8)

Lisätään B osaan seuraavat luvut: ”B.63 LISÄÄNTYMIS-/KEHITYSTOKSISUUDEN SEULONTATESTI JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 421 (2016). Kemikaalien testaamiseen tarkoitettuja OECD:n testiohjeita tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen mukaisesti. Seulontatestiohje 421 hyväksyttiin alun perin vuonna 1995, ja se perustui alustava lisääntymistoksisuuden seulontatesti -protokollaan, jota käsiteltiin kahdessa asiantuntijakokouksessa, Lontoossa vuonna 1990 (1) ja Tokiossa vuonna 1992 (2). 2. Tätä testimenetelmää on päivitetty lisäämällä siihen hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkitykselliset päätetapahtumat sen jälkeen, kun OECD aloitti vuonna 1998 tärkeän toimenpiteen, nimittäin olemassa olevien testiohjeiden uudistamisen ja uusien testiohjeiden laatimisen mahdollisten hormonaalisten haitta-aineiden seulontaa ja testausta varten (3). OECD:n testiohjetta 407 (oraalinen toistuvan annostelun toksisuustutkimus (28 pv) jyrsijöillä, tämän liitteen B.7 luku) parannettiin vuonna 2008 lisäämällä siihen parametreja, joilla voidaan havaita testikemikaalien hormonitoimintaan kohdistuva vaikutus. Testiohjeen 421 päivittämisen tavoitteena oli sisällyttää seulontatestiohjeeseen joitakin hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkityksellisiä päätetapahtumia sellaisia tilanteita varten, kun altistusajat kattavat muutamia kehityksen kannalta herkkiä ajanjaksoja (syntymää edeltävät tai heti syntymän jälkeiset ajanjaksot). 3. Valitut hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkitykselliset uudet päätetapahtumat, jotka sisältyvät myös testiohjeeseen 443 (pidennetty yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskeva tutkimus, tämän liitteen B.56 luku), sisällytettiin testiohjeeseen 421 toteutettavuustutkimuksen perusteella. Tutkimuksessa käsiteltiin päätetapahtumien lisäämistä koskevia tieteellisiä ja teknisiä kysymyksiä ja mahdollisia muutoksia, joita testiasetelmaan pitäisi tehdä päätetapahtumien lisäämisen vuoksi (4). 4. Tämä testimenetelmä on suunniteltu tuottamaan tiettyjä tietoja, jotka koskevat testikemikaalin vaikutuksia uroksen ja naaraan lisääntymiskykyyn, kuten sukupuolirauhasten toimintaan, parittelukäyttäytymiseen, hedelmöittymiseen, conceptuksen kehittymiseen ja synnytykseen. Se ei ole vaihtoehtoinen eikä korvaa nykyisiä testimenetelmiä B.31, B.34, B.35 tai B.56. ALUSTAVAT HUOMIOT 5. Tätä seulontatestimenetelmää voidaan käyttää alustavien tietojen saamiseksi testikemikaalin mahdollisista vaikutuksista lisääntymiseen ja/tai kehitykseen joko kemikaalien toksikologisten ominaisuuksien varhaisvaiheen arvioinnissa tai huolta aiheuttavien kemikaalien tutkimuksessa. Sitä voidaan käyttää myös osana sellaisten olemassa olevien kemikaalien alustavien seulontatestien sarjaa, joista toksikologista tietoa on saatavilla niukasti tai joista sitä ei ole saatavilla lainkaan. Sitä voidaan käyttää myös annosalueen määritystutkimuksena laajemmissa lisääntymis-/kehitystutkimuksissa tai silloin, kun sitä pidetään muulloin tarpeellisena. Tutkimuksen toteuttamisessa on noudatettava periaatteita ja näkökohtia, jotka esitetään pääpiirteittäin OECD:n ohjeasiakirjassa 19 kliinisten oireiden tunnustamisesta, arvioimisesta ja soveltamisesta inhimillisinä toimenpiteinä turvallisuusarvioinneissa käytettäviin eläimiin (5). 6. Tällä testimenetelmällä ei saada täydellisiä tietoja kaikista lisääntymiseen ja kehitykseen liittyvistä näkökohdista. Testimenetelmä on vain rajallinen mahdollisuus havaita syntymää edeltäneen altistuksen vaikutuksia syntymän jälkeen tai sellaisia vaikutuksia, joita voi ilmaantua syntymän jälkeisen altistuksen aikana. (Esimerkiksi) annosryhmissä käytettyjen eläinten pienen määrän, päätetapahtumien valikoivuuden ja tutkimuksen lyhyen keston vuoksi tällä menetelmällä ei saada sellaista näyttöä, jonka perusteella voitaisiin päätellä varmasti, ettei vaikutuksia ole. Koska myöskään muihin lisääntymis-/kehitystoksisuustesteihin pohjautuvia tietoja ei ole, positiiviset tulokset ovat hyödyllisiä alustavassa vaaran arvioinnissa, ja ne voivat vaikuttaa päätöksiin lisätestauksen tarpeellisuudesta ja ajoituksesta. 7. Hormonitoimintaan liittyvien parametrien avulla saatuja tuloksia on tarkasteltava OECD:n asiakirjaan ”Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (6) (hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskeva toimintamalli) liittyvässä kontekstissa. Tässä asiakirjassa OECD:n parannettu testiohje 421 sisältyy tasolle 4 in vivo -testinä, jolla saadaan tietoa haittavaikutuksista hormonitoiminnan kannalta merkityksellisten päätetapahtumien osalta. Hormonitoimintaan liittyvää signaalia ei kuitenkaan pidetä yksinään riittävänä näyttönä siitä, että testikemikaali olisi hormonaalinen haitta-aine. 8. Tässä testimenetelmässä testikemikaali annostellaan suun kautta. Jos käytetään muita altistusreittejä, menetelmään voi olla tarpeen tehdä muutoksia. 9. Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa. 10. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 11. Testikemikaalia annetaan porrastettuina annoksina useille uros- ja naarasryhmille. Uroksille on annettava testikemikaalia vähintään neljä viikkoa suunniteltua lopettamispäivää edeltävään päivään saakka kyseinen päivä mukaan luettuna (ts. vähintään kaksi viikkoa ennen parittelua, parittelujakson aikana ja noin kaksi viikkoa parittelun jälkeen). Koska parittelua edeltävä annostelujakso on urosten osalta lyhyt, hedelmällisyys ei välttämättä ole erityisen herkkä indikaattori kiveksiin kohdistuvasta toksisuudesta. Sen vuoksi kivesten tarkka histologinen tutkimus on tärkeä. Parittelua edeltävää kahden viikon annostelujaksoa, jota seuraa parittelun/hedelmällisyyden tarkkailu, ja vähintään neljä viikkoa kestävä kokonaisannostelujakso ja urosten sukupuolielinten yksityiskohtainen histopatologinen tutkimus, katsotaan riittäväksi, jotta voidaan havaita suurin osa urosten hedelmällisyyteen ja spermatogeneesiin kohdistuvista vaikutuksista. 12. Naaraille on annettava testikemikaalia tutkimuksen koko keston ajan. Niille testikemikaalia annostellaan siis kahden viikon ajan ennen parittelua (tavoitteena on kattaa vähintään kaksi täyttä kiimakiertoa), hedelmöittymisen vaihteleva ajankohta, tiineyden kesto ja vähintään 13 päivää synnytyksen jälkeen suunniteltua lopettamispäivää edeltävään päivään saakka, kyseinen päivä mukaan luettuna. 13. Tutkimuksen kesto sopeutumisvaiheen ja annostelua edeltävän kiimakierron arvioinnin jälkeen määräytyy naaraan lisääntymiskyvyn mukaan, ja se on noin 63 päivää [vähintään 14 päivää ennen parittelua, (enintään) 14 päivän parittelujakso, 22 päivän tiineys ja 13 päivän imetysaika]. 14. Annostelujakson aikana eläimiä havainnoidaan tarkoin päivittäin toksisuusoireiden varalta. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus. MENETELMÄN KUVAUS Eläinlajin valinta 15. Tässä testimenetelmässä on suunniteltu käytettävän rottaa koe-eläimenä. Jos tässä testimenetelmässä määritettyjä parametreja tutkitaan muilla jyrsijöillä, sille on esitettävä yksityiskohtainen perustelu. Kansainvälisessä validointiohjelmassa, jossa tutkittiin hormonaalisten haitta-aineiden havaitsemista OECD:n testiohjeen 407 (joka vastaa tämän liitteen B.7 lukua) perusteella, rotta oli ainoa käytetty laji. Kantoja, joiden hedelmällisyys on alhainen tai joilla tiedetään esiintyvän kehityshäiriöitä, ei tule käyttää. Koe-eläiminä on käytettävä terveitä pariutumattomia eläimiä, joilla ei ole tehty aikaisempia kokeita. Koe-eläinten laji, kanta, sukupuoli, paino ja ikä on oltava tiedossa. Tutkimuksen alkaessa eläinten painot saavat vaihdella mahdollisimman vähän, enintään ± 20 % kummankin sukupuolen keskipainosta. Mikäli tutkimusta käytetään pitkäaikaistutkimuksen tai koko sukupolven tutkimuksen esitestinä, molemmissa tutkimuksissa tulee mieluiten käyttää samasta kannasta ja lähteestä olevia eläimiä. Koe-eläintilat ja ruokinta 16. Kaikissa menettelyissä on noudatettava laboratorioeläinten hoitoa koskevia paikallisia vaatimuksia. Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:ää prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, tulee kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion valinnassa on varmistettava, että testikemikaalin ja ravinnon suhde on sopiva, mikäli testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna. 17. Eläimet voidaan pitää häkeissä muutaman samaa sukupuolta olevan eläimen ryhmissä tai yksittäin, jos se on tieteellisesti perusteltua. Yhdessä ryhmähäkissä saa olla enintään viisi eläintä. Parittelun tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa häkeissä. Tiineet naaraat on laitettava häkkiin yksittäin, ja niille on annettava pesämateriaaleja. Imettävät naaraat laitetaan häkkiin yksittäin poikastensa kanssa. 18. Eläinten ravinto on analysoitava säännöllisesti kontaminanttien varalta. Näyte ruokavaliosta on säilytettävä siihen saakka, kunnes tutkimusraportti on valmis. Eläinten valmistelu 19. Terveet nuoret täysikasvuiset eläimet jaetaan satunnaisesti verrokki- ja testiryhmiin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet merkitään yksilöllisesti ja pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen tutkimuksen aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin. Annosten valmistelu 20. Testikemikaali suositellaan annosteltavaksi suun kautta, ellei muita annostelureittejä pidetä asianmukaisempina. Jos valitaan suun kautta annostelu, testikemikaali annetaan yleensä ruokintaletkun kautta; vaihtoehtoisesti testikemikaalit voidaan kuitenkin antaa myös ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. 21. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan kantaja-aineeseen. On suositeltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai suspensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuosta/emulsiota ja sitten mahdollisesti muihin kantaja-aineisiin perustuvia liuoksia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Testikemikaalin stabiliteetti ja homogeenisuus kantaja-aineessa on määritettävä. MENETTELY Eläinten lukumäärä ja sukupuoli 22. On suositeltavaa, että jokaisessa ryhmässä on aluksi vähintään 10 urosta ja 12–13 naarasta. Naaraiden kiimakierto arvioidaan ennen altistusta, ja eläimiä, joiden osalta tyypillistä 4–5 päivän kiertoa ei voida vahvistaa, ei oteta mukaan tutkimukseen. Jotta kuhunkin ryhmään saadaan varmasti 10 naarasta, niitä pitää olla aluksi enemmän kuin uroksia. Lukuun ottamatta selviä toksisia vaikutuksia, kuhunkin ryhmään oletetaan saatavan vähintään kahdeksan tiineenä olevaa naarasta, mikä on yleensä pienin hyväksyttävä tiineiden naaraiden määrä yhdessä ryhmässä. Tavoitteena on saada tarpeeksi tiineystapauksia ja poikasia, jotta voidaan tehdä luotettava arvio testikemikaalin mahdollisesta vaikutuksesta hedelmällisyyteen, tiineyteen, emon ja poikasen käytökseen sekä F 1 -sukupolven kasvuun ja kehitykseen hedelmöityksestä synnytyksen jälkeiseen päivään 13 saakka. Annostelu 23. Yleensä tulee käyttää vähintään kolmea testiryhmää ja yhtä verrokkiryhmää. Annostasojen perusteena voidaan käyttää akuuttia toksisuutta koskevista testeistä saatuja tietoja tai toistuvan annostelun tutkimusten tuloksia. Testikemikaalin annostelua lukuun ottamatta verrokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään kantaja-ainetta, sitä tulee antaa verrokkiryhmälle suurin käytetty määrä. 24. Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon kaikki saatavilla olevat aikaisemmat toksisuustiedot ja (toksiko)kineettiset tiedot. Lisäksi on otettava huomioon, että tiineiden ja muiden kuin tiineiden eläinten herkkyydessä voi olla eroja. Korkein annostaso tulee valita siten, että sen tarkoituksena on aiheuttaa toksisia vaikutuksia mutta ei kuolemaa tai vakavia kärsimyksiä. Annostasojen on oltava laskevia, jotta voitaisiin osoittaa kaikki annokseen liittyvät vasteet ja haitaton taso alhaisimmalla annostasolla (NOAEL). Kaksin-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat alenevassa annossarjassa, ja usein on hyödyllisempää lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (ts. suurempia kuin 10-kertaisia). 25. Jos havaitaan yleistä toksisuutta (kuten painonlaskua, maksaan, sydämeen, keuhkoihin tai munuaisiin kohdistuvia vaikutuksia jne.) tai muita muutoksia, jotka eivät ole välttämättä toksisia (esimerkiksi ravinnonoton vähentymistä, maksan suurenemista), hormonitoiminnan kannalta herkkiin ominaisuuksiin kohdistuvia vaikutuksia on tulkittava varauksellisesti. Raja-annostesti 26. Jos oraalisessa testissä jokin annostaso, joka on vähintään 1 000 mg/kg (eläimen painokilo) /vrk tai vastaava suhteellinen määrä ravinnossa tai juomavedessä, kun testikemikaali annetaan ravinnon tai juomaveden seassa, ja joka annetaan tässä testimenetelmässä kuvattujen menettelyjen mukaisesti, ei aiheuta lainkaan havaittavaa toksista vaikutusta ja jos sitä ei aikaisempien tutkimustulosten perusteella ole odotettavissa (esimerkiksi rakenteellisesti samantyyppiset yhdisteet), täydellinen useita annostasoja käyttävä testi ei välttämättä ole tarpeen. Raja-annostestiä voidaan soveltaa muulloin paitsi silloin, kun ihmisten altistuminen viittaa siihen, että on käytettävä suurempaa suun kautta annettavaa annosta. Muiden antotapojen kuten inhalaation tai ihoapplikaation osalta suurin mahdollinen pitoisuus määräytyy yleensä testikemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien perusteella. Annostelu 27. Eläimille annetaan testikemikaalia päivittäin seitsemänä päivänä viikossa. Jos testikemikaali annetaan ruokintaletkun kautta, se on annettava eläimille yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Suurin yhdellä kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa olla yli 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksena ovat vesiliuokset, joita käytettäessä määrä voi olla 2 ml/100 g painoa. Poikkeuksena tästä ovat ärsyttävät tai syövyttävät testikemikaalit, joiden kohdalla voidaan yleensä todeta vaikutusten voimistuminen suurempia pitoisuuksia käytettäessä. Testikemikaalin määrän vaihtelu on minimoitava pitoisuutta muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla varmistetaan tilavuudeltaan sama nestemäärä. 28. Kun testikemikaalit annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää varmistaa, että testikemikaalin määrät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nestetasapainoa. Jos testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna, voidaan ilmoittaa joko testikemikaalin pitoisuus ravinnossa (ppm) tai eläimen painoon suhteutettu annostaso; käytetty tapa on mainittava. Jos testikemikaali annetaan letkulla, annos tulee antaa päivittäin samaan aikaan ja sitä on mukautettava vähintään viikoittain siten, että annostaso pysyy samana eläimen painoon nähden. Testiaikataulu 29. Testikemikaalia on alettava antaa kummallekin sukupuolelle vähintään kaksi viikkoa ennen parittelua sen jälkeen, kun eläimiä on sopeutettu vähintään viisi päivää ja kun eläimistä on seulottu ne naaraat, joiden kiimakierto on normaali (altistusta edeltävällä kahden viikon jaksolla). Tutkimus on aikataulutettava siten, että kiimakierron arviointi alkaa pian sen jälkeen, kun eläimet ovat saavuttaneet täyden sukukypsyyden. Eri rottakannoissa ja eri laboratorioissa voi olla tässä vaihtelua; esimerkiksi Sprague-Dawley-rotat tulevat sukukypsiksi 10-viikkoisina, Wistar-rotat taas noin 12-viikkoisina. Poikineet emot on lopetettava päivänä 13 synnytyksen jälkeen tai pian sen jälkeen. Syntymäpäivä (ts. kun synnytys on tapahtunut) määritellään synnytyksen jälkeiseksi päiväksi 0. Naaraat, joiden osalta parittelua ei voida todeta tapahtuneen, lopetetaan 24–26 päivää parittelujakson viimeisen päivän jälkeen. Annostelua jatketaan kummallekin sukupuolelle parittelujakson aikana. Uroksille annostelua on jatkettava parittelujakson jälkeen vähintään siihen saakka, kunnes annostelujakso on kokonaisuudessaan vähintään 28 päivää. Sen jälkeen urokset lopetetaan. Vaihtoehtoisesti ne pidetään elossa ja annostelua jatketaan mahdolliseen toiseen parittelukertaan asti, jos sitä pidetään tarkoituksenmukaisena. 30. Annostelua tiineeksi tulleille naaraille on jatkettava tiineyden ajan ja vähintään synnytyksen jälkeiseen päivään 13 asti, kyseinen päivä mukaan luettuna, tai lopettamista edeltävään päivään saakka. Tutkimuksissa, joissa testikemikaalia annostellaan hengitysteiden tai ihon kautta, annostelua on jatkettava vähintään tiineyden päivään 19 saakka, kyseinen päivä mukaan luettuna, ja annostelua on jatkettava mahdollisimman pian, viimeistään kuitenkin SJP:nä 4. 31. Lisäyksessä 2 on kaavio testiaikataulusta. Paritus 32. Tässä tutkimuksessa on käytettävä yleensä 1:1-parittelua (yhden uroksen ja yhden naaraan parittelu). Poikkeuksia voidaan tehdä, jos yksittäisiä uroksia kuolee. Naaras on laitettava häkkiin saman uroksen kanssa, kunnes parittelun todetaan tapahtuneen tai kunnes kaksi viikkoa on kulunut. Naaraat on tutkittava joka aamu sperman tai vaginatulpan havaitsemiseksi. Tiineyspäivä 0 määritellään päiväksi, jolloin todisteet parittelusta vahvistetaan (vaginatulpan muodostuminen tai spermaa havaitaan). Jos parittelua ei tapahdu, voidaan harkita naaraan uutta paritusta saman ryhmän hedelmällisiksi todettujen urosten kanssa. Poikueiden koko 33. Päivänä 4 synnytyksen jälkeen kunkin poikueen kokoa voidaan mukauttaa poistamalla siitä poikasia satunnaisvalinnalla siten, että yhteen poikueeseen jää neljä tai viisi poikasta kumpaakin sukupuolta sen mukaan, mikä on käytetyn rottakannan normaali poikuekoko. Kahdesta ylimääräisestä poikasesta on otettava verinäytteet, jotka yhdistetään ja käytetään seerumin T4-pitoisuuden määrittämiseen. Poikasten valikoiva eliminointi esimerkiksi painon tai peräaukon ja sukupuolielinten välisen etäisyyden perusteella ei ole tarkoituksenmukaista. Jos uros- tai naaraspuolisten poikasten määrä on sellainen, että poikueeseen ei jää neljää tai viittä poikasta kumpaakin sukupuolta, voidaan tehdä osittaismukautus (esimerkiksi kuusi urosta ja neljä naarasta). Poikasia ei eliminoida poikueesta, jos poikueen koko supistuisi karsintatavoitetta pienemmäksi (8 tai 10 poikasta / poikue). Jos käytettävissä on vain yksi poikanen karsimistavoitetta enemmän, eliminoidaan vain yksi poikanen, ja siltä otetaan verinäyte mahdollisia seerumin T4-määrityksiä varten. 34. Jos poikueen kokoa ei mukauteta, jokaisesta poikueesta lopetetaan kaksi poikasta päivänä 4 syntymän jälkeen, ja niiltä otetaan verinäytteet seerumin kilpirauhashormonipitoisuuden mittausta varten. Mikäli mahdollista, näiden kahden poikasen tulisi olla naaraita, jotta urospuolisista poikasista voidaan tutkia nännien vetäytyminen, mutta tämä ei saa johtaa siihen, ettei poikueeseen jäisi naaraspuolisia poikasia arvioitavaksi tutkimuksen päättyessä. Yhtään poikasta ei eliminoida, jos poikueen koko pienenisi alle 8 tai 10 poikaseen / poikue (käytetyn rottakannan normaalin poikuekoon mukaan). Jos käytettävissä on vain yksi poikanen normaalia poikuekokoa enemmän, eliminoidaan vain yksi poikanen, ja siltä otetaan verinäyte mahdollisia seerumin T4-määrityksiä varten. Eläviä eläimiä koskevat havainnot Kliiniset havainnot 35. Testijakson aikana yleisiä kliinisiä havaintoja on tehtävä vähintään kerran päivässä ja sitä useammin, jos toksisuuden merkkejä havaitaan. Havainnointi on tehtävä mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen ennakoidut vaikutukset ovat suurimmillaan. Käyttäytymistavan muutokset, merkit vaikeasta tai pitkittyneestä synnytyksestä ja kaikki toksisuuden merkit sekä kuolleisuus on kirjattava. Näihin tietoihin on kirjattava myös toksisuuden merkkien alkamisaika, vakavuusaste ja kesto. Eläimen paino ja ravinnon/veden kulutus 36. Urokset ja naaraat on punnittava ensimmäisenä annostelupäivänä, vähintään kerran viikossa sen jälkeen ja tutkimuksen päättyessä. Tiineyden aikana naaraat on punnittava päivinä 0, 7, 14 ja 20 sekä 24 tunnin kuluessa synnytyksestä (päivänä 0 tai 1 synnytyksen jälkeen) ja vähintään päivänä 4 ja 13 synnytyksen jälkeen. Havainnot raportoidaan erikseen kustakin täysikasvuisesta eläimestä. 37. Ravinnon kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ennen parittelua sekä tiineyden ja imetyksen aikana. Ravinnon kulutuksen mittaus parittelujakson aikana ei ole pakollista, mutta sen voi tehdä. Myös vedenkulutus näiden jaksojen aikana on mitattava, jos testikemikaali annetaan juomaveteen sekoitettuna. Kiimakierrot 38. Kiimakiertoja on seurattava ennen altistuksen aloittamista, jotta tutkimukseen voidaan valita naaraita, joiden kiimakierto on säännöllinen (ks. 22 kohta). Myös irtosolunäytteitä on seurattava päivittäin altistusjakson alkamisesta siihen saakka, kunnes parittelun todetaan tapahtuneen. Jos annostelun aloittamisen epäillään aiheuttavan akuutteja stressireaktioita, jotka voivat muuttaa kiimakiertoja, laboratoriot voivat altistaa koe-eläimet testikemikaalille kahden viikon ajaksi ja ottaa niiltä irtosolunäytteet päivittäin, jotta ne voivat seurata kiimakiertoa vähintään kahden viikon ajan parittelua edeltävällä jaksolla. Seurantaa on jatkettava parittelujaksolla siihen saakka, että parittelun voidaan todeta tapahtuneen. Vagina-/kohdunkaulasolujen ottamisessa on pyrittävä välttämään limakalvon vaurioittamista, sillä se voi aiheuttaa valetiineyden (7) (8). Poikasia koskevat parametrit 39. Tiineyden kesto on kirjattava, ja se lasketaan tiineyden päivästä 0 alkaen. Jokainen poikue on tutkittava mahdollisimman pian synnytyksen jälkeen, jotta voidaan määrittää poikasten lukumäärä ja sukupuoli, kuolleena ja elävänä syntyneiden poikasten määrä, pienikasvuisten poikasten lukumäärä (poikaset, jotka ovat huomattavasti pienempiä kuin verrokkiryhmän poikaset) ja selvästi näkyvät epämuodostumat. 40. Elävät poikaset on laskettava ja niiden sukupuoli on määritettävä ja poikueet on punnittava 24 tunnin kuluessa synnytyksestä (päivänä 0 tai 1 synnytyksen jälkeen) ja vähintään päivänä 4 ja 13 synnytyksen jälkeen. Edellä 35 kohdassa kuvattujen havaintojen lisäksi on kirjattava myös poikasten kaikenlainen poikkeava käyttäytyminen. 41. Jokaisen poikasen peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys on mitattava samana synnytyksen jälkeisenä päivänä SJP 0 – SJP 4. Poikasen paino on punnittava samana päivänä, kun peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys mitataan, ja tämä mittaus on normalisoitava poikasen koon mittauksen perusteella, mieluiten painon kuutiojuureen (9). Urospuolisten poikasten nännien/nännipihojen määrä on laskettava SJP:nä 12 tai 13 OECD:n ohjeasiakirjassa 151 suositellun mukaisesti (10). Kliininen biokemia 42. Verinäytteet määrätystä paikasta otetaan seuraavan aikataulun mukaan: — vähintään kahdelta poikaselta jokaisesta poikueesta päivänä 4 syntymän jälkeen, jos se on mahdollista poikasten lukumäärän perusteella (ks. 33–34 kohta) — kaikilta emoilta ja vähintään kahdelta poikaselta jokaisesta poikueesta tutkimuksen päättyessä päivänä 13, ja — kaikilta täysikasvuisilta uroksilta tutkimuksen päättyessä. Kaikki verinäytteet on säilytettävä asianmukaisissa olosuhteissa. Päivänä 13 otetuista poikasten ja täysikasvuisten urosten verinäytteistä määritetään kilpirauhashormonien (T4) pitoisuus seerumissa. Emojen ja päivänä 4 poikasilta otettujen verinäytteiden T4-pitoisuus määritetään, jos se on tarpeen. Myös muiden hormonien pitoisuuksia voidaan määrittää, jos se on tarpeen. Poikasten verinäytteet voidaan yhdistää poikueittain kilpirauhashormonin määritystä varten. Kilpirauhashormonit (T4 ja THS) on mitattava mieluiten kokonaispitoisuutena. 43. Seuraavat seikat saattavat vaikuttaa hormonimääritysten vaihteluun ja absoluuttisiin pitoisuuksiin: — lopettamisaika hormonipitoisuuksien vuorokausivaihtelun takia — lopettamistapa: on vältettävä aiheuttamasta eläimille turhaa stressiä, joka voi vaikuttaa hormonipitoisuuksiin — hormonimääritysten testipaketit, joiden standardikäyrät voivat vaihdella. 44. Plasmanäytteet, jotka on nimenomaisesti tarkoitettu hormonimäärityksiin, on otettava samaan aikaan päivästä. Hormonipitoisuuksien analysoimisesta saadaan toisenlaisia numeerisia arvoja kuin erilaisten kaupallisten testipakettien avulla. Patologia Ruumiinavaustutkimukset 45. Kun täysikasvuiset eläimet lopetetaan tai kun ne kuolevat testin aikana, niistä on tutkittava makroskooppisesti mahdolliset epämuodostumat tai patologiset muutokset. Erityistä huomiota on kiinnitettävä lisääntymiselimiin. Kiinnittymiskohtien määrä on kirjattava. Irtosolunäytteet on tutkittava ruumiinavauspäivän aamuna, jotta kiimakierron vaihe voidaan määrittää ja jotta voidaan mahdollistaa korrelaatio munasarjojen histopatologisen tutkimuksen kanssa. 46. Kaikkien täysikasvuisten urospuolisten eläinten kiveksistä ja lisäkiveksistä sekä eturauhasesta ja rakkularauhasesta sekä niiden etuosista kokonaisuudessaan on poistettava kaikki ylimääräinen kudos tarvittaessa, ja niiden märkäpaino on punnittava mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivumisen estämiseksi. Lisäksi voidaan valinnaisesti punnita esimerkiksi levator ani- ja bulbocavernosus-lihaskompleksi, Cowperin rauhaset ja terska uroksilta sekä parilliset munasarjat (märkäpaino) ja kohtu (myös kohdunkaula) naarailta. Jos nämä päätetään punnita, se on tehtävä mahdollisimman pian dissektion jälkeen. 47. Kuolleet poikaset ja päivänä 13 synnytyksen jälkeen tai pian sen jälkeen lopetetut poikaset on tutkittava huolellisesti ulkoisesti selvästi näkyvien epämuodostumien varalta. Huomiota on kiinnitettävä erityisesti ulkoisiin lisääntymiselimiin, joista on tutkittava, näkyykö niissä merkkejä muuttuneesta kehityksestä. Yhden urospoikasen ja yhden naaraspoikasen kilpirauhanen on säilöttävä päivänä 13. 48. Kaikilta täysikasvuisilta eläimiltä on säilöttävä munasarjat, kivekset, avustavat sukupuolielimet (kohtu ja kohdunkaula, lisäkivekset, eturauhanen, rakkularauhanen ja niiden etuosat), kilpirauhanen ja kaikki muut elimet, joissa näkyy makroskooppisia leesioita. Formaliinilla kiinnittämistä ei suositella kivesten ja lisäkivesten tavanomaiseen tutkimukseen. Hyväksyttävä menetelmä on käyttää näihin kudoksiin Bouinin kiinnitysainetta tai Davidsonin muunneltua kiinnitysainetta (11). Tunica albugineaan on tehtävä varovasti pieni reikä neulalla elimen molempiin päihin, jotta kiinnitysaine pääsee tunkeutumaan sisään nopeasti. Histopatologia 49. Suurimman annoksen ryhmän ja verrokkiryhmän eläinten munasarjoista, kiveksistä ja lisäkiveksistä (erityistä huomiota on kiinnitettävä spermatogeneesin vaiheisiin ja kivesten interstitiaalisolujen rakenteen histopatologiaan) on tehtävä tarkka histologinen tutkimus. Muut poikasilta ja täysikasvuisilta eläimiltä otetut elimet, myös kilpirauhanen, voidaan tutkia, jos se on tarpeen. Kilpirauhasen paino voidaan määrittää kiinnittämisen jälkeen. Puhdistus on tehtävä hyvin varovasti ja vasta kiinnittämisen jälkeen kudosvaurioiden välttämiseksi. Kudosvauriot voivat haitata histopatologista analyysia. Tutkimukset tulee tehdä myös kaikille muiden annostusryhmien eläimille, jos suurimman annoksen ryhmässä havaitaan muutoksia. Histopatologiaa koskevissa ohjeissa (11) on tarkempia tietoja endokriinisten kudosten dissektiosta, kiinnittämisestä, mikrotomiasta ja histopatologiasta. TIEDOT JA RAPORTOINTI Tiedot 50. Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot. Lisäksi kaikki tiedot on esitettävä taulukossa, jossa on eritelty testiryhmittäin eläinten lukumäärä testin alussa, testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, kuoleman tai inhimillisistä syistä lopettamisen ajankohta, hedelmällisten eläinten lukumäärä, tiineiden naaraiden lukumäärä, niiden eläinten määrä, joissa toksisuusvaikutuksia on havaittavissa, kuvaus havaituista toksisuuden merkeistä sekä mahdollisten toksisten vaikutusten alkamisaika, kesto ja vakavuus, histopatologisten muutosten tyypit sekä kaikki asiaankuuluvat tiedot poikueesta. Lisäyksessä 3 on malli yhteenvetotaulukosta, joka on osoittautunut erittäin hyödylliseksi lisääntymiseen/kehitykseen kohdistuvien vaikutusten arvioinnissa. 51. Tutkimuksen rajallisuuden vuoksi testien ”merkitsevyyttä” tarkastelevista tilastoanalyyseista on varsin vähän hyötyä monien päätetapahtumien, etenkin lisääntymiseen liittyvien päätetapahtumien, osalta. Jos tilastoanalyyseja tehdään, valitun menetelmän on oltava tutkitun muuttujan jakauman kannalta asianmukainen, ja se on valittava ennen tutkimuksen aloittamista. Peräaukon ja sukupuolielinten välistä etäisyyttä ja nännien vetäytymistä koskevan tilastoanalyysin on perustuttava yksilökohtaisiin tietoihin poikasista, ja poikueeseen kohdistuvat vaikutukset on otettava huomioon. Tarvittaessa poikue on analysoitava yksikkö. Poikasen painoa koskevan tilastoanalyysin on perustuttava yksilökohtaisiin tietoihin poikasista, ja poikueeseen kohdistuvat vaikutukset on otettava huomioon. Pienen ryhmäkoon vuoksi aikaisemmat kontrollitiedot (esimerkiksi poikueen koko), jos niitä on saatavilla, voivat olla hyödyllinen apu tutkimustulosten tulkinnassa. Tulosten arviointi 52. Tämän toksisuustutkimuksen löydökset on arvioitava havaittujen vaikutusten, ruumiinavauksen ja mikroskopialöydösten avulla. Arvioinnissa tulee todeta testikemikaalin annoksen ja poikkeavuuksien – mukaan lukien vakavat vauriot, tietyt kohde-elimet, hedelmättömyys, kliiniset poikkeavuudet, vaikutukset lisääntymiskykyyn ja poikueen kokoon/laatuun, painon muutokset, vaikutukset kuolleisuuteen sekä muut toksiset vaikutukset – esiintyvyyden, ilmaantuvuuden ja vakavuuden välinen mahdollinen suhde. 53. Koska urosten altistusjakso on lyhyt, uroksen lisääntymiskykyyn kohdistuvien vaikutusten arvioinnissa tulisi harkita myös kivesten ja lisäkivesten histopatologista tutkimusta hedelmällisyystietojen ohella. Lisääntymistä/kehitystä koskevien aiempien vertailutietojen (esimerkiksi poikueen koko, peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys, nännien vetäytyminen, seerumin T4-pitoisuus) käytöstä voi olla hyötyä tutkimuksen tulosten tulkinnan apuna. 54. Laadunvalvontaa varten on suositeltavaa kerätä vertailutietoja aiemmista tutkimuksista ja laskea vaihtelukertoimista numeeriset tiedot varsinkin sellaisista parametreista, jotka liittyvät hormonaalisten haitta-aineiden havaitsemiseen. Näitä tietoja voidaan käyttää vertailutarkoituksiin, kun varsinaisia tutkimuksia arvioidaan. Testiraportti 55. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testikemikaali: — alkuperä, erän numero, viimeinen käyttöpäivä, jos saatavilla — testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa. Yhdestä ainesosasta koostuva aine: — ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet — kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan kuin käytännössä on mahdollista jne. Useista ainesosista koostuvat aineet, UVCB-aineet ja seokset: — luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja merkityksellisten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla. Kantaja-aine (tarvittaessa): — jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen valinta on perusteltava. Koe-eläin: — käytetty laji/kanta — eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli — lähde, elinolosuhteet, ravinto jne. — kunkin eläimen paino testin alussa — lajin valinnan perustelut, jos se on muu kuin rotta. Koeolosuhteet: — annostason valintaperusteet — yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmisteesta, saavutetuista pitoisuuksista sekä valmisteen stabiiliudesta ja tasalaatuisuudesta — testikemikaalin annostelun yksityiskohdat — ravinnossa/juomavedessä olevan testikemikaalin määrän (ppm) muuntaminen varsinaiseksi annokseksi (mg/kg/vrk) tarvittaessa — yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta — yksityiskohtainen kuvaus satunnaistamismenettelystä, jolla valittiin karsittavat poikaset, jos karsinta tehtiin. Tulokset: — paino / painon muutokset — ravinnon ja veden kulutus, jos tiedot ovat saatavilla — toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, myös hedelmällisyyden, tiineyden ja toksisuuden mahdollisten muiden merkkien osalta — tiineyden kesto — toksiset tai muut vaikutukset lisääntymiseen, poikasiin, syntymänjälkeiseen kasvuun jne. — kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta riippumatta) — niiden täysikasvuisten naaraiden määrä, joilla on normaali tai epänormaali kiimakierto, ja kierron pituus — elävänä syntyneiden poikasten määrä ja kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet abortoitumiset — poikasten painotiedot — peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys kaikilta poikasilta (sekä paino tämän etäisyyden mittauspäivänä) — urospoikasten nännien vetäytyminen — kilpirauhashormonipitoisuudet päivänä 13 urospoikasilta ja täysikasvuisilta uroksilta (ja emoilta ja naaraspoikasilta päivänä 4, jos pitoisuus mitataan niiltä) — niiden poikasten lukumäärä, joilla on selvästi nähtäviä poikkeavuuksia, ulkoisten sukupuolielinten silmämääräinen arviointi, pienikasvuisten poikasten lukumäärä — eläinten kuolinaika tutkimusaikana tai tieto siitä, pysyivätkö eläimet hengissä tutkimuksen päättymiseen saakka — kiinnittymisten lukumäärä, poikueen koko ja painot kirjaushetkellä — poikasia saaneiden eläinten paino lopetettaessa ja niiden elinten paino — ruumiinavauslöydökset — yksityiskohtaiset tiedot kaikista histopatologisista löydöksistä — absorptiotiedot (jos saatavilla) — tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa. Tulosten pohdinta. Päätelmät. Tulosten tulkinta 56. Tutkimuksen tuloksena saadaan arviot toistettujen annosten antamiseen liittyvästä lisääntymis-/kehitystoksisuudesta (ks. 5 ja 6 kohta). Sen perusteella tiedetään, onko tehtävä lisätutkimuksia, ja se voi ohjata myös myöhempien tutkimusasetelmien suunnittelua. OECD:n ohjeasiakirjaa 43 on käytettävä lisääntymiseen ja kehitykseen kohdistuviin vaikutuksiin liittyvien tulosten tulkinnan apuna (12). OECD:n ohjeasiakirjassa 106 (jyrsijöillä tehtyjen endokriinisten ja lisääntymiseen liittyvien testien histologinen arviointi) on tietoa (endokriinisten) elinten ja irtosolunäytteiden preparoinnista ja arvioinnista. Näistä tiedoista voi olla apua tämän testiohjeen soveltamisessa. LÄHDEKIRJALLISUUS (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Saatavana OECD:stä pyynnöstä. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Saatavana OECD:stä pyynnöstä. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Saatavana OECD:stä pyynnöstä. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84–97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383–390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Lisäys 1 MÄÄRITELMÄT (KS. MYÖS OECD:N OHJEASIAKIRJA 150 (6)) Androgeenisuus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen androgeenihormonin (esimerkiksi testosteronin) tavoin. Antiandrogeenisuus on kemikaalin kyky estää luonnollisen androgeenihormonin (esimerkiksi testosteronin) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Antiestrogeenisuus on kemikaalin kyky estää luonnollisen estrogeenihormonin (esimerkiksi 17ß-estradiolin) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Kilpirauhasen toimintaa estävä vaikutus on kemikaalin kyky estää luonnollisen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T3:n) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Kemikaali on aine tai seos. Kehitystoksisuus: Pre-, peri-, postnataalisina, rakenteellisina tai toiminnallisina häiriöinä jälkeläisissä esiintyvän lisääntymistoksisuuden ilmeneminen. Annostelu on yleinen termi, joka kattaa annoksen, annostelutaajuuden ja annostelun keston. Annos on annostellun testikemikaalin määrä. Annos ilmaistaan testikemikaalin painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esim. mg/kg päivässä) tai vakioina pidettävinä ruokavalion pitoisuuksina (ppm). Ilmeinen toksisuus on yleistermi, jolla tarkoitetaan testikemikaalin antamisen jälkeen ilmeneviä selviä toksisuuden merkkejä. Niitä on oltava riittävästi vaaran arviointia varten, ja niiden on oltava sellaisia, että annetun annoksen suurentamisen voidaan odottaa aiheuttavan vakavia merkkejä myrkyllisyydestä ja todennäköisesti kuolleisuutta. Hedelmällisyyden heikentyminen tarkoittaa uroksen tai naaraan lisääntymistoimintojen tai -kyvyn häiriöitä. Emoille myrkylliset vaikutukset: Tiineinä oleviin naaraisiin kohdistuvat haittavaikutukset, joita esiintyy joko spesifisti (suora vaikutus) tai epäspesifisti (epäsuora vaikutus). NOAEL on lyhennys englanninkielisistä sanoista no-observed-adverse-effect level (taso, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta). Se on siis suurin annos, jolla ei havaita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia. Estrogeenisuus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen estrogeenihormonin (esimerkiksi 17ß-estradiolin) tavoin. Lisääntymistoksisuus tarkoittaa haitallisia vaikutuksia, jotka kohdistuvat jälkeläisiin, ja/tai uroksen ja naaraan lisääntymistoimintojen tai -kyvyn heikentymistä. Testikemikaali on tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Kilpirauhasen kaltainen vaikutus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T3:n) tavoin. Validointi on tieteellinen menettely, jonka tarkoituksena on luonnehtia testimenetelmän toiminnallisia vaatimuksia ja rajoituksia sekä osoittaa sen luotettavuus ja merkityksellisyys tiettyyn tarkoitukseen nähden. Lisäys 2 KAAVIO TESTIAIKATAULUSTA (TUTKIMUKSEN ENIMMÄISKESTO TÄYDEN 14 PÄIVÄN PITUISEN PARITTELUJAKSON PERUSTEELLA) Lisäys 3 YHTEENVETOTAULUKKO LISÄÄNTYMISEEN/KEHITYKSEEN KOHDISTUVISTA VAIKUTUKSISTA HAVAINNOT ARVOT Annostus (yksiköt) 0 (kontrolli) … … … … Aloittaneet parit (N) Kiimakierto (vähintään keskimääräinen pituus ja epäsäännöllisten kiertojen tiheys) Naaraat, joissa merkkejä parittelusta (N) Tiineeksi tulleet naaraat (N) Hedelmöityspäivät 1–5 (N) Hedelmöityspäivät 6–… (21) (N) Tiineys ≤ 21 päivää (N) Tiineys = 22 päivää (N) Tiineys ≥ 23 päivää (N) Emot, joilla eläviä poikasia (N) Emot, joilla eläviä poikasia päivänä 4 synn. jälk. (N) Kiinnittyneet alkiot / emo (keskiarvo) Elävät poikaset / emo synnytyksessä (keskiarvo) Elävät poikaset / emo päivänä 4 (keskiarvo) Sukupuolijakauma (u/n) synnytyksessä (keskiarvo) Sukupuolijakauma (u/n) päivänä 4 (keskiarvo) Poikueen paino synnytyksessä (keskiarvo) Poikueen paino päivänä 4 (keskiarvo) Poikasen paino synnytyksessä (keskiarvo) Poikasen paino peräaukon ja sukupuolielinten välisen etäisyyden mittauksen yhteydessä (urosten ja naaraiden keskiarvot) Poikasen peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys samana syntymänjälkeisenä päivänä, syntymä – päivä 4 (urosten ja naaraiden keskiarvot, merkitse SJP) Poikasen paino päivänä 4 (keskiarvo) Urospoikasten nännin vetäytyminen päivänä 13 (keskiarvo) Poikasen paino päivänä 13 (keskiarvo) POIKKEAVAT POIKASET Emot, joilla 0 poikkeavaa poikasta Emot, joilla 1 poikkeava poikanen Emot, joilla ≥ 2 poikkeavaa poikasta JÄLKELÄISTEN KUOLEMAT Prenataalit / kiinnittymisten jälkeiset tapaukset (kiinnittymiset miinus elävänä syntyneet poikaset) Naaraat, joilla 0 tapausta Naaraat, joilla 1 tapaus Naaraat, joilla 2 tapausta Naaraat, joilla ≥ 3 tapausta Postnataalit tapaukset (elävänä syntyneet poikaset miinus SJP:nä 13 elossa olevat poikaset) Naaraat, joilla 0 tapausta Naaraat, joilla 1 tapaus Naaraat, joilla 2 tapausta Naaraat, joilla ≥ 3 tapausta B.64 YHDISTELMÄTESTI: TOISTUVAN ANNOSTELUN TOKSISUUSTUTKIMUS JA LISÄÄNTYMIS-/KEHITYSTOKSISUUDEN SEULONTATESTI JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 422 (2016). Kemikaalien testaamiseen tarkoitettuja OECD:n testiohjeita tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen mukaisesti. Seulontatestiohje 422 hyväksyttiin alun perin vuonna 1996, ja se perustui yhdistettyyn toistetun annoksen ja lisääntymis-/kehitystoksisuuden seulontatesti -protokollaan, jota käsiteltiin kahdessa asiantuntijakokouksessa, Lontoossa vuonna 1990 (1) ja Tokiossa vuonna 1992 (2). 2. Tässä testimenetelmässä yhdistetään lisääntymis-/kehitystoksisuuden seulontaa koskeva osa, joka perustuu jäsenmaissa kertyneeseen kokemukseen alkuperäisen menetelmän käyttämisessä nykyisten suurina määrinä tuotettavien kemikaalien yhteydessä ja kartoittaviin testeihin, joissa käytetään positiivisia kontrolliaineita (3) (4), sekä toistuvan annostelun toksisuutta koskeva osa, joka on OECD:n testiohjeen 407 (oraalinen toistuvan annostelun toksisuustutkimus (28 pv) jyrsijöillä, vastaa tämän liitteen B.7 lukua) mukainen. 3. Tätä testimenetelmää on päivitetty lisäämällä siihen hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkitykselliset päätetapahtumat sen jälkeen, kun OECD aloitti vuonna 1998 tärkeän toimenpiteen, nimittäin olemassa olevien testiohjeiden uudistamisen ja uusien testiohjeiden laatimisen mahdollisten hormonaalisten haitta-aineiden seulontaa ja testausta varten (5). Tässä yhteydessä testiohjetta 407 (joka vastaa tämän liitteen B.7 lukua) parannettiin vuonna 2008 lisäämällä siihen parametreja, jotka soveltuvat testikemikaalien endokriinisen toiminnan havaitsemiseen. Testiohjeen 422 päivittämisen tavoitteena oli sisällyttää seulontatestiohjeeseen joitakin hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkityksellisiä päätetapahtumia sellaisia tilanteita varten, kun altistusajat kattavat muutamia kehityksen kannalta herkkiä ajanjaksoja (syntymää edeltävät tai heti syntymän jälkeiset ajanjaksot). 4. Valitut hormonaalisten haitta-aineiden kannalta merkitykselliset uudet päätetapahtumat, jotka sisältyvät myös testiohjeeseen 443 (pidennetty yhden sukupolven lisääntymistoksisuutta koskeva tutkimus, tämän liitteen B.56 luku), sisällytettiin testiohjeeseen 422 toteutettavuustutkimuksen perusteella. Tutkimuksessa käsiteltiin päätetapahtumien lisäämistä koskevia tieteellisiä ja teknisiä kysymyksiä ja mahdollisia muutoksia, joita testiasetelmaan pitäisi tehdä päätetapahtumien lisäämisen vuoksi (6). 5. Tämä testimenetelmä on suunniteltu tuottamaan tiettyjä tietoja, jotka koskevat testikemikaalin vaikutuksia uroksen ja naaraan lisääntymiskykyyn, kuten sukupuolirauhasten toimintaan, parittelukäyttäytymiseen, hedelmöittymiseen, conceptuksen kehittymiseen ja synnytykseen. Se ei ole vaihtoehtoinen eikä korvaa nykyisiä testimenetelmiä B.31, B.34, B.35 tai B.56. ALUSTAVAT HUOMIOT 6. Kun määritetään ja arvioidaan testikemikaalin toksisia ominaisuuksia, toistettujen annosten aiheuttama oraalinen toksisuus voidaan määrittää sen jälkeen, kun akuutista testauksesta on saatu alustavia tietoja toksisuudesta. Tämä tutkimus antaa tietoa mahdollisista terveyshaitoista, joita todennäköisesti seuraa toistuvasta altistuksesta melko lyhyen ajan kuluessa. Menetelmä koostuu tavanomaisesta toistuvan annostelun toksisuustutkimuksesta, jota voidaan käyttää sellaisten kemikaalien testaamisessa, joiden osalta 90 päivän tutkimus ei ole perusteltu (kun esimerkiksi tuotantomäärä ei ylitä tiettyjä rajoja), tai pitkäaikaisen tutkimuksen esitutkimuksena. Tutkimuksen toteuttamisessa on noudatettava periaatteita ja näkökohtia, jotka esitetään pääpiirteittäin OECD:n ohjeasiakirjassa 19 kliinisten oireiden tunnustamisesta, arvioimisesta ja soveltamisesta inhimillisinä toimenpiteinä turvallisuusarvioinneissa käytettäviin eläimiin (7). 7. Lisäksi tutkimus koostuu lisääntymis-/kehitystoksisuuden seulontatestistä, ja siksi sitä voidaan käyttää alustavien tietojen saamiseksi mahdollisista vaikutuksista, jotka kohdistuvat uroksen ja naaraan lisääntymiskykyyn, kuten sukupuolirauhasten toimintaan, parittelukäyttäytymiseen, hedelmöittymiseen, conceptuksen kehittymiseen ja synnytykseen, joko testikemikaalien toksikologisten ominaisuuksien arvioinnin varhaisessa vaiheessa tai huolta aiheuttavien kemikaalien tutkimuksessa. Tällä testimenetelmällä ei saada täydellisiä tietoja kaikista lisääntymiseen ja kehitykseen liittyvistä näkökohdista. Testimenetelmällä voi vain rajallisesti havaita syntymää edeltäneen altistuksen vaikutuksia syntymän jälkeen tai sellaisia vaikutuksia, joita voi ilmaantua syntymän jälkeisen altistuksen aikana. (Esimerkiksi) päätetapahtumien valikoivuuden ja tutkimuksen lyhyen keston vuoksi tällä menetelmällä ei saada sellaista näyttöä, joka tukisi varmoja päätelmiä siitä, ettei lisääntymiseen/kehitykseen kohdistuvia vaikutuksia ole. Koska myöskään muihin lisääntymis-/kehitystoksisuustesteihin pohjautuvia tietoja ei ole, positiiviset tulokset ovat hyödyllisiä alustavassa vaaran arvioinnissa, ja ne voivat vaikuttaa päätöksiin lisätestauksen tarpeellisuudesta ja ajoituksesta. 8. Hormonitoimintaan liittyvien parametrien avulla saatuja tuloksia on tarkasteltava OECD:n asiakirjaan ”Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (8) (hormonaalisten haitta-aineiden testausta ja arviointia koskeva toimintamalli) liittyvässä kontekstissa. Tässä asiakirjassa OECD:n parannettu testiohje 422 sisältyy tasolle 4 in vivo -testinä, jolla saadaan tietoa haittavaikutuksista hormonitoiminnan kannalta merkityksellisten päätetapahtumien osalta. Hormonitoimintaan liittyvää signaalia ei kuitenkaan pidetä yksinään riittävänä näyttönä siitä, että testikemikaali olisi hormonaalinen haitta-aine. 9. Tässä menetelmässä painotetaan neurologisia vaikutuksia nimenomaisena päätetapahtumana ja eläinten tarkan kliinisen havainnoinnin tarvetta, jotta tietoa saataisiin mahdollisimman paljon. Menetelmällä on tarkoitus tunnistaa mahdollisesti neurotoksisia kemikaaleja, jotka voivat vaatia tarkempia tutkimuksia tältä osin. Lisäksi menetelmällä voidaan saada perustietoja immunologisista vaikutuksista. 10. Koska muihin systeemistä toksisuutta, lisääntymis-/kehitystoksisuutta, neurotoksisuutta ja/tai immunotoksisuutta koskeviin tutkimuksiin pohjautuvia tietoja ei ole, positiiviset tulokset ovat hyödyllisiä alustavassa vaaran arvioinnissa, ja ne voivat vaikuttaa päätöksiin lisätestauksen tarpeellisuudesta ja ajoituksesta. Erityisen hyödyllinen tämä testi voi olla osana OECD:n seulontatietoaineistoa (Screening Information Data Set, SIDS) sellaisten olemassa olevien kemikaalien arvioinnissa, joista toksikologista tietoa on saatavilla niukasti tai joista sitä ei ole saatavilla lainkaan. Sitä voidaan käyttää myös vaihtoehtona kahdelle erilliselle testille, joissa tarkastellaan toistuvasta annostelusta johtuvaa toksisuutta (OECD:n testiohje 407, joka vastaa tämän liitteen B.7 lukua) ja lisääntymis-/kehitystoksisuutta (OECD:n testiohje 421, joka vastaa tämän liitteen B.63 lukua). Sitä voidaan käyttää myös annosalueen määritystutkimuksena laajemmissa lisääntymis-/kehitystutkimuksissa tai silloin, kun sitä pidetään muulloin tarpeellisena. 11. Yleensä oletetaan, että tiineiden ja muiden kuin tiineiden eläinten herkkyydessä on eroja. Siksi tässä yhdistelmätestissä voi olla vaikeampaa määrittää annostasot, jotka ovat asianmukaiset sekä yleisen systeemisen toksisuuden että nimenomaisen lisääntymis-/kehitystoksisuuden arvioinnin kannalta, verrattuna siihen, että kumpikin testi tehtäisiin erikseen. Lisäksi yleistä systeemistä toksisuutta koskevien testitulosten tulkinta voi olla vaikeampaa kuin silloin, kun tehdään erillinen toistuvan annostelun tutkimus, etenkin jos seerumiin liittyviä ja histopatologisia parametreja ei arvioida tutkimuksessa samaan aikaan. Näiden teknisten haasteiden vuoksi tämän yhdistetyn seulontatestin tekeminen edellyttää vankkaa kokemusta toksisuuden testaamisesta. Toisaalta yhdistelmätesti voi olla parempi keino erotella lisääntymiseen/kehitykseen kohdistuvat suorat vaikutukset niistä, jotka ovat toissijaisia muihin (systeemisiin) vaikutuksiin nähden, ja lisäksi yhdistelmätestissä tarvitaan vähemmän koe-eläimiä. 12. Tässä testissä annostelujakso on pidempi kuin tavanomaisessa 28 päivän mittaisessa toistuvan annostelun tutkimuksessa. Siinä käytetään kuitenkin vähemmän eläimiä kummankin sukupuolen ryhmässä kuin silloin, kun tavanomainen 28 päivän mittainen toistuvan annostelun tutkimus tehdään lisääntymis-/kehitystoksisuutta koskevan seulontatestin lisäksi. 13. Tässä testimenetelmässä testikemikaali annostellaan suun kautta. Jos käytetään muita altistusreittejä, menetelmään voi olla tarpeen tehdä muutoksia. 14. Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa. 15. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 16. Testikemikaalia annetaan porrastettuina annoksina useille uros- ja naarasryhmille. Uroksille on annettava testikemikaalia vähintään neljä viikkoa suunniteltua lopettamispäivää edeltävään päivään saakka kyseinen päivä mukaan luettuna (ts. vähintään kaksi viikkoa ennen parittelua, parittelujakson aikana ja noin kaksi viikkoa parittelun jälkeen). Koska parittelua edeltävä annostelujakso on urosten osalta lyhyt, hedelmällisyys ei välttämättä ole erityisen herkkä indikaattori kiveksiin kohdistuvasta toksisuudesta. Sen vuoksi kivesten tarkka histologinen tutkimus ontärkeä. Parittelua edeltävää kahden viikon annostelujaksoa, jota seuraa parittelun/hedelmällisyyden tarkkailu, ja vähintään neljä viikkoa kestävä kokonaisannostelujakso katsotaan riittäväksi, jotta voidaan havaita suurin osa urosten hedelmällisyyteen ja spermatogeneesiin kohdistuvista vaikutuksista. 17. Naaraille on annettava testikemikaalia tutkimuksen koko keston ajan. Niille testikemikaalia annostellaan siis kahden viikon ajan ennen parittelua (tavoitteena on kattaa vähintään kaksi täyttä kiimakiertoa), hedelmöittymisen vaihteleva ajankohta, tiineyden kesto ja vähintään 13 päivää synnytyksen jälkeen suunniteltua lopettamispäivää edeltävään päivään saakka kyseinen päivä mukaan luettuna. 18. Tutkimuksen kesto sopeutumisvaiheen ja annostelua edeltävän kiimakierron arvioinnin jälkeen määräytyy naaraan lisääntymiskyvyn mukaan, ja se on noin 63 päivää [vähintään 14 päivää ennen parittelua, (enintään) 14 päivän parittelujakso, 22 päivän tiineys ja 13 päivän imetysaika]. 19. Annostelujakson aikana eläimiä havainnoidaan tarkoin päivittäin toksisuusoireiden varalta. Kokeen aikana kuolleille tai lopetetuille eläimille tehdään ruumiinavaus. Kokeen lopussa vielä elossa olevat eläimet lopetetaan ja niille tehdään ruumiinavaus. MENETELMÄN KUVAUS Eläinlajin valinta 20. Tässä testimenetelmässä on suunniteltu käytettävän rottaa koe-eläimenä. Jos tässä testiohjeessa 422 määritettyjä parametreja tutkitaan muilla jyrsijöillä, sille on esitettävä yksityiskohtainen perustelu. Kansainvälisessä validointiohjelmassa, jossa tutkittiin hormonaalisten haitta-aineiden havaitsemista testiohjeen 407 mukaisesti, rotta oli ainoa käytetty laji. Kantoja, joiden hedelmällisyys on alhainen tai joilla tiedetään esiintyvän kehityshäiriöitä, ei tule käyttää. Koe-eläiminä on käytettävä terveitä pariutumattomia eläimiä, joilla ei ole tehty aikaisempia kokeita. Koe-eläinten laji, kanta, sukupuoli, paino ja ikä on oltava tiedossa. Käytettävien eläinten paino ei saisi juurikaan vaihdella eikä ylittää ±20:tä prosenttia kummankaan sukupuolen keskipainosta kokeen alussa. Mikäli tutkimusta käytetään pitkäaikaistutkimuksen tai koko sukupolven tutkimuksen esitestinä, molemmissa tutkimuksissa tulee mieluiten käyttää samasta kannasta ja lähteestä olevia eläimiä. Koe-eläintilat ja ruokinta 21. Kaikissa menettelyissä on noudatettava laboratorioeläinten hoitoa koskevia paikallisia vaatimuksia. Koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °). Suhteellisen kosteuden olisi oltava vähintään 30 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ruokavalion valinnassa on varmistettava, että testikemikaalin ja ravinnon suhde on sopiva, mikäli testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna. 22. Eläimet voidaan pitää häkeissä muutaman samaa sukupuolta olevan eläimen ryhmissä tai yksittäin, jos se on tieteellisesti perusteltua. Yhdessä ryhmähäkissä saa olla enintään viisi eläintä. Parituksen tulee tapahtua tarkoitukseen sopivissa häkeissä. Tiineet naaraat on laitettava häkkiin yksittäin, ja niille on annettava pesämateriaaleja. Imettävät naaraat laitetaan häkkiin yksittäin poikastensa kanssa. 23. Eläinten ravinto on analysoitava säännöllisesti kontaminanttien varalta. Näyte ruokavaliosta on säilytettävä siihen saakka, kunnes tutkimusraportti on valmis. Eläinten valmistelu 24. Terveet nuoret täysikasvuiset eläimet satunnaistetaan ja jaetaan altistusryhmiin ja häkkeihin. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Eläimet merkitään yksilöllisesti ja pidetään häkeissään vähintään viiden päivän ajan ennen tutkimuksen aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-oloihin. Annosten valmistelu 25. Testikemikaali suositellaan annosteltavaksi suun kautta, ellei muita annostelureittejä pidetä asianmukaisempina. Jos valitaan suun kautta annostelu, testikemikaali annetaan yleensä ruokintaletkun kautta; vaihtoehtoisesti testikemikaalit voidaan kuitenkin antaa myös ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna. 26. Tarvittaessa testikemikaali liuotetaan tai suspendoidaan sopivaan kantaja-aineeseen. On suositeltavaa, että ensin harkitaan vesiliuosta tai suspensiota aina, kun se on mahdollista, ja sen jälkeen öljyyn (esimerkiksi maissiöljyyn) tehtävää liuosta/suspensiota ja sitten mahdollisesti muihin kantaja-aineisiin perustuvia liuoksia. Jos kantaja-aine on muu kuin vesi, sen toksiset ominaisuudet on tunnettava. Testikemikaalin stabiliteetti kantaja-aineessa on määritettävä. MENETTELY Eläinten lukumäärä ja sukupuoli 27. On suositeltavaa, että jokaisessa ryhmässä on aluksi vähintään 10 urosta ja 12–13 naarasta. Naaraiden kiimakierto arvioidaan ennen altistusta, ja eläimiä, joiden osalta tyypillistä 4–5 päivän kiertoa ei voida vahvistaa, ei oteta mukaan tutkimukseen. Jotta kuhunkin ryhmään saadaan varmasti 10 naarasta, niitä pitää olla aluksi enemmän kuin uroksia. Lukuun ottamatta selviä toksisia vaikutuksia kuhunkin ryhmään oletetaan saatavan vähintään kahdeksan tiineenä olevaa naarasta, mikä on yleensä pienin hyväksyttävä tiineiden naaraiden määrä yhdessä ryhmässä. Tavoitteena on saada tarpeeksi tiineystapauksia ja poikasia, jotta voidaan tehdä luotettava arvio testikemikaalin mahdollisesta vaikutuksesta hedelmällisyyteen, tiineyteen, emon ja poikasen käytökseen sekä F 1 -sukupolven kasvuun ja kehitykseen hedelmöityksestä synnytyksen jälkeiseen päivään 13 saakka. Jos eläimiä lopetetaan kokeen aikana, testiin on otettava alussa sen verran enemmän eläimiä kuin niitä lopetetaan ennen tutkimuksen päättymistä. Myös ylimääräisen, kymmenestä eläimestä (viisi kumpaakin sukupuolta) koostuvan satelliittiryhmän käyttöä voidaan harkita verrokkiryhmässä ja suurimman annoksen ryhmässä, jotta systeemisten toksisten vaikutusten korjaantuvuutta, jatkuvuutta ja ilmaantumisen viivästymistä voidaan havainnoida vähintään 14 päivän ajan käsittelyn jälkeen. Satelliittiryhmien eläimiä ei pariuteta, eikä niitä näin ollen käytetä lisääntymis-/kehitystoksisuuden arviointiin. Annostelu 28. Yleensä tulee käyttää vähintään kolmea testiryhmää ja yhtä verrokkiryhmää. Jos sopivia tietoja yleisestä toksisuudesta ei ole saatavilla, voidaan tehdä annosalueen määritystesti (samasta kannasta ja lähteestä olevia eläimiä käyttäen) käytettävien annosten määrittämisen helpottamiseksi. Testikemikaalin annostelua lukuun ottamatta verrokkiryhmän eläimiä on käsiteltävä täsmälleen samoin kuin testiryhmän eläimiä. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään kantaja-ainetta, sitä tulee antaa verrokkiryhmälle suurin käytetty määrä. 29. Annostasojen valinnassa tulee ottaa huomioon kaikki saatavilla olevat aikaisemmat toksisuustiedot ja (toksiko)kineettiset tiedot. Lisäksi on otettava huomioon, että tiineiden ja muiden kuin tiineiden eläinten herkkyydessä voi olla eroja. Korkein annostaso tulee valita siten, että sen tarkoituksena on aiheuttaa toksisia vaikutuksia mutta ei kuolemaa tai selviä kärsimyksiä. Sen jälkeen annostasojen on oltava laskevia, jotta voitaisiin osoittaa kaikki annokseen liittyvät vasteet ja haitaton taso alhaisimmalla annostasolla. Kaksin-nelinkertaiset erot annostasojen välillä ovat usein parhaimmat, ja usein on hyödyllisempää lisätä neljäs testiryhmä kuin käyttää hyvin suuria annosvälejä (ts. suurempia kuin 10-kertaisia). 30. Jos havaitaan yleistä toksisuutta (kuten painonlaskua, maksaan, sydämeen, keuhkoihin tai munuaisiin kohdistuvia vaikutuksia jne.) tai muita muutoksia, jotka eivät ole välttämättä toksisia (esimerkiksi ravinnonoton vähentymistä, maksan suurenemista), hormonitoiminnan kannalta herkkiin päätetapahtumiin kohdistuvia vaikutuksia on tulkittava varauksellisesti. Raja-annostesti 31. Ellei yhdellä annostasolla, joka on vähintään 1 000 mg painokiloa kohti / vrk tai jota annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna vastaava prosenttiosuus (painomääritysten perusteella), tehdyssä oraalisessa testissä, joka on tehty tälle tutkimukselle annettujen ohjeiden mukaan, havaita myrkyllisiä vaikutuksia ja jos myrkyllisyyttä ei ole odotettavissa rakenteeltaan samanlaisilla aineilla saatujen tutkimustulosten perusteella, täydellinen tutkimus useilla annostasoilla ei ehkä ole välttämätön. Raja-annostestiä sovelletaan, paitsi jos ihmisten altistumisesta voidaan päätellä, että on käytettävä korkeampaa annostasoa. Muiden antotapojen kuten inhalaation tai ihoapplikaation osalta suurin mahdollinen altistus määräytyy yleensä testikemikaalien fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien perusteella. Annostelu 32. Eläimille annetaan testikemikaalia päivittäin seitsemänä päivänä viikossa. Jos testikemikaali annetaan ruokintaletkun kautta, se on annettava eläimille yhtenä annoksena mahaletkun tai sopivan intubaatiokanyylin kautta. Suurin yhdellä kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa olla yli 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksena ovat vesiliuokset, joita käytettäessä tilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Poikkeuksena tästäovat ärsyttävät tai syövyttävät testikemikaalit, joiden kohdalla voidaan yleensä todeta vaikutusten voimistuminen suurempia pitoisuuksia käytettäessä. Testikemikaalin määrän vaihtelu on minimoitava pitoisuutta muuttamalla, jotta kaikilla annostasoilla varmistetaan tilavuudeltaan sama nestemäärä. 33. Kun testikemikaalit annetaan ravintoon tai juomaveteen sekoitettuna, on tärkeää varmistaa, että testikemikaalin määrät eivät häiritse normaalia ravinto- tai nestetasapainoa. Jos testikemikaali annetaan ravintoon sekoitettuna, voidaan ilmoittaa joko testikemikaalin pitoisuus ravinnossa (ppm) tai eläimen painoon suhteutettu annostaso; käytetty tapa on mainittava. Jos testikemikaali annetaan letkulla, annos tulee antaa päivittäin samaan aikaan ja sitä on mukautettava vähintään viikoittain siten, että annostaso pysyy samana eläimen painoon nähden. Mikäli yhdistelmätutkimusta käytetään pitkäaikaistutkimuksen tai täydellisen lisääntymistoksisuustutkimuksen esitestinä, kummassakin tutkimuksessa on käytettävä samanlaista ruokavaliota. Testiaikataulu 34. Testikemikaalia on alettava antaa kummallekin sukupuolelle vähintään kaksi viikkoa ennen parittelua sen jälkeen, kun eläimiä on sopeutettu vähintään viisi päivää ja kun eläimistä on seulottu ne naaraat, joiden kiimakierto on normaali (altistusta edeltävällä kahden viikon jaksolla). Tutkimus on aikataulutettava siten, että kiimakierron arviointi alkaa pian sen jälkeen, kun eläimet ovat saavuttaneet täyden sukukypsyyden. Eri rottakannoissa ja eri laboratorioissa voi olla tässä vaihtelua; esimerkiksi Sprague-Dawley-rotat tulevat sukukypsiksi 10-viikkoisina, Wistar-rotat taas noin 12-viikkoisina. Poikineet emot on lopetettava päivänä 13 synnytyksen jälkeen tai pian sen jälkeen. Jotta emot voivat paastota ennen verinäytteen ottamista (jos tämä vaihtoehto on ensisijainen), emoja ja niiden jälkeläisiä ei välttämättä tarvitse lopettaa samana päivänä. Syntymäpäivä (ts. kun synnytys on tapahtunut) määritellään synnytyksen jälkeiseksi päiväksi 0. Naaraat, joiden osalta parittelua ei voida todeta tapahtuneen, lopetetaan 24–26 päivää parittelujakson viimeisen päivän jälkeen. Annostelua jatketaan kummallekin sukupuolelle parittelujakson aikana. Uroksille annostelua on jatkettava parittelujakson jälkeen vähintään siihen saakka, kunnes annostelujakso on kokonaisuudessaan vähintään 28 päivää. Sen jälkeen urokset lopetetaan. Vaihtoehtoisesti ne pidetään elossa ja annostelua jatketaan mahdolliseen toiseen parittelukertaan asti, jos sitä pidetään tarkoituksenmukaisena. 35. Annostelua tiineeksi tulleille naaraille on jatkettava tiineyden ajan ja vähintään synnytyksen jälkeiseen päivään 13 asti, kyseinen päivä mukaan luettuna, tai lopettamista edeltävään päivään saakka. Tutkimuksissa, joissa testikemikaalia annostellaan hengitysteiden tai ihon kautta, annostelua on jatkettava vähintään tiineyden päivään 19 saakka, kyseinen päivä mukaan luettuna, ja annostelua on jatkettava mahdollisimman pian, viimeistään kuitenkin synnytyksen jälkeisenä päivänä (SJP) 4. 36. Niitä satelliittiryhmän eläimiä, jotka on varattu seurantahavaintoihin (jos tutkimuksessa tehdään niitä), ei pariuteta. Niitä on pidettävä ilman altistusta vähintään 14 päivää ensimmäisen suunnitellun emojen lopettamispäivän jälkeen, jotta voidaan todeta toksisten vaikutusten ilmaantuneen viipeellä, pysyneen tai korjaantuneen. 37. Lisäyksessä 2 on kaavio testiaikataulusta. Kiimakierrot 38. Kiimakiertoja on seurattava ennen altistuksen aloittamista, jotta tutkimukseen voidaan valita naaraita, joiden kiimakierto on säännöllinen (ks. 27 kohta). Myös irtosolunäytteitä on seurattava päivittäin altistusjakson alkamisesta siihen saakka, kunnes parittelun todetaan tapahtuneen. Jos annostelun aloittamisen epäillään aiheuttavan akuutteja stressireaktioita, jotka voivat muuttaa kiimakiertoja, laboratoriot voivat altistaa koe-eläimet testikemikaalille kahden viikon ajaksi ja ottaa niiltä irtosolunäytteet päivittäin, jotta ne voivat seurata kiimakiertoa vähintään kahden viikon ajan parittelua edeltävällä jaksolla. Seurantaa on jatkettava parittelujaksolla siihen saakka, että parittelun voidaan todeta tapahtuneen. Vagina-/kohdunkaulasolujen ottamisessa on pyrittävä välttämään limakalvon vaurioittamista, sillä se voi aiheuttaa valetiineyden (8) (9). Paritus 39. Tässä tutkimuksessa on käytettävä yleensä 1:1-parittelua (yhden uroksen ja yhden naaraan parittelu). Poikkeuksia voidaan tehdä, jos yksittäisiä uroksia kuolee. Naaras on laitettava häkkiin saman uroksen kanssa, kunnes parittelun todetaan tapahtuneen tai kunnes kaksi viikkoa on kulunut. Naaraat on tutkittava joka aamu sperman tai vaginatulpan havaitsemiseksi. Tiineyspäivä 0 määritellään päiväksi, jolloin todisteet parittelusta vahvistetaan (vaginatulpan muodostuminen tai spermaa havaitaan). Jos parittelua ei tapahdu, voidaan harkita naaraan uutta paritusta saman ryhmän hedelmällisiksi todettujen urosten kanssa. Poikueiden koko 40. Päivänä 4 synnytyksen jälkeen kunkin poikueen kokoa voidaan mukauttaa poistamalla siitä poikasia satunnaisvalinnalla siten, että yhteen poikueeseen jää neljä tai viisi poikasta kumpaakin sukupuolta sen mukaan, mikä on käytetyn rottakannan normaali poikuekoko. Kahdesta ylimääräisestä poikasesta on otettava verinäytteet, jotka yhdistetään ja joita käytetään seerumin T4-pitoisuuden määrittämiseen. Poikasten valikoiva eliminointi esimerkiksi painon tai peräaukon ja sukupuolielinten välisen etäisyyden perusteella ei ole tarkoituksenmukaista. Jos uros- tai naaraspuolisten poikasten määrä on sellainen, että poikueeseen ei jää neljää tai viittä poikasta kumpaakin sukupuolta, voidaan tehdä osittaismukautus (esimerkiksi kuusi urosta ja neljä naarasta). Poikasia ei eliminoida poikueesta, jos poikueen koko supistuisi karsintatavoitetta pienemmäksi (8 tai 10 poikasta / poikue). Jos käytettävissä on vain yksi poikanen karsimistavoitetta enemmän, eliminoidaan vain yksi poikanen, ja siltä otetaan verinäyte mahdollisia seerumin T4-määrityksiä varten. 41. Jos poikueen kokoa ei mukauteta, jokaisesta poikueesta lopetetaan kaksi poikasta päivänä 4 syntymän jälkeen, ja niiltä otetaan verinäytteet seerumin kilpirauhashormonipitoisuuden mittausta varten. Mikäli mahdollista, näiden kahden poikasen tulisi olla naaraita, jotta urospuolisista poikasista voidaan tutkia nännien vetäytyminen, mutta tämä ei saa johtaa siihen, ettei poikueeseen jäisi naaraspuolisia poikasia arvioitavaksi tutkimuksen päättyessä. Yhtään poikasta ei eliminoida, jos poikueen koko pienenisi alle 8 tai 10 poikaseen / poikue (käytetyn rottakannan normaalin poikuekoon mukaan). Jos käytettävissä on vain yksi poikanen normaalia poikuekokoa enemmän, eliminoidaan vain yksi poikanen, ja siltä otetaan verinäyte mahdollisia seerumin T4-määrityksiä varten. Havainnot 42. Kliinisiä yleishavaintoja on tehtävä vähintään kerran päivässä mieluiten suurin piirtein samaan aikaan / samoihin aikoihin joka päivä ja ottaen huomioon, että odotettuja vaikutuksia esiintyy eniten annostelun jälkeen. Eläinten terveydentila on kirjattava. Eläinten sairastavuus ja kuolleisuus tarkistetaan vähintään kahdesti päivässä. 43. Kaikkia poikasia saaneita eläimiä on havainnoitava kliinisesti seikkaperäisesti kerran ennen ensimmäistä altistuskertaa (samaa koe-eläintä koskevia vertailuja varten) ja sen jälkeen vähintään kerran viikossa. Havainnot tulee tehdä eläimen oman häkin ulkopuolella vakioalueella mieluiten samaan kellonaikaan joka päivä. Havainnot on kirjattava tarkoin muistiin, mieluiten koelaboratorion erikseen määrittelemiä pisteytysjärjestelmiä käyttäen. Vaihtelut koeolosuhteissa on pyrittävä minimoimaan, ja havainnoijien on mieluiten oltava annostelusta tietämättömiä henkilöitä. Kirjattavia havaintoja ovat mm. ihon, karvapeitteen, silmien ja limakalvojen muutokset sekä sisäeritteiden, kuonaeritteiden ja autonomisen toiminnan (esimerkiksi kyynelvuoto, piloerektio, mustuaisen koko ja epätavallinen hengitys) esiintyminen. Käynnin, asennon ja käsittelyvasteen muutokset, mahdolliset klooniset tai tooniset liikkeet, stereotypiat (esimerkiksi ylenmääräinen turkin hoito, jatkuva kehän kiertäminen), vaikea tai pitkittynyt synnytys tai omituinen käytös (esimerkiksi itsensä silpominen, takaperin käveleminen) tulee myös kirjata muistiin (10). 44. Yhden kerran tutkimuksen aikana viideltä urokselta ja viideltä naaraalta, jotka valitaan satunnaisesti kustakin ryhmästä, on arvioitava aistien reaktiivisuus erityyppisille ärsykkeille (ts. kuulon, näön tai asentotunnon kautta välittyville ärsykkeille) (8) (9) (11), tarttumaotteen voimakkuus (12) ja motorinen toiminta (13). Mahdollisten toimenpiteiden tarkemmat yksityiskohdat löytyvät mainituista kirjallisuusviitteistä. Myös muita kuin viittauksissa mainittuja toimenpiteitä voidaan käyttää. Urosten osalta nämä toiminnalliset havainnot on tehtävä annostelujakson loppupuolella hieman ennen suunniteltua lopettamista mutta ennen hematologisia tai kliinis-biokemiallisia määrityksiä varten tarvittavien verinäytteiden ottamista (ks. 53–56 kohta ja alaviite 1). Naaraiden tulee olla fysiologisesti samanlaisessa tilassa näiden toiminnallisten testien aikana, ja ne olisi mieluiten testattava kerran imetyksen viimeisellä viikolla (ts. IP 6–13) hieman ennen suunniteltua lopetusta. Mahdollisuuksien mukaan emoja ja poikasia tulisi pitää erossa toisistaan vain hyvin lyhyitä aikoja. 45. Kerran tutkimuksen loppupuolella tehtäviä toiminnallisia havaintoja ei tarvitse tehdä, jos kyseessä on myöhemmän subkroonisen (90 päivän) tutkimuksen tai pitkäaikaistutkimuksen esitutkimus. Tällöin toiminnalliset havainnot tehdään seurantatutkimuksessa. Toisaalta tästä toistuvan annostelun tutkimuksesta saatavat toiminnallisia havaintoja koskevat tiedot voivat helpottaa annostasojen valintaa myöhempää subkroonista tutkimusta tai pitkäaikaistutkimusta varten. 46. Poikkeuksellisesti toiminnallisia havaintoja ei myöskään tarvitse tehdä ryhmillä, joissa muutoin ilmenee merkkejä myrkyllisyydestä laajuudessa, joka häiritsisi merkitsevästi toiminnallisten kokeiden suorittamista. 47. Tiineyden kesto on kirjattava, ja se lasketaan tiineyden päivästä 0 alkaen. Jokainen poikue on tutkittava mahdollisimman pian synnytyksen jälkeen, jotta voidaan määrittää poikasten lukumäärä ja sukupuoli, kuolleena ja elävänä syntyneiden poikasten määrä, pienikasvuisten poikasten lukumäärä (poikaset, jotka ovat huomattavasti pienempiä kuin verrokkiryhmän poikaset) ja selvästi näkyvät epämuodostumat. 48. Elävät poikaset on laskettava ja niiden sukupuoli on määritettävä ja poikueet on punnittava 24 tunnin kuluessa synnytyksestä (päivänä 0 tai 1 synnytyksen jälkeen) ja vähintään päivänä 4 ja 13 synnytyksen jälkeen. Poikasia saaneita eläimiä koskevien havaintojen lisäksi (ks. 43 ja 44 kohta) on kirjattava myös poikasten kaikenlainen poikkeava käyttäytyminen. 49. Jokaisen poikasen peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys on mitattava samana synnytyksen jälkeisenä päivänä välillä SJP 0 – SJP 4. Poikasen paino on punnittava samana päivänä, kun peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys mitataan, ja tämä mittaus olisi normalisoitava poikasen koon mittauksen perusteella, mieluiten kuutiojuureen painosta (14). Urospuolisten poikasten nännien/nännipihojen määrä on laskettava SJP:nä 12 tai 13 OECD:n ohjeasiakirjassa 151 suositellun mukaisesti (15). Eläimen paino ja ravinnon/veden kulutus 50. Urokset ja naaraat on punnittava ensimmäisenä annostelupäivänä, vähintään kerran viikossa sen jälkeen ja tutkimuksen päättyessä. Tiineyden aikana naaraat on punnittava päivinä 0, 7, 14 ja 20 sekä 24 tunnin kuluessa synnytyksestä (päivänä 0 tai 1 synnytyksen jälkeen) ja vähintään päivänä 4 ja 13 synnytyksen jälkeen. Havainnot raportoidaan erikseen kustakin täysikasvuisesta eläimestä. 51. Ravinnon kulutus on mitattava vähintään kerran viikossa ennen parittelua sekä tiineyden ja imetyksen aikana. Ravinnon kulutuksen mittaus parittelujakson aikana ei ole pakollista, mutta sen voi tehdä. Myös vedenkulutus näiden jaksojen aikana on mitattava, jos testikemikaali annetaan juomaveteen sekoitettuna. Hematologia 52. Seuraavat hematologiset tutkimukset on tehtävä kerran tutkimuksen aikana viidellä uroksella ja viidellä naaraalla, jotka valitaan satunnaisesti kustakin ryhmästä: hematokriitti, hemoglobiini, erytrosyyttien määrä, retikulosyytit, leukosyyttien kokonaismäärä ja erittelylaskenta, trombosyyttien määrä ja veren hyytymisajan/-potentiaalin mittaus. Muita määrityksiä, jotka on tehtävä, jos testikemikaalilla tai sen oletetuilla metaboliiteilla on tai epäillään olevan hapettavia ominaisuuksia, ovat methemoglobiinipitoisuus ja Heinzin kappaleet. 53. Verinäytteet on otettava määrätystä paikasta. Naaraiden on oltava fysiologisesti samanlaisessa tilassa näytteenoton aikana. Jotta vältetään käytännön hankaluudet, jotka liittyvät tiineyden alkamisen vaihteluun, naaraiden verinäytteet voidaan ottaa parittelua edeltävän jakson lopussa vaihtoehtona sille, että ne otetaan juuri ennen eläinten lopettamista tai sen yhteydessä. Urosten verinäytteet on otettava mieluiten juuri ennen eläinten lopettamista tai sen yhteydessä. Vaihtoehtoisesti verinäytteet voidaan ottaa uroksilta myös parittelua edeltävän jakson lopussa, jos niin tehtiin myös naaraiden kanssa. 54. Verinäytteet on säilytettävä asianmukaisissa olosuhteissa. Kliininen biokemia 55. Kliinisen biokemian määritykset tärkeimpien myrkyllisten kudosvaikutusten ja erityisesti munuais- ja maksavaikutusten tutkimiseksi tulee tehdä verinäytteistä, jotka otetaan jokaisesta ryhmästä valitulta viideltä urokselta ja viideltä naaraalta. On suositeltavaa, että eläimet paastoaisivat yli yön ennen verinäytteiden ottoa ( 22 ) . Plasma- ja seerumikokeisiin tulee sisällyttää natrium, kalium, glukoosi, kokonaiskolesteroli, urea, kreatiniini, kokonaisproteiini ja albumiini, vähintään kaksi hepatosellulaarisia vaikutuksia osoittavaa entsyymiä (kuten alaniiniaminotransferaasi, aspartaattiaminotransferaasi ja sorbitolidehydrogenaasi) ja sappihapot. Muiden entsyymien (maksasta tai muualta peräisin olevien) ja bilirubiinin mittauksista voidaan saada hyödyllistä tietoa tietyissä olosuhteissa. 56. Verinäytteet määrätystä paikasta otetaan seuraavan aikataulun mukaan: — vähintään kahdelta poikaselta jokaisesta poikueesta päivänä 4 syntymän jälkeen, jos se on mahdollista poikasten lukumäärän perusteella (ks. 40–41 kohta) — kaikilta emoilta ja vähintään kahdelta poikaselta jokaisesta poikueesta tutkimuksen päättyessä päivänä 13 ja — kaikilta täysikasvuisilta uroksilta tutkimuksen päättyessä. Kaikki verinäytteet on säilytettävä asianmukaisissa olosuhteissa. Päivänä 13 otetuista poikasten ja täysikasvuisten urosten verinäytteistä määritetään kilpirauhashormonien (T4) pitoisuus seerumissa. Emojen ja päivänä 4 poikasilta otettujen verinäytteiden T4-pitoisuus määritetään, jos se on tarpeen. Myös muiden hormonien pitoisuuksia voidaan määrittää, jos se on tarpeen. Poikasten verinäytteet voidaan yhdistää poikueittain kilpirauhashormonin määritystä varten. Kilpirauhashormonit (T4 ja THS) on mitattava mieluiten kokonaispitoisuutena. 57. Valinnaisesti viideltä satunnaisesti valitulta urokselta jokaisesta ryhmästä voidaan ottaa ajoitetut virtsanäytteet tutkimuksen viimeiseltä viikolta, ja näytteistä voidaan tehdä seuraavat määritykset: ulkonäkö, tilavuus, osmolaalisuus tai ominaistiheys, pH, valkuainen, glukoosi ja veri ja/tai verisolut. 58. Lisäksi on harkittava yleistä kudosvauriota osoittavien seerumissa esiintyvien merkkiaineiden määritystä. Muita määrityksiä, jotka on tehtävä, jos testikemikaalin tunnetut ominaisuudet voivat vaikuttaa tai niiden epäillään vaikuttavan tähän liittyviin metaboliaprofiileihin, ovat kalsium, fosfaatti, triglyseridien ja glukoosin paastoarvot, tietyt hormonit, methemoglobiini ja koliiniesteraasi. Nämä on määritettävä tapauskohtaisesti. 59. Seuraavat seikat saattavat vaikuttaa hormonimääritysten vaihteluun ja absoluuttisiin pitoisuuksiin: — lopettamisaika hormonipitoisuuksien vuorokausivaihtelun takia — lopettamistapa: on vältettävä aiheuttamasta eläimille turhaa stressiä, joka voi vaikuttaa hormonipitoisuuksiin — hormonimääritysten testipaketit, joiden standardikäyrät voivat vaihdella. 60. Plasmanäytteet, jotka on nimenomaisesti tarkoitettu hormonimäärityksiin, on otettava samaan aikaan päivästä. Hormonipitoisuuksien analysoimisesta saadaan toisenlaisia numeerisia arvoja kuin erilaisten kaupallisten testipakettien avulla. 61. Jos aiemmat lähtötason tiedot eivät riitä, hematologiset ja kliiniset biokemialliset muuttujat on määritettävä ennen annostelun aloittamista tai mieluiten ryhmällä eläimiä, jotka eivät kuulu koeryhmiin. Naaraiden osalta tiedot on saatava imettävistä eläimistä. PATOLOGIA Ruumiinavaustutkimukset 62. Kaikille tutkimukseen sisältyville eläimille on tehtävä täydellinen ja yksityiskohtainen ruumiinavaus, jossa tutkitaan huolellisesti eläimen ruumis päältä päin, kaikki ruumiin aukot sekä kallo-, rinta- ja vatsaontelot ja niiden sisältö. Erityistä huomiota on kiinnitettävä lisääntymiselimiin. Kiinnittymiskohtien määrä on kirjattava. Irtosolunäytteet on tutkittava ruumiinavauspäivänä, jotta kiimakierron vaihe voidaan määrittää ja jotta voidaan mahdollistaa korrelaatio naaraan lisääntymiselinten histopatologisen tutkimuksen kanssa. 63. Kaikkien täysikasvuisten urospuolisten eläinten kiveksistä ja lisäkiveksistä sekä eturauhasesta ja rakkularauhasesta sekä niiden etuosista kokonaisuudessaan on poistettava kaikki ylimääräinen kudos tarvittaessa, ja niiden märkäpaino on punnittava mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivumisen estämiseksi. Lisäksi elimistä voidaan valinnaisesti punnita esimerkiksi levator ani- ja bulbocavernosus-lihaskompleksi, Cowperin rauhaset ja terska uroksilta sekä parilliset munasarjat (märkäpaino) ja kohtu (myös kohdunkaula) naarailta. Jos nämä päätetään punnita, se on tehtävä mahdollisimman pian dissektion jälkeen. Kaikkien täysikasvuisten eläinten munasarjat, kivekset, lisäkivekset, avustavat sukupuolielimet ja kaikki elimet, joissa on makroskooppisia leesioita, on säilöttävä. 64. Kaikkien täysikasvuisten urosten ja naaraiden sekä jokaisesta poikueesta yhden urospoikasen ja yhden naaraspoikasen (päivä 13) kilpirauhaset on säilöttävä tarkoituksenmukaisimmalla kiinnitysaineella myöhemmin tehtäväksi suunniteltua histopatologista tutkimusta varten. Kilpirauhasen paino voidaan määrittää kiinnittämisen jälkeen. Puhdistus on tehtävä hyvin varovasti ja vasta kiinnittämisen jälkeen kudosvaurioiden välttämiseksi. Kudosvauriot voivat haitata histopatologista analyysia. Verinäytteet tulee ottaa nimetystä kohdasta juuri ennen eläinten lopettamista tai sen yhteydessä. Näytteet tulee säilyttää asianmukaisissa olosuhteissa (ks. 56 kohta). 65. Lisäksi vähintään viiden täysikasvuisen uroksen ja naaraan, jotka valitaan satunnaisesti jokaisesta ryhmästä (lukuun ottamatta niitä, jotka on löydetty kuolemaisillaan ja/tai lopetettu ennen tutkimuksen päättymistä), maksasta, munuaisista, lisämunuaisista, kateenkorvasta, pernasta, aivoista ja sydämestä on poistettava kaikki ylimääräinen kudos tarvittaessa, ja niiden märkäpaino on punnittava mahdollisimman pian dissektion jälkeen kuivumisen välttämiseksi. Seuraavat kudokset on säilöttävä sellaiseen kiinnitysaineeseen, joka sopii parhaiten kyseiselle kudostyypille ja myöhemmin tehtäväksi suunniteltuun histopatologiseen tutkimukseen: kaikki silmin havaittavat vauriot, aivot (edustavat alueet, myös iso- ja pikkuaivot ja aivosilta), selkäydin, silmä, mahalaukku, ohutsuoli, paksusuoli (myös Peyerin levyt), maksa, munuaiset, lisämunuaiset, perna, sydän, kateenkorva, henkitorvi ja keuhkot (säilötään puhaltamalla keuhkot täyteen kiinnitysainetta ja upottamalla ne sitten kiinnitysaineeseen), sukurauhaset (kivekset ja munasarjat), avustavat sukuelimet (kohtu ja kohdunkaula, lisäkivekset, eturauhanen ja rakkularauhanen sekä niiden etuosat), vagina, virtsarakko, imusolmukkeet (proksimaalisimman imusolmukkeen lisäksi on otettava vielä toinen imusolmukelaboratorion kokemuksen perusteella sopivasta paikasta (16)), ääreishermo (lonkka- tai säärihermo) mieluiten läheltä lihasta, luurankolihas ja luu sekä osa luuydintä (leike tai vaihtoehtoisesti tuore luuydinaspiraatti). Kivekset suositellaan kiinnitettävän upottamalla ne Bouinin tai muunneltuun Davidsonin kiinnitysaineeseen (16) (17) (18); formaliinikiinnitystä ei suositella näille kudoksille. Tunica albugineaan on tehtävä varovasti pieni reikä neulalla elimen molempiin päihin, jotta kiinnitysaine pääsee tunkeutumaan sisään nopeasti. Kliinisten ja muiden löydösten perusteella voi olla tarpeen tutkia myös muita kudoksia. Myös elimet, joita pidetään testikemikaalin tunnettujen ominaisuuksien perusteella todennäköisinä kohde-eliminä, on säilöttävä. 66. Seuraavista kudoksista voi löytyä tärkeitä merkkejä hormonitoimintaan liittyvistä vaikutuksista: sukurauhaset (munasarjat ja kivekset), avustavat sukuelimet (kohtu ja kohdunkaula, lisäkivekset, rakkularauhanen ja sen etuosa, dorsolateraalinen ja ventraalinen eturauhanen), vagina, aivolisäke, uroksen rintarauhanen ja lisämunuainen. Uroksen rintarauhasten muutoksia ei ole dokumentoitu riittävästi, mutta tämä parametri voi olla hyvin herkkä aineille, joilla on estrogeenisia vaikutuksia. Niiden elinten/kudosten, joita ei ole lueteltu kohdassa 65, havainnointi ei ole pakollista. 67. Kuolleet poikaset ja päivänä 13 synnytyksen jälkeen tai pian sen jälkeen lopetetut poikaset on tutkittava huolellisesti ulkoisesti selvästi näkyvien epämuodostumien varalta. Huomiota on kiinnitettävä erityisesti ulkoisiin lisääntymiselimiin, joista on tutkittava, näkyykö niissä merkkejä muuttuneesta kehityksestä. Histopatologia 68. Kaikille verrokkiryhmään ja suuriannoksiseen ryhmään kuuluneiden eläinten säilötyille elimille ja kudoksille on tehtävä perusteellinen histopatologinen tutkimus (erityistä huomiota on kiinnitettävä spermatogeneesiin urosten sukupuolirauhasissa ja kivesten interstitiaalisolujen rakenteeseen). Poikasten ja muiden täysikasvuisten eläinten kilpirauhanen voidaan tutkia, jos se on tarpeen. Histopatologiset tutkimukset tulee tehdä myös kaikille muiden annostusryhmien eläimille, jos altistukseen liittyviä muutoksia havaitaan suuren annoksen ryhmässä. Histopatologiaa koskevissa ohjeissa (10) on tarkempia tietoja endokriinisten kudosten dissektiosta, kiinnittämisestä, mikrotomiasta ja histopatologiasta. 69. Kaikki suuret leesiot on tutkittava. NOAEL-arvon määrittämisen tueksi on tutkittava myös muiden annosryhmien kohde-elimet, etenkin niistä ryhmistä, joissa havaittavia haittavaikutuksia ei vaikuttaisi aiheutuneen. 70. Mahdolliseen satelliittiryhmään kuuluvilta eläimiltä tulee tutkia histopatologisesti sellaiset kudokset ja elimet, joissa ilmenee samoja vaikutuksia kuin käsitellyillä ryhmillä. TIEDOT JA RAPORTOINTI Tiedot 71. Tuloksina on esitettävä yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot. Lisäksi kaikki tiedot on esitettävä taulukossa, jossa on eritelty testiryhmittäin eläinten lukumäärä testin alussa, testin aikana kuolleiden tai inhimillisistä syistä lopetettujen eläinten lukumäärä, kuoleman tai inhimillisistä syistä lopettamisen ajankohta, hedelmällisten eläinten lukumäärä, tiineiden naaraiden lukumäärä, niiden eläinten määrä, joissa toksisuusvaikutuksia on havaittavissa, kuvaus havaituista toksisuuden merkeistä sekä mahdollisten toksisten vaikutusten alkamisaika, kesto ja vakavuus, histopatologisten muutosten tyypit sekä kaikki asiaankuuluvat tiedot poikueesta. Lisäyksessä 3 on malli yhteenvetotaulukosta, joka on osoittautunut erittäin hyödylliseksi lisääntymiseen/kehitykseen kohdistuvien vaikutusten arvioinnissa. 72. Numeeriset tulokset on mahdollisuuksien mukaan arvioitava asianmukaisella ja yleisesti hyväksytyllä tilastomenetelmällä. Verrattaessa vaikutusta pitoisuusalueen mukaan on vältettävä monien t-testien käyttöä. Tilastomenetelmät tulee valita tutkimusasetelman suunnitteluvaiheessa. Peräaukon ja sukupuolielinten välistä etäisyyttä ja nännien vetäytymistä koskevan tilastoanalyysin on perustuttava yksilökohtaisiin tietoihin poikasista, ja poikueeseen kohdistuvat vaikutukset on otettava huomioon. Tarvittaessa poikue on analysoitava yksikkö. Poikasen painoa koskevan tilastoanalyysin on perustuttava yksilökohtaisiin tietoihin poikasista, ja poikueeseen kohdistuvat vaikutukset on otettava huomioon. Tutkimuksen rajallisuuden vuoksi testien ”merkitsevyyttä” tarkastelevista tilastoanalyyseista on varsin vähän hyötyä monien päätetapahtumien, etenkin lisääntymiseen liittyvien päätetapahtumien, osalta. Jotkin eniten käytetyistä menetelmistä, varsinkin keskilukujen määrittämisessä käytetyt parametritestit, eivät ole tarkoituksenmukaisia. Jos tilastoanalyyseja tehdään, valitun menetelmän on oltava tutkitun muuttujan jakauman kannalta asianmukainen, ja se on valittava ennen tutkimuksen aloittamista. Tulosten arviointi 73. Tämän toksisuustutkimuksen löydökset on arvioitava havaittujen vaikutusten, ruumiinavauksen ja mikroskopialöydösten avulla. Arvioinnissa tulee todeta testikemikaalin annoksen ja poikkeavuuksien – mukaan lukien vakavat vauriot, tietyt kohde-elimet, hedelmättömyys, kliiniset poikkeavuudet, vaikutukset lisääntymiskykyyn ja poikueen kokoon/laatuun, painon muutokset, vaikutukset kuolleisuuteen sekä muut toksiset vaikutukset – esiintyvyyden, ilmaantuvuuden ja vakavuuden välinen mahdollinen suhde. 74. Koska urosten altistusjakso on lyhyt, uroksen lisääntymiskykyyn kohdistuvien vaikutusten arvioinnissa tulisi harkita myös kivesten ja lisäkivesten histopatologista tutkimusta hedelmällisyystietojen ohella. Lisääntymistä/kehitystä koskevien aiempien kontrollitietojen (esimerkiksi poikueen koko, peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys, nännien vetäytyminen, seerumin T4-pitoisuus) käytöstä voi olla hyötyä tutkimuksen tulosten tulkinnan apuna. 75. Laadunvalvontaa varten on suositeltavaa kerätä vertailutietoja aiemmista tutkimuksista ja laskea vaihtelukertoimista numeeriset tiedot varsinkin sellaisista parametreista, jotka liittyvät hormonaalisten haitta-aineiden havaitsemiseen. Näitä tietoja voidaan käyttää vertailutarkoituksiin, kun varsinaisia tutkimuksia arvioidaan. Testiraportti 76. Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: Testikemikaali: — alkuperä, erän numero, viimeinen käyttöpäivä, jos saatavilla — testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa. Yhdestä ainesosasta koostuva aine: — ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet — kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa epäpuhtauksien kemialliset tunnistetiedot sen mukaan kuin käytännössä on mahdollista jne. Useista ainesosista koostuvat aineet, UVCB-aineet ja seokset: — luonnehditaan mahdollisimman tarkoin ainesosien kemiallinen koostumuksen (ks. edellä), esiintymistiheyden ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla. Kantaja-aine (tarvittaessa): — kantaja-aineen valinnan perustelut, jos se on muu kuin vesi. Koe-eläin: — käytetty laji/kanta — eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli — lähde, elinolosuhteet, ravinto jne. — kunkin eläimen paino testin alussa — lajin valinnan perustelut, jos se on muu kuin rotta. Koeolosuhteet: — annostason valintaperusteet — yksityiskohtaiset tiedot testikemikaalin koostumuksesta/ravintovalmisteesta, saavutetuista pitoisuuksista sekä valmisteen stabiiliudesta ja tasalaatuisuudesta — testikemikaalin annostelun yksityiskohdat — ravinnossa/juomavedessä olevan testikemikaalin määrän (ppm) muuntaminen varsinaiseksi annokseksi (mg/kg/vrk) tarvittaessa — yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta — yksityiskohtainen kuvaus satunnaistamismenettelystä, jolla valittiin karsittavat poikaset, jos karsinta tehtiin. Tulokset: — paino / painon muutokset — ravinnon ja veden kulutus tarvittaessa — toksiset vastetiedot sukupuolen ja annostason mukaan, myös hedelmällisyyden, tiineyden ja toksisuuden mahdollisten muiden merkkien — osalta — tiineyden kesto — toksiset tai muut vaikutukset lisääntymiseen, poikasiin, syntymänjälkeiseen kasvuun jne. — kliinisten havaintojen luonne, vaikeusaste ja kesto (korjaantuvuudesta riippumatta) — arvioinnit aistitoiminnoista, tarttumaotteen voimakkuudesta ja motorisesta aktiivisuudesta — verikokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot — kliiniset biokemialliset kokeet ja niihin liittyvät lähtötasoarvot — niiden täysikasvuisten naaraiden määrä, joilla on normaali tai epänormaali kiimakierto, ja kierron pituus — elävänä syntyneiden poikasten määrä ja kiinnittymisen jälkeen tapahtuneet abortoitumiset — niiden poikasten lukumäärä, joilla on selvästi näkyviä epämuodostumia ulkoisten sukupuolielinten silmämääräinen arviointi, pienikasvuisten poikasten lukumäärä — eläinten kuolinaika tutkimusaikana tai tieto siitä, pysyivätkö eläimet hengissä tutkimuksen päättymiseen saakka — kiinnittymisten lukumäärä, poikueen koko ja painot kirjaushetkellä — poikasten painotiedot — peräaukon ja sukupuolielinten välinen etäisyys kaikilta poikasilta (sekä paino tämän etäisyyden mittauspäivänä) — urospoikasten nännien vetäytyminen — kilpirauhashormonipitoisuudet päivänä 13 urospoikasilta ja täysikasvuisilta uroksilta (ja emoilta ja poikasilta päivänä 4, jos pitoisuus mitataan) — poikasia saaneiden eläinten paino lopetettaessa ja niiden elinten paino — ruumiinavauslöydökset yksityiskohtaiset tiedot kaikista histopatologisista löydöksistä — absorptiotiedot (jos saatavilla) — tulosten tilastollinen käsittely tarvittaessa. Tulosten pohdinta. Päätelmät. Tulosten tulkitseminen 77. Tutkimuksen tuloksena saadaan arviot toistettujen annosten antamiseen liittyvästä lisääntymis-/kehitystoksisuudesta. Koska tutkimuksessa painotetaan sekä yleiseen toksisuuteen että lisääntymis-/kehitystoksisuuteen liittyviä päätetapahtumia, tutkimustulosten perusteella voidaan erotella toisaalta ne lisääntymiseen/kehitykseen kohdistuvat vaikutukset, joiden osalta yleistä toksisuutta ei ilmene, sekä toisaalta ne vaikutukset, jotka ilmenevät ainoastaan pitoisuuksilla, jotka ovat myrkyllisiä myös emoille ja isille (ks. 7–11 kohta). Sen perusteella tiedetään, onko tehtävä lisätutkimuksia, ja se voi ohjata myös myöhempien tutkimusasetelmien suunnittelua. OECD:n ohjeasiakirjaa 43 on käytettävä lisääntymiseen ja kehitykseen kohdistuviin vaikutuksiin liittyvien tulosten tulkinnan apuna (19). OECD:n ohjeasiakirjassa 106 (jyrsijöillä tehtyjen endokriinisten ja lisääntymiseen liittyvien testien histologinen arviointi (16) on tietoa (endokriinisten) elinten ja irtosolunäytteiden preparoinnista ja arvioinnista. Näistä tiedoista voi olla apua tämän testimenetelmän käyttämisessä. LÄHDEKIRJALLISUUS (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Saatavana OECD:stä pyynnöstä. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Saatavana OECD:stä pyynnöstä. (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141–149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol., 18, 89–95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84–97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267–283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233–236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599–609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). ”Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383–390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (17) Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. Teoksessa: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, s. 52–85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524–533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Lisäys 1 MÄÄRITELMÄT (KS. MYÖS OECD:N OHJEASIAKIRJAN 150 KOHTA 20) Androgeenisuus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen androgeenihormonin (esimerkiksi testosteronin) tavoin. Antiandrogeenisuus on kemikaalin kyky estää luonnollisen androgeenihormonin (esimerkiksi testosteronin) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Antiestrogeenisuus on kemikaalin kyky estää luonnollisen estrogeenihormonin (esimerkiksi 17ß-estradiolin) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Kilpirauhasen toimintaa estävä vaikutus on kemikaalin kyky estää luonnollisen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T3:n) vaikutus nisäkkäiden organismissa. Kemikaali on aine tai seos. Kehitystoksisuus Pre-, peri-, postnataalisina, rakenteellisina tai toiminnallisina häiriöinä jälkeläisissä esiintyvän lisääntymistoksisuuden ilmeneminen. Annos on annostellun testikemikaalin määrä. Annos ilmaistaan testikemikaalin painona koe-eläimen painoyksikköä kohti (esim. mg/kg päivässä) tai vakioina pidettävinä ruokavalion pitoisuuksina. Annostelu on yleinen termi, joka kattaa annoksen, annostelutaajuuden ja annostelun keston. Ilmeinen toksisuus on yleistermi, jolla tarkoitetaan testikemikaalin antamisen jälkeen ilmeneviä selviä toksisuuden merkkejä. Niitä on oltava riittävästi vaaran arviointia varten, ja niiden on oltava sellaisia, että annetun annoksen suurentamisen voidaan odottaa aiheuttavan vakavia merkkejä myrkyllisyydestä ja todennäköisesti kuolleisuutta. Hedelmällisyyden heikentyminen tarkoittaa uroksen tai naaraan lisääntymistoimintojen tai -kyvyn häiriöitä. Emoille myrkylliset vaikutukset Tiineinä oleviin naaraisiin kohdistuvat haittavaikutukset, joita esiintyy joko spesifisti (suora vaikutus) tai epäspesifisti (epäsuora vaikutus) ja jotka liittyvät tiineyteen. NOAELon lyhennys englanninkielisistä sanoista no-observed-adverse-effect level (taso, joka ei aiheuta havaittavaa haittavaikutusta). Se on siis suurin annos, jolla ei havaita mitään haitallisia käsittelyyn liittyviä vaikutuksia. Estrogeenisuus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen estrogeenihormonin (esimerkiksi 17ß-estradiolin) tavoin. Lisääntymistoksisuus tarkoittaa haitallisia vaikutuksia, jotka kohdistuvat jälkeläisiin, ja/tai uroksen ja naaraan lisääntymistoimintojen tai -kyvyn heikentymistä. Testikemikaali on tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Kilpirauhasen kaltainen vaikutus on kemikaalin kyky vaikuttaa nisäkkäiden organismissa luonnollisen kilpirauhashormonin (esimerkiksi T3:n) tavoin. Validointi on tieteellinen menettely, jonka tarkoituksena on luonnehtia testimenetelmän toiminnallisia vaatimuksia ja rajoituksia sekä osoittaa sen luotettavuus ja merkityksellisyys tiettyyn tarkoitukseen nähden. Lisäys 2 KAAVIO TESTIAIKATAULUSTA (TUTKIMUKSEN ENIMMÄISKESTO TÄYDEN 14 PÄIVÄN PITUISEN PARITTELUJAKSON PERUSTEELLA) Lisäys 3 YHTEENVETOTAULUKKO LISÄÄNTYMISEEN/KEHITYKSEEN KOHDISTUVISTA VAIKUTUKSISTA HAVAINNOT ARVOT Annostus (yksiköt)……. 0 (kontrolli) … … … … Aloittaneet parit (N) Kiimakierto (vähintään keskimääräinen pituus ja epäsäännöllisten kiertojen tiheys) Naaraat, joissa merkkejä parittelusta (N) Tiineeksi tulleet naaraat (N) Hedelmöityspäivät 1–5 (N) Hedelmöityspäivät 6–… (23) (N) Tiineys ≤ 21 päivää (N) Tiineys = 22 päivää (N) Tiineys ≥ 23 päivää (N) Emot, joilla eläviä poikasia (N) Emot, joilla eläviä poikasia päivänä 4 synn. jälk. (N) Kiinnittyneet alkiot / emo (keskiarvo) Elävät poikaset / emo synnytyksessä (keskiarvo) Elävät poikaset / emo päivänä 4 (keskiarvo) Sukupuolijakauma (u/n) synnytyksessä (keskiarvo) Sukupuolijakauma (u/n) päivänä 4 (keskiarvo) Poikueen paino synnytyksessä (keskiarvo) Poikueen paino päivänä 4 (keskiarvo) Poikasen paino synnytyksessä (keskiarvo) Poikasen paino peräaukon ja sukupuolielinten välisen etäisyyden mittauksen yhteydessä (urosten ja naaraiden keskiarvot) Poikase