Komission direktiivi 88/302/ETY, annettu 18 päivänä marraskuuta 1987, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen yhdeksännen kerran



Virallinen lehti nro L 133 , 30/05/1988 s. 0001 - 0127

Suomenk. erityispainos Alue 15 Nide 14 s. 0003

Ruotsink. erityispainos Alue 15 Nide 14 s. 0003



KOMISSION DIREKTIIVI, annettu 18 päivänä marraskuuta 1987, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen yhdeksännen kerran (87/302/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 27 päivänä kesäkuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY(1), sellaisena kuin se on muutettuna kuudennen kerran direktiivillä 79/831/ETY(2), ja erityisesti sen 19 artiklan, sekä katsoo, että direktiivin 67/548/ETY 3 artiklan 1 kohdassa säädetään, että aineiden ja valmisteiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja ympäristömyrkyllisyys on määritettävä liitteessä V vahvistetuin menetelmin, direktiivin 67/548/ETY 3 artiklan 2 kohdassa säädetään, että aineen tai valmisteen aiheuttama todellinen tai mahdollinen ympäristölle aiheutuva vaara on määritettävä liitteessä VII ja VIII esitettyjen ominaisuuksien perusteella, liite V, sellaisena kuin se on muutettuna komission direktiivillä 84/449/ETY(3), sisältää tällä hetkellä ainoastaan liitteessä VII esitettyjen ominaisuuksien testausmenetelmät ja on tarpeen asettaa käytettäväksi myös liitteessä VIII esitettyjen ominaisuuksien testausmenetelmät, ja tämän direktiivin säännökset ovat vaarallisten aineiden ja valmisteiden kaupan teknisten esteiden poistamiseksi annettujen direktiivien mukauttamista tekniikan kehitykseen käsittelevän komitean lausunnon mukaisia, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Lisätään tämän direktiivin liitteen teksti direktiivin 67/548/ETY liitteeseen V. 2 artikla Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava ennen 31 päivää joulukuuta 1988 tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät säännökset ja ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. Niiden on saatettava nämä säännökset voimaan 30 päivästä kesäkuuta 1989 alkaen. 3 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 18 marraskuuta 1987. Komission puolesta Stanley CLINTON DAVIS Komission jäsen (1) EYVL N:o 196, 16.8.1967, s. 1/67 (2) EYVL N:o L 259, 15.10.1979, s. 10 (3) EYVL N:o L 251, 19.9.1984, s. 1 LIITE Tässä selostetut testausmenetelmät on tarkoitettu tiettyjen myrkyllisyyttä ja ympäristömyrkyllisyyttä koskevien neuvoston direktiivin 79/831/ETY liitteessä VIII lueteltujen ominaisuuksien määrityksiin. Liitteessä VIII oleville 1 ja 2 tasolle soveltuvat testausmenetelmät on selostettu, mutta testejä ei ole jaoteltu edelleen eri tasojen mukaan. SISÄLLYSLUETTELO OSA B: Myrkyllisyyden määritysmenetelmät 6 Yleisjohdanto, osa B 6 Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystutkimus, toistuva annostelu suun kautta, 90 vrk., jyrsijät 10 Subkrooninen oraalinen myrkyllisyystutkimus, toistuva annostelu suun kautta, 90 vrk., muut kuin jyrsijät 14 Subkrooninen myrkyllisyystutkimus (ihon kautta), toistuva annostelu ihon kautta, 90 vrk., jyrsijät 18 Subkrooninen myrkyllisyystutkimus (hengitysteiden kautta), toistuva annostelu hengitysteiden kautta, 90 vrk., jyrsijät 22 Teratogeenisuustutkimus, jyrsijät ja muut kuin jyrsijät 26 Krooninen myrkyllisyystesti 29 Karsinogeenisuustesti 34 Yhdistetty krooninen myrkyllisyys/karsinogeenisuustesti 39 Myrkkyjen vaikutus lisääntymiskykyyn (yhden sukupolven testi) 45 Myrkkyjen vaikutus lisääntymiskykyyn (kahden sukupolven testi) 49 Myrkkykinetiikka 53 Mutageenisuustestaus ja karsinogeenisten aineiden seulonta 57 - Geenimutaatiot - Saccharomyces cerevisiae 57 - Mitoottinen rekombinaatio - Saccharomyces cerevisiae 60 - Nisäkässoluviljelmällä suoritettava geenimutaatiotesti 63 - DNA-vaurio ja sen korjaantuminen - UDS-testi nisäkässoluviljelmällä 66 - Sisarkromatidivaihdostesti 70 - Resessiivi letaali -testi banaanikärpäsellä (Drosophila melanogaster) 73 - Solutransformaatiotestit nisäkässoluviljelmillä 75 - Dominoiva letaalitesti jyrsijöillä 78 - Nisäkkäiden sukusolujen sytogenetiikka in vivo 81 - Hiiren spot-testi 84 - Hiiren periytyvä translokaatio 87 OSA C: Ympäristömyrkyllisyyden määritysmenetelmät 90 Yleisjohdanto, osa C 90 Levän inhibitiotesti 91 Myrkyllisyystutkimus madoilla, keinomaatesti 97 Biologinen hajoaminen - Zahn-Wellens-testi 101 Biologinen hajoaminen - aktiivilietteen simulointitestit 108 Biologinen hajoaminen - aktiivilietteen soluhengityksen inhibitiotesti 120 Biologinen hajoaminen - modifioitu SCAS-testi 125 OSA B: MYRKYLLISYYDEN MÄÄRITYSMENETELMÄT YLEISJOHDANTO: OSA B PITKÄAIKAISTUTKIMUKSET Subkrooniset, krooniset ja karsinogeenisuustutkimukset Testattavan aineen ja käsittelyseoksen kuvaus Testattavan aineen koostumuksen, merkittävien epäpuhtauksien sekä olennaisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, kuten stabiilisuuden, on oltava tiedossa ennen myrkyllisyystutkimusten aloittamista. Testattavan aineen fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista saadaan tärkeitä tietoja, joiden perusteella valitaan antotapa ja suunnitellaan subkroonisten, kroonisten ja karsinogeenisuustutkimusten kulku sekä testattavan aineen käsittely- ja varastointitapa. Kemiallista rakennetta ja fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia koskevat tiedot voivat myös antaa viitteitä valitun antotavan imeytymisominaisuuksista sekä aineenvaihduntaan ja kudoksiin kohdistuvista vaikutuksista. Aikaisemmista myrkyllisyyttä ja sen kinetiikkaa koskevista tutkimuksista voidaan myös saada myrkkykineettisiä parametrejä koskevia tietoja. Analyysimenetelmän annosteluaineessa ja biologisessa materiaalissa olevan testattavan aineen kvalitatiivista ja kvantitatiivista määritystä varten (mukaan lukien merkittävät epäpuhtaudet, kun mahdollista) on oltava valmiina ennen tutkimuksen aloittamista. Koe-eläimet: lajin ja kannan valinta Koska on tarpeen käsitellä eläimiä suurimman osan niiden elinajasta, tutkimukset tehdään yleensä helposti saatavissa olevilla ja suhteellisen lyhytikäisillä koe-eläinlajeilla. On erittäin tärkeää, että käytetyllä koe-eläinkannalla vertailukelpoisissa olosuhteissa ilmenneet spontaanit sairaudet ja kasvaimet ovat tiedossa. Kantojen on oltava tarkoin määriteltyjä, eikä niissä saa esiintyä häiritseviä synnynnäisiä vikoja. F1-hybridi-sisäsiitoskannoilla on tässä suhteessa etuja, mutta mikäli ulkosiitoskannoista on saatavilla tarpeelliset taustatiedot ja eläimet ovat peräisin suljetusta yhdyskunnasta, niitä voidaan käyttää. Eläinten hoito, ruoka- ja vesihuolto Eläinkokeet ja -tutkimukset on suoritettava kansallisten määräysten mukaisesti ottaen huomioon humaanit periaatteet ja eläinten hyvinvointia koskeva kansainvälinen kehitys. Ympäristöolosuhteiden ja eläinten hoitotapojen tarkka valvonta on luotettavien tutkimustulosten ehdoton edellytys. Asuinoloilla, väliintulevalla sairaudella, lääkehoidolla, ruokavalion, ilman, veden ja kuivikkeiden epäpuhtauksilla sekä yleisillä eläintenhoito-olosuhteilla voi olla huomattava vaikutus pitkäaikaistutkimusten tuloksiin. Kemiallisten sterilointiaineiden vaikutus tutkimukseen on oltava selvillä. Ruokavalion on täytettävä kaikki testattavan lajin ravintovaatimukset, eikä siinä saa olla tutkimuksen tulokseen vaikuttavia epäpuhtauksia. Jyrsijöille on oltava ruokaa ja vettä jatkuvasti saatavilla ja ruoka on uusittava vähintään kerran viikossa. Tällä hetkellä käytetään kolmea ruokavaliota: tavanomaista, synteettistä ja erilaisia vapaavalintaisia seoksia. Käytettiinpä mitä ruokavaliota tahansa, rehun toimittajan on määräajoin tarkistettava perusruokavalion ravintoarvo ja epäpuhtausaste ja toimittettava nämä tiedot laboratorioon kunkin rehuerän yhteydessä. On hyvin toivottavaa, että ruokavalion vaikutus aineenvaihduntaan sekä kasvainten kehittymiseen ja eläimen elinikään on tiedossa. Tämän lisäksi koelaboratorio voi analysoida perusravinnon aineosia ja tahattomia epäpuhtauksia, kuten karsinogeenejä. Mikäli analyysejä tehdään, niiden tulokset säilytetään ja liitetään kustakin testattavasta aineesta tehtävään tutkimusselostukseen. Yleisiä ravinnon aineosia, joiden tiedetään vaikuttavan syövän syntyyn (esim. antioksidantit, tyydyttymättömät rasvahapot, seleeni) ei saa esiintyä häiritsevän suurina pitoisuuksina. Koska useat ravintoaineiden epäpuhtaudet voivat vaikuttaa karsinogeenisuusmäärityksiin, erityistä huomiota on kiinnitettävä ravinnossa oleviin hyönteismyrkkyjäämiin, orgaanisiin klooriyhdisteisiin, polysyklisiin aromaattisiin hiilivetyihin, estrogeeneihin, raskasmetalleihin, nitrosamiineihin ja mykotoksiineihin. Stabilisuustestit ovat välttämättömiä, kun testattava aine annetaan veden tai ruoan mukana. Ennen toistuvilla annoksilla tehtäviä testejä määritetään huolellisesti suoritettujen stabiilisuus- ja homogeenisuuskokeiden avulla, kuinka usein on tarpeen antaa ravintoseosta ja suorittaa valvontaa. Kun ravinto on steriloitua, steriloinnin vaikutus testattavaan aineeseen ja ravinnon aineosiin on oltava tiedossa. Tarvittavat säätötoimenpiteet on suoritettava. Karsinogeenisuustestien suorittajien on tiedettävä käytetyssä vedessä mahdollisesti olevat epäpuhtaudet. Ihmisten käyttöön tarkoitettu vesi on yleensä sopivaa ja sen koostumuksesta on tavallisesti tietoja saatavilla. Ruokavaliossa olevan testattavan aineen pitoisuutta voidaan joutua säätämään eläinten kasvaessa, jotta testiainetta joutuu elimistöön suhteellisen vakiona pysyvä määrä suhteessa eläimen painoon. Kontrolli- ja koe-eläinten ruokavalion ravintoarvojen tulisi olla mahdollisimman yhdenmukaisia. Sen vuoksi ruokavalioon lisätyn testattavan aineen ravintoarvo on otettava huomioon. Tähänastisten kokemusten mukaan alle 5 % testattavaa ainetta, joka ei sisällä ravintoaineita, lisättynä ruokavalioon ei merkittävästi vaikuta ruokavalion ravintoarvoon. 1 Inhalaatiotutkimus Raja-annostestiä ei ole määritelty, koska ei ole mahdollista määrittää yksittäistä sisäänhengityksen altistusrjaa. 2 Teratogeenisuustutkimus Tässä testimenetelmässä tutkittava aine annetaan yleensä suun kautta. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muitakin antotapoja riippuen tutkittavan aineen ominaisuuksien tai ihmisten yleisen altistustavan mukaan. Tällaisissa tapauksissa testausmenetelmään tehdään tarvittavat muutokset ottaen huomioon 28 päivän testausmenetelmissä tarvittavat soveltuvat osatekijät. 3 Myrkkykinetiikka Myrkkykineettiset tutkimukset ovat avuksi myrkyllisyystulosten tulkinnassa ja arvioinnissa. Näiden tutkimusten tarkoituksena on selvittää tutkittavan kemikaalin tiettyjä myrkyllisiä ominaisuuksia ja niiden tuloksista saattaa olla hyötyä jatkotutkimusten suunnittelussa. Tarkoituksena ei ole, että kaikki parametrit on aina määritettävä. Vain harvoissa tapauksissa on tarpeen tehdä koko toksikokineettinen koesarja (imeytyminen, eritys, jakaantuminen ja aineenvaihdunta). Tiettyjä yhdisteitä tutkittaessa saattaa olla eduksi muuttaa koesarjan järjestystä tai yhden annoksen tutkimus voi olla riittävä. Määritelmät >TAULUKON PAIKKA> 4 Akuutti ja subakuutti tutkimus toisella lajilla Toisella lajilla tehdyn tutkimuksen tarkoituksena on täydentää ensimmäisestä tutkimuksesta tehtyjä johtopäätöksiä. Toisella lajilla tehty tutkimus voidaan suorittaa jo kuvatulla testimenetelmällä tai sitä voidaan soveltaa pienempään eläinmäärään. 5 Hedelmällisyystutkimukset Kun kolmen sukupolven lisääntymistestin suorittaminen on tarpeen, selostettua kahden sukupolven lisääntymistestiä voidaan jatkaa kolmanteen sukupolveen. 6 Mutageenisuustutkimukset Mutageenisuuden lisätestit sekä karsinogeenisuuden seulontatestit Direktiiviin liitteessä VIII mainitaan mutageenisuuden jatkotutkimuksia tai karsinogeenisuuden esiseulontaa koskevia lisätutkimuksia. Tässä osassa selostettuja tutkimuksia voidaan yleensä käyttää kummallakin osa-alueella. Johdanto Aineen mutageenisuuden alustava määritys koostuu bakteerien geeni(piste)mutaatiota ja nisäkkäiden solujen sytogeneettisiä vaurioita (in vitro tai in vivo) koskevista tutkimuksista. Näihin "perussarjan" tutkimuksiin soveltuvia menetelmiä on selostettu edellä. Tässä osassa käsitellään lisätutkimuksia, jotka soveltuvat perussarjalla saatujen tulosten varmentamiseen ja/tai valaisemiseen, ja joita voidaan käyttää lukuisiin tarkoituksiin: 1 varmentamaan perussarjalla saatuja tuloksia; 2 tutkimaan tulostapahtumaa, jota perussarjalla ei tutkita; 3 aloittamaan tai laajentamaan in vivo -tutkimuksia. Tästä syystä selostettu testivalikoima sisältää eukaryoottisysteemit in vitro ja in vivo sekä laajan sarjan biologisia tulostapahtumia. Nämä testit antavat tietoja geenimutaatioista organismeissa, jotka ovat kehittyneempiä kuin perussarjassa käytetyt bakteerit, ja lisätietoja aineen kromosomipoikkeamia aiheuttavista ominaisuuksista. Muita tulostapahtumia kuin geeni(piste)mutaatioita ja kromosomipoikkeamia kartoittavia testejä selostetaan niinikään. Niistä saadaan lisätietoja ja ne voidaan tarpeen mukaan sisällyttää tutkimussuunnitelmiin. Yleisperiaatteena on, että mutageenisuustutkimusten jatko-ohjelmaa harkittaessa se on suunniteltava niin, että sen avulla saadaan olennaista lisätietoa tutkittavan aineen mutageenisuudesta ja/tai karsinogeenisuudesta. Sopivien tutkimusten valinta riippuu useista tekijöistä, kuten aineen kemiallisista ja fysikaalisista ominaisuuksista, sytogeneettisten ja bakteeritutkimusten tuloksista, aineen-vaihduntaprofiilista, muiden myrkyllisyystutkimusten tuloksista sekä aineen tunnetuista käyttötavoista. Testien jäykkä valintamenetelmä ei tule kysymykseen, koska on otettava huomioon lukuisia seikkoja. Joitakin yleisiä periaatteita voidaan kuitenkin käyttää ohjenuorana. Jos perussarjan testi oli positiivinen, lisätutkimusten on sisällettävä vähintään yksi testi, jolla määritetään sama geneettinen tulostapahtuma. Jos perussarjan molemmat testit olivat negatiivisia, lisätutkimuksena on yleensä tehtävä geenimutaatiotesti ja kromosomipoikkeavuustesti. Lisätietoja voidaan myös hankkia osoitustesteillä (luettelo jäljempänä). Tällaiset tutkimusmenetelmät on ryhmitelty jäljempänä niiden pääasiallisen geneettisen tulostapahtuman mukaisesti. Geeni(piste)mutaatiotutkimukset Aineen geenimutaatioita aiheuttavien ominaisuuksien jatkotutkimuksiin voi jokin seuraavista testeistä olla sopiva: a) Suora- tai takaisinmuutatiotutkimukset eukaryoottisilla mikro-organismeilla (Saccharomyces cerevisiae). b) Nisäkkäiden solumuutoksia käsittävät in vitro -tutkimukset. c) Drosophila melanogaster illa tehty sukupuoleen liittyvä resessiivinen letaalitesti. d) Somaattinen solumutaatiotutkimus in vivo: hiiren spot-testi. Kromosomipoikkeavuuden tutkimukset Aineen kromosomipoikkevuuksia aiheuttavien ominaisuuksien jatkotutkimuksiin voi jokin seuraavista testeistä olla sopiva: a) nisäkkäiden sytogeneettiset tutkimukset in vivo, Luuydinsolujen metafaasianalyysin tekoa olisi harkittava, ellei se sisälly alustaviin tutkimuksiin ("perussarjaan"). Lisäksi voidaan tutkia siittiösolun sytogeneettisyyttä in vivo, b) nisäkässolujen sytogeneettiset tutkimukset in vitro, elleivät ne sisälly alustaviin tutkimuksiin, c) Dominoiva letaalitesti jyrsijöillä, d) Hiiren periytyvä translokaatiotesti. Osoitustestit DNA:han kohdistuvista vaikutuksista Tietyillä menetelmillä saadaan viitteitä DNA:han kohdistuvista vaikutuksista, vaikkei niillä varsinaisesti tutkita mutageenisuustapahtumaa. Näillä tutkimuksilla voidaan saada mutageenisuustestin tuloksia täydentäviä ja tulkintaa helpottavia tietoja. Kun tällaisia tutkimuksia tarvitaan, jokin alla esitetyistä eukaryoottisia mikro-organismeja tai nisäkässoluja käyttävistä menetelmistä voi olla sopiva: a) Mitoottinen rekombinaatio Saccharomyces cerevisiaella, b) DNA-vaurio ja sen korjaantuminen - UDS-testi nisäkässoluviljelmillä, c) Sisarkromatidivaihdos nisäkässoluviljelmillä. Muut karsinogeenisuutta mittaavat viitetestit Tietyillä nisäkkäiden solumuutoksia tutkivilla tutkimuksilla voidaan määrittää aineen soluviljelmään aiheuttamia morfologisia ja käyttäytymistä koskevia muutoksia, joilla arvellaan olevan yhteyttä pahanlaatuisiin muutoksiin in vivo. Tutkimuksissa voidaan käyttää useita solutyyppejä ja muutosten arviointiperusteita. Perimän vaikutusten vaarallisuuden arviointi nisäkkäillä On olemassa menetelmiä, joiden avulla määritetään geeni(piste)mutaatioiden aiheuttamaa perinnöllisyysvaikutusta nisäkkäillä (hiiren spesifisen lokuksen -testi(1)) tai kromosomipoikkeavuuksille (hiiren periytyvä translokaatiotesti). Näitä menetelmiä voidaan käyttää arvioitaessa aineen mahdollista geneettistä vaara ihmiselle. Koska nämä testit ovat varsin monimutkaisia ja niihin, etenkin spesifisen lokuksen -testiin, tarvitaan hyvin suuri määrä eläimiä, näihin tutkimuksiin on oltava painavat syyt. SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS TOISTUVA ANNOSTELU SUUN KAUTTA, 90 VUOROKAUTTA, JYRSIJÄT 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annetaan päivittäin suun kautta asteittain suurenevina annoksina useille koe-eläinryhmille 90 vuorokauden aikana, niin että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Antoaikana eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkkyvaikutusten toteamiseksi. Kokeen aikana kuolleille eläimille ja sen päättymisen jälkeen vielä elossa oleville eläimille suoritetaan ruumiinavaus. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Eläimet siirretään koetiloihin ja kokeen aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen testin alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Testattavia aineita voidaan antaa ruoan mukana, ruokintaletkulla, kapseleina tai juomavedessä. Samaa antotapaa on käytettävä kaikille koe-eläimille koko kokeen ajan. Mikäli liuotinta tai muita lisäaineita käytetään annostelun helpottamiseksi, niiden myrkyttömyyden on oltava tiedossa esimerkiksi aikaisempien tutkimustulosten perusteella. Koeolosuhteet Koe-eläimet Rotta on suositeltavin laji, ellei sen käyttöä ole kontraindikoitu. Koe-eläimiksi valitaan yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä eläimiä ja annostus aloitetaan ennen kuin rotat ovat kuuden viikon ikäisiä, kuitenkin viimeistään kahdeksan viikon iässä. Testin alkaessa eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskiarvosta. Mikäli subkrooninen oraalinen testi on tehty pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, samaa lajia ja kantaa käytetään kummassakin tutkimuksessa. Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään 20 eläintä (10 naarasta ja 10 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä lopettaviksi aiottujen eläinten määrä. Lisäksi voidaan muodostaa 20 eläimen satelliittiryhmä (10 eläintä kumpaakin sukupuolta), jolle annetaan suurin annos 90 vuorokauden aikana ja jota tarkkaillaan 28 päivän ajan kokeen loputtua myrkkyvaikutusten ohimenevyyden, pysyvyyden tai viivästyneen esiintymisen toteamiseksi. Annostasot Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa sekä kontrolliryhmää, jolle ei anneta testattavaa ainetta, mutta jota käsitellään muuten aivan samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos annostelun helpottamiseksi käytetään liuotinta, sitä annostellaan kontrolleille samalla tavoin kuin testiryhmille ja liuottimen määrä on yhtä suuri kuin suurimman annostason saavan testiryhmän liuotinmäärä. Suurimman annoksen tulisi aiheuttaa myrkytysoireita mutta ei lainkaan tai hyvin vähän kuolemantapauksia. Pienimmällä annoksella ei saisi olla myrkkyvaikutusta. Mikäli ihmisten altistumisesta on tietoja, pienimmän testiannoksen on oltava tätä suurempi. Keskimmäisen annostason tulisi aiheuttaa pienimmät havaittavissa olevat myrkytysoireet. Käytettäessä useampia väliannostasoja ne tulee porrastaa niin, että myrkkyvaikutukset lisääntyvät asteittain. Pienimmän ja keskisuuren annoksen saavissa ryhmissä sekä kontrolliryhmässä kuolemantapausten luvun on oltava pieni, jotta tuloksista voidaan tehdä luotettava arviointi. Kun testattavaa ainetta annetaan ruoan mukana, voidaan käyttää pysyvää pitoisuutta ruoassa (ppm tai mg/kg ruokaa) tai pysyvää annostasoa suhteessa eläimen ruumiinpainoon. On mainittava, kumpaa tapaa käytetään. Kun aine annetaan letkuruokintana, annos annetaan samaan aikaan joka päivä. Sitä säädetään määräajoin (viikottain tai kahden viikon välein), jotta annostaso pysyy muuttomattomana suhteessa eläimen painoon. Raja-annostesti Jos 90 päivää kestävän, jäljempänä selostetulla menetelmällä 1 000 mg/kg ruumiinpaino/päivä tai ihmisten altistumiseen perustuvalla suuremmalla annoksella tehdyn tutkimuksen tuloksena ei synny myrkyllisiä vaikutuksia, tutkimusta ei tarvitse jatkaa. Tutkittaessa lievästi myrkyllisiä aineita on syytä varmistua siitä, etteivät ruoan seassa annetut testattavat ainemäärät ja niiden ominaisuudet vaikuta eläimen ravinnon hyväksikäyttöön. Tarkkailuaika Eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja kaikki myrkytysoireet, niiden alkamisaika, voimakkuus ja kesto kirjataan. Kuolinaika ja myrkkyvaikutusten alkamis- ja loppumisaika kirjataan. Testin suorittaminen Eläimille tulisi antaa testattavaa ainetta mieluimmin viikon jokaisena päivänä 90 vuorokauden ajan. Mikäli tutkimukseen kuuluu seurantatarkkailuun tarkoitettu satelliittiryhmä, sitä tarkkaillaan 28 päivän ajan tutkimuksen jälkeen myrkkyvaikutusten ohimenevyyden tai pysyvyyden toteamiseksi. Eläinten tarkkailussa on kiinnitettävä huomiota muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa ja käyttäytymistavassa. Ruoan kulutus mitataan viikottain (ja veden kulutus kun testattava aine annetaan juomavedessä) ja eläimet punnitaan viikottain. Tarkkailua on suoritettava säännöllisesti, jotta koe-eläimiä ei menetettäisi kannibalismin, kudosten autolyysin tai virheellisen sijoituksen vuoksi. Tutkimuksen päätyttyä eloonjääneille eläimille satelliittiryhmää lukuun ottamatta suoritetaan ruumiinavaus. Kuolemaisillaan olevat eläimet poistetaan välittömästi ja niille suoritetaan ruumiinavaus. Seuraava tutkimus tehdään kokeen päätyttyä kaikille testiryhmien ja kontrolliryhmän eläimille: a) Silmätutkimus olisi suoritettava oftalmoskoopilla tai vastaavalla laitteella ennen aineen antamista ja testin päätyttyä mieluimmin kaikille eläimille, mutta vähintään suurimman annoksen saaneille sekä kontrolliryhmälle. Jos silmissä havaitaan muutoksia, kaikki eläimet tutkitaan. b) Veritutkimus, jossa määritetään hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, leukosyyttien määrä ja erittely sekä joitakin hyytymisominaisuuksia kuten hyytymisaika, protrombiiniaika, tromboplastiiniaika tai trombosyytit, tehdään testiajanjakson päätyttyä. c) Veren kliininen biokemiallinen tutkimus tehdään testiajanjakson päätyttyä. Kaikkiin tutkimuksiin soveltuvia määrityskohteita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattien metabolia sekä, maksan ja munuaisten toiminta. Määrityksien valintaperusteena on aineen todettu vaikutusmekanismi. Suositeltavia määrityskohteita ovat: kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, glukoosin paastoarvo (lajille soveltuva paaston pituus), seerumin glutamiinipyruviinitransaminaasi(2), seerumin glutamiinioksaloasetaattitransaminaasi(3), ornitiinidekarboksylaasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi, virtsan typpi, albumiini, veren kreatiniinin kokonaisbilirubiini ja seerumin proteiinit. Myrkyllisyyden arvioinnissa auttavat tarvittaessa lipidi-, hormoni-, happo/emästasapaino-, methemoglobiini- ja kolinesteraasiaktiivisuudenanalyysit. Muitakin kliinisiä biokemiallisia testejä voidaan tehdä tutkittaessa laajemmin todettuja vaikutuksia. d) Virtsa-analyysiä ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu tai todettu myrkyllisyys antaa siihen aihetta. Mikäli taustatiedot ovat riittämättömät, hematologisten ja biokemiallisten parametrien määritystä tulisi harkita ennen annostuksen aloittamista. Ruumiinavaus Kaikille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus, jossa tutkitaan ruumis ulkopuolelta, kaikki aukot, kallo-, rinta- ja vatsaontelo sekä niiden sisältö. Maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset punnitaan märkinä mahdollisimman pian irrottamisen jälkeen, jotta ne eivät pääse kuivumaan. Seuraavat elimet ja kudokset säilytetään sopivassa aineessa mahdollista myöhempää histopatologista tutkimusta varten: kaikki näkyvät vammat, aivot - ytimen/ aivosillan osat mukaanlukien, pikkuaivokuori ja aivokuori, aivolisäke, kilpirauhanen/lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, henkitorvi ja keuhkot, sydän, aortta (sylkirauhaset), maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, (muut sukupuolielimet), (iho), ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke (naaraan rintarauhanen), (reisilihaksistoa), ääreishermo, rintalaa luuytimineen, (silmät), (reisiluu ja nivelen pintaa) (selkärankaa kolmesta kohdasta - kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta) sekä (kyynelrauhaset). Suluissa olevat kudokset tutkitaan vain, mikäli ne tai kohde-elimet osoittavat merkkejä myrkyllisyydestä. Histopatologinen tutkimus a) Suurimman annoksen saaneesta ryhmästä sekä kontrolliryhmästä otetuille elin- ja kudosnäytteille suoritetaan täydellinen histopatologinen tutkimus. b) Kaikki näkyvät vammat tutkitaan. c) Muiden annosryhmien eläinten kohde-elimet tutkitaan. d) Alhaisen ja keskitason annosryhmien eläinten keuhkot tutkitaan infektioiden löytämiseksi, koska niiden perusteella pystytään vaivattomasti arvioimaan eläinten terveydentila. Näiden ryhmien eläinten maksan ja munuaisten histopatologista tutkimusta voidaan myös harkita. Yleensä ei näiden ryhmien eläimille tarvitse suorittaa muita histopatologisia tutkimuksia, mutta elimet, jotka olivat vaurioituneet suurimman annoksen saaneessa ryhmässä, on aina tutkittava myös näiden ryhmien osalta. e) Kun tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, histopatologinen tutkimus suoritetaan niille elimille ja kudoksille, joissa muiden ryhmien eläimillä ilmeni vaurioita. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin erityyppistä vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikki tunnetut tilastointimenetelmät ovat sallittuja. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet, - annostasot (käytetty liuotin) ja pitoisuudet, - myrkkyvaikutukset sukupuolen ja annostason perusteella, - oireeton taso, mikäli mahdollista, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkky- ja muista vaikutuksista, - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - silmälöydökset, - veritestit ja kaikki tulokset, - kliiniset biokemialliset testit ja kaikki tulokset (myös virtsa-analyysitulokset), - ruumiinavauslöydökset, - tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä, - tulosten tilastointitapa, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. SUBKROONINEN ORAALINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS TOISTUVA ANNOSTELU SUUN KAUTTA, 90 VRK, MUUT KUIN JYRSIJÄT 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annetaan päivittäin suun kautta asteittain suurenevina annoksina useille koe-eläinryhmille (muille kuin jyrsijöille) 90 vuorokauden aikana, niin että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Antoaikana eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkytysoireiden toteamiseksi. Kokeen aikana kuolleille eläimille ja sen päättymisen jälkeen vielä elossa oleville eläimille suoritetaan ruumiinavaus. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Eläimet siirretään koetiloihin ja kokeen aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen kokeen alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Testattavaa ainetta voidaan antaa ruoan mukana tai kapseleina, jos se on helpompaa. Muitakin suun kautta annettavia annostelutapoja voidaan käyttää. Samaa antotapaa tulee käyttää kaikille koe-eläimille koko kokeen ajan. Mikäli liuotinta tai muita lisäaineita käytetään annostelun helpottamiseksi, niiden myrkyttömyys täytyy olla tiedossa esimerkiksi aikaisempien tutkimustulosten perusteella. Koeolosuhteet Koe-eläimet Kun koe tehdään jollakin muulla lajilla kuin jyrsijöillä, yleisimmin käytetty eläinlaji on koira, mieluimmin rotukoira. Muitakin eläinlajeja voidaan käyttää. Eläinten on oltava nuoria ja terveitä ja koiria käytettäessä annostus olisi aloitettava 4-6 kuukauden iässä ja viimeistään 9 kuukauden iässä. Mikäli subkrooninen oraalinen testi on tehty pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, samaa lajia/rotua olisi käytettävä kummassakin testissä. Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään kahdeksan eläintä (neljä naarasta ja neljä urosta). Testin päättyessä eläimiä on oltava riittävästi, jotta myrkyllisyydestä voidaan tehdä luotettava arvio. Annostasot Kokeessa käytetään vähintään kolmea annostasoa sekä kontrolliryhmää, jolle ei anneta testattavaa ainetta, mutta jota käsitellään muuten aivan samoin kuin testiryhmän eläimiä. Suurimman annoksen olisi aiheutettava myrkytysoireita, mutta ei kuolemantapauksia. Pienin annos ei saisi aiheuttaa myrkytysoireita. Mikäli ihmisten altistumisesta on tietoja, pienimmän testiannoksen on oltava tätä suurempi. Keskimmäisen annostason olisi aiheutettava pienimmät havaittavissa olevat myrkytysoireet. Käytettäessä useampia väliannosasteita ne on porrastettava niin, että myrkytysoireet lisääntyvät asteittain. Pienimmän ja keskisuuren annoksen saavissa ryhmissä sekä kontrolliryhmässä ei myöskään saisi esiintyä kuolemantapauksia. Lievästi myrkyllisiä aineita testattaessa on varmistauduttava siitä, että testattavan aineen määrä ei vaikuta normaaliin ravinnon hyväksikäyttöön. Kun testattavaa ainetta annetaan ruoan mukana, voidaan käyttää pysyvää pitoisuutta ruoassa (ppm tai mg/kg ruokaa) tai pysyvää annostasoa suhteessa eläimen ruumiinpainoon. On mainittava, kumpaa tapaa käytetään. Kun ainetta annetaan suoraan esimerkiksi kapseleina, annos annetaan samaan aikaan joka päivä ja sitä säädetään tarvittaessa viikottain, jotta annostaso pysyy muuttomattomana suhteessa eläimen painoon. Mikäli subkrooninen oraalinen testi on tehty pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, molemmissa on yleensä käytettävä samaa ruokavaliota. Raja-annostesti Jos 90 vuorokautta kestävän, jäljempänä selostetulla menetelmällä 1 000 mg/kg ruumiinpaino/päivä tai ihmisten altistumiseen perustuvalla suuremmalla annoksella tehdyn tutkimuksen tuloksena ei synny myrkyllisiä vaikutuksia, tutkimusta ei tarvitse jatkaa. Tutkittaessa lievästi myrkyllisiä aineita on syytä varmistua siitä, etteivät ruoan seassa annetut testattavat ainemäärät ja niiden ominaisuudet vaikuta eläimen ravinnon hyväksikäyttöön. Tarkkailuaika Eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja kaikki myrkytysoireet, niiden alkamisaika, voimakkuus ja kesto kirjataan. Kuolinaika ja myrkytysoireiden alkamis- ja loppumisaika kirjataan. Testin suorittaminen Eläimille tulisi antaa testattavaa ainetta mieluimmin viikon jokaisena päivänä 90 vuorokauden aikana. Lähinnä käytännön syistä pidetään kuitenkin hyväksyttävänä antaa testattavaa ainetta viitenä päivänä viikossa, mikäli annos annetaan muulla tavoin kuin ravinnon yhteydessä. Eläinten tarkkailussa tulee kiinnittää huomiota ainakin seuraaviin kohtiin: muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa ja käyttäytymistavassa. Ruoankulutus mitataan viikottain (ja veden kulutus mikäli testattava aine annetaan juomavedessä) ja eläimet punnitaan viikottain. Huolellinen kliininen tutkimus suoritetaan päivittäin ja tarvittaviin toimenpiteisiin ryhdytään, jotta eläimiä ei menettäisi testin aikana. Tutkimuksen päätyttyä kaikille eloonjääneille eläimille suoritetaan ruumiinavaus. Kuolemaisillaan olevat eläimet poistetaan välittömästi ja niille suoritetaan ruumiinavaus. Seuraava tutkimus tehdään testin päätyttyä kaikille testiryhmien ja kontrolliryhmän eläimille: a) Silmätutkimus on suoritettava oftalmoskoopilla tai vastaavalla laitteella ennen aineen antamista ja testin päätyttyä mieluimmin kaikille eläimille, mutta ainakin suurimman annoksen saaneille sekä kontrolliryhmälle. Mikäli silmissä havaitaan muutoksia, kaikki eläimet tutkitaan. b) Veritutkimus, jossa määritetään hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, leukosyyttien määrä ja erittely sekä joitakin hyytymismäärityksiä kuten hyytymisaika, protrombiiniaika, tromboplastiiniaika tai trombosyytit tehdään testin alussa, sen jälkeen joko kuukauden väliajoin tai testin puolivälissä sekä testiajanjakson päätyttyä. c) Veren kliininen biokemiallinen tutkimus on suoritettava testin alussa, sen jälkeen joko kuukauden väliajoin tai testin puolivälissä sekä testiajanjakson päätyttyä. Kaikkiin tutkimuksiin soveltuvia määrityskohteita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattien metabolia sekä, maksan ja munuaisten toiminta. Testien valintaperusteena on aineen todettu vaikutusmekanismi. Suositeltavia määrityskohteita ovat: kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, glukoosin paastoarvo (lajille/rodulle soveltuva paaston pituus), seerumin glutamiinipyruviinitransaminaasi(4), seerumin glutamiinioksaloasetaattitransaminaasi(5), ornitiinidekarboksylaasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi, virtsan typpi, albumiini, veren kreatiniinin kokonaisbilirubiini ja seerumin proteiinit. Myrkyllisyyden arvioinnit auttavat tarvittaessa lipidi-, hormoni-, happo/emästasapaino-, methemoglobiini- ja kolinesteraasiaktiivisuuden analyysit. Muitakin kliinisiä biokemiallisia testejä voidaan tehdä, mikäli todettujen vaikutusten laajempi tutkimus on tarpeen. Muiden kuin jyrsijöiden on paastottava (korkeintaan vuorokausi) ennen verinäytteiden ottamista. d) Virtsan analyysia ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu tai todettu toksisuus antaa siihen aihetta. Ruumiinavaus Kaikille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus, jossa tutkitaan ruumis ulkopuolelta, kaikki aukot, kallo-, rinta- ja vatsaontelo sekä niiden sisältö. Maksa, munuaiset, kilpirauhanen (sekä lisäkilpirauhanen) ja kivekset punnitaan märkinä mahdollisimman pian irrottamisen jälkeen, jotta ne eivät pääse kuivumaan. Seuraavat elimet ja kudokset säilytetään sopivassa aineessa mahdollista myöhempää histopatologista tutkimusta varten: kaikki näkyvät vammat, aivot - ytimen/ aivosillan osat mukaanlukien, pikkuaivokuori ja aivokuori, aivolisäke, kilpirauhanen/lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, (henkitorvi), keuhkot, sydän, aortta, sylkirauhaset, maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, (muut sukupuolielimet), (iho), sappirakko, ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke (naaraan rintarauhanen), (reisilihaksistoa), ääreishermo, (silmät), rintalaa luuytimineen, (reisiluu ja nivelen pintaa) sekä (selkärankaa kolmesta kohdasta - kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta). Suluissa olevat kudokset tutkitaan vain, jos ne tai kohde-elimet osoittavat merkkejä myrkyllisyydestä. Histopatologinen tutkimus Suurimman annoksen saaneesta ryhmästä sekä kontrolliryhmästä otetuille elin- ja kudosnäytteille tehdään täydellinen histopatologinen tutkimus. Muiden ryhmien osalta tutkitaan elimet, jotka suurimman annoksen saaneessa ryhmässä olivat vaurioituneet tai mikäli kliininen tutkimus viittaa tutkimustarpeeseen. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin erityyppistä vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - lajin rotu tai kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet, - annostasot (käytetty liuotin) ja pitoisuudet, - myrkytysoireet sukupuolen ja annostason perusteella, - oireeton taso, mikäli mahdollista, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkky- ja muista vaikutuksista (erityisesti kliiniset löydökset), - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - silmälöydökset, - veritestit ja kaikki tulokset, - kliiniset biokemialliset testit ja kaikki tulokset (myös virtsa-analyysitulokset), - ruumiinavauslöydökset, - tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä, - tulosten tilastointitapa, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. SUBKROONINEN MYRKYLLISYYSTESTI (IHON KAUTTA) TOISTUVA ANNOSTELU IHON KAUTTA, 90 VUOROKAUTTA, JYRSIJÄT 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annostellaan päivittäin 90 vuorokauden ajan useisiin ryhmiin jaettujen koe-eläinten iholle eri pitoisuuksina, yksi pitoisuus kullekin ryhmälle. Tutkimuksen kuluessa eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkkyoireiden toteamiseksi. Kokeen aikana kuolleille eläimille ja sen loputtua elossa oleville eläimille suoritetaan ruumiinavaus. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Eläimet siirretään koetiloihin ja testin aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen testin alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe-ja kontrolliryhmiin. Juuri ennen kokeen alkua eläinten selästä poistetaan karvapeite leikkaamalla. Karvapeite voidaan myös ajella, mutta se tulee tehdä noin vuorokautta ennen testin alkua. Karvanpoisto on yleensä toistettava noin viikon välein. Karvapeitettä poistettaessa on varottava vahingoittamasta ihoa. Vähintään 10 % ruumiin pinnasta on oltava ajeltuna, jotta siihen voidaan annostellaan testattavaa ainetta. Koealueen suuruus ja peitesiteen mitat riippuvat eläimen painosta. Kun testataan kiinteitä aineita, jotka voidaan tarvittaessa jauhaa, aine kostutetaan vedellä tai sopivalla liuottimella, jotta ihoon saadaan hyvä kosketus. Testattavia nesteitä ei yleensä laimenneta. Päivittäinen altistus tehdään 5-7 kertaa viikossa. Koeolosuhteet Koe-eläimet Voidaan käyttää täysikasvuisia rottia, kaneja tai marsuja. Muitakin lajeja voidaan käyttää, mutta niiden käyttö on perusteltava. Tutkimuksen alkaessa koe-eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskiarvosta. Mikäli pitkäaikaistutkimuksen esitestinä on tehty subkrooninen ihon kautta tapahtuva altistustesti, kummassakin kokeessa on käytettävä samaa lajia ja kantaa. Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään 20 terveihoista eläintä (10 naarasta ja 10 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä lopettaviksi aiottujen eläinten määrä. Lisäksi voidaan muodostaa 20 eläimen satelliittiryhmä (10 eläintä kumpaakin sukupuolta), jolle annetaan suurin annos 90 vuorokauden aikana ja jota tarkkaillaan 28 päivän ajan kokeen loputtua myrkytysoireiden ohimenevyyden, pysyvyyden tai viivästyneen esiintymisen toteamiseksi. Annostasot Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää tai liuotinkontrolliryhmää, jos liuotinta käytetään. Päivittäinen altistusaika on vähintään kuusi tuntia. Eläimet altistetaan testattavalle aineelle samaan aikaan joka päivä ja annosta säädetään määräajoin (viikottain tai joka toinen viikko), jotta annostaso pysyy muuttumattomana suhteessa eläimen painoon. Kontrolliryhmän eläimille ei anneta testattavaa ainetta, mutta muuten niitä käsitellään aivan samoin kuin testiryhmän eläimiä. Mikäli liuotinta käytetään annostelun helpottamiseksi, kontrolleille annostellaan liuotinta samalla tavoin kuin testiryhmille ja liuottimen määrä on yhtä suuri kuin suurimman annostason saavan testiryhmän liuotinmäärä. Suurimman annoksen tulisi aiheuttaa myrkytysoireita, mutta ei lainkaan tai hyvin vähän kuolemantapauksia. Pienimmällä annoksella ei saisi olla myrkkyvaikutusta. Mikäli ihmisten altistustasosta on tietoja, pienimmän testiannoksen on oltava tätä suurempi. Keskimmäisen annostason olisi aiheutettava pienimmät havaittavissa olevat myrkytysoireet. Käytettäessä useampia väliannostasoja ne on porrastettava niin, että myrkytysoireet lisääntyvät asteittain. Pienimmän ja keskisuuren annoksen saavissa ryhmissä sekä kontrolliryhmässä kuolemantapausten luvun on oltava pieni, jotta tuloksista voidaan tehdä luotettava arviointi. Mikäli testattava aine aiheuttaa voimakasta ihon ärsytystä, aineen pitoisuutta pienennetään ja tämä voi aiheuttaa muiden myrkytysoireiden poisjäämisen tai vähenemisen korkeimmalla annostasolla. Jos iho on pahoin vaurioitunut, voi olla tarpeen lopettaa tutkimus ja aloittaa uusi pienemmillä pitoisuuksilla. Raja-annostesti Jos esitutkimuksessa ei esiinny testattavaan aineeseen liittyviä myrkkyvaikututuksia 1 000 mg/kg:n tai sitä suuremmalla, ihmisten altistumisen perusteella määritetyllä annostasolla, jatkotestejä ei yleensä tarvitse tehdä. Tarkkailuaika Eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkytysoireiden toteamiseksi. Kuolinaika sekä myrkytysoireiden alkamis- ja loppumisaika kirjataan. Testin suorittaminen Eläimet säilytetään yksittäishäkeissä. Niitä käsitellään testattavalla aineella mieluimmin viikon jokaisena päivänä 90 vuorokauden ajan. Mikäli tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, sitä tarkkaillaan vielä 28 päivän ajan altistamisen loputtua myrkkyvaikutusten ohimenevyyden tai pysyvyyden toteamiseksi. Altistamisajan on oltava kuusi tuntia päivässä. Testattavaa ainetta annostellaan tasaisesti alueelle, joka on n. 10 % ruumiin koko pinta-alasta. Testattaessa erittäin myrkyllisiä aineita altistusalue voi olla pienempi, mutta aine tulisi levittää alueelle mahdollisimman ohuena ja tasaisena kalvona. Testattava aine pidetään kosketuksessa ihoon huokoisen sideharson ja ärsyttämättömän teipin avulla. Testialueelle on asetettava jokin sopiva peite pitämään harsosidos ja testattava aine paikoillaan ja estämään eläintä syömästä sitä. Eläimen liikkumista voidaan rajoittaa, mutta täydellisesti liikkumattomaksi saattaminen ei ole suositeltava menettelytapa. Altistusajan päätyttyä jäljellä oleva aine poistetaan vedellä tai puhdistamalla iho jollakin muulla sopivalla tavalla. Eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja myrkytysoireet, niiden alkamis- ja kestoaika sekä voimakkuus kirjataan. Eläimiä tarkkailtaessa kiinnitetään huomiota muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa ja käyttäytymistavassa. Ruoan kulutus mitataan ja eläimet punnitaan viikottain. Tarkkailua on suoritettava säännöllisesti, jotta koe-eläimiä ei menetettäisi kannibalismin, kudosten autolyysin tai virheellisen sijoituksen vuoksi. Tutkimuksen päätyttyä eloonjääneille eläimille satelliittiryhmää lukuunottamatta suoritetaan ruumiinavaus. Kuolemaisillaan olevat eläimet poistetaan viipymättä ja niille suoritetaan ruumiinavaus. Seuraavat tutkimukset tehdään testin päätyttyä kaikille eläimille, mukaan lukien kontrolliryhmän eläimet: a) Silmätutkimus on suoritettava oftalmoskoopilla tai vastaavalla laitteella ennen aineen antamista ja testin päätyttyä mieluimmin kaikille eläimille, mutta vähintään suurimman annoksen saaneille sekä kontrolliryhmälle. Mikäli silmissä havaitaan muutoksia, kaikki eläimet tutkitaan. b) Veritutkimus, jossa määritetään hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, leukosyyttien määrä ja erittely sekä joitakin hyytymisominaisuuksia kuten hyytymisaika, protrombiiniaika, tromboplastiiniaika tai trombosyyttien määrä, tehdään tutkimusajanjakson päätyttyä. c) Veren kliininen biokemiallinen tutkimus on suoritettava tutkimusajanjakson päätyttyä. Kaikkiin tutkimuksiin soveltuvia määrityskohteita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattien metabolia sekä, maksan ja munuaisten toiminta. Testien valintaperusteena on aineen todettu vaikutustapa. Suositeltavia määrityskohteita ovat: kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, glukoosin paastoarvo (lajille soveltuva paaston pituus), seerumin glutamiinipyruviinitransaminaasi(6), seerumin glutamiinioksaloasetaattitransaminaasi(7), ornitiinidekarboksylaasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi, virtsan typpi, albumiini, veren kreatiniinin kokonaisbilirubiini ja seerumin proteiinit. Myrkyllisyyden arvioinnissa auttavat tarvittaessa lisävalaistusta esimerkiksi lipidi-, hormoni-, happo/emästasapaino-, methemoglobiini- ja kolinesteraasiaktiivisuuden analyysit. Muitakin kliinisiä biokemiallisia testejä voidaan tehdä, jos todettujen vaikutusten laajempi tutkimus on tarpeen. d) Virtsa-analyysia ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun oletettu tai todettu myrkyllisyys antaa siihen aihetta. Mikäli käytettävissä olevat taustatiedot ovat riittämättömät, hematologisten ja biokemiallisten parametrien määritystä tulisi harkita ennen altistuksen aloittamista. Ruumiinavaus Kaikille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus, jossa tutkitaan ruumis ulkopuolelta, kaikki aukot, kallo-, rinta- ja vatsaontelo sekä niiden sisältö. Maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset punnitaan märkinä mahdollisimman pian irrottamisen jälkeen, jotta ne eivät pääse kuivumaan. Seuraavat elimet ja kudokset säilytetään sopivassa aineessa mahdollista myöhempää histopatologista tutkimusta varten: kaikki näkyvät vammat, aivot - ytimen/ aivosillan osat mukaanlukien, pikkuaivokuori ja aivokuori, aivolisäke, kilpirauhanen/lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, (henkitorvi), keuhkot, sydän, aortta, sylkirauhaset, maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, muut sukupuolielimet, sappirakko (jos on), ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke (naarailta rintarauhanen), (reisilihaksistoa), ääreishermo, (silmät), (rintalaa luuytimineen), (reisiluu ja nivelen pintaa) (selkärankaa kolmesta kohdasta - kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta) sekä (kyynelrauhaset). Suluissa olevat kudokset tutkitaan vain, jos ne tai kohde-elimet osoittavat merkkejä myrkyllisyydestä. Histopatologinen tutkimus a) Suurimman annoksen saaneen ryhmän sekä kontrolliryhmän eläinten normaalista ja altistetusta ihosta otetuille näytteille sekä elin- ja kudosnäytteille tehdään täydellinen histopatologinen tutkimus. b) Kaikki näkyvät vammat tutkitaan. c) Muiden annosryhmien eläinten tärkeät elimet tutkitaan. d) Rotan ollessa koe-eläimenä tutkitaan alhaisen ja keskitason annosryhmien eläinten keuhkot infektioiden löytämiseksi, koska niiden perusteella pystytään vaivattomasti arvioimaan eläinten terveydentila. Yleensä ei näiden ryhmien eläimille tarvitse suorittaa muita histopatologisia tutkimuksia, mutta elimet, jotka suurimman annoksen saaneessa ryhmässä olivat vaurioituneet, on aina tutkittava myös näiden ryhmien osalta. e) Kun tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, histopatologinen tutkimus suoritetaan niille elimille ja kudoksille, joissa muiden ryhmien eläimillä oli vaurioita. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta näkyy kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä kokeen alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin erityyppistä vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet, - annostasot (käytetty liuotin) ja pitoisuudet, - myrkyllisyysoireet sukupuolen ja annostason perusteella, - oireeton taso, mikäli mahdollista, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista, - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - silmälöydökset, - veritestit ja kaikki tulokset, - kliiniset biokemialliset testit ja kaikki tulokset (myös virtsa-analyysitulokset), - ruumiinavauslöydökset, - tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä, - tulosten tilastointitapa, mikäli mahdollista, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. SUBKROONINEN MYRKYLLISYYSTUTKIMUS (HENGITYSTEIDEN KAUTTA) TOISTUVA ANNOSTELU HENGITYSTEIDEN KAUTTA, 90 VUOROKAUTTA, JYRSIJÄT 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Koe-eläinryhmät altistetaan päivittäin tietyksi ajaksi testattavalle aineelle asteittain suurenevina annoksina 90 vuorokauden aikana siten, että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Jos käytetään liuotinta sopivan ilmaseospitoisuuden aikaansaamiseksi, tutkimuksessa on käytettävä liuotinkontrolliryhmää. Tutkimuksen kuluessa eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkyllisyysoireiden toteamiseksi. Testin aikana kuolleille eläimille ja sen päättymisen jälkeen vielä elossa oleville eläimille suoritetaan ruumiinavaus. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Eläimet siirretään koetiloihin ja tutkimuksen aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen tutkimuksen alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Testattaviin aineisiin voidaan tarpeen mukaan lisätä liuotinta, jotta saadaan halutun pitoinen ilmaseos. Mikäli liuotinta tai muita lisäaineita käytetään annostelun helpottamiseksi, niiden myrkyttömyys täytyy olla tiedossa esimerkiksi aikaisempien tutkimustulosten perusteella. Koeolosuhteet Koe-eläimet Rotta on suositeltavin laji, ellei sen käyttö ole kontraindikoitu. Koe-eläimiksi valitaan yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä rottia. Tutkimuksen alkaessa eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % tavanomaisesta keskiarvosta. Mikäli pitkäaikaistutkimuksen esitestinä tehdään subkrooninen hengitysteiden kautta tapahtuva altistumistesti, kummassakin kokeessa on käytettävä samaa eläinlajia ja -kantaa. Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään 20 eläintä (10 naarasta ja 10 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä lopettaviksi aiottujen eläinten määrä. Lisäksi voidaan muodostaa 20 eläimen satelliittiryhmä (10 eläintä kumpaakin sukupuolta), jolle annetaan suurin annos 90 vuorokauden aikana ja jota tarkkaillaan 28 vuorokauden ajan tutkimuksen päätyttyä myrkytysoireiden ohimenevyyden, pysyvyyden tai viivästyneen esiintymisen toteamiseksi. Annostasot Kokeessa käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää tai liuotinkontrolliryhmää (jolle annostellaan liuotinta suurimman annoksen sisältävän liuotinmäärän verran). Kontrolliryhmän eläimiä käsitellään aivan samoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niille ei annetta testattavaa ainetta. Suurimman annoksen olisi aiheutettava myrkytysoireita, mutta ei lainkaan tai hyvin vähän kuolemantapauksia. Mikäli altistusannoksesta ihmisillä on tietoja, pienimmän testiannoksen on oltava tätä suurempi. Keskimmäinen annostaso olisi säädettävä sellaiseksi, että se aiheuttaa vähäisimmät havaittavissa olevat myrkytysoireet. Käytettäessä useampia väliannostasoja ne on porrastettava niin, että myrkkyvaikutukset lisääntyvät asteittain. Pienimmän ja keskisuuren annoksen saavissa ryhmissä sekä kontrolliryhmässä kuolemantapausten luvun on oltava pieni, jotta tuloksista voidaan tehdä luotettava arviointi. Altistusaika Päivittäinen altistusaika on kuusi tuntia hengityskammion tasapainotuksen jälkeen. Erityistapauksissa aika voi vaihdella. Laitteet Eläinten testauksiin käytetään inhalaatiolaitetta, jonka dynaamisessa ilmavirrassa ilma vaihtuu vähintään 12 kertaa tunnissa, jotta hapen ja tasaisesti jakautuneen altistusaineen saanti voidaan varmistaa. Jos tutkimuksessa käytetään kammiota, sen on oltava suunniteltu siten, että koe-eläimet voidaan sijoittaa mahdollisimman väljästi, ja että ne joutuvat hengittämään mahdollisimman tehokkaasti testattavaa ainetta. Yleissääntönä kammion ilman pitämiseksi vakaana on, että koe-eläinten viemä tila on korkeintaan 5 % kammion tilavuudesta. Eläimen sieraimet ja suu, yksinomaan pää tai koko ruumis voidaan altistaa yksittäiskammiossa; kaksi ensin mainittua tapaa vähentävät testattavan aineen imeytymistä muulla tavoin. Tarkkailuaika Eläimiä tarkkaillaan päivittäin testin ja toipumisen aikana myrkytysoireiden toteamiseksi. Kuolinaika ja myrkkyvaikutusten alkamis- ja loppumisaika kirjataan. Testin suorittaminen Eläimet altistetaan testattavalle aineelle päivittäin viidestä seitsemään päivänä viikossa 90 vuorokauden ajan. Mikäli tutkimukseen kuuluu seurantatarkkailuun tarkoitettu satelliittiryhmä, sitä tarkkaillaan vielä 28 päivän ajan altistamisen jälkeen myrkkyvaikutusten ohimenevyyden tai pysyvyyden toteamiseksi. Testin aikana lämpötilan on oltava 22 ± 3 °C. Suositeltavin suhteellinen kosteus on 30-70 %, mutta tietyissä tapauksissa (esim. aerosolitesteissä) tämä ei ole mahdollista käytännössä. Altistamisen aikana ei anneta ruokaa eikä vettä. Testissä on käytettävä dynaamista inhalointimenetelmää, jossa on analyyttinen pitoisuuden valvontajärjestelmä. Esitestaus on suositeltavaa tarvittavien altistuspitoisuuksien määrittämiseksi. Ilman virtaus säädetään siten, että olosuhteet ovat homogeeniset altistuskammion joka kohdassa. Vakaisiin altistusolosuhteisiin on päästävä mahdollisimman lyhyessä ajassa. Seuraavat mittaukset tai tarkkailutoimenpiteet on suoritettava: a) ilmavirran nopeus (jatkuva tarkkailu), b) testattavan aineen todellinen hengityskohdassa mitattu pitoisuus. Päivittäisen altistuksen aikana pitoisuuden vaihtelu saa olla korkeintaan ± 15 % keskiarvosta. Testattaessa pölyjä ja aerosoleja tämän tason saavuttaminen voi olla vaikeaa ja tällöin hyväksytään suurempi poikkeama. Päivittäisten pitoisuuksien olisi pysyttävä mahdollisimman vakaina koko tutkimuksen ajan. Hiukkas-ja aerosolitestauksissa hiukkasten koko on mitattava tarvittaessa hiukkasten koko jakautuman selvittämiseksi, c) lämpötila ja kosteus, d) altistamisen aikana ja sen jälkeen eläimiä tarkkaillaan ja huomiot kirjataan järjestelmällisesti. Jokaisesta eläimestä pidetään erikseen kirjaa. Eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja kaikki myrkytysoireet, niiden alkamisaika, voimakkuus ja kesto kirjataan. Eläimiä tarkkailtaessa on kiinnitettävä huomiota muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä, limakalvoissa, hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa ja käyttäytymistavassa. Eläimet punnitaan viikottain ja viikottainen ruoan kulutus mitataan. Tarkkailu on suoritettava säännöllisesti, jotta koe-eläimiä ei menetettäisi kannibalismin, kudosten autolyysin tai virheellisen sijoituksen vuoksi. Tutkimuksen päätyttyä eloonjääneille eläimille suoritetaan ruumiinavaus. Kuolemaisillaan olevat eläimet poistetaan ja niille suoritetaan ruumiinavaus. Seuraavat tutkimukset tehdään kokeen päätyttyä kaikille eläimille, mukaan lukien kontrolliryhmän eläimet: a) Silmätutkimus on suoritettava oftalmoskoopilla tai vastaavalla laitteella ennen aineelle altistusta ja tutkimuksen päätyttyä mieluimmin kaikille eläimille, mutta ainakin korkeimman annoksen saaneille sekä kontrolliryhmälle. Mikäli silmissä havaitaan muutoksia, kaikki eläimet tutkitaan. b) Veritutkimus, jossa määritetään hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, leukosyyttien määrä ja erittely sekä joitakin hyytymisominaisuuksia kuten hyytymisaika, protrombiiniaika, tromboplastiiniaika tai trombosyyttien määrä, tehdään tutkimusajanjakson päätyttyä. c) Veren kliininen biokemiallinen tutkimus on suoritettava tutkimusajan päätyttyä. Kaikkiin tutkimuksiin soveltuvia määrityskohteita ovat elektrolyyttitasapaino, hiilihydraattien metabolia sekä, maksan ja munuaisten toiminta. Testien valintaperusteena on aineen todettu vaikutustapa. Suositeltavia määrityskohteita ovat: kalsium, fosfori, kloridi, natrium, kalium, glukoosin paastoarvo (lajille soveltuva paaston pituus), seerumin glutamiinipyruviinitransaminaasi(8), seerumin glutamiinioksaloasetaattitransaminaasi(9), ornitiinidekarboksylaasi, gammaglutamyylitranspeptidaasi, virtsan typpi, albumiini, veren kreatiniinin kokonaisbilirubiini ja seerumin proteiinit. Myrkyllisyyden arvioinnissa tarvittaessa esimerkiksi lipidi-, hormoni-, happo/emästasapaino-, methemoglobiini- ja kolinesteraasiaktiivisuuden analyysit. Muitakin kliinisiä biokemiallisia testejä voidaan tehdä, mikäli todettujen vaikutusten laajempi tutkimus on tarpeen. d) Virtsa-analyysia ei yleensä tarvita. Se tehdään silloin, kun odotettu tai todettu myrkyllisyys antaa siihen aihetta. Mikäli käytettävissä olevat taustatiedot ovat riittämättömät, hematologisten ja biokemiallisten parametrien määritystä tulisi harkita ennen altistuksen aloittamista. Ruumiinavaus Kaikille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus, jossa tutkitaan ruumis ulkopuolelta, kaikki aukot, kallo-, rinta- ja vatsaontelo sekä niiden sisältö. Maksa, munuaiset, lisämunuaiset ja kivekset punnitaan märkinä mahdollisimman pian irrottamisen jälkeen, jotta ne eivät pääse kuivumaan. Seuraavat elimet ja kudokset säilytetään sopivassa aineessa mahdollista myöhempää histopatologista tutkimusta varten: näkyviä vammoja sisältävät kohteet, keuhkot - jotka olisi poistettava kokonaisina, punnittava ja käsiteltävä jollakin fiksatiivilla, jotta keuhkojen rakenne säilyy (fiksatiiviperfuusio on tehokas menetelmä), nenänielun kudokset, aivot - ytimen/ aivosillan osat mukaanlukien, pikkuaivokuori ja aivokuori, aivolisäke, kilpirauhanen/lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, henkitorvi, keuhkot, sydän, aortta, sylkirauhaset, maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, (muut sukupuolielimet), (iho), sappirakko (jos on), ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke (naaraan rintarauhanen), (reisilihaksistoa), ääreishermo, (silmät), rintalaa luuytimineen, (reisiluu ja nivelen pintaa) sekä (selkärankaa kolmesta kohdasta - kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta). Suluissa olevat kudokset tutkitaan vain, jos ne tai kohde-elimet osoittavat merkkejä myrkyllisyydestä. Histopatologinen tutkimus a) Suurimman annoksen saaneen ryhmän ja kontrolliryhmän eläinten hengitystiet sekä elin- ja kudosnäytteet tutkitaan tarkoin. b) Kaikki näkyvät vammat tutkitaan. c) Muiden annosryhmien eläinten kohde-elimet on myös tutkittava. d) Alhaisen ja keskitason annosryhmien eläinten keuhkot tutkitaan histopatologisesti, koska näin pystytään vaivattomasti arvioimaan eläinten terveydentila. Yleensä ei näiden ryhmien eläimille tarvitse suorittaa muita histopatologisia tutkimuksia, mutta elimet, jotka suurimman annoksen saaneessa ryhmässä olivat vaurioituneet, on aina tutkittava myös näiden ryhmien osalta. e) Kun tutkimukseen sisältyy satelliittiryhmä, histopatologinen tutkimus suoritetaan niille elimille ja kudoksille, joissa muiden ryhmien eläimillä oli vaurioita. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin erityyppistä vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet: Altistamislaitteen kuvaus: merkki, tyyppi, mitat, ilmanlähde, hiukkasten ja aerosolien tuottamistapa, ilmastointitapa, poistoilman käsittelytapa ja eläinten sijainti koekammiossa altistamisen aikana. Lämpötilan, kosteuden, ja tarvittaessa hiukkasten koon ja aerosolin pitoisuuden mittaustapa on mainittava. Altistamistiedot: Altistamistiedot laaditaan taulukon muotoon, jossa esitetään keskiarvo ja poikkeamat (esim. keskihajonta) ja, mikäli mahdollista, seuraavat tiedot: a) ilmavirran nopeus inhalaatiolaitteessa, b) ilman lämpötila ja kosteus, c) nimellispitoisuudet (inhalaatiolaitteeseen asetetun testattavan aineen kokonaismäärä jaettuna ilman tilavuudella), d) käytetty liuotin, e) todelliset pitoisuudet hengitysalueella, f) hiukkasten keskikoko (tarvittaessa), - myrkyllisyysoireet sukupuolen ja annostason perusteella, - oireeton taso, mikäli mahdollista, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista, - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - silmälöydökset, - veritestit ja niiden tulokset, - kliiniset biokemialliset testit ja niiden tulokset (myös virtsa-analyysitulokset), - ruumiinavauslöydökset, - tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä, - tulosten tilastointitapa, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. TERATOGEENISUUSTUTKIMUS, JYRSIJÄT JA MUUT KUIN JYRSIJÄT 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annetaan päivittäin asteittain suurenevina annoksina tai pitoisuuksina useille kantavista eläimistä koostuville koe-eläinryhmille raskausaikana ainakin alkion organogeneesin ajan siten, että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Vähän ennen laskettua synnyttämisajankohtaa emo lopetetaan, kohtu poistetaan ja sen sisältö tutkitaan. Tällä testausmenetelmällä tutkitaan myrkkyvaikutuksia alkioon ja sikiöön. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Terveet, nuoret, sukukypsät, pariutumattomat naaraat, jotka ovat samanikäisiä ja -kokoisia, siirretään koetiloihin vähintään viisi päivää ennen kokeen alkua. Sen jälkeen ne pariutetaan urosten kanssa, joiden hedelmällisyys on tutkittu. Siemennyksen jälkeen naaraat jaetaan satunnaisesti koeryhmiin. Siemennys voi tapahtua joko luonnollisesti tai keinosiementämällä. Testattavan aineen päivittäinen annostelu aloitetaan pian siemennyksen jälkeen ja sitä jatketaan organogeneesin ajan. Päivää ennen raskauden päättymistä kohtu poistetaan ja sikiöt tutkitaan sisäelinten ja luuston kehityshäiriöiden, kasvun ja luun muodostuksen hidastumisen sekä suoliston verenvuotojen toteamiseksi. Koeolosuhteet Koe-eläimet Rotta, hiiri, hamsteri ja kani ovat yleisesti käytettyjä eläinlajeja. Suositeltavimmat lajit ovat rotta ja kani. Yleisesti käytettyjä laboratoriokantoja on käytettävä. Kannan hedelmällisyys ei saa olla alhainen ja teratogeenisuusvasteen on oltava hyvä. Eläimet on säilytettävä yksittäishäkeissä. Lukumäärä ja sukupuoli Kutakin annostasoa varten tarvitaan vähintään 20 kantavaa rottaa, hiirtä tai hamsteria tai 12 kania. On varmistauduttava siitä, että tutkimukseen saadaan tarvittava määrä poikueita ja poikasia aineen teratogeenisten ominaisuuksien arvioimiseksi. Annostasot Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää. Jos käytetään liuotinta aineen annostelussa, on perustettava myös liuotinkontrolliryhmä. Liuottimen myrkkyvaikutusten olisi oltava tiedossa; sillä ei saisi olla teratogeenisia eikä lisääntymiseen vaikuttavia ominaisuuksia. Kontrolliryhmän (ryhmien) eläimiä käsitellään aivan samoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi ettei niille anneta testattavaa ainetta. Elleivät aineen fysikaalis-kemialliset tai biologiset ominaisuudet aiheuta rajoituksia, suurimman annoksen olisi aiheutettava emossa joitakin näkyviä myrkkyvaikutuksia kuten lievää painon menetystä, mutta korkeintaan 10 % kuolemantapauksia. Pienimmällä annoskoolla ei olisi oltava havaittavia testattavasta aineesta johtuvia vaikutuksia. Keskimmäinen annostaso/keskimmäiset annostasot olisi säädettävä geometrisesti suurimman ja pienimmän koon väliin. Raja-annostesti Jos vähintään 1 000 mg/kg ei aiheuta sikiössä myrkkyvaikutuksia tai teratogeenisuutta, kun tutkitaan lievästi myrkyllisiä aineita, muita annostasoja ei tarvitse tutkia. Altistusaika Jos on mahdollista todeta kohdunkaulan tulppa tai spermaa, toteamispäivä on 0-päivä. Annosteluajan tulee kattaa suurin osa organogeneesistä. Tänä voidaan rotalla ja hiirellä pitää päiviä 6-15, hamsterilla päiviä 6-14 ja kanilla päiviä 6-18. Mikäli 0-päiväksi katsotaan parittelu- tai keinosiemennyspäivä, näihin aikoihin on lisättävä yksi päivä. Vaihtoehtoisesti annostusaikaa voidaan pidentää raskauden päättymistä edeltävään päivään. Tarkkailuaika Huolellinen kliininen tutkimus on suoritettava vähintään kerran päivässä. Sen ohella tarkkailua on suoritettava päivittäin ja toimenpiteisiin ryhdyttävä tarvittaessa, jotta tutkimuksesta ei menetettäisi eläimiä. Testin suorittaminen Testattavaa ainetta annetaan suun kautta ruokintaletkulla. Annos tulee antaa suunnilleen samaan aikaan joka päivä. Naaraspuolisille koe-eläimille annetaan testattavaa ainetta päivittäin tutkimusajan päättymiseen saakka. Annoksen määritysperusteena voidaan käyttää naaraiden painoa annostelun alkaessa. Koska raskauden aikana paino nousee nopeasti, vaihtoehtona on punnita eläimet määräajoin ja mitoittaa annos viimeisen punnituksen perusteella. Myrkytysoireet ja niiden voimakkuus sekä alkamis- ja kestoaika kirjataan. Naaraat, jotka osoittavat oireita abortoimisesta tai ennenaikaisesta synnyttämisestä, lopetetaan ja niille suoritetaan huolellinen makroskooppinen tutkimus. Altistamisen jälkeistä tarkkailuaikaa olisi jatkettava suunnilleen raskauden viimeistä edelliseen päivään. Tarkoituksena on kattaa suurin osa raskausajasta, mutta välttää luonnollisen synnytyksen aiheuttamia tulosten tulkintavaikeuksia. Eläinten tarkkailuun on sisällyttävä vähintään seuraava kohteet: muutokset, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa sekä käyttäytymistavassa. Ruoan kulutus mitataan ja eläimet punnitaan viikottain. Ruumiinavaus Tutkimuksen kuluessa tai sen jälkeen kuolleet emot tutkitaan paljain silmin havaittavien, raskauteen mahdollisesti vaikuttavien rakenteellisten tai patologisten muutosten toteamiseksi. Kohtu poistetaan välittömästi emon lopettamisen jälkeen ja alkio- ja sikiökuolemat sekä elävien sikiöiden määrä todetaan. Kohtukuolemien ajankohta on yleensä mahdollista määrittää. Rottien ja kanien munasarjojen keltarauhasten lukumäärä voidaan määrittää. Sikiöiden sukupuoli määritetään, kukin sikiö punnitaan, paino kirjataan ja keskimääräinen sikiöpaino lasketaan. Ulkoinen tutkimus suoritetaan kullekin sikiölle. Rottien, hiirien ja hamstereiden poikueista kolmannes tai puolet preparoidaan ja niistä tutkitaan luuston poikkeamat ja jäljelle jäävät sikiöt preparoidaan ja niistä tutkitaan kudosten poikkeamat tavanomaisia menetelmiä käyttäen. Kanien jokaiselle sikiölle suoritetaan dissektio ja sisäelinten poikkeamat ja luuston epämuodostumat tutkitaan. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä testin alussa, kantaviksi tulleiden eläinten määrä, elossa olleiden sikiöiden sekä sikiöiden, joissa havaittiin kudos- tai luustopoikkeamia, lukumäärä ja prosentuaalinen osuus kutakin poikuetta kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet, - annostasot (käytetty liuotin) ja pitoisuudet, - myrkyllisyysvasteen tulokset annostasoittain, - oireeton taso (mikäli mahdollista), - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista, - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - raskauden kesto ja poikuetta koskevat tiedot (myöskin taustatiedot tutkimusta edeltävältä ajalta), - sikiötä koskevat tiedot (elossa/kuollut, kudos- ja luustovauriot), - poikueita koskevat tiedot (elossa/kuollut, kudos- ja luustovauriot kunkin poikueen osalta), - tulosten tilastollinen käsittely, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. KROONINEN MYRKYLLISYYSTESTI 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annetaan valittua antotapaa käyttäen yleensä viikon jokaisena päivänä useille koe-eläinryhmille suurimman osan niiden elinajasta, niin että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Antoaikana ja sen päätyttyä eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkkyvaikutusten toteamiseksi. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Testin valmistelu Eläimet siirretään koetiloihin ja testin aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen testin alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Koeolosuhteet Koe-eläimet Rotta on suositeltavin laji. Aikaisempien tutkimusten perusteella voidaan valita jokin muu laji (jyrsijä tai muu laji). Koe-eläimiksi valitaan yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä eläimiä ja annostelu aloitetaan niin pian kuin mahdollista vierotuksen jälkeen. Testin alkaessa eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskiarvosta. Mikäli subkrooninen testi suun kautta annosteltuna on tehty pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, samaa lajia ja kantaa on käytettävä kummassakin tutkimuksessa. Lukumäärä ja sukupuoli Kun tutkimuksessa käytetään jyrsijöitä, kutakin annostasoa ja kontrolliryhmää varten tarvitaan vähintään 40 eläintä (20 naarasta ja 20 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla kantavia. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä lopetettaviksi aiottujen eläinten määrä. Tutkittaessa muita kuin jyrsijöitä voidaan käyttää pienempää eläinmäärää. Kussakin ryhmässä on kuitenkin oltava vähintään neljä eläintä kumpaakin sukupuolta. Annostasot ja altistustiheys Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää. Suurimman annoksen olisi aiheutettava selkeitä myrkytysoireita mutta vähän kuolemantapauksia. Pienimmällä annoksella ei saisi olla myrkkyvaikutusta. Väliannostaso (tasot) on porrastettava ylimmän ja alimman annoksen keskiväliin. Annostasojen valinnassa on otettava huomioon aikaisemmista myrkyllisyystesteistä ja -tutkimuksista saadut tulokset. Eläimet altistetaan tavallisesti päivittäin. Mikäli kemikaalia annostellaan juomaveteen tai ravintoon sekoitettuna, niitä on oltava jatkuvasti saatavilla. Kontrollit Tutkimuksessa on käytettävä kontrolliryhmää, joka on aivan samanlainen kuin tutkimusryhmät, paitsi että sille ei anneta tutkittavaa ainetta. Erityistapauksissa, esimerkiksi aerosoleihin liittyvissä inhalaatiotutkimuksissa tai kun suun kautta annosteltavaa ainetta tutkittaessa käytetään emulgaattoria, jonka biologiset ominaisuudet eivät ole tiedossa, tutkimukseen tulee liittää myös negatiivinen kontrolliryhmä. Negatiivista kontrolliryhmää käsitellään aivan samalla tavalla kuin tutkimusryhmiä, paitsi ettei sitä altisteta tutkittavalle aineelle eikä liuottimelle. Annostelutapa Kaksi pääasiallisesti käytettyä annostelutapaa ovat altistus suun kautta ja hengitysteiden kautta. Valinta riippuu testattavan aineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista sekä ihmisten todennäköisestä altistumistavasta. Ihon kautta altistamiseen liittyy huomattavia käytännön ongelmia. Johtopäätökset ihon kautta imeytymisestä johtuvasta kroonisista systeemisistä myrkkyvaikutuksista voidaan yleensä tehdä suun kautta annosteltua ainetta koskevan testin sekä niiden tietojen perusteella, joita ihon kautta imeytymisestä on saatu aikaisemmista testeistä, joissa aineen myrkyllisyyttä ihon kautta annosteltuna on testattu. Tutkimukset, joissa annostelu tapahtuu suun kautta Kun testattava aine imeytyy ruoansulatuskanavasta sen ollessa myös ihmisten todennäköinen altistumistapa, suun kautta annostelu on paras tapa, ellei kontraindikaatioita ole. Testattavaa ainetta voidaan antaa eläimille ravinnon yhteydessä, juomaveteen liuotettuna tai kapseleina. Eläimille olisi annetteva testattavaa ainetta viikon jokaisena päivänä, koska annostus viitenä päivänä viikossa voi aiheuttaa myrkyllisyysoireiden häviämisen tai niistä toipumisen sen ajan kuluessa, jolloin ainetta ei anneta, ja näin vaikuttaa tuloksiin ja niiden tulkintaan. Lähinnä käytännön syistä annostelu viitenä päivänä viikossa voidaan kuitenkin hyväksyä. Tutkimukset, joissa annostelu tapahtuu hengitysteiden kautta. Koska altistus hengitysteiden kautta on teknisesti paljon ongelmallisempi kuin muut altistustavat, seuraavassa selostetaan tarkemmin tätä altistustapaa. On myös huomattava, että aineen tiputus henkitorveen voi joissakin tapauksissa olla hyväksyttävä vaihtoehto. Pitkäaikaisaltistukset suunnitellaan yleensä ihmisten todennäköisen altistumistavan perusteella. Eläimet altistetaan hengityskammion tasapainotuksen jälkeen joko kuudeksi tunniksi päivittäin viitenä päivänä viikossa (jaksoittainen altistus) tai todennäköisen ympäristöaltistustavan perusteella 22-24 tuntia vuorokaudessa viikon jokaisena päivänä (jatkuva altistus), jolloin eläimillä on noin tunnin mittainen ruokailuaika samaan aikaan joka päivä. Kummassakaan tapauksessa eläimien saaman testattavan aineen pitoisuutta ei yleensä muuteta. Jaksoittaisen ja jatkuvan altistuksen pääasiallinen ero on, että jaksoittaisessa altistuksessa eläimillä on 17-18 tuntia aikaa toipua päivittäisestä altistuksesta ja viikonloppuisin vielä tätäkin pidempi toipumisaika. Jaksoittaisen tai jatkuvan altistuksen valinta riippuu tutkimuksen tavoitteista ja siitä, mitä ihmisten altistumistapaa simuloidaan. Tietyt tekniset vaikeudet on joka tapauksessa otettava huomioon. Esimerkiksi eläinten syöttäminen ja juottaminen altistuksen aikana ja monimutkaisemmat (ja luotettavammat) laitteet aerosolien ja höyryn tuottamiseksi sekä niiden valvonta voivat aiheuttaa ongelmia, jotka ovat merkittävämpiä kuin ympäristöolosuhteiden simuloimiseksi valitun jatkuvan altistuksen edut. Altistuskammiot Eläinten testauksiin käytetään inhalaatiokammiota, jonka dynaamisessa ilmavirrassa ilma vaihtuu vähintään 12 kertaa tunnissa, jotta hapen ja tasaisesti jakautuneen altistamisaineen saanti voidaan varmistaa. Testattavalle aineelle tapahtuvaa altistusta lukuun ottamatta kontrolli- ja altistuskammioiden on oltava rakenteeltaan yhdenmukaisia. Kammiossa on yleensä lievä negatiivinen paine, jotta testattavaa ainetta ei pääsisi vuotamaan ympäristöön. Kammioissa on oltava riittävästi tilaa eläimille. Yleissääntönä kammion ilman pitämiseksi vakaana on, että koe-eläinten viemä tila on korkeintaan 5 % kammion tilavuudesta. Seuraavat mittaukset tai valvontatoimenpiteet on suoritettava: i) Ilman virtaus: ilman virtausnopeutta kammion läpi on tarkkailtava jatkuvasti, ii) Pitoisuus: päivittäisen altistuksen aikana pitoisuuden vaihtelu saa olla korkeintaan ± 15 % keskiarvosta, iii) Lämpötila ja kosteus: lämpötilan on oltava 22 ± 2 °C ja kammion kosteuden 30-70 %, paitsi milloin testattavaa ainetta suspensoidaan veden avulla kammion ilmaan. Molempia arvoja on jatkuvasti tarkkailtava, iv) Hiukkasten koon mittaukset: kun testataan nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja, kammion ilmassa olevien hiukkasten koko on määritettävä. Aerosolihiukkasten on oltava kooltaan koe-eläinten hengitykselle sopivia. Näytteet kammion ilmasta on otettava eläinten hengitysalueelta. Otoksen on oltava edustava näyte testattavan aineen hiukkasten jakautumisesta ja gravimetrisesti myös kaikista aerosolin suspensiohiukkasista, vaikka suuri osa aerosolista ei joudu hengitykseen. Hiukkasten koosta on tehtävä analyysi useita kertoja hiukkasten tuottoa säädettäessä ja sen jälkeen koe-eläinten altistuksen aikana niin usein kuin tarvitaan hiukkasten jakautumisen vakaana pysymisen varmistamiseksi. Tutkimuksen kesto Altistusajan on oltava vähintään yksi vuosi. Testin suorittaminen Tarkkailu Huolellinen kliininen tutkimus on suoritettava ainakin kerran päivässä. Sen ohella eläimiä tarkkaillaan päivittäin ja toimenpiteisiin ryhdytään tarvittaessa, jotta tutkimuksesta ei menetettäisi eläimiä. Kuolleet eläimet pakastetaan tai niille suoritetaan ruumiinavaus ja heikot tai kuolemaisillaan olevat eläimet eristetään tai lopetetaan. Myrkytysoireiden puhkeamista ja kehittymistä tarkkaillaan ja sairauden, autolyysin tai kannibalismin aiheuttamat menetykset pyritään pitämään mahdollisimman vähäisinä. Kunkin eläimen osalta kirjataan kliiniset oireet, neurologiset ja silmän muutokset sekä kuolleisuus. Myrkkyvaikutusten puhkeaminen ja kehitys sekä epäillyt kasvaimet kirjataan. Kunkin eläimen paino kirjataan kerran viikossa tutkimusajan 13 ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen vähintään kerran neljässä viikossa. Ravinnon kulutus mitataan viikottain 13 ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen noin kolmen kuukauden välein, ellei eläinten terveydentila tai painon muutokset edellytä useampia määrityksiä. Veritutkimus Veritutkimus (esim. hemoglobiini, puna- ja valkosolujen määrä, trombosyytit tai jokin muu hyytymisominaisuusmääritys) on tehtävä kolmen ja kuuden kuukauden kuluttua ja sen jälkeen noin kuuden kuukauden välein. Tutkimuksen päätyttyä otetaan verinäyte kunkin ryhmän osalta 10 uros- ja 10 naaraspuolisesta rotasta ja kaikista muiden lajien koe-eläimistä. Jos mahdollista, näytteet on otettava joka kerta samoista rotista. Muista kuin jyrsijöistä otetaan tämän lisäksi näyte ennen tutkimuksen alkua. Mikäli kliiniset havainnot viittaavat eläinten terveydentilan huononemiseen tutkimuksen kuluessa, näiden eläinten verenkuva on tutkittava. Suurimman annoksen saaneen ryhmän ja kontrolliryhmän eläinten verenkuva tutkitaan. Pienempiä annoksia saaneiden ryhmien osalta verenkuva tutkitaan vain, jos suurimman annosryhmän ja kontrolliryhmän välillä on suuri ero tai jos patologiset löydökset edellyttävät sen tutkimista. Virtsa-analyysi Virtsanäyte otetaan kunkin ryhmän osalta jos mahdollista samoin välein ja samalta 10 uros- ja 10 naaraspuoliselta rotalta, jolta otettiin verinäyte, ja kaikilta muiden lajien koe-eläimiltä. Seuraavat määritykset on tehtävä joko kunkin eläimen näytteestä tai jyrsijöiden osalta sukupuolen ja ryhmän perusteella yhdistetystä näytteestä: - ulkonäkö: määrä ja tiheys kunkin eläimen osalta, - proteiinit, glukoosi, ketonit, veri (semikvantitatiivisesti), ja - sakan mikroskooppitutkimus (semikvantitatiivisesti). Kliininen kemia Otetaan verinäytteetnoin kuuden kuukauden välein mieluimmin joka kerta samalta 10 uros- ja 10 naaraspuoliselta rotalta ja kaikilta muiden lajien koe-eläimiltä kliinisen kemian määrityksiä varten. Muilta kuin jyrsijöiltä otetaan lisäksi näyte ennen tutkimuksen alkua. Näytteiden plasmasta tehdään seuraavat määritykset: - kokonaisproteiinipitoisuus, - albumiinipitoisuus, - maksakokeet esim. alkaalifosfataasin, glutamiinipyruviinitransaminaasin(10), glutamiinioksaloasetaattitransaminaasin(11) toiminta, gammaglutamyylitranspeptidaasi, ornitiinidekarboksylaasi, - hiilihydraattien metabolia, esim. glukoosin paastoarvo, - munuaisten toiminta, esim. veren ureatyppi. Ruumiinavaus Kaikille, myös tutkimuksen kuluessa kuolleille tai huonokuntoisuuden vuoksi lopetetuille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus. Ennen eläinten lopettamista niistä otetaan verinäytteet verenkuvan määritystä varten. Kaikki paljain silmin havaittavat vammat, kasvaimet tai kasvaimeksi epäillyt kohteet säilytetään. Silmämääräiset havainnot on pyrittävä korreloimaan mikroskooppisiin löydöksiin. Kaikki elimet ja kudokset on säilytettävä histopatologista tutkimusta varten. Tämä koskee yleensä seuraavia elimiä ja kudoksia: aivot(12),(ydin/aivosilta, pikkuaivokuori ja aivokuori), aivolisäke, kilpirauhanen (sekä lisäkilpirauhanen), kateenkorva, keuhkot (ja henkitorvi), sydän, aortta, sylkirauhaset, maksa(3), perna, munuaiset(3), lisämunuaiset(3), ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, kohtu, virtsarakko, imusolmukkeet, haima, sukupuolirauhaset(3), muut sukupuolielimet, naaraan rintarauhanen, iho, lihakset, ääreishermo, selkärankaa (kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta), rintalaa luuytimineen, reisiluu (nivelineen) sekä silmät. Keuhkojen ja virtsarakon täyttäminen fiksatiivilla on näiden elinten paras säilytystapa, keuhkojen täyttäminen hengitystietutkimuksissa on välttämätöntä, jotta tarvittava histopatologinen tutkimus voidaan suorittaa. Erityistutkimuksissa, kuten altistustesteissä hengitysteiden kautta, koko hengityselimistö mukaan lukien nenä, nielu ja kurkunpää, tulee tutkia. Tehtäessä muita kliinisiä tutkimuksia niiden tulosten on oltava selvillä ennen mikroskooppitutkimusta, koska niistä saattaa olla patologille merkittävää apua. Histopatologinen tutkimus Kaikki näkyvät muutokset, erityisesti jossakin elimessä esiintyvät kasvaimet tai muut vammat tulee tutkia mikroskooppisesti. Lisäksi suositellaan seuraavia toimenpiteitä: a) Kaikkien säilytettyjen elinten ja kudosten mikroskooppinen tutkimus ja selostus kaikista vammoista: 1 tutkimuksen aikana kuolleiden tai lopetettujen eläinten osalta, ja 2 kaikkien suurimman annoksen ryhmän eläinten ja kontrolliryhmän eläinten osalta. b) Alempien annosryhmien eläinten elimet tai kudokset, joissa esiintyi testattavasta aineesta aiheutuneita tai mahdollisesti aiheutuneita poikkeavuuksia, tutkitaan niin ikään. c) Jos testi osoittaa, että eläinten normaali elinikä on huomattavasti lyhentynyt tai sen tuloksena on syntynyt myrkkyvasteeseen vaikuttavia seurauksia, lähinnä alempi annostaso on tutkittava yllä selostetulla tavalla. d) Tiedot tutkimuksessa käytetyssä eläinkannassa samoissa laboratorio-olosuhteissa yleisesti ilmenevistä vammoista eli aikaisemmat tarkkailutulokset ovat välttämätön tietolähde, jotta altistetuissa koe-eläimissä ilmenneiden muutosten merkitsevyys pystytään arvioimaan. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä kokeen alussa, vammautuneiden eläinten määrä ja eläinten prosentuaalinen osuus kutakin vammaa kohden. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet: Altistamislaitteen kuvaus: merkki, tyyppi, mitat, ilmanlähde, hiukkasten ja aerosolien tuottamistapa, ilmastointitapa, poistoilman käsittelytapa ja eläinten sijainti koekammiossa altistamisen aikana. Lämpötilan, kosteuden, hiukkasten koon ja aerosolin pitoisuuden mittaustapa on mainittava. Altistamistiedot: Altistamistiedot laaditaan taulukkomuotoon, jossa esitetään keskiarvo ja poikkeamat (esim. keskihajonta) ja seuraavat tiedot: a) ilmavirran nopeus inhalaatiolaitteessa, b) ilman lämpötila ja kosteus, c) nimellispitoisuudet (inhalaatiolaitteeseen asetetun testattavan aineen kokonaismäärä jaettuna ilman tilavuudella), d) käytetty liuotin, e) todelliset pitoisuudet hengitysalueella, f) hiukkasten keskikoko (tarvittaessa), - annostasot (mukaan lukien liuotin, mikäli sitä on käytetty) - myrkyllisyysvasteen tulokset sukupuolen ja annostason perusteella, - oireeton taso, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista, - kunkin oireen toteamisaika ja kehittyminen, - ruokintaa ja painoa koskevat tiedot, - silmälöydökset, - veritestit ja kaikki tulokset, - kliiniset biokemialliset testit ja kaikki tulokset (myös mahdolliset virtsa-analyysitulokset), - ruumiinavauslöydökset, - tarkka selostus kaikista histopatologisista löydöksistä, - tulosten tilastollinen käsittely, jos mahdollista, - tulosten pohdinta, - tulosten tulkinta. 3.2 Arviointi ja tulkinta Ks. Yleisjohdanto, osa B. 4 LÄHDELUETTELO Ks. Yleisjohdanto, osa B. KARSINOGEENISUUSTESTI 1 MENETELMÄ 1.1 Johdanto Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.2 Määritelmät Ks. Yleisjohdanto, osa B. 1.3 Vertailuaineet Ei ole. 1.4 Testin periaate Testattavaa ainetta annetaan valittua antotapaa käyttäen yleensä viikon jokaisena päivänä useille koe-eläinryhmille suurimman osan niiden elinajasta siten, että kukin ryhmä saa eri suuruisen annoksen. Antoaikana ja sen päätyttyä eläimiä tarkkaillaan päivittäin myrkkyvaikutusten ja erityisesti kasvainten kehittymisen toteamiseksi. 1.5 Laatukriteerit Ei ole. 1.6 Testin kuvaus Eläimet siirretään koetiloihin ja testin aikana annettava ruokinta aloitetaan vähintään viisi päivää ennen testin alkua. Nuoret, terveet eläimet jaetaan satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmiin. Koe-eläimet Laji (jyrsijä tai muu laji) valitaan aikaisempien tutkimusten perusteella. Koe-eläimiksi valitaan yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä eläimiä ja annostelu aloitetaan vierotuksen jälkeen niin pian kuin mahdollista. Testin alkaessa eläinten paino saa vaihdella korkeintaan ± 20 % keskiarvosta. Mikäli subkrooninen testi suun kautta annosteltuna on tehty pitkäaikaistutkimuksen esitestinä, samaa lajia/kantaa on käytettävä kummassakin tutkimuksessa. Lukumäärä ja sukupuoli Kun tutkimuksessa käytetään jyrsijöitä, kutakin annostasoa ja kontrolliryhmää varten tarvitaan vähintään 100 eläintä (50 naarasta ja 50 urosta). Naaraiden on oltava synnyttämättömiä, eivätkä ne saa olla tiineenä. Mikäli tutkimussuunnitelma edellyttää eläinten lopettamista tutkimuksen kuluessa, eläinmäärään on lisättävä lopettaviksi aiottujen eläinten määrä. Annostasot ja altistustiheys Testissä käytetään vähintään kolmea annostasoa ja kontrolliryhmää. Suurimman annoksen olisi aiheutettava vähäisiä myrkytysoireita, kuten lievää painon nousun hidastumista (alle 10 %), eikä sen tuloksena saisi olla huomattavia muutoksia normaaliin elinikään kasvainten aiheuttamia vaikutuksia lukuun ottamatta. Pienin annos ei saisi vaikuttaa eläimen normaaliin kasvuun, kehitykseen ja elinikään eikä aiheuttaa mitään myrkyllisyysoireita. Pienimmän annoksen on yleensä oltava vähintään 10 % suurimmasta annoksesta. Väliannostaso (tasot) on porrastettava ylimmän ja alimman annoksen keskiväliin. Annostasojen valinnassa on otettava huomioon aikaisemmista myrkyllisyystesteistä ja -tutkimuksista saadut tulokset. Eläimet altistetaan tavallisesti päivittäin. Mikäli kemikaalia annostellaan juomaveteen tai ravintoon sekoitettuna, niitä on oltava jatkuvasti saatavilla. Kontrollit Tutkimuksessa on käytettävä kontrolliryhmää, joka on aivan samanlainen kuin tutkimusryhmät, paitsi että sille ei anneta tutkittavaa ainetta. Erityistapauksissa, esimerkiksi aerosoleihin liittyvissä inhalaatiotutkimuksissa, tai kun suun kautta annosteltavaa ainetta tutkittaessa käytetään emulgaattoria, jonka biologiset ominaisuudet eivät ole tiedossa, tutkimukseen tulee liittää vielä yksi kontrolliryhmä, jolle ei anneta liuotinta. Annostelutapa Kolme pääasiallisesti käytettyä annostelutapaa ovat altistus suun kautta, ihon kautta ja hengitysteiden kautta. Valinta tehdään testattavan aineen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien sekä ihmisten todennäköisen altistumistavan mukaan. Tutkimukset, joissa annostelu tapahtuu suun kautta Kun testattava aine imeytyy ruoansulatuskanavasta sen ollessa myös ihmisten todennäköinen altistumistapa, suun kautta annostelu on paras tapa, ellei kontraindikaatioita ole. Testattavaa ainetta voidaan antaa eläimille ravinnon yhteydessä, juomaveteen liuotettuna tai kapseleina. Eläimille olisi annettava testattavaa ainetta viikon jokaisena päivänä, koska annostus viitenä päivänä viikossa voi aiheuttaa myrkyllisyysoireiden häviämisen tai niistä toipumisen sen ajan kuluessa, jolloin ainetta ei anneta, ja näin vaikuttaa tuloksiin ja niiden tulkintaan. Lähinnä käytännön syistä annostelu viitenä päivänä viikossa voidaan kuitenkin hyväksyä. Tutkimukset, joissa altistus tapahtuu ihon kautta Altistusmenetelmäksi voidaan valita ihon altistus, joko sen vuoksi, että se simuloi ihmisten pääasiallista altistumistapaa tai esimerkkimenetelmäksi ihovaurioiden tuottamisesta. Tutkimukset, joissa altistus tapahtuu hengitysteiden kautta Koska altistus hengitysteiden kautta on teknisesti paljon ongelmallisempi kuin muut altistustavat, seuraavassa selostetaan tarkemmin tätä menetelmää. On myös huomattava, että aineen tiputus henkitorveen voi joissakin tapauksissa olla hyväksyttävä vaihtoehto. Pitkäaikaisaltistukset suunnitellaan yleensä ihmisten todennäköisen altistumistavan perusteella. Eläimet altistetaan hengityskammion tasapainotuksen jälkeen joko kuudeksi tunniksi päivittäin viitenä päivänä viikossa (jaksoittainen altistus) tai todennäköisen ympäristöaltistustavan perusteella 22-24 tuntia vuorokaudessa viikon jokaisena päivänä (jatkuva altistus), jolloin eläimillä on noin tunnin mittainen ruokailuaika samaan aikaan joka päivä. Kummassakaan tapauksessa eläimien saaman testattavan aineen pitoisuutta ei yleensä muuteta. Jaksoittaisen ja jatkuvan altistuksen pääasiallinen erona on, että jaksoittaisessa altistuksessa eläimillä on 17-18 tuntia aikaa toipua päivittäisestä altistuksesta ja viikonloppuisin vielä tätäkin pidempi toipumisaika. Jaksoittaisen tai jatkuvan altistuksen valinta riippuu tutkimuksen tavoitteista ja siitä, mitä ihmisten altistumistapaa simuloidaan. Tietyt tekniset vaikeudet on joka tapauksessa otettava huomioon. Esimerkiksi eläinten syöttäminen ja juottaminen altistuksen aikana ja monimutkaisemmat (ja luotettavammat) laitteet aerosolien ja höyryn tuottamiseksi sekä niiden valvonta voivat aiheuttaa ongelmia, jotka ovat merkittävämpiä kuin ympäristöolosuhteiden simuloimiseksi valitun jatkuvan altistuksen edut. Altistuskammiot Eläinten testauksiin käytetään inhalaatiokammioita, joiden dynaamisessa ilmavirrassa ilma vaihtuu vähintään 12 kertaa tunnissa, jotta hapen ja tasaisesti jakautuneen altistusaineen saanti voidaan varmistaa. Testattavalle aineelle tapahtuvaa altistusta lukuunottamatta kontrolli- ja altistuskammioiden on oltava rakenteeltaan yhdenmukaisia. Kammiossa on yleensä lievä negatiivinen paine, jotta testattavaa ainetta ei pääsisi vuotamaan ympäristöön. Kammioissa on oltava riittävästi tilaa eläimille. Yleissääntönä kammion ilman pitämiseksi vakaana on, että koe-eläinten viemä tila on korkeintaan 5 % kammion tilavuudesta. Seuraavat mittaukset tai valvontatoimenpiteet on suoritettava: i) Ilman virtaus: ilman virtausnopeutta kammion läpi tulee tarkkailla jatkuvasti, ii) Pitoisuus: päivittäisen altistuksen aikana pitoisuuden vaihtelun saa olla korkeintaan ± 15 % keskiarvosta. Tutkimuksen koko kestoajan päivittäiset pitoisuudet on pidettävä mahdollisimman vakaana, iii) Lämpötila ja kosteus: kun jyrsijöitä käytetään koe-eläiminä, lämpötilan on oltava 22 ± 2 °C ja kammion kosteuden 30-70 %, paitsi milloin testattavaa ainetta suspensoidaan veden avulla kammion ilmaan. Molempia arvoja on jatkuvasti tarkkailtava, iv) Hiukkasten koon mittaukset: kun testataan nestemäisiä tai kiinteitä aerosoleja, kammion ilmassa olevien hiukkasten koko on määritettävä. Aerosolihiukkasten on oltava kooltaan koe-eläinten hengitykselle sopivia. Näytteet kammion ilmasta on otettava eläinten hengitysalueelta. Otoksen on oltava edustava näyte testattavan aineen hiukkasten jakautumisesta ja gravimetrisesti myös kaikista aerosolin suspensiohiukkasista, vaikka suuri osa aerosolista ei joudu hengitykseen. Hiukkasten koosta on tehtävä analyysi useita kertoja niiden tuottoa säädettäessä ja sen jälkeen koe-eläinten altistuksen aikana niin usein kuin tarvitaan hiukkasten jakautumisen vakaana pysymisen varmistamiseksi. Tutkimuksen kesto Karsinogeenisuustesti kattaa suurimman osan koe-eläinten normaalista elinajasta. Koe päättyy hiiriä ja hamstereita testattaessa 18 kuukauden kuluttua ja rottia testattaessa 24 kuukauden kuluttua, mutta jos testattavat eläinkannat ovat pitkäikäisempiä ja/tai niille kehittyy hitaasti spontaaneja kasvaimia, koe on lopetettava 24 kuukauden kuluttua hiiri- ja hamsteritesteissä ja 30 kuukauden kuluttua rotan ollessa koe-eläimenä. Vaihtoehtoisesti näin pitkäaikaisen tutkimuksen lopettaminen on mahdollista silloin, kun pienimmän annoksen saaneessa ryhmässä tai kontrolliryhmässä on elossa enää 25 %. Sellaisen tutkimuksen päättyessä, jossa eri sukupuolien vasteessa on selkeä ero, kumpikin sukupuoli on arvioitava erikseen. Kun ainoastaan suurimman annoksen saanut ryhmä kuolee ennenaikaisesti selkeisiin myrkkyvaikutuksiin, tämän ei tarvitse merkitä tutkimuksen lopettamista, jos myrkyllisyysoireet eivät aiheuta vaikeuksia muissa ryhmissä. Negatiivinen tulos on hyväksyttävä, jos tutkimuksesta on menetetty korkeintaan 10 % jostakin ryhmästä autolyysin, kannibalismin tai hoito-ongelmien ja vähintään 50 % kaikkien ryhmien eläimistä on elossa 18 kuukauden kuluttua käytettäessä hiiriä tai hamstereita ja 24 kuukauden kuluttua, kun koe-eläiminä käytetään rottia. Testin suorittaminen Tarkkailu Eläinten päivittäisessä tarkkailussa on kiinnitettävä huomiota muutoksiin, joita tapahtuu karvapeitteessä ja ihossa, silmissä ja limakalvoissa sekä hengitys- ja verenkiertoelimissä, autonomisessa ja keskushermostossa, somatomotorisissa toiminnoissa sekä käyttäytymistavassa. Säännöllinen tarkkailu on tarpeen, jotta eläimiä ei menetettäisi kannibalismin, kudosten autolyysin tai hoitovirheiden vuoksi. Huonokuntoiset eläimet poistetaan ja niille suoritetaan ruumiinavaus. Kunkin eläimen osalta kirjataan kliiniset oireet sekä kuolleisuus. Kasvainten kehittymiseen on kiinnitettävä erityistä huomiota. Jokaisen paljain silmin tai käsin tunnustelemalla havaittavissa olevan kasvaimen toteamisaika, paikka, koko, ulkonäkö ja kehitys kirjataan. Ravinnon kulutus (ja veden kulutus, kun testattava aine annetaan juomavedessä) mitataan viikottain 13 ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen noin kolmen kuukauden välein, ellei eläinten terveydentila tai painon muutokset edellytä useampia määrityksiä. Kunkin eläimen paino kirjataan kerran viikossa tutkimusajan 13 ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen vähintään kerran neljässä viikossa. Kliiniset tutkimukset Hematologia Jos eläinten terveydentilan todetaan huonontuneen tutkimuksen kuluessa, näiden eläinten verenkuva on tutkittava. Koe-eläimistä otetaan verinäyte 12 ja 18 kuukauden kuluttua ja ennen eläinten lopettamista. Suurimman annoksen saaneen ryhmän ja kontrolliryhmän eläinten verenkuva tutkitaan. Pienempiä annoksia saaneiden ryhmien osalta verenkuva tutkitaan, jos suurimman annoksen ryhmästä erityisesti juuri ennen eläinten lopetusta otetuista näytteistä saadut tulokset tai patologiset löydökset edellyttävät sen tutkimista. Ruumiinavaus Kaikille, myös tutkimuksen kuluessa kuolleille tai huonokuntoisuuden vuoksi lopetetuille koe-eläimille suoritetaan ruumiinavaus. Kaikki paljain silmin havaittavat kasvaimet, vammoja tai kasvaimeksi epäiltyjä vaurioita sisältävät kohteet säilytetään. Seuraavat elimet ja kudokset on säilytettävä histopatologista tutkimusta varten: aivot, (sekä osia ytimestä/aivosillasta, pikkuaivokuori ja aivokuori), aivolisäke, kilpirauhanen/ lisäkilpirauhanen, kateenkorvakudosta, henkitorvi ja keuhkot, sydän, aortta, sylkirauhaset, maksa, perna, munuaiset, lisämunuaiset, haima, sukupuolirauhaset, kohtu, muut sukupuolielimet, iho, ruokatorvi, mahalaukku, pohjukaissuoli, ohutsuoli, umpisuoli, paksusuoli, peräsuoli, virtsarakko, tyypillinen imusolmuke, naaraan rintarauhanen, reiden lihaksistoa, ääreishermo, rintalasta luuytimineen, reisiluu (nivelineen), selkärankaa kolmesta kohdasta (kaulasta, henkitorven keskiosasta ja lantiosta) sekä silmät. Keuhkojen ja virtsarakon täyttäminen fiksatiivilla on näiden elinten paras säilytystapa. Keuhkojen täyttäminen hengitystietutkimuksissa on välttämätöntä, jotta tarvittava histopatologinen tutkimus voidaan suorittaa. Kun altistumista tutkitaan hengitysteiden kautta, koko hengityselimistö mukaan lukien nenä, nielu ja kurkunpää, on säilytettävä. Histopatologinen tutkimus a) Tutkimuksen aikana kuolleiden ja lopetettujen eläinten sekä suurimman annoksen saaneen ryhmän ja kontrolliryhmän eläinten elimille ja kudoksille on tehtävä täydellinen histopatologinen tutkimus. b) Kaikki paljain silmin havaittavat kasvaimet tai kasvaimiksi epäillyt vauriot on tutkittava mikroskooppisesti kaikkien ryhmien osalta. c) Jos suurimman annoksen saaneessa ryhmässä ja kontrolliryhmässä esiintyvien uudismuodostumien määrä poikkeaa huomattavasti toisistaan, muiden ryhmien vastaaville elimille tai kudoksille on suoritettava histopatologinen tutkimus. d) Jos suurimman annoksen saaneessa ryhmässä eloonjääneiden osuus on huomattavasti kontrolliryhmää pienempi, seuraavaksi alempi ryhmä on tutkittava perusteellisesti. e) Jos testi osoittaa, että suurimman annoksen saaneessa ryhmässä on syntynyt uudiskasvainvasteeseen vaikuttavia myrkky- tai muita vaikutuksia, lähinnä alempi annostaso on tutkittava perusteellisesti. 2 TULOKSET Tulokset esitetään taulukkomuodossa, josta ilmenevät kuhunkin testiryhmään kuuluvien eläinten lukumäärä kokeen alussa, kasvaimia kehittäneiden eläinten määrä, kasvaimien toteamisajankohta ja eläinten lukumäärä, joilla todettiin kasvaimia niiden lopettamisen jälkeen. Tulosten merkitsevyys arvioidaan jotakin tilastollista menetelmää käyttäen. Kaikkia tunnettuja tilastointimenetelmiä voidaan käyttää. 3 RAPORTOINTI 3.1 Tutkimusselostus Tutkimusselostuksen on, jos mahdollista, sisällettävä seuraavat tiedot: - eläinlaji, kanta, hankintapaikka, ympäristöolosuhteet, ruokavalio, - koeolosuhteet, Altistamislaitteen kuvaus: merkki, tyyppi, mitat, ilmanlähde, hiukkasten ja aerosolien tuottamistapa, ilmastointitapa, poistoilman käsittelytapa ja eläinten sijainti koekammiossa altistamisen aikana. Lämpötilan, kosteuden, hiukkasten koon ja aerosolin pitoisuuden mittaustapa on mainittava. Altistamistiedot: Altistamistiedot laaditaan taulukon muotoon, jossa esitetään keskiarvo ja poikkeamat (esim. keskihajonta) ja seuraavat tiedot: a) ilmavirran nopeus inhalaatiolaitteessa, b) ilman lämpötila ja kosteus, c) nimellispitoisuudet (inhalaatiolaitteeseen asetetun testattavan aineen kokonaismäärä jaettuna ilman tilavuudella), d) käytetty liuotin, e) todelliset pitoisuudet hengitysalueella, f) hiukkasten keskikoko (tarvittaessa), - annostasot (mukaan lukien liuotin, mikäli sitä on käytetty) - selostus kasvainten esiintymisestä sukupuolen ja kasvaimen laadun perusteella, - eläinten kuolinaika tutkimuksen kuluessa ja eloonjääneet sen päätyttyä, - myrkkyvastetulokset sukupuolen ja annostason perusteella, - selostus myrkyllisyysoireista ja muista vaikutuksista, - poikkeavuuksien toteamisaika ja kehittyminen, - ruoki