FI Euroopan unionin virallinen lehti L 54/1

KOMISSION ASETUS (EY) N:o 152/2009,

annettu 27 päivänä tammikuuta 2009,

näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon rehu- ja elintarvikelainsäädännön sekä eläinten terveyttä ja hyvinvointia koskevien sääntöjen mukaisuuden varmistamiseksi suoritetusta virallisesta valvonnasta 29 päivänä huhtikuuta 2004 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 882/2004 (1) ja erityisesti sen 11 artiklan 4 kohdan a, b ja c alakohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1) Direktiivin 70/373/ETY täytäntöönpanemiseksi annettiin seuraavat säädökset, jotka ovat voimassa asetuksen (EY) N:o 882/2004 61 artiklan 2 kohdan mukaisesti: — yhteisön määritysmenetelmästä rehujen virallista tarkastusta varten 15 päivänä kesäkuuta 1971 annettu ensimmäinen komission direktiivi 71/250/ETY (2), — yhteisön määritysmenetelmästä rehujen virallista tarkastusta varten 18 päivänä marraskuuta 1971 annettu toinen komission direktiivi 71/393/ETY (3), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 27 päivänä huhtikuuta 1972 annettu kolmas komission direktiivi 72/199/ETY (4), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 5 päivänä joulukuuta 1972 annettu neljäs komission direktiivi 73/46/ETY (5), — yhteisön näytteenottomenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 1 päivänä maaliskuuta 1976 annettu ensimmäinen komission direktiivi 76/371/ETY (6), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 1 päivänä maaliskuuta 1976 annettu seitsemäs komission direktiivi 76/372/ETY (7), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 15 päivänä kesäkuuta 1978 annettu kahdeksas komission direktiivi 78/633/ETY (8), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 31 päivänä heinäkuuta 1981 annettu yhdeksäs komission direktiivi 81/715/ETY (9), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 25 päivänä heinäkuuta 1984 annettu kymmenes komission direktiivi 84/425/ETY (10), — siipikarjan rehuseosten energia-arvon laskentamenetelmästä 9 päivänä huhtikuuta 1986 annettu komission direktiivi 86/174/ETY (11), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 28 päivänä heinäkuuta 1993 annettu yhdestoista komission direktiivi 93/70/ETY (12), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen virallista tarkastusta varten 17 päivänä joulukuuta 1993 annettu kahdestoista komission direktiivi 93/117/ETY (13), — yhteisön määritysmenetelmistä rehujen aminohappojen, raakarasvan ja olakvindoksin määritystä varten ja direktiivin 71/393/ETY muuttamisesta 3 päivänä syyskuuta 1998 annettu komission direktiivi 98/64/EY (14), — yhteisön menetelmien vahvistamisesta amproliumin, diklatsuriilin ja karbadoksin määrittämiseksi rehuista ja direktiivien 71/250/ETY ja 73/46/ETY muuttamisesta sekä direktiivin 74/203/ETY kumoamisesta 20 päivänä huhtikuuta 1999 annettu komission direktiivi 1999/27/EY (15), — yhteisön menetelmistä lasalosid-natriumin määrittämiseksi 23 päivänä heinäkuuta 1999 annettu komission direktiivi 1999/76/EY (16), — yhteisön analyysimenetelmistä rehun A-vitamiinin, E-vitamiinin ja tryptofaanin määrittämiseksi 6 päivänä heinäkuuta 2000 annettu komission direktiivi 2000/45/EY (17), — rehujen dioksiinipitoisuuksien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien määrittämistä koskevista vaatimuksista 26 päivänä heinäkuuta 2002 annettu komission direktiivi 2002/70/EY (18), — analyysimenetelmästä eläinperäisten ainesosien määrittämiseksi rehujen virallista tarkastusta varten 23 päivänä joulukuuta 2003 annettu komission direktiivi 2003/126/EY (19).

(2) Koska direktiivi 70/373/ETY on korvattu asetuksella (EY) N:o 882/2004, on aiheellista korvata kyseisen direktiivin täytäntöönpanosäädökset yhdellä asetuksella. Samalla menetelmät olisi mukautettava tieteen ja tekniikan kehitykseen. Menetelmät, jotka eivät enää täytä alkuperäistä tarkoitustaan, on poistettava. Lainsäädännön mukaisesti näytteenottoa koskevat säännökset päivitetään sopivana ajankohtana, jotta otetaan huomioon rehujen valmistus-, varastointi-, kuljetus- ja markkinointitapojen viimeaikainen kehitys, mutta nykyiset näytteenottoa koskevat säännökset on aiheellista pitää toistaiseksi voimassa.

(3) Sen vuoksi direktiivit 71/250/ETY, 71/393/ETY, 72/199/ETY, 73/46/ETY, 76/371/ETY, 76/372/ETY, 78/633/ETY, 81/715/ETY, 84/425/ETY, 86/174/ETY, 93/70/ETY, 93/117/EY, 98/64/EY, 1999/27/EY, 1999/76/EY, 2000/45/EY, 2002/70/EY ja 2003/126/EY olisi kumottava.

(4) Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Rehujen virallisessa tarkastuksessa suoritettava näytteenotto rehun sisältämien aineiden, lisäaineiden sekä haitallisten aineiden määrittämiseksi, lukuun ottamatta torjunta-ainejäämiä ja mikro-organismeja, on suoritettava tämän direktiivin liitteessä I esitettyjen menetelmien mukaisesti.

2 artikla

Näytteet on valmistettava määritystä varten ja tulokset on ilmoitettava liitteessä II esitettyjen menetelmien mukaisesti.

3 artikla

Rehujen virallista tarkastusta varten tehtävissä määrityksissä on noudatettava menetelmiä, jotka on vahvistettu liitteessä III (Rehuaineiden ja rehuseosten koostumuksen valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä IV (Rehujen sisältämien sallittujen lisäaineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä V (Rehujen sisältämien haitallisten aineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät) ja liitteessä VI (Rehujen sisältämien eläinperäisten ainesosien määritysmenetelmät rehujen virallista valvontaa varten).

4 artikla

Siipikarjan rehuseosten energia-arvo on laskettava liitteen VII mukaisesti.

5 artikla

Liitteessä VIII vahvistettuja määritysmenetelmiä sellaisten laittomien lisäaineiden osoittamiseksi, jotka eivät enää ole sallittuja rehuissa, käytetään varmistustarkoituksiin.

6 artikla

Kumotaan direktiivit 71/250/ETY, 71/393/ETY, 72/199/ETY, 73/46/ETY, 76/371/ETY, 76/372/ETY, 78/633/ETY, 81/715/ETY, 84/425/ETY, 86/174/ETY, 93/70/ETY, 93/117/EY, 98/64/EY, 1999/27/EY, 1999/76/EY, 2000/45/EY, 2002/70/EY ja 2003/126/EY.

Viittauksia kumottuihin direktiiveihin pidetään viittauksina tähän asetukseen liitteessä IX olevien vastaavuustaulukoiden mukaisesti.

7 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Sitä sovelletaan 26 päivästä elokuuta 2009.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa. Tehty Brysselissä 27 päivänä tammikuuta 2009. Komission puolesta Androulla VASSILIOU Komission jäsen

(1) EUVL L 165, 30.4.2004, s. 1, oikaisu EUVL L 191, 28.5.2004, s. 1.

(2) EYVL L 155, 12.7.1971, s. 13.

(3) EYVL L 279, 20.12.1971, s. 7.

(4) EYVL L 123, 29.5.1972, s. 6.

(5) EYVL L 83, 30.3.1973, s. 21.

(6) EYVL L 102, 15.4.1976, s. 1.

(7) EYVL L 102, 15.4.1976, s. 8.

(8) EYVL L 206, 29.7.1978, s. 43.

(9) EYVL L 257, 10.9.1981, s. 38.

(10) EYVL L 238, 6.9.1984, s. 34.

(11) EYVL L 130, 16.5.1986, s. 53.

(12) EYVL L 234, 17.9.1993, s. 17.

(13) EYVL L 329, 30.12.1993, s. 54.

(14) EYVL L 257, 19.9.1998, s. 14.

(15) EYVL L 118, 6.5.1999, s. 36.

(16) EYVL L 207, 6.8.1999, s. 13.

(17) EYVL L 174, 13.7.2000, s. 32.

(18) EYVL L 209, 6.8.2002, s. 15.

(19) EUVL L 339, 24.12.2003, s. 78.

LIITE I NÄYTTEENOTTOMENETELMÄT 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Rehujen virallisessa tarkastuksessa käytettävät näytteet on otettava seuraavassa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Näin saatujen näytteiden katsotaan edustavan koko tutkittavaa erää. 2. NÄYTTEENOTTAJAT Näytteitä ottavat kyseisen jäsenvaltion tähän tehtävään valtuuttamat henkilöt. 3. MÄÄRITELMÄT Tutkittava erä: tuoteyksikkömäärä, jonka katsotaan olevan ominaisuuksiltaan tasalaatuinen. Osanäyte: tuotemäärä, joka on otettu tutkittavan erän yhdestä kohdasta. Kokoomanäyte: tutkittavan erän eri kohdista otetuista osanäytteistä muodostettu yhteisnäyte. Supistettu näyte: kokoomanäytteen edustava osa, joka on saatu kokoomanäytteestä jakomenettelyn avulla. Lopullinen näyte: supistetun näytteen tai homogenoidun kokoomanäytteen osa. 4. VÄLINEISTÖ 4.1 Näytteenottovälineiden on oltava valmistettu materiaaleista, jotka eivät aiheuta kontaminaatiota tuotteista otettuihin näytteisiin. Nämä välineet voivat olla jäsenvaltioiden virallisesti hyväksymiä. 4.2 Kiinteiden rehujen näytteenottoon suositellut välineet 4.2.1 Manuaalinen näytteenotto 4.2.1.1 Tasapohjainen kauha, jossa on pystysuorat sivuseinämät. 4.2.1.2 Näytteenottokaira, jossa on pitkä ura tai osastoja. Kairan mittojen on oltava oikeassa suhteessa tutkittavaan erään (esim. astian syvyys, säkin mitat) sekä rehun raekokoon. 4.2.2 Koneellinen näytteenotto Hyväksyttyä koneellista laitetta voidaan käyttää otettaessa näytteitä liikkuvasta rehusta. 4.2.3 Näytteenjakolaite Osanäytteiden ottamiseen sekä supistettujen ja lopullisten näytteiden valmistamiseen voidaan käyttää laitetta, joka on suunniteltu jakamaan näyte suunnilleen yhtä suuriin osiin. 5. MÄÄRÄÄ KOSKEVAT VAATIMUKSET 5.A Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina 5.A.1 Tutkittava erä Tutkittavan erän on oltava sen kokoinen, että näyte voidaan ottaa kaikista erän kohdista. 5.A.2 Osanäytteet 5.A.2.1 Irtorehu: Pienin vaadittu osanäytteiden lukumäärä: 5.A.2.1.1 tutkittava erä enintään 2,5 tonnia: seitsemän 5.A.2.1.2 tutkittava erä yli 2,5 tonnia √ 20 x tutkittavan erän tonnimäärä (1), kuitenkin enintään 40 osanäytettä 5.A.2.2 Pakattu rehu: Pienin vaadittu määrä pakkauksia, joista otetaan näyte (2): 5.A.2.2.1 Yli 1 kg:n pakkaukset: 5.A.2.2.1.1 tutkittavassa erässä 1–4 pakkausta kaikki pakkaukset 5.A.2.2.1.2 tutkittavassa erässä 5–16 pakkausta neljä 5.A.2.2.1.3 tutkittavassa erässä yli 16 pakkausta √ tutkittavassa erässä (1) olevien pakkausten lukumäärä, kuitenkin enintään 20 pakkausta 5.A.2.2.2 Pakkausten paino enintään 1 kg neljä 5.A.2.3 Nestemäinen tai puolijuokseva rehu: Pienin vaadittu määrä tutkittavia säiliöitä, joista otetaan näyte (2): 5.A.2.3.1 Säiliön tilavuus yli 1 litra: 5.A.2.3.1.1 tutkittavassa erässä 1–4 säiliötä kaikki säiliöt 5.A.2.3.1.2 tutkittavassa erässä 5–16 säiliötä neljä 5.A.2.3.1.3 tutkittavassa erässä yli 16 säiliötä √ tutkittavassa erässä (1) olevien säiliöiden lukumäärä, kuitenkin enintään 20 säiliötä 5.A.2.3.2 Säiliön tilavuus enintään yksi litra neljä 5.A.2.4 Rehukakut ja nuolukivet Pienin vaadittu tutkittavien rehukakkujen tai nuolukivien lukumäärä, joista otetaan näyte (2): Yksi rehukakku tai yksi nuolukivi tutkittavan erän jokaista 25 yksikköä kohti, kuitenkin enintään 4 rehukakkua tai nuolukiveä 5.A.3 Kokoomanäyte Tutkittavaa erää kohden riittää yksi kokoomanäyte. Yhden kokoomanäytteen muodostavien osanäytteiden kokonaismäärän on oltava vähintään seuraava: 5.A.3.1 Irtorehu: 4 kg 5.A.3.2 Pakattu rehu: 5.A.3.2.1 pakkauksen paino yli 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2 pakkauksen paino enintään 1 kg neljän alkuperäisen pakkauksen sisällön paino 5.A.3.3 Nestemäinen tai puolijuokseva rehu: 5.A.3.3.1 säiliön tilavuus yli 1 litra: neljä litraa 5.A.3.3.2 säiliön tilavuus enintään yksi litra neljän alkuperäisen säiliön sisällön paino 5.A.3.4 Rehukakut ja nuolukivet 5.A.3.4.1 yksikköpaino yli 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2 yksikköpaino enintään 1 kg neljän alkuperäisen rehukakun tai nuolukiven paino 5.A.4 Lopullinen näyte Lopullinen näyte on kokoomanäyte tarpeen mukaan supistettuna. Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen määrän on oltava vähintään: Kiinteä rehu 500 g Nestemäinen tai puolijuokseva rehu 500 ml 5.B Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria (3). 5.B.1 Tutkittava erä: katso 5.A.1 5.B.2 Osanäytteet 5.B.2.1 Irtorehu: katso 5.A.2.1 5.B.2.2 Pakattu rehu: Pienin vaadittu lukumäärä tutkittavia pakkauksia, joista otetaan näyte: 5.B.2.2.1 tutkittavassa erässä 1–4 pakkausta kaikki pakkaukset 5.B.2.2.2 tutkittavassa erässä 5–16 pakkausta neljä 5.B.2.2.3 tutkittavassa erässä yli 16 pakkausta √ tutkittavan erän (1) pakkausten lukumäärä, kuitenkin enintään 40 pakkausta 5.B.3 Kokoomanäyte Kokoomanäytteiden lukumäärä vaihtelee tutkittavan erän koon mukaan. Seuraavassa annetaan pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti. Yhden kokoomanäytteen muodostavien osanäytteiden yhteispainon on oltava vähintään seuraava: 5.B.3.1 Irtorehu: Tutkittavan erän paino (tonnia): Pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti: enintään 1 1 yli 1 ja enintään 10 2 yli 10 ja enintään 40 3 yli 40 4 5.B.3.2 Pakattu rehu Tutkittavan erän koko ilmaistuna pakkausten lukumääränä: Pienin vaadittu kokoomanäytteiden lukumäärä tutkittavaa erää kohti: 1–16 1 17–200 2 201–800 3 yli 800 4 5.B.4 Lopullinen näyte Lopullinen näyte on kokoomanäyte supistettuna. Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä kutakin kokoomanäytettä kohti. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen on oltava massaltaan vähintään 500 g. 6. NÄYTTEIDEN OTTAMISTA, VALMISTAMISTA JA PAKKAAMISTA KOSKEVAT OHJEET 6.1 Yleistä Näytteet on otettava ja valmistettava mahdollisimman nopeasti noudattaen varotoimenpiteitä, joilla varmistetaan, ettei tuote muutu tai saastu. Kaikkien näytteiden kanssa kosketuksiin joutuvien välineiden sekä pintojen ja säiliöiden on oltava puhtaita ja kuivia. 6.2 Osanäytteet 6.2.A Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina Osanäytteet on otettava satunnaisesti koko tutkittavasta erästä, ja niiden on oltava suunnilleen samansuuruisia. 6.2.A.1 Irtorehu Tutkittava erä kuvitellaan jaetuksi suunnilleen samankokoisiin osiin. Valitaan satunnaisesti sellainen määrä osia, joka vastaa 5.A.2 kohdan mukaista osanäytteiden määrää, ja jokaisesta osasta otetaan vähintään yksi näyte. Näytteet voidaan tarvittaessa ottaa tutkittavaa erää siirrettäessä (lastauksen tai purkamisen yhteydessä). 6.2.A.2 Pakattu rehu Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä pakkauksia on valittu näytteenottoa varten, kunkin pakkauksen sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen. Tarvittaessa näytteet on otettava vasta sitten, kun pakkaukset on erikseen tyhjennetty. Kaikki kokkareet on hajotettava, jolloin ne erotetaan näytteestä ja pannaan hajotettuina takaisin näytteeseen. 6.2.A.3 Homogeeniset ja homogenoituvat nestemäiset tai puolijuoksevat rehut Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä säiliöitä on valittu näytteenottoa varten, sisältö on tarvittaessa homogenoitava ja vaadittava määrä näytettä otettava kustakin säiliöstä. Osanäytteet voidaan ottaa säiliöitä tyhjennettäessä. 6.2.A.4 Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut, joita ei voi homogenoida Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä säiliöitä on valittu näytteenottoa varten, on otettava näytteet rehun eri kerroksista. Näytteet voidaan ottaa myös säiliötä tyhjennettäessä, kuitenkin siten, että ensimmäisiä jakeita ei oteta talteen. Kummassakin tapauksessa näytteen kokonaismäärän on oltava vähintään 10 litraa. 6.2.A.5 Rehukakut ja nuolukivet Kun 5.A.2 kohdan mukainen lukumäärä rehukakkuja tai nuolukiviä on valittu näytteenottoa varten, otetaan pala jokaisesta kakusta tai kivestä. 6.2.B Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria Tutkittava erä kuvitellaan jaetuksi suunnilleen samankokoisiin osiin, joiden lukumäärä vastaa 5.B.3 kohdan mukaista kokoomanäytteiden lukumäärää. Jos kyseinen luku on suurempi kuin yksi, jaetaan tutkittava erä 5.B.2 kohdan mukaista osanäytteiden kokonaislukumäärää vastaavaan määrään suunnilleen samankokoisia osia. Jokaisesta osasta otetaan suunnilleen samankokoinen näyte (4) siten, että kustakin osasta otettujen näytteiden yhteispainon on oltava vähintään jokaiselle kokoomanäytteelle asetettu minimi 4 kg. Tutkittavan erän eri osista otettuja osanäytteitä ei saa yhdistää kokoomanäytteeksi. 6.3 Kokoomanäytteen valmistaminen 6.3.A Rehut, joissa aineet tai tuotteet ovat tasaisesti jakaantuneina Kokoomanäyte muodostetaan sekoittamalla osanäytteet keskenään. 6.3.B Rehut, jotka sisältävät sellaisia haitallisia aineita tai tuotteita, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakaantuneina rehuaineessa, kuten aflatoksiinit, torajyvä, risiinikasvi ja crotalaria Kustakin tutkittavan erän osasta otetut osanäytteet sekoitetaan ja niistä valmistetaan 5.B.3 kohdan mukainen määrä kokoomanäytteitä pitäen huolta siitä, että jokaisen kokoomanäytteen alkuperä on merkitty muistiin. 6.4 Lopullisen näytteen valmistaminen Kunkin kokoomanäytteen sisältämä aines sekoitetaan huolellisesti, jotta näytteestä tulee homogeeninen. (5) Tarvittaessa kokoomanäyte on ensin pienennettävä vähintään 2 kg:n tai 2 litran suuruiseksi (supistettu näyte) joko käyttämällä koneellista tai automaattista näytteenjakolaitetta tai jakamalla näyte neljännesmenetelmällä. Tämän jälkeen valmistetaan vähintään kolme lopullista näytettä, jotka ovat suunnilleen samankokoisia ja täyttävät 5.A.4 tai 5.B.4 kohdan määrälliset vaatimukset. Kukin näyte laitetaan asianmukaiseen astiaan. On toteutettava kaikki tarvittavat varotoimenpiteet, jotta vältetään näytteen koostumuksen muuttuminen, saastuminen tai turmeltuminen kuljetuksen tai varastoinnin aikana. 6.5 Lopullisen näytteen pakkaaminen Näyteastiat tai -pakkaukset sinetöidään ja varustetaan etiketillä siten, ettei niitä voi avata sinettiä vahingoittamatta (koko etiketin on oltava kiinni sinetissä). 7. NÄYTTEENOTTOPÖYTÄKIRJA Jokaisesta näytteenotosta on laadittava näytteenottopöytäkirja, josta jokainen tutkittava erä voidaan yksiselitteisesti tunnistaa. 8. NÄYTTEIDEN LÄHETTÄMINEN Jokaisesta kokoomanäytteestä on lähetettävä vähintään yksi lopullinen näyte mahdollisimman nopeasti viralliseen laboratorioon yhdessä analyysin suorittajan tarvitsemien tietojen kanssa. (1) Mikäli saatu luku ei ole kokonaisluku, se pyöristetään ylöspäin lähimpään kokonaislukuun. (2) Jos pakkauksen tai säiliön sisältö ei ylitä yhtä kiloa tai yhtä litraa ja jos rehukakun tai nuolukiven paino ei ylitä yhtä kiloa, osanäyte on yhden alkuperäisen pakkauksen tai säiliön sisältö, yksi rehukakku tai yksi nuolukivi. (3) 5.A kohdassa säädettyjä menetelmiä käytetään aflatoksiinien, torajyvän, risiinikasvin ja crotalarian valvontaan täysrehuissa ja täydennysrehuissa. (4) Kun kyseessä on pakattu rehu, kunkin tutkittavan pakkauksen sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen sen jälkeen, kun pakkaukset on tarvittaessa erikseen tyhjennetty. (5) Kaikki kokkareet on hajotettava, jolloin ne erotetaan näytteestä ja pannaan hajotettuina takaisin näytteeseen.

LIITE II REHUJEN MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT YLEISET SÄÄNNÖKSET A. NÄYTTEIDEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN 1. Tarkoitus Seuraavassa esitettävät menetelmät koskevat lopullisten näytteiden valmistusta määritystä varten; näytteet lähetetään tutkimuslaboratorioihin sen jälkeen, kun ne on otettu liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti. Näytteet on valmistettava siten, että määritysmenetelmien mukaiset punnitut määrät ovat homogeenisia ja edustavia. 2. Varotoimenpiteet Näytteiden valmistusmenettely riippuu käytettävistä määritysmenetelmistä. Tästä syystä on olennaisen tärkeää varmistaa, että näytteiden valmistusmenettely on käytettävien määritysmenetelmien kannalta asianmukainen. Kaikki toimenpiteet on suoritettava siten, että vältetään mahdollisimman hyvin näytteen saastuminen ja sen koostumuksen muuttuminen. Näyte on jauhettava, sekoitettava ja seulottava mahdollisimman nopeasti altistaen sitä ilmalle ja valolle mahdollisimman vähän. Sellaisia myllyjä ja jauhatuslaitteita, joissa näytteen huomattava lämpeneminen on todennäköistä, ei pidä käyttää. On suositeltavaa jauhaa erityisen lämmönarat rehut käsin. Lisäksi on huolehdittava siitä, ettei itse välineistössä ole kontaminaatiota aiheuttavia hivenainejäämiä. Jos näytettä ei voi valmistaa muuttamatta merkittävästi sen sisällön kosteuspitoisuutta, on kosteuspitoisuus määritettävä ennen valmistusta ja sen jälkeen liitteessä III olevassa A osassa säädetyn menetelmän mukaisesti. 3. Menettely Näyte jaetaan sopiviksi eränäytteiksi määritystä ja vertailua varten käyttäen asianmukaisia jakotekniikoita, kuten vuorottelevaa kahtiointia taikka kiinteän tai pyörivän kourujakajan käyttöä. Kartiomurskaimen ja neljännesmenetelmän käyttöä ei suositella, koska ne aiheuttavat eränäytteisiin suuren jakovirheriskin. Vertailunäyte pannaan sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan, ja määritykseen tarkoitetut, vähintään 100 gramman suuruiset eränäytteet valmistetaan jäljempänä esitetyllä tavalla. 3.1 Sellaisenaan jauhettavat rehut Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, koko näyte seulotaan tarvittaessa jauhamisen jälkeen seulalla, jonka neliönmuotoisten reikien sivu on 1 mm (suosituksen ISO R565 mukaisesti). Liikajauhatusta on vältettävä. Seulottu näyte sekoitetaan ja pannaan tarkoituksenmukaiseen puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan. Näyte sekoitetaan uudelleen välittömästi ennen punnitsemista määritystä varten. 3.2 Kuivauksen jälkeen jauhettavat rehut Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, näyte kuivataan kosteuspitoisuuteen 8–12 % käyttäen esikuivatusmenetelmää, joka esitetään liitteessä III olevan A osan 4.3 kohdassa kuvatun kosteudenmääritysmenetelmän yhteydessä. Tämän jälkeen jatketaan edellä 3.1 kohdassa esitetyllä tavalla. 3.3 Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut Näyte kerätään sopivaan puhtaaseen, kuivaan ja ilmatiiviisti suljettavaan näyteastiaan. Näyte sekoitetaan perusteellisesti välittömästi ennen näytteen ottamista. 3.4 Muut rehut Jos näytettä ei voi valmistaa jollain edellä esitetyllä tavalla, se on valmistettava millä tahansa muulla tavalla, jolla varmistetaan, että määritystä varten punnitut ainemäärät ovat homogeenisia ja edustavat lopullisia näytteitä. 4. Näytteiden säilytys Näytteet on säilytettävä lämpötilassa, jossa niiden koostumus ei muutu. Vitamiinien tai valolle erityisen herkkien aineiden määritykseen tarkoitetut näytteet on säilytettävä ruskeasta lasista valmistetuissa näyteastioissa. B. MÄÄRITYSMENETELMISSÄ KÄYTETTÄVIÄ REAGENSSEJA JA VÄLINEITÄ KOSKEVAT SÄÄNNÖKSET 1. Jollei määritysmenetelmissä toisin mainita, kaikkien reagenssien on oltava analyysilaatua (p.a.). Hivenainejäämiä määritettäessä reagenssien puhtaus on tarkistettava nollanäytteellä. Saatujen tuloksien mukaan voi reagenssien lisäpuhdistus olla tarpeen. 2. Määritysmenetelmissä mainituissa toimenpiteissä, joihin liittyy liuosten valmistus, laimennus, huuhtelu tai pesu ja joissa käytettävän liuottimen tai laimentimen laatua ei mainita, on käytettävä vettä. Pääsääntöisesti on käytettävä demineralisoitua tai tislattua vettä. Määritysmenetelmissä mainituissa erityistapauksissa vesi on puhdistettava erityisillä puhdistusmenetelmillä. 3. Tutkimuslaboratorioissa käytettävistä välineistä määritysmenetelmissä mainitaan ainoastaan erikoisinstrumentit ja -välineet tai erityiskäyttöön tarkoitetut instrumentit ja välineet. Niiden on oltava puhtaita etenkin määritettäessä hyvin pieniä ainemääriä. C. MÄÄRITYSMENETELMIEN KÄYTTÖ JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN 1. Uuttomenettely Useat menetelmät edellyttävät erityistä uuttomenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita uuttomenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetyn menettelyn uuttoteho on analysoitavan materiaalin osalta samantasoinen kuin menetelmässä kuvatun menettelyn uuttoteho. 2. Puhdistusmenettely Useat menetelmät edellyttävät erityistä puhdistusmenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita puhdistusmenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetty puhdistusmenettely johtaa tutkittavaa materiaalia analysoitaessa analyysituloksiin, jotka vastaavat menetelmässä mainittua menettelyä käytettäessä saatuja tuloksia. 3. Käytetyn määritysmenetelmän ilmoittaminen Yleensä kunkin rehussa olevan ainesosan määrittämiseksi vahvistetaan vain yksi määritysmenetelmä. Kun useita menetelmiä on mainittu, määritysselosteessa on mainittava tutkimuslaboratorion käyttämä menetelmä. 4. Määritysten lukumäärä Määritysselosteessa annetun tuloksen on oltava keskiarvo, joka on saatu ainakin kahdesta määrityksestä, jotka on tehty erillisistä näytteistä ja joiden toistettavuus on tyydyttävä. Jos kuitenkin haitallisten aineiden määrityksessä ensimmäisen määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Kun kyse on aineen tai ainesosan ilmoitetun pitoisuuden valvonnasta ja jos ensimmäisen määrityksen tulos vahvistaa ilmoitetun pitoisuuden eli määrityksen tulos on ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Joissain tapauksissa hyväksyttävä vaihteluväli on määritelty lainsäädännössä, kuten neuvoston direktiivissä 79/373/ETY (1). 5. Määritystuloksen ilmoittaminen Määritystulos on ilmaistava määritysmenetelmässä vahvistetulla tavalla asianmukaisella merkitsevien numeroiden tarkkuudella, ja tulos on tarvittaessa korjattava sen mukaan, mikä lopullisen näytteen kosteuspitoisuus oli ennen näytteen valmistamista. 6. Mittausepävarmuus ja saanto haitallisten aineiden määrityksessä Direktiivissä 2002/32/EY tarkoitettujen haitallisten aineiden, kuten dioksiinien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden, ollessa kyseessä eläinten rehuksi tarkoitettua tuotetta ei pidetä vahvistetun enimmäispitoisuuden mukaisena, jos määritystuloksen katsotaan ylittävän enimmäispitoisuuden, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus ja korjaus saannon suhteen. Vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus. Tätä menettelyä sovelletaan ainoastaan silloin, kun määritysmenetelmässä voidaan arvioida mittausepävarmuus ja korjata tulos saannon suhteen (esimerkiksi mikroskooppitutkimuksessa tämä ei ole mahdollista). Määritystulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmän mittausepävarmuus voidaan arvioida ja tulos korjata saannon suhteen): a) saannon suhteen korjattuna, saantoaste ilmoitetaan. Korjaus saannon suhteen ei ole tarpeen, jos saantoaste on 90–110 %; b) muodossa x +/- U, jossa x on määritystulos ja U on mittaukseen liittyvä laajennettu epävarmuus, käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 %. Kuitenkin jos määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi ja edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen, määritystulos voidaan ilmoittaa ilman korjausta saannon suhteen, ja saantoaste ja mittausepävarmuus voidaan näissä tapauksissa jättää pois. (1) EYVL L 86, 6.4.1979, s. 30.

LIITE III REHUAINEIDEN JA REHUSEOSTEN KOOSTUMUKSEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT A. KOSTEUDEN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehun kosteuspitoisuus. Jos rehu sisältää haihtuvia aineita, kuten orgaanisia happoja, on huolehdittava siitä, että kosteuspitoisuuden kanssa määritetään myös merkittäviä määriä haihtuvia aineita. Menetelmä ei koske suoraan rehuina käytettäviä maitotuotteita, kivennäisaineita ja pääasiassa kivennäisaineista koostuvia seoksia, eläin- ja kasvirasvoja ja -öljyjä tai öljysiemeniä ja öljypitoisia hedelmiä. 2. Periaate Näyte kuivataan määrätyissä olosuhteissa, jotka vaihtelevat rehun laadun mukaan. Painohäviö määritetään punnitsemalla. Hyvin kosteat, kiinteät rehunäytteet on syytä esikuivata ennen varsinaista kosteusmääritystä. 3. Välineistö 3.1 Kosteutta imemättömästä materiaalista valmistettu mylly, joka on helppo puhdistaa ja jolla saadaan aikaan nopea, tasainen jauhautuminen mutta jolla vältetään havaittavissa oleva kuumentuminen ja ulkopuolisen ilman vaikutus mahdollisimman hyvin ja joka on 4.1.1 ja 4.1.2 kohdassa säädettyjen vaatimusten mukainen (esimerkiksi vasara- tai vesijäähdytteiset pienoismyllyt, kartiomyllyt, hitaasti liikkuvat tai hammaspyörillä varustetut hienonnuslaitteet). 3.2 Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 1 mg. 3.3 Lasisia tai korroosionkestävästä metallista valmistettuja kuivausastioita, jotka voidaan sulkea ilmatiiviisti kannella; astian tilavuuden on oltava sellainen, että näytettä voidaan levittää sille noin 0,3 g/cm2. 3.4 Sähkölämmitteinen, tasalämpöinen ja nopeasti säädettävissä oleva lämpökaappi (± 2 oC), jossa on tuuletusjärjestelmä (1). 3.5 Säädettävä sähkölämmitteinen vakuumilämpökaappi, jossa on öljypumppu ja johon voidaan johtaa kuumaa, kuivaa ilmaa tai jossa voidaan käyttää kuivausainetta (kuten kalsiumoksidia). 3.6 Eksikkaattori, jossa on paksu rei’itetty metalli- tai posliinilevy ja joka sisältää tehokasta kuivausainetta. 4. Menettely Huomautus: Tässä jaksossa kuvatut toimenpiteet on suoritettava välittömästi näytelähetyksen avaamisen jälkeen. Määritykset on suoritettava ainakin kahtena rinnakkaismäärityksenä. 4.1 Valmistaminen 4.1.1 Muut kuin 4.1.2 ja 4.1.3 kohdassa tarkoitetut rehut Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Tarvittaessa se jauhetaan tai jaetaan sopivalla tavalla kosteuspitoisuuden muuttumista välttäen (ks. 6 kohta). 4.1.2 Vilja ja suurimot Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Se jauhetaan niin hienoksi, että vähintään 50 % näytteestä läpäisee seulan, jonka reikien koko 0,5 mm, eikä 1 mm:n pyöreäreikäistä seulaa jää läpäisemättä yli 10 % näytteestä. 4.1.3 Nestemäiset ja liisterimäiset rehut sekä pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvat rehut Punnitaan noin 25 g näytettä 10 mg:n tarkkuudella, lisätään sopiva määrä 10 mg:n tarkkuudella punnittua vedetöntä hiekkaa ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos. 4.2 Kuivaus 4.2.1 Muut kuin 4.2.2 ja 4.2.3 kohdassa tarkoitetut rehut Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 1 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 103 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua neljän tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 103 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvia rehuja kuivataan lämpökaapissa 130 oC:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kahden punnituksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 % kosteudesta. 4.2.2 Vilja, jauhot, suurimot ja rouheet Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 130 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua kahden tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 130 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. 4.2.3 Rehuseokset, jotka sisältävät yli 4 % sakkaroosia tai laktoosia: rehuaineet, kuten johanneksenleipäpuun palot, hydrolysoidut viljatuotteet, maltaat, kuivatut juurikasleikkeet, kala ja liukoisia sokereita sisältävät rehut; rehuseokset, jotka sisältävät yli 25 % mineraalisuoloja kidevesi mukaan luettuna. Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta vakuumilämpökaappiin (3.5), joka on kuumennettu 80–85 oC:seen. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Paine säädetään 100 torriksi ja annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivausainetta käyttäen (noin 300 g 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 80–85 oC. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, näyteastia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumilämpökaapissa 80–85 oC:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero ei saa ylittää 0,1 %:a kosteudesta. 4.3 Esikuivaus 4.3.1 Muut kuin 4.3.2 kohdassa tarkoitetut rehut Kiinteille, vaikeasti jauhettaville rehunäytteille, joiden kosteuspitoisuus on suuri, suoritetaan esikuivaus seuraavasti: Punnitaan 50 g hienontamatonta näytettä (puristetut tai kokkareina olevat rehut voidaan tarvittaessa hienontaa karkeiksi) 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 x 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 60–70 oC:ssa, kunnes kosteuspitoisuus on laskenut 8–12 prosenttiin. Näyteastia otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Näyte jauhetaan välittömästi 4.1.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan rehutyypin mukaan 4.2.1 tai 4.2.3 kohdassa esitetyllä tavalla. 4.3.2 Viljat Jyvät, joiden kosteuspitoisuus on yli 17 %, on esikuivattava seuraavasti: Punnitaan 50 g jauhamattomia jyviä 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 × 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 130 oC:ssa 5–7 minuuttia. Astia poistetaan lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa 2 tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Jyvät jauhetaan välittömästi 4.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan 4.2.2 kohdan mukaisesti. 5. Tulosten laskeminen Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, lasketaan käyttäen seuraavia kaavoja: 5.1 Kosteuspitoisuus ilman esikuivausta jossa: m = näytteen alkuperäinen paino grammoina, m0 = näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen. 5.2 Kosteuspitoisuus esikuivausta käyttäen jossa: m = näytteen alkuperäinen paino grammoina, m1 = näytteen paino grammoina esikuivauksen jälkeen, m2 = näytteen paino grammoina hienontamisen tai jauhamisen jälkeen, m0 = näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen. 5.3 Toistettavuus Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 % kosteuden absoluuttisesta arvosta. 6. Huomautus Jos jauhaminen on tarpeen ja sen havaitaan muuttavan tuotteen kosteuspitoisuutta, rehun komponenttien määritystulokset on korjattava alkuperäisen näytteen kosteuspitoisuuden perusteella. B. ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus. 2. Periaate Näyte kuivataan vakiopainoon 103 oC:ssa (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava alle 1 mg). Painohäviö määritetään punnitsemalla. 3. Välineistö 3.1 Korroosionkestävästä materiaalista valmistettu tasapohjainen astia, jonka läpimitta on 8–9 cm ja jonka korkeus on noin 3 cm. 3.2 Lämpömittari, jossa on vahvistettu säiliö ja yläpäässä oleva paisuntaputki ja joka on varustettu asteikolla noin 80 oC:sta ainakin 110 oC:seen ja jonka pituus on noin 10 cm. 3.3 Hiekkahaude tai sähkölevy. 3.4 Eksikkaattori, jossa on tehokasta kuivausainetta. 3.5 Analyysivaaka. 4. Menettely Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 oC:n noin 7 minuutissa. Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 oC:n. Sekoitusta jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa. Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 oC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 oC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa. Huomautus : Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa rasvan hapettumiseen, ja tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut kasvaa. 5. Tulosten laskeminen Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, saadaan seuraavasta kaavasta: joissa: m = näytteen paino grammoina, m1 = astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta, m2 = astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen. Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä ”alle 0,05 %”. Toistettavuus Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero ei saa absoluuttisena arvona ilmoitettuna olla yli 0,05 %. C. RAAKAVALKUAISPITOISUUDEN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus. 2. Periaate Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Ammoniakki tislataan ja kerätään mitattuun määrään rikkihappoa, ja ylimääräinen rikkihappo titrataan natriumhydroksidin standardiliuoksella. Vaihtoehtoisesti vapautunut ammoniakki tislataan ylimäärään boorihappoliuosta, jonka jälkeen se titrataan kloorivetyhappo- tai rikkihappoliuoksella. 3. Reagenssit 3.1 Kaliumsulfaatti. 3.2 Katalysaattori: kupari(II)oksidi CuO tai kupari(II)sulfaattipentahydraatti, CuSO45H2O. 3.3 Sinkki, rakeinen. 3.4 Rikkihappo, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7 Rikkihappo, standardiliuos, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8 Metyylipunaindikaattori: 300 g metyylipunaista liuotetaan 100 ml:aan 95–96 % etanolia (v/v) 3.9 Natriumhydroksidiliuos (teknisen laadun käyttö mahdollista) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10 Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11 Natriumhydroksidi, standardiliuos c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12 Kiehumakiviä, suolahapossa pestyjä ja hehkutettuja. 3.13 Asetanilidi (sulamispiste = 114 oC, typpipitoisuus = 10,36 %). 3.14 Typetön sakkaroosi. 3.15 Boorihappo (H3BO3). 3.16 Metyylipunaindikaattoriliuos: liuotetaan 0,1 g metyylipunaa 100 ml:aan etanolia tai metanolia. 3.17 Bromikresolivihreäliuos: liuotetaan 100 mg bromikresolivihreää 100 ml:aan etanolia tai metanolia. 3.18 Boorihappoliuos (10–40 g/l, käytettävien laitteiden mukaan) Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, boorihappoliuoksiin on lisättävä metyylipuna- ja bromokresoli-indikaattoreita. Kun boorihappoliuosta valmistetaan 1 litra, siihen on ennen tilavuuden säätämistä lisättävä 7 ml metyylipunaindikaattoriliuosta (3.16) ja 10 ml bromikresolivihreäliuosta (3.17). Käytetystä vedestä johtuen boorihappoliuoksen pH saattaa vaihdella erien välillä. Usein on lisättävä vähän emästä, jotta nollanäyte saadaan positiiviseksi. Huomautus : Säätäminen onnistuu yleensä lisäämällä noin 3–4 ml NaOH:ta (3.11) 1 litraan boorihappoa, jonka pitoisuus on 10 g/l. Liuos säilytetään huoneen lämpötilassa suojattuna valolta ja ammoniakkihöyryiltä. 3.19 Kloorivetyhapon standardiliuos c(HCl) = 0,10 mol/l. Huomautus : Myös muita standardiliuosten konsentraatioita (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ja 3.19) voidaan käyttää, jos konsentraatio korjataan laskelmissa. Konsentraatiot on aina ilmaistava neljän desimaalin tarkkuudella. 4. Välineistö Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin menetelmän mukaan. 5. Menettely 5.1 Hajotus Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotuspolttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä katalysaattoria (3.2) (0,3–0,4 g kupari(II)oksidia tai 0,9–1,2 g kupari(II)sulfaattipentahydraattia, 25 ml rikkihappoa (3.4) ja tarvittaessa muutamia kiehumakiviä (3.12) ja sekoitetaan. Kolvia kuumennetaan varovasti tarvittaessa ajoittain pyörittäen, kunnes massa on hiiltynyt ja kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä. Kun liuos on muuttunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden tunnin ajan; tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä. 5.2 Tislaus Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään tarvittaessa muutama sinkkirae (3.3). Jatketaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdan mukaisesti. 5.2.1 Tislaus rikkihappoon Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.7) tarkasti mitattuna. Lisätään muutama pisara metyylipunaindikaattoria (3.8). Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttimeen ja jäähdyttimen pää upotetaan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks. 8.3 huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus). Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan. 5.2.2 Tislaus boorihappoon Kun tisleestä titrataan ammoniakki manuaalisesti, noudatetaan alla olevaa menettelyä. Jos tislauslaite on täysin automaattinen ja suorittaa ammoniakin titraamisen tisleestä, noudatetaan valmistajan käyttöohjeita. Keräilyastia, joka sisältää 25–30 ml boorihappoliuosta (3.18), asetetaan jäähdyttimen ulostulon alle siten, että poistoputki jää boorihappoliuoksen pinnan alapuolelle. Tislauslaite säädetään annostelemaan 50 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9). Tislauslaitetta käytetään valmistajan ohjeiden mukaan ja tislataan pois natriumhydroksidiliuoksen lisäyksen tuloksena vapautunut ammoniakki. Tisle kerätään boorihappoa sisältävään vastaanottoliuokseen. Tisleen määrä (vesihöyrytislauksen aika) riippuu näytteen sisältämän typen määrästä. Valmistajan ohjeita noudatetaan. Huomautus : Puoliautomaattisessa tislauslaitteessa natriumhydroksidiylimäärän lisäys ja vesihöyrytislaus tapahtuvat automaattisesti. 5.3 Titraus Jatketaan 5.3.1 tai 5.3.2 kohdan mukaisesti. 5.3.1 Rikkihappo Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon konsentraation mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.10 tai 3.11), kunnes loppupiste saavutetaan. 5.3.2 Boorihappo Keräilyastian sisältö titrataan kloorivetyhapon standardiliuoksella (3.19) tai rikkihapon standardiliuoksella (3.6) byrettiä käyttäen ja todetaan käytetyn titrausliuoksen määrä. Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, loppupiste on saavutettu, kun sisältöön alkaa ilmestyä vaaleanpunaista väriä. Byretin lukema arvioidaan 0,05 ml:n tarkkuudella. Loppupisteen havaitseminen saattaa olla helpompaa valaistun magneettisekoittimen tai fotometrisen detektorin avulla. Tämä voidaan tehdä automaattisesti vesihöyrytislaimella, jossa on automaattinen titraus. Tislauslaitteen tai tislaus/titrauslaitteen käytössä noudatetaan valmistajan ohjeita. Huomautus : Kun käytetään automaattista titrausjärjestelmää, titraus alkaa välittömästi tislauksen alettua ja kun 1-prosenttinen boorihappoliuos (3.18) on kulunut. Käytettäessä täysin automaattista tislausyksikköä ammoniakki voidaan titrata automaattisesti ja loppupiste detektoida käyttämällä potentiometristä pH-järjestelmää. Tässä tapauksessa käytetään automaattista titrauslaitetta, jossa on pH-mittari. pH-mittari on kalibroitava asianmukaisesti välille pH 4–7 noudattaen tavanomaisia laboratorioiden pH-kalibrointimenettelyjä. Titrauksen pH-loppupiste saavutetaan, kun pH on 4,6, mikä on titrauskäyrän jyrkin kohta (käännekohta). 5.4 Nollakoe Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan nollakoe (hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.14) näytteen sijasta. 6. Tulosten laskeminen Tulokset lasketaan 6.1 tai 6.2 kohdan mukaisesti. 6.1 Tuloksen laskeminen 5.3.1 kohdan mukaisessa titrauksessa Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen: jossa: V0 = nollakokeessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml), V1 = näytteen titrauksessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml), c = natriumhydroksidin (3.10 tai 3.11) konsentraatio (mol/l), m = näytteen paino (g). 6.2 Tuloksen laskeminen 5.3.2 kohdan mukaisessa titrauksessa 6.2.1 Titraus kloorivetyhapolla Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla: jossa: m = näytteen paino (g), c = kloorivetyhapon standardiliuoksen (3.19) konsentraatio (mol/l), V0 = nollakokeessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml), V1 = näytteen titrauksessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml). 6.2.2 Titraus rikkihapolla Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla: jossa: m = näytteen paino (g), c = rikkihapon standardiliuoksen (3.6) konsentraatio (mol/l), V0 = nollakokeessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml), V1 = näytteen titrauksessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml). 7. Menetelmän varmistus 7.1 Toistettavuus Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin: — 0,2 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on alle 20 %, — 1,0 %, suhteellisena arvona suuremmasta lukuarvosta, kun raakavalkuaispitoisuus on 20–40 %, — 0,4 % absoluuttisena arvona, kun raakavalkuaispitoisuus on yli 40 %. 7.2 Tarkkuus Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5–2,0 grammalla asetanilidia (3.13) siten, että läsnä on 1 grammaa sakkaroosia (3.14); 1 g asetanilidia kuluttaa 14,80 ml rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %. 8. Huomautukset 8.1 Välineet voivat olla käsikäyttöisiä, puoliautomaattisia tai automaattisia. Jos liuos joudutaan siirtämään astiasta toiseen hajotuksen ja tislauksen välillä, siirto on suoritettava siten, ettei häviöitä tapahdu. Jos tislauslaitteen kolvissa ei ole tiputussuppiloa, lisätään natriumhydroksidi välittömästi ennen kolvin liittämistä jäähdyttimeen kaataen liuos hitaasti kolvin seinämää myöten. 8.2 Jos hajotettu tuote kiinteytyy, määritys on aloitettava alusta käyttämällä suurempaa määrää rikkihappoa (3.4) kuin edellä on mainittu. 8.3 Kun tuotteiden typpipitoisuus on alhainen, voidaan rikkihapon (3.7) määrä keräilyastiassa tarvittaessa vähentää 10–15 ml:aan ja täyttää 25 ml:ksi vettä lisäämällä. 8.4 Raakavalkuaisen rutiinimäärityksissä voidaan käyttää vaihtoehtoisia menetelmiä, mutta vertailumenetelmänä on käsillä olevassa C osassa kuvailtu Kjeldahlin menetelmä. Vaihtoehtoisilla menetelmillä (kuten Dumas-menetelmällä) saatujen tulosten vastaavuus on osoitettava erikseen kunkin analysoitavan materiaalin osalta. Koska vaihtoehtoisilla menetelmillä saadut tulokset saattavat vastaavuuden varmistamisesta huolimatta hieman poiketa vertailumenetelmällä saaduista tuloksista, määritysselosteessa on mainittava, mitä menetelmää raakavalkuaisen määrityksessä on käytetty. D. UREAN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehujen ureapitoisuus. 2. Periaate Näyte suspendoidaan veteen sellaisen aineen läsnä ollessa, joka saa suspension kirkastumaan. Suspensio suodatetaan. Suodoksen ureamäärä määritetään sen jälkeen kun siihen on lisätty 4-dimetyyliaminobentsaldehydiä (4-DMAB) mittaamalla liuoksen absorbanssi 420 nm:n aallonpituudella. 3. Reagenssit 3.1 4-dimetyyliaminobentsaldehydiliuos: 1,6 g 4-DMAB:ta liuotetaan 100 ml:aan 96-prosenttista etanolia ja siihen lisätään 10 ml kloorivetyhappoa (ρ201,19 g/ml). Tämä reagenssi säilyy korkeintaan kahden viikon ajan. 3.2 Carrez-liuos I: veteen liuotetaan 21,9 g sinkkiasetaattia Zn(CH3COO)2 2H2O ja 3 g jääetikkaa. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä. 3.3 Carrez-liuos II: Liuotetaan veteen 10,6 g kaliumferrosyanidia K4Fe(CN)6 3H2O. Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä. 3.4 Aktiivihiili, joka ei absorboi ureaa (tarkastettava). 3.5 Urealiuos 0,1 % (w/v). 4. Välineistö 4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min. 4.2 Lasihiostulpallisia koeputkia 160 × 16 mm. 4.3 Spektrofotometri. 5. Menettely 5.1 Näytteen määritys Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä (3.4) 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.2), sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan ja lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.3). Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan. Läpinäkyvästä, värittömästä suodoksesta pipetoidaan 5 ml lasihiostulpallisiin koeputkiin, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1) ja sekoitetaan. Putket asetetaan 20 C:ssa (+/– 4 C) olevaan vesihauteeseen. Viidentoista minuutin kuluttua mitataan näyteliuoksen absorbanssi spektrofotometrillä 420 nm:n aallonpituudella. Lukemaa verrataan reagensseista valmistettuun nollakoeliuokseen. 5.2 Kalibrointikäyrä Pipetoidaan 100 ml:n mittapulloihin 1, 2, 4, 5 ja 10 ml urealiuosta (3.5) ja täytetään merkkiin asti vedellä. Kutakin liuosta pipetoidaan koeputkiin 5 ml, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1), homogenoidaan ja niiden absorbanssi mitataan edellä kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliliuokseen, joka sisältää 5 ml 4-DMAB:ta ja 5 ml vettä ja jossa ei ole ureaa. Piirretään kalibrointikäyrä. 6. Tulosten laskeminen Urean määrä näytteessä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen. Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä. 7. Huomautukset 7.1 Kun urean määrä ylittää 3 %, näytteen määrä vähennetään 1 g:ksi tai alkuperäinen liuos laimennetaan siten, ettei siinä ole yli 50 mg ureaa 500 ml:ssa. 7.2 Kun ureapitoisuus on alhainen, näytteen kokoa suurennetaan, kunhan suodos säilyy läpinäkyvänä ja värittömänä. 7.3 Jos näyte sisältää yksinkertaisia typpiyhdisteitä, kuten aminohappoja, optinen tiheys on mitattava 435 nm:ssä. E. HAIHTUVIEN TYPPIPITOISTEN EMÄSTEN MÄÄRITYS I MIKRODIFFUUSIO 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehuista haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna. 2. Periaate Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautetaan mikrodiffuusiolla käyttäen kaliumkarbonaattiliuosta, sidotaan boorihappoliuokseen ja titrataan rikkihapolla. 3. Reagenssit 3.1 Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v). 3.2 Indikaattori: liuotetaan 33 mg bromikresolivihreää ja 65 mg metyylipunaista 100 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia. 3.3 Boorihappoliuos: liuotetaan 10 g boorihappoa 1 litran mittapullossa 200 ml:aan 95–96-prosenttista (v/v) etanolia ja 700 ml:aan vettä. Lisätään 10 ml indikaattoria (3.2). Sekoitetaan ja liuoksen väri säädetään tarvittaessa vaaleanpunaiseksi lisäämällä natriumhydroksidiliuosta. 1 ml tätä liuosta sitoo enintään 300 μg NH3:a. 3.4 Kyllästetty kaliumkarbonaattiliuos: liuotetaan 100 g kaliumkarbonaattia 100 ml:aan kiehuvaa vettä. Annetaan jäähtyä ja suodatetaan. 3.5 Rikkihappo, 0,01 mol/l. 4. Välineistö 4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min. 4.2 Lasisia tai muovisia Conway-maljoja (ks. oheinen kaavio). 4.3 1/100 ml:n asteikolla varustettuja mikrobyrettejä. 5. Menettely Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi. Pipetoidaan Conway-maljan keskiympyrään 1 ml boorihappoliuosta (3.3) ja reunaympyrään 1 ml näytemaljasuodosta. Peitetään osittain rasvatulla kannella. Reunaympyrään lisätään nopeasti 1 ml kyllästettyä kaliumkarbonaattiliuosta (3.4) ja kansi suljetaan ilmatiiviisti. Maljaa pyöritetään varovasti vaakasuorassa tasossa siten, että nämä kaksi reagenssia sekoittuvat. Inkuboidaan vähintään neljä tuntia huoneenlämmössä tai yksi tunti 40 oC:ssa. Boorihappoliuoksessa olevat haihtuvat emäkset titrataan rikkihapolla (3.5) mikrobyrettiä (4.3) käyttäen. Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä. 6. Tulosten laskeminen 1 ml H2SO4:ää, 0,01 mol/l, vastaa 0,34 mg:aa ammoniakkia. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä. Toistettavuus Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli: — 10 %:a, suhteellisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on alle 1,0 %, — 0,1 %:a, absoluuttisena arvona ilmoitettuna, kun ammoniakkipitoisuus on vähintään 1,0 %. 7. Huomautus Jos näytteen ammoniakkipitoisuus ylittää 0,6 %, on alkuperäinen suodos laimennettava. CONWAY CELL Scale 1/1 II TISLAUSMENETELMÄ 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna kalajauhosta, joka ei käytännöllisesti katsoen sisällä ureaa. Menetelmä soveltuu ainoastaan näytteisiin, joiden ammoniakkipitoisuus on alle 0,25 %. 2. Periaate Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautuvat keitettäessä näyteliuosta magnesiumoksidin kanssa ja ne sidotaan tunnettuun määrään rikkihappoa, jonka ylimäärä titrataan takaisin natriumhydroksidiliuoksella. 3. Reagenssit 3.1 Trikloorietikkahappoliuos, 20 % (w/v). 3.2 Magnesiumoksidi. 3.3 Kuohunestoaine (esim. silikoni). 3.4 Rikkihappo, 0,05 mol/l. 3.5 Natriumhydroksidiliuos, 0,1 mol/l. 3.6 Metyylipunaliuos, 0,3 % (w/v), joka on valmistettu 95–96-prosenttiseen (v/v) etanoliin. 4. Välineistö 4.1 Sekoitin: noin 35–40 kierr./min. 4.2 Kjeldahl-tyyppinen tislauslaitteisto. 5. Menettely Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi. Otetaan kirkasta liuosta sopiva määrä haihtuvien typpipitoisten emästen oletetun pitoisuuden kannalta (100 ml on yleensä sopiva määrä). Laimennetaan 200 ml:ksi ja lisätään 2 g magnesiumoksidia (3.2) ja muutama pisara kuohunestoainetta (3.3). Liuoksen on oltava lakmuspaperilla määritettynä emäksinen; muussa tapauksessa siihen lisätään hieman magnesiumoksidia (3.2). Jatketaan raakavalkuaispitoisuuden määrityksessä käytettävän menetelmän 5.2 ja 5.3 kohdan mukaisesti (tämän liitteen C osa). Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä. 6. Tulosten laskeminen 1 ml H2SO4:ää, 0,05 mol/l, vastaa 1,7 mg:aa ammoniakkia. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä. Toistettavuus Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suhteellisena arvona ilmoitettuna suurempi kuin 10 % ammoniakkimäärästä. F. AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS (TRYPTOFAANIA LUKUUN OTTAMATTA) 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehujen vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla. Se sopii seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini. Menetelmällä ei eroteta toisistaan aminohappojen suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen. 2. Periaate 2.1 Vapaat aminohapot Vapaat aminohapot uutetaan laimealla kloorivetyhapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm. 2.2 Kokonaisaminohapot Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut 1 kohdassa mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä. Hapettaminen tapahtuu 0 oC:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan kloorivetyhapolla (3.20) avulla 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20. Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm). 3. Reagenssit Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS). 3.1 Vetyperoksidi, w (w/w) = 30 %. 3.2 Muurahaishappo, w (w/w) = 98–100 %. 3.3 Fenoli. 3.4 Natriumdisulfiitti. 3.5 Natriumhydroksidi. 3.6 5-Sulfosalisyylihappo-dihydraatti. 3.7 Kloorivetyhappo, tiheys noin 1,18 g/ml. 3.8 Trinatriumsitraatti-dihydraatti. 3.9 2,2'-Tiodietanoli (tiodiglykoli). 3.10 Natriumkloridi. 3.11 Ninhydriini. 3.12 Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC. 3.13 Norleusiini tai muu yhdiste, jota voidaan käyttää sisäisenä standardina. 3.14 Typpikaasu (<10 ppm happea). 3.15 1-Oktanoli. 3.16 Aminohapot. 3.16.1 Edellä 1 kohdassa luetellut standardina käytettävät yhdisteet. Puhtaat yhdisteet, jotka eivät sisällä kidevettä. Kuivataan tyhjiössä P2O5:n tai H2SO4:n päällä viikon ajan ennen käyttöä. 3.16.2 Kysteiinihappo. 3.16.3 Metioniinisulfoni. 3.17 Natriumhydroksidiliuos, c = 7,5 mol/l: liuotetaan 300 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi. 3.18 Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: liuotetaan 40 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi. 3.19 Muurahaishappo-fenoliliuos: sekoitetaan 889 g muurahaishappoa (3.2) ja 111 g vettä ja lisätään 4,73 g fenolia (3.3). 3.20 Hydrolyysiseos, c = 6 mol HCl/l ja 1 g fenolia litrassa: lisätään 1 g fenolia (3.3) 492 ml:aan HCl (3.7) ja laimennetaan vedellä 1 litraksi. 3.21 Uuttoseos, c = 0,1 mol HCl /l ja 2 % tiodiglykolia litrassa: laimennetaan 8,2 ml HCl (3.7) noin 900 ml:aan vettä, lisätään 20 ml tiodiglykolia (3.9) ja täytetään vedellä yhdeksi litraksi (ei sekoiteta suoraan aineita 3.7 ja 3.9). 3.22 5-Sulfosalisyylihappo, ß = 6 %: Liuotetaan 60 g 5-sulfosalisyylihappoa (3.6) veteen ja laimennetaan vedellä litraksi. 3.23 Hapetusseos (permuurahaishappo-fenoli): sekoitetaan 0,5 ml vetyperoksidia (3.1) 4,5 ml:aan muurahaishappo-fenoliliuosta (3.19) pienessä dekantterilasissa. Inkuboidaan 20–30 oC:ssa tunnin ajan, jotta saadaan permuurahaishappoa, annetaan sitten jäähtyä jäävesihauteessa (15 min) ennen näytteeseen lisäämistä. Varoitus: vältettävä ihokosketusta ja käytettävä suojavaatteita. 3.24 Sitraattipuskuriliuos, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: liuotetaan 19,61 g natriumsitraattia (3.8), 5 ml tiodiglykolia (3.9), 1 g fenolia (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) noin 800 ml:aan vettä. Säädetään pH arvoon 2,20. Laimennetaan vedellä yhdeksi litraksi. 3.25 Eluointipuskurit, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9). 3.26 Ninhydriinireagenssi, valmistetaan analysaattorin vaatimusten mukaisesti (4.9). 3.27 Aminohappojen standardiliuokset. Nämä liuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa. 3.27.1 Aminohappojen standardin kantaliuos (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml kutakin aminohappoa kloorivetyhapossa. Saatavana kaupallisesti. 3.27.2 Kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuos, c = 1,25 μmol/ml. Liuotetaan 0,2115 g kysteiinihappoa (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinisulfonia (3.16.3) sitraattipuskuriin (3.24) litran mittapullossa ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 12 kuukautta. Tätä liuosta ei tarvita, jos standardin kantaliuos (3.27.1) sisältää kysteiinihappoa ja metioniinisulfonia. 3.27.3 Sisäisen standardin kantaliuos, esimerkiksi norleusiini, c = 20 μmol/ml. Liuotetaan 0,6560 g norleusiinia (3.13) sitraattipuskuriin (3.24) mittapullossa ja täytetään 250,0 ml:ksi sitraattipuskurilla (3.24). Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta. 3.27.4 Aminohappojen kalibrointiliuos hydrolysaateille: kysteiinihappo ja metioniinisulfoni, c = 5 nmol/50 μl, muut aminohapot c = 10 nmol/50 μl. Liuotetaan 2,2 g natriumkloridia (3.10) 30 ml:aan sitraattipuskuria (3.24) 100 ml:n dekantterilasissa. Lisätään 4,00 ml aminohappojen standardin kantaliuosta (3.27.1), 4,00 ml kysteiinihapon ja metioniinisulfonin standardin kantaliuosta (3.27.2) ja tarvittaessa 0,50 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.27.3). Säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidilla (3.18). Siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24) ja sekoitetaan. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta. Katso myös huomautukset 9.1 kohdassa. 3.27.5 Aminohappojen kalibrointiliuos 5.3.3.1 kohdan mukaisesti valmistetuille hydrolysaateille ja uutteille (5.2). Kalibrointiliuos valmistetaan 3.27.4 kohdan mukaisesti kuitenkin jättäen natriumkloridi pois. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta. 4. Välineistö 4.1 100 ml:n tai 250 ml:n pyörökolvi, joka on varustettu palautusjäähdyttimellä. 4.2 Borosilikaattilasinen 100 ml:n pullo, jossa on kumi/teflontiivisteinen kierrettävä uuninkestävä korkki (esimerkiksi Duran, Schott). 4.3 Koneellisella ilmanvaihdolla varustettu ja lämpötilaltaan säädettävä kuivausuuni, jonka tarkkuus on parempi kuin ± 2 oC. 4.4 pH-mittari (lukemat kolmen desimaalin tarkkuudella). 4.5 Kalvosuodatin (0,2 μm). 4.6 Sentrifugi. 4.7 Vakuumipyöröhaihdutin. 4.8 Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin. 4.9 Aminohappoanalysaattori tai HPLC-laitteisto, joissa on ioninvaihtokolonni, välineistö kolonnin jälkeistä ninhydriiniderivointia varten ja fotometri. Kolonni täytetään sellaisella sulfonoidulla polystyreenihartsilla, jolla voidaan erottaa eri aminohapot toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista yhdisteistä. Puskuri- ja ninhydriinipumpun virtausnopeuden stabiilisuuden tulee olla ±0,5 % ajanjaksona, jona analysoidaan sekä standardiliuos että näyte. Tietyissä aminohappoanalysaattoreissa voidaan käyttää hydrolyysimenetelmää, jossa hydrolysaatin natriumpitoisuus on c = 0,8 mol/l ja se sisältää näin kaiken hapetuksessa jäljelle jääneen muurahaishapon. Muut laitteet eivät erota tyydyttävästi tiettyjä aminohappoja, jos hydrolysaatti sisältää liikaa muurahaishappoa ja/tai natriumionipitoisuus on suuri. Tässä tapauksessa hapon määrää vähennetään haihduttamalla hydrolysaatti noin 5 ml:aan ennen pH:n säätämistä. Haihduttamisen on tapahduttava tyhjiössä enintään 40 oC:ssa. 5. Menettely 5.1 Näytteen valmistaminen Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.12) ennen jauhamista. 5.2 Vapaiden aminohappojen määrittäminen rehuista ja esiseoksista Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml uuttoseosta (3.21). Ravistellaan seosta 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.8). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään koko ajan sekoittaen 5,0 ml sulfosalisyylihappoliuosta (3.22) ja jatketaan sekoittamista 5 minuutin ajan magneettisekoittimella. Suodatetaan tai sentrifugoidaan liuos mahdollisen sakan erottamiseksi. Pipetoidaan 10,0 ml saatua liuosta 100 ml:n dekantterilasiin, säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18), huuhdotaan sopivan kokoiseen mittapulloon sitraattipuskurilla (3.24) ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24). Jos käytetään sisäistä standardia (3.27.3), sitä lisätään 1,00 ml lopullisen liuoksen kutakin 100 ml:aa kohden ja täytetään merkkiin asti purskuriliuoksella (3.24). Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti. Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, uutteet säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa. 5.3 Kokonaisaminohappojen määrittäminen 5.3.1 Hapettaminen Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1): — 100 ml:n pyörökolviin (4.1) avointa hydrolyysiä varten (5.3.2.3), tai — 250 ml:n pyörökolviin (4.1), jos tarvitaan alhaista natriumpitoisuutta (5.3.3.1), tai — 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) suljettua hydrolyysiä varten (5.3.2.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg ja kosteuspitoisuuden enintään 100 mg. Asetetaan pyörökolvi tai pullo jää-vesihauteeseen ja jäähdytetään 0 oC:seen, lisätään 5 ml hapetusseosta (3.23) ja sekoitetaan kaarevakärkisellä lasilastalla. Suljetaan kolvi/pullo lastoineen ilmatiiviin kalvon avulla, asetetaan jää-vesihaude näin suljettuine astioineen jääkaappiin, jonka lämpötila on 0 oC, ja jätetään sinne 16 tunniksi. Tämän jälkeen se otetaan jääkaapista ja hajotetaan hapetusreagenssin ylimäärä lisäämällä 0,84 g natriumdisulfiittia (3.4). Siirrytään 5.3.2.1 kohtaan. 5.3.2 Hydrolyysi 5.3.2.1 Hapetettujen näytteiden hydrolyysi Edellä 5.3.1. kohdan mukaisesti valmistettuun hapetettuun näytteeseen lisätään 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) huolehtien siitä, että astian seinämiin ja lastaan jäänyt näyte huuhdellaan pois. Jatketaan valitun hydrolyysimenetelmän mukaan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta. 5.3.2.2 Hapettamattomien näytteiden hydrolyysi Punnitaan 100 ml:n tai 200 ml:n pyörökolviin (4.1) tai 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) 0,1–1,0 g valmistettua näytettä (5.1) 0,2 mg:n tarkkuudella. Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään varovasti 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) ja sekoitetaan näytteeseen. Jatketaan joko 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta. 5.3.2.3 Avoin hydrolyysi Lisätään kolme lasihelmeä kolvissa olevaan seokseen (valmistettu 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti) ja keitetään tasaisesti kuplittaen palautusjäähdyttimen alla 23 tuntia. Hydrolyysin jälkeen huuhdellaan jäähdytin 5 ml:lla sitraattipuskuria (3.24). Kolvi irrotetaan ja jäähdytetään jäähauteessa. Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti. 5.3.2.4 Suljettu hydrolyysi Asetetaan 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti valmistettua näyteseosta sisältävä pullo uuniin (4.3) 110 oC:seen. Ensimmäisen tunnin aikana pidetään kierrekorkki sulkematta pullon päällä, jottei kaasun muodostuksen vuoksi syntyisi painetta ja jotta vältyttäisiin räjähdyksiltä. Pulloa ei saa sulkea korkilla. Tunnin kuluttua pullo suljetaan kierrekorkilla ja sen annetaan olla uunissa (4.3) 23 tunnin ajan. Hydrolyysin jälkeen pullo otetaan uunista, avataan korkki varovasti ja asetetaan pullo jää-vesihauteeseen. Annetaan jäähtyä. Riippuen tavasta, jolla pH säädetään (5.3.3), siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti sitraattipuskurin avulla (3.24) 250 ml:n dekantterilasiin tai 250 ml:n pyörökolviin. Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti. 5.3.3 pH:n säätäminen Aminohappoanalysaattorin (4.9) natriuminsietokyvyn mukaan noudatetaan 5.3.3.1 tai 5.3.3.2 kohtaa pH:n säätämiseksi. 5.3.3.1 Kromatografit (4.9), jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta On suositeltavaa käyttää sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3), jos käytetään aminohappoanalysaattoreita, jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta (kun hapon määrää on vähennettävä). Tässä tapauksessa lisätään 2,00 ml sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3) hydrolysaattiin ennen haihdutusta tai sen jälkeen. Lisätään 2 tippaa 1-oktanolia (3.15) 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdan mukaisesti saatuun hydrolysaattiin. Haihdutetaan näyte 5–10 ml:aan pyöröhaihduttimella (4.7), jonka hauteen lämpötila on 40 oC. Jos tilavuus pienenee vahingossa alle viiden millilitran, hydrolysaatti on hylättävä ja analyysi aloitettava uudelleen. pH säädetään arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18) ja jatketaan kohdasta 5.3.4. 5.3.3.2 Muut aminohappoanalysaattorit (4.9): Kohdan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 mukaisesti saatu hydrolysaatti neutraloidaan osittain lisäämällä varovasti koko ajan sekoittaen 17 ml natriumhydroksidiliuosta (3.17) ja huolehditaan siitä, että lämpötila on alle 40 oC. Lopullinen pH:n säätäminen 2,20:een tapahtuu huoneen lämpötilassa 3.17 kohdan mukaisen natriumhydroksidiliuoksen avulla ja lopuksi 3.18 kohdan mukaisella natriumhydroksidiliuoksella. Siirrytään 5.3.4 kohtaan. 5.3.4 Näyteliuos kromatografiaa varten Siirretään kvantitatiivisesti hydrolysaatti, jonka pH on säädetty (5.3.3.1 tai 5.3.3.2.), sitraattipuskurilla (3.24) 200 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti puskurilla (3.24). Jos sisäistä standardia ei ole vielä käytetty, lisätään sitä 2,00 ml (3.27.3) ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24). Sekoitetaan huolellisesti. Siirrytään kromatografiavaiheeseen (5.4). Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, näyteliuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa. 5.4 Kromatografia Annetaan uutteen (5.2) tai hydrolysaatin (5.3.4) tasoittua huoneenlämpöisiksi ennen kromatografiaa. Ravistellaan seosta ja suodatetaan sopiva määrä 0,2 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.5). Saatu kirkas liuos analysoidaan aminohappoanalysaattorilla käyttäen ioninvaihtokromatografiaa (4.9). Injektio voidaan suorittaa käsin tai automaattisesti. On tärkeää, että kolonniin lisätään aina sama määrä (±0,5 %) vertailu- tai näyteliuosta, paitsi silloin kun käytetään sisäistä standardia, ja että natriumin ja aminohappojen suhde standardi- ja näyteliuoksissa on mahdollisimman lähellä toisiaan. Kalibrointiajojen tiheys riippuu ninhydriinireagenssin ja analysaattorin toiminnan stabiilisuudesta. Standardi- tai näyteliuosta laimennetaan sitraattipuskurilla (3.24), siten, että standardiliuoksen antama piikin pinta-ala on 30–200 % näytteen aminohapon antaman piikin pinta-alasta. Aminohappojen kromatografia vaihtelee jonkin verran käytetyn analysaattorin tyypin ja käytetyn hartsin mukaan. Valitun menetelmän on mahdollistettava aminohappojen erottaminen toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista aineista. Pylvääseen ruiskutettujen yhdisteiden pitoisuuden muutosten on käyttöalueella annettava lineaarinen vaste. Analysoitaessa aminohappojen ekvimolaarisia liuoksia sovelletaan seuraavassa kappaleessa määriteltyjä laakson ja piikin välisiä suhteita. Ekvimolaarisen liuoksen tulee sisältää vähintään 30 % kunkin aminohapon siitä enimmäismäärästä, joka voidaan määrittää tarkasti käytetyllä aminohappoanalysaattorilla (4.9). Kromatogrammissa treoniinin ja seriinin osittain päällekkäisten piikkien välisen laakson suhde matalamman piikin korkeuteen ei saa olla suurempi kuin 2:10. (Jos määritetään ainoastaan kyst(e)iiniä, metioniiniä, treoniiniä ja lysiiniä, vierekkäisten piikkien riittämätön erottuminen toisistaan häiritsee määritystä.) Muiden aminohappojen osalta erottumisen on oltava parempi kuin 1:10. Kromatografiajärjestelmän on pystyttävä erottamaan lysiini lysiiniartefaktoista ja ornitiinistä. 6. Tulosten laskeminen Näytteen ja vertailuliuoksen piikkien pinta-ala mitataan kunkin yksittäisen aminohapon osalta ja määrä (X) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti; tulos ilmoitetaan grammoina aminohappoa näytekiloa kohden. Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä A = analysoitavan piikin pinta-ala, hydrolysaatti tai uute B = analysoitavan piikin pinta-ala, standardiliuos C = sisäisen standardin piikin pinta-ala hydrolysaatissa tai uutteessa D = sisäisen standardin piikin pinta-ala kalibrointiliuoksessa M = analysoitavan aminohapon molekyylipaino c = standardin konsentraatio μmol/ml m = näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu tai rasva poistettu) V = ml kokonaishydrolysaattia (5.3.4) tai ml uutteen laskettua kokonaislaimennosta (6.1). Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) käyttäen molekyylipainoa 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin molekyylipainoa 149,21 g/mol. Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa molekyylipainoa. 6.1 Uutteiden kokonaislaimennoksen tilavuus (F) vapaiden aminohappojen määrittämistä varten (5.2) lasketaan seuraavasti: V = lopullisen uutteen määrä. 7. Menetelmän arviointi Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos). Tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavien arvojen poissulkemisen jälkeen on esitetty tämän kohdan taulukoissa. Keskiarvot g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Broilereiden täysrehu 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Valkuaistiiviste 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Esiseos 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä. 7.1 Toistettavuus Toistettavuus edellä mainitussa laboratorioiden välisessä vertailussa on ilmaistu muodossa ”laboratorion sisäinen standardipoikkeama” alla olevassa taulukossa. Laboratorion sisäinen standardipoikkeama (Sr) g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilereiden täysrehu 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Valkuaistiiviste 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Esiseos 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

Variaatiokerroin (%) laskettuna laboratorion sisäisestä standardipoikkeamasta (Sr) Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilereiden täysrehu 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Valkuaistiiviste 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Esiseos 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä. 7.2 Uusittavuus Edellä mainitun vertailun laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Standardointipoikkeama laboratorioiden välillä (SR) g/kg Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilereiden täysrehu 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Valkuaistiiviste 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Esiseos 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä.

Laboratorioiden välisistä standardipoikkeamista (SR) laskettu variaatiokerroin (%) Vertailuaine Aminohappo Treoniini Kyst(e)iini Metioniini Lysiini Sikojen täysrehu 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilereiden täysrehu 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Valkuaistiiviste 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Esiseos 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = osallistuneiden laboratorioiden lukumäärä. 8. Vertailumateriaalin käyttö Menetelmän oikea soveltaminen tarkistetaan sertifioidulla vertailumateriaalilla, jos sellainen on saatavilla, tehdyllä kaksoismäärityksellä. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa. 9. Huomautukset 9.1 Aminohappoanalysaattoreiden välisten erojen vuoksi annettuja aminohappojen kalibrointiliuosten (3.27.4 ja 3.27.5) ja hydrolysaattien (5.3.4) lopullisia konsentraatioita on pidettävä suuntaa antavina. Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta. Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille. 9.2 Kun hydrolysaattien analysointiin käytetään suuren erotuskyvyn nestekromatografialaitteistoa, koeolosuhteet on optimoitava valmistajan suositusten mukaisesti. 9.3 Jos menetelmää sovelletaan rehuihin, jotka sisältävät enemmän kuin yhden prosentin kloridia (tiiviste, kivennäisaineita sisältävät ravinteet tai lisäravinteet), sillä saatetaan saada metioniinille liian pieniä arvoja, ja erityiskäsittely on tarpeen. G. TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmän avulla voidaan määrittää rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan. 2. Periaate Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella ja kuumennetaan 110 oC:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi. Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa. Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutteessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssidetektoria. 3. Reagenssit 3.1 Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS/cm). 3.2 Standardi: tryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä. 3.3 Sisäinen standardi: α-metyylitryptofaani (puhtaus/pitoisuus ≥ 99 %), kuivattu tyhjiössä fosforipentoksidin päällä. 3.4 Bariumhydroksidioktahydraatti (on varottava, ettei Ba(OH)2 8 H2O joudu liiaksi kosketuksiin ilman kanssa; tällöin muodostuisi BaCO3:a, joka voi häiritä määritystä) (ks. huomautus 9.3). 3.5 Natriumhydroksidi. 3.6 Ortofosforihappo, w (w/w) = 85 % 3.7 Kloorivetyhappo, ρ201,19 g/ml. 3.8 Metanoli, HPLC-laatua vastaava. 3.9 Petrolieetteri, kiehumislämpötila 40–60 oC. 3.10 Natriumhydroksidiliuos, c = 1 mol/l: Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1). 3.11 Kloorivetyhappo, c = 6 mol/l: Mitataan 492 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.12 Kloorivetyhappo, c = 1 mol/l: Mitataan 82 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.13 Kloorivetyhappo, c = 0,1 mol/l: Mitataan 8,2 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä. 3.14 Ortofosforihappo, c = 0,5 mol/l: Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1). 3.15 Väkevä tryptofaaniliuos (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa. 3.16 Konsentroitu sisäisen standardin liuos, c = 2,50 μmol/ml: Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa. 3.17 Tryptofaanin ja sisäisen standardin kalibrointistandardiliuos: Mitataan 2,00 ml konsentroitua tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin (α-metyylitryptofaanin) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10–30 %). Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä. Liuos suojataan suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana. 3.18 Etikkahappo. 3.19 1,1,1-Trikloori-2-metyyli-2-propanoli. 3.20. Etanoliamiini w (w/w) > 98 %. 3.21 Valmistetaan liuos, jossa on 1 g 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) 100 ml:ssa metanolia (3.8). 3.22 HPLC:ssä käytettävä liikkuva faasi: 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.21) (1g/100ml). pH säädetään arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1). 4. Välineistö 4.1 HPLC-laitteisto, jossa on spektrofluorimetri-detektori. 4.2 Nestekromatografiakolonni, 125 mm × 4 mm, C18, hartsin (pakkausaineen) hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava. 4.3 pH-mittari. 4.4 Polypropyleenipullo, tilavuus 125 ml, jossa on leveä kaula ja kierretulppa. 4.5 Kalvosuodatin 0,45 μm. 4.6 Autoklaavi, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7 Mekaaninen ravistelija tai magneettisekoitin. 4.8 Vortex-sekoitin. 5. Menettely 5.1 Näytteiden valmistaminen Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joilla on suuri kosteuspitoisuus, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joilla on suuri rasvapitoisuus, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista. 5.2 Vapaan tryptofaanin määritys (uutteesta) Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml kloorivetyhappoa (3.13) ja 5,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)). Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti. Standardiliuos ja uutteet suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutteita voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää. 5.3 Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista) Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1–1 g valmistettua näytettä (5.1) polypropyleenipulloon (4.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pullo suljetaan löyhästi kierrekorkilla. Pullo pannaan autoklaaviin (4.6), jossa on kiehuvaa vettä, ja autoklavoidaan 30–60 minuutin ajan. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (± 2) oC:ssa 20 tuntia. Lämpötila on laskettava juuri alle 100 oC:seen, ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2 · 8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (α-metyylitryptofaania, 3.16). Jäähdytetään pulloja vesi/jäähauteessa 15 minuuttia. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista. Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti. Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää. 5.4 HPLC-määritys Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2): Nestekromatografiakolonni (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 3 μm, tai vastaava Kolonnin lämpötila: huoneenlämpötila Liikkuva faasi (3.22): 3,00 g etikkahappoa (3.18) + 900 ml vettä (3.1) +50,0 ml liuosta (3.21), jossa on 1,1,1-trikloori-2-metyyli-2-propanolia (3.19) metanolissa (3.8) (1 g/100 ml). Säädetään pH arvoon 5,00 etanoliamiinilla (3.20). Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä (3.1). Virtausnopeus: 1 ml/min Kokonaisajoaika: noin 34 min Detektioaallonpituus: eksitaatio: 280 nm, emissio: 356 nm. Injektiotilavuus: 20 μl. 6. Tulosten laskeminen Lasketaan tryptofaanin määrä (X) grammoina 100 grammassa näytettä. A = sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17) B = tryptofaanin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3) V1 = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml) c = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50) V2 = uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml C = sisäisen standardin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3) D = tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17) V3 = kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (= 2,00 ml) m = näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu ja/tai rasva poistettu) M = tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23 g/mol). 7. Toistettavuus Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta. 8. Laboratorioiden välisen vertailun tulokset Järjestetyssä EY-vertailussa (4. vertailututkimus) 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: Näyte 1 Sian rehu Näyte 2 Sian rehu, johon on lisätty L-tryptofaania Näyte 3 Sian rehutiiviste L 12 12 12 n 50 55 50 Keskiarvo [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2 L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %. Toisessa EY-vertailussa (3. vertailututkimus) 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa: Näyte 4 Vehnä-soijaseos Näyte 5 Vehnä-soijaseos (= näyte 4), johon on lisätty tryptofaania (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Keskiarvo [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11 L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %. Vielä järjestettiin EY-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Näyte 1 Sikarehuseos (CRM 117) Näyte 2 Vähärasvainen kalajauho (CRM 118) Näyte 3 Soijajauho (CRM 119) Näyte 4 Rasvaton maitojauhe (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Keskiarvo [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [%] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = laboratorioiden lukumäärä n = keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä) sr = toistettavuuden keskihajonta SR = uusittavuuden keskihajonta r = toistettavuus R = uusittavuus CVr = toistettavuuden variaatiokerroin, % CVR = uusittavuuden variaatiokerroin, %. 9. Huomautukset 9.1 Seuraavilla erityisillä kromatografiaolosuhteilla voidaan erottaa paremmin tryptofaani ja α-metyylitryptofaani. Isokraattinen erotus, jonka jälkeen kolonni puhdistetaan gradienteilla: Nestekromatografia-kolonni: 125 mm × 4 mm, C18, hiukkaskoko 5 μm, tai vastaava Kolonnin lämpötila: 32 oC Liikkuva faasi: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanoli, 95+5 (V+V). B: metanoli Gradientti: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 %A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Virtausnopeus: 1,2 ml/min Kokonaisajoaika: noin 33 min. 9.2 Kromatografia vaihtelee HPLC-laitetyypin ja käytetyn kolonnin täytemateriaalin mukaan. Valitun järjestelmän on pystyttävä erottamaan tryptofaanin piikki ja sisäisen standardin piikki pohjaviivalle asti. Lisäksi on tärkeää, että hajoamistuotteet eroavat hyvin tryptofaanista ja sisäisestä standardista. Hydrolysaatteja on ajettava myös ilman sisäistä standardia, jotta voidaan tarkistaa epäpuhtauksien esiintyminen sisäisen standardin kohdalla olevan pohjaviivan avulla. On tärkeää, että ajoaika on riittävän pitkä, jotta kaikki hajoamistuotteet eluoituvat; myöhään eluoituvat piikit saattavat muuten häiritä myöhempiä kromatografia-ajoja. Kromatografiajärjestelmän vasteen on oltava lineaarinen toiminta-alueella. Lineaarinen vaste on mitattava sisäisen standardin vakiopitoisuudella (normaalilla pitoisuudella) ja erilaisilla tryptofaanipitoisuuksilla. On tärkeää, että sekä tryptofaanin että sisäisen standardin piikkien koot ovat HPLC-fluoresenssijärjestelmän lineaarisella alueella. Jos joko tryptofaanin ja/tai sisäisen standardin piikki on liian pieni tai liian suuri (piikit ovat liian pienet tai suuret), analyysi on toistettava käyttäen erilaista näytemäärää ja/tai muuttaen lopputilavuutta. 9.3 Bariumhydroksidi Bariumhydroksidi tulee vanhetessaan vaikealiukoisemmaksi. HPLC-määritystä varten tehty liuos voi sen vuoksi olla samea, minkä vuoksi voidaan saada alhaisia tryptofaanituloksia. H. RAAKARASVAN JA RAAKAÖLJYN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä määritetään rehuissa olevan raakarasvan ja -öljyn määrä. Se ei koske öljysiementen ja öljypitoisten hedelmien määrityksiä. Jäljempänä kuvattavan kahden menettelytavan käyttö riippuu rehun luonteesta ja koostumuksesta sekä määrityksen käyttötarkoituksesta. 1.1 Menettelytapa A — Suoraan uutettavissa oleva raakarasva ja -öljy Tätä menetelmää voidaan käyttää kasviperäisiin rehuihin lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat menettelytavan B soveltamisalaan. 1.2 Menettelytapa B — Raakarasvan ja -öljyn kokonaismäärä Menetelmää voidaan soveltaa eläinperäisiin rehuihin sekä kaikkiin rehuseoksiin. Sitä käytetään kaikkiin sellaisiin rehuihin, joista rasvaa ja öljyä ei voida täysin uuttaa ilman sitä edeltävää hydrolysointia (esim. gluteenit, hiiva, perunaproteiinit ja tuotteet, joita on käsitelty muun muassa ekstrudoimalla, kuumentamalla tai hiutaleiksi tekemällä). 1.3 Tulosten tulkitseminen Aina, kun menettelytapaa B käyttäen saadaan suurempi tulos kuin menettelytapaa A käyttäen, menettelytavalla B saatua tulosta pidetään todellisena arvona. 2. Periaate 2.1 Menettelytapa A Näyte uutetaan petrolieetterillä. Liuotin tislataan pois ja jäännös kuivataan ja punnitaan. 2.2 Menettelytapa B Näyte käsitellään kuumentamalla sitä kloorivetyhapon kanssa. Seos jäähdytetään ja suodatetaan. Jäännös pestään ja kuivataan ja määritystä jatketaan menettelytavan A mukaisesti. 3. Reagenssit 3.1 Petrolieetteri, kiehumislämpötila: 40–60 oC. Bromiluvun on oltava alle 1 ja haihdutusjäännöksen alle 2 mg/100 ml. 3.2 Natriumsulfaatti, vedetön. 3.3 Kloorivetyhappo, c = 3 mol /l. 3.4 Suodatuksen apuaine, esim. Kieselgur, Hyflo-supercel. 4. Välineistö 4.1 Uuttolaitteisto. Jos käytetään Soxhlet-laitteistoa (jossa on sifoni), refluksointinopeuden on oltava sellainen, että Soxhlet-väliosan täyttyminen liuottimella ja tyhjeneminen siitä tapahtuvat noin 10 kertaa tunnissa. Jos laitteistoon kuuluu suoramallinen väliosa, refluksointinopeuden on oltava noin 10 ml minuutissa. 4.2 Uuttohylsyjä, joissa ei ole petrolieetteriin liukenevaa materiaalia ja joiden huokoisuus täyttää 4.1 kohdassa esitetyt vaatimukset. 4.3 Lämpökaappi, joko vakuumikaappi, joka on säädetty 75 ± 3 oC:seen tai kiertoilmakaappi, joka on säädetty 100 ± 3 oC:seen. 5. Menettely 5.1 Menettelytapa A (katso 8.1 kohta) Näytettä punnitaan 5 g 1 mg:n tarkkuudella uuttohylsyyn (4.2) ja se peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy asetetaan uuttolaitteeseen (4.1) ja sitä uutetaan kuusi tuntia petrolieetterillä (3.1). Petrolieetteriuute otetaan talteen kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä (2). Liuotin tislataan pois. Pullon ja sen sisältämän jäännöksen annetaan kuivua puolentoista tunnin ajan lämpökaapissa (4.3). Pullon jäännöksineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että rasvan ja öljyn paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg). 5.2 Menettelytapa B Näytettä punnitaan 2,5 g 1 mg:n tarkkuudella (ks. 8.2 kohta) 400 ml:n dekantterilasiin tai 300 ml:n erlenmeyerkolviin ja astiaan lisätään 100 ml kloorivetyhappoa (3.3) ja kiehumakiviä. Dekantterilasi peitetään kellonlasilla tai erlenmeyerkolvi yhdistetään palautusjäähdyttimeen. Seos saatetaan varovasti kiehuvaksi käyttäen pientä liekkiä tai sähkölevyä ja seoksen annetaan kiehua hiljalleen tunnin ajan. Näytteen tarttumista astian seinämiin tulee välttää. Astian sisällön annetaan jäähtyä ja lisätään suodatuksen apuainetta (3.4) sen verran, ettei rasvaa ja öljyä häviä suodatuksessa. Suodatukseen käytetään kostutettua, rasvatonta, kaksinkertaista suodatinpaperia. Jäännös pestään kylmällä vedellä, kunnes saadaan neutraali suodos. Tarkastetaan, ettei suodos sisällä öljyä tai rasvaa. Jos sitä esiintyy, näyte on ennen hydrolysointia uutettava petrolieetterillä menettelytapaa A käyttäen. Jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi asetetaan kellonlasille ja sen annetaan kuivua puolitoista tuntia 100 ± 3 oC:ssa lämpökaapissa (4.3). Kuivan jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi pannaan uuttohylsyyn (4.2) ja peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy pannaan uuttolaitteeseen (4.1) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa esitetyllä tavalla. 6. Tuloksen ilmoittaminen Jäännöksen paino ilmoitetaan prosentteina näytteen painosta. 7. Toistettavuus Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli: — 0,2 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on alle 5 %, — 4,0 %:a suhteellisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on 5–10 %, — 0,4 %:a absoluuttisena arvona, kun raakarasva- ja -öljypitoisuus on yli 10 %. 8. Huomautukset 8.1 Runsaasti rasvaa ja öljyä sisältäviä tuotteita, joita on hankala jauhaa tai joista on vaikea saada homogeenista näytettä, käsitellään seuraavasti: Näytettä punnitaan 20 g 1 mg:n tarkkuudella ja siihen sekoitetaan vähintään 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (3.2). Sitä uutetaan petrolieetterillä (3.1) 5.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Saadun uutteen tilavuus täydennetään 500 ml:ksi petrolieetterillä (3.1) ja se sekoitetaan. Liuosta otetaan 50 ml ja kaadetaan pieneen, kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä. Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan viimeisessä kappaleessa kuvatulla tavalla. Liuottimen annetaan haihtua hylsyssä olevasta uuttojäännöksestä, jäännös jauhetaan 1 mm raekokoon ja siirretään takaisin hylsyyn (lisäämättä natriumsulfaattia) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa kuvatulla tavalla. Rasvan ja öljyn pitoisuus prosentteina näytteestä lasketaan seuraavalla kaavalla: (10m1 + m2) × 5 jossa: m1 = ensimmäisen uuton jälkeen saadun jäännöksen (määräosa uutteesta) paino grammoina, m2 = toisen uuton jälkeen saadun jäännöksen paino grammoina. 8.2 Pieniä rasva- ja öljymääriä sisältävien näytteiden punnitusmäärä voidaan nostaa 5 grammaan. 8.3 Lemmikkieläinten ruokiin, joiden vesipitoisuus on suuri, voi olla tarvetta sekoittaa vedetöntä natriumsulfaattia ennen hydrolysointia ja uuttoa, joka suoritetaan menettelytavassa B kuvatulla tavalla. 8.4 Edellä 5.2 kohdassa voi olla tehokkaampaa käyttää kuumaa vettä kylmän veden sijaan jäännöksen pesemiseksi suodatuksen jälkeen. 8.5 Mainittua 1,5 tunnin kuivatusaikaa saatetaan joutua pidentämään joidenkin rehujen osalta. Liiallista kuivaamista on kuitenkin vältettävä, sillä se voi johtaa alhaisempiin tuloksiin. Myös mikroaaltouunia voidaan käyttää. 8.6 Ennen hydrolysointia tapahtuvaa menettelytavan A mukaista esiuuttoa ja menettelytavan B mukaista uudelleen uuttoa suositellaan, jos raakarasvan/öljyn pitoisuus on yli 15 %. Tämä riippuu jossakin määrin rehun tai rehuseoksen luonteesta ja siinä olevan rasvan/öljyn laadusta. I. RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS 1. Tarkoitus ja soveltamisala Menetelmällä voidaan määrittää rehusta sen rasvaton orgaaninen aines, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä ja jota kutsutaan sovitusti raakakuiduksi. 2. Periaate Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään peräkkäin tietyn väkevyisillä kiehuvilla rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erotetaan suodattamalla näyte lasisintterisuodattimella, se pestään, kuivataan, punnitaan ja poltetaan tuhkaksi 475–500 oC:ssa. Tuhkaamisesta aiheutuva painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta. 3. Reagenssit 3.1 Rikkihappo, c = 0,13 mol/l. 3.2 Kuohunestoaine (esimerkiksi n-oktanoli). 3.3 Suodatuksen apuaine (Celite 545 tai vastaava), jota on kuumennettu 500 oC:n lämpötilassa neljän tunnin ajan (8.6). 3.4 Asetoni. 3.5 Petrolieetteri, kiehumislämpötila: 40–60 oC. 3.6 Kloorivetyhappo, c = 0,5 mol/1. 3.7 Kalumhydroksidiliuos, c = 0,23 mol/l. 4. Välineistö 4.1 Lämmityslaitteisto rikkihappoliuoksella tai kaliumhydroksidiliuoksella tehtävään kuumauuttoon; lämmityslaitteistoon kuuluu suodatinupokkaan (4.2) jalusta ja letku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili; tarvittaessa laitteistoon saadaan paineilmaa. Ennen kutakin päivittäistä käyttöönottoa laitteisto esilämmitetään keittämällä siinä vettä viiden minuutin ajan. 4.2 Vetoisuudeltaan 50 ml:n suuruinen lasinen suodatinupokas, jossa on huokoisuudeltaan 40–90 μm:n lasisintterisuodatin. Ennen ensimmäistä käyttökertaa upokasta kuumennetaan 500 oC:ssa muutaman minuutin ajan ja jäähdytetään (8.6). 4.3 Vetoisuudeltaan vähintään 270 ml oleva sylinteri, jossa on kiehumisen kestävä palautusjäähdytin. 4.4 Termostaattisäätöinen lämpökaappi. 4.5 Termostaattisäätöinen muhveliuuni. 4.6 Uuttoyksikkö, johon kuuluu suodatinupokkaan jalusta (4.2) ja poistoletku, jossa on ilmanpoisto- ja tyhjennysventtiili. 4.7 Osia lämmityslaitteiston (4.1), upokkaan (4.2) ja sylinterin (4.3) kokoamiseen sekä kylmäuuttoyksikön (4.6) ja upokkaan liittämiseen. 5. Menettely Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g esikäsiteltyä näytettä upokkaaseen (4.2) (ks. huomautukset 8.1, 8.2 ja 8.3) ja lisätään 1 g suodatuksen apuainetta (3.3). Liitetään suodatinupokas (4.2) lämmityslaitteistoon (4.1), ja tämän jälkeen liitetään sylinteri (4.3) upokkaaseen. Sylinteri-upokasyhdistelmä täytetään 150 ml:lla kiehuvaa rikkihappoa (3.1) ja tarvittaessa lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2). Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia. Avataan poistoletkun venttiili (4.1), ja suodatetaan rikkihappo tyhjössä suodatinupokkaan läpi ja pestään jäännös kolme kertaa peräkkäin 30 ml:lla kiehuvaa vettä huolehtien siitä, että jäännös suodatetaan kuivaksi jokaisen pesukerran jäl