Neljäs komission direktiivi 73/46/ETY annettu 5 päivänä joulukuuta 1972 yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten



Virallinen lehti nro L 083 , 30/03/1973 s. 0021 - 0034

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 5 s. 0115

Kreikank. erityispainos: Luku 03 Nide 9 s. 0114

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 5 s. 0115

Espanjank. erityispainos: Luku 03 Nide 6 s. 0230

Portugalink. erityispainos: Luku 03 Nide 6 s. 0230



NELJÄS KOMISSION DIREKTIIVI annettu 5 päivänä joulukuuta 1972 yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten (73/46/ETY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 20 päivänä heinäkuuta 1970 annetun neuvoston direktiivin(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna 20 päivänä heinäkuuta 1972 annetulla direktiivillä 72/275/ETY(2), ja erityisesti sen 2 artiklan, sekä katsoo, että mainitussa direktiivissä säädetään rehujen virallisen tarkastuksen suorittamisesta yhteisön näytteenotto- ja määritysmenetelmiä käyttäen sen tarkastamiseksi, että rehujen laatua ja koostumusta koskevat lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten vaatimukset tulevat täytetyksi, useita yhteisön määritysmenetelmiä on jo vahvistettu 15 kesäkuuta 1971 annetulla direktiivillä 71/250/ETY(3), 18 päivänä marraskuuta 1971 annetulla direktiivillä 71/393/ETY(4) ja 27 päivänä huhtikuuta 1972 annetulla direktiivillä 72/199/ETY(5); työ on tämän jälkeen edistynyt siinä määrin, että olisi hyväksyttävä neljäs ryhmä menetelmiä, ja tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän rehukomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN: 1 artikla Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen kosteus- sekä rehujen magnesium- ja raakakuitupitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti. Tämän direktiivin liitteessä I esitettyihin menetelmiin sovelletaan 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetun ensimmäisen komission direktiivin 71/250/ETY liitteessä olevassa 1 osassa (Johdanto) olevia yleisiä määräyksiä. 2 artikla Jäsenvaltioiden on vaadittava, että rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät retinoli- (A-vitamiini), tiamiini- (aneuriini, B1-vitamiini), askorbiini- ja dehydroaskorbiinihappo (C-vitamiini) -pitoisuusmääritykset suoritetaan tämän direktiivin liitteessä II esitettyjen menetelmien mukaisesti. Tämän direktiivin liitteessä II esitettyihin menetelmiin on sovellettava 15 päivänä kesäkuuta 1971 annetun ensimmäisen komission direktiivin 71/250/ETY liitteessä olevan 1 osan (Johdanto) yleisiä määräyksiä, lukuun ottamatta näytteen esikäsittelyä koskevia määräyksiä. 3 artikla Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset tai hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1 päivänä tammikuuta 1974. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä. 4 artikla Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 5 päivänä joulukuuta 1972. Komission puolesta Puheenjohtaja S. L. MANSHOLT (1) EYVL N:o L 170, 3.8.1970, s. 2 (2) EYVL N:o L 171, 29.7.1972, s. 39 (3) EYVL N:o L 155, 12.7.1971, s. 13 (4) EYVL N:o L 279, 20.12.1971, s. 7 (5) EYVL N:o L 123, 29.5.1972, s. 6 LIITE I 1. ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus. 2. Periaate Näyte kuivataan vakiopainoon 103 °C:ssa. Painohäviö määritetään punnitsemalla. 3. Välineistö 3.1 Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka läpimitta on 8 9 cm ja jonka korkeus on noin 3 cm. 3.2 Elohopealämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 °C:sta ainakin 110 °C:seen ja jonka pituus on noin 10 cm. 3.3 Hiekkahaude tai sähkölevy. 3.4 Eksikkaattori, joka sisältää tehokasta kuivausainetta. 3.5 Analyysivaaka. 4. Menettely Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 °C:n noin 7 minuutissa. Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 °C. Sekoitusta jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa. Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 °C:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 °C:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa. >TAULUKON PAIKKA> 5. Tulosten laskeminen Kosteuspitoisuus, joka ilmoitetaan prosenttina näytteestä, saadaan kaavasta: (M1 M2) 7 >NUM>100 >DEN>M0 jossa: M0 = näytteen paino grammoina, M1 = astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta, M2 = astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen. Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä "alle 0,05 %". Toistettavuus Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero ei saa olla yli 0,05 %. 2. MAGNESIUMIN MÄÄRITYS - atomiabsorptiospektrofotometrisesti - 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää magnesiumin määrä rehuissa. Se soveltuu erityisesti alle 5 %:n magnesiumpitoisuuksien määrittämiseen. 2. Periaate Näyte poltetaan tuhkaksi, joka liuotetaan laimeaan kloorivetyhappoon. Jos näyte ei sisällä orgaanisia aineita, se liuotetaan suoraan laimeaan kloorivetyhappoon. Liuos laimennetaan ja magnesiumpitoisuus määritetään atomiabsorptiospektrofotometrisesti 285,2 nm:n aallonpituudella vertaamalla standardiliuoksiin. 3. Reagenssit 3.1 Kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,16. 3.2 Väkevä kloorivetyhappo, analyysilaatua, tiheys 1,19. 3.3 Magnesiumnauha tai -lanka tai magnesiumsulfaattiheptahydraatti, joka on kuivattu huoneen lämpötilassa. 3.4 Strontiumsuolaliuos (kloridi tai nitraatti), jonka pitoisuus on 2,5 % (w/v) strontiumia (= 76,08 g SrCl2 7 6 H2O, analyysilaatua, tai 60,38 g Sr(NO3)2, analyysilaatua). 3.5 Magnesiumin standardiliuos: punnitaan mg:n tarkkuudella 1 g magnesiumia (3.3), josta on tarkoin poistettu siinä ennen ollut oksidikerros, tai vastaava määrä (10,143 g) magnesiumsulfaattiheptahydraattia (3.3). Siirretään se 1 000 ml:n mittapulloon, lisätään 80 ml kloorivetyhappoa (3.1), annetaan sen liueta ja täytetään 1 000 ml:ksi vedellä. 1 ml tätä liuosta sisältää 1 000 mg magnesiumia. 4. Välineistö 4.1 Platina-, kvartsi- tai posliinipolttoupokkaita. 4.2 Termostaattisäädöllä varustettu muhveliuuni. 4.3 Atomiabsorptiospektrofotometri. 5. Menettely 5.1 Näyteliuoksen valmistaminen 5.1.1 Yksinomaan mineraalipitoisista aineista koostuvat rehut Punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä 500 ml:n vetoiseen mittapulloon ja lisätään 250 300 ml vettä. Lisätään 40 ml kloorivetyhappoa (3.1), kuumennetaan kiehuvaksi ja annetaan nesteen kiehua varovasti 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan kuivaan dekantterilasiin kuivan laskostetun suodattimen läpi. Heitetään pois ensimmäiset 30 ml suodoksesta. Piin esiintyessä käsitellään 5 g näytettä riittävällä määrällä (15 30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdutetaan kuivaksi vesihauteella ja viedään yhdeksi tunniksi lämpökaappiin, jonka lämpötila on 105 °C. Suoritusta jatketaan 5.1.2 kohdan kolmannesta virkkeestä. 5.1.2 Pääasiassa mineraalipitoisista aineksista koostuvat rehut Punnitaan milligramman tarkkuudella 5 g näytettä upokkaaseen ja poltetaan näyte tuhkaksi 550 °C:ssa muhveliuunissa, kunnes muodostuu tuhkaa, jossa ei ole hiilipitoisia hiukkasia. Annetaan jäähtyä. Piin poistamiseksi tuhkaan lisätään riittävä määrä (15 30 ml) kloorivetyhappoa (3.2), haihdutetaan kuivaksi vesihauteella ja viedään lämpökaappiin 105 °C:seen yhden tunnin ajaksi. Jäännös käsitellään 10 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1) ja se siirretään 500 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä. Annetaan tämän jäähtyä ja täytetään pullo vedellä. Sekoitetaan ja suodatetaan kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi. Ensimmäiset 30 ml suodosta heitetään pois. 5.1.3 Pääasiassa orgaanisista aineista koostuvat rehut Upokkaaseen punnitaan mg:n tarkkuudella 5 g näytettä ja poltetaan 550 °C:ssa muhveliuunissa tuhkaksi, jossa ei ole hiilipitoisia partikkeleita. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.2), haihdutetaan kuivaksi vesihauteella ja kuivataan tämän jälkeen yhden tunnin ajan 105 °C:ssa lämpökaapissa, jotta pii saataisiin liukenemattomaan muotoon. Tuhka käsitellään 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1), siirretään 250 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä, sen lämpötila kohotetaan kiehumispisteeseen, jätetään jäähtymään ja mittapullo täytetään merkkiin vedellä. Sekoitetaan ja suodatetaan kuivaan astiaan kuivan laskostetun suodattimen läpi. Ensimmäiset 30 ml suodoksesta heitetään pois. 5.2 Atomiabsorptiomittaus Laimentamalla standardiliuos (3.5) vedellä valmistetaan ainakin viiden referenssiliuoksen sarja, joissa pitoisuudet kasvavat suhteessa spektrofotometrin optimaaliseen mittausalueeseen. Kuhunkin liuokseen lisätään 10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja tämän jälkeen täytetään 100 ml:ksi vedellä. Laimennetaan vedellä 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdasta saatua suodosta siten, että liuoksen magnesiumpitoisuus on referenssiliuosten konsentraatioiden rajoissa. Tämän liuoksen kloorivetyhappopitoisuus ei saa ylittää 0,4 N. Lisätään 10 ml strontiumsuolaliuosta (3.4) ja täytetään pullo 100 ml:ksi vedellä. Määritettävän liuoksen ja referenssiliuosten absorptio mitataan 285,2 nm:ssa. 6. Tulosten laskeminen Lasketaan näytteessä olevan magnesiumin määrä suhteessa referenssiliuoksiin. Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä. Toistettavuus Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaisen määrityksen tulosten ero ei saa olla yli 5 % magnesiumin määrästä. 3. RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuista sen rasvattoman orgaanisen aineksen määrä, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä. Jäännöstä kutsutaan perinteisesti raakakuiduksi. 2. Periaate Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään keittäen peräkkäin tietyn väkevyisillä rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erotetaan suodattamalla näyte asbestin kanssa, se pestään, kuivataan, punnitaan ja poltetaan tuhkaksi 900 °C:ssa. Tuhkaksi poltosta aiheutuva painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta. 3. Reagenssit 3.1 0,26 N rikkihappo. 3.2 Käsitelty asbesti: asbestin joukkoon, joka on laadultaan Goochin-upokkaassa käytettävää laatua, lisätään noin viisi kertaa sen painoa vastaava määrä laimeaa suolahappoa (1 tilavuusosa suolahappoa, tiheys 1,19 + 3 tilavuusosaa vettä). Seosta keitetään noin 45 minuuttia, sen annetaan jäähtyä ja se suodatetaan Büchner-suppilon läpi. Jäännöstä pestään ensin vedellä, kunnes pesuvesi ei enää ole suolahappoinen ja sen jälkeen asetonilla (3.6). Asbesti kuivataan lämpökaapissa ja sitä pidetään uunissa 900 °C:ssa kahden tunnin ajan. Sen annetaan jäähtyä ja se säilytetään suljetussa astiassa. Tällä tavalla käsiteltyä asbestia voidaan käyttää useita kertoja. Sen on sokeakokeen osalta täytettävä 5.1 kohdassa mainitut vaatimukset. 3.3 Kuohunestoaine (esim. silikoni). 3.4 0,23 N kaliumhydroksidiliuos. 3.5 0,5 N suolahappo. 3.6 Asetoni. 3.7 Dietyylieetteri. 4. Välineistö 4.1 Dekantterilaseja, joiden tilavuus on vähintään 600 ml ja joissa on mitta-asteikko vähintään 200 ml:n välein. 4.2 Posliinikiekkoja, joiden läpimitta on noin 80 mm ja paksuus noin 4 mm ja joissa on 32 noin 4 mm:n läpimittaista reikää. 4.3 Kumitulpalla varustettuja imupulloja, joiden tilavuus on noin 2 l, ja joissa on mitta-asteikko 800 ml:n kohdalla ja jotka voidaan yhdistää 120 mm:n läpimittaisiin lasisuppiloihin. 4.4 Suodatinlevyjä, joiden läpimitta on noin 40 mm ja paksuus noin 4 mm ja joiden reunat ovat siten vinot, että ne sopivat suppilon kartioon (4.3). Levyissä tulee olla 16 noin 4 mm:n läpimittaista reikää ja ne on peitetty metalliverkolla, jonka silmäkoko on noin 1 mm. Sekä levyjen että verkon on oltava happoja ja emäksiä kestävää materiaalia. 4.5 Platina- tai kvartsiupokkaita. 4.6 Termostaattisäätöinen muhveliuuni. 4.7 Eksikkaattori 4.8 Asbestisuodatin: 2,0 g asbestia (3.2) suspensoidaan 100 ml:aan vettä, joka suodatetaan vakuumissa käyttäen metalliverkolla varustettua suodatinlevyä (4.4), joka on yhdistetty imupullon suodatinsuppiloon (4.3). Suodos otetaan talteen ja se suodatetaan vielä kerran saman suodattimen läpi. Suodos heitetään pois. 5. Menettely Dekantterilasiin (4.1) punnitaan mg:n tarkkuudella 3 g näytettä ja 2 g käsiteltyä asbestia (3.2), lisätään 200 ml rikkihappoa (3.1) ja muutama pisara kuohunestoainetta (3.3). Seoksen lämpötila kohotetaan nopeasti kiehumapisteeseen ja sen annetaan kiehua tarkalleen 30 minuuttia. Tilavuuden pitämiseksi vakiona dekantterilasin päälle asetetaan jäähdytyslaitteeksi esim. 500 ml:n pyöreäpohjainen keittokolvi, jossa kierrätetään kylmää vettä. Seoksen kiehuminen lopetetaan lisäämällä noin 50 ml kylmää vettä ja se suodatetaan välittömästi vakuumia käyttäen asbestisuodattimen läpi, joka on valmistettu aikaisemmin siten kuin 4.8. kohdassa esitetään. Jäännös pestään viidellä noin 100 ml:n erällä kiehuvaa vettä siten, että suodoksen lopulliseksi tilavuudeksi tulee 800 ml. Jäännös siirretään kvantitatiivisesti dekantterilasiin (4.1), johon on ensin asetettu posliinikiekko (4.2) säätelemään kiehumista. Siihen lisätään 200 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4). Lämpötila nostetaan nopeasti kiehumispisteeseen ja seoksen annetaan kiehua tarkalleen 30 minuuttia. Siihen lisätään noin 50 ml kylmää vettä ja se suodatetaan välittömästi vakuumia käyttäen uuden asbestisuodattimen läpi, joka on valmistettu aiemmin 4.8 kohdan mukaan. Jäännös pestään kiehuvalla vedellä, kunnes pesuvesi on neutraalia (todetaan lakmuspaperilla), sen jälkeen kolme kertaa asetonilla (3.6) (kaikkiaan noin 100 ml asetonia). Jäännös siirretään kvantitatiivisesti polttoupokkaaseen (4.5), kokkareet hajotetaan tarvittaessa ja sen annetaan kuivua vakiopainoon kuivauskaapissa, jonka lämpötila on 130 °C. Upokkaan sisältöineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa (4.7) ja se punnitaan nopeasti. Upokas asetetaan muhveliuuniin (4.6) ja sen sisältö poltetaan tuhkaksi pitämällä upokasta uunissa 30 minuuttia 900 °C:ssa. Upokkaan sisältöineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa (4.7) ja se punnitaan nopeasti. Sokeakoe tehdään käyttäen samaa menettelyä käsitellylle asbestille (3.2), mutta ilman näytettä. Painohäviö, joka saadaan poltettaessa 6 g asbestia, ei saa olla yli 10 mg. 6. Tulosten laskeminen Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti: >NUM>(a b) 7 100 >DEN>3 jossa: a = näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö, b = sokeakokeen polttamisesta aiheutuva painohäviö Toistettavuus Kahden samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli: 0,3 prosenttiyksikköä, kun raakakuitupitoisuus on alle 10 %:n; 3 % raakakuitupitoisuuden määrästä, kun sen määrä on vähintään 10 %. 7. Huomautuksia 7.1 Rehuista, jotka sisältävät yli 10 % öljyjä ja rasvoja, on rasva poistettava ennen analyysiä dietyylieetterillä (3.7). Tämän suorittamiseksi näytettä (3 g, joka on punnittu mg:n tarkkuudella) huuhdellaan kolme kertaa noin 50 ml:lla dietyylieetteriä (3.7) asbestisuodattimella (4.8) ja eetteri suodatetaan pois varovasti vakuumia käyttäen. Näyte, josta rasva on poistettu, sekä asbesti siirretään kvantitatiivisesti dekantterilasiin (4.1) ja määritystä jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla. 7.2 Rehuista, jotka sisältävät öljyjä ja rasvoja ja joita ei voida uuttaa suoraan, on rasva poistettava siten kuin 7.1 kohdassa esitetään, ja niistä on poistettava rasva vielä uudelleen happokäsittelyn jälkeen, kun happo on pesty jäännöksestä. Tämän suorittamiseksi jäännöstä pestään kolme kertaa asetonilla (3.6) (yhteensä 100 ml) ja sen jälkeen kolme kertaa 50 ml:lla dietyylieetteriä (3.7). Tämän jälkeen jäännös siirretään kvantitatiivisesti dekantterilasiin (4.1) ja analyysiä jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla (käsittely kaliumhydroksidiliuoksella). 7.3 Jos rehuissa on runsaasti kalsiumia (yli 2 % kalsiumia), näyte (3 g, mg:n tarkkuudella punnittuna) punnitaan dekantterilasiin (4.1), johon lisätään 100 ml 0,5 N suolahappoa (3.5). Seosta pidetään viileässä viiden minuutin ajan, jonka jälkeen se suodatetaan välittömästi ja pestään kylmällä vedellä. Suodattamisen helpottamiseksi lisätään 2,0 g asbestia, joka on tarkoitettu käytettäväksi rikkihappokeitossa. Jos suodatus osoittautuu vaikeaksi, suspensiota laimennetaan asetonilla (3.6). Sen jälkeen jatketaan 5 kohdassa esitetyllä tavalla. LIITE II 1. RETINOLIN (A-VITAMIININ) MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää retinolin (A-vitamiinin) määrä rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 10 000 ky/kg suuria väriainemääriä sisältävissä rehuissa ja 4 000 ky/kg muissa tapauksissa(1). Tuotteet luokitellaan kahteen ryhmään niiden oletetun retinolipitoisuuden perusteella: A-ryhmä: pitoisuus alle 200 000 ky/kg; B-ryhmä: pitoisuus vähintään 200 000 ky/kg. 2. Periaate Näyte hydrolysoidaan kuumassa kaliumhydroksidi-etanoli-liuoksessa ja antioksidantin läsnäollessa tai typpiatmosfäärissä. Seos uutetaan 1,2-dikloorietaanilla. Uute haihdutetaan kuivaksi ja käsitellään petrolieetterillä. Liuokselle suoritetaan kromatografia aluminiumoksidipylväässä (B-ryhmän tuotteille tarvitaan kromatografia vain tietyissä tapauksissa). A-ryhmän retinolipitoisuus määritetään mittaamalla Carr-Price-reaktion perusteella muodostunut värillinen kompleksi spektrofotometrisesti 610 nm:ssä; B-ryhmän retinoli määritetään spektrofotometrisesti UV:ssa 325 nm:ssä. 3. Reagenssit a) A- ja B-ryhmän tuotteiden analysoimiseksi käytetyt reagenssit 3.1 96 % (v/v) etanoli 3.2 10 % (w/v) natriumaskorbaattiliuos, analyysilaatua, tai 3.3 puhdistettu typpi. 3.4 50 % (w/v) kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua. 3.5 1 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua. 3.6 0,5 N kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua. 3.7 1,2-dikloorietaani, analyysilaatua. 3.8 Petrolieetteri, kiehumisväli 30 50 °C. Puhdistetaan tarvittaessa seuraavasti: sekoitetaan 1 000 ml:aan petrolieetteriä 20 ml eriä väkevää rikkihappoa, kunnes happo pysyy värittömänä. Poistetaan happo ja pestään petroolieetteri 500 ml:lla vettä, sitten kaksi kertaa 250 ml:lla 10-%:ista (w/v) natriumhydroksidiliuosta ja lopuksi kolme kertaa 500 ml:lla vettä. Poistetaan vesifaasi, petrolieetteri kuivataan yhden tunnin ajan aktiivihiilen ja vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan ja tislataan. 3.9 Aluminiumoksidi, joka on standardoitu Brockmannin mukaan: hehkutetaan kahdeksan tunnin ajan 750 °C:ssa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja säilytetään ruskeassa hioslasipullossa. Ennen käyttöönottoa punnitaan ruskeaan pulloon 10 g aluminiumoksidia ja 0,7 ml vettä, suljetaan tulpalla, ja pulloa kuumennetaan viiden minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella ravistellen. Annetaan jäähtyä. Todennetaan näin valmistetun alumiinin aktiivisuus suorittamalla tunnetulle retinolimäärälle (3.17) (noin 500 ky) 5.3 ja 5.4 kohdan mukaiset vaiheet. 3.10 Emäksinen aluminiumoksidi, aktiivisuusaste 1 (Woelm, Merck tai vastaava). 3.11 Puhdas dietyylieetteri. Poistetaan peroksidit ja jäljellä oleva vesi kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä (3.10) (25 g aluminiumoksidia 250 ml:n dietyylieetterierää kohti). 3.12 Petrolieetteriliuokset (3.8), joissa on 4, 8, 12, 16 ja 20 % (v/v) dietyylieetteriä (3.11).3.13 0,5 M natriumsulfidiliuos 70 % (v/v) glyseriinissä, valmistettu analyysilaatua olevasta natriumsulfidista. b) yksinomaan A-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit 3.14 Bentseeniä, analyysilaatua. 3.15 Kloroformi, analyysilaatua. Poistetaan etanoli, fosgeeni ja jäljellä oleva vesi kromatografisesti emäksisessä aluminiumoksidipylväässä (3.10) (50 g aluminiumoksidia 200 ml kloroformia kohti; on suositeltavaa kromatografoida eluaatin ensimmäinen 50 ml toisen kerran). 3.16 Carr-Price-reagenssi: sekoitetaan noin 25 g antimonitrikloridia, analyysilaatua (jota on säilytetty eksikkaattorissa), 100 ml:aan kloroformia (3.15) kunnes liuos on kylläistä. Pieni antimonitrikloridisakka ei aiheuta vaikeuksia. Lisätään 2 ml etikkahappoanhydridiä analyysilaatua. Seos säilytetään jääkaapissa ruskeassa hioslasipullossa. Liuosta voidaan säilyttää useita viikkoja. 3.17 Retinoli - standardoitu spektrofotometrisesti. c) yksinomaan B-ryhmän tuotteiden määrittämiseen käytetyt reagenssit 3.18 Isopropanoli, kromatografiaa varten. 4. Välineistö 4.1 Vesihaude. 4.2 Tyhjiöhaihdutuslaitteisto varustettuna eri kokoisilla pyöreäpohjaisilla kolveilla. 4.3 Lasista valmistettuja kromatografiaputkia (pituus 300 mm; sisäläpimitta noin 13 mm). 4.4 Spektrofotometri, jossa käytetään 10 mm:n kyvettejä. UV-alueella suoritettavissa mittauksissa käytetään kvartsikyvettejä. 4.5 UV-lamppuja, jotka soveltuvat käyttöön 365 nm:ssä. 5. Menettely >TAULUKON PAIKKA> 5.1 Tutkittava näyte Punnitaan hienoksi jauhetusta näytteestä otaksutun retinolipitoisuuden perusteella 0,1 1,0 g konsentraattia (pitoisuus suurempi kuin 20 000 ky/g); 3,0 5,0 g esiseosta (sisältää noin 400 20 000 ky/g); 10 20 g mineraaliseosta; 30 g A-ryhmän tuotteita Tutkittava näyte laitetaan välittömästi 500 ml:n hiostulpalliseen pulloon. 5.2 Hydrolyysi ja uutto(2) Näytteeseen lisätään ensin 40 ml etanolia (3.1), sitten 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.2)(3), 10 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) ja lopuksi 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.13). Refluksoidaan 30 minuuttia 70 80 °C:ssa ja annetaan seoksen jäähtyä virtaavassa vedessä. Lisätään 50 ml etanolia (3.1) ja 100 ml 1,2-dikloorietaania (3.7) pipetoimalla. Ravistetaan voimakkaasti ja supernatantti dekantoidaan dekantterilasiin. Lisätään dekantterilasiin 150 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.5), ravistellaan 10 sekuntia ja annetaan seoksen seistä, kunnes kerrokset ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerros (alempi kerros) dekantointisäiliöön, lisätään 40 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.6), ravistellaan 10 sekunnin ajan ja annetaan tämän seistä, kunnes kerrokset ovat erottuneet. Otetaan dikloorietaanikerros talteen dekantointisäiliöön ja pestään 6 8 kertaa 40 ml:n erillä vettä, kunnes tämä on vapaa alkalista (fenoliftaleiinitesti). Dikloorietaanikerros otetaan talteen ja loput jäljelle jääneestä vedestä poistetaan suodatinpaperilla. Erä liuosta haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä käyttäen vesihaudetta, jonka lämpötila on 40 °C. Jäännös käsitellään nopeasti 5 ml:lla petrolieetteriä (3.8). A-ryhmän tuotteiden osalta kromatografia suoritetaan 5.3.1 kohdan mukaan. B-ryhmän tuotteiden osalta liuos siirretään 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin petrolieetterillä (3.8), sekoitetaan ja mitataan optinen tiheys 5.4.2 kohdan mukaan. 5.3 Kromatografia 5.3.1 A-ryhmän tuotteet Kromatografiaputki (4.3) täytetään 200 mm:n korkeuteen 10 g:lla aluminiumoksidia (3.9), joka on aiemmin lietetty petrolieetteriin (3.8). Putkeen pipetoidaan 5.2 kohdassa saatu liuos, ja tähän lisätään välittömästi 20 ml petrolieetteriä (3.8). Eluoidaan peräkkäin 10 ml:n erillä petrolieetteriä, joissa on 4, 8, 12, 16 ja 20 % dietyylieetteriä (3.12), joko normaalipaineessa tai alipaineessa virtausnopeuden ollessa 2 3 pisaraa sekunnissa. Karoteeni eluoituu ensin(4). Retinoli eluoituu tavallisesti petrolieetteriliuoksella, jossa on 20 % dietyylieetteriä (3.12). Eluoitumista seurataan UV-valossa (pylvään säteilytys lyhyesti elohopealampulla). Fluoresoiva retinolivyöhyke erottuu selvästi keltaisista ksantofyllivyöhykkeistä, jotka tulevat tämän jälkeen. Retinolia sisältävä eluoitunut fraktio otetaan talteen erlenmeyerpulloon. 5.3.2 B-ryhmän tuotteet Kromatografointi on suoritettava vain, jos 5.4.2 kohdassa saadut optisen tiheyden mittaukset eivät ole 5.4.2 kohdassa esitettyjen vaatimusten mukaisia. Jos kromatografointi osoittautuu tarpeelliseksi, kromatografiapylvääseen pipetoidaan erä petrolieetteriin valmistettua liuosta, joka on saatu 5.2 kohdassa ja joka sisältää noin 500 k.y. retinolia, ja kromatografointi suoritetaan kuten 5.3.1 kohdassa esitetään. 5.4 Optisen tiheyden mittaus 5.4.1 A-ryhmän tuotteet Eluaatti, joka sisältää 5.3.1 kohdan mukaisesti saadun retinolin, haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä. Jäännös käsitellään 2 ml:lla bentseeniä (3.14). Tästä liuoksesta otetaan 0,3 ml:a ja siihen lisätään 3 ml Carr-Price-reagenssia (3.16). Tästä kehittyy sininen väri. Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 610 nm:ssä tarkalleen 30 sekuntia reaktion alkamisesta. Retinolipitoisuus määritetään standardikäyrän avulla, joka on saatu nousevia retinolistandardipitoisuuksia sisältävien bentseeniliuoksien perusteella. Bentseeniliuokset on käsitelty Carr-Pricereagenssilla (2 16 IU retinolistandardia (3.17), 0,3 ml:ssa bentseeniä (3.14) + 3 ml:ssa Carr-Price-reagenssia (3.16)). Standardikäyrä on tarkistettava säännöllisesti ja usein käyttäen standardia ja juuri valmistettua Carr-Price-reagenssiliuosta. 5.4.2 B-ryhmän tuotteet Otetaan erä 5.2 kohdan mukaisesti saatua petrolieetteriin valmistettua liuosta, joka sisältää noin 200 ky retinolia. Tämä haihdutetaan kuivaksi tyhjiössä ja jäännös käsitellään 25 ml:lla isopropanolia (3.18). Optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä 325, 310 ja 334 nm:ssä. Absorptiomaksimi sijaitsee 325 nm:ssä. Liuoksen retinolipitoisuus lasketaan seuraavasti: E325 7 18,30 = ky retinolia/ml Kuitenkin on optisten tiheyksien suhteiden E310 : E325 ja E334 : E325 oltava 6 : 7 = 0,857. Jos jokin näistä suhteista eroaa huomattavasti tästä arvosta ( 0,880), on ennen optisten tiheyksien mittausta suoritettava kromatografointi 5.3.2 kohdassa esitetyn menetelmän mukaisesti. Jos kromatografoinnin jälkeen suoritettava optisten tiheyksien mittaus osoittaa, että edellä mainitut suhteet vielä eroavat huomattavasti arvosta 0,857 ( 0,880), on mittaus suoritettava A-ryhmän tuotteille annetun menetelmän mukaisesti. 6. Tulosten laskeminen Näytteen retinolipitoisuus lasketaan huomioiden tutkittavan näytteen paino ja määrityksen kuluessa suoritetut laimennukset. Tulokset ilmoitetaan ky:nä retinolia rehukiloa kohti tai konsentraatti- tai esiseoskiloa kohti. Toistettavuus Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen ero ei saa olla yli: - 20 % retinolin määristä, jotka ovat alle 75 000 ky/kg; - 15 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 75 000 150 000 ky/kg; - 10 % retinolin määristä, jotka ovat välillä 150 000 250 000 ky/kg; - 25 000 ky, kun pitoisuudet ovat välillä 250 000 500 000 ky/kg; - 5 % retinolin määristä, jotka ovat suurempia kuin 500 000 ky/kg. 2. TIAMIININ (B1-VITAMIININ, ANEURIININ) MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä määritetään tiamiinin (aneuriinin, B1-vitamiinin) määrä rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg. 2. Periaate Liuos käsitellään kuumalla laimealla rikkihapolla ja hydrolysoidaan tämän jälkeen entsymaattisesti. Saatu liuos hapetetaan emäksisissä olosuhteissa. Muodostunut tiokromi uutetaan isobutanolilla ja määritetään fluorometrisesti. 3. Reagenssit 3.1 Tiamiinistandardiliuos, 100 µg/ml: liuotetaan 112,3 mg tiamiinihydrokloridia, joka on tätä ennen kuivattu tyhjiössä vakiopainoon, 1 000 ml:aan 0,2 N rikkihappoa (3.2). Liuos säilyy viileässä ja pimeässä yhden kuukauden ajan. 3.2 0,2 N rikkihappo. 3.3 Puhdasta natriumbisulfiittia. 3.4 20 % (w/v) kaliumferrisyanidiliuos, analyysilaatua. 3.5 25 % (w/v) kaliumhydroksidiliuos, analyysilaatua. 3.6 Hapetusseos: sekoitetaan 2 ml kaliumferrisyanidiliuosta (3.4) 48 ml:aan kaliumhydroksidiliuosta (3.5). Tämä liuos ei säily neljää tuntia kauempaa. 3.7 Isobutanoli, analyysilaatua. 3.8 2,5 N natriumasetaattiliuos. 3.9 Monientsyymipreparaatti, joka sisältää proteaasia, fosfataasia ja amylaasia (esimerkiksi Clarase). 3.10 96 % (v/v) etanoli. 4. Välineistö 4.1 Vesihaude. 4.2 Sentrifugi (3 500 kierr./min) varustettuna 30 50 ml:n vetoisilla putkilla, joissa on lasihiostulpat. 4.3 Fluorometri. 5. Menettely 5.1 Entsymaattinen hydrolyysi Kahteen 250 ml:n mittapulloon A ja B punnitaan samat määrät hienoksi jauhettua näytettä, joka sisältää noin 100 µg tiamiinia, ja lisätään 125 ml rikkihappoa (3.2). Lisätään 1,0 ml standardiliuosta (3.1) (sisäinen standardi) ainoastaan pulloon A. Pulloja ravistellaan voimakkaasti, ne asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen 15 minuutiksi ja ravistellaan silloin tällöin. Annetaan mittapullojen jäähtyä noin 45 °C:seen. Kuhunkin pulloon lisätään 20 ml natriumasetaattiliuosta (3.8) ja 0,5 g entsyymien seosta (3.9) ja seisotetaan 20 minuuttia huoneen lämmössä. Lisätään 20 ml natriumasetaattiliuosta (3.8), täytetään merkkiin vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan. Suodokset A ja B otetaan talteen sitten, kun ensimmäiset 15 ml on heitetty pois. Valmistetaan seuraavat liuokset: 5.1.1 Referenssiliuos T Sentrifugiputkeen (4.2) pipetoidaan 5 ml suodosta A ja lisätään noin 10 g natriumbisulfiittia (3.3). Putki upotetaan kiehuvaan vesihauteeseen 15 minuutin ajaksi ja tämän jälkeen jäähdytetään huoneen lämpötilaan. 5.1.2 Liuokset A (sisäinen standardi) ja B (näyte) Pipetoidaan 5 ml suodosta A sentrifugiputkeen (4.2) ja 5 ml suodosta B toiseen sentrifugiputkeen (4.2). 5.2 Hapetus Liuoksiin T, A ja B lisätään 5 ml hapetusseosta (3.6) ja yhden minuutin kuluttua 10 ml isobutanolia (3.7). Asetetaan putkiin tulpat ja niitä ravistetaan voimakkaasti viiden sekunnin ajan. Annetaan seistä yhden minuutin ja sentrifugoidaan kerrosten erottamiseksi. Kustakin putkesta pipetoidaan 5 ml supernatanttina olevaa isobutanolikerrosta 25 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin etanolilla (3.10) ja homogenoidaan (= uutteet T, A ja B). 5.3 Fluoresenssimittaus Mittaukset suoritetaan aallonpituudella, jolla fluorometri antaa optimaalisen vasteen tiokromin fluoresenssiin. Heräteaallonpituus on noin 365 nm. Laite säädetään nollaan käyttäen uutetta T. Mitataan uutteiden A ja B fluoresenssin voimakkuus. 6. Tulosten laskeminen Näytteen tiamiinipitoisuus ilmoitettuna milligrammoissa kiloa kohti saadaan suhteesta: >NUM>a 7 b >DEN>(a b) c jossa: a = uutteen A (sisäinen standardi) fluoresenssin intensiteetti b = uutteen B (näyte) fluoresenssin intensiteetti; c = tutkittavan näytteen paino grammoina; d = tutkittavaan näytteeseen (sisäinen standardi) lisätyn tiamiinin määrä mikrogrammoina. Toistettavuus Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen ero ei saa olla yli: 10 % tiamiinin määrästä, joka on alle 500 mg/kg, ja 5 % tiamiinin määrästä, joka on vähintään 500 mg/kg. 3. ASKORBIINIHAPON JA DEHYDROASKORBIINIHAPON (C-VITAMIININ) MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä on mahdollista määrittää rehuissa, konsentraateissa ja esiseoksissa olevan askorbiini- ja dehydroaskorbiinihapon (C-vitamiinin) kokonaismäärä. Määrityksen alaraja on 5 mg/kg. Tuotteet luokitellaan kahteen ryhmään niiden oletetun C-vitamiinipitoisuuden perusteella: A-ryhmä: pitoisuus alle 10 g/kg; B-ryhmä: pitoisuus vähintään 10 g/kg 2. Periaate Näyte suspendoidaan laimeaan metafosforihappoliuokseen ja se uutetaan kloroformilla. Vesipitoinen faasi käsitellään 2,6-dikloorifenoli-indofenoliliuoksella askorbiinihapon muuttamiseksi dehydroaskorbiinihapoksi ja sen jälkeen 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuoksella. Muodostunut hydratsoni uutetaan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seoksella. Liuokselle suoritetaan kromatografia silikageelipylväässä, eluaatti haihdutetaan kuivaksi ja jäännös liuotetaan laimeaan rikkihappoon. Liuoksen optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 509 nm:ssä. A-ryhmän tuotteiden osalta pylväässä suoritetusta kromatografiasta saadulle eluaatille tehdään vielä levykromatografia hydratsonin eristämiseksi. 3. Reagenssit 3.1 0,05 % L-askorbiinihapon standardiliuos: liuotetaan 50 mg L-askorbiinihappoa, analyysilaatua, noin 20 ml:aan metafosforihappoliuosta (3.2) ja liuoksen tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä. Liuos valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.2 10 % (w/v) metafosforihappoliuos: 200 g metafosforihappoa, analyysilaatua, jauhetaan huhmaressa, liuotetaan veteen ja täytetään 2 000 ml:ksi vedellä. Liuos säilytetään 4 °C:ssa. Tämä liuos säilyy viikon. 3.3 Kloroformi, analyysilaatua. 3.4 0,5 % (w/v) 2,6-dikloorifenoli-indofenoliliuos, analyysilaatua, valmistetaan välittömästi ennen käyttöä. 3.5 Suodatusapu (S. ja S. N:o 121 tai tätä vastaava) 3.6 2 % (w/v) 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin happoliuos: liuotetaan 2 g 2,4-dinitrofenyylihyratsiinia 100 ml:aan laimeaa rikkihappoa (25 ml rikkihappoa, analyysilaatua, tiheys 1,84, laimennettu täyttämällä 100 ml:ksi vedellä). Viileässä säilytettynä tämä liuos säilyy yhden viikon. 3.7 Typpi, tai 3.8 Hiilidioksidi. 3.9 Etyyliasetaatin, analyysilaatua, jääetikan ja asetonin, analyysilaatua, seos: tilavuussuhteet 96/2/2. 3.10 Dikloorimetaanin, analyysilaatua, ja jääetikan seos: tilavuussuhteet 97/3.3.11 Silikageeli, raekoko 0,05 0,2 mm. 3.12 Stahl-laatua oleva silikageeli H, levykromatografiaa varten. 3.13 Laimea rikkihappo: 200 ml:n mittapulloon mitataan 105 ml vettä ja täytetään merkkiin rikkihapolla, analyysilaatua, tiheys 1,84. 3.14 Levykromatografian eluointiliuos: sekoitetaan 75 ml dietyylieetteriä, analyysilaatua, 25 ml etyyliasetaattia, analyysilaatua, ja 4,0 ml 96 % (w/v) etikkahappoa, analyysilaatua. Tehdään uudestaan 2 3 kromatografian suorituksen jälkeen. 4. Välineistö 4.1 Termostaatilla varustettu vesihaude, joka on asetettu 20 °C:n lämpötilaan. 4.2 Sentrifugi (3 500 kierr./min) varustettuna hiostulpallisilla 40 50 ml:n vetoisilla putkilla. 4.3 Pyöröhaihdutin, jossa käytetään 250 ml:n pulloja. 4.4 Lasista valmistettuja kromatografiaputkia (pituus: 100 mm, sisäläpimitta: 20 mm), joissa on sintterikiekko (esim. Allihn-putket). 4.5 Spektrofotometri tai kolorimetri, jossa on 10 mm:n kyvetit. 4.6 Levykromatografialaitteisto, jossa käytetään silikageelilevyjä (3.12), jotka on päällystetty 0,5 0,6 mm:n paksuuteen. (Valmiina hankittavat levyt ovat tarkoitukseen sopivia). Levyt kuivataan 2,5 3 tunnin ajan kuivauskaapissa 120 130 °C:ssa. Niiden annetaan jäähtyä ja pidetään eksikkaattorissa ainakin 24 tuntia ennen käyttöä. 4.7 Kuivauskaappi, jonka lämpötila on säädetty 120 130 °C:seen. 5. Menettely 5.1 Uutto Kahteen 250 ml:n mittapulloon (lasisilla hiostulpilla varustettuja) A ja B punnitaan erikseen yhtä suuret määrät hienojakoista näytettä, joka sisältää noin 200 µg C-vitamiinia. Lisätään vain A-pulloon 0,4 ml standardiliuosta (3.1) ja sekoitetaan varovasti ravistaen (sisäinen standardi). Kumpaankin pulloon lisätään 30 ml kloroformia (3.3) ja 25 ml metafosforihappoliuosta (3.2) 4 °C:ssa. Pulloja ravistellaan hetken ja seisotetaan 10 15 minuuttia. Lisätään 25 ml vettä, pullot varustetaan tulpilla, ravistellaan voimakkaasti 10 sekunnin ajan ja annetaan seistä 10 15 minuuttia vesihauteessa (4.1). Suoritetaan sentrifugointi vesipitoisen faasin erottamiseksi kloroformifaasista. Toimenpiteet vesipitoisille uutteille A (sisäinen standardi) ja B suoritetaan samanaikaisesti jäljempänä kuvatulla tavalla. 5.2 Hapetus Pipetoidaan 40 ml kohdassa 5.1 valmistettua vesipitoista supernatanttia (hieman samea) reaktioputkeen, joka on varustettu lasisella hiostulpalla, lisätään 0,5 1 ml 2,6-dikloorifenoli-indofenoliliuosta (3.4) ja sekoitetaan. Kehittyy punainen väri, jonka tulisi pysyä ainakin 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen lisätään noin 300 mg suodatusapuainetta (3.5), sekoitetaan ja suodatetaan kuivan laskostetun suodattimen läpi. Suodoksen ei välttämättä tarvitse olla kirkas. 5.3 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin kanssa tapahtuva reaktio ja hydratsonin uutto Pipetoidaan 10 ml 5.2 kohdan suodosta sentrifugiputkeen (4.2), lisätään 2 ml 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuosta (3.6) ja sekoitetaan. Putkeen johdetaan typpi- (3.7) tai hiilidioksidi (3.8) -virta nopeasti, putki suljetaan tulpalla ja se upotetaan noin 15 tunnin ajaksi (yön yli) vesihauteeseen (4.1). Tämän jälkeen lisätään 3 ml vettä, 20 ml etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seosta (3.9) ja noin 800 mg suodatusapua (3.5). Putki suljetaan tulpalla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekunnin ajan ja sentrifugoidaan. 15 ml supernatanttifaasista pipetoidaan haihdutuspulloon ja haihdutetaan alipaineessa pyöröhaihduttajalla (4.3), kunnes saadaan öljymäinen jäännös. Jäännös liuotetaan 2 ml:aan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seosta (3.9) kuumentamalla se uudestaan 50 °C:seen, annetaan tämän jäähtyä, lisätään 10 ml dikloorimetaanin ja jääetikan seosta (3.10) ja sekoitetaan. 5.4 Pylväskromatografia Kromatografiaputki (4.4) täytetään 30 mm:n tasolle dikloorimetaani/jääetikka-seoksella (3.10). Suspendoidaan (voimakkaasti sekoittaen) 5 g silikageeliä (3.11) 30 ml:aan trikloorimetaanin ja jääetikan seosta (3.10); suspensio kaadetaan putkeen. Annetaan tämän seistä ja haihdutetaan typpi (3.7) alipaineessa. Putkeen dekantoidaan 5.3 kohdassa saatu liuos, pullo huuhdotaan pienellä määrällä dikloorimetaanin ja jääetikan seosta (3.10) ja tämä dekantoidaan putkeen, ja viimeksi mainittu täytetään seoksella (3.10) ja toimenpidettä jatketaan pesemällä pylväs samalla seoksella (3 4 kertaa noin 5 ml:n suuruisella erällä), kunnes saadaan väritön eluaatti. Väriltään keltainen osa eluaatista heitetään pois. Pylvään yläosassa oleva punertava vyöhyke eluoidaan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seoksella (3.9), eluaatti otetaan talteen ja haihdutetaan kuivaksi. 5.4.1 A-ryhmän tuotteiden osalta (C-vitamiinipitoisuus alle 10 g/kg) jäännös liuotetaan 2,0 ml:aan etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seosta (3.9) ja sille suoritetaan levykromatografia välittömästi 5.5 kohdassa esitetyllä tavalla. 5.4.2 B-ryhmän tuotteiden osalta (C-vitamiinisisältö yhtä suuri tai suurempi kuin 10 g/kg) öljymäinen jäännös käsitellään 4.0 ml:lla laimeaa rikkihappoa (3.13), ravistetaan voimakkaasti jäännöksen liuottamiseksi täydellisesti ja optinen tiheys mitataan 5.6 kohdassa esitetyllä tavalla. 5.5 Levykromatografia Seuraavassa selostetut toimenpiteet suoritetaan rinnakkaismäärityksinä. Levylle (4.6) pipetoidaan ohueksi viivaksi 0,5 ml:n erä 5.4.1 kohdassa saatua liuosta. Levyä kehitetään ainakin 20 minuuttia säiliössä, joka on kyllästetty eluointiliuoksella (3.14), kunnes väriltään vaaleanpunainen hydratsonivyöhyke saadaan selvästi erottumaan. Jätetään kuivumaan avoimessa tilassa. Vaaleanpunaisen alueen raja merkitään, vyöhyke raaputetaan pois spaattelilla ja jauhe siirretään kvantitatiivisesti kromatografiaputkeen (4.4). Eluoidaan peräkkäin kerran 2 ml:lla ja kaksi kertaa 1,5 ml:lla etyyliasetaatin, jääetikan ja asetonin seosta (3.9). Eluoitunut liuos kootaan talteen pieneen pulloon (viimeisen erän on oltava väritön). Haihdutetaan kuivaksi, öljymäinen jäännös käsitellään 4,0 ml:lla laimeaa rikkihappoa (3.13), ravistetaan voimakkaasti jäännöksen liuottamiseksi täydellisesti ja mitataan optinen tiheys. 5.6 Optisen tiheyden mittaus Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 509 nm:ssä 20 30 minuuttia jäännöksen liuottamisesta laimeaan rikkihappoon. Mittaus suoritetaan laimeaan rikkihappoon (3.13) vertaamalla. 5.7 Sokeakoe Sokeakoe suoritetaan käyttäen samaa suoritustapaa ilman näytettä. 6. Tulosten laskeminen Näytteen C-vitamiinipitoisuus grammoina kilogrammaa kohti saadaan suhteesta: >NUM> (c a) 7 2 >DEN>(b c) 7 10d jossa: a = sokeakokeessa havaittu optinen tiheys; b = sisäisen standardiliuoksen optinen tiheys; c = näyteliuoksen optinen tiheys; d = tutkittavan näytteen paino grammoina. Toistettavuus Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tuloksen välinen ero ei saa ylittää: 10 % C-vitamiinin määrästä, joka on alle 10 g/kg; 5 % C-vitamiinin määrästä, joka on 10 g/kg tai suurempi. (1) 1 ky = 0,3 ìg retinolia. (2) Maitotuotteiden ja sellaisten tuotteiden osalta, joilla on taipumusta muodostaa kokkareita tai turvota, kaksinkertaistetaan 5 artiklan 2 kohdan, 1 ja 2 alakohdassa, esitettyjen reagenssien määrät. (3) Natriumaskorbaattia ei tarvitse lisätä suoritettaessa hydrolyysi typpiatmosfäärissä. (4) Karoteenipitoisuus voidaan määrittää mittaamalla optinen tiheys 450 nm:ssä; E >NUM>1 % >DEN>1 cm = 2600.