Komission asetus (EY) N:o 1081/96, annettu 14 päivänä kesäkuuta 1996, vertailumenetelmästä lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseksi uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa ja asetuksen (ETY) N:o 690/92 kumoamisesta



Virallinen lehti nro L 142 , 15/06/1996 s. 0015 - 0025



KOMISSION ASETUS (EY) N:o 1081/96, annettu 14 päivänä kesäkuuta 1996, vertailumenetelmästä lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseksi uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa ja asetuksen (ETY) N:o 690/92 kumoamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon maito- ja maitotuotealan yhteisestä markkinajärjestelystä 27 päivänä kesäkuuta 1968 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 804/68 (1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission asetuksella (EY) N:o 2931/95 (2), ja erityisesti sen 9 artiklan 3 kohdan, 16 artiklan 1 kohdan ja 4 kohdan sekä 17 artiklan 14 kohdan, sekä katsoo, että tukea uuhenmaidosta valmistettujen juustojen yksityiselle varastoinnille voidaan myöntää kypsytettävien juustojen yksityiselle varastoinnille annettavan tuen myöntämistä koskevista yleisistä säännöistä 8 päivänä maaliskuuta 1971 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 508/71 (3) nojalla; on odotettavissa, että uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistettuja juustoja tuodaan yhteisöön kolmansista maista suosituimmuusjärjestelyjen mukaisesti, edellä mainittujen olemassa olevien uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistettuja juustoja koskevien säännösten mukaisesti on tarpeen todentaa asianmukaisella tarkastuksella, etteivät kyseiset tuotteet sisällä lehmänmaitoa; on aiheellista vahvistaa yhteinen vertailumenetelmä lehmänmaidon toteamiseksi, sanotun kuitenkaan estämättä tavanomaisten menetelmien käyttöä, jos ne ovat yhdenmukaisia tiettyjen perusteiden kanssa, uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistettuihin juustoihin sovellettava vertailumenetelmä korvaa komission asetuksessa (ETY) N:o 690/92 (4) kuvatun vertailumenetelmän, joka voidaan siten kumota, ja tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat maidon ja maitotuotteiden hallintokomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla Liitteessä olevaa vertailumenetelmää sovelletaan sen varmistamiseksi, ettei juusto, joka on valmistettu yksinomaan uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista, sisällä lehmänmaidon kaseiinia. Lehmänmaidon kaseiinia katsotaan esiintyvän silloin, jos analysoitavan näytteen näennäinen lehmänmaidon kaseiinipitoisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin liitteessä kuvatun 1 prosentia lehmänmaitoa sisältävän vertailunäytteen pitoisuus. 2 artikla Edellä 1 artiklassa tarkoitettuja tavanomaisia menetelmiä lehmänmaidon kaseiinin toteamiseksi juustoissa voidaan käyttää seuraavin edellytyksin: - toteamisrajan on oltava 0,5 prosenttia tai alle sen, - vääriä positiivisia tuloksia ei saa esiintyä. Jos niitä ei voida välttää, kaikki näytteet, joista on saatu positiivinen tulos, on analysoitava vertailumenetemää käyttäen, - lehmänmaidon kaseiinin on oltava havaittavissa vaaditulla herkkyydellä pitkienkin kypsyttämisjaksojen jälkeen, kuten voi tapahtua tavanomaisissa kaupallisissa olosuhteissa. Jos tämä vaatimus ei täyty tietyntyyppisen 1 artiklassa tarkoitetun juuston osalta, kyseinen juusto on analysoitava vertailumenetelmää käyttäen. 3 artikla Kumotaan asetus (ETY) N:o 690/92. Asetuksen (ETY) N:o 690/92 liitteitä pidetään tämän asetuksen liitteinä. 4 artikla Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Sitä sovelletaan 1 päivästä lokakuuta 1996. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 14 päivänä kesäkuuta 1996. Komission puolesta Franz FISCHLER Komission jäsen (1) EYVL N:o L 148, 28.6.1968, s. 13 (2) EYVL N:o L 307, 20.12.1995, s. 10 (3) EYVL N:o L 58, 11.3.1971, s. 1 (4) EYVL N:o L 74, 20.3.1992, s. 23 LIITE VERTAILUMENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN TOTEAMISEKSI UUHEN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI UUHEN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA 1. Tarkoitus Lehmänmaidon ja kaseinaatin toteaminen uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysin jälkeisten ã-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla. 2. Soveltamisala Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin toteamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti uuhen-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa. Se ei sovellu maidon ja juuston toteamiseen, joita on väärennetty lämpökäsittelyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla. 3. Menetelmän periaate 3.1 Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista. 3.2 Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja plasmiinilla (EC.3.4.21.7) pilkkominen. 3.3 Plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys. 3.4 Värjättyjen ã3- ja ã2-kaseiinikuvioiden (todiste lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samasta 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävien vertailustandardien geelistä. 4. Reagenssit On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita. Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa. Huom. Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 × 125 × 0,25 mm. Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään. Isoelektrinen fokusointi 4.1 Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi 4.1.1 Geelin varastoliuos Liuotetaan 4,85 g akryyliamidia 0,15 g N, N'-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS) 48,05 g ureaa 15,00 g glyserolia (87 % w/w) veteen ja täydennetään 100 ml:ksi, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa. Huom. Käytetään mieluummin kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta kuin annettuja painoltaan määrättyjä hermomyrkyllisiä akryyliamideja. Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan. Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 ìS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amerblite MB-3 kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 ìm:n kalvon läpi. 4.1.2 Geeliliuos Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (ks. 4.1.1). 9,0 ml varastoliuosta 24 mg de ß-alaniinia500 ìl amfolyyttiä, pH 3,5-9,5 (1) 250 ìl amfolyyttiä, pH 5-7 (2) 250 ìl amfolyyttiä, pH 6-8 (3) Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa kahden-kolmen minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä. Huom. Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2). 4.1.3 Katalyyttiliuokset 4.1.3.1 N, N, N', N'-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED) 4.1.3.2 40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER): Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täydennetään 2 ml:ksi. Huom. Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta. 4.2 Kontaktineste Petroli tai parafiiniöljy. 4.3 Anodiliuos Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi. 4.4 Katodiliuos Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä. Näytteen valmistus 4.5 Reagenssit proteiinien eristämiseksi 4.5.1 Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täydennetään 100 ml:ksi vedellä). 4.5.2 Dikloorimetaani. 4.5.3 Asetoni. 4.6 Proteiinia liuottava puskuriliuos Liuotetaan 5,75 g glyserolia (87 % w/w) 24,03 g ureaa 250 mg ditiotreitolia veteen ja täydennetään 50 ml:ksi. Huom. Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko. 4.7 Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla 4.7.1 Ammoniumkarbonaattipuskuri Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8. 4.7. Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml. 4.7.3 å-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten Liuotetaan 2,624 g å-aminkapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia. 4.8 Standardit 4.8.1 Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta uuhenmaidon ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana komission Mittaus- ja vertailumateriaalien tutkimuslaitoksesta (Institute for Reference Materials and Measurements), B-2440 Geel, Belgia. 4.8.2 Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa. Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa nopeudella 2 500 g 20 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6-8 °C, poistetaan ylempi rasvakerros kokonaan. 1 % standardin valmistamiseksi lisätään 5,00 ml naudan rasvatonta maitoa 495 ml:aan puhvelin rasvatonta maitoa 1 l:n dekantterilasissa, säädetään pH:n arvoksi 6,4 laimeaa maitohappoa (10 % w/v) lisäämällä. Säädetään lämpötila 35 °C:seen ja lisätään 100 ìl vasikanjuoksetta (juoksetteen aktiivisuus 1:10 000, n. 3 000 U/ml), sekoitetaan 1 minuutin ajan ja sen jälkeen dekantterilasi jätetään seisomaan alumiinifoliolla päällystettynä 35 °C:seen yhdeksi tunniksi juustomassan muodostamiseksi. Kun juustomassa on muodostunut, juoksettunut maito kylmäkuivataan kokonaisuudessaan ilman enempää homogenisointia tai heran valuttamista. Kylmäkuivauksen jälkeen se jauhetaan hienoksi homogeenisen jauheen saamiseksi. 0 % standardin valmistamiseksi suoritetaan sama menettely aitoa rasvatonta puhvelinmaitoa käyttäen. Standardeja on säilytettävä lämpötilassa - 20 °C. Huom. On suositeltavaa tarkistaa puhvelinmaidon puhtaus plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla ennen standardien valmistamista. Reagenssit proteiinien värjäykseen 4.9 Kiinnitysaine Liuotetaan 150 g trikloorietikkahappoa veteen ja täydennetään 1 000 ml:ksi. 4.10 Värinpoistoliuos Laimennetaan 500 ml metanolia ja 200 ml jääetikkaa 2 000 ml:ksi tislatulla vedellä. Huom. Värinpoistoliuos on valmistettava tuoreeksi joka päivä; se voidaan valmistaa sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet varastoliuoksia, 50 % (v/v) metanolia ja 20 % (v/v) jääetikkaa. 4.11 Värjäysliuokset 4.11.1 Värjäysliuos (varastoliuos 1) Liuotetaan 3,0 g Coomassie-briljanttisinistä G 250 (C.I. 42655) 1 000 ml:aan 90 % (v/v) metanolia magneettisekoittajaa käyttäen (n. 45 minuuttia), suodatetaan kahden keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi. 4.11.2 Värjäysliuos (varastoliuos 2) Liuotetaan 5,0 g kuparisulfaattipentahydraattia 1 000 ml:aan 20 % (v/v) etikkahappoa. 4.11.3 Värjäysliuos (työskentelyliuos) Sekoitetaan yhteen 125 ml kumpaakin varastoliuosta (4.11.1, 4.11.2) välittömästi ennen värjäystä. Huom. Värjäysliuos tulisi valmistaa sinä päivänä, jolloin sitä käytetään. 5. Välineet 5.1 Lasilevyjä (265 × 125 × 4 mm); kumitela (leveys 15 cm); vaakatasopöytä. 5.2 Kantaja-arkki geelille (265 × 125 mm). 5.3 Peitearkki (280 × 125 mm). Kiinnitetään teippinauha (280 × 6 × 0,25 mm) kummallekin pitkälle sivulle (ks. kuva 1). 5.4 Elektrofokusointikammio, jossa on jäähdytyslevy (esim. 265 × 125 mm) ja sopiva virtalähde (≥ 2,5 kV) tai automaattinen elektroforeesilaite. 5.5 Kiertokryostaatti, säädetty termostaatilla lämpötilaan 12 ± 0,5 °C. 5.6 Sentrifugi, säädettävissä nopeuteen 3 000 g. 5.7 Elektroninauhat (pituus ≥ 265 mm). 5.8 Muovisia tippapulloja anodi- ja katodiliuoksille. 5.9 Näyteapplikaattoreita (10 × 5 mm, viskoosia tai niukasti proteiineja absorboivaa suodatinpaperia). 5.10 Ruostumatonta terästä olevia saksia, leikkausveitsiä ja pinsettejä. 5.11 Ruostumatonta terästä olevia tai lasisia värjäys- ja värinpoistoastioita (esim. 280 × 150 mm välinetarjottimia). 5.12 Säädettävissä oleva sauvahomogenisaattori (varren halkaisija 10 mm), rpm alueella 8 000-20 000. 5.13 Magneettisekoittaja. 5.14 Ultraäänihaude. 5.15 Kalvojen saumaukseen sopiva laite. 5.16 Mikropipettejä, 5-25 ìl. 5.17 Tyhjiöhaihdutin tai kylmäkuivain. 5.18 Vesihaude, joka on termostaatilla säädettävissä lämpötiloihin 35 ja 40 ± 1 °C, ravistelijalla varustettuna. 5.19 Tiheysmittari, luettavissa aallonpituudella ë=634 nm. 6. Menettely 6.1 Näytteen valmistus 6.1.1 Kaseiinien eristäminen Punnitaan 5 g:aa vastaava määrä juuston kuiva-ainetta tai vertailustandardeja 100 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 60 ml tislattua vettä ja homogenisoidaan sauvahomogenisaattorilla (8 000 - 10 000 rpm). Säädetään pH-arvoon 4,6 laimean etikkahapon (4.5.1) avulla ja sentrifugoidaan (5 min, 3 000 g). Dekantoidaan rasva ja hera, homogenisoidaan jäännös nopeudella 20 000 rpm 40 ml:n kanssa tislattua vettä, jonka pH on säädetty arvoon 4,5 laimean etikkahapon (4.5.1) avulla, lisätään 20 ml dikloorimetaania (4.5.2), homogenisoidaan jälleen ja sentrifugoidaan (5 min, 3 000 g). Poistetaan lastalla kaseiinikerros, joka kelluu vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä (ks. kuva 2) ja dekantoidaan molemmat faasit pois. Homogenisoidaan kaseiini uudelleen 40 ml:n tislattua vettä (ks. edellä) ja 20 ml:n dikloorimetaania (4.5.2) kanssa ja sentrifugoidaan. Toistetaan menettely, kunnes molemmat uuttofaasit ovat värittömiä (2-3 kertaa). Homogenisoidaaan proteiinijäännös 50 ml:n kanssa asetonia (4.5.3) ja suodatetaan keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi. Pestään suodatinpaperille jäävä jäännös kahdesti kahdella erillisellä 25 ml:n annoksella asetonia ja annetaan kuivua ilmassa tai typpivirrassa; tämän jälkeen jauhetaan hienoksi huhmareessa. Huom. Kuivat eristetyt kaseiinit on säilytettävä lämpötilassa -20 °C. 6.1.2 ß-kaseiinien pilkkominen plasmiinilla ã-kaseiinin vahvistamiseksi Dispergoidaan 25 mg eristettyjä kaseiineja (6.1.1) 0,5 ml:aan ammoniumkarbonaattipuskuria (4.7.1) ja homogenisoidaan 20 minuutin ajan esim. ultraäänikäsittelyä käyttäen. Kuumennetaan lämpötilaan 40 °C ja lisätään 10ìl plasmiinia (4.7.2), sekoitetaan ja inkuboidaan tunnin ajan 40 °C:ssa jatkuvasti ravistellen. Entsyymin inhiboimiseksi lisätään 20 ìl å-kapronihappoliuosta (4.7.3), tämän jälkeen lisätään 200 mg kiinteää ureaa ja 2 mg ditiotreitolia. Huom. Symmetrisempien kaseiiniviivojen saamiseksi fokusoinnissa on suositeltavaa kylmäkuivata liuos å-kapronihappoliuoksen lisäämisen jälkeen ja liuottaa sitten jäännökset 0,5 ml:aan proteiinia liuottavaan puskuriin (4.6). 6.2 Ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistus Muutaman vesipisaran avulla levitetään geelin kantaja-arkki (5.2) lasilevyn (5.1) päälle poistaen kaikki ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä tai kankaalla. Samoin levitetään peitearkki (5.3), jossa on välikkeet (0,25 mm), toisen lasilevyn päälle. Asetetaan levy vaakasuoraan vaakatasopöydälle. Lisätään 10 ìl TEMED:tä (4.1.3.1) valmistettuun ilmattomaan geeliliuokseen (4.1.2), sekoitetaan ja lisätään 10 ìl PER-liuosta (4.1.3.2), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan välittömästi tasaisesti peitearkin keskikohtaan. Asetetaan geelin kantajalevyn yksi reuna (arkkipuoli alaspäin) peitearkin päälle ja lasketaan sitä hitaasti niin, että geelikerros muodostuu arkkien väliin ja leviää tasaisesti ja ilman kuplien muodostumista (kuva 3). Lasketaan varovasti geelin kantajalevy kokonaan alas ohutta lastaa käyttäen ja asetetaan vielä kolme lasilevyä sen päälle painoksi. Kun polymeroituminen on tapahtunut (noin 60 min), poistetaan geelin kantaja-arkille polymeroitunut geeli yhdessä peitearkin kanssa lasilevyjä koputellen. Puhdistetaan kantaja-arkin kääntöpuoli huolellisesti geelijäännösten ja urean poistamiseksi. Saumataan geeli-sandwich kalvorullaksi ja säilytetään jääkaapisssa (enintään 6 viikkoa). Huom. Välikkeellistä peitearkkia voidaan käyttää uudelleen. Polyakryyliamidigeeli voidaan leikata pienempiin osiin, mitä suositellaan, kun näytteitä on ainoastaan muutama tai jos käytetään automaattista elektroforeesilaitetta (2 geeliä, koko 4,5 × 5 cm). 6.3 Isoelektrinen fokusointi Säädetään jäähdyttävä termostaatti 12 °C:seen. Pyyhkäistään geelin kantaja-arkin kääntöpuoli petrolilla, tipautetaan sitten muutama pisara petrolia (4.2) jäähdytyslohkon keskelle. Sen jälkeen geeli-sandwich levitetään kantajapuoli alaspäin lohkon päälle siten, ettei muodostu kuplia. Pyyhkäistään ylimääräinen petroli pois ja poistetaan peitearkki. Imeytetään elektrodinauhoihin elektrodiliuoksia (4.3, 4.4), leikataan geelin pituisiksi ja asetetaan asianmukaisille paikoille (elektrodien etäisyys 9,5 cm). Isoelektrisen fokusoinnin olosuhteet: 6.3.1 Geelikoko 265 mm × 125 mm × 0,25 mm >TAULUKON PAIKKA> Huom. Jos geelien paksuutta tai leveyttä muutetaan, sähkövirran ja tehon arvoja on säädettävä sopivasti (esim. sähkövirran ja tehon arvot on kaksinkertaistettava, jos käytetään 265 mm × 125 mm × 0,5 mm geeliä). 6.3.2 Esimerkki automaattisen elektroforeesilaitteen jänniteohjelmasta (2 kooltaan 5,0 × 4,5 cm geeliä); elektrodit asetetaan suoraan geeliin ilman nauhoja. >TAULUKON PAIKKA> Asetetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 0 Vh Poistetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 30 Vh 6.4 Proteiinien värjäys 6.4.1 Proteiinien kiinnitys Poistetaan elektrodinauhat välittömästi virran sammuttamisen jälkeen ja asetetaan geeli välittömästi värjäys/värinpoistoastiaan, joka on täytetty 200 ml:lla kiinnitysainetta (4.9); jätetään 15 minuutiksi, jatkuvasti ravistellen. 6.4.2 Geelilevyn pesu ja värjäys Valutetaan kiinnitysaine huolellisesti pois ja pestään geelilevy kahdesti, 30 sekuntia kummallakin kerralla, 100 ml:lla värinpoistoliuosta (4.10). Kaadetaan värinpoistoliuos pois ja täytetään astia 250 ml:lla värjäysliuosta (4.11.3); annetaan värjäytyä 45 minuuttia kevyesti ravistellen. 6.4.3 Geelilevyn värinpoisto Kaadetaan värjäysliuos pois, pestään geelilevy kahdesti käyttäen 100 ml:aa värinpoistoliuosta (4.10) kummallakin kerralla, ravistellaan sitten 15 minuutin ajan 200 ml:ssa värinpoistoliuosta ja toistetaan värinpoistovaihe vähintään 2 tai 3 kertaa, kunnes tausta on kirkas ja väritön. Huuhdellaan geelilevy sen jälkeen tislatulla vedellä (2 × 2 min.) ja kuivataan ilmassa (2-3 tuntia) tai hiustenkuivaajalla (10-15 min.). Huom. 1: Kiinnitys, pesu, värjäys ja värinpoisto on tehtävä 20 °C:ssa. Korkeampia lämpötiloja ei saa käyttää. Huom. 2: Jos herkempää hopeavärjäystä (esim. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code N:o 17-1150-01) pidetään parempana, plasmiini-käsitellyt kaseiininäytteet on laimennettava 5 mg/ml:ksi. 7. Arviointi Arviointi suoritetaan vertaamalla tuntemattoman näytteen proteiinikuviota vertailustandardeihin samassa geelissä. Lehmänmaidon toteaminen uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidosta sekä uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksesta valmistetuissa juustoissa tapahtuu ã2- ja ã3-kaseiinien välityksellä, joiden isoelektriset pisteet vaihtelevat välillä pH 6,5-7,5 (kuvat 4a ja 4b, kuva 5). Toteamisraja on alle 0,5 %. 7.1 Silmämääräinen arviointi Naudanmaidon määrän arvioimiseksi silmämääräisesti on suositeltavaa säätää näytteiden ja standardien pitoisuudet samantasoisten intensiteettien saamiseksi lampaan, vuohen ja/tai puhvelin ã2- ja ã3-kaseiineille (ks. "ã2 E, G, B" ja "ã3 E, G, B" kuvissa 4a ja 4b, kuvassa 5). Näiden mukaisesti naudanmaidon määrä (vähemmän kuin, yhtä paljon kuin tai enemmän kuin 1 %) tuntemattomassa näytteessä voidaan todeta suoraan vertaamalla naudan ã3- ja ã2-kaseiinien voimakkuutta (ks. "ã3 C" ja "ã2 C" kuvissa 4a ja 4b, kuvassa 5) vastaaviin 0 %:n ja 1 %:n vertailustandardeihin (uuhi, vuohi) tai laboratorion välistandardeihin (puhveli). 7.2 Tiheysmittaukseen perustuva arviointi Jos mahdollista, käytetään tiheysmittaria (5.19) naudan ã2- ja ã3-kaseiinien piikkien pinta-alojen määrittämiseksi suhteessa lampaan, vuohen ja/tai puhvelin vastaaviin (ks. kuva 5). Tätä arvoa verrataan 1 %:n vertailustandardin (uuhi, vuohi) tai laboratorion välistandardin (puhveli) ã2- ja ã3 -kaseiinipiikkien pinta-alan suhteeseen, kun analysointi on suoritettu samassa geelissä. Huom. Menetelmä toimii tyydyttävästi, jos 1 %:n vertailustandardissa esiintyy selvä positiivinen merkki sekä naudan ã2- että ã3-kaseiineista, muttei merkkejä 0 %:n vertailustandardeissa. Jos näin ei ole, menettelyä on parannettava noudattamalla täsmällisesti menetelmän yksityiskohtia. Näyte todetaan positiiviseksi, jos naudan sekä ã2- että ã3-kaseiinien tai vastaavien piikkien pinta-alojen suhteet ovat yhtä suuret tai suuremmat kuin 1 %:n vertailustandardin taso. 8. Viitteet 1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990). 2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995). 3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of ã2-caseins using plasmin as signal amplifier. Julkaisussa: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, toim.) ss 389-393, Bode-Verlag, München (1989). 4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982). 5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980). >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 1: Kaaviokuva peitearkista >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 2: Vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä kelluva kaseiinikerros sentrifugoinnin jälkeen >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 3: Sulkemistekniikka erittäin ohuiden polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi. a = väliketeippi (0,25 mm); b = peitearkki (5.3); c, e = lasilevyt (5.1); d = geeliliuos (4.1.2); f = geelin kantaja-arkki (5.2) >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 4a: Uuhen- ja vuohenmaidosta valmistetun juuston, joka sisältää eri määriä lehmänmaitoa, plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi. Merkinnät: % CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, C = lehmä, E = uuhi, G = vuohi. Kuvassa on esitetty IEF-geelin ylempi puolisko. >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 4b: Uuhen-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetun juuston, joka sisältää eri määriä lehmänmaitoa, plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi. Merkinnät: % CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, 1+ = näyte, joka sisältää 1 % lehmänmaitoa ja johon on lisätty puhdasta naudan kaseiinia linjan keskellä. C = lehmä, E = uuhi, G = vuohi, B = puhveli. Kuvassa on esitetty IEF-geelin koko erotusetäisyys. >VIITTAUS FILMIIN> Kuva 5: Standardien (STD) sekä uuhen- ja vuohenmaidon seoksesta valmistetun juuston näytteiden densitogrammit päällekkäin asetettuna isoelektrisen fokusoinnin jälkeen. a, b = standardit, jotka sisältävät 0 ja 1 % lehmänmaitoa, c-g = juustonäytteet, jotka sisältävät 0, 1, 2, 3 ja 7 % lehmänmaitoa. C = lehmä, E = uuhi, G = vuohi. Ylempi puolisko IEF-geelistä tutkittiin aallonpituudella ë = 634 nm. (1) Valmisteet Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ja Resolyte® pH 5-7 ja pH 6-8 (BHD, Merck) ovat osoittautuneet erityisen sopiviksi vaaditun ã-kaseiinien erottumisen saamiseksi.