2001/183/EY: Komission päätös, tehty 22 päivänä helmikuuta 2001, näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja varmistamiseksi ja päätöksen 92/532/ETY kumoamisesta (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) (tiedoksiannettu numerolla K(2001) 426)



Virallinen lehti nro L 067 , 09/03/2001 s. 0065 - 0076



Komission päätös, tehty 22 päivänä helmikuuta 2001, näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja varmistamiseksi ja päätöksen 92/532/ETY kumoamisesta (tiedoksiannettu numerolla K(2001) 426) (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) (2001/183/EY) EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon eläinten terveyttä koskevista edellytyksistä saatettaessa vesiviljeltyjä eläimiä ja tuotteita markkinoille 28 päivänä tammikuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/67/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna direktiivillä 98/45/EY(2), ja erityisesti sen 15 artiklan, sekä katsoo seuraavaa: (1) Näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi säädetään komission päätöksessä 92/532/ETY(3), sellaisena kuin se on muutettuna päätöksellä 96/240/EY(4). (2) Päätöksen 92/532/ETY hyväksymisen jälkeen käytäntö ja tiede ovat kehittyneet ja direktiivi 91/67/ETY on muutettu. Tämä edellyttää näytteenottosuunnitelmien ja taudinmääritysmenetelmien ajanmukaistamista. (3) Ajanmukaistaminen liittyy verenvuotoseptikemiaa (VHS) ja vertamuodostavan kudoksen tarttuvaa kuoliota (IHN) aiheuttavien virusten tutkimiseen ja tunnistamiseen ja direktiivin 91/67/ETY viimeisimpiin muutoksiin. (4) Neuvoston direktiivillä 93/53/ETY(5) perustetulta yhteisön vertailulaboratoriolta on pyydetty lausunto. (5) Näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä tiettyjen kalatautien esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi tehty päätös 92/532/ETY olisi selkeyden vuoksi kumottava. (6) Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän eläinlääkintäkomitean lausunnon mukaiset, ON TEHNYT TÄMÄN PÄÄTÖKSEN: 1 artikla Näytteenottosuunnitelmat ja taudinmääritysmenetelmät verenvuotoseptikemian (VHS) ja tarttuvan vertamuodostavan kudoksen kuolion (IHN) esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi annetaan liitteessä. 2 artikla Kumotaan päätös 92/532/ETY tällä päätöksellä. 3 artikla Tämä päätös on osoitettu kaikille jäsenvaltioille. Tehty Brysselissä 22 päivänä helmikuuta 2001. Komission puolesta David Byrne Komission jäsen (1) EYVL L 46, 19.2.1991, s. 1. (2) EYVL L 189, 3.7.1998, s. 12. (3) EYVL L 337, 21.11.1992, s. 18. (4) EYVL L 79, 29.3.1996, s. 19. (5) EYVL L 175, 19.7.1993, s. 23. LIITE NÄYTTEENOTTOSUUNNITELMAT JA TAUDINMÄÄRITYSMENETELMÄT VERENVUOTOSEPTIKEMIAN (VHS) JA TARTTUVAN VERTAMUODOSTAVAN KUDOKSEN KUOLION (IHN) ESIINTYMISEN HAVAITSEMISEKSI JA VAHVISTAMISEKSI JOHDANTO Tässä liitteessä: a) annetaan ohjeet ja vähimmäisvaatimukset näytteenottosuunnitelmista ja taudinmääritysmenetelmistä verenvuotoseptikemian (VHS) ja vertamuodostavan kudoksen tarttuvan kuolion (IHN) esiintymisen havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi; b) yhtenäistetään direktiivin 91/67/ETY liitteissä B ja C olevat hyväksyttyjen vyöhykkeiden ja muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten tautiaseman hyväksymistä ja hyväksynnän säilyttämistä koskevat säännökset; c) vahvistetaan säännökset, joilla pyritään VHS:n ja IHN:n oikean taudinmäärityksen tekemiseen ja vyöhykkeiden ja muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten tautiaseman viralliseen tunnustamiseen direktiivin 91/67/ETY 5 ja 6 artiklan mukaisesti; d) ja tämä liite on osoitettu VHS:n ja IHN:n valvonnasta vastaaville viranomaisille ja näitä tauteja koskevia kokeita tekevälle laboratoriohenkilöstölle. Sen mukaisesti painotus on näytteenottomenetelmissä ja -periaatteissa ja laboratoriokokeiden tekemisessä ja niiden tulosten arvioinnissa sekä yksityiskohtaisissa laboratoriomenetelmissä. Laboratoriot voivat kuitenkin tarvittaessa tehdä muutoksia tässä liitteessä kuvattuihin kokeisiin tai käyttää eri kokeita, edellyttäen, että voidaan osoittaa sama herkkyys ja spesifisyys. Liitteen I osassa on VHS:n ja IHN:n seurannan näytteenottosuunnitelmat ja taudinmääritysmenetelmät, vyöhykkeen tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevan kalanviljelylaitoksen hyväksytyn aseman saamiseksi ja säilyttämiseksi. Liitteen II osassa kuvataan taudinmääritysmenetelmät VHS- tai IHN-epäilyn vahvistamiseksi. Liitteen III osassa vahvistetaan sellaisen virallisen terveystarkastusohjelman vaatimukset ja ohjeet, jolla osoitetaan asiakirjoin aikaisempi VHS- tai IHN-vapaus. Liitteen IV osassa annetaan suosituksia VHS- ja IHN-virusten titraatiomenettelystä soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi. Lyhytnimet ja lyhennykset on lueteltu V osassa. I OSA Näytteenottosuunnitelmat ja taudinmääritysmenetelmät vyöhykkeen tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevan kalanviljelylaitoksen hyväksytyn aseman saamiseksi ja säilyttämiseksi I Tarkastukset ja näytteenotto 1. Vyöhykkeiden tai muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten hyväksytyn VHS- ja/tai IHN-aseman saamista tai säilyttämistä varten suoritettavassa valvonnassa sovellettavat kliinisiä terveystarkastuksia, näytteiden keruuta ja valintaa koskevat yleiset säännökset Asetuksen 91/67/ETY liitteen B ja C mukaisen hyväksytyn VHS- ja/tai IHN-aseman saamista tai säilyttämistä varten suoritettavista kliinisistä terveystarkastuksista ja vyöhykkeillä tai muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevissa kalanviljelylaitoksissa tapahtuvasta kalojen kudoksen ja/tai ovaarinesteen keräämisestä annetaan yhteenveto taulukoissa 1A, 1B ja 1C. Yksityiskohtaisempia tietoja on osissa I.I.2-I.I.4. Taulukoita 1A ja 1B ei sovelleta uusiin viljelylaitoksiin tai viljelylaitoksiin, jotka aloittavat uudestaan toimintansa hyväksytyltä vyöhykkeeltä tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevista viljelylaitoksista tulevilla kaloilla, mädillä tai sukusoluilla, edellyttäen, että ne noudattavat direktiivin 91/67/ETY liitteessä C olevassa I.A.6.a tai b osassa tai II.A.3.a tai b osassa säädettyjä vaatimuksia. Kliiniset tarkastukset tehdään loka- ja kesäkuun välisenä aikana tai milloin veden lämpötila on alle 14 °C. Silloin kun viljelylaitokset tarkastetaan kliinisesti kaksi kertaa vuodessa, näiden tarkastusten välisen ajan on oltava vähintään neljä kuukautta. Kaikki tuotantoyksiköt (lammikot, altaat, verkkoaltaat jne.) on tarkastettava kuolleiden, heikkojen tai poikkeavasti käyttäytyvien kalojen havaitsemiseksi. Erityistä huomiota on kiinnitettävä poistovesipisteeseen, jonne heikoilla katoilla on taipumus kerääntyä veden virtauksen vuoksi. Näytteitä varten kerättävät kalat valitaan seuraavasti: - Jos viljelyssä on kirjolohia, vain tämän lajin kaloja kerätään näytteeseen. Muussa tapauksessa näyte kootaan kaikkien muiden viljelyssä olevien lajien kaloista, jos nämä lajit ovat alttiita VHS- ja/tai IHN-virukselle (siten kuin direktiivin 91/67/ETY liitteessä A luetellaan). Lajeja on oltava näytteessä oikeassa suhteessa. - Jos kalantuotannossa käytetään useampaa kuin yhtä vedensaantilähdettä, näytteessä on oltava kaikkia vedensaantilähteitä edustavia kaloja. - Jos joukossa on heikkokuntoisia, poikkeavasti käyttäytyviä tai äskettäin kuolleita (mutta ei vielä hajoamistilassa olevia) kaloja, näytteeseen on ensisijaisesti valittava tällaisia kaloja. Jos joukossa ei ole tällaisia kaloja, valittuihin kaloihin on sisällyttävä terveitä, ulkonäöltään tavanomaisia kaloja, jotka kerätään siten, että kaikki viljelylaitoksen osat ja kaikki vuosiluokat ovat oikeassa suhteessa edustettuina näytteessä. 2. Vyöhykkeiden tai muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten hyväksytyn VHS- ja/tai IHN-aseman saamista tai säilyttämistä varten suoritettavassa valvonnassa sovellettavat erityiset säännökset, nätteiden keruu mukaan lukien 1. Vyöhyke tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitseva viljelylaitos, joka asetetaan viranomaisten valvontaan, voi saada hyväksytyn VHS- tai IHN-aseman seuraavalla kahdella tavalla: a) Malli A - kaksivuotinen valvontaohjelma: Kaikissa vyöhykkeen viljelylaitoksissa tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevissa viljelylaitoksissa, joille haetaan hyväksyntää, tehdään terveystarkastus kaksi kertaa vuodessa kahden vuoden ajan vähintään kahden vuoden kuluttua siitä, kun niissä on vahvistettu, että VHS:n ja/tai IHN:n kliinisiä tai muita merkkejä ei ole esiintynyt. Tämän kahden vuoden valvonta-ajanjakson aikana, joka edeltää hyväksytyn aseman saamista, VHS:n ja/tai IHN:n kliinisiä tai muita merkkejä ei saa esiintyä ja näytteet on kerättävä tutkimusta varten taulukon 1A mukaisesti. Lisäksi näytteet valitaan, valmistellaan ja tutkitaan I.I-I.IV osien mukaisesti ja laboratoriotutkimusten on oltava negatiivisia VHS:n ja/tai IHN:n varalta; tai b) Malli B - kaksivuotinen valvontaohjelma pienemmällä näytteen koolla Sellaisen virallisen terveystarkastusohjelman jälkeen, jolla asiakirjoin osoitetaan ainakin nelivuotinen VHS- ja/tai IHN-vapaus, hyväksyttäviksi aiotuissa vyöhykkeen viljelylaitoksissa tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevissa viljelylaitoksissa tehdään terveystarkastus kaksi kertaa vuodessa kahden vuoden ajan. Tämän kahden vuoden valvonta-ajanjakson aikana, joka edeltää hyväksytyn aseman saamista, VHS:n ja/tai IHN:n kliinisiä tai muita merkkejä ei ole saanut esiintyä ja näytteet kerätään tutkimusta varten taulukon 1B mukaisesti. Lisäksi näytteet valitaan, valmistellaan ja tutkitaan osien I.I-I.IV mukaisesti ja laboratoriotutkimusten on oltava negatiivisia VHS:n ja/tai IHN:n varalta. Jotta viranomaiset voivat tunnustaa terveystarkastusohjelman VHS- ja/tai IHN-vapauden osalta asiakirjoin osoitetuksi, sen on täytettävä osassa III annetut vaatimukset ja ohjeet. 2. Uusien viljelylaitosten tai viljelylaitosten, jotka aloittavat uudestaan toimintansa hyväksytyltä vyöhykkeeltä tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevasta viljelylaitoksesta tulevien kalojen, mädin tai sukusolujen kanssa, hyväksymistä koskevat erityissäännökset. Uudet viljelylaitokset ja muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevat viljelylaitokset, jotka aloittavat uudelleen toimintansa hyväksytyltä vyöhykkeeltä tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevista viljelylaitoksista tulevilla kaloilla, mädillä tai sukusoluilla, voivat saada tautivapaan aseman direktiivin 91/67/ETY liitteessä C olevan I.A.6 a tai b osan tai II.A.3 a tai b osan mukaisesti. Edellä olevassa mallissa A ja B (I.I.2.1.a osa ja I.I.2.1.b osa) säädettyjä vaatimuksia ei vastaavasti sovelleta tällaisiin viljelylaitoksiin. 3. Hyväksytyn VHS- ja/tai IHN-aseman säilyttämistä koskeva seurantaohjelma Vyöhykkeen tai muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevan hyväksyttävän VHS- ja/tai IHN-aseman säilyttämiseksi tehtävät tarkastukset ja näytteenotto tutkimuksia varten on tehtävä taulukon 1C mukaisesti. Näytteet on valittava, valmisteltava ja tutkittava osien I.I-I.IV mukaisesti ja laboratoriotutkimusten on oltava negatiivisia VHS:n ja/tai IHN:n taudinaiheuttajien varalta. 3. Kalanäytteiden valmistelu ja lähettäminen Ennen lähettämistä tai laboratorioon siirtämistä tutkittavat elinten kappaleet irrotetaan kalasta steriilien dissektiovälineiden avulla ja asetetaan steriileihin muoviputkiin, jotka sisältävät kuljetuselatusainetta eli 10 prosenttia vasikan seerumia ja antibiootteja sisältävää soluviljelyyn käytettävää elatusainetta. Suositeltava on yhdiste, joka sisältää 200 ky penisilliiniä, 200 μg streptomysiiniä ja 200 μg kanamysiiniä millilitrassa, mutta myös muita teholtaan tutkittuja antibiootteja voidaan käyttää. Tutkittavat kudokset ovat perna, etummainen munuainen ja lisäksi joko sydän tai aivot. Joissain tapauksissa ovaarineste täytyy tutkia (taulukko 1A-C). Lukumäärältään enintään 10 kalan (taulukko 1A-C) ovaarineste tai elinten kappaleet voidaan kerätä yhteen steriiliin muoviputkeen, joka sisältää 4 ml kuljetuselatusainetta, yhteisnäytteeksi. Kussakin näytteessä olevan kudoksen painon on oltava vähintään 0,5 grammaa (g). Putket ja riittävä määrä jäitä tai "kylmävaraajia" olisi asetettava eristettyihin säiliöihin (esimerkiksi paksuseinäisiin polystyreenilaatikoihin) sen varmistamiseksi, että näytteet jäähtyvät laboratorioon kuljettamisen aikana. Näytteitä on varjeltava jäätymiseltä. Näytteen lämpötila kuljetuksen aikana ei saa koskaan ylittää 10 °C:ta, ja kuljetuslaatikossa on oltava jäätä vielä vastaanottopaikassa tai yhden tai useamman kylmävaraajan on vielä oltava osittain tai kokonaan jäätynyt. Virologinen tutkimus aloitetaan mahdollisimman pian ja viimeistään 48 tunnin kuluessa näytteiden keruusta. Poikkeustapauksissa(1) virologinen tutkimus voidaan aloittaa viimeistään 72 tunnin kuluessa aineksen keruusta, edellyttäen, että tutkittava aines on suojattu kuljetuselatusaineella ja että lämpötilavaatimuksia kuljetuksen aikana noudatetaan (I.I.3 osan 3 kohta). Kokonaisia kaloja voidaan lähettää laboratorioon, jos lämpötilavaatimukset kuljetuksen aikana voidaan täyttää. Kokonaiset kalat voidaan kääriä imukykyiseen paperiin, ja ne lähetetään lopuksi muovipussissa edellä kuvatulla tavalla jäädytettynä. Eläviä kaloja voidaan myös lähettää. Pakkaaminen ja pakkausmerkinnät tehdään asianmukaisesti voimassa olevien kansallisten ja kansainvälisten kuljetussäännösten mukaisesti. 4. Diagnostisen lisäaineiston kerääminen Muita kalojen kudoksia voidaan asianomaisen taudinmäärityslaboratorion kanssa tehdyn sopimuksen mukaisesti kerätä ja valmistella lisätutkimuksia varten. II Näytteiden valmistelu virologista tutkimusta varten 1. Jäädyttäminen poikkeustapauksissa Jos esiintyy käytännön ongelmia (esimerkiksi huonot sääolosuhteet, pyhiä, laboratorio-ongelmia), minkä takia soluja on mahdotonta inokuloida 48 tunnin sisällä kudosnäytteiden keräämisestä, on hyväksyttävää jäädyttää kudosnäytteet soluviljelyelatusaineessa enintään -20 °C:ssa ja tehdä virologinen tutkimus 14 päivän kuluessa. Tämä kudos saadaan kuitenkin jäädyttää ja sulattaa vain kerran ennen tutkimusta. Kudosnäytteiden jäädyttämisen syistä on pidettävä yksityiskohtaista kirjaa (myrsky, solulinjat kuolivat tms.) 2. Elinten homogenointi Putkissa olevat kudokset on laboratoriossa täydellisesti homogenoitava (joko stomacher-homogenisaattorin, sekoittimen tai huhmaren ja steriiliä hiekkaa sisältävän morttelin avulla) ja sen jälkeen suspendoitava alkuperäiseen kuljetuselatusaineeseen. Jos näyte koostuu kokonaisista kaloista, joiden pituus on alle 4 cm, nämä leikataan steriileillä saksilla tai skalpellilla pieniksi palasiksi sen jälkeen, kun suolen aukon takana oleva osa ruumiista on poistettu. Jos näyte koostuu kokonaisista 4-6 cm:n pituisista kaloista, sisälmykset munuaiset mukaan lukien olisi otettava talteen. Jos näyte koostuu yli 6 cm:n pituisista kaloista, kudosnäytteet olisi kerättävä I.I.3 osan mukaisesti. Kudosnäytteet olisi leikattava steriileillä saksilla tai skalpellilla pieniksi palasiksi edellä kuvatun mukaisesti ja suspendoitava kuljetuselatusaineeseen. Kudosaineen ja kuljetuselatusaineen lopullisen suhteen on oltava 1:10. 3. Homogenaatin sentrifugointi Homogenaatti sentrifugoidaan sentrifugissa, joka on jäähdytetty 2-5 °C:seen, 2000-4000 x g, 15 minuutin ajan, ja supernatantti kerätään talteen ja sitä käsitellään joko neljä tuntia 15 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa antibiooteilla, esimerkiksi gentamysiini 1 mg/ml voi olla hyödyllinen tässä vaiheessa. Jos näyte lähetetään elatusaineessa (eli antibiooteille altistuneena), supernatantin käsittely antibiooteilla voidaan jättää pois. Antibioottikäsittelyllä pyritään pitämään näytteiden bakteerikontaminaatio hallinnassa ja tekemään suodatus kalvosuodattimilla tarpeettomaksi. Jos supernatantti varastoidaan - 80 °C:seen 48 tunnin sisällä näytteenoton jälkeen, se voidaan käyttää uudelleen vain kerran virologista tutkimusta varten. Jos esiintyy käytännön ongelmia (esimerkiksi inkubaattori menee rikki, soluviljelyn kanssa on ongelmia), minkä takia on mahdotonta inokuloida soluja 48 tunnin sisällä kudosaineksen keräämisestä, on hyväksyttävää jäädyttää supernatantti - 80 °C:seen ja tehdä virologinen tutkimus 14 päivän sisällä. Ennen inokulaatiota soluihin supernatantti sekoitetaan tilavuudeltaan yhtä suureen määrään tarpeen mukaan laimennettua antiseerumiseosta, joka koostuu kotoperäisinä esiintyvien IPN-virusserotyyppien vasta-aineista, ja inkuboidaan tällaisena vähintään tunti 15 °C:ssa tai enintään 18 tuntia 4 °C:ssa. Antiseerumin pitoisuuden on oltava vähintään 1/2000 50-prosenttisessa plakkineutralisaatiokokeessa. Käsittelemällä kaikki inokulaatit IPN-viruksen antiseerumilla (tietyillä alueilla Euroopassa tätä virusta esiintyy 50 prosentissa kalanäytteistä) pyritään estämään IPN-viruksesta aiheutuvan CPE:n kehittyminen inokuloiduissa soluviljelmissä. Tämä lyhentää virologisten tutkimusten kestoa sekä vähentää sellaisten tapausten lukumäärää, joissa CPE:n ilmeneminen olisi katsottava VHS- tai IHN-viruksen mahdolliseksi indikaatioksi. Jos näytteet ovat lähtöisin IPN-vapaiksi katsotuista tuotantoyksiköistä, inokulaatteja ei tarvitse käsitellä IPN-viruksen antiseerumilla. III Virologinen tutkimus 1. Soluviljelmät ja elatusaineet Joko BF-2:ta tai RTG-2:ta ja joko EPC- tai FHM-soluja kasvatetaan 20-30 °C:ssa sopivassa elatusaineessa, esimerkiksi Eagle's MEM -elatusaineessa (tai sen muunnelmissa), johon on lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja antibiootteja standardipitoisuuksina. Viljeltäessä soluja suljetuissa pulloissa elatusaineen puskuroimista bikarbonaatilla suositellaan. Avoimissa yksiköissä kasvatettavissa soluviljelmissä käytettävä elatusaine voidaan puskuroida Tris-HCl:lla (23 mM) ja natriumbikarbonaatilla (6 mM). pH:n on oltava 7,6 +- 0,2. Kudosaineen inokulaatiossa käytettävien soluviljelmien tulisi olla nuoria (4-48 tunnin ikäisiä) ja aktiivisessa kasvuvaiheessa (ei yhtyviä) inokulaatiohetkellä. 2. Soluviljelmien inokulaatio Soluviljelmiin inokuloidaan antibioottikäsiteltyä elinsuspensiota kahtena laimennoksena eli itse primäärilaimennoksen lisäksi sen 1:10 laimennoksena, joka on tulosta kudosaineksen lopullisesta laimennuksesta soluviljelmissä käytettävään elatusaineeseen suhteessa 1:100 ja 1:1000 (homologisen interferenssin estämiseksi). Vähintään kaksi solulinjaa on inokuloitava (katso I.III.1 osa). Inokulaatin koon ja soluviljelyelatusaineen tilavuuden suhteen tulisi olla noin 1:10. Kutakin laimennosta ja solulinjaa kohti käytettävän solualueen tulisi olla vähintään noin 2 cm2 vastaten yhtä kuoppaa 24-kuoppaisessa soluviljelyastiassa. Soluviljelyastioiden käyttö on suositeltavaa, mutta myös muut, samanlaisen tai suuremman kasvupinnan tarjoavat alustat soveltuvat tähän tarkoitukseen. 3. Soluviljelmien inkubaatio Inokuloituja soluviljelmiä inkuboidaan 15 °C:ssa 7-10 päivää. Jos soluviljelmän elatusaineen väri muuttuu punaisesta keltaiseksi osoittaen elatusaineen happamoitumista, pH-arvoa on säädettävä steriilin bikarbonaattiliuoksen tai vastaavien aineiden avulla solun virusinfektioherkkyyden varmistamiseksi. Jäädytetyt VHS- ja IHN-viruskannat on soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi titrattava kuuden kuukauden välein tai jos epäillään herkkyyden alentamista. Suositeltava menettely esitetään IV osassa. 4. Mikroskopointi Inokuloidut soluviljelmät on tarkastettava säännöllisesti (vähintään 3 kertaa viikossa) CPE:n muodostumisen havaitsemiseksi 40-150-kertaisella suurennuksella. Jos havaitaan selvä CPE-esiintymä, viruksen tunnistamismenetelmät on aloitettava välittömästi I.IV osan mukaisesti. 5. Jatkoviljelmät Jos CPE:tä ei ole kehittynyt 7-10 päivän primaarisen inkubaation jälkeen, suoritetaan jatkoviljely tuoreille soluviljelmille käyttäen samanlaista soluainetta kuin primaariviljelmässä. Kaikista primaariviljelmän muodostavista viljelmistä/kuopista lähtöisin olevat elatusaineen määräosat (supernatantti) ryhmitellään solukannan mukaan 7-10 päivää inokulaation jälkeen. Ryhmitelmät inokuloidaan tämän jälkeen homologisiin soluviljelmiin laimentamattomina ja laimennettuina suhteessa 1:10 (tulos supernatantin lopullisista laimennoksista suhteessa 1:10 ja 1:100), kuten I.III.2 osassa esitetään. Vaihtoehtoisesti primaariviljelmän muodostavat elatusaineen määräosat inokuloidaan suoraan tuoretta soluviljelmää sisältävään kuoppaan (kuopasta kuoppaan -jatkoviljely). Inokulointia voi edeltää kaikkien laimennosten esi-inkubointi IPN-viruksen antiseerumin kanssa sopivana laimennoksen, kuten I.II.3 osassa esitetään. Tämän jälkeen inokuloituja viljelmiä inkuboidaan 7-10 päivän ajan 15 °C:ssa tarkkailun alaisena siten kuin I.III.4 osassa esitetään. Jos myrkyllistä CPE:tä esiintyy kolmen ensimmäisen päivän sisällä inkubaatiosta, jatkoviljelmä voidaan tehdä tässä vaiheessa, mutta soluja on tällöin inkuboitava seitsemän päivän ajan ja jatkoviljeltävä uudelleen seitsemän uuden inkubaatiopäivän ajan. Siinä tapauksessa, että myrkyllinen CPE kehittyy kolmen päivän jälkeen, solut voidaan vaihtaa kerran ja inkubaatiota jatkaa, kunnes 14 vuorokautta on kulunut ensimmäisestä inokulaatiosta. Seitsemänä viimeisenä inkubaatiopäivänä ei tulisi ilmetä myrkyllisyyttä. Jos bakteerikontaminaatiota tapahtuu antibioottikäsittelystä huolimatta, jatkoviljelyä on edellettävä sentrifugaatio (2000-4000 x g, 15-30 minuuttia 2-5°C:ssa) ja/tai supernatantin suodattaminen 0,45 μm:n kalvosuodattimella (proteiineja hylkivä kalvo). Lisäksi jatkoviljelymenettelyt ovat samat kuin myrkyllisen CPE:n osalta. IV Viruksen tunnistaminen 1. Viruksen tunnistamistestit Jos soluviljelmässä on todettu CPE:n muodostuminen, elatusaine (supernatantti) kerätään talteen ja tutkitaan yhdellä tai useammalla seuraavista menetelmistä: neutralisaatio, IF, ELISA. Jos testeissä ei ole tunnistettu virusta varmuudella viikon kuluessa, supernatantti on siirrettävä kansalliseen kalaviruksiin erikoistuneeseen vertailulaboratorioon tai EU:n kalatauteja tutkivaan vertailulaboratorioon välitöntä tunnistusta varten. 2. Neutralisaatio Solut poistetaan talteen kerätystä supernatantista sentrifugoinnilla (2000-4000 x g) tai suodattamalla proteiineja hylkivällä kalvolla (0,45 μm), ja elatusaine laimennetaan suhteeseen 1:100 ja 1:10000 soluviljelmän elatusaineessa. Kahden supernatantin laimennosten määräosat sekoitetaan ja niitä inkuboidaan erikseen 60 minuutin ajan 15 °C:ssa yhdessä seuraavien reagenssien samansuuruisten osien kanssa: - seerumi, joka sisältää VHS-viruksen ryhmäspesifistä vasta-ainetta 1:50-laimennoksena (vol:vol)(2), - seerumi, joka sisältää IHN-viruksen ryhmäspesifistä vasta-ainetta 1:50-laimennoksena (vol:vol)(3), - IPN-viruksen kotoperäisten serotyyppien antiseerumiseosta 1:50-laimennoksena (vol:vol)(4), - vain elatusainetta (positiivinen kontrolli). Vähintään kaksi soluviljelmää inokuloidaan kukin 50 μl:lla viruksen supernatantin ja seerumin seosta ja inkuboidaan 15 °C:ssa. CPE:n kehittymistä valvotaan I.II.4 osan mukaisesti. Jotkut VHSV-kannat eivät reagoi neutralisaatiokokeissa. Tällaiset isolaatit on tunnistettava IF:n tai ELISA:n avulla. Muita tehokkuudeltaan tutkittuja neutralisaatiotestejä voidaan käyttää vaihtoehtoisesti. 3. IF Kutakin tunnistettavaa eristettyä virusta kohti istutetaan vähintään kahdeksalle peitinlasille tai vastaavalle alustalle CPE-soluja sellaisella tiheydellä, että se johtaa noin 60-90 prosentin peittoon 24 tunnin viljelyn jälkeen. CPE-soluja suositellaan tähän tarkoitukseen, koska ne kiinnittyvät voimakkaasti lasipintoihin, mutta myös muita solulinjoja voidaan käyttää (esim. BF-2, RTG-2 tai FHM). Kun solut ovat asettuneet lasipinnalle (noin tunti istuttamisesta) tai kun viljelmiä on inkuboitu enintään 24 tunnin ajan, tunnistettava virus inokuloidaan. Neljä viljelmää inokuloidaan tilavuussuhtein 1:10 ja neljä viljelmää suhtein 1:1000. Näitä sitten inkuboidaan 15 °C:ssa 20-30 tuntia. Inkubaation jälkeen viljelmät huuhdotaan kahteen kertaan Eagle's MEM -tuotteella, kiinnitetään 80-prosenttisella jääkylmällä asetonilla ja värjätään kaksikerros-IFAT:llä. Ensimmäinen reagenssikerros koostuu poly- tai monikloonisista vertailulaatua olevista vasta-aineista. Toinen reagenssikerros on ensimmäisessä kerroksessa käytetyn immunoglobuliinin fluorokromikonjugoitu antiseerumi. Kutakin kokeessa käytettyä antiseerumia kohti värjätään vähintään yksi suurella annoksella inokuloitu ja yksi pienellä annoksella inokuloitu viljelmä. Kokeen on sisällettävä asianmukaiset negatiiviset ja positiiviset kontrollit. Fluorokromeista FITC tai TRITC ovat suositeltavia. Värjätyt viljelmät irrotetaan glyserolisuolaliuoksella. Ne tutkitaan tulevan ultraviolettivalon alla. Käytetään 10 x tai 12 x -okulaaria ja x 25 tai x 40 -objektiivilinssejä, joiden vastaavat numeeriset aukot ovat > 0,7 ja > 1,3. Edellä esitetty IF-menetelmä on annettu vain esimerkkinä. Muita teholtaan tutkittuja IF-menetelmiä (soluviljelyn, kiinnittymisen ja vertailulaatua olevien vasta-aineiden osalta) voidaan käyttää vaihtoehtoisesti. 4. ELISA Mikrotiitterilevyt peitetään yöksi vertailulaatua olevien vasta-aineiden immunoglobuliinijakeiden suositelluilla laimennoksilla. Sen jälkeen, kun kuopat on huuhdeltu PBS-Tween-20-puskurilla, tunnistettava virus viedään kuoppiin kaksin- tai nelinkertaisina laimennossarjoina ja annetaan reagoida peittävän vasta-aineen kanssa 60 minuutin ajan 37 °C:ssa. PBS-Tween-20-puskurilla tapahtuvan huuhtelun jälkeen lisätään spesifisyydeltään peittäviä vasta-aineita vastaavia biotinyylillä käsiteltyjä vasta-aineita ja annetaan reagoida 60 minuutin ajan 20 °C:ssa. Sen jälkeen, kun edellä kuvattu huuhtelu on toistettu, lisätään HRP-konjugoitu streptavidiini ja annetaan reagoida tunnin ajan 20 °C:ssa. Viimeisen huuhtelun jälkeen sidottu entsyymi saadaan näkyviin sopivien ELISA-substraattien (OPD tai muut) avulla. Edellä esitetty biotiini- ja avidiini-pohjainen ELISA-versio on annettu vain esimerkkinä. Sen asemasta voidaan käyttää myös muita teholtaan tutkittuja ELISA-versioita. TAULUKKO 1A Vyöhykkeiden ja muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten kahtena vuonna ennen hyväksyttävän VHS- tai IHN-aseman myöntämistä tapahtuva valvonta- ja näytteenottosuunnitelma (direktiivin 91/67/ETY liitteiden B ja C ja tämän liitteen I osan säännökset) >TAULUKON PAIKKA> Kalojen enimmäismäärä yhteisnäytettä kohti: 10. TAULUKKO 1B Virallisesti asiakirjoilla osoitettujen VHS- ja IHN-tautivapaiden vyöhykkeiden ja muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten hyväksyttävän VHS- tai IHN-aseman myöntämisen jälkeisenä kahden vuoden valvonta-ajanjaksona tapahtuva valvonta- ja näytteenottosuunnitelma (direktiivin 91/67/ETY liitteiden B ja C ja tämän liitteen I ja III osan säännökset) >TAULUKON PAIKKA> Kalojen enimmäismäärä yhteisnäytettä kohti: 10. TAULUKKO 1C Vyöhykkeiden ja muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten valvonta- ja näytteenottosuunnitelma VHS- tai IHN-aseman säilyttämiseksi (direktiivin 91/67/ETY liitteiden B ja C ja tämän liitteen I osan säännökset) >TAULUKON PAIKKA> Kalojen enimmäismäärä yhteisnäytettä kohti: 10. II OSA Taudinmääritysmenettelyt IHN:N tai VHS:N vahvistamiseksi epäillyissä taudinpurkauksissa VHS:n ja IHN:n taudinmäärityksessä on käytettävä yhtä tai useampaa seuraavista menetelmistä: - A. tavanomainen viruseristys ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen, - B. viruseristys samanaikaisesti viruksen serologisen tunnistamisen kanssa, - C. muut taudinmääritysmenetelmät (IFAT, ELISA). VHS:n ja IHN:n vahvistaminen hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevissa viljelylaitoksissa ei saa perustua pelkästään menetelmään C. Lisäksi on käytettävä joko menetelmää A tai B. Virologiseen tutkimukseen tarkoitetun kudoksen mukana voi joissakin tapauksissa olla myös lisäaineistoa bakteriologista, parasitologista, histologista tai muuta tutkimusta varten erotusdiagnoosin mahdollistamiseksi. A Viruksen tavanomainen eristäminen ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen I.1 Näytteiden valinta Tutkimuskäyttöön valitaan vähintään 10 kalaa, joissa ilmenee tyypillisiä IHN:n tai SHV:n merkkejä. I.2 Kalanäytteiden valmistelu ja lähettäminen Siten kuin I.I.3 osassa säädetään. I.3 Diagnostisen lisäaineiston kerääminen Siten kuin I.I.4 osassa säädetään. II Näytteiden valmistelu virologista tutkimusta varten Siten kuin I.II osassa säädetään. III Viroloinen tutkimus Siten kuin I.III osassa säädetään. IV Viruksen tunnistaminen Siten kuin I.IV osassa säädetään. B Viruksen eristäminen samanaikaisesti viruksen serologisen tunnistamisen kanssa I.1 Näytteiden valinta Siten kuin II.A.I.1 osassa säädetään. I.2 Kalanäytteiden valmistelu ja lähettäminen Siten kuin I.I.3 osassa säädetään. I.3 Diagnostisen lisäaineiston kerääminen Siten kuin I.I.4 osassa säädetään. II.1 Elinten homogenointi Siten kuin I.II.2 osassa säädetään. II.2 Homogenaatin sentrifugointi Homogenaatti sentrifugoidaan sentrifugissa, joka on jäähdytetty 2-5 °C:seen, 2000-4000 x g, 15 minuutin ajan, ja supernatantti kerätään talteen, ja sitä käsitellään neljä tuntia 15 °C:ssa antibiooteilla, esimerkiksi gentamysiinillä (1 mg/ml), tai suodattamalla proteiineja hylkivällä kalvolla (0,45 μm). II.3 Supernatantin käsittely diagnostisten antiseerumien avulla Antibiootilla käsitelty tai kalvosuodattimella suodatettu elinsuspensio laimennetaan suhteeseen 1:10 ja 1:1000 soluviljelyelatusaineessa, ja määräosat sekoitetaan ja inkuboidaan 60 minuutin ajan 15 °C:ssa I.IV.2 osassa lueteltujen reagenssien samansuuruisten osien kanssa. III.1 Soluviljelmät ja elatusaineet Siten kuin I.III.1 osassa säädetään. III.2 Soluviljelmien inokulaatio Kustakin (II.B.II.3 osan mukaisesti valmistetusta) virus/seerumiseoksesta inokuloidaan 50 μl vähintään kahteen kunkin solulinjan soluviljelmään. III.3 Soluviljelmien inkubaatio Siten kuin I.III.3 osassa säädetään. III.4 Mikroskopointi Inokuloidut soluviljelmät tarkastetaan päivittäin CPE:n muodostumisen havaitsemiseksi noin 40-150-kertaisella suurennuksella. Jos jokin käytetyistä antiseerumeista estää CPE:n muodostumisen, virus voidaan katsoa tunnistetuksi. Jos kyseiset antiseerumit eivät estä CPE:n muodostumista, on syytä panna toimeen viruksen tunnistamismenettelyt I.IV osan mukaisesti. III.5 Jatkoviljelmät Jos CPE:tä ei ole muodostunut 7-10 päivän kuluessa, on suoritettava jatkoviljely supernatantilla inokuloiduista viljelmistä ja elatusaineesta (II.B.II.3 osa) I.III.5 osan mukaisesti. C Muut taudinmääritysmenetelmät Supernatantti, joka on valmistettu I.II.2 osassa kuvatulla tavalla, käsitellään IFAT:lla tai ELISAlla vastaavasti II.IV.3 tai II.IV.4 osan mukaisesti. Näitä nopeita menetelmiä on täydennettävä virologisella tutkimuksella A:n tai B:n mukaisesti alle 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, jos a) on saatu negatiivinen tulos; tai b) on saatu positiivinen tulos ensimmäistä IHN- tai VHS-tapausta edustavista näytteistä hyväksytyllä vyöhykkeellä. Taudinmääritys kudoksista voidaan tehdä muillakin taudinmääritysmenetelmillä, kuten jäähdytettyjen kantojen RT-PCR-, IF-kokeella tai formaliinilla kiinnitetyn kudosaineksen immunohistokemialla. Näihin menetelmiin on liityttävä kiinnittämättömän kudosaineen inokulaatio soluviljelmiin. III OSA Vyöhykkeiden tai muilla kuin hyväksytyillä vyöhykkeillä sijaitsevien kalanviljelylaitosten asiakirjoilla osoitettu VHS- ja/tai IHN-vapaus Virallisen terveystarkastusohjelman ohjeet ja vaatimukset 1. Terveystarkastusohjelma voidaan aloittaa joko - sellaisen virallisesti hyväksytyn VHS- ja/tai IHN-viruksen hävittämisohjelman jälkeen, johon kuuluu kaikkien kalojen poistaminen laitoksesta, sen puhdistaminen, desinfiointi ja käyttötauko ennen kuin sinne siirretään uudestaan kaloja hyväksytyiltä tiloilta, tai - kalanviljelylaitoksissa, joissa ei ole VHS- ja IHN-tartunnan taustaa. 2. Terveystarkastusohjelman on perustuttava sekä kliinisiin tarkastuksiin että laboratoriokokeisiin. 3. Ohjelmaan on kuuluttava kaksi vuosittaista kliinistä terveystarkastusta I osassa annettujen ohjeiden mukaisesti. 4. Ainakin yhdessä vuosittain tehtävistä tarkastuksista on jokaiselta tilalta kerättävä 30 kalakudos- ja/tai ovaarinestenäytettä. Näytteet on valittava, valmistettava ja niille on tehtävä laboratoriotutkimus I, II ja IV osan mukaisesti. 5. Terveystarkastusohjelmaa on noudatettava ainakin 4 vuotta kaikissa hyväksyntää hakevissa vyöhykkeellä sijaitsevissa kalanviljelylaitoksissa tai (muulla kuin hyväksytyllä vyöhykkeellä sijaitsevassa) kalanviljelylaitoksessa. 6. Jotta ohjelma voidaan tunnustaa virallisesti, yhtään VHS- tai IHN-tapausta ei saa olla ilmennyt tai todettu (ei kliinisiä tartuntoja eikä virusisolaatiota). IV OSA Titraatiomenettely soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi Seuraavassa esitetään I.III.3 osassa tarkoitetut suositellut titraatiomenettelyt. Määrityksessä olisi käytettävä ainakin kahta VHSV-isolaattia ja yhtä IHNV-isolaattia. Isolaattien tulisi edustaa tärkeimpiä EU:ssa esiintyviä virusryhmiä, esimerkiksi VHSV:n osalta olisi oltava yksi makean veden kirjolohen patogeeninen ja yksi piikkikampelan isolaatti ja IHNV:n osalta yksi makean veden kirjolohen patogeeninen eurooppalainen kanta. Määrityksessä olisi käytettävä jäsenvaltioiden hyvin määriteltyjä isolaatteja. Vertailuisolaatteja on saatavilla yhteisön kalatautien vertailulaboratoriosta. Viruksia, jotka ovat peräisin vain muutaman kerran siirrostetuista viljelmistä, viljellään kudosviljelypulloissa, joissa on BF-2- tai RTG-2-soluja (VHS-virusmääritystä varten) tai EPC-soluja (IHN-virusmääritystä varten). Elatusaineessa olisi oltava vähintään 10 prosenttia seerumia. Inokulaatiossa on käytettävä alhaista infektiokerrointa (< 1). Kun sytopaattinen vaikutus on täysin kehittynyt, virukset otetaan talteen sentrifugoimalla soluviljelmien supernatanttia 2000 x g 15 minuutin ajan. Neste steriloidaan 0,45 ìm:n kalvosuodattimella ja jaetaan etiketillä merkittyihin kryoputkiin. Virus säilytetään - 80 °C:n lämpötilassa. Viikon kuluttua jäädyttämisestä kolme rinnakkaisnäytepulloa sulatetaan kylmän vesihanan alla, ja virusnäytteet titrataan vastaavilla solulinjoilla. Vähintään 6 kuukauden välein tai aina, kun epäillään solulinjan herkkyyden vähentyneen, kukin virusisolaatti sulatetaan ja titrataan. Titraatiomenettelyt on kuvattava yksityiskohtaisesti ja noudatettava samaa menettelyä joka kerta. Jos titrauksessa määritetään loppupistelaimennus, on määritykseen otettava vähintään 6 rinnakkaisnäytettä kustakin laimennuksesta. Tittereitä verrataan aiemmin saatuihin tittereihin. Jos jollekin kyseisiin kolmeen virusisolaattiin kuuluvista isolaateista saadaan titteri, joka laskee on 2 log-kertaluvun verran (tai enemmän) kuin alkuperäinen titteri, kyseistä solulinjaa ei saa enää käyttää valvonnassa. Jos laboratoriossa pidetään erilaisia solulinjoja, kukin linja on tutkittava erikseen. Kirjanpito on säilytettävä vähintään 10 vuotta. V OSA Lyhytnimet ja lyhenteet BF-2 BF-2 isoaurinkoahvenen fibroblastit (solulinja) CPE Sytopaattinen vaikutus CRL Yhteisön kalatautien vertailulaboratorio ELISA Entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys EPC Epithelioma papulosum cyprinii (solulinja) FHM Paksupäämutu (solulinja) FITC Fluoreseiini-isotiosyanaatti Hepes N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo HRP Piparjuuriperoksidaasi IF Immunofluoresenssi IFAT Epäsuora fluoresenssivasta-ainetesti IHN(V) Vertamuodostavan kudoksen tarttuva kuolio (virus) IPN(V) Kalojen tarttuva haimakuoliotauti (virus) MEM Vähimmäismäärä olennaista elatusainetta MOI Infektiokerroin (infektiivisten viruspartikkelien lukumäärä ja viljelmässä olevien solujen määrän suhde) OPD O-fenyleenidiamiini PBS Fosfaattipuskuroitu suolaliuos RTG-2 Kirjolohen sukurauhaset (solulinja) RT-PCR Käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio Tris-HCl Tris(hydroksimetyyli) aminometaani-HC1 TRITC Tetrametyyli-rodamiini-isotiosyanaatti VHS(V) Virusperäinen verenvuotoseptikemia (virus) (1) Poikkeustapauksissa esimerkiksi silloin, kun kaloja kerätään hyvin syrjäisiltä alueilta, joilta ei ole mahdollisuutta postittaa päivittäin. (2) Tai siten kuin vertailulaboratorio määrittelee antiseerumin mahdollisen sytotoksisuuden osalta. (3) Tai siten kuin vertailulaboratorio määrittelee antiseerumin mahdollisen sytotoksisuuden osalta. (4) Tai siten kuin vertailulaboratorio määrittelee antiseerumin mahdollisen sytotoksisuuden osalta.