10)

Lisätään luvut C.27, C.28, C.29 ja C.30: ”C.27 MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SEDIMENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN SEDIMENTTIÄ, JOHON TUTKITTAVAA AINETTA ON LISÄTTY JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 218 (2004). Tällä testimenetelmällä on tarkoitus arvioida pitkäaikaisen kemikaalialtistuksen vaikutuksia makean veden kaksisiipisen Chironomus-lajin (surviaissääsken) toukkiin, jotka elävät sedimentissä. Menetelmä perustuu Chironomus riparius- ja Chironomus tentans -toksisuustestimenettelyihin, jotka on kehitetty Euroopassa (1)(2)(3) ja Pohjois-Amerikassa (4)(5)(6)(7)(8) ja vahvistettu yhteistutkimuksissa (ring-test) (1)(6)(9). Myös muita hyvin dokumentoituja chironomid-lajeja, kuten Chironomus yoshimatsui (10)(11), voidaan käyttää. 2. Tässä testimenetelmässä altistus tapahtuu lisäämällä sedimenttiin testiainetta. Soveltuvan altistuksen valinta määräytyy testin sovellustarkoituksen mukaan. Testiaineen lisäämisellä sedimenttiin on tarkoitus simuloida kemikaalin pysyvää kertymää sedimenttiin. Tässä altistusjärjestelmässä tutkittavaa ainetta lisätään vesi-sedimenttisysteemin sedimenttiin. 3. Aineet, joita sedimentissä elävillä eliöillä testataan, säilyvät yleensä sedimentissä pitkään. Sedimentissä elävien eliöiden altistamiseen voidaan käyttää useita reittejä. Jokaisen altistusreitin suhteellinen tärkeys sekä toksiseen kokonaisvaikutukseen vaadittava aika määräytyvät käytettävän kemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Jos kyseessä on voimakkaasti adsorboiva aine (esim. log Kow > 5) tai aine, joka sitoutuu kovalenttisesti sedimenttiin, kontaminoituneen ravinnon nauttiminen voi olla tärkeä altistusreitti. Jotta hyvin rasvahakuisten aineiden myrkyllisyyttä ei aliarvioida, voidaan harkita ravinnon lisäämistä sedimenttiin ennen testiaineen lisäämistä. Jotta kaikki mahdolliset altistusreitit voidaan huomioida, tämä testimenetelmä keskittyy pitkäaikaiseen altistukseen. Testin kesto on 20–28 päivää C. riparius- ja C. yoshimatsui -lajeille ja 28–65 päivää C. tentans -lajille. Jos lyhytaikaisia tietoja tarvitaan tiettyyn tarkoitukseen, kuten epävakaan kemikaalin vaikutusten tutkimiseen, ylimääräiset rinnakkaisnäytteet voidaan poistaa 10 päivän jälkeen. 4. Mitatut tutkittavat ominaisuudet ovat kuoriutuneiden täysikasvuisten kokonaismäärä ja kuoriutumiseen kulunut aika. Jos lyhytaikaiset lisätiedot ovat tarpeen, toukkien eloonjäämistä ja kasvua on suositeltavaa mitata vasta kymmenen päivän kuluttua käyttämällä ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä. 5. Synteettisen sedimentin käyttö on suositeltavaa. Synteettisellä sedimentillä on useita etuja luonnolliseen sedimenttiin verrattuna: — kokeellinen vaihtelu vähenee, koska sedimentti on toistettava ”vakiomatriisi”, eikä kontaminoitumattomia ja puhtaita sedimenttilähteitä tarvitse etsiä — testit voidaan aloittaa milloin tahansa ilman, että testisedimentin kausivaihtelua esiintyy, sedimentistä ei tarvitse poistaa alkuperäiselimistöä esikäsittelyllä ja lisäksi synteettisen sedimentin käyttö pienentää kuluja, joita rutiinitestaukseen tarvittavan sedimenttimäärän keräämisestä kentältä syntyy — synteettisen sedimentin käyttö sallii toksisuuden vertailun ja aineiden lajittelemisen myrkyllisyyden mukaan. 6. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 7. Surviaissääsken munatoukat altistetaan testikemikaalin pitoisuusalueelle vesi-sedimenttisysteemeissä. Testiainetta lisätään sedimenttiin, ja munatoukat siirretään dekantterilaseihin, joissa sedimentin ja veden pitoisuudet on stabiloitu. Surviaissääskien kuoriutumisaste ja kehittymisnopeus mitataan testin lopussa. Toukkien eloonjäänti ja paino voidaan myös tarvittaessa mitata 10 päivän kuluttua (käytättämällä soveltuvia ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä). Nämä tiedot analysoidaan regressiomallilla, jolla arvioidaan pitoisuus, joka aiheuttaa X prosentin laskun kuoriutumisessa tai toukkien eloonjäännissä tai painossa (esim. EC15, EC50), tai tilastollisen hypoteesin testillä, jolla määritetään NOEC/LOEC. Jälkimmäinen vaihtoehto edellyttää vaikutusarvojen vertaamista vertailuarvoihin tilastotutkimuksilla. TESTIAINETTA KOSKEVIA TIETOJA 8. Testiaineen vesiliukoisuuden, höyrynpaineen, mitatun tai lasketun erottumisen erottuminen sedimenttiin sekä stabiiliuden vedessä ja sedimentissä on oltava tiedossa. Käytössä on oltava luotettava analyysimenetelmä, jolla testiaine voidaan kvantifioida sedimentin päällä olevassa vedessä, huokosvedessä ja sedimentissä, ja menetelmän tarkkuus ja havaitsemisraja tunnetaan ja ne on raportoitu. Hyödyllisiä tietoja ovat esimerkiksi rakennekaava ja testiaineen puhtaus. Myös testiaineen kemiallinen kohtalo (esim. häviäminen, abioottinen ja bioottinen hajoaminen) on hyödyllistä tietää. Kirjallisuusviitteessä (12) annetaan lisäohjeita sellaisten aineiden testauksesta, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista. VERTAILUKEMIKAALIT 9. Testimenettelyn ja testiolosuhteiden luotettavuus voidaan tarkistaa testaamalla ajoittain vertailukemikaaleja. Esimerkkejä vertailumyrkyistä, joita on käytetty onnistuneesti yhteistutkimuksissa ja validointitutkimuksissa: lindaani, trifluraliini, pentakloorifenoli, kadmiumkloridi ja kaliumkloridi (1)(2)(5)(6)(13). TESTIN LUOTETTAVUUS 10. Testi on luotettava, jos — kuoriutuvuus kontrolleissa on vähintään 70 prosenttia testin lopussa (1)(6) — C. riparius ja C. yoshimatsui aikuistuvat kontrolliastioissa 12–23 päivän kuluessa astiaan laittamisesta. C. tentans vaatii 20–65 päivää — testin lopussa mitataan jokaisen astian pH ja liuenneen hapen pitoisuus. Happipitoisuuden täytyy olla vähintään 60 prosenttia ilman kyllästysarvosta (ASV) käytetyssä lämpötilassa, ja sedimentin päällä olevan veden pH-arvon pitää olla 6–9 kaikissa testiastioissa — veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,0 °C. Veden lämpötilaa voidaan kontrolloida tasalämpöisessä huoneessa, jolloin huoneen lämpötila on tarkistettava soveliain väliajoin. MENETELMÄN KUVAUS Testiastiat 11. Tutkimus tehdään 600 ml:n dekantterilaseissa, joiden halkaisija on 8 cm. Muitakin astioita voidaan käyttää, kunhan sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys on sopiva. Sedimentin pinta-alan on oltava riittävä, jotta tilaa on 2–3 cm2 toukkaa kohden. Sedimenttikerroksen ja sen päällä olevan veden syvyyden suhteen on oltava 1:4. Testiastioiden ja muiden testijärjestelmän kanssa kosketuksissa olevien välineiden on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia (esim. teflonia). Lajin valinta 12. Paras laji tähän testiin on Chironomus riparius. Chironomus tentans soveltuu myös, mutta sen käsittely on hankalampaa ja se edellyttää pidempää testijaksoa. Myös Chironomus yohimatsui -lajia voidaan käyttää. Tietoa Chironomus riparius -lajin kasvatusmenetelmistä on lisäyksessä 2. Myös muiden lajien kasvatusolosuhteista on saatavissa tietoa: Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Lajin tunnistus on varmistettava ennen testiä, mutta sitä ei ole tarpeen tehdä ennen joka testiä, jos eliöt ovat peräisin omasta kasvattamosta. Sedimentti 13. Synteettisen sedimentin (keinosedimentin) käyttö on suositeltavaa. Jos kuitenkin käytetään luonnollista sedimenttiä, se on kuvailtava (vähintään pH, orgaaninen kokonaishiilipitoisuus, mutta myös muut parametrit, kuten C/N-suhde ja rakeisuus ovat suositeltavia), eikä siinä saa olla kontaminaatiota tai muita organismeja, jotka saattavat kilpailla chironomid-eliöiden kanssa tai syödä ne. Lisäksi on suositeltavaa, että luonnollista sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Tätä testiä varten suositellaan seuraavaa synteettistä sedimenttiä, joka perustuu testimenetelmässä C.8 (14) käytettyyn keinomaahan (1)(15)(16): a) 4–5 % (kuivapaino) turvetta: pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0; on tärkeää käyttää ainoastaan ilmakuivattua jauhemaista turvetta, joka on jauhettu hienoksi (hiukkaskoko ≤ 1 mm) b) 20 % (kuivapaino) kaoliniittisavea (kaoliniitin osuus mieluiten yli 30 %) c) 75–76 % (kuivapaino) kvartsihiekkaa (pääosin hienoa hiekkaa, yli 50 prosenttia 50–200 μm:n hiukkasia) d) deionisoitua vettä lisätään, kunnes lopullisen seoksen kosteus on 30-50 % e) kemiallisesti puhdasta kalsiumkarbonaattia (CaCO3) lisätään, jotta lopullisen sedimenttiseoksen pH-arvoksi tulee 7,0 ± 0,5 orgaanisen hiilen pitoisuuden on oltava lopullisessa seoksessa 2 % (± 0,5 %). Sitä voidaan säätää lisäämällä sopiva määrä turvetta ja hiekkaa kohtien a) ja c) mukaisesti. 14. Turpeen, kaoliniittisaven ja hiekan alkuperän on oltava tiedossa. Tarkista, ettei sedimentin ainesosissa ole kemikaalista kontaminaatiota (esim. raskasmetalleja, orgaanisia klooriyhdisteitä ja orgaanisia fosforiyhdisteitä). Esimerkki synteettisen sedimentin valmistuksesta on lisäyksessä 3. Myös kuivien ainesosien sekoittaminen on hyväksyttävää, jos voidaan osoittaa, että sedimentin ainesosat eivät erotu (esim. kelluvia turvehiukkasia) veden lisäämisen jälkeen ja että turve tai sedimentti on sopeutunut tarpeeksi. Vesi 15. Testivedeksi soveltuu vesi, joka täyttää lisäyksissä 2 ja 4 luetellut laimennusveden kemialliset ominaisuudet. Kasvatus- ja testivedeksi soveltuu mikä tahansa vesi, luonnonvesi (pinta- tai pohjavesi), synteettinen vesi (katso lisäys 2) tai talousvesi, josta on poistettu kloori, jos surviaissääsket voivat elää siinä viljelyn ja testauksen ajan osoittamatta stressaantumisen merkkejä. Testiveden pH-arvon on oltava testin alussa 6–9, eikä kokonaiskovuus CaCO3:na saa olla yli 400 mg/l. Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäillään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä pehmeämpää vettä (tässä tapauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä). Samantyyppistä vettä on käytettävä koko tutkimuksen ajan. Lisäyksessä 4 luetellut vedenlaadun ominaisuudet on mitattava vähintään kahdesti vuodessa tai aina kun on epäilystä siitä, että nämä ominaisuudet ovat voineet muuttua merkittävästi. Kantaliuokset – sedimentit, joihin on lisätty testiainetta 16. Sedimentit, joiden pitoisuus on haluttu, valmistetaan yleensä lisäämällä testiaineliuosta suoraan sedimenttiin. Testiaineen kantaliuos, joka on liuotettu deionisoituun veteen, sekoitetaan synteettiseen sedimenttiin valssauskoneella, sekoittimella tai käsin. Jos testiaine liukenee huonosti veteen, se voidaan liuottaa käyttämällä pienintä mahdollista määrää soveltuvaa orgaanista liuotinta (esim. heksaania, asetonia tai kloroformia). Seuraavaksi liuokseen sekoitetaan 10 g hienoa kvartsihiekkaa yhtä testiastiaa kohden. Sen jälkeen liuottimen annetaan haihtua. Sitä ei saa jäädä hiekkaan yhtään. Seuraavaksi hiekkaan sekoitetaan sopiva määrä sedimenttiä jokaista dekantterilasia varten. Testiaineen liuottamiseen, dispergoimiseen tai emulgointiin saa käyttää vain helposti haihtuvia aineita. On pidettävä mielessä, että testiaineen ja hiekkaseoksen mukana tuleva hiekka on otettava huomioon sedimentin valmistuksessa (eli sedimentin valmistukseen on käytettävä pienempi määrä hiekkaa). Varmista huolellisesti, että sedimenttiin lisättävä testiaine sekoittuu sedimenttiin hyvin ja tasaisesti. Homogeenisuusasteen voi määrittää tarvittaessa analysoimalla osanäytteitä. TESTISUUNNITELMA 17. ”Testisuunnitelma” tarkoittaa testipitoisuuksien lukumäärän ja pitoisuusvälien valintaa, astioiden lukumäärää kutakin pitoisuutta kohti ja toukkien lukumäärää astiaa kohti. Suunnitelmat EC-pisteen arviointia, NOEC:n määritystä ja rajatestin tekemistä varten on kuvattu. Regressioanalyysille suositeltava testisuunnitelma 18. Testissä käytettävien pitoisuuksien on katettava vaikutuspitoisuus (esim. EC15, EC50) ja se pitoisuusalue, joka on merkityksellinen kyseisen testiaineen kannalta.Tarkkuus ja etenkin luotettavuus, jolla vaikutuspitoisuuksien (ECx) estimaatit voidaan tehdä, paranee yleensä, kun vaikutuspitoisuus sijoittuu testattujen pitoisuuksien alueelle. Ekstrapolointia paljon matalimman positiivisen pitoisuuden alle tai korkeimman pitoisuuden ylle on vältettävä. Alustava pitoisuusalueen määrittely voi auttaa sopivien testipitoisuuksien valinnassa (katso kohta 27). 19. Jos halutaan arvioida ECx, jokaisesta pitoisuudesta tarvitaan vähintään viisi testipitoisuutta ja kolme rinnakkaisnäytettä. On joka tapauksessa suositeltavaa käyttää riittäviä testipitoisuuksia, jotta mallin estimointi onnistuu hyvin. Pitoisuuksien välinen kerroin ei saa olla yli kaksi (poikkeus voidaan tehdä, jos annosvastekäyrä on loiva). Käsittelyssä käytettävien toistojen määrää voidaan laskea, jos eri vasteita aiheuttavien testipitoisuuksien määrää nostetaan. Jos toistojen määrää lisätään tai testipitoisuuden välejä pienennetään, testin luottamusväli yleensä kapenee. Toistoja tarvitaan lisää, jos halutaan arvioida toukkien eloonjäänti ja kasvu 10 päivän aikana. NOEC:n/LOEC:n estimointiin suositeltava testisuunnitelma 20. Jos halutaan arvioida LOEC tai NOEC, on käytettävä vähintään viittä testipitoisuutta ja vähintään neljää rinnakkaisnäytettä, eikä pitoisuuksien välinen kerroin saa olla yli kaksi. Rinnakkaisnäytteiden määrän on oltava riittävän suuri, jotta tilastollinen voima on riittävä ja kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Kehittymisnopeuteen soveltuu yleensä varianssianalyysi (ANOVA), kuten Dunnett-testi ja Williams-testi (17)(18)(19)(20). Kuoriutumisasteeseen voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferronin korjauksella) tai Mantel-Haenszelin testiä. Rajatesti 21. Rajatesti (yksi testipitoisuus ja kontrolli) voidaan tehdä, jos alustavassa pitoisuusalueen määrityksessä ei havaittu vaikutuksia. Rajatestin tarkoituksena on tehdä testi riittävän suurella pitoisuudella, jotta päättäjät voivat sulkea pois testiaineen mahdolliset toksiset vaikutukset, ja raja asetetaan pitoisuuteen, jota ei odoteta esiintyvän missään tilanteessa. Suositeltava arvo on 1 000 mg/kg (kuivapaino). Yleensä vähintään kuusi rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kontrollinäytteestä on tarpeen. On osoitettava, että tilastollinen voima on riittävä, jotta kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Jos vaste on metrinen (kehittymisnopeus ja paino), t-testi on soveltuva tilastollinen menetelmä, jos tiedot täyttävät tämän testin vaatimukset (normaalisuus, homogeeniset vaihtelut). Jos vaatimukset eivät täyty, voidaan käyttää t-testiä, jossa varianssit ovat heterogeenisia, tai parametritonta testiä, kuten Wilcoxon-Mann-Whitheyn testiä. Fisherin tarkka testi soveltuu kuoriutumisasteeseen. MENETTELY Altistumisolosuhteet Vesi-sedimenttisysteemin valmistelu käyttäen sedimenttiä, johon tutkittavaa ainetta on lisätty 22. Testimenetelmässä C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla kuvattu lisäysmenetelmä on suositeltava tapa lisätä testiainetta (14). Sedimentit, joihin testiaine on lisätty, asetetaan astioihin ja niiden päälle lisätään vettä, kunnes sedimentin ja veden tilavuussuhde on 1:4 (katso kohdat 11 ja 15). Sedimenttikerroksen syvyyden on oltava 1,5–3 cm. Sedimentin voi peittää muovikiekolla, kun testivettä lisätään vesipatsaaseen, jotta sedimentin ainesosien erottuminen ja hienon materiaalin resuspensio voidaan välttää, mutta kiekko on poistettava heti tämän jälkeen. Myös muut välineet voivat olla sopivia. 23. Testiastiat on peitettävä (esim. lasilevyillä). Jos vettä haihtuu tutkimuksen aikana, lisää vettä, kunnes veden tilavuus on alkuperäisellä tasolla. Käytä tähän tarkoitukseen tislattua tai deionisoitua vettä, jotta suoloja ei keräydy. Stabilointi 24. Kun sedimenttiin on lisätty testiaine ja sedimentin yläpuolelle on lisätty vesi, testiaineen on hyvä antaa erottua vesifaasista sedimenttiin (3)(4)(6)(13). Tämä on suositeltavaa tehdä samassa lämpötilassa ja ilmastuksessa, joita testissä käytetään. Sopiva tasapainottumisaika määräytyy sedimentin ja kemikaalin mukaan, ja se voi vaihdella tunneista päiviin tai harvinaisissa tapauksissa jopa viikkoihin (4–5 viikkoa). Koska monet kemikaalit voisivat hajota tässä ajassa, tasapainotilaa ei jäädä odottamaan, vaan tasapainottumisajaksi suositellaan 48 tuntia. Tämän tasapainottumisajan jälkeen testiaineen pitoisuus on mitattava sedimentin yläpuolisessa vedessä, huokosvedessä ja sedimentissä vähintään suurimmassa pitoisuudessa ja alemmassa pitoisuudessa (katso kohta 38). Näiden testiaineen analyyttisten määritysten perusteella voidaan laskea massatase, ja tulokset voidaan ilmoittaa mitattujen pitoisuuksien pohjalta. Testiorganismien lisääminen 25. Neljä tai viisi päivää ennen testiorganismien lisäämistä munamassat otetaan viljelmistä ja pannaan pieniin astioihin kasvatusalustassa. Alustana voidaan käyttää kantaliuoksesta saatua kypsynyttä alustaa tai vasta valmistettua alustaa. Jälkimmäisessä tapauksessa kasvatusalustaan lisätään pieni määrä ravintoa, kuten viherlevää ja/tai muutama pisara hienoksi jauhetuista kalanruokahiutaleista saatua suodosta (katso lisäys 2). Käytä ainoastaan vastamunittuja munamassoja. Tavallisesti toukat alkavat kuoriutua muutama päivä munimisen jälkeen (Chironomus riparius 2–3 vrk lämpötilassa 20 °C, Chironomus tentans 1–4 vrk lämpötilassa 23 °C ja Chironomus yoshimatui 1–4 vrk lämpötilassa 25 °C), ja toukkien kasvu tapahtuu neljässä vaiheessa, joista jokainen kestää 4–8 päivää. Testissä käytetään ensimmäisen kehitysvaiheen munatoukkia (2–3 tai 1–4 vrk kuoriutumisen jälkeen). Sääskien kehitysvaiheen voi tarkistaa pääkapselin leveydestä (6). 26. Kaksikymmentä munatoukkaa sijoitetaan satunnaisesti tylpällä pipetillä jokaiseen testiastiaan, jossa on testiainetta sisältävää sedimenttiä ja vettä. Veden ilmastus on lopetettava, kun toukkia lisätään testiastioihin eikä sitä saa aloittaa 24 tuntiin toukkien lisäämisen jälkeen (katso kohdat 25 ja 32). Käytetyn testisuunnitelman (katso kohdat 19 ja 20) mukaisesti toukkien määrä pitoisuutta kohti on vähintään 60 EC-pisteen arviointia varten ja 80 NOEC-määritystä varten. Testipitoisuudet 27. Raja-annostesti voi auttaa määrittämään pitoisuusaluetta varsinaista testiä varten. Tähän tarkoitukseen käytetään testiaineen pitoisuuksia laajoin pitoisuusvälein. Jotta surviaissääskien pintatiheys on sama, jota käytetään varsinaisessa testissä, surviaissääsket altistetaan jokaiselle testiaineen pitoisuudelle siksi aikaa, että sopivat testipitoisuudet voidaan arvioida. Rinnakkaisnäytteitä ei tarvita. 28. Varsinaisessa testissä käytettävät testipitoisuudet päätetään raja-annostestin perusteella. Käytössä on oltava vähintään viisi pitoisuutta, jotka valitaan kohdissa 18 ja 20 kuvatulla tavalla. Kontrollit 29. Testissä on käytettävä kontrolliastioita, joissa on sedimenttiä mutta ei testiainetta, ja soveltuvaa määrää rinnakkaisnäytteitä (katso kohdat 19–20). Jos testiaineen lisäyksessä on käytetty liuotinta (katso kohta 16), sedimentin liuotinkontrolli on lisättävä. Testijärjestelmä 30. Käytettävät järjestelmät ovat staattisia. Puolistaattisia tai läpivirtausjärjestelmiä, joissa sedimentin yläpuolinen vesi uusiutuu ajoittain tai jatkuvasti, voidaan käyttää poikkeustapauksissa, kuten jos vedenlaatu ei sovellu testiorganismille tai vaikuttaa kemialliseen tasapainoon (esim. liuenneen hapen pitoisuus laskee liian matalaksi, eritystuotteiden pitoisuus nousee liian korkeaksi tai sedimentistä uuttuu mineraaleja, jotka vaikuttavat pH-arvoon ja/tai veden kovuuteen). Yleensä muut sedimentin päällä olevan veden laatua kohentavat toimet, kuten ilmastus, ovat kuitenkin riittäviä ja suositeltavia. Ravinto 31. Toukkia on ruokittava mieluiten päivittäin tai vähintään kolmesti viikossa. Riittävä määrä kalanruokaa (suspensiona vedessä tai hienoksi jauhettuna, esim. TetraMin tai TetraPhyll, lisätietoja lisäyksessä 2) on 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg C. yoshimatui -lajille) päivässä toukkaa kohden ensimmäisten 10 päivän aikana. Tätä vanhemmat toukat voivat tarvita vähän enemmän ruokaa: 0,5–1 mg päivässä toukkaa kohden pitäisi riittää testin loppuun saakka. Ravinnon määrää täytyy pienentää kaikissa käsittelyissä ja kontrolleissa, jos sienikasvua ilmenee tai kontrolleissa esiintyy kuolleisuutta. Jos sienikasvua ei saada loppumaan, testi on toistettava. Jos kyseessä on voimakkaasti adsorboiva aine (esim. log Kow > 5) tai aine, joka sitoutuu kovalenttisesti sedimenttiin, organismien eloonjääntiin ja luontaiseen kasvuun tarvittava ravinnon määrä voidaan lisätä synteettiseen sedimenttiin ennen stabiloitumisvaihetta. Tässä tapauksessa on käytettävä kalanruoan sijaan kasviainesta, kuten 0,5 prosenttia (kuivapaino) nokkosen (Urtica dioica), valkomulperin (Morus alba), valkoapilan (Trifolium repens), pinaatin (Spinacia oleracea) tai muun kasviaineksen (Cerophyl tai alfaselluloosa) hienoksi jauhettuja lehtiä. Inkubaatio-olosuhteet 32. Sedimentin päällä olevaa vettä aletaan ilmastaa varovasti mieluiten 24 tuntia toukkien lisäämisen jälkeen, ja ilmastusta jatketaan testin loppuun saakka (on pidettävä huoli, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske alle 60 prosenttiin ilman kyllästysarvosta). Ilmastus tapahtuu lasisella Pasteur-pipetillä, joka on kiinnitetty 2–3 senttiä sedimenttikerroksen yläpuolelle (yksi tai muutama kupla sekunnissa). Haihtuvia kemikaaleja testattaessa voidaan harkita, jätetäänkö vesi-sedimenttisysteemi ilmastamatta. 33. Testi tehdään vakiolämpötilassa 20 °C (± 2 °C). Suositeltu lämpötila C. tentans -lajille on 23 °C (± 2 °C) ja C. yoshimatui -lajille 25 °C (± 2 °C). Valoisa aika on 16 tuntia, ja valon voimakkuuden pitää olla 500–1 000 luksia. Altistuksen kesto 34. Altistus alkaa, kun toukat lisätään astioihin, joissa on testiainetta, ja kontrolliastioihin. Altistuksen enimmäiskesto on 28 vuorokautta lajeille C. riparius ja C. yoshimatsui, ja 65 vuorokautta lajille C. tentans. Jos sääsket kuoriutuvat aikaisemmin, testi voidaan lopettaa vähintään viisi päivää sen jälkeen, kun viimeinen surviaissääski on kasvanut täysikasvuiseksi kontrollissa. Havainnot Kuoriutuminen 35. Kehitysaika ja täysin kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien yhteismäärä määritetään. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista. 36. Testiastioita on tarkkailtava vähintään kolmesti viikossa ja epänormaalia käyttäytymistä on arvioitava silmämääräisesti (esim. sedimentistä poistuminen, epätavallinen uinti) kontrolliin verrattuna. Sääsket on laskettava päivittäin, kun kuoriutuminen on odotettavissa. Täysikasvuisten sääskien sukupuoli ja lukumäärä kirjataan päivittäin. Tunnistuksen jälkeen sääsket poistetaan astioista. Ennen testin loppua mahdollisesti munitut munamassat on kirjattava ylös ja poistettava, jottei sedimenttiin tule lisää toukkia. Myös niiden näkyvissä olevien koteloiden määrä, jotka eivät ole kuoriutuneet, on merkittävä ylös. Kuoriutumisen mittausohjeet ovat lisäyksessä 5. Kasvu ja eloonjäänti 37. Jos tiedot 10 vuorokauden toukkien eloonjäännistä ja kasvusta tarvitaan, testin alussa on otettava käyttöön ylimääräisiä testiastioita myöhempää käyttöä varten. Toukat seulotaan ylimääräisten astioiden sedimentistä 250 μm:n seulalla. Kuolleiksi lasketaan toukat, jotka eivät liiku tai reagoi mekaanisiin ärsykkeisiin. Myös ne toukat, joita ei otettu talteen, lasketaan kuolleiksi (mikrobit ovat saattaneet hajottaa testin alussa kuolleet toukat). Eloonjääneiden toukkien (tuhkaton) kuivapaino testiastiaa kohden määritetään ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiassa lasketaan. On hyödyllistä määrittää, missä kehitysvaiheessa eloonjääneet toukat ovat. Tähän tarkoitukseen voidaan mitata kunkin toukan pääkapselin leveys. Mittaukset Testiaineen pitoisuus 38. Ennen testin aloittamista (eli toukkien lisäämistä) otetaan sedimenttinäytteet (bulk) vähintään yhdestä astiasta käsittelyä kohden, jotta testiaineen pitoisuus sedimentissä voidaan määrittää. On suositeltavaa, että vähintään yläpuolisen veden, huokosveden ja sedimentin näytteet analysoidaan testin alussa (katso kohta 24) ja lopussa suurimmassa pitoisuudessa ja matalammassa pitoisuudessa. Testiaineen pitoisuudesta saadaan tietoa testiaineen käyttäytymisestä ja jakautumisesta vesi-sedimenttisysteemissä. 39. Jos välimittauksia tehdään (esim. päivänä 7) ja analyysiin tarvitaan suuria näytteitä, joiden ottaminen testiastioista vaikuttaisi testijärjestelmään, analyyttisiin määrityksiin käytetään ylimääräisistä testiastioista otettuja näytteitä. Näitä astioita käsitellään samalla tavoin kuin testiastioita (mukaan lukien testiorganismien lisääminen), mutta niitä ei käytetä biologiseen havainnointiin. 40. Huokosveden suositeltava eristystapa on sentrifugointi (esim. 10 000 g ja 4 °C 30 minuutin ajan). Jos on kuitenkin osoitettu, että testiaine ei adsorboidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää. Joskus pitoisuuksien analysointi huokosvedestä ei ole mahdollista, koska näyte on liian pieni. Fysikaalis-kemialliset parametrit 41. Testiastioiden pH ja lämpötila on mitattava asiaankuuluvasti (katso kohta 10). Kovuus ja ammoniakki on mitattava kontrolliastioissa ja yhdessä testiastiassa suurimmalla pitoisuudella testin alussa ja lopussa. TIEDOT JA RAPORTOINTI Tulosten käsittely 42. Tämän testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutus uros- ja naarassääskien kehittymisnopeuteen ja täysin kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärään. 10 päivän testissä määritetään vaikutukset toukkien eloonjääntiin ja painoon. Jos eri sukupuolten herkkyydessä ei ilmene tilastollisesti merkitsevää eroa, urosten ja naaraiden tulokset voidaan yhdistää tilastollisia analyysejä varten. Sukupuolten väliset herkkyyserot voidaan määrittää tilastotieteellisesti esimerkiksi χ2-r × 2 -taulukkotestillä. Toukkien eloonjäänti ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden määritetään 10 päivän kuluttua, jos tarpeen. 43. Kuivapainoon perustuvat vaikutuspitoisuudet lasketaan mieluiten testin alussa mitattujen sedimenttipitoisuuksien perusteella (katso kohta 38). 44. EC50:n tai minkä tahansa muun ECx:n piste-estimaattia laskettaessa astiakohtaisia tilastotietoja voidaan käyttää aitoina toistoina. Laskettaessa minkä tahansa ECx-arvon luottamusväliä astioiden välinen vaihtelu on otettava huomioon tai vaihtoehtoisesti osoitettava vaihtelu niin pieneksi, että se voidaan jättää huomiotta. Jos malliin sovelletaan pienimmän neliösumman menetelmää, astiakohtaisiin tilastotietoihin on sovellettava muunnosta, jotta varianssin homogeenisuus paranee. ECx-arvot on kuitenkin laskettava sen jälkeen, kun vaste on muunnettu takaisin alkuperäisarvoon. 45. Kun NOEC/LOEC on tarkoitus määrittää tilastollisen hypoteesin testillä, astioiden välinen vaihtelu on huomioitava esimerkiksi hierarkkisella ANOVAlla. Robustimpia testejä (21) voidaan käyttää soveltuvissa tilanteissa, kun tavalliset ANOVAn oletukset eivät täyty. Kuoriutumisaste 46. Kuoriutumisasteet ovat dikotomisia tietoja, ja ne voidaan analysoida Cochran-Armitagen testillä, jota sovelletaan alaspäin askeltavasti, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa, ja näitä tietoja pidetään tämän odotuksen mukaisina. Jos näin ei ole, voidaan käyttää Fisherin tarkkaa testiä tai Mantel-Haenszelin testiä, jossa p-arvot on korjattu Bonferroni-Holmin menetelmällä. Jos on näyttöä siitä, että saman pitoisuuden toistojen välinen varianssi on suurempi kuin binomijakauma antaa edellyttää (ylihajonta), voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä tai Fisherin tarkkaa testiä (21). Kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa (ne) määritetään, ja summa jaetaan lisättyjen sääskien määrällä (na): jossa: ER = kuoriutumisaste ne = kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa na = astiaan lisättyjen toukkien määrä 47. Kun näytekoko on suuri ja ylihajontaa esiintyy, paras vaihtoehto on pitää kuoriutumisastetta jatkuvana vasteena ja käyttää esimerkiksi Williamsin testiä, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa ja yhdenmukainen kuoriutumisastetietojen kanssa. Dunnettin testi soveltuu, kun monotonisuutta ei esiinny. Näytekoko määritetään tässä suureksi, jos sekä kuoriutuneiden että kuoriutumattomien toukkien määrä on toistossa (astiassa) yli viisi. 48. Jos halutaan soveltaa ANOVA-menetelmiä, ER-arvot on ensin muunnettava arcsin-neliöjuuri-muunnoksella tai Tukey-Freemanin muunnoksella, jotta saadaan likimääräinen normaalijakauma ja varianssi tasoittuu. Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferroni) tai Mantel-Haenszelin testiä voidaan soveltaa, kun käytetään absoluuttisia frekvenssejä. Arcsin-neliöjuuri-muunnosta sovelletaan ottamalla kuoriutumisasteen neliöjuuren käänteinen sini (sin–1). 49. Kuoriutumisasteissa ECx-arvot lasketaan käyttämällä regressioanalyysiä (tai esim. probit- (22), logit- tai Weibull-mallia tai soveltuvaa kaupallista ohjelmistoa). Jos regressioanalyysi epäonnistuu (esim. osittaisia vasteita on alle kaksi), käytetään muita parametrittomia menetelmiä, kuten liukuvaa keskiarvoa tai yksinkertaista interpolaatiota. Kehittymisnopeus 50. Keskimääräinen kehittymisaika edustaa keskimääräistä ajanjaksoa toukkien lisäämisestä (testipäivä 0) kokeellisen sääskikohortin kuoriutumiseen. (Aidon kehittymisajan laskennassa on huomioitava toukkien ikä lisäyshetkellä.) Kehittymisnopeus on kehittymisajan käänteisluku (yksikkö: 1/vrk) ja edustaa päivässä tapahtuvaa toukkien kehittymistä. Kehittymisnopeuden käyttö on suositeltavaa näiden sedimentin toksisuuskokeiden arvioinnissa, sillä sen varianssi on pienempi ja se on homogeenisempi ja lähempänä normaalijakaumaa kuin kehittymisaika. Siksi tehokkaita parametritestimenetelmiä käytetään mieluummin kehittymisnopeuden kuin kehittymisajan kanssa. Kun kehittymisnopeus on jatkuva vaste, ECx-arvot voidaan estimoida regressioanalyysillä (esim. (23), (24)). 51. Seuraavissa tilastollisissa testeissä oletetaan, että tarkastuspäivänä × havaittu sääskimäärä kuoriutuu päivän x ja päivän x-l välissä (l = tarkastusvälin pituus, yleensä 1 päivä). Keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa (x) lasketaan seuraavasti: jossa: : keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa i : tarkastusvälin indeksi m : tarkastusvälien enimmäismäärä : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien määrä ne : testin lopussa kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärä (= ) xi : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien kehittymisnopeus jossa: dayi : tarkastuspäivä (päivää lisäyksen jälkeen) li : tarkastusvälin i pituus (päivissä, yleensä 1 päivä) Testiraportti 52. Testiraportin on sisällettävä vähintään seuraavat tiedot: Testiaine: — fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (vesiliukoisuus, höyrynpaine, jakaantumiskerroin maa-aineksessa (tai sedimentissä, jos saatavissa), stabiilisuus vedessä jne.) — kemialliset tunnistetiedot (yleisnimi, kemiallinen nimi, rakennekaava, CAS-numero jne.) sekä puhtaus ja testiaineen kvantifioinnissa käytetty analyysimenetelmä. Testilajit: — käytetyt koe-eläimet: lajit, tieteellinen nimi, eliöiden lähde ja kasvatusolosuhteet — tiedot munamassojen ja toukkien käsittelystä — koe-eläinten ikä testiastioihin lisättäessä. Testiolosuhteet: — käytetty sedimentti, eli luonnollinen vai synteettinen sedimentti — luonnollisen sedimentin osalta sedimentin näytteenottopaikan sijainti ja kuvaus, mukaan lukien, jos mahdollista, kontaminaatiohistoria, ominaisuudet: pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, C/N-suhde ja rakeisuus (tarvittaessa) — synteettisen sedimentin valmistus: ainesosat ja niiden ominaisuudet (orgaanisen hiilen pitoisuus, pH, kosteus jne. testin alussa) — testiveden valmistus (jos käytetään synteettistä vettä) ja ominaisuudet (happipitoisuus, pH, johtavuus, kovuus jne. testin alussa) — sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys — sedimentin päällä olevan veden ja huokosveden tilavuus, märän sedimentin paino huokosveden kanssa ja ilman huokosvettä — testiastiat (materiaali ja koko) — tapa, jolla testiaine lisättiin sedimenttiin: käytetyt pitoisuudet, toistojen määrä ja mahdollisen liuottimen käyttö — vesi-sedimenttisysteemin stabilointivaihe: kesto ja olosuhteet — inkubaatio-olosuhteet: lämpötila, valojakso ja valon voimakkuus, ilmastus (taajuus ja voimakkuus) — yksityiskohtaiset tiedot syöttämisestä, kuten ravinnon tyyppi, valmistus, määrä ja syöttöaikataulu. Tulokset: — kaikki nimelliset testipitoisuudet, mitatut testipitoisuudet ja tulokset kaikista analyyseistä, joilla määritettiin testiaineen pitoisuus testiastiassa — testiastioissa olevan veden laatu, eli pH, lämpötila, liuennut happi, kovuus ja ammoniakki — mahdollinen haihtuneen testiveden korvaus — kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien määrä astiassa päivää kohden — kuoriutumattomien toukkien määrä astiassa — toukkien keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden, kehitysasteittain jos tarpeen — kuoriutumisprosentti rinnakkaisnäytteessä ja testipitoisuudessa (uros- ja naarassääsket yhteensä) — täysin kuoriutuneiden sääskien keskimääräinen kehittymisnopeus rinnakkaisnäytteessä ja testissä (uros- ja naarassääsket yhteensä) — toksisten tutkittavien ominaisuuksien estimaatit, kuten ECx (ja siihen liittyvät luottamusvälit), NOEC ja/tai LOEC, ja niiden määrittämiseen käytetyt tilastolliset menetelmät — tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin. KIRJALLISUUSVIITTEET 1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8) US-EPA/OPPTS 850,1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14) Tämän liitteen testimenetelmä C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla. 15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. 18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. 19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. 20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. 21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. 22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. 24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. Lisäys 1 MÄÄRITELMÄT Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä: Synteettinen sedimentti on luonnollisen sedimentin fyysisiä ainesosia jäljittelevistä materiaaleista valmistettu seos. Yläpuolinen vesi on testiastiassa sedimentin päällä oleva vesi. Huokosvesi on sedimenttirakeiden välissä olevaa vettä. Sedimentti, johon on lisätty testiaine. Testikemikaali: Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Lisäys 2 Chironomus riparius -lajin kasvatussuosituksia 1. Chironomus-toukkia voi kasvattaa kiteytysmaljoissa tai suurissa astioissa. Astian pohjalle levitetään noin 5–10 mm:n paksuinen kerros hienoa kvartsihiekkaa. Myös piimaa (esim. Merck, tuotenro 8117) on osoitettu soveltuvaksi substraatiksi (ohuempi, enintään muutaman millimetrin paksuinen kerros riittää). Sen jälkeen lisätään monta senttiä soveltuvaa vettä. Jos haihtumista tapahtuu, kuivuminen on estettävä lisäämällä vettä tarvittaessa. Vesi voidaan vaihtaa tarvittaessa. Varovainen ilmastus on tarpeen. Toukkien kasvatusastioita on säilytettävä soveltuvassa häkissä, jotta kuoriutuvat aikuiset eivät pääse pakenemaan. Häkin on oltava tarpeeksi tilava, jotta kuoriutuneet aikuiset mahtuvat parveilemaan. Muutoin parittelua ei välttämättä tapahdu (vähimmäiskoko on n. 30 × 30 × 30 cm). 2. Häkkejä säilytetään huoneenlämmössä tai huoneessa, jonka lämpötila on vakioitu (20 ± 2 °C). Valoisa jakso on 16 tuntia (voimakkuus n. 1 000 luksia), pimeys 8 tuntia. On ilmoitettu, että lisääntyminen voi estyä, jos ilman suhteellinen kosteus on alle 60 prosenttia. Laimennusvesi 3. Mitä tahansa soveltuvaa luonnollista tai synteettistä vettä voidaan käyttää. Kaivovesi, talousvesi, josta on poistettu kloori, ja keinotekoinen neste (esim. Elendtin ”M4”- tai ”M7”-liuos, ks. jäljempänä) ovat yleisesti käytettyjä. Vesi on ilmastettava ennen käyttöä. Kasvatusvesi voidaan tarvittaessa uusia kaatamalla tai lappamalla käytetty vesi kasvatusastioista varoen tuhoamasta toukkaputkia. Toukkien ruokinta 4. Chironomus-toukat ruokitaan kalojen hiutaleruoalla (TetraMin®, TetraPhyll® tai muu vastaava kaupallinen kalanruoka), jota annetaan noin 250 mg astiaa kohden päivässä. Ruoka voidaan antaa kuivana jauheena tai suspensiona vedessä: 1,0 g hiutaleruokaa lisätään 20 ml:aan laimennusvettä ja seos sekoitetaan homogeeniseksi. Tätä valmistetta voi antaa noin 5 ml astiaa kohden päivässä (ravista ennen käyttöä). Vanhoille toukille voi antaa enemmän ruokaa. 5. Ruokkimista säädellään vedenlaadun mukaan. Jos kasvatusalusta muuttuu sameaksi, ravinnon määrää on vähennettävä. Ravinnon määrän lisäämistä on seurattava tarkasti. Jos ravintoa on liian vähän, toukat siirtyvät kohti vesipatsasta, ja jos ravintoa on liian paljon, mikrobien toiminta voi lisääntyä ja happipitoisuudet laskea. Kumpikin vaihtoehto voi laskea kasvunopeutta. 6. Vähän viherlevän (esim. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) soluja voidaan lisätä, kun uusia kasvatusastioita perustetaan. Kuoriutuneiden aikuisten ruokinta 7. Eräät kokeen suorittajat ovat ehdottaneet, että kylläisessä sakkaroosiliuoksessa liotettu vanutuppo saattaa riittää kuoriutuneiden aikuisten ravinnoksi. Kuoriutuminen 8. Kun lämpötila on 20 ± 2 °C, toukkien kasvatusastioista alkaa kuoriutua aikuisia noin 13–15 päivän kuluttua. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista. Munamassat 9. Kun kasvatushäkissä on aikuisia, kaikista toukkien kasvatusastioista on tarkistettava kolme kertaa viikossa, onko niissä hyytelömäisiä munamassoja. Jos munamassoja on, ne on poistettava varovasti. Ne siirretään pieneen astiaan, jossa on pieni määrä kasvatusvettä. Munamassoja voi käyttää uuden viljelyastian perustamiseen (esim. 2–4 munamassaa astiaa kohden) tai toksisuustesteihin. 10. Munatoukkien pitäisi kuoriutua 2–3 päivän kuluttua. Uusien viljelyastioiden perustaminen 11. Kun viljelmät on perustettu, uuden toukkaviljelyastian voi aloittaa testivaatimusten mukaan kerran viikossa tai harvemmin. Vanhat astiat poistetaan, kun aikuiset sääsket ovat kuoriutuneet. Näin saadaan säännöllisesti aikuisia mahdollisimman vähäisellä vaivalla. Testiliuosten ”M4” ja ”M7” valmistus 12. Elendt (1990) kuvasi ”M4”-liuoksen. ”M7”-liuos valmistetaan samoin kuin ”M4” lukuun ottamatta taulukossa 1 merkittyjä aineita, joiden pitoisuus on neljä kertaa pienempi ”M7”-liuoksessa kuin ”M4”-liuoksessa. ”M7”-liuosta koskeva julkaisu on valmisteilla (Elendt, henkilökohtainen viesti). Testiliuosta ei valmisteta Elendtin ja Biasin mukaan (1990), sillä kantaliuosten valmistusta varten annetut NaSiO3-, 5 H2O-, NaNO3-, KH2PO4- ja K2HPO4-pitoisuudet eivät ole riittäviä. ”M7”-liuoksen valmistus 13. Jokainen kantaliuos (I) valmistetaan erikseen, ja näistä kantaliuoksista (I) valmistetaan yhdistetty kantaliuos (II) (katso taulukko 1). ”M7”-liuos valmistetaan täyttämällä 50 millilitraa yhdistettyä kantaliuosta (II) ja taulukossa 2 annetut määrät jokaista makroravinteiden kantaliuosta 1 litraksi deionisoitua vettä. Vitamiinien kantaliuos valmistetaan lisäämällä deionisoituun veteen kolmea vitamiinia taulukon 3 mukaisesti, ja 0,1 millilitraa yhdistettyä vitamiinien kantaliuosta lisätään lopulliseen ”M7”-liuokseen vähän ennen käyttöä. (Vitamiinien kantaliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä.) Liuos ilmastetaan ja stabiloidaan. KIRJALLISUUSVIITTEET BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Taulukko 1 Hivenaineiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten Kantaliuokset (I) Määrä (mg), joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä Yhdistetyn kantaliuoksen (II) valmistus: Sekoita seuraavat määrät (ml) kantaliuoksia (I) ja täytä 1 litraksi deionisoitua vettä Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Taulukko 2 Makroravinteiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten Määrä, joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä (mg) Lisätyn makroravinteiden kantaliuoksen määrä M4- ja M7-liuosten valmistuksessa (ml/l) Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa M4 ja M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Taulukko 3 Vitamiinien kantaliuos M4- ja M7-liuosta varten. Kaikki kolme vitamiiniliuosta yhdistetään yhdeksi vitamiinien kantaliuokseksi. Määrä, joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä (mg) Lisätyn vitamiinien kantaliuoksen määrä M4- ja M7-liuosten valmistuksessa (ml/l) Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa M4 ja M7 (mg/l) Tiamiinihydrokloridi 750 0,1 0,075 Syaanikobalamiini (B12) 10 0,1 0,0010 Biotiini 7,5 0,1 0,00075 KIRJALLISUUSVIITTEET Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. Lisäys 3 SYNTEETTISEN SEDIMENTIN VALMISTUS Sedimentin koostumus Synteettisen sedimentin koostumuksen on oltava seuraavanlainen: Ainesosa Ominaisuudet Prosenttiosuus sedimentin kuivapainosta Turve Rahkasuoturvetta, pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0, ei näkyviä kasvijäänteitä, hienoksi jauhettuna (hiukkaskoko ≤ 1 mm) ja ilmakuivattuna 4–5 Kvartsihiekka Raekoko: > 50 prosenttia hiukkasista on oltava kokoa 50–200 μm 75–76 Kaoliniittisavi Kaoliniittipitoisuus ≥ 30 % 20 Orgaaninen hiili Säädetään lisäämällä turvetta ja hiekkaa 2 (± 0,5) Kalsiumkarbonaatti CaCO3, jauhettu, kemiallisesti puhdas 0,05–0,1 Vesi Johtavuus ≤ 10 μS/cm 30–50 Valmistelut Turve ilmakuivataan ja jauhetaan hienoksi. Tarvittava määrä turvejauhetta suspendoidaan deionisoituun veteen käyttämällä tehokasta homogenisointilaitetta. Suspension pH-arvoksi säädetään 5,5 ± 0,5 CaCO3:lla. Suspension annetaan vakioitua vähintään kahden päivän ajan sekoittamalla sitä varovasti lämpötilassa 20 ± 2 °C, jotta pH stabiloituu ja saadaan stabiili mikrobikomponentti. Sen jälkeen pH mitataan uudelleen. Arvon pitäisi olla 6,0 ± 0,5. Sen jälkeen turvesuspensioon sekoitetaan muut ainesosat (hiekka ja kaoliniittisavi) ja deionisoitu vesi, jotta saadaan homogeenistä sedimenttiä, jonka vesipitoisuus on 30–50 prosenttia sedimentin kuivapainosta. Lopullisen seoksen pH mitataan vielä kerran, ja se säädetään tarvittaessa CaCO3:lla alueelle 6,5–7,5. Sedimentistä otetaan näytteitä, joista määritetään kuivapaino ja orgaanisen hiilen pitoisuus. On suositeltavaa, että synteettistä sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Säilytys Synteettisen sedimentin kuivia ainesosia voi säilyttää kuivassa ja viileässä paikassa huoneenlämmössä. Valmistettua (märkää) sedimenttiä ei saa säilyttää ennen käyttöä tässä testissä. Se on käytettävä heti valmistuksen lopussa olevan 7 päivän sopeutusajan jälkeen. KIRJALLISUUSVIITTEET Tämän liitteen luku C.8. Myrkyllisyystutkimus madoilla. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. Lisäys 4 Hyväksyttävän laimennusveden kemialliset ominaisuudet Aine Pitoisuudet Hiukkaset < 20 mg/l Orgaanisen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l Ionisoitumaton ammoniakki < 1 μg/l Kovuus CaCO3:na < 400 mg/l (17) Jäännöskloori < 10 mg/l Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden kokonaismäärä < 50 ng/l Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden ja polykloorattujen bifenyylien kokonaismäärä < 50 ng/l Orgaanisen kloorin kokonaismäärä < 25 ng/l Lisäys 5 Chironomid-toukkien kuoriutumisen tarkkailuohjeet Dekantterilaseihin asetetaan pyydykset kuoriutuneita toukkia varten. Näitä pyydyksiä tarvitaan päivästä 20 lähtien testin loppuun saakka. Alla on esimerkki käytetystä pyydyksestä: A: polyamidiverkko B: ylösalaisin käännetyt muovikupit C: reunukseton altistusdekantterilasi D: verkkoaukot vedenvaihtoa varten E: vettä F: sedimentti C.28 MYRKYLLISYYSTESTI CHIRONOMID-ELIÖLLÄ VESI-SEDIMENTTISYSTEEMISSÄ KÄYTTÄEN VETTÄ, JOHON TUTKITTAVAA AINETTA ON LISÄTTY JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 219 (2004). Tällä testimenetelmällä on tarkoitus arvioida pitkäaikaisen kemikaalialtistuksen vaikutuksia makean veden kaksisiipisen Chironomus-lajin (surviaissääsken) toukkiin, jotka elävät sedimentissä. Menetelmä perustuu pääosion BBA:n ohjeistukseen, jossa käytetään vesi-sedimenttisysteemiä, keinomaata ja vesipatsaan altistusmenetelmää (1). Siinä huomioidaan myös Chironomus riparius- ja Chironomus tentans -lajien toksisuustestimenettelyt, jotka on kehitetty Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) ja vahvistettu yhteistutkimuksissa (ring-test) (1)(6)(9). Myös muita hyvin dokumentoituja chironomid-lajeja, kuten Chironomus yoshimatsui (10)(11), voidaan käyttää. 2. Tässä testimenetelmässä altistaminen tapahtuu lisäämällä testiainetta veteen. Soveltuvan altistuksen valinta määräytyy testin sovellustarkoituksen mukaan. Vesialtistuksessa, jossa testiainetta lisätään vesipatsaaseen, tarkoituksena on simuloida torjunta-aineiden lentosumutusta. Se kattaa alkuhuippupitoisuudet huokosvedessä. Menetelmä on hyödyllinen myös muuntyyppisissä altistuksissa (mukaan lukien kemikaalivuoto) lukuun ottamatta kertymisprosesseja, jotka kestävät kauemmin kuin testijakso. 3. Aineet, joita sedimentissä elävillä eliöillä testataan, säilyvät yleensä sedimentissä pitkään. Sedimentissä elävien eliöiden altistamiseen voidaan käyttää useita reittejä. Jokaisen altistusreitin suhteellinen tärkeys sekä toksiseen kokonaisvaikutukseen vaadittava aika määräytyvät käytettävän kemikaalin fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan. Jos kyseessä on voimakkaasti adsorboiva aine (esim. log Kow > 5) tai aine, joka sitoutuu kovalenttisesti sedimenttiin, kontaminoituneen ravinnon nauttiminen voi olla tärkeä altistusreitti. Jotta hyvin rasvahakuisten aineiden myrkyllisyyttä ei aliarvioida, voidaan harkita ravinnon lisäämistä sedimenttiin ennen testiaineen lisäämistä. Jotta kaikki mahdolliset altistusreitit voidaan huomioida, tämä testimenetelmä keskittyy pitkäaikaiseen altistukseen. Testin kesto on 20–28 päivää C. riparius- ja C. yoshimatsui -lajeille ja 28–65 päivää C. tentans -lajille. Jos lyhytaikaisia tietoja tarvitaan tiettyyn tarkoitukseen, kuten epävakaiden kemikaalien vaikutusten tutkimiseen, ylimääräiset rinnakkaisnäytteet voidaan poistaa 10 päivän jälkeen. 4. Mitatut tutkittavat ominaisuudet ovat kuoriutuneiden täysikasvuisten kokonaismäärä ja kuoriutumiseen kulunut aika. Jos lyhytaikaiset lisätiedot ovat tarpeen, toukkien eloonjäämistä ja kasvua on suositeltavaa mitata vasta kymmenen päivän kuluttua käyttämällä ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä. 5. Synteettisen sedimentin käyttö on suositeltavaa. Synteettisellä sedimentillä on useita etuja luonnolliseen sedimenttiin verrattuna: — kokeellinen vaihtelu vähenee, koska sedimentti on toistettava ”vakiomatriisi”, eikä kontaminoitumattomia ja puhtaita sedimenttilähteitä tarvitse etsiä — testit voidaan aloittaa milloin tahansa ilman, että testisedimentin kausivaihtelua esiintyy, sedimentistä ei tarvitse poistaa alkuperäiselimistöä esikäsittelyllä ja lisäksi synteettisen sedimentin käyttö pienentää kuluja, joita rutiinitestaukseen tarvittavan sedimenttimäärän keräämisestä kentältä syntyy — synteettisen sedimentin käyttö sallii toksisuuden vertailun ja aineiden lajittelemisen myrkyllisyyden mukaan: testien, joissa käytettiin luonnollista sedimenttiä ja synteettistä sedimenttiä, toksisuustiedot olivat verrattavissa useiden kemikaalien osalta (2). 6. Käytetyt määritelmät on esitetty lisäyksessä 1. TESTIN PERIAATE 7. Surviaissääsken munatoukat altistetaan testiaineen pitoisuusalueelle vesi-sedimenttisysteemeissä. Testi aloitetaan lisäämällä munatoukkia dekantterilaseihin, joissa on vesi-sedimenttisysteemiä, ja lisäämällä sen jälkeen testiainetta veteen. Surviaissääskien kuoriutumisaste ja kehittymisnopeus mitataan testin lopussa. Toukkien eloonjäänti ja paino voidaan myös tarvittaessa mitata 10 päivän kuluttua (käytättämällä soveltuvia ylimääräisiä rinnakkaisnäytteitä). Nämä tiedot analysoidaan regressiomallilla, jolla arvioidaan pitoisuus, joka aiheuttaa X prosentin laskun kuoriutumisessa, toukkien eloonjäännissä tai painossa (esim. EC15, EC50), tai tilastollisen hypoteesin testillä, jolla määritetään NOEC/LOEC. Jälkimmäinen vaihtoehto edellyttää vaikutusarvojen vertaamista vertailuarvoihin tilastotutkimuksilla. TESTIAINETTA KOSKEVIA TIETOJA 8. Testiaineen vesiliukoisuuden, höyrynpaineen, mitatun tai lasketun erottumisen erottuminen sedimenttiin sekä stabiiliuden vedessä ja sedimentissä on oltava tiedossa. Käytössä on oltava luotettava analyysimenetelmä, jolla testiaine voidaan kvantifioida sedimentin päällä olevassa vedessä, huokosvedessä ja sedimentissä, ja menetelmän tarkkuus ja havaitsemisraja tunnetaan ja ne on raportoitu. Hyödyllisiä tietoja ovat esimerkiksi rakennekaava ja testiaineen puhtaus. Myös testiaineen kemiallinen kohtalo (esim. häviäminen, abioottinen ja bioottinen hajoaminen) on hyödyllistä tietää. Kirjallisuusviitteessä (12) annetaan lisäohjeita sellaisten aineiden testauksesta, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet vaikeuttavat niiden testaamista. VERTAILUKEMIKAALIT 9. Testimenettelyn ja testiolosuhteiden luotettavuus voidaan tarkistaa testaamalla ajoittain vertailukemikaaleja. Esimerkkejä vertailumyrkyistä, joita on käytetty onnistuneesti yhteistutkimuksissa ja validointitutkimuksissa: lindaani, trifluraliini, pentakloorifenoli, kadmiumkloridi ja kaliumkloridi. (1)(2)(5)(6)(13). TESTIN LUOTETTAVUUS 10. Testi on luotettava, jos — kuoriutuvuus kontrolleissa on vähintään 70 prosenttia testin lopussa (1)(6) — C. riparius ja C. yoshimatsui aikuistuvat kontrolliastioissa 12–23 päivän kuluessa astiaan laittamisesta. C. tentans vaatii 20–65 päivää — testin lopussa mitataan jokaisen astian pH ja liuenneen hapen pitoisuus. Happipitoisuuden täytyy olla vähintään 60 prosenttia ilman kyllästysarvosta (ASV) käytetyssä lämpötilassa, ja sedimentin päällä olevan veden pH-arvon pitää olla 6–9 kaikissa testiastioissa — veden lämpötila vaihtelee enintään ± 1,0 °C. Veden lämpötilaa voidaan kontrolloida tasalämpöisessä huoneessa, jolloin huoneen lämpötila on tarkistettava soveliain väliajoin. MENETELMÄN KUVAUS Testiastiat 11. Tutkimus tehdään 600 ml:n dekantterilaseissa, joiden halkaisija on 8 cm. Muitakin astioita voidaan käyttää, kunhan sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys on sopiva. Sedimentin pinta-alan on oltava riittävä, jotta tilaa on 2–3 cm2 toukkaa kohden. Sedimenttikerroksen ja sen päällä olevan veden syvyyden suhteen on oltava 1:4. Testiastioiden ja muiden testijärjestelmän kanssa kosketuksissa olevien välineiden on oltava kokonaan lasia tai muuta kemiallisesti inerttiä materiaalia (esim. teflonia). Lajin valinta 12. Paras laji tähän testiin on Chironomus riparius. Chironomus tentans soveltuu myös, mutta sen käsittely on hankalampaa ja se edellyttää pidempää testijaksoa. Myös Chironomus yohimatsui -lajia voidaan käyttää. Tietoa Chironomus riparius -lajin kasvatusmenetelmistä on lisäyksessä 2. Myös muiden lajien kasvatusolosuhteista on saatavissa tietoa: Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Lajin tunnistus on varmistettava ennen testiä, mutta sitä ei ole tarpeen tehdä ennen joka testiä, jos eliöt ovat peräisin omasta kasvattamosta. Sedimentti 13. Synteettisen sedimentin (keinosedimentin) käyttö on suositeltavaa. Jos kuitenkin käytetään luonnollista sedimenttiä, se on kuvailtava (vähintään pH, orgaaninen kokonaishiilipitoisuus, mutta myös muut parametrit, kuten C/N-suhde ja rakeisuus ovat suositeltavia), eikä siinä saa olla kontaminaatiota tai muita organismeja, jotka saattavat kilpailla chironomid-eliöiden kanssa tai syödä ne. Lisäksi on suositeltavaa, että luonnollista sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Tätä testiä varten suositellaan seuraavaa synteettistä sedimenttiä, joka perustuu testimenetelmässä C.8 (14) käytettyyn keinomaahan (1)(15)(16): a) 4–5 % (kuivapaino) turvetta: pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0; on tärkeää käyttää ainoastaan ilmakuivattua jauhemaista turvetta, joka on jauhettu hienoksi (hiukkaskoko ≤ 1 mm) b) 20 % (kuivapaino) kaoliniittisavea (kaoliniitin osuus mieluiten yli 30 %) c) 75–76 % (kuivapaino) kvartsihiekkaa (pääosin hienoa hiekkaa, yli 50 prosenttia 50–200 μm:n hiukkasia) d) deionisoitua vettä lisätään, kunnes lopullisen seoksen kosteus on 30–50 % e) kemiallisesti puhdasta kalsiumkarbonaattia (CaCO3) lisätään, jotta lopullisen sedimenttiseoksen pH-arvoksi tulee 7,0 ± 0,5 f) orgaanisen hiilen pitoisuuden on oltava lopullisessa seoksessa 2 % (± 0,5 %). Sitä voidaan säätää lisäämällä sopiva määrä turvetta ja hiekkaa kohtien a ja c mukaisesti. 14. Turpeen, kaoliniittisaven ja hiekan alkuperän on oltava tiedossa. Tarkista, ettei sedimentin ainesosissa ole kemikaalista kontaminaatiota (esim. raskasmetalleja, orgaanisia klooriyhdisteitä ja orgaanisia fosforiyhdisteitä). Esimerkki synteettisen sedimentin valmistuksesta on lisäyksessä 3. Myös kuivien ainesosien sekoittaminen on hyväksyttävää, jos voidaan osoittaa, että sedimentin ainesosat eivät erotu (esim. kelluvia turvehiukkasia) veden lisäämisen jälkeen ja että turve tai sedimentti on sopeutunut tarpeeksi. Vesi 15. Testivedeksi soveltuu vesi, joka täyttää lisäyksissä 2 ja 4 luetellut laimennusveden kemialliset ominaisuudet. Kasvatus- ja testivedeksi soveltuu mikä tahansa vesi, luonnonvesi (pinta- tai pohjavesi), synteettinen vesi (katso lisäys 2) tai talousvesi, josta on poistettu kloori, jos surviaissääsket voivat elää siinä viljelyn ja testauksen ajan osoittamatta stressaantumisen merkkejä. Testiveden pH-arvon on oltava testin alussa 6–9, eikä kokonaiskovuus CaCO3:na saa olla yli 400 mg/l. Jos kovuusionien ja testiaineen välillä epäillään yhteisvaikutusta, on kuitenkin käytettävä pehmeämpää vettä (tässä tapauksessa ei saa käyttää Elendt M4 -viljelynestettä). Samantyyppistä vettä on käytettävä koko tutkimuksen ajan. Lisäyksessä 4 luetellut vedenlaadun ominaisuudet on mitattava vähintään kahdesti vuodessa tai aina kun on epäilystä siitä, että nämä ominaisuudet ovat voineet muuttua merkittävästi. Kantaliuokset – vesi, johon on lisätty testiainetta 16. Testipitoisuudet lasketaan vesipatsaan eli sedimentin päällä olevan veden pitoisuuksien perusteella. Halutunpitoiset testiliuokset valmistetaan tavallisesti kantaliuoksista laimentamalla. Kantaliuokset valmistetaan mieluiten liuottamalla testiainetta testiviljelyaineeseen. Liuottimien tai dispergointiaineiden käyttö voi olla tarpeen joissakin tapauksissa riittävän väkevän kantaliuoksen valmistamiseksi. Esimerkkejä sallituista liuottimista ovat asetoni, etanoli, metanoli, etyleeniglykolimonoetyylieetteri, etyleeniglykolidimetyylieetteri, dimetyyliformamidi ja trietyleeniglykoli. Sallittuja dispergointiaineita ovat Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metyyliselluloosa ja HCO-40. Liuotusapuaineen pitoisuuden on oltava mahdollisimman pieni lopullisessa testiviljelyaineessa (≤ 0,1 ml/l), ja sen on oltava sama kaikissa käsittelyissä. Jos käytetään liuotusapuaineita, niillä ei saa olla merkittävää vaikutusta eloonjäämiseen eikä näkyviä haitallisia vaikutuksia varhaisiin kehitysvaiheisiin. Se on osoitettava ainoastaan liuotinta sisältävän kontrollin avulla. Näiden aineiden käyttöä on kuitenkin vältettävä mahdollisimman pitkälle. TESTISUUNNITELMA 17. ”Testisuunnitelma” tarkoittaa testipitoisuuksien lukumäärän ja pitoisuusvälien valintaa, astioiden lukumäärää kutakin pitoisuutta kohti ja toukkien lukumäärää astiaa kohti. Suunnitelmat EC-pisteen arviointia, NOEC:n määritystä ja rajatestin tekemistä varten on kuvattu. Regressioanalyysi on parempi vaihtoehto kuin hypoteesin testaus. Regressioanalyysille suositeltava testisuunnitelma 18. Testissä käytettävien pitoisuuksien on katettava vaikutuspitoisuus (esim. EC15, EC50) ja se pitoisuusalue, joka on merkityksellinen kyseisen testiaineen kannalta. Tarkkuus ja etenkin luotettavuus, jolla vaikutuspitoisuuksien (ECx) estimaatit voidaan tehdä, paranee yleensä, kun vaikutuspitoisuus sijoittuu testattujen pitoisuuksien alueelle. Ekstrapolointia paljon matalimman positiivisen pitoisuuden alle tai korkeimman pitoisuuden ylle on vältettävä. Alustava pitoisuusalueen määrittely voi auttaa sopivien testipitoisuuksien valinnassa (katso kohta 27). 19. Jos halutaan arvioida ECx, jokaisesta pitoisuudesta tarvitaan vähintään viisi testipitoisuutta ja kolme rinnakkaisnäytettä. On joka tapauksessa suositeltavaa käyttää riittäviä testipitoisuuksia, jotta mallin estimointi onnistuu hyvin. Pitoisuuksien välinen kerroin ei saa olla yli kaksi (poikkeus voidaan tehdä, jos annosvastekäyrä on loiva). Käsittelyssä käytettävien toistojen määrää voidaan laskea, jos eri vasteita aiheuttavien testipitoisuuksien määrää nostetaan. Jos toistojen määrää lisätään tai testipitoisuuden välejä pienennetään, testin luottamusväli yleensä kapenee. Toistoja tarvitaan lisää, jos halutaan arvioida toukkien eloonjäänti ja kasvu 10 päivän aikana. NOEC:n/LOEC:n estimointiin suositeltava testisuunnitelma 20. Jos halutaan arvioida LOEC tai NOEC, on käytettävä vähintään viittä testipitoisuutta ja vähintään neljää toistoa, eikä pitoisuuksien välinen kerroin saa olla yli kaksi. Toistojen määrän on oltava riittävän suuri, jotta tilastollinen voima on riittävä ja kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Kehittymisnopeuteen soveltuu yleensä varianssianalyysi (ANOVA), kuten Dunnett-testi ja Williams-testi (17)(18)(19)(20). Kuoriutumisasteeseen voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferronin korjauksella) tai Mantel-Haenszelin testiä. Rajatesti 21. Rajatesti (yksi testipitoisuus ja kontrolli) voidaan tehdä, jos alustavassa pitoisuusalueen määrityksessä ei havaittu vaikutuksia. Rajatestin tarkoituksena on osoittaa, että testiaineen toksisuusarvo on suurempi kuin testattu rajapitoisuus. Tässä testimenetelmässä ei voida suositella pitoisuutta, joten asia jätetään sääntelyviranomaisten harkittavaksi. Yleensä vähintään kuusi rinnakkaisnäytettä sekä testi- että kontrollinäytteestä on tarpeen. On osoitettava, että tilastollinen voima on riittävä, jotta kontrollista havaitaan 20 prosentin ero viiden prosentin merkitsevyystasolla (p = 0,05). Jos vaste on metrinen (kehittymisnopeus ja paino), t-testi on soveltuva tilastollinen menetelmä, jos tiedot täyttävät tämän testin vaatimukset (normaalisuus, homogeeniset vaihtelut). Jos vaatimukset eivät täyty, voidaan käyttää t-testiä, jossa varianssit ovat heterogeenisia, tai parametritonta testiä, kuten Wilcoxon-Mann-Whitheyn testiä. Fisherin tarkka testi soveltuu kuoriutumisasteeseen. MENETTELY Altistumisolosuhteet Vesi-sedimenttisysteemin valmistelu käyttäen vettä, johon tutkittavaa ainetta on lisätty 22. Testiastioihin lisätään sopiva määrä synteettistä sedimenttiä (katso kohdat 13–14 ja lisäys 3), jotta kerroksen paksuus on vähintään 1,5 cm. Vettä lisätään, kunnes sen syvyys on 6 cm (katso kohta 15). Sedimenttikerroksen ja veden syvyyden suhde ei saa olla yli 1:4, eikä sedimenttikerroksen paksuus saa olla yli 3 cm. Vesi-sedimenttisysteemiä on ilmastettava varovasti seitsemän päivää ennen testiorganismien lisäämistä (katso kohta 14 ja lisäys 3). Sedimentin voi peittää muovikiekolla, kun vettä kaadetaan päälle, jotta sedimentin ainesosien erottuminen ja hienon materiaalin resuspensio voidaan välttää, mutta kiekko on poistettava heti tämän jälkeen. Myös muut välineet voivat olla sopivia. 23. Testiastiat on peitettävä (esim. lasilevyillä). Jos vettä haihtuu tutkimuksen aikana, lisää vettä, kunnes veden tilavuus on alkuperäisellä tasolla. Käytä tähän tarkoitukseen tislattua tai deionisoitua vettä, jotta suoloja ei keräydy. Testiorganismien lisääminen 24. Neljä tai viisi päivää ennen testiorganismien lisäämistä munamassat otetaan viljelmistä ja pannaan pieniin astioihin kasvatusalustassa. Alustana voidaan käyttää kantaliuoksesta saatua kypsynyttä alustaa tai vasta valmistettua alustaa. Jälkimmäisessä tapauksessa kasvatusalustaan lisätään pieni määrä ravintoa, kuten viherlevää ja/tai muutama pisara hienoksi jauhetuista kalanruokahiutaleista saatua suodosta (katso lisäys 2). Käytä ainoastaan vastamunittuja munamassoja. Tavallisesti toukat alkavat kuoriutua muutama päivä munimisen jälkeen (Chironomus riparius 2–3 vrk lämpötilassa 20 °C, Chironomus tentans 1–4 vrk lämpötilassa 23 °C ja Chironomus yoshimatui 1–4 vrk lämpötilassa 25 °C), ja toukkien kasvu tapahtuu neljässä vaiheessa, joista jokainen kestää 4–8 päivää. Testissä käytetään ensimmäisen kehitysvaiheen munatoukkia (2–3 tai 1–4 vrk kuoriutumisen jälkeen). Sääskien kehitysvaiheen voi tarkistaa pääkapselin leveydestä (6). 25. Kaksikymmentä munatoukkaa sijoitetaan satunnaisesti tylpällä pipetillä jokaiseen testiastiaan, jossa on testiainetta sisältävää sedimenttiä ja vettä. Veden ilmastus on lopetettava, kun toukkia lisätään testiastioihin eikä sitä saa aloittaa 24 tuntiin toukkien lisäämisen jälkeen (katso kohdat 24 ja 32). Käytetyn testisuunnitelman (katso kohdat 19 ja 20) mukaisesti toukkien määrä pitoisuutta kohti on vähintään 60 EC-pisteen arviointia varten ja 80 NOEC-määritystä varten. 26. 24 tuntia toukkien lisäämisen jälkeen sedimentin päällä olevaan veteen lisätään testiainetta, ja aloitetaan kevyt ilmastus. Pieni määrä testiaineliuosta lisätään pipetillä vedenpinnan alle. Sen jälkeen sedimentin päällä oleva vesi sekoitetaan varoen häiritsemästä sedimenttiä. Testipitoisuudet 27. Raja-annostesti voi auttaa määrittämään pitoisuusaluetta varsinaista testiä varten. Tähän tarkoitukseen käytetään testiaineen pitoisuuksia laajoin pitoisuusvälein. Jotta surviaissääskien pintatiheys on sama, jota käytetään varsinaisessa testissä, surviaissääsket altistetaan jokaiselle testiaineen pitoisuudelle siksi aikaa, että sopivat testipitoisuudet voidaan arvioida. Rinnakkaisnäytteitä ei tarvita. 28. Varsinaisessa testissä käytettävät testipitoisuudet päätetään raja-annostestin perusteella. Käytössä on oltava vähintään viisi pitoisuutta, jotka valitaan kohdissa 18 ja 20 kuvatulla tavalla. Kontrollit 29. Testissä on käytettävä kontrolliastioita, joissa on sedimenttiä mutta ei testiainetta, ja soveltuvaa määrää rinnakkaisnäytteitä (katso kohdat 19–20). Jos testiaineen lisäyksessä on käytetty liuotinta (katso kohta 16), sedimentin liuotinkontrolli on lisättävä. Testijärjestelmä 30. Käytettävät järjestelmät ovat staattisia. Puolistaattisia tai läpivirtausjärjestelmiä, joissa sedimentin yläpuolinen vesi uusiutuu ajoittain tai jatkuvasti, voidaan käyttää poikkeustapauksissa, kuten jos vedenlaatu ei sovellu testiorganismille tai vaikuttaa kemialliseen tasapainoon (esim. liuenneen hapen pitoisuus laskee liian matalaksi, erityistuotteiden pitoisuus nousee liian korkeaksi tai sedimentistä uuttuu kivennäisaineita, jotka vaikuttavat pH-arvoon ja/tai veden kovuuteen). Yleensä muut sedimentin päällä olevan veden laatua kohentavat toimet, kuten ilmastus, ovat kuitenkin riittäviä ja suositeltavia. Ravinto 31. Toukkia on ruokittava mieluiten päivittäin tai vähintään kolmesti viikossa. Riittävä määrä kalanruokaa (suspensiona vedessä tai hienoksi jauhettuna, esim. TetraMin tai TetraPhyll, lisätietoja lisäyksessä 2) on 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg C. yoshimatui -lajille) päivässä toukkaa kohden ensimmäisten 10 päivän aikana. Tätä vanhemmat toukat voivat tarvita vähän enemmän ruokaa: 0,5–1 mg päivässä toukkaa kohden pitäisi riittää testin loppuun saakka. Ruoan määrää pitää pienentää kaikissa käsittelyissä ja säädellä, jos sienikasvua ilmenee tai kontrolleissa esiintyy kuolleisuutta. Jos sienikasvua ei saada loppumaan, testi on toistettava. Jos kyseessä on voimakkaasti adsorboiva aine (esim. log Kow>5) tai aine, joka sitoutuu kovalenttisesti sedimenttiin, organismien eloonjääntiin ja luontaiseen kasvuun tarvittava ravinnon määrä voidaan lisätä synteettiseen sedimenttiin ennen stabiloitumisvaihetta. Tässä tapauksessa on käytettävä kalanruoan sijaan kasviainesta, kuten 0,5 prosenttia (kuivapaino) nokkosen (Urtica dioica), valkomulperin (Morus alba), valkoapilan (Trifolium repens), pinaatin (Spinacia oleracea) tai muun kasviaineksen (Cerophyl tai alfaselluloosan) hienoksi jauhettuja lehtiä. Inkubaatio-olosuhteet 32. Sedimentin päällä olevaa vettä aletaan ilmastaa varovasti mieluiten 24 tuntia toukkien lisäämisen jälkeen, ja ilmastusta jatketaan testin loppuun saakka (on pidettävä huoli, ettei liuenneen hapen pitoisuus laske alle 60 prosenttiin ilman kyllästysarvosta). Ilmastus tapahtuu lasisella Pasteur-pipetillä, joka on kiinnitetty 2–3 senttiä sedimenttikerroksen yläpuolelle (yksi tai muutama kupla sekunnissa). Haihtuvia kemikaaleja testattaessa voidaan harkita, jätetäänkö vesi-sedimenttisysteemi ilmastamatta. 33. Testi tehdään vakiolämpötilassa 20 °C (± 2 °C). Suositeltu lämpötila C. tentans -lajille on 23 °C (± 2 °C) ja C. yoshimatui -lajille 25 °C (± 2 °C). Valoisa aika on 16 tuntia, ja valon voimakkuuden pitää olla 500–1 000 luksia. Altistuksen kesto 34. Altistus alkaa, kun toukat lisätään astioihin, joissa on testiainetta, ja kontrolliastioihin. Altistuksen enimmäiskesto on 28 vuorokautta lajeille C. riparius ja C. yoshimatsui, ja 65 vuorokautta lajille C. tentans. Jos sääsket kuoriutuvat aikaisemmin, testi voidaan lopettaa vähintään viisi päivää sen jälkeen, kun viimeinen surviaissääski on kasvanut täysikasvuiseksi kontrollissa. HAVAINNOT Kuoriutuminen 35. Kehitysaika ja täysin kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien yhteismäärä määritetään. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista. 36. Testiastioita on tarkkailtava vähintään kolmesti viikossa ja epänormaalia käyttäytymistä on arvioitava silmämääräisesti (esim. sedimentistä poistuminen, epätavallinen uinti) kontrolliin verrattuna. Sääsket on laskettava päivittäin, kun kuoriutuminen on odotettavissa. Täysikasvuisten sääskien sukupuoli ja lukumäärä kirjataan päivittäin. Tunnistuksen jälkeen sääsket poistetaan astioista. Ennen testin loppua mahdollisesti munitut munamassat on kirjattava ylös ja poistettava, jottei sedimenttiin tule lisää toukkia. Myös niiden näkyvissä olevien koteloiden määrä, jotka eivät ole kuoriutuneet, on merkittävä ylös. Kuoriutumisen mittausohjeet ovat lisäyksessä 5. Kasvu ja eloonjäänti 37. Jos tiedot 10 vuorokauden toukkien eloonjäännistä ja kasvusta tarvitaan, testin alussa on otettava käyttöön ylimääräisiä testiastioita myöhempää käyttöä varten. Toukat seulotaan ylimääräisten astioiden sedimentistä 250 μm:n seulalla. Kuolleiksi lasketaan toukat, jotka eivät liiku tai reagoi mekaanisiin ärsykkeisiin. Myös ne toukat, joita ei otettu talteen, lasketaan kuolleiksi (mikrobit ovat saattaneet hajottaa testin alussa kuolleet toukat). Eloonjääneiden toukkien (tuhkaton) kuivapaino testiastiaa kohden määritetään ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiassa lasketaan. On hyödyllistä määrittää, missä kehitysvaiheessa eloonjääneet toukat ovat. Tähän tarkoitukseen voidaan mitata kunkin toukan pääkapselin leveys. Mittaukset Testiaineen pitoisuus 38. Vähintään sedimentin päällä olevan veden, huokosveden ja sedimentin näytteet analysoidaan testin alussa (mieluiten yksi tunti testiaineen lisäämisen jälkeen) ja lopussa suurimmassa pitoisuudessa ja matalammassa pitoisuudessa. Testiaineen pitoisuudesta saadaan tietoa testiaineen käyttäytymisestä ja jakautumisesta vesi-sedimenttisysteemissä. Sedimenttinäytteen ottaminen testin alussa voi vaikuttaa testijärjestelmään (esim. testitoukkia poistuu), joten testin alussa ja testin aikana tehtäviä analyyttisiä määrityksiä varten on tarvittaessa käytettävä ylimääräisiä testiastioita (katso kohta 39). Sedimentin mittaukset eivät välttämättä ole tarpeen, jos testiaineen jakautuminen veden ja sedimentin välille on määritetty selkeästi vesi/sedimentti-tutkimuksessa vastaavissa olosuhteissa (esim. sedimentin ja veden suhde, sovelluksen tyyppi, orgaanisen hiilen pitoisuus sedimentissä). 39. Jos välimittauksia tehdään (esim päivänä 7) ja analyysiin tarvitaan suuria näytteitä, joiden ottaminen testiastioista vaikuttaisi testijärjestelmään, analyyttisiin määrityksiin käytetään ylimääräisistä testiastioista otettuja näytteitä. Näitä astioita käsitellään samalla tavoin kuin testiastioita (mukaan lukien testiorganismien lisääminen), mutta niitä ei käytetä biologiseen havainnointiin. 40. Huokosveden suositeltava eristystapa on sentrifugointi (esim. 10 000 g ja 4 °C 30 minuutin ajan). Jos on kuitenkin osoitettu, että testiaine ei adsorboidu suotimiin, voi myös suodatus olla hyväksyttävää. Joskus pitoisuuksien analysointi huokosvedestä ei ole mahdollista, koska näyte on liian pieni. Fysikaalis-kemialliset parametrit 41. Testiastioiden pH ja lämpötila sekä testiveteen liuennut happi on mitattava asiaankuuluvasti (katso kohta 10). Kovuus ja ammoniakki on mitattava kontrolliastioissa ja yhdessä testiastiassa suurimmalla pitoisuudella testin alussa ja lopussa. TIEDOT JA RAPORTOINTI Tulosten käsittely 42. Tämän testin tarkoituksena on määrittää testiaineen vaikutus uros- ja naarassääskien kehittymisnopeuteen ja täysin kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärään. 10 päivän testissä määritetään vaikutukset toukkien eloonjääntiin ja painoon. Jos eri sukupuolten herkkyydessä ei ilmene tilastollisesti merkitsevää eroa, urosten ja naaraiden tulokset voidaan yhdistää tilastollisia analyysejä varten. Sukupuolten väliset herkkyyserot voidaan määrittää tilastotieteellisesti esimerkiksi χ2-r × 2 -taulukkotestillä. Toukkien eloonjäänti ja yksilön keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden määritetään 10 päivän kuluttua, jos tarpeen. 43. Vaikutuspitoisuudet ilmaistaan pitoisuuksina sedimentin päällä olevassa vedessä, ja vaikutuspitoisuudet lasketaan mieluiten testin alussa mitattujen sedimenttipitoisuuksien perusteella (katso kohta 38). 44. EC50:n tai minkä tahansa muun ECx:n piste-estimaattia laskettaessa astiakohtaisia tilastotietoja voidaan käyttää aitoina toistoina. Laskettaessa minkä tahansa ECx-arvon luottamusväliä astioiden välinen vaihtelu on otettava huomioon tai vaihtoehtoisesti osoitettava vaihtelu niin pieneksi, että se voidaan jättää huomiotta. Jos malliin sovelletaan pienimmän neliösumman menetelmää, astiakohtaisiin tilastotietoihin on sovellettava muunnosta, jotta varianssin homogeenisuus paranee. ECx-arvot on kuitenkin laskettava sen jälkeen, kun vaste on muunnettu takaisin alkuperäisarvoon. 45. Kun NOEC/LOEC on tarkoitus määrittää tilastollisen hypoteesin testillä, astioiden välinen vaihtelu on huomioitava esimerkiksi hierarkkisella ANOVAlla. Robustimpia testejä (21) voidaan käyttää soveltuvissa tilanteissa, kun tavalliset ANOVAn oletukset eivät täyty. Kuoriutumisaste 46. Kuoriutumisasteet ovat dikotomisia tietoja, ja ne voidaan analysoida Cochran-Armitagen testillä, jota sovelletaan alaspäin askeltavasti, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa, ja näitä tietoja pidetään tämän odotuksen mukaisina. Jos näin ei ole, voidaan käyttää Fisherin tarkkaa testiä tai Mantel-Haenszelin testiä, jossa p-arvot on korjattu Bonferroni-Holmin menetelmällä. Jos on näyttöä siitä, että saman pitoisuuden toistojen välinen varianssi on suurempi kuin binomijakauma antaa edellyttää (ylihajonta), voidaan käyttää Cochran-Armitagen testiä tai Fisherin tarkkaa testiä (21). 47. Kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa (ne) määritetään, ja summa jaetaan lisättyjen sääskien määrällä (na): jossa: ER = kuoriutumisaste ne = kuoriutuneiden sääskien määrä astiassa na = astiaan lisättyjen toukkien määrä 48. Kun näytekoko on suuri ja ylihajontaa esiintyy, paras vaihtoehto on pitää kuoriutumisastetta jatkuvana vasteena ja käyttää esimerkiksi Williamsin testiä, kun monotoninen annosvaste on odotettavissa ja yhdenmukainen kuoriutumisastetietojen kanssa. Dunnettin testi soveltuu, kun monotonisuutta ei esiinny. Näytekoko määritetään tässä suureksi, jos sekä kuoriutuneiden että kuoriutumattomien toukkien määrä on toistossa (astiassa) yli viisi. 49. Jos halutaan soveltaa ANOVA-menetelmiä, ER-arvot on ensin muunnettava arcsin-neliöjuuri-muunnoksella tai Freeman-Tukeyn muunnoksella, jotta saadaan likimääräinen normaalijakauma ja varianssi tasoittuu. Cochran-Armitagen testiä, Fisherin tarkkaa testiä (Bonferroni) tai Mantel-Haenszelin testiä voidaan soveltaa, kun käytetään absoluuttisia frekvenssejä. Arcsin-neliöjuuri-muunnosta sovelletaan ottamalla kuoriutumisasteen neliöjuuren käänteinen sini (sini–1). 50. Kuoriutumisasteissa ECx-arvot lasketaan käyttämällä regressioanalyysiä (tai esim. probit- (22), logit- tai Weibull-mallia tai soveltuvaa kaupallista ohjelmistoa). Jos regressioanalyysi epäonnistuu (esim. osittaisia vasteita on alle kaksi), käytetään muita parametrittomia menetelmiä, kuten liukuvaa keskiarvoa tai yksinkertaista interpolaatiota. Kehittymisnopeus 51. Keskimääräinen kehittymisaika edustaa keskimääräistä ajanjaksoa toukkien lisäämisestä (testipäivä 0) kokeellisen sääskikohortin kuoriutumiseen. (Aidon kehittymisajan laskennassa on huomioitava toukkien ikä lisäyshetkellä.) Kehittymisnopeus on kehittymisajan käänteisluku (yksikkö: 1/vrk) ja edustaa päivässä tapahtuvaa toukkien kehittymistä. Kehittymisnopeuden käyttö on suositeltavaa näiden sedimentin toksisuuskokeiden arvioinnissa, sillä sen varianssi on pienempi ja se on homogeenisempi ja lähempänä normaalijakaumaa kuin kehittymisaika. Siksi tehokkaita parametritestimenetelmiä käytetään mieluummin kehittymisnopeuden kuin kehittymisajan kanssa. Kun kehittymisnopeus on jatkuva vaste, ECx-arvot voidaan estimoida regressioanalyysillä (esim. (23) ja (24)). 52. Seuraavissa tilastollisissa testeissä oletetaan, että tarkastuspäivänä x havaittu sääskimäärä kuoriutuu päivän x ja päivän x-l välissä (l = tarkastusvälin pituus, yleensä 1 päivä). Keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa (x) lasketaan seuraavasti: jossa: : keskimääräinen kehittymisnopeus astiassa i : tarkastusvälin indeksi m : tarkastusvälien enimmäismäärä : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien määrä ne : testin lopussa kuoriutuneiden sääskien kokonaismäärä (= ) xi : tarkastusvälissä i kuoriutuneiden sääskien kehittymisnopeus jossa: dayi : tarkastuspäivä (päivää lisäyksen jälkeen) li : tarkastusvälin i pituus (päivissä, yleensä 1 päivä) Testiraportti 53. Testiraportin on sisällettävä vähintään seuraavat tiedot: Testiaine: — fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikaalis-kemialliset ominaisuudet (vesiliukoisuus, höyrynpaine, jakaantumiskerroin maa-aineksessa (tai sedimentissä, jos saatavissa), stabiilisuus vedessä jne.) — kemialliset tunnistetiedot (yleisnimi, kemiallinen nimi, rakennekaava, CAS-numero jne.) sekä puhtaus ja testiaineen kvantifioinnissa käytetty analyysimenetelmä. Testilajit: — käytetyt koe-eläimet: lajit, tieteellinen nimi, eliöiden lähde ja kasvatusolosuhteet — tiedot munamassojen ja toukkien käsittelystä — koe-eläinten ikä testiastioihin lisättäessä. Testiolosuhteet: — käytetty sedimentti, eli luonnollinen vai synteettinen sedimentti — luonnollisen sedimentin osalta sedimentin näytteenottopaikan sijainti ja kuvaus, mukaan lukien, jos mahdollista, kontaminaatiohistoria, ominaisuudet: pH, orgaanisen hiilen pitoisuus, C/N-suhde ja rakeisuus (tarvittaessa) — synteettisen sedimentin valmistus: ainesosat ja niiden ominaisuudet (orgaanisen hiilen pitoisuus, pH, kosteus jne. testin alussa) — testiveden valmistus (jos käytetään synteettistä vettä) ja ominaisuudet (happipitoisuus, pH, johtavuus, kovuus jne. testin alussa) — sedimentin ja sen päällä olevan veden syvyys — sedimentin päällä olevan veden ja huokosveden tilavuus, märän sedimentin paino huokosveden kanssa ja ilman huokosvettä — testiastiat (materiaali ja koko) — kantaliuosten valmistusmenetelmät ja testipitoisuudet — testiaineen lisääminen: käytetyt testipitoisuudet, toistojen määrä ja mahdollisen liuottimen käyttö — inkubaatio-olosuhteet: lämpötila, valojakso ja valon voimakkuus, ilmastus (taajuus ja voimakkuus) — yksityiskohtaiset tiedot syöttämisestä, kuten ravinnon tyyppi, valmistus, määrä ja syöttöaikataulu. Tulokset: — kaikki nimelliset testipitoisuudet, mitatut testipitoisuudet ja tulokset kaikista analyyseistä, joilla määritettiin testiaineen pitoisuus testiastiassa — testiastioissa olevan veden laatu, eli pH, lämpötila, liuennut happi, kovuus ja ammoniakki — mahdollinen haihtuneen testiveden korvaus — kuoriutuneiden uros- ja naarassääskien määrä astiassa päivää kohden — kuoriutumattomien toukkien määrä astiassa — toukkien keskimääräinen kuivapaino astiaa kohden, kehitysasteittain jos tarpeen — kuoriutumisprosentti rinnakkaisnäytteessä ja testipitoisuudessa (uros- ja naarassääsket yhteensä) — täysin kuoriutuneiden sääskien keskimääräinen kehittymisnopeus rinnakkaisnäytteessä ja testissä (uros- ja naarassääsket yhteensä) — toksisten tutkittavien ominaisuuksien estimaatit, kuten ECx (ja siihen liittyvät luottamusvälit), NOEC ja/tai LOEC, ja niiden määrittämiseen käytetyt tilastolliset menetelmät — tulosten pohdinta, mukaan luettuna mahdolliset vaikutukset, joita tästä testimenetelmästä poikkeamisella on ollut testin tuloksiin. KIRJALLISUUSVIITTEET 1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. 2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8) US-EPA/OPPTS 850,1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14) Tämän liitteen luku C.8: Myrkyllisyystutkimus madoilla. 15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. 18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. 19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. 20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. 21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. 22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. 24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. Lisäys 1 MÄÄRITELMÄT Tässä testimenetelmässä käytetään seuraavia määritelmiä: Synteettinen sedimentti on luonnollisen sedimentin fyysisiä ainesosia jäljittelevistä materiaaleista valmistettu seos. Yläpuolinen vesi on testiastiassa sedimentin päällä oleva vesi. Huokosvesi on sedimenttirakeiden välissä olevaa vettä. Vesi, johon on lisätty testiaine. Testikemikaali: Tätä testimenetelmää käyttäen testattu aine tai seos. Lisäys 2 Chironomus riparius -lajin kasvatussuosituksia 1. Chironomus-toukkia voi kasvattaa kiteytysmaljoissa tai suurissa astioissa. Astian pohjalle levitetään noin 5–10 mm:n paksuinen kerros hienoa kvartsihiekkaa. Myös piimaa (esim. Merck, tuotenro 8117) on osoitettu soveltuvaksi substraatiksi (ohuempi, enintään muutaman millimetrin paksuinen kerros riittää). Sen jälkeen lisätään monta senttiä soveltuvaa vettä. Jos haihtumista tapahtuu, kuivuminen on estettävä lisäämällä vettä tarvittaessa. Vesi voidaan vaihtaa tarvittaessa. Varovainen ilmastus on tarpeen. Toukkien kasvatusastioita on säilytettävä soveltuvassa häkissä, jotta kuoriutuvat aikuiset eivät pääse pakenemaan. Häkin on oltava tarpeeksi tilava, jotta kuoriutuneet aikuiset mahtuvat parveilemaan. Muutoin parittelua ei välttämättä tapahdu (vähimmäiskoko on n. 30 × 30 × 30 cm). 2. Häkkejä säilytetään huoneenlämmössä tai huoneessa, jonka lämpötila on vakioitu (20 ± 2 °C). Valoisa jakso on 16 tuntia (voimakkuus n. 1 000 luksia), pimeys 8 tuntia. On ilmoitettu, että lisääntyminen voi estyä, jos ilman suhteellinen kosteus on alle 60 prosenttia. Laimennusvesi 3. Mitä tahansa soveltuvaa luonnollista tai synteettistä vettä voidaan käyttää. Kaivovesi, talousvesi, josta on poistettu kloori, ja keinotekoinen neste (esim. Elendtin ”M4”- tai ”M7”-liuos, ks. jäljempänä) ovat yleisesti käytettyjä. Vesi on ilmastettava ennen käyttöä. Kasvatusvesi voidaan tarvittaessa uusia kaatamalla tai lappamalla käytetty vesi kasvatusastioista varoen tuhoamasta toukkaputkia. Toukkien ruokinta 4. Chironomus-toukat ruokitaan kalojen hiutaleruoalla (TetraMin®, TetraPhyll® tai muu vastaava kaupallinen kalanruoka), jota annetaan noin 250 mg astiaa kohden päivässä. Ruoka voidaan antaa kuivana jauheena tai suspensiona vedessä: 1,0 g hiutaleruokaa lisätään 20 ml:aan laimennusvettä ja seos sekoitetaan homogeeniseksi. Tätä valmistetta voi antaa noin 5 ml astiaa kohden päivässä (ravista ennen käyttöä). Vanhoille toukille voi antaa enemmän ruokaa. 5. Ruokkimista säädellään vedenlaadun mukaan. Jos kasvatusalusta muuttuu sameaksi, ravinnon määrää on vähennettävä. Ravinnon määrän lisäämistä on seurattava tarkasti. Jos ravintoa on liian vähän, toukat siirtyvät kohti vesipatsasta, ja jos ravintoa on liian paljon, mikrobien toiminta voi lisääntyä ja happipitoisuudet laskea. Kumpikin vaihtoehto voi laskea kasvunopeutta. 6. Vähän viherlevän (esim. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) soluja voidaan lisätä, kun uusia kasvatusastioita perustetaan. Kuoriutuneiden aikuisten ruokinta 7. Eräät kokeen suorittajat ovat ehdottaneet, että kylläisessä sakkaroosiliuoksessa liotettu vanutuppo saattaa riittää kuoriutuneiden aikuisten ravinnoksi. Kuoriutuminen 8. Kun lämpötila on 20 ± 2 °C, toukkien kasvatusastioista alkaa kuoriutua aikuisia noin 13–15 päivän kuluttua. Urokset tunnistaa helposti sulkamaisista tuntosarvista. Munamassat 9. Kun kasvatushäkissä on aikuisia, kaikista toukkien kasvatusastioista on tarkistettava kolme kertaa viikossa, onko niissä hyytelömäisiä munamassoja. Jos munamassoja on, ne on poistettava varovasti. Ne siirretään pieneen astiaan, jossa on pieni määrä kasvatusvettä. Munamassoja voi käyttää uuden viljelyastian perustamiseen (esim. 2–4 munamassaa astiaa kohden) tai toksisuustesteihin. 10. Munatoukkien pitäisi kuoriutua 2–3 päivän kuluttua. Uusien viljelyastioiden perustaminen 11. Kun viljelmät on perustettu, uuden toukkaviljelyastian voi aloittaa testivaatimusten mukaan kerran viikossa tai harvemmin. Vanhat astiat poistetaan, kun aikuiset sääsket ovat kuoriutuneet. Näin saadaan säännöllisesti aikuisia mahdollisimman vähäisellä vaivalla. Testiliuosten ”M4” ja ”M7” valmistus 12. Elendt (1990) kuvasi ”M4”-liuoksen. ”M7”-liuos valmistetaan samoin kuin ”M4” lukuun ottamatta taulukossa 1 merkittyjä aineita, joiden pitoisuus on neljä kertaa pienempi ”M7”-liuoksessa kuin ”M4”-liuoksessa. ”M7”-liuosta koskeva julkaisu on valmisteilla (Elendt, henkilökohtainen viesti). Testiliuosta ei valmisteta Elendtin ja Biasin mukaan (1990), sillä kantaliuosten valmistusta varten annetut NaSiO3-, 5 H2O-, NaNO3-, KH2PO4- ja K2HPO4-pitoisuudet eivät ole riittäviä. ”M7”-liuoksen valmistus 13. Jokainen kantaliuos (I) valmistetaan erikseen, ja näistä kantaliuoksista (I) valmistetaan yhdistetty kantaliuos (II) (katso taulukko 1). ”M7”-liuos valmistetaan täyttämällä 50 millilitraa yhdistettyä kantaliuosta (II) ja taulukossa 2 annetut määrät jokaista makroravinteiden kantaliuosta 1 litraksi deionisoitua vettä. Vitamiinien kantaliuos valmistetaan lisäämällä deionisoituun veteen kolmea vitamiinia taulukon 3 mukaisesti, ja 0,1 millilitraa yhdistettyä vitamiinien kantaliuosta lisätään lopulliseen ”M7”-liuokseen vähän ennen käyttöä. (Vitamiinien kantaliuos säilytetään jäädytettynä pienissä erissä.) Liuos ilmastetaan ja stabiloidaan. Taulukko 1 Hivenaineiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten Kantaliuokset (I) Määrä (mg), joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä Yhdistetyn kantaliuoksen (II) valmistus: Sekoita seuraavat määrät (ml) kantaliuoksia (I) ja täytä 1 litraksi deionisoitua vettä Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 Taulukko 2 Makroravinteiden kantaliuokset M4- ja M7-liuosta varten Määrä, joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä (mg) Lisätyn makroravinteiden kantaliuoksen määrä M4- ja M7-liuosten valmistuksessa (ml/l) Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa M4 ja M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 Taulukko 3 Vitamiinien kantaliuos M4- ja M7-liuosta varten Kaikki kolme vitamiiniliuosta yhdistetään yhdeksi vitamiinien kantaliuokseksi.

Määrä, joka täytetään 1 litraksi deionisoitua vettä (mg) Lisätyn vitamiinien kantaliuoksen määrä M4- ja M7-liuosten valmistuksessa (ml/l) Lopulliset pitoisuudet testiliuoksissa M4 ja M7 (mg/l) Tiamiinihydrokloridi 750 0,1 0,075 Syaanikobalamiini (B12) 10 0,1 0,0010 Biotiini 7,5 0,1 0,00075 KIRJALLISUUSVIITTEET BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. Lisäys 3 SYNTEETTISEN SEDIMENTIN VALMISTUS Sedimentin koostumus Synteettisen sedimentin koostumuksen on oltava seuraavanlainen: Ainesosa Ominaisuudet Prosenttiosuus sedimentin kuivapainosta Turve Rahkasuoturvetta, pH mahdollisimman tarkoin 5,5–6,0, ei näkyviä kasvijäänteitä, hienoksi jauhettuna (hiukkaskoko ≤ 1 mm) ja ilmakuivattuna 4–5 Kvartsihiekka Raekoko: > 50 prosenttia hiukkasista on oltava kokoa 50–200 μm 75–76 Kaoliniittisavi Kaoliniittipitoisuus ≥ 30 % 20 Orgaaninen hiili Säädetään lisäämällä turvetta ja hiekkaa 2 (± 0,5) Kalsiumkarbonaatti CaCO3, jauhettu, kemiallisesti puhdas 0,05–0,1 Vesi Johtavuus ≤ 10 μS/cm 30–50 Valmistelut Turve ilmakuivataan ja jauhetaan hienoksi. Tarvittava määrä turvejauhetta suspendoidaan deionisoituun veteen käyttämällä tehokasta homogenisointilaitetta. Suspension pH-arvoksi säädetään 5,5 ± 0,5 CaCO3:lla. Suspension annetaan vakioitua vähintään kahden päivän ajan sekoittamalla sitä varovasti lämpötilassa 20 ± 2 °C, jotta pH stabiloituu ja saadaan stabiili mikrobikomponentti. Sen jälkeen pH mitataan uudelleen. Arvon pitäisi olla 6,0 ± 0,5. Sen jälkeen turvesuspensioon sekoitetaan muut ainesosat (hiekka ja kaoliniittisavi) ja deionisoitu vesi, jotta saadaan homogeenistä sedimenttiä, jonka vesipitoisuus on 30–50 prosenttia sedimentin kuivapainosta. Lopullisen seoksen pH mitataan vielä kerran, ja se säädetään tarvittaessa CaCO3:lla alueelle 6,5–7,5. Sedimentistä otetaan näytteitä, joista määritetään kuivapaino ja orgaanisen hiilen pitoisuus. On suositeltavaa, että synteettistä sedimenttiä sopeutetaan ennen chironomid-eliöillä tehtävää myrkyllisyystestiä seitsemän päivää samoille olosuhteille, jotka testissä vallitsevat. Säilytys Synteettisen sedimentin kuivia ainesosia voi säilyttää kuivassa ja viileässä paikassa huoneenlämmössä. Valmistettua (märkää) sedimenttiä ei saa säilyttää ennen käyttöä tässä testissä. Se on käytettävä heti valmistuksen lopussa olevan 7 päivän sopeutusajan jälkeen. KIRJALLISUUSVIITTEET: Tämän liitteen luku C.8. Myrkyllisyystutkimus madoilla. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. Lisäys 4 Hyväksyttävän laimennusveden kemialliset ominaisuudet Aine Pitoisuudet Hiukkaset < 20 mg/l Orgaanisen hiilen kokonaismäärä < 2 mg/l Ionisoitumaton ammoniakki < 1 μg/l Kovuus CaCO3:na < 400 mg/l (20) Jäännöskloori < 10 mg/l Orgaanista fosforia sisältävien torjunta-aineiden kokonaismäärä < 50 ng/l Orgaanista klooria sisältävien torjunta-aineiden ja polykloorattujen bifenyylien kokonaismäärä < 50 ng/l Orgaanisen kloorin kokonaismäärä < 25 ng/l Lisäys 5 Chironomid-toukkien kuoriutumisen tarkkailuohjeet Dekantterilaseihin asetetaan pyydykset kuoriutuneita toukkia varten. Näitä pyydyksiä tarvitaan päivästä 20 lähtien testin loppuun saakka. Alla on esimerkki käytetystä pyydyksestä: A : polyamidiverkko B : ylösalaisin käännetyt muovikupit C : reunukseton altistusdekantterilasi D : verkkoaukot vedenvaihtoa varten E : vettä F : sedimentti C.29 BIOHAJOAVUUS – CO2 SULJETUISSA ASTIOISSA (HEADSPACE-TESTI) JOHDANTO 1. Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta nro 310 (2006). Testimenetelmällä voidaan arvioida kemikaalien biohajoavuutta, ja sen avulla saadaan vastaavaa tietoa kuin tämän liitteen luvussa C.4, A–F kuvatuilla kuudella testimenetelmällä. Niinpä kemikaalia, jonka tulokset ovat positiiviset tässä testimenetelmässä, voidaan pitää helposti biohajoavana, eli se hajoaa nopeasti ympäristössä. 2. Vakiintunut hiilidioksidimenetelmä (CO2) (1), joka perustuu Sturmin alkuperäiseen testiin (2) ja jolla arvioidaan orgaanisten kemikaalien biohajoavuutta mittaamalla mikrobien toiminnan tuloksena syntyvää hiilidioksidia, on tavallisesti ensimmäinen vaihtoehto, kun testataan heikosti liukenevia ja voimakkaasti adsorboivia kemikaaleja. Sitä käytetään myös liukeneville (mutta ei haihtuville) kemikaaleille, sillä monet pitävät hiilidioksidin muodostumista ainoana pitävänä todisteena mikrobien toiminnasta. Liuenneen orgaanisen hiilen poistumista voivat aiheuttaa fyysis-kemialliset prosessit – adsorptio, haihtuminen, saostuminen, hydrolyysi – sekä mikrobien toiminta, ja monet ei-biologiset reaktiot kuluttavat happea. Orgaaniset kemikaalit harvoin tuottavat hiilidioksidia abioottisesti. Alkuperäisessä ja muunnetussa Sturmin testissä (1)(2) CO2:ta poistetaan nestefaasista absorboiviin astioihin kuplittamalla (sparging) eli hiilidioksidia poistetaan kuplittamalla ilmaa nestefaasin läpi. Larsonin versiossa (3)(4) CO2 siirretään puolestaan reaktioastiasta absorboiviin materiaaleihin kuljettamalla hiilidioksidia sisältämätöntä ilmaa kaasutilan (headspace) läpi ja lisäksi ravistamalla testiastiaa jatkuvasti. Ainoastaan Larsonin muunnoksessa reaktioastiaa ravistetaan. Liukenemattomia aineita sekoitetaan standardissa ISO 9439 (5) ja alkuperäisessä yhdysvaltalaisessa versiossa (6), joissa kummassakin käytetään kuplitusta (sparging) kaasutilan vaihdon sijaan. Toisessa virallisessa US EPA -menetelmässä (7), joka perustuu Gledhillin menetelmään (8), ravistettu reaktioastia suljetaan ilmatiiviisti, ja tuotettu CO2 sidotaan astiassa olevaan emäkseen suoraan kaasufaasista, kuten klassisissa Warburgin/Barcroftin respirometripulloissa. 3. On kuitenkin osoitettu, että epäorgaaninen hiili (IC) kerääntyy standardin Sturmin muunnetun testin aikana väliaineessa useisiin kemikaaleihin (9). Epäorgaanisen hiilen pitoisuus oli jopa 8 mg/l aniliinin (20 mg C/l) hajoamisen aikana. Siten CO2:n sitominen emäkseen ei antanut oikeaa kuvaa siitä, miten paljon CO2:ta tuotettiin mikrobiologisesti hajoamisen aikana. Tästä syystä vaatimus, että > 60 prosenttia ThCO2:sta on kerättävä 10-päiväisen jakson aikana (10 %:n hajoamistason saavuttamista seuraavat 10 päivää), jotta testikemikaali voidaan luokitella helposti biohajoavaksi, ei täyty joidenkin sellaisten kemikaalien osalta, jotka määriteltäisiin helposti biohajoaviksi DOC-poistuman perusteella. 4. Kun hajoamisprosentti on alempi kuin odotettu arvo, epäorgaanista hiiltä saattaa kerääntyä testiliuokseen. Silloin hajoavuutta voidaan arvioida muilla nopean biohajoavuuden testeillä. 5. Sturmin menetelmän muiden heikkouksien (vaivalloinen, aikaa vievä, alttiimpi koevirheille eikä sovellu haihtuville kemikaaleille) vuoksi oli aiemmin alettu etsiä Gledhillin tekniikan lisäksi toista suljetun astian menetelmää läpivirtausjärjestelmien (10)(11) sijaan. Boatman et al (12) tarkastelivat aiempia menetelmiä ja ottivat käyttöön suljetun kaasutilan järjestelmän, jossa CO2 vapautetaan kaasutilaan inkubaation jälkeen happamoittamalla väliaine. CO2 mitattiin kaasukromatografisella (GC)/IC-analyysillä automaattisesti kaasutilasta otetuista näytteistä, mutta nestefaasin liuennutta epäorgaanista hiiltä (DIC) ei huomioitu. Lisäksi käytetyt astiat olivat hyvin pieniä (20 ml) ja niissä oli vain 10 ml:aa väliainetta, mikä aiheutti ongelmia esimerkiksi, kun liukenemattomia testikemikaaleja lisättiin hyvin pieniä määriä. Lisäksi siirrostetussa liuoksessa ei välttämättä ole ollenkaan tai tarpeeksi mikro-organismeja, jotka pystyvät hajottamaan testikemikaaleja. 6. Nämä vaikeudet voitettiin Struijsin ja Stoltenkampin (13) sekä Birchin ja Fletcherin (14) itsenäisissä tutkimuksissa. Jälkimmäiset saivat inspiraation anaerobisen biohajoavuuden testissä käytetystä laitteesta (15). Ensimmäisessä menetelmässä (13) CO2 mitataan kaasutilassa happamoittamisen ja tasapainottumisen jälkeen, kun taas jälkimmäisessä (14) DIC mitataan sekä kaasu- että nestefaasissa, ilman käsittelyä. Yli 90 prosenttia muodostuneesta IC:stä oli nestefaasissa. Kummassakin menetelmässä on etunsa Sturmin testiin verrattuna, sillä niissä testijärjestelmä on pienempi ja helpompi käsitellä, haihtuvia kemikaaleja voidaan testata ja mahdollinen viive tuotetun CO2:n mittauksessa vältetään. 7