Lisätään liitteet seuraavasti:

”

Lisäys

MENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN OSOITTAMISEKSI LAMPAAN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI LAMPAAN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA

1. SOVELTAMISALA

Lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittaminen lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysissä muodostuvien γ-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla.

2. SOVELTAMISALA

Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa. Se ei sovellu niiden osoittamiseen, jos maito tai juusto on väärennetty lämpökäsitellyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla.

3. MENETELMÄN PERIAATE

3.1 Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista

3.2 Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja pilkkominen plasmiinilla (EC.3.4.21.7)

3.3 Plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys

3.4 Värjättyjen γ3- ja γ2-kaseiinikuvioiden (näyttö lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samassa geelissä 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävistä vertailustandardeista

4. REAGENSSIT

On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita. Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa.

Huomautus: Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 × 125 × 0,25 mm. Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään.

Isoelektrinen fokusointi

4.1 Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi

4.1.1 Geelin kantaliuos

Liuotetaan

4,85 g akryyliamidia

0,15 g N, N′-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS)

48,05 g ureaa

15,00 g glyserolia (87 % w/w)

veteen ja täytetään 100 ml:aan, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa.

Huomautus: Painoltaan määrättyjen hermomyrkyllisten akryyliamidien sijasta voi käyttää myös kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta. Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan. Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 μS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amberlite MB-3:n kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 μm:n kalvon läpi.

4.1.2 Geeliliuos

Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (*) (ks. 4.1.1).

9,0 ml varastoliuosta

24 mg de β-alaniinia

500 μl amfolyyttiä, pH 3,5–9,5

250 μl amfolyyttiä, pH 5-7

250 μl amfolyyttiä, pH 6-8

Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa 2–3 minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä.

Huomautus: Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2).

4.1.3 Katalyyttiliuokset

4.1.3.1 N, N, N′, N′-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED)

4.1.3.2 40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER):

Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täytetään 2 ml:aan.

Huomautus: Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta.

4.2 Kontaktineste

Petroli tai parafiiniöljy.

4.3 Anodiliuos

Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi.

4.4 Katodiliuos

Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä.

Näytteen valmistus

4.5 Reagenssit proteiinien eristämiseksi

4.5.1 Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täytetään 100 ml:aan vedellä)

4.5.2 Dikloorimetaani

4.5.3 Asetoni

4.6 Proteiinia liuottava puskuriliuos

Liuotetaan

5,75 g glyserolia (87 % w/w)

24,03 g ureaa

250 mg ditiotreitolia

veteen ja täytetään 50 ml:aan.

Huomautus: Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko.

4.7 Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla

4.7.1 Ammoniumkarbonaattipuskuri

Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8.

4.7.2 Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml

4.7.3 ε-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten

Liuotetaan 2 624 g ε-aminokapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia.

4.8 Standardit

4.8.1 Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta lampaan- ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana vertailumateriaalien ja -mittausten tutkimuslaitoksesta (IRMM), B-2440 Geel, Belgia.

4.8.2 Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa

Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa, 2 500 g 20 minuutin ajan. Kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6–8 °C, poistetaan ylempi rasvakerros kokonaan. 1 % standardin valmistamiseksi lisätään 5,00 ml naudan rasvatonta maitoa 495 ml:aan puhvelin rasvatonta maitoa 1 l:n dekantterilasissa, säädetään pH:n arvoksi 6,4 laimeaa maitohappoa (10 % w/v) lisäämällä. Säädetään lämpötila 35 °C:seen ja lisätään 100 μl vasikanjuoksetetta (juoksetteen aktiivisuus 1:10 000, n. 3 000 U/ml), sekoitetaan 1 minuutin ajan ja sen jälkeen dekantterilasi jätetään seisomaan alumiinifoliolla päällystettynä 35 °C:seen yhdeksi tunniksi juustomassan muodostamiseksi. Kun juustomassa on muodostunut, juoksettunut maito kylmäkuivataan kokonaisuudessaan ilman enempää homogenointia tai heran valuttamista. Kylmäkuivauksen jälkeen se jauhetaan hienoksi homogeenisen jauheen saamiseksi. Sama menettely suoritetaan 0 %:n standardin valmistamiseksi aitoa rasvatonta puhvelinmaitoa käyttäen. Standardeja on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.

Huomautus: On suositeltavaa tarkistaa puhvelinmaidon puhtaus plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla ennen standardien valmistamista.

Reagenssit proteiinien värjäykseen

4.9 Kiinnitysaine

Liuotetaan 150 g trikloorietikkahappoa veteen ja täytetään 1 000 ml:aan.

4.10 Värinpoistoliuos

Laimennetaan 500 ml metanolia ja 200 ml jääetikkaa 2 000 ml:ksi tislatulla vedellä.

Huomautus: Tuore värinpoistoliuos on valmistettava joka päivä; se voidaan valmistaa sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet varastoliuoksia, 50 % (v/v) metanolia ja 20 % (v/v) jääetikkaa.

4.11 Värjäysliuokset

4.11.1 Värjäysliuos (kantaliuos 1)

Liuotetaan 3,0 g Coomassie-briljanttisinistä G 250 (C.I. 42655) 1 000 ml:aan 90 % (v/v) metanolia magneettisekoittajaa käyttäen (n. 45 minuuttia), suodatetaan kahden keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi.

4.11.2 Värjäysliuos (kantaliuos 2)

Liuotetaan 5,0 g kuparisulfaattipentahydraattia 1 000 ml:aan 20 % (v/v) etikkahappoa.

4.11.3 Värjäysliuos (työskentelyliuos)

Sekoitetaan yhteen 125 ml kumpaakin varastoliuosta (4.11.1, 4.11.2) välittömästi ennen värjäystä.

Huomautus: Värjäysliuos tulisi valmistaa sinä päivänä, jona sitä käytetään.

5. LAITTEET JA TARVIKKEET

5.1 Lasilevyjä (265 × 125 × 4 mm); kumitela (leveys 15 cm); vaakatasopöytä

5.2 Kantaja-arkki geelille (265 × 125 mm)

5.3 Peitearkki (280 × 125 mm). Kiinnitetään teippinauha (280 × 6 × 0,25 mm) kummallekin pitkälle sivulle (ks. kuva 1).

5.4 Elektrofokusointikammio, jossa on jäähdytyslevy (esim. 265 × 125 mm) ja sopiva virtalähde (≥ 2,5 kV) tai automaattinen elektroforeesilaite

5.5 Kiertokryostaatti, säädetty termostaatilla lämpötilaan 12 ± 0,5 °C

5.6 Sentrifugi, säädettävissä nopeuteen 3 000 g

5.7 Elektrodiliuskat (pituus ≥ 265 mm)

5.8 Muovisia tippapulloja anodi- ja katodiliuoksille

5.9 Näyteapplikaattoreita (10 × 5 mm, viskoosia tai suodatinpaperia, joka ei absorboi proteiineja)

5.10 Ruostumatonta terästä olevia tai lasisia värjäys- ja värinpoistoastioita (esim. 280 × 150 mm instrumenttitarjottimia)

5.12 Säädettävissä oleva sauvahomogenisaattori (varren halkaisija 10 mm), rpm alueella 8 000–20 000

5.13 Magneettisekoitin

5.14 Ultraäänihaude

5.15 Kalvojen saumaukseen sopiva laite

5.16 Mikropipettejä, 25 μl

5.17 Tyhjiöhaihdutin tai kylmäkuivain

5.18 Vesihaude, joka on termostaatilla säädeltävissä lämpötiloihin 35 ja 40 ± 1 °C, ravistelijalla varustettuna

5.19 Tiheysmittari, luettavissa aallonpituudella λ = 634 nm

6. SUORITUS

6.1 Näytteen valmistus

6.1.1 Kaseiinien eristäminen

Punnitaan 5:ttä g:aa juuston kuiva-ainetta vastaava määrä näytettä tai vertailustandardeja 100 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 60 ml tislattua vettä ja homogenoidaan sauvahomogenisaattorilla (8 000–10 000 rpm). Säädetään pH-arvoon 4,6 laimealla etikkahapolla (4.5.1) ja sentrifugoidaan (5 min., 3 000 g). Dekantoidaan rasva ja hera, homogenoidaan jäännös kierrosnopeudella 20 000 rpm 40 ml:n kanssa tislattua vettä, jonka pH on säädetty arvoon 4,5 laimealla etikkahapolla (4.5.1), lisätään 20 ml dikloorimetaania (4.5.2), homogenoidaan jälleen ja sentrifugoidaan (5 min., 3 000 g). Poistetaan lastalla kaseiinikerros, joka kelluu vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä (ks. kuva 2) ja dekantoidaan molemmat faasit pois. Homogenoidaan kaseiini uudelleen 40 ml:n tislattua vettä (ks. edellä) ja 20 ml:n dikloorimetaania (4.5.2) kanssa ja sentrifugoidaan. Toistetaan menettely, kunnes molemmat uuttofaasit ovat värittömiä (2–3 kertaa). Homogenoidaan proteiinijäännös 50 ml:lla asetonia (4.5.3) ja suodatetaan keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi. Pestään suodatinpaperille jäävä jäännös kahdesti kahdella erillisellä 25 ml:n annoksella asetonia ja annetaan kuivua ilmassa tai typpivirrassa; tämän jälkeen jauhetaan hienoksi huhmareessa.

Huomautus: Eristetyt kuivat kaseiinit on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.

6.1.2 β-kaseiinien pilkkominen plasmiinilla γ-kaseiinin vahvistamiseksi

Dispergoidaan 25 mg eristettyjä kaseiineja (6.1.1) 0,5 ml:aan ammoniumkarbonaattipuskuria (4.7.1) ja homogenoidaan 20 minuutin ajan esim. ultraäänellä. Kuumennetaan lämpötilaan 40 °C ja lisätään 10 μl plasmiinia (4.7.2), sekoitetaan ja inkuboidaan tunnin ajan 40 °C:ssa jatkuvasti ravistellen. Entsyymin inhiboimiseksi lisätään 20 μl ε-kapronihappoliuosta (4.7.3), tämän jälkeen lisätään 200 mg kiinteää ureaa ja 2 mg ditiotreitolia.

Huomautus: Symmetrisempien kaseiinijuovien saamiseksi fokusoinnissa on suositeltavaa kylmäkuivata liuos ε-kapronihappoliuoksen lisäämisen jälkeen ja liuottaa sitten jäännökset 0,5 ml:aan proteiinia liuottavaan puskuriin (4.6).

6.2 Ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistus

Muutaman vesipisaran avulla levitetään geelin kantaja-arkki (5.2) lasilevyn (5.1) päälle ja kuivataan kaikki ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. Samoin levitetään peitearkki (5.3), jossa on välikkeet (0,25 mm), toisen lasilevyn päälle. Asetetaan levy vaakasuoraan vaakatasopöydälle.

Lisätään 10 μl TEMED:tä (4.1.3.1) valmistettuun ilmattomaan geeliliuokseen (4.1.2), sekoitetaan ja lisätään 10 μl PER-liuosta (4.1.3.2), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan välittömästi tasaisesti peitearkin keskikohtaan. Asetetaan geelin kantajalevyn yksi reuna (arkkipuoli alaspäin) peitearkin päälle ja lasketaan sitä hitaasti niin, että geelikerros muodostuu arkkien väliin ja leviää tasaisesti ja ilman kuplien muodostumista (kuva 3). Lasketaan varovasti geelin kantajalevy kokonaan alas ohutta lastaa käyttäen ja asetetaan vielä kolme lasilevyä sen päälle painoksi. Kun polymeroituminen on tapahtunut (noin 60 min), poistetaan geelin kantaja-arkille polymeroitunut geeli yhdessä peitearkin kanssa lasilevyjä koputellen. Puhdistetaan kantaja-arkin kääntöpuolelta huolellisesti geelijäännökset ja urea. Saumataan geeli-sandwich kalvoon ja säilytetään jääkaapissa (enintään 6 viikkoa).

Huomautus: Välikkeellistä peitearkkia voidaan käyttää uudelleen. Polyakryyliamidigeeli voidaan leikata pienempiin osiin, mitä suositellaan, kun näytteitä on ainoastaan muutama tai jos käytetään automaattista elektroforeesilaitetta (2 geeliä, koko 4,5 × 5 cm).

6.3. Isoelektrinen fokusointi

Säädetään jäähdyttävä termostaatti 12 °C:seen. Pyyhkäistään geelin kantaja-arkin kääntöpuoli petrolilla, tipautetaan sitten muutama pisara petrolia (4.2) jäähdytyslohkon keskelle. Sen jälkeen geeli-sandwich levitetään kantajapuoli alaspäin lohkon päälle siten, ettei muodostu kuplia. Pyyhkäistään ylimääräinen petroli pois ja poistetaan peitearkki. Imeytetään elektrodinauhoihin elektrodiliuoksia (4.3, 4.4), leikataan geelin pituisiksi ja asetetaan asianmukaisille paikoille (elektrodien etäisyys 9,5 cm).

Isoelektrisen fokusoinnin olosuhteet:

6.3.1 Geelikoko 265 × 125 × 0,25 mm

Vaihe Aika (min) Jännite (V) Sähkövirta (mA) Teho (W) Volttituntia (Vh) 1. Esifokusointi 30 enintään 2 500 enintään 15 vak. 4 noin 300 2. Näytteen fokusointi (7) 60 enintään 2 500 enintään 15 vak. 4 noin 1 000 3. Lopullinen fokusointi 60 enintään 2 500 enintään 5 enintään 20 noin 3 000 40 enintään 2 500 enintään 6 enintään 20 noin 3 000 30 enintään 2 500 enintään 7 enintään 25 noin 3 000

Huomautus: Jos geelien paksuutta tai leveyttä muutetaan, sähkövirran ja tehon arvoja on säädettävä sopivasti (esim. sähkövirran ja tehon arvot on kaksinkertaistettava, jos käytetään 265 mm × 125 mm × 0,5 mm geeliä).

6.3.2 Esimerkki automaattisen elektroforeesilaitteen jänniteohjelmasta (2 kooltaan 5,0 × 4,5 cm geeliä); elektrodit asetetaan suoraan geeliin ilman liuskoja.

Vaihe Jännite Sähkövirta Teho Lämpötila Volttituntia 1. Esifokusointi 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Näytteen fokusointi 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusointi 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusointi 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Asetetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 0 Vh.

Poistetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 30 Vh.

6.4 Proteiinien värjäys

6.4.1 Proteiinien kiinnitys

Poistetaan elektrodinauhat välittömästi voimanlähteen sammuttamisen jälkeen ja asetetaan geeli välittömästi värjäys/värinpoistoastiaan, joka on täytetty 200 ml:lla kiinnitysainetta (4.9); jätetään 15 minuutiksi, jatkuvasti ravistellen.

6.4.2 Geelilevyn pesu ja värjäys

Valutetaan kiinnitysaine huolellisesti pois ja pestään geelilevy kahdesti, 30 sekuntia kummallakin kerralla, 100 ml:lla värinpoistoliuosta (4.10). Kaadetaan värinpoistoliuos pois ja täytetään astia 250 ml:lla värjäysliuosta (4.11.3); annetaan värjäytyä 45 minuuttia kevyesti ravistellen.

6.4.3 Geelilevyn värinpoisto

Kaadetaan värjäysliuos pois, pestään geelilevy kahdesti käyttäen 100 ml värinpoistoliuosta (4.10) kummallakin kerralla, ravistellaan sitten 15 minuutin ajan 200 ml:ssa värinpoistoliuosta ja toistetaan värinpoistovaihe vähintään 2 tai 3 kertaa, kunnes tausta on kirkas ja väritön. Huuhdellaan geelilevy sen jälkeen tislatulla vedellä (2 × 2 min.) ja kuivataan ilmassa (2–3 tuntia) tai hiustenkuivaajalla (10–15 min.).

Huomautus 1: Kiinnitys, pesu, värjäys ja värinpoisto on tehtävä 20 °C:ssa. Korkeampia lämpötiloja ei saa käyttää.

Huomautus 2: Jos herkempää hopeavärjäystä (esim. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code N:o 17–1150–01) pidetään parempana, plasmiinilla käsitellyt kaseiininäytteet on laimennettava 5 mg/ml:ksi.

7. ARVIOINTI

Arviointi suoritetaan vertaamalla tuntemattoman näytteen proteiinikuviota vertailustandardeihin samassa geelissä. Lehmänmaidon toteaminen lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidosta sekä lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksesta valmistetuissa juustoissa tapahtuu sellaisten γ3- ja γ2-kaseiinien välityksellä, joiden isoelektriset pisteet vaihtelevat välillä pH 6,5–7,5 (kuvat 4 a ja 4 b, kuva 5). Toteamisraja on alle 0,5 %.

7.1 Silmämääräinen arviointi

Naudanmaidon määrän arvioimiseksi silmämääräisesti on suositeltavaa säätää näytteiden ja standardien pitoisuudet samantasoisten väri-intensiteettien saamiseksi lampaan, vuohen ja/tai puhvelin γ3- ja γ2-kaseiineille (ks. ”γ2 E,G,B” ja ”γ3 E,G,B” kuvissa 4 a, 4 b ja 5). Naudanmaidon määrä (vähemmän kuin, yhtä paljon kuin tai enemmän kuin 1 %) tuntemattomassa näytteessä voidaan todeta suoraan vertaamalla naudan γ3- ja γ2-kaseiinien isoelektrisessä fokusoinnissa saadun värin intensiteettiä (ks. ”γ3 C” ja ”γ2 C” kuvissa 4 a, 4 b ja 5) vastaaviin 0 %:n ja 1 %:n vertailustandardeihin (lammas, vuohi) tai laboratorion välistandardeihin (puhveli).

7.2 Tiheysmittaukseen perustuva arviointi

Jos mahdollista, käytetään tiheysmittaria (5.19) naudan γ3- ja γ2-kaseiinien piikkien pinta-alojen määrittämiseksi suhteessa lampaan, vuohen ja/tai puhvelin vastaaviin (ks. kuva 5). Tätä arvoa verrataan 1 %:n vertailustandardin (lammas, vuohi) tai laboratorion välistandardin (puhveli) γ3- ja γ2-kaseiinipiikkien pinta-alan suhteeseen, kun analysointi on suoritettu samassa geelissä.

Huomautus: Menetelmä toimii tyydyttävästi, jos 1 %:n vertailustandardissa esiintyy selvä positiivinen merkki sekä naudan γ3- että γ2-kaseiineista, muttei merkkejä 0 %:n vertailustandardeissa. Jos näin ei ole, menettelyä on parannettava noudattamalla täsmällisesti menetelmän yksityiskohtia.

Näyte todetaan positiiviseksi, jos naudan sekä γ3- että γ2-kaseiinien tai vastaavien piikkien pinta-alojen suhteet ovat yhtä suuret tai suuremmat kuin 1 %:n vertailustandardin taso.

8. VIITTEET

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Kuva 1

Kuva peitearkista

Kuva 2

Vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä kelluva kaseiinikerros sentrifugoinnin jälkeen

Kuva 3

Sulkemistekniikka erittäin ohuiden polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi

a = väliketeippi (0,25 mm); b = peitearkki (5.3); c, e = lasilevyt (5.1); d = geeliliuos (4.1.2); f = geelin kantaja-arkki (5.2)

Kuva 4 a

Lampaan- ja vuohenmaidosta valmistetun, eri määriä lehmänmaitoa sisältävän juuston plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi

% CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, C = lehmä, E = lammas, G = vuohi.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin ylempi puolisko.

Kuva 4 b

Lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetun, eri määriä lehmänmaitoa sisältävän juuston plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi

% CM = lehmänmaidon prosenttiosuus; 1 + = näyte, joka sisältää 1 % lehmänmaitoa ja johon on lisätty puhdasta naudan kaseiinia linjan keskellä. C = lehmä, E = lammas; G = vuohi, B = puhveli.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin koko erotusetäisyys.

Kuvio 5

Standardin (STD) sekä lampaan- ja vuohenmaidon seoksesta valmistetun juuston näytteiden densitogrammit päällekkäin asetettuna isoelektrisen fokusoinnin jälkeen

a, b = standardit, jotka sisältävät 0 ja 1 % lehmänmaitoa; c–g = juustonäytteet, jotka sisältävät 0, 1, 2, 3 ja 7 % lehmänmaitoa. C = lehmä, E = lammas, G = vuohi.

Ylempi puolisko IEF-geelistä tutkittiin aallonpituudella λ = 634 nm.