voidaan käyttää laitteen kalibrointiin tai varmistusmittauksiin. () EYVL N:o L 275, 26.9.1986, s. 36 1.1.6 Nollakokeet 1.1.6.1 Nollanäytemääritys Kyseessä on kokonainen määritys, joka tehdään tutkittavaa ainetta sisältämättömästä näytteestä otetusta näyteannoksesta. 1.1.6.2 Nollareagenssikoe Kyseessä on kokonainen määritys, joka tehdään ilman näyteannosta tai jossa käytetään vastaavaa määrää sopivaa liuotinta näyteannoksen sijasta. 1.1.7 Spesifisyys Spesifisyydellä tarkoitetaan menetelmän kykyä erottaa tutkittava aine muista aineista. Tämä ominaisuus riippuu ensisijaisesti määritykseen käytettävän menetelmän toimintaperiaatteesta, mutta se voi vaihdella yhdisteen tai matriisin luokan mukaan. Spesifisyyttä koskevien tietojen on liityttävä vähintään johonkin aineeseen, jonka voidaan odottaa lähettävän signaalin kyseistä määritystä tehtäessä (esimerkiksi kyseisen jäämän homologit, analogit, hajoamistuotteet). Spesifisyyttä koskevista tiedoista on oltava mahdollista johtaa kvantitatiivisesti tarkkuus, jolla menetelmä pystyy erottamaan koeolosuhteissa tutkittavan aineen muista aineista. 1.1.8 Tarkkuus Tässä päätöksessä tarkkuudella tarkoitetaan keskiarvon tarkkuutta. Käytettävä tarkkuuden määritelmä on annettu standardin ISO 3534 P1977 2.83 kohdassa (keskiarvon tarkkuus: todellisen arvon ja keskiarvotuloksen läheisyys, joka saadaan toistamalla suuri määrä kokeita). Epätarkkuuden perussyyt ovat: a) satunnaisvirheet, b) systemaattiset virheet; esim. alhainen saanto. Hyvin suurella määrällä kokeita keskiarvon tarkkuus lähestyy systemaattista virhettä. Menetelmän selostuksessa on ilmoitettava kokeiden lukumäärä. Tarkkuuden arvo on vertailuaineen keskiarvon ja sen todellisen arvon erotus ilmoitettuna prosenttiosuutena todellisesta arvosta. Jos vertailuainetta ei ole käytettävissä, eri muuttajat voidaan arvioida tekemällä määritys näytteestä, johon on lisätty tutkittavaa ainetta. Kun täysin yhtenäistettyä menetelmää tai pätevää vertailuainetta ei ole käytettävissä, tutkittavan aineen pitoisuus näytteessä voidaan määrittää menetelmällä, jonka spesifisyys, tarkkuus ja toistotarkkuus on suuri. 1.1.9 Toistotarkkuus Kyseessä on määrätyissä koeolosuhteissa kokeita toistamalla saatujen tulosten läheisyys [standardi ISO 3534 P1977 (), 2.84 kohta]. Toistotarkkuus sisältää toistettavuuden ja uusittavuuden. Toistettavuus: Erillisten määritysten sellaisten tulosten läheisyys, jotka on saatu toistettavuuden vaatimusten mukaisesti, toisin sanoen samalla menetelmällä, samanlaisella näyteannoksella, samassa laboratoriossa, saman suorittajan toimesta, samoilla laitteilla ja lyhyellä aikavälillä. Uusittavuus: Erillisten määritysten sellaisten tulosten läheisyys, jotka on saatu uusittavuuden vaatimusten mukaisesti, toisin sanoen samalla menetelmällä, samanlaisella näyteannoksella, eri laboratorioissa, eri suorittajien toimesta ja eri laitteilla. Neuvoston direktiivin 85/591/ETY () liitteen mukaisesti direktiivin säännösten perusteella hyväksyttäväksi harkittavien määritysmenetelmien arvojen on perustuttava yhteiseen kokeeseen, joka on mieluiten tehty standardin ISO 5725 P1986 () mukaisesti. Tässä yhteydessä käytettävät ilmaisut "toistettavuus" ja "uusittavuus" on määritelty standardissa ISO 5725 P1986. Näitä kokeita tehtäessä olisi käytettävä näyteaineita, joiden tutkittavan aineen tunnettu pitoisuus on lähellä jäämien enimmäismääriä. () International Organization for Standardization: Statistics P vocabulary and symbols. () EYVL N:o L 372, 31.12.1985, s. 50 () Kansainvälinen Standardisointijärjestö: Koemenetelmien täsmällisyys P toistettavuuden ja uusittavuuden määrittäminen laboratorioiden välisissä kokeissa. Kunnes verrattavuus vahvistetaan yhteiskokeella, kirjoituspöytätutkimuksena suoritettavaan menetelmien esivalintaan riittävät tiedot toistettavuudesta. Toistettavuudelle ja uusittavuudelle käytettävä mittayksikkö, variaatiokerroin, on määritelty standardin ISO 3534 P1977 2.35 kohdassa (variaatiokerroin: standardipoikkeaman ja aritmeettisen keskiarvon itseisarvon suhde). 1.1.10 Toteamisraja Toteamisraja on pienin määritetty pitoisuus, josta voidaan päätellä tutkittavan aineen esiintyminen kohtuullisella tilastollisella varmuudella (vähintään 95 % kielletyille aineille P ks. 1.2.6.1). Toteamisraja voidaan laskea eri tavoin: a) Voidaan tehdä nollakoemääritys vähintään 20 edustavasta nollanäytteestä, jolloin toteamisraja on saatu keskiarvo, johon on lisätty nollakokeiden standardipoikkeama kerrottuna kolmella. Huomautus 1: Määrityksessä käytettävien näyteannosten määrä on annettava. Huomautus 2: Jos on todennäköistä, että sellaiset seikat kuten laji, sukupuoli, ikä, ravinto tai muut ympäristötekijät voivat vaikuttaa menetelmän tuloksiin, jokaista homogeenista populaatiota varten, johon menetelmää sovelletaan, on oltava vähintään 20 nollanäytettä. b) Kun edustavat nollakokeet lähettävät spektrometrisissä määrityksissä vain taustahäiriöitä, toteamisraja on kolminkertaista huippujen välistä häiriötasoa vastaava pitoisuus. 1.1.11 Toimenpideraja Toimenpideraja on tutkittavan aineen menetelmällä mitattava alin pitoisuus, joka voidaan määrittää tietyllä tarkkuudella ja toistettavuudella. 1.1.12 Herkkyys Herkkyys on menetelmän kykyä erottaa eroja tutkittavan aineen pitoisuuksissa. Tässä päätöksessä herkkyys on kalibrointikäyrän kulmakerroin kyseisellä tasolla. 1.1.13 Käyttökelpoisuus Käyttökelpoisuus on määritysmenetelmän ominaisuus, joka riippuu menetelmän sovellusalasta ja johon menetelmän näytekapasiteetti ja hintatekijät vaikuttavat. 1.1.14 Sovellettavuus Sovellettavuus on luettelo niistä näyte- tai ainetyypeistä, joihin menetelmää voidaan soveltaa sellaisenaan tai pienten muutosten jälkeen. 1.1.15 Tulosten tulkinta 1.1.15.1 Positiiviset tulokset Tutkittavan aineen esiintyminen näytteessä on osoitettu määritysmenetelmän mukaisesti, kun yleiset perusteet ja käytettävän määritysmenetelmän erityisperusteet täyttyvät. a) Aineilla, joiden sallittu poikkeama on nolla, määritystulos on positiivinen, jos näytteen sisältämä tutkittava aine tunnistetaan yksiselitteisesti. b) Aineilla, joiden jäämien enimmäismäärä on vahvistettu, määritystulos on positiivinen, kun kokeellisesti määritetty (mahdollisesti tarvittavien saantoa koskevien korjausten tekemisen jälkeen) näytteen sisältämän tutkittavan aineen määrä on suurempi kuin vahvistettu jäämien enimmäismäärä, ottaen huomioon väärien positiivisten tai negatiivisten tulosten hyväksyttävä todennäköisyys. 1.1.15.2 Negatiiviset tulokset Määritysmenetelmän mukaan määritystulosta pidetään negatiivisena, jos yleiset perusteet ja käytettävän määritysmenetelmän erityisperusteet täyttyvät soveltuvien vertailuaineiden ja nollakoemäärityksen suhteen ja a) aineilla, joiden sallittu poikkeama on nolla, jos tutkittavaa ainetta ei ole tunnistettu yksiselitteisesti, tai b) aineilla, joiden jäämien enimmäismäärä on vahvistettu, jos näytteen sisältämän tutkittavan aineen määrä on pienempi kuin edellä 1.11.15.1 kohdassa annettu määrä. Huomautus: Edellisen a tapauksen negatiivinen tulos ei osoita, että näyte ei sisällä tutkittavaa ainetta, ja b tapauksen negatiivinen tulos ei osoita, että tutkittavan aineen todellinen pitoisuus on pienempi kuin vahvistettu jäämien enimmäismäärä. 1.1.16 Kromatografia Tämän menetelmän mukaan puhdistettu näyteliuos jaetaan kahteen osaan ennen kromatografointia: a) toinen osanäyte kromatografoidaan sellaisenaan, ja b) tunnistettava standardiaine lisätään toiseen osanäytteeseen, jonka jälkeen tämä tutkittavan standardiaineen ja näyteliuoksen seos kromatografoidaan. Lisätyn standardiaineen määrän on oltava yhtä suuri kuin näyteliuoksen sisältämän tutkittavan aineen arvioitu määrä. 1.1.17 Immunogrammi Tässä päätöksessä "immunogrammilla" tarkoitetaan sellaisen immunokemiallisen vasteen graafista esitystä suhteessa retentioaikaan tai eluutiotilavuuteen, joka saadaan kromatografisella erotuksella näyteuutteen aineiden immunokemiallisen määrityksen kanssa (yleensä erikseen). 1.2 Yleiset vaatimukset 1.2.1 Perusteet Direktiivin 85/591/ETY liitteen mukaisesti jäljempänä annettavia perusteita on sovellettava määritysmenetelmien tarkasteluun. 1.2.2 Seulontamenetelmät Seulontamenetelmien vaatimuksia ei voi vahvistaa. Niiden pääasiallisin vaatimus on se, että väärien negatiivisten tulosten esiintymisen on oltava mahdollisimman vähäinen. 1.2.2.1 Spesifisyys on määriteltävä. 1.2.2.2 Tarkkuus ja toistotarkkuus Paljousmääritys ei ole aina tarpeen. Riippuen siitä, onko aineen käyttö kiellettyä vai sallittua, seulontamenetelmä voi olla kvalitatiivinen tai kvantitatiivinen. Väärät positiiviset tulokset voidaan hyväksyä, mutta väärien negatiivisten tulosten on oltava mahdollisimman vähäisiä kyseisellä tasolla. 1.2.2.3 Toteamisraja Toteamisraja riippuu tarkoituksesta. Aineilla, joilla on vahvistettu jäämien enimmäismäärä, sen on oltava riittävän alhainen, jotta jäämät voidaan todeta tällä tasolla. Teuraseläimissä kiellettyjen aineiden toteamisrajan on oltava mahdollisimman alhainen. 1.2.2.4 Käyttökelpoisuus On toivottavaa, että menetelmällä on mahdollista määrittää paljon näytteitä alhaisin kustannuksin. 1.2.3 Varmistusmenetelmät 1.2.3.1 Spesifisyys Varmistusmenetelmien olisi annettava mahdollisimman yksiselitteistä tietoa tutkittavan aineen kemiallisesta rakenteesta. Jos monet aineet antavat saman vasteen, menetelmällä ei voi erottaa eri aineita. Yleisesti pelkästään kromatografiaan perustuvat menetelmät, joissa ei käytetä molekyylispektrometriaa, eivät sovellu varmistusmenetelmiksi. Jos yhdellä menetelmällä ei ole riittävää spesifisyyttä, vaadittu spesifisyys voidaan saavuttaa menetelmällä, joka käsittää puhdistuksen, kromatografisen erotuksen ja spektrometrisen tai immunokemiallisen määrityksen soveltuvan yhdistelmän, esimerkiksi GC PMS, LC PMS, IAC/GC PMS, GC PIR, LC/IR, LC/IMG. 1.2.3.2 Tarkkuus Vertailuaineen toistomääritysten osalta kokeellisesti määritetyn keskiarvon poikkeama todellisesta arvosta (mahdollisesti tarvittavien saantoa koskevien korjausten tekemisen jälkeen) on oltava seuraavien rajojen sisällä: >TAULUKON PAIKKA> 1.2.3.3 Toistotarkkuus Toistettavuus vaatimusten mukaisessa vertailuaineen toistomäärityksessä laboratorioiden välinen keskiarvon variaatiokerroin (CV), joka lasketaan Horwitzin yhtälöllä [(CV(%) = 2(1 P0,5l°gC), jossa C on pitoisuus ilmoitettuna 10 potenssina], on >TAULUKON PAIKKA> Toistettavuuden vaatimusten mukaisesti tehdyissä määrityksissä saadun laboratorioiden välisen CV:n on yleensä oltava 1/2 P 2/3 välillä edellä annetuista arvoista. 1.2.3.4 Toteamisraja Riippuu tarkoituksesta (katso 1.2.6.1). 1.2.3.5 Toimenpideraja Riippuu tarkoituksesta (katso 1.2.6.2). 1.2.3.6 Herkkyys Riippuu tarkoituksesta. 1.2.3.7 Käyttökelpoisuus Nopeus ja kulut eivät ole niin tärkeitä kuin seulontamenetelmien kohdalla. Suurin osa varmistusmenetelmien käyttökelpoisuusseikoista ovat vähemmän tärkeitä tässä päätöksessä määriteltyihin perusteisiin verrattuna. Yleensä on riittävää, että tarvittavat reagenssit ja laitteet ovat käytettävissä. 1.2.4 Kalibrointikäyrät Jos käytettävä menetelmä riippuu kalibrointikäyrästä, on ilmoitettava seuraavat tiedot: P kalibrointikäyrän matemaattinen kaava, P sallitut vaihteluvälit, joiden puitteissa kalibrointikäyrän muuttujat saavat vaihdella mittauksesta toiseen, P kalibrointikäyrän toiminta-alue. Soveltuvia sisäisiä standardeja ja vertailuaineita olisi käytettävä mahdollisuuksien mukaan varmistusmenetelmien kalibrointikäyrien tarkastamiseksi ja olisi annettava tiedot muuttujien vaihteluista, jotka ovat hyväksyttäviä ainakin kalibrointikäyrän toiminta-alueella. 1.2.5 Häiriöalttius 1.2.5.1 Tekijät, jotka käytännössä voivat vaihdella koeolosuhteissa (esimerkiksi reagenssien pysyvyys, näytteen koostumus, pH, lämpötila) sekä kaikki niiden poikkeamat, jotka voivat vaikuttaa määritystuloksiin, on ilmoitettava. Menetelmän kuvauksessa annetaan keinot häiriöiden poistamiseksi. Tarvittaessa kuvataan varmistukseen soveltuvat havainnointiperiaatteet. 1.2.5.2 Kromatografiassa olisi saatava vain yksi piikki, jolloin piikin vahvistettu korkeus (tai alue) vastaa lisätyn tutkittavan aineen määrää. Käytettäessä GC:ta tai LC:ta piikin puolikorkeuden leveyden olisi oltava välillä 90 P110 % alkuleveydestä ja retentioajat saisivat poiketa toisistaan korkeintaan 5 %:lla. TLC-menetelmissä tutkittavan aineen täplää olisi pelkästään vahvistettava. Uutta täplää ei saisi syntyä ja sen ulkomuoto ei saisi muuttua. 1.2.5.3 On ensiarvoisen tärkeää selvittää kaikki häiriöt, jotka voivat aiheutua matriisin aineosista. 1.2.6 Jäämien enimmäistason ja määritysrajojen keskinäinen suhde 1.2.6.1 Aineilla, joiden antaminen teuraseläimille on kielletty, määritysmenetelmän toteamisrajan on oltava riittävän alhainen, jotta mahdollisen laittoman käytön jälkeen löydettävät jäämätasot voidaan määrittää vähintään 95 % todennäköisyydellä. 1.2.6.2 Aineilla, joiden jäämien enimmäismäärä on vahvistettu, menetelmän toimenpideraja, johon on lisätty kolmella kerrottu menetelmän näytteelle jäämien enimmäistasolla antama standardipoikkeama, ei saa olla suurempi kuin tämä taso. 1.2.6.3 Aineiden, joiden enimmäismäärä on vahvistettu, menetelmä on validoitava tällä tasolla ja tämän tason puolikkaalla ja kaksinkertaisella tasolla. 2 JÄÄMIEN TUNNISTUKSEN JA MÄÄRITYKSEN PERUSTEET 2.1 Yleiset vaatimukset Pienimoolimassaisten orgaanisten yhdisteiden jäämien esiintymisen lopulliseksi vahvistamiseksi tehtäviä määrityksiä suorittavien laboratorioiden on huolehdittava siitä, että tulosten tulkintaperusteet täyttyvät tämän osan vaatimusten mukaisesti. Nämä perusteet on laadittu tutkittavan aineen tunnistamista varten ja niillä on estettävä väärät positiiviset tulokset. Lopullisen johtopäätöksen tekemiseksi on tarpeen noudattaa kyseisen määritysmenetelmän perusteita. 2.2 Määritysmenetelmiä koskevat yleiset näkökohdat 2.2.1 Näytteen valmistus Näyte on otettava ja sitä on käsiteltävä siten, että mahdollisesti esiintyvän tutkittavan aineen havaitsemismahdollisuudet ovat mahdollisimman suuret. 2.2.2 Häiriöalttius On annettava 1.2.5 kohdassa (häiriöalttius) eritellyt tiedot. 2.2.3 Menetelmän yleisperusteet 2.2.3.1 Näytteen sisältämään tutkittavaan aineeseen sovellettavan menetelmän spesifisyyden (1.1.7) sekä toteamisrajan (1.1.10) ja toimenpiderajan (1.1.11) on oltava tunnettuja. Huomautus: Nämä tiedot voidaan saada koetuloksista ja/tai teoreettisen tarkastelun perusteella. 2.2.3.2 Positiivisen tuloksen osalta määrityksen aikana tutkittavan aineen fysikaalinen ja kemiallinen käyttäytyminen ei saisi erota sopivaan näytteeseen valmistetun vastaavan standardiaineen käyttäytymisestä. 2.2.3.3 Määrityksen positiivinen tai negatiivinen tulos pätee vain menetelmän spesifisyyden sekä toteamis- ja toimenpiderajojen puitteissa tutkittavan aineen ja näytteen osalta. 2.2.3.4 Tunnettuja määriä tutkittavaa ainetta sisältäville vertailuaineille tai vahvistetuille aineille on mielellään tehtävä menetelmän kaikki vaiheet käsittävä määritys samanaikaisesti kunkin tutkittavana olevan osanäytteen kanssa. Määritettäviin näytteisiin voidaan myös lisätä sisäistä standardia. 2.2.4 Erilliseen fysikaaliseen ja/tai kemialliseen esiväkevöintiin, puhdistukseen ja erotukseen sovellettavat perusteet 2.2.4.1 Tutkittavan aineen on oltava siinä jakeessa, joka on ominainen vastaavalle sopivassa näytteessä olevalle standardiaineelle samoissa koeolosuhteissa. 2.2.4.2 Standardiainetta, kontrollinäytteitä ja näyteannoksia vastaavat retentioaikaa koskevat tiedot on annettava yhdessä lopullisen positiivisen tai negatiivisen tuloksen kanssa. 2.2.5 Kvantitatiivisten määritysten perusteet 2.2.5.1 Kaikkien kvantitatiivisten määritysten saanto on mitattava ja määritettävä. 2.2.5.2 Laboratorioiden välisen saannon vaihtelun on oltava mahdollisimman vähäinen. 2.2.5.3 Olisi ilmoitettava selvästi, onko lopullisia tuloksia korjattu vai ei saannon perusteella. Jos niitä on korjattu, käytetty korjausmenetelmä on kuvattava. 2.3 Varmistukseen vain muiden menetelmien yhteydessä käytettäviin määritysmenetelmiin sovellettavat perusteet 2.3.1 Tutkittavan aineen IA-menetelmällä määrittämiseen sovellettavat laatuvaatimukset 2.3.1.1 Kalibrointikäyrän toiminta-alue on määritettävä ja sen on yleensä katettava vähintään yhden dekadin pitoisuusalue. 2.3.1.2 Tarvitaan vähintään kuusi kalibrointipistettä, jotka ovat jakautuneet kalibrointikäyrälle sopivin välein. 2.3.1.3 Sopivien menetelmän laatua mittaavien muuttujien on oltava yhdenmukaiset edellisten määritysten kanssa; esimerkiksi NSB ja kalibrointikäyrän muuttujat. 2.3.1.4 Kontrollinäytteiden on oltava mukana jokaisessa määrityksessä. Pitoisuustasot: O-pitoisuus ja pitoisuudet toiminta-alueen ala-, keski- ja yläosan pitoisuustasolla. Tulosten on oltava yhdenmukaiset edellisten määritysten kanssa. Kaikki alkuperäiset kontrollinäytteitä ja näyteannoksia koskevat tiedot on toimitettava yhdessä lopullisen positiivinen tai negatiivisen tuloksen kanssa. 2.3.2 Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi GC- tai LC-menetelmällä epäspesifistä havainnointia käyttäen 2.3.2.1 Tutkittavan aineen on eluoiduttava vastaavalle standardiaineelle samoissa koeolosuhteissa ominaisessa retentioajassa. 2.3.2.2 Kromatogrammissa lähimmän piikin huipun on oltava erotettavissa tutkittavan aineen piikistä vähintään yhdellä täydellä leveydellä 10 %:ssa enimmäiskorkeudesta. 2.3.2.3 Lisätietojen saamiseksi voidaan käyttää rinnakkaiskromatografiaa ja vähintään kahta kolonnia, joiden polaarisuudet ovat erilaiset. 2.3.3 Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi TLC-menetelmällä 2.3.3.1 Tutkittavan aineen Rf-arvon tai Rf-arvojen on vastattava standardiaineelle tunnusomaista Rf-arvoa tai tunnusomaisia Rf-arvoja. Tämä vaatimus täyttyy, kun tutkittavan aineen Rf-arvon poikkeama tai Rf-arvojen poikkeamat standardiaineen Rf-arvosta tai Rf-arvoista samoissa koeolosuhteissa on tai ovat rajoissa ± 3%. 2.3.3.2 Tutkittavan aineen ulkonäkö ei saa olla erotettavissa standardiaineesta. 2.3.3.3 Tutkittavan aineen täplän keskipisteen ja sitä lähinnä olevan täplän keskipisteen välimatkan on oltava vähintään puolet täplien halkaisijoiden summasta. 2.3.3.4 Lisätietojen saamiseksi voidaan käyttää rinnakkaiskromatografiaa ja/tai kaksiulotteista TLC:tä. 2.4 Varmistukseen käytettäviin määritysmenetelmiin sovellettavat perusteet 2.4.1 Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi LC/IA tai LC/IMG -menetelmällä 2.4.1.1 LC/IMG-menetelmässä tutkittavan aineen huipun IMG:ssä olisi muodostuttava vähintään 5 LC-jakeesta. 2.4.1.2 Edellä 2.2.4.1 ja 2.2.4.2 kohdassa annettuja perusteita on noudatettava. 2.4.1.3 Reagenssit Vasta-aineen ja muiden reagenssien lähde ja ominaisuudet on annettava. 2.4.1.4 Kalibrointikäyrä Koska menetelmä riippuu kalibrointikäyrien käytöstä, on annettava 1.2.4 kohdassa (kalibrointikäyrät) tarkoitetut tiedot. IA:n laatuvaatimukset (2.3.1.1 P2.3.1.4) on täytettävä. 2.4.1.5 Jos menetelmää ei käytetä yhdessä muiden menetelmien kanssa, varmistukseen on käytettävä kahta erillistä LC-erotusta tai eri vasta-aineita käyttäen valmistettua kahta immunogrammia. 2.4.2 Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi LC PSP-menetelmällä 2.4.2.1 Edellä 2.3.2.1 ja 2.3.2.2 kohdassa annettuja perusteita on noudatettava. 2.4.2.2 Tutkittavan aineen spektrissä esiintyvän maksimiabsorptioaallonpituuden on oltava sama kuin standardiaineella havaitsemiseen käytettävän järjestelmän mukaan määräytyvän erotuskyvyn rajoissa. Diodirivimäärityksessä se on tavallisesti ± 2 nm. 2.4.2.3 Yli 220 nm:ssä tutkittavan aineen spektri ei silmämääräisesti tarkasteltuna saa erota standardiaineen spektristä niillä kummankin spektrin alueilla, joissa suhteellinen absorbanssi on yli 10 %. Tämä peruste täyttyy, kun spektrissä esiintyvät samat maksimit ja nämä kaksi spektriä eivät eroa yli 10 % standardiaineen absorbanssista missään tarkastelukohdassa. 2.4.2.4 Jos menetelmää ei käytetä yhdessä muiden menetelmien kanssa, varmistukseen on käytettävä rinnakaiskromatografiaa LC-vaiheessa. Rinnakkaiskromatografiaa koskevat vaatimukset esitetään 1.2.5.2 kohdassa. 2.4.3. Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi TLC PSP-menetelmällä 2.4.3.1 Menetelmän on vastattava TLC:lle (2.3.3.1 P2.3.3.3 kohta) annettuja perusteita. 2.4.3.2 Tutkittavan aineen spektrissä esiintyvän maksimiabsorptioaallonpituuden on oltava sama kuin standardiaineella havaitsemiseen käytettävän järjestelmän mukaan määräytyvän erotuskyvyn rajoissa. 2.4.3.3 Tutkittavan aineen spektri ei silmämääräisesti tarkasteltuna saa erota standardiaineen spektristä. 2.4.3.4 Jos menetelmää ei käytetä yhdessä muiden menetelmien kanssa, varmistukseen on käytettävä rinnakaiskromatografiaa TLC-vaiheessa. Rinnakkaiskromatografiaa koskevat vaatimukset esitetään 1.2.5.2 kohdassa. 2.4.4 Perusteet tutkittavan aineen määrittämiseksi GC PMS-menetelmällä 2.4.4.1 GC-menetelmän perusteet 2.4.4.1.1 Edellä 2.3.2.1 ja 2.3.2.2 kohdassa annettuja perusteita on noudatettava. 2.4.4.1.2 Sisäistä standardia on käytettävä, jos soveltuvaa ainetta on saatavissa. Mieluiten olisi käytettävä tutkittavan aineen muotoa, joka on varustettu pysyvästä isotoopista muodostuvalla leimalla tai, jos sitä ei ole saatavissa, vastaavaa standardia, jonka retentioaika on lähellä tutkittavan aineen retantioaikaa. 2.4.4.1.3 Tutkittavan aineen retentioajan suhde sisäiseen standardiin CG:ssa, toisin sanoen tutkittavan aineen suhteellisen retentioajan, olisi oltava sama kuin standardina käytetyn tutkittavan aineen suhteellisen retentioajan kyseisessä matriisissa ± 0,5%:n rajoissa. 2.4.4.1.4 Jos menetelmää käytetään varmistukseen ja jos sisäistä standardia ei käytetä, tutkittava aineen tunnistus on varmistettava rinnakkaiskromatografialla. 2.4.4.2 LRMS-menetelmän perusteet 2.4.4.2.1 Seulonnassa on määritettävä vähintään eniten esiintyvän diagnostisen ionin intensiteetti. 2.4.4.2.2 Varmistuksessa on suositeltavaa määrittää vähintään neljän diagnostisen ionin intensiteetit. Jos käytetyllä menetelmällä tutkittavasta aineesta ei saada neljää diagnostista ionia, sen tunnistus perustuu ainakin kahden toisistaan riippumattoman GC PLRMS-menetelmän tuloksiin, jotka on saatu käyttäen eri johdannaisia ja/tai ionisointimenetelmiä, joista kukin tuottaa kaksi tai kolme diagnostista ionia. Molekyyli-ionin on mieluiten oltava yksi valitusta diagnostisesta ionista. 2.4.4.2.3 Tutkittavasta aineesta tarkasteltavien kaikkien diagnostisten ionien suhteellisten paljouksien on oltava yhteensopivia standardiaineen aineen kanssa, mieluiten rajoissa ± 10 % (EI) tai ± 20 % (CI). 2.4.5 Perusteet tutkittavan aineen tunnistamiseksi IR-menetelmällä 2.4.5.1 Riittävien piikkien määritelmä Riittävät piikit ovat standardiaineen infrapunaspektrin absorptiomaksimit, jotka täyttävät seuraavat vaatimukset. 2.4.5.1.1 Absorptiomaksimi on aallonpituusalueella 1 800 P500 cm P1. 2.4.5.1.2 Absorptiointensiteetin on oltava vähintään: a) spesifinen molaarinen absorbanssi, joka on 40 suhteessa 0-absorbanssiin, ja 20 suhteessa piikin pohjaviivaan, tai b) suhteellinen absorbanssi, joka on 12,5 % voimakkaimman piikin absorbanssista aallonpituus alueella 1 800 P500 cm P1, kun molemmat määritetään suhteessa 0-absorbanssiin, ja 5 % voimakkaimman piikin absorbanssista aallonpituusalueella 1 800 P500 cm P1, kun molemmat määritetään suhteessa pohjaviivaan. Huomautus: Vaikka a kohdan mukaisesti määritetyt piikit ovat teoriassa suositeltavampia, b kohdan piikit on käytännössä helpompi määrittää. 2.4.5.2 Määritetään tutkittavan aineen infrapunaspektrissä olevien niiden piikkien lukumäärä, joiden frekvenssit vastaavat standardiaineen spektrissä olevaa riittävää piikkiä ± 1 cm P1:n rajoissa. 2.4.5.3 IR-menetelmän perusteet 2.4.5.3.1 Absorptiota on esiinnyttävä tutkittavan aineen spektrin kaikilla alueilla, jotka vastaavat standardiaineen vertailuspektrissä olevaa riittävää piikkiä. 2.4.5.3.2 Standardiaineen infrapunaspektrissä vaaditaan vähintään 6 riittävää piikkiä. Jos riittävien piikkien määrä on alle 6, kyseistä infrapunaspektriä ei saa käyttää vertailuspektrinä. 2.4.5.3.3 "Tuloksen", toisin sanoen tutkittavan aineen infrapunaspektristä havaittujen riittävien piikkien prosentuaalisen osuuden, on oltava vähintään 50. 2.4.5.3.4 Jos riittävän piikin suhteen ei saada täyttä vastaavuutta, tutkittavan aineen spektrin soveltuvan alueen on vastattava yhteensopivaa piikkiä. 2.4.5.3.5 Menetelmää voidaan soveltaa vain absorptiopiikkeihin näytteen spektrissä, jossa intensiteetti on vähintään kolme kertaa kahden piikin välinen taustahäiriö. 2.5 Muut määritysmenetelmät Muita kuin 2.3 ja 2.4 kohdassa annettuja määritysmenetelmiä tai menetelmäyhdistelmiä (esimerkiksi LC PMS, MS PMS, GC PIR) voidaan käyttää seulontaan ja varmistukseen, jos ne täyttävät vastaavat perusteet, joilla tutkittava aine voidaan tunnistaa yksiselitteisesti kyseisellä tasolla. LIITE Lyhenteet ja symbolit CI = kemiallinen ionisointi EI = electron impact -ionisointi g = gramma GC = kaasukromatografia IA = immunomääritys IAC = immunoaffiniteettikromatografia IMG = immunogrammi IR = infrapuna spektrometria kg = kilogramma (103 g) l = litra LC = nestekromatografia LRMS = alhaisen erotuskyvyn massaspektrometria mg = milligramma (10 P3 g) MS = massaspektrometria ng = nanogramma (10 P9 g) NSB = epäspesifinen sitoutuminen Rf = liikkuvuus suhteessa liuotinrintamaan SP = spektrometria, esimerkiksi diodirivi TLC = ohutkerroskromatografia ìg = mikrogramma (10 P6 g) / = off-line systeemi (erillinen) P = on-line liitäntä (suoraan liitetty) esimerkiksi LC/GC PMS = LC erillisenä, jota seuraa GC, johon on suoraan liitetty MS