KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 72/77, annettu 13 päivänä tammikuuta 1977, öljysiementen näytteiden otosta ja esikäsittelystä sekä öljy-, epäpuhtaus- ja kosteuspitoisuuden määrittämisestä annetun asetuksen (ETY) N:o 1470/68 muuttamisesta



Virallinen lehti nro L 012 , 15/01/1977 s. 0011 - 0024

Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 7 s. 0218

Kreikank. erityispainos: Luku 03 Nide 16 s. 0215

Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 7 s. 0218

Espanjank. erityispainos: Luku 03 Nide 11 s. 0104

Portugalink. erityispainos: Luku 03 Nide 11 s. 0104



KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 72/77, annettu 13 päivänä tammikuuta 1977, öljysiementen näytteiden otosta ja esikäsittelystä sekä öljy-, epäpuhtaus- ja kosteuspitoisuuden määrittämisestä annetun asetuksen (ETY) N:o 1470/68 muuttamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon rasva-alan yhteisestä markkinajärjestelystä 22 päivänä syyskuuta 1966 annetun neuvoston asetuksen N:o 136/66/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1707/73(2), ja erityisesti sen 26 artiklan 3 kohdan, sekä katsoo, että olisi säädettävä aiheellisesta menetelmästä erukahapon pitoisuuden täsmälliseksi määrittämiseksi rapsin ja rypsin siemenistä; tämän vuoksi olisi muutettava öljysiementen näytteiden otosta ja esikäsittelystä sekä öljy-, epäpuhtaus- ja kosteuspitoisuuden määrittämisestä 23 päivänä syyskuuta 1968 annettu komission asetus (ETY) N:o 1470/68(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (ETY) N:o 3025/75(4), ja tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat rasvojen hallintokomitean lausunnon mukaiset, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla Lisätään asetukseen (ETY) N:o 1470/68 seuraava 2 b artikla: "Asetuksen N:o 282/67/ETY 4 artiklassa tarkoitettu erukahappopitoisuuden määritys on tehtävä tämän asetuksen liitteessä VI määritellyn menetelmän mukaisesti. Asetuksen N:o 282/67/ETY 3 artiklan 2 kohdan mukainen erukahapon enimmäispitoisuus katsotaan olevan rapsin ja rypsin siemenissä, joista liitteessä VI olevan I osaston mukaisesti uutettu öljy sisältää enintään 15,0 prosenttia erukahappoa C 22, liitteessä VI olevien II ja III osastojen mukaisesti laskettuna." 2 artikla Täydennetään asetus (ETY) N:o 1470/68 tämän asetuksen liitteenä olevalla liitteellä VI. 3 artikla Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 13 päivänä tammikuuta 1977. Komission puolesta Finn GUNDELACH Varapuheenjohtaja (1) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66 (2) EYVL N:o L 175, 29.6.1973, s. 5 (3) EYVL N:o L 239, 28.9.1968, s. 2 (4) EYVL N:o L 300, 20.11.1975, s. 5 LIITE VI YHTEISÖSSÄ KÄYTETTÄVÄ MENETELMÄ INTERVENTIOELINTEN HALLUSSA OLEVIEN SIEMENTEN ERUKAHAPPOPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMISEKSI I Näytteiden valmistus II Rasvahappojen metyyliestereiden valmistus III Rasvahappojen metyyliestereiden kaasukromatografia I NÄYTTEIDEN VALMISTUS 1. Näytteiden ottaminen siemenistä, laboratorionäytteiden esikäsittely määritettäviksi näytteiksi ja öljypitoisuuden määritys tuotteesta sellaisenaan tehdään asetuksen (ETY) N:o 1470/68 liitteissä I, II ja V määriteltyjen menetelmien mukaisesti. 2. Näytteenottomenettelyn kohteena olevista siemenistä uutetun öljynäytteen valmistus. 2.1 Näyte on nestemäinen ja täysin kirkas: näytettä ravistetaan varotoimenpiteenä ennen koenäytteiden ottamista. 2.2 Näyte on nestemäinen, mutta samea tai siinä on sakkaa: näyte asetetaan lämpökaappiin, jonka lämpötila on 50 °C. Kun näyte on saavuttanut tämän lämpötilan, ravistetaan voimakkaasti ja annetaan laskeutua. Suodatetaan paperin läpi lämpökaapissa, jonka lämpötila on 30 °C. 2.3 Näyte on kiinteä: näyte asetetaan lämpökaappiin, jonka lämpötila on 10 °C korkeampi kuin oletettu sulamislämpötila. Toimitaan kuten 2.1 (jos sulanut näyte on kirkas) ja 2.2 kohdassa (jos sulanut näyte on samea tai siinä on sakkaa). II RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMINEN 1. JOHDANTO Näiden menetelmien tarkoituksena on eläin- ja kasvirasvojen sekä kaikenlaisten rasvahappojen muuttaminen rasvahappojen metyyliestereiksi. Tällä tavoin saatuja metyyliestereitä voidaan käyttää useissa tällaista muutosta vaativissa menetelmissä: kaasukromatografiassa, ohutkerroskromatografiassa, infrapuna-spektrofotometriassa jne. 2. SOVELTAMISALA Kuvailtuja menetelmiä sovelletaan eläin- ja kasvirasvoihin. Menetelmiä, jotka on kuvattu 3 kohdassa, sovelletaan sellaisten rasvahappojen metyyliestereiden valmistukseen, joissa on vähintään kuusi hiiliatomia. Jos läsnä on C6- ja C8-rasvahappoja ja on kyse kaasukromatografiaan tarkoitettujen estereiden valmistamisesta, metyyliestereiden liuoksesta ei saisi poistaa liuotinta. Jäljempänä 3.1 kohdassa kuvailtu yleinen menetelmä voi tuottaa virheellisiä tuloksia, jos läsnä on: - sekundäärisiä happiryhmiä sisältäviä yhdisteitä (hydroksi-, hydroperoksi-, keto- tai epoksiryhmiä); - syklopropaani- tai syklopropeeniryhmiä sisältäviä yhdisteitä; - konjugoituneita monityydyttymättömiä yhdisteitä ja asetyleeniyhdisteitä; - vahoja, tällöin on suositeltavaa käyttää jotakin 3.2 kohdassa kuvatuista menetelmistä. Rasvat, jotka sisältävät vain vähän tällaisia ryhmiä (esimerkiksi puuvillansiemenöljy), voidaan kuitenkin määrittää 3.1 menetelmän mukaisesti. Fosfolipidit voidaan määrittää rasvahappojen saippuoinnin ja esteröinnin jälkeen. Saippuoitumatonta ainetta ei poisteta ja, jos sitä esiintyy huomattavissa määrin, se voi häiritä myöhempiä määrityksiä (huomautus 1). 3. MENETELMÄ SELLAISTEN RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMISEKSI, JOISSA ON VÄHINTÄÄN KUUSI HIILIATOMIA Jäljempänä 3.1 kohdassa annetaan yleinen metyyliestereiden valmistusmenetelmä, jossa käytetään booritrifluoridia, ja jota olisi mieluiten sovellettava. Kun ei ole mahdollista käyttää tätä menetelmää, käytetään 3.2 kohdassa kuvattuja korvaavia menetelmiä. 3.1 Yleinen menetelmä booritrifluoridia käyttäen 3.1.1 Periaate Glyseridien saippuoiminen ja sitten rasvahappojen vapauttaminen ja esteröiminen booritrifluoridin läsnäollessa. 3.1.2 Välineet - 50 100 ml pulloja, joissa hiottu kaula - palautusjäähdytin, jonka tehollinen pituus on 20 30 cm ja jossa on pulloon sopiva hios, - rasvaton kiehumakivi, - putki typpihuuhtelua varten, - mittapipetti, jonka tilavuus on vähintään 10 ml ja pumpetti tai automaattipipetti; - hioksellisia koeputkia tulppineen, - 250 ml erotussuppiloita. 3.1.3 Reagenssit - natriumhydroksidin metanoliliuos, noin 0,5 N: liuotetaan 2 g natriumhydroksidia 100 ml:aan metanolia, joka sisältää enintään 0,5 % (m/m) vettä. Kun liuosta on käytettävä melko pitkän aikaa, muodostuu hiukan natriumkarbonaattia (valkoinen sakka); tällä ei ole mitään vaikutusta metyyliestereiden valmistukseen, - booritrifluoridin metanoliliuos, jonka pitoisuus on 12 15 % (m/m). (Markkinoilla on liuoksia, joiden pitoisuus on 14 50 %.) (huomautus 2). Varoitus: Booritrifluoridi on myrkyllinen yhdiste. Siksi ei suositella, että liuos valmistetaan itse booritrifluoridista ja metanolista (huomautus 3). - heptaani, kromatografiaa varten (huomautus 2, huomautus 4), - toistotislattu petrolieetteri (kp. 40 60 °C), jonka bromiluku on alle 1 ja joka ei sisällä jäännöksiä tai heksaania (huomautus 2), - vedetön natriumsulfaatti, - natriumkloridin kyllästetty liuos, - metyylipuna, 0,1 % (m/v) liuos 60 % (v/v) etanolissa, - typpi, joka sisältää happea vähemmän kuin 5 mg/kg. 3.1.4 Menettely Booritrifluoridin myrkyllisyydestä johtuen seuraavat toimenpiteet on tehtävä vetokaapissa. Kaikki lasitavarat on pestävä vedellä välittömästi käytön jälkeen. Jos öljyt tai rasvahapot sisältävät happoja, joissa on enemmän kuin kaksi kaksoissidosta, on suositeltavaa poistaa ilma metanolista ja pullosta muutaman minuutin kestävällä typpihuuhtelulla. Näyte valmistetaan kohdan "I. Näytteiden valmistus" mukaisesti. Tarkka punnitus ei ole tarpeen. Koenäytteen koko on tunnettava ainoastaan pullon koon ja reagenssien määrän valintaa varten, seuraavan taulukon mukaisesti: >TAULUKON PAIKKA> Jos metyyliesterit on tarkoitettu kaasukromatografisesti määritettäviksi, koenäytteen tulisi mieluiten olla noin 350 mg. Jos se on pienempi, olisi toteutettava varotoimenpiteitä sen varmistamiseksi, että näyte on edustava (huomautus 5). 3.1.4.1 Öljyt ja rasvat Valmistettu koenäyte laitetaan pulloon. Lisätään osoitettu määrä natriumhydroksidin metanoliliuosta ja kiehumakivi. Jäähdytin liitetään pulloon. Keitetään refluksoiden kiehuvaksi, kunnes rasvapisarat katoavat (tämä voi kestää 5 10 minuuttia tai, poikkeustapauksissa, kauemmin kuin 10 minuuttia). Mittapipetin ja pumpetin tai automaattipipetin avulla lisätään jäähdyttimen yläosan kautta kiehuvaan seokseen osoitettu määrä booritrifluoridin metanoliliuosta. Keittämistä jatketaan kahden minuutin ajan. Kiehuvaan seokseen lisätään jäähdyttimen yläosan kautta 2 5 ml heptaania (huomautus 4) (heptaanin määrä ei vaikuta reaktioon) ja keittämistä jatketaan minuutin ajan. Irrotetaan pullosta lämpölähde ja sitten jäähdytin. Lisätään muutama ml kylläistä natriumkloridiliuosta ja sekoitetaan varovasti pyörittämällä pulloa useaan kertaan. Jatketaan kylläisen natriumkloridiliuoksen lisäämistä, kunnes nesteen pinta ulottuu pullon kaulaan asti. Siirretään noin 1 ml ylimmästä kerroksesta (heptaaniliuos) hiokselliseen koeputkeen ja lisätään vesijäämien poistamiseksi tarvittava määrä vedetöntä natriumsulfaattia. Jos koenäyte on 350 mg, saatu liuos sisältää noin 5 10 % metyyliestereitä ja se voidaan injektoida suoraan kaasukromatografin kolonniin. Muissa tapauksissa heptaaniliuosta laimennetaan siten, että saadaan 5 10 % metyyliesteripitoisuus (huomautus 6). Koko määrän saamiseksi kuivina estereinä, suolaliuos ja heptaanifaasi siirretään 250 ml erotussuppiloon. Erotetaan. Suolaliuoksen uuttamiseen käytetään 50 ml petrolieetteriä (kp. 40 60 °C) tai heksaania. Tämä uutto toistetaan. Heptaanifaasi ja kaksi uutetta yhdistetään ja ne pestään 20 ml annoksilla vettä, kunnes happamuus on kadonnut (indikaattori: metyylipuna). Kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja haihdutetaan liuotin vesihauteessa typpivirrassa (huomautus 6, huomautus 7). Pienempien kuin 500 mg:n koenäytteiden osalta on suositeltavaa vähentää tässä suhteessa liuottimen ja veden määrää. 3.1.4.2 Rasvahapot Jos näyte muodostuu ainoastaan rasvahapoista, saippuoimista ei suoriteta. Haluttu määrä valmistettuja rasvahappoja laitetaan pulloon. Lisätään määrätty määrä booritrifluoridin metanoliliuosta. Kiehutetaan kahden minuutin ajan. Sen jälkeen toimitaan kuten 3.1.4.1 kohdassa, alkaen kohdasta: "Kiehuvaan seokseen lisätään...".3.2 Korvaavat menetelmät ilman booritrifluoridin käyttöä 3.2.1 Neutraalit rasvat (happoluku 2) ja rasvahapot 3.2.2.1 Periaate Happamien rasvojen osalta vapaiden rasvahappojen neutralointi, glyseridien emäksinen metanolyysi ja sitten rasvahappojen esteröinti happamassa ympäristössä. Rasvahappojen osalta esteröinti happamassa ympäristössä. 3.2.2.2 Välineet - nopean sekoittamisen mahdollistava sekoittaja ja soveltuva kuumennuslaite (esimerkiksi kuumennettava magneettisekoittaja), - 250 ml erlenmeyerpullo tai pyöreäpohjainen pullo, jossa on hiottu kaula, - putki typpihuuhtelua varten, - jäähdytin, joka voidaan liittää erlenmeyerpulloon tai pyöreäpohjaiseen pulloon, - rasvaton kiehumakivi, - 250 ml erotussuppiloita, - kapeakaulainen 100 ml erlenmeyerpullo. 3.2.2.3 Reagenssit - natriummetylaattiliuos, joka saadaan liuottamalla 1 g natriumia 100 ml:aan metanolia, joka sisältää enintään 0,5 % (m/m) vettä, - vedetön vetykloridihapon metanoliliuos, noin 1 N (ks. huomautukset 3.2.2.6 a) ja b) kohta), - heptaani, kromatografiaa varten (huomautus 2, huomautus 4), - vedetön natriumsulfaatti, - typpi, joka sisältää happea alle 5 mg/kg. 3.2.2.4 Menettely happamien rasvojen osalta (happoluku > 2) Jos öljyt sisältävät happoja, joissa on enemmän kuin kaksi kaksoissidosta, on suositeltavaa poistaa ilma metanolista ja pullosta muutaman minuutin kestävällä typpihuuhtelulla. Näyte valmistetaan kohdan "I. Näytteiden valmistus" mukaisesti. Laitetaan 250 ml:n erlenmeyerpulloon tai pyöreäpohjaiseen pulloon noin 4 g (huomautus 5) valmistettua rasvaa. Lisätään 40 ml natriummetylaattiliuosta (ks. huomautus 3.2.2.6 c) kohta). Liitetään palautusjäähdyttimeen, sekoitetaan ja kuumennetaan kiehuvaksi. Liuoksesta on tultava kirkasta; yleensä tämä tapahtuu noin 10 minuutin kuluttua. Käytännössä reaktio on päättynyt 15 minuutin kuluttua. Pulloon tai kolviin lisätään sitten vähintään 50 ml vetykloridiliuosta, kuumennetaan uudelleen kiehuvaksi ja keitetään 10 minuutin ajan (ks. huomautus 3.2.2.6 d) kohta). Jäähdytetään juoksevan veden alla, lisätään sitten pulloon tai kolviin 100 ml vettä ja kaadetaan seos 250 ml:n erotussuppiloon sekä lisätään 30 ml heptaania (huomautus 4). Ravistetaan voimakkaasti ja annetaan laskeutua, kunnes kaksi faasia on täysin erottunut. Heptaanifaasi otetaan talteen. Vesifaasi uutetaan toistamiseen 30 ml:lla heptaania. Nämä kaksi heptaaniuutetta yhdistetään ja pestään useaan kertaan vedellä, kunnes tulos on neutraali. Erottamisen jälkeen kuivataan natriumsulfaatilla. Suodatetaan puuvillan läpi ja haihdutetaan tarvittaessa 100 ml:n erlenmeyerpullossa kiehuvassa vesihauteessa typpihuuhtelulla (huomautus 6, huomautus 7), kunnes jäljellä on 20 ml liuotinta. 3.2.2.5 Menettely rasvahappojen osalta Rasvahappojen kohdalla on syytä käyttää seuraavaa yksinkertaistettua menettelyä: Jos rasvahapot sisältävät happoja, joissa on enemmän kuin kaksi kaksoissidosta, on suositeltavaa poistaa ilma metanolista ja pullosta muutaman minuutin kestävällä typpihuuhtelulla. Näyte valmistetaan kohdan "I. Näytteiden valmistus" mukaisesti. Laitetaan 250 ml:n erlenmeyerpulloon tai pyöreäpohjaiseen pulloon noin 4 g (huomautus 5) valmistettua rasvaa. Lisätään 50 ml vetykloridiliuosta ja kiehumakivi, liitetään palautusjäähdyttimeen ja kiehutetaan 10 minuutin ajan. Jäähdytetään juoksevan veden alla, lisätään sitten pulloon tai kolviin 100 ml vettä ja kaadetaan seos 250 ml:n erotussuppiloon sekä lisätään 30 ml heptaania (huomautus 4). Ravistetaan voimakkaasti ja annetaan laskeutua, kunnes kaksi faasia on täysin erottunut. Erotetaan vesifaasi ja uutetaan se uudelleen 30 ml:lla heptaania. Yhdistetään nämä kaksi heptaaniuutetta ja pestään ne useaan kertaan vedellä, kunnes tulos on neutraali. Erottamisen jälkeen kuivataan natriumsulfaatilla. Suodatetaan puuvillan läpi ja haihdutetaan 100 ml:n erlenmeyerpullossa kiehuvassa vesihauteessa typpihuuhtelulla (huomautus 6, huomautus 7), kunnes jäljellä on 20 ml liuotinta. 3.2.2.6 Huomautukset a) Laboratoriossa on helppo valmistaa pieniä määriä vedetöntä kaasumaista vetykloridihappoa vapauttamalla sitä yksinkertaisesti kaupallisesta liuoksesta (d = 1,18) väkevää rikkihappoa vähitellen lisäämällä (d = 1,84). Vapautuva kaasu kuivataan yksinkertaisesti kuplittamalla rikkihapon läpi. Koska metanolilla on suuri taipumus yhtyä vetykloridikaasuun, on hyvä toteuttaa kaikki tavanomaiset varotoimenpiteet saatettaessa ne kosketuksiin toistensa kanssa; kaasu johdetaan esimerkiksi pienen ylösalaisin käännetyn suppilon läpi, joka juuri ja juuri koskettaa metanolin pintaa. On myös mahdollista valmistaa etukäteen suuria määriä vetykloridin metanoliliuoksia, jotka säilyvät erinomaisesti hioksellisissa pulloissa pimeässä. b) Vetykloridihapon metanoliliuoksen sijasta voidaan käyttää noin 1 N rikkihapon metanoliliuosta, mutta esteröinnin on kestettävä vähintään 20 minuuttia ja saostunut natriumsulfaatti häiritsee kiehumista ja vaatii suodatusta tai magneettisekoittajan käyttöä. c) Ennen koenäytteen syöttöä voidaan myös lisätä 40 ml metanolia ja 0,4 g natriumia, valmistaen näin natriummetylaattiliuos paikalla. d) Hyvin happamien rasvojen osalta, ottaen huomioon natriummetylaatin suhteellisen merkittävä määrä, syntyy natriumkloridisakkaa, joka voi aiheuttaa ryöpsähtelyä seuraavan kiehumisen aikana. Tämä sakka voidaan suodattaa pois, mutta se ei yleensä ole tarpeen suositeltavan lyhyen kuumennusajan vuoksi. 4. ERITYISMENETELMÄT SELLAISTEN METYYLIESTEREIDEN VALMISTAMISEKSI, JOISSA ON VÄHINTÄÄN NELJÄ HIILIATOMIA 4.1 Periaate Metyyliesterit saadaan rasvojen reaktiosta kaliumhydroksidin metanoliliuoksen kanssa välivaiheessa ennen saippuoimista. 4.2 Soveltamisala Menetelmä on pääasiassa tarkoitettu sellaisten metyyliestereiden valmistukseen, jotka määritetään kaasukromatografialla. Menetelmä ei sovellu happamille rasvoille (happoluku > 2). 4.3 Välineet - noin 20 ml koeputkia, joissa on hiottu tulppa, - 50 ja 100 ml mittapulloja, - 1 ml (tai suurempia) mittapipettejä, - 10 ml mittalaseja. 4.4 Reagenssit - kaliumhydroksidin metanoliliuos, noin 2 N: liuotetaan 11,2 g kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia, joka sisältää enintään 0,5 % (m/m) vettä, - heptaani, kromatografiaa varten (huomautus 2, huomautus 4), - vertailuliuos I: 50 ml:n mittapulloon punnitaan 0,1 mg tarkkuudella 1 g metyylipentanoaattia ja täytetään merkkiin heptaanilla, - vertailuliuos II: 100 ml:n mittapulloon punnitaan 0,1 mg tarkkuudella 200 mg metyylipentanoaattia ja täytetään merkkiin heptaanilla. 4.5 Menettely Kun voihappo on myöhemmin määritettävä kaasukromatografisesti, on käytettävä vertailuliuosta: vertailuliuosta I, jos voihapon oletettu pitoisuus on suurempi kuin 1 % ja vertailuliuosta II, jos tämä on pienempi kuin 1 %. Jos rasvahappojen koostumus on määritettävä kaasukromatografisesti, vertailuliuosta ei saa käyttää. Näyte valmistetaan kohdan "I. Näytteiden valmistus" mukaisesti. Noin 20 ml:n koeputkeen, jossa on hiottu tulppa, punnitaan 1 mg tarkkuudella 1 g valmistettua näytettä. Lisätään 10 ml heptaania mittalasilla mitattuna. Lisätään mittapipetillä 1,0 ml soveltuvaa vertailuliuosta. Huomautus: Jos voihappoa ei tarvitse määrittää, näytteen punnitus 1 mg tarkkuudella ja vertailuliuoksen lisääminen ei ole tarpeen. Lisätään 0,5 ml noin 2 N kaliumhydroksidin metanoliliuosta ja sekoitetaan koeputken sisältöä heilutellen, kunnes se kirkastuu. Tämä kestää noin 20 sekuntia. Glyserolin erottumisen vuoksi liuos samenee uudelleen lähes heti kirkastumisen jälkeen. Glyseroli erottuu nopeasti. Erotetaan metyyliestereitä sisältävä ylin kerros. 5. HUOMAUTUKSIA 1. Jos saippuoitumaton aine häiritsee, laimennetaan saippuoimisen jälkeinen liuos vedellä ja poistetaan saippuoitumaton aine dietyylieetterillä, heksaanilla tai petrolieetterillä tavanomaisissa olosuhteissa uuttamalla. Tehdään vettä sisältävä saippualiuos happamaksi ja erotetaan rasvahapot. Valmistetaan niiden metyyliesterit 3.1.4.2 tai 3.2.3.5 menetelmän mukaisesti. 2. Metyyliestereiden kaasukromatografian yhteydessä tietyt reagenssit, erityisesti booritrifluoridin metanoliliuokset voivat aiheuttaa häiriöpiikkien ilmenemistä (booritrifluoridin metanoliliuoksilla alueella C20 C22). Tämän vuoksi jokainen uusi reagenssierä on tutkittava valmistamalla puhtaan öljyhapon metyyliestereitä ja kromatografoimalla ne. Jos ilmenee häiriöpiikki, kyseistä reagenssia ei saa käyttää. Eri reagenssit eivät saa aiheuttaa rasvahappojen metyyliestereitä häiritseviä piikkejä kaasukromatografian aikana. 3. Jos on ehdottoman välttämätöntä valmistaa booritrifluoridin metanoliliuos kaasumaisesta booritrifluoridista, toimitaan seuraavasti: taarataan kahden litran pullo, jossa on litra metanolia. Jäähdytetään jää-vesihauteessa. Vetokaapissa työskennellen pullo pidetään hauteessa ja kuplitetaan BF3:a kaasupullosta lasiputken läpi metanoliin, kunnes 125 g on absorboitunut. Ylläpidetään BF3-virtaa lasiputkessa ennen putken upottamista metanoliin ja siihen asti, kun se poistetaan, jotta estetään nesteen virtaaminen takaisin kaasun paineenalennusjärjestelmään. Kaasu ei saisi päästä pullosta ulos niin nopeasti, että syntyy valkoista sumua. Reagenssi säilyy kaksi vuotta. 4. Heptaani (kaasukromatografisesti tutkittu puhtaiden C7-isomeerien seos) voidaan korvata heksaanilla, jos läsnä ei ole rasvahappoja, joissa on vähintään 20 hiiliatomia. 5. Jos ei ole käytettävissä määrättyä määrää koenäytettä, määrä voidaan vähentää 10 mg:aan tai pienemmäksi, jos reagenssien määrää ja välineiden kokoa pienennetään samassa suhteessa. 6. Metyyliesterit on mieluiten määritettävä mahdollisimman nopeasti. Tarvittaessa metyyliestereitä sisältävä heptaaniliuos voidaan säilyttää inerttikaasussa jääkaapissa. Pitempää varastointia varten on suositeltavaa suojata metyyliesterit autoksidaatiolta lisäämällä hapettumisenestoliuosta sellaisena pitoisuutena, joka ei haittaa myöhempiä määrityksiä, esimerkiksi 0,005 % (m/v) BHT:ä (2,6di-t-butyyli-4-metyylifenolia). Tarvittaessa kuivia metyyliestereitä, jotka eivät sisällä liuottimia, voidaan säilyttää 24 tuntia inerttikaasussa jääkaapissa tai pidemmän aikaa sinetöidyssä tyhjöputkessa pakastimessa. 7. Osa haihtuvimmista metyyliestereistä voidaan menettää, jos liuottimen poistaminen pitkittyy tai jos typpivirta on liian voimakas. Infrapunaspektrofotometriaa varten liuotin on poistettava mahdollisimman täydellisesti. Kaasukromatografiaa varten ei ole suositeltavaa poistaa liuotinta.8. Kun kyseessä on risiiniöljyn tyyppinen öljy, kirkkaus ei ole reaktion peruste. III RASVAHAPPOJEN METYYLIESTEREIDEN KAASUKROMATOGRAFIA 1. JOHDANTO Tämän menetelmän tarkoituksena on antaa yleiset ohjeet II osaston mukaisesti saatujen rasvahappojen metyyliestereiden seoksen laadullisen ja määrällisen koostumuksen kaasukromatografista määritystä varten. Polymeroituneita rasvahappoja ei voi tällä menetelmällä määrittää. Ohjeet annetaan tavallisia kaasukromatografialaitteistoja varten, joissa on täyttökolonni ja liekki-ionisaatiodetektori (huomautus 1). 2. VÄLINEET 2.1 Kaasukromatografialaitteisto Laitteisto, jolla voidaan saavuttaa 4.1.2 kohdassa määritelty tehokkuus ja erotuskyky, on sopiva. 2.1.1 Injektori Injektorilla on oltava mahdollisimman pieni kuollut tilavuus. Jos materiaali ei estä, sen lämpötilan on oltava 25 50 °C korkeampi kuin kolonnin lämpötila. 2.1.2 Uuni Uunin on pystyttävä lämmittämään kolonnit vähintään 220 °C:seen ja ylläpitämään valittu lämpötila 1 °C:n tarkkuudella. Jos käytetään ohjelmoituja olosuhteita, on suositeltavaa valita kaksoiskolonnilaite. 2.1.3 Kolonni 2.1.3.1 Putki Putken on oltava inerttiä ainetta suhteessa määritettäviin rasvoihin: lasia tai, jos sitä ei ole käytettävissä, ruostumatonta terästä (huomautus 2). Pituus: 1 3 m. Jos läsnä on pitkäketjuisia (> C20) rasvahappoja, käytetään suhteellisen lyhyttä putkea. Jos määritetään C4- ja C6-happoja, on suositeltavaa käyttää 2 m kolonnia. Sisähalkaisija: 2 4 mm. 2.1.3.2 Täyttö Kantoaine: happopestyä ja silanoitua piimaata tai muuta soveltuvaa inerttiä kantoainetta hiukkaskokojakauman ollessa kapea (25 µm välillä 125 200 µm), kolonnin sisähalkaisijan ja pituuden määrätessä keskiarvon. Stationäärifaasi: polyesterityyppinen polaarinen faasi (esimerkiksi dietyleeniglykolipolysukkinaatti, butaanidiolipolysukkinaatti, etyleeniglykolipolyadipaatti, jne.) tai muu jäljempänä esitettäviä vaatimuksia vastaava faasi (esimerkiksi syanosilikonit, jne.). Kyllästymisaste on 5 20 %. Tiettyihin erotuksiin voidaan käyttää polaarittomia faaseja. 2.1.3.3 Kolonnin valmistelu Kun kolonni on, mikäli mahdollista, irrotettu detektorista, laitteiston uuni kuumennetaan 10 °C työskentelylämpötilaa korkeammaksi ja ylläpidetään valmisteltavassa kolonnissa inerttiä kaasuvirtaa 20 60 ml/min vähintään 16 tuntia tässä lämpötilassa ja sen jälkeen 2 tuntia 195 °C lämpötilassa. 2.1.4 Detektori Detektorin olisi kestettävä korkeampaa lämpötilaa kuin kolonnin. Jäljempänä annettavat ohjeet koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä (huomautus 1). 2.2 Ruisku Enintään 10 µl ruisku, joka on jaettu µl:n kymmenesosiin. 2.3 Piirturi Kun piirturin käyrää käytetään määritettävän seoksen koostumuksen laskemiseen, piirturin on oltava elektroninen laite, jonka tarkkuus on suuri, ja joka on yhteensopiva käytettävän laitteiston kanssa: - vasteen nopeus pienempi kuin 1,5 s, mieluiten pienempi kuin 1 s (vasteen nopeus on aika, jonka piirturin kynä tarvitsee liikkuakseen nollasta 90 %:iin, kun syötetään 100 %:n hetkellinen signaali), - paperin leveys: vähintään 25 cm, - paperin liikkumisnopeus: 25 150 cm/h. 2.4 Integraattori tai laskin (valinnainen) Elektronisen integraattorin tai laskimen käyttö mahdollistaa nopean ja tarkan laskemisen. Tämän täytyy antaa lineaarinen vaste, sen herkkyyden on oltava riittävä ja perusviivan poikkeaman korjauksen on oltava tyydyttävä. 3. REAGENSSIT - kantajakaasu: inerttikaasu (typpi, helium, argon jne.), joka on hyvin kuivattu ja sisältää happea vähemmän kuin 10 ppm, - apukaasut: vähintään 99,9-prosenttinen vety, joka ei sisällä orgaanisia aineita; ilma tai happi, joka ei sisällä orgaanisia aineita, - kalibrointiaineet: metyyliestereiden seos tai koostumukseltaan tunnetun, ja jos mahdollista, lähellä määritettävää rasvaa olevan öljyn metyyliestereitä. 4. MENETTELY 4.1 Laitteiston säätäminen 4.1.1 Optimaalisten työskentelyolosuhteiden määrittäminen Työskentelyolosuhteiden valitsemiseksi on otettava huomioon seuraavat muuttujat: - kolonnin pituus ja halkaisija, - stationäärifaasin luonne ja määrä, - kolonnin lämpötila, - kantajakaasun virtausnopeus, - haluttu erotuskyky, - koenäytteen koko, - määrityksen kesto. Koenäytteen koko valitaan siten, että detektori-elektrometri-yhdistelmä antaa lineaarisen vasteen. Yleensä seuraavat arvot antavat haluttuja tuloksia, eli teoreettisten pohjien lukumäärä metyylistearaatille vähintään 2 000 ja tämän eluoituminen noin 15 minuutissa: >TAULUKON PAIKKA> >TAULUKON PAIKKA> Jos laitteisto sen sallii, injektorin lämpötila on noin 200 °C ja detektorin lämpötila yhtä suuri tai suurempi kuin kolonnin lämpötila. Vedyn virtausnopeus liekki-ionisaatiodetektorissa on yleensä noin puolet kantajakaasun virtausnopeudesta, ja hapen virtausnopeus on noin 5 10 kertaa vedyn virtausnopeus. 4.1.2 Tehokkuuden ja erotuskyvyn määrittäminen Määritetään seos, jossa on suunnilleen yhtä paljon metyylistearaattia ja -oleaattia (esimerkiksi kaakaovoin metyyliesterit). Koenäytteen koko, kolonnin lämpötila ja kantajakaasun virtausnopeus valitaan siten, että metyylistearaattipiikin maksimi havaitaan noin 15 minuuttia liuottimen piikin jälkeen ja tämä piikki on noin kolme neljännestä koko asteikosta. Lasketaan teoreettisten pohjien lukumäärä n (tehokkuus) kaavalla: n = 16 ( >NUM>dRt >DEN>ù1 )²ja erotuskyky R kaavalla: R = >NUM>2 Ä >DEN>ù1 + ù2 jossa >TAULUKON PAIKKA> >VIITTAUS FILMIIN> Ylläpidettävät toimintaolosuhteet ovat ne, jotka antavat teoreettisten pohjien lukumääräksi metyylistearaatille vähintään 2 000 ja erotuskyvyksi vähintään 1,25. Niiden on oltava lisäksi sellaiset, että linoleenihappo (C18:3) erottuu arakidiinihaposta (C20:0) ja gadoleiinihaposta (C20:1). 4.2 Määritys Koenäyte on 0,1 2 µl II osaston mukaisesti saatujen metyyliestereiden heptaaniliuosta. Jos esterit eivät sisällä liuottimia, tehdään noin 10-prosenttinen liuos heptaaniin ja injektoidaan sitä 0,1 1 µl. Niiden ainesosien tutkimiseksi, jotka esiintyvät hyvin pieninä määrinä, koenäytettä voidaan suurentaa (10-kertaiseksi asti); tavallisesti toimitaan 4.1.1 kohdassa määritellyissä olosuhteissa. Voidaan kuitenkin käyttää alhaisempaa kolonnin lämpötilaa, jos on tarpeen määrittää C12:a pienempiä rasvahappoja, tai korkeampaa lämpötilaa, jos on tarpeen määrittää C20:ä suurempia rasvahappoja. Molemmissa edellisissä tapauksissa on tarvittaessa mahdollista käyttää ohjelmoitua lämpötilasäätöä. Esimerkiksi jos näyte sisältää alle 12 hiiliatomia sisältävien rasvahappojen metyyliestereitä, näyte injektoidaan 100 °C lämpötilassa (tai 50 60 °C:ssa, jos esiintyy voihappoa) ja lämpötila ohjelmoidaan välittömästi nousemaan 4 8 °C/min kunnes saavutetaan optimaalinen lämpötila. Tietyissä tapauksissa voidaan yhdistää molemmat menetelmät: lämpötilan ohjelmoinnin jälkeen eluointia jatketaan vakiolämpötilassa, kunnes kaikki ainesosat ovat eluoituneet. Jos laite ei toimi ohjelmoidussa lämpötilassa käytetään kahta kiinteää lämpötilaa välillä 100 195 °C. Tarvittaessa suositellaan määrityksen tekemistä kahdesta määrätystä faasista, joiden polaarisuudet ovat erilaiset, naamioituneiden piikkien poissaolon varmistamiseksi, esimerkiksi kalaöljyille tai kun konjugoituneet C18:3 ja C20:0 tai C18:3 ja C18:2 esiintyvät samanaikaisesti. 5. TULOSTEN ILMAISEMINEN 5.1 Kvalitatiivinen määritys Määritetään koostumukseltaan tunnettu vertailuseos koetta vastaavissa toimintaolosuhteissa ja määritetään retentioetäisyydet (tai retentioajat) rasvahapoille, joista seos koostuu. Piirretään käyrät, jotka antavat retentioetäisyyden (tai retentioajan) logaritmin hiiliatomien lukumäärän funktiona; samoissa lämpötilaolosuhteissa ja suoraketjuisille estereille sekä tyydyttymättömyysasteen ollessa määrätty, näiden puolilogaritmipaperille piirrettyjen käyrien on oltava käytännöllisesti katsoen yhdensuuntaisia suoria. Tunnistetaan kokeen piikit näitä suoria käyttäen, tarvittaessa interpoloiden. On syytä välttää toimintaolosuhteita, jolloin esiintyy "naamioituneita piikkejä", eli kahta ainesosaa ei pystytä erottamaan riittämättömän erotuskyvyn vuoksi. 5.2 Kvantitatiivinen määritys 5.2.1 Koostumuksen määrittäminen Käytetään sisäisen standardin menetelmää (lukuun ottamatta poikkeustapauksia), toisin sanoen oletetaan, että kromatogrammissa ovat edustettuina kaikki näytteessä esiintyvät ainesosat, joten piikkien pinta-alojen summa edustaa 100 % ainesosia (täydellinen eluoituminen). Jos laitteistoon sisältyy integraattori, käytetään sen antamia lukuja. Päinvastaisessa tapauksessa määritetään jokaisen piikin pinta-ala kolmioimalla kertoen tämän korkeus sen puolikorkeuden leveydellä ottaen huomioon mahdolliset piirtämisen aikana käytetyt erilaiset vaimennukset. 5.2.1.1 Yleinen tapaus Jos läsnä ei ole merkittäviä määriä C8:aa pienempiä ainesosia, ainesosan pitoisuus lasketaan, metyyliesteriprosentteina ilmaistuna, määrittämällä vastaavan piikin pinta-alan edustama prosenttiosuus suhteessa kaikkien piikkien pinta-alojen summaan: % (m/m) yhdistettä i metyyliestereinä ilmaistuna >NUM>A1 >DEN>ÓA1 × 100 där: A1 = yhdistettä i vastaavan piikin pinta-ala, ÓA1 = kaikkien piikkien pinta-alojen summa. 5.2.1.2 Korjauskertoimien käyttö Tietyissä tapauksissa, erityisesti kun läsnä on C8:aa pienempiä happoja tai happoja, joissa on sekundäärisiä ryhmiä, ja kun käytetään lämmönjohtokykyyn perustuvia detektoreita, olisi käytettävä korjauskertoimia piikkien pinta-alojen prosenttiosuuksien muuttamiseksi ainesosien massaprosenteiksi. Korjauskertoimet määritetään kromatogrammin avulla, joka on saatu koetta vastaavissa toimintaolosuhteissa koostumukseltaan tarkkaan tunnetusta metyyliestereiden vertailuseoksesta. Vertailuseokselle: % (m/m) yhdistettä i = >NUM>B1 >DEN>ÓB1 × 100 B1 = yhdisteen i massa vertailuseoksessa, ÓB1 = vertailuseoksen eri ainesosien massojen summa. Vertailuseoksesta saadun kromatogrammin avulla voidaan laskea: % (pinta-ala/pinta-ala) yhdistettä i >NUM>C1 >DEN>ÓC1 × 100 C1 = yhdistettä i vastaavan piikin pinta-ala, ÓC1 = kaikkien piikkien pinta-alojen summa. josta: korjauskerroin K1 = >NUM>B1 × ÓC1 >DEN>C1 × ÓB1 Tavallisesti korjauskertoimet ilmaistaan suhteessa tekijään K16 = 1 ja suhteellisiksi kertoimiksi saadaan: K = 1 >NUM>K1 >DEN>K16 Näytteen osalta jokaisen ainesosan pitoisuus annetaan prosentteina (m/m) yhdistettä i metyyliestereinä ilmaistuna procenten (m/m) av komponenten (i) = >NUM>K1 × A1 >DEN>Ó(K1 × A1) × 100 5.2.1.3 Sisäisen standardin käyttö Tietyissä tapauksissa (erityisesti C4 ja C6-happojen määritys ja happojen määritys siinä tapauksessa, että kaikki rasvahapot eivät ole eluoituneet) olisi käytettävä sisäistä standardia (tapauksesta riippuen C5 ja C15 tai C17) ja määritettävä siten sisäisen standardin korjauskerroin. yhdisteen i prosenttiosuus (m/m) metyyliestereinä ilmaistuna = >NUM>ms × Ks × A1 >DEN>m1 × Ks × As × 100 ms = sisäisen standardin massa milligrammoina, m = näytteen massa milligrammoina, K's = sisäisen standardin korjauskerroin, As = sisäistä standardia vastaavan piikin pinta-ala, Ai = yhdistettä i vastaavan piikin pinta-ala. 5.2.2 Tulosten ilmaiseminen Tulos ilmoitetaan: kolmen merkitsevän numeron tarkkuudella, kun se on suurempi kuin 10 %, kahden merkitsevän numeron tarkkuudella, kun se on 1 10 %, yhden merkitsevän numeron tarkkuudella, kun se on pienempi kuin 1 %, toisin sanoen jokaisessa tapauksessa pilkun jäljessä on yksi numero. 5.2.3 Toistettavuus Kahden määrityksen, jotka sama henkilö on tehnyt samana päivänä samalla laitteella ja samoista estereistä, joiden ainesosia esiintyy enemmän kuin 5 %, tulosten välisen eron suhteellinen arvo ei saa olla suurempi kuin 3 % määritetystä arvosta ehdottoman ylärajan ollessa 1 %. Niiden ainesosien osalta, joita esiintyy vähemmän kuin 5 %, toistettavuuden suhteellinen arvo huononee nopeasti pitoisuuden pienentyessä. 5.2.4 Uusittavuus Kun ainesosia esiintyy enemmän kuin 5 %, kahdessa eri laboratoriossa saatujen tulosten välisen eron suhteellinen arvo määritetystä arvosta ei saa olla suurempi kuin 10 % ehdottoman ylärajan ollessa 3 %. Kun ainesosia esiintyy vähemmän kuin 5 %, uusittavuuden suhteellinen arvo huononee nopeasti pitoisuuden pienentyessä. 6. HUOMAUTUKSIA 1. Voidaan käyttää kaasukromatografia, jossa on lämmönjohtokykyyn perustuva detektori (katarometri). Silloin kuvattuja olosuhteita on muutettava seuraavasti: >TAULUKON PAIKKA> Kvantitatiivisen määrityksen osalta on otettava huomioon 5.2.1.2 kohdassa määritellyt korjauskertoimet. 2. Jos esiintyy monityydyttymättömiä ainesosia, joissa on enemmän kuin kolme kaksoissidosta, ruostumattomasta teräksestä valmistettu putki voi aiheuttaa niiden hajoamista.